JP6106731B2 - ペプチド骨格およびｃ末端改変を持つ改変したコンプスタチン - Google Patents

Description

本発明は、体内の補体カスケードの活性化に関する。本発明は、特に、Ｃ３タンパク質を結合し、補体活性化を抑制できるペプチドおよびペプチドミメティック（peptidomimetics）を提供する。

（政府支援）
米国特許法第２０２（ｃ）より、米国政府が、助成番号ＧＭ６２１３４下で国立衛生研究所からの基金で部分的になされた、本明細書に記載された発明にある権利をし得ると認められる。

特許、出願公開、技術文献および学術文献を含めた種々の刊行物を本明細書の全体に引用する。これらの各引用刊行物をここに出典明示してそのすべてを本明細書の一部とみなす。

ヒト補体系は、病原性生物に対する防御および免疫反応の媒介において強力なプレーヤーである。補体は３つの異なる経路：古典的、レクチンおよび代替経路を介して活性化できる。３つの経路すべてにより共有される主要な活性化事象は、Ｃ３転化酵素によるその活性化生成物Ｃ３ａおよびＣ３ｂへの補体系の中心的なタンパク質Ｃ３の蛋白質分解切断である。これらの断片の生成は、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂによる病原性細胞のオプソニン作用、すなわち、それらを食作用またはクリアランスを受け易くするプロセス、および補体受容体との相互作用を介して免疫細胞の活性化に導く (Markiewski & Lambris, 2007, Am J Pathol 171: 715-727)。また、標的細胞上のＣ３ｂの沈着は、新しい転化酵素複合体の形成を引き起こし、それにより、自己増幅ループを始める。

血漿および細胞表面結合タンパク質のアンサンブルは、補体カスケードにより自己攻撃から宿主細胞を予防するように、注意深く補体活性化を調節する。しかしながら、補体の過剰な活性化または不適当な調節は、自己免疫ないし炎症性疾患の範囲にある多数の病理学疾患に導きかねない(Holers, 2003, Clin Immunol 107: 140-51; Markiewski & Lambris, 2007,前記; Ricklin & Lambris, 2007, Nat Biotechnol 25: 1265-75; Sahuら, 2000, J Immunol 165: 2491-9)。したがって、治療的補体抑制物質の開発は高度に望ましい。この状況において、Ｃ３およびＣ３ｂは、そのカスケード中のそれらの中心的な役割が補体の開始、増幅および下流の活性化の同時の抑制を可能とするために、有望な標的として出現した(Ricklin & Lambris, 2007, 前記)。

コンプスタチンは、３つの活性化経路のすべてをブロックできることが示された最初の非宿主由来の補体抑制物質であった(Sahuら, 1996, J Immunol 157: 884-91; 米国特許第６，３１９，８９７号)。この環状トリデカペプチドは、Ｃ３およびＣ３ｂの双方に結合し、Ｃ３転化酵素により天然のＣ３の切断を防止する。その高い抑制効力は、治療剤としてその可能性を示す実験モデルを用いて、一連の研究により確認された(Fianeら, 1999a, Xenotransplantation 6: 52-65; Fianeら, 1999b, Transplant Proc 31:934-935; Nilssonら, 1998 Blood 92: 1661-1667; Ricklin & Lambris, 2008, Adv Exp Med Biol 632: 273-292; Schmidtら, 2003, J Biomed Mater Res A 66: 491-499; Soulikaら, 2000, Clin Immunol 96: 212-221)。コンプスタチンの連続的な最適化は、活性の改善を持つアナログを与えた(Ricklin & Lambris, 2008, 前記; WO2004/026328; WO2007/062249)。これらのアナログの１つは、先進国の高齢患者における盲目の主要原因である加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療についての治験で現在試験されている(Colemanら, 2008, Lancet 372: 1835-1845; Ricklin & Lambris, 2008,前記)。ＡＭＤおよび他の疾患におけるその治療可能性に徴して、さらなる大きな効力を達成するコンプスタチンのさらなる最適化は相当に重要なものである。

初期の構造活性研究は、コンプスタチンペプチドの環状性質、ならびにβ−ターンおよび疎水性クラスターの双方の存在を分子的な鍵となる特徴として同定した(Morikisら, 1998, Protein Sci 7: 619-627; WO99/13899; Morikisら, 2002, J Biol Chem 277:14942-14953; Ricklin & Lambris, 2008,前記）。４および７位での疎水性残基は特に重要であることが判明し、非天然のアミノ酸でのそれらの改変は、元来のコンプスタチンペプチドの２６４倍の活性改善を持つアナログを生成した(Katragaddaら, 2006, J Med Chem 49: 4616-4622; WO2007/062249)。

従前の最適化工程は組合せスクリーニング試験、溶液構造および計算モデルに基づいた(Chiuら, 2008, Chem Biol Drug Des 72: 249-256; Mulakalaら, 2007, Bioorg Med Chem 15: 1638-1644; Ricklin & Lambris, 2008,前記)が、補体断片Ｃ３ｃと複合したコンプスタチンの共結晶構造の最近の公開は、合理的な最適化を始めるための重要な一里塚を表わす。結晶構造は、Ｃ３ｃのマクログロブリン（ＭＧ）ドメイン４および５の界面で浅い結合部位を明らかにし、１３のアミノ酸のうち９つが水素結合または疎水性効果のいずれかにより直接的に結合に関与することを示した。溶液中のコンプスタチンペプチドの構造(Morikisら, 1998,前記)と比較して、コンプスタチンの結合形態は、残基５〜８ないし８〜１１のβ−ターンの位置のシフトを含む立体構造変化を経験した(Janssenら, 2007,前記; WO2008/153963)。

前記に徴して、さらに大きな活性を持つ改変したコンプスタチンペプチドまたはミメティックの開発が、当該技術分野におけるかなりの進歩を構成することは明らかである。

本発明は、体内の補体カスケードの活性化に関する。本発明は、特に、Ｃ３タンパク質を結合し、補体活性化を抑制できるペプチドおよびペプチドミメティックを提供する。

本発明は、コンプスタチン（ＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ（環状Ｃ２−Ｃ１２）；配列番号：１）と比較して補体抑制活性の改善を有する、補体抑制ペプチドのコンプスタチンのアナログおよびミメティックを提供する。

本発明の１つの態様は、改変したコンプスタチンペプチド（ＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ；配列番号：１（環状Ｃ２−Ｃ１２））を含む化合物またはそのアナログを要旨とし、ここに、８位のＧｌｙを改変して、その位置にてペプチドの骨格立体配置を抑制する。１つの具体例において、骨格はＧｌｙをＮ−メチルＧｌｙに置換することにより抑制される。ペプチドは、１以上の以下のもの：Ａｌａでの９位のＨｉｓの置換；ＴｒｐまたはＴｒｐのアナログでの４位のＶａｌの置換；Ｔｒｐのアナログでの７位のＴｒｐの置換；Ｎ末端のアセチル化；およびＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅでの１３位のＴｈｒの置換によりさらに改変し得る。特定の具体例において、４位のＴｒｐのアナログは、１−メチル−Ｔｒｐまたは１−ホルミル−Ｔｒｐであって、７位のＴｒｐのアナログは存在するならば、ハロゲン化Ｔｒｐである。

ある具体例は、配列番号：２の配列を有するペプチドを含むコンプスタチンアナログを要旨とし、それは：
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｘａａ３−Ｇｌｙ−Ｘａａ４−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ５（環状Ｃ２−Ｃ１２）であり、
［式中、８位のＧｌｙを改変して、その位置でのペプチドの骨格立体構造を拘束し、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｃ−Ｉｌｅ、Ａｃ−Ｖａｌ、Ａｃ−Ｌｅｕ、またはＧｌｙ−Ｉｌｅを含むジペプチドであり；
Ｘａａ２はＴｒｐまたはＴｒｐのアナログであり、ここに、Ｔｒｐのアナログは、Ｔｒｐと比較して疎水性特性を増加させ；
Ｘａａ３は、Ｔｒｐ、またはインドール環の水素結合ポテンシャルを増加させる、そのインドール環に対する化学的修飾を含むＴｒｐのアナログであり；
Ｘａａ４は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；および
Ｘａａ５は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅのいずれかのカルボキシ末端の−ＯＨが、−ＮＨ_２により所望により置換されていてもよいＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅである］である。

ある具体例において、Ｘａａ２はＣ３との無極性相互作用に関与する。他の具体例において、Ｘａａ３はＣ３との水素結合に関与する。種々の具体例において、Ｘａａ２のＴｒｐのアナログは、５−フルオロ−ｌ−トリプトファンまたは６−フルオロ−ｌ−トリプトファンのごときハロゲン化トリプトファンである。他の具体例において、Ｘａａ２のＴｒｐアナログは、５位での低級アルコキシルまたは低級アルキル置換基、例えば、５−メトキシトリプトファンまたは５−メチルトリプトファンを含む。他の具体例において、Ｘａａ２のＴｒｐアナログは１位での低級アルキルまたは低級アルケノイル置換基を含み、例示的具体例は、１−メチルトリプトファンまたは１−ホルミルトリプトファンを含む。他の具体例において、Ｘａａ３のＴｒｐのアナログは、５−フルオロ−ｌ−トリプトファンまたは６−フルオロ−ｌ−トリプトファンのごときハロゲン化トリプトファンである。特定の具体例において、Ｘａａ２は１−メチルトリプトファンまたは１−ホルミルトリプトファンであって、Ｘａａ３は所望により５−フルオロ−ｌ−トリプトファンを含む。

ある具体例において、８位のＧｌｙはＮ−メチル化され、Ｘａａ１はＡｃ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ２は１−メチル−Ｔｒｐまたは１−ホルミル−Ｔｒｐであり、Ｘａａ３はＴｒｐであり、Ｘａａ４はＡｌａであって、Ｘａａ５はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅである。特に、Ｘａａ５はＩｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅであり得る。特に、コンプスタチンアナログは、配列番号：５、７、８、９、１０または１１のいずれか１つを含む。

いくつかの具体例において、化合物は、そのペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現により生成されたペプチドを含む。他の具体例において、化合物は、ペプチド合成により少なくとも部分的に生成される。また、合成法の組合せを用いることができる。

本発明のもう一つの態様は、その化合物のｉｎ ｖｉｖｏ保持を延長するさらなる成分をさらに含む前記の請求項のいずれかの化合物を要旨とする。さらなる成分は、１つの具体例においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。さらなる成分は、もう一つの具体例において、アルブミン結合低分子である。もう一つの具体例において、さらなる成分はアルブミン結合ペプチドである。
アルブミン結合ペプチドは、配列ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ（配列番号：１４）を含み得る。特定の具体例は、アルブミン結合ペプチドに結合した配列番号：５、７、８、９、１０または１１のいずれか１つを含む。所望により、化合物およびアルブミン結合ペプチドをスペーサーにより分離する。スペーサーは、ミニ−ＰＥＧまたはミニ−ＰＥＧ３のごときポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子であり得る。

本発明のもう一つの態様は、配列番号：５、７、８、９、１０または１１のいずれか１つの非ペプチドまたは部分的なペプチドミメティックを含む、補体活性化を抑制する化合物を要旨とし、ここに、化合物はＣ３に結合し、等価なアッセイ条件下で配列番号：１を含むペプチドより少なくとも５００倍大きな活性で補体活性化を抑制する。

本発明のコンプスタチンアナログ、コンジュゲートおよびミメティックは、当該技術分野において知られ本明細書により詳細に記載したように、コンプスタチン自体が利用されるいずれの目的でも、実際に有用なものである。これらのある使用は、患者への投与のための医薬組成物中の化合物の処方を含む。かかる処方は、化合物の医薬上許容される塩、ならびに当業者の範囲内にある１以上の医薬上許容される希釈剤、担体 賦形剤等を含み得る。

本発明の種々の特徴および利点は、以下の詳細な記載、図面および実施例に対する参照により理解されるであろう。

例示的具体例の詳細な記載
定義：
本発明の方法および他の態様に関する種々の用語は、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって用いる。特記しない限りは、かかる用語は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を与えるものである。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供された定義と一致するように解釈されるものである。

量、一時的な期間等のごとき測定可能な値を参照する場合の本明細書に用いた「約」なる用語は、特定の値からの±２０％または±１０％、いくつかの具体例において±５％、いくつかの具体例において±１％、いくつかの具体例において±０.１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は開示された化合物および組成物を調製および用いるのに適当である。

本明細書に用いた「コンプスタチン」なる用語は、配列番号：１のＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ（環状Ｃ２−Ｃ１２）よりなるペプチドをいう。「コンプスタチンアナログ」なる用語は、本明細書により詳細に記載し、当該技術分野において知られた天然および非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログの置換、ならびに種々のアミノ酸内またはアミノ酸間の改変を含む改変したコンプスタチンをいう。コンプスタチンまたはコンプスタチンアナログ内の特定のアミノ酸またはアナログの位置を参照する場合、それらの位置は、時々、ペプチド内の「位置」をいい、その位置は、１（コンプスタチン中のＩｌｅ）〜１３（コンプスタチン中のＴｈｒ）まで番号が付与される。例えば、Ｇｌｙ残基は「８位」を占める。

「医薬上活性」および「生物学的活性」という用語は、Ｃ３またはその断片に結合し、補体活性化を抑制する本発明の化合物の能力をいう。この生物学的活性は本明細書中により詳細に説明されているように、１以上のいくつかの公知のアッセイにより測定され得る。

本明細書に用いた「アルキル」とは、約１〜約１０の炭素原子（さらに、本明細書中の炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、所望により置換されていてもよい飽和直鎖状、分岐鎖状、環状の炭化水素を意味し、約１〜約７の炭素原子が好ましい。アルキル基は、特に限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロピエンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロオクチル、アダマンチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチルおよび２，３−ジメチルブチルを含む。「低級アルキル」なる用語とは、約１〜約５の炭素原子（さらに、本明細書中の炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、所望により置換されていてもよい飽和直鎖状、分岐鎖状、環状の炭化水素をいう。低級アルキル基は、特に限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル、イソペンチルおよびネオペンチルを含む。

本明細書に用いた「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩをいう。
本明細書に用いた「アルカノイル」とは、「アシル」とも互換的に用いられるが、約１〜約１０の炭素原子（さらに、本明細書中の炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、所望により置換されていてもよい直鎖状または分岐鎖状の脂肪族アシル残基をいい、約１〜約７の炭素原子が好ましい。アルカノイル基は、特に限定されるものではないが、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリルペンタノイル、イソペンタノイル、２−メチル−ブチル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル等を含む。「低級アルカノイル」なる用語は、約１〜約５の炭素原子（さらに、本明細書中の炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、所望により置換されていてもよい直鎖状または分岐鎖状の脂肪族アシル残基をいう。低級アルカノイル基は、特に限定されるものではないが、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソ−プロピオニル、ブチリル、イソ−ブチリル、ペンタノイル、イソ−ペンタノイル等を含む。

本明細書に用いた「アリル」は、約５〜約１４の炭素原子（さらに、本明細書中の炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、所望により置換されていてもよい、一または二環性の芳香環系をいい、約６〜約１０の炭素が好ましい。非限定の例は、例えば、フェニルおよびナフチルを含む。

本明細書に用いた「アラルキル」は、約６〜約２０の炭素原子（さらに、本明細書中の炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、アリル置換基を担持するアルキルラジカルをいい、約６〜約１２の炭素原子が好ましい。アラルキル基は、所望により置換され得る。非限定の例は、例えば、ベンジル、ナフチルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチルおよびジフェニルエチルを含む。

本明細書に用いた「アルコキシ」および「アルコキシル」は、所望により置換されていてもよいアルキル−Ｏ−基をいい、ここに、アルキルとは前記に定義されたものである。例示的なアルコキシおよびアルコキシル基は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、i−プロポキシ、ｎ−ブトキシおよびヘプトキシを特に含む。

本明細書に用いた「カルボキシ」は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基をいう。
本明細書に用いた「アルコキシカルボニル」は、アルキルが前記に定義されものである−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル基をいう。
本明細書に用いた「アロイル」は、アリル基が前記に定義されものである−Ｃ（＝Ｏ）−アリール基をいう。例示的なアロイル基はベンゾイルおよびナフトイルを含む。

典型的には、置換された化学的部分は、分子上の選択された位置における水素を置換した１以上の置換基を含む。例示的な置換基は、例えば、ハロ、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリル、スルフヒドリル、ヒドロキシル（−ＯＨ）、アルコキシル、シアノ（−ＣＮ）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アシル（アルカノイル：−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）；−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、アミノカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２）、−Ｎ−置換されたアミノカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ”）、ＣＦ_３、ＣＦ_２ＣＦ_３等である。前記の置換基の関係において、各Ｒ”部分には、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリル、またはアラルキル等のいずれであってもよい。

本明細書に用いた「Ｌ−アミノ酸」は、タンパク質に通常存在する天然発生の左旋性のアルファ−アミノ酸、またはそれらのアルファ−アミノ酸のアルキルエステルをいう。「Ｄ−アミノ酸」なる用語は、右旋性のアルファ−アミノ酸をいう。特記しない限りは、本明細書中に言及したすべてのアミノ酸はＬ−アミノ酸である。

「疎水性の」または「無極性の」は本明細書において同義語として用いられ、双極子により特徴付けられるのではなく、いずれかの分子間または分子内相互作用をいう。

「ＰＥＧ化」とは、大きさは関係なく、少なくとも一つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分がタンパク質またはペプチドと結合して、ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートを形成する反応をいう。「ＰＥＧ化は、大きさは関係なく、少なくとも1つのＰＥＧ部分が、ペプチドまたはタンパク質と化学的に結合することを意味する。ＰＥＧなる用語は、一般的にＰＥＧポリマーの近似平均分子量を示す数的接尾語とともに使われる；例えば、ＰＥＧ−８，０００とは平均分子量が８０００のポリエチレングリコールをいう。

本明細書に用いた「医薬上許容される塩」とは、開示された化合物の誘導体をいい、親化合物はその酸性または塩基性塩を形成することにより修飾される。医薬上許容される塩の例として、特に限定されるものではないが、アミンのごとき塩基残基の無機質または有機酸塩；カルボキシル酸のごとき酸性残基のアルカリまたは有機酸塩等が挙げられる。かくして、「酸付加塩」は、酸の付加により調製された親化合物の対応する塩誘導体をいう。医薬上許容される塩は、無機または有機酸から形成された親化合物の従来の塩または四級アンモニウム塩を含む。例えば、かかる従来の塩は、特に限定されるものではないが、塩化水素、臭化水素、硫化、リン化、窒化等のごとき無機酸；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸等の有機酸から調製された塩に由来するものを含む。本発明のある酸性または塩基性化合物は、双性イオンとして存在し得る。遊離酸、遊離塩基、双性イオンを含めた化合物のすべての形態は、本発明の範囲内であると考えられる。

（説明）
本発明によれば、Ｃ３に結合するコンプスタチンの生物学的および物理化学的特徴についての情報は、親コンプスタチンペプチドと比較してかなり改善した活性を持つ改変したコンプスタチンペプチドを設計するために利用された。いくつかの具体例において、アナログは、コンプスタチンよりも少なくとも３００倍大きな活性を有する。他の具体例において、アナログは、実施例に記載したアッセイを利用して比較すると、コンプスタチンより３５０、４００、４５０、５００、５５０および６００倍またはそれを超えて大きな活性を有する。

従前のアプローチにより合成されたコンプスタチンアナログは、親ペプチドと比較して９９倍(Mallik, B.ら , 2005,前記； WO2004/026328)までおよび約２６４倍(Katragaddaら, 2006,前記；WO2007/062249)まで、活性の改善を所有することが示されている。本発明により生成されたアナログは、これまで利用されていないコンプスタチンの位置の改変を介して活性の改善を示し、コンプスタチンまたはいずれかの現在記載されたアナログに対する活性の改善を与えることができる。かくして、本発明のアナログは、本明細書の図および実施例に示したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより示された、親ペプチドまたは現在まで生成されたそのアナログのいずれよりもさらに大きな活性を所有する。

以下の表は、コンプスタチン（Ｉｃ［ＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣ］Ｔ；配列番号：１）を超えてかなり改善された活性を持つ、選択された例示的アナログのアミノ酸配列および補体抑制活性を示す。選択されたアナログは、WO2007/062249に記載した強力なコンプスタチンアナログ（Ａｃ−Ｉｃ［ＣＶ（^１−ＭｅＷ）ＱＤＷＧＡＨＲＣ］Ｔ−ＮＨ_２、配列番号：４、実施例１においてペプチド１４ともいう）と比較して、指定の位置（１〜１３）の特定の改変により引用される。配列番号：５および７〜１１のペプチド（実施例１において、ペプチド１５および１７〜２１ともいう）は、本発明によりなされた改変の代表例であり、その結果、かなりより強力なコンプスタチンアナログを生じる。

本発明による１つの改変は、そのペプチドの８位のペプチド骨格の拘束を含む。特定の具体例において、骨格は８位のグリシン（Ｇｌｙ^８）をＮ−メチルグリシンに置換することにより拘束される。実施例１で言及されるごとく、例示的なペプチド８および１５に参照がなされる。

理論により拘束および制限されることを意図することなく、Ｎ−メチル化がいくつかの方法においてペプチドに影響できることが注目される。第１に、潜在的な水素結合供与体は、水素結合を形成できないメチル基と置換される。第２に、Ｎ−メチル基は弱電子供与性であり、これは、それが近隣のカルボニル基の塩基度をわずかに増加できることを意味する。第３に、Ｎ−メチル基のサイズは立体的拘束を引き起こすことができる。最後に、Ｎ−メチル化は、アミド結合のトランス／シス集団を変更し、かくして、プロリンと同様の方法で局所のペプチド立体構造を変更できる。

［Ｔｒｐ（Ｍｅ）^４Ｇｌｙ（Ｎ−Ｍｅ）^８Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチン（配列番号：５；ペプチド１５）の活性増加は、従前に最も活性なアナログの［Ｔｒｐ（Ｍｅ）^４Ｇｌｙ^８Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチン（配列番号：４；ペプチド１４）に比較して注目すべき改善である。Ｇｌｙ^８のＮ−メチル化は、境界様β−ターンの強化、局所骨格拘束の増大、Ｔｒｐ７の側鎖に関与する疎水的相互作用の改善により、標的認識および複雑な安定性を改善するようである。

特定の具体例において、８位の改変は、１３位のＴｈｒをＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅに置換することを含むさらなる改変で補足される。実施例１に言及した例示的なペプチド１６、１７、１８、１９、２０および２１（配列番号：６、７、８、９、１０および１１）に参照がなされる。再度、理論により制限および拘束されることなく、Ｔｈｒの疎水性Ｉｌｅへの置換は有益であることが判明した。Ｉｌｅの２つの異性体（すなわち、ＬｅｕおよびＮｌｅ）に観察された同様の効果は、その物理化学的および立体的特性が、特定の接触よりも、この改善を担い得ることを示唆する。しかしながら、親和性および活性におけるより区別される改善は、Ｔｈｒ^１３およびＩｌｅ^１３の双方の骨格Ｎ−メチル化で観察された。観察された改善が増加した骨格拘束、したがって、結合上のより低い立体構造のエントロピーペナルティー（entropic penalties）に起因し得るが、立体的にまたは分子内の疎水性接触の形成を介してのいずれかで、１３位の残基の性質が活性立体構造の形成および安定化にさらに影響することができるそのケースでもある。

８位および１３位の前記改変は、従前に活性を改善したことが示されたコンプスタチンの他の改変と組み合わせて、かなり改善された補体抑制活性を持つペプチドを生成できる。例えば、Ｎ末端のアセチル化は、典型的にはコンプスタチンおよびそのアナログの補体抑制活性を増加させる。結果的に、Ｎ−アセチル化に限定されるものではないが、ペプチドのアミノ末端のアシル基の付加は、ペプチドが合成的に調製される場合に特に有用な本発明の１つの好ましい具体例である。しかしながら、原核生物または真核生物の発現系におけるペプチドをコードする核酸分子の発現、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によりペプチドを調製することは時々利点がある。これらの具体例について、自然発生のＮ末端を利用し得る。

もう一つの実施例として、９位のＨｉｓに対するＡｌａの置換がコンプスタチンの活性を改善し、同様に本発明のペプチドの好ましい改変であることは知られている。４位のＶａｌに対するＴｙｒの置換の結果、活性における適度の改善を生じることができることがさらに決定された(Klepeisら, 2003, J Am Chem Soc 125：8422-8423)。

ＷＯ２００４／０２６３２８およびＷＯ２００７／０６２２２４９において、Ｔｒｐおよび４位のあるＴｒｐアナログ、ならびに７位のあるＴｒｐアナログ、特に、９位のＡｌａと組み合わせたものが、コンプスタチンのものより多数倍の大きな活性を与えることが開示されている。これらの改変を本発明に利点に同様に用いる。

特に、４位にて、５−フルオロ−ｌ−トリプトファンまたは５−メトキシ−、５−メチル−もしくは１−メチル−トリプトファン、または１−ホルミル−トリプトファンを含むペプチドは、コンプスタチンよりも３１〜２６４倍大きな活性を所有することが示されている。１−メチルおよび１−ホルミル−トリプトファンが特に好ましい。インドール「Ｎ」−媒介水素結合は、コンプスタチンの結合および活性につき４位に必要ではないと考えられる。４位にて水素を低級アルキル、アルカノイルまたはインドール窒素に置換することによる、この水素結合の不存在または極性特性の低下は、コンプスタチンの結合および活性を増強する。いずれかの特定の理論または作用機序に制限することを意図することなく、４位の疎水的相互作用または効力はＣ３とのコンプスタチンの相互作用を強くすると考えられる。結果的に、４位でのＴｒｐの改変（例えば、当該技術分野においてよく知られた方法による側鎖構造の改変）、または前記の疎水的相互作用を維持または増強するＴｒｐアナログの４位または７位の置換は、本発明において、前記の８位および１３位での改変と組み合わせた有利な改変とと考えられる。かかるアナログは当該技術分野においてよく知られ、限定されるものではないが、本明細書に例示されたアナログ、ならびに非置換または別法の置換のその誘導体を含む。適当なアナログの例は、次の刊行物および多数の他のもの：Beene,ら, 2002, Biochemistry 41：10262-10269 (特に、単一または複数のハロゲン化Ｔｒｐアナログを記載する)；Babitzky & Yanofsky, 1995, J. Biol. Chem. 270：12452-12456 (特に、メチル化およびハロゲン化Ｔｒｐおよび他のＴｒｐおよびインドールアナログを記載する)；および米国特許第６，２１４，７９０号、第６，１６９，０５７号、第５，７７６，９７０号、第４，８７０，０９７号、第４，５７６，７５０号および第４，２９９，８３８号への参照により見出し得る。当該技術分野に知られるごとく、Ｔｒｐアナログはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ発現、またはペプチド合成によりコンプスタチンペプチドに導入し得る。

ある具体例において、コンプスタチンの４位のＴｒｐは、前記定義のごとき１−アルキル置換基、より詳しくは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ５）置換基を含むアナログで置換される。これらは、限定されるものではないが、Ｎ（α）メチルトリプトファン、Ｎ（α）ホルミルトリプトファンおよび５−メチルトリプトファンを含む。他の具体例において、コンプスタチンの４位のＴｒｐは、１−アルカノイル置換基、より詳しくは、前記定義の低級アルカノイル（例えばＣ１−Ｃ５）を含むアナログで置換される。例示されたアナログに加えて、これらは、限定されるものではないが、１−アセチル−Ｌ−トリプトファンおよびＬ−β−ホモトリプトファンを含む。

ＷＯ２００７／０６２２２４９において、コンプスタチンにおける７位の５−フルオロ−ｌ−トリプトファンの組込みが、野性型コンプスタチンに対し、コンプスタチンとＣ３との間の相互作用のエンタルピーを増加させたが、コンプスタチンにおける４位の５−フルオロ−トリプトファンの組込みがこの相互作用のエンタルピーを減少させたことが開示された。結果的に、ＷＯ２００７／０６２２２４９に記載された７位のＴｒｐの改変は、前記の８位および１３位に対する改変と組み合わせた有用な改変と考えられる。

本発明の改変したコンプスタチンペプチドは、従来のペプチド合成方法により、１以上のアミノ酸残基の縮合を介してペプチド合成の種々の合成法により調製し得る。例えば、ペプチドは標準的固相方法により合成され、製造者の指示により、Applied Biosystems Model 431Aペプチド合成機(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)で行い得る。固相方法によるかまたは液相中でペプチドまたはペプチドミメティックを合成する他の方法は、当業者によく知られている。ペプチド合成の経過中に、分岐鎖のアミノ基およびカルボキシル基は、一般的に知られた保護基を用いて、必要に応じて保護／脱保護し得る。適切なペプチド合成法の一例は、実施例１に記載されている。ペプチドおよびペプチド誘導体についての別法の保護基を利用する改変は、当該技術分野に明白であろう。

別法として、本発明のあるペプチドは、適切な原核生物または真核生物系における発現により生成し得る。例えば、ＤＮＡ構築体は、細菌細胞（例えば、大腸菌）または酵母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiae）中の発現に適したプラスミドベクターに、または昆虫細胞中の発現用バキュロウイルス・ベクターに、または哺乳動物細胞中の発現用のウイルスベクターに挿入し得る。かかるベクターは、宿主細胞中のＤＮＡの発現を可能とする方法で配置された、宿主細胞中のＤＮＡの発現に必要な調節要素を含む。発現に必要なかかる調節要素は、プロモーター配列、転写開始配列および所望によりエンハンサー配列を含む。

また、ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて核酸分子の発現により生成できる。コンカテマーの上限が利用される発現系に依存する、ペプチドのコンカテマーをコードするＤＮＡ構築体は、ｉｎ ｖｉｖｏ発現系に導入し得る。コンカテマーが生成された後、Ｃ末端Ａｓｎおよび次のＮ末端Ｇ間の切断は、ヒドラジンへのポリペプチドの曝露により達成される。

組換え原核生物または真核生物系における遺伝子発現により生成されたペプチドは、当該技術分野において知られた方法により精製し得る。また、遺伝子発現および合成法の組合せは、コンプスタチンアナログを生成するために利用し得る。例えば、アナログは遺伝子発現により生成し、その後、１以上の翻訳後合成プロセスに付して、例えば、ＮまたはＣ末端を改変できるか、または分子を環化できる。

有利には、非天然のアミノ酸、例えば、メチル化アミノ酸を組み込むペプチドは、適切な原核生物または真核生物系においてｉｎ ｖｉｖｏにより生成し得る。例えば、大腸菌栄養素要求体中の発現を介して非天然のＴｒｐアナログをコンプスタチンに導入するための、KatragaddaおよびLambris (2006, Protein Expression and Purification 47：289-295)により記載されたもののごとき方法を利用して、コンプスタチンの選択された位置にてＮ−メチル化または他の非天然のアミノ酸を導入し得る。

コンプスタチンの構造は当該技術分野において知られ、前記アナログの構造は同様の手段により決定される。一旦短いペプチドの特定の所望の立体構造が確認されたならば、その立体構造に適合するペプチドまたはペプチドミメティックを設計する方法は、当該技術分野においてよく知られている。本発明に特に関連するペプチドアナログの設計は、前記のごとき（すなわち、官能基の効果または立体的考察のために）、アミノ酸残基の種々の側鎖の寄与を考慮することによりさらに洗練し得る。

ペプチドミメティックが、Ｃ３に結合し補体活性化の抑制に必要な特定の骨格立体構造および側鎖機能性を提供する目的で、ペプチドとして同様によく機能し得ることは当業者により理解されるであろう。結果的に、適切な骨格立体構造を形成するように連結できる天然発生アミノ酸、アミノ酸誘導体、アナログまたは非アミノ酸分子の使用を介してＣ３結合の補体抑制化合物を生成することは、本発明の範囲内にあると考えられる。非ペプチドアナログ、またはペプチドおよび非ペプチド成分を含むアナログは、本明細書において、本発明のペプチドの置換または誘導を指定するために時々「ペプチドミメティック」、「等立体的（isosteric）ミメティック」といい、それは補体活性化を抑制する例示されたペプチドと十分に類似するような同一の骨格立体構造特徴および／または他の機能性を所有する。

高親和性ペプチドアナログの開発のためのペプチドミメティックの使用は、当該技術分野においてよく知られている(例えば、 Vagnerら, 2008, Curr. Opin. Chem. Biol. 12：292-296；Robinsonら, 2008, Drug Disc. Today 13：944-951参照)。ペプチド内のアミノ酸残基のものに類似する回転拘束を仮定すると、当該技術分野においてよく知られたいずれかの種類の計算技術により、非アミノ酸部分を含むアナログを分析でき、それらの立体構造モチーフを確認できる。

本発明の改変したコンプスタチンペプチドは、ペプチドへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分の付加により改変できる。当該技術分野においてよく知られているように、ＰＥＧ化は、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療用ペプチドおよびタンパク質の半減期を増加できる。１つの具体例において、ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００の平均分子量を有する。もう一つの具体例において、ＰＥＧは、約１，０００〜約２０，０００の平均分子量を有する。もう一つの具体例において、ＰＥＧは、約１，０００〜約１０，０００の平均分子量を有する。例示的な具体例において、ＰＥＧは、約５，０００の平均分子量を有する。ポリエチレングリコールは、分岐鎖または直鎖、好ましくは直鎖であり得る。

本発明のコンプスタチンアナログは、連結基によりＰＥＧに共有結合できる。かかる方法は当該技術分野においてよく知られている。(Kozlowski A.ら 2001, BioDrugs 15：419-29に概説され；また、 Harris JMおよびZalipsky S, eds. Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680 (1997)参照)。受入れ可能な連結基の非限定例は、エステル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、スクシンイミド基（限定なくして、コハク酸スクシンイミジル（ＳＳ）、プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）およびＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（限定なくして、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（限定なくして、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＰＣ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または第一級アミンを含む。ある具体例において、連結基はスクシンイミド基である。１つの具体例において、連結基はＮＨＳである。

本発明のコンプスタチンアナログは、別法として、アミノ基、スルフィド（sulfhydral）基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介してＰＥＧ（すなわち、連結基なし）に直接的に結合できる。１つの具体例において、ＰＥＧは、コンプスタチンのＣ末端に付加されたリジン残基に結合される。

また、ＰＥＧ化の別法として、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏクリアランスは、ペプチドをある種の他の分子またはペプチドに連結することにより低減できる。例えば、静脈内ボーラスによりウサギに注入した場合、あるアルブミン結合ペプチドは、２．３ｈの非常に長い半減期を示す (Dennisら, 2002, J Biol Chem. 277：35035-35043)。このタイプのペプチドは、Ｄ３Ｈ４４の抗組織因子Ｆａｂに融合し、組織因子を結合するＦａｂの能力を保持しつつ、そのＦａｂがアルブミンを結合することを可能にした (Nguyenら, 2006, Protein Eng Des Sel. 19：291-297)。アルブミンとのこの相互作用の結果、野生型のＤ３Ｈ４４Ｆａｂと比較した場合、マウスおよびウサギにおいてｉｎ ｖｉｖｏクリアランスをかなり低減し、半減期を延長し、ＰＥＧ化Ｆａｂ分子、イムノアドヘシンおよびアルブミン融合につき見られたものに匹敵した。ＷＯ２００７／０６２２４９は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）と融合したコンプスタチンアナログを記載し、融合タンパク質が補体活性化の抑制に活性であるということを報告する。しかしながら、その合成は長く、融合生成物の収率は所望のものより低かった。本明細書の実施例２は、ＡＢＰならびにアルブミン結合低分子（ＡＢＭ）を利用し、所望により成分間のスペーサーを使用する改善された合成戦略を記載する。それらの手順の結果、補体活性化を抑制ができるＡＢＰ−およびＡＢＭ−コンプスタチンアナログのコンジュゲートを生成し、また、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ生存を示す。実際に、ＡＢＰは、その抑制活性をかなりには損なうことなく、コンプスタチンアナログの半減期を２１倍改善できた。かくして、かかるコンジュゲートは、注入なくして、抑制物質の全身投与を可能にする。

コンプスタチンアナログ、ペプチドミメティックおよびコンジュゲートの補体活性化抑制活性は、当該技術分野に知られた種々のアッセイにより試験し得る。１つの具体例において、実施例１に記載されたアッセイは利用される。他のアッセイの非網羅的なリストは、米国特許第６，３１９，８９７号、ＷＯ９９／１３８９９、ＷＯ２００４／０２６３２８およびＷＯ２００７／０６２２４９に記載され、それらは、限定されるものではないが、（１）Ｃ３およびＣ３断片へのペプチド結合、（２）種々の溶血のアッセイ；（３）Ｃ３のＣ３転化酵素媒介切断の測定；および（４）Ｄ因子によるＢ因子切断の測定を含む。

当該技術分野において知られるごとく、本明細書に記載したペプチドおよびペプチドミメティックは、コンプスタチン自体が利用されるいずれかの目的のための実際に有用なものである。かかる使用は、限定されるものではないが、（１）患者（ヒトまたは動物）の血清、組織または器官中の補体活性化の抑制、これは、限定されるものではないが、加齢黄斑変性症、慢性関節リウマチ、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌、および喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性炎、気腫、気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、肺炎、呼吸促迫症候群（ＲＤＳ−新生児および成人）、鼻炎および副鼻腔炎のごとき呼吸器疾患を含めたある種の疾患または状態の治療を促進できる；（２）細胞または器官移植中に、または人工臓器または組織片の使用において生じる補体活性化の抑制（例えば、本発明のペプチドで細胞、器官、人工臓器または移植片を覆うかまたは処理することによる）；（３）生理液（血液、尿）の体外シャンティング中に生じる補体活性化の抑制（例えば、生理液が本発明のペプチドでシャントされる管を覆うことによる）；および（４）コンプスタチン活性化の他の抑制物質を同定する低分子ライブラリーのスクリーニング（例えば、Ｃ３またはＣ３断片と結合するコンプスタチンアナログと競合する試験化合物の能力を測定するように設計された液相または固相の高処理アッセイ）を含む。

前記の１以上の有用性を実施するために、本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載または例示されたコンプスタチンアナログまたはコンジュゲートを含む医薬組成物を要旨とする。かかる医薬組成物は、対象への投与に適した形態で、単独で有効成分よりなり得るか、または医薬組成物は、その有効成分および１以上の医薬上許容される担体、１以上のさらなる成分またはこれらのいくらかの組合せを含み得る。有効成分は、当該技術分野においてよく知られるごとく、例えば、生理学的に許容できるカチオンまたはアニオンと組み合わせて、生理学的に許容できるエステルまたは塩の形態で医薬組成物中に存在し得る。

医薬組成物の処方は、薬理学の技術分野において知られたかまたはその後に開発されたいずれの方法によっても調製し得る。一般的に、かかる調製方法は、有効成分を担体または１以上の他の副成分と関連させ、次いで、必要または所望ならば、製品を所望の単一または複数投与単位に成形または包装する工程を含む。

本明細書に用いた「医薬上許容される担体」なる用語は、補体抑制物質を組み合せでき、組合せ後に、それを用いて、哺乳動物にその補体抑制物質を投与できる化学組成物を意味する。

以下の実施例は、本発明をより詳細に記載するために提供される。それらは、発明を例示することを意図し、発明を限定することを意図しない。

実施例１
モノ−Ｎ^α−メチル化スキャンを［Ｔｙｒ^４Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチン（Ａｃ−Ｉｃ［ＣＶＹＱＤＷＧＡＨＲＣ］Ｔ−ＮＨ_２；配列番号：３）に対して行った。これらのアナログのアッセイ結果に基づいて、１３位の選択的なＮ−メチル化および置換を［Ｔｒｐ（Ｍｅ）^４Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチン（Ａｃ−Ｉｃ［ＣＶ（^１−ＭｅＷ）ＱＤＷＧＡＨＲＣ］Ｔ−ＮＨ_２；配列番号：４）に行った。選択したアナログは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いて、さらに特徴付けした。また、分子動態（ＭＤ）シミュレーションを行い、親和性の増加の観察のための可能な機序を調べた。

材料および方法：
略語． Ａｃ、アセチル基；Ａｃｍ、アセトアミドメチル；Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；ＣＨＡＲＭＭ、Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＣ、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着定量法；ＥＳＩ、エレクトロスプレーイオン化；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトシキカルボニル；ＨＯＡｔ、１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール；ＩＴＣ、等温滴定熱量測定；ＭＡＬＤＩ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法；ＭＢＨＡ、４−メチルベンズ−ヒドリルアミン；ＭＯＥ、分子操作環境；ＮＡＭＤ、ナノスケール分子動力学；Ｎｌｅ、Ｌ−ノルロイシン；ＮＭＰ、Ｎ−メチルピロリジノン；ＲＭＳＤ、平均二乗偏差；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴；ＴＩＰＳ、トリイソプロピルシラン；Ｔｒｔ、トリチル。

化学薬品． 低負荷リンクアミドＭＢＨＡ樹脂および以下のＦｍｏｃアミノ酸：Ｉｌｅ、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｙ、Ｓａｒ、Ａｌａ、ＭｅＡｌａ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、ＰｈｅおよびＴｈｒ（ｔＢｕ）をNovabiochem (San Diego, CA)から得た。 ＤＩＣおよびＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−ＯＨをAnaSpec (San Jose, CA)から購入した。ＨＯＡｔはAdvanced ChemTech (Louisville, KY)から購入した。ＮＭＰおよびＤＣＭは、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)から得た。合成用の他のすべての化学試薬はSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入し、さらなる精製なくして用いた。

ペプチド合成および精製． すべてのペプチドは、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＡｔを用いて、Ｆｍｏｃ固相法によりマニュアルにて合成した。Ｎ−メチル化アミノ酸が商業的に入手可能ではなかった場合、Ｎ^α−メチル化は、Bironら (2006, J Peptide Sci 12:213-219)により報告された、最適化された方法を用いることにより行った。下記手順を直鎖ペプチドの合成に用いた：リンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２９４ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）を、底部のフリットを持つ１０ｍＬ ＨＳＷポリプロピレン製シリンジ(Torviq, Niles, MI)に入れ、３０分間ＤＣＭ（５ｍＬ）中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ保護基（ＮＭＰ中の２５％ピペリジン、５ｍＬ、５および１０分間）の除去後、樹脂をＮＭＰ（洗浄当たり５ｍＬ）およびＤＣＭ（洗浄当たり５ｍＬ）で４回洗浄し、個々のアミノ酸を樹脂にカップリングさせた。各カップリングについて、３当量（３ｍｍｏｌ）のアミノ酸、ＨＯＡｔおよびＤＩＣを用いて、ＮＭＰ中で１０分間前活性化した。すべてのカップリングを１時間行い、カイザー試験またはクロラニル試験のいずれかによりモニターした。陽性のテスト結果の場合には、陰性のテスト結果が観察されるまで、カップリングを繰り返した。

Ｎ末端アミノ基は、５ｍＬのＤＣＭ中の２０当量の無水酢酸および２当量のＤＩＰＥＡで３０分間アセチル化した。Ｃｙｃ（Ａｃｍ）残基を含む直鎖ペプチドは、ＤＭＦ／アニソール（１９：１）の酢酸タリウムを用いて、周囲温度で３時間樹脂上で環化した。樹脂は、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびＤＣＭ／ジエチルエーテル（１：１）（洗浄当たり各５ｍＬ）で４回洗浄し、４時間真空下で乾燥させた。ペプチドは、３時間９５％のＴＦＡ、２．５％の水および２．５％のＴＩＰＳの混合物で樹脂から切断した。真空下のＴＦＡの蒸発後、ペプチドを沈殿させ、洗浄当たり３０ｍＬの冷エチルエーテルで３回洗浄した。液体を遠心分離により固体から分離し、デカントした。粗製ペプチドを空気乾燥し、アセトニトリルおよび水（１：３）に溶解した後、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣ(Vydac C18 218TP152022 column, Western Analytical Products, Murrieta, CA)により精製し、１５ｍＬ／分間の流速にて３５分間にわたり０．１％ＴＦＡ水溶液中の１５〜５０％アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させた。所望の生成物を含む画分を集め、濃縮し、凍結乾燥した。精製したペプチドを１０〜１５％の全収率で単離し、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ(Phenomenex 00G-4041-E0 Luna 5μ C18 100A column, 250x4.60 mm；Phenomenex, Torrance, CA)により決定した＞９５％純粋であった。各ペプチドの質量は、ThermoQuest Finnigan LCQ DuoおよびWaters MALDI micro MX instrumentsを用いて確認した。

Ｃ３の精製． Ｃ３は、ペンシルバニア大学病院の血液銀行から得た新鮮なヒト血漿から精製した。略言すると、血漿は、１５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０で分画し、ペレットをｐＨ７．８の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中で再懸濁し、次いで、同じ緩衝液でＤＥＡＥ−ＨＲ ４０カラム（５０×５ｃｍ；Millipore Inc., Billerica, MA）上の陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。タンパク質を５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ７．８の２０ｍＭリン酸塩緩衝液の６Ｌの直線濃度勾配（１５〜７０％）で溶出した。Ｃ３は、サイズ排除Superdex 200 26/60 column (Amersham Biosciences) およびMono S column (Amersham Biosciences)でさらに精製して、Ｃ３（Ｈ_２Ｏ）からＣ３を分離した。

補体活性化の抑制． 補体の古典経路の活性化を抑制するコンプスタチンアナログの能力をＥＬＩＳＡ(Mallikら, 2005, J Med Chem 48:274-86)により評価した。略言すれば、補体は、コンプスタチンアナログの存在または不存在下で抗原抗体複合体を用いて、ヒト血清中で活性化し、プレート表面上のＣ３断片の沈着物をＨＲＰ−コンジュゲートしたポリクローナル抗Ｃ３抗体を用いて検出した。４０５ｎｍで得られた吸光度データは、１００％の補体活性化に対応する吸光度に基づいて、％抑制に翻訳した。パーセント抑制は、ペプチド濃度に対してプロットし、得られたデータセットは、Origin ７．０ソフトウェアを用いて、ロジスティックス用量反応関数に適合させた。ＩＣ_５０値は、最低χ^２値を生成した適合パラメーターから得た。各アナログは少なくとも３〜７回アッセイした。標準偏差は、すべて平均値の３０％以内にあった。

ＩＴＣ分析． すべてのＩＴＣ実験は、シリンジ中の１．８〜５μＭ Ｃ３のタンパク質濃度および個々のコンプスタチンアナログの４０〜１００μＭのペプチド濃度を用いて、Microcal VP-ITC 熱量計(Microcal Inc., Northampton, MA)で行った。すべての滴定は、２〜７μＬの複数の各ペプチド注入を用いて、２５℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液）中で行った。未処理の等温線は緩衝液へのペプチド注入を表わす等温線を引くことにより、希釈熱につき補正した。得られた等温線は、Origin ７．０ソフトウェアを用いて、部位モデルの単一部位に適合し、最低のχ^２値を生成したモデルはそれぞれのデータセットに適切であると考えられた。ギブズの自由エネルギーは、ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳとして計算した。各実験を少なくとも２回繰り返した。誤差は平均値の２０％以内であった。

ＳＰＲ分析． 前記のごとく、Ｃ３ｂおよび各コンプスタチンアナログ間の相互作用の動力学は、泳動緩衝液としてＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を用いて、２５℃にてBiacore 3000 instrument (GE Healthcare Corp., Piscataway, NJ)でＳＰＲにより分析した。略言すると、ビオチン化Ｃ３ｂ（３０μｇ／ｍＬ）を、ストレプトアビジンを被覆したセンサーチップに固定化し、各アナログの二倍系列希釈系（１μＭ〜５００ｐＭ）を５〜１０分の解離相で３０μｌ／分間にて２分間注入した。ペプチド［Ｔｒｐ（Ｍｅ）^４］−Ａｃ−コンプスタチンは内部の対照および基準として各実験系に含ませた。データ分析は、Scrubber (BioLogic Software, Campbell, Australia)を用いて行った。未処理フローセルおよび緩衝ブランク注入のアンサンブルからのシグナルを引いて、緩衝効果および注入アーティファクトにつき補正した。処理したバイオセンサーデータは、１：１ラングミュア結合モデルに全体的に適合し、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａから計算した。ペプチド溶液は、すべての実験に２連にて注入し、各スクリーニングアッセイは少なくとも２回行った。ｋ_ａおよびｋ_ｄの誤差は平均値の１０％以内にあった。

分子動態シミュレーション． すべてのＭＤシミュレーションは、ＣＨＡＲＭＭ２７力場を用いて、プログラムＮＡＭＤ(Phillips,ら, 2005, J. Comput. Chem. 26:1781-1802)で行った。自由なコンプスタチンアナログについて、ＮＭＲ構造 (Morikis & Lambris, 2002, Biochem. Soc. Trans. 30：1026-1036) (PDBコード：1A1P)を採用して、出発構造を構築した。点変異は、プログラムMolecular Operating Environment (MOE, Chemical Computing Group, 2005)で導入した。コンプスタチンアナログの変異した残基は、CHARMM27 (MacKerellら, 1998, J. Phys. Chem. B 102：3586-3616) パラメーターセットを含むＣＨＡＲＭＭ(Brooks ら, 1983, J. Comput. Chem. 4：187-217)バージョンc33b1を用いて最小化し、一方、調和拘束を骨格原子に配置した。結晶構造から欠けている補体Ｃ３ｃの残基をホモロジーモデリングを用いて加え、またＣＨＡＲＭＭを用いて最小化した。

ＰＤＢファイル中の結晶学的水分子を維持し、構造はＴＩＰ３Ｐ (Jorgensenら, 1983, J. Chem. Phys. 79：926-935)水分子の立方体周期的なボックス中で溶媒和した。水シミュレーションボックスの縁と、溶質の最接近している原子との間の距離は、少なくとも１０Åであった。次いで、系の電気的中性を維持するためにナトリウムおよび塩素対イオンをＶＭＤプログラム(Humphreyら, 1996, J. Mol. Graphics 14：33-38, 27-28)を用いて加えた。

系は、連続３ステップでまず最小化し、その間に、タンパク質を最初に固定しままとし、水分子を１０，０００コンジュゲート勾配ステップに向けて移動することを可能とし；次に、タンパク質骨格だけを１００，０００ステップの間固定したままとし；最後に、すべての原子をさらなる１０，０００ステップの間移動するのを可能とした。粒子メッシュエワルド法(Dardenら, 1993, J. Chem. Phys. 98：10089-10092)を用いて、Å当たり約１点のグリッドで周期的境界条件における長距離の静電的相互作用を処理した。非結合ファンデルワールス相互作用を９Å〜１２Åの間で３Åを超えて滑らかに切り替えた。水素原子への結合に関与する結合長は、ＳＨＡＫＥ(Ryckaertら, 1977, J. Comput. Phys. 23：327-341)を用いることにより拘束した。すべてのＭＤシミュレーション用の時間ステップは、２ｆｓであった。Nose-Hoover Langevinピストン(Fellerら, 1995, J. Chem. Phys. 103：4613-4621；Martynaら, 1994, J. Chem. Phys. 101：4177-4189)を圧力制御のために用い、ピストン期間を２００ｆｓ、ピストン遅延を１００ｆｓにセットした。１００ピコセカンドのＭＤシミュレーションを一定体積で行い、その間に、系を３０Ｋの増加で３１０Ｋまで加熱し；引き続いての等温等圧ＭＤシミュレーションを２０ｎｓおよび５ｎｓ間に用いて、各々、自由なコンプスタチンアナログおよび複合体についてのすべての溶質原子に対する拘束のない溶媒密度を調節した。最後に、最低のエネルギー構造をＭＤ平衡軌道ファイルから得、引き続いて、構造およびエントロピー寄与度分析に用いた。

結果：
補体活性化の抑制． 骨格Ｎ−メチル化スキャンを［Ｔｙｒ^４Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチンテンプレート（ペプチド１；配列番号：３）に行い、アナログ２〜１３（表１−１）を生成した。ペプチド１は現在のリード化合物［Ｔｒｐ（Ｍｅ）^４ Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチン（ペプチド１４、配列番号：４）より強力ではなかったが、それは、低コストの合成のために最初のスキャンのために選定した。次いで、補体の活性化を抑制する各ペプチドの能力は、ＥＬＩＳＡにより評価し、ペプチド１の活性と比較した（表１−１）。最もネガティブな効果は、Ｖａｌ^３、Ｔｙｒ^４およびＡｌａ^９のＮ−メチル化につき観察し、それはペプチド３、４および９を完全に不活性にした。対照的に、Ｇｌｙ^８およびＴｈｒ^１３のＮ−メチル化は、わずかに増加した効力（各々、１．７倍および１．３倍）を持つペプチド８および１３を生成した。他のすべての位置のＮ−メチル化の結果、検知可能だが、まだかなり低減した抑制活性を生じた（表１−１）。

次いで、本発明者らは、Ｎ−メチル化スキャンからの知見を現在の強力なアナログのＡｃ−Ｉ［ＣＶ（^１−ＭｅＷ）ＱＤＷＧＡＨＲＣ］Ｔ−ＮＨ_２（配列番号：４；本明細書において［Ｔｒｐ（Ｍｅ）^４Ａｌａ^９］−Ａｃ−コンプスタチン（ペプチド１４）ともいう）に適用し、８位および１３位での選択的なＮ−メチル化およびアミノ酸置換を持つアナログを合成した（ペプチド１５〜２３；表１−２）。従来の研究が８位の側鎖を置換するための制限を示した(Morikisら, 1998, Protein Sci. 7：619-627；Furlongら, 2000, Immunopharmacology 48：199-212)ので、改変をＮ−メチル化の不存在（Ｇｌｙ^８）または存在（ＮＭｅＧｌｙ^８、すなわち、Ｓａｒ^８）に制限した。対照的に、従前の研究は、Ｃ末端１３位が置換につきより多くの柔軟性を可能とすることを示し、Ｔｈｒに対するＩｌｅについての優先をさらに示唆した(Morikis & Lambris, 2002, Biochem. Soc. Trans. 30：1026-1036)。したがって、本発明者らは、さらに１３位の重要性を調べ、この位置に種々のＮ−メチル化残基、疎水性残基または芳香族残基を含めるように一連のＳａｒ^８アナログを設計した。Ｎ−メチル化スキャンからの結果と一致して、８位（Ｓａｒ８；ペプチド１５）での単一のＮ−メチル基の導入は、抑制効力を１．３倍増加させた（表１−３）。加えて、１３位のＩｌｅによるＴｈｒの置換は、Ｇｌｙ^８およびＳａｒ^８の双方のペプチドにつきかなりの増加に導いた。しかしながら、ＬｅｕまたはＮｌｅによるＩｌｅの置換およびＨｉｓまたはＰｈｅの導入のいずれも、Ｉｌｅ^１３アナログ上のいずれの改善も生成しなかった。対照的に、Ｔｈｒ^１３およびＩｌｅ^１３の双方のＮ−メチル化の結果、抑制活性をかなり増加させ（各々、ＩＣ_５０＝８６および６２ｎＭ）、これまで記載した最も強力なコンプスタチンアナログを生成した。

結合動力学の特徴付け． Ｃ３ｂについての動力学のプロフィールおよび結合能に対する個々の置換の効果を評価するために、ペプチド１５〜２１をＳＰＲによりさらに特徴付けした（表１−２）。一般的には、相対的なＫ_Ｄ値は、ＥＬＩＳＡ結果と良好な整合性を示した（Ｒ^２＝０．７９；表１−３）。Ｇｌｙ^８のＮ−メチル化（ペプチド１４から１５、１６から１７）は結合動力学および親和性を明確に改善し、双方の動力学速度定数に対してかなりの効果を有した。対照的に、ＴｈｒからＩｌｅへの置換（ペプチド、１４から１６、１５から１７）は、ＳＰＲプロフィールにわずかだけだが、さらに依然として有益な影響を有した。再度、双方の置換（ペプチド１７）の組合せは相乗効果を有し、Ｓａｒ^８およびＩｌｅ^１３の単独の改変の影響（各々、２．２倍および１．１倍）と比較して、ペプチド１４より２．７倍強い親和性を有した。１３位の置換は、単独で、解離速度（ｋ_ｄ＝３．４〜７．２×１０^−３ｓ^−１）に主として影響するようであり；会合速度は、すべてのＳａｒ^８アナログにつき本質的に一定のままであった（ｋ_ａ＝１．３〜１．７×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１）。この系において、Ｔｈｒ^１３（ペプチド２０）およびＩｌｅ^１３（ペプチド２１）のＮ−メチル化は、再度、解離速度に最も強い影響を有し、アナログ２１に最強の結合物質とさせ、ペプチド１４の親和性を５倍を超えて増加させた。Ｉｌｅ１３の評価した異性体（Ｌｅｕ、Ｎｌｅ；ペプチド１８および１９）は、動力学のプロフィールおよび親和性に無視できる影響を有し、この骨格につき共通の結合様式を示した。

結合熱力学の特徴付け． ＩＴＣ実験は、親和性および効力に対して観察した効果をそれらの熱力学的プロフィールと関連させるために、ペプチド１５〜１７および２０〜２１につき行った（表１−２および１−３）。ＩＴＣ中の絶対的Ｋ_Ｄ値は、ＳＰＲからのものよりわずかに高い傾向があったが、それらはＥＬＩＳＡおよびＳＰＲの結果と高度に相関した（各々、Ｒ^２＝０．８９および０．９６）。従前のリード化合物（ペプチド１４）の高度に有益なエンタルピー値（ΔＨ＝−１７．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、新しく設計したアナログのいずれによっても超えられなかった。対照的に、ペプチド１４（−ＴΔＳ＝６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と比較した場合、全パネルは、エントロピー値をかなり改善した（−ＴΔＳ＝０．６〜５．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。

ペプチド１５（Ｓａｒ^８Ｔｈｒ^１３；−ＴΔＳ＝０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、すべての報告されたコンプスタチンアナログの最低のエントロピーペナルティーを示した。しかしながら、大多数のこの大きなエントロピー獲得は、好ましいエンタルピー（ΔΔＨ＝５．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の損失により相殺された。同様の傾向は全パネルに観察し、エンタルピー−エントロピー補償の影響を示した。ペプチド１７でのごときＴｈｒ^１３についてのＩｌｅ^１３のさらなる置換は、ペプチド１５におけるエントロピー獲得（−ＴΔＳ＝２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のいくらかを与えつつ、損失したエンタルピー（ΔＨ＝−１４．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のいくらかを再捕捉した。ペプチド２０〜２１でのように１３位のＮ−メチル化は、ペプチド１４のそれにさらに近いそれらのエンタルピーをもたらした。全体として、これらのペプチド用の結合能の増加は、主としてエントロピーペナルティーの低下により達成されるようであった。さらに、ＩＴＣデータは、それが、ペプチド１７の親和性の大きな増加に大部分は寄与したＩｌｅ^１３置換ではなく、Ｓａｒ^８であったことを示すＳＰＲ結果を確認した。

ＭＤシミュレーション． アナログの熱力学的プロフィールにおける小ペプチド改変さえの大きな影響は、Ｃ３ｃとのコンプスタチンのＮＭＲ構造および［Ｔｒｐ^４］−Ａｃ−コンプスタチンの結晶構造に基づいたＭＤシミュレーションを用いて、さらに調べた(Morikisら, 1998,前記；Janssenら, 2007, J. Biol. Chem. 282：29241-29247)。８位でのＮ−メチル化の場合（ペプチド１７）において、本発明者らは、この改変が、メチル化Ｇｌｙ^８窒素に直接的に連結し、タイトポケット（tight pocket）を占める非常に重要な残基Ｔｒｐ^７の側鎖に影響したと考えた。したがって、ＭＤシミュレーションはペプチド１４および１７のＴｒｐ^７結合ポケット中の水分子の分布を比較するために行った。本発明者らは、４つの水分子をペプチド１４につき観察できたが、ペプチド１７でのシミュレーションを繰り返した後に、いずれも見出されないことが分かった。この結果は、８位のＮ−メチル化がＴｒｐ^７の側鎖が、Ｃ３ｃ結合ポケットに良好に適合するのを可能とする。

溶液ベースおよびタンパク質結合構造間の先の比較は、重要なβ−ターンにおけるシフトを含むかなりの立体構造再配列を明らかにした(Janssenら, 2007,前記)。Ｎ−メチル化がペプチド骨格の局所立体構造に影響することが報告されているので、本発明者らは、Ｃ３ｃの不存在および存在下でペプチド１４および１７につきＭＤシミュレーションを行ない、次いで、自由および結合したペプチドの得られた最低エネルギー配座異性体を比較した(Chatterjeeら, 2008, Acc. Chem. Res. 41：1331-1342)。結果は、β−ターンを包含する残基５〜８を開き、新たなターンを双方のペプチドの自由構造中の残基８および１１間で形成したことを示した。また、そのβ−ターンは、結合構造中のもので覆われた。しかしながら、２．９Åの距離を持つＴｒｐ^７およびＡｒｇ^１１間の分子内水素結合はペプチド１７のケースにおいてのみ形成され、恐らく自由な１７の立体構造を拘束し、それをより強固にするようであった。

実施例２
この実施例は、以下に示すアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）またはアルブミン結合低分子（ＡＢＭ）にコンジュゲートした、コンプスタチンアナログ（実施例１に記載したペプチド１７：Ａｃ−Ｉｌｅｃ［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓａｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−Ｉｌｅ−ＮＨ_２；配列番号：７）の合成の改善および血漿中半減期決定を記載する。

ABP: Ac-RLIEDICLPRWGCLWEDD-NH₂ (C-Cジスルフィド結合) (配列番号：１４)

２つのミニ−PEG-3分子をスペーサーとして用い、ペプチド１７のＣ末端にカップリングした。

比較については、コンジュゲートしていないペプチド１７の血漿中半減期も決定した。

材料および方法：
略語． Ａｃ、アセチル；Ａｃｍ、アセトアミドメチル；Ａｃｍ、アセトアミドメチル；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＣ、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド；
ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着定量法；ＥＳＩ、エレクトロスプレーイオン化；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトシキカルボニル；ＨＬＢ、親水性−親油性バランス；ＨＯＡｔ、１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール；ＨＳＷ、Henke Sass Wolf；ＩＴＣ、等温滴定熱量測定；ＭＡＬＤＩ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法；ＭＢＨＡ、４−メチルベンズ−ヒドリルアミン；Ｍｍｔ、モノメトキシトリチル；ナノＥＳＩ、ナノエレクトロスプレーイオン化；ＮＭＰ、Ｎ−メチルピロリジノン；ＰｙＢＯＰ、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴；ＴＢＴＡ、トリス−（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン；ＴＥＡ、トリエチルアミン；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＰ、トリイソプロピルシラン；Ｔｒｔ、トリチル。

材料．
ＤＩＣおよびＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−ＯＨは、AnaSpec (San Jose, CA)から購入した。低負荷NovaSyn（登録）TGR樹脂および他のＦｍｏｃアミノ酸は、Novabiochem (San Diego, CA)から得た。ミニ−ＰＥＧおよびミニ−ＰＥＧ−３はPeptide International (Louisville, Kentucky)から購入した。ＨＯＡｔはAdvanced ChemTech (Louisville, KY)から購入した。ＡＢＭはEnamine Ltd. (Kiev, Ukraine)から得た。ＮＭＰおよびＤＣＭはFisher Scientific (Pittsburgh, PA)から得た。水はMilli-Q水浄化システム(Millipore Corporate, Billerica, MA)を用いて精製した。合成用の他のすべての化学試薬はSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入し、さらなる精製なくして用いた。

直鎖ペプチド（ペプチド１７のミニ−（ＰＥＧ−３）_２−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＮＨ_２およびＡＢＰ）の合成． すべてのペプチドは、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＡｔを用いて、Ｆｍｏｃ固相法によりマニュアルにて合成した。略言すると、樹脂（２９４ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）を、底部にフリットを持つ１０ｍＬ ＨＳＷポリプロピレン製シリンジ(Torviq, Niles, MI)に入れ、３０分間ＤＣＭ（５ｍＬ）中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ保護基（ＮＭＰ中の２５％ピペリジン、５ｍＬ、５および１０分間）の除去後、樹脂をＮＭＰ（洗浄当たり５ｍＬ）およびＤＣＭ（洗浄当たり５ｍＬ）で４回洗浄し、個々のアミノ酸を樹脂にカップリングさせた。各カップリングについて、３当量（３ｍｍｏｌ）のアミノ酸、ＨＯＡｔおよびＤＩＣを用いて、ＮＭＰ中で１０分間前活性化した。すべてのカップリングを１時間行い、カイザー試験またはクロラニル試験のいずれかによりモニターした。必要ならば、Ｎ末端アミノ酸は、５ｍＬのＤＣＭ中の２０当量の無水酢酸および２当量のＤＩＰＥＡで３０分間アセチル化した。

ペプチドの環化、改変および切断． Ｃｙｃ（Ａｃｍ）残基を含む直鎖ペプチドは、周囲温度にて３時間ＤＭＦ／アニソール（１９：１）中の１．２当量のタリウムトリフルオロアセテートを用いて樹脂上で環化した。アジドペプチド１７を合成するために、ペプチド１７誘導体のＣ末端Ｌｙｓの側鎖Ｍｍｔ保護基を５％のＴＩＰＳ含むＤＣＭ中で１％ ＴＦＡを用いて除去した。次いで、２−アジド酢酸をＮＭＰ中のＰｙＢＯＰ／ＨＯＡｔ／ＤＩＰＥＡを用いて、側鎖にカップリングした。ペプチド１７−ＡＢＭは同様の方法で合成した。アルキン−ＡＢＰを合成するために、プロピオル酸はＮＭＰ／ＤＣＭ（１：１）中のＤＩＣ／ＨＯＡｔを用いて、ＡＢＰのＮ末端にカップリングした。樹脂は、ＤＣＭ、ＤＣＭ／ジエチルエーテル（１：１）でよく洗浄し、４時間高真空下で乾燥させた後、ペプチドを９５％ＴＦＡ、２．５％水および２．５％ＴＩＰＳの混合物で２時間切断した。真空下のＴＦＡの蒸発後、ペプチドを沈殿させ、１洗浄当たり３０ｍＬの冷エチルエーテルを用いて、３回洗浄した。液体は遠心分離により固体から分離し、デカントした。粗製ペプチドは空気乾燥し、ＨＰＬＣ精製用のアセトニトリルおよび水（１：３）中の０．１％ＴＦＡに溶解した。

ペプチド１７−ＡＢＰの合成のための銅（Ｉ）媒介アジドアルキンヒュスゲン環化付加． ５０ｍｇ（２２μｍｏｌ）の精製したアジドおよびアルキンペプチドの各々を５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２：１）に溶解した。１０当量（２２０μｍｏｌ）のＴＥＡを添加して、溶液を塩基性にした。次いで、５％（１．１μｍｏｌ）のＣｕＳＯ_４、２５％のアスコルビン酸ナトリウムおよび１％のＴＢＴＡをその混合物に添加した。混合物は一晩撹拌し、ＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターした。次いで、それを真空下で濃縮し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。

ペプチド精製．
ペプチドは、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣカラム(Xbridge（商標）BEH130 Prep C18 5um 19x150mm, PN# 186003945, Waters, Milford, MA)に注入し、２０ｍＬ／分間の流量にて１５分間にわたり０．１％ＴＦＡ中の１５〜５０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させた。所望の生成物を含む画分を質量に基づいて集め、凍結乾燥した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ(Xbridge（商標）BEH130 C18 5um, 4.6x150mm, PN# 186003580, Waters, Milford, MA)により決定した＞９５％純粋であった。各ペプチドの質量はWaters MALDIマイクロMX装置または SYNAPT HDMSを用いて確認した。

補体活性化の抑制． 補体の古典経路の活性化を抑制するコンプスタチンアナログの能力を実施例１に記載されたＥＬＩＳＡにより評価した。各コンジュゲートは少なくとも３回分析した。

ＳＰＲ分析． 実施例１に記載のごとく、Ｃ３ｂおよび各コンプスタチンアナログ間の相互作用の動力学は、泳動緩衝液としてＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を用いて、２５℃にてBiacore 3000装置(GE Healthcare Corp., Piscataway, NJ)でＳＰＲにより分析した。略言すると、ビオチン化Ｃ３ｂ（３０μｇ／ｍＬ）を、ストレプトアビジンを被覆したセンサーチップに固定化し、各アナログの二倍系列希釈系（１μＭ〜５００ｐＭ）を５〜１０分の解離相で３０μｌ／分間にて２分間注入した。ペプチド１７（コンジュゲートしていない）は内部対照および基準として各実験系に含ませた。データ分析は、Scrubber (BioLogic Software, Campbell, Australia)を用いて行った。未処理フローセルからのシグナルおよび緩衝ブランク注入を引いて、緩衝効果および注入アーティファクトにつき補正した。処理したバイオセンサーのデータは、１：１ラングミュア結合モデルに全体的に適合し、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａから計算した。ペプチド溶液は、すべての実験に２連にて注入し、各スクリーニングアッセイは少なくとも２回行った。

ＳＰＥによる血漿試料からのコンプスタチンアナログの抽出． ９６ウェルプレート HLB Oasis １０ｍｇ(Waters, Milford, MA)を抽出のために使用した。ＳＰＥ材料は、５００μｌのメタノールの添加に続いて５００μＬのmilli-Q水の添加により条件を整えた。試料は、内部標準に続いて４％Ｈ_３ＰＯ_４での１：１希釈により調製した。試料を負荷後に、洗浄を０．１％ギ酸中の５％メタノールの５００μＬで行った。試料は、０．１％ギ酸中の６５％メタノールの１５０μＬで溶出し、収集プレート中に集めた。溶剤はスピードバック濃縮機中で乾燥まで蒸発させ、０．１％ギ酸中の５％アセトニトリル中で再構成した。試料は分析まで−２０℃に維持した。

消化による血漿試料からのペプチド１７−ＡＢＰおよびペプチド１７−ＡＢＭの単離．
ヒヒ血漿試料（４０μＬ）を内部標準と混合し、４０ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液で１：１に溶解した。Rapigest洗浄剤を０．１％最終濃度まで添加した。ジスルフィド架橋は６０℃にて３０分間５ｍＭ ＤＴＴ中で還元した。システインのアルキル化は、１５ｍＭの最終濃度までのヨードアセトアミドの添加、および暗所での３０分間のインキュベーションにより行った。試料は、１６μＬの１μｇ／μＬトリプシン溶液の添加および３７℃にての一晩のインキュベーションにより酵素的に消化した。その後、試料ｐＨは５％ ＴＦＡで低下させて、洗浄剤分解を引き起した。非常に疎水性のペプチドの非特異的吸着を回避するために、アセトニトリルを２０％まで添加した。試料は６℃および１４０００ｒｐｍにて３０分間で遠心分離し、１０ｋＤａのカットオフmicrocon遠心フィルター(Millipore, Billerica, MA)での濾過に先立ち、上清を０．１％ギ酸で希釈して、１０％までアセトニトリル濃度を低下させた。フィルターは、０．１％ギ酸中の１０％ ＡＣＮの５０μＬで洗浄し、集めた試料を乾燥まで蒸発させ、０．１％ギ酸中の１０％ＡＣＮで再構成した。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析． ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析は、MassLynx 4.1 software (Waters)に制御され、nanoESI sourceを装備したSYNAPT HDMS(Waters, Milford, MA)で行った。各試料を３連にて注入した。nanoACQUITY UPLC (Waters)システムは逆相液体クロマトグラフィー用のペプチド分離に用いた。注入後、分析物を５μｍ Symmetry C18カラム(180 μm x 20 mm, Waters)にて５μｌ／分にて３％移動相Ａ（水中の０．１％ギ酸）で３分間捕捉し、１．７μｍ BEH130 C18カラム(75 μm x 150 mm, Waters)でさらに分離した。分析カラム温度は３５℃に保持した。ペプチドは流速０．３μｌ／分にて分離した。勾配は、消化された試料につき５０分間の長さまたは６０分間の線形３〜４０％Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）であった。毛細管電圧は３．２ｋＶであり、コーン電圧は３５Ｖであり、ソース温度は１００℃であった。［Ｇｌｕ１］−フィブリノゲンペプチドは、３０秒のサンプリング速度でロック質量矯正に用いた。質量スペクトルは、スキャン周波数０．６秒にてｍ／ｚ４００〜２０００Ｄａにわたり陽性モードで得た。ＭＳ／ＭＳ関数に用いた時間ウィンドウは、選択したペプチドの保持時間の±３分間であった。分析物の存在はＭＳ／ＭＳにより確認した。選択性はブランク試料の分析により試験して、分析物で共溶出するいずれかの干渉の存在を決定した。

ｉｎ ｖｉｖｏ保持． 体重５〜８ｋｇの若年ヒヒ(P. Anubis, Baboon Research Resources, University of Oklahoma)を用いた。３頭のヒヒを試験に用い；各化合物に１頭。すべての動物は、末梢静脈を介する注入によりボーラス用量のペプチド（１０ｍｇ）を受けた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイ用の血液サンプルは、５０μｇレピルジンを含む１ｍｌのプラスチックチューブ中に集め、血漿分離のために４℃にて２０００ｇで２０分間遠心分離した。血漿試料は−７０℃で保存した。血液サンプルはペプチド１７の注入後、２０、４０、６０、９０および１２０分；ペプチド１７−ＡＢＰおよびペプチド１７−ＡＢＭの注入後、１分、３０分、次いで、１、６、２４および４８時間にて集めた。

結果：
ペプチド１７−ＡＢＭの合成． 以下の反応図式に要約されるごとく、ペプチド１７−ＡＢＭは、固相ペプチド合成およびＨＰＬＣ精製後に得た。直鎖ペプチドは各アミノ酸の単一カップリングで合成した。タリウムトリフルオロアセテートおよびヨウ素の双方をジスルフィド結合形成につき評価した。前者は、よりきれいな反応を与え、その後、すべての環化に用いた。ペプチド１７−ＡＢＭの質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＴＯＦにより確認した（［ＭＨ］^２＋計算値 １２１１．０５、実測値 １２１１．０６）。

ペプチド１７−ＡＢＰの合成． 溶液中でアジドアルキンヒュスゲン環化付加は、以下の反応図式により、コンジュゲーションのために用いた。２−アジド酢酸を２−ブロモ酢酸およびアジ化ナトリウムから合成した。次いで、それを樹脂上のジスルフィド結合の形成後にＣ末端Ｌｙｓ側鎖にカップリングした。中間体２および３は、切断およびＨＰＬＣ精製後に、各々、１２．３％および１２．７％の収率で得た。

異なる３つの溶媒系をアジドアルキンヒュスゲン環化付加につき比較した。最良の結果はｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ_２Ｏ系に続いて、ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ系で観察した。ＤＭＦだけを溶媒して用いた場合に生成物は観察しなかった。また、三級塩基の重要性を評価した。過剰のＴＥＡの添加なくして、２時間後に生成物は検出しなかった。最適化した条件下にて反応はきれいであり、ペプチド１７−ＡＢＰをＨＰＬＣ精製後に５０％の収率で単離した。生成物の質量は、ＥＳＩ−ＴＯＦによりさらに確認した（［ＭＨ］^４＋計算値１１３１．５２、実測値１１３１．７８）。

補体活性化の抑制． 古典経路補体活性化を抑制するペプチド１７−ＡＢＭおよびペプチド１７−ＡＢＰの能力は、ヒト血清を用いるＥＬＩＳＡにより評価した。結果を表２−１に示す。

ヒヒにおける血漿中濃度． ペプチド１７ならびにＡＢＰおよびＡＢＭコンジュゲートの血漿中濃度は、ヒヒへの静脈内ボーラス注射後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。ペプチド１７は、約６０分間の半減期を示した。ペプチド１７−ＡＢＭは、５ｈの半減期を持ち、５倍の改善を示した。２１時間の最長の半減期をペプチド１７−ＡＢＰにつき観察し、それはコンジュゲートされていないペプチド１７のものより２１倍大きかった。

本発明は前記に記載および例示された具体例に制限されず、添付した特許請求の範囲内で変形および改変できる。

Claims (15)

1. Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｘａａ３−Ｇｌｙ−Ｘａａ４−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ５（環状Ｃ２−Ｃ１２）
   ［式中、８位のＧｌｙをＮ−メチル化により改変して、その位置にて骨格立体構造を拘束し、
   Ｘａａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｃ−Ｉｌｅ、Ａｃ−Ｖａｌ、Ａｃ−Ｌｅｕ、またはジペプチドＧｌｙ−Ｉｌｅであり；
   Ｘａａ２はＴｒｐまたはＴｒｐのアナログであり、ここに、Ｔｒｐのアナログは、Ｔｒｐと比較して疎水性特性を増加させ；
   Ｘａａ３は、Ｔｒｐ、またはインドール環の水素結合ポテンシャルを増加させる、そのインドール環に対する化学的修飾を含むＴｒｐのアナログであり；
   Ｘａａ４は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；および
   Ｘａａ５は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅのいずれかのカルボキシ末端の−ＯＨが、−ＮＨ_２により非置換または置換されているＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅである］
   である配列番号：２の配列を有するペプチドを含むコンプスタチンアナログ。
2. Ｘａａ１がＡｃ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ２が１−メチル−Ｔｒｐまたは１−ホルミル−Ｔｒｐであり、Ｘａａ３がＴｒｐであり、Ｘａａ４がＡｌａであって、Ｘａａ５がＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅである請求項１記載のコンプスタチンアナログ。
3. Ｘａａ５が、Ｉｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅである請求項２記載のコンプスタチンアナログ。
4. 配列番号：５、７、８、９、１０または１１のいずれかを含む請求項２記載のコンプスタチンアナログ。
5. さらに、コンプスタチンアナログのｉｎ ｖｉｖｏ保持を延長するさらなる成分を含む請求項１〜４のいずれか１記載のコンプスタチンアナログ。
6. さらなる成分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項５記載のコンプスタチンアナログ。
7. さらなる成分が、アルブミン結合低分子である請求項５記載のコンプスタチンアナログ。
8. アルブミン結合低分子が、コンプスタチンアナログの末端に結合している請求項７記載のコンプスタチンアナログ。
9. さらなる成分が、アルブミン結合ペプチドである請求項５記載のコンプスタチンアナログ。
10. アルブミン結合ペプチドが、配列ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ（配列番号：１４）を含む請求項９記載のコンプスタチンアナログ。
11. アルブミン結合ペプチドに結合した配列番号：５、７、８、９、１０または１１のいずれか１つを含む請求項９記載のコンプスタチンアナログ。
12. 化合物およびアルブミン結合ペプチドがスペーサーにより分離される請求項９記載のコンプスタチンアナログ。
13. スペーサーがポリエチレングリコール分子である請求項１２記載のコンプスタチンアナログ。
14. 前記請求項１〜１３のいずれか１記載のコンプスタチンアナログおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
15. 補体活性化の抑制のための医薬製造における前記請求項１〜１３のいずれか１記載のコンプスタチンアナログの使用。