CN105307686B - 结构化多肽特异性的调控 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了对人血浆激肽释放酶特异的肽配体。

Description

结构化多肽特异性的调控
技术领域
本发明涉及共价连接至分子支架的多肽，其中两个或更多个肽环在支架的附着点之间相对。特别地，本发明描述了对人蛋白酶血浆激肽释放酶特异的、并且在一个或两个肽环中存在修饰以增强效能和/或蛋白酶抗性的肽。
背景技术
环状肽能够以高亲和性和靶标特异性的方式结合蛋白靶标，因而是用于治疗开发的有吸引力的分子类型。实际上，数个环状肽已经成功用于临床，例如，如抗菌肽万古霉素，免疫抑制药物环孢霉素或抗癌药物奥曲肽(Driggers等人,Nat Rev Drug Discov 2008,7(7),608-24)。良好的结合特性来自肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面，以及降低的环状结构构象柔性。典型地，大环结合数百平方埃的表面，例如，环状肽CXCR4拮抗剂CVX15(400Wu,B等人,Science 330(6007), 1066-71)、结合整合素αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的环状肽(355)(Xiong,J. P.,等人,Science 2002,296(5565),151-5)、或结合尿激酶型纤溶酶原激活物的环状肽抑制剂upain-1(603Zhao,G.,等人,J Struct Biol2007,160(1),1-10)。
由于其环状构型，肽大分子比线性肽柔性低，导致了在结合靶标时熵损失较少，得到了较高的结合亲和性。降低的柔性还导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比增加了结合特异性。该效果已经被基质金属蛋白酶8(MMP-8)有效的选择性抑制剂例证了，其中当其环打开时，失去了对其它MMP的选择性(Cherney,R. J.,等人,J Med Chem 1998,41(11),1749-51)。通过大环化实现的有利的结合特性，甚至在具有一个以上肽环的多环肽中更显著，例如，在万古霉素、乳酸链球菌肽或放线菌素中。
先前不同的研究小组将带有半胱氨酸残基的多肽连接至合成的分子结构上(Kemp,D.S和McNamara,P.E.,J.Org.Chem,1985；Timmerman,P.等人, ChemBioChem,2005)。Meloen和同事使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速且定量地环化至合成的支架上，用于蛋白表面的结构化模拟(Timmerman,P. 等人,ChemBioChem,2005)。生成候选药物化合物的方法公开于WO 2004/077062 和WO 2006/078161中，其中通过将含有半胱氨酸的多肽连接至例如三(溴甲基) 苯的分子支架生成所述化合物。
WO2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。特别地，该文献公开了包括第一和第二反应基团的各种支架分子，以及使所述支架与另外的分子接触，在偶联反应中，在支架和另外的分子之间形成至少两个连接。
WO 2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和模拟肽。该文献公开了人工合成来自现有蛋白的各种肽集合。然后将这些肽与具有某些引入氨基酸改变的恒定合成肽组合，以生成组合文库。通过由化学连接将该多样性引入以区分各种氨基酸改变为特征的肽，为发现希望的结合活性提供了增加的机会。该文献的图1表示代表各种环肽构建体的合成的示意图。该文献中公开的构建体依赖-SH 功能化肽，典型地包含半胱氨酸残基，和支架上的杂芳基，典型地包含苄基卤取代基如二或三溴苯基苯。这样的基团发生反应，从而在肽和支架之间形成硫醚连接。
我们最近开发了基于噬菌体展示的组合方法，用于产生和筛选兴趣靶标的双环肽的大文库(Heinis,等人,Nat Chem Biol 2009,5(7),502-7；还参见国际专利申请 WO2009/098450)。简言之，含三个半胱氨酸残基和两个区域的六个随机氨基酸 (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的线性肽组合文库在噬菌体上展示，通过半胱氨酸侧链共价连接至小分子(三(溴甲基)苯)进行环化。在对人蛋白酶组织蛋白酶G 和血浆激肽释放酶(PK)的亲和性选择中分离的双环肽具有纳摩尔级的抑制常数。最好的抑制剂PK15以3nM的Ki抑制人PK(hPK)。在数个分离双环肽的氨基酸序列中的相似性表明两个肽环均对结合有贡献。在最高测试浓度(10μM)下，PK15 即不抑制大鼠PK(81％序列同一性)，也不抑制同源的人丝氨酸蛋白酶因子XIa (hfXIa；69％序列同一性)或凝血酶(36％序列同一性)(Heinis,等人,Nat ChemBiol 2009,5(7),502-7)。这一发现表明双环抑制剂是高度特异的，其它人胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶不被抑制。具有上述效能和靶标选择性的合成小肽抑制剂(如PK15) 具有用作治疗剂来控制遗传性血管性水肿中PK活性的潜力或防止心肺分流术中的接触激活，其中遗传性血管性水肿是威胁生命的疾病，其特征为水肿的反复发作。
肽PK15分离自基于肽PK2、H-ACSDRFRNCPLWSGTCG-NH2的文库，其中第二个6-氨基酸环是随机的。PK15的序列是H-ACSDRFRNCPADEALCG-NH2，并且对人激肽释放酶的IC50结合常数是1.7nM。
发明内容
我们分析了激肽释放酶结合试剂，以便对结合亲和性和活性进行最优化。在我们同样待决的未公开的专利申请PCT/EP2012/069898中，描述了选择性的双环肽配体，它是人血浆激肽释放酶的抑制剂。
在此处描述的一个实施方式中，肽配体的环包含五个氨基酸，并且第一环包括基序GrxW/FPxK/RGr，其中Gr是反应基团。在本上下文中，提及“第一”环时，并不一定指序列中环的特定位置。但是，在某些实施方式中，第一环可以是在氨基端至羧基端肽序列中的近端环。例如，多肽进一步包含第二远端环，远端环含有基序Gr T/LHQ/TxLGr。第一环序列的示例包括GrxWPARGr、GrxWPSRGr、 GrxFPFRGr和GrxFPYRGr。在这些示例中，x可以是任何氨基酸，然而，例如是S 或R。
例如，多肽可以是表4、表5或表6所示多肽之一。
反应基团能够是反应性氨基酸。例如，反应性氨基酸是半胱氨酸。
可通过鉴定可用于突变的那些残基并通过制备在那些位置上包含突变的文库，制备多肽变体。例如，表4、图5、6中的多肽06-56可在位置Q4和T10突变，而不损失活性(参见以下实施例)。可选择在这些位置含有突变的多肽配体，该多肽配体与06-56相比具有改进的结合活性。
对于激肽释放酶抑制性双环，其对获得足够的蛋白酶稳定性谱是适当的，从而其在血浆或其它相关环境中具有低的蛋白酶所驱动的清除。在观察大鼠血浆中母体肽的进展性消失的快速可比较的血浆稳定性试验中(方法#1)，发现N端丙氨酸(其存在于选择时，原本包含在前导序列的合成肽中)从大鼠和人血浆中测试的所有双环序列中被快速移除。通过合成不含N和C端丙氨酸的前导候选物可避免该降解。为了移除潜在的氨基肽酶和羧基肽酶的识别位点，现在位于前导候选物Cys1上的游离氨基端在肽合成期间被醋酸酐加帽，产生了N端乙酰化的分子。在等同的测量中，C端半胱氨酸作为酰胺被合成，从而移除潜在的羧基肽酶识别位点。
因而，在一个实施例中，双环前导候选物具有下述通用序列：
Ac-C1AA1AA2AAnC2AAn+1AAn+2AAn+3C3(TMB)-NH2
其中“Ac”指N-端乙酰化，“-NH2”指C端酰胺化，其中“C1、C2、C3”指序列中的第一、第二和第三半胱氨酸，其中“AA1”至“AAn”指氨基酸的位置(其性质“AA”通过上述选择定义)，其中“(TMB)”指已经被TBMB(三溴甲基苯) 或任何其它合适的反应支架环化的肽序列。
在本上下文中，前导肽“Ac-(06-34-18)(TMB)”和“Ac-(06-34-18)(TMB)Phe2Tyr4”分别具有序列Ac-CSWPARCLHQDLC-NH2和Ac-CSFPYRCLHQDLC-NH2。根据上述体系，这些可以编号为：
1)Ac-C1 S1W2P3A4R5 C2 L6H7Q8D9L10 C3 -NH2
注释为Ac-(06-34-18)(TMB)
2)Ac-C1 S1F2P3Y4R5 C2 L6H7Q8D9L10 C3 -NH2
注释为Ac-(06-34-18)(TMB)Phe2 Tyr4
其中，不变的半胱氨酸以下划线表示。这些肽已经得以详细地表征，并显示对激肽释放酶具有亚-纳摩尔的效能，对激肽释放酶同源蛋白具有非常有利的选择性谱，同时对大鼠激肽释放酶保留良好的交叉反应性。后者对于在动物模型中建立药代动力学是有价值的。
未修饰的肽Ac-06-34-18(TMB)-NH2在大鼠血浆中具有2.3小时的半衰期，而 Ac-06-34-18(TMB)-NH2Phe2 Tyr4的半衰期略短，为0.9小时(表1)。在鉴定 Ac-06-34-18(TMB)-NH2中蛋白酶解识别位点的努力中，随着时间对大鼠血浆中的肽进行取样(方法#1)，并且使用MALDI-TOF质谱分析每个样本中肽片段的进展性出现。这揭示，环1中的Arg5是蛋白酶识别和随后肽降解的主要位点。
进行化学合成的方法，来鉴定足以保护肽免受大鼠血浆蛋白酶降解的精氨酸5 取代。发现去除环1中的Arg5、或者将Arg侧链取代为任何不带电的或带电的化学实体，增强肽配体的稳定性。
而且，通过对靠近Arg5的N或C端的肽键进行化学修饰来增强蛋白酶解稳定性。例如，化学修饰是α-N-烷基化、或用还原的酰胺形式进行的肽键修饰。
在一个实施方式中，通过临近的氨基酸对Arg5的空间位阻增强蛋白酶解稳定性。例如，α-N-烷基化导致空间位阻。
然后，评价这些双环肽候选物的如下性质：
1)维持针对人激肽释放酶的效能(找到10nM或更低的Ki)；
2)维持针对大鼠激肽释放酶的效能(找到50nM或更低的Ki)；
3)在大鼠血浆中增强的稳定性(和野生型肽相比，期望更大的t1/2)
4)维持针对其它激肽释放酶相关酶和蛋白的选择性谱。
在PCT/EP2012/069898中的研究过程中，确定如下精氨酸修饰或模拟物 (mimics)满足上述4个原则，这些是：
a)4-胍基苯丙氨酸(4-GuanPhe：在大鼠血浆中t1/2提高：1-5倍)；
b)高精氨酸(HArg：在大鼠血浆中t1/2提高：约2-5倍)；以及
c)α-N-甲基精氨酸(NMe-Arg：在大鼠血浆中t1/2提高：>10倍)。
我们发现某些非天然氨基酸允许以nM的Ki结合血浆激肽释放酶，同时显著增加血浆中的停留时间。数据总结在表1和图17中。
而且，PCT/EP2012/069898还公开了06-34-18中位置3的其他修饰，其中脯氨酸取代为氮杂环丁烷羧酸(Aze3)。这种修饰，很可能是由于它更大的限制和降低的熵，总是将基于06-34-18的肽的效能增强2至5倍(factor)(表1)。结合位于Arg5的增强稳定性的修饰(尤其是，HArg、NMe-Arg和4GuanPhe)，获得了更强效的双环肽衍生物。
示例性的非天然氨基酸选自N-甲基精氨酸、高精氨酸和羟基脯氨酸。精氨酸的N-甲基和同源(homo-)衍生物用于取代精氨酸，例如脯氨酸3可被羟基脯氨酸、氮杂环丁烷羧酸或α-取代的氨基酸(如氨基异丁酸)取代。在另一个实施方式中，精氨酸被胍基-苯丙氨酸取代。
在一个实施方式中，多肽包括含有基序GrxWPARGr的第一环，其中P被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代；和/或 R被胍基-苯丙氨酸取代。
在一个实施方式中，多肽包含含有基序GrxFPYRGr的第一环，其中R被N- 甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代，其中脯氨酸被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或R被胍基-苯丙氨酸取代。
现在，我们对PCT/EP2102/069898中所用的方法进行了开发，并如此处所述，正如应用到第二环的优化。根据本发明，我们鉴定了环2中额外的蛋白酶识别位点，它位于06-34-18序列中的组氨酸7。这种残基尤其被包含在离体人血浆中的蛋白酶所识别。而且，这种位点还被大鼠的膜结合蛋白酶所识别，正如在体内大鼠药代动力学研究中确定的。因此，对于06-34-18，为了实现治疗性目的所需的合适的药代动力学稳定性谱，应该稳定两个蛋白酶识别位点(环1中的Arg5和环2中的His7)从而使肽耐受人血浆蛋白酶，且耐受在大鼠和人的体内所遇见的蛋白酶解侵袭性环境。
因此，在第一方面，本发明提供特异于人激肽释放酶的肽配体，其包含多肽，所述多肽含有被至少两个环序列分开的至少三个反应基团和与多肽的反应基团形成共价键的分子支架，从而在分子支架上形成至少两个多肽环，其中肽配体的环包含五个氨基酸，并且一个环包含基序Gr T/LHQ/TxLGr。
在肽06-34-18的上下文中，这个环是第二环，位于相对于第一环的C端。
例如，基序是GrxHxDLGr，其中Gr是反应基团。例如，基序GrTHxxLGr。
在一个实施方式中，多肽的两个临近的环包含基序GrxW/FPxK/RGr T/LHQ/TDLGr。
这种多肽的示例如表4、表5或表6中所示。
在第二方面，本发明涉及本发明的第一方面所述的肽配体，其中去除环2中的His7，或用任何不带电或带电的化学实体取代组氨酸侧链，以增强肽配体的稳定性。
例如，通过对靠近His7的N或C端的肽键进行化学修饰增强蛋白酶解稳定性。例如，化学修饰是α-N-烷基化、或用其还原的酰胺形式进行的肽键修饰。
在一个实施方式中，通过临近的氨基酸对His7的空间位阻增强蛋白酶解稳定性。例如，将位置9取代为它的D-氨基酸对映异构体、或者α-N-烷基化导致空间位阻。
在另一个实施方式中，通过在位置6引入空间位阻性的氨基酸增强蛋白酶解稳定性。例如，通过在位置6引入Cβ-衍生的氨基酸(比如苯基甘氨酸或环己基甘氨酸)增强蛋白酶解稳定性，Cβ-衍生的氨基酸增强肽配体序列对人血浆激肽释放酶的效能并降低C端肽键的蛋白酶解水解。
本发明的教导能够和PCT/EP2012/06989的教导相组合，从而根据本发明的多肽可包含第一环和第二环，所述第一环包含基序GrxWPARGr或GrxFPYRGr，所述第二环包含基序Gr T/LHQ/TxLGr。
在一个实施例中，在第一环中Pro 3被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或Arg 5被 N-甲基精氨酸取代；和/或Arg 5被高精氨酸取代；和/或Arg 5被胍基苯丙氨酸取代。
附图说明
图1双环肽的噬菌体选择。(a)双环肽噬菌体文库。随机氨基酸表示为“X”，丙氨酸表示为“A”，以及恒定的三个半胱氨酸残基表示为“C”。(b)具有3、 5或6个氨基酸的环的化学合成双环肽结构的模式。由三个半胱氨酸侧链将线性肽连接至三(溴甲基)苯(TBMB)产生所述结构。在双环肽中变异氨基酸由“Xaa”表示。(c-e)从文库5x5(c)，文库3x3 A(d)和文库3x3 B(e)分离的双环肽的序列。通过阴影突出显示氨基酸的相似性。
图2比较hPK的表面氨基酸和同源丝氨酸蛋白酶。(a)带有表面表征的hPK (PDB进入2ANW)结构。暴露于表面的氨基酸原子和比4、8和更靠近结合S1口袋的苯甲脒(灰色)的氨基酸原子染色更深。(b)hPK的结构。突出了 hfXIa中不同的氨基酸侧链。(c)hPK结构。突出了rPK中不同的氨基酸侧链。
图3绘图表示用于确定多肽配体中对于突变优选的残基的方法。
图4在2nM下，肽与血浆激肽释放酶结合中分析肽06-34中的氨基酸取代(表 4)。对于各位置，表明了与母体序列相比，在该位置不同突变的作用。
图5在2nM下，肽与血浆激肽释放酶结合中分析肽06-56中的氨基酸取代(表 4)。对于各位置，表明了与母体序列相比，在该位置不同突变的作用。
图6在10nM下，肽与血浆激肽释放酶结合中分析肽06-56中的氨基酸取代 (表4)。对于各位置，表明了与母体序列相比，在该位置不同突变的作用。
图7表明了在t0、第1、2和3天暴露于35％大鼠血浆后Ac-06-34-18(TMB)-NH2 的质谱的质谱输出(方法#1)。由于干扰离子和片段的低浓度，质量精确性多少会有不同；但是，鉴定离散的蛋白水解片段是可能的。
图8暴露于大鼠血浆后鉴定的Ac-06-34-18(TMB)-NH2的代谢物M1、M2、 M3的化学结构。
图9 Ac-06-34-18(TMB)-NH2前导物(lead)的化学结构。
图10 Ac-06-34-18(TMB)-NH2前导物和其第一环乱序重排(scrambled)衍生物对激肽释放酶的酶抑制试验。观察到亲和性的急剧降低，显示WPAR药效团完整性的重要性。
图11精氨酸及其类似物的化学结构。
图12 Trp和潜在疏水类似物的化学结构。
图13 Pro和潜在的限制类似物的化学结构。
图14 Aze3、NMeArg5和双修饰Ac-06-34-18(TMB)-NH2的可比较的激肽释放酶抑制。
图15丙氨酸及其衍生物的化学结构。
图16 F2Y4、F2Y4 HR5和双修饰Ac-06-34-18(TMB)-NH2的可比较的激肽释放酶抑制。
图17 Ac-(06-34-18)中环1修饰的化学结构，其赋予有利的大鼠血浆稳定性和/或增强效能(Aze3取代Pro3、4GuanPhe取代Arg5、HArg取代Arg5、NMe-Arg5 取代Arg5)。
图18a野生型肽接触人血浆。注意到出现去除了His7-Gln8、Leu6和 Leu6-His7-Gln8的片段。由于MALDI-TOF的性质，信号强度并不是定量的。序列中可能的水解位点以图中的箭头表示，通过序列上方的水平箭头表示随后降解的方向。
图18b Arg5N-甲基化06-34-18接触人血浆。这种肽在大鼠血浆中具有增强的稳定性。然而，所述肽在人血浆中是不稳定的，正如出现了环2中缺乏His7-Gln8、 Leu6和Leu6-His7-Gln8的片段所证实的。由于MALDI-TOF的性质，信号强度并不是定量的。
图19a 06-34-18的环2的化学结构。
图19b环2中位置6所采用的结构的概要。非标准的氨基酸缩写在方法和表 7中定义。
图19c环2中位置7所采用的结构的概要。非标准的氨基酸缩写在方法和表 7中定义。
图19d环2中位置8所采用的结构的概要。非标准的氨基酸缩写在方法和表 7中定义。
图20a 06-34-18的环2中N-His类肽(peptoid)的结构。在Nα引入高组氨酸侧链，而Cα失去它的手性中心。
图20b 06-34-18的环2中位置6和7之间还原酰胺的结构。亚甲基取代羰基，去除了易断裂的肽键。
图21a野生型(06-34-18)在t＝0、21和46小时的时候在人血浆中可比较的稳定性。
图21b野生型(06-34-18)在t＝0、21和46小时的时候在大鼠血浆中可比较的稳定性。
图21c(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9在t＝0、21和46小时的时候在人血浆中可比较的稳定性。
图21d Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6在t＝0、 21和46小时的时候在人血浆中可比较的稳定性。
图21e Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6在t＝0、 21和46小时的时候在大鼠血浆中可比较的稳定性。
图22 Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6的完整化学结构。所有的氨基酸都是L-对映异构体形式。
图23和蛋白酶解稳定的但药理学上惰性的Ac-(06-34-18)全D-对映异构体相比，肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6和Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3Tyr4 HArg5 D-Asp9的大鼠药代动力学分析。注意到，Ac-(06-34-18) Phe2 Aze3 Tyr4HArg5 Ala(ψCH2NH)6的清除非常类似D氨基酸对照肽“Ac- (06-34-18)全D”的清除。水平虚线表示每个相应肽的定量限。
具体实施方式
除非另有定义，所有用于文中的技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同涵义，如肽化学领域、细胞培养和噬菌体展示领域、核酸化学和生物化学领域。用于分子生物学、遗传学和生物化学方法的标准技术(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版,John Wiley&Sons,Inc.)引入文中作参考。
如文中引用的肽配体，指与分子支架共价连接的肽。典型地，该肽含有两个或更多能够与支架形成共价键的反应基团，以及在所述反应基团之间相对 (subtended)的序列，其被称为环序列，因为当肽和支架结合时，其形成环。在本情况中，肽包含至少三个反应基团，并在支架上形成至少两个环。
反应基团是能够与分子支架形成共价键的基团。典型地，反应基团存在于肽的氨基酸侧链上。实例是含有氨基的基团，如半胱氨酸、赖氨酸和硒代半胱氨酸。
在本文的上下文中，特异性指配体结合或与其同类(cognate)靶标相互作用、而排除与所述靶标相似的实体的能力。例如，特异性可以指配体抑制人酶的相互作用、但不抑制来自不同物种的同源酶的相互作用的能力。使用文中描述的方法，可以调控(即增加或降低)特异性，从而使配体与预期靶标的同系物或旁系物的相互作用能力更强或更弱。特异性与活性、亲和性或活力并不是同义词，配体对其靶标的作用效能(如，例如结合亲和性或抑制水平)并不一定与其特异性相关。
如文中使用的结合活性，指来自结合试验的定量结合测量，例如文中所描述的。因而，结合活性指在给定靶标浓度下结合的肽配体的量。
多特异性是结合两个或更多靶标的能力。典型地由于其构象特征，结合肽能结合单一靶标，如抗体情况中的表位。但是可开发能结合两个或更多靶标的肽；例如，如以上提到的本领域中已知的双特异抗体。本发明中，肽配体能结合两个或更多靶标，因此是多特异性的。例如，其结合两个靶标，是双特异性的。结合可以是独立的，这意味着在肽上对靶标的结合位点不被一个或另一个靶标结合所结构性地阻碍。在这样的情况中，两个靶标可独立地结合。更一般的是，可预期一个靶标的结合将至少部分地阻碍另一个的结合。
双特异性配体和具有包括两个相关靶标特异性的配体之间存在根本的差异。在第一种情况中，配体分别对两个靶标有特异性，以特异的方式与每个靶标相互作用。例如，配体中的第一环可以结合第一靶标，第二环结合第二靶标。在第二种情况中，因为其不能区分两个靶标，所以配体是非特异性的，例如其通过与两个靶标共同的靶标表位相互作用。
在本发明的上下文中，例如，对靶标和直系同源物具有活性的配体有可能是双特异配体。但是，在一个实施方式中，配体不是双特异性的，但是其特异性的精度较低，因而其结合靶标和一个或多个直系同源物。一般地，没有被选择针对靶标和其直系同源物的配体不太可能因为调控环长度而是双特异性。
如果配体确实是双特异性，在一个实施方式中，配体靶标特异性的至少一种将是所选配体中共同的，且可通过文中公开的方法调控该特异性水平。第二或其它特异性没有必要是共享的，也不需要是文中所示过程的对象。
靶标是肽配体结合、或与肽配体相互作用的分子或其部分。尽管结合被看作大多数活性类型的首要条件，其自身就是一种活性，还可以设想其它活性。因而，本发明不需要测量直接或间接结合。
分子支架是能够在多个点上连接肽以便给予肽一种或多种结构特性的任何分子。其不是交联剂，因为其不只是取代二硫键；相反，其为肽提供了两个或更多附着点。适当地，分子支架包含至少三个肽的附着点，称为支架反应基团。这些基团能够与肽上的反应基团反应，形成共价键。优选的分子支架的结构如下所述。
根据本领域公知的方法进行结合活性(或任何其它希望的活性)的筛选，例如来自噬菌体展示技术。例如，固定于固相的靶标可用于鉴定和分离组库 (repertoire)的结合成员。筛选能够根据希望的特征选择组库的成员。
术语文库指异源多肽或核酸的混合物。文库由不同的成员组成。从这个意义上讲，文库是组库的同义词。文库成员间序列差异决定了文库中存在的多样性。该文库可以采用多肽或核酸简单混合物的形式，或者可以是用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。在某些条件下，每个单独的生物体或细胞仅含有一个或数量有限的文库成员。
在一个实施方式中，为了允许表达核酸编码的多肽，将核酸引入表达载体中。因而，在一个优选的方面，文库可以是宿主生物体群的形式，各生物体含有一个或多个表达载体的拷贝，所述表达载体含有核酸形式的文库的单一成员，该核酸可被表达以生成对应的多肽成员。因而，宿主生物体群具有编码遗传多样的多肽变体的大组库的潜能。
在一个实施方式中，核酸的文库编码多肽组库。典型地，文库的各核酸成员具有与文库中一个或多个其它成员相关的序列。通过相关的序列，指与文库的至少一个其它成员具有至少50％同一性、例如至少60％同一性、例如至少70％同一性、例如至少80％同一性、例如至少90％同一性、例如至少95％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的氨基酸序列。可在跨越至少3个氨基酸，例如，至少4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，例如至少12个氨基酸，例如至少 14个氨基酸，例如至少16个氨基酸，例如至少17个氨基酸，或全长参照序列的连续节段上判断同一性。
组库是变体集合，在本文的情况中是多肽变体，其序列不同。典型地，反应基团的位置和性质将不变，但是在其之间形成环的序列可以是随机的。组库的大小是不同的，但应当认为其包含至少102个成员。可以构建1011或更多成员的组库。
如文中使用的，一套(a set of)多肽配体，指可被用于文中所述方法中的选择中的多种多肽配体。可能地，一套可以是组库，但其也可以是小的多肽集合，从至少2个多至10、20、50、100或更多。
如文中使用的，一组(a group of)多肽配体，指两个或更多配体。在一个实施方式中，一组配体仅包含共有至少一个靶标特异性的配体。典型地，一组由至少2、3、4、5、6、7、8、9或10、20、50、100或更多配体组成。在一个实施方式中，一组由2个配体组成。
(A)肽配体的构建
(i)分子支架
分子支架描述于，例如WO2009098450中，以及描述于其中引用的文献，特别是WO2004077062和WO2006078161中。
如先前的文献中注意到的，分子支架可以是小分子，如小的有机分子。
在一个实施方式中，分子支架可以是，或者可以是基于天然单体，如核苷、糖或甾体。例如，分子支架可以包含这样的实体的短聚合物，如二聚物或三聚物。
在一个实施方式中，分子支架是毒性已知的化合物，例如，低毒性的化合物。合适的化合物的实例包括胆固醇、核苷酸、甾体或现有的药物，如tamazepam。
在一个实施方式中，分子支架可以是大分子。在一个实施方式中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方式中，分子支架包含能够与多肽官能团反应、形成共价键的反应基团。
分子支架可以包括化学基团如胺、巯基、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤和酰基卤。
在一个实施方式中，分子支架可以包含、或可以由三(溴甲基)苯组成，特别是1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)或其衍生物。
在一个实施方式中，分子支架是2,4,6-三(溴甲基)三甲基苯。其与1,3,5-三 (溴甲基)苯类似，但是含有额外的三个附着于苯环的甲基。其优点是额外的甲基可形成与多肽进一步的接触，因而增加了额外的结构性限制。
本发明的分子支架含有化学基团，该化学基团允许本发明编码文库的多肽的官能团与分子支架形成共价键。所述化学基团选自大范围的官能基，包括胺、巯基、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤和酰基卤。
(ii)多肽
可通过天然或非天然氨基酸的侧链提供多肽的反应基团。多肽的反应基团可选自巯基、氨基、羧基、胍基、酚基或羟基。多肽的反应基团可选自叠氮化物、酮羰基、炔基、烯基或芳基卤基团。用于连接分子支架的多肽反应基团可以是多肽的氨基或羧基端。
在某些实施方式中，用于连接分子支架的各多肽反应基团是相同类型的。例如，各反应基团可以是半胱氨酸残基。进一步的细节在WO2009098450中提供。
在某些实施方式中，用于连接分子支架的反应基团可以包含两个或更多不同的类型，或可以包含三个或更多不同的类型。例如，反应基团可以包含两个半胱氨酸残基和一个赖氨酸残基，或包含一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基和一个 N-端胺。
可采用半胱氨酸，是由于其具有最不同于所有其它氨基酸的反应性的优点。可用于分子支架上与半胱氨酸的巯基反应的支架反应基团是烷基卤(或也称为卤代烃或卤代烷)。实例是溴甲基苯(由TBMB示例的支架反应基团)或碘乙酰胺。用于选择性地将化合物偶联至蛋白中半胱氨酸的其它支架反应基团是马来酰亚胺。可用作本发明中分子支架的马来酰亚胺的实例包括：三-(2-马来酰亚胺乙基) 胺、三-(2-马来酰亚胺乙基)苯、三-(马来酰亚胺基)苯。硒代半胱氨酸也是天然氨基酸，其具有与半胱氨酸相似的反应性，可用于相同的反应。因而，除非上下文特别指明，无论在哪儿提及半胱氨酸，典型地可认为其可取代硒代半胱氨酸。
赖氨酸(和肽N端的伯胺)也适合作为反应基团通过连接分子支架修饰噬菌体上的肽。但是，在噬菌体蛋白中其比半胱氨酸更丰富，噬菌体颗粒可能交联或可能损失其感染性的风险更高。然而，已经发现赖氨酸尤其可用于分子内部反应中(如，当分子支架已经连接到噬菌体肽时)从而与分子支架形成第二或连续的连接。在该情况中，分子支架优选与展示肽的赖氨酸反应(特别是，非常接近的赖氨酸)。选择性地与伯胺反应的支架反应基团是琥珀酰亚胺、醛、或烷基卤。在许多随附的实施例中使用的溴甲基基团中，苯环的电子可稳定阳离子过渡状态。因而，该特定的芳基卤比烷基卤反应性高100-1000倍。用作分子支架的琥珀酰亚胺的实例包括三-(琥珀酰亚胺基氨基三乙酸)、1,3,5-苯基三乙酸。用作分子支架的醛的实例包括三甲酰基甲烷。用作分子支架的烷基卤的实例包括1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三甲基苯、1,3,5-三(溴甲基)苯、1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙基苯。
带有用于连接分子支架的反应基团的氨基酸可位于多肽中任何合适的位置。为了影响生成的特定结构或环，带有反应基团的氨基酸的位置可根据技术操作人员而不同，例如，为了使生成的多肽发生突变，可通过操作编码多肽的核酸。通过这种手段，可根据本文的教导操作环长度。
例如，多肽可以包含序列AC(X)nC(X)mCG，其中X代表随机的天然氨基酸， A代表丙氨酸，C代表半胱氨酸，G代表甘氨酸，以及n和m可以相同或不同，是3至6之间的数。
(iii)多肽的反应基团
本发明的分子支架可以通过多肽上的官能或反应基团键合至多肽。其典型地从多肽聚合物中存在的特定氨基酸的侧链形成。这样的反应基团可以是半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链、或N端氨基或任何其它适合的反应基团。再一次地，细节可参见WO2009098450。
天然氨基酸反应基团的实例是半胱氨酸的巯基，赖氨酸的氨基，天冬氨酸或谷氨酸的羧基，精氨酸的胍基，酪氨酸的酚基或丝氨酸的羟基。非天然氨基酸可提供更宽范围的反应基团，包括叠氮化物、酮-羰基、炔烃、乙烯基(vinyl)、或芳基卤基团。多肽末端的氨基和羧基还可以作为反应基团与分子支架/分子核心形成共价键。
本发明的多肽含有至少三个反应基团。所述多肽还可以含有四个或更多反应基团。使用的反应基团越多，在分子支架中可形成越多的环。
在一个优选的实施方式中，生成带有三个反应基团的多肽。所述多肽与带有三倍旋转对称的分子支架/分子核心反应生成单一产物异构体。出于几个原因，单一产物异构体的生成是有利的。化合物文库的核酸仅编码多肽的一级序列，但是并不编码多肽与分子核心反应时所形成的分子异构状态。如果仅形成一个产物异构体，向产物异构体的核酸指定就清楚限定了。如果形成多个产物异构体，核酸就不能给出关于筛选或选择过程中分离的产物异构体性质的信息。如果合成本发明文库的特定成员，单一产物异构体的形成也是有利的。在此情况中，多肽与分子支架的化学反应产生了单一产物异构体，而不是异构体的混合物。
在本发明的另一个实施方式中，产生具有四个反应基团的多肽。所述多肽与带有四面体对称的分子支架/分子核心反应生成两个产物异构体。尽管两个不同的产物异构体由一个相同的核酸编码，可通过化学合成两个异构体、分离两个异构体、以及检测两个异构体对靶标配体的结合来确定分离的异构体的异构体性质。
在本发明的一个实施方式中，多肽反应基团的至少一个对其余反应基团是正交的。使用正交反应基团允许将所述正交反应基团引导至分子核心的特定位点。可以使用涉及正交反应基团的连接策略来限制形成的产物异构体的数量。换言之，通过针对至少三个键的一个或多个选择与针对至少三个键中其余的所选反应基团差异或不同的反应基团，可以有用地实现特定顺序的键合或将多肽的特定反应基团引导至分子支架上的特定位置。
在另一个实施方式中，本发明多肽的反应基团与分子接头反应，其中所述接头能够与分子支架反应，从而所述接头将在最终键合状态下介于分子支架和多肽之间。
在某些实施方式中，多肽文库或套的成员氨基酸可以被任何天然或非天然氨基酸取代。从这些可互换氨基酸中排除的是，携带将多肽交联至分子核心的官能团的那些，因而单独的环序列是可互换的。可互换多肽序列可具有随机序列、恒定序列或带有随机和恒定氨基酸的序列。带有反应基团的氨基酸也可以位于多肽中限定的位置，因为这些氨基酸的位置决定了环的大小。
在一个实施方式中，带有三个反应基团的多肽具有序列(X)lY(X)mY(X)nY(X)o, 其中Y代表带有反应基团的氨基酸，X代表随机氨基酸，m和n是3和6之间的数值，其定义了插入多肽节段的长度，其可以相同或不同，以及I和o是0和20 之间的数值，定义了侧翼多肽节段的长度。
可使用巯基介导的缀合的替代物通过共价相互作用将分子支架附着至肽。可替换地，在根据本发明选择或分离多肽后，这些技术可用将进一步的半簇(如，不同于分子支架的感兴趣的小分子)修饰或附着至多肽，-在这样的实施方式中，而后很明显附着不需要是共价的，可以包括非共价的附着。可使用这些不是巯基介导方法(或者与巯基介导的方法组合)的方法，所述方法通过产生展示带有非天然氨基酸的蛋白和肽的噬菌体(所述非天然氨基酸具有必需的化学反应基团) 组合带有互补反应基团的小分子进行，或者所述方法通过在选择/分离相后生成分子时，将非天然氨基酸引入化学或重组合成的多肽中进行。更多细节可参见 WO2009098450或Heinis,等人,Nat Chem Biol 2009,5(7),502-7。
(iv)组合环以形成多特异性分子
有利地，通过测序和重新合成引入组合环的多肽组合来自肽配体、或肽配体组库的环。可替换地，可以合成编码这种多肽的核酸。
当组合组库时，特别是组合单一环组库时，有利地消化编码组库的核酸，并再连接以形成具有与构成其的组库不同的环组合的新组库。噬菌体载体可包含多接头和其它限制性酶的位点，限制性酶的位点提供了独特的切割和降级(relegation)载体的点，以生成希望的多特异性肽配体。在抗体方面操作噬菌体文库的方法是公知的，也可以用于本发明的情况中。
(v)效应物基团和官能团的附着
可将效应物和/或官能团附着至，例如，多肽的N或C端，或附着至分子支架。
合适的效应物基团包括抗体和其部分或片段。例如，效应物基团可包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域、或其任意组合，另外还包括一个或多个恒定区结构域。效应物基团还可以包括抗体铰链区(这种区域通常存在于IgG分子的CH1和CH2结构域之间)。
在本发明该方面进一步优选的实施方式中，根据本发明的效应物基团是IgG 分子的Fc区域。有利地，根据本发明的肽配体效应物基团包括或由肽配体Fc融合体组成，所述肽配体Fc融合体具有1天或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或更长的tβ半衰期。最有利地，根据本发明的肽配体包含或由具有1天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合体组成。
官能团通常包括结合基团、药物、用于其它实体附着的反应基团、辅助大环肽摄入细胞的官能团等等。
肽穿透至细胞中的能力将使得针对细胞内靶标的肽起效。可被具有穿透细胞能力的肽接近的靶标包括转录因子、细胞内信号传导分子如酪氨酸激酶、以及参与凋亡通路的分子。能够穿透细胞的官能团包括被添加到肽或分子支架的肽或化学基团。如那些衍生自如VP22、HIV-Tat、果蝇(触角)同源盒蛋白的肽，例如，在Chen和Harrison,BiochemicalSociety Transactions(2007)35卷,第四部分,p821 "Cell-penetrating peptides indrug development:enabling intracellular targets"和Gupta 等人在Advanced DrugDiscovery Reviews(2004)57卷9637中的“Intracellular delivery of large moleculesand small peptides by cell penetrating peptides”中描述的。已经表明在通过浆膜移位中有效的短肽实例包括来自果蝇触角蛋白的16个氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)JBiol.Chem.269卷p10444“The third helix of the Antennapedia homeodomaintranslocates through biological membranes”)、18个氨基酸的“模型两亲性肽”(Oehlke等人(1998)Biochim Biophys Acts 1414卷p127 “Cellular uptake of an alpha-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polarcompounds into the cell interior non-endocytically”)、和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非肽的方法包括使用容易附着于生物分子的小分子模拟物或 SMOC(Okuyama等人(2007)Nature Methods 4卷p153‘Small-molecule mimics of an a-helix forefficient transport of proteins into cells’)。其它向分子添加胍基的化学策略也能增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)J Biol Chem 282卷p13585 “GuanidinylatedNeomcyin Delivers Large Bioactive Cargo into cells through a heparin SulphateDependent Pathway”)。可以将小分子量分子，如甾体添加到分子支架以增强细胞的摄入。
可附着至肽配体的一类官能团包括抗体和其结合片段，如Fab、Fv或单一结构域片段。特别是，可以使用结合能够增加肽配体体内半衰期的蛋白的抗体。
还可以引入RGD肽，所述RGD肽结合存在于许多细胞上的整合素。
在一个实施方式中，根据本发明的肽配体效应物基团具有选自如下的tβ半衰期：12小时或更长、24小时或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、7天或更长、8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长或20天或更长。有利地，根据本发明的肽配体效应物基团或组合物具有12至60小时范围内的tβ半衰期。在进一步的实施方式中，其具有1天或更长的t半衰期。在进一步的实施方式中，其在12至26小时范围内。
官能团包括药物，如用于癌症治疗的细胞毒性剂。这些包括烷化剂，如顺铂和卡铂、以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物(硫唑嘌呤和巯嘌呤)或嘧啶类似物；植物生物碱和萜，包括长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛；足叶草毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初被称为紫杉醇 (Taxol)；拓扑异构酶抑制剂，包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及II型抑制剂，包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、和替尼泊苷。进一步的制剂可包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂更生霉素(其用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素等。
可能的效应物基团还包括酶，例如如用于酶/前药治疗中的羧肽酶G2，其中肽配体取代了ADEPT中的抗体。
(vi)合成
应当注意到，一旦感兴趣的多肽根据本发明被分离或鉴定，那么其随后的合成可被尽可能简化。因而，不需要通过重组DNA技术生成多肽的组或套。例如，可以确定感兴趣多肽的序列，并可通过标准技术以及随后的在体外与分子支架的反应合成地生产多肽。当进行时，可使用标准化学方法，因为不再需要保持遗传编码的载体颗粒(如噬菌体)的功能性或完整性。这使得能够快速大规模地制备可溶性物质，用于进一步的下游实验或验证。在该方面，通过本发明方法鉴定的候选物或前导物的大规模制备可使用传统的化学方法完成，如在Timmerman等人中公开的。
因而，本发明还涉及制备如文中所示选择的多肽或缀合物，其中制备任选地包括如下所解释的进一步的步骤。在一个实施方式中，这些步骤在化学合成得到的终产物多肽/缀合物上进行，而不是在噬菌体上进行。
任选地，当例如在初始的分离/鉴定步骤后制备缀合物或复合物时，兴趣多肽中的氨基酸残基可被取代。
例如，肽还可以被延伸以引入另一个环，从而导入多个特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学方法，使用正交保护的赖氨酸 (和类似物)，在其N端或C端或环内简单地化学延伸。标准蛋白化学方法可用于导入可激活的N或C端。可替换地，可通过如(Dawson PE,Muir TW,Clark-Lewis I,Kent,SBH.1994.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science 266:776-779)中描述的片段缩合或天然化学连接、或通过酶进行添加，例如使用如 (Subtiligase:atool for semisynthesis of proteins Chang TK,Jackson DY,Burnier JP, Wells JAProc Natl Acad Sci U S A.1994 Dec 20；91(26):12544-8或Bioorganic& MedicinalChemistry Letters Tags for labelling protein N-termini with subtiligase forproteomics 18卷,22期,2008年11月15日,6000-6003页Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics中；Hikari A.I.Yoshihara,Sami Mahrus和James A.Wells)中描述的副连接酶(subtiligase)。
可替换地，可通过二硫键的进一步缀合使肽延伸或修饰。其具有另外的优点，即一旦在细胞的还原环境中时，允许第一和第二肽彼此分离。在这样的情况中，可在第一肽的化学合成期间添加分子支架(如TBMB)，从而与三个半胱氨酸基团反应；然后可将另外的半胱氨酸附加于第一肽的N端，从而该半胱氨酸仅与第二肽的游离半胱氨酸反应。
相似的技术可同样地应用于两个双环和双特异性大环的合成/偶联，潜在地产生一个四特异性分子。
而且，可以使用适当的化学方法，在N端或C端偶联或通过侧链以相同的方式完成其它官能团或效应物基团的添加。在一个实施方式中，以这样的方式进行偶联，其不阻断任一实体的活性。
(vii)肽修饰
为了将双环肽(双环(Bicycles)；缀合至分子支架的肽)开发成适合的类药物分子，无论是用于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用，都需要考虑一些特征。以下列出至少需要设计到给定前导双环中的：
·蛋白酶稳定性，无论这涉及双环对血浆蛋白酶的稳定性、对上皮(“膜锚定”) 蛋白酶的稳定性、对胃肠蛋白酶的稳定性、对肺表面蛋白酶的稳定性、对胞内蛋白酶等的稳定性。应当在不同的物种之间维持蛋白酶稳定性，从而可以在动物模型中开发双环前导候选物，并可以有信心向人施用。
·氧化敏感残基的取代，如具有抗氧化类似物的色氨酸和蛋氨酸，以改善分子的药物稳定性谱，
·希望的溶解度谱，其是带电和亲水性残基与疏水性残基比例的函数，其对制剂和吸收目的而言很重要，
·带电残基与疏水残基的正确平衡，因为疏水残基影响血浆蛋白结合的程度，从而影响血浆中游离的可用部分的浓度，而带电的残基(特别是精氨酸)可能会影响肽与细胞表面磷脂膜的相互作用。二者组合可能影响半衰期、分布体积和肽药物的暴露，并且可以根据临床端点进行定制。此外，带电残基相对于疏水残基的正确的组合和数值可以减少在注射部位的刺激(为皮下施用肽药物)。
·根据临床指征和治疗方案定制的半衰期。可能在急性疾病管理设置中明智地开发未修饰的分子用于短期暴露，或开发具有化学修饰的双环肽，以增强血浆半衰期，因此对于较慢性疾病状态的管理是最佳的。
稳定治疗性肽候选物对抗蛋白水解降解的方法有多种，与模拟肽领域重叠(参见综述，Gentilucci等人,Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,3185-203,和Nestor 等人Curr.Medicinal Chem(2009),16,4399-418)。
其包括
·肽的环化
·N端和C端加帽，通常是N-端乙酰化和C-端酰胺化。
·丙氨酸扫描，以揭示和潜在地去除蛋白水解攻击位点。
·D-氨基酸取代，以探测氨基酸侧链的空间要求，通过空间阻碍、以及通过 D-氨基酸稳定β转角构象的倾向，增加蛋白水解的稳定性(Tugyi等人(2005)PNAS, 102(2),413–418)。
·N-甲基/N-烷基氨基酸取代，以通过易断裂酰氨键的直接修饰给予蛋白水解保护(Fiacco等人,Chembiochem.(2008),9(14),2200–3)。N-甲基化还强烈地影响肽键的扭转角，并被认为有助于细胞穿透和口服利用度(Biron等人(2008),Angew.Chem. Int.Ed.,47,2595–99)。
·非天然氨基酸的引入，即，通过采用
-等比容的(isosteric)/等电子侧链，其不被蛋白酶识别，而对靶标效能没有影响，
-受限制的氨基酸侧链，从而附近肽键的蛋白水解在构象上和空间上受到阻碍。特别是，其涉及脯氨酸类似物、庞大的侧链、Cα-双取代衍生物(其中最简单的衍生物是Aib，H2N-C(CH3)2-COOH)，和环氨基酸，一个简单的衍生物是氨基环丙基羧酸)。
·肽键替代物，实例包括
-N-烷基化(见以上，即CO-NR)
-还原的肽键(CH2-NH-)
-类肽(N-烷基氨基酸，NR-CH2-CO)
-硫代酰胺(CS-NH)
-氮杂肽(azapeptide)(CO-NH-NR)
-反式烯烃(RHC＝C-)
-翻转(retro-inverso)(NH-CO)
-尿素替代物(NH-CO-NHR)
·肽骨架长度的调控
-即β2/3-氨基酸，(NH-CR-CH2-CO、NH-CH2-CHR-CO)，
·氨基酸上α碳的取代，其限制了骨架构象，最简单的衍生物是氨基异丁酸(Aib)。
应当明确地指出，这些修饰中的某些也可以用于有意改进肽对靶标的效能，或，例如用于鉴定强效的氧化敏感氨基酸的替代物(Trp和Met)。还应当指出，双环前导Ac-06-34-18(TMB)-NH2已经具有能给予蛋白水解降解抗性的两个修饰，这两个修饰为N/C-端加帽，和(双)环化。
(B)多肽配体的组库、套和组
(i)文库的构建
旨在用于筛选的文库可以使用本领域公知的技术构建，例如，如 WO2004/077062中所示的，或使用文中描述的生物系统，包括噬菌体载体系统。其它载体系统是本领域中已知的，包括其它噬菌体(如，噬菌体λ)、细菌质粒表达载体、基于真核细胞的表达载体，包括酵母载体等等。例如，参见WO2009098450 或Heinis,等人,Nat Chem Biol 2009,5(7),502-7。
如WO2004/077062中所示的那些非生物系统基于传统的化学筛选方法。其简单，但是缺乏生物系统的能力，因为其对于筛选肽配体的大文库是不可能的、或者至少是不切实际的负担。但是，例如，当仅需要筛选小量肽配体时，其是有用的。然而，通过这样的独立试验进行的筛选，可能耗时、且能够检测到结合特异性靶标的独特分子的数量通常不超过106个化学实体。
相反地，生物筛选或选择方法通常允许取样更大数量的不同分子。因而，生物方法可用于本发明的应用中。在生物过程中，在单一反应容器内分析分子，具有有益性质(即，结合)的分子从无活性分子中物理分离。可获得允许生成并同时分析多于1013个独立化合物的选择策略。高效的亲和性选择技术的实例是噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展示、细菌展示或RNA/DNA适体方法。这些体外生物选择方法的共同之处在于配体组库由DNA或RNA编码。这允许通过测序增殖和鉴定所选配体。例如，噬菌体展示技术已经被用于对实质上任何靶标具有非常高的结合亲和性的抗体分离。
当使用生物系统时，一旦选择载体系统，并将一个或多个编码兴趣多肽的核酸序列克隆至文库载体中，人们可以通过在表达前进行诱变生成克隆分子中的多样性；可替换地，可以在进行诱变和额外的选择循环之前表达和选择编码蛋白。
通过标准分子方法进行编码结构优化多肽的核酸序列的诱变。特别使用聚合酶链反应，或PCR(Mullis和Faloona(1987)Methods Enzymol.,155:335，并入此处作为参考)。PCR是本领域公知的，其使用由热稳定、DNA依赖的DNA聚合酶催化多个循环的DNA复制，来扩增感兴趣的靶标序列。多种抗体文库的构建已经在Winter等人(1994)Ann.Rev.Immunology12,433-55中讨论了，其在此引做参考。
可替换地，考虑到根据本发明多肽的短链长度，变体可从头合成，并插入合适的表达载体。可通过本领域公知的标准技术进行肽合成，如上所述。自动肽合成仪可广泛获得，如Applied Biosystems ABI 433(Applied Biosystems,Foster City, CA,USA)。
(ii)遗传编码的多样性
在一个实施方式中，感兴趣多肽是遗传编码的。这提供了增加的多样性和容易处理的优点。遗传多肽文库的一个实例是mRNA展示文库。另一个实例是可复制的遗传展示包(rgdp)文库，如噬菌体展示文库。在一个实施方式中，感兴趣多肽是作为噬菌体展示文库而遗传编码的。
因而，在一个实施方式中本发明的复合物包含可复制的遗传展示包(rgdp)，如噬菌体颗粒。在这些实施方式中，核酸可包含于噬菌体基因组。在这些实施方式中，多肽可包含于噬菌体衣壳。
在某些实施方式中，本发明可用于生成遗传编码的多肽组合文库，所述多肽通过将许多核酸翻译成相应的多肽、并将所述分子支架的分子连接至所述多肽而产生。
遗传编码的多肽组合文库可以由噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、细菌展示或mRNA展示生成。
用于进行噬菌体展示的技术和方法可见于WO2009098450。
在一个实施方式中，可如下所述进行筛选：使多肽配体的文库、套或组与靶标接触，并分离结合所述靶标的一个或多个成员。
在另一个实施方式中，所述文库、套或组的个体成员与筛选中的靶标接触，鉴定与所述靶标结合的所述文库的成员。
在另一个实施方式中，所述文库、套或组的成员同时与靶标接触，选择结合所述靶标的成员。
靶标可以是肽、蛋白、多糖、脂质、DNA或RNA。
靶标可以是受体、受体配体、酶、激素或细胞因子。
靶标可以是原核蛋白、真核蛋白、或古菌蛋白。更特别地，靶标配体可以是哺乳动物蛋白或昆虫蛋白或细菌蛋白或真菌蛋白或病毒蛋白。
靶标配体可以是酶，如蛋白酶。
应当指出的是，本发明还包括从根据本发明的筛选中分离的多肽配体。在一个实施方式中，本发明的筛选方法进一步包括以下步骤：制备一定量的作为能够结合所述靶标而分离的多肽。
本发明还涉及具有两个以上环的肽配体。例如，可通过连接与根据本发明的分子支架相连的双环多肽的N和C端，生成连接至分子支架的三环多肽。在该方式中，连接的N和C端产生第三个环，生成三环多肽。该实施方式不需要在噬菌体上进行，但是可在如文中所述的多肽-分子支架的缀合物上进行。连接N和C端是常规的肽化学问题。如果需要任何指导的情况下，C端可以被激活和/或N和C 端可延伸，例如向每一端加入半胱氨酸，然后通过二硫键合将它们连接。可替换地，可通过使用引入N/C端的接头区域来实现连接。可替换地，通过常规的肽键连接N和C端。可替换地，可以采用连接N和C端的任何其它适当的方法，例如，可通过标准技术进行N-C-环化，例如，在Linde等人Peptide Science 90,671-682 (2008)"Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbonecyclization and N-methylation of melanocortin peptides",或在Hess等人J.Med.Chem.51,1026-1034(2008)"backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treatingobesity"中公开的那些。这样的三环分子的一个优点是避免了游离端蛋白水解的降解，特别是由外切蛋白酶作用引起的。该性质的三环多肽的另一个优点是第三环可被用于一般的应用功能，如BSA结合、细胞进入或运送作用、标记或任何其它这样的用途。应当指出的是，该第三环一般不用于选择(因为其不是在噬菌体上产生的，而仅仅是在多肽-分子支架缀合物上产生的)，因而有利地其用于其它这样的生物功能，留下环1和2 用于特异性的选择/产生。
(iii)噬菌体纯化
可以使用任何适合的纯化噬菌体的方法。在本发明中可以应用标准技术。例如，通过过滤或沉淀纯化噬菌体，如PEG沉淀；可如之前所描述的，通过聚乙二醇(PEG)沉淀生产和纯化噬菌体颗粒。细节参见WO2009098450。
如果需要进一步的指导，可参照Jespers等人(Protein Engineering Design andSelection 2004 17(10):709-713.Selection of optical biosensors fromchemisynthetic antibody libraries)。在一个实施方式中，可如其中所教导的纯化噬菌体。该公开的正文特别地引入文中作为噬菌体纯化方法的参考；特别地，参考Jespers等人第 709页右栏下部材料和方法章节的开始部分。
而且，可以如Marks等人J.Mol.Biol 222卷pp581-597所公开的纯化噬菌体，其并入此处尤其用于参考如何进行噬菌体生产/纯化的具体描述。
(iv)反应化学
本发明利用多肽修饰的化学条件，其有利地保留产物遗传编码元件的功能和完整性。特别地，当遗传编码元件是展示在编码其的噬菌体表面上的多肽时，化学方法有利地并不损害噬菌体的生物完整性。一般地，条件在WO2009098450中设定了。
(c)根据本发明多肽配体的用途
根据本发明的方法选择的多肽配体可用于体内治疗和预防的应用、体外和体内诊断应用、体外试验和试剂应用等。具有选定特异性水平的配体在涉及检测非人动物的应用中是有用的，其中希望有交叉反应，或在诊断应用中是有用的，其中需要仔细控制与同系物或旁系物的交叉反应。在某些应用中，例如疫苗应用中，可利用激发对预定范围抗原的免疫反应的能力定制特定疾病和病原体的疫苗。
优选将至少90至95％同质性的基本上纯的肽配体施用于哺乳动物，最优选98 至99％或更高同质性的基本上纯的肽配体用于药学应用，特别是当哺乳动物是人时。一旦部分纯化、或纯化至希望的同质性，所选的多肽可用于诊断或治疗(包括体外的)或开发和进行试验步骤、免疫荧光染色等等(Lefkovite和Pernis,(1979 和1981)ImmunologicalMethods,卷I和II,Academic Press,NY)。
本发明的肽配体典型地在预防、抑制或治疗炎症状态、变应性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染和自体免疫性疾病(其包括但不局限于I型糖尿病、多发硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病和重症肌无力)中是有用的。
在本申请中，术语“预防”包括在疾病诱发之前施用保护性组合物。“抑制”指诱导事件之后，但在疾病的临床表现出现前施用组合物。“治疗”涉及疾病的症状明显之后施用保护性组合物。
可用于筛选肽配体保护免受疾病或治疗疾病有效性的动物模型系统是可获得的。本发明促进了动物模型系统的利用，其允许开发能与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，以允许使用动物模型。
检验易感小鼠中系统性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域公知的(Knight等人.(1978)J Exp.Med.,147:1653；Reinersten等人(1978)New Eng.J:Med.,299: 515)。通过使用来自另一物种的可溶性AchR蛋白诱导疾病，在SJL/J雌性小鼠中检测重症肌无力(MG)(Lindstrom等人.(1988)Adv.Inzn7unol.,42:233)。通过注射II型胶原蛋白在小鼠易感株中诱导关节炎(Stuart等人(1984)Ann.Rev. Immunol.,42:233)。已经描述了通过注射结核分枝杆菌热休克蛋白在易感大鼠中诱导佐剂性关节炎的模型(Van Eden等人(1988)Nature,331:171)。如所述，通过施用甲状腺球蛋白在小鼠中诱导甲状腺炎(Maron等人(1980)J.Exp.Med.,152: 1115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是天然发生的或如Kanasawa等人(1984) Diabetologia,27:113所述的在某些小鼠株中诱导。小鼠和大鼠中的EAE用作人 MS的模型。在该模型中，通过施用髓鞘碱性蛋白诱导脱髓鞘疾病(参见Paterson (1986)Textbook of Immunopathology,Mischer等人编.,Grune和Stratton,New York, pp.179-213；McFarlin等人(1973)Science,179:478:以及Satoh等人(1987)J； Immunol.,138:179)。
一般地，本发明的肽配体将以纯化形式与药学上合适的载体一起使用。典型地，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，其中任意包括盐和/或缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏液。如果需要保持悬浮液中的多肽复合物，可以从增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐中选择合适的生理学上可接受的佐剂。
静脉内载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。也可存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的肽配体可作为独立施用的组合物或与其它试剂联合施用。其可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可包括各种细胞毒性或其它试剂组合本发明的所选抗体、受体或其结合蛋白的“混合物”，或甚至具有不同特异性的根据本发明的所选多肽的组合，如使用不同靶标配体所选的多肽，无论是否在施用之前将其合并到一起。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是任何本领域普通技术人员通常知道的那些。对于治疗，包括但不局限于免疫治疗，所选的本发明的抗体、受体或其结合蛋白可以根据标准技术施用给任何患者。可以通过任何合适的模式施用，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、经肺途径、或也适当地，通过直接的导管输注。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状态、其它药物的同时施用、禁忌症和临床医生需要考虑的其它参数。
本发明的肽配体可被冻干用于保存，并在使用前在适当的载体中重配。表明该技术是有效的，可以使用本领域公知的冻干和重配技术。本领域技术人员将理解冻干和重配将导致不同程度的活性损失，可能不得不向上调整使用水平以补偿该活性的损失。
可施用包含本发明肽配体或其混合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗的应用中，实现所选细胞群的至少部分抑制、抑制、调控、杀死、或某些其它可测量参数的足够的量被定义为“治疗有效剂量”。需要实施该剂量的量将取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的一般状态，但是选择的肽配体通常剂量范围从每千克体重0.005至5.0mg，0.05至2.0mg/kg/剂量更常使用。为了预防的应用，含有本发明肽配体或其混合物的组合物还可以以相似或稍低的剂量施用。
含有根据本发明肽配体的组合物可用于预防和治疗设置，以辅助改变、失活、杀死或移除哺乳动物中所选的靶标细胞群。另外，文中所述的所选多肽组库可用于体外或体外选择性杀死、消除或有效地从异质细胞集合中移除靶标细胞群。来自哺乳动物的血液可在体外和选择的肽配体组合，从而杀死或从血液中移除不想要的细胞，再根据标准技术重输回哺乳动物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防、抑制或治疗炎症状态、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染、眼科疾病和自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本文所限定的肽配体。
合适的“眼科疾病”的示例(包括渗出性和/或炎症性眼科疾病，涉及视网膜血管渗透性和/或完整性受损的疾病，涉及视网膜微血管破裂而导致灶性出血的疾病，眼后部的疾病，视网膜疾病和眼前部的疾病)包括但不限于：年龄相关性黄斑变性(ARMD)、渗出性黄斑变性(也被称为“湿性”或新生血管性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、老年盘状黄斑变性、囊样黄斑水肿、眼睑水肿、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病变、急性黄斑视神经视网膜病变、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、脉络膜视网膜病变、脉络膜血管新生、新生血管性黄斑病变、新生血管性青光眼、阻塞性动脉和静脉视网膜病(例如视网膜静脉阻塞或视网膜动脉阻塞)、中央视网膜静脉阻塞、弥散性血管内凝血病、视网膜分支静脉阻塞、高血压性眼底改变、眼部缺血综合征、视网膜动脉微动脉瘤、Coat病、旁中心凹毛细血管扩张、半侧视网膜静脉阻塞、视乳头静脉炎(papillophlebitis)、中央视网膜动脉阻塞、视网膜分支动脉阻塞、颈动脉病(CAD)、霜样树枝状(frosted branch)脉管炎、镰状红细胞性视网膜病和其它血红蛋白病、血管样条纹、外因 (aetiologies)比如疾病(如糖尿病性黄斑水肿)、眼伤或眼外科手术所导致的黄斑水肿发作；例如损伤、外伤或肿瘤所导致的视网膜缺血或变性、葡萄膜炎、虹膜炎、视网膜脉管炎、眼内炎、全眼球炎、转移性眼炎、脉络膜炎、视网膜色素上皮炎、结膜炎、睫状体炎、巩膜炎、巩膜外层炎、视神经炎、球后视神经炎、角膜炎、睑炎、渗出性视网膜脱离、角膜溃疡、结膜溃疡、慢性钱币状角膜炎、泰格森(thygeson)角膜炎、进行性蚕蚀性角膜溃疡，由细菌或病毒感染以及眼科手术所引起的眼炎症性疾病，由眼的物理损伤引起的眼炎症性疾病，眼炎症性疾病引起的症状，包括痒、耀斑、水肿和溃疡、红斑、红斑渗出性多形性红斑、结节性红斑、环形红斑、硬皮病、皮炎、血管神经性水肿、喉头水肿、声门水肿、声门下喉炎、支气管炎、鼻炎、咽炎、鼻窦炎、喉炎或中耳炎。
本文涉及的“眼后部的疾病”包括影响视网膜、黄斑、眼后部区域中的中央凹(fovea)中的疾病。合适的“眼后部的疾病”的示例包括但不限于：黄斑水肿，如临床黄斑水肿或各种病因(如糖尿病)引起的血管造影囊样黄斑水肿、渗出性黄斑变性和视网膜的激光治疗引起的黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、早产儿视网膜病变(也称为晶状体后纤维组织增生症)、视网膜缺血和脉络膜血管新生、视网膜病(糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视网膜水肿，视网膜脱离、由于视网膜下血管新生导致的老年性黄斑变性、近视性视网膜病变)；炎症性疾病；与肿瘤(如视网膜母细胞瘤或假神经胶质瘤)相关的葡萄膜炎；玻璃体切割术后的血管新生；血管疾病(视网膜缺血、脉络膜血管功能不全、脉络膜血栓、颈动脉缺血引起的视网膜病变)；和视神经的血管新生。
本文涉及的“眼前部的疾病”指的是主要影响眼的前部组织(如角膜、虹膜、睫状体、结膜等)的疾病。合适的“眼前部的疾病”的示例包括但不限于：角膜血管新生(因炎症、移植、虹膜发育不全、伴有渗出性或炎症性成分的角膜疾病或浑浊、由于穿透眼睛或挫伤性眼损伤导致的血管新生；慢性葡萄膜炎；前葡萄膜炎；外科手术(如LASIK、LASEK、屈光手术、IOL植入术)导致的炎症性疾病；作为白内障手术并发症的不可逆角膜水肿；(物理的、化学的、药理的等) 刺激(insult)或外伤导致的水肿；炎症；结膜炎(如，持续性过敏、巨乳头性季节性间歇性过敏、常年性过敏、细菌、病毒或衣原体感染引起的中毒性结膜炎)； (春季性、特应性、干燥性)角结膜炎；虹膜睫状体炎；虹膜炎；巩膜炎；巩膜外层炎；感染性角膜炎；浅层点状角膜炎；圆锥角膜；后发多形性营养不良；Fuch 营养不良(角膜和内皮)；无晶状体的和人工晶状体的大泡性角膜病；角膜水肿；巩膜疾病；眼部疤痕性类天疱疮；睫状体扁平部炎；波斯纳睫状体综合征；白塞氏病；小柳原田综合征；过敏反应；眼表疾病；结膜水肿；弓形虫病脉络膜视网膜炎；眼眶炎症性假瘤；球结膜水肿；结膜静脉充血；眼眶蜂窝织炎；急性泪囊炎；非特异性脉管炎；结节病；和巨细胞病毒感染。
合适的“与眼的过度血管通透性和/或水肿相关的疾病”的示例，如在视网膜或玻璃体中，包括但不限于：年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜水肿、视网膜出血、玻璃体出血、黄斑水肿(ME)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)和非增生性糖尿病视网膜病变(DR)、辐射性视网膜病变、毛细血管扩张、中心性浆液性视网膜病变、以及视网膜静脉阻塞。视网膜水肿是流体在视网膜内的空间的积累。糖尿病患者中发生的视网膜微血管变化导致 DME。这种血-视网膜屏障的折衷导致血浆组分泄漏到周围的视网膜中，造成视网膜水肿。视网膜的其它疾病包括视网膜静脉阻塞(例如分支或中央静脉阻塞)、辐射性视网膜病变、镰状细胞性视网膜病变、早产儿视网膜病变、Von Hippel Lindau 病、后葡萄膜炎、慢性视网膜脱离、欧文盖斯综合征、Eals病、视网膜炎和/或脉络膜炎。
(D)多肽的突变
典型地，通过在一个或多个位置改变选择的分子生成希望的多样性。选择待改变的位置，从而构建环序列中各独立位置的文库。合适时，可从选择步骤中忽略一个或多个位置，例如，如果很明显这些位置中不存在不损失活性的突变。
然后或者可通过随机化实施变异，在其间原位氨基酸被任何氨基酸或其类似物、天然或合成的氨基酸取代，产生非常大量变体，或者可通过用一个或多个限定的氨基酸亚组取代原位氨基酸，产生数量更有限的变体。
已经报道了引入这种多样性的各种方法。用于突变所选位置的方法也是本领域公知的，包括使用错配的寡核苷酸或简并的寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过靶向抗原结合环的突变，产生了一些合成的抗体文库。在本发明的上下文中可以使用相同的技术。例如，人破伤风类毒素结合Fab的H3区域已被随机化而产生一系列新的结合特异性(Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89: 4457)。随机或半随机H3和L3区域已被附加到种系V基因节段，其产生具有突变的框架区的大文库(Hoogenboom-&Winter(1992)R Mol.Biol.,227:381；Barbas 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457；Nissim等人(1994)EMBOJ,13: 692；Griffiths等人(1994)EMBO J,13:3245；De Kruif等人(1995)J.Mol.Biol.,248:97)。该多样化已经扩展到包括一些或全部其它抗原结合环(Crameri等人 (1996)Nature Med.,2:100；Riechmann等人(1995)BiolTechnology,13:475； Morphosys,W097/08320,见上)。
但是，由于用于本发明的多肽比抗体更小，优选的方法是重头合成突变体多肽。结构化多肽的诱变连同文库的构建在上面描述了。
参照以下实施例进一步描述本发明。
实施例
材料和方法
噬菌体文库的克隆
根据Heinis等人,Nat Chem Biol 2009,5(7),502-7)生成噬菌体文库。在Heinis等人中，以正确的方向将编码具有序列Xaa-Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)3-、接头 Gly-Gly-Ser-Gly、和两个无二硫化物的结构域D1和D2的半随机肽的基因(Kather, 等人,J Mol Biol2005,354(3),666-78)克隆至噬菌体载体fd0D12中，得到“文库3x3”。编码肽组库和两个基因3结构域的基因在两个连续的PCR反应中分步生成。首先，用两个引物prepcr(5’-GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGT TGAAAGTAG-3’)和sfi2fo(5’-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCGGACGGAGCATTGACAGG-3’)PCR扩增D1和D2的基因；限制性位点下划线表示，使用载体fdg3p0ss21(Kather,等人,J Mol Biol 2005,354(3),666-78)作模板。第二，使用引物sficx3ba:5’-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCANNKT GTNNKNNKNNKTGCNNKNNKNNKNNKTGTNNKGGGCGGTTCTGGCGCTG-3’ (限制性位点是下划线部分)和sfi2fo，在PCR反应中附加编码随机肽的DNA。 55和11μg SfiI-消化的fd0D12质粒和PCR产物的连接在10个20x20cm氯霉素 (30μg/ml)2YT的板上生成5.6x108个菌落。用补充有15％甘油的2YT介质从板上剥离菌落，保存在-80℃。采用相同的技术进行文中描述的文库构建，以生成例如3x3文库的半随机肽Pro-Ala-Met-Ala-Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)3-Cys，因而用以下替代sficx3ba引物序列：5’-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCATGTNNK NNKNNKTGCNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3’。根据相同的方法生成具有其它环长度的文库。
噬菌体选择
噬菌体文库的甘油储液在500ml 2YT/氯霉素(30μg/ml)培养物中稀释至 OD600＝0.1，在30℃下过夜生产噬菌体(15-16小时)。如Heinis,等人,Nat ChemBiol 2009,5(7)502-7所述，纯化和化学修饰噬菌体，生物素化hPK(3μg)(IHPKA,来自人血浆,InnovativeResearch,Novi,MI,USA)与50μl预先清洗的磁性链霉亲和素珠 (Dynal,来自Invitrogen的M-280,Paisley,英国)在室温下孵育10分钟。清洗珠3 次，而后用含1％BSA和0.1％Tween20的0.5ml清洗缓冲液(10mM Tris-Cl,pH 7.4, 150mM NaCl,10mM MgCl2,1mM CaCl2)在室温下旋转封闭30分钟。同时通过加入含有3％BSA和0.3％Tween 20的1ml清洗缓冲液封闭化学修饰的噬菌体(典型地1010-1011t.u.溶解于2ml清洗缓冲液)。而后封闭的珠与封闭的化学修饰的噬菌体混合，在室温下在旋转轮上孵育30分钟。用含有0.1％Tween 20的清洗缓冲液清洗珠8次，并用清洗缓冲液清洗2次，而后用100μl 50mM甘氨酸，pH 2.2孵育 5分钟。将洗脱的噬菌体转移到50μl 1M Tris-Cl,pH 8进行中和，与30ml OD600＝0.4 的TG1细胞在37℃下孵育90分钟，将细胞铺板于大的2YT/氯霉素板。使用相同的过程进行一或二轮额外的选择。在第二轮选择中，包被亲和素的磁珠被用来防止链霉亲和素特异性肽的富集。根据供应商的说明书，通过0.8mg亲和素(Pierce, Rockford,IL,USA)与0.5ml甲苯磺酰基激活的磁珠(Dynal,来自Invitrogen的 M-280,Paisley,英国)反应制备亲和素珠。
人、猴子和大鼠PK的克隆和表达
人、猴子和大鼠PK的催化结构域在哺乳动物细胞中作为失活的前体表达，所述失活的前体具有通过proTEV切割位点使N端连接至催化结构域的前肽。克隆表达载体，并如下所述表达、激活和纯化蛋白。编码PK信号序列、多组氨酸标签、 proTEV切割位点、PK的成熟催化结构域和终止密码子的合成基因购自Geneart(雷根斯堡,德国)(补充材料)。制备含有人、猴子(Macaca mulatta)和大鼠PK合成基因的质粒DNA，使用限制性酶对XhoI和HindIII(Fermentas,维尔纽斯,拉脱维亚)，以及T4 DNA连接酶(Fermentas)将基因转移到pEXPR-IBA42哺乳动物表达载体 (IBA Biotechnology,德国)。将连接的质粒转化到XL-1蓝色电效能细胞 (Stratagene,Santa Clara,USA)，铺板于含氨苄西林(10μg/ml)的2YT琼脂板上。生成来自三个表达载体的DNA(命名为mPK、rPK和hPK)，通过DNA测序确认正确的序列(Macrogen,首尔，韩国)。
如下所述在哺乳动物细胞中表达三种直系同源血浆激肽释放酶。50ml悬浮液配制的HEK-293细胞生长在不含血清的ExCell 293介质中(SAFC Biosciences,St. Louis,MO)，所述介质中存在4mM谷氨酰胺和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸 (3.75mM)，在100ml烧瓶中在存在5％CO2、在37℃下在ISF-4-W培养箱(Kühner AG,Birsfelden,瑞士)中以180rpm轨道振荡。胚肾(HEK-293)细胞在高细胞密度下(20x 106细胞/ml)(Backliwal,等人Biotechnol Bioeng 2008,99(3),721-7)使用线性聚乙烯亚胺(PEI,Polysciences,Eppenheim,德国)被三种质粒(300μg/ml)转染。在7天的生产相结束时，在4℃、2500rpm离心15分钟，收获细胞。通过0.45μm PES膜(Filter-top 250ml低蛋白结合TPP)过滤从介质中除去任何额外的细胞碎片。使用Ni-NTA树脂、清洗缓冲液(500mM NaCl,25mM Na2HPO4,pH7,4)和洗脱缓冲液(500mM NaCl,25mM Na2HPO4,pH 7,4,500mM咪唑)通过Ni亲和性色谱纯化带有多组氨酸标签的蛋白。用(50单位)proTEV(Promega,Madison,威斯康星州, USA)部分激活蛋白，用Ni亲和性色谱和凝胶过滤(PD10柱,150mM NaCl,0,5mM EDTA,50mM HEPES,pH 7)额外地纯化蛋白。
开发具有改进的结合活性的多肽
各位置的随机化
文库构建：为了绘制结合激肽释放酶的双环肽中的氨基酸，构建了一套小文库。对于含有2个5残基环的双环，生成10个独立的文库，其中每个文库在肽序列中特定密码子上随机化。设计各文库的寡核苷酸，以通过位点定向诱变突变噬菌体基因组DNA。诱变包括感兴趣密码子的随机化(变成NNS)，从模板基因组序列中移除独特的ApaL1限制性位点。使用QIAgen QIAquick PCR纯化试剂盒纯化诱变产物，其中在超纯水中洗脱。使用各文库，通过使用BioRad Micropulser仪器(Ec1程序)和1mm BioRad比色皿，通过电穿孔分别转化TG1大肠杆菌。在 37C下、1ml SOC介质中回收1小时后，文库转化体过夜生长在含抗生素的25ml2TY肉汤中，以选择性地仅生长文库转化体。通过离心收获细菌，使用QIAgen Plasmid PlusMidi试剂盒从大肠杆菌中纯化文库噬菌体DNA，并在蒸馏水中洗脱。 New England Biolabs缓冲液4中用ApaL1将纯化的DNA消化2小时，以除去母体物质。消化后，用QIAgen PCR纯化试剂盒(如上所述)再纯化DNA，并将其用于转化TG1(电穿孔；如上所述)。在SOC中回收1小时后，将转化体铺板于含选择性抗生素的LB琼脂板上，使菌落在37C下过夜生长。
个体克隆的结合试验：随机挑选文库转化体菌落，作为个体培养物在含有选择性抗生素的2TY肉汤中生长。使用QIAgen PyroMark Q96 DNA测序仪DNA测序所挑选的菌落，以揭示在每个克隆中存在的氨基酸取代。分离时，如下所述分析了各独特取代的克隆的人血浆激肽释放酶结合。从培养物中收获含噬菌体的上清，根据Heinis等人(Nature ChemicalBiology卷5pp 502-507(2009))的方法用三溴甲基苯(TBMB)环化噬菌体。使用基于同质板的结合试验，分析该步骤中纯化的噬菌体对生物素化人血浆激肽释放酶的结合；在BMGLabtech Pherastar FS板阅读器上测量试验的读取。来自一式三份试验样本的定量结合数据取平均(平均值)，表示为信号：背景(其中背景是没有靶标物质的试验样本)。信号：背景表示为平行母体样本的％。误差条指示平均值的标准偏差。所示的试验代表至少2个独立的实验。分析数据与肽序列相关。灰色标记的取代是未检测(克隆不是分离自随机文库取样)。平行分析未结合的双环样本(任意的)，以说明试验的基线。
肽结构域的随机化
文库构建：根据上述Heinis等人在“噬菌体文库的克隆”中描述的方法生成小的噬菌体文库。修饰sficx3ba引物，从而使编码双环的部分基于母体5x5双环(5x5: 两个5-残基的环)DNA序列，其中仅4-6个密码子随机化成NNS。随机化密码子是编码感兴趣肽结构域/基序的那些。
个体克隆的结合试验：挑选文库转化体菌落、或选择输出的菌落，作为个体培养物在含有选择性抗生素的2TY肉汤中生长。使用QIAgen PyroMark Q96 DNA 测序仪DNA测序所挑选的菌落，以揭示在每个克隆中存在的氨基酸取代，如下所述分析了其对人血浆激肽释放酶的结合。从培养物中收获含噬菌体的上清，根据 Heinis等人(Nature ChemicalBiology卷5pp 502-507(2009))的方法用三溴甲基苯 (TBMB)环化噬菌体。使用基于同质板的结合试验，分析该步骤中纯化的噬菌体对生物素化人血浆激肽释放酶的结合；在BMGLabtech Pherastar FS板阅读器上测量试验的读取。来自一式三份试验样本的定量结合数据取平均(平均值)，表示为信号：背景。所示的分析数据代表至少2个独立的实验。分析数据与肽序列相关。
双环肽的合成和纯化
肽序列如表4至6所示。核心肽序列是Ac-C1 S1W2P3A4R5 C2 L6H7Q8D9L10 C3 -NH2 (注释为Ac-(06-34-18)(TMB)-NH2)以及Ac-C1 S1F2P3Y4R5 C2 L6H7Q8D9L10 C3 -NH2 (注释为Ac-(06-34-18)(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4)。
肽合成基于Fmoc化学、使用Peptide Instruments制造的Symphony肽合成仪进行。使用标准Fmoc氨基酸(Sigma,Merck)，其具有以下的侧链保护基：Arg(Pbf)； Asn(Trt)；Asp(OtBu)；Cys(Trt)；GIu(OtBu)；Gln(Trt)；His(Trt)；Lys(Boc)；Ser(tBu)； Thr(tBu)；Trp(Boc),Tyr(tBu)(Sigma)。偶联试剂是HCTU(Pepceuticals)，二异丙基乙胺(DIPEA,Sigma)用作碱，用20％DMF中的哌啶(AGTC)实现脱保护。使用0.37 mmole/gr Fmoc-Rink酰胺AM树脂(AGTC)，在100umole规模上进行合成，以相对于氨基酸而言4倍过量地使用Fmoc氨基酸，以及4倍过量地使用碱。氨基酸以 0.2M溶解于DMF中，HCTU以0.4M溶解于DMF，DIPEA以1.6M溶解于N- 甲基吡咯烷酮(Alfa Aesar)。偶联时间一般为30分钟，脱保护时间为2x 2.5分钟。 Fmoc-N-甲基甘氨酸(Fmoc-Sar-OH,Merck)偶联1小时，随后残基的脱保护和偶联时间分别是20分钟和1小时。合成后，用二氯甲烷清洗树脂，并干燥。使用10mL 95:2.5:2.5:2.5v/v/v/w TFA/H2O/iPr3SiH/二硫苏糖醇持续3小时有效从支持物上切割侧链保护基。切割后，通过过滤除去用过的树脂，将滤液加入35mL已经在-80℃中冷却的二乙醚中。离心肽沉淀物，弃去醚上清，用冷却的乙醚清洗肽沉淀物2 次以上。然后将肽再溶解于5-10mL乙腈-水中，冻干。取少量样本用于通过质谱分析粗产品的纯度(MALDI-TOF,来自AppliedBiosystems的Voyager DE)。冻干后，将肽粉末溶解于补充有0.5mL 1M二硫苏糖醇的10mLH2O中的6M盐酸胍中，并加样到C8Luna制备型HPLC柱(Phenomenex)。用0.1％七氟丁酸酸化溶剂 (H2O，乙腈)。15分钟内的梯度范围为30-70％乙腈、以15/20mL/分钟的流速、使用Gilson制备型HPLC系统。组合含有纯的线性肽物质(如通过MALDI鉴定的)的馏分，并用三溴甲基苯(TBMB，Sigma)修饰。为此，线性肽用H2O稀释到～35mL，加入～500uL 100mM乙腈中的TBMB，并且用5mL 1M的H2O中 NH4HCO3(pH 8)启动反应。使反应在室温下继续进行～30-60分钟，一旦反应完成(通过MALDI判断)，冻干。冻干后，如上述纯化修饰的肽，但是用GeminiC18 柱(Phenomenex)取代Luna C8，并将酸变成0.1％三氟乙酸。合并含有正确TMB- 修饰物质的纯馏分，冻干并保存在-20℃下进行储存。
需要来自表7所示来源的非天然氨基酸。
大的或阻碍的氨基酸(NMe-Ser、NMe-Trp、NorHar、4PhenylPro、Agb、Agp、 NMe-Arg、Pen、Tic、Aib、Hyp、NMe-Ala、NMe-Cys、4,4-BPAl、3,3-DPA、Dpg、 1NAl、2NAl、Aze、4BenzylPro、Ind)通常偶联1小时(20分钟脱保护)，对于随后的残基进行6小时(20分钟脱保护)。如之前所述HCTU用作偶联剂。规模通常在50umole。
类肽、还原的酰氨键和α-N-甲基化肽的合成
根据Zuckermann等人(Ronald N.Zuckermann,Janice M.Kerr,Stephen B.H.Kent,Walter H.Moos,Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)]by submonomer solid-phase synthesis Journal of theAmerican Chemical Society,(1992),114(26),10646-10647)开发的方案合成类肽(即 N-His7)。
根据Sasaki Y,Coy DH.,Solid phase synthesis of peptides containing theCH2NH peptide bond isostere,Peptides.1987Jan-Feb；8(1):119-21中的方案合成还原的酰氨假肽键。
根据Nature Protocols,“Synthesis of N-methylated cyclic peptides”,byChatterjee et al,7(3)2012,pp432中描述的方案，使用Mitsunobu反应的改良形式合成N-甲基化肽(NMe-His、NMe-Gln)。所有其它N-甲基化氨基酸(NMe-Leu、NMe-Asp) 作为Fmoc前体从商业来源获得。
酶试验
在10mM Tris HCl,150mM NaCl,10mM MgCl2,1mM CaCl2和1mg/mL BSA (均来自Sigma英国)pH7.4中，在25℃下，在固体黑色96孔板上进行功能性酶试验。简言之，26.5pM人血浆激肽释放酶(购自Stratech,英国)或500pM大鼠血浆激肽释放酶(在室内表达和纯化)，在不存在或存在浓度递增的测试肽下孵育 15分钟，而后添加产生荧光的底物Z-PheArg-AMC(Enzo Lifesciences英国)至在 4％DMSO中的最终试验浓度100μM。使用Pherastar FS(BMG Labtech)，在360nm 激发和460nm发射下，测量AMC释放。在MARS数据分析软件中(BMGlabtech) 计算反应线性相的速率(通常5至45分钟)。然后在Prism(GraphPad)中用该速率计算IC50和Ki。四参数抑制非线性回归方程用来计算IC50。单一位点匹配(One site-fit)Ki方程用于计算Ki，对于150μM的底物，将Ki限制至Km。所有Ki/IC50 值是至少两个独立实验的平均值，并对于Ki值低于1nM的肽至少三次。
肽作为TFA盐以其粉末形式溶解，存储溶液通常在水中制备。离心并过滤(20 μm注射器过滤器)所有的溶液，而后在280nm测量吸光度。根据肽和TMB的 Trp/Tyr含量计算消光系数(TMB核心，当包含在肽中时，具有～300M-1cm-1的ε)。对于含有具有可疑发色性质的非天然氨基酸的肽(即，NorHar、4PhenylPro、3Pal、 4Pal、Tic、4GuanPhe、4,4-BPAI、3,3-DPA、1NAI、2NAI、4BenzylPro、Ind)，通过称重粉末并将肽溶解于确定量的水中确定浓度。对于对激肽释放酶的Ki在1nM 或更低的肽，独立地分两次制备。
血浆稳定性谱
使用三种方法评估血浆中双环(缀合至分子支架的肽)的稳定性。
方法#1：
开发了一种快速的血浆稳定性谱试验，其应用母体质量的质谱检测 (MALDI-TOF,Voyager DE,Applied Biosystems)，直至母体肽的质量再也观察不到时。特别地，在35％大鼠或人血浆(血清实验室，使用柠檬酸作为抗凝剂)存在时、在37℃下孵育200uM肽，其中补充了1x PBS(来自10xPBS存储液,Sigma)。在不同的时间点(即，t＝0、3、24小时，而后是每天，直至第10天)，将2uL样本加入到18uL 1：1的乙腈：H2O混合物中30mM碳酸氢铵中。样本冷冻在-80℃直至分析的时候。对于质谱分析，确定该肽的大约的检测窗口，将给定时间点的乙腈：H2O稀释的样本直接点样(0.7uL)在MALDI板上。基质(α-氰基肉桂酸， Sigma，制备成含有0.1％三氟乙酸的1:1乙腈：水中的饱和溶液)盖在样本(1uL) 上。可在相似的激光强度设定下，在MALDI TOF上，随后确定时间，直到不再检测到母体肽。应当指出，这是一个定性试验，用于检测血浆稳定性的相对变化。
方法#2：
为了更快地获得稳定性的数据，还在95％血浆中评估了肽。在此，省去PBS，将1mM肽存储液(DMSO中)直接稀释于血浆(即，2.5uL存储液至47.5uL血浆中)，指定最终浓度为50uM。在适当的时间点取5uL样本，冷冻于-80℃。为了分析，将样本解冻，与15uL 1:1乙腈:甲醇混合，在13k离心5分钟。吸取5uL含肽的上清，并与1:1乙腈:H2O混合液中的30mM碳酸氢铵混合。然后将1uL该混合物点样在MALDI板上，如上所述进行分析。如上所述，应当指出，这是一个用于检测血浆稳定性的相对变化的定性测量。
方法#3：
为了定量获得血浆稳定性，肽存储液(DMSO中1mM)运送到Biofocus,英国，其进行该分析。将肽用水稀释到100uM，以1：20在血浆中稀释(5uM最终浓度，血浆为95％)，适时地取样，如上述沉淀，使用Waters Xevo TQ-MS定量。
实施例1：鉴定结合活性的优选残基
从表4中所示的5X5肽的实施例中，可能鉴定具有结合活性的肽之间的保守氨基酸。为了确定哪些残基对结合活性是优选的，进一步研究了来自两个鉴定的肽家族的代表。这些是肽06-34，其在双环的第一环中包含了CXWPARC基序，以及肽06-56，其在横穿双环的两个环中都包含CGGxxNCR基序。对于各肽序列，产生一套10个噬菌体的文库，其中环残基的9个保持恒定，另一个残基是随机的，从而任何氨基酸可表达在文库中的那个位置(参见上述方法中的“各位置的随机化-文库构建”)。对于各文库，在噬菌体结合试验中筛选一套20个随机选择的噬菌体克隆对人激肽释放酶的结合，以鉴定对靶标结合重要的残基(参见上述方法中的“各位置的随机化-各克隆的结合试验”)。来自该实验的数据表示在图4-6中。
对于肽06-34(图4)，很明显双环的Arg1可被多种不同的氨基酸取代，而保留或增强对人血浆激肽释放酶的结合。相反地，由大多数氨基酸取代残基2、3、4、 5(Trp2、Pro3、Ala4、Arg5)大幅降低了试验中所见的信号，该试验设置了对高亲和性结合物的严格截止值(cut-off)。Val6可被许多不同的氨基酸取代，并保留或增强其结合活性。在第二环中其它残基的取代表明只有Leu10能够被多种不同氨基酸取代而保留活性。位置7、8和9限制了取代的能力，没有鉴定到增强结合的取代。
对于肽06-56(图5和6)，很明显位置1和2上的甘氨酸是非常优选的用于结合血浆激肽释放酶的残基，如位置6、8和9上的精氨酸、色氨酸和苏氨酸。位置 4上的谷氨酰胺和位置10上的苏氨酸可被各种残基取代，而保留良好的结合活性。三个其余的残基-位置1上的脯氨酸、位置5的天冬酰胺和位置7的苏氨酸具有有限的取代能力。
氨基酸取代的分析
从之前的分析中，明显地看出对于06-34，位置1和位置6可被各种氨基酸取代，而仍然保留等同于或大于母体肽的结合活性。为了评估这些观察是否也适用于分离的合成肽，根据图4的发现设计了一套肽，其中Arg1由丝氨酸取代，Val6 由苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代。也合成了采用这些取代的各种组合的肽。这些取代在试验中生成了更高的结合信号(表5)。
所有的合成肽变体在酶抑制试验中，与06-34母体肽相比具有大约相同或增强的对人血浆激肽释放酶的活性，表明这种类型的分析可用于微调靶标结合亲和性，并表明了鉴定非常高效能的前导肽候选物的途径。
还在分离的酶试验中测试了肽对大鼠血浆激肽释放酶。Arg1至Ser1的取代最低限度地影响对大鼠激肽释放酶的活性，而Val6至苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸的取代产生了具有明显增加的对大鼠血浆激肽释放酶效能的肽。对人激肽释放酶的活性完全保留了。因而，通过确定可被取代的位置，可以鉴定具有希望的特性的肽，如靶标直系同源的交叉反应。
为了证实用非天然氨基酸取代这两个位置、从而具有导入母体肽中不存在的功能或特性的能力的可能性，06-34-03中的Arg1和Val6被丙氨酸或N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、或在位置1上用N-甲基丝氨酸取代，并评估结合。明显地，如表6 所示，位置1/6可以一起移除侧链，因为R1A/V6A(06-34-03 Ala1,6)肽与母体相比，完全保留了效能。用N-甲基甘氨酸取代残基1,6(06-34-03 NMeGly1,6)引起效能的降低，但是结合亲和性保留在低纳摩尔范围。在位置1导入N-甲基丝氨酸引起效能10倍的损失，但是结合保留在皮摩尔范围。因而，可鉴定双环中允许肽骨架结构变化或侧链变化的某些位置，这些位置可考虑被用于增强蛋白酶的稳定性、增强溶解性、降低聚集势能和导入直系同源的官能团。
实施例2：WPAR结构域的详细分析
在06-34-03肽的情况中，分析从实施例1中鉴定的WPAR基序，以鉴定WPAR 基序的替代物或改进。构建文库，其中06-34-03的位置1、6、7、8、9和10固定、位置2、3、4和5随机化(参见以上方法中的“肽结构域的随机化-文库构建”)。在各种严格度上进行针对人血浆激肽释放酶的筛选(参见以上方法中的“噬菌体选择”)。鉴定所有的输出序列，分析其靶标结合(参见以上方法中的“肽结构域的随机化-各克隆的结合试验”)。表17列举了每个独特的序列、其在选择输出中的相对丰度(频率)和根据靶标结合强度的排名。
表17表明WPAR基序给予了对人血浆激肽释放酶最好的结合，尽管其它激肽释放酶结合序列以高丰度从选择中检索到。这些序列包括但不局限于：WPSR、 WPAR、WSAR、WPFR、WPYR、FPFR、和FPFR。在位置2、3、4和5上最有效和丰富的基序可被总结为：W/F P x K/R。
表18(A)表明WPAR和WPSR是在更严格的选择输出中最丰富的；FPFR 和FPYR在较低严格度的选择输出中是丰富的。这表明WPAR样序列比FPFR样序列是更强的结合物。在靶标结合试验中(表18(B))，各基序的分析(在06-34-03 的情况中)揭示了在06-34-03序列的位置2、3、4和5的WPAR是激肽释放酶结合的最佳序列。
实施例3：WPAR药效团以外序列的优化
已经在肽06-34-03的情况中研究了WPAR基序及其变体。图1证明了当取代为其它残基时，WPAR基序以外的某些位置能保留激肽释放酶结合。为了研究激肽释放酶结合的非WPAR决定簇，如以上方法中所述的“肽结构域的随机化-文库构建”用固定的WPAR序列生成噬菌体文库，所有其它位置被随机化 (CxWPARCxxxxxC)。
80个随机的文库成员直接从文库池(无选择)分离，在高和低严格度下分析对激肽释放酶的结合(参见以上方法中的“肽结构域的随机化-各克隆的结合试验”)。这些在WPAR以外含有随机序列的文库成员表现出低的、或没有对人血浆激肽释放酶的结合(数据未显示)，表明WPAR基序的单独存在并不足以保留可测得的激肽释放酶结合：双环序列中的其余部分也一定对相互作用有贡献、或影响。
为了研究激肽释放酶结合的非WPAR决定簇，用该文库进行了对人血浆激肽释放酶的选择，以及分离最佳的含WPAR的肽序列。分离超过150个选择的输出序列，筛选对人血浆激肽释放酶的结合(如以上方法中所述)。这些序列按激肽释放酶结合的次序排序，前50的序列在表19中比对。表19表明在位置1的残基不影响激肽释放酶结合，但是在位置7看到了组氨酸的强烈一致(这支持以上实施例1中的发现)。来自实施例1工作中的肽06-34-03是最好的序列之一。第二环的组合物表明当具有WPAR基序时，给予强的激肽释放酶结合的明显趋势。
最好的含有WPAR的结合至人血浆激肽释放酶的结合物具有趋势：
CX W P A R C T/L H Q/T D LC
H7、D9和L10在含有WPAR的激肽释放酶结合序列中是高度保守的。
在第二双环的环中鉴定到两个基序(位置6-10)：
1.CX W P A R C T H Q/T D LC(位置6,7&10:“THxxL”)
2.CX W P A R C T/L H Q/T D LC(位置7,8,和10:“xHxDL”)
超过120个鉴定的人血浆激肽释放酶结合物(选择的输出序列)根据其来自基序“THxxL”还是来自“xHxDL”，被分为2个不同的组。对于所有组，输出序列的平均激肽释放酶结合试验信号被标注为指定组的激肽释放酶结合的测量值(表 20)。
表20所示的激肽释放酶结合试验证明，当双环肽中具有WPAR基序时，‘THxxL’和‘xHxDL’基序产生最好的激肽释放酶结合。2个基序‘THxDL’的组合提供了对人血浆激肽释放酶最高的结合，包括06-34-03肽的‘THQDL’第二环序列。
实施例4：血浆稳定性的系统分析
对于抑制激肽释放酶的双环，应当获得足够的蛋白酶稳定性谱，从而其在血浆或其它相关环境中具有低的蛋白酶驱动的清除。在观察大鼠血浆中母体肽的进展性消失的快速可比较的血浆稳定性试验(方法章节，方法#1)中，在大鼠和人血浆中测试的所有双环序列中发现N端丙氨酸(其存在于选择时，原本包含在前导序列的合成肽中)被快速移除。通过合成不含N和C端丙氨酸的前导候选物可避免该降解。为了移除潜在的氨基和羧基肽酶的识别位点，在肽合成期间将现在位于前导候选物Cys1上的游离氨基端用醋酸酐加帽，产生了N端乙酰化的分子。在等同的测量中，C端半胱氨酸作为酰胺被合成，从而移除潜在的羧基肽酶识别位点。因而，双环前导候选物具有下述通用序列： Ac-C1AA1AA2AAnC2AAn+1AAn+2AAn+3C3(TMB)-NH2，其中“Ac”指N-端乙酰化， "-NH2"指C端酰胺化，其中"C1,C2,C3"指序列中的第一、第二和第三半胱氨酸，其中"AA1"至"AAn"指氨基酸的位置(其性质“AA”通过上述选择定义)，其中"(TMB)"指已经被TBMB或任何其它合适的反应支架环化的肽序列。
由于Ac-06-34-18(TMB)-NH2对人(Ki＝0.17nM)和大鼠激肽释放酶(IC50＝1.7nM)的高亲和性，我们选择该双环用于前导开发(图9、表1、表5)。使用上述相同的快速血浆稳定性谱试验，Ac-06-34-18(TMB)-NH2具有大约2天的可观察窗口(方法章节，方法#1)，其等于～2小时的大鼠血浆半衰期(如通过LC/MS定量确定的，参见以下，表23，方法#3)。
为了试图鉴定Ac-06-34-18(TMB)-NH2中的蛋白水解识别位点，随着时间在 35％大鼠血浆中取样肽(方法#1)，使用MALDI-TOF质谱分析各样本的肽片段的进展性出现。Ac-06-34-18(TMB)-NH2的母体质量是1687Da。随着时间(图7、8)，出现的片段质量是1548.6(M1)、1194.5(M2)和1107.2(M3)。从 Ac-06-34-18(TMB)-NH2(Ac-C1S1W2P3A4R5C2L6H7Q8D9L10C3-NH2)序列中，可以计算M1的峰对应于不含Arg5(-R5)的Ac-06-34-18(TMB)-NH2。这看起来是初期蛋白水解事件，其随后是Ac-06-34-18(TMB)-NH2中4个氨基酸的节段WPAR的移除(M2,-WPAR)，和最后Ac-06-34-18(TMB)-NH2的完整第一环被切除(M3, -SWPAR)(图8)。从该数据，很明显地Ac-06-34-18(TMB)-NH2的Arg5是负责双环降解的主要大鼠血浆蛋白酶识别位点。
丙氨酸取代和第一环的乱序重排：
已经鉴定了Arg5构成大鼠血浆蛋白酶识别位点，进行了 Ac-06-34-18(TMB)-NH2衍生物的化学合成行动，目的是鉴定具有更高的血浆蛋白水解稳定性的候选物。重要的是，这种修饰不应影响对人或大鼠激肽释放酶的效能。通过用A2A3或A2Q3取代W2P3，以及通过使双环的部分或完整的第一环乱序重排，进行有关WPAR序列/药效团作用的初步探索(图9，10)。下表8表示序列和相应的对激肽释放酶的亲和性。
从这些数据中，清楚地表明伴随W2P3的移除，以～100000倍极大地降低了对激肽释放酶的结合，有效地给予分子药理惰性。通过四个乱序重排肽(Scram 1-4) 表明了氨基酸正确序列的重要性，因为其全部展现对激肽释放酶亲和性实质上的降低(图10)。奇怪的是，所有的肽具有大致相同的大鼠血浆稳定性谱(在1至 2天之间，方法#1)，表明血浆蛋白酶识别位点依赖精氨酸的存在(产生和图7相似的降解模式)，而不是其在序列中的位置。
接着，生成五个Ac-06-34-18(TMB)-NH2的衍生物，其中W2、P3、A4、R5和 C2被其对应的D对映异构体的对应物取代(表9)。
从该数据中，明显地A4、R5和C2的D氨基酸取代增加了肽对血浆蛋白酶的稳定性。由于被大鼠血浆蛋白酶切除Arg5似乎是肽降解中的第一事件，肽键的初始水解将发生在Arg5的N和/或C端侧。可以合理地认为，用其D对映异构体取代Arg5两侧的氨基酸能通过空间阻碍阻断相邻肽键的水解。事实上，该作用在之前已经观察到(Tugyi等人(2005)PNAS,102(2),413–418)。
D氨基酸取代对激肽释放酶亲和性的不利作用在所有情况中是显著的；效能损失的范围从300-(D-Arg5)至45000倍(D-Trp2)。这表明这些侧链正确的三维展示对激肽释放酶双环结合口袋的重要性。同样显著的是D-Ala4的作用：在此，改变单一甲基基团(作为Ala侧链)的方向降低亲和性7000倍。
N-甲基化
随后，在第一环中的残基系统性地被其N-甲基的对应部分取代。N-甲基化作为肽键自身的直接保护；但是，由于缺少酰氨氢、添加了空间体积(甲基基团) 和改变了优选的扭转角，在效能中的损失是可预期的。
表10总结了数据。
环1中氨基酸的N-甲基化整体上展现了较不明显的对效能的不利作用。特别是，Arg5的N-甲基化仍产生单数位纳摩尔的结合物(与野生型肽相比，亲和性降低20倍)，其大鼠血浆稳定性超出了试验时间(MS中没有观察到肽的片段化)，使得其成为有吸引力的改进的前导候选物。由于具有D氨基酸取代，与Arg5相邻残基的甲基化给予肽增加的稳定性，大概是通过空间干扰影响Arg5的N和/或C 端肽键的蛋白酶催化的水解。需要注意的是，Ser1可被N-甲基化，而无显著的效能损失，表明该位置中肽骨架的完整性对结合不是很必要的。
精氨酸取代
考虑到Arg5在大鼠血浆蛋白酶识别中的重要性，在Ac-06-34-18(TMB)-NH2 前导中测试了一套精氨酸类似物。化学结构如图11所示，效能对稳定性的数据在表11中表示。
显著地，所有精氨酸类似物增加了肽的稳定性，超过了试验的窗口时间，确认了在血浆蛋白酶识别中Arg5完整性的重要性。增加(HomoArg)或降低侧链长度 (Agb,Agp)均降低亲和性，但是HomoArg类似物仍然产生非常好的结合物(Ki＝2.1 nM)，该结合物具有增加的稳定性。通过Arg5中的一个亚甲基基团延长氨基酸骨架(所谓的β氨基酸)而保留相同的侧链(β-homoArg5)也产生具有增强的稳定性的结合物，但是代价是更显著降低的亲和性(Ki＝8.2nM)。用苯环取代Arg侧链的脂肪族部分产生了共振稳定的、更大的、刚性的含胍基的侧链(4GuanPhe)。在所有测试的Arg类似物中，4GuanPhe具有最大的亲和性(与野生型相比降低2倍)、增加的血清稳定性。有趣的是，胍基苯基基团结构上接近已知的小分子激肽释放酶抑制剂苯甲脒(Stürzebecher等人(1994),Novel plasma Kallikrein inhibitors ofthe benzamidine type.Braz J Med Biol Res.27(8):1929-34；Tang等人(2005),Expression, crystallization,and three-dimensional structure of the catalyticdomain of human plasma Kallikrein.J.Biol.Chem.280:41077-89)。而且，衍生的苯基胍已被用作其它丝氨酸蛋白酶uPA的选择性抑制剂(Sperl等人(4-aminomethyl)phenylguanidine derivatives as nonpeptidic highly selective inhibitors ofhuman urokinase(2000)Proc Natl Acad Sci U S A.97(10):5113-8.)。因而，含有4GuanPhe5的 Ac-06-34-18(TMB)-NH2可被视为小分子抑制剂，其选择性由周围的双环肽所给予。这包含了对其它基于双环的抑制剂的原理，其中已知的低选择性小分子抑制剂被“接枝”到双环的正确位置，产生了优良效能和选择性的分子。
通过甲基化(SDMA,NDMA)、正电荷的移除(Cit,其中胍基团被等比容但不带电的脲基团取代)、或完全删除Arg(ΔArg)，精氨酸胍基基团的自身修饰对激肽释放酶结合效能具有强的不利作用。因而，重要的是胍基的完整性和存在，而不是在Arg5上连接至胍基或骨架的侧链性质。应当提到的是，Arg5可以被赖氨酸取代，但是又降低了亲和性(参见WPAK肽)。
总之，至此的数据表明利用HomoArg、NMeArg或4GuanPhe作为精氨酸取代的Ac-06-34-18(TMB)-NH2可以构成具有高亲和性的血浆稳定性增强的候选物。
实施例5：通过非天然修饰和组合增强血浆稳定性的修饰改进前导候选物的效能
可通过一些机制可行地实施给定双环候选物效能的改进。这些在实施例4中部分解决了，可以改写为如下：
1、引入开拓疏水作用并产生较低的分离率(off rate)的疏水半簇，从而实现较高的亲和性。
2、引入开拓大范围离子相互作用的带电基团，产生较快的结合率(on rate) 和较高的亲和性(参见例如Schreiber等人Rapid,electrostatically assisted associationof proteins(1996),Nature Struct.Biol.3,427-31)。
3、引入对肽另外的限制，即通过
-正确地限制氨基酸侧链，使得与靶标结合时熵的损失最小；
-限制骨架的扭转角，使得与靶标结合时熵的损失最小；
-以同一理由在分子中引入另外的环化。
(综述参见Gentilucci等人Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,3185-203,以及Nestor等人,Curr.MedicinalChem(2009),16,4399-418)。
色氨酸和疏水类似物取代：
最初，将一系列疏水氨基酸取代引入Trp2位点，以鉴定能够取代氧化敏感的色氨酸的候选物，并鉴定能够提高效能的候选物(解决以上的第一点)。这些氨基酸的侧链在图12中显示，亲和性数据汇总于以下表12中。
如预期地，没有修饰增加血浆稳定性。2-萘基丙氨酸最接近Trp2，表现出比野生型稍弱的效能，使其成为好的Trp2抗氧化取代。有趣的是，3,3-DPA2具有与 Trp非常不同的结构，但其相应的肽仍然保留高效能。这可能表明接触激肽释放酶上口袋的Trp能被用于通过鉴定正确设计的疏水实体开发较高的结合亲和性。
脯氨酸类似物
接着，我们惊喜地确定了Pro3在Ac-06-34-18(TMB)-NH2的WPAR药效团中的作用。由于已知其在诱导肽骨架上额外的刚性和螺旋性中的特性，选择4-羟基- 或4-氟-反式(L)-脯氨酸(HyP3、4FluoPro3)(图13，表13)。另外，Hyp上存在羟基探测了脯氨酸侧链的溶剂可接近性。相应衍生物的Ki几乎与野生型相同，表明对肽骨架的任何作用是微不足道，但是也证明侧链是可接近的。为了进一步说明这一点，对Ac-06-34-18(TMB)-NH2两个额外的衍生物进行了测试，这两个衍生物在Pro3侧链的γ碳上包含大的延伸(4苯基-脯氨酸,4苄基-脯氨酸)。前者显示明显的效能保留，而后者则受到严重影响，这表明脯氨酸侧链是可接近的，但仅限于不同的修饰。尽管在这些修饰中的空间体积，血浆稳定性与野生型是相同的。因此，这些修改不改进对其它蛋白酶的选择性。
为了探测脯氨酸环的大小对结合的作用，高度限制的4元Pro类似物氮杂环丁烷羧酸(Aze)，以及更高柔性的6元环(哌啶酸,Pip)取代Pro3。 Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Aze3以目前所有衍生物中的最高亲和性结合激肽释放酶，超过野生型3倍(factor)(图14、表13)。在环大小和Ki之间看起来是反比关系，其表明在Ac-06-34-18(TMB)-NH2位置3的构象限制对紧密结合分子是关键的。
在耐受大体积基团中脯氨酸侧链的柔性被双/三环脯氨酸类似物Tic、NorHar 和Ind强调(图13)。特别是对于后二者的情况，在一位数纳摩尔范围的亲和性仍然很好。
最后，我们试图探测对Pro3上全部环结构的要求。为此，我们选择了氨基异丁酸(Aib，图15，表13)，其中由于在α-碳上的双甲基取代，其对诱导α或310螺旋的相邻氨基酸具有强的结构性效果(Toniolo等人(1993)，Biopolymers 33, 1061-72；Karle等人(1990),Biochemistry 29,6747-56)。值得注意的是，这种非天然、非环状氨基酸在Pro3取代中耐受性良好，Ki为1.2nM。因此，Pro3在WPAR 药效团中的作用是向肽骨架引入一个限制。这种限制可以通过采用具有降低的环大小的脯氨酸类似物得到加强(见Aze3)。相反，脯氨酸环可相对有效地被非环状但诱导结构的氨基酸(如Aib)取代。
多种类似物
在表10中，表明Ac-06-34-18(TMB)-NH2环1中的Ser1可以是N-甲基化，而对效能具有非常小的影响(WT中0.5对0.17nM Ki)。我们试图确定该位置是否耐受位置1上Cα上大的双取代。为了这个目的，用Dpg(二丙基甘氨酸)取代Ser1(图 15)。该肽对激肽释放酶的亲和性是1.1nM，表明位置1是非常柔韧的，实际上可适应任何大的残基。因而，环1中的该位置可被开拓用于考虑包容希望的化学功能或基团，包括增溶氨基酸、放射标记、染料标记、接头、缀合位点等等。
还在位置4测试了一些丙氨酸类似物。如用N-甲基和D-丙氨酸已经看到的(表 10、9)，Ala4对Cα上的空间定位、或对骨架自身的修饰高度敏感。该类的两个以上的衍生物强调了这点，因为在Ala4(β-Ala4)肽骨架的延伸大大降低亲和性 (～20μM)。正如对D-Ala4所预期的，Aib4将亲和性降低至几乎相同的程度 (289nM，图15和表14)。值得注意的是，Ala侧链一个亚甲基的延伸(Aba4) 看起来增强对激肽释放酶的亲和性。
最后，中央的半胱氨酸(Cys2)被更大且更限制的类似物-青霉胺(Pen，图 15)取代，由于其降低对相邻Arg5蛋白酶识别位点的空间进入，希望青霉胺增加蛋白水解稳定性。实际上，大鼠血浆稳定性轻度增加，但是效能显著降低，强调了该结构性的连接有支架的残基的充分完整性的重要性。
将增强血浆稳定性和增强效能的非天然氨基酸组合到单一双环前导中
保留相当效能和最大大鼠血浆稳定性的Ac-06-34-18(TMB)-NH2中的非天然取代(如方法#1所确定的)是Arg5变体高精氨酸(HomoArg5)、4-胍基苯丙氨酸 (4GuanPhe5)和N-甲基精氨酸(NMeArg5)。与野生型肽相比Ac-06-34-18(TMB)-NH2 中增加效能的非天然取代是Pro3类似物氮杂环丁烷羧酸(Aze3)和Ala4类似物2- 氨基丁酸(Aba4)。因而，Aze3、Aba4与增加蛋白酶稳定性的HomoArg5、4GuanPhe5 和NMeArg5组合，来确定是否能产生具有高血浆稳定性和增加效能的肽候选物。
表15和16代表了各种构建体的亲和性，以及血浆稳定性。
首先，含有精氨酸类似物的肽的大鼠血浆半衰期(第4列，表15)的定量确定，揭示了Arg5N-甲基化在肽的保护中是最强效的(t1/2>20小时)，随后是 HomoArg5和GuanPhe5。Arg N-甲基化的强保护作用可能并不奇怪，因为其直接防止肽键的水解。当这些化合物中包含Aze3时，这些肽的亲和性在所有情况中将增强，使得Ac-(06-34-18)Aze3 HomoArg5和Ac-(06-34-18)Aze3 NMeArg5成为进一步开发的有吸引力的候选物(表15，图16)。
Aba4增加亲和性的作用在Aze3和任何精氨酸类似物的情况下不能再现，因为Ki值比没有Aba4时观察到的Ki值高。因而，Aze3增加效能的作用不依赖于精氨酸取代的类型，而Aba4的作用则似乎不是。
最后，这些肽对大鼠激肽释放酶的活性显著降低(表15)。但是，这些值是相对的，在该阶段并不是定量的，因为大鼠激肽释放酶的蛋白制备并非平常，且含有杂质。
实施例6：不含Trp的FPYR激肽释放酶双环前导的血浆稳定性增加和Aze3引起的亲 和性增加
从实施例1-4的选择输出中，我们发现一些类似Ac-06-34-18(TMB)-NH2的序列，其具有高丰度但是含有改变的WPAR基序。其是WPSR和FPYR。后者特别有趣，因为其缺少氧化敏感的色氨酸。
合成了含有WPSR、FPYR、WPYR和FPAR的双环，并与WPAR母体肽比较(表21)。
如预期的，没有肽表现出显著不同的血浆稳定性。用Phe2取代Trp2导致Ki 降低40倍，强调了需要较大的Trp2侧链。但是，该降低可通过用Tyr4取代Ala4 (得到了FPYR基序)补偿，从而亲和性再次增加到几乎是野生型WPAR序列的水平(Ki＝0.46nM)。因而，在Ac-06-34-18(TMB)-NH2双环的位置2和位置4的残基之间存在协同的相互作用。考虑到高的靶标结合亲和性和缺少 Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4中的Trp2，采用如上实施例中描述的方法研究了该候选物增加的大鼠血浆半衰期。而且，通过用非天然氨基酸类似物取代这些残基，我们研究了Phe2和Tyr4之间的相互作用。
Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4中Phe2/Tyr4的非天然取代
我们进行了一套非穷尽的合成，在Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4前导的 Phe2或Tyr4上引入取代。从与图12相同的套中选择非天然氨基酸，亲和性数据总结在表22中。
此处，用任何受试氨基酸进行的取代通常是良好耐受的，不管侧链是否是杂芳(3Pal，4Pal)、芳香的且大的(1Nal、2Nal、4,4-BPal)或环脂族(Cha)实体。 3Pal在位置2上很好地耐受(Ki＝0.91)，其有趣是因为Pal含有可电离基团(即，其能够被开发成制剂)。但是，看起来原始的Phe2/Tyr4组合仍然最有效能。
大鼠血浆中Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4的稳定和氮杂环丁烷羧酸3取代的 作用
用高精氨酸、4胍基苯丙氨酸和N-甲基精氨酸取代，在Aze3不存在和存在时，制备Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4。HomoArg/4Guanphe耐受良好，Ki值几乎与母体Phe2Tyr2肽相同(表23)，且大鼠血浆稳定性增加了13倍(t1/2＝12.2小时，表23、图16)。而且，对大鼠激肽释放酶的IC50值与母体相似，表明其是有吸引力的体内研究候选物。
在FPYR情况中Pro3至Aze3的取代也产生了具有增强亲和性的肽候选物，事实上生成了Ki小于1nM的肽，其在大鼠(Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3Tyr4 NMeArg5) 中具有超过20小时的半衰期。
实施例7：通过在环2中进行单氨基酸取代改善06-34-18双环前导候选物的人血浆 稳定性
鉴定His7作为主要的血浆蛋白酶识别位点
用LC-MS(方法#3，表2)定量确定如下环1-修饰的06-34-18肽的大鼠和人血浆稳定性。很明显，赋予大鼠血浆蛋白酶稳定性的化学修饰(HArg5、4GuanPhe5、 NMe-Arg5)在人血浆蛋白酶解的环境中无效。
随后Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2 Tyr4(称为野生型肽)接触人血浆，并分析随时间出现的片段。这和在人血浆中使用06-34-18的NMe-Arg5衍生物所观察到的降解谱进行比较(图18a和18b)。根据方法#2确定片段化。
根据质谱信息，内切蛋白酶解水解发生在06-34-18序列中His7的N-和/或C- 端侧，随后(通过外切蛋白酶解活性)切除Leu6或(通过外切蛋白酶解活性)切除His7-Gln8，或者所有三个残基一起切除。根据观察到的片段性质，可能初始的内切蛋白酶解水解事件发生在Leu6和His7之间的肽键，而不是His7和Gln8之间的肽键。此外，如果在Arg5位置的大鼠血浆蛋白酶识别位点被N-甲基化阻断，则观察到同样的片段化模式(图18b)，这表明人血浆的蛋白酶解特异性不同于大鼠的。
系统性评估环2残基的作用，以及对血浆蛋白酶的稳定性
此后，针对各个环2的残基对人血浆稳定性和人激肽释放酶效能的影响，评价各个环2的残基。
使用发明背景章节中部分概述的实验方法，通过以下进行完整的环2氨基酸扫描：
1)用丙氨酸取代环2的每个氨基酸，来除去作为蛋白酶识别位点的侧链，
2)用D-氨基酸对映异构体对应物取代环2的每个氨基酸，来空间上阻碍降解性蛋白酶的接近，
3)用D-丙氨酸取代环2的一些氨基酸，来空间上阻碍蛋白酶接近肽键，
各个变体的效能数据分别总结于表3a、3b和3c。
1)环2残基的丙氨酸扫描
表3a显示用Ala7修饰His7，看起来降低了第二环中的蛋白酶解性降解，因为检测不到-L、-HQ、-LHQ片段。然而，环1中在Arg5位置上的蛋白酶解活性(这以前只在大鼠血浆中观察到)现在变得可被检测到。因此很清楚，人血浆蛋白酶能够攻击两个蛋白酶解识别位点(Arg5和His7)。即使Ala7和His7(正如在野生型肽中)相比似乎增强了稳定性，其效能却显著降低(56倍)，使Kd达到23nM，对于治疗性分子而言，这是不够有效的。然而，剩余的Ala取代都将效能降低至不同程度，而没有增加血浆稳定性(正如通过出现了环2降解的双环肽片段所判断的，表3a第四栏)。总之，这突出了这样一种发现，即His7的侧链是蛋白酶识别位点。
2)环2残基的D-氨基酸扫描
表3b显示用D对映异构体的对应物取代各个氨基酸的作用。这种修饰使侧链不变，但是在Cα上将其设计为(project)替代的构型。环2内任意位置的D-氨基酸看起来稳定肽的环2，使其免于蛋白酶解的降解；然而，正如上述采用Ala7变体所看到的，现在特异性切换为环1中的不稳定位点(Arg5)。水解切换到Arg5 使得难以量化D-氨基酸所诱导的在环2中稳定化的影响，因为这种独立的过程影响剩余母体材料的量(以下进一步说明)。已经在文献中认识到了D-氨基酸取代的远端保护作用，并且可能通过空间上降低或预防对可水解键的接近而发挥作用 (Tugyi等人(2005)PNAS,102(2),413–418)。然而，D-氨基酸逐步远离假定的His7 蛋白酶识别位点(即D-Asp9、D-Leu10)还显示少量的对应着切除的亮氨酸6(其临近His7)的片段。
值得注意的是，大部分D-氨基酸变体显示强烈降低的效能(效能降低130至 9000倍之间)，突出了肽与激肽释放酶蛋白相互作用的三维和空间性质。D-Asp9 似乎是例外，因为观察到稳定性的增加，同时维持了4nM(与WT相比，9倍的降低)的效能。这种修饰可潜在地成为候选治疗分子中有用的稳定性取代。
3)环2残基的D-丙氨酸扫描
表3c显示用D-丙氨酸取代若干所选的环2氨基酸的影响。由于当前引入的甲基导致的去除侧链以及在Cα上引入空间阻断，对效能具有强烈的不利影响。无论如何，在两种情况下，保留了低纳摩尔亲和性(Ac-(06-34-18)D-Ala9和Ac- (06-34-18)Phe2 Tyr4 D-Ala9)。正如采用D-Asp9，这些修饰可潜在地成为候选治疗分子中有用的稳定性取代。
用氨基酸模拟物取代Leu6、His7和Gln8上的氨基酸侧链
随后，进行一系列的(a campaign of)Leu6、His7和Gln8的氨基酸取代来评价这些残基的空间、电荷以及结构需求，并且评价它们对降低血浆蛋白酶对His7 位点识别的影响(环2的结构示于图19a)。
适合的一般方法在之前的介绍性章节中有讨论。
·06-34-18环2中位置6的取代
在残基Leu6，试图在氨基酸的Cβ引入空间体积(bulk)，目的在于降低蛋白酶接近Leu6和His7之间易断裂的键。测试的结构示于图19b。对效能的影响汇总在表24a中。相较于野生型的肽，一些修饰显示亲和性的增强，尤其是在Ac- (06-34-18)的情况时(在Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4的情况时更少)。尤其是，这些是非天然氨基酸苯基甘氨酸(Phg)和环己基甘氨酸(Chg)。所有这些修饰或多或少看起来降低了在第二环中的蛋白酶解切割，但最有效的稳定剂被证明是叔丁基甘氨酸(tBuGly)。当接触人血浆时，这种肽Ac-(06-34-18)Phe2Tyr4 tBuGly6 只显示第一环中Arg5的去除。总之，Chg、Phg和tBuGly修饰中的任意一个可用于增强第二环的血浆稳定性。此外，我们鉴定了增强对激肽释放酶的效能的两个修饰(Chg、Phg)。
·06-34-18环2中位置7的取代
在残基7，用以下模拟物，研究了取代组氨酸侧链对血浆稳定性和效能的影响：吡啶基丙氨酸2Pal、3Pal、4Pal是咪唑侧链的碱性可电离杂芳香模拟物。噻吩丙氨酸(Thi)、呋喃丙氨酸(FuAla)、ThiAz、1,2,4-三唑丙氨酸、(1,2,4 Triaz)、噻唑丙氨酸(ThiAz)是咪唑侧链的5元杂芳不带电荷的模拟物。His1Me/His3Me 是咪唑侧链的N-甲基取代衍生物。Dap、Agb和Agp代表咪唑侧链的正电荷取代，但是缺乏芳香侧链(图19c)。表24b总结了效能数据。引人注目的是，所有肽在环2中显示对血浆蛋白酶增强的稳定性，可见的降解只发生在环1的Arg5位置。显然，在位置7的正电荷不足以提供血浆蛋白酶(Dap、Agp、Agb)的识别位点。相反，除去正电荷同时保留原始咪唑侧链的接近的模拟，也除去了蛋白酶解识别位点。尽管一些结构对原始咪唑环非常接近的模拟，所有肽衍生物对血浆激肽释放酶显示出显著降低的亲和性。这表明，以完全的效能与激肽释放酶进行结合需要His7的完整结构。保持低纳摩尔结合的有趣的候选物是噻唑丙氨酸、呋喃丙氨酸、和His1Me。有趣的推定的候选物是高组氨酸和咪唑甘氨酸
·06-34-18环2中位置8的取代
残基8(Gln8)更远离位于Leu6和His7之间的切割位点。对一些取代进行了测试(图19d和表24c)。带负电荷的氨基酸引入该位置，从而将盐桥带至His7 附近。这可以降低血浆蛋白酶对His7的识别。对附加的环2序列进行测试，其出现在噬菌体选择输出中，其还缺少组氨酸7。此环2序列为LTTEL(称为Ac- (06-34-18)Phe2 Tyr4 Thr7 Thr8 Glu9)。此外，在位置8测试β氨基酸(bHGln8，图19d)。也在这个位置测试正电荷氨基酸，从而潜在地阻止His7的蛋白酶解识别和随后的降解。尽管，这些分子的效能往往<10纳摩尔，对血浆稳定的影响较小。可值得进一步定量研究这些分子，以确定其对血浆稳定性的精确影响。
实施例8：通过在环2中进行氨基酸骨架修饰来改善06-34-18双环前导候选物的人 血浆稳定性
氨基酸骨架修饰代表了一种广泛认可的方法，通过这种方法可以保护肽骨架免受蛋白酶的水解(综述见Gentilucci等人，Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16, 3185-203,and Nestor et al,Curr.Medicinal Chem(2009),16,4399-418)。
本领域中成熟的方法是将氨基酸的Nα进行N-烷基化，例如N-甲基化。表25a 中显示用Nα-甲基化对应物系统性取代环的两个酰胺骨架的效果。原则上，这是一种非常有效的水解保护性修饰，不仅因为肽键本身免受蛋白酶解性水解，还因为Nα上的甲基体积对相邻肽键的保护作用。的确，可观察到对环2蛋白酶解的强烈保护作用，但效能总是降低100或更多倍。正如采用D-氨基酸进行的取代，N-烷基化保护位于His7的易断裂位点，即使它出现在Asp9或Leu10。
另一种方式是采用合适的氨基酸侧链(称为类肽)进行的Nα的N-烷基化，通过这种方式修饰肽骨架。在His7的Nα引入高组氨酸侧链，同时伴随地除去His7 Cα上的侧链，得到N-烷基甘氨酸。该衍生物的结构示于图20a(称为N-His7)，在06-34-18整个第二环的范围内。
为了试图修饰肽骨架本身的结构，肽键的还原形式引入Leu6和His7之间(图20b)。这里，Ala6取代Leu6，此残基的羰基还原成亚甲基，一并得到缺乏天然肽键的键连。这种衍生物称作“还原酰胺”或“假肽键”，并称为ψCH2NH。由于在这个位置上没有羰基，肽不能在该位置上水解，并应推断肽具有有利的蛋白酶稳定性特征。
在血浆分析中，两种肽衍生物(Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4 N-His和Ac- (06-34-18)Phe2 Tyr4 Ala(ψCH2NH)6)在环2中展示出显著提高的稳定性。观察到的片段仅相当于环1在Arg5位置上的降解。效能数据概括在表25b中。正如预期的那样，N-His衍生物表现出强烈降低的结合。然而，假酰胺肽Ac-(06-34-18) Phe2 Tyr4 Ala(ψCH2NH)6保持了很好的效能，为1.5nM的Kd。
实施例9：通过在环1和环2中的选择性化学修饰，产生强效的、大鼠和人血浆稳定 的、交叉反应的双环肽前导物
通过上面的两个实施例，鉴定了增强环2蛋白酶稳定性同时显示良好效能的几个环2修饰。期望在建立PK/PD的动物模型中保留对大鼠血浆激肽释放酶适当的效能。对于合适的环2稳定性增强的候选物，比较性的大鼠效能总结在表26a 中。大部分分子对大鼠血浆激肽释放酶显示出<100nM的效能。
在实施例1-6中，已公开了方法，通过这种方法06-34-18的环1可以相对于血浆蛋白酶稳定。这些有利的修饰可以和增强血浆稳定性的环2修饰相组合(实施例7、8)。制备几个有代表性的候选物，并评价人/大鼠血浆稳定性，及对人/ 大鼠血浆激肽释放酶的效能(表26b)。
值得注意的是，和单独具有环2修饰的肽相比，和环1修饰(modifier)组合时大部分的肽显示出对人和鼠激肽释放酶更好的效能(表26a)。大部分的效能都用于治疗和PK/PD目的可接受的范围内(见人和大鼠激肽释放酶的数据，表26b)。
由于环1中引入HArg5来取代Arg5，以及由于环2中引入了降低His7位点处蛋白酶解的修饰，表26a和26b中显示的肽，应在人和大鼠血浆中展现增强的稳定性。
像之前一样，使用MALDI TOF分析(方法#1和#2)比较性评价血浆稳定性，随着时间的推移观察到肽水解片段的形成(对于野生型的稳定性，见图18a、21a、 21b)。相较于野生型肽，多变体(multivariant)肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6(人血浆稳定性：图21d，大鼠血浆稳定性：图21e)和 Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9(人血浆稳定性：图21c)在人、大鼠血浆中均显示显著增强的稳定性。
总之，这表明在06-34-18的环1和环2中适当的修饰可组合用于产生高度强效的、交叉反应的、且血浆稳定的双环肽，其显示适于治疗目的的特征。
实施例10：两个前导肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6和 Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9有利的体内药代动力学性质
肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6(其包含增强亲和性的修饰Aze3和增强血浆蛋白酶稳定性的修饰HArg5和增强血浆蛋白酶稳定性的环2 Ala6和His7之间的还原酰胺键)和Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9(其包含增强亲和性的修饰Aze3和增强血浆蛋白酶稳定性的修饰HArg5 和环2中的D-Asp9)被选择用于大鼠中的药代动力学评估。Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6的完整化学结构示于图22。
对两种肽的从大鼠循环中的清除率进行了评估，并与对照肽相比，对照肽由 Ac-(06-34-18)(TMB)序列组成，其氨基酸被每个相应的D-对映异构体取代(序列因此是“(Ac-cswparclhqdlc-NH 2(TMB))。这种对照肽具有相同的原子和序列组成，保留了类似的物理化学性质，缺乏对激肽释放酶靶标的任何效能，并且重要的是完全耐受蛋白酶解活性。因此，全D Ac-06-34-18对照肽从大鼠循环中清除大多经肾脏驱动，因为没有蛋白酶解驱动的清除。因此，基于06-34-18序列的任何优化的蛋白酶稳定性且强效的激肽释放酶抑制性双环，应该以相似于对照全 -D 06-34-18肽的速率从大鼠循环中清除。
以1.02mg/mL(含2.9％DMSO)在PBS缓冲溶液中作为静脉注射(boli)的形式以5.2mg/kg，将肽应用到Sprague Dawley大鼠，在给药后5、10、20、30、 60、120和240分钟通过临时留置的高静脉插管(tall vein cannulae)从每只动物采集一系列的血液样本，并转移至EDTA管中用于产生血浆。对于肽“全D Ac-06-34-18”从3只大鼠获取数据，对于“Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6”从2只大鼠获取数据，以及对于“Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9”从2只大鼠获取数据。
然后用3倍体积的1:1乙腈和甲醇混合物处理血浆样本，通过离心除去沉淀的蛋白质，用UPLC-MS/MS分析上清。
对样本中肽含量的量化参考对照大鼠血浆中制备的校准线。使用来自SummitResearch Services的软件包PK解决方案2.0，通过非房室模型分析 (non-compartmentalanalysis)确定药代动力学参数。
肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6显示48分钟的消除半衰期，而对照全D 06-34-18肽以54分钟的半衰期清除。两种肽的分布体积是相当的(表27，图23)，因此，药理学上活性的Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6肽和药理学上惰性、蛋白酶稳定的全D 06-34-18对照肽一样稳定，表明Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6具有有利的性能以便进一步发展作为治疗剂(图23)。肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9清除更快，但是消除半衰期约27分钟。
三种肽的静脉内药代动力学参数总结于表27。
结果强调肽Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6在大鼠体内循环中增强的蛋白酶解稳定性。5.8mL/分钟/kg的清除非常接近公布的大鼠肾小球滤过率(renal filtration rate)(约8-9mL/分钟/kg)，这表明这种双环肽的血浆蛋白酶驱动的清除是几乎不存在的(Jobin J,Bonjour JP,(1985)Am J Physiol.；248(5 Pt 2):F734-8)。
除非另有指明，和本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明。适合这种用途的方法、装置和材料如上描述。本文引用的所有出版物通过参考其全部并入此处，目的在于描述和公开出版物中报道的方法、试剂、和工具，其可以和本发明联合使用。
表格
表1：
PCT/EP2012/069898中公开的Ac-06-34-18的效能、大鼠血浆稳定性和物种交叉反应性。1根据方法#1确定的。2根据方法#3确定的。表转自PCT/EP2012/069898。
表2：
不同的环1-修饰的06-34-18肽衍生物的离体大鼠和人血浆稳定性总结，通过方法#3确定的。
表3a：
环2中的丙氨酸扫描。将获得的效能和WT进行比较，对在人血浆中孵育后观察到的肽片段进行标注。
表3b：
环2中的D氨基酸扫描。将获得的效能和WT进行比较，对在人血浆中孵育后观察到的肽片段进行标注
表 3c：
环2中的D丙氨酸扫描。将获得的效能和WT进行比较。片段和采用全D氨基酸取代所看到的那些相似(表 3b)。注意到，还评价了Ac-(06-34-18)和 Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4。
D-丙氨酸扫描 Ki(nM) F(Ki<sub>var</sub>/Ki<sub>WT</sub>)
Ac-(06-34-18)D-Ala6 1037.00 2469
Ac-(06-34-18)D-Ala8 11.67 28
Ac-(06-34-18)D-Ala9 0.87 2
Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4 D-Ala6 9453.00 22507
Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4 D-Ala8 242.60 578
Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4 D-Ala9 19.87 47
Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4 D-Ala10 572.15 1362
表4:5×5肽
表5：基于用天然氨基酸进行的非关键残基的鉴定的06-34-取代
*：残基编号从左到右，其中残基1-5在环1中，残基6-10在环2中。
表6：基于用N-甲基化氨基酸进行的非关键残基的鉴定的06-34-取代
肽 序列 Ki人PK(nM)
06-34 ACRWPARCVHQDLCA 0.128
06-34-03–Ala1,6 AC<u>A</u>WPARC<u>A</u>HQDLCA 0.147
06-34-03-N-MeGly1,6 AC(<u>N-MeG</u>)WPARC(<u>N-MeG</u>)HQDLCA 24.8
06-34-18 AC<u>S</u>WPARC<u>L</u>HQDLCA 0.040
06-34-18–N-MeSer1 AC(<u>N-MeS</u>)WPARC<u>L</u>HQDLCA 0.560
表7
表8
表9
D氨基酸取代对效能和大鼠血浆稳定性的比较性影响
表10
环1残基的N-甲基化和Cys2对效能和大鼠血浆稳定性的比较性影响
表11
Ac-06-34-18(TMB)-NH2中精氨酸类似物对效能和稳定性的比较性影响。注意到ΔArg修饰不显示任何高达100μM肽的抑制。
表12
Ac-06-34-18(TMB)-NH2中疏水氨基酸取代Trp2的比较性亲和性影响
表13
针对带有γ-碳取代基的脯氨酸衍生物、各种环尺寸的类似物、双/三环衍生物以及受限制的氨基酸(比如Aib)，获得的比较性亲和性
表14
Ser、Ala4和Cys2多重(miscellaneous)取代的比较性影响
表15
通过在血浆稳定的候选物中并入Aze3所诱导的效能的比较性增强。1根据方法#1估计的比较性稳定性。2根据方法#3确定大鼠血浆中真实的肽稳定性的半衰期。3IC50值是相对的，不是绝对的。
表16
将Aba4纳入含有Aze3以及血浆稳定的修饰NMeArg5、HomoArg5和 4GuanPhe5的肽时，对效能的影响
表17
在06-34-03序列内的位置2、3、4和5上采用随机化的WPAR基序，从筛选中鉴定了42个独特的激肽释放酶结合物(binder)。根据激肽释放酶的结合对序列进行排列，总的筛选输出中的相对丰度进行标注。
表18
A.特定基序在各个输出中的丰度。根据筛选的严谨度分析输出序列。计算特定基序在来自特定严谨度筛选的输出中的％。B.在位置2、3、4和5上的特定基序与人血浆激肽释放酶的结合(其中位置1、6、7、8、9和10固定至06-34-03的那些)。
表19
前50名含有固定的WPAR基序的激肽释放酶结合物。在双环文库中WPAR 序列是固定的，其中位置1、6、7、8、9和10随机化。分离激肽释放酶筛选输出序列，并分析激肽释放酶的结合。根据激肽释放酶的结合对序列进行排序。从筛选中分离肽06-34-03的序列，用红色突出显示。含WPAR的激肽释放酶结合肽的第二环中的趋势可见。
表20
来自激肽释放酶筛选的输出序列，其中在第一环中采用固定的WPAR，并且根据源自“THxxL”基序(A)还是源自“xHxDL”基序(B)，对它们相关的激肽释放酶结合分析信号进行分组。针对给定组的所有成员，计算平均结合分析信号。含有精确给定的基序的组，以绿色突出显示；显示了具有一个以上或一个以下偏离基序的改变的组的示例。
表21
WPAR基序变体的亲和性和稳定性
表22
在Phe2/Tyr4上用疏水类似物进行取代的影响
表23
Arg5取代和Aze3对Ac-06-34-18(TMB)-NH2 Phe2Tyr4影响的总结。1根据方法#1估计的比较性稳定性。2根据方法#3确定在大鼠血浆中真实的肽稳定性的半衰期。3IC50值是相对的，不是绝对的。
表24a
在位置6上单氨基酸取代的影响。在Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4(左栏)和 Ac-(06-34-18)(右栏)的情况时测试修饰。
表24b
在位置7上单氨基酸取代的影响。仅仅在Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4的情况时测试修饰。
残基7修饰 Ki(nM) F(Ki<sub>var</sub>/Ki<sub>WT</sub>)
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4(wild type) 0.42 1
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Phe7 43 102
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Thi7 34 80
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 4ThiAz7 14 33
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 1,2,4‐TriAz7 455 1084
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 4FuAla7 17 39
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 2Pal7 53 126
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 3Pal7 130 308
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 4Pal7 79 187
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Dap7 246 586
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Agp7 672 1599
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Agb7 2253 5365
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 His1Me7 10 23
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 His3Me7 292 696
表24c
在位置8上单氨基酸取代的影响。仅仅在Ac-(06-34-18)Phe2 Tyr4的情况时测试修饰。
残基8修饰 Ki(nM) F(Ki<sub>var</sub>/Ki<sub>WT</sub>)
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Thr8 4.23 10
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Thr7 Thr8 Glu9 81.02 193
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Asp8 3.83 9
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Glu8 2.53 6
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Dap8 5.49 13
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 bHGln8 16.83 40
表25a
环2中的α-N-甲基化氨基酸扫描。获得的效能和WT进行比较，以及标注在人血浆中孵育后观察到的肽片段。
表25b
环2中的肽骨架修饰
肽骨架修饰 Ki(nM) F(Ki<sub>var</sub>/Ki<sub>WT</sub>)
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 N‐His7 218 519
Ac‐(06‐34‐18)Phe2 Tyr4 Ala(ψCH2NH)6 1.47 4
表26a
对人和大鼠血浆激肽释放酶增强的血浆蛋白酶稳定性的候选物的环2比较性效能。
表26b
环1和环2-修饰的06-34-18衍生物的比较性效能。注意到将Aze3(亲和性增强)和HArg5(血浆稳定性增强)修饰纳入环1，将增强稳定性的修饰纳入环2。
表27
Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Ala(ψCH2NH)6、Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3Tyr4 HArg5 D-Asp9和Ac-(06-34-18)全D对照在大鼠中的药代动力学参数。由于 Ac-(06-34-18)Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 D-Asp9在两个大鼠个体中差异的(divergent) 肽浓度，不能以一定的置信度计算清除率和分布体积。

Claims (13)

1.一种对人激肽释放酶特异的肽配体，所述肽配体包含多肽，所述多肽含有被至少两个环序列分开的至少三个反应基团、和与所述多肽的反应基团形成共价键的分子支架，从而在所述分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述肽配体的环包含五个氨基酸，并且一个环包含基序GrA(ψCH2NH)HQ/TxLGr，其中x表示任何氨基酸，Gr表示反应基团。
2.根据权利要求1所述的肽配体，其中所述多肽包含第一环和第二环，所述第一环包含基序GrxWPARGr或GrxFPYRGr，所述第二环包含基序GrA(ψCH2NH)HQ/TxLGr。
3.根据权利要求2所述的肽配体，其中在第一环中P被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或在第一环中R被N-甲基精氨酸或高精氨酸或胍基-苯丙氨酸取代。
4.根据权利要求3所述的肽配体，其中所述多肽包括含有基序GrxFPYRGr的第一环，其中P被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸或高精氨酸或胍基-苯丙氨酸取代。
5.根据权利要求1所述的肽配体，其中Gr是半胱氨酸。
6.根据权利要求1所述的肽配体，其包含Cys Ser1 Phe2 Aze3 Tyr4 HArg5 Cys Ala(ψCH2NH)6 His7 Gln8 Asp9 Leu10 Cys。
7.根据权利要求1所述的肽配体，其包含：
8.根据权利要求1所述的肽配体，其附着至抗体或其片段。
9.一种组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的肽配体和药学上合适的载体。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的肽配体在制备用于预防、抑制或治疗炎症状态、变应性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染、眼科疾病和自体免疫性疾病的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其用于预防、抑制或治疗眼科疾病。
12.根据权利要求11所述的用途，其中眼科疾病包括渗出性和/或炎症性眼科疾病，涉及视网膜血管渗透性和/或完整性受损的疾病，涉及视网膜微血管破裂而导致灶性出血的疾病，眼后部的疾病，视网膜疾病和眼前部的疾病，选自：年龄相关性黄斑变性， 黄斑水肿，眼睑水肿， 视网膜水肿， 糖尿病性视网膜病变， 急性黄斑视神经视网膜病变， 脉络膜视网膜病变， 脉络膜血管新生， 新生血管性黄斑病变， 新生血管性青光眼， 阻塞性动脉和静脉视网膜病， 弥散性血管内凝血病， 高血压性眼底改变， 眼部缺血综合征， 视网膜动脉微动脉瘤， Coat病， 旁中心凹毛细血管扩张， 视乳头静脉炎， 颈动脉病， 霜样树枝状脉管炎， 镰状红细胞性视网膜病， 血管样条纹， 疾病、眼伤或眼外科手术所导致的黄斑水肿发作， 损伤、外伤或肿瘤所导致的视网膜缺血或变性， 葡萄膜炎， 虹膜炎， 视网膜脉管炎， 眼内炎， 全眼球炎， 转移性眼炎， 脉络膜炎， 视网膜色素上皮炎， 结膜炎， 睫状体炎， 巩膜炎， 巩膜外层炎， 视神经炎， 角膜炎， 睑炎， 渗出性视网膜脱离， 角膜溃疡，结膜溃疡， 慢性钱币状角膜炎， 泰格森角膜炎， 进行性蚕蚀性角膜溃疡，由细菌或病毒感染以及眼科手术所引起的眼炎症性疾病，由眼的物理损伤引起的眼炎症性疾病，眼炎症性疾病引起的症状，包括痒、耀斑、水肿和溃疡、红斑、硬皮病、皮炎、血管神经性水肿、喉头水肿、声门水肿、声门下喉炎、支气管炎、鼻炎、咽炎、鼻窦炎、喉炎或中耳炎。
13.根据权利要求12所述的用途，其中年龄相关性黄斑变性选自渗出性黄斑变性和老年盘状黄斑变性；黄斑水肿是囊样黄斑水肿；脉络膜视网膜病变是中心性浆液性脉络膜视网膜病变；阻塞性动脉和静脉视网膜病选自视网膜静脉阻塞和视网膜动脉阻塞；视网膜静脉阻塞选自中央视网膜静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞和半侧视网膜静脉阻塞；视网膜动脉阻塞选自中央视网膜动脉阻塞和视网膜分支动脉阻塞；红斑选自红斑渗出性多形性红斑、结节性红斑和环形红斑；以及视神经炎选自球后视神经炎。
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