WO2020145228A1 - 配位子及びCEACAM5抗体Fabフラグメントからなる複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
大腸癌の早期の転移は肝臓に限局しているため、早期に肝転移を発見し治療できれば、再発率を低下させることができる(Cell Mol.Gastroenterol.Hepatol.;2017;3:163-173)。
ムチン1(Mucin 1:MUC1)は、乳腺、気管及び消化管等の上皮組織を構成する上皮細胞の内腔側に発現する膜結合型糖タンパク質である(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan;4(1):45-60)。MUC1は乳癌(Mod. Pathol., 2005 Oct;18(10):1295-304)、肺癌(Hum. Pathol., 2008 Jan;39(1):126-36)、大腸癌(Int. J. Oncol., 2000 Jan;16(1):55-64)、膀胱癌(PLoS One, 2014 Mar;9(3):e92742)、皮膚癌(Histopathology, 2000 Sep;37(3):218-23)、甲状腺癌(J. Pathol.,2003 Jul;200(3):357-69.)、胃癌(J. Pathol., 2000 Mar;190(4):437-43)、膵臓癌(Int. J. Oncol., 2004 Jan;24(1):107-13)、腎臓癌(Mod. Pathol., 2004 Feb;17(2):180-8)、卵巣癌(Gynecol. Oncol.,2007 Jun;105(3):695-702)及び子宮頚癌(Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul;122(1):61-9)等の癌細胞で過剰に発現しており、MUC1は癌病巣を検出するための標的分子として有用である(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan;4(1):45-60、Pathol. Res. Pract., 2010 Aug15;206(8):585-9)。
MUC1は細胞外ドメインに存在する20アミノ酸のタンデムリピート配列であるHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(本願配列表の配列番号19)の9番目のスレオニンがO-グリコシル化される。癌細胞ではこのO-グリコシル化が不完全であり、T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr)、Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)及び2,3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr)等のO-グリコシル化が癌特異的に起こることが知られている(特許文献1、非特許文献1)。正常組織のMUC1は、これらの癌特異的なO-グリコシル化は受けないため、ヒト癌特異的MUC1はヒトでの各種癌を治療するための標的分子として特に有用である。このような抗ヒト癌特異的MUC1抗体として、例えば1B2抗体(特許文献1)、PankoMab抗体(非特許文献2)、5E5抗体(特許文献2)等が知られている。これらの抗体のうち、1B2抗体はPankoMab抗体に比較してヒト癌特異的MUC1に対する特異性が高いことが報告されている(特許文献1)。
肝転移の診断にはCT(コンピュータ断層撮影)やMRI(核磁気共鳴画像法)、FDG-PET(Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography)が使用されている。CTやMRI、FDG-PETの検出感度はそれぞれ74.4、80.3、81.4%で、1cm以下の腫瘍では検出感度はCTで47.3%、MRIで60.2%に低下する(Radiology;2010;257:674-684)。肝特異性造影剤MRIも使用されているが、1cm以下の腫瘍ではその検出感度は29~38%である(Radiology;2005;237:89-98)。
一方で、一般に抗体は血中半減期が長く、体内に投与後、癌を可視化するのに十分なシグナルを与える腫瘍対血液比に達するのに4日~5日の長い期間を必要とする(Clin.Pharmacol.Ther.;2010;87:586-592)。また抗体のFc領域は、抗体依存性細胞障害(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity:ADCC)や補体依存性細胞障害(Complement-Dependent Cytotoxicity:CDC)の薬理作用を引き起こす(Glycoconj.J.;2013;30:227-236、Curr.Opin.Biotechnol.;2002;13:609-614)。また抗体は肝臓で代謝されるため標的に関わらず肝臓に高集積するが、大腸癌の早期の転移は肝臓に限局しているため、抗体で肝転移の病巣を検出することは難しい(Clin.Pharmacol.Ther.;2010;87:586-592)。
Fab、scFv、ダイアボディのような低分子化された組み換え抗体フラグメントは、組織浸透性が高いため病巣に届きやすく、大腸菌や酵母での発現系を用いた低コストでの生産が期待できることから治療用抗体として利用される一方、血中半減期が短く、腎排泄される特徴を有することから、診断薬としての利用も報告されている(Nat.Biotechnol.;2005;23:1126-1136)。
抗ヒトCEACAM5抗体のフラグメントでは、マウスモノクローナル抗体のNP-4のFab’を99mTcで標識したCEA-Scanが大腸癌の診断に利用できることが報告されている(非特許文献5)。しかしながら、CEA-Scanの病巣部位への取り込みは正常な肝臓への取り込みを上回らず、また、肝転移の検出感度はFDG-PETより低い(非特許文献6)。CEA-Scanは、1999年にFDAに大腸癌の診断薬として認可されたが、もはや販売されていない(非特許文献7)。
DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸)は、放射性金属のキレーターとして臨床実績がありかつ広く用いられている。近年DOTAを用いて金属標識を行い、ペプチドや抗体と結合させ、ターゲッティングする研究が報告されている (非特許文献8)。
がん治療では、DOTAを有する医薬として、Satoreotide tetraxetan(非特許文献9)がフェーズI開発中として報告されている。90Y-epratuzumab tetraxetan を血液系腫瘍を有する患者に投与したことが報告されている(非特許文献10)。
一般的に、DOTA等のキレート剤および低分子化抗体やペプチドが結合した複合体は、腎臓で高度に取り込まれ、保持されるまたは集積される(非特許文献11,12)。
このように、当該複合体の腎臓の集積は正確な診断や治療において不都合が生じる(非特許文献13)。
このように腎臓で高度に集積されることを回避するために、第一として抗体のフラグメント、例えばFab、scFV、Fab’、dsFV等に改変した複合体での検討があげられ、第二としてキレートと抗体の間に特異的に腎臓内で切断されるリンカー(ペプチドリンカーともいう)を有する複合体での検討があげられる(非特許文献12)。
当初、ペプチドリンカーがGly(グリシン)-Lys(リジン)であるヨード馬尿酸-Gly-Lys-Fabが腎刷子縁膜酵素により切断されヨード馬尿酸が代謝物として尿中に含まれ排出されることが報告されている(非特許文献14)。また、ペプチドリンカーがGly-Tyr(チロシン)であるヨード馬尿酸-Gly-Tys-Fabが報告されている(非特許文献13)。
一方、馬尿酸の代わりに有機レニウム錯体CpTR-COOHにペプチドリンカーのGly-Lysを結合させた[188Re]CpTR-Gly-Lys-Fabが報告されている(非特許文献15)。
また、ペプチドリンカーがGly-Phe(フェニルアラニン)-Lysである99mTc-PGGFML-IT-Fabが報告されている(特許文献4)。
また、キレートとしてNOTAに着目し、当該NOTAとペプチドリンカーからなる複合体が報告されている(特許文献5)。
前記ペプチドリンカーを有する複合体が創製されたが、キレート剤の種類によっては当該酵素により切断されない課題が生じ、キレート剤とペプチドリンカーとの間に特定構造の連結部(-CH2-Ph-CO-NH-)を導入することにより解決しようとした複合体が報告されている(特許文献6)。放射性同位体として汎用されているインジウム等の比較的大きな原子半径を有する原子を配位できる配位子を有する複合体を得ることを目指している。キレートとペプチドリンカーを介するスペーサーとして特許文献5に記載のチオウレア構造を有するものを導入したが腎刷子縁膜酵素による分解が進行しないことを言及している。
リソソームによる切断を目指したペプチドリンカーがMet(メチオニン)-Ile(イソロイシン)である、複合体67Ga-NOTA-Met-Ile-Fabが以下の知見に基づき報告されている(非特許文献16)。
ペプチドリンカーを有していない複合体NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFvのリソソーム切断で生じる代謝物67Ga-NOTA-Bn-Metが尿排泄されることが報告されたこと(非特許文献17)、上記複合体NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFvのdsFvの軽鎖N末端から2番目がIleであることから、複合体67Ga-NOTA-Met-Ile-Her2(ハーセプチン)Fabを設計した(非特許文献19)。
しかしながらFabフラグメントでは、抗体の二価から一価になるため、その結合活性が減弱することが多い。さらに抗体を体内診断薬や光免疫療法で用いる薬剤として利用するためには、金属や蛍光色素等で標識しなければならないが、そのような物質で標識されることにより、その抗体の結合活性が減弱するとの課題がある。
本発明の課題は、金属や蛍光色素等による標識によっても結合活性が減弱しない抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントを用いた、体内診断薬および放射線内用療法に有用な標識化された複合体を提供することにある。
抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント(特許文献7)とペプチドリンカー及び配位子からなる複合体、並びに抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメントと配位子とからなる複合体を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記複合体を含む診断用組成物及びそれを利用した診断方法を提供すること、並びに、上記複合体を含む医薬組成物及びそれを利用した治療方法を提供することにある。
また、本発明の課題は、腎臓に集積するキレーターおよび生物分子を有する複合体がより速やかに排泄する複合体を提供することにある。
また、本発明者らは、造影剤や抗がん剤等の医薬として有用な抗体等の生物分子、配位子と金属から形成された錯体(金属錯体ともいう)、スペーサー及びぺプチドリンカーからなる複合体が、腎臓に集積する恐れがあるため、より速やかに排泄される複合体につき検討した。その結果、放射性金属のキレーターとして臨床実績がありかつ広く用いられているDOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸)に着目し、3arm DOTA、特定のスペーサー、特定のペプチドリンカーおよび生物分子からなる複合体が腎臓内で分解され排出されることを見出した。
以上より、本発明は以下のCEACAM5のFab抗体からなる複合体及び当該複合体を含む診断用組成物及び/又は医薬組成物、並びに、当該複合体を用いた癌の診断及び/又は治療方法等に関する。また、本発明は以下のMUC1のFab抗体からなる複合体及び当該複合体を含む診断用組成物及び/又は医薬組成物、並びに、当該複合体を用いた癌の診断及び/又は治療方法等に関する。また、本発明は腎臓から速やかに排出されるDOTA、スペーサー、ペプチドリンカー及び生物分子からなる複合体、当該複合体の中間体、並びに、当該複合体を用いた生物分子に関連した疾患の診断及び/又は治療方法等に関する。
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
[式中、
Fab1は、
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、及び
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、
からなる群より選択される、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントであり、該Fab1は該Fab1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介してXに結合しており;
Xは、ペプチドリンカー又は結合であり;
S1は、スペーサー又は結合であり;
Yは、配位子であり;並びに、
pは、1~25の自然数であり、Fab1に結合している基(Y-S1-X)の数を示し;
但し、Xが結合であるときは、S1が-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、且つ、Yは1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸(以下、DOTAと略記する場合がある)である]
で示される複合体。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、及び
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、
からなる群より選択される、上記[1]に記載の複合体。
[4]Xが、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有する、2~4個のアミノ酸からなるペプチドを含むペプチドリンカーである、上記[1]~[3]のいずれかに記載の複合体。
-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-NH-(CH2)2-C(=O)-、
-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、
-NH-(CH2)3-C(=O)-、
-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、
-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
下式(a)~(q)で示されるスペーサー、又は、結合であり、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-ジフェニルアラニン-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3- からなる群より選択されるペプチドリンカー、又は
(29)結合、
であり、ここに、Metはメチオニンを、Ileはイソロイシンを、Glyはグリシンを、Lysはリシンを、Pheはフェニルアラニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Argはアルギニンを、Aspはアスパラギン酸を、Z1は下式(II-I)又は(II-II)に示される基を、-Lys*-Z2-は下式(III-I)又は(III-II)に示される基を、-Tyr*-CH2-は下式(IV)に示される基を、-Lys*-C(=S)-は下式(V)に示される基を、-Lys*-Z3-は下式(III-III)に示される基をそれぞれ示す、基(A-3)、(A-4)又は(A-5)は下式のとおりであり、上記[1]~[4]のいずれかに記載の複合体。
Xが
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、及び
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[1]から[5]のいずれかに記載の複合体。
[7-1]S1が-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-であり、又は、下式
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3- からなる群より選択されるペプチドリンカーである、
上記[1]から[5]のいずれかに記載の複合体。
[7-2]S1が、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、であり、又は、下式
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3- からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[7-1]に記載の複合体。
[8]S1が-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-(CH2)2-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、-NH-(CH2)3-C(=O)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、下式(a)~(q)で示されるスペーサー、又は、結合であり、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-ジフェニルアラニン-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3- からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。。
[10]S1が-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、下式(f)若しくは(g)で示されるスペーサー、又は、結合からなる群より選択される基であり、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。
[11]Xが、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、及び
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。
[12]Xが、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、及び
(28)Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。
[13]Xが、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。
[14]下式に示される化合物からなる群より選択される複合体であって、Fab1が該Fab1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介して、隣接する炭素原子に結合している、上記[1]~[5]の何れかに記載の複合体。
[16]Yが、DFOである、上記[15]に記載の複合体。
[17]Yが、DOTAである、上記[15]に記載の複合体。
[18]Yが、3arm DOTA又は4arm DOTAである、上記[17]に記載の複合体。
[19]Yが、3arm DOTAである、上記[18]に記載の複合体。
[20]Yが、4arm DOTAである、上記[18]に記載の複合体。
[21]下式に示される化合物からなる群より選択される複合体であって、Fab1が該Fab1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介して、隣接する炭素原子に結合している、上記[15]又は[17]から[20]のいずれかに記載の複合体。
また、本発明複合体は、下記二つの複合体の混合物でもよい。
[22]下式に示される化合物からなる群より選択される複合体であって、Fab1が該Fab1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介して、隣接する炭素原子に結合している、上記[15]又は[17]から[20]の何れかに記載の複合体。
[24]Yに金属が配位した、上記[1]~[20]のいずれかに記載の複合体。
[25]金属が配位した、上記[21]~[22]のいずれか1項に記載の複合体
[26]金属が金属放射性同位元素である、上記[24]または[25]に記載の複合体。
[27]金属が89Zrである、上記[26]に記載の複合体。
[28]金属が常磁性金属イオンである、上記[24]または[25]に記載の複合体。
[29]金属がGd3+である、上記[28]に記載の複合体。
[30]PETトレーサーである、上記[24]~[29]のいずれかに記載の複合体。
[32]早期診断薬、又は病期診断薬として用いられる、上記[31]に記載の診断用組成物。
[33]ヒトCEACAM5を発現する癌の診断に用いられる、上記[31]又は[32]のいずれかに記載の診断用組成物。
[34]癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌である、上記
[33]に記載の診断用組成物。
[36]ヒトCEACAM5を発現する癌を治療するための医薬組成物である、上記[35]に記載の医薬組成物。
[37]癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌である、上記[36]に記載の医薬組成物。
[38]癌の診断用組成物、及び/又は癌の治療用医薬組成物の製造のための、上記[24]~[29]のいずれかに記載の1種類以上の使用。
[40]上記[24]~[30]のいずれかに記載の1種類以上の複合体を対象に投与することを含む、癌の診断方法。
[41]上記[24]~[30]]のいずれかに記載の複合体の治療有効量を対象に投与することを含む、癌の治療方法。
[42]
下式(Ia):
DOTA1:3arm DOTA、
U:結合、又は、-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q:-C(=O)-、-NH-C(=O)-、又は、-NH-C(=S)-
X: C、又はN
R1a、R1b:同一又は異なって水素原子、又は、C1-6アルキル、
なお、R1a及びR1bは、一緒になってC1-6アルキレンを形成することができる。
pは、1~25の自然数であり、Biomolecule1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介して、隣接する炭素原子に結合している。
R1:H、ハロゲン、C1-6アルキル、又は、ハロC1-6アルキル、
R2:C1-6アルキル、又は、ハロC1-6アルキル,
L2:Ile、Gly、Ala、Val、Phe、-NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-、-NHCH(CHCH3N3)C(=O)-、又は、-NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-、
R3:H、C1-6アルキル、
R4:H、C1-6アルキル、
L3:結合、Arg、又は、His、
L4: -NH-(CH2)2-、-NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-、又は、結合、
V1:下式(A-1)~(A-5)に示される基、
Biomolecule1:生物分子
[43]L3、L4およびV1が以下の基である[42]記載の複合体。
L3:結合、Arg、又は、His、
L4: -NH-(CH2)2- 、-NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-、又は、結合、
V1:下式(A-1)から(A-5)のいずれかに記載の基、
[45] 下式(Ib):
DOTA1:3arm DOTA、
U:結合、又は、-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q:-C(=O)-、-NH-C(=O)-、又は、-NH-C(=S)-
X: C、又はN
R1a、R1b:同一又は異なって水素原子、又は、C1-6アルキル
なお、R1a及びR1bは、一緒になってC1-6アルキレンを形成することができる。
pは、1~25の自然数であり、Biomolecule2中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介して、隣接する炭素原子に結合している。
R1:H、ハロゲン、C1-6アルキル、又は、ハロC1-6アルキル、
R2:C1-6アルキル、又は、ハロC1-6アルキル,
L2:Ile、Gly、Ala、Val、Phe、-NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-、-NHCH(CHCH3N3)C(=O)-、又は、-NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-、
R3:H、C1-6アルキル、
R4:H、C1-6アルキル、
L3:結合、Arg、又は、His、
L4: -NH-(CH2)2-、-NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-、又は、結合、
V1:下式(A-1)から(A-5)のいずれかに記載の基、
Biomolecule2:抗体Fabフラグメント、
[46-1]
下式(Ic):
L3:結合、
L4: -NH-(CH2)2-または、-NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-、
Biomolecule:Biomolecule1又はBiomolecule2である]
である上記[42]から[45]のいずれかに記載の複合体。
[46-2]
前記[46-1]の複合体において、式(Ic)中、
L3が結合であり、
L4が -NH-(CH2)2-である複合体。
[47-1] 下式(Id)で示される上記[42]から[46-2]に記載の複合体。
L3:結合、
L4: -NH-(CH2)2-または、-NHCH((C=O)OH)(CH2)4-、
Biomolecule:Biomolecule1又はBiomolecule2である]
である上記[42]から[45]のいずれかに記載の複合体。
[47-2] 前記[47-1]の複合体において、式(Id)中、
L3が結合であり、
L4が -NH-(CH2)2-である複合体。
[48]
V1が、下式(A-3)から(A-5)
[49]
式(Ia)又は(Ib)中の基(B)が、
[51-1]
Biomolecule1及びBiomolecule2において、以下の抗体Fabフラグメントを除く生物分子又は抗体Fabフラグメントである[42]から[50]の何れかに記載の複合体:
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、及び
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、からなる群より選択される、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント。
[51-2]
Biomolecule1及びBiomolecule2において、以下の抗体Fabフラグメントを除く生物分子又は抗体Fabフラグメントである[51-1]に記載の複合体:
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、又は、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号4に示される軽鎖を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント。
(a)配列番号12又は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント、
及び
(b)配列番号12又は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号12又は配列番号14のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメントからなる群より選択される、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[53]Biomolecule1またはBiomolecule2が、以下(a)及び(b)からの群から選択される抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメントである[52]に記載の複合体:
(a)配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント;及び
(b)配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[55] pが1~4の自然数である、上記[42]~[54]のいずれかに記載の複合体。
[56]DOTA1に金属が配位した、上記[42]~[55]のいずれかに記載の複合体。
[57]金属が金属放射性同位元素である、上記[56]に記載の複合体。
[58]金属が89Zrである、上記[57]に記載の複合体。
[59]金属が常磁性金属イオンである、上記[56]に記載の複合体。
[60]金属がGd3+である、上記[59]に記載の複合体。
[61]PETトレーサーである、上記[56]~[60]のいずれかに記載の複合体。
[62]上記[56]~[61]のいずれかに記載の1種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む診断用組成物。
[63]早期診断薬、又は病期診断薬として用いられる、上記[62]に記載の診断用組成物。
[64]Biomolecule1又はBiomolecule2に関連した疾患の診断に用いられる、上記[62]又は[63]のいずれかに記載の診断用組成物。
[65]Biomolecule1又はBiomolecule2に関連した疾患がMUC1に関連した疾患である、上記[64]に記載の診断用組成物。
[66]MUC1を発現する癌の診断に用いられる、上記[65]に記載の診断用組成物。
[67]癌が、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌である、上記[66]に記載の診断用組成物。
[69]Biomolecule1又はBiomolecule2に関連した疾患の診断に用いられる、上記[68]に記載の医薬組成物。
[70]Biomolecule1又はBiomolecule2に関連した疾患がMUC1に関連した疾患である、上記[69]に記載の医薬組成物。
[71]MUC1を発現する癌を治療するための医薬組成物である、上記[70]に記載の医薬組成物。
[72]癌が、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌である、上記[71]に記載の医薬組成物。
[73]癌の診断用組成物、及び/又は癌の治療用医薬組成物の製造のための、上記[56]~[60]のいずれかに記載の1種類以上の使用。
[74]癌の診断、及び/又は癌の治療に用いられる、上記[56]~[60]のいずれかに記載の複合体。
[75]上記[56]~[60]のいずれかに記載の1種類以上の複合体を対象に投与することを含む、癌の診断方法。
[76]上記[56]~[60]のいずれかに記載の複合体の治療有効量を対象に投与することを含む、癌の治療方法。
「アルキル」とは、いずれも直鎖又は分枝状の飽和炭化水素鎖を意味し、一価基を意味する。
「C1-6アルキル」とは、炭素数が1~6のアルキル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等である。ある態様としてはC1-4アルキルであり、ある態様としてはメチル又はエチルであり、ある態様としてはメチルである。
「C1-6アルキレン」とは,上記C1-6アルキルの水素を除いた2価基である。ある態様としてはメチレン、エチレン、プロピレン又はメチルメチレン等である。
「ハロゲン」は、F、Cl、Br、Iを意味する。
「ハロC1-6アルキル」とは、1個以上のハロゲンで置換されたC1-6アルキルである。ある態様としては1~5個のハロゲンで置換されたC1-6アルキルであり、ある態様としてはCF3である。
本発明の複合体は、下式(I):
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
[式中、
Fab1は、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントであり、該Fab1は該Fab1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介してXに結合しており、
Xは、ペプチドリンカー又は結合であり、
S1は、スペーサー又は結合であり、
Yは、配位子であり、並びに、
pは、1~25の自然数であり、Fab1に結合している(Y-S1-X)の数を示し、
但し、Xが結合であるときは、S1が-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、且つ、Yは下式
で示される複合体である。
抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント(Fab1)
前記式(I)において「Fab1」で示される抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントについて説明する。
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量5万~7万の重鎖と2~3万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約440個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにIgGには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4が存在し、それぞれγ1、γ2、γ3、γ4と呼ばれている。軽鎖は、通常約220個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、L型とK型の2種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な2本の重鎖及び2本の軽鎖が、ジスルフィド結合(S-S結合)及び非共有結合によって結合され、分子量15万~19万である。2種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖2本と同一の重鎖2本からできている。
鎖内S-S結合は、重鎖に四つ(μ、ε鎖には五つ)、軽鎖には二つあって、アミノ酸100~110残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにN末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス(サブクラス)からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)とよばれている。これよりC末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、CH1、CH2、CH3あるいはCLと表される。
1つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、以下の特徴を有するFabフラグメントである:
配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖定常領域としては、Igλ又はIgκのいずれの定常領域も選択可能である。1つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖定常領域は、ヒトIgκ定常領域である。
1つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、以下のFab2フラグメントである:
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント(Fab2という)。
Fabフラグメントを含め、抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖C末端のリシンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖N末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている(J.Pharm.Sci.;2008;97:2426-2447)。
本発明の複合体に含まれる抗CEACAM5抗体Fabフラグメントには、翻訳後修飾により生じたFabフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの例としては、重鎖N末端のピログルタミル化した抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントが挙げられる。このようなN末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている(Anal.Biochem.;2006;348:24-39)。
配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント。
ある実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントである:
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント。
別の実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗CEACAM5抗体Fabフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントである:
配列番号2のアミノ酸番号31から35までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2のアミノ酸番号50から66までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号2のアミノ酸番号99から110までのアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、並びに、配列番号4のアミノ酸番号24から38までのアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号4のアミノ酸番号54から60までのアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号4のアミノ酸番号93から101までのアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、ヒトCEACAM5に結合する。得られた抗ヒトCEACAM5抗体FabフラグメントのヒトCEACAM5に対する結合活性を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance;SPR)法による解析やELISA等の方法がある。例えば、SPR法による解析を用いる場合、Biacore T200(GEヘルスケア・ジャパン社)を用いて、センサーチップにBiotin CAPture Kit(GEヘルスケア・ジャパン社)とビオチン化したヒトCEACAM5を固相化し、段階希釈したFabフラグメントを添加することで結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、及び解離定数(KD)を測定できる。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、本明細書に開示される、本発明の抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の<本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの生産方法>に記載の方法に従い生産することができる。
「配位子」とは、複合体において、金属とキレート錯体を形成しうる部分であり、キレート剤から構成される基を意味する。構成される基とは、キレート剤からプロトンが除かれて、結合手を有する基である。当該キレート剤から構成される基は、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントと直接、或いは、スペーサー及び/又はペプチドリンカーを介して結合するものである。
「キレート剤」とは、金属と配位結合できる化合物をいう。本明細書における「キレート剤」としては、シデロホアと、非シデロホアが挙げられる。シデロホアとしては、ヒドロキサム酸型、カテコール型、又は、混合配位子型が挙げられる。ヒドロキサム酸型シデロホアとしては、例えば、フェリクローム、下式:
非シデロホアとしては、例えば、下式:
DOTAはその反応性官能基であるカルボン酸の1つを介してスペーサー又はペプチドリンカーと反応させることができ(以下、このように結合した3つのカルボン酸を有するDOTAを3arm DOTAと記載する場合がある(PLoS One. 2019 Mar 22;14(3):e0213397)。)。
DOTAのうち、3arm DOTAとして、例えば以下のものが挙げられる。
なお、本明細書中の化合物及び複合体は、特に記載がない限りフリー体及びその塩も包含する。ここに「その塩」とは、その化合物及び複合体の置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合があり、その化合物及び複合体が形成しうる塩である。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。例えば、DFOは、デフェロキサミンメタンスルホン酸塩としても存在し、他の塩としても存在する。DTPAは、フリー体とともにDTPAナトリウム塩としても存在する。
MRI造影剤に用いる場合の「キレート剤」のある態様としては、上記のシデロホア及び非シデロホアキレート剤である。
PETトレーサーに用いる場合の「キレート剤」のある態様としては、上記のシデロホア及び非シデロホアキレート剤であり、ある態様としては、DFO又はDOTAである。
本発明の複合体において、キレート剤は金属を含んでいてもよい。本明細書において、「金属」は、常磁性金属イオン又は金属放射性同位元素を意味する。金属としては、各キレート剤に配位結合する金属であれば特に制限はない。複合体の使用目的に応じて、適切なキレート剤と金属の組合せが選択される。
金属放射性同位元素はPETトレーサー等に用いられる。金属放射性同位元素のある態様としては、89Zr、52Mn、52Fe、64Cu、67Ga、68Ga、72As、90Y、99mTc、111In又は177Luが挙げられるが、これらに限定されない。PETトレーサーやSPECTトレーサー等に用いられる金属放射性同位元素のある態様としては、89Zr、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、又は111Inが挙げられる。ある態様としては、ジルコニウム(Zr)の放射同位体が挙げられる。ある態様としては89Zrが挙げられる。癌の治療に用いられる金属放射性同位元素のある態様としては、90Y又は177Luが挙げられる。
本発明の複合体のある態様としては、Yが、89Zrが配位結合しているDFOである複合体である。別の態様としては、Yが、90Y、67Ga、68Ga及び177Luからなる金属放射性同位元素が配位結合しているDOTAである複合体である。また別の態様としては、Yが、Gd3+及びY3+からなる常磁性金属イオンが配位結合しているDOTAである複合体である。また別の態様としては、Yが、Gd3+が配位結合しているDOTAである複合体である。
本発明の複合体は、配位子(Y)又はスペーサー(S1)とFab1とが、直接結合(即ち、Xが結合)していてもよく、あるいはペプチドリンカー(即ち、Xがペプチドリンカー)を介して結合していてもよい。
本明細書において「ペプチドリンカー」とは、2~4個のアミノ酸からなるペプチドを含むリンカーであって、所望により抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントとの結合に適するアタッチメントZ1からZ3等を有していてもよい。ここに、ペプチドリンカーに包含されるペプチドとしては、特に限定されないが、好ましくはグリシン(Gly)、リシン(Lys)、メチオニン(Met)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、バリン(Val)、チロシン(Tyr)、アルギニン(Arg)、アラニン(Ala)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、ヒスチジン(His)及びロイシン(Leu)、3-(2-ナフチル)アラニン、及び、ジフェニルアラニンからなる群よりそれぞれ選択される、2~4個のアミノ酸からなるペプチド、より好ましくはグリシン、リシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、アルギニン、3-(2-ナフチル)アラニン、及び、ジフェニルアラニンからなる群よりそれぞれ選択される2~4個のアミノ酸からなるペプチドである。なお、特に断りのない限りグリシン以外のアミノ酸残基の立体はL-体とする。
アタッチメントはペプチド末端のアミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基と、或いは、アミノ酸の側鎖中のアミノ基(例えばリシン)や水酸基(例えばチロシン)と結合してペプチドリンカーを形成している。ペプチド末端のアミノ酸の側鎖中の官能基にアタッチメントが結合してペプチドリンカーを形成した例としては、例えば、Lysと一体となったアタッチメントとして下式(III-I)又は(III-II)で示される基が挙げられ、本明細書においてはこれら2つを併せて-Lys*-Z2-と記載する。下式(III-I)を-Lys*-Z2(#N)-、下式(III-II)を-Lys*-Z2(#S)-と記載する場合がある。下式(III-III)を-Lys*-Z3ーと記載する場合がある。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-ジフェニルアラニン-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、及び
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-からなる群から選択されるペプチドリンカーである。
ある態様としては、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群から選択されるペプチドリンカーである。
「X」のペプチドリンカーのある態様としては、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-ジフェニルアラニン-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、及び、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-からなる群から選択されるペプチドリンカーである。
「X」のペプチドリンカーのある態様としては、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、及び
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-からなる群から選択されるペプチドリンカーである。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、及び
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
「X」のペプチドリンカーのある態様としては、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3- からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-及び
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3- からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
「X」のペプチドリンカーのある態様としては、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、及び
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-、
からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
「X」のペプチドリンカーのある態様としては、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
「X」のペプチドリンカーのある態様としては、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
本発明の複合体は、配位子(Y)とペプチドリンカー(X)とが、直接結合(即ち、S1は結合)するか、又は、スペーサー(即ち、S1はスペーサー)を介して結合している。
本明細書においてS1の「スペーサー」は、配位子と、ペプチドリンカー又はFab1との間に一定の距離を作るため、或いは、配位子と、ペプチドリンカーとの結合のために、導入する基であり、ある態様としては、-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-(CH2)2-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、-NH-(CH2)3-C(=O)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、下式(a)~(q)で示されるスペーサー等が挙げられる。
ある態様としては、S1が-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-であり、又は、下式
ある態様としては、S1は、結合である。
また、本発明のYがDOTAである複合体は、DOTAと抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント(Fab1)が、直接結合又はスペーサー(-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-)を介して結合していてもよい。但し、DOTAと抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント(Fab1)とがスペーサーである-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-を介して結合した複合体は、下式(VI)で示される複合体である。
本発明の複合体のある態様としては、YがDOTAであり、S1が式(g)及び(l)で示されるスペーサーであり、且つ、Xが、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有する、2~4個のアミノ酸からなるペプチドを含む、ペプチドリンカーである複合体である。
ある態様としては、YがDOTAであり、S1が式(g)及び(l)で示されるスペーサーであり、且つ、Xが
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、及び
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-からなる群から選択されるペプチドリンカーである複合体である。
ある態様としては、YがDOTAであり、S1が-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、上式(g)、(i)、(k)で示されるスペーサーであり、かつXが
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
ある態様としては、YがDOTAであり、S1が式(g)で示されるスペーサーであり、かつXが、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-からなる群より選択されるペプチドリンカーである。
本発明の複合体の具体的な態様は以下の通りである。
式中、Fab2は、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むFabフラグメントである。
pは、1~25の自然数である。Fab2が該Fab2中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介して、隣接する炭素原子に結合している。
本発明の複合体の製造において、抗CEACAM5抗体Fabフラグメントと、配位子、スペーサー及び/又はペプチドリンカーとの結合、及び配位子とスペーサー及び/又はペプチドリンカーとの結合は、公知の手法により、当業者が適宜行うことができる。
本発明の複合体は、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント(Fab1)中の1以上のアミノ基又はチオール基を介して1以上の標識部(Y-S1-X)が結合した複合体である。また、本発明の複合体は、式(Ia)又は(Ib)のBiomolecule1及びbiomolecule2中1以上のアミノ基又はチオール基を介して1以上の標識部が結合した複合体である。本発明の複合体は結合する標識部の数が互いに相違する複合体の混合物であってもよく、式(I)において、Fab1に1~25の標識部(Y-S1-X)が結合した複合体のいずれか又はそれらの混合物であることを示す。ある態様としては、本発明の複合体は、1つのFab1に対して、1~25の標識部(Y-S1-X)を含み、ある態様としては、1~23の標識部(Y-S1-X)を含み、ある態様としては1~15の標識部(Y-S1-X)を含み、ある態様としては1~11の標識部(Y-S1-X)を含み、ある態様としては1~9の標識部(Y-S1-X)を含み、ある態様としては1~7の標識部(Y-S1-X)を含み、ある態様としては1~5の標識部(Y-S1-X)を含み、更に、ある態様としては1~4の標識部(Y-S1-X)を含む。
式(Ia)又は(Ib)において、Biomolecule1及びBiomolecule2は1~25の当該標識部が結合した複合体のいずれか又はそれらの混合物であることを示す。ある態様としては、本発明の複合体は、1つのBiomolecule1及びBiomolecule2に対して、1~25の当該標識部を含み、ある態様としては、1~23の当該標識部を含み、ある態様としては1~15の当該標識部を含み、ある態様としては1~11の当該標識部を含み、ある態様としては1~9の当該標識部を含み、ある態様としては1~7の当該標識部を含み、ある態様としては1~5の当該標識部を含み、更に、ある態様としては1~4の当該標識部を含む。
即ち、1つのFab1に対する標識部(Y-S1-X)の結合数を表す「p」及び1つのBiomolecule1及びBiomolecule2に対する当該標識部の結合数を表す「p」は、同一又は異なって、ある態様としては1~25の自然数であり、ある態様としては1~23の自然数であり、ある態様としては1~15の自然数であり、ある態様としては1~11の自然数であり、ある態様としては1~9の自然数であり、ある態様としては1~7の自然数であり、ある態様としては1~6の自然数であり、ある態様としては1~5の自然数であり、ある態様としては1~4の自然数であり、更に、ある態様としては1~3の自然数である。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントは、ある態様では、当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
ある態様において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号1の塩基番号1から363までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号3の塩基番号1から336までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号1に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号3に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該技術分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開第90/07861号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターには、当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び当該抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
好ましい発現ベクターとしては、配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが挙げられる。
好ましい発現ベクターには、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
また、これらの発現ベクターは、本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントをコードするポリヌクレオチドの重鎖フラグメント及び/又は軽鎖をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。宿主細胞中でFabフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、宿主細胞がエシェリキア属菌の場合、例えば、Trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、CMV、RSV、SV40などのウイルス由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アクチンプロモーター、EF(elongation factor)1αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターで形質転換される宿主細胞には、以下の(a)~(d)からなる群より選択される宿主細胞が含まれる:
(a)抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(d)抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(d)配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
5.本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの生産方法
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの生産は、上記の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントを発現させる工程を含む。
(a)本発明の複合体に含まれる抗ヒ卜CEACAM5抗体Fabフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)本発明の複合体に含まれる抗ヒ卜CEACAM5抗体Fabフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、本発明の複合体に含まれる抗ヒ卜CEACAM5抗体Fabフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)配列番号2のアミノ酸番号1から121に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から112に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの生産において、形質転換された宿主細胞は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素(例えば、無機塩(例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム)、ビタミン類、抗生物質(例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等)など)を含んでいてもよい。
本発明の複合体に含まれる抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの生産においては、上記の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントを発現させる工程に加えて、発現させた抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントを回収、好ましくは単離、精製する工程を含めてもよい。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
本発明の複合体を生産する方法には、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントを、標識部(Y-S1-X)と共有結合させる工程を含めることができる。前記標識部(Y-S1-X)における各構成要素間の結合は、公知の手法により、当業者が適宜行うことができる。反応例としては、配位子(Y)を直接又はスペーサー(S1)を介してペプチドリンカー(X)に結合させた後に、前記ペプチドリンカーと抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントとを結合させることができる。また、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントをペプチドリンカー(X)に結合させた後に、前記ペプチドリンカーと配位子(Y)とを直接又はスペーサー(S1)を介して結合させることもできる。なお、原料としてあらかじめ配位子とスペーサー(S1)とが結合した化合物を用いることもできる。
また、上記抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントに代えて、本発明に記載の生物分子でも同様に生産することが可能である。
7.配位子、スペーサー、ペプチドリンカーおよび生物分子からなる複合体
下式に示される本発明の配位子、スペーサー、ペプチドリンカーおよび生物分子からなる複合体について説明する。
別の態様として、式S2が、
別の態様として、式S2が
別の態様として、式S2が
式(S2)中の基Qの態様として、-C(=O)-、-NH-C(=O)-、又は、-NH-C(=S)-が挙げられる。
式(S2)中の基Qの態様として、-C(=O)-、又は、-NH-C(=O)-が挙げられる。
式(S2)中の基Qの態様として、-NH-C(=O)-が挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L2の態様として、Ile、Phe,Glyが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L2の態様として、Ileが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L2の態様として、Pheが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L2の態様として、Glyが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L3の態様として、結合、Arg、Hisが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L3の態様として、結合が挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L3の態様として、Argが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L3の態様として、Hisが挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L4の態様として、-NH-(CH2)2- 、-NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-、又は、結合が挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L4の態様として、-NH-(CH2)2-が挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L4の態様として、-NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-、が挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基L4の態様として、結合が挙げられる。
式(Ia)又は(Ib)中の基V1の態様として、下式(A-1)~(A-5)に示される基、
式(Ia)又は(Ib)中の基V1の態様として、下式(A-1)に示される基、
式(Ia)又は(Ib)中の基V1の態様として、下式(A-2)に示される基、
式(Ia)又は(Ib)中の基V1の態様として、下式(A-3)に示される基、
式(Ia)又は(Ib)中の基V1の態様として、下式(A-4)に示される基、
式(Ia)又は(Ib)中の基V1の態様として、下式(A-5)に示される基、
式(Ia)又は(Ib)中の下式(B)は、スペーサーおよびペプチドリンカーからなる基である。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
本発明の態様は、下式に示される複合体。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
本発明の態様は、下式に示される複合体。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
本発明の態様は、下式に示される複合体。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
本発明の態様は、下式に示される複合体。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
本発明の態様は、下式に示される複合体。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
本発明の態様は、下式に示される複合体。
配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。]
また本発明の態様として、下式(Ie)及び(If)が挙げられる。
生物分子の態様としては、生理活性を有するものであればいずれでもよく、ペプチド、タンパク質、ホルモン、薬物、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、多糖類などがあげられる。タンパク質の場合、抗体、酵素、受容体およびそれらの断片が含まれる。
別の生物分子の態様としては、ぺプチド、タンパク質が挙げられる。
別の生物分子の態様としては、タンパク質が挙げられる。
別の生物分子の態様としては、タンパク質のうち、Fabフラグメント、酵素、受容体、それらの断片が挙げられる。例えばソマトスタチン、PSMAリガンド、RGD (Arg-Gly-Asp) Peptide、ATSM (Diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone))、211At-AITM (4-211At- astato-N-[4-(6-(isopropylamino)pyridine-4-yl)-1,3-thiazol-2-yl]-N- methylbenzamide)がそれにあたる。
例えばnivolumab、pembrolizumab、bevacizumab、rituximab、pertuzumab、daratumumab、denosumab、cetuximab、ipilimumab、panitumumab、brentuximab、ramucirumab、atezolizumab、obinutuzumab、elotuzumab、avelumab、ibritumomab、alemtuzumab、gemtuzumab、necitumumab等が挙げられる。
また、別の生物分子の態様として、アルファ線治療やベータ線治療に期待できるものが挙げられる。
例えば、Octreoscan、131I-MIBG (I-131 metaiodobenzylguanidine)、211 At-MABG(211 At-astato-benzylguanidine)、Trastuzumab 、Humanized antibody A33(Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 2005 Oct;20(5):514-23.)、Omburtamab、Tenatumomab、CD45 antibody(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03128034; 9595; NCI-2017-00452)、Ibritumomab、Actimabが挙げられる。
また、別の生物分子の態様として、Cancer studies and molecular medicineに記載のHuM195, MX35-F(ab’)2 monoclonal antibodies, Murine 9.2.27, Proteoglycan (MCSP) antigen, CD20 antigen, CD30 antigen等が挙げられる(Cancer studies and molecular medicine (2004), 1, 1, 1-7)。
また、別の生物分子の態様として、CD19, GD2, VE cadherin等が挙げられる。
[1M]具体的に当該Fab3又はFab4は、以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメントであり、なお配列番号12に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントを有するFabフラグメントをFab3、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントを有するFabフラグメントをFab4という:
(a)配列番号12又は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント;及び
(b)配列番号12又は配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号12又は配列番号14のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[2M]ある態様として、以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、上記[1M]に記載の抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント:
(a)配列番号6又は配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント;及び
(b)配列番号6又は配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号6又は配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[3M]ある態様として、以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、上記[1M]に記載の抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント:
(a)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント;及び
(b)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号10のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
(a)配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント;及び
(b)配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[5M]ある態様として、配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメントである、上記[4M]に記載の抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[6M]ある態様として配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号8のアミノ酸番号1のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメントである、上記[4M]に記載の抗ヒトMUC1抗体Fabフラグメント。
[7M]国際公開WO2018/092885記載の抗MUC1抗体FabフラグメントであるP10-1またはP10-2(Fab5という)である。
また本発明複合体は、上記個々の態様の組み合わせから構成することができる。
本発明は、金属を含む本発明の複合体(以下、検出可能な本発明の複合体と称する。)を含む、診断用組成物に関する。本発明の診断用組成物は、本発明の複合体を1種類以上含むものであってもよい。すなわち、本発明の診断用組成物は、本発明の複合体を1種類含むものであってもよく、または2種類以上の本発明の複合体の組合せを含むものであってもよい。検出可能な本発明の複合体は、常法に従って製剤化され、早期診断薬、又は病期診断薬(特に癌の診断薬)として利用することができる。
早期診断薬とは、病状が観察されない、又は病期の早い段階で診断を行うことを目的とする診断薬を意味する。例えば、癌においては、病状が観察されないか、ステージ0又はステージ1の段階で用いる診断薬を意味する。
病期診断薬とは、病状がどの程度進行しているかを検査することが可能な診断薬を意味する。例えば、癌については、そのステージを検査することが可能な診断薬を意味する。
本発明の診断用組成物により診断できることが期待される癌は、ヒトCEACAM5を発現する癌である。ある態様としては、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌及びこれらが転移した癌が挙げられる。ある態様として、当該癌は大腸癌又は大腸癌が転移した癌である。より好ましくは、当該癌は大腸癌が転移した癌であり、そのような癌には転移性肝癌が含まれる。また、ヒトMUC1を発現する癌である。ある態様としては、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌が挙げられる。ある態様は、当該癌は乳癌又は膀胱癌である。
本発明の診断用組成物の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤を挙げることができ、静脈内注射、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射、膀胱内投与等により投与することができる。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。薬学的に許容される担体や添加剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の担体や添加剤を用いることができる。
本発明はまた、癌の早期診断用組成物、病期診断用組成物の製造のための、検出可能な本発明の複合体の使用に関する。本発明は、癌の早期診断、病期診断において使用するための、検出可能な本発明の複合体にも関する。
そして、本発明は、検出可能な本発明の複合体を、対象に投与することを含む癌の診断方法にも関する。ここにおいて、「対象」とは、その診断を受けることを必要とするヒト又はその他の哺乳動物である。ある態様としては、その診断を受けることを必要とするヒトである。本発明の診断方法における検出可能な本発明の複合体の有効量は上記製剤化にあたっての本発明の複合体の有効量と同様の量であってもよい。本発明の診断方法において、検出可能な本発明の複合体は、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することが挙げられる。
別の態様において、本発明は、本発明の抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、ペプチドリンカー及び/又は配位子を含む複合体の製造のための、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの使用にも関する。ある態様としては、本発明は、本発明の複合体を含む診断用組成物の製造のための、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの使用にも関する。
また、金属放射性同位元素を含む本発明の診断用組成物が提供される際の態様としては、当該組成物の使用の直前に金属放射性同位元素で標識されてもよく、金属放射性同位元素を含む診断用組成物として提供されてもよい。
本発明には、90Y又は177Lu等の金属放射性同位元素を含む1種類以上の本発明の複合体Fabフラグメントの質量ベースで0.001mg/kgないし100mg/kg程度を用いることができる。
本発明の複合体を含む医薬組成物は、癌の治療のために用いることができる。本発明の複合体を含む医薬組成物により治療できることが期待される癌は、ヒトCEACAM5を発現する癌であり、例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌及びこれらが転移した癌が挙げられる。または、本発明の複合体を含む医薬組成物により治療できることが期待される癌は、ヒトMUC1を発現する癌であり、例えば、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌が挙げられる。ある態様は、当該癌は乳癌又は膀胱癌である。
本発明には、本発明の複合体を含む、大腸癌又は大腸癌が転移した癌を治療するための医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の複合体の治療有効量を投与する工程を包含する、大腸癌又は大腸癌が転移した癌を治療する方法が含まれる。また、本発明には、本発明の複合体の治療有効量を投与する工程を包含する、大腸癌又は大腸癌が転移した癌の癌細胞の細胞死を誘導する方法が含まれる。
癌を治療するための医薬組成物は、癌の診断にも用いることができる。例えば、大腸癌又は大腸癌が転移した癌を治療するための医薬組成物を、当該癌の診断にも用いることもできる。
また、本発明には、大腸癌又は大腸癌が転移した癌の治療に使用するための、本発明の複合体が含まれる。さらに、本発明には、大腸癌又は大腸癌が転移した癌を治療するための医薬組成物の製造のための、本発明の複合体の使用が含まれる。
別の実施形態において、本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物の製造のための、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの使用にも関する。
上記実施形態あるいは態様において、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントの代わりに生物分子で行うことが可能である。本発明の複合体は、生物分子に関連した疾患の診断用組成物又は医薬組成物として提供されうる。
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示を目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
Gd/DOTA:Gdで標識された3arm DOTA、Gd/4arm DOTA:Gdで標識された4arm DOTA、MS:質量分析、ESI+:m/z値(イオン化法ESI、断りのない場合[M+H]+)、ESI-:m/z値(イオン化法ESI、断りのない場合[M-H]-)、APCI/ESI+:m/z値(イオン化法APCI/ESI、APCI/ESIはAPCIとESIの同時測定を意味する。断りのない場合[M+H]+)、APCI/ESI-:m/z値(イオン化法APCI/ESI、断りのない場合[M+H]-)、Ex-No:複合体番号、SNo:製造例番号、Str:化学構造式、Me:メチル、Et:エチル、tBu:tert-ブチル、1,3-Ph:1,3-フェニレン、1,4-Ph:1,4-フェニレン、diph-Ala:ジフェニルアラニン、及び、naph-Ala:3-(2-ナフチル)アラニン。
マウス由来の抗ヒトCEACAM5抗体であるT84.66を文献(Protein Eng.Des.Sel.;2004;17:481-489)に記載の方法を参考にしてヒト化後、文献(Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics;2014;82:1624-1635)に準じて構築したヒト化抗体の分子モデルを用いて、標識部を結合させても親和性が減弱しないことが期待される可変領域を有する抗体を設計した。
前記抗体の重鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列(Protein Engineering;1987;1:499-505)をコードする遺伝子を、そして3’側にヒトIgγ1のFab領域遺伝子(配列番号1の塩基番号364から678までの塩基配列からなる)をそれぞれ繋げ、この重鎖フラグメント遺伝子をGSベクターpEE6.4(Lonza社)に挿入した。また、抗体の軽鎖可変領域遺伝子の5’側にシグナル配列をコードする遺伝子を、そして3’側にヒトIgκの定常領域遺伝子(配列番号3の塩基番号337から657までの塩基配列からなる)をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をGSベクターpEE12.4(Lonza社)に挿入した。抗体の重鎖フラグメントと軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のpEEベクターをNotIとPvuIで制限酵素切断し、ライゲーション用キットTAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara社)を用いてライゲーションを行い、重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたGSベクターを構築した。
なお、可変領域及びCDR配列はKabat番号付けに従って決定した(Kabatら、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、 5th Ed.、 United States Public Health Service、 National Institute of Health、 Bethesda)。
本実施例は複合体の製造実施例を開示する。本実施例中の各製造実施例では「実施例2」にハイフンを介して「複合体の番号」を記載する。例えば、「実施例2-11」は、本実施例における複合体11の製造実施例であることを示す。また、本実施例におけるFab2は実施例1で得られた抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント(PB009-01/Fab2)であり、「p-Fab」はFab2がそのp個のアミノ基を介してp個の[ ]又は( )中に記載の標識部に結合して複合体を形成していることを示す。なお、以下のいくつかの実施例において、MS解析により確認できた各複合体のFab2が結合する標識部(Y-S1-X)の数を記載しているが、その結果はそれ以外の結合数を有する複合体を含まないことを示すものではない。MS解析機器の精度の関係でその存在を確認できていない結合数の複合体が存在している可能性が残ることは容易に理解されよう。また、本実施例中の構造式において、Gdが結合したDOTAの構造式は、Gdで標識されたDOTAを模式的に示したものである。
(実施例2-11.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(1.00 g)のジクロロメタン(6 mL)溶液に氷冷下でトリフルオロ酢酸(以下TFAと略称)(3 mL)を加え、同温で2時間攪拌した。減圧濃縮した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、濃縮した。この残渣にN-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-アスパラギン酸水素O4-tert-ブチルエステル(920 mg)、ジクロロメタン(10 mL)、ジイソプロピルエチルアミン(以下DIPEAと略称)(2 mL)、ヘキサフルオリドリン酸(1-)1-(ジメチルアミノ)-N,N-ジメチル-1-[(3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-3-イル)オキシ]メタンイミニウム(以下HATUと略称)(1.2 g)を加え、室温で16時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、濃縮することで標題化合物(2.86 g)を得た。MS(ESI+); 809.5[M+Na]+
O4-tert-ブチル-N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(2.86 g)のテトラヒドロフラン(以下THFと略称)(10 mL)溶液にモルホリン(6 mL)を加え、室温で1時間攪拌した。氷浴下で冷却した後、生じた固体を濾過し、残渣をメタノールで洗浄した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→4%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(1.04 g)を得た。MS(ESI+); 565.5
(iii) N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)-O4-tert-ブチル-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステルの合成
O4-tert-ブチル-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(570 mg)、ジクロロメタン(6 mL)、3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}安息香酸(305 mg)、DIPEA(520 μL)、HATU(575 mg)の混合物を室温で43時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→80%酢酸エチル/ヘキサン)で精製することにより標題化合物(712 mg)を得た。MS(ESI+); 798.6
N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)-O4-tert-ブチル-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(712 mg)のジクロロメタン(2 mL)溶液に氷冷下でTFA(2 mL)を加え、同温にて7時間攪拌した。トリエチルアミン、アミノシリカゲルを加え減圧下濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(アミノシリカゲル,溶媒勾配;0→2%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(495 mg)を得た。MS(ESI+); 698.4
(v) O4-tert-ブチル-N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステルの合成
N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-O4-tert-ブチル-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(495 mg)、N, N-ジメチルホルムアミド(以下DMFと略称)(5 mL)、[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]酢酸(以下DOTA-tris(t-Bu)esterと略称)(446 mg)、DIPEA(400 μL)、HATU(404 mg)の混合物を室温で66時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→20%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(387 mg)を得た。MS(ESI+); 1275.5[M+Na]+
O4-tert-ブチル-N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-α-アスパルチルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(387 mg)、10%パラジウム担持炭素(50%含水、65 mg)、エタノール(4 mL)の混合物を水素雰囲気下(1 atm)室温で5時間攪拌した。セライトを用いてその混合物を濾過、濃縮した。残渣に10%パラジウム担持炭素(50%含水、650 mg)、エタノール(8 mL)を加え、この混合物を水素雰囲気下(1 atm)室温で20時間攪拌した。その混合物を、セライトを用いて濾過後、濃縮することにより標題化合物(336 mg)を得た。MS(ESI+); 1140.5[M+Na]+
(vii) O4-tert-ブチル-N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-α-アスパルチルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルの合成
O4-tert-ブチル-N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-α-アスパルチルグリシル-L-リシン tert-ブチルエステル(336 mg)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(2.5 mL)の混合物に2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸メチルエステル(56 mg)、THF(5 mL)の溶液を氷冷下にて加え、この混合物を同温にて2時間攪拌した。氷冷下、1M水酸化ナトリウム水溶液(60 μL)を加えた後、室温で1時間攪拌した。酢酸エチル、10%クエン酸水溶液を加えた後、有機層を分離した。水層を10%メタノール/クロロホルムで抽出し、集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→20%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(341 mg)を得た。MS(ESI+); 1198.5
O4-tert-ブチル-N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-α-アスパルチルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(341 mg)、のジクロロメタン(2 mL)溶液にTFA(2 mL)を加え、室温で5時間攪拌した。減圧濃縮した後、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→20%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(99.6 mg)を得た。MS(ESI+); 918.3
(ix) [N-{3-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]ベンゾイル}-L-α-アスパルチルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウムの合成
N-[3-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-α-アスパルチルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(20.0 mg)、水(2 mL)、塩化ガドリニウム(6 mg)の混合物に炭酸水素ナトリウム水溶液(0.1 M、800 μL)を加え、室温で10分間攪拌した。炭酸水素ナトリウム水溶液(0.1 M、60 μL)を加え、室温で1時間攪拌した。エチレンジアミン四酢酸(以下EDTAと略称)水溶液(0.5 M、300 μL)を加え、室温で10分間攪拌した。反応混合物を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→25%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(12.0 mg)を得た。MS(ESI-); 1071.4
[N-{3-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]ベンゾイル}-L-α-アスパルチルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウム(1 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させた。その溶液40 μLを分注し、0.1Mホウ酸緩衝液(40 μL)を加え、pH6.6になるように0.1M炭酸ナトリウム水溶液を加えた。
4.45 mg/mL Fab2のホウ酸緩衝液(160μL)に、先に調製した溶液を加え、30℃で2時間インキュベートした。0.05 M EDTA水溶液(40 μL)を加えた後、30℃で10分間インキュベートした。PD-10 カラムで精製し、アミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルター(メルクミリポア社)を用いて回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄を7回繰り返し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1073の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-12.([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-フェニルアラニン (1.5 g) のジクロロメタン(30 ml) 混合液に、N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル一塩酸塩 (2.1 g), Et3N (2.4 mL)とHATU (2.5 g)を順番に加え、室温で、一晩反応した。
反応混合物を濃縮後、シリカゲルカラム(溶媒勾配;10→50%酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、標題化合物 (3.16 g)を得た。MS(ESI+): 606.4 [M+Na]+
(ii) N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-フェニルアラニル-L-リシンtert-ブチルエステルの合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-フェニルアラニル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル (3150 mg)のエタノール (60 ml)、10%パラジウム担持炭素(50%含水、1000 mg)の混合物を、水素雰囲気下(1 atm)室温で4時間半攪拌した。原料が残存していたため、系内をアルゴン置換後、混合物をセライトろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をメタノール (60 ml) に溶かし、10%パラジウム担持炭素(50%含水、1000 mg) 加えた混合物を、水素雰囲気下(1 atm)室温で5時間攪拌した。原料消失を確認後、系内をアルゴン置換し、混合物をセライトろ過し、ろ液を濃縮し、標題化合物 (2520 mg)を得た。MS(ESI+): 450.4
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-フェニルアラニル-L-リシンtert-ブチルエステル (825 mg) の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (6 ml) 懸濁液に、2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸メチルエステル(340 mg)のTHF (12 ml) 溶液を氷冷下、加えた。同温で、2時間攪拌後、1M水酸化ナトリウム水溶液 (0.36 ml) を加え、1時間室温で攪拌した。混合物を酢酸エチルと水で希釈後、10% クエン酸水溶液で酸性にした。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (溶媒勾配;0→8% メタノール/クロロホルム) で精製し、標題化合物 (743 mg)を得た。MS(ESI+): 552.4 [M+Na]+
(iv) L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(325 mg)のジクロロメタン (4 ml) 溶液に、氷冷下、TFA (2 ml) を滴下した。混合物を同温で、1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、標題化合物 (418 mg) の粗生成物を得た。MS(ESI+):430.4
L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(415 mg) のジクロロメタン (10 ml) 混合物に、N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシン(118 mg) 、トリエチルアミン(以下TEAと略称)(0.26 ml)、HATU (256 mg) を順に加え、混合物を室温で一晩攪拌した。混合物を減圧濃縮後、シリカゲルカラム (溶媒勾配;0→30%アセトン/クロロホルム) で精製し、標題化合物 (206 mg)を得た。MS(ESI+): 609.4 [M+Na)+
N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(205 mg) を用いて、上記実施例2-12(iv)と同様にして、標題化合物(223 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+): 487.4
(vii) グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(9 mg) のジクロロメタン (1 ml) 混合物に、TFA (1 ml) を加え、室温で1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、標題化合物(8 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+): 431.3
グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンモノ(トリフルオロ酢酸)塩(8 mg) と2,2’,2’’,2’’’-{2-[(4-イソチオシアナトフェニル)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトライル}四酢酸(p-SCN-Bn-DOTAと略称)(8 mg) の DMF (1 ml) 混合物に、DIPEA (35 μL) を加え、室温で、1.5 時間攪拌した。混合物を1% TFA水溶液 (約5 ml)で希釈し、逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配5-50% アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製し、標題化合物(13 mg)を得た。MS(ESI+): 982.3
(ix) ヒドロゲン=[N-{[4-({1,4,7,10-テトラキス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-2-イル-κ4N1,N4,N7,N10}メチル)フェニル]カルバモチオイル}グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(4-)]ガドリナート(1-)の合成
N-[(4-{[1,4,7,10-テトラキス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-2-イル]メチル}フェニル)カルバモチオイル]グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(12 mg) を水 (5 ml) で希釈し、塩化ガドリニウム (4 mg) を加えた。0.1 M 炭酸水素ナトリウムで、混合物のpHを 5-6 に調節し、室温で、1時間攪拌した。混合物に0.5 M EDTA 水溶液(80 μL)を加え、室温で5分攪拌した。TFA (10 μL)を加えた後、逆相カラムクロマトグラフィー (溶媒勾配5-50% アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製し、標題化合物(5 mg)を得た。MS(ESI+): 1137.0
(x) 複合体No.12の合成
ヒドロゲン=[N-{[4-({1,4,7,10-テトラキス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-2-イル-κ4N1,N4,N7,N10}メチル)フェニル]カルバモチオイル}グリシル-L-フェニルアラニル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(4-)]ガドリナート(1-)を用いて、上記実施例2-11の工程(x)と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1136の[Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-13.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル(1.00 g)のジクロロメタン(6 mL)溶液に氷冷下でTFA(3 mL)を加え、同温にて2時間攪拌した。減圧濃縮した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、濃縮した。この残渣にN-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニン(556 mg)、ジクロロメタン(10 mL)、DIPEA(2 mL)、HATU(1.16 g)を加え、室温で1時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を1M水酸化ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、濃縮することで標題化合物(1.70 g)を得た。MS(ESI+); 625.5
(ii) L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステルの合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(1.70 g)のジクロロメタン(10 mL)溶液に氷冷下でTFA(4 mL)を加え、同温にて7時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(アミノシリカゲル,溶媒勾配;0→4%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(663 mg)を得た。MS(ESI+); 525.4
L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル(663 mg)、ジクロロメタン(6 mL)、3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}安息香酸(480 mg)、DIPEA(700 μL)、HATU(960 mg)の混合物を室温で39時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→100%酢酸エチル/ヘキサン)で精製することにより標題化合物(935 mg)を得た。MS(ESI+); 758.5
(iv) N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステルの合成
N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(935 mg)のジクロロメタン(2 mL)溶液に氷冷下でTFA(2 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。Et3N、アミノシリカゲルを加え減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(アミノシリカゲル,溶媒勾配;0→10%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(260 mg)を得た。MS(ESI+); 658.5
N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(260 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(v)と同様にして、標題化合物(353 mg)を得た。MS(ESI-): 1210.4
(vi) N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-L-リシン tert-ブチルエステルの合成
N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(353 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(vi)と同様にして、標題化合物(245 mg)を得た。MS(ESI+): 1078.8
N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-L-リシン tert-ブチルエステル(245 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(vii)と同様にして、標題化合物(139 mg)を得た。MS(ESI+): 1158.8
(viii) N-[3-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-[3-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(341 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(viii)と同様にして、標題化合物(38.2 mg)を得た。MS(ESI+): 934.4
(ix) [N-{3-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]ベンゾイル}-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウムの合成
N-[3-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(28 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(ix)と同様にして、標題化合物(13.8 mg)を得た。MS(ESI+): 1089.2
(x) 複合体No.13の合成
[N-{3-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]ベンゾイル}-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウムを用いて、上記実施例2-11の工程(x)と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1089の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体、及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-15.([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(400 mg)のジクロロメタン(4 mL)溶液に氷冷下でTFA(4 mL)を加え、氷冷下で1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮することにより標題化合物(642 mg)を得た。MS(ESI+); 340.4
(ii) N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルの合成
グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(642 mg)、ジクロロメタン(6 mL)の混合物に氷冷下で3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}安息香酸(228 mg)、DIPEA(1.5 mL)、HATU(345 mg)を加え、この混合物を室温で2時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→4%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(489 mg)を得た。MS(ESI+); 573.4
(iii) N-[3-(17,17-ジメチル-3,15-ジオキソ-5,8,11,16-テトラオキサ-2,14-ジアザオクタデカン-1-イル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルの合成
N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(489 mg)、アニソール(280 μL)、ジクロロメタン(5 mL)の混合物に氷冷下でTFA(2 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、ジクロロメタン(7 mL)を加え、氷冷下で2,2-ジメチル-4-オキソ-3,8,11,14-テトラオキサ-5-アザヘキサデカン-16-酸(289 mg)、DIPEA(1.5 mL)、HATU(487 mg)を加え、この混合物を室温で2時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→1%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(427 mg)を得た。MS(ESI+); 762.5
N-[3-(17,17-ジメチル-3,15-ジオキソ-5,8,11,16-テトラオキサ-2,14-ジアザオクタデカン-1-イル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(427 mg)、アニソール(200 μL)、ジクロロメタン(4 mL)の混合物に氷冷下でTFA(1.3 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、DMF(6 mL)を加え、氷冷下でDOTA-tris(t-Bu)ester(353 mg)、DIPEA(0.96 mL)、HATU(320 mg)を加え、この混合物を室温で2時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→10%メタノール/クロロホルム)で精製することにより、標題化合物(863 mg)を得た。MS(ESI+): 1238.9[M+Na]+
(v) N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(863 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(viii)と同様にして、標題化合物(40.0 mg)を得た。MS(ESI+): 992.5
(vi) [N-{3-[3-オキソ-15-(オキソ-κO)-16-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウムの合成
N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(40 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(ix)と同様にして、標題化合物(15.9 mg)を得た。MS(ESI-): 1145.0
(vii) 複合体No.15の合成
(実施例2-24.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)の合成)
複合体No.24の合成(イミノチオラン経由コンジュゲーション)
4.45 mg/mL Fab2のホウ酸緩衝液(160 μL)に2 mg/mL 2-イミノチオラン(以下、2-ITと略称)の0.1Mホウ酸緩衝液(5 μL)を加え、37℃で40分間インキュベートした。過剰の2-ITはアミコンウルトラ-0.5mL 遠心式フィルターを用い、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄を3回繰り返し、最後に濃縮した。
実施例2-13(ix)で合成した[N-{3-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]ベンゾイル}-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウム(1 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させた。その溶液に0.1 Mホウ酸緩衝液(40 μL)を加え、pH 6.0になるように0.1 M炭酸ナトリウム水溶液を加えた。
抗体を含む得られた濾液に調製したリンカー溶液を加え、30℃で2時間インキュベートした。EDTA含有リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)を加えた後、30℃で10分間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で7回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1190の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-29.([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)の合成)
2,2-ジメチル-4-オキソ-3,8,11,14-テトラオキサ-5-アザヘキサデカン-16-酸(396 mg)のジクロロメタン(10 mL)溶液に3-(アミノメチル)安息香酸メチルエステル一塩酸塩(286 mg)、HATU(590 mg)、Et3N(900 μL)を加え、室温にて2時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;2→6%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(598 mg)を得た。MS (ESI+); 455.2
(ii)3-(17,17-ジメチル-3,15-ジオキソ-5,8,11,16-テトラオキサ-2,14-ジアザオクタデカン-1-イル)安息香酸の合成
3-(17,17-ジメチル-3,15-ジオキソ-5,8,11,16-テトラオキサ-2,14-ジアザオクタデカン-1-イル)安息香酸メチルエステル(597 mg)のTHF (15mL)溶液に1M水酸化ナトリウム水溶液(4 mL)及び水(5 mL)を加え、室温にて5時間攪拌した。反応溶液を水で希釈し、10%クエン酸を加えた後、酢酸エチルで抽出し、集めた有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、濾液を減圧濃縮することで標題化合物(662 mg)を得た。MS (ESI+); 441.1
(iii) N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルの合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(1.63 g)、ジクロロメタン(5 mL)の混合物に氷冷下でTFA(3 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した。N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニン(1.11 g)、ジクロロメタン(8 mL)、HATU(2.12 g)の混合物にDIPEA(5 mL)を加え、室温で5分間攪拌した。この反応混合物に先の反応で得られた残渣のジクロロメタン(4 mL)溶液を加え、室温で20時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→5%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(1.63 g)を得た。MS(APCI/ESI+); 571.3
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(150 mg)、ジクロロメタン(2 mL)の混合物に氷冷下でTFA(2 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した。3-(17,17-ジメチル-3,15-ジオキソ-5,8,11,16-テトラオキサ-2,14-ジアザオクタデカン-1-イル)安息香酸(120 mg)、ジクロロメタン(3 mL)、HATU(150 mg)の混合物にDIPEA(360 μL)を加え、室温で5分間攪拌した。この反応混合物に先の反応で得られた残渣のジクロロメタン(2 mL)溶液を加え、室温で1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→5%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(113 mg)を得た。MS(ESI+); 893.4
(v) N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-[3-(17,17-ジメチル-3,15-ジオキソ-5,8,11,16-テトラオキサ-2,14-ジアザオクタデカン-1-イル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(113 mg)とジクロロメタン(2 mL)の混合物に氷冷下でTFA(2 mL)を加え、同温にて1時間攪拌後、減圧濃縮し、粗生成物を得た。DOTA-tris(t-Bu)ester(80 mg)とHATU(80 mg)及びジメチルアセトアミド(以下DMAcと略称)(1 mL)の混合物にDIPEA(0.22 mL)を室温にて加え10分攪拌した後、先に得られた粗生成物のDMAc(1 mL)混合物を加え、同温で2時間攪拌した。反応混合物は逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(178 mg)を得た。MS(ESI-): 1345.8
(vi) N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩(178 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(viii)と同様にして、標題化合物(60.0 mg)を得た。MS(APCI/ESI+): 1123.4
N-(3-{3,15-ジオキソ-16-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル}ベンゾイル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(40 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(ix)と同様にして、標題化合物(10.3 mg)を得た。MS(ESI+): 1278.3
(viii) 複合体No.29の合成
[N-{3-[3-オキソ-15-(オキソ-κO)-16-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル]ベンゾイル}-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウムを用いて、上記実施例2-11の工程(x)と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1278の[Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-33.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(150 mg)、ジクロロメタン(2 mL)の混合物に氷冷下でTFA(2 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した。2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボン酸(88 mg)、ジクロロメタン(2 mL)、HATU(150 mg)、DIPEA(360 μL)の混合物に、先の反応で得られた残渣のジクロロメタン(2 mL)溶液を加え、室温で1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→6%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(231 mg)を得た。MS(APCI/ESI+); 752.2[M+Na]+
(ii) N-(2-{[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-[2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(231 mg)を用いて、上記実施例2-29の工程(v)と同様にして、標題化合物(222 mg)を得た。MS(ESI-): 1182.7
(iii) N-(2-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-(2-{[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩(222 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(viii)と同様にして、標題化合物(53 mg)を得た。MS(APCI/ESI+): 960.2
N-(2-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(22 mg)を用いて、上記実施例2-11の工程(ix)と同様にして、標題化合物(7.0 mg)を得た。MS(ESI+): 1115.3
(v) 複合体No.33の合成
(iv)の化合物を用いて、上記実施例2-11の工程(x)と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1115の[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-35.([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)の合成)
複合体No.35の合成
実施例2-29(vii)で合成した[N-{3-[3-オキソ-15-(オキソ-κO)-16-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-トリオキサ-2,14-ジアザヘキサデカン-1-イル]ベンゾイル}-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(3-)]ガドリニウムを用いて、上記実施例2-24の工程と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1380の[Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]が1つ結合した複合体であることをMS解析により確認した。
(実施例2-40.([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(690 mg)を用いて、上記実施例2-33の工程(i)と同様にして、標題化合物(710 mg)を得た。MS(ESI+): 726.5[M+Na]+
(ii) N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(41 mg) を用いて、上記実施例2-12(iv)と同様にして、標題化合物(42 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+): 604.3
(iii) N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(41 mg) のジクロロメタン (4 ml) 混合物に、TFA (2 ml) を加え、室温で1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮後、トルエン共沸して粗生成物(43 mg)を得た。そのうち16 mgを逆相カラムクロマトグラフィー (溶媒勾配;5→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製し、標題化合物(11 mg)を得た。MS(ESI+): 548.2
(iv) N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-テトラキス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-2-イル]メチル}フェニル)カルバモチオイル]アミノ}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンモノ(トリフルオロ酢酸)塩(11 mg)を用いて、実施例2-12の工程(viii)と同様にして、標題化合物(17 mg)を得た。MS(ESI+): 1099.5
N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-テトラキス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-2-イル]メチル}フェニル)カルバモチオイル]アミノ}メチル)ベンゾイル]-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン (16 mg) を用いて、実施例2-12の工程(ix)と同様にして、標題化合物(6 mg)を得た。MS(ESI+): 1254.6
(vi) 複合体No.40の合成
ヒドロゲン=[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-テトラキス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-2-イル-κ4N1,N4,N7,N10}メチル)フェニル]カルバモチオイル}アミノ)メチル]ベンゾイル}-L-メチオニルグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシナト(4-)]ガドリナート(1-)を用いて、上記実施例2-24の工程と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1355の[Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-47:([Gd/DOTA]p-Fab2)の合成)
(i)17.8 mg/mL Fab2(60 μL)の0.1 Mリン酸水素二ナトリウム水溶液(390 μL)に調製したN-ヒドロキシスルホスクシンイミジルDOTA溶液(200 μL)を加え、4℃で23時間インキュベートした。過剰のリンカーはアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用い10mMリン酸緩衝液で洗浄を3回繰り返し、0.3Mの酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。
(実施例2-48: ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2)の合成)
(実施例2-60:([DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)の合成)
(3-ホルミルフェノキシ)酢酸ベンジルエステル(2.90 g)、2-メチルプロパン-2-オール(60 mL)および水(30 mL)の混合物に、室温で2-メチルブタ-2-エン(6 mL)、リン酸二水素ナトリウム二水和物(3.35 g)および亜塩素酸ナトリウム(3.64 g)を加え、2時間撹拌した。反応液に酢酸エチルと1 M塩酸(60 mL)を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した。濾液を濃縮することで標題化合物(2.93 g)を得た。MS(ESI-); 285.1
(ii) N-[(ベンジルオキシ)カルボニル]グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステルの合成
N-[(ベンジルオキシ)カルボニル]グリシル-L-チロシン tert-ブチルエステル(2.49 g)をアセトン(50 mL)に溶解し、ブロモ酢酸エチルエステル(2.05 g)、炭酸カリウム(2.41 g)を加え、室温で4時間撹拌した。不溶物を濾去し、濾液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:ヘキサン=30:70-60:40)で精製して、標題化合物(2.99 g)を得た。MS(ESI+): 537.4 [M+Na]+
(iii) N-{3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステルの合成
N-[(ベンジルオキシ)カルボニル]グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステル(2.75 g)をエタノール(55 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下、10%パラジウム担持炭素(50%含水、550 mg)を加え、水素雰囲気下(1 atm)室温で終夜撹拌した。系内をアルゴン置換後、不溶物を濾去、濾液を濃縮し、残渣をジクロロメタン(55 mL)に溶解し、3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]安息香酸(1.99 g)、HATU (2.84 g)、Et3N (1.5 mL)を加え、室温で1時間撹拌した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:ヘキサン=30:70-70:30)で精製して、標題化合物(3.07 g)を得た。MS(ESI-): 647.4
N-{3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステル(3282 mg)をTHF (66 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下、10%パラジウム担持炭素(50%含水、328 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で終夜撹拌した。反応液をセライト濾過し、濾液を濃縮して、標題化合物(2.54 g)を得た。MS(ESI-): 557.4
(v) N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステルの合成
N4-{5-[アセチル(ヒドロキシ)アミノ]ペンチル}-N1-(5-{4-[(5-アミノペンチル)(ヒドロキシ)アミノ]-4-オキソブタンアミド}ペンチル)-N1-ヒドロキシブタンジアミドモノメタンスルホン酸塩(DFO.MeSO3H)(500 mg)、N-[3-(カルボキシメトキシ)ベンゾイル]グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステル(446 mg)、EDC HCl (175 mg)、1H-ベンゾトリアゾール-1-オール(以下HOBtと略称)(123 mg)にDMF (5 mL)、Et3N (0.16 mL)加え、室温で終夜撹拌した。反応液に0.1%TFA水溶液(1 ml)、TFA (0.03 mL)を加え、逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-0:100)にて精製し、標題化合物 (548 mg)を得た。MS(ESI-): 1099.7
(vi) N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(カルボキシメチル)-L-チロシン tert-ブチルエステルの合成
N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステル(500 mg)にメタノール(5 mL)およびDMF (5 mL)を加え、少し加熱して溶解し、1M水酸化ナトリウム水溶液 (600 μL)を加え、室温で終夜撹拌した。1M水酸化ナトリウム水溶液 (600 μL)を追加して、室温で終夜撹拌した。氷冷下でTFA (90 μL)を加え、減圧下メタノールを留去し、得られた溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-0:100)にて精製することで標題化合物 (315 mg)を得た。MS(ESI-): 1071.6
N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(カルボキシメチル)-L-チロシン tert-ブチルエステル(269 mg)、EDC HCl (58 mg)、HOBt (41 mg)の混合物にDMF (4 mL)を加え、更に1-(2-アミノエチル)-1H-ピロール-2,5-ジオン一塩酸塩(44 mg)、Et3N (35 μL)を加え、室温で4時間撹拌した。反応液に0.1%TFA水溶液(1 mL)を加え、逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-0:100)で精製して、原料カルボン酸と標題化合物の混合物(155 mg、約6:4)を得た。これをDMSO (1 mL)およびDMF (2 mL)に溶解させ、EDC HCl (22 mg)、HOBt (15 mg)を加え、室温で5分間撹拌後、1-(2-アミノエチル)-1H-ピロール-2,5-ジオン一塩酸塩(15.5 mg)、Et3N (12 μL)を加え、室温で1時間撹拌した。反応液に0.1%TFA水(1mL)を加え、逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-10:90)にて精製することで、標題化合物 (118 mg)を得た。MS(ESI-): 1193.6
(viii) N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-{[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]アミノ}-2-オキソエチル)-L-チロシンの合成
N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-{[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]アミノ}-2-オキソエチル)-L-チロシン tert-ブチルエステル(118 mg)をTFA (1.2 mL)に溶解し、室温で1.5時間撹拌した。反応液を濃縮し、DMF(1.5ml)、水(0.5ml)を加え、逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-10:90)にて精製することで、標題化合物 (82 mg)を得た。MS(ESI-): 1137.5
0.1Mホウ酸緩衝液にて4.45 mg/mLに調製したFab2溶液に0.1Mホウ酸緩衝液にて調製した2-IT溶液を加え、37℃で30分間インキュベートした。過剰の2-ITはアミコンウルトラ-0.5 mL遠心式フィルターを用いてEDTA含有リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)で洗浄し、最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過した。得られた濾液に、DMFに溶解させたN-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-O-(2-{[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]アミノ}-2-オキソエチル)-L-チロシンを加え、0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.5)で希釈し、室温で2時間インキュベートした。過剰の試薬はアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用いEDTA含有リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)で洗浄し、それを3回繰り返し、最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過した。
続いて、得られた上澄みに、リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)にて10 mg/mLに調製した2-ヨードアセトアミド溶液を加えた後、37℃で30分間インキュベートした。過剰のヨードアセトアミドはアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用いリン酸緩衝生理食塩水で洗浄を3回繰り返し、最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、Fab2が結合した複合体を精製した。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1241の[DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]が1つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-61:([DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)の合成)
3-ヒドロキシ安息香酸(1.0 g) とグリシンtert-ブチルエステル一塩酸塩(1.2 g)のDMF (10 mL) 混合物に氷冷下HATU (3.3 g)およびDIPEA (3 mL)を加え、室温にて1時間攪拌した。混合物に水および酢酸エチルを加えて二回分液抽出し、有機層を水及び飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧濃縮し、得られた固体に酢酸エチルを加え室温にて攪拌したのち不溶物を濾取し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=95/5-50/50)にて精製し目的物のフラクションを集めて濃縮し、減圧乾燥して、標題化合物 (1.23 g)を得た。MS(ESI+): 274.2 [M+Na]+
(ii)3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}プロパン酸 ベンジルエステルの合成
氷冷下3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}プロパン酸 tert-ブチルエステル(3.0 g)に4M塩化水素/ジオキサン (10 mL) を加えたのち、その混合物を室温にて1時間攪拌した。濃縮後, トルエンで2度共沸乾燥を行った後、室温にてメタノール(20 mL) と1M水酸化ナトリウム水溶液(13 mL)を加え、同温で1時間半攪拌した。混合物を濃縮した後、THF(10 mL),メタノール(10 mL) 及び臭化ベンジル(1.8 mL) を加え、室温にて3日間攪拌した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製(ヘキサン/酢酸エチル=95/5-0/100 → クロロホルム/メタノール=90/10)し、標題化合物(2.19 g)を得た。MS(ESI+): 313.2
(iii) N-{3-[(3-オキソ-1-フェニル-2,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-14-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシン tert-ブチルエステルの合成
N-(3-ヒドロキシベンゾイル)グリシン tert-ブチルエステル(915 mg)、3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}プロパン酸ベンジルエステル(1.38 g)、アゾジカルボン酸ジエチル(40%トルエン溶液, 約2.2M、3.4 mL)、THF (20 mL)を加え、その後室温でトリフェニルホスフィン(2.0 g)を少しずつ加えた後、バス温60℃で終夜攪拌した。塩化マグネシウム(1.5 g)およびトルエン(20 mL)を加え、バス温60℃で2時間加熱撹拌した。室温まで放冷したあと、析出した固体を濾過で除去し、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製(シリカゲル;ヘキサン/酢酸エチル=95/5-20/80)した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて再度精製(アミノシリカゲル; ヘキサン/酢酸エチル= 95/5-50/50)し、標題化合物(1.12 g)を得た。MS(ESI+): 546.4
(iv) N-{3-[(3-オキソ-1-フェニル-2,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-14-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシンの合成
室温にてN-{3-[(3-オキソ-1-フェニル-2,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-14-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシン tert-ブチルエステル(1.11 g)を4M 塩化水素/ジオキサン(5 mL)に溶解させ、同温にて2時間攪拌した。混合物を濃縮し、減圧乾燥して標題化合物(1.12 g)を得た。MS(ESI+): 490.3
N-{3-[(3-オキソ-1-フェニル-2,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-14-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシン(1300 mg)、N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル一塩酸塩 (1.0 g)のDMF (20 mL)溶液に氷冷下HATU (1.2 g)及びDIPEA (1.4 mL)を加え、室温にて2時間攪拌した。混合物に水および酢酸エチルを加えて分液抽出し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製(アミノシリカゲル;ヘキサン/酢酸エチル= 90/10-0/100)し、標題化合物 (1.14 g) を得た。MS(ESI+): 808.5
(vi) N-[3-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)ベンゾイル]グリシル-L-リシン tert-ブチルエステルの合成
N-{3-[(3-オキソ-1-フェニル-2,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-14-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシン tert-ブチルエステル(1.12 g), Et3N (20 μL)及びエタノール(20 mL)の混合物に、10%パラジウム担持炭素(50%含水、200 mg)を室温で加え、水素雰囲気下、同温にて終夜撹拌した。開放系にして30分以上室温攪拌後、反応液をセライト濾過し、濾液を濃縮して、標題化合物(825 mg)を得た。MS(ESI+): 584.5
(vii) N-[3-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステルの合成
N-[3-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)ベンゾイル]グリシル-L-リシン tert-ブチルエステル(350 mg)、THF (3 mL)及びDMF (1 mL)の混合物に室温にて2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸メチルエステル(150 mg)及びEt3N (500 μL)を加え、バス温度60℃にて4日間攪拌した。混合物を室温まで冷却後、TFA (300 μL)及び水(500 μl) を加えて中和した。その混合物に水とDMFを適量加えて、逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-0:100)で精製した。目的物のフラクションを集めて濃縮し、減圧乾燥して、標題化合物(250 mg)を得た。MS(ESI+): 664.5
N4-{5-[アセチル(ヒドロキシ)アミノ]ペンチル}-N1-(5-{4-[(5-アミノペンチル)(ヒドロキシ)アミノ]-4-オキソブタンアミド}ペンチル)-N1-ヒドロキシブタンジアミドモノメタンスルホン酸塩(DFO.MeSO3H)(240 mg)、N-[3-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(243 mg)のDMF (3 mL)及びDMSO (1 mL)の混合物に氷冷下EDC HCl(140 mg), HOBt (100 mg)及びDIPEA (200 μL) を加え、室温にて3時間攪拌した。TFA(100 μL)及び水(500 μL)を加え、その溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-10:90)で精製し、凍結乾燥して標題化合物 (207 mg)を得た。 MS(ESI+): 1228.5 [M+Na]+
(ix) N-{3-[(19,30,41-トリヒドロキシ-12,20,23,31,34,42-ヘキサオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,19,24,30,35,41-ヘキサアザトリテトラコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
室温にてN-{3-[(19,30,41-トリヒドロキシ-12,20,23,31,34,42-ヘキサオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,19,24,30,35,41-ヘキサアザトリテトラコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン tert-ブチルエステル(202 mg)にTFA (1 mL)を加え、同温にて1時間攪拌した。混合物を濃縮し、DMF(4 ml)及び水(500 μL)を加えた混合物を逆相カラムクロマトグラフィー(0.1%TFA水溶液:アセトニトリル=95:5-10:90)で精製し、凍結乾燥して標題化合物(137 mg)を得た。MS(ESI-): 1148.7
(x) 複合体No.61の合成
N-{3-[(19,30,41-トリヒドロキシ-12,20,23,31,34,42-ヘキサオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,19,24,30,35,41-ヘキサアザトリテトラコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンを用いて、上記実施例2-60の工程(ix)と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1252の[DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-18.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab2)の合成)
窒素雰囲気下、カルボノクロリド酸4-ニトロフェニルエステル (952 mg)のジクロロメタン(10 ml)溶液を氷冷し、[(4-アミノフェニル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステル (1000 mg) 及びピリジン (430 μL) のジクロロメタン (10 mL)混合溶液を滴下した後、同温で1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;10→100%酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、粗生成物を得た。粗生成物に酢酸エチルを加え攪拌して固体を粉砕した。固体をろ取し、酢酸エチルで洗浄後、減圧乾燥することで標題化合物 (861 mg)を得た。MS(ESI+): 410.3 [M+Na]+
(ii) L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミド (257 mg)のジクロロメタン (4 ml) 溶液に、氷冷下、TFA (2 ml) を滴下した。混合物を同温で、1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、ジイソプロピルエーテルを加え、デカンテーションを2回行い沈殿した固体を洗浄し、標題化合物 (248 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+):385.3
(iii) N-[(4-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}フェニル)カルバモイル]-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドの合成
(4-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}フェニル)カルバミン酸4-ニトロフェニルエステル (54 mg) とL-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドモノ(トリフルオロ酢酸)塩 (70 mg)のジクロロメタン(5 ml)混合溶液にTEA (59 μL)を加え、室温で30分間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;2→6%メタノール/クロロホルム)で精製し、標題化合物 (55 mg)を得た。MS(ESI+): 633.5
N-[(4-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}フェニル)カルバモイル]-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミド (54 mg)のジクロロメタン (4 ml) 溶液に、氷冷下、TFA (2 ml) を滴下し、同温で1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、ジイソプロピルエーテルを加えデカンテーションを2回行い沈殿した固体を洗浄し、標題化合物(65 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+):555.4 [M+Na]+
(v) N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-{[4-(アミノメチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドモノ(トリフルオロ酢酸)塩 (64 mg)、DOTA-tris(t-Bu)ester(50 mg)のDMAc(2 mL)混合溶液にHATU(66 mg)、DIPEA(45 μL)を加え、室温で2時間攪拌した。反応混合物に1% TFA水溶液(約4 ml) 及び アセトニトリル (約1 ml)を加えた後、その希釈溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;20→100% 0.1%TFAアセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(92 mg)を得た。MS(ESI+):1109.4 [M+Na]+
(vi) N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩 (90 mg)のジクロロメタン (4 mL)溶液にTFA (4 mL)を加え、室温で終夜攪拌した。減圧濃縮した後、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;5→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(57 mg)を得た。MS(ESI+):919.4
(vii) [N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウムの合成
N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩 (22 mg)、水(3 mL)の混合物に塩化ガドリニウム(8 mg)を加え、0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてpH 5-6に調整し、室温で1時間攪拌した。反応混合物にTFA (10 μL)を加えた後、その溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;5→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(16 mg)を得た。MS(ESI-):1072.1
実施例2-18(vii)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム(1 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させた。その溶液に0.1 Mホウ酸緩衝液(40 μL)を加え、0.1 M炭酸ナトリウム水溶液及び0.25M 酢酸緩衝液を用いてpH 7.3に調整した。
4.45 mg/mL Fab2のホウ酸緩衝液(160μL)に、先に調製した溶液を40μL加え、30℃で2時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で7回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1074の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び、3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(i)複合体No.66の合成
実施例2-18(vii)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム(1 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させた。その溶液に0.1 Mホウ酸緩衝液(40 μL)を加え、0.1 M炭酸ナトリウム水溶液を用いてpH 6.5に調整した。
4.45 mg/mL Fab2のホウ酸緩衝液(320μL)に、先に調製した溶液を加え、30℃で2時間インキュベートした。0.05MのEDTAを10 μL加え、30℃で10分間インキュベートした。アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターを用い、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、溶液を回収した。
回収した溶液に20 mM ビストリスプロパン緩衝溶液 (pH 9.5)を加え5倍量に希釈し、5 mL HiTrap Q column (GE Healthcare) に担持させ、室温で6時間静置した。20 mM ビストリスプロパン緩衝溶液 (pH 9.5)及び1 M 塩化ナトリウム水溶液を用いカラムを洗浄して,担持溶液を回収した。アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターを用いてリン酸緩衝生理食塩水へと緩衝溶液交換を行った後、その溶液をPD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1092の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 and/or A-5)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体、3つ結合した複合体及び4つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(i)複合体No.67の合成
実施例2-18(vii)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム(2 mg)をDMSO(80 μL)に溶解させ 0.1Mホウ酸緩衝液(80 μL) を加えた後0.1 M 炭酸ナトリウム水溶液を用いてpH7.3に調整した。
4.45 mg/mL Fab2のホウ酸緩衝液(320 μL)に0.1Mホウ酸緩衝液にて調製した2 mg/mLの2-IT溶液(10 μL)を加え、37℃で40分間インキュベートした。過剰の2-ITはアミコンウルトラ-15 mL遠心式フィルターを用いてリン酸緩衝生理食塩水で洗浄、200μLまで濃縮した後、先に調整した溶液を加え、30℃で2時間インキュベートした。0.05MのEDTA(10μL)を加え、30℃で10分間インキュベートした後、PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。
当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1175の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-68.[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab2)の合成)
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-イソロイシン (3.00 g)とHATU (5.92 g)のジクロロメタン(30 ml)混合溶液にDIPEA (6.6 mL), (2-アミノエチル)カルバミン酸ベンジルエステル一塩酸塩 (3.29 g)を順番に加え、室温で、1時間攪拌した。反応混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、濃縮した。残渣に酢酸エチル/ジクロロメタン(1:2)溶液を200 mLを加えた後、濃縮し100mL溶液とした後、氷冷した。析出した固体をろ取し、酢酸エチル/ジクロロメタン(1:1)溶液で洗浄して固体を得た。ろ液を再度濃縮後、氷冷し、析出した固体をろ取して酢酸エチル/ジクロロメタン(1:1)溶液で洗浄し固体を得た。得られた固体を合わせ、減圧乾燥することで標題化合物(4.10 g)を得た。MS(ESI+): 408.3
(ii) N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミドの合成
N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-N2-(tert-ブトキシカルボニル)-L-イソロイシンアミド (2.00 g)のジクロロメタン(10 mL)溶液に氷冷下でTFA(7.51 mL)を加え、同温で1時間攪拌した。減圧濃縮した後、この残渣にN-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニン (1.35 g)、DIPEA(4.2 mL)、ジクロロメタン(20 mL)及び HATU(2.24 g)を加え、室温で1時間攪拌した。析出した固体をろ取しジクロロメタン及びメタノールで洗浄後、減圧乾燥することで標題化合物(1.58 g)を得た。MS(ESI+): 539.4
(iii) L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミドの合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミド (1.05 g)のジクロロメタン (6 ml) 溶液に、氷冷下、TFA (3 ml) を滴下した。混合物を同温で、2時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、ジクロロメタン及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、濃縮することで標題化合物(690 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+):439.4
アルゴン雰囲気下、4-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}安息香酸 (395 mg), TEA (660 μL) 及びトルエン (20 mL)の混合溶液にホスホロアジド酸ジフェニルエステル (680 μL)を加え、室温で1時間攪拌後、バス温100℃にて2時間攪拌した。反応溶液を室温まで放冷し、L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミド (690 mg) のTHF (7 mL)溶液を加え、室温で3時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、炭酸水素ナトリウム水溶液及び酢酸エチルを加え、生じた固体を濾過、酢酸エチルで洗浄後、減圧乾燥することで標題化合物(790 mg)を得た。MS(ESI+):687.5
(v) N-{[4-(アミノメチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミドの合成
N-[(4-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}フェニル)カルバモイル]-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミド (790 mg)のジクロロメタン (3 ml) 溶液に、氷冷下、TFA (2 ml) を滴下した。混合物を同温で、1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。析出した固体を濾取し、水で洗浄後、減圧乾燥することで標題化合物(720 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+):587.6
(vi) N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミドの合成
N-{[4-(アミノメチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミド (360 mg)、DOTA-tris(t-Bu)ester(386 mg)、DIPEA(320 μL)のDMAc(2 mL)混合溶液にHATU(280 mg)を加え、室温で2時間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→20%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(683 mg)を得た。MS(ESI+); 1141.9
N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-{[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミド (683 mg)、10%パラジウム担持炭素(50%含水、382 mg)及びメタノール(10 mL)の混合物を水素雰囲気下(1 atm)室温で18時間攪拌した。その混合物を、濾過し不溶物を除去後、濃縮した。残渣に10%パラジウム担持炭素(50%含水、382 mg)及びメタノール(10 mL)を加え、この混合物を水素雰囲気下(1 atm)室温で2時間攪拌した。その混合物を、濾過し不溶物を除去後、濃縮することにより標題化合物(417 mg)を得た。MS(ESI+); 1007.7
(viii) N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-アミノエチル)-L-イソロイシンアミドペンタキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-アミノエチル)-L-イソロイシンアミド (417 mg)、水(210 μL)、トリ(プロパン-2-イル)シラン (210 μL)及びTFA(8 mL)の混合溶液を、室温で3時間攪拌した。減圧濃縮した後、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→33%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(255 mg)を得た。MS(ESI+); 839.7
(ix) N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-{[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-アミノエチル)-L-イソロイシンアミドペンタキス(トリフルオロ酢酸)塩 (255 mg)のDMAc(2 mL)溶液に氷冷下TEA (200 μL)を加え、同温にて10分間攪拌した。その溶液に1,4-ジイソチオシアナトベンゼン (174 mg) のDMAc (2 mL)溶液を加え、同温にて1時間攪拌した。その反応溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(136 mg)を得た。MS(ESI+); 1031.4
N-{[4-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)フェニル]カルバモイル}-L-メチオニル-N1-(2-{[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩 (36 mg)、水(1.8 mL)の混合物に塩化ガドリニウム(10 mg)、0.1 M炭酸水素ナトリウム水溶液(1.7 mL)を加えpH5.4に調整し、室温で30分間攪拌した。反応混合物を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(33.0 mg)を得た。MS(ESI-); 1184.3
(xi)複合体No.68の合成
実施例2-68(x)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-(2-{[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]アミノ}エチル)-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム (1 mg)をDMSO(310 μL)に溶解させた。
4.45 mg/mL Fab2のリン酸緩衝生理食塩水溶液(320 μL)に、先に調製した溶液を30μL加え、0.1 M炭酸ナトリウム水溶液を用いて約pH 9.0に調整し、37℃で24時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1187の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例2-69.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2)の合成)
L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル (303 mg) と2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボン酸 (160 mg)のジクロロメタン(10 mL)混合溶液にTEA(0.24 mL)及びHATU(241 mg)を加え、室温で1時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→4%メタノール/クロロホルム)で精製することにより標題化合物(191 mg)を得た。MS(ESI+); 784.4
(ii) N-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-[2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル (190 mg)のジクロロメタン (3 ml) 溶液に、氷冷下、TFA (1 ml) を滴下した。混合物を同温で、1時間攪拌した後、減圧濃縮することで標題化合物 (262 mg)の粗生成物を得た。MS(ESI+):684.5
(iii) N-(2-{[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
DOTA-tris(t-Bu)ester (138 mg) のDMAc(1 mL)溶液にHATU (184 mg)およびDIPEA (124 μL)を加え、室温で5分攪拌した。その反応溶液にN-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩 (261 mg)のDMAc(1 mL)溶液を加え、室温で2時間攪拌した。反応混合物を1% TFA水溶液(約1 ml)で希釈後、その溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;20→100%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(231 mg)を得た。MS(ESI+); 1260.7 [M+Na]+
N-(2-{[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩 (230 mg)、10%パラジウム担持炭素(50%含水、300 mg)、メタノール(10 mL)の混合物を室温で10分間攪拌した。その混合物を濾過し不溶物を除去した後、ろ液を濃縮した。その残渣に10%パラジウム担持炭素(50%含水、300 mg)、メタノール(10 mL)を加えた後、水素雰囲気下(3 atm)室温で18時間攪拌した。その混合物を濾過し不溶物を除去した後、濃縮することにより標題化合物(152 mg)を得た。MS(ESI+); 1104.5
(v) N-(2-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-L-リシンペンタキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-(2-{[4,7,10-トリス(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-L-リシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩 (152 mg)のジクロロメタン(1 mL)溶液にTFA(1.5 mL)を加え、室温で4時間攪拌した。減圧濃縮した後、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→33%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(76 mg)を得た。MS(ESI+); 880.4
(vi) N-(2-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]-L-リシンテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-(2-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-L-リシンペンタキス(トリフルオロ酢酸)塩 (76 mg), 1,4-ジイソチオシアナトベンゼン (50 mg)のDMAc(1 mL)溶液に氷冷下TEA (60 μL)を加え、同温にて1時間攪拌した。その反応溶液を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→50%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(46 mg)を得た。MS(ESI-); 1070.6
(vii) {N-[2-({4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセチル-κO)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]-L-リシナト(3-)}ガドリニウムの合成
N-(2-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル)-L-メチオニルグリシル-N6-[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]-L-リシンテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩 (16 mg)、水(800 μL)の混合物に塩化ガドリニウム(8 mg)、0.1 M炭酸水素ナトリウム水溶液(700 μL)を加え、室温で30分間攪拌した。反応混合物を逆相カラムクロマトグラフィー(溶媒勾配;0→40%アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(7.4 mg)を得た。MS(ESI-); 1225.3
実施例2-69(vii)で合成した{N-[2-({4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセチル-κO)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]-L-リシナト(3-)}ガドリニウム (1 mg)をDMSO(310 μL)に溶解させた。
4.45 mg/mL Fab2のリン酸緩衝生理食塩水溶液(320 μL)に、先に調製した溶液を30μL加え、0.1 M炭酸ナトリウム水溶液を用いて約pH 9.0に調整し、37℃で24時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.9kDaのFab2の1つに対して、分子量1228の[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体、3つ結合した複合体、4つ結合した複合体及び5つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
上記製造実施例で得られた複合体を表1~2に示す。
表15から18に記載の実施例化合物のMS解析を下表19から23に示す。
実施例2で作製した各抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント複合体について、CEACAM5に対する結合活性を評価するためにELISAを行った。本試験では、抗原固相化液の溶媒として、蒸留水で10倍に希釈して10 mMに調製したりん酸緩衝液(ナカライテスク、0.1mol/L-りん酸緩衝液(pH 7.2))を、洗浄液として、蒸留水で20倍に希釈した20X PBS/Tween 20バッファー(Thermo社、28352)を用いた。また、本試験中に用いるウシ血清アルブミン(BSA)は30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA社、A9576-50ML)を適切な割合になるように添加して使用した。CEACAM5(R&D Systems社、4128-CM-050)を10 mMりん酸緩衝液(pH7.2)で0.1 μg/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色384プレート(Nunc社、460372)に1ウェル当たり30 μL添加し、4℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。CEACAM5固相化液を逆遠心で除去した後に、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを添加することでブロッキングした。その後、逆遠心によりブロッキング溶液を除去し、1.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて、上記各CEACAM5抗体Fab2フラグメント複合体、あるいは対照として標識部を有さないFab2フラグメント(PB009-01)を10000 ng/mL程度の溶液を3倍希釈で14段階希釈し、1ウェル当たり30 μL添加して、室温にて60分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて1000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase:HRP)標識ヤギ抗ヒトIgG (H+L chain)抗体(MBLライフサイエンス社、206)を1ウェル当たり30 μL添加し、室温で30分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、基質としてECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare社、RPN2232)を1ウェル当たり30 μL添加した。室温にて15分間インキュベートした後に、そのシグナル値をEnvisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。
各抗体の試験をデュプリケートで行い、4パラメータロジスティック曲線モデルによりEC50値を算出した。PB009-01についての、9試行のEC50値(nM)の幾何平均(Geometric mean)、標準偏差(Geometric SD factor)、95%信頼区間(95% CI of geo. mean)の下限値(Lower)と上限値(Upper)を表24に示す。また、デュプリケートで試行した各複合体のEC50値を表25に示す。なお、表中Ex-Noは実施例2における複合体番号を示す。
実施例2で作製した各抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント複合体について、CEACAM5に対する結合活性を評価するためにELISAを行った。本試験では、抗原固相化液の溶媒として、蒸留水で10倍に希釈して10 mMに調製したりん酸緩衝液(ナカライテスク、0.1mol/L-りん酸緩衝液(pH 7.2))を、洗浄液として、蒸留水で20倍に希釈した20X PBS/Tween 20バッファー(Thermo社、28352)を用いた。また、本試験中に用いるウシ血清アルブミン(BSA)は30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA社、A9576-50ML)を適切な割合になるように添加して使用した。CEACAM5(R&D Systems社、4128-CM-050)を10 mMりん酸緩衝液(pH7.2)で0.1 μg/mLとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色384プレート(Nunc社、460372)に1ウェル当たり30 μL添加し、4℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。CEACAM5固相化液を逆遠心で除去した後に、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを添加することでブロッキングした。その後、逆遠心によりブロッキング溶液を除去し、1.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて、上記各CEACAM5抗体Fab2フラグメント複合体、あるいは対照として標識部を有さないFab2フラグメント(PB009-01)を10000 ng/mL程度の溶液を3倍希釈で14段階希釈し、1ウェル当たり30 μL添加して、室温にて60分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて1000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase:HRP)標識ヤギ抗ヒトIgG (H+L chain)抗体(MBLライフサイエンス社、206)を1ウェル当たり30 μL添加し、室温で30分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、基質としてECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare社、RPN2232)を1 ウェル当たり30 μL添加した。室温にて15分間インキュベートした後に、そのシグナル値をEnvisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。
複合体には、「X」のペプチドリンカーとして、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを有するものが包含される。これらのリンカーを有する本発明の複合体は、当該リンカー部分において、腎臓に存在するこれらの酵素により特異的に切断されるため、標識部の腎臓への集積性が低減されることが期待される。以下に、本発明のこのような複合体の腎臓集積性の評価結果を示す。
(試験方法)
前記実施例で製造したペプチドリンカーを含む複合体のGd標識複合体を、蛋白質量として一匹当たり0.02 mg(100 μL)となるように、マウス(BALB/c 又は BALB/c nu/nu)の尾静脈より投与した。およそ24時間後に屠殺して腎臓を摘出し、腎臓中のGd量をICP-MSを用いて測定した。各群3例で実施し、3例の平均値を算出し、投与後の腎臓一個あたりに含まれるGd量を、全投与Gd量に対する百分率(% of dose/tissue)で示した。結果を後記表28に示す。表中、Ex-Noは実施例2の複合体番号を示す。また、対照複合体としてペプチドリンカーを含まない、前記製造実施例2-47で製造したEx-No.47([Gd/DOTA]p-Fab)を使用し同様に試験を行い、5試行の幾何平均(Geometric mean)、標準偏差(Geometric SD factor)、95%信頼区間(95% CI of geo. mean)の下限値(Lower)と上限値(Upper)を算出した。
結果を後記表29に示す。当該対照複合体の百分率(% of dose/tissue)を基準として、前記ペプチドリンカーを有する各複合体の腎臓に含まれるGd量の低下割合を求め、表28に示した。表28に示す通り、対照複合体に対して、前記ペプチドリンカーを有する各複合体では標識部の腎臓への集積性が39.6~82.9%ポイント低かった。
(試験方法)
前記実施例で製造したペプチドリンカーを含む複合体のGd標識複合体を、蛋白質量として一匹当たり0.02 mg(100 μL)となるように、マウス(BALB/c 又は BALB/c nu/nu)の尾静脈より投与した。およそ24時間後に屠殺して腎臓を摘出し、腎臓中のGd量をICP-MSを用いて測定した。各群3例で実施し、3例の平均値を算出し、投与後の腎臓一個あたりに含まれるGd量を、全投与Gd量に対する百分率(% of dose/tissue)で示した。結果を後記表30に示す。表中、Ex-Noは実施例2の複合体番号を示す。また、対照複合体としてペプチドリンカーを含まない、前記製造実施例2で製造したEx-No 47([Gd/DOTA]p-Fab)を使用し同様に試験を行った。
(結果)
結果を後記表30に示す。当該対照複合体の百分率(% of dose/tissue)を基準として、前記ペプチドリンカーを有する各複合体の腎臓に含まれるGd量の低下割合を求め、表30に示した。表30に示す通り、対照複合体47に対して、前記ペプチドリンカーを有する各複合体では標識部の腎臓への集積性が92.15~95.38%ポイント低かった。
実施例4-3:Gd標識複合体の腎臓集積性評価試験(正常マウス)
(試験方法)
前記実施例で製造したペプチドリンカーを含む複合体のGd標識複合体を、蛋白質量として一匹当たり0.02 mg(100 μL)となるように、マウス(BALB/c 又は BALB/c nu/nu)の尾静脈より投与した。およそ24時間後に屠殺して腎臓を摘出し、腎臓中のGd量をICP-MSを用いて測定した。各群3例で実施し、3例の平均値を算出し、投与後の腎臓一個あたりに含まれるGd量を、全投与Gd量に対する百分率(% of dose/tissue)で示した。対照複合体としてペプチドリンカーを含まない、前記製造実施例2で製造したEx-No.47を使用し同様に試験を行い、Ex-No.47についての、5試行の腎残存量の平均を表31に示す。
(結果)
当該対照複合体の百分率(% of dose/tissue)を基準として、前記ペプチドリンカーを有する各複合体の腎臓に含まれるGd量の低下割合(%)を求め、表32に示した。表32に示す通り、対照複合体に対して、前記ペプチドリンカーを有する各複合体では標識部の腎臓への集積性が21.00~94.66%ポイント低下した。
(試験方法)
前記実施例で製造したペプチドリンカーを含む複合体のGd標識複合体を、蛋白質量として一匹当たり0.02 mg(100 μL)となるように担癌マウスの尾静脈より投与した。本実施例で使用する担癌マウスは、検体を投与する前にヒト大腸癌細胞株LS174T細胞(ATCC(登録商標);CL-188)を2.0~5.0×106個/個体を背部皮下に移植して担癌状態としたマウス(BALB/cnu/nu)を用いた。検体を投与して24時間後に屠殺して腎臓ならびに腫瘍を摘出し、腎臓中ならびに腫瘍中のGd量をICP-MSを用いて測定した。本試験は各群3例で実施し、3例の平均値を算出した。投与後の腎臓一個あたりに含まれるGd量を投与Gd量に対する百分率(% of dose/tissue)、また、腫瘍組織1gあたりに含まれるGd量を、全投与Gd量に対する百分率(% of dose/g)で示した。結果を表35、36に示す。表中、Ex-Noは実施例2の複合体番号を示す。また、対照複合体としてペプチドリンカーを含まない、製造実施例2-47で製造したEx-No.47を使用し同様に試験を行った。、Ex-No.47についての、2試行の平均を表33、34に示す。
(結果)
表35、36に示す通り、対照複合体に対して、ペプチドリンカーを有する各複合体では標識部の腎臓への集積性が52.26~77.68%ポイント低下した。
本実施例は複合体の製造実施例を開示する。本実施例中の各製造実施例では「実施例5」にハイフンを介して「複合体の番号」を記載する。例えば、「実施例5-101」は、本実施例における複合体101の製造実施例であることを示す。また、本実施例におけるFab5は国際公開WO2018/092885記載の(P10-2)を用いた。「p-Fab5」はFab5がそのp個のアミノ基を介してp個の[ ]又は( )中に記載の標識部に結合して複合体を形成していることを示す。なお、以下のいくつかの実施例において、MS解析により確認できた各複合体のFab5が結合する標識部)の数を記載しているが、その結果はそれ以外の結合数を有する複合体を含まないことを示すものではない。MS解析機器の精度の関係でその存在を確認できていない結合数の複合体が存在している可能性が残ることは容易に理解されよう。また、本実施例中の構造式において、Gdが結合したDOTAの構造式は、Gdで標識されたDOTAを模式的に示したものである。
(i)複合体No.101の合成
実施例2-18(vii)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム(1 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させた。その溶液に0.1 Mホウ酸緩衝液(40 μL)を加え、0.25M 酢酸緩衝液を用いてpH 6.6に調整した。
5.2 mg/mLFab5のホウ酸緩衝液(240μL)に、先に調製した溶液を80μL加え、30℃で2時間インキュベートした。0.05MのEDTAを15 μL加え、30℃で10分間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で7回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量1074の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(i)複合体No.104の合成
実施例2-18(vii)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム(1 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させた。その溶液に0.1 Mホウ酸緩衝液(40 μL)を加え、0.1 M炭酸ナトリウム水溶液を用いてpH 10.2に調整した。
3 mL の HEPES-NaOH buffer (pH=4.5) を用いて緩衝溶液交換を二回行い、濃縮し、pH=4.52の100 μL溶液とした後、その溶液を45℃で30分間インキュベートした。
PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量1092の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 and/or A-5)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(i)複合体No.107の合成
実施例2-18(vii)で合成した[N-({4-[(2-{4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセトアミド-κO)メチル]フェニル}カルバモイル)-L-メチオニル-N1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミダト(3-)]ガドリニウム(0.75 mg)をDMSO(40 μL)に溶解させ 0.1Mホウ酸緩衝液(40 μL) を加えた後0.1 M炭酸ナトリウム水溶液及び0.25M 酢酸緩衝液を用いてpH8.2に調整した。
5.2 mg/mLFab5のホウ酸緩衝液(240 μL)に0.1Mホウ酸緩衝液にて調製した2 mg/mLの2-IT溶液(7.5 μL)を加え、37℃で40分間インキュベートした。過剰の2-ITはアミコンウルトラ-0.5 mL遠心式フィルターを用いてリン酸緩衝生理食塩水で洗浄、濃縮した後、先に調整した溶液を加え、30℃で2時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。
当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量1175の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体及び3つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例5-112.[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5)の合成)
(i)複合体No.112の合成
ホウ酸緩衝液及びグリセリン溶液にて5.2 mg/mLに調製したFab5溶液(240 μL)に0.1 M炭酸ナトリウム水溶液及び先に調製した溶液を30μL加え、pH 8.8とし、37℃で2時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量1187の[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(i)複合体No.113の合成
実施例2-69(vii)で合成した{N-[2-({4,7,10-トリス[(カルボキシ-κO)メチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル-κ4N1,N4,N7,N10}アセチル-κO)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-5-カルボニル]-L-メチオニルグリシル-N6-[(4-イソチオシアナトフェニル)カルバモチオイル]-L-リシナト(3-)}ガドリニウム (0.22 mg)をDMSO(72 μL)に溶解させた。
ホウ酸緩衝液及びグリセリン溶液にて5.2 mg/mLに調製したFab5溶液(240 μL)に0.1 M炭酸ナトリウム水溶液及び先に調製した溶液を30μL加え、pH 9.3とし、37℃で2時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量1228の[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]が1つ結合した複合体及び2つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
上記製造実施例で得られた複合体の化学構造式(Str)を表37及び38に示す。
表40から41に記載の上記実施例化合物のMS解析を下表に示す。
実施例5の方法で作製した各抗ヒトMUC1抗体Fab5フラグメント複合体について、ヒト癌特異的MUC1に対する結合活性を評価するためにELISAを行った。本試験では、洗浄液として、蒸留水で20倍に希釈した20X PBS/Tween 20バッファー(Thermo社、28352)を用いた。また、本試験中に用いるウシ血清アルブミン(BSA)は30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA社、A9576-50ML)を適切な割合になるように添加して使用した。ヒト癌特異的MUC1ペプチド(特許文献1)を0.5 μmol/Lでヌンクマキシソープ白色384プレート(Nunc社、460372)に1ウェル当たり30 μL添加し、4℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。MUC1ペプチドを逆遠心で除去した後に、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを添加することでブロッキングした。その後、逆遠心によりブロッキング溶液を除去し、1.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて、上記各抗ヒトMUC1抗体Fab5フラグメント複合体(Ex-No.104、108、112)を10000 ng/mL程度の溶液を3倍希釈で14段階希釈し、1ウェル当たり30 μL添加して、室温にて60分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて10000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgκ抗体(Southern Biotechnology Associates社)を1ウェル当たり30 μL添加し、室温で30分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、基質としてECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare社、RPN2232)を1ウェル当たり30 μL添加した。室温にて15分間インキュベートした後に、そのシグナル値をEnvisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。
各抗体の試験をデュプリケートで行い、4パラメータロジスティック曲線モデルによりEC50値を算出した。P10-2についての、3試行それぞれのEC50値(nM)を表51に示す。また、デュプリケートで試行した各複合体のEC50値を表52に示す。
実施例5の方法で作製した各抗ヒトMUC1抗体Fab5フラグメント複合体について、ヒト癌特異的MUC1に対する結合活性を評価するためにELISAを行った。本試験では、洗浄液として、蒸留水で20倍に希釈した20X PBS/Tween 20バッファー(Thermo社、28352)を用いた。また、本試験中に用いるウシ血清アルブミン(BSA)は30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA社、A9576-50ML)を適切な割合になるように添加して使用した。ヒト癌特異的MUC1ペプチド(特許文献1)を0.5 μmol/Lでヌンクマキシソープ白色384プレート(Nunc社、460372)に1ウェル当たり30 μL添加し、4℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。MUC1ペプチドを逆遠心で除去した後に、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを添加することでブロッキングした。その後、逆遠心によりブロッキング溶液を除去し、1.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて、上記各抗ヒトMUC1抗体Fab5フラグメント複合体(Ex-No.101-113)を10000 ng/mL程度の溶液を3倍希釈で14段階希釈し、1ウェル当たり30 μL添加して、室温にて60分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、5.0%BSAを含有するPBS/Tween 20バッファーを用いて10000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgκ抗体(Southern Biotechnology Associates社)をを1ウェル当たり30 μL添加し、室温で30分間インキュベートした。プレートをPBS/Tween 20バッファーで3回洗浄し、基質としてECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare社、RPN2232)を1ウェル当たり30 μL添加した。室温にて15分間インキュベートした後に、そのシグナル値をEnvisionカウンター(パーキンエルマー社)で測定した。
各抗体の試験をデュプリケートで行い、4パラメータロジスティック曲線モデルによりEC50値を算出した。P10-2についての、3試行それぞれのEC50値(nM)を表53に示す。また、デュプリケートで試行した各複合体のEC50値を表54に示す。
実施例7:Gd標識複合体の腎臓集積性評価試験(正常マウス)
(試験方法)
前記実施例で製造したペプチドリンカーを含む複合体のGd標識複合体を、蛋白質量として一匹当たり0.02 mg(100 μL)となるように、マウス(BALB/c or BALB/c nu/nu)の尾静脈より投与した。およそ24時間後に屠殺して腎臓を摘出し、腎臓中のGd量をICP-MSを用いて測定した。各群3例で実施し、3例の平均値を算出し、投与後の腎臓一個あたりに含まれるGd量を、全投与Gd量に対する百分率(% of dose/tissue)で示した。対照複合体としてペプチドリンカーを含まない、前記製造実施例5で製造したEx-No 108 を使用し同様に試験を行った。Ex-No 108についての2試行の平均を表55に示す。
(結果)
結果を表56に示す。当該対照複合体の腎臓に含まれるGd量を基準として、前記ペプチドリンカーを有する各複合体の腎臓に含まれるGd量の低下割合を求めた。表56 に示す通り、対照複合体に対して、前記ペプチドリンカーを有する各複合体では標識部の腎臓への集積性が91.52~93.03%ポイント低かった。
(試験方法)
前記実施例で製造したペプチドリンカーを含む複合体のGd標識複合体を、蛋白質量として一匹当たり0.02 mg(100 μL)となるように担癌マウスの尾静脈より投与した。本実施例で使用する担癌マウスは、検体を投与する前にヒト乳癌細胞株MDA-MB-468(ATCC(登録商標);HTB-132)を5.0×106個/個体を背部皮下に移植して担癌状態としたマウス(BALB/cnu/nu)を用いた。検体を投与して24時間後に屠殺して腎臓ならびに腫瘍を摘出し、腎臓中ならびに腫瘍中のGd量をICP-MSを用いて測定した。本試験は各群3例で実施し、3例の平均値を算出した。投与後の腎臓一個あたりに含まれるGd量を投与Gd量に対する百分率(% of dose/tissue)、また、腫瘍組織1gあたりに含まれるGd量を、全投与Gd量に対する百分率(% of dose/g)で示した。結果を表59、60に示す。表中、Ex-Noは実施例5の複合体番号を示す。また、対照複合体としてペプチドリンカーを含まない、前記製造実施例5で製造したEx-No.108を使用し同様に試験を行った。Ex-No.108についての、2試行の平均を表57、58に示す。
(結果)
結果を表57から60に示す通り、対照複合体に対して、前記ペプチドリンカーを有する各複合体では標識部の腎臓への集積性が88.08~90.87%ポイント低下した。
(実施例9-115.[DOTA]p-Fab5の合成)
20.8 mg/mLFab5(90 μL)の0.1 Mリン酸水素二ナトリウム水溶液(585 μL)に、調製したN-ヒドロキシスルホスクシンイミジルDOTA溶液(300 μL)を加え、4℃で23時間インキュベートした。過剰のリンカーはアミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターを用い10mMリン酸緩衝液で洗浄を2回繰り返し、0.3Mの酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体Ex-No.115を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量387の[DOTA]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体、3つ結合した複合体及び4つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
(実施例9-116.[DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5の合成
5.2 mg/mLFab5のリン酸緩衝生理食塩水溶液(240 μL)に、先に調製した溶液を30μL加え、0.1 M炭酸ナトリウム水溶液を用いて約pH 8.0に調整し、30℃で2時間インキュベートした。PD-10 カラムを用い精製し、アミコンウルトラ-15mL遠心式フィルターで回収した。回収した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し最後に濃縮後、メンブレンフィルターで濾過し、複合体Ex-No.116を得た。同様の操作を再度行い、得られた複合体Ex-No.116を混合した。当該複合体は、分子量47.5kDaのFab5の1つに対して、分子量1032の[DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-lle-NH-(CH2)2-(A-3)]が1つ結合した複合体、2つ結合した複合体、3つ結合した複合体及び4つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。
64Cu標識タンパクの調製例1
[64Cu]CuCl2の0.05 mol/L塩酸溶液10 μL(19.8 MBq、富士フイルム富山化学)に0.1 mol/L 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.5) 139 μLを加え混和した。さらに実施例9-115で調製したタンパク複合体を51 μL加え、これを室温で60分間インキュベートし、反応させた。反応液を限外濾過膜(Amicon Ultra 10K、Millipore)に加え、さらに50 mmol/L 酢酸ナトリウム緩衝液を加えて限外濾過精製を行うことで、目的の64Cu-タンパク複合体溶液(A)を得た。得られた溶液にタンパク複合体140 μLとPBS溶液145 μLを混合し、シリンジフィルター(Millex-GV 0.22 μm、Millipore)を使って濾過することで、64Cu-タンパク複合体(A)含有PBS溶液 (11.5 MBq, 19.17 MBq/mg)を調製した。
64Cu標識タンパクの調製例2
[64Cu]CuCl2の0.05 mol/L塩酸溶液20μL(37.1 MBq、富士フイルム富山化学)に0.1 mol/L 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.5) 285 μLを加え混和した。さらに実施例9-116で調製したタンパク複合体を94.7 μL加え、これを室温で60分間インキュベートし、反応させた。反応液を限外濾過膜(Amicon Ultra 10K、Millipore)に加え、さらに50 mmol/L 酢酸ナトリウム緩衝液を加えて限外濾過精製を行うことで、目的の64Cu-タンパク複合体溶液(B)を得た。得られた溶液にタンパク複合体260 μLとPBS溶液377 μLを混合し、シリンジフィルター(Millex-GV 0.22 μm、Millipore)を使って濾過することで、64Cu-タンパク複合体(B)含有PBS溶液 (31.5 MBq, 26.27 MBq/mg)を調製した。
PET/CT撮像
コモンマーモセット(2歳齢)をイソフルランで麻酔し、64Cu-タンパク複合体溶液(A)または(B)を含むPBS溶液175-185 μLを尾静脈から投与した。投与後に麻酔下、PET/CT撮像装置(PET:Clairvivo PET、島津製作所製、CT:Aquilion、TOSHIBA製)で画像を取得した。
64Cu-タンパク複合体溶液(A)を含むPBS溶液を投与して約3時間後に得られたPET/CT画像が図1である。また、 64Cu-タンパク複合体溶液(B)を含むPBS溶液を投与して約3時間後に得られたPET/CT画像が図2である。図3はSUVを示す。SUVとは組織1gあたりの放射能を体重1gあたりの投与放射能で割った値、つまり、SUV = 組織1gあたりの放射能/体重1gあたりの投与放射能で表される値である。尚、放射能は減衰補正した値を用いる。図1に比べ、図2の方が腎臓への集積が低いことが観察された。
また、本発明は、MUC1に対する優れた結合活性を有する複合体を含み、MUC1が関与する癌の診断及び/又は治療に有用であることが期待される。
また本発明複合体 3arm DOTA、特定のスペーサー、特定のペプチドリンカーおよび生物分子からなる複合体が腎臓内で分解され排出されることから、生物分子に関連する疾患の診断及び/又は治療に有用であることが期待される。
Claims (43)
- 下式(I):
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
[式中、
Fab1は、
(a)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、及び
(b)配列番号2のアミノ酸番号1から121までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号4のアミノ酸番号1から112までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、からなる群より選択される、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメントであり、該Fab1は該Fab1中にあるp個のアミノ基又はチオール基を介してXに結合しており;
Xは、ペプチドリンカー又は結合であり;
S1は、スペーサー又は結合であり;
Yは、配位子であり;並びに、
pは、1~25の自然数であり、Fab1に結合している(Y-S1-X)の数を示し;
但し、Xが結合であるときは、S1が-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、且つ、Yは1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸である]
で示される複合体。 - Fab1が、
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、及び
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号2のアミノ酸番号1のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトCEACAM5抗体Fabフラグメント、
からなる群より選択される、請求項1に記載の複合体。 - Fab1が、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項2に記載の複合体。
- Xが、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有する、2~4個のアミノ酸からなるペプチドを含むペプチドリンカーである、請求項1~3のいずれか1項に記載の複合体。
- S1が、
-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-NH-(CH2)2-C(=O)-、
-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、
-NH-(CH2)3-C(=O)-、
-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、
-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、
-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、
下式(a)~(q)で示されるスペーサー、又は、結合であり、R1は水素原子、ハロゲン、C1-6アルキル、又は、ハロC1-6アルキルであり、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-ジフェニルアラニン-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-、
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-及び
からなる群より選択されるペプチドリンカー
又は
(29)結合
であり、ここに、Metはメチオニンを、Ileはイソロイシンを、Glyはグリシンを、Lysはリシンを、Pheはフェニルアラニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Argはアルギニンを、Aspはアスパラギン酸を、Z1は下式(II-I)又は(II-II)に示される基を、-Lys*-Z2-は下式(III-I)又は(III-II)に示される基を、-Tyr*-CH2-は下式(IV)に示される基を、-Lys*-C(=S)-は下式(V)に示される基を、、-Lys*-Z3-は下式(III-III)に示される基をそれぞれ示し、基(A-3)、(A-4)又は(A-5)は下式のとおりである、請求項1~4のいずれか1項に記載の複合体。
- S1が-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、又は、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-であり、
Xが
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、及び
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、請求項1~5のいずれか1項に記載の複合体。 - S1が-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-であり、又は、下式
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、請求項1~5のいずれか1項に記載の複合体。 - S1が-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=O)-、下式(e)から(i)若しくは(k)で示されるスペーサー、又は、結合であり、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-ナフチル)アラニン)-Lys*-Z2-及び
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、請求項1~5の何れかに記載の複合体。 - Xが、
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-、
からなる群より選択されるペプチドリンカーである請求項1~5のいずれか1項に記載の複合体。 - Xが、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、及び
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-
からなる群より選択されるペプチドリンカーである請求項1~5のいずれか1項に記載の複合体。 - Yが、デフェロキサミン又は1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸である、請求項1~10のいずれか1項に記載の複合体。
- Yが、デフェロキサミンである、請求項11に記載の複合体。
- Yが、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸である、請求項11に記載の複合体。
- Yが、3arm DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸)又は4arm DOTAである、請求項13に記載の複合体。
- Yが、3arm DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸)である、請求項14に記載の複合体。
- pが1~5の自然数である、請求項1~24のいずれか1項に記載の複合体。
- Yに金属が配位した、請求項1~15のいずれか1項に記載の複合体。
- 金属が配位した、請求項16~24のいずれか1項に記載の複合体。
- 金属が金属放射性同位元素である、請求項26又は27に記載の複合体。
- 金属が89Zrである、請求項28に記載の複合体。
- 金属が常磁性金属イオンである、請求項26又は27に記載の複合体。
- 金属がGd3+である、請求項30に記載の複合体。
- PETトレーサーである、請求項26~31のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項26~32のいずれか1項に記載の1種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む診断用組成物。
- 早期診断薬、又は病期診断薬として用いられる、請求項33に記載の診断用組成物。
- ヒトCEACAM5を発現する癌の診断に用いられる、請求項33又は34に記載の診断用組成物。
- 癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌である、請求項35に記載の診断用組成物。
- 請求項26~31記載の1種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- ヒトCEACAM5を発現する癌を治療するための医薬組成物である、請求項37に記載の医薬組成物。
- 癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌である請求項38に記載の医薬組成物。
- 癌の診断用組成物、及び/又は癌の治療用医薬組成物の製造のための、請求項26~31のいずれか1項に記載の複合体の使用。
- 癌の診断、及び/又は癌の治療に用いられる、請求項26~31のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項26~31のいずれか1項に記載の複合体を対象に投与することを含む、癌の診断方法。
- 請求項26~31のいずれか1項に記載の複合体の治療有効量を対象に投与することを含む、癌の治療方法。
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