JP2020019778A - 構築されたポリペプチド特異性のモジュレーション - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト血漿カリクレインに特異的なペプチドリガンドを提供する。【解決手段】ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンドであって、前記ペプチドリガンドが、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと、前記ポリペプチドの前記反応性基と共有結合を形成する分子足場とを含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成され、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１−Ｐｈｅ２−Ａｚｅ３−Ｔｙｒ４−ＨＡｒｇ５−Ｃｙｓ−Ａ（ψＣＨ２ＮＨ）６−Ｈｉｓ７−Ｇｌｎ８−Ａｓｐ９−Ｌｅｕ１０−Ｃｙｓを含み、かつ、前記ペプチドリガンドが、抗体またはその断片を含む。【選択図】なし

Description

本発明は、分子足場に、２個以上のペプチドループが分子足場への取付ポイントの間に
対するように共有結合したポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、ヒトプロテア
ーゼ血漿カリクレインに特異的であり、力価および／またはプロテアーゼ耐性を向上させ
るように１つまたは２つのペプチドループにおいて修飾されているペプチドを記載する。

環状ペプチドは、タンパク質標的に高い親和性および標的特異性で結合することができ
、したがって治療法の開発のために魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性
ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗がん薬のオクトレオチ
ド（octreotide）のように、数種の環状ペプチドが、既に臨床において用いられ成功して
いる（Ｄｒｉｇｇｅｒｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００８、７（
７）、６０８〜２４）。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に
大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。
通常、大環状分子は、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４０
０Å^２；Ｗｕ、Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０（６００７）、１０６６〜７１）、イン
テグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３
５５Å^２）（Ｘｉｏｎｇ、Ｊ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２、２９６（５５６５）
、１５１〜５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチ
ド阻害剤ウパイン（upain）−１（６０３Å^２；Ｚｈａｏ、Ｇ．ら、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ
Ｂｉｏｌ ２００７、１６０（１）、１〜１０）のように、数百平方オングストロームの
表面に結合する。

その環状立体配置のため、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも柔軟性が低く
、標的への結合によるエントロピー損失がより小さくなり、より高い結合親和性をもたら
す。柔軟性の低下は、標的特異的コンホメーションをロックし、直鎖状ペプチドと比較し
て結合特異性を増加させる。このような効果は、その環が開環されると他のＭＭＰに対す
る選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的
な阻害剤により例証されてきた（Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ
１９９８、４１（１１）、１７４９〜５１）。大環状化により達成される有利な結合特性
は、例えばバンコマイシン、ナイシンまたはアクチノマイシン等、２個以上のペプチド環
を有する多環性ペプチドにおいてさらにより明らかである。

様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に
繋いでいる（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．およびＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ
ｅｍ、１９８５、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。
Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するために、合成足場
上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベ
ンゼンおよび関連分子を使用している（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣ
ｈｅｍ、２００５）。システイン含有ポリペプチドを分子足場、例えばトリス（ブロモメ
チル）ベンゼンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、
ＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に開示されている。

ＷＯ２００４／０７７０６２号は、候補薬物化合物の選択方法を開示している。より詳
細には、この文書は、第１および第２の反応基を含む様々な足場分子、ならびに、前記足
場をさらなる分子と接触させて、カップリング反応において足場とさらなる分子との間に
少なくとも２つの連結を形成させることを開示している。

ＷＯ２００６／０７８１６１号は、結合化合物、免疫原性化合物およびペプチド模倣体
を開示している。この文書は、既存のタンパク質からとった様々なペプチドのコレクショ
ンの人工合成を開示している。その後、これらのペプチドを一部のアミノ酸変化が導入さ
れた一定の合成ペプチドと組み合わせて、コンビナトリアルライブラリを生じさせる。様
々なアミノ酸変化を特徴とする別々のペプチドに、化学結合を介してこの多様性を導入す
ることによって、所望の結合活性を見つける機会の増大がもたらされる。この文書の図１
は、様々なループペプチド構築体の合成の模式図を示している。この文書中に開示されて
いる構築体は、典型的にはシステイン残基を含む−ＳＨ官能化したペプチド、および典型
的にはビス−またはトリス−ブロモフェニルベンゼンなどのベンジルハロゲン置換基を含
む足場上の芳香族複素環基に依存する。そのような基は、反応してペプチドと足場との間
にチオエーテル結合を形成する。

本出願人らは近年、二環性ペプチドの大型ライブラリを作製し、対象とする標的に対し
スクリーニングするためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチを
開発した（Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２
〜７；国際特許出願である国際公開第２００９／０９８４５０号パンフレットも参照）。
要約すると、３個のシステイン残基と、２個のランダムな６アミノ酸領域とを含有する（
Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ）直鎖状ペプチドのコンビナトリ
アルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子（トリス−（ブロモメ
チル）ベンゼン）へと共有結合させることにより環化させた。ヒトプロテアーゼカテプシ
ンＧおよび血漿カリクレイン（ＰＫ）に対する親和性の選択において単離された二環性ペ
プチドは、ナノモル濃度の阻害定数を有していた。最良の阻害剤、ＰＫ１５は、３ｎＭの
Ｋ_ｉでヒトＰＫ（ｈＰＫ）を阻害する。数種の単離された二環性ペプチドのアミノ酸配列
における類似性は、両方のペプチドループが結合に寄与することを示唆した。ＰＫ１５は
、検査した最高濃度（１０μＭ）において、ラットＰＫ（８１％配列同一性）も、相同的
なヒトセリンプロテアーゼ第ＸＩａ因子（ｈｆＸＩａ；６９％配列同一性）もトロンビン
（３６％配列同一性）も阻害しなかった（Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ
２００９、５（７）、５０２〜７）。この知見によって、二環性阻害剤が、高い特異性
があること、および他のヒトトリプシン様セリンプロテアーゼは阻害されないことが示唆
された。上記の力価および標的選択性を有するＰＫ１５のような合成の低ペプチド性阻害
剤は、浮腫の再発性のエピソードによって特徴づけられる生命にかかわる疾患である遺伝
性の血管性浮腫においてＰＫ活性を制御するため、または心肺バイパス手術における接触
活性化を妨げるための治療剤として潜在的な適用を有する。

ペプチドＰＫ１５は、ペプチドＰＫ２、Ｈ−ＡＣＳＤＲＦＲＮＣＰＬＷＳＧＴＣＧ−Ｎ
Ｈ_２（ここで第２の６−アミノ酸のループは、ランダム化されていた）に基づいてライブ
ラリから単離された。ＰＫ１５の配列は、Ｈ−ＡＣＳＤＲＦＲＮＣＰＡＤＥＡＬＣＧ−Ｎ
Ｈ_２であって、ヒトカリクレインについてのＩＣ５０結合定数は、１．７ｎＭであった。

本出願人らは、カリクレイン結合試薬を解析して、結合の親和性および活性を最適化し
た。本出願人らの同時係属の未公開の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６９８９８では
、ヒト血漿カリクレインの阻害剤である選択性二環性ペプチドリガンドが記載されている
。

本発明の一実施形態では、ペプチドリガンドのループは、５個のアミノ酸を含み、第１
のループは、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ（式中、Ｇ_ｒは反応基である）を含む
。この文脈において、「第１の」ループの言及は、必ずしも配列におけるループの特定の
位置を表示しない。しかし、一部の実施形態において、第１のループは、アミノ末端から
カルボキシ末端に及ぶペプチド配列における近位ループとなり得る。例えば、ポリペプチ
ドは、モチーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む第２の遠位ループをさらに含む。第１
のループの配列の例として、Ｇ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒ、Ｇ_ｒｘＷＰＳＲＧ_ｒ、Ｇ_ｒｘＦＰＦＲ
Ｇ_ｒおよびＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒが挙げられる。これらの例において、ｘは、いかなるアミ
ノ酸であってもよいが、例えば、ＳまたはＲである。

例えば、このポリペプチドは、表４、表５または表６に示されるポリペプチドのうちの
１つであってもよい。

この反応性基は、反応性アミノ酸であってもよい。例えば、この反応性アミノ酸は、シ
ステインである。

このポリペプチドのバリアントは、変異に利用できる残基を特定し、係る位置に変異を
包含するライブラリを調製することにより、調製することができる。例えば、表４、図５
、６のポリペプチド０６−５６は、Ｑ４およびＴ１０の位置（下の実施例を参照されたい
）において活性の損失なしで変異され得る。０６−５６と比較すると結合活性が改善され
た、これらの位置において変異を含むポリペプチドリガンドが選択され得る。

カリクレイン阻害性のバイシクル（ｂｉｃｙｃｌｅ）に関しては、これは、血漿または
他の関連の環境中でプロテアーゼ駆動性の低いクリアランスを有するように、十分なプロ
テアーゼ安定性プロフィールを得ることに関係する。ラット血漿中の親ペプチドの進行性
の消失を観察した迅速な血漿安定性の比較アッセイ（方法番号１）では、Ｎ末端アラニン
（これは、選択の時点で存在しており、かつリード配列の合成ペプチド中にもともと含ま
れる）が、ラットおよびヒトの両方で試験された全てのバイシクル配列にまたがって急速
に除去されることが見出された。この分解はＮ末端およびＣ末端の両方のアラニンを欠く
リード候補を合成することによって回避された。アミノおよびカルボキシペプチダーゼに
ついて潜在的な認識ポイントを除去するために、リード候補のＣｙｓ１上に現在ある遊離
のアミノ末端は、ペプチド合成の間に無水酢酸でキャップされ、その結果、Ｎ末端でアセ
チル化される分子がもたらされる。同等の方法で、Ｃ末端システインがアミドとして合成
されて、カルボキシペプチダーゼについて潜在的な認識ポイントが減少される。

従って、一例では、二環性のリード候補は以下の一般的な配列を有する。
ここで「Ａｃ」とは、Ｎ末端アセチル化を指し、「−ＮＨ_２」は、Ｃ末端アミド化を指
し、ここでは、「Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３」は、この配列中の第１、第２および第３のシステイ
ンを指し、ここで
は、アミノ酸の位置を指し（その性質
は上記の選択によって定義される）、「（ＴＭＢ）」は、ＴＢＭＢ（トリスブロモメチル
ベンゼン）または任意の他の適切な反応性足場でペプチド配列が環化されたことを示す。

この状況では、リードペプチド「Ａｃ−（０６−３４−１８）（ＴＭＢ）」および「Ａ
ｃ−（０６−３４−１８）（ＴＭＢ）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４」は、それぞれ、配列Ａｃ−Ｃ
ＳＷＰＡＲＣＬＨＱＤＬＣ−ＮＨ_２およびＡｃ−ＣＳＦＰＹＲＣＬＨＱＤＬＣ−ＮＨ_２を
有する。これらは、上記のスキームにしたがって、以下のようにナンバリングされ得、
１）Ａｃ−Ｃ _１ Ｓ_１Ｗ_２Ｐ_３Ａ_４Ｒ_５ Ｃ _２ Ｌ_６Ｈ_７Ｑ_８Ｄ_９Ｌ_１０ Ｃ _３ −ＮＨ_２
（Ａｃ−（０６−３４−１８）（ＴＭＢ）と示される）
２）Ａｃ−Ｃ _１ Ｓ_１Ｆ_２Ｐ_３Ｙ_４Ｒ_５ Ｃ _２ Ｌ_６Ｈ_７Ｑ_８Ｄ_９Ｌ_１０ Ｃ _３ −ＮＨ_２
（Ａｃ−（０６−３４−１８）（ＴＭＢ）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４と示され）、
ここで、不変のシステインには下線を付している。これらのペプチドは、詳細に特徴付け
られ、カリクレインに対してナノモル未満の力価を有することが示される（カリクレイン
相同性のタンパク質について極めて都合の良い選択性プロファイルである）が、ラットカ
リクレインに対して良好な交差反応性を保持している。ラットカリクレインは、動物モデ
ルで薬物動態を確立するのに有用である。

未修飾のペプチドＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ_２は、ラット血漿中で２．
３時間という半減期を有するが、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ_２ Ｐｈｅ２
Ｔｙｒ４の半減期は、０．９時間でわずかに短い（表１）。Ａｃ−０６−３４−１８（
ＴＭＢ）−ＮＨ_２中のタンパク質分解の認識部（複数あってもよい）を特定する労力にお
いて、ペプチドをラット血漿中で経時的にサンプリングして（方法番号１）、各々の試料
を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いてペプチド断片の進行性の出現について解析し
た。これによって、ループ１におけるＡｒｇ５が、プロテアーゼ認識およびその後のペプ
チド分解の主な部位であることが明らかになった。

化学合成のプロセスをとって、ラット血漿プロテアーゼ分解からペプチドを十分保護す
るアルギニン５置換基を特定した。ループ１中のＡｒｇ５の除去、またはなんらかの非荷
電または荷電された化学物質によるＡｒｇ側鎖の置換によって、ペプチドリガンドの安定
性が向上されることが見出された。

さらに、タンパク質分解に対する安定性は、Ａｒｇ５に対してＮ末端またはＣ末端で隣
接するペプチド結合の化学的修飾によって向上される。この化学的修飾は例えば、α−Ｎ
−アルキル化、またはその還元アミド型によるペプチド結合の修飾である。

一実施形態では、タンパク質分解に対する安定性は、Ａｒｇ５に近位のアミノ酸の立体
障害によって向上される。例えば、立体障害は、α−Ｎ−アルキル化から生じる。

これらの二環性ペプチド候補を、次に、以下の特徴について評価した。
１）ヒトカリクレインに対する力価の維持（１０ｎＭ以下のＫｉを追求）
２）ラットカリクレインに対する力価の維持（５０ｎＭ以下のＫｉを追求）
３）ラット血漿中での安定性の向上（野生型ペプチドに比較してより大きいｔ_１／２が
望ましい）
４）他のカリクレイン関連酵素およびタンパク質に対する選択性プロファイルの維持

ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６９８９８における検討の経過では、以下のアルギニン修飾
または模倣物は、上記の４つの基準を満たすことが確認され、これらは、
ａ）４−グアニジルフェニルアラニン（４−ＧｕａｎＰｈｅ：ｔ_１／２は、ラット血漿中
で増大する（１〜５倍））、
ｂ）ホモアルギニン（ＨＡｒｇ：ｔ_１／２はラット血漿中で増大する（約２〜５倍））、
および
ｃ）α−Ｎ−メチルアルギニン（ＮＭｅ−Ａｒｇ：ｔ_１／２はラット血漿中で増大する（
＞１０倍）である。

本出願人らは、特定の非天然のアミノ酸が、血漿における滞留時間を有意に増加させつ
つ、ｎＭでＫｉによる血漿カリクレインとの結合を可能にすることを見出した。このデー
タは、表１および図１７にまとめている。

さらに、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６９８９８はまた、０６−３４−１８における位置
３での追加の修飾を開示しており、ここではプロリンが、アゼチジンカルボン酸（Ａｚｅ
３）で置き換えられた。この修飾は、おそらく、そのより大きな制約およびエントロピー
の低下に起因して、２〜５倍に０６−３４−１８ベースのペプチドの力価を常に向上する
（表１）。Ａｒｇ５において安定性を向上させる修飾と組み合わせて（特に、ＨＡｒｇ、
ＮＭｅ−Ａｒｇおよび４ＧｕａｎＰｈｅ）、さらに強力な二環性のペプチド誘導体が得ら
れる。

例示的な非天然のアミノ酸は、Ｎ−メチルアルギニン、ホモ−アルギニンおよびヒドロ
キシプロリンから選択される。アルギニンのＮ−メチルおよびホモ誘導体は、アルギニン
の置き換えに用いられ、プロリン３は、例えば、ヒドロキシプロリン、アゼチジンカルボ
ン酸またはアミノイソ酪酸等のアルファ置換アミノ酸に置き換えられてよい。別の一実施
形態において、アルギニンは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えることができる
。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＧ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒを含む第１のルー
プを含み、Ｐは、アゼチジンカルボン酸に置き換えられ、および／またはＲは、Ｎ−メチ
ルアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、ホモアルギニンに置き換えられ、お
よび／またはＲは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えられる。

一実施形態において、ポリペプチドは、モチーフＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒを含む第１のルー
プを含み、Ｒは、Ｎ−メチルアルギニンに置き換えられ、および／またはＲは、ホモアル
ギニンに置き換えられ、プロリンは、アゼチジンカルボン酸により置き換えられ、および
／またはＲは、グアニジル−フェニルアラニンに置き換えられる。

本出願人らは、ここで、第２のループの最適化に適用されるように、ＰＣＴ／ＥＰ２１
０２／０６９８９８で用いられ、本明細書に示されるアプローチを開発した。本発明によ
れば、本出願人らは、０６−３４−１８配列においてヒスチジン７に位置する、ループ２
における追加的なプロテアーゼ認識部位を特定した。この残基は、具体的には、エクスビ
ソにおいてヒト血漿に含まれるプロテアーゼによって認識される。さらに、この部位はま
た、インビボのラット薬物動態研究で確認されたとおり、ラット膜結合プロテアーゼによ
っても認識される。従って、０６−３４−１８に関しては、治療目的に必要な適切な薬物
動態学的安定性プロファイルを保持するために、両方のプロテアーゼ認識部位（ループ１
中のＡｒｇ５およびループ２中のＨｉｓ７）は、ペプチドがヒト血漿プロテアーゼに対し
て、ならびにインビボでラットおよびヒトの両方で遭遇するタンパク質分解性の攻撃的な
環境に対して耐性であるように、安定化されなければならない。

従って、第１の態様では、本発明は、ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンドで
あって、前記ペプチドリガンドが、少なくとも２つのループ配列によって隔てられる少な
くとも３つの反応性基を含むポリペプチド、およびこのポリペプチドの反応性基と共有結
合を形成する分子足場を含み、その結果、少なくとも２つのポリペプチドループが分子足
場上に形成され、ペプチドリガンドのループが５つのアミノ酸を含み、１つのループがモ
チーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む、ペプチドリガンドを提供する。

ペプチド０６−３４−１８の状況では、このループは、第１のループに対してＣ末端に
位置する第２のループである。

例えば、モチーフはＧ_ｒｘＨｘＤＬＧ_ｒであり、ここでＧ_ｒは反応性基である。例えば
、モチーフＧ_ｒＴＨｘｘＬＧ_ｒ。

一実施形態では、ポリペプチドの２つの隣接するループは、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ
^Ｋ／_ＲＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴＤＬＧ_ｒを含む。

係るポリペプチドの例は、表４、表５または表６に示される。

第２の態様では、本発明は、ループ２中のＨｉｓ７の除去、または任意の非荷電もしく
は荷電化学物質によるヒスチジン側鎖の置換が、ペプチドリガンドの安定性を向上させる
、本発明の第１の態様に記載のペプチドリガンドに関する。

例えば、タンパク質分解に対する安定性は、Ｈｉｓ７に対してＮ末端またはＣ末端で隣
接するペプチド結合の化学的修飾によって向上する。この化学的修飾は例えば、α−Ｎ−
アルキル化、またはその還元アミド型によるペプチド結合の修飾である。

一実施形態では、タンパク質分解に対する安定性は、Ｈｉｓ７に近位のアミノ酸の立体
障害によって向上する。例えば、立体障害は、位置９のそのＤアミノ酸鏡像異性体での置
換、またはα−Ｎ−アルキル化から生じる。

別の実施形態では、タンパク質分解に対する安定性は、位置６での立体障害アミノ酸の
導入によって向上する。例えば、タンパク質分解に対する安定性は、位置６でのフェニル
グリシンまたはシクロヘキシルグリシンなどのＣＣβ誘導体化アミノ酸の導入によって向
上し、それによりヒト血漿カリクレインに対するペプチドリガンド配列の力価が向上し、
Ｃ末端ペプチド結合のタンパク質加水分解が低下する。

本発明によるポリペプチドが、モチーフＧ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒまたはＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒ
を含む第１のループと、モチーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む第２のループとを含
むように、本発明の教示をＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６９８９の教示と組み合わせてもよ
い。

一例では、第１のループでは、Ｐｒｏ３が、アゼチジンカルボン酸で置き換えられてお
り；および／またはＡｒｇ５がＮ−メチルアルギニンで置き換えられており；および／ま
たはＡｒｇ５がホモアルギニンで置き換えられており；および／またはＡｒｇ５がグアニ
ジルフェニルアラニンで置き換えられている。

二環性ペプチドのファージ選択。（ａ）二環性ペプチドファージライブラリ。ランダムなアミノ酸を、「Ｘ」として示し、アラニンを「Ａ」として、および一定の３つのシステイン残基を「Ｃ」として示す。（ｂ）３、５または６つのアミノ酸のループを有する化学的に合成された二環性ペプチド構造の式。この構造は、トリス−（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）に対して３つのシステイン側鎖を介して直鎖ペプチドを連結することによって生成される。二環性ペプチドで異なるアミノ酸は、「Ｘａａ」で示される。ライブラリ５×５（ｃ）、ライブラリ３×３Ａ（ｄ）およびライブラリ３×３Ｂ（ｅ）から単離された二環性ペプチドの（ｃ〜ｅ）配列。アミノ酸中の類似性は、影付きで強調する。 ｈＰＫおよび相同なセリンプロテアーゼの表面アミノ酸の比較。（ａ）ｈＰＫ（ＰＤＢエントリー２ＡＮＷ）の構造であって、表面を提示している。表面に露出されており、かつＳ１ポケットに結合されたベンズアミジン（灰色）に対して４、８および１２Åより近いアミノ酸の原子はさらに濃く染色される。（ｂ）ｈＰＫの構造。ｈｆＸＩａが異なるアミノ酸の側鎖は強調している。（ｃ）ｈＰＫの構造。ｒＰＫが異なるアミノ酸の側鎖は強調している。 ポリペプチドリガンド中の変異について好ましい残基の決定のために用いられる方法の図的記述。 ２ｎＭでの血漿カリクレインに対するペプチドの結合に関するペプチド０６−３４（表４）中のアミノ酸置換の解析。各々の位置に関して、その位置での種々の変異の影響を、親配列と比較して示す。 ２ｎＭでの血漿カリクレインに対するペプチドの結合に関するペプチド０６−５６（表４）中のアミノ酸置換の解析。各々の位置に関して、その位置での種々の変異の影響を、親配列と比較して示す。 １０ｎＭでの血漿カリクレインに対するペプチドの結合に関するペプチド０６−５６中のアミノ酸置換の解析（表４）。各々の位置に関して、その位置での種々の変異の効果を、親配列と比較して示す。 ０日、１日、２日および３日における、３５％のラット血漿に対する暴露後のＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の質量分析を示す質量分析計のアウトプット（方法番号１）。質量の精度は、妨害イオンおよび低濃度の断片に起因していくらか変化するが、別個のタンパク質分解断片の特定が可能である。 ラット血漿への暴露後に特定されたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の代謝物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の化学構造。 ラット血漿への暴露後に特定されたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の代謝物Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の化学構造。 Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２リードの化学構造。 Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２リードおよびその第１のループがスクランブルされた誘導体によるカリクレインの酵素阻害アッセイ。親和性の劇的な低下が観察され、ＷＰＡＲファルマコフォアの完全性の重要性が強調される。 アルギニンおよびそのアナログの化学構造。 Ｔｒｐおよび潜在的な疎水性アナログの化学構造。 Ｐｒｏおよび潜在的な制約されたアナログの化学構造。 Ａｚｅ３、ＮＭｅＡｒｇ５および二重に修飾されたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２によるカリクレイン阻害の比較。 アラニンおよびその誘導体の化学構造。 Ｆ２Ｙ４、Ｆ２Ｙ４ ＨＲ５および二重に修飾されたＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２によるカリクレイン阻害の比較。 有益なラット血漿安定性および／または力価向上を付与するＡｃ−（０６−３４−１８）中のループ１修飾の化学構造（Ｐｒｏ３の代わりにＡｚｅ３、Ａｒｇ５の代わりに４ＧｕａｎＰｈｅ、Ａｒｇ５の代わりにＨＡｒｇ、Ａｒｇ５の代わりにＮＭｅ−Ａｒｇ５）。 野生型ペプチドが、ヒト血漿に供される。Ｈｉｓ７−Ｇｌｎ８、Ｌｅｕ６、およびＬｅｕ６−Ｈｉｓ７−Ｇｌｎ８を除去した断片の出現に留意されたい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの性質に起因して、シグナルの強度は、定量的ではない。配列中の潜在的な加水分解部分は、図の中に矢印で示されており、引き続く分解の向きが配列上の水平の矢印によって示される。 Ａｒｇ５ Ｎ−メチル化０６−３４−１８を、ヒト血漿に供する。このペプチドは、ラット血漿中での安定性を向上した。しかし、ヒト血漿中で、このペプチドは、ループ２の中のＨｉｓ７−Ｇｌｎ８、Ｌｅｕ６、およびＬｅｕ６−Ｈｉｓ７−Ｇｌｎ８を欠いている断片の出現によって例証されるように、安定ではない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの性質に起因して、シグナルの強度は、定量的ではない。 ０６−３４−１８のループ２の化学構造 ループ２の位置６で使用される構造のまとめ。標準ではないアミノ酸の略語は、方法および表７に定義される。 ループ２の位置７で使用される構造のまとめ。標準ではないアミノ酸の略語は、方法および表７に定義される。 ループ２の位置８で使用される構造のまとめ。標準ではないアミノ酸の略語は、方法および表７に定義される。 ０６−３４−１８のループ２内のＮ−Ｈｉｓペプトイドの構造。ホモヒスチジン側鎖をＮα上に導入したが、Ｃαはその不斉中心を失う。 ０６−３４−１８のループ２内の位置６と７との間の還元アミドの構造。カルボニルの代わりのメチレンによって、切断可能なペプチド結合が除去される。 ヒト血漿中のｔ＝０、２１および４６時間での野生型（０６−３４−１８）の安定性の比較。 ラット血漿中のｔ＝０、２１および４６時間での野生型（０６−３４−１８）の安定性の比較。 ヒト血漿中のｔ＝０、２１および４６時間での（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ｄ−Ａｓｐ９の安定性の比較。 ヒト血漿中のｔ＝０、２１および４６時間でのＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６の安定性の比較。 ラット血漿中のｔ＝０、２１および４６時間でのＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６の安定性の比較。 Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６の全体の化学構造。全てのアミノ酸がＬ−鏡像異性型である。 Ａｃ−（０６−３４−１８）のタンパク質分解には安定だが、薬理学的には不活性な全Ｄ型の鏡像異性体と比較した、ペプチドＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６およびＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ｄ−Ａｓｐ９のラットの薬物動態学的分析。Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６のクリアランスは、Ｄアミノ酸制御ペプチド「Ａｃ−（０６−３４−１８）全Ｄ型（ａｌｌ Ｄ）」のものに極めて似ていることに留意されたい。水平な破線は、各々の代表的なペプチドについての定量限界を示す。

別段に定義しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、ペ
プチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野など
の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生化
学的の方法には、本明細書中に参考として組み込まれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子
クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ
、Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）標準の技法が使用される。

本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう
。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる２つ以上
の反応基、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成することからループ配列
と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。本事例において、ペプチドは、少なく
とも３個の反応基を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。

反応基とは、分子足場と共有結合を形成することができる基である。典型的には、反応
基は、ペプチド上のアミノ酸側鎖上に存在する。例としては、システイン、リジンおよび
セレノシステインなどのアミノ含有基である。

本明細書の文脈における特異性は、標的と類似の実体を除外したその同族標的と結合す
るか、さもなければ相互作用するリガンドの能力を指す。例えば、特異性は、ヒト酵素の
相互作用を阻害するが、異なる種由来の相同酵素の相互作用を阻害しないリガンドの能力
を指すことができる。本明細書に記載されているアプローチを用いて、企図される標的の
ホモログまたはパラログとリガンドがより相互作用できるようにまたはできなくなるよう
に、特異性が増加または減少するようモジュレートすることができる。特異性は、活性、
親和性またはアビディティーと同義であるとは企図されておらず、その標的におけるリガ
ンドの作用の効力（例えば、結合親和性または阻害のレベル等）は、必ずしもその特異性
に関係しない。

本明細書における結合活性は、例えば、本明細書に記載されている結合アッセイから得
られる定量的な結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所定の標的濃度で結合して
いるペプチドリガンドの量を指す。

多重特異性は、２種以上の標的に結合する能力である。通常、結合ペプチドは、そのコ
ンホメーション特性により、抗体の場合はエピトープ等、単一の標的と結合することがで
きる。しかし、２種以上の標的に結合することができるペプチド、例えば、上記のように
当技術分野において既知の通り、二重特異的抗体を開発することができる。本発明におい
て、ペプチドリガンドは、２種以上の標的に結合することができ、したがって多重特異的
となり得る。例えば、これは、２種の標的に結合し、二重特異的である。結合は、独立的
となることができ、これは、ペプチドにおける標的に対する結合部位が、標的の一方また
は他方の結合により構造的に妨げられないことを意味する。この場合、両方の標的が独立
的に結合していてよい。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも
部分的に妨害するであろうと予想される。

二重特異的リガンドと、２つの関連した標的を包含する特異性を有するリガンドとの間
に基本的な相違が存在する。第１の事例では、リガンドは両方の標的について個々に特異
的であり、お互いと特異的な方式で相互作用する。例えば、リガンド中の第１のループは
、第１の標的に結合し得、第２のループは第２の標的に結合し得る。第２の事例では、リ
ガンドは非特異的である。なぜなら、リガンドは、例えば、両方に共通の標的のエピトー
プとの相互作用によって、２つの標的を区別できないからである。

本発明の状況では、例えば、標的およびオルソログについて活性を有するリガンドは、
二重特異性リガンドであり得ることが可能である。しかし、一実施形態では、このリガン
ドは二重特異性ではなく、有する特異性の正確性が少なく、その結果、このリガンドは、
標的と１つまたは複数のオルソログの両方に結合する。一般には、標的およびそのオルソ
ログの両方に対して選択されていないリガンドは、ループ長のモジュレーションの結果と
して二重特異性である可能性が低い。

このリガンドが真に二重特異性である場合、一実施形態では、リガンドの標的特異性の
うちの少なくとも１つは、選択されるリガンドのうちでも一般的であり、その特異性のレ
ベルは、本明細書に開示される方法によってモジュレートされ得る。第２またはさらなる
特異性は共有される必要はなく、本明細書に示される手順の対象となる必要もない。

標的は、ペプチドリガンドが結合する、さもなければ相互作用する分子またはその一部
である。結合は、多くの種類の活性に必須のものと理解され、それ自体が活性となり得る
が、他の活性が想定される。よって、本発明は、直接的または間接的な結合の測定を必要
としない。

分子足場とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに１つまたは複数の構造的特
長を与えることができる、任意の分子である。これは、ジスルフィド結合を単に置き換え
るのではなく、その代わりに、ペプチドの２つ以上の付着点をもたらすという点で、架橋
結合剤ではない。好適には、分子足場は、足場反応基と呼ばれる、ペプチドの付着点を少
なくとも３つ含む。これらの基は、ペプチド上の反応基と反応して共有結合を形成するこ
とができる。分子足場の好ましい構造を以下に記載する。

結合活性（または任意の他の所望の活性）のスクリーニングは、当分野で周知の方法に
従って、例えばファージディスプレイ技術から実施する。例えば、固相に固定した標的を
用いて、レパートリーの結合メンバーを同定および単離することができる。スクリーニン
グにより、所望の特徴に応じたレパートリーのメンバーの選択が可能となる。

用語、ライブラリは、不均質なポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリは
、同一ではないメンバーで構成される。この点で、ライブラリはレパートリーと同義であ
る。ライブラリメンバー間の配列の相違が、ライブラリ中に存在する多様性を司っている
。ライブラリは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態をとり得るか、または
、核酸のライブラリで形質転換させた生物もしくは細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物
もしくは植物細胞などの形態であり得る。ある条件下では、それぞれの個々の生物または
細胞は、１つのみまたは限定された数のライブラリメンバーを含有する。

一実施形態では、核酸によってコードされているポリペプチドの発現を可能にするため
に、核酸を発現ベクター内に組み込む。したがって、好ましい態様では、ライブラリは宿
主生物の集団の形態をとってよく、それぞれの生物は、発現させてその対応するポリペプ
チドメンバーを産生させることができる、ライブラリの単一のメンバーを核酸の形態で含
有する発現ベクターの１つまたは複数のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団
は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードしている潜在性を
有する。

一実施形態では、核酸のライブラリはポリペプチドのレパートリーをコードしている。
ライブラリのそれぞれの核酸メンバーは典型的にはライブラリの１つまたは複数の他のメ
ンバーに関連する配列を有する。関連する配列とは、ライブラリの少なくとも１つの他の
メンバーに対して少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも６０％の同一性、例えば
少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも９０％
の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば
少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、少なくとも３個
のアミノ酸、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸、例えば
少なくとも１２個のアミノ酸、例えば少なくとも１４個のアミノ酸、例えば少なくとも１
６個のアミノ酸、例えば少なくとも１７個のアミノ酸の連続的なセグメントまたは参照配
列の完全長にわたって判断し得る。

レパートリーは、バリアント（この場合はその配列が異なるポリペプチドバリアント）
のコレクションである。通常、反応基の位置および性質は変動しないが、その間にループ
を形成する配列がランダム化されてよい。レパートリーは、サイズが異なるが、少なくと
も１０^２種のメンバーを含むと考慮されるべきである。１０^１１種以上のメンバーのレパ
ートリーを構築することができる。

ポリペプチドリガンドのセットは、本明細書において、記載されている方法における選
択に付すことができる複数のポリペプチドリガンドを指す。潜在的には、セットは、レパ
ートリーとなり得るが、少なくとも２、最大１０、２０、５０、１００種以上のポリペプ
チドの小規模のコレクションであってもよい。

ポリペプチドリガンドの群は、本明細書において、２種以上のリガンドを指す。一実施
形態において、リガンドの群は、少なくとも１種の標的特異性を共有するリガンドのみを
含む。通常、群は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０、２０、５０
、１００種以上のリガンドからなるであろう。一実施形態において、群は、２種のリガン
ドからなる。

（Ａ）ペプチドリガンドの構築
（ｉ）分子足場
分子足場は、例えば、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットならびにそこに
引用されている参考文献、特に、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットおよび
国際公開第２００６０７８１６１号パンフレットにおいて記載されている。

前述の文書に記されている通り、分子足場は、有機小分子等の小分子でもよい。

一実施形態では、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量
体であり得る、またはそれに基づき得る。例えば、分子足場は、二量体または三量体など
の、そのような実体の短いポリマーを含み得る。

一実施形態では、分子足場は、既知の毒性、例えば低い毒性の化合物である。適切な化
合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム（ｔａｍ
ａｚｅｐａｍ）などの既存の薬物が含まれる。

一実施形態では、分子足場は巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミ
ノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。

一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基（複数であってもよい）と反応し
て共有結合を形成することができる反応基を含む。

分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボ
ン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、酸無水物、スクシンイミド、マレイミド
、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの化学基を含有し得る。

一実施形態では、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−ト
リス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含み得る、または
それからなり得る。

一実施形態では、分子足場は２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。
これは、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環に付
着したさらに３つのメチル基を含有する。これは、追加的なメチル基が、ポリペプチドと
のさらに別の接触を形成し、したがって追加的な構造的制約を加え得るという利点を有す
る。

本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリのポリペプチドの官能基が分子
足場と共有結合を形成することのできる化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオ
ール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、
アルキン、無水物、サクシニミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよびハ
ロゲン化アシルを包含する広範な官能基から選択される。

（ｉｉ）ポリペプチド
ポリペプチドの反応基は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖によって提供され得る。
ポリペプチドの反応基は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジニウム基、
フェノール基またはヒドロキシル基から選択され得る。ポリペプチドの反応基は、アジド
、ケト−カルボニル、アルキン、ビニル、またはハロゲン化アリール基から選択され得る
。分子足場と連結させるためのポリペプチドの反応基は、ポリペプチドのアミノまたはカ
ルボキシ末端であり得る。

一部の実施形態では、分子足場と連結させるためのポリペプチドの反応基のそれぞれは
、同じ種類のものである。例えば、それぞれの反応基はシステイン残基であり得る。さら
なる詳細は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットに提供されている。

一部の実施形態では、分子足場と連結させるための反応基は、２つ以上の異なる種類を
含み得るか、または３つ以上の異なる種類を含み得る。例えば、反応基は、２つのシステ
イン残基および１つのリジン残基を含み得るか、あるいは、１つのシステイン残基、１つ
のリジン残基および１つのＮ末端アミンを含み得る。

システインは、その反応性が全ての他のアミノ酸と最も異なっているという利点を有す
るため、使用し得る。システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用する
ことができる足場反応基は、アルキルハロゲン化物、（またはハロゲノアルカンもしくは
ハロアルカンとも命名される）。具体例は、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢにより例証
される足場反応基）またはヨードアセトアミドである。化合物をタンパク質中のシステイ
ンと選択的にカップリングさせるために使用される他の足場反応基はマレイミドである。
本発明において分子足場として使用し得るマレイミドの例には、トリス−（２−マレイミ
ドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド
）ベンゼンが含まれる。セレノシステインは、また、システインと類似の反応性を有して
おり、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインに
言及する場合はいつでも、文脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシステ
インを置換することが典型的には許容される。

また、リジン（およびペプチドのＮ末端の第一級アミン）も、分子足場との連結によっ
てファージ上のペプチドを修飾するための反応基として適している。しかし、ファージを
選択に使用する場合は、リジンはファージタンパク質中でシステインよりも豊富に存在し
、ファージ粒子が架橋結合し得るか、または、その感染力を失い得る危険性が高くなる。
それにもかかわらず、リジンは、分子内反応（例えば、分子足場が既にファージペプチド
と連結している場合）において、分子足場と第２のまたは連続した連結を形成するために
特に有用であることが見出されている。この場合、分子足場は、ディスプレイされたペプ
チドのリジン（特に、非常に近位にあるリジン）と優先的に反応する。第一級アミンと選
択的に反応する足場反応基は、スクシンイミド、アルデヒドまたはハロゲン化アルキルで
ある。添付の実施例のうちのいくつかにおいて使用されているブロモメチル基では、ベン
ゼン環の電子が陽イオン性の遷移状態を安定化することができる。したがって、この特定
のハロゲン化アリールは、ハロゲン化アルキルよりも反応性が１００〜１０００倍高い。
分子足場として使用するためのスクシンイミドの例には、トリス−（スクシンイミジルア
ミノトリアセテート）、１，３，５−ベンゼン三酢酸が含まれる。分子足場として使用す
るためのアルデヒドの例には、トリホルミルメタンが含まれる。分子足場として使用する
ためのハロゲン化アルキルの例には、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６
−トリメチルベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン、１，３，５−ト
リス（ブロモメチル）−２，４，６−トリエチルベンゼンが含まれる。

分子足場と連結させるための反応基を有するアミノ酸は、ポリペプチド内の任意の適切
な位置に位置していてよい。作製された特定の構造またはループに影響を与えるために、
反応基を有するアミノ酸の位置は、例えば、産生されるポリペプチドを突然変異させるた
めにポリペプチドをコードしている核酸を操作することによって、技術者によって変動さ
せ得る。係る手段により、ループ長は、本教示に従って操作することができる。

例えば、ポリペプチドは、配列ＡＣ（Ｘ）_ｎＣ（Ｘ）_ｍＣＧ（式中、Ｘはランダムな天
然のアミノ酸を表し、Ａはアラニンを表し、Ｃはシステインを表し、Ｇはグリシンを表し
、同一であっても異なっていてもよいｎおよびｍは、３〜６の間の数である）を含むこと
ができる。

（ｉｉｉ）ポリペプチドの反応基
本発明の分子足場は、ポリペプチドにおける官能基または反応基を介してポリペプチド
と結合していてよい。これらは通常、ポリペプチドポリマーに存在する特定のアミノ酸の
側鎖から形成される。係る反応基は、システイン側鎖、リジン側鎖またはＮ末端アミン基
もしくはその他の適した反応基となり得る。重ねて記すが、詳細は、国際公開第２００９
０９８４５０号パンフレットに見出すことができる。

天然のアミノ酸の反応基の例は、システインのチオール基、リジンのアミノ基、アスパ
ラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジウム基、チロシ
ンのフェノール基またはセリンのヒドロキシル基である。非天然のアミノ酸は、アジ化物
、ケト−カルボニル、アルキン、ビニルまたはハロゲン化アリール基を包含する広範な反
応基をもたらすことができる。ポリペプチド末端のアミノおよびカルボキシル基もまた、
分子足場／分子コアと共有結合を形成する反応基としての役割を果たすことができる。

本発明のポリペプチドは、少なくとも３個の反応基を含有する。前記ポリペプチドは、
４個以上の反応基を含有することもできる。より多くの反応基が用いられるほど、より多
くのループを分子足場に形成することができる。

好ましい実施形態において、３個の反応基を有するポリペプチドが生成される。３回（
three-fold）回転対称を有する分子足場／分子コアと前記ポリペプチドの反応は、単一の
産物異性体（product isomer）を生成する。単一の産物異性体の生成は、いくつかの理由
から有利である。化合物ライブラリの核酸は、ポリペプチドの一次配列のみをコードし、
分子コアとポリペプチドの反応により形成される分子の異性体状態をコードしない。１種
の産物異性体のみが形成され得るのであれば、産物異性体への核酸の割当は、明確に定義
される。複数の産物異性体が形成される場合、核酸は、スクリーニングまたは選択プロセ
スにおいて単離された産物異性体の性質に関する情報を与えることができない。単一の産
物異性体の形成は、本発明のライブラリの特異的なメンバーが合成される場合も有利であ
る。この場合、分子足場とポリペプチドの化学反応は、異性体の混合物ではなく単一の産
物異性体を生じる。

本発明の別の一実施形態において、４個の反応基を有するポリペプチドが生成される。
４面体対称を有する分子足場／分子コアと前記ポリペプチドの反応は、２種の産物異性体
を生成する。２種の異なる産物異性体が、全く同一の核酸にコードされるとしても、単離
された異性体の異性体的な性質は、両方の異性体を化学的に合成し、２種の異性体を分離
し、標的リガンドへの結合に関して両方の異性体を検査することにより決定することがで
きる。

本発明の一実施形態では、ポリペプチドの反応基のうちの少なくとも１つは、残りの反
応基と直交性である。直交性の反応基の使用は、前記直交性の反応基を分子コアの特異的
部位に向けることを可能にする。直交性の反応基を含む連結戦略は、形成された生成物異
性体の数を制限するために使用し得る。言い換えれば、少なくとも３つの結合のうちの１
つまたは複数について、少なくとも３つの結合のうちの残りについて選択したものと区別
されるまたは異なる反応基を選択することによって、特定の順序の結合、またはポリペプ
チドの特定の反応基を分子足場上の特定の位置に指示することが、有用に達成され得る。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドの反応基を分子リンカーと反応させ、前記リ
ンカーは、リンカーが最終的な結合状態において分子足場とポリペプチドとの間に介在す
るように、分子足場と反応することができる。

一部の実施形態において、ポリペプチドのライブラリまたはセットのメンバーのアミノ
酸は、いずれかの天然または非天然のアミノ酸に置き換えることができる。これらの交換
可能なアミノ酸から除外されるのは、ループ配列単独が交換可能となるような、分子コア
にポリペプチドを架橋するための官能基を持つアミノ酸である。交換可能なポリペプチド
配列は、ランダムな配列、定常な配列またはランダムおよび定常なアミノ酸を有する配列
のいずれかを有する。反応基を有するアミノ酸は、これらのアミノ酸の位置はループサイ
ズを決定するため、ポリペプチド内の定義された位置のいずれかに位置する。

一実施形態では、３つの反応基を有するコードされているポリペプチドは、配列（Ｘ）
_ｌＹ（Ｘ）_ｍＹ（Ｘ）_ｎＹ（Ｘ）_ｏ［式中、Ｙは反応基を有するアミノ酸を表し、Ｘはラ
ンダムなアミノ酸を表し、ｍおよびｎは、同一でも異なっていてもよい介在ポリペプチド
セグメントの長さを定義する３〜６の数字であり、ｌおよびｏは、フランキングポリペプ
チドセグメントの長さを定義する、０〜２０の数字である］を有する。

チオール仲介性のコンジュゲーションの代替方法を使用して、共有的相互作用を介して
分子足場をペプチドに付着させることができる。あるいは、これらの技法は、本発明に従
ってこれらを選択された単離した後の、修飾またはさらなる部分（分子足場から区別され
る対象の小分子など）とポリペプチドとの付着に使用し得る。したがって、本実施形態で
は、明らかに、付着は共有的である必要はなく、非共有的な付着を包含し得る。これらの
方法は、非天然アミノ酸を保有し、必須の化学反応基を、相補的反応基を保有する小分子
と組み合わせて有するタンパク質およびペプチドをディスプレイするファージを産生させ
ることによって、または、分子が選択／単離段階の後に作製される場合は、非天然アミノ
酸を化学的にもしくは組換えによって合成したポリペプチド内に組み込ませることによっ
て、チオール仲介性の方法の代わりに（またはそれと組み合わせて）使用し得る。さらな
る詳細は、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットまたはＨｅｉｎｉｓら、Ｎａ
ｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７に見出すことができる。

（ｉｖ）多重特異的分子を形成するためのループの組合せ
ペプチドリガンドまたはペプチドリガンドのレパートリー由来のループは、組み合わせ
たループを組み入れているポリペプチドの配列決定およびｄｅ ｎｏｖｏ合成により有利
に組み合わされる。あるいは、係るポリペプチドをコードする核酸を合成することができ
る。

レパートリー、特に単一ループのレパートリーが組み合わされる場合、レパートリーを
コードする核酸は、有利に消化され、再ライゲーションされて、構成物レパートリー由来
のループの異なる組合せを有する新規レパートリーを形成する。ファージベクターは、ポ
リリンカーおよび制限酵素のための他の部位（ベクターの切断および再ライゲーション（
relegation）のためのユニークなポイントを提供する）を包含して、所望の多重特異的ペ
プチドリガンドを作製することができる。ファージライブラリを操作するための方法は、
抗体に関してよく知られており、本事例においても適用することができる。

（ｖ）エフェクター基および官能基の取り付け
エフェクターおよび／または官能基を、例えば、ポリペプチドのＮもしくはＣ末端にま
たは分子足場に付けることができる。

適切なエフェクター基は、抗体およびその部分または断片を包含する。例えば、エフェ
クター基は、１種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）
、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメインまたはこ
れらのいずれかの組合せを包含することができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域
（ＩｇＧ分子のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間に通常存在する領域等）を含むこともで
きる。

本発明の本態様のさらに好ましい実施形態において、本発明に係るエフェクター基は、
ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明に係るペプチドリガンドエフェクター基
は、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上または
７日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれから
なる。最も有利には、本発明に係るペプチドリガンドは、１日間以上のｔβ半減期を有す
るペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、あるいはこれからなる。

官能基は、一般に、結合基、薬物、他の実体を付けるための反応基、細胞への大環状ペ
プチドの取り込みを助ける官能基その他を包含する。

細胞へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとする
ことができる。細胞へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、
転写因子、チロシンキナーゼ等の細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与
する分子を包含する。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいず
れかに付加されたペプチドまたは化学基を包含する。ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウ
ジョウバエ（Drosophila）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）等に由来す
るペプチド等、ペプチドは、例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００７）３５巻、パート
４、８２１頁「Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｎａｂｌｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｒｇ
ｅｔｓ」およびＧｕｐｔａらによる「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆ ｌａｒｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ
ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）５７巻９６３７に記載されている。
細胞膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、シ
ョウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸ペネトラチン（penetrat
in）ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、１０
４４４頁「Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ
ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈ
ｌｋｅら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔｓ １４１４巻１２７頁
「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｎ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ａｍｐ
ｈｉｐａｔｈｉｃ ｍｏｄｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａ
ｌ ｔｏ ｄｅｌｉｖｅｒ ｐｏｌａｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅ
ｌｌ ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｎｏｎ−ｅｎｄｏｃｙｔｉｃａｌｌｙ」）およびＨＩＶ ＴＡ
Ｔタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分
子に容易に付けることができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用を包含する（Ｏｋｕｙ
ａｍａら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４巻１５３頁「Ｓｍａｌｌ−ｍｏ
ｌｅｃｕｌｅ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ａｎ ａ−ｈｅｌｉｘ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎ
ｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ」。分子にグ
アニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗ
ａｂら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２巻１３５８５頁「Ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｙｌａｔｅｄ Ｎｅｏｍｃｙｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｓ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
Ｃａｒｇｏ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｕｌｐ
ｈａｔｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ」）。ステロイド等、低分子量の分子を
分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強させることができる。

ペプチドリガンドに付けることのできる官能基の一クラスは、抗体、およびＦａｂ、Ｆ
ｖまたはシングルドメイン断片等、その結合断片を包含する。特に、インビボにおけるペ
プチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を用いるこ
とができる。

多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するＲＧＤペプチドを組み入れていること
もできる。

一実施形態において、本発明に係るペプチドリガンドエフェクター基は、１２時間以上
、２４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日
間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日
間以上、１４日間以上、１５日間以上または２０日間以上からなる群から選択されるｔβ
半減期を有する。有利には、本発明に係るペプチドリガンドエフェクター基または組成物
は、１２〜６０時間の範囲内のｔβ半減期を有するであろう。さらに別の実施形態におい
て、これは、１日間以上のｔ半減期を有するであろう。さらにまた別の実施形態において
、これは、１２〜２６時間の範囲内であろう。

官能基は、がん治療のための細胞傷害性薬剤等の薬物を包含する。これは、シスプラチ
ンおよびカルボプラチン等のアルキル化剤ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、
シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；プリンアナログ、アザチオプリ
ンおよびメルカプトプリンを包含する抗代謝剤））またはピリミジンアナログ；ビンクリ
スチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシン等、ビンカアルカロイドを包含
する植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポ
シドおよびテニポシド；本来タキソールとして知られた、パクリタキセルを包含するタキ
サン；カンプトテシンを包含するトポイソメラーゼ阻害剤：イリノテカンおよびトポテカ
ン、ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシドを包含す
るＩＩ型阻害剤を包含する。さらに別の薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン（腎臓移植
において用いられる）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンその他を包含す
る抗腫瘍抗生物質を包含することができる。

可能なエフェクター基は、例えば、ペプチドリガンドが、ＡＤＥＰＴにおいて抗体を置
き換える、酵素／プロドラッグ治療法において用いるためのカルボキシペプチダーゼＧ２
等、酵素も包含する。

（ｖｉ）合成
本発明のポリペプチドが、本発明によって一旦単離されるか、または特定されれば、そ
の後の合成は、可能ならいつでも、単純化され得ることに留意すべきである。従って、ポ
リペプチドの群またはセットは、組み換えＤＮＡ技術によって生成される必要はない。例
えば、目的のポリペプチドの配列が決定されてもよく、それらは、標準的な技術によって
、続いてインビトロでの分子足場での反応によって、合成的に製造されてもよい。これが
行われる場合、標準的な化学が用いられてもよい。なぜなら、もはやファージのような遺
伝的にコードされたキャリア粒子の機能または完全性を保存する必要がないからである。
これによって、さらなる下流の実験またはバリデーションのために可溶性の材料の迅速な
大規模調製が可能になる。これに関して、本発明の方法によって特定される候補またはリ
ードの大規模調製は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらに開示されるもののような従来の化学を用い
て達成され得る。

従って、本発明はまた、本明細書に示されるように選択されたポリペプチドまたはコン
ジュゲートの製造に関し、ここではこの製造は、下に説明されるような任意のさらなるス
テップを包含する。一実施形態では、これらのステップは、ファージではなく、化学合成
によって作製された最終生成物のポリペプチド／コンジュゲートで行われる。

必要に応じて、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、例えば、最初の単離／特定の
ステップの後に、コンジュゲートまたは複合体を製造するとき、置換されてもよい。

ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、それによって複数の特異性を導入す
るために伸長されてもよい。

ペプチドを伸長するために、これは、標準的な固相または溶液相化学を用い、直交的に
保護されたリジン（およびアナログ）を用いて、ループのＮ末端もしくはＣ末端で、また
はループ内で化学的に、伸長されてもよい。標準的なタンパク質化学を、活性化可能なＮ
末端またはＣ末端を導入するために用いてもよい。あるいは、追加は、例えば、（Ｄａｗ
ｓｏｎ ＰＥ，Ｍｕｉｒ ＴＷ，Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ，Ｋｅｎｔ，ＳＢＨ．１９
９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）に記載のように
断片縮合もしくは天然の化学的ライゲーションによって、または例えば、（Ｓｕｂｔｉｌ
ｉｇａｓｅ：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ Ｃｈａｎｇ ＴＫ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＤＹ，Ｂｕｒｎｉｅｒ ＪＰ，Ｗｅｌｌｓ
ＪＡ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９４ Ｄｅｃ ２０；９１
（２６）：１２５４４−８、またはＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｔａｇｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ ｗｉｔｈ ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅ
ｏｍｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｉｓｓｕｅ ２２，１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００
８，Ｐａｇｅｓ ６０００−６００３，Ｔａｇｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ ｗｉｔｈ ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅ
ｏｍｉｃｓ；Ｈｉｋａｒｉ Ａ．Ｉ．Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓａｍｉ Ｍａｈｒｕｓ ａ
ｎｄ Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｗｅｌｌｓ）に記載のようなサブチリガーゼを用いて酵素によっ
て、行ってもよい。

あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を通じてさらなるコンジュゲーションによっ
て伸長または修飾されてもよい。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元性環
境内でお互いから一度解離することが可能になるという追加の利点を有する。この場合、
分子足場（例えば、ＴＢＭＢ）が、３つのシステイン基と反応するように第１のペプチド
の化学合成の間に追加され得るが、次いで、さらなるシステインが、このシステインが第
２のペプチドの遊離のシステインとのみ反応するように、第１のペプチドのＮ末端に追加
されてもよい。

同様の技術を、２つの二環性および二重特異性の大員環の合成／カップリングに等しく
適用して、可能性としては四重特異的な分子を作成する。

さらに、他の官能基またはエフェクター基の追加は、適切な化学を用いて同じ方式で達
成され得、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または側鎖を介してカップリングする。一実施形態
では、このカップリングは、これがいずれの実体の活性もブロックしないような方式で行
われる。

（ｖｉｉ）ペプチド修飾
二環性ペプチド（バイシクル（Bicycle）、分子足場にコンジュゲートしたペプチド）
を適した薬物様分子へと開発するため、注射、吸入、経鼻、点眼、経口または局所的投与
のいずれのためであれ、多数の特性を考慮する必要がある。次の記載は、少なくとも所定
のリードバイシクルに設計される必要がある。
・ プロテアーゼ安定性、これが、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー型」）プロテ
アーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼその他に
対するバイシクル安定性に関係するか否か。プロテアーゼ安定性は、バイシクルリード候
補が、動物モデルにおいて開発できると共に、確信を持ってヒトに投与できるように、異
なる種の間で維持されるべきである。
・ 分子の医薬品安定性プロファイルを改善するための、トリプトファンおよびメチオニ
ン等、酸化感受性残基の酸化抵抗性アナログへの置き換え。
・ 製剤および吸収目的に重要な、荷電かつ親水性対疎水性残基の比例の関数である、望
ましい溶解性プロファイル。
・ 荷電対疎水性残基の正確な均衡。その理由として、疎水性残基は、血漿タンパク質結
合の程度、すなわち、血漿における遊離した利用できる画分の濃度に影響を与え、一方、
荷電残基（特にアルギニン）は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に
影響を与え得るからである。組み合わせた両者は、半減期、分布の体積およびペプチド薬
物への曝露に影響を与えることができ、臨床エンドポイントに応じて目的に合わせて作製
することができる。加えて、荷電対疎水性残基の正確な組合せおよび数は、注射部位にお
ける刺激作用を低下させることができる（ペプチド薬物を皮下投与した場合）。
・ 臨床適応および治療レジメンに応じた、目的に合わせた半減期。急性疾病管理設定に
おける短時間の曝露のための無修飾分子を開発する、あるいは血漿半減期を増強させる化
学修飾を有する、したがってより慢性病状の管理に最適な二環性ペプチドを開発すること
は、堅実な行為となろう。

タンパク質分解に対して治療ペプチド候補を安定化させるためのアプローチは数多くあ
り、ペプチド模倣薬の分野と重複する（総説のため、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉら、Ｃｕｒｒ
．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ、（２０１０）、１６、３１８５〜２０
３およびＮｅｓｔｏｒら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９）、１６
、４３９９〜４１８を参照）。

係るアプローチの例として、次のものが挙げられる。
・ ペプチドの環化
・ ＮおよびＣ末端キャッピング、通常、Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化
・ タンパク質分解による攻撃部位（複数あってもよい）を明らかにし、潜在的に除去す
るためのアラニン走査
・ 立体障害により、また、β−ターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の
傾向によりタンパク質分解に対する安定性を増加させるための、アミノ酸側鎖の立体要件
を探るためのＤ−アミノ酸置き換え（Ｔｕｇｙｉら（２００５）ＰＮＡＳ、１０２（２）
、４１３〜４１８）
・ 解離しやすいアミド結合の直接的な修飾によりタンパク質分解からの保護を与えるた
めのＮ−メチル／Ｎ−アルキルアミノ酸置き換え（Ｆｉａｃｃｏら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈ
ｅｍ．（２００８）、９（１４）、２２００〜３）。Ｎ−メチル化は、ペプチド結合のね
じれ角における強い効果も有し、細胞浸透＆経口利用能を助けると考えられる（Ｂｉｒｏ
ｎら（２００８）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４７、２５９５〜９９）
・ 非天然のアミノ酸の組み入れ、すなわち、次を用いることによる。
− プロテアーゼにより認識されないが、標的効力に効果を持たない、等比体積／等電
子側鎖
− 近くのペプチド結合のタンパク質分解による加水分解が、コンホメーション的およ
び立体的に妨害されるような、制約されたアミノ酸側鎖。特に、これらは、プロリンアナ
ログ、巨大な（bulky）側鎖、Ｃα−二置換誘導体（最も単純な誘導体が、Ａｉｂ、Ｈ_２
Ｎ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＯＯＨである場合）およびシクロアミノ酸（単純な誘導体がアミ
ノ−シクロプロピルカルボン酸である）に関係する。
・ ペプチド結合代用物、その例として次のものが挙げられる。
− Ｎ−アルキル化（上述、すなわち、ＣＯ−ＮＲを参照）
− 還元されたペプチド結合（ＣＨ_２−ＮＨ−）
− ペプトイド（Ｎ−アルキルアミノ酸、ＮＲ−ＣＨ_２−ＣＯ）
− チオ−アミド（ＣＳ−ＮＨ）
− アザペプチド（ＣＯ−ＮＨ−ＮＲ）
− トランス−アルケン（ＲＨＣ＝Ｃ−）
− レトロインベルソ（Retro-inverso）（ＮＨ−ＣＯ）
− 尿素代用物（ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ）
・ ペプチド主鎖長のモジュレーション
− すなわち、β^２／３−アミノ酸（ＮＨ−ＣＲ−ＣＨ_２−ＣＯ、ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ
Ｒ−ＣＯ）
・ 主鎖コンホメーションを制約する、アミノ酸のアルファ−炭素における置換、最も単
純な誘導体はアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）である。

これら修飾のいくつかが、標的に対するペプチドの効力の計画的な改善に、あるいは例
えば、酸化感受性アミノ酸（ＴｒｐおよびＭｅｔ）の強力な置換の同定にも有用となり得
ることを明確に留意されたい。バイシクルのリードＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−
ＮＨ２は既に、タンパク質分解に対する耐性を付与する２つの改変を保有し、これらは、
Ｎ／Ｃ末端キャッピングおよび（二）環化であることもまた留意されるべきである。

（Ｂ）ポリペプチドリガンドのレパートリー、セットおよび群
（ｉ）ライブラリの構築
選択を意図するライブラリは、例えばＷＯ２００４／０７７０６２号に記載の当分野で
知られている技法、または本明細書中に記載のファージベクター系を含めた生物系を用い
て構築し得る。他のベクター系が当分野で知られており、他のファージ（例えばファージ
ラムダ）、細菌プラスミド発現ベクター、酵母ベクターを含めた真核細胞に基づく発現ベ
クターなどが含まれる。例えば、国際公開第２００９０９８４５０号パンフレットまたは
Ｈｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５（７）、５０２〜７を参照
されたい。

ＷＯ２００４／０７７０６２号に記載のものなどの非生物系は、慣用の化学的スクリー
ニング手法に基づく。これらは単純であるが、ペプチドリガンドの大きなライブラリをス
クリーニングすることは不可能、または少なくとも非実用的に煩雑であるため、生物系の
威力を欠く。しかし、これらは、例えば、少数のペプチドリガンドのみをスクリーニング
する必要がある場合に有用である。しかし、そのような個々のアッセイによるスクリーニ
ングは時間がかかる場合があり、特定の標的との結合について試験することができるユニ
ークな分子の数は、一般に１０^６個の化学的実体を超えない。

対照的に、生物学的スクリーニングまたは選択方法は、一般に、はるかにより多数の様
々な分子のサンプリングを可能にする。したがって、生物学的方法が本発明の応用におい
てより適切に使用され得る。生物学的手順では、分子を単一の反応器中でアッセイし、好
都合な特性（すなわち結合）を有するものを、不活性の分子から物理的に分離する。１０
^１３個を超える個々の化合物を同時に作製およびアッセイすることを可能にする選択戦略
が利用可能である。強力な親和性選択技法の例は、ファージディスプレイ、リボソームデ
ィスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはＲＮＡ
／ＤＮＡアプタマー方法である。これらの生物学的なインビトロ選択方法は、リガンドレ
パートリーがＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされていることが共通している。これら
は、配列決定によって選択されたリガンドの繁殖および同定を可能にする。ファージディ
スプレイ技術は、例えば、事実上任意の標的に対して非常に高い結合親和性を有する抗体
の単離に使用されている。

生物系を使用する場合は、ベクター系を選択し、対象のポリペプチドをコードしている
１つまたは複数の核酸配列をライブラリベクター内にクローニングした後、発現前に突然
変異誘発を行うことによってクローニングした分子内に多様性を発生させ得るか、あるい
は、突然変異誘発の前にコードされているタンパク質を発現および選択し、さらなる選択
のラウンドを行い得る。

構造的に最適化されたポリペプチドをコードしている核酸配列の突然変異誘発は、標準
の分子学的方法によって実施する。特に有用なものは、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち
ＰＣＲである（本明細書中に参考として組み込まれているＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏ
ｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５）。対象の標的配
列を増幅するために熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、複
数のサイクルのＤＮＡ複製を使用するＰＣＲは、当分野で周知である。様々な抗体ライブ
ラリの構築は、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１
２、４３３〜５５、およびそれ中に引用される参考文献中に記述されている。

あるいは、本発明によるポリペプチドの短い鎖長を考慮すると、変異体を好ましくは新
規合成し、適切な発現ベクター内に挿入する。ペプチド合成は、上述のように当分野で知
られている標準の技法によって実施することができる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ＡＢＩ４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）などの自動ペプチド合成機が広く利用可能である。

（ｉｉ）遺伝的にコードされている多様性
一実施形態では、対象のポリペプチドは、遺伝的にコードされている。これは、増強さ
れた多様性と共に取扱いの容易性の利点を提供する。遺伝的なポリペプチドライブラリの
一例はｍＲＮＡディスプレイライブラリである。別の例は、ファージディスプレイライブ
ラリなどの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）ライブラリである。一
実施形態では、対象のポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリとして遺伝的に
コードされている。

したがって、一実施形態では、本発明の複合体は、ファージ粒子などの複製可能な遺伝
子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）を含む。これらの実施形態では、核酸はファージ
ゲノムによって含まれ得る。これらの実施形態では、ポリペプチドはファージのコートに
よって含まれ得る。

一部の実施形態では、本発明を使用して、いくつかの核酸を対応するポリペプチドへと
翻訳し、前記分子足場の分子を前記ポリペプチドと連結させることによって作製される、
遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを生成し得る。

遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリは、ファージデ
ィスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲ
ＮＡディスプレイによって作製し得る。

ファージディスプレイを行うための技法および方法論は、国際公開第２００９０９８４
５０号パンフレットに見出すことができる。

一実施形態において、スクリーニングは、ポリペプチドリガンドのライブラリ、セット
または群を標的と接触させ、前記標的と結合する１種または複数種のメンバーを単離する
ことにより行うことができる。

別の実施形態では、前記ライブラリ、セットまたは群の個々のメンバーをスクリーニン
グにおいて標的と接触させ、前記標的と結合する前記ライブラリのメンバーを同定する。

別の実施形態では、前記ライブラリ、セットまたは群のメンバーを標的と同時に接触さ
せ、前記標的と結合するメンバーを選択する。

標的は、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。

標的は、受容体、受容体リガンド、酵素、ホルモンまたはサイトカインであり得る。

標的は、原核タンパク質、真核タンパク質、または古細菌タンパク質であり得る。より
詳細には、標的リガンドは、哺乳動物タンパク質もしくは昆虫タンパク質または細菌タン
パク質もしくは真菌タンパク質もしくはウイルスタンパク質であり得る。

標的リガンドは、プロテアーゼなどの酵素であり得る。

また、本発明には本発明によるスクリーニングから単離したポリペプチドリガンドも包
含されることに留意されたい。一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、前記標
的と結合することができるものとして単離された、一定量の本発明のポリペプチドを製造
するステップをさらに含む。

本発明は、また、３個以上のループを有するペプチドリガンドに関する。例えば、本発
明による分子足場に結合した二環ポリペプチドのＮおよびＣ末端を結合させることによっ
て、分子足場に結合した三環ポリペプチドを作製することができる。この様式で、結合し
たＮおよびＣ末端が第３のループを作り、三環ポリペプチドが作製される。本実施形態は
、ファージ上では実施する必要がなく、ここで述べた本発明のポリペプチド−分子足場の
コンジュゲート上で実施し得る。ＮおよびＣ末端の結合は、ルーチン的なペプチド化学の
事項である。指導が必要な場合は、Ｃ末端を活性化し得る、および／または例えばそれぞ
れの末端にシステインを付加するためにＮおよびＣ末端を延長させ、その後、ジスルフィ
ド結合によってそれらを結合させ得る。あるいは、結合は、Ｎ／Ｃ末端内に組み込ませた
リンカー領域の使用によって達成し得る。あるいは、ＮおよびＣ末端は、慣用のペプチド
結合によって結合させ得る。あるいは、ＮおよびＣ末端を結合させる任意の他の適切な手
段を用いてもよく、例えば、Ｎ−Ｃ環化は、例えばＬｉｎｄｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、９０、６７１〜６８２（２００８）「主鎖の環化およびメラノコルチンペプ
チドのＮ−メチル化の、構造−活性の関係性および代謝安定性の研究（Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔ
ａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ）」、またはＨｅｓｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５１、１０２６〜１０３４（２
００８）「新規の経口投与薬としての主鎖環状ペプチド模倣体メラノコルチン−４受容体
作用剤は、肥満の処置をもたらした（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｏ
ｍｉｍｅｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ
ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｒａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｄｒｕｇ ｌｅａｄ
ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｂｅｓｉｔｙ）」に開示されているように、標準の技法
によって行うことができる。そのような三環分子の一利点は、特にエクソプロテアーゼ作
用による、遊離末端のタンパク質劣化の回避である。この性質の三環ポリペプチドの別の
利点は、ＢＳＡ結合、細胞進入もしくは輸送効果、タグ付けまたは任意の他のそのような
使用などの、一般に適用可能な機能のために第３のループを利用し得ることである。この
第３のループは典型的には選択に利用可能でなく（ファージ上ではなく、ポリペプチド−
分子足場のコンジュゲート上でのみ生成されるため）、したがって、他のそのような生物
学的機能におけるその使用は、特異性を選択／作製するためにループ１および２をどちら
も有利に残すことに留意されたい。

（ｉｉｉ）ファージの精製
ファージの精製のためのいずれかの適した手段を用いることができる。標準の技法を本
発明において適用し得る。例えば、ファージは、濾過またはＰＥＧ沈殿などの沈殿によっ
て精製し得る。ファージ粒子は、以前に記載のようにポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ
）沈殿によって生成および精製し得る。詳細は国際公開第２００９０９８４５０号パンフ
レットにある。

さらなる指導が必要な場合は、Ｊｅｓｐｅｒｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２００４、１７（１０）：７０９
〜７１３．、化学合成抗体ライブラリからの光バイオセンサーの選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｈｅｍｉｓｙｎｔｈｅ
ｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ））を参照されたい。一実施形態では、
その中に教示されているようにファージを精製し得る。この出版物の本文は、ファージ精
製の方法について本明細書中に参考として具体的に組み込まれている。詳細には、Ｊｅｓ
ｐｅｒｓらのページ７０９の右段の途中から開始される材料および方法のセクションを参
照されたい。

さらに、ファージは、ファージの生成／精製をどのように実施するかの具体的な説明に
ついて本明細書中に参考として具体的に組み込まれている、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ、第２２２巻、ページ５８１〜５９７によって公開されているように精製し得る
。

（ｉｖ）反応化学
本発明は、ポリペプチドの修飾のための化学条件（この生成物の遺伝子的にコードされ
たエレメントの機能および完全性を保持することが有利である）を利用する。具体的には
、遺伝子的にコードされたエレメントが、それをコードしているファージの表面上でディ
スプレイされたポリペプチドである場合、ファージの生物学的完全性を損なわないことが
化学的に有利である。一般には、条件は、ＷＯ２００９０９８４５０に示される。

（Ｃ）本発明に係るポリペプチドリガンドの使用
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、インビボ治療および予防適
用、インビトロおよびインビボ診断適用、インビトロアッセイおよび試薬適用その他にお
いて用いることができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が
望ましい非ヒト動物における検査に関与する適用において、あるいはホモログまたはパラ
ログとの交差反応性が慎重に制御される必要がある診断適用において有用である。ワクチ
ン適用等、一部の適用において、所定の範囲の抗原に対する免疫応答を誘発する能力を活
用して、ワクチンを特異的疾患および病原体の目的に合わせることができる。

少なくとも９０〜９５％の均一性の実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投
与に好ましく、９８〜９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場
合に製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、
選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッ
セイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ
およびＰｅｒｎｉｓ、（１９７９および１９８１）免疫学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第ＩおよびＩＩ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）
。

本発明のペプチドリガンドは、典型的には、炎症性状態、アレルギー性過敏症、がん、
細菌またはウイルス感染症、および自己免疫障害（以下に限定されないが、Ｉ型糖尿病、
多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症
が含まれる）の予防、抑制または処置において使用が見つかる。

本出願では、用語「予防」は、疾患の誘導前に保護的組成物を投与することを含む。「
抑制」とは、誘導現象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与することをい
う。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与することを含む。

疾患に対する保護、またはその処置におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニン
グするために使用できる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明
により促進されて、ヒトおよび動物標的と交差反応し得るポリペプチドリガンドの開発を
可能にし、動物モデルの使用を可能にする。

感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を試験する方法は当分野で知
られている（Ｋｎｉｇｈｔら（１９７８）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：１６５３、Ｒ
ｅｉｎｅｒｓｔｅｎら（１９７８）Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ：Ｍｅｄ．、２９９：５１５）。
重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて、別の種からの可溶性ＡｃｈＲ
タンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験する（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９
８８）Ａｄｖ．Ｉｎｚｎ７ｕｎｏｌ．、４２：２３３）。関節炎は、マウスの感受性株に
おいてＩＩ型コラーゲンを注射することによって誘導する（Ｓｔｕａｒｔら（１９８４）
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４２：２３３）。感受性ラットにおいてマイコバク
テリア熱ショックタンパク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデ
ルが記載されている（Ｖａｎ Ｅｄｅｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３１：１７１）
。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のようにサイログロブリンを投与することによって誘
導する（Ｍａｒｏｎら（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：１１１５）。インス
リン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Ｋａｎａｓａｗａら（１９８４）Ｄｉａｂｅｔｏ
ｌｏｇｉａ、２７：１１３によって記載されているものなどの特定のマウス株において自
然に発生するか、または誘導することができる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、
ヒトにおけるＭＳのモデルとして役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパ
ク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８６）免
疫病理学の教科書（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、Ｍｉ
ｓｃｈｅｒら編、ＧｒｕｎｅおよびＳｔｒａｔｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ページ１７９
〜２１３、ＭｃＦａｒｌｉｎら（１９７３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７９：４７８、ならびに
Ｓａｔｏｈら（１９８７）Ｊ；Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：１７９を参照）。

一般に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適切な担体と共
に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含
めた、任意の水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経
口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび
塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液に保つ
ために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択し得
る。

静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素
補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤およ
び不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Ｍａｃｋ（１９８２）レミン
トンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ）、第１６版）。

本発明のペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として、または他の薬剤と併せて
使用し得る。これらには、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたは
シスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれ
る場合がある。医薬組成物には、様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明の
選択された抗体、その受容体もしくは結合タンパク質、またはさらには様々な標的リガン
ドを用いて選択されたポリペプチドなどの様々な特異性を有する本発明による選択された
ポリペプチドの組合せとを併せた「カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前に
プールするかどうかに拘らない。

本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任
意のものであり得る。それだけには限定されないが免疫療法を含めた治療には、本発明の
選択された抗体、その受容体または結合タンパク質は、標準の技法に従って任意の患者に
投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、ま
た、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であ
ることができる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時
投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。

本発明のペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成する
ことができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾
燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々
な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するために使用レベルを上方調節する必
要があり得ることが理解されよう。

本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／ま
たは治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的の応用では、選択された
細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能
なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。こ
の用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態
に依存するが、一般に体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されたペプ
チドリガンドの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使
用される。予防的な応用では、本発明のペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する
組成物を、同様または僅かに低い用量で投与してもよい。

本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的
細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設
定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーは
、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除
去するために、体外またはインビトロで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液を体外
で選択されたペプチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させるまたは
他の様式で血液から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。

本発明のさらなる態様によれば、炎症性状態、アレルギー性過敏症、がん、細菌または
ウイルス感染、眼科障害、および自己免疫障害を予防、抑制または処置する方法であって
、本明細書に定義されるペプチドリガンドの必要な患者に対して投与することを包含する
方法が提供される。

適切な「眼科の障害」の例（これには、滲出性および／または炎症性の眼科の障害、網
膜の血管の透過性および／または完全性の損傷に関連する障害、局所出血を引き起こす網
膜微小血管の破裂に関連する障害、眼後部の疾患、網膜疾患、および前眼部の疾患を含む
）としては、限定するものではないが、以下が挙げられる。加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、
滲出性黄斑変性（「ウェット（滲出型）（ｗｅｔ）」または新血管性加齢性黄斑変性症（
ｗｅｔ−ＡＭＤ）としても公知である）、黄斑浮腫、老人性円板状黄斑変性症、嚢胞様黄
斑浮腫、眼瞼浮腫、網膜浮腫、糖尿病網膜症、急性黄斑神経網膜症、中心性漿液性網膜脈
絡膜症、網脈絡膜炎、脈絡叢新血管新生、血管新生黄斑症、新生血管緑内障、動脈閉塞性
および静脈閉塞性網膜症（例えば、網膜静脈閉塞症または網膜動脈閉塞症）、網膜中心静
脈閉塞症、播種性血管内凝固症候群、網膜分枝静脈閉塞症、高血圧性眼底変化、眼性虚血
発作、網膜動脈小動脈瘤、コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半側網膜静脈閉塞症、乳
頭血管炎、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頚動脈疾患（ＣＡＤ）、霜状分枝
血管炎（ｆｒｏｓｔｅｄ ｂｒａｎｃｈ ａｎｇｉｔｉｓ）、鎌状赤血球網膜症および他
のヘモグロビン異常症、網膜色素線条症、疾患を病因とする黄斑浮腫（例えば、糖尿病黄
斑浮腫）、眼部の損傷もしくは眼部の外科手術；例えば、損傷、外傷もしくは腫瘍により
引き起こされる網膜の虚血もしくは網膜変性、ぶどう膜炎、虹彩炎、網膜血管炎、眼内炎
、全眼球炎、転移性眼炎、脈絡膜炎、網膜色素上皮炎、結膜炎、毛様体炎、強膜炎、上強
膜炎、視神経炎、球後視神経炎、角膜炎、眼瞼炎、滲出性網膜剥離、角膜潰瘍、結膜潰瘍
、慢性貨幣状角膜炎、タイゲソン角膜炎、進行性モーレン潰瘍、細菌もしくはウイルス感
染によって、および眼部の外科手術によって引き起こされる眼部の炎症性疾患、眼部の物
理的な損傷により引き起こされる眼部の炎症性疾患、掻痒、発赤、浮腫および潰瘍を含む
眼部の炎症性疾患により引き起こされる症状、紅斑症、多形滲出性紅斑、結節性紅斑、環
状紅斑、浮腫性硬化症、皮膚炎、血管神経性浮腫、咽頭水腫、声門水腫、声門下喉頭炎、
気管支炎、鼻炎、咽頭炎、副鼻腔炎、喉頭炎または中耳炎。

本明細書で言及される「眼の後部の疾患（ｂａｃｋ−ｏｆ−ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ
）」としては、とりわけ、眼の後部領域における網膜、黄斑、窩に影響する疾患が挙げら
れる。適切な「眼の後部の疾患」の例としては、限定するものではないが、以下が挙げら
れる。黄斑浮腫、例えば、臨床上の黄斑浮腫または血管造影の類嚢胞黄斑浮腫（種々の病
因論、例えば、糖尿病で生じる）、滲出性黄斑変性症および黄斑浮腫（網膜のレーザー処
置から生じる）、加齢性黄斑変性症、未熟児の網膜症（水晶体後部線維増殖症としても公
知）、網膜虚血および脈絡膜血管新生、網膜の疾患（糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫
、網膜剥離、網膜下新血管形成による老年性黄斑変性症、近視性網膜症）；炎症性疾患；
腫瘍に関連するブドウ膜炎、例えば、網膜芽細胞腫または偽網膜膠腫；硝子体切除術後の
新血管形成；血管疾患（網膜虚血、脈絡膜血管不全、脈絡膜血栓症、頸動脈虚血から生じ
る網膜症）；ならびに視神経の新血管形成。

本明細書で言及される「眼の前部の疾患（ｆｒｏｎｔ−ｏｆ−ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ
ｓ）」とは、眼の前部の組織、例えば、角膜、光彩、毛様体、結膜などに主に影響する疾
患、を指す。適切な「眼の前部の疾患」の例としては、限定するものではないが、以下が
挙げられる。角膜の新血管形成（炎症、移植、虹彩の発達不全、滲出性または炎症性の要
素を有する角膜疾患または混濁化、眼の穿通または眼球の挫傷性傷害に起因する血管新生
に起因する）；慢性ブドウ膜炎；前ブドウ膜炎；ＬＡＳＩＫ、ＬＡＳＥＫ、屈折矯正手術
、ＩＯＬ移植のような手術によってもたらされる炎症性状態；白内障手術の合併症として
の不可逆性角膜浮腫；傷害または外傷（物理的、化学的、薬理学的など）の結果としての
浮腫；炎症；結膜炎（例えば、持続的アレルギー性、巨大乳頭性、季節周期的アレルギー
性、通年性アレルギー性、毒性の結膜炎（細菌、ウイルスまたはクラミジアの感染により
引き起こされる））；角結膜炎（春季、アトピー性、乾燥）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強
膜炎；上強膜炎；感染性角膜炎；点状表層角膜炎；円錐角膜；後部多形性角膜ジストロフ
ィー；フックスジストロフィー（角膜および内皮）；無水晶体および偽水晶体水疱性角膜
症；角膜浮腫；強膜疾患；眼部瘢痕性類天疱瘡；毛様体扁平部炎；ポスナーシュロスマン
症候群；ベーチェット病；フォークト・小柳・原田症候群；過敏反応；眼球表面障害；結
膜浮腫；トキソプラズマ網脈絡膜炎；眼窩の炎症性偽腫瘍；結膜浮腫；結膜静脈鬱血；眼
窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異的血管炎；サルコイドーシス；ならびにサイトメガロ
ウイルス感染。

例えば、網膜または硝子体における、適切な「眼の過剰な血管透過性および／または浮
腫に関連する障害」の例としては、限定するものではないが、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ
）、網膜浮腫、網膜出血、硝子体出血、黄斑浮腫（ＭＥ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）
、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）および非増殖性糖尿病性網膜症（ＤＲ）、放射線網膜
症、毛細血管拡張症、中心性漿液性網膜症、および網膜静脈閉塞が挙げられる。網膜浮腫
は、網膜内空間における液体の蓄積である。ＤＭＥは、糖尿病を有する患者で生じる網膜
微小血管変化の結果である。血液−網膜障壁のこの妥協によって網膜の周囲への血漿構成
要素の漏出がもたらされて、網膜浮腫が生じる。網膜の他の障害としては、網膜静脈閉塞
（例えば、血管枝または中心静脈閉塞）、放射線網膜症、鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜
症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、後部ブドウ膜炎、慢性網膜剥離、アーヴァイン・ガ
ス症候群、イールズ病、網膜炎および／または脈絡膜炎が挙げられる。

（Ｄ）ポリペプチドの変異
所望の多様性は通常、１個または複数個の位置における選択された分子の変動により生
じる。変化する位置は、ライブラリが、ループ配列における個々の位置毎に構築されるよ
うに選択される。例えば、このような位置が、活性を失うことなく変異に利用できないこ
とが明らかになる場合、適宜、選択手順から１個または複数個の位置を省略することがで
きる。

次に、常在アミノ酸が、天然または合成のいずれかのアミノ酸またはそのアナログによ
り置き換えられ、非常に大多数のバリアントを産生するランダム化により、あるいは常在
アミノ酸を定義されたサブセットのアミノ酸の１個または複数個と置き換え、より限定的
な数のバリアントを産生することにより、変種を達成することができる。

係る多様性を導入するための様々な方法が報告されている。選択された位置に変異導入
するための方法も、本技術分野でよく知られており、ＰＣＲを使用した、あるいは使用し
ない、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
例えば、抗原結合ループへの変異を標的化することにより、数種の合成抗体ライブラリが
作製された。本発明の文脈において、同一の技法を用いることができる。例えば、ヒト破
傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域がランダム化されて、様々な範囲の新しい結合特異
性を生じた（Ｂａｒｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８９：４４５７）。ランダムまたはセミランダム（semi-random）Ｈ３およびＬ３領
域が、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントに付属されて、変異導入されたフレームワーク領域を
有する大型のライブラリを生じた（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ−＆Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）
Ｒ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍら（１９９４）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ、１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ、１３：３２４
５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４８：９７）。係る多
様化は、他の抗原結合ループの一部または全部を包含するよう伸長された（Ｃｒａｍｅｒ
ｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９９
５）ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、国際公開第９
７／０８３２０号パンフレット、上記参照）。

しかし、本発明において用いられるポリペプチドは、抗体よりもさらに小さいため、好
ましい方法は、変異体ポリペプチドをｄｅ ｎｏｖｏ合成するものである。構造化ポリペ
プチドの突然変異誘発は、ライブラリ構築に関連して上述されている。

次の実施例を参照することにより、次に、本発明をさらに説明する。

［材料および方法］
＜ファージライブラリのクローニング＞
ファージライブラリは、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ
２００９，５（７），５０２−７）に従って作成した。Ｈｅｉｎｉｓら、では、配列Ｘａ
ａ−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−、リンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｙならびに２つのジスルフィドなしのドメインＤ１およびＤ２を有する半ランダム
なペプチドをコードする遺伝子（Ｋａｔｈｅｒ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
２００５，３５４（３），６６６−７８）を、ファージベクターｆｄ０Ｄ１２の中に正
確な方向でクローニングして、「ライブラリ３×３」を得た。ペプチドレパートリーをコ
ードする遺伝子、および２つの遺伝子３ドメインを段階的に、２つの連続のＰＣＲ反応に
おいて作成した。第１に、Ｄ１およびＤ２の遺伝子を、２つのプライマーｐｒｅｐｃｒ（
５’−ＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＧ−３’）お
よびｓｆｉ２ｆｏ（５’−ＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＧ
ＧＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧ−３’；制限部位には下線を付している）を用い、ベクター
ｆｄｇ３ｐ０ｓｓ２１（Ｋａｔｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００５
，３５４（３），６６６−７８）をテンプレートとして用いて、ＰＣＲ増幅した。第２に
、ランダムペプチドをコードするＤＮＡを、プライマーｓｆｉｃｘ３ｂａ：５’−ＴＡＴ
ＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＮ
ＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＴＮＮＫＧＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’（制限
部位には下線を付している）、およびｓｆｉ２ｆｏを用いて、ＰＣＲ反応により付加した
。５５および１１μｇのＳｆｉＩ消化されたｆｄ０Ｄ１２プラスミドおよびＰＣＲ生成物
のライゲーションで、５．６×１０^８個のコロニーを、１０の２０×２０ｃｍのクロラム
フェニコール（３０μｇ／ｍｌ）２ＹＴプレート上で生成した。コロニーは、１５％のグ
リセロールを補充された２ＹＴ培地を用いてプレートからこすり取って、−８０℃で保管
した。本明細書に記載されるライブラリの構築は、同じ技術を使用して、例えば、セミラ
ンダムなペプチドＰｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_３−Ｃｙｓ−（
Ｘａａ）_３−Ｃｙｓを、３×３ライブラリについて、生成し、従って、ｓｆｉｃｘ３ｂａ
プライマー配列を５’−ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧＴＮＮ
ＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３
’で置き換えた。他のループ長を有するライブラリを同じ方法論に従って生成した。

＜ファージ選択＞
ファージライブラリのグリセロールストックを、５００ｍｌの２ＹＴ／クロラムフェニ
コール（３０μｇ／ｍｌ）培養中でＯＤ_６００＝０．１まで希釈して、ファージを、３０
℃で一晩（１５〜１６時間）生成した。ファージを、Ｈｅｉｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９，５（７），５０２−７に記載のように精製して、化
学的に修飾した。ビオチン化ｈＰＫ（３μｇ）（ＩＨＰＫＡ、ヒト血漿由来、Ｉｎｎｏｖ
ａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、ＭＩ、ＵＳＡ）を、５０μｌの予備洗浄した
磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｍ−２８０（インビトロｇｅｎ、Ｐａｉｓ
ｌｅｙ、ＵＫ））とともにＲＴで１０分間インキュベートした。ビーズを、３回洗浄した
後に、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する０．５ｍｌの洗浄バッフ
ァー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ_２、１ｍＭのＣａＣｌ_２）を用いて３０分間ＲＴで回転しながらブロックした。化学
的に修飾されたファージ（典型的には、２ｍｌの洗浄バッファー中で１０^１０〜１０^１１
ｔ．ｕ．に溶解）を、３％のＢＳＡおよび０．３％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１ｍｌの
洗浄バッファーの添加によって、同時にブロックした。次いで、ブロックしたビーズをブ
ロックした化学的に修飾されたファージと混合して、回転ホイール上で、ＲＴで３０分間
インキュベートした。ビーズを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する洗浄バッファーを
用いて８回洗浄し、洗浄バッファーで２回洗浄した後、１００μｌの５０ｍＭグリシン、
ｐＨ２．２とともに５分間インキュベートした。溶出されたファージを５０μｌの１Ｍの
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８に中和のために移して、３０ｍｌのＴＧ１細胞とともにＯＤ_６０
０＝０．４で９０分間３７℃でインキュベートして、細胞を大きい２ＹＴ／クロラムフェ
ニコールプレート上にプレートした。同じ手順を用いて、１回または２回の追加の回のパ
ンニングを行った。２回目の選択では、ニュートラアビジンコーティングの磁性ビーズを
用いて、ストレプトアビジン特異的なペプチドの富化を防止した。このニュートラアビジ
ンビーズは、０．８ｍｇのニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ
、ＵＳＡ）と０．５ｍｌのトシル−活性化磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｍ−２８０ ｆｒｏ
ｍ インビトロｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）とを、供給業者の指示に従って反応させ
ることによって調製した。

＜ヒト、サルおよびラットのＰＫのクローニングおよび発現＞
ヒト、サルおよびラットＰＫの触媒性ドメインを、哺乳動物細胞中で、その触媒性ドメ
インに対してプロＴＥＶ切断部位を介してＮ末端に接続されたプロペプチドを有する不活
性前駆体として発現させた。発現ベクターをクローニングして、下記のとおり、タンパク
質を発現し、活性化して、精製した。ＰＫシグナル配列、ポリヒスチジンタグ、ｐｒｏＴ
ＥＶ（プロＴＥＶ）切断部位、ＰＫの成熟触媒性ドメインおよび終止コドンをコードする
合成遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｓｕｐｐｌ
ｅｍｅｎｔａｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）から購入した。ヒト、サル（Ｍａｃａｃａ ｍ
ｕｌａｔｔａ）およびラットのＰＫの合成遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを調製して、遺
伝子をｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ４２哺乳動物発現ベクター（ＩＢＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、制限酵素対のＸｈｏｌおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌａｔｖｉａ）ならびにＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて移動した。連結されたプラスミドを、ＸＬ−
１ブルーエレクトロコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ
、ＵＳＡ）に形質転換して、アンピシリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有する２ＹＴ寒天プレ
ート上にプレートした。３つの発現ベクター（命名はｍＰＫ、ｒＰＫおよびｈＰＫ）由来
のＤＮＡを生成して、正確な配列を、ＤＮＡシーケンシング（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｓｅｏ
ｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）によって確認した。

３つのオーソロガス（同じ遺伝子座）の血漿カリクレインを、以下のように哺乳動物細
胞中で発現した。懸濁適合化されたＨＥＫ２９３細胞５０ｍｌを、４ｍＭのグルタミンお
よびヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるバルプロ酸（３．７５ｍＭ）の存在下で、軌道
振盪１００ｍｌフラスコ中、１８０ｒｐｍで、ＩＳＦ−４−Ｗインキュベーター（Ｋｕｅ
ｈｎｅｒ ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、３７℃、
５％ＣＯ_２の存在下、無血清のＥｘＣｅｌｌ２９３培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の中で増殖させた。胚性腎細胞（ＨＥＫ−２９３）を高
い細胞密度（２０×１０^６細胞／ｍｌ）において（Ｂａｃｋｌｉｗａｌ， ｅｔ ａｌ．
，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００８，９９（３），７２１−７）、３つの
プラスミド（３００μｇ／ｍｌ）を用い、直鎖のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてトランスフェクトし
た。７日の産生段階の終わりに、細胞を４℃で１５分間２’５００ｒｐｍの遠心分離によ
って回収した。追加の細胞破片を、０．４５μｍのＰＥＳ膜（Ｆｉｌｔｅｒ−ｔｏｐ ２
５０ｍｌ低タンパク質結合ＴＰＰ）を通した濾過によって培地から除去した。ポリヒスチ
ジン−タグ化タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂、洗浄バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌ
、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）および溶出バッファー（５００ｍＭのＮａＣ
ｌ、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４、５００ｍＭのイミダゾール）を用いて、Ｎ
ｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。タンパク質を、（５０単位）
のプロＴＥＶ（ｐｒｏＴＥＶ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
、ＵＳＡ）を用いて部分的に活性化し、さらにＮｉ−アフィニティークロマトグラフィー
およびゲル濾過（ＰＤ１０カラム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０
ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）によって精製した。

［結合活性の改善されたポリペプチドの開発］
＜個々の位置のランダム化＞
ライブラリの構築：カリクレイン結合二環性ペプチド中のアミノ酸をマッピングするた
めに、１セットの小さいライブラリを構築した。５つの残基の２つのループから構成され
るバイシクルに関しては、各々がペプチド配列中の特定のコドンでランダム化された１０
の別個のライブラリを生成した。各々のライブラリについてオリゴヌクレオチドを設計し
て、部位指向性の突然変異誘発によってファージゲノムＤＮＡを変異させた。突然変異誘
発は、目的のコドンのランダム化（ＮＮＳに変化）およびテンプレートゲノム配列からの
固有のＡｐａＬ１制限部位の除去を包含した。突然変異誘発生成物は、超純水への溶出を
用いるＱＩＡｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。各々のラ
イブラリを用いて、別々に、ＴＧ１−Ｅ．ｃｏｌｉを、エレクトロポレーションによって
、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｅｃ１ ｐｒｏｇｒａｍ）
および１ｍｍのＢｉｏＲａｄのキュベットを用いて形質転換した。１ｍｌのＳＯＣ培地中
、３７℃で１時間回復させた後、ライブラリの形質転換体を、抗生物質を含む２５ｍｌの
２ＴＹブロス中で一晩増殖させて、ライブラリの形質転換体のみを選択的に増殖させた。
細菌を、遠心分離によって回収して、ライブラリのファージＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉから
、ＱＩＡｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉキットを用いて精製して、蒸留水
中に溶出した。精製されたＤＮＡを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓバッファ
ー４の中で２時間ＡｐａＬ１を用いて消化して、親物質を除去した。消化後、ＤＮＡを、
ＱＩＡｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（上記のとおり）を用いて再精製し、これを用いてＴＧ
１を形質転換した（エレクトロポレーション；上記のとおり）。ＳＯＣ中での１時間の回
復後、形質転換体を、選択性抗生物質を含有するＬＢ−寒天プレートの上にプレートして
、コロニーを３７℃で一晩成長させた。

個々のクローンの結合のアッセイ：ライブラリ形質転換体クローンは、ランダムに採取
して、個々の培養物として、選択性の抗生物質を含有する２ＴＹブロス中で増殖させた。
採取したコロニーを、ＱＩＡｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＤＮＡシーケンサーを
用いてＤＮＡ配列決定して、各々のクローンに存在するアミノ酸置換を明らかにした。単
離された場合、各々の固有の置換のクローンを、以下のようにヒト血漿カリクレイン結合
についてアッセイした。ファージを含有している上清を、培養物から回収して、ファージ
を、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖ
ｏｌ．５ ｐｐ５０２−５０７（２００９））の方法に基づいて、トリスブロモメチルベ
ンゼン（ＴＢＭＢ）で環化した。このプロセスから精製されたファージを、プレートベー
スのホモジニアス結合アッセイを用いて、ビオチン化ヒト血漿カリクレインに対する結合
についてアッセイし、アッセイ読み出しはＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ
ＦＳプレートリーダーにより測定した。三連のアッセイ試料からの定量的結合データを
平均し（平均）、シグナル：バックグラウンドとして表現した（ここで、バックグラウン
ドとは、標的物質なしでアッセイした試料であった）。シグナル：バックグラウンドを、
並行な親の試料の％として表現した。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。示したアッ
セイは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。このアッセイデータは、ペプチド
配列と相互に関連した。灰色で印した置換は、試験しなかった（クローンは、ランダムラ
イブラリサンプリングからは単離しなかった）。非結合（任意）バイシクルの試料を、並
行してアッセイして、アッセイベースラインを図示した。

＜ペプチドドメインのランダム化＞
ライブラリ構築：小さいファージライブラリを、上記の「ファージライブラリのクロー
ニング」に記載されるようにＨｅｉｎｉｓらの方法に従って生成した。バイシクルコード
部分が、ＮＮＳにランダム化された４〜６のコドンのみを有する、親の５×５バイシクル
（５×５：２つの５残基ループ）ＤＮＡ配列に基づくように、ｓｆｉｃｘ３ｂａプライマ
ーを修飾した。ランダム化コドンは、目的のペプチドドメイン／モチーフをコードするも
のであった。

個々のクローンの結合のアッセイ：ライブラリ形質転換体コロニー、または選択アウト
プットコロニーを、採取して、個々の培養物として、選択性の抗生物質を含有する２ＴＹ
ブロス中で増殖させた。採取したコロニーを、ＱＩＡｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６
ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列決定して、各々のクローンに存在するアミノ酸
置換を明らかにし、以下のとおり、ヒト血漿カリクレイン結合についてアッセイした。フ
ァージを含有している上清を、培養物から回収して、ファージを、Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ
ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．５ ｐｐ５０２−５
０７（２００９））の方法に基づいて、トリスブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ）で環化
した。このプロセスから精製されたファージを、プレートベースのホモジニアス結合アッ
セイを用いて、ビオチン化ヒト血漿カリクレインに対する結合についてアッセイし、アッ
セイ読み出しはＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳプレートリーダーに
より測定した。二連のアッセイ試料からの定量的結合データを平均し（平均）、シグナル
：バックグラウンドとして表現した。示したアッセイデータは、少なくとも２つの独立し
た実験の代表である。このアッセイデータは、ペプチド配列と相互に関連した。

＜二環性ペプチドの合成および精製＞
ペプチド配列を、表４〜６に示す。コアペプチド配列は、Ａｃ−Ｃ _１ Ｓ_１Ｗ_２Ｐ_３Ａ_４
Ｒ_５ Ｃ _２ Ｌ_６Ｈ_７Ｑ_８Ｄ_９Ｌ_１０ Ｃ _３ −ＮＨ_２（Ａｃ−（０６−３４−１８）（ＴＭＢ）
−ＮＨ２として示される）およびＡｃ−Ｃ _１ Ｓ_１Ｆ_２Ｐ_３Ｙ_４Ｒ_５ Ｃ _２ Ｌ_６Ｈ_７Ｑ_８Ｄ_９
Ｌ_１０ Ｃ _３ −ＮＨ_２（Ａｃ−（０６−３４−１８）（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２ Ｔｙ
ｒ４として示される）であった。

ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが製造した、Ｓｙｍｐｈｏ
ｎｙペプチドシンセサイザーを用いる、Ｆｍｏｃ化学に基づいた。標準のＦｍｏｃ−アミ
ノ酸類を使用し（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）、以下の側鎖保護基を用いた：Ａｒｇ（Ｐｂ
ｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；ＧＩｕ（ＯｔＢｕ）
；Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ
（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｓｉｇｍａ）。カップリング試薬は
、ＨＣＴＵ（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であって、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を、ベースとして使用し、脱保護は、ＤＭＦ（ＡＧＴＣ）中の２０
％のピペリジンで達成した。合成は、０．３７ｍｍｏｌｅ／ｇｒ Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ
アミドＡＭ樹脂（ＡＧＴＣ）を用いて１００ｕｍｏｌｅ規模で行い、Ｆｍｏｃ−アミノ酸
を４倍過剰で利用して、ベースはアミノ酸に関して４倍過剰であった。アミノ酸を、０．
２ＭでＤＭＦ中に、ＨＣＴＵ（０．４ＭでＤＭＦ中に）、およびＤＩＰＥＡ（１．６Ｍで
Ｎ−メチルピロリドン中に）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）に溶解した。カップリング時間は
一般には３０分であって、脱保護時間は２×２．５分間であった。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル
グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ）を、１時間カップリングして、以下の
残基についての脱保護およびカップリング時間はそれぞれ２０分および１時間であった。
合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄して、乾燥した。側鎖保護基のおよび支持体からの
切断は、１０ｍＬの９５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ
／ｉＰｒ３ＳｉＨ／ジチオスレイトールを用いて３時間達成した。切断後、使用済みの樹
脂を濾過によって取り除き、濾液を、−８０℃に冷却された３５ｍＬのジエチルエーテル
に添加した。ペプチドペレットを遠心分離して、エーテルの上清を廃棄して、ペプチドペ
レットを、冷エーテルを用いて２回以上洗浄した。次いで、ペプチドを５〜１０ｍＬのア
セトニトリル−水中に再溶解して、凍結乾燥した。わずかな試料を、質量分析法（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））によ
る粗生成物の純度の分析のために取り出した。凍結乾燥後、ペプチド粉末を１０ｍＬの６
Ｍ塩酸グアニジウム（Ｈ_２Ｏ中に含まれる）中に採取し、０．５ｍＬの１Ｍのジチオスレ
イトールを補充し、Ｃ８ Ｌｕｎａ分取ＨＰＬＣ カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上に
ロードした。溶媒（Ｈ_２Ｏ、アセトニトリル）を０．１％のヘプタフルオロ酪酸を用いて
酸性化した。勾配は、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを用いて、１５／２０ｍＬ／分
の流速で、１５分で３０〜７０％のアセトニトリルにわたった。純粋な直鎖のペプチド物
質を含有する画分（ＭＡＬＤＩによって特定されるとおり）を合わせて、トリスブロモメ
チルベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）で修飾した。このために、直鎖のペプチドを、Ｈ
_２Ｏを用いて最大約３５ｍＬまで希釈し、アセトニトリル中に含まれる約５００ｕＬの１
００ｍＭのＴＢＭＢを添加して、その反応を、Ｈ_２Ｏに含まれる５ｍＬの１ＭのＮＨ４Ｈ
ＣＯ３（ｐＨ８）で開始した。その反応を、ＲＴで約３０〜６０分間進行させて、一旦凍
結乾燥させ、その反応を終わらせた（ＭＡＬＤＩで判定）。凍結乾燥後、修飾されたペプ
チドを、上記のとおり精製したが、ただしＬｕｎａ Ｃ８はＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム
（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で置き換え、酸は０．１％トリフルオロ酢酸に変えた。正確な
ＴＭＢ−修飾物質を含有する純粋な画分をプールして、凍結乾燥して、貯蔵のために−２
０℃で保持した。

天然でないアミノ酸は、表７に示される供給源から入手した。

大きい（ｂｕｌｋｙ）または干渉する（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）のアミノ酸（ＮＭｅ−Ｓｅ
ｒ、ＮＭｅ−Ｔｒｐ、ＮｏｒＨａｒ、４ＰｈｅｎｙｌＰｒｏ、Ａｇｂ、Ａｇｐ、ＮＭｅ−
Ａｒｇ、Ｐｅｎ、Ｔｉｃ、Ａｉｂ、Ｈｙｐ、ＮＭｅ−Ａｌａ、ＮＭｅ−Ｃｙｓ、４，４−
ＢＰＡｌ、３，３−ＤＰＡ、Ｄｐｇ、１ＮＡｌ、２ＮＡｌ、Ａｚｅ、４ＢｅｎｚｙｌＰｒ
ｏ、Ｉｎｄ）を、通常、１時間（２０分脱保護）および６時間の間、以下の残基について
カップリングした（２０分脱保護）。ＨＣＴＵを、前のとおり、カップリング試薬として
用いた。スケールは通常５０ｕｍｏｌｅであった。

＜ペプトイドの合成、還元アミド結合およびα−Ｎ−メチル化ペプチド＞
ペプトイド（すなわち、Ｎ−Ｈｉｓ７）を、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒ
ｏｎａｌｄ Ｎ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｊａｎｉｃｅ Ｍ．Ｋｅｒｒ，Ｓｔｅｐｈｅｎ
Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ｗａｌｔｅｒ Ｈ．Ｍｏｏｓ，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｏｉｄｓ［ｏｌｉｇｏ（Ｎ
−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）］ｂｙ ｓｕｂｍｏｎｏｍｅｒ ｓｏｌ
ｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（１９９２），１１４（２６），１０６４６
−１０６４７）が開発したスキームに従って合成した。

還元アミド擬ペプチド（ｐｓｅｕｄｏ ｐｅｐｔｉｄｅ）結合は、Ｓａｓａｋｉ Ｙ，
Ｃｏｙ ＤＨ．，ＣＨ２ＮＨＳｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＣＨ２ＮＨ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ
ｉｓｏｓｔｅｒｅ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．１９８７ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；８（１）：１１９
−２１のスキームに従って合成した。

Ｎ−メチル化ペプチド（ＮＭｅ−Ｈｉｓ、ＮＭｅ−Ｇｌｎ）は、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃｙｃｌｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｂｙ Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ，７（３）２０１２，
ｐｐ４３２に記載されるスキームに従って、光延反応の改変型を用いて合成した。全ての
他のＮ−メチル化アミノ酸（ＮＭｅ−Ｌｅｕ、ＮＭｅ−Ａｓｐ）を、市販の供給源からＦ
ｍｏｃ前駆体として得た。

＜酵素アッセイ＞
機能的な酵素アッセイを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０
ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（全てＳｉｇｍａ
ＵＫ）（ｐＨ７．４）の中で、２５℃で、ソリッドブラック（ｓｏｌｉｄ ｂｌａｃｋ）
９６ウェルプレートにおいて行った。要するに、２６．５ｐＭヒト血漿カリクレイン（Ｓ
ｔｒａｔｅｃｈ、ＵＫより購入）または５００ｐＭラット血漿カリクレイン（社内で発現
および精製した）を、漸増濃度の試験ペプチドの存在または不存在のもとで１５分間イン
キュベートし、その後に蛍光発生的な基質Ｚ−ＰｈｅＡｒｇ−ＡＭＣ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆ
ｅｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＫ）を、１００μＭ（４％のＤＭＳＯの中に含有）の最終アッセ
イ濃度まで添加した。ＡＭＣの遊離は、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ ＦＳ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅ
ｃｈ）、励起３６０ｎｍ、発光４６０ｎｍを用いて測定した。反応の直線段階（典型的に
は５〜４５分）の速度は、ＭＡＲＳデータ解析ソフトウェア（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ）
で算出した。次いで、その速度を用いて、ＩＣ５０およびＫｉをＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ
Ｐａｄ）中で算出した。４つのパラメータ阻害非線形回帰式を用いて、ＩＣ５０を算出し
た。ワンサイト（Ｏｎｅ ｓｉｔｅ）−適合Ｋｉ式を用いてＫｉを算出し、これは、Ｋｉ
を１５０μＭである基質についてのＫｍに制約する。全てのＫｉ／ＩＣ５０値は、少なく
とも２つの独立した実験の平均であり、１ｎＭより低いＫｉ値を有するペプチドについて
は少なくとも３つの平均である。

ペプチドは、ＴＦＡ塩としてそれらの粉末型で溶解し、ストック溶液は通常は水中で調
製した。全ての溶液を遠心分離して、濾過した（２０μｍのシリンジフィルター）後に、
２８０ｎｍで吸収を測定した。吸光係数は、ペプチドのＴｒｐ／Ｔｙｒ含量、およびＴＭ
Ｂのもの（ＴＭＢコアは、ペプチドに含まれる場合、約３００Ｍ^−１ｃｍ^−１というεを
有する）に基づいて算出した。疑わしい発色団特性（すなわち、ＮｏｒＨａｒ、４Ｐｈｅ
ｎｙｌＰｒｏ、３Ｐａｌ、４Ｐａｌ、Ｔｉｃ、４ＧｕａｎＰｈｅ、４，４−ＢＰＡｌ、３
，３−ＤＰＡ、１ＮＡｌ、２ＮＡｌ、４ＢｅｎｚｙｌＰｒｏ、Ｉｎｄ）を有する非天然の
アミノ酸を含有するペプチドについて、濃度は、規定量の水の中に粉末を秤量することお
よびペプチドを溶解することによって決定した。これらは、１ｎＭ以下でカリクレインに
対するＫｉを有するペプチドについて、独立して２回調製した。

＜血漿安定性プロファイリング＞
３つの方法を使用して、血漿中のバイシクル（分子足場にコンジュゲートされたペプチ
ド）の安定性を評価した。

方法番号１：
迅速血漿安定性プロファイリングアッセイ（ｒａｐｉｄ ｐｌａｓｍａ ｓｔａｂｉｌ
ｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）を開発し、これには親ペプチドの質量がもは
や観察不能になる時点まで、親の質量の質量分析検出（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇ
ｅｒ ＤＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。具体的には、２００
ｕＭのペプチドを、３５％ラットまたはヒト血漿（Ｓｅｒａ ｌａｂｓ、抗凝固薬として
クエン酸塩を使用）の存在下で、１×ＰＢＳ（１０×ＰＢＳ Ｓｔｏｃｋ、Ｓｉｇｍａ由
来）を補充して、３７℃でインキュベートした。種々の時点（すなわち、ｔ＝０、３、２
４時間、その後は１０日まで毎日）、２ｕＬの試料を、アセトニトリル：Ｈ_２Ｏの１：１
混合物中に含有される、１８ｕＬの３０ｍＭの重炭酸アンモニウムに添加した。試料は分
析の時点まで−８０℃で凍結した。ペプチドの適切な検出ウインドウを決定する質量分光
分析のために、所定の時点のアセトニトリル：Ｈ_２Ｏ希釈試料を、ＭＡＬＤＩプレートの
上に直接（０．７ｕＬ）スポットした。マトリックス（α−シアノ桂皮酸、Ｓｉｇｍａ（
０．１％トリフルオロ酢酸を含有する１：１のアセトニトリル：水の中の飽和溶液として
調製））を、試料上に積層した（１ｕＬ）。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ上の同様のレーザー強度
設定で、次に、親ペプチドがもはや検出不能になるまで時間を決定してもよい。これは、
血漿安定性における相対的変化を検出するように機能する定量アッセイであることに留意
されたい。

方法番号２：
安定性のデータをより迅速に得るために、ペプチドをまた９５％血漿中でも評価した。
ここでは、ＰＢＳを省き、１ｍＭペプチドストック（ＤＭＳＯ中に含まれる）を直接、血
漿中に希釈し（すなわち、４７．５ｕＬ血漿中に２．５ｕＬのストック）、５０ｕＭの最
終濃度を得た。５ｕＬの試料を適切な時点で採取して、−８０℃で凍結した。分析のため
に、試料を解凍して、１５ｕＬの１：１のアセトニトリル：メタノールと混合し、１３ｋ
で５分間遠心分離した。５ｕＬのペプチド含有上清を吸引して、アセトニトリル：Ｈ_２Ｏ
の１：１混合物中に含有される３０ｍＭの重炭酸アンモニウムと混合した。次いで、この
１ｕＬを、ＭＡＬＤＩプレート上にスポットして、上記のとおり解析した。上記のとおり
、これは、血漿安定性の相対的な変化を検出するように機能する定量的アッセイであるこ
とに注目すべきである。

方法番号３：
血漿安定性を定量的に得るために、ペプチドストック溶液（ＤＭＳＯ中に１ｍＭ含有）
を、Ｂｉｏｆｏｃｕｓ、ＵＫに送り、ここで分析を行った。ペプチドを、水を用いて１０
０ｕＭに希釈して、血漿中で１：２０希釈し（５ｕＭの最終濃度、血漿を９５％で使用）
、必要に応じてサンプリングして、上記のとおり沈殿させて、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ
ＴＱ−ＭＳを用いて定量した。

＜結合活性について好ましい残基の特定＞
表４に示される５×５ペプチドの例から、結合活性を有するペプチドの間で保存される
アミノ酸を特定することが可能である。結合活性に関してどの残基が好ましいかを決定す
るために、ペプチドの特定されたファミリーのうち２つからの代表をさらに研究した。こ
れらはペプチド０６−３４（これは、バイシクルの第１のループにＣＸＷＰＡＲＣモチー
フを含む）、およびペプチド０６−５６（これは、バイシクルの両方のループにまたがる
ＣＧＧｘｘＮＣＲモチーフを含む）であった。各々のペプチド配列について、任意のアミ
ノ酸がライブラリ中でその位置で発現され得るように、ループ残基のうち９つが一定に保
持され、他の残基はランダム化された、１セットの１０のファージライブラリを作成した
（上記の方法における「Ｒａｎｄｏｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐ
ｏｓｉｔｉｏｎｓ − Ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」を参照されたい）
。各々のライブラリに関しては、２０のランダムに選択されたファージクローンのセット
を、ファージ結合アッセイにおいてヒトカリクレインに対する結合についてスクリーニン
グして、標的結合について重要な残基を特定した（上記の方法における「Ｒａｎｄｏｍｉ
ｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ − Ａｓｓａｙ ｏ
ｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｌｏｎｅｓ」を参照されたい）。
この実験のデータは、図４〜６に示す。

ペプチド０６−３４（図４）に関しては、バイシクルのＡｒｇ１は、種々の異なるアミ
ノ酸で置き換えられてもよく、ヒト血漿カリクレインに対する結合は、保持されるかまた
は増強されることが明らかである。対照的に、ほとんどのアミノ酸での残基２、３、４、
５（Ｔｒｐ２、Ｐｒｏ３、Ａｌａ４、Ａｒｇ５）の置換によって、高い親和性の結合因子
についてストリンジェントなカットオフで設定されたアッセイにおいて見出されるシグナ
ルは大きく低下した。Ｖａｌ６は、多くの異なるアミノ酸で置換され得、結合活性は、保
持されるかまたは増強される。第２のループ中の他の残基の置換によって、Ｌｅｕ１０の
みは、活性を保持したままで、種々の異なるアミノ酸によって置き換えられ得ることが示
された。位置７、８および９は、置換に関して有する能力が限定されており、結合を増強
する置換は特定されなかった。

ペプチド０６〜５６（図５および６）に関しては、位置１および２のグリシンは、位置
６、８および９のアルギニン、トリプトファンおよびトレオニンのように、血漿カリクレ
インに対する結合について大いに好ましい残基である。位置４のグルタミンおよび位置１
０のトレオニンは、良好な結合活性を保持したままで、種々の残基によって置換され得る
。残りの３つの残基（位置１のプロリン、位置５のアスパラギン、および位置７のトレオ
ニン）は、置換について有する能力が限られている。

＜アミノ酸置換の解析＞
先行する分析から、０６−３４については、位置１および位置６が、種々のアミノ酸に
よって置き換え可能であり、さらに親ペプチドの結合活性以上の結合活性を保持したまま
であることが明らかである。これらの観察が単離された合成ペプチドで保たれるか否かを
評価するために、１セットのペプチドを図４の図面に応じて設計し、ここではＡｒｇ１を
セリンで置換し、かつＶａｌ６はトレオニン、メチオニンまたはロイシンのいずれかで置
換した。これらの置換の種々の組み合わせを使用するペプチドもまた合成した。これらの
置換は、このアッセイではより大きい結合シグナルを生じた（表５）。

全てのバリアント合成ペプチドが、酵素阻害アッセイにおいて、０６−３４の親ペプチ
ドと比較してヒト血漿カリクレインに対してほぼ等しいかまたは向上した活性を有し、こ
れによってこの種の分析を用いて、標的の結合親和性を微調節できることが示されており
、かつ極めて高い力価のリードペプチド候補を特定する経路が示唆される。

このペプチドをまた、単離された酵素アッセイにおいてラット血漿カリクレインに対し
て試験した。Ａｒｇ１のＳｅｒ１への置換は、ラットカリクレインに対する活性にわずか
な影響を有したが、Ｖａｌ６のトレオニン、メチオニンまたはロイシンへの置換によって
、ラット血漿カリクレインに対する力価が顕著に増大しているペプチドが生じた。ヒトカ
リクレインに対する活性は、完全に保持された。従って、置換を受けやすい位置を決定す
ることによって、標的オルソログ交差反応性などの所望の特性を有するペプチドを特定し
てもよい。

親ペプチドに存在しない機能性または特性を導入する能力を有するように、これらの２
つの位置を天然でないアミノ酸で置き換える実現性を実証するために、０６−３４−０３
中のＡｒｇ１およびＶａｌ６を、アラニンもしくはＮ−メチルグリシン（サルコシン）に
より、またはＮ−メチルセリンのいずれかにより、位置１で置き換えて、結合について評
価した。顕著なことに、表６に示されるとおり、位置１／６は、側鎖を一緒に除去しやす
い。なぜなら、Ｒ１Ａ／Ｖ６Ａ（０６−３４−０３ Ａｌａ１、６）ペプチドは、親に比
較して完全な力価を保持していたからである。残基１、６をＮ−メチルグリシンで置換す
れば（０６−３４−０３ ＮＭｅＧｌｙ１、６）、力価の低下を生じたが、結合親和性は
低いナノモル範囲で保持されたままであった。１位置のＮ−メチルセリンの導入は、力価
の１０倍の低下を生じるが、結合はピコモル範囲で保持される。従って、意図的な、プロ
テアーゼ安定性の向上、溶解度の向上、凝集能力の低下、およびオルソログの官能基の導
入を可能にし得る、ペプチド骨格構造または側鎖中で変化を可能にする、バイシクルの特
定の位置が特定され得る。

＜ＷＰＡＲドメインの詳細な分析＞
実施例１から特定したＷＰＡＲモチーフを、０６−３４−０３ペプチドの状況で分析し
て、ＷＰＡＲモチーフの代替または改善を特定した。０６−３４−０３の位置１、６、７
、８、９および１０を固定し、位置２、３、４および５をランダム化した（上記の方法の
「ペプチドドメインのランダム化−ライブラリ構築」を参照されたい）ライブラリを構築
した。ヒト血漿カリクレインに対する選択を、種々のストリンジェンシーで行った（上記
の方法における「ファージ選択」を参照されたい）。全てのアウトプット配列を特定して
、標的結合について解析した（上記の方法における「ペプチドドメインのランダム化−個
々のクローンの結合のアッセイ」を参照されたい）。表１７は、各々の固有の配列、選択
アウトプットにおけるその相対的な量（頻度）、および標的結合強度による順位番号を列
挙している。

表１７によって、ＷＰＡＲモチーフが、ヒト血漿カリクレインに対して最高の結合を付
与するが、他のカリクレイン結合配列は、選択から大量に回収されることが示される。こ
れらとしては、限定するものではないが、ＷＰＳＲ、ＷＰＡＲ、ＷＳＡＲ、ＷＰＦＲ、Ｗ
ＰＹＲ、ＦＰＦＲ、およびＦＰＦＲが挙げられる。位置２、３、４および５で最も有効か
つ豊富なモチーフは、以下のようにまとめられ得る：^Ｗ／_Ｆ Ｐｘ^Ｋ／_Ｒ

表１８（Ａ）によって、ＷＰＡＲおよびＷＰＳＲが、よりストリンジェントな選択アウ
トプット中で最も豊富であって、ＦＰＦＲおよびＦＰＹＲは、ストリンジェンシーが低い
方の選択アウトプットで豊富であったことが示される。これによって、ＷＰＡＲ様の配列
がＦＰＦＲ様配列よりも強力な結合因子であることが示される。標的結合アッセイにおけ
る各々のモチーフ（０６−３４−０３の状況における）の解析によって（表１８（Ｂ））
、ＷＰＡＲは、０６−３４−０３配列の位置２、３、４および５で、カリクレイン結合に
最適の配列であることが明らかになる。

＜ＷＰＡＲファルマコフォアの外の配列の最適化＞
ＷＰＡＲモチーフおよびそのバリアントを、ペプチド０６−３４−０３の状況で研究し
た。図１によって、ＷＰＡＲモチーフの外側のいくつかの位置が、他の残基について置換
された場合、カリクレイン結合を維持し得ることが実証される。カリクレイン結合の非Ｗ
ＰＡＲ決定基を研究するために、上記の方法において「ペプチドドメインのランダム化−
ライブラリ構築」に記載のように、固定されたＷＰＡＲ配列および全ての他のランダム化
した位置（ＣｘＷＰＡＲＣｘｘｘｘｘＣ）を有するファージライブラリを作成した。

８０個のランダムライブラリのメンバーを、ライブラリのプール（選択なし）から直接
単離して、高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーの両方においてカリクレイ
ンに対する結合についてアッセイした（上記の方法における「ペプチドドメインのランダ
ム化−個々のクローンの結合のアッセイ」を参照されたい）。これらのライブラリのメン
バー（ＷＰＡＲの外側のランダム配列を含む）は、ヒト血漿カリクレインに対して結合を
ほとんど示さないか、または全く示さず（データ示さず）、このことは、ＷＰＡＲモチー
フ単独の存在では、測定可能なカリクレイン結合を保持するに十分ではないことを示して
おり、バイシクルの配列の残りの部分も、また相互作用に寄与または影響しているはずで
ある。

ヒト血漿カリクレインに対する選択をこのライブラリで行い、カリクレイン結合の非Ｗ
ＰＡＲ決定基を研究して、最適のＷＰＡＲ含有ペプチド配列を単離した。１５０を超える
選択アウトプット配列を単離して、ヒト血漿カリクレインに対する結合についてスクリー
ニングした（上記の方法に記載のとおり）。この配列を、カリクレイン結合の順序でラン
ク付けして、トップの５０の配列を表１９に整列させた。表１９によって、位置１の残基
がカリクレイン結合に影響しないが、ヒスチジンに関して強力な一致が位置７でみられる
ことが示される（これは、上記の実施例１の知見を支持する）。このペプチド０６−３４
−０３−（実施例１の作業に由来する）は、最高の配列の１つである。第２のループの組
成は、ＷＰＡＲモチーフを有する場合に強力なカリクレイン結合を付与する明らかな傾向
を示す。

ヒト血漿カリクレインに対する最高のＷＰＡＲ含有結合因子は、以下の傾向：
を有し、
Ｈ７、Ｄ９およびＬ１０は、ＷＰＡＲ含有カリクレイン結合配列中で高度に保存されてい
る。

第２のバイシクルループ（位置６−１０）内で２つのモチーフを特定した：

１２０を超える特定されたヒト血漿カリクレイン結合因子（選択アウトプット配列）を
、モチーフ「ＴＨｘｘＬ」または「ｘＨｘＤＬ」からのそれらの誘導に従って、２つの異
なる方法で分類した。全てのグループに関して、アウトプット配列についての平均カリク
レイン結合アッセイシグナルは、所定の基についてのカリクレイン結合の指標として注記
された（表２０）。

表２０に示されるカリクレイン結合アッセイデータによって、「ＴＨｘｘＬ」および「
ｘＨｘＤＬ」モチーフが、ＷＰＡＲモチーフを有する二環性ペプチド中の場合、最高のカ
リクレイン結合を生じることが示される。２つのモチーフの組み合わせ「ＴＨｘＤＬ」に
よって、ヒト血漿カリクレインに対する最高の結合が得られ、かつ０６−３４−０３ペプ
チドの「ＴＨＱＤＬ」第２ループ配列を含む。

＜血漿安定性の体系的な解析＞
カリクレイン阻害性のバイシクルに関しては、血漿または他の関連の環境で低いプロテ
アーゼ駆動クリアランスを有するように、十分なプロテアーゼ安定性プロファイルを得る
ことが妥当である。ラット血漿における親ペプチドの進行性の消失が観察された迅速比較
血漿安定性アッセイ（方法のセクション、方法番号１）では、Ｎ末端アラニン（選択の時
点で存在し、リード配列の合成ペプチドにもともと含まれていた）は、ラットおよびヒト
の血漿の両方によって試験された全てのバイシクルの配列にまたがって急速に除去された
ことが見出される。この分解は、Ｎ末端およびＣ末端のアラニンの両方を欠いているリー
ド候補を合成することによって回避された。アミノおよびカルボキシペプチダーゼについ
て潜在的な認識ポイントを除去するために、リード候補のＣｙｓ１上に現在存在する遊離
のアミノ末端を、ペプチド合成の間、無水酢酸でキャッピングして、Ｎ末端アセチル化さ
れる分子を導く。同等の方法で、Ｃ末端システインをアミドとして合成して、カルボキシ
ペプチダーゼについて潜在的な認識部位を取り除く。従って、二環性のリード候補は、以
下の遺伝子配列：
を有し、ここで「Ａｃ」は、Ｎ末端アセチル化を指し、「−ＮＨ２」は、Ｃ末端アミド化
を指し、ここで「Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３」は、配列中の第１、第２および第３のシステインを
指し、ここで
は、アミノ酸の位置を指し（その性質
は上記の選択によって定義される）、そして「（ＴＭＢ）」は、このペプチド配列がＴＢ
ＭＢまたは任意の他の適切な反応性足場で環化されたことを示す。

ヒト（Ｋｉ＝０．１７ｎＭ）およびラットカリクレイン（ＩＣ５０＝１．７ｎＭ）の両
方に対するＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の高い親和性に起因して、本出願
人らは、このバイシクルをリードの開発のために選択した（図９、表１、表５）。上記の
同じ迅速血漿安定性プロファイリングアッセイを用いて、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭ
Ｂ）−ＮＨ２は、約２時間というラット血漿半減期に等しい、約２日という可観測性ウイ
ンドウを有した（方法のセクション、方法番号１）（ＬＣ／ＭＳによって定量的に決定し
た、下の表２３、方法番号３を参照されたい）。

Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の中のタンパク質分解認識部位（複数でも
よい）を特定する労力では、ペプチドを、３５％ラット血漿中で、経時的にサンプリング
して（方法番号１）、各々の試料を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いてペプチド断
片の進行性の出現について解析した。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の親の
質量は、１６８７Ｄａである。経時的に（図７、８）、質量１５４８．６（Ｍ１）、１１
９４．５（Ｍ２）、および１１０７．２（Ｍ３）の断片が出現する。Ａｃ−０６−３４−
１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２（Ａｃ−Ｃ_１Ｓ_１Ｗ_２Ｐ_３Ａ_４Ｒ_５Ｃ_２Ｌ_６Ｈ_７Ｑ_８Ｄ_９Ｌ_１０
Ｃ_３−ＮＨ２）の配列から、Ｍ１のピークは、Ａｒｇ５（−Ｒ５）を欠いているＡｃ−０
６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２に相当することが算出され得る。これによって、最初
のタンパク質分解性事象が明らかになり、この後に、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）
−ＮＨ２（Ｍ２、−ＷＰＡＲ）の中の４−アミノ酸セグメントＷＰＡＲの除去が続き、最
終的には、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の第１のループ全体が切除される
（Ｍ３、−ＳＷＰＡＲ）（図８）。このデータから、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）
−ＮＨ２のＡｒｇ５は、バイシクルの分解を担う主なラット血漿プロテアーゼ認識部位で
あることが証明される。

第１のループのアラニン置換およびスクランブリング：
ラット血漿プロテアーゼの認識部位を構成するのに特定されたＡｒｇ５を有して、Ａｃ
−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２誘導体の化学合成の活動を、より高い血漿タンパ
ク質分解に対する安定性を有する候補を特定する目的で行った。重要なことに、係る修飾
は、ヒトまたはラットカリクレインに対する力価に影響するべきではない。ＷＰＡＲ配列
／ファルマコフォアの役割に関する最初の探査（図９、１０）は、Ｗ_２Ｐ_３をＡ_２Ａ_３ま
たはＡ_２Ｑ_３で置き換えることによって、およびバイシクルの第１ループの一部または全
体をスクランブルすることによって行われた。下の表８は、配列およびカリクレインに対
するそれぞれの親和性を示す。

これらのデータから、Ｗ_２Ｐ_３の同時の除去は、カリクレインに対する結合を、約１０
００００倍の係数まで劇的に低下することが明らかになり、分子の薬理学的な不活性化が
効率的にもたらされる。アミノ酸の正確な配列の重要性が、４つのスクランブルされたペ
プチド（Ｓｃｒａｍ１〜４）によって強調される。なぜならそれらの全てがカリクレイン
に対する親和性の実質的な低下を示すからである（図１０）。不思議なことに、全てのペ
プチドがおおまかには同一のラット血漿安定性プロファイルを有し（１〜２日目、方法番
号１）、このことは、血漿プロテアーゼ認識が、アルギニンの存在（図７と同様の分解パ
ターンを生じる）に依拠するのであって、配列内の位置には依拠しないことを示している
。

次に、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の５つの誘導体を生成し、ここでは
Ｗ_２、Ｐ_３、Ａ_４、Ｒ_５、およびＣ_２が、それらのそれぞれのＤ鏡像異性体対応物により
置き換えられた（表９）。

このデータから、Ａ_４、Ｒ_５、およびＣ_２のＤアミノ酸置換は、血漿プロテアーゼに対
するペプチド安定性を増大することが明らかである。ラット血漿プロテアーゼによるＡｒ
ｇ５切り出しは、ペプチド分解の最初の事象であると考えられるので、ペプチド結合の最
初の加水分解は、Ａｒｇ５のＮ末端側および／またはＣ末端側で生じる。Ａｒｇ５のいず
れかの側のアミノ酸をそれらのＤ鏡像異性体で置換すれば、立体障害を通じて隣接するペ
プチド結合加水分解をブロックするということがもっともらしく思われる。実際、これは
、以前に観察された効果である（Ｔｕｇｙｉ ｅｔ ａｌ（２００５）ＰＮＡＳ，１０２
（２），４１３−４１８）。

カリクレインへの親和性に対するＤアミノ酸置換の有害な影響は、全ての場合に印象的
であり、力価の低下は、３００倍（Ｄ−Ａｒｇ５）〜４５０００倍（Ｄ−Ｔｒｐ２）にお
よぶ。これによって、カリクレインバイシクル結合ポケットへのこれらの側鎖の正確な三
次元ディスプレイの重要性が強調される。同等に著しいのは、Ｄ−Ａｌａ４の効果である
。ここでは、単一のメチル基（Ａｌａ側鎖である）の方向を変化することで、親和性は７
０００分の１に低下される。

Ｎ−メチル化：
次に、第１のループ中の残基を、それらのＮメチル対応物で体系的に置き換えた。Ｎ−
メチル化は、ペプチド結合自体の直接的な保護として機能するが、しかし、アミド水素が
ないこと、立体的なバルクの追加（メチル基）および好ましい二面角の変化のせいで、力
価の低下が予想される。

表１０は、データをまとめる。
ループ１のアミノ酸のＮ−メチル化が示す、力価に対する有害な影響の低下はそれほど
強烈ではない。具体的には、Ａｒｇ５のＮメチル化はやはり、１ケタのナノモル結合因子
を生じ（野生型ペプチドと比較して親和性の２０分の１に低下）、そのラット血漿安定性
は、アッセイ時間を超え（ＭＳ中のペプチドの断片化は、観察不能であった）、これによ
って、魅力的な改善されたリード候補となる。Ｄ−アミノ酸置換と同様に、Ａｒｇ５に隣
接する残基のＮ−メチル化によって、Ａｒｇ５に対するペプチド結合Ｎ末端および／また
はＣ末端のプロテアーゼ触媒性加水分解に影響する立体的な干渉をおそらく通じて、ペプ
チドに対する安定性の向上が付与される。注目すべきであるが、Ｓｅｒ１は、力価の有意
な低下なくＮメチル化され得、これによって、この位置でのペプチド骨格の完全性は、結
合に必須ではないことが示される。

アルギニン置換：
ラット血漿プロテアーゼによる認識におけるＡｒｇ５の重要性を考慮して、１セットの
アルギニンアナログを、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２リード中で試験した
。この化学構造を図１１に示しており、力価対安定性データを表１１に示す。

著しいことに、全てのアルギニンアナログが、アッセイのウインドウ時間を超えてペプ
チドの安定性を増大し、これによって、血漿プロテアーゼ認識におけるＡｒｇ５の完全性
の重要性が確認された。側鎖（Ａｇｂ、Ａｇｐ）の長さを延長すること（ＨｏｍｏＡｒｇ
）または減少することは両方とも親和性を低下したが、ＨｏｍｏＡｒｇアナログはやはり
、極めて良好な結合因子（Ｋｉ＝２．１ｎＭ）を生じ、安定性が増大している。同じ側鎖
（β−ｈｏｍｏＡｒｇ５）を保持したままで、Ａｒｇ５中の１つのメチレン基ずつアミノ
酸骨格を長くすること（いわゆるβアミノ酸）はまた、安定性の向上した結合因子を生じ
たが、ただし親和性のさらに有意な低下に相当する代償を払った（Ｋｉ＝８．２ｎＭ）。
Ａｒｇ側鎖の脂肪族部分をフェニル環で置き換えることは、共鳴の安定性、より嵩高く、
かつ硬直化したグアニジル含有側鎖（４ＧｕａｎＰｈｅ）を生じる。試験した全てのＡｒ
ｇアナログのうち、４ＧｕａｎＰｈｅは、増大した血漿安定性で、最大の親和性を有した
（野生型と比較して１／２に低下）。興味深いことに、グアニジルフェニル基は、公知の
低分子カリクレイン阻害剤ベンズアミジンと構造的に近い（Ｓｔｕｅｒｚｅｂｅｃｈｅｒ
ｅｔ ａｌ（１９９４），Ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ｔｙｐｅ．Ｂｒａｚ Ｊ Ｍ
ｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ．２７（８）：１９２９−３４；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００
５），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｒｅｅ
−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２８０：４１０７７−８９）。さらに、誘導体化されたフェニルグアニジン
は、別のセリンプロテアーゼｕＰＡの選択的阻害剤として使用された（Ｓｐｅｒｌ ｅｔ
ａｌ，（４−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｄｅｒｉｖ
ａｔｉｖｅｓ ａｓ ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｉｃ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７（１０）：５１１３−８）。従って、４Ｇｕａ
ｎＰｈｅ５を含有するＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２は、低分子阻害剤とみ
ることが可能で、その選択性は、周囲の二環性のペプチドで付与される。これは、他のバ
イシクルベースの阻害剤についての原理を含んでもよく、ここでは低選択性の公知の低分
子阻害剤は、正確な位置でバイシクル上に「移植」され、優れた力価および選択性の分子
が導かれる。

メチル化（ＳＤＭＡ、ＮＤＭＡ）、正の荷電の除去（Ｃｉｔ、ここでグアニジル基は、
等比体積だが、非荷電の尿素基で置換される）、またはＡｒｇ全体の欠失（ΔＡｒｇ）の
いずれかによる、Ａｒｇグアニジル基自体の修飾は、カリクレイン結合力価に強力な有害
な影響を有する。従って、グアニジル基の完全性および存在は、重要であるが、グアニジ
ル基または骨格に対してＡｒｇ５で接続する側鎖の性質は重要ではない。注目すべきは、
Ａｒｇ５はまた、リジンで置き換えられてもよいが、やはり親和性は低下している（ＷＰ
ＡＫペプチドを参照されたい）。

まとめると、ここまでのデータによって、アルギニン置換として、ＨｏｍｏＡｒｇ、Ｎ
ＭｅＡｒｇまたは４ＧｕａｎＰｈｅのいずれかを使用するＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭ
Ｂ）−ＮＨ２は、高い親和性を有する血漿安定性の向上した候補を構成し得ることが示さ
れる。

天然ではない修飾および血漿安定性向上の修飾との組み合わせを通じたリード候補の力価
改善
所定の二環性候補の力価を改善することは、いくつかの機序を通じて都合よく達成され
得る。これらの機序は、実施例４で部分的に取り組まれており、以下のように再記述され
得る：
１．より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活かし、かつより低いオフレー
トにつながる疎水性部分を組み込むこと
２．長期にわたるイオン性相互作用を活用する荷電された基を組み込み、より速いオン
レートおよびより高い親和性をもたらすこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ
，Ｒａｐｉｄ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｓｓｏｃｉ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉ
ｏｌ．３，４２７−３１を参照されたい）
３．このペプチドへ、すなわち、以下
−エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に制
約すること、
−エントロピーの損失が標的結合の際に最小であるように、骨格の二面角を制約するこ
と、
−同一の理由のために分子中に追加の環化を導入すること、
によって、追加的な制約を組み込むこと。
（概説については、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，３１８５〜２０３およびＮｅｓｔｏｒ
ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−
４１８を参照されたい）。

トリプトファンおよび疎水性アナログ置換：
最初に、ある範囲の疎水性アミノ酸を、Ｔｒｐ２部位中に置換して、酸化感受性トリプ
トファンを置き換え得る候補を特定し、かつ力価を増大し得る候補を特定する（上記の第
１のポイントを指定する）。これらのアミノ酸の側鎖は、図１２に示され、親和性データ
は、下の表１２にまとめられる。

予想どおり、血漿安定性を増大する修飾はない。２−ナフチルアラニンは、Ｔｒｐ２に
最も近く、かつ野生型よりもわずかに弱い力価を示し、これによって、Ｔｒｐ２について
良好な酸化耐性の置き換えとなる。興味深いことに、３，３−ＤＰＡ２は、Ｔｒｐに極め
て似ていない構造を有するが、対応するペプチドは高い力価を保持する。これによって、
カリクレイン上のＴｒｐ接触ポケットは、正確に設計された疎水性の実体を特定すること
によって、高親和性結合について活用され得ることが示され得る。

プロリンアナログ：
次に、本出願人らは、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２中のＷＰＡＲファル
マコフォア中のＰｒｏ３の役割を決定することに興味があった。４−ヒドロキシ−または
４−フルオロ−ｔｒａｎｓ（Ｌ）−プロリン（ＨｙＰ３、４ＦｌｕｏＰｒｏ３）を、ペプ
チド骨格に対するさらなる剛性およびらせん構造を誘導するのにおけるそれらの公知の特
性について選択した（図１３、表１３）。さらに、Ｈｙｐ上のヒドロキシルの存在は、プ
ロリン側鎖の溶媒接近可能性を探査する。それぞれの誘導体のＫｉは、野生型のものにつ
いてほとんど同一であって、このことは、ペプチド骨格上のいずれの影響も無視できるこ
とを示すが、また側鎖が接近可能であることも実証している。これをさらに推敲するため
、Ｐｒｏ３側鎖のγ炭素に対する嵩高い拡張を含んだＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）
−ＮＨ２の２つの追加の誘導体を試験した（４フェニル−Ｐｒｏ、４ベンジル−Ｐｒｏ）
。前者は、力価の著しい保存を示したが、後者は、重度に影響され、これによってＰｒｏ
側鎖は接近可能であるが、別個の修飾のみに限定されることが実証される。これらの修飾
中の立体バルクにかかわらず、血漿安定性は、野生型のものと同一であった。従って、こ
れらの修飾は、他のプロテアーゼに対して選択性を改善しない。

結合に対するプロリン環の大きさの効果を探査するために、極めて制約された４員のＰ
ｒｏアナログアゼチジンカルボン酸（Ａｚｅ）、およびさらに可塑性の６員の環（ピペコ
リン酸、Ｐｉｐ）を、Ｐｒｏ３について置換した。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−
ＮＨ２ Ａｚｅ３は、カリクレインと、いままでの全ての誘導体のうち最高の親和性で結
合し、野生型の親和性を３倍まで上回る（図１４、１３）。環の大きさとＫｉとの間に反
比例関係があると思われ、このことはＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の位置
３での構成的制約が、密接結合分子に重要であることを示唆する。

大きく嵩高い基に耐えることにおけるプロリン側鎖の可塑性は、二環性／三環性のプロ
リンアナログＴｉｃ、ＮｏｒＨａｒおよびＩｎｄで強調される（図１３）。特に後者の２
つの場合には、親和性は、やはり１ケタのナノモル範囲で十分である。

最終的に、本出願人らは、Ｐｒｏ３で環構造について要件を完全に探査しようと努めた
。この目的を達成するために、本出願人らは、α炭素でのその二重のメチル置換に起因し
て、αまたは３_１０らせん構造を誘導するのにおいて隣接するアミノ酸に対して強力な構
造的影響を有するアミノイソ酪酸（Ａｉｂ、図１５、表１３）を選択する（Ｔｏｎｉｏｌ
ｏ ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３３，１０６１−７２；Ｋａｒ
ｌｅ ｅｔ ａｌ（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９，６７４７−５６）。
著しいことに、この非天然の非環状アミノ酸は、１．２ｎＭのＫｉで、Ｐｒｏ３の代わり
に十分耐容される。従って、ＷＰＡＲファルマコフォア中のＰｒｏ３の役割は、ペプチド
骨格に対して制約を導入することである。この制約は、環の大きさの低下したプロリンア
ナログを使用することによって増強され得る（Ａｚｅ３を参照されたい）。逆に、プロリ
ン環は、非環式だが構造的に誘導性のアミノ酸、例えば、Ａｉｂで比較的効率的に置換さ
れ得る。

種々雑多なアナログ：
表１０では、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２のループ１のＳｅｒ１は、力
価に対して極めてわずかな影響でもってＮメチル化され得る（０．５対０．１７ｎＭのＫ
ｉ（ＷＴにおける））ことが示された。本出願人らは、この位置が位置１で、Ｃα上で大
きい二重置換に耐容したか否かを決定しようと努めた。この目的を達成するために、Ｓｅ
ｒ１を、Ｄｐｇ（ジプロピルグリシン）で置き換えた（図１５）。カリクレインに対する
このペプチドの親和性は、１．１ｎＭであって、位置１は、実質上なんらかの嵩高い残基
に適応するのに極めて可塑性であることが示される。従って、ループ１中のこの位置は、
アミノ酸可溶化、放射性標識、色素標識、リンカー、コンジュゲーション部位などを含む
、所望の化学的な官能基または基の意図的な包含のために活用され得る。

いくつかのアラニンアナログをまた、位置４で試験した。Ｎ−メチルおよびＤ−アラニ
ン（表１０、９）で既に示されているとおり、Ａｌａ４は、Ｃαでの立体的方向に対して
、または骨格自体に対する修飾に対して、極めて鋭敏である。このクラスの２つ以上の誘
導体は、これを強調する。なぜなら、Ａｌａ４でのペプチド骨格の伸長（β−Ａｌａ４）
は、親和性を劇的に低下するからである（約２０μＭ）。Ｄ−Ａｌａ４から予想されると
おり、Ａｉｂ４は、親和性をほぼ同じ程度まで低下する（２８９ｎＭ、図１５および表１
４）。著しいことに、Ａｌａ側鎖の１メチレンずつの伸長（Ａｂａ４）は、カリクレイン
に対する親和性を向上すると考えられる。

最終的に、隣接するＡｒｇ５プロテアーゼ認識ポイントに対する空間的アクセスの低下
に起因するタンパク質分解に対する安定性の増大を期待して、中央のシステイン（Ｃｙｓ
２）を、より嵩高く、かつさらに制約されたアナログであるペニシラミン（Ｐｅｎ、図１
５）で置き換えた。実際、ラット血漿安定性はわずかに向上され、しかし力価は有意に低
下し、これによって、この構造的足場に接続性の残基の十分な完全性の重要性が強調され
る。

＜単一のバイシクルリードへの血漿安定性の向上性および力価の向上性の非天然アミノ酸
の組み合わせ＞
感知できるほどの力価および最大のラット血漿安定性（方法番号１で決定される）を保
持したＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２の中の非天然の置換は、Ａｒｇ５バリ
アントホモアルギニン（ＨｏｍｏＡｒｇ５）、４−グアニジルフェニルアラニン（４Ｇｕ
ａｎＰｈｅ５）およびＮ−メチルアルギニン（ＮＭｅＡｒｇ５）であった。野生型ペプチ
ドに比較して力価を増大したＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２中の非天然の置
換は、Ｐｒｏ３アナログアゼチジンカルボン酸（Ａｚｅ３）およびＡｌａ４アナログ２−
アミノ酪酸（Ａｂａ４）であった。従って、Ａｚｅ３、Ａｂａ４を、プロテアーゼ安定性
向上性のＨｏｍｏＡｒｇ５、４ＧｕａｎＰｈｅ５およびＮＭｅＡｒｇ５と組み合わせて、
これが、高い血漿安定性および力価の増大を有するペプチド候補を生じたか否かを決定し
た。

表１５および１６は、血漿安定性と一緒に、種々の構築物の親和性を示す。

最初に、アルギニンアナログ含有ペプチドのラット血漿半減期の定量的な決定（第４カ
ラム、表１５）によって、Ａｒｇ５のＮ−メチル化が、ペプチドを保護するのに最も強力
であって（ｔ_１／２＞２０時間）、それに続くのがＨｏｍｏＡｒｇ５およびＧｕａｎＰｈ
ｅ５であったことが明らかになった。ＡｒｇのＮ−メチル化の強力な保護効果は、おそら
く驚くことではない。なぜならこれは、ペプチド結合の加水分解を直接妨げるからである
。これらの化合物中のＡｚｅ３の封入の際に、これらのペプチドの親和性は、全ての場合
に増強され得、さらなる開発のためにＡｃ−（０６−３４−１８）Ａｚｅ３ ＨｏｍｏＡ
ｒｇ５およびＡｃ−（０６−３４−１８） Ａｚｅ３ ＮＭｅＡｒｇ５の魅力的な候補を
作成する（表１５、図１６）。

Ａｂａ４の親和性向上効果は、Ａｚｅ３および任意のアルギニンアナログの状況では再
現できない。なぜなら、Ｋｉ値は、Ａｂａ４なしで観察される値よりも高かったからであ
る。従って、Ａｚｅ３の力価向上効果は、アルギニン置換の種類次第であるが、Ａｂａ４
のものはおそらく違う。

最終的に、これらのペプチドのラットカリクレインに対する活性は、有意に低下する（
表１５）。しかし、これらの値は、この段階では相対的であって、定量的ではない。なぜ
なら、ラットカリクレインのタンパク質調製は、ささいなものではなく、不純物を含んだ
からである。

＜Ｔｒｐ−フリーのＦＰＹＲカリクレインバイシクルリードの血漿安定性向上、およびＡ
ｚｅ３による親和性向上＞
実施例１〜４における選択アウトプットから、本出願人らは、豊富だが、制約された変
更されたＷＰＡＲモチーフを有したＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２に似てい
るいくつかの配列を発見した。これらは、ＷＰＳＲおよびＦＰＹＲであった。後者は具体
的には、酸化感受性のトリプトファンを欠くので、興味深い。

ＷＰＳＲ、ＦＰＹＲ、ＷＰＹＲおよびＦＰＡＲを含むバイシクルを合成して、ＷＰＡＲ
親ペプチドに対して比較した（表２１）。

期待どおり、有意に異なる血漿安定性を示したペプチドはなかった。Ｔｒｐ２をＰｈｅ
２で置き換えれば、Ｋｉの４０倍の減少を被り、これによって、さらに嵩高いＴｒｐ２側
鎖の要件が強調される。しかし、この減少は、Ａｌａ４をＴｙｒ４で置き換えること（Ｆ
ＰＹＲモチーフをもたらす）によって損なわれ得、その結果、親和性がやはり、ほぼ野生
型ＷＰＡＲ配列の親和性まで増大する（Ｋｉ＝０．４６ｎＭ）。従って、Ａｃ−０６−３
４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２バイシクルの位置２と位置４の残基の間で協同的な相互作用
がある。Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４の中のＴｒｐ２
の高い標的結合親和性および欠失を考慮すれば、この候補は、上記の実施例に記載される
ようなアプローチを使用して、ラット血漿半減期を増大するために検討された。さらに、
本出願人らは、これらの残基を、非天然のアミノ酸アナログで置き換えることによって、
Ｐｈｅ２とＴｙｒ４との間の相互作用を検討した。

Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４の中のＰｈｅ２／Ｔｙ
ｒ４の非天然の置換
本出願人らは、Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４リード
の中のＰｈｅ２またはＴｙｒ４に対する置換を組み込んでいる合成の限定的なセットを行
った。非天然のアミノ酸を図１２の中と同じセットから選択して、親和性のデータを表２
２にまとめる。

ここでは、試験した任意のアミノ酸による置換は一般に、側鎖が複素芳香環（３Ｐａｌ
、４Ｐａｌ）であるか、芳香族および嵩高い（１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、４，４−ＢＰａｌ）
または脂環式（Ｃｈａ）実体であるかにかかわらず、十分許容される。３Ｐａｌは、位置
２で十分耐容され（Ｋｉ＝０．９１）、これは、Ｐａｌがイオン性基（これは、すなわち
、構築のために活用され得る）を含むので興味深い。しかし、もとのＰｈｅ２／Ｔｙｒ４
の組み合わせが最も強力なままであると考えられる。

＜ラット血漿中のＡｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４の安定
性およびアゼチジンカルボン酸３置換の効果＞
Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２Ｔｙｒ４を、ホモ−アルギニン
、４−グアニジルフェニルアラニンおよびＮ−メチルアルギニン置換を用いて、Ａｚｅ３
の存在および不存在のもとで調製した。ＨｏｍｏＡｒｇ／４Ｇｕａｎｐｈｅは十分耐容さ
れ、Ｋｉ値は、親のＰｈｅ２Ｔｙｒ２ペプチドとほぼ同一であり（表２３）、かつラット
血漿安定性は、１３倍まで向上された（ｔ_１／２＝１２．２時間、表２３、図１６）。さ
らに、ラットカリクレインに対するＩＣ５０値は、親の値と同様であり、これによって、
インビボの研究について魅力的な候補であることが示される。

ＦＰＹＲの状況におけるＰｒｏ３からＡｚｅ３への置換によって再度、親和性の向上し
たペプチド候補が得られ、実際、１ｎＭ未満のＫｉを有するペプチドが生成され、これは
ラットで２０時間を超える半減期を有する可能性が高い（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐ
ｈｅ２ Ａｚｅ３Ｔｙｒ４ ＮＭｅＡｒｇ５）。

＜ループ２における単一のアミノ酸置換を通じて０６−３４−１８バイシクルリード候補
のヒト血漿安定性を改善する＞
［主な血漿プロテアーゼ認識部位としてのＨｉｓ７の特定］
以下のループ１修飾０６−３４−１８ペプチドのラットおよびヒトの血漿安定性を、Ｌ
Ｃ−ＭＳを用いて定量的に決定した（方法番号３、表２）。ラット血漿プロテアーゼに対
して安定性を付与する化学的修飾（ＨＡｒｇ５、４ＧｕａｎＰｈｅ５、ＮＭｅ−Ａｒｇ５
）は、ヒト血漿のタンパク質分解性の状況では有効ではないことが明らかである。

Ａｃ−０６−３４−１８（ＴＭＢ）−ＮＨ２ Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４（野生型ペプチドと
呼ばれる）を引き続き、ヒト血漿に供して、断片が現れるか経時的に解析した。これを、
０６−３４−１８のＮＭｅ−Ａｒｇ５誘導体（図１８ａおよび１８ｂ）を用いてヒト血漿
で観察される分解プロフィールと比較した。断片化を、方法番号２によって決定した。

質量分析情報によれば、細胞内タンパク質分解性加水分解が、０６−３４−１８配列の
Ｈｉｓ７のＮ末端側および／またはＣ末端側のいずれかで生じ、引き続きＬｅｕ６（細胞
外タンパク質分解活性を通じて）またはＨｉｓ７−Ｇｌｎ８（細胞外タンパク質分解活性
を通じて）または３つ全ての残基を一緒に切り出す。観察される断片の性質から、最初の
細胞内タンパク質分解性加水分解事象は、Ｈｉｓ７とＧｌｎ８との間ではなく、Ｌｅｕ６
とＨｉｓ７との間のペプチド結合で生じる可能性が高い。さらに、Ａｒｇ５上のラット血
漿プロテアーゼ認識ポイントがＮメチル化でブロックされる場合、同じ断片化パターンが
観察され（図１８ｂ）、このことは、ヒト血漿のタンパク質分解性特性がラットのものと
は別個であることを示している。

ループ２残基の役割、および血漿プロテアーゼに対する安定化の体系的なアセスメント
引き続き、ヒト血漿安定性およびヒトカリクレイン力価に対するそれらの効果に関して
ループ２の残基の各々の役割を評価した。

本発明のセクションに対するバックグラウンドで部分的に概説される実験的なアプロー
チを用いて、完全なループ２アミノ酸スキャンを以下によって行った。
１）ループ２アミノ酸の各々をアラニンで置き換えて、プロテアーゼ（単数または複数
）についての認識ポイントとして機能する側鎖を除去すること
２）ループ２のアミノ酸の各々をそのＤアミノ酸鏡像異性対応物で置き換えて、変性プ
ロテアーゼ（複数可）による接近と立体的に対抗すること
３）ループ２のアミノ酸のいくつかをＤアラニンで置き換えて、プロテアーゼ（複数可
）によるペプチド結合への接近と立体的に対抗すること

各々のバリアントについての力価データをそれぞれ表３ａ、３ｂ、および３ｃにまとめ
る。

１）ループ２残基のアラニンスキャン
表３ａは、−Ｌ、−ＨＱ、−ＬＨＱ断片が検出不能であったので、Ａｌａ７によるＨｉ
ｓ７の修飾が、第２のループ中のタンパク質分解性の変化を低下すると考えられることを
示す。しかし、Ａｒｇ５上のループ１中のタンパク質分解性の分解（これは、ラット血漿
でのみ以前に観察された）は現在検出可能になっている。従って、ヒト血漿プロテアーゼ
が両方のタンパク質分解認識ポイント（Ａｒｇ５およびＨｉｓ７）を攻撃できることが明
らかである。Ａｌａ７がたとえ、Ｈｉｓ７に比べて安定性を向上すると考えられ（野生型
ペプチドにおいてのように）ても、その力価は有意に低下し（５６分の１）、Ｋｄは２３
ｎＭになり、これは、治療分子には十分に強力ではない。残りのＡｌａ置換は全て、血漿
安定性の増大はないが、力価を種々の程度まで低下する（ループ２分解バイシクルペプチ
ド断片の出現によって判定、表３ａ第４カラム）。まとめると、これによって、Ｈｉｓ７
の側鎖がプロテアーゼ認識ポイントであるという知見が強調される。

２）ループ２残基のＤアミノ酸スキャン
表３ｂは、アミノ酸の各々をＤ鏡像異性体対応物で置き換える効果を示す。この修飾は
、側鎖をインタクトに残すが、これをＣα上で代替の構成に投影する。ループ２内の任意
の位置のＤアミノ酸は、タンパク質分解からペプチドのループ２を安定化すると考えられ
るが、しかし、上記のＡｌａ７バリアントでわかるとおり、特異性は、現在ループ１中の
不安定部位に切り替わる（Ａｒｇ５）。Ａｒｇ５への加水分解の切り替えによって、ルー
プ２中のＤアミノ酸誘導性安定化の効果を定量することが困難にされる。なぜならこの独
立したプロセスは、残りの親物質（下でさらに取り組まれる）の量に影響するからである
。Ｄアミノ酸置換の遠位保護効果は、文献中で認識されており、加水分解性結合への接近
を立体的に低下または防止することによって機能する可能性が高い（Ｔｕｇｙｉ ｅｔ
ａｌ（２００５）ＰＮＡＳ，１０２（２），４１３−４１８）。しかし、Ｄ−アミノ酸類
はさらに進行性に推定のＨｉｓ７プロテアーゼ認識部位（すなわち、Ｄ−Ａｓｐ９、Ｄ−
Ｌｅｕ１０）から離れ、またＨｉｓ７に隣接する、切り出されたロイシン６に対応する少
量の断片を示す。

とりわけ、ほとんどのＤ−アミノ酸バリアントは、強力に低下した力価（力価の１３０
〜９０００分の１の低下）を示し、このことは、カリクレインタンパク質とのペプチドの
相互作用の三次元および立体の性質を強調する。Ｄ−Ａｓｐ９は、安定性の増大が観察さ
れるが、４ｎＭ（ＷＴに比較して９分の１に低下）の力価が維持されているという点で、
例外であると考えられる。この修飾は、候補治療分子中の有用な安定化置換である可能性
があり得る。

３）ループ２残基のＤアラニンスキャン
表３ｃは、２〜３の選択のループ２アミノ酸をＤ−アラニンで置き換えることの効果を
示す。この側鎖を取り除くこと、および現在導入されたメチル基に起因してＣα上に立体
ブロックを導入することは、力価に対して強力に有害な影響を有する。それにもかかわら
ず、２つの事例では、低ナノモル親和性は、保持される（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｄ
−Ａｌａ９、およびＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４ Ｄ−Ａｌａ９）。
Ｄ−Ａｓｐ９と同様に、これらの修飾は、候補治療分子中の有用な安定性置換である可能
性があり得る。

＜Ｌｅｕ６、Ｈｉｓ７およびＧｌｎ８上でアミノ酸模倣物を用いるアミノ酸側鎖の置換＞
その後、Ｌｅｕ６、Ｈｉｓ７およびＧｌｎ８のアミノ酸置換の活動は、これらの残基の
立体的、荷電上および構造的な要件を評価するために、ならびに血漿プロテアーゼによる
Ｈｉｓ７部位の認識の低下に対するそれらの影響を評価するために行った（ループ２の構
造は、図１９ａに示す）。

適切な一般的アプローチは、導入のセクション中で以前に考察された。

・０６−３４−１８のループ２中の位置６での置換
残基Ｌｅｕ６では、Ｌｅｕ６とＨｉｓ７との間の切断可能な結合に対するプロテアーゼ
の接近を低下させる目的で、アミノ酸のＣβで立体的なバルクを導入することが求められ
た。試験された構造を図１９ｂに示す。力価に対する効果を、表２４ａにまとめる。いく
つかの修飾によって、特にＡｃ−（０６−３４−１８）の状況では、野生型ペプチドに比
較した親和性の強化が示される（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４の状況
ではもっと少ない）。具体的には、これらは、天然でないアミノ酸フェニルグリシン（Ｐ
ｈｇ）およびシクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）である。これらの修飾の全てが、第２の
ループでタンパク質分解切断をある程度低下すると考えられるが、最も強力な安定化因子
は、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン（ｔＢｕＧｌｙ）であることが証明された。このペプチド
、Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４ ｔＢｕＧｌｙ６は、ヒト血漿に供さ
れた場合、第１のループにおけるＡｒｇ５の除去のみを示した。まとめると、任意のＣｈ
ｇ、Ｐｈｇ、およびｔＢｕＧｌｙ修飾が、第２のループの血漿安定性を増強するように機
能し得る。さらに、本出願人らは、カリクレインに対する力価を向上する２つの修飾（Ｃ
ｈｇ、Ｐｈｇ）を特定した。

・０６−３４−１８のループ２における位置７での置換
残基７では、ヒスチジン側鎖を置換することによる血漿安定性および力価に対する影響
を、以下の模倣物を使用して研究した。ピリジルアラニン２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、４Ｐａｌ
は、イミダゾール側鎖の塩基性のイオン性芳香族複素環模倣物である。チエニルアラニン
（Ｔｈｉ）、フリルアラニン（ＦｕＡｌａ）、ＴｈｉＡｚ、１，２，４トリアゾールアラ
ニン、（１，２，４トリアザ）、チアゾリルアラニン（ＴｈｉＡｚ）は、イミダゾール側
鎖の５員の複素環式芳香族非荷電模倣物である。Ｈｉｓ１Ｍｅ／Ｈｉｓ３Ｍｅは、イミダ
ゾール側鎖のＮメチル置換誘導体である。Ｄａｐ、ＡｇｂおよびＡｇｐは、しかし、芳香
族側鎖を欠いている、イミダゾール側鎖の正の荷電の置換に相当する（図１９ｃ）。表２
４ｂは、力価のデータをまとめている。著しく、全てのペプチドが、ループ２では血漿プ
ロテアーゼに対する安定性の向上を示し、可視の分解はループ１中でＡｒｇ５でのみ生じ
た。明らかに、位置７の正の電荷は、血漿プロテアーゼについての認識ポイントを提供す
るのに十分ではない（Ｄａｐ、Ａｇｐ、Ａｇｂ）。逆に、もともとのイミダゾール側鎖の
密接な模倣を保持したままで正の電荷を除去することはまた、タンパク質分解認識部位も
除去する。もとのイミダゾール環に対するいくつかの構造の極めて密接な模倣にもかかわ
らず、全てのペプチド誘導体は、血漿カリクレインに対して有意に低下した親和性を示す
。これによって、Ｈｉｓ７のインタクトな構造が、カリクレインに対する結合が完全な力
価を有するのに必要であることが示される。低ナノモル結合を保持した興味深い候補は、
チアゾリルアラニン、フリルアラニン、およびＨｉｓ１Ｍｅであった。興味深い推定の候
補は、ホモヒスチジン、およびイミダゾリルグリシンであり得る。

・０６−３４−１８のループ２における位置８での置換
残基８（Ｇｌｎ８）は、Ｌｅｕ６とＨｉｓ７との間に存在する切断部位に対してさらに
遠位である。２〜３の置換基を試験した（図１９ｄおよび表２４ｃ）。負に荷電されたア
ミノ酸をこの位置に導入して、塩架橋を近隣のＨｉｓ７に対して仕向け、これが血漿プロ
テアーゼによるＨｉｓ７の認識を低下し得る。これもヒスチジン７を欠いていた、ファー
ジ選択アウトプットに存在した追加のループ２の配列を試験した。このループ２配列は、
ＬＴＴＥＬ（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４ Ｔｈｒ７ Ｔｈｒ８ Ｇ
ｌｕ９と呼ばれる）であった。さらに、βアミノ酸を位置８で試験した（ｂＨＧｌｎ８、
図１９ｄ）。Ｈｉｓ７のタンパク質分解認識および引き続く分解を潜在的に邪魔するよう
に、正の電荷のアミノ酸をまた、この位置で試験した。これらの分子の力価は１０ナノモ
ル未満である場合が多かったが、血漿安定化に対する効果は小さかった。これらの分子に
よって、血漿安定性に対するそれらの正確な影響を決定する定量的研究がさらに正当化さ
れ得る。

＜ループ２中のアミノ酸骨格修飾を通じて０６−３４−１８バイシクルリード候補のヒト
血漿安定性を改善する＞
アミノ酸骨格修飾は、広く認識された手段であって、これによってペプチド骨格は、プ
ロテアーゼ加水分解から保護され得る（概説については、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ ａｔ
ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，
３１８５−２０３およびＮｅｓｔｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃ
ｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−４１８を参照されたい）。

当該分野で十分確立された方法は、Ｎ−アルキル化すること、例えば、アミノ酸のＮα
をＮ−メチル化することである。表２５ａは、ループ２のアミド骨格をそれらのＮα−メ
チル化対応物で体系的に置き換えることの効果を示す。原理的には、これは、極めて有効
な加水分解保護的な修飾である。なぜならペプチド結合自体がタンパク質分解性の加水分
解から保護されるだけではなく、Ｎα上のメチル基のバルクが、近隣のペプチド結合に保
護的影響も有するからである。実際、ループ２タンパク質分解に対する強力に保護的な効
果は、観察可能であるが、力価は、１００以上の倍数まで常に低下する。Ｄアミノ酸置換
と同様に、Ｎ−アルキル化は、Ｈｉｓ７で切断可能部位を、これがＡｓｐ９またはＬｅｕ
１０に存在する場合でさえ、保護する。

ペプチド骨格を修飾し得る別の手段は、適切なアミノ酸側鎖（ペプトイドと命名）を用
いるＮαのＮアルキル化によって修飾され得る。ホモヒスチジン側鎖を、Ｈｉｓ７のＮα
に導入したが、一方でＨｉｓ７のＣα上の側鎖を同時に除去し、Ｎ−アルキルグリシンを
生じる。この誘導体の構築は、０６−３４−１８の全体的な第２のループの状況内で、図
２０ａに示す（Ｎ−Ｈｉｓ７と命名）。

ペプチド骨格自体の構造を修飾しようとして、ペプチド結合の還元型を、Ｌｅｕ６とＨ
ｉｓ７との間に導入した（図２０ｂ）。ここで、Ｌｅｕ６を、Ａｌａ６で置き換え、この
残基上のカルボニルを、メチレンに還元して、天然のペプチド結合を全く欠く連結を生じ
る。この誘導体は、「還元アミド」または「擬ペプチド結合（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄ
ｅ ｂｏｎｄ）」を指し、ψＣＨ_２ＮＨと命名される。この位置でのカルボニルの非存在
に起因して、このペプチドは、この位置で加水分解できず、ペプチドに対する好ましいプ
ロテアーゼ安定性の特徴を推論すべきである。

血漿アッセイでは、両方のペプチド誘導体（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔ
ｙｒ４ Ｎ−ＨｉｓおよびＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４ Ａｌａ（ψ
ＣＨ_２ＮＨ）６）は、ループ２中で有意に増強された安定性を示した。観察された断片は
、単に、Ａｒｇ５上のループ１中の分解に相当する。力価データは、表２５ｂにまとめら
れる。期待どおり、Ｎ−Ｈｉｓ誘導体は、強力に低下した結合を示した。しかし、擬アミ
ドペプチドＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ｔｙｒ４ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６
）は、１．５ｎＭのＫｄで極めて良好な力価を保持した。

＜ループ１およびループ２の両方での選択的化学修飾による、強力なラットおよびヒト血
漿安定性、交差反応性の二環性ペプチドリードの生成＞
先行する２つの実施例から、いくつかのループ２修飾（良好な力価を提示するが、ルー
プ２中でプロテアーゼ安定性が増強された）を特定した。ラット血漿カリクレインに対す
る適切な力価の保持は、動物モデルでＰＫ／ＰＤを確立するために望ましい。ラット能力
の比較を、適切なループ２安定性増強候補について、表２６ａでまとめた。ほとんどの分
子は、ラット血漿カリクレインに対して１００ｎＭ未満の力価を示す。

実施例１〜６では、０６−３４−１８のループ１が血漿プロテアーゼに対して安定化さ
れ得る方法を開示した。これらの有利な修飾は、ループ２中の血漿安定性増強修飾と組み
合される（実施例７、８）。いくつかの代表的な候補を調製して、ヒト／ラット血漿安定
性、およびヒト／ラット血漿カリクレインに対する力価について評価した（表２６ｂ）。

とりわけ、ほとんどのペプチドディスプレイは、ループ１修飾子と組み合せた場合、ル
ープ２修飾子単独を有するペプチドよりもヒトおよびラットカリクレインに対する力価が
優れている（表２６ａ）。ほとんどの力価は、治療およびＰＫ／ＰＤ目的のためにある範
囲では許容できる（ヒトおよびラットのカリクレインデータを参照されたい、表２６ｂ）
。

ループ１中のＡｒｇ５の代わりに、ＨＡｒｇ５の導入に起因して、およびループ２中の
修飾の導入（Ｈｉｓ７部位でタンパク質分解を低下した）に起因して、表２６ａおよび２
６ｂに示されるペプチドは、ヒトおよびラット血漿の両方で安定性の向上を示すはずであ
る。

血漿安定性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイを用いる前に比較して評価し（方法番号１
および方法番号２）、ペプチド性加水分解の断片の形成を、経時的に観察した（野生型安
定性については、図１８ａ、２１ａ、２１ｂを参照されたい）。野生型ペプチドに比較し
て、多価ペプチドＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ
５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６（ヒト血漿安定性：図２１ｄ、ラット血漿安定性：図２１
ｅ）およびＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ｄ
−Ａｓｐ９（ヒト血漿安定性：図２１ｃ）は、ヒトラット血漿の両方で顕著に向上された
安定性を示す。

まとめると、これによって、０６−３４−１８のループ１およびループ２の両方におけ
る適切な修飾を組み合わせて、高度に強力、交差反応性および血漿安定性の二環性（ｂｉ
ｃｙｃｌｉｃ）ペプチド（これは治療目的に適切なプロファイルを示す）を生じ得ること
が示される。

＜２つのリードペプチド、Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４
ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６およびＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａ
ｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ｄ−Ａｓｐ９の有利なインビボ薬物動態学的特性＞
ペプチドＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａ
ｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６（これは、ループ２中でＡｌａ６とＨｉｓ７との間の親和性向上
性修飾Ａｚｅ３および血漿プロテアーゼ安定性向上性修飾ＨＡｒｇ５および血漿プロテア
ーゼ安定性向上性還元アミド結合を含む）およびＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２
Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ｄ−Ａｓｐ９（これは、ループ２中に親和性向上性修
飾Ａｚｅ３および血漿プロテアーゼ安定性向上性修飾ＨＡｒｇ５およびＤ−Ａｓｐ９を含
む）を、ラット中で薬物動態学的アセスメントについて選択した。Ａｃ−（０６−３４−
１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６の完全な
化学構造を図２２に示す。

両方のペプチドについてのラット循環からのクリアランス速度を評価して、Ａｃ−（０
６−３４−１８）（ＴＭＢ）配列から構成された対照のペプチド（そのアミノ酸は、各々
のそれぞれのＤ−鏡像異性体によって置き換えられた（したがってこの配列は、「（Ａｃ
−ｃｓｗｐａｒｃｌｈｑｄｌｃ−ＮＨ２（ＴＭＢ）である））と比較した。この対照のペ
プチドは同一の原子組成および配列組成を有し、同様の物理化学的特性を保持し、カリク
レイン標的に対する任意の力価を欠き、かつ重要なことにタンパク質分解性活性に対して
完全に耐性である。従って、全Ｄ型の（Ａｌｌ Ｄ）Ａｃ−０６−３４−１８対照ペプチ
ドのラット循環からのクリアランスは、タンパク質分解性によってもたらされるクリアラ
ンスが存在しないので、ほとんど腎臓による。なんらかの最適化されたプロテアーゼ安定
化および強力なカリクレイン阻害性バイシクル（Ｂｉｃｙｃｌｅ）（０６−３４−１８配
列に基づく）は、従って、対照の全Ｄ型の（Ａｌｌ−Ｄ）０６−３４−１８ペプチドと同
様の速度でラット循環から排出されるはずである。

ペプチドを、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに対して、５．２ｍｇ／ｋｇで１．
０２ｍｇ／ｍＬ（２．９％のＤＭＳＯを含む）で、ＰＢＳ緩衝化溶液中で静脈内ボーラス
として適用し、連続の血液試料を、各々の動物から、留置尾静脈カニューレを介して、投
与後、５、１０、２０、３０、６０、１２０、および２４０分間で採取し、血漿生成のた
めにＥＤＴＡチューブに移した。データは、３匹のラットからペプチド「全Ｄ型（ａｌｌ
Ｄ）Ａｃ−０６−３４−１８」について、２匹のラットから「Ａｃ−（０６−３４−１
８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６」について
、および２匹のラットから「Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４
ＨＡｒｇ５ Ｄ−Ａｓｐ９」について、入手した。

次いで、血漿試料を、アセトニトリルおよびメタノールの１：１混合物の３容積で処置
して、沈殿したタンパク質を、遠心分離によって取り出し、その上清をＵＰＬＣ−ＭＳ／
ＭＳによって分析した。

試料中のペプチド含量についての定量は、対照のラット血漿中で調製した較正線を参照
した。薬物動態学的パラメータは、Ｓｕｍｍｉｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅか
らのソフトウェアパッケージＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ２．０を用いてノンコンパートメ
ント分析で決定した。

ペプチド（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５
Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６は、４８分という排出半減期を示したが、対照の全Ｄ型０６−
３４−１８ペプチドは、５４分の半減期で排出された。２つのペプチドについての分布の
容積を比較した（表２７、図２３）。従って、薬理学的に活性な（Ａｃ−（０６−３４−
１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６ペプチド
は、薬理学的に不活性なプロテアーゼ、安定な全Ｄ型０６−３４−１８対照ペプチドと同
じく安定であって、このことは、（Ａｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔ
ｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６が治療剤としてさらなる開発のための好
ましい特性を有することを示す（図２３）。ペプチドＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐｈｅ
２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ｄ−Ａｓｐ９は、さらに迅速に排出されたが、排
出半減期は約２７分であった。

３ペプチドについての静脈内薬物動態学的パラメータは、表２７にまとめられる。

その結果は、ラットのインビボ循環における、ペプチドＡｃ−（０６−３４−１８）Ｐ
ｈｅ２ Ａｚｅ３ Ｔｙｒ４ ＨＡｒｇ５ Ａｌａ（ψＣＨ２ＮＨ）６のタンパク質分解
に対する安定性の向上を強調する。５．８ｍＬ／分／ｋｇでのクリアランスは、ラットで
の公開された腎濾過速度（約８〜９ｍＬ／分／ｋｇ）に極めて近く、このことは、この二
環性（Ｂｉｃｙｃｌｉｃ）ペプチドの血漿プロテアーゼに由来するクリアランスが、実質
上存在しないことを示す［Ｊｏｂｉｎ Ｊ，Ｂｏｎｊｏｕｒ ＪＰ，（１９８５）Ａｍ
Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．；２４８（５Ｐｔ２）：Ｆ７３４−８］。

他に断りがなければ、本発明の実施または検査において、本明細書に記載されている方
法および材料と同様または均等のいずれかの方法および材料を用いることができる。係る
使用に適した方法、機器および材料は、上に記載されている。本明細書において引用され
ているあらゆる刊行物は、本発明に関連して用いることのできる、係る刊行物に報告され
ている方法論、試薬およびツールを説明および開示する目的のため、ここに本明細書の一
部を構成するものとしてその全内容を援用する。

表

Claims (16)

1. ヒトカリクレインに特異的なペプチドリガンドであって、前記ペプチドリガンドが、少
   なくとも２つのループ配列によって隔てられる少なくとも３つの反応性基を含むポリペプ
   チドと、前記ポリペプチドの前記反応性基と共有結合を形成する分子足場とを含み、その
   結果、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成され、前記ペプチド
   リガンドの前記ループが５つのアミノ酸を含み、１つのループがモチーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ
   ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む、ペプチドリガンド。
2. 前記ペプチドリガンドのループが５つのアミノ酸を含み、１つのループがモチーフＧ_ｒ
   ｘＨｘＤＬＧ_ｒを含み、ここでＧ_ｒが反応性基である、請求項１に記載のペプチドリガン
   ド。
3. 前記ペプチドリガンドのループが５つのアミノ酸を含み、１つのループがモチーフＧ_ｒ
   ＴＨｘｘＬＧ_ｒを含み、ここでＧ_ｒが反応性基である、請求項１に記載のペプチドリガン
   ド。
4. ２つの隣接ループが、モチーフＧ_ｒｘ^Ｗ／_ＦＰｘ^Ｋ／_ＲＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴＤＬＧ_ｒを
   含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
5. 表４、表５、表６、表２５ｂ、表２６ａ、表２６ｂまたは図２２に示されるポリペプチ
   ドのうちの１つを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
6. ループ２中のＨｉｓ７の除去、または任意の非荷電もしくは荷電化学物質によるヒスチ
   ジン側鎖の置換が、前記ペプチドリガンドの安定性を向上させる、請求項１〜５のいずれ
   か１項に記載のペプチドリガンド。
7. タンパク質分解に対する安定性が、Ｈｉｓ７に対してＮ末端またはＣ末端に隣接するペ
   プチド結合の化学修飾によって向上する、請求項６に記載のペプチドリガンド。
8. 化学修飾が、α−Ｎ−アルキル化、または還元アミド型のペプチド結合の修飾である、
   請求項７に記載のペプチドリガンド。
9. タンパク質分解に対する安定性が、Ｈｉｓ７に隣接するアミノ酸の立体障害によって向
   上する、請求項６に記載のペプチドリガンド。
10. 前記立体障害が、位置９のそのＤアミノ酸鏡像異性体またはα−Ｎ−アルキル化での置
    換から生じる、請求項９に記載のペプチドリガンド。
11. タンパク質分解に対する安定性が、位置６での立体障害アミノ酸の導入によって向上す
    る、請求項６に記載のペプチドリガンド。
12. タンパク質分解に対する安定性が、位置６でのフェニルグリシンまたはシクロヘキシル
    グリシンのなどのＣβ誘導体化アミノ酸の導入によって向上し、それによりヒト血漿カリ
    クレインに対するペプチドリガンド配列の力価が向上し、Ｃ末端ペプチド結合の前記タン
    パク質分解加水分解が低下する、請求項６に記載のペプチドリガンド。
13. １つまたは複数の非天然のアミノ酸置換を含み、プロテアーゼ分解に耐性である、請求
    項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
14. 前記ポリペプチドが、モチーフＧ_ｒｘＷＰＡＲＧ_ｒまたはＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒを含む第
    １のループと、モチーフＧ_ｒ ^Ｔ／_ＬＨ^Ｑ／_ＴｘＬＧ_ｒを含む第２のループとを含む、請求
    項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
15. 前記第１のループＰｒｏが、アゼチジンカルボン酸で置き換えられており、および／ま
    たは第１のループＲが、Ｎ−メチルアルギニンで置き換えられており、および／またはＲ
    が、ホモアルギニンで置き換えられており、および／またはＲが、グアニジルフェニルア
    ラニンで置き換えられている、請求項１５に記載のペプチドリガンド。
16. 前記ポリペプチドが、モチーフＧ_ｒｘＦＰＹＲＧ_ｒを含む第１のループを含み、ここで
    Ｒが、Ｎ−メチルアルギニンで置換されており、および／またはＲがホモアルギニンで置
    換されており、および／またはＲがグアニジルフェニルアラニンで置換されており、Ｐｒ
    ｏがアゼチジンカルボン酸で置換されている、請求項１６に記載のペプチドリガンド。