KR20210074284A - 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물 - Google Patents

표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물 Download PDF

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KR20210074284A
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메구미 이케다
모에 고노
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Abstract

표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 안정된 의약 조성물 등의 제공. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물에 있어서, 완충제로서 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 배합하고, 안정화제로서 수크로오스 또는 글리세린을 배합하고, 그리고 비이온성 계면 활성제를 배합하고, pH를 6.5 내지 7.5로 조정한다. 이에 의해, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 보존할 때의 다량체나 불용성 미립자의 발생을 억제할 수 있다.

Description

표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물
본 발명은 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 함유하는 안정된 의약 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 표지부-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체, 또는 표지부-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 함유하는 안정된 의약 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법, 및 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 안정적으로 보존하는 방법에 관한 것이기도 하다.
유전자 재조합 기술의 발달에 의해, 면역 글로불린, 모노클로날 항체, 인간형화 항체 등의 항체를 의약품으로서 이용하는 것이 가능하게 되었다. 예를 들어, 암을 진단, 치료하기 위해 항암제나 금속 방사성 동위 원소, 형광 색소 등을 결합시킨 항체가 사용되고 있다. 또한, 항체를 사용한 타겟팅은 종양 세포에 대한 특이성이 높고, 부작용이 적은 것이 알려져 있다. 이러한 배경 하에, 현재까지 금속 방사성 동위 원소로 표지된 모노클로날 항체 등이 개발되어 있다(특허문헌 1).
한편, 일반적으로 항체는 혈중 반감기가 길고, 체 내에 투여 후, 암을 가시화하기에 충분한 시그널 대 백그라운드비를 제공하는 종양 대 혈액비에 달하는 데에 4일 내지 5일의 장기간을 필요로 한다(Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592). 또한, 항체의 Fc 영역은 항체 의존성 세포 장애(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity: ADCC)나 보체 의존성 세포 장애(Complement-Dependent Cytotoxicity: CDC)의 약리 작용을 일으킨다(Glycoconj. J.; 2013; 30: 227-236, Curr. Opin. Biotechnol.; 2002; 13: 609-614). 또한, 항체는 간장에서 대사되기 때문에 표적에 관계없이 간장에 고집적되는데, 대장암의 조기 전이는 간장에 국한되어 있기 때문에, 항체에 의해 대장암의 간 전이의 병소를 검출하는 것은 어렵다(Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592).
이에 대하여, Fab와 같이 저분자화된 재조합 항체 프래그먼트는 조직 침투성이 높기 때문에 병소에 도달하기 쉽고, 대장균이나 효모에서의 발현계를 사용한 저비용으로의 제조를 기대할 수 있으며, 혈중 반감기가 짧고, 신장 배설되는 특징을 갖는 점에서, 진단약으로서의 이용이 기대되고 있다(Nat. Biotechnol.; 2005; 23: 1126-1136).
이러한 배경 하에, 암의 진단을 목적으로 하여, 금속 방사성 동위 원소를 배위시킨 Fab 프래그먼트 복합체나 형광 색소를 결합시킨 Fab 프래그먼트의 이용이 검토되고 있다.
또한, 항체를 안정적으로 보존하는 방법에 대하여는, 지금까지 많은 검토가 이루어져 있다. 예를 들어, 특허문헌 2에는 인간형화 C4C1 Fab 프래그먼트를 포함하는 제제에, 비이온성 계면 활성제, 당류를 첨가하고, pH를 특정한 범위로 조정함으로써 안정화하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는, IL-1β에 대한 인간 항체를 포함하는 제제에 완충제를 첨가하고, pH를 특정한 범위로 조정함으로써 안정화하는 방법이 기재되어 있다.
일본 특허 공표 제2013-510093호 공보 국제 공개 제00/66160호 공보 일본 특허 공표 제2012-511540호 공보
1가의 Fab 프래그먼트는 분자량 약 50kDa으로, 분자량 약 150kDa의 항체보다 작고, 신장 배설되며, 혈중 반감기도 짧다. 또한, Fc 영역이 없기 때문에 ADCC나 CDC를 야기하지 않는다. 이러한 특장으로부터, 항체와 비교하여, 금속 방사성 동위 원소를 배위시킨 Fab 프래그먼트나 형광 색소를 결합시킨 Fab 프래그먼트는 진단약으로서 보다 유효하다고 기대된다.
그러나, 배위자나 형광 색소를 결합시킨 Fab 프래그먼트는 보존 시의 열 스트레스나 광 스트레스에 의해, 다량체나 불용성 미립자를 생성하기 쉽다는 과제나, 사용 전의 융해·교반 과정에서 불용성 미립자가 생성된다는 과제가 있다. 또한, 안정화를 위해 보존 용액 중에 각종 화합물을 배합하면, 배위 효율이나 형광 퇴색과 같은 문제 등이 발생하는 것도 염려되고 있다.
본 발명의 과제는, 보존 시에 있어서의 다량체나 불용성 미립자의 발생을 억제할 수 있는, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체 함유 의약 조성물 등을 제공하는 데 있다. 또한, 표지부로서 배위자를 사용한 경우에, 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하를 억제할 수 있는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체 함유 의약 조성물을 제공하는 것이나, 표지부로서 형광 색소를 사용한 경우에, 형광 색소의 퇴색을 억제할 수 있는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체 함유 의약 조성물을 제공하는 것도 본 발명의 과제이다.
본 발명자들은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체 함유 의약 조성물의 처방에 대하여 예의 검토를 거듭한 결과, 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하고, 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하고, 또한 비이온성 계면 활성제를 배합하고, pH가 6.5 내지 7.5인 의약 조성물로 함으로써, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 보존 시에 있어서의 다량체나 불용성 미립자의 발생을 억제할 수 있으며, 또한 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색도 억제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 보존 안정성이 우수하고, 또한 표지부에 대한 금속 배위 효율이나 표지 형광 색소의 퇴색도 억제할 수 있는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 제공하는 것이며, 일 양태에 있어서, 본 발명은 아래와 같으면 된다.
[1] 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체, 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 포함하고, pH가 6.5 내지 7.5인 의약 조성물이며,
완충제가 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 포함하는 것이고,
안정화제가 수크로오스 또는 글리세린을 포함하는 것인, 상기 의약 조성물.
[2] 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
표지부가 하기 식 (I):
Figure pct00001
[식 중, 파선은 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 상기 [1]에 기재된 의약 조성물.
[3] 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 상기 [2]에 기재된 의약 조성물.
[4] 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
표지부가 하기 식 (I):
Figure pct00002
[식 중, 파선은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 상기 [1]에 기재된 의약 조성물.
[5] 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 상기 [4]에 기재된 의약 조성물.
[6] 비이온성 계면 활성제가 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[7] 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체가 추가로 89Zr을 포함하는, 상기 [2] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[8] 대장암 또는 대장암이 전이된 암의 진단에 사용하는, 상기 [7]에 기재된 의약 조성물.
[9] 유방암 또는 유방암이 전이된 암의 진단에 사용하는, 상기 [7]에 기재된 의약 조성물.
[10] 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
표지부가 하기 식 (II):
Figure pct00003
[식 중, 파선은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=O)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 상기 [1]에 기재된 의약 조성물.
[11] 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 상기 [10]에 기재된 의약 조성물.
[12] 비이온성 계면 활성제가 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 상기 [10] 또는 [11]에 기재된 의약 조성물.
[13] 유방암 또는 유방암이 전이된 암의 진단에 사용하는, 상기 [10] 내지 [12] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[14] 수술 중 진단약인, 상기 [13]에 기재된 의약 조성물.
[15] 완충제의 농도가 10 내지 30mmol/L인, 상기 [1] 내지 [14] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[16] 안정화제의 농도가 5 내지 30w/v％인, 상기 [1] 내지 [15] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[17] 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.02 내지 0.2w/v％인, 상기 [1] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[18] 용액 제제, 동결 제제 또는 동결 건조 제제인, 상기 [1] 내지 [17] 중 어느 것에 기재된 의약 조성물.
[19] 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법이며,
(a) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 제조하고, 배합하는 공정,
(b) 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하는 공정,
(c) 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하는 공정,
(d) 비이온성 계면 활성제를 배합하는 공정, 및
(e) pH를 6.5 내지 7.5로 조정하는 공정
을 포함하는, 상기 제조 방법.
[20] 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 안정적으로 보존하는 방법이며,
(a) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하는 공정,
(b) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하는 공정,
(c) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 비이온성 계면 활성제를 배합하는 공정, 및
(d) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하는 공정
을 포함하는, 상기 방법.
본 발명의 의약 조성물은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 보존 시에 있어서의 다량체나 불용성 미립자의 발생을 억제할 수 있으며, 또한 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색도 억제할 수 있기 때문에, 저장, 수송 및 사용 시의 안정성의 점에서 유용하다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 안정성의 점에서, 제약학적으로 허용되는 완충제나 의약품 첨가물을 사용한 것이며, 인간 투여 시의 안전성의 점에서도 유용하다.
이하에, 본 발명에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명에 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 한다.
1. 의약 조성물
어떤 양태에서는, 본 발명은 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체, 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 포함하고, pH가 6.5 내지 7.5인 의약 조성물이며, 상기 완충제가 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 포함하는 것이며, 상기 안정화제가 수크로오스 또는 글리세린을 포함하는 것인 상기 의약 조성물에 관한 것이다. 상기 의약 조성물로 함으로써, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 보존 시에 있어서의 다량체나 불용성 미립자의 발생을 억제할 수 있으며, 또한 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색도 억제하는 것이 가능해진다. 그 때문에, 본 발명의 의약 조성물에서는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 저장, 수송 및 사용 시의 응집 등을 억제할 수 있다.
1-1. 항인간 항체 Fab 프래그먼트
항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로 분자량 5만 내지 7만의 중쇄와 2 내지 3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지고, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 γ, μ, α, δ, ε쇄라고 불린다. 또한 IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 존재하고, 각각 γ1, γ2, γ3, γ4라고 불린다. 경쇄는 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하고, L형과 K형의 2종이 알려져 있고, 각각 λ, κ쇄라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만 내지 19만이다. 2종의 경쇄는 어느 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개를 포함하고 있다.
쇄 내 S-S 결합은 중쇄에 네개(μ, ε쇄에는 다섯개), 경쇄에는 두개 있고, 아미노산 100 내지 110 잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프 사이에서 유사하며, 구조 단위 혹은 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단측에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이라도 그의 아미노산 서열이 일정하지 않아 가변 영역이라고 불리고 있으며, 각 도메인은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불린다. 이로부터 C 말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 혹은 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은 각각 CH1, CH2, CH3 혹은 CL이라고 표시된다.
항체와 항원의 결합 특이성은, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 의해 구성되는 부분의 아미노산 서열에 의한다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쪽 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역으로 거의 한정되는 것을 알고 있고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N 말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 칭하고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.
항체의 중쇄 정상 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 있는 영역은 힌지 영역이라고 불리고, 이 영역은 프롤린 잔기를 많이 포함하고, 2개의 중쇄를 연결하는 복수의 쇄간 S-S 결합을 포함한다. 예를 들어 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 힌지 영역에는, 중쇄간의 S-S 결합을 구성하고 있는, 각각 2개, 4개, 11개, 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 힌지 영역은 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해 효소에 대한 감수성이 높은 영역이다. 항체를 파파인으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄간 S-S 결합보다 N 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, 2개의 Fab 프래그먼트와 1개의 Fc 프래그먼트로 분해된다. Fab 프래그먼트는 경쇄와, 중쇄 가변 영역, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성된다. Fab 프래그먼트는 가변 영역을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 항체 Fab 프래그먼트는, 어떤 양태에서는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다. 또한, 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 항체 Fab 프래그먼트는, 어떤 양태에서는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다.
1-1-1. 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
CEACAM5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5)는 종양 마커의 하나이며, 정상 조직에서 거의 발현이 확인되지 않지만, 태아의 소화관이나 대장암에서 발현되고 있다(BBA; 1990; 1032: 177-189, Mol. Pathol.; 1999; 52: 174-178). 또한, CEACAM5는 유방암 등에서도 발현되고 있는 것이 알려져 있다(Diagn. Cytopathol.; 1993; 9: 377-382, Cancer Res.; 1990; 50: 6987-6994, Histopathology; 2000; 37: 530-535). 또한, 대장암 환자에서는 건강인에 비해 혈 중 CEACAM5의 농도가 높아(J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462), CEACAM5는 종양 마커로서 사용되고 있다. 대장암 환자의 조직학적인 검토에서는 90％ 이상의 조직에서 CEACAM5가 고발현되고 있다(British J. Cancer; 2013; 108: 662-667).
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에는, 이하의 특징을 갖는 Fab 프래그먼트가 포함된다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4 등 중 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역은 인간 Igγ1 정상 영역이다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ 중 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역은 인간 Igκ 정상 영역이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 이하의 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
Fab 프래그먼트를 포함하여, 항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C 말단의 리신의 카르복시펩티다아제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 당화 등을 들 수 있고, 각종 항체에 있어서, 이러한 번역 후 수식이 발생하는 것이 알려져 있다(J. Pharm. Sci.; 2008; 97: 2426-2447).
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에는, 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab 프래그먼트도 포함될 수 있다. 번역 후 수식에 의해 발생할 수 있는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 N 말단이 피로글루타밀화된 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 들 수 있다. 이러한 N 말단의 피로글루타밀화에 의한 번역 후 수식은, 항체의 활성에 현저한 영향을 미치는 것이 아님이 당해 분야에서 알려져 있다(Anal. Biochem.; 2006; 348: 24-39).
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는 하기 특징을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는 하기 특징을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 의약 조성물에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트도 포함된다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 110까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 그리고 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 38까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54부터 60까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93부터 101까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는 인간 CEACAM5에 결합한다. 얻어진 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 인간 CEACAM5에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR)법에 의한 해석이나 ELISA 등의 방법이 있다. 예를 들어 SPR법에 의한 해석을 사용하는 경우, Biacore T200(GE 헬스케어·재팬사)을 사용하여, 센서 칩에 Biotin CAPture Kit(GE 헬스케어·재팬사)와 비오틴화한 인간 CEACAM5를 고상화하고, 단계 희석한 Fab 프래그먼트를 첨가함으로써 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)를 측정할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 본 명세서에 개시되는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 후술하는 「4-4. 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법」에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
1-1-2. 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
뮤신 1(Mucin 1: MUC1)은 유선, 기관 및 소화관 등의 상피 조직을 구성하는 상피 세포의 내강측에 발현되는 막결합형 당단백질이다(Nat. Rev. Cancer; 2004 Jan; 4(1): 45-60). MUC1은 유방암이나 대장암 등의 암 세포에서 과잉으로 발현되고 있고(Mod. Pathol.; 2005 Oct; 18(10): 1295-1304, Int. J. Oncol.; 2000 Jan; 16(1): 55-64), MUC1은 암병소를 검출하기 위한 표적 분자로서 유용하다(Nat. Rev. Cancer; 2004 Jan; 4(1): 45-60, Pathol. Res. Pract.; 2010 Aug 15; 206(8): 585-589.).
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 특징을 갖는 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4 등 중 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역은 인간 Igγ1 정상 영역이다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ 중 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역은 인간 Igκ 정상 영역이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다.
전술한 바와 같이, Fab 프래그먼트를 포함하여, 항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에는, 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab 프래그먼트도 포함될 수 있다. 번역 후 수식에 의해 발생할 수 있는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 N 말단이 피로글루타밀화된 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 들 수 있다. 이러한 N 말단의 피로글루타밀화에 의한 번역 후 수식은, 항체의 활성에 영향을 미치는 것이 아님이 당해 분야에서 알려져 있는 것은 전술한 바와 같다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 하기 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 하기 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 하기 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 하기 특징을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 인간 암 특이적 MUC1에 결합한다. 얻어진 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, ELISA나 FACS 등의 방법이 있다. 예를 들어 ELISA를 사용하는 경우, 인간 암 특이적 MUC1 양성 세포(예를 들어, T-47D 세포)를 ELISA 플레이트에 고정화하고, 이에 대하여 Fab 프래그먼트를 첨가하여 반응시킨 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 등으로 표지한 항Igκ 항체 등을 반응시킨 후, 그의 활성을 검출하는 시약(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 표지의 경우, 화학 발광 호스래디쉬 퍼옥시다아제 기질) 등을 사용한 활성 측정에 의해, 2차 항체의 결합을 동정한다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 본 명세서에 개시되는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 후술하는 「4-4. 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법」에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
1-2. 표지부
1-2-1. 배위자를 포함하는 표지부
어떤 실시 형태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 배위자 및 링커인 복합체이다. 또한, 본 명세서에 있어서 「배위자」란, 복합체에 있어서 금속과 킬레이트 착체를 형성할 수 있는 부분이며, 킬레이트제로 구성되는 기를 의미한다. 또한, 「구성되는 기」란, 킬레이트제로부터 프로톤이 제거되어 결합손을 갖는 기이며, 「킬레이트제」란, 금속과 배위 결합할 수 있는 화합물이다.
어떤 실시 형태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 배위자 및 링커인 경우, 배위자를 구성하는 킬레이트제로서는 시데로포어와 비시데로포어를 들 수 있다. 또한 어떤 양태로서는, MAG3(머캅토아세틸-글리실-글리실-글리신, CAS 번호: 66516-09-4), 및 그의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다. 시데로포어로서는, 히드록삼산형, 카테콜형 또는 혼합 배위자형을 들 수 있다. 히드록삼산형 시데로포어로서는, 예를 들어 페리크롬, 하기 식:
Figure pct00004
으로 나타나는 데페록사민(DFO), 푸사리닌 C, 오르니박틴, 로도토룰산, 및 이들의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다. 카테콜형 시데로포어로서는, 예를 들어 엔테로박틴, 바실리박틴, 비브리오박틴, 및 이들의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다. 혼합 배위자형 시데로포어로서는, 예를 들어 아조토박틴, 피오베르딘, 에르시니아박틴, 및 이들의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다. 또한, 상기 시데로포어의 경우, DFO는 그의 반응성 관능기인 -NH2를 개재하여 링커 또는 Fab 프래그먼트와 반응시킬 수 있고, DFO 이외의 시데로포어의 경우에는, 카르복시기, 수산기, 아미노기 등의 반응성 관능기를 개재하여, 당업자가 통상 사용하는 방법으로 링커 또는 Fab 프래그먼트와 반응시킬 수도 있다.
비시데로포어로서는, DTPA(디에틸렌트리아민오아세트산, CAS 번호: 67-43-6), DTPA-BMA(1,7-비스(메틸카르바모일메틸)-1,4,7-트리아자헵탄-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 119895-95-3), EOB-DTPA(에톡시벤질 DTPA, 2-[[(2S)-2-[비스(카르복시메틸)아미노]-3-(4-에톡시페닐)프로필]-[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]아미노]아세트산), TTHA(트리에틸렌테트라민육아세트산, CAS 번호: 869-52-3), DO3A(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 217973-03-0), HP-DO3A(10-(2-히드록시프로필)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 120041-08-9), DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산, CAS 번호: 60239-18-1), 및 이들의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 표지부가 배위자 및 링커인 경우의 배위자를 구성하는 「킬레이트제」는 바람직하게는 DFO이다.
「링커」란, 항인간 항체 Fab 프래그먼트와 배위자 사이에 거리를 만드는 기이다. 어떤 실시 형태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 배위자 및 링커인 경우, 항인간 항체 Fab 프래그먼트와 배위자 사이에 거리를 만드는 링커로서는, 하기 식:
Figure pct00005
(이하 -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-라 표기함), -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -C(=O)-(C1-20알킬렌)-C(=O)-를 들 수 있다. 여기서 「C1-20알킬렌」이란, 직쇄 또는 분지의 탄소수 1 내지 20의 알킬렌이다. C1-20알킬렌의 어떤 양태로서는, C1-10알킬렌, C1-2알킬렌을 들 수 있다. C1-20알킬렌의 어떤 양태로서는, 에틸렌을 들 수 있다. 링커를 형성하기 위해 사용할 수 있는 시약으로서는, HO-C(=O)-(C1-20알킬렌)-C(=O)-OH, 숙신산, p-페닐렌디이소티오시아네이트 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 표지부가 배위자 및 링커인 경우의 「링커」는 바람직하게는 -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-이다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 배위자 및 링커인 경우, 항인간 항체 Fab 프래그먼트와 링커를 반응시켜 얻어진 물질에 배위자를 형성하는 킬레이트제를 반응시켜 제조할 수 있다. 배위자를 형성하는 킬레이트제에 링커를 반응시켜 얻어진 물질에 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 반응시켜 제조할 수도 있다. 반응예로서는, 킬레이트제의 아미노기와 링커를 반응시켜 얻어진 물질을, 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 하나 이상의 아미노기(예를 들어, N 말단 아미노기나 리신 측쇄의 아미노기)와 반응시키는 것을 들 수 있다. 표지부가 배위자인 경우, 항인간 항체 Fab 프래그먼트와 배위자를 형성하는 킬레이트제를 반응시켜 제조할 수도 있다. 반응예로서는, 킬레이트제를 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 하나 이상의 아미노기(예를 들어, N 말단 아미노기나 리신 측쇄의 아미노기)와 반응시키는 것을 들 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 제조에는, 아민에 이소티오시아네이트를 첨가하여 티오우레아를 합성하는 반응이나, 아민에 카르복실산을 첨가하여 아미드를 합성하는 반응 등을 사용할 수 있다. 당해 반응은 당업자에게 공지된 방법을 적용함으로써 행할 수 있다. 또한, 원료로서 미리 배위자와 링커가 결합된 화합물을 사용할 수도 있다. 배위자와 링커가 결합된 화합물의 예로서는, 이하의 식으로 나타나는 p-SCN-Bn-DFO(p-이소티오시아노페닐아미노티오카르보닐기 치환 DFO, CAS 번호: 1222468-90-7):
Figure pct00006
, p-이소티오시아노벤질기 치환 DTPA(p-SCN-Bn-DTPA, CAS 번호: 102650-30-6), p-이소티오시아노벤질기 치환 DOTA(p-SCN-Bn-DOTA, CAS 번호: 127985-74-4), 및 p-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA([(R)-2-아미노-3-(4-이소티오시아네이토페닐)프로필]-트랜스-(S,S)-시클로헥산-1,2-디아민-오아세트산, CAS 번호: 157380-45-5)를 들 수 있다.
어떤 실시 형태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 표지부가 하기 식 (I)로 표시되는 배위자 및 링커인 복합체이다:
Figure pct00007
식 중, 파선은 항인간 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 배위자 및 링커인 경우, 배위자를 구성하는 킬레이트제가 금속 방사성 동위 원소와 킬레이트 착체를 형성할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 금속 방사성 동위 원소는 예를 들어 PET 트레이서 등에 사용되는 것을 말하고, 89Zr, 51Mn, 52Fe, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 99mTc 또는 111In 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 89Zr이다. 즉, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 금속 방사성 동위 원소를 포함하지 않는 것이어도 되고, 금속 방사성 동위 원소로서 89Zr을 포함하는 것이어도 된다.
또한, 본 발명의 의약 조성물이 제공될 때의 양태로서는, 금속 방사성 동위 원소를 포함하지 않는 양태로 제공하고, 사용 직전에 금속 방사성 동위 원소로 표지하여 사용해도 되고, 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 진단에 사용하는 의약 조성물로서 제공되어도 된다. 예를 들어, 짧은 반감기의 금속 방사성 동위 원소(예를 들어, 89Zr(반감기 3.3일))를 사용하는 경우에는, 금속 방사성 동위 원소를 포함하지 않는 양태로 제공하고, 사용 직전에 금속 방사성 동위 원소로 표지하는 것이 바람직하다.
1-2-2. 형광 색소를 포함하는 표지부
어떤 실시 형태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 형광 색소인 경우, 형광 색소로서는, 광 이미징에 통상 사용되는 근적외 파장(650 내지 1000nm)에 흡수 극대 및 발광 극대가 있는 색소를 사용할 수 있다. 형광 색소의 어떤 양태로서는, 시아닌 또는 인도시아닌 화합물을 들 수 있다. 어떤 양태로서는, IRDye800CW(LI-COR사), Cy(Molecular Probe사), Alexa Fluor, BODIPY 및 DyLight(Thermo Fisher Scientific사), CF790(Biotium사), DY(DYOMICS GMBH사), HiLyte Fluor680 및 HiLyte Fluor750(Anaspec사), PULSAR650 및 QUASAR670(Biosearch Technologies사) 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는 표지부가 형광 색소인 경우의 형광 색소는, 바람직하게는 하기 식으로 표시되는 IRDye800CW(LI-COR Biosciences사):
Figure pct00008
이다. 또한, 상기 형광 색소는 그의 카르복시기, 수산기, 아미노기 등을 개재하거나, 혹은 당업자가 통상 사용하는 방법으로 활성화기를 도입하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트 혹은 항인간 항체 Fab 프래그먼트에 결합한 링커와 반응시킬 수 있다. 활성화기가 도입된 형광 색소의 어떤 양태로서는, N-히드록시숙신이미드(NHS)기로 에스테르화된 형광 색소를 들 수 있다. 예를 들어 IRDye800CW의 NHS 에스테르는 시판되고 있으며, 그들을 이용 가능하다.
어떤 실시 형태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 표지부가 하기 식 (II)로 표시되는 형광 색소인 복합체이다:
Figure pct00009
식 중, 파선은 항인간 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=O)의 탄소 원자와 결합되어 있다.
의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트와 표지부의 결합은 공지된 방법에 의해 당업자가 적절히 행할 수 있다. 예를 들어, 표지부를 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 하나 이상의 아미노기(예를 들어, N 말단 아미노기나 아미노산 측쇄의 아미노기), 하나 이상의 티올기(예를 들어, 아미노산 측쇄의 티올기), 또는 하나 이상의 카르복실기(예를 들어, C 말단이나 아미노산의 측쇄의 카르복실기)에 결합시킬 수 있다. 어떤 양태로서, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 표지부가 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 하나 이상의 아미노기에 결합한 복합체이다.
1-3. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체
본 발명의 의약 조성물은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 것이다. 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
상기 표지부가 하기 식 (I):
Figure pct00010
[식 중, 파선은 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 표지부-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체이다.
어떤 양태에서는, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이다.
또한, 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 상기 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
상기 표지부가 하기 식 (I):
Figure pct00011
[식 중, 파선은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 표지부-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체이다.
어떤 양태에서는, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이다.
또한, 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 상기 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
상기 표지부가 하기 식 (II):
Figure pct00012
[식 중, 파선은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=O)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 표지부-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체이다.
어떤 양태에서는, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는 이하의 (a) 및 (b):
(a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
(b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 하나 이상의 표지부가 결합한 복합체이다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 어떤 양태로서는 1 내지 25의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 23의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 16의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 10의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 4 내지 23의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 4 내지 16의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 4 내지 10의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 4 내지 9의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 3 내지 23의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 3 내지 16의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 3 내지 10의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 3 내지 9의 표지부와 결합한, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다. 어떤 양태로서는 금속을 더 포함하는, 하나 이상의 표지부와 결합한 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 복합체는 하나 이상의 표지부와, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 포함하는 복합체이다. 어떤 양태로서는 1 내지 27의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 23의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 15의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 7의 표지부와 결합한, 어떤 양태로서는 1 내지 5의 표지부와 결합한, 또한 어떤 양태로서는 1 내지 4의 표지부와 결합한, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다. 어떤 양태로서는 금속을 더 포함하는, 하나 이상의 표지부와 결합한 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이다.
또한, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체는, 특별히 기재되지 않는 한 프리체 및 그의 염도 포함한다. 여기서 「그의 염」이란, 그 복합체의 치환기의 종류에 따라 산 부가염 또는 염기와의 염을 형성하는 경우가 있고, 그 화합물 및 복합체를 형성할 수 있는 염이다. 구체적으로는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 만델산, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 디톨루오일타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 아스파르트산, 글루탐산 등의 유기산과의 산 부가염, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등의 무기 염기, 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 리신, 오르니틴 등의 유기 염기와의 염, 아세틸류신 등의 각종 아미노산 및 아미노산 유도체와의 염 및 암모늄염 등을 들 수 있다. 예를 들어, DFO는 데페록사민메탄술폰산염으로서도 존재하고, 다른 염으로서도 존재한다.
본 발명의 의약 조성물에 있어서의 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 농도는 진단상 또는 치료상 유효한 작용을 발휘하는 양이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 1 내지 100mg/mL이며, 보다 바람직하게는 5 내지 20mg/mL이다.
1-4. 완충제
본 발명의 의약 조성물에 있어서의 완충제는 후술하는 범위로 pH를 유지하고, 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율에 대한 영향을 억제한다는 관점에서, 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 완충제의 농도는 완충제의 종류와 목적으로 하는 pH에 따라서 변동되지만, 10 내지 30mmol/L인 것이 바람직하다.
어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 완충제는 시트르산이며, 그의 농도는 10 내지 30mmol/L, 바람직하게는 15 내지 25mmol/L이다. 또한, 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 완충제는 인산이며, 그의 농도는 10 내지 30mmol/L, 바람직하게는 15 내지 25mmol/L이다.
1-5. 안정화제
본 발명의 의약 조성물에 있어서의 안정화제는 보존 시에 있어서의 열 스트레스, 광 스트레스 또는 진탕 스트레스 등에 의한 다량체, 산성측 전하 유사체, 또는 불용성 미립자의 발생을 억제하면서, 또한 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색도 억제한다는 관점에서, 수크로오스 또는 글리세린을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 안정화제의 농도는 사용하는 안정화제의 종류에 따라서 변동되지만, 5 내지 30w/v％인 것이 바람직하다.
어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 안정화제는 수크로오스이며, 그의 농도는 5 내지 30w/v％, 바람직하게는 15 내지 25w/v％이다. 또한, 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 완충제는 글리세린이며, 그의 농도는 5 내지 30w/v％, 바람직하게는 15 내지 25w/v％이다.
1-6. 비이온성 계면 활성제
본 발명의 의약 조성물에서는, 비이온성 계면 활성제를 사용할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에 있어서 비이온성 계면 활성제는 불용성 미립자의 발생을 억제하면서, 또한 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색도 억제한다는 관점에서, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴록사머 188을 사용할 수 있다. 또한, 폴리소르베이트 80은 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄올레산에스테르라고도 불리고, 무수 소르비톨의 수산기의 일부를 올레산으로 에스테르화한 것의 폴리옥시에틸렌에테르이며, 모노올레산소르비탄 1몰에 대하여 약 20몰의 산화에틸렌기가 에테르 결합한 구조를 갖는 것이다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 비이온성 계면 활성제의 농도는 그의 종류에 따라서 변동되지만, 0.02 내지 0.2w/v％인 것이 바람직하다.
어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 비이온성 계면 활성제는 폴리소르베이트 80이며, 그의 농도는 0.02 내지 0.2w/v％, 바람직하게는 0.04 내지 0.1w/v％이다.
1-7. pH
본 발명의 의약 조성물에서는, 보존 시에 있어서의 열 스트레스, 광 스트레스 또는 진탕 스트레스 등에 의한 다량체, 산성측 전하 유사체, 또는 불용성 미립자의 발생을 억제하면서, 또한 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색도 억제한다는 관점에서, pH는 6.5 내지 7.5이며, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.0이다.
어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체로서 전술한 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체 또는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 5 내지 20mg/mL의 농도로 포함하고, 완충제로서 15 내지 25mmol/L의 시트르산을 포함하고, 안정화제로서 15 내지 25w/v％의 수크로오스를 포함하고, 비이온성 계면 활성제로서 0.04 내지 0.1w/v％의 폴리소르베이트 80을 포함하고, pH가 6.5 내지 7.0인 것이 바람직하다.
1-8. 진단에 사용하는 의약 조성물
본 발명은, 어떤 양태에서는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는, 진단에 사용하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체가 표지부로서 배위자를 포함하는 경우, 금속 방사성 동위 원소(예를 들어, 89Zr)를 배위시킴으로써, 검출 가능한 복합체가 된다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체가 표지부로서 형광 색소를 포함하는 경우, 당해 복합체가 검출 가능한 복합체이다. 이들 검출 가능한 복합체는 조기 진단약, 병기 진단약 또는 수술 중 진단약(특히 암의 진단약)으로서 이용할 수 있다. 수술 중 진단약이란, 외과 수술이나 내시경 수술 등의 수술 중에, 병변부를 특정하고, 그의 성질을 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다. 본 발명의 진단에 사용하는 의약 조성물을 수술 중 진단약으로서 사용하는 경우, 당해 진단에 사용하는 의약 조성물은, 예를 들어 수술의 2 내지 32시간 전, 어떤 양태로서는 6 내지 24시간 전, 또 다른 양태로서는 2시간 전에 환자에게 투여된다.
조기 진단약이란, 병상이 관찰되지 않거나, 또는 병기가 이른 단계에서 진단을 행하는 것을 목적으로 하는 진단약을 의미한다. 예를 들어 암에 있어서는, 병상이 관찰되지 않거나, 스테이지 0 또는 스테이지 1의 단계에서 사용하는 진단약을 의미한다.
병기 진단약이란, 병상이 어느 정도 진행되고 있는지를 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다. 예를 들어 암에 대하여는, 그의 스테이지를 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다.
본 발명의 의약 조성물이 표지부-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 경우, 인간 CEACAM5를 발현하는 암의 진단에 사용할 수 있다. 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물이 표지부-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 경우, 대장암, 유방암, 폐암, 갑상선암, 또는 이들이 전이된 암의 진단에 사용하는 것이 바람직하고, 특히 대장암 또는 대장암이 전이된 암의 진단에 사용하는 것이 바람직하다. 대장암이 전이된 암은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 전이성 간암을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물이 표지부-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 경우, 인간 MUC1을 발현하는 암의 진단에 사용할 수 있다. 어떤 양태에서는, 본 발명의 의약 조성물이 표지부-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 경우, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암의 진단에 사용할 수 있고, 특히 유방암 또는 방광암의 진단에 사용하는 것이 바람직하다.
1-9. 의약 조성물의 제형·첨가물
본 발명의 의약 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않지만, 어떤 양태에서는 액체 제제, 동결 제제 또는 동결 건조 제제이다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 예를 들어 주사제나 점적용제 등의 비경구제로서 사용할 수 있고, 정맥 내 주사, 표적 국소로의 근육 내 주사, 또는 피하 주사 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 검출 가능한 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 용량은 환자의 연령이나 체중, 사용하는 제제의 제형, 혹은 Fab 프래그먼트의 결합 역가 등에 따라서 다르지만, 예를 들어 환자의 단위 체중당 Fab 프래그먼트의 질량 베이스로 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용하면 된다.
본 발명의 의약 조성물에는, 원한다면 현탁제, 용해 보조제, 등장화제, 보존제, 흡착 방지제, 부형제, 무통화제, 황 함유 환원제, 산화 방지제 등의 의약품 첨가물을 적절히 첨가할 수 있다.
현탁제로서는, 예를 들어 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 트라가칸트 분말, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있다.
용해 보조제로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 마크로골, 피마자유 지방산 에틸에스테르 등을 들 수 있다.
등장화제로서는, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 들 수 있다.
보존제로서는, 예를 들어 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸, 벤질알코올 등을 들 수 있다.
흡착 방지제로서는, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥시드·프로필렌옥시드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.
부형제로서는, 예를 들어 크실리톨 등을 들 수 있다.
무통화제로서는, 예를 들어 이노시톨, 리도카인 등을 들 수 있다.
황 함유 환원제로서는, 예를 들어 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소 원자수 1 내지 7의 티오알칸산 등의 술프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서는, 예를 들어 에리토르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈산트리아밀, 갈산프로필, 혹은 에틸렌디아민사아세트산이나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
2. 진단에 사용하는 의약 조성물의 사용·진단 방법
본 발명은 또한, 암의 조기 진단에 사용하는 의약 조성물, 병기 진단에 사용하는 의약 조성물 또는 수술 중 진단에 사용하는 의약 조성물의 제조를 위한, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은, 어떤 양태에서는 암의 조기 진단, 병기 진단 또는 수술 중 진단에 있어서 사용하기 위한, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물이다.
본 발명은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물을, 수술 전 또는 수술 중에 대상에 투여하는 것을 포함하는 암의 진단 방법에도 관한 것이다. 여기에 있어서 「대상」이란, 그 진단을 받는 것이 필요한 인간 또는 기타 포유 동물이며, 어떤 양태로서는, 그 진단을 받는 것이 필요한 인간이다. 상기 진단 방법에 있어서의 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 본 발명의 의약 조성물의 유효량은 환자의 연령이나 체중, 사용하는 제제의 제형, 혹은 Fab 프래그먼트의 결합 역가 등에 따라서 다르지만, 예를 들어 환자의 단위 체중당 Fab 프래그먼트의 질량 베이스로 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용하면 된다. 상기 진단 방법에 있어서, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 본 발명의 의약 조성물은 표적 조직 국소로의 근육 내 주사, 또는 피하 주사 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 상기 진단 방법에 있어서 본 발명의 의약 조성물을 수술 전에 투여하는 경우, 당해 복합체는 예를 들어 수술의 2 내지 48시간 전, 어떤 양태로서는 6 내지 24시간 전, 또 다른 양태로서는 2시간 전에 환자에게 투여된다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 의약 조성물의 제조를 위한 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 사용에도 관한 것이다.
3. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 안정적으로 보존하는 방법
어떤 양태에서는, 본 발명은, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은, 어떤 양태에서는, (a) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 제조하고, 배합하는 공정, (b) 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하는 공정, (c) 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하는 공정, (d) 폴리소르베이트 80을 비이온성 계면 활성제로서 배합하는 공정, 및 (e) pH를 6.5 내지 7.5로 조정하는 공정을 포함하는, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법이다. 또한, 배합의 순번은 특별히 한정되지 않는다.
또한, 어떤 양태에서는, 본 발명은 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 안정적으로 보존하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서 「안정적으로 보존한다」란, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 보존 시에 있어서의 다량체나 불용성 미립자의 발생을 억제하는 것을 말한다. 또한, 어떤 양태에서는, 본 명세서에 있어서 「안정적으로 보존한다」는 것은, 배위자에 대한 금속 방사성 동위 원소의 배위 효율의 저하나 형광 색소의 퇴색을 억제하는 것도 포함하는 개념이다. 구체적으로 본 발명은, 어떤 양태에서는, (a) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하는 공정, (b) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하는 공정, (c) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 폴리소르베이트 80을 비이온성 계면 활성제로서 배합하는 공정, 및 (d) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하는 공정을 포함하는, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 안정적으로 보존하는 방법이다. 또한, 배합의 순번은 특별히 한정되지 않는다.
전술한 제조 방법 및 안정적으로 보존하는 방법에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트나 표지부의 구조나, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 구조 등에 대하여는, 전술한 「1. 의약 조성물」의 항에 기재한 바와 같다. 또한, 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제의 농도 범위나 pH의 범위 등에 대해서도, 전술한 「1. 의약 조성물」의 항에 기재한 바와 같다. 또한, 상기 공정은 어느 순서로 행해도 된다.
또한, 상술한 제조 방법 및 방법에 있어서, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체가 표지부로서 배위자를 포함하는 경우, 어떤 양태에서는, 금속 방사성 동위 원소를 배위시키는 공정을 포함할 수 있다. 또한, 금속 방사성 동위 원소의 종류 등에 대해서도, 전술한 「1. 의약 조성물」의 항에 기재한 바와 같다.
또한, 전술한 제조 방법 및 방법에 있어서, 어떤 양태에서는, 동결시키는 공정이나 동결 건조시키는 공정을 포함할 수 있다. 또한, 동결 방법이나 동결 건조 방법에 대하여는 공지된 방법을 사용할 수 있다.
4. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 제조 방법
4-1. 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
항인간 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 복합체가 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 포함하는 경우, 어떤 양태에서는, 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
어떤 실시 형태에 있어서, 상기 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 1의 염기 번호 1부터 363까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 3의 염기 번호 1부터 336까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
항인간 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 복합체가 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 포함하는 경우, 어떤 양태에서는, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
어떤 양태에 있어서, 상기 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 13에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 7에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
어떤 실시 형태에 있어서, 상기 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 15에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 서열 번호 9에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 또는 상기 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 염기 서열에 기초하여, 당해 기술 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 제90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다.
4-2. 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 복합체 중의 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터에는, 상기 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 상기 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
바람직한 발현 벡터로서는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
보다 바람직한 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 발현 벡터에는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 복합체 중의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터에는, 상기 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 상기 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
바람직한 발현 벡터로서는, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
보다 바람직한 발현 벡터로서는, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
이들 발현 벡터는, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 각종 숙주 세포 중에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 발현 벡터로서는, 예를 들어 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 사용할 수 있다.
이들 발현 벡터는, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 항Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 중쇄 프래그먼트 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 숙주 세포 중에서 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 Fab 프래그먼트를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 숙주 세포가 에세리키아속균인 경우 예를 들어 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 중에서의 발현용 프로모터로서는, 예를 들어 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있고, 바실러스속균에서의 발현용 프로모터로서는 SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 포유 동물 세포 등의 진핵 세포인 경우, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다.
이들 발현 벡터는 숙주 세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 더 포함할 수 있다. 한편, 숙주로서 효모, 동물 세포 또는 곤충 세포를 사용하는 경우, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 항Fab 프래그먼트를 코딩하는 발현 벡터는 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 중쇄 프래그먼트 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 목적에 따라서 통상 사용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
4-3. 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포
항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다.
(a) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
또한, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다.
(a) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
형질 전환하는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어 Fab 프래그먼트를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 다양한 세포(예를 들어, 세균(에세리키아속균, 바실러스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물 세포 또는 곤충 세포(예를 들어, Sf9 등), 포유 동물 세포주(예를 들어, CHOK1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포 등의 배양 세포)가 예시된다. 형질 전환 자체는, 예를 들어 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다.
4-4. 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법
상기 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법, 바람직하게는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 또는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함한다.
항인간 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법에 있어서, 형질 전환된 숙주 세포는 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 혹은 유기 질소원과 같은 영양원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 혹은 유기 질소원으로서는, 예를 들어 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 카제인, 고기 엑기스, 콩깻묵, 감자 추출액 등이 예시된다. 또한 원한다면 기타 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)를 포함하고 있어도 된다.
형질 전환된 숙주 세포의 배양 자체는 공지된 방법에 의해 행해진다. 배양 조건, 예를 들어 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은 적절히 선택된다. 예를 들어 숙주가 동물 세포인 경우, 배지로서는 약 5 내지 20％의 태아 소혈청을 포함하는 MEM 배지(Science; 1952; 122: 501), DMEM 배지(Virology; 1959; 8: 396-397), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-524), 199 배지(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73: 1-8) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하고, 배양은 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 336시간 행해지고, 필요에 따라서 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 예를 들어 태아 소혈청을 포함하는 그레이스(Grace's) 배지(PNAS; 1985; 82: 8404-8408) 등을 들 수 있고, 그의 pH는 약 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 40℃에서 15 내지 100시간 행해지고, 필요에 따라서 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들어 상기 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 바람직하게는 pH가 5 내지 8인 배지이다. 숙주가 이.콜라이인 경우, 바람직한 배지로서 LB 배지, M9 배지(밀러(Miller) 등, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은 필요에 따라서 통기, 교반하면서 통상 14 내지 43℃, 약 3 내지 24시간 행할 수 있다. 숙주가 바실러스속균인 경우, 필요에 따라서 통기, 교반을 하면서 통상 30 내지 40℃, 약 16 내지 96시간 행할 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 배지로서 예를 들어 버크홀더(Burkholder) 최소 배지(PNAS; 1980; 77: 4505-4508)를 들 수 있고, pH는 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 35℃에서 약 14 내지 144시간 행해지고, 필요에 따라서 통기나 교반을 행할 수도 있다.
상기 항인간 항체 Fab 프래그먼트의 제조 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정에 더하여, 발현시킨 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 회수, 바람직하게는 단리, 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리, 정제 방법으로서는, 예를 들어 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
4-5. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 제조 방법
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 제조 방법은, 상기 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 표지부와 공유 결합시키는 공정을 포함한다. 당해 복합체를 제조하는 방법은 또한, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트와 표지부를 공유 결합시키는 공정을 포함하고 있어도 된다. 당해 복합체를 제조하는 방법은 또한, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 발현시킨 당해 Fab 프래그먼트를 회수하는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트와 표지부를 공유 결합시키는 공정을 포함하고 있어도 된다. 사용되는 링커, 배위자, 또는 형광 색소 등은 「1. 의약 조성물」의 항에 기재된 것을 사용할 수 있다.
어떤 양태로서는, 당해 복합체를 제조하는 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트를 배위자와 링커를 개재하여 결합시키는 공정을 포함하는 방법이다. 어떤 양태로서는, 당해 복합체를 제조하는 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 발현시킨 당해 Fab 프래그먼트를 회수하는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트를 배위자와 링커를 개재하여 결합시키는 공정을 포함하는 방법이다.
어떤 양태로서는, 당해 복합체를 제조하는 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트를 i) 배위자와 링커를 개재하여 결합시키거나 또는 ii) 배위자와 직접 공유 결합시키는 공정을 포함하는 방법이다. 어떤 양태로서는, 당해 복합체를 제조하는 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 발현시킨 당해 Fab 프래그먼트를 회수하는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트를 i) 배위자와 링커를 개재하여 결합시키거나 또는 ii) 배위자와 직접 공유 결합시키는 공정을 포함하는 방법이다.
어떤 양태로서는, 당해 복합체를 제조하는 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트를 i) 형광 색소와 링커를 개재하여 결합시키거나 또는 ii) 형광 색소와 직접 공유 결합시키는 공정을 포함하는 방법이다. 어떤 양태로서는, 당해 복합체를 제조하는 방법은, 형질 전환된 상기 숙주 세포를 배양하고, 항인간 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 발현시킨 당해 Fab 프래그먼트를 회수하는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트를 i) 형광 색소와 링커를 개재하여 결합시키거나 또는 ii) 형광 색소와 직접 공유 결합시키는 공정을 포함하는 방법이다.
본 발명에 대하여 전반적으로 기재하였지만, 더욱 이해를 얻기 위해 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공한다. 그러나, 이들은 예시를 목적으로 하는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
실험 1-1: 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 제작
마우스 유래의 항인간 CEACAM5 항체인 T84.66을 문헌(Protein Eng. Des. Sel.; 2004; 17: 481-489)에 기재된 방법을 참고로 하여 인간화한 후, 문헌(Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics; 2014; 82: 1624-1635)에 준하여 구축한 인간화 항체의 분자 모델을 사용하여, 표지부를 결합시켜도 친화성이 감약되지 않는 것이 기대되는 가변 영역을 갖는 항체를 설계하였다.
상기 항체의 중쇄 프래그먼트 유전자(서열 번호 1)의 5'측에 시그널 서열(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(서열 번호 17))을 코딩하는 유전자를 연결시키고, 이 중쇄 프래그먼트 유전자를 GS 벡터 pEE6.4(Lonza사)에 삽입하였다. 또한, 항체의 경쇄 유전자(서열 번호 3)의 5'측에 시그널 서열(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(서열 번호 18))을 코딩하는 유전자를 연결시키고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4(Lonza사)에 삽입하였다. 항체의 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 pEE 벡터를 NotI와 PvuI로 제한 효소 절단하고, 라이게이션용 키트 TAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara사)을 사용하여 라이게이션을 행하여, 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 구축하였다.
전술한 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 사용하여, 일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 항체 발현을 행하였다. 일과성 발현에 대하여는, Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scintific사)에서 약 300만개/mL로 배양된 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific사)에 대하여, 전술한 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 트랜스펙션하고, 5 내지 7일간 배양하였다. 배양 상청을 KappaSelect(GE 헬스케어·재팬사)를 사용하여 정제하고, Fab 프래그먼트를 얻었다. 항상적 발현에 대하여는, CHOK1SV 세포(Lonza사)에 PvuI로 직쇄로 한 전술한 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 Gene Pulser(Bio-Rad사)를 사용한 일렉트로포레이션법으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 다음날에 메티오닌술폭시이민을 첨가하고, 5 내지 7일간 배양하였다. 메틸셀룰로오스 함유 반고형 배지에 세포를 파종하고, 콜로니 형성 후에 ClonePix FL(Molecular Devices사)을 사용하여 Fab 프래그먼트의 발현량이 많은 세포를 취득하였다. 당해 세포의 배양 상청을 Capto L(GE 헬스케어·재팬사), Q Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어·재팬사) 및 BioPro S75(와이엠씨사)를 사용하여 정제하고, Fab 프래그먼트를 얻었다.
제작한 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(PB009-1이라고 칭한다.)의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에, PB009-1의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. PB009-1의 중쇄 가변 영역은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35, 50부터 66, 99부터 110까지의 아미노산 서열을 포함한다. PB009-1의 경쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 38, 54부터 60, 93부터 101까지의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 가변 영역 및 CDR 서열은 카바트(Kabat) 번호 부여에 따라서 결정하였다(카바트 등; 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).
실험 1-2: 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 킬레이트제 표지화
킬레이트제인 DFO의 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 PB009-1에 대한 결합에는, p-SCN-Bn-DFO(p-이소티오시아노페닐아미노티오카르보닐기 치환 DFO)(Macrocyclics사)를 사용하였다. 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)로 1mg/mL로 조제한 Fab 프래그먼트 용액에, 1/5양의 0.1M 탄산나트륨 용액(pH 9.0)을 첨가하였다. 이것에 최종 농도 1mg/mL가 되도록 p-SCN-Bn-DFO를 첨가하고, 37℃에서 1시간 반 반응시켰다. 반응 후, 아미콘울트라 3K-0.5mL 원심식 필터(머크 밀리포아사)를 사용하여, DFO가 링커(-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-)를 개재하여 결합한 DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체(PB009-2라고 칭한다.)를 정제하였다.
PB009-2에 대하여, 질량 분석으로 DFO로 구성되는 배위자의 결합수를 확인하였다. PB009-2를, MassPREP Micro Desalting Column(Waters사)을 사용하여 탈염하고, SYNAPT G2 질량 분석계(Waters사)를 사용하여 측정을 실시하였다. 그 결과, 하나의 PB009-1에 DFO로 구성되는 배위자가 적어도 3개부터 10개 결합한 분자가 확인되었다.
실험 1-3: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 pH의 영향의 검토(다량체 생성 및 산성측 전하 유사체 생성에의 영향)
PB009-2를 포함하는 액제에 대하여, pH가 PB009-2의 안정화에 미치는 영향을 평가하였다. 본 시험에서는, PB009-2를 포함하는 액제에 대하여, PB009-2의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제 및 비이온성 계면 활성제를 배합하고, 표 1에 나타내는 시료 A-1 내지 A-6을 조제하였다. 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00013
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 정치 상태에 있어서의 열 안정성 시험을 행하였다. 열 안정성 시험에서는, 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 PB009-2의 안정성을, 크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)에 의해 측정되는 다량체량, 및 화상화 모세관 등전점 전기 영동법(icIEF법)에 의해 측정되는 산성측 전하 유사체량에 기초하여 평가하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
[크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)]
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 G3000SWXL(TOSOH사)을 접속하고, 20mmol/L 인산/400mmol/L 염화나트륨 pH 7.0의 조성을 갖는 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 시료는 PB009-2 환산으로 50μg이 되는 주입량(예: 5mg/mL의 경우에는 10μL)으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 시료 온도는 5℃로 설정하고, 검출은 UV280nm에서 실시하였다.
[화상화 모세관 등전점 전기 영동법(icIEF법)]
icIEF 측정은, iCE3 시스템에 cIEF Cartridge(Protein Simple사)를 접속하고, 측정을 행하였다. 요소, 메틸셀룰로오스, 파말라이트(Pharmalyte) 3-10, pI 마커 5.12, pI 마커 9.77을 포함하는 샘플 매트릭스 188μL와, 초순수로 PB009-2 농도 5mg/mL로 희석한 샘플 12μL를 혼화하고, 측정 시료로 하였다. 프리포커싱(prefocusing)은 1500V에서 1분, 포커싱은 3000V에서 6분 실시하였다.
SE-HPLC 측정 후, 검출된 다량체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 다량체의 양(％)을 구하였다. 다량체량(％)에 대하여는, SE-HPLC법으로 검출된 다량체 피크의 총 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정하였다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체(다량체화되지 않은 PB009-2)의 피크를 가리킨다.
icIEF법으로 검출된 산성측 전하 유사체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 산성측 전하 유사체의 양(％)을 구하였다. 산성측 전하 유사체량(％)에 대하여는, icIEF법으로 검출된 산성측 전하 유사체 피크의 총 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정된다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체(유연화되지 않은 PB009-2)의 피크를 가리킨다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법 및 icIEF법에 의한 평가 결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과, 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 SE-HPLC 다량체량(％)은 pH가 낮을수록 증가 경향이 있고, pH 7.0 부근에서 최소가 되었다. 또한, 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 산성측 전하 유사체량(％)은 pH가 낮을수록 감소 경향이 되었다. 이상의 결과를 종합적으로 판단하여, 안정성의 관점에서, PB009-2를 포함하는 액제의 pH는 7.0 부근이 최적이라고 확인되었다.
Figure pct00014
실험 1-4: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 안정화제, 비이온성 계면 활성제의 영향의 검토(다량체 생성 및 산성측 전하 유사체 생성에 대한 영향)
PB009-2를 포함하는 액제에 대하여, 각종 안정화제 또는 비이온성 계면 활성제가 PB009-2의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다. 본 시험에서는, PB009-2를 포함하는 액제에 대하여, PB009-2의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제 및 첨가제를 배합하고, 표 3에 나타내는 시료 B-1 내지 B-10을 조제하였다. 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00015
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 정치 상태에 있어서의 열 안정성 시험을 행하였다. 열 안정성 시험에서는, 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 PB009-2의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량, 및 icIEF법에 의해 측정되는 산성측 전하 유사체량에 기초하여 평가하였다. SE-HPLC법의 실험법은 이하와 같다.
[크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)]
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 AdvanceBio SEC 300A 칼럼(Agilent사)을 접속하고, 20mmol/L 인산/400mmol/L 염화나트륨 pH 7.0의 조성을 갖는 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 시료는 PB009-2 환산으로 50μg이 되는 주입량(예: 5mg/mL의 경우에는 10μL)으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 시료 온도는 5℃로 설정하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
SE-HPLC 측정 후, 검출된 다량체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 다량체의 양(％)을 구하였다. 다량체량(％)에 대하여는, SE-HPLC법으로 검출된 다량체 피크의 총 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정하였다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체(다량체화되지 않은 PB009-2)의 피크를 가리킨다.
icIEF법의 분석 조건은 실험 1-3과 동일하다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법 및 icIEF법에 의한 평가 결과를 표 4에 나타낸다. 먼저, 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 SE-HPLC 다량체량(％)은, 히스티딘, 수크로오스 및 글리세린 첨가 시료에 있어서 증가 억제 경향이 있었다. 또한, 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 산성측 전하 유사체량(％)은, 히스티딘, 아스파르트산 첨가 시료에 있어서 증가가 확인되었다. 이상의 결과를 종합적으로 판단하여, 안정성의 관점에서, 수크로오스 또는 글리세린이 PB009-2를 포함하는 액제의 안정화제로서 바람직한 것이 확인되었다.
Figure pct00016
실험 1-5: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 계면 활성제의 영향의 검토(불용성 미립자 생성에 대한 영향)
PB009-2를 10mg/mL 포함하고, 20mmol/L 시트르산, pH 7.0으로 한 처방의 액제에 대하여, 계면 활성제인 폴리소르베이트 80을 0 내지 0.6w/v％의 범위로 함유하는 시료를 조제하였다(시료 No.C-1 내지 C-7: 표 5 참조). 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00017
각 시료에 대하여, 진탕 후 및 동결 융해 후에 있어서의 불용성 미립자수를, 광 차폐 입자 계수법을 사용하여 측정하였다. 진탕 시험은 시료를 150rpm으로 24시간 진탕시킴으로써 행하였다. 또한, 동결 융해 시험은 시료를 -80℃에서 4시간 이상에 걸쳐 동결시키고, 그 후 5℃에서 4시간 이상에 걸쳐 융해시키는 프로세스를 계 3회 실시함으로써 행하였다. 광 차폐 입자 계수법의 분석 조건은 이하와 같다.
[광 차폐 입자 계수법]
샘플 0.2mL를 HIAC 시스템(Pacific Scientific사)에 주입하고, 시료 1mL 중에 포함되는 입경 1.2㎛ 이상의 불용성 미립자의 입자수의 측정을 실시하였다.
본 실험에서 얻어진 광 차폐 입자 계수법에 의한 평가 결과를 표 6에 나타낸다. 진탕 및 동결 융해에 의해 불용성 미립자수는 증가하지만, 폴리소르베이트 80을 0.02w/v％ 이상의 농도로 첨가함으로써 그 증가가 억제되는 것이 나타났다. 그리고, PB009-2를 포함하는 액제에 0.05w/v％의 폴리소르베이트 80을 첨가하는 것이 불용성 미립자의 생성을 억제하는 관점에서 바람직한 것이 확인되었다.
Figure pct00018
실험 1-6: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화를 위한 최적 pH 선정
PB009-2를 10mg/mL 포함하고, 20mmol/L 시트르산 또는 20mmol/L HEPES(2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진]에탄술폰산)를 완충제로 하고, 10w/v％ 수크로오스를 안정화제로서 및 0.05w/v％ 폴리소르베이트 80을 비이온성 계면 활성제로서 포함하는 처방(시료 No.D-1 내지 D-8)에 대하여, pH 6.1 내지 7.9의 범위에서 시료를 조제하였다. 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다. 그 후, 각 시료에 대하여 정치 상태에서의 25℃ 1주일 보관 후의 PB009-2의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량에 기초하여 평가하였다. SE-HPLC법은 실험 1-4와 마찬가지로 행하였다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법에 의한 평가 결과를 표 7에 나타낸다. 25℃ 1주일 보관 후에 있어서의 SE-HPLC 다량체량(％)은 저pH 및 고pH 시료 중 어느 쪽에 있어서도 증가 경향이 있고, pH 6.7 부근에서 가장 작아졌다. 따라서, pH 6.7이 최적 pH이며, 최적 pH를 적절하게 유지하는 완충제로서 20mmol/L 시트르산이 특히 바람직한 것이 판명되었다.
Figure pct00019
실험 1-7: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화를 위한 안정화제 농도의 최적화 검토
PB009-2를 10mg/mL 포함하고, 20mmol/L 시트르산, 0.05w/v％ 폴리소르베이트 80, pH 6.7로 한 처방의 액제(시료 No.E-1 내지 E-5)에 대하여, 수크로오스 또는 글리세린을 0 내지 20w/v％의 범위로 함유하는 시료를 조제하였다. 시료는 각 처방 조성으로 조제한 후, 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다. 또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다. 그 후, 각 시료에 대하여 정치 상태에서의 25℃ 1주일 보관 후의 PB009-2의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량에 기초하여 평가하였다. SE-HPLC법은 실험 1-4와 마찬가지로 행하였다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법에 의한 평가 결과를 표 8에 나타낸다. 그 결과, 25℃ 1주일 보관 후에서는, 수크로오스 또는 글리세린의 첨가 농도의 증가에 수반하여 SE-HPLC 다량체량(％)의 생성이 억제되는 것이 확인되었다. 또한, 수크로오스와 글리세린에서는 안정성에 미치는 영향에 차는 확인되지 않았다. 이상의 결과를 근거로 하면, 침투압비의 관점에서 10w/v％ 수크로오스가 PB009-2를 포함하는 액제를 위한 의약품 첨가제로서 특히 바람직한 것이 판명되었다.
Figure pct00020
실험 1-8: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 안정화 용액 제제에 있어서의 89 Zr 표지화의 검토
PB009-2를 10mg/mL 포함하는 하기 표 9에 기재된 처방의 액제에 있어서, -80℃ 보관 후에 있어서의 89Zr에 의한 표지 효율을 평가하였다.
89Zr은 1M 옥살산 수용액에 용해시킨 89Zr-옥살레이트로서 국립 대학 법인 오카야마 대학 자연 생명 과학 연구 지원 센터 광·방사선 정보 해석 부문 시카타 시설에서 제조한 것을 사용하고, 40μL의 89Zr-옥살레이트를 20μL의 2M 탄산나트륨 수용액으로 중화하고, 190μL의 초순수로 희석하였다. 계속해서, 0.05w/v％ 폴리소르베이트 80, 10w/v％ 수크로오스 또는 30w/v％ 글리세린 및 20mmol/L 시트르산을 포함하는 PB009-2(10mg/mL) 액제를 150μL 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 얻어진 반응 혼합물은, 아미콘울트라-0.5mL 원심식 필터(Merck Millipore사)를 사용하여 정제함으로써 목적으로 하는 PB009-2의 89Zr 표지체를 얻었다. 이 89Zr-DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 PB009-3이라고 칭한다. 정제 전후의 PB009-3 용액을 TLC(thin-layer chromatography) 및 SE-HPLC법에 의해 측정함으로써, 89Zr의 반응률을 확인하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
TLC는 TLC 알루미늄 시트(Merck사, 1-05560-0001)에 샘플을 소량 도포하고, 전개액으로서 0.1M EDTA 용액(pH 7.0)을 사용하여 실시하였다. 89Zr의 반응률은 이하와 같이 산출하였다.
(원점 부근의 방사선량 a)/(전체의 방사선량 b)×100
[크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)]
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 G3000SWXL(TOSOH사)을 접속하고, 20mmol/L 인산/150mmol/L 염화나트륨/5％ 아세토니트릴 pH 7.0의 조성을 갖는 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 칼럼 온도는 30℃, 검출은 UV 280nm 및 RI에서 실시하였다.
시험의 결과, 검토한 어느 쪽 처방도 반응률(정제 전)은 90％ 전후로 높은 값을 나타내고(표 9), UV 검출기 및 RI 검출기에서 확인되는 PB009-3의 피크와 UV 검출기에서 확인되는 PB009-2의 피크를 비교하여, 각각의 유지 시간이 동등하였던 점에서 DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체가 89Zr에 의해 표지되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 수크로오스 처방도 글리세린 처방도, 89Zr 표지 반응을 저해할 우려는 작은 것이 나타났다.
Figure pct00021
실험 1-9: DFO-항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 제제에 있어서의 보관 시의 안정성의 검토
PB009-2를 포함하는 액제에 대하여, PB009-2의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 시트르산, 수크로오스 및 폴리소르베이트 80을 배합하고, 표 10에 나타내는 시료 F-1을 조제하였다. 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 또한, 당해 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00022
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 정치 상태에 있어서의 보관 안정성 시험을 행하였다. 보관 안정성 시험은, -20℃ 또는 5℃에서 1 내지 6개월간 보관 후에 있어서의 PB009-2의 안정성을 SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량에 기초하여 평가하였다. SE-HPLC법은 실험 1-4와 마찬가지로 행하였다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법에 의한 평가 결과를 표 11에 나타낸다. 그 결과, -20℃에서의 보관에 있어서, 적어도 6개월간의 보관 안정성에 문제가 없는 것이 확인되었다. 5℃에서의 보관에 있어서는, 1개월간까지의 보관 안정성이 동일한 시기의 -20℃에서의 보관 안정성과 동등한 것이 확인되었다.
Figure pct00023
실험 2-1: 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 제작
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab라고 칭하는 2종류의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 제작하였다. P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 구체적으로는 마우스 유래의 항인간 암 특이적 MUC1 항체인 1B2 항체를 문헌(Front Biosci.; 2008 Jan 1; 13: 1619-33)에 기재된 방법을 참고로 하여 인간화한 후, 문헌(Proteins; 2014 Aug; 82(8): 1624-35)에 준하여 구축한 인간화 항체의 분자 모델을 사용하여, 친화성의 향상 및 표지부를 결합시켜도 친화성이 감약되지 않는 것이 기대되는 서열을 설계하였다.
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 각 중쇄 프래그먼트 유전자(각각 서열 번호 5 및 서열 번호 7)의 5'측에 시그널 서열(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(서열 번호 17))을 코딩하는 유전자를 연결시켜 생기는 중쇄 프래그먼트 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE6.4(Lonza사)를 제작하였다. 또한, P10-1 Fab 및 P10-2 Fab 공통의 경쇄 유전자(서열 번호 9)의 5'측에 시그널 서열(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(서열 번호 18))을 코딩하는 유전자를 연결시켜 생기는 경쇄 유전자가 삽입된 GS 벡터 pEE12.4(Lonza사)를 제작하였다.
일과성 발현의 방법으로 Fab 프래그먼트의 발현을 행하였다. Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사)에서 약 250만개/mL로 배양된 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific사)에 대하여, 전술한 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 GS 벡터를 ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 트랜스펙션하고, 8일간 배양하였다. 발현시킨 후, 배양 상청을 KappaSelect(GE Healthcare사)를 사용하여 정제하고, 각 Fab 프래그먼트를 얻었다.
P10-1 Fab의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 5에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 6에 각각 나타낸다. P10-1 Fab의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 11에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 12에 각각 나타낸다.
P10-2 Fab의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 7에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 8에 각각 나타낸다. P10-2 Fab의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 13에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 14에 각각 나타낸다.
P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 경쇄는 공통이며, 그의 염기 서열은 서열 번호 9에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 10에 각각 나타낸다. P10-1 Fab 및 P10-2 Fab의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 15에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 16에 각각 나타낸다.
정제한 P10-2 Fab의 아미노산 수식을 분석한 결과, 정제 항체의 대부분에 있어서, 중쇄 N 말단의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식되어 있는 것이 시사되었다.
실험 2-2: 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 킬레이트제 표지화
킬레이트제인 DFO의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 P10-2에 대한 결합에는, p-SCN-Bn-DFO(p-이소티오시아노페닐아미노티오카르보닐기 치환 DFO)(Macrocyclics사)를 사용하였다. 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)로 12.5mg/mL로 조정한 Fab 프래그먼트 용액에, 10mmol/L가 되도록 100mmol/L 탄산나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.0으로 조절하였다. 이것에 최종 농도 1mmol/L가 되도록 p-SCN-Bn-DFO를 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. p-SCN-Bn-DFO는 이소티오시아네이트기를 갖고 있으므로, Fab 프래그먼트의 Lys와 빠르게 반응한다. 이것을 아미콘울트라 10K-0.5mL 원심식 필터로 회수하고, DFO가 링커(-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-)를 개재하여 결합한 DFO-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체(PB010-3이라고 칭한다.)를 정제하였다.
실험 2-3: DFO-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 pH의 영향의 검토(다량체 생성 및 불용성 미립자 생성에 대한 영향)
PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, pH가 PB010-3의 안정화에 미치는 영향을 평가하였다. 본 시험에서는, PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, PB010-3의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 배합하고, 표 12에 나타내는 시료 G-1 내지 G-6을 조제하였다. pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00024
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 정치 상태에 있어서의 열 안정성 시험을 행하였다. 열 안정성 시험은 40℃ 1주일 보관 후에 있어서의 PB010-3의 안정성을, 크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)에 의해 측정되는 다량체량, 및 광 차폐 입자 계수법에 의해 측정되는 불용성 미립자수에 기초하여 평가하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
[SE-HPLC법]
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 BioSep SEC s3000(Phenomenex사)을 접속하고, PBS(pH 7.4)를 이동상으로서 사용하고, 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 시료는 PB010-3 환산으로 20μg이 되는 주입량(예: 2mg/mL의 경우에는 10μL)으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 시료 온도는 10℃로 설정하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
[광 차폐 입자 계수법]
샘플 0.2mL를 HIAC 시스템(Pacific Scientific사)에 주입하고, 1.2㎛ 이상의 불용성 미립자수의 측정을 실시하였다.
SE-HPLC법으로 검출된 다량체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 다량체의 양(％)을 구하였다. 다량체량에 대하여는, SE-HPLC법으로 검출된 다량체 피크의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정된다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체(다량체화되지 않은 PB010-3)의 피크를 가리킨다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법, 광 차폐 입자 계수법에 의한 평가 결과를 표 13에 나타낸다. 그 결과, 40℃ 1주일 보관 후에 있어서의 SE-HPLC 다량체량(％)은 pH가 높을수록 증가 경향이 되었다. 또한, 40℃ 1주일 보관 후에 있어서의 1.2㎛ 이상의 불용성 미립자수는 pH가 낮을수록 증가 경향이 되었다. 이상의 결과를 종합적으로 판단하여, 안정성의 관점에서, PB010-3을 포함하는 액제의 pH는 6.5 내지 7.0 부근이 최적이라고 확인되었다.
Figure pct00025
실험 2-4: DFO-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 안정화제, 비이온성 계면 활성제의 영향의 검토(다량체 생성 및 불용성 미립자 생성에 대한 영향)
PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, 각종 안정화제가 PB010-3의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다. 본 검토에서는, PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, PB010-3의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 배합하고, 표 14에 나타내는 시료 H-1 내지 H-4를 조제하였다. 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00026
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 보관 시험 및 진탕 시험을 행하였다. 보관 시험은 각 시료를 5℃ 및 -20℃ 조건 하에서 정치 보관함으로써 행하였다. 또한, 진탕 시험은 시료를 150rpm으로 24시간 진탕시킴으로써 행하였다. 각 시험 전후에 있어서의 PB010-3의 안정성을, 크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)에 의해 측정되는 다량체량, 및 광 차폐 입자 계수법에 의해 측정되는 불용성 미립자수에 기초하여 평가하였다.
분석 조건은 실험 2-3과 동일하다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법, 광 차폐 입자 계수법에 의한 평가 결과를 표 15, 표 16에 나타낸다. 그 결과, 폴리소르베이트 80을 첨가하지 않은 처방, 및 폴리소르베이트 80에 더하여 수크로오스 또는 글리세린을 첨가한 처방에서는, 5℃ 또는 -20℃에서 3개월 보관한 경우에도 다량체량의 증가 억제 효과가 확인되었다. 한편, 폴리소르베이트 80을 첨가하지 않은 처방에서는, 진탕 시험 후에 있어서 불용성 미립자수의 현저한 증가가 확인되었다. 이상의 결과를 근거로 하여, 폴리소르베이트 80에 더하여 수크로오스 또는 글리세린을 첨가한 처방이 바람직하고, 나아가 침투압비의 관점에서 10w/v％ 수크로오스가 PB010-3을 포함하는 액제를 위한 의약품 첨가제로서 특히 바람직한 것이 판명되었다.
Figure pct00027
Figure pct00028
실험 2-5: DFO-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 계면 활성제의 영향의 검토(불용성 미립자 생성에 대한 영향)
PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, 계면 활성제가 PB010-3의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다. 본 시험에서는 PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, PB010-3의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 배합하고, pH를 조정하여 표 17에 나타내는 시료 I-1 내지 I-4를 조제하였다. 또한, pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00029
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 진탕 시험 및 동결 융해 시험을 행하였다. 진탕 시험은 시료를 150rpm으로 24시간 진탕시켜 행하였다. 동결 융해 시험은 시료를 -80℃에서 4시간 이상에 걸쳐 동결하고, 그 후 5℃에서 4시간 이상에 걸쳐 융해한다는 프로세스를 계 3회 실시하여 행하였다. 그리고, 각 시험 전후에 있어서의 PB010-3의 안정성을, 광 차폐 입자 계수법에 의해 측정되는 불용성 미립자수에 기초하여 평가하였다. 분석 조건은 실험 2-3과 동일하다.
본 실험에서 얻어진 광 차폐 입자 계수법에 의한 평가 결과를 표 18에 나타낸다. 그 결과, 폴리소르베이트 80은 0.02w/v％ 이상의 농도로 함으로써, 진탕 시 및 동결 융해 시의 불용성 미립자수 증가 억제 효과가 있는 것이 확인되었다.
Figure pct00030
실험 2-6: DFO-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 안정화 용액 제제에 있어서의 89 Zr 표지화의 검토
PB010-3을 10mg/mL 포함하는 하기 표 19에 기재된 처방의 액제에 있어서, -80℃ 보관 후에 있어서의 89Zr에 의한 표지 효율을 평가하였다.
89Zr은 1M 옥살산 수용액에 용해시킨 89Zr-옥살레이트로서 국립 대학 법인 오카야마 대학 자연 생명 과학 연구 지원센터 광·방사선 정보 해석 부문 시카타 시설에서 제조한 것을 사용하고, 40μL의 89Zr-옥살레이트를 20μL의 2M 탄산나트륨 수용액으로 중화하고, 190μL의 초순수로 희석하였다. 계속해서, 0.05w/v％ 폴리소르베이트 80, 10w/v％ 수크로오스 또는 30w/v％ 글리세린, 및 20mmol/L 시트르산을 포함하는 PB010-3(10mg/mL) 액제를 150μL 첨가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 얻어진 반응 혼합물을, 아미콘울트라-0.5mL 원심식 필터(Merck Millipore사)를 사용하여 정제함으로써 목적으로 하는 PB010-3의 89Zr 표지체를 얻었다. 이 89Zr 표지한 P10-2 Fab DFO(PB010-3)를 PB010-4라고 칭한다. 정제 전후의 PB010-4 용액을 TLC(thin-layer chromatography) 및 SE-HPLC법에 의해 측정함으로써, 89Zr의 반응률을 확인하였다. TLC및 SE-HPLC법의 분석 조건은 실험 1-8과 동일하다.
시험의 결과, 검토한 어느 쪽 처방도 반응률(정제 전)은 90％ 전후로 높은 값을 나타내고(표 19), UV 검출기 및 RI 검출기에서 확인되는 PB010-4의 피크와 UV 검출기에서 확인되는 PB010-3의 피크를 비교하여, 각각의 유지 시간이 동등하였던 점에서 PB010-3이 89Zr에 의해 표지되어 있는 것을 확인하였다. 검토를 실시한 처방은, 어느 쪽도 89Zr 표지 반응을 저해할 우려는 작은 것이 나타났다.
Figure pct00031
실험 2-7: DFO-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 제제에 있어서의 보관 시의 안정성의 검토
PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, 냉장 및 냉동 보관 시의 안정성을 평가하였다. 본 시험에서는 PB010-3을 포함하는 액제에 대하여, PB010-3의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 배합하고, 표 20에 기초하여 시료 J-1을 조제하였다. pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00032
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료를 5℃ 및 -20℃ 조건 하에서 정치 보관하였다. 보관 후의 PB010-3의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량, 역상 크로마토그래피법(RP-HPLC법)에 의해 측정되는 유리 Fab체량(％), 및 광 차폐 입자 계수법에 의해 측정되는 불용성 미립자수에 기초하여 평가하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
[SE-HPLC법]
실험 2-3과 동일 조건에서 실시하였다.
[RP-HPLC법]
RP-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 Intrada WP-RP(Imtakt사)를 접속하고, 측정을 행하였다. 이동상 A 라인에 0.1％ TFA, 이동상 B 라인에 0.1％ TFA/아세토니트릴을 접속하고, 하기 표에 나타내는 비율로 1.0mL/분의 유량으로 흘렸다. 시료는 PB010-3 환산으로 20μg이 되는 주입량(예: 1mg/mL의 경우에는 20μL)으로 하고, 표 21의 RP-HPLC 구배 프로그램을 적용하였다. 칼럼 온도는 60℃, 시료 온도는 10℃로 설정하고, 검출은 UV 214nm에서 실시하였다.
Figure pct00033
RP-HPLC법으로 검출된 다량체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 유리 Fab체량(％)을 구하였다. 유리 Fab체량에 대하여는, RP-HPLC법으로 검출된 유리 Fab 프래그먼트의 피크 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정된다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체의 피크를 가리킨다.
[광 차폐 입자 계수법]
실험 2-3과 동일 조건에서 실시하였다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법, RP-HPLC법, 광 차폐 입자 계수법에 의한 평가 결과를 표 22에 나타낸다. 그 결과, 3개월까지의 보관 안정성에 문제가 없는 것이 확인되었다.
Figure pct00034
실험 3-1: 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트의 형광 표지화
실험 2-1에서 조제한 P10-2 Fab에 대하여 형광 색소의 도입을 행하였다. 구체적으로는, 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)로 약 1mg/mL로 조정한 Fab 프래그먼트 용액에, 1/10양의 1M 인산수소이칼륨 용액(pH 9)을 첨가하여 pH 8.5로 조절하였다. 이것에 최종 농도 310.8μg/mL가 되도록 IRDye800CW NHS Ester(LI-COR Biosciences사)를 첨가하고, 실온 및 차광에서 2시간 교반하였다. IRDye800CW NHS Ester는 N-히드록시숙신이미드기를 갖고 있으므로, Fab 프래그먼트의 Lys와 빠르게 반응한다. 이것을 아미콘울트라 3K-0.5mL 원심식 필터(Merck Millipore사)로 회수하고, IRDye800CW-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체(PB010-2라고 칭한다.)를 정제하였다.
실험 3-2: IRDye800CW-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 pH의 영향
PB010-2를 포함하는 액제에 대하여, pH가 PB010-2의 안정화에 미치는 영향을 평가하였다. 본 시험에서는 PB010-2의 농도를 10mg/mL로 하고, 표 23에 기초하여 시료 K-1 내지 K-5를 조제하였다. pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00035
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 정치 상태에 있어서의 열 안정성 시험을 행하였다. 열 안정성 시험은, 40℃ 1주일 보관 후에 있어서의 PB010-2의 안정성을, 크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)에 의해 측정되는 다량체량, 및 마이크로플로 이미징법에 의해 측정되는 불용성 미립자수로부터 평가하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
[크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)]
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 G2000SWXL(TOSOH사)을 접속하고, 20mmol/L 인산/1000mmol/L 염화나트륨 pH 7.0의 조성을 갖는 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 시료는 PB010-2 환산으로 50μg이 되는 주입량(예: 5mg/mL의 경우에는 10μL)으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 시료 온도는 5℃로 설정하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
SE-HPLC법으로 검출된 다량체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 다량체량(％)을 구하였다. 다량체량에 대하여는, SE-HPLC법으로 검출된 다량체 피크의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정된다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체의 피크를 가리킨다.
[마이크로플로 이미징법]
마이크로플로 이미징 시스템(Protein Simple사)에 샘플 650μL를 주입하고, 시료 1mL 중에 포함되는 입경 1.2㎛ 이상의 불용성 미립자의 입자수의 측정을 실시하였다.
본 시험에서 얻어진 SE-HPLC법, 마이크로플로 이미징법에 의한 평가 결과를 표 24에 나타낸다. 그 결과, 40℃ 1주일 보관 후의 SE-HPLC 다량체는 pH가 높을수록 증가 경향이 되었다. 또한, 40℃ 1주일 보관 후에 있어서의 1.2㎛ 이상의 불용성 미립자수는 pH가 낮을수록 증가 경향이 되었다. 이상의 결과를 종합적으로 판단하여, pH 6.5 내지 7.5 부근이 최적 pH라고 확인할 수 있었다.
Figure pct00036
실험 3-3: IRDye800CW-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 안정화제, 또는 비이온성 계면 활성제의 영향
PB010-2를 포함하는 액제에 대하여, 각종 안정화제가 PB010-2의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다. 본 시험에서는 PB010-2를 포함하는 액제에 대하여, PB010-2의 최종 농도가 10mg/mL가 되도록 완충제 및 첨가제를 배합하고, 표 25에 기초하여 시료 L-1 내지 L-6을 조제하였다. pH는 염산 또는 수산화나트륨을 적량 첨가하여 조정하였다. 각 시료는 포어 크기 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다.
Figure pct00037
액제의 안정성을 평가하기 위해서, 각 시료의 진탕 시험, 동결 융해 시험, 열 안정성 시험 및 광 폭로 시험을 행하였다. 진탕 시험은 시료를 150rpm으로 24시간 진탕시켜 행하였다. 동결 융해 시험은 시료를 -80℃에서 4시간 이상에 걸쳐 동결하고, 그 후 5℃에서 4시간 이상에 걸쳐 융해시키는 프로세스를 계 3회 실시하여 행하였다. 열 안정성 시험은 시료를 40℃에서 2주일 보관하여 행하였다. 광 폭로 시험은 시료를 횡치 상태에서 보관하고, 백색 형광 램프를 사용하여 1000lx의 광을 96시간 조사함으로써 행하였다. 그리고, 각 시험 전후에 있어서의 PB010-2의 안정성을, 크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)에 의해 측정되는 다량체량, 역상 크로마토그래피법(RP-HPLC법)에 의해 측정되는 염료 항체 비율(Dye Antibody Ratio), 및 마이크로플로 이미징법에 의해 측정되는 불용성 미립자수에 기초하여 평가하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
[크기 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법)]
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 AdvanceBio SEC 300A(Agilent사)를 접속하고, 20mmol/L 인산/1000mmol/L 염화나트륨 pH 7.0의 조성을 갖는 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 시료는 PB010-2 환산으로 50μg이 되는 주입량(예: 5mg/mL의 경우에는 10μL)으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 시료 온도는 5℃로 설정하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
SE-HPLC법으로 검출된 다량체의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 다량체량(％)을 구하였다. 다량체량에 대하여는, SE-HPLC법으로 검출된 다량체 피크의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 규정된다. 여기서 메인 피크란, 활성 본체의 피크를 가리킨다.
[역상 크로마토그래피법(RP-HPLC법)]
RP-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 Intrada WP-RP(Imtakt사)를 접속하고, 측정을 행하였다. 이동상 A 라인에 0.1％ 트리플루오로아세트산/물, 이동상 B 라인에 0.1％ 트리플루오로아세트산/아세토니트릴을 접속하고, 1.0mL/min의 유속으로 흘렸다. 시료는 PB010-2 환산으로 10μg이 되는 주입량(예: 1mg/mL의 경우에는 10μL)으로 하고, 표 26의 RP-HPLC 구배 프로그램을 적용하였다. 분석 시간은 45분간, 검출은 UV 파장 280; 780nm에서 실시하였다. 칼럼 온도는 75℃, 시료 온도는 5℃로 설정하였다.
Figure pct00038
RP-HPLC법으로 검출된 UV 파장 780nm에 있어서의 피크의 총 면적, UV 파장280nm에 있어서의 피크의 총 면적, PB010-1의 흡광 계수(1.42mL/mg·cm-1), PB010-1의 분자량(47527.43) 및 IRDye800CW의 PBS 중에서의 몰 흡광 계수(240000mL/mmol·cm-1)를 사용하여, 이하의 계산식에 적용함으로써 염료 항체 비율를 구하였다.
Figure pct00039
[마이크로플로 이미징법]
마이크로플로 이미징 시스템(Protein Simple사)에 샘플 650μL를 주입하고, 시료 1mL 중에 포함되는 입경 1.0㎛ 이상의 불용성 미립자의 입자수의 측정을 실시하였다.
본 실험에서 얻어진 SE-HPLC법, RP-HPLC법 및 마이크로플로 이미징법에 의한 평가 결과를 표 27 내지 29에 나타낸다. 아르기닌 첨가 처방 및 수크로오스 첨가 처방에 있어서는, 40℃ 2주일 보관 후의 다량체량의 증가가 억제되는 경향이 확인되었다. 또한, 아르기닌 첨가 처방에서는, 40℃ 2주일 보관 후, 염료 항체 비율의 저하가 확인되었다. 또한, 염화나트륨 첨가 처방 및 첨가제 무첨가 처방에 있어서는, 동결 융해 후의 불용성 미립자수가 다른 처방과 비교하여 증가하는 경향이 확인되었다. 이상의 결과를 종합적으로 판단하여, 안정성의 관점에서, 수크로오스가 PB010-2를 포함하는 액제의 안정화제 및 등장화제로서 바람직한 것이 확인되었다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
실험 3-4: IRDye800CW-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화를 위한 최적 pH 선정
PB010-2를 포함하는 액제에 대하여, 20mmol/L 시트르산 또는 20mmol/L 인산을 완충제로 한 처방(시료 No.M-1 내지 M-10)에 대하여, pH 6.6 내지 7.4의 범위에서 시료를 조제하였다. 시료는 PB010-2 최종 농도가 10mg/mL이며, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다. 각 시료는 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다. 각 시료의 진탕 시험, 동결 융해 시험, 열 안정성 시험 및 광 폭로 시험 후의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량 및 RP-HPLC에 의해 측정되는 염료 항체 비율에 기초하여 평가하였다. 또한, SE-HPLC법 및 RP-HPLC법은 실험 3-3과 마찬가지로 하여 측정하였다.
결과를 표 30 내지 31에 나타낸다.
다량체량 및 염료 항체 비율의 관점에서는, pH가 낮을수록 안정(고pH에서는 열·광 스트레스에 의해 불안정)해졌다. 한편, pH 6.0에 근접할수록 용해도 저하에 의한 미립자 생성의 리스크가 있는 점에서, pH 6.8로 하는 것이 특히 바람직한 것이 판명되었다.
Figure pct00043
Figure pct00044
실험 3-5: IRDye800CW-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 안정화에 미치는 완충제 및 계면 활성제의 영향
PB010-2를 포함하고, 20mmol/L 시트르산(pH 6.8) 또는 20mmol/L 인산(pH 6.8), 280mmol/L 수크로오스를 첨가한 처방에, 계면 활성제인 폴리소르베이트 80을 0.05w/v％로 첨가한 시료와 첨가하지 않은 시료(시료 No.N-1 내지 N-4)를 조제하였다. PB010-2의 최종 농도는 10mg/mL로 하였다. 시료는 각 처방 조성으로 조제한 후, 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하여 조제하였다. 또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
시료를 -20℃ 혹은 5℃에서 1개월 보관하고, 또한 열 안정성 시험은 40℃에서 2주일 또는 25℃에서 1개월간, 정치 상태에서 보관하여 행하였다. 광 폭로 시험은 시료를 횡치 상태에서 보관하고, 백색 형광 램프를 사용하여 1000lx의 광을 96시간 조사함으로써 행하였다. 그리고, 각 시험 전후에 있어서의 PB010-2의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량, 마이크로플로 이미징법에 의해 측정되는 불용성 미립자수, 및 SE-HPLC법에 의해 측정되는 형광 강도, 효소 결합 면역흡착 검정(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)법에 의해 측정되는 항원 결합 활성에 기초하여 평가하였다. 또한, SE-HPLC법 및 마이크로플로 이미징법은 실험 3-3의 방법에 준하여 측정하였다. 형광 강도에 대하여는, 검출된 메인 피크의 형광 강도를 하기 식에 적용시킴으로써 평가하였다.
Figure pct00045
[ELISA법]
hMUC-1(PEPTIDE INSTITUTE사) 항원을 0.8nM 포함하는 인산 완충액을 어세이 플레이트에 첨가하여 2-8℃에서 18시간 처리한 후, 20％ Blocking One(나카라이테스크사) 및 0.05w/v％의 Tween-20을 포함하는 트리스 완충 생리 식염수(TBS)를 사용하여 항원을 고정하였다. PB010-2 용액을 0-100000ng/mL의 농도 범위에 있어서5％ Blocking One 및 0.05w/v％의 Tween-20을 포함하는 TBS로 단계 희석하고, 항원이 고정된 플레이트 상에 첨가하였다. 플레이트를 25℃ 60분 인큐베이트한 후, 4000배로 희석된 염소 항-인간 카파(goat anti-human Kappa)-HRP(Southern Biotech사)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 25℃ 60분 인큐베이트한 후, 워시를 3회 실시하였다. 플레이트에 100μL TMB+Substrate-Chromogen(Dako사)을 첨가한 후, 25℃ 20분 인큐베이트하고, 1mol/L 황산을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 그 후, Spectra Max 190(Molecular Devices사)을 사용하여 450nm의 UV 흡수를 평가함으로써, 결합 활성을 평가하였다. 또한, PB010-2 표준품의 활성을 100％로 하여, 상대 결합 활성으로서 산출하였다.
결과를 표 32 내지 35에 나타낸다.
폴리소르베이트 80을 첨가한 처방에 있어서, 열 안정성 시험 및 광 폭로 시험 후의 불용성 미립자의 증가가 억제된 점에서, 비이온성 계면 활성제로서 0.05w/v％ 폴리소르베이트 80을 사용하는 것이 특히 바람직한 것이 판명되었다. 또한, 시트르산을 첨가한 처방에서는, 인산을 첨가한 처방과 비교하여 40℃ 보관 후의 다량체 증가 경향이 작은 점에서, 완충제로서 시트르산을 사용하는 것이 특히 바람직한 것이 판명되었다. 또한, 어느 쪽 처방 및 보관 조건에 있어서도, 항원 결합 활성 및 형광 강도의 저하는 확인되지 않았다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
실험 3-6: IRDye800CW-항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 제제에 있어서의 보관 시의 안정성의 검토
20mmol/L 시트르산을 사용하여 pH 6.8로 조제한 처방 용액에, PB010-2 농도가 10mg/mL, 수크로오스 농도가 280mmol/L, 폴리소르베이트 80 농도가 0.05w/v％가 되도록 첨가한 표 36에 나타내는 처방을 조제하고, 0.22㎛의 필터로 무균 여과하고, 유리 바이알(3mL 용량)에 1.2mL씩 충전하였다. 시료는 동결 건조를 행하고, 고무 마개로 타전한 후, 알루미늄캡을 씌워 권체하였다. 그 후, 열 안정성 시험 후 또는 광 폭로 시험 후에 있어서의 PB010-2의 안정성을 평가하였다.
Figure pct00050
열 안정성 시험은 시료를 40℃에서 2주일, 정치 상태에서 보관함으로써 행하였다. 광 폭로 시험은 시료를 횡치 상태에서 보관하고, 백색 형광 램프를 사용하여 1000lx의 광을 96시간 조사함으로써 행하였다. 그리고, 각 시험 전후에 있어서의 PB010-2의 안정성을, SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체량 및 형광 강도와, RP-HPLC법에 의해 측정되는 염료 항체 비율에 기초하여 평가하였다. 또한, SE-HPLC법 및 RP-HPLC법은 실험 3-3에 준하여 측정하였다. 또한, 형광 강도의 평가는 실험 3-5와 마찬가지로 하여 측정하였다.
결과를 표 37 내지 39에 나타내는데, 상기 처방으로 함으로써, 40℃ 2주일 보관 후에 있어서도, 광 폭로 후에 있어서도, PB010-2가 안정적으로 유지되는 것이 나타났다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
<서열표 프리텍스트>
서열 번호 1: PB009-1 Fab 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 2: PB009-1 Fab 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열
서열 번호 3: PB009-1 Fab 경쇄를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 4: PB009-1 Fab 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 5: P10-1 Fab 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 6: P10-1 Fab 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열
서열 번호 7: P10-2 Fab 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 8: P10-2 Fab 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열
서열 번호 9: P10-1 Fab 및 P10-2 Fab 경쇄를 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 10: P10-1 Fab 및 P10-2 Fab 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 11: P10-1 Fab 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 12: P10-1 Fab 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 13: P10-2 Fab 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 14: P10-2 Fab 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 15: P10-1 Fab 및 P10-2 Fab 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열
서열 번호 16: P10-1 Fab 및 P10-2 Fab 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 17: PB009-1 Fab, P10-1 Fab 및 P10-2 Fab를 위한 중쇄 시그널 서열
서열 번호 18: PB009-1 Fab, P10-1 Fab 및 P10-2 Fab를 위한 경쇄 시그널 서열
서열 번호 19: MUC1의 세포 외 도메인의 탠덤 반복 서열
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Pharmaceutical composition comprising complex of labeling moiety and anti-human antibody Fab fragment <130> FA1535-19221 <150> JP 2018-191605 <151> 2018-10-10 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding PB009-1 Fab heavy chain fragment <220> <221> CDS <222> (1)..(678) <400> 1 gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192 Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 gac tga 678 Asp 225 <210> 2 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PB009-1 Fab heavy chain fragment <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp 225 <210> 3 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding PB009-1 Fab light chain <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 3 gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PB009-1 Fab light chain <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 5 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-1 Fab heavy chain fragment <400> 5 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgactga 669 <210> 6 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-1 Fab heavy chain fragment <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 <210> 7 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-2 Fab heavy chain fragment <400> 7 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgactga 669 <210> 8 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-2 Fab heavy chain fragment <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 <210> 9 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-1 and P10-2 Fab light chain <400> 9 gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60 atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300 tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 10 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-1 and P10-2 Fab light chain <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-1 Fab heavy chain variable region <400> 11 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-1 Fab heavy chain variable region <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-2 Fab heavy chain variable region <400> 13 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180 aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300 ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-2 Fab heavy chain variable region <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding P10-1 and P10-2 Fab light chain variable region <400> 15 gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60 atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300 tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339 <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P10-1 and P10-2 Fab light chain variable region <400> 16 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain signal sequence for PB009-1, P10-1 and P10-2 Fab <400> 17 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain signal sequence for PB009-1, P10-1 and P10-2 Fab <400> 18 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tandem repeat sequence of an extracellular domain of MUC1 <400> 19 His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ala 20

Claims (20)

  1. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체, 완충제, 안정화제 및 비이온성 계면 활성제를 포함하고, pH가 6.5 내지 7.5인 의약 조성물이며,
    완충제가 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 포함하는 것이고,
    안정화제가 수크로오스 또는 글리세린을 포함하는 것인, 상기 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
    표지부가 하기 식 (I):
    Figure pct00054

    [식 중, 파선은 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 의약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
    (b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 의약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
    (b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
    표지부가 하기 식 (I):
    Figure pct00055

    [식 중, 파선은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=S)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 의약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
    (b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 의약 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온성 계면 활성제가 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 의약 조성물.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체가 추가로 89Zr을 포함하는, 의약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 대장암 또는 대장암이 전이된 암의 진단에 사용하는, 의약 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 유방암 또는 유방암이 전이된 암의 진단에 사용하는, 의약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
    (b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
    표지부가 하기 식 (II):
    Figure pct00056

    [식 중, 파선은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에 대한 결합을 나타내고, 여기에서 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 중의 아미노기를 개재하여 표지부 말단의 C(=O)의 탄소 원자와 결합되어 있음]로 나타나는 기인, 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 항인간 항체 Fab 프래그먼트가 이하의 (a) 및 (b):
    (a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 그리고
    (b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트
    로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 의약 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 비이온성 계면 활성제가 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 의약 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암 또는 유방암이 전이된 암의 진단에 사용하는, 의약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 수술 중 진단약인, 의약 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제의 농도가 10 내지 30mmol/L인, 의약 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제의 농도가 5 내지 30w/v％인, 의약 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온성 계면 활성제의 농도가 0.02 내지 0.2w/v％인, 의약 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 제제, 동결 제제 또는 동결 건조 제제인, 의약 조성물.
  19. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법이며,
    (a) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 제조하고, 배합하는 공정,
    (b) 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하는 공정,
    (c) 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하는 공정,
    (d) 비이온성 계면 활성제를 배합하는 공정, 및
    (e) pH를 6.5 내지 7.5로 조정하는 공정
    을 포함하는, 상기 제조 방법.
  20. 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 안정적으로 보존하는 방법이며,
    (a) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 시트르산, 인산, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 또는 트리스히드록시메틸아미노메탄을 완충제로서 배합하는 공정,
    (b) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 수크로오스 또는 글리세린을 안정화제로서 배합하는 공정,
    (c) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액에 대하여, 비이온성 계면 활성제를 배합하는 공정, 및
    (d) 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 용액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하는 공정
    을 포함하는, 상기 방법.
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