CN102405060A - 多特异性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供多特异性肽配体的方法，所述多特异性肽配体包含在三个或更多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的、能够结合两种或更多种独立的靶的多肽，所述方法包括步骤：（a）提供多肽的第一集合，每个多肽包含能够与分子支架共价连接的两个或更多个反应基团，以及至少一个环，所述环包含在所述反应基团的两个之间对向的两个或更多个氨基酸的序列；（b）提供如（a）中描述的多肽的第二集合；（c）将所述第一集合的一个或更多个成员的至少一个环连接到所述第二集合的一个或更多个成员的至少一个环，来形成包含两个环的至少一个多肽，和（d）在至少三个氨基酸位置处将所述复合多肽轭合到分子支架。

Description

多特异性肽
本发明涉及肽，其结构通过与化合物的结合来限制，所述化合物提供了结构主干，为所述肽赋予构象。特别地，本发明涉及这样的肽，其具有对两种或更多种分子靶的结合亲和性，所述分子靶可以是相同的或不同的。
具有双特异性的多肽是本领域已知的。特别地，已经设计了抗体分子，其能够同时地结合两种不同的抗原，或结合同一抗原分子上的两个表位。
包含VH和VL区域的互补配对的双特异性抗体是本领域已知的。这些双特异性抗体包含VH和VL的两个配对，每个VHVL对结合单个抗原或表位。这样的双特异性抗体包括杂交的杂交瘤（Milstein & Cuello AC, Nature 305: 537-40），迷你抗体（minibodies）（Hu et al.,（1996）Cancer Res 56: 3055-3061；），双抗体（diabodies）（Holliger et al.,（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,6444-6448 ；WO 94/13804），螯合重组抗体（CRAbs；（Neri et al.,（1995）J. Mol. Biol. 246,367-373），biscFv（例如，Atwell et al.,（1996）Mol. Immunol. 33, 1301-1312），"knobs in holes" 稳定化的抗体（Carter et al.,（1997）Protein Sci. 6, 781-788）。在每种情况下，每个抗体种类包含两个抗原结合位点，各自由VH和VL结构域的互补配对构成。每种抗体从而能够同时结合两个不同的抗原或表位，与每个抗原或表位的结合由VH和其互补的VL结构域介导。
两种不同的抗体结合特异性此外可以合并到同一结合位点。大多数情况下，与结构上相关的抗原或表位对应的、或与广泛地交叉反应的抗体对应的两种或更多种特异性可以被靶向。例如，已经描述了交叉反应的抗体，通常其中两个抗原在序列和结构上相关，例如，鸡蛋白溶菌酶和火鸡溶菌酶（McCafferty et al., WO 92/01047），或涉及游离半抗原，或涉及与载体轭合的半抗原（Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13: 14 3245-60）。在进一步的实例中，WO 02/02773（Abbott Laboratories）描述了具有“双特异性”的抗体分子。所指的抗体分子是针对多个抗原产生的或选择的，从而它们的特异性跨越超过一种单独的抗原。WO 02/02773的抗体中每个互补的VH/VL配对规定了对两种或更多种结构上相关的抗原的单个结合特异性；这样的互补配对中的VH和VL结构域各自不具有独立的特异性。抗体因而具有涵盖两种结构上相关的抗原的广泛的单独特异性。
此外，已经描述了多反应性的天然的自身抗体（Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531），与结构上不相关的至少两种（通常更多种）不同的抗原或表位反应。还已经显示的是，利用噬菌体展示技术对单克隆抗体的随机的肽集合的选择将鉴定出拟合抗原结合位点的一系列肽序列。一些序列是高度相关的，拟合共有序列，而其他的是相当不同的，被称为模拟表位（Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993,5, 268-271）。因此清楚的是，包含相关和互补的VH和VL结构域的抗体的结合位点具有结合来自大量已知抗原的多种不同抗原的潜力。
WO03/002609（Domantis）描述了双特异性抗体的生产，其中每个VH/VL配对具有双特异性，即，能够结合相同的或不同的抗原上的两个表位。构象可以是开放的或闭合的；在开放构象中，两个表位可以同时地结合，但是在闭合构象中，与第一表位的结合阻止或阻碍了与第二表位的结合。
具有多种结合特异性的非免疫球蛋白蛋白质是自然中已知的；例如，多种转录因子结合DNA和其他蛋白质分子。然而，在现有技术中选择结合肽的方法仅选择具有单一特异性，而非双或多特异性的肽。
不同的研究小组早先用半胱氨酸残基将多肽拴系到合成的分子结构上（Kemp, D. S. and McNamara, P. E., J. Org. Chem, 1985；Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005）。Meloen和同事使用了三（溴甲基）苯和相关的分子用于在合成的支架上多个肽环的快速和定量的环化，用于蛋白质表面的结构模拟（Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005）。在WO2004/077062和WO 2006/078161中公开了产生候选药物化合物的方法，其中所述化合物通过将含有半胱氨酸的多肽连接到分子支架例如三（溴甲基）苯上来产生。
WO2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。特别地，该文献公开了包含第一和第二反应基团的各种支架分子，在偶联反应中用进一步的分子接触所述支架来形成所述支架和所述进一步的分子之间的至少两个连键。
WO2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和肽模拟物。该文献公开了取自现有蛋白质的肽的各种集合的人工合成。这些肽然后与具有引入的某些氨基酸改变的恒定的合成肽组合，来产生组合文库。通过经由化学键来分隔特征在于各种氨基酸变化的肽，而引入这样的多样性，提供了找到期望的结合活性的提高的机会。该文献的附图7显示了各种环肽构建体的合成的示意图。然而，产生的肽具有单特异性。在提供多个肽环时，所述环协同结合单个靶标。
在我们的共同待决的未公开的国际专利申请PCT/GB2009/000301中，我们公开了生物选择技术，例如，噬菌体展示的运用，来选择拴系到合成的分子结构上的肽。
发明概述
根据拴系到分子支架上来形成至少两个肽环的多肽，我们开发了多特异性结合多肽。可以以三种方式之一实现多特异性。
在本发明的第一架构中，通过多肽与分子支架的相互作用形成的多肽环能够结合超过一个靶。在这种结构内，在一个实施方式中，对于与期望的靶的结合，环可以单独地选择，然后组合。在另一个实施方式中，对于与不同的期望靶的结合，作为单个结构的部分，一起选择环。
在第二架构中，官能团可以连接于多肽的N或C末端，或两个末端。官能团可以采取结合基团的形式，例如，多肽，包括抗体结构域、Fc结构域，或如上所述的能够结合靶的进一步结构化的肽。此外可以采取能够化学键接靶的反应基团的形式。此外，它可以是效应物基团，包括大的血浆蛋白质，例如，血清白蛋白和细胞穿透肽。
在第三架构中，官能团可以连接于分子支架本身上。官能团的实例如前述的结构。
第一架构
根据本发明的第一架构的第一方面，因而，提供了用于提供多特异性肽配体的方法，所述多特异性肽配体包含在三个或更多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的、能够结合两种或更多种独立的靶的多肽，所述方法包括步骤：
（a）提供多肽的第一集合，每个多肽包含能够与分子支架共价连接的两个或更多个反应基团，以及至少一个环，所述环包含在所述反应基团的两个之间对向的两个或更多个氨基酸的序列；
（b）提供如（a）中描述的多肽的第二集合；
（c）将所述第一集合的一个或更多个成员的至少一个环连接到所述第二集合的一个或更多个成员的至少一个环，来形成包含两个环的至少一个多肽，和
（d）在至少三个氨基酸位置将所述复合的多肽轭合到分子支架上。
通过将对结合不同的靶负责的不同分子的部分连接在一起，本发明因而提供了多特异性分子的制备。这些是在分子支架的连接点之间对向的环，所述连接点由反应基团来限定。优选的，在组合形成第三集合之前，对于与所述第一和第二靶的结合，筛选所述第一和第二集合。
针对第一和第二靶的筛选可以以几种形式进行。例如，第一或第二集合可以轭合到分子支架用于筛选。做为选择，特别是对于单环集合来说，成员可以通过容许反应基团配对，例如通过二硫化物键合来内部地交联。
明显的是，几种排列是可能的。第一和第二集合可以包含一个、两个或更多个肽环。在存在超过一个环时，针对第一或第二靶的结合的选择将不会区分涉及超过一个环的协作结合与单个环的单独结合。因而，来自第一或第二集合中的分子的环的分离不能确保单独的环足够靶结合，或者确保任何这样的的结合能力将转移给靶分子。如果第一和第二集合包含单环，更可能的是这种环足够满足靶结合，这种能力将转移到杂交分子。
因而，在一个实施方式中，所述第一和/或第二集合的成员轭合到分子支架来形成单个多肽环。单个环的运用提高了当将环连接到来自另一个集合的那些时结合活性将转移以产生多特异性多肽的概率。
然而，当第一和/或第二集合是包含两个或更多个环的多肽时，这样的环可以从多肽中分离并与来自另一个集合的多肽的单个环组合。在这样的情况下，与所述多肽的单独一个相应的多肽成员的一部分连接到第二集合的多肽的至少一个环。在某些情况下，全部多肽可以连接到来自另一个集合的其他多肽，如下文进一步描述的。
在一个实施方式中，所述第一和第二集合被组合来形成第三集合，其针对与第一和第二靶的结合被筛选。第一和第二集合可以单独针对所述靶来预先筛选，或可以是首次用于实验的(naïve)。优选的，集合之一被预先筛选；另一个可以是首次用于实验的。
在一个实施方式中，提供了用于提供多特异性肽配体的方法，所述多特异性肽配体包含在三个或更多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的、能够结合两种或更多种独立的靶的多肽，所述方法包括步骤：
（a）提供多肽的第一集合；
（b）将所述多肽轭合到分子支架上，所述分子支架在两个或更多个氨基酸残基处结合所述多肽，来形成多肽轭合物的第一集合；
（c）针对与第一靶的结合筛选所述第一集合，选择结合所述第一靶的所述第一集合的成员；
（d）用多肽的第二集合重复步骤（a）到（c），产生结合第二靶的多肽轭合物的第二集合；
（e）分离来自所述第一和所述第二集合的成员的环，组合它们来形成多肽轭合物的第三集合，其中所述多肽在至少三个氨基酸处结合所述分子支架，选择能够结合第一和第二靶两者的分子。
结合能力从含有两个环的分子到仅含有所述环之一的杂交分子的转移可能是低效的。因而，与其他实施方式一样，高效的筛选能力是高度期望的。筛选可以通过分析单个分子来进行。在WO 2004/077062 和WO2006/078161中提供了这样的方法。单个化合物或小的化合物集的筛选是冗长的，如果分析大量的化合物将是昂贵的。可以用筛选分析来分析的化合物的数量一般不超过几千个。
在优选的实施方式中，多肽的集合以核酸文库的形式提供，作为遗传展示系统的部分来合并。可应用的系统包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体或多核糖体展示、mRNA展示和在人工微囊中体外表达。优选的技术是利用丝状噬菌体的细菌噬菌体展示。
优选的，本发明的多肽轭合物是双特异性的，仅包含两个环。几个这样的多肽轭合物可以一起合并到同一蛋白质中。例如，相同特异性的两个这样的多肽轭合物可以连接在一起，例如，N-末端到C-末端，提高配体对它的靶的亲和性。做为选择，在另一个实施方式中，多个双特异性多肽轭合物被组合来形成多聚体。例如，两个不同的双特异性多肽轭合物被组合来产生四特异性分子。做为选择，三个或更多个多肽轭合物，其可以是相同的或不同的，可以组合来形成多特异性配体。
在一个实施方式中，多价的复合物可以通过将分子支架连接在一起来构建。这在下文进一步讨论。
所述第一和第二靶是不同的。它们可以是多肽、蛋白质或核酸，或是其一部分，所述多肽、蛋白质或核酸可以是天然存在的或是合成的。靶可以是表位，这样的表位可以在相同的或不同的分子上。
本领域技术人员将理解，靶分子的选择是大的和可变的。它们可以是例如人类或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的酶辅助因子或DNA结合蛋白。适合的细胞因子和生长因子包括但不限于：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心脏营养素-1、EGF、EGF受体、ENA78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、FGF-酸性、FGF-碱性、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、Fractalkine（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-I、胰岛素、IFNy、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-1（3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72a.a.）、IL-8（77a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17a、IL-17c,IL-17d、IL-17e、IL-17f、IL-18（IGIF）、IL-21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质化细胞生长因子-2（KGF-2）、KGF、Leptin、LIF、Lymphotactin、Mullerian抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞吸引蛋白、M-CSF、MDC（67a.a.）、MDC（69a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67a.a.）、MDC（69a.a.）、MIG、MlP-la、MIP-1p、MIP-3a、MIP3、MIP-4、骨髓祖代抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、Neurturin，神经生长因子、P-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFIa、SDFIp、SCF、SCGF、干细胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-2、TGF-3、肿瘤坏死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1,1-309、HER1、HER2、HER3和HER4；细胞因子受体包括上述细胞因子的受体。趋化因子靶包括CC趋化因子配体CCL21/6Ckine、CCL12/MCP-5、CCL6/C10、CCL22/MDC、CCL14/HCC-1/HCC-3、CCL3L1/MIP-1alpha同种型LD78beta、CCL23/Ckbeta8-1、CCL3/MIP-1alpha、CCL28、CCL4L1/LAG-1、CCL27/CTACK、CCL4/MIP-1beta、CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2、CCL15/MIP-1delta、CCL26-like/Eotaxin-3-like、CCL9/10/MIP-1gamma、CCL26/Eotaxin-3、CCL19/MIP-3beta、CCL11/Eotaxin,CCL20/MIP-3alpha、CCL14a/HCC-1、CCL23/MPIF-1、CCL14b/HCC-3、CCL18/PARC、CCL16/HCC-4、CCL5/RANTES、CCL1/I-309/TCA-3、TAFA1/FAM19A1、MCK-2、TAFA5/FAM19A5、CCL2/JE/MCP-1、TAFA3/FAM19A3、CCL8/MCP-2、TAFA4/FAM19A4、CCL7/MCP-3/MARC、CCL17/TARC、CCL13/MCP-4和CCL25/TECK；趋化因子受体包括CCR1、CCR7、CCR2、CCR8、CCR3、CCR9、CCR4、CCR10、CCR5、CCRL2/LCCR/CRAM-A/B和CCR6；CXC趋化因子配体包括CXCL13/BLC/BCA-1、CXCL10/IP-10/CRG-2、CXCL14/BRAK、LIX、CXCL16、CXCL15/Lungkine、CXCL5/ENA-78、CXCL9/MIG、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL1/2/3/GRO、CXCL4/PF4、CXCL1/GROalpha/KC/CINC-1、CXCL12/SDF-1alpha、CXCL2/GRObeta/MIP-2/CINC-3、CXCL12/SDF-1beta、CXCL3/GROgamma/CINC-2/DCIP-1、CXCL12/SDF-1、CXCL11/I-TAC、CXCL7/胸腺趋化因子-1和CXCL8/IL-8；CXC趋化因子受体包括CXCR3、CXCR7/RDC-1、CXCR4、CXCR1/IL-8RA、CXCR5、CXCR2/IL-8RB和CXCR6；TNF超家族配体包括4-1BB配体/TNFSF9、LIGHT/TNFSF14、APRIL/TNFSF13、淋巴毒素、BAFF/BLyS/TNFSF13B、淋巴毒素β/TNFSF3、CD27配体/TNFSF7、OX40配体/TNFSF4、CD30配体/TNFSF8、TL1A/TNFSF15、CD40配体/TNFSF5、TNF-alpha/TNFSF1A、EDA（pan）、TNF-beta/TNFSF1B、EDA-A1/EctodysplasinA1、TRAIL/TNFSF10、EDA-A2、TRANCE/TNFSF11、Fas配体/TNFSF6、TWEAK/TNFSF12以及GITR配体/TNFSF18；TNF超家族受体包括4-1BB/TNFRSF9/CD137、NGFR/TNFRSF16、BAFFR/TNFRSF13C、骨保护素/TNFRSF11B、BCMA/TNFRSF17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DCR3/TNFRSF6B、TNFRH3/TNFRSF26、DcTRAILR1/TNFRSF23、TNFRI/TNFRSF1A、DcTRAILR2/TNFRSF22、TNFRII/TNFRSFIB、DR3/TNFRSF25、TRAILR1/TNFRSF10A、DR6/TNFRSF21、TRAILR2/TNFRSF10B、EDAR、TRAILR3/TNFRSF10C、Fas/TNFRSF6/CD95、TRAILR4/TNFRSF10D、GITR/TNFRSF18、TROY/TNFRSF19、HVEM/TNFRSF14、TWEAKR/TNFRSF12、淋巴毒素βR/TNFRSF3和XEDAR；Toll-样受体包括TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9；酶，包括组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP26、MMP27、MMP28、尿激酶、激肽释放酶，包括KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14和KLK15；补体系统的成分；细胞内信号分子和转录因子；p53；和MDM2。
靶还可以是大的血浆蛋白质，例如，血清白蛋白，如下文阐述的。
将理解的是，这个列表决不是穷举的。
靶还可以是大的血浆蛋白质，例如，血清白蛋白，如下文阐述的。
将理解的是，这个列表决不是穷举的。当多肽轭合物结合两个表位（在相同的或不同的靶上）时，靶分子可以选自这个列表。
所述靶可以竞争与多肽轭合物的结合，从而它们两者不能同时结合。做为选择，它们两者可以同时地结合，从而所述多肽轭合物桥接所述靶。在这样的实施方式中，第三集合可以同时地针对第一和第二靶来筛选。
在第二方面，本发明提供了多特异性多肽轭合物，其包含共价连接到分子支架的肽配体。根据本发明的轭合物结合至少两个靶。有益地，所述轭合物可通过上文阐述的方法获得。
有益地，双特异性多肽轭合物可以包含能够结合靶分子的第一结合功能，以及能够结合延长轭合物的体内半衰期的分子或基团的第二结合功能。例如，所述分子或基团可以是体积大的试剂，例如，HSA或细胞基质蛋白质。在一个实施方式中，所述双特异性轭合物可以能够仅在半衰期增强分子或基团的替代上结合目标分子。因而，例如，通过体积大的分子例如HSA，双特异性轭合物维持在受试者的血流的循环中。当靶分子遭遇时，双特异性轭合物的结合功能之间的竞争引起HSA的替代和靶的结合。
在第三方面中，本发明的第一架构提供了编码在此定义的至少双特异性轭合物的一种或更多种核酸分子。
所述核酸可以进一步编码信号序列，用于在表达时多肽从宿主细胞输出，以及在表达时可以与丝状细菌噬菌体颗粒的表面成分（或遗传展示系统的其他成分）融合。
在进一步的方面中，本发明提供了包含根据本发明的核酸的载体。
在又进一步的方面中，本发明提供了用根据本发明的载体转染的宿主细胞。DNA载体可以是噬菌体基因组；然而，如下文阐述的，本发明人解决了轭合到分子支架的肽的噬菌体展示所固有的难题，涉及的化学处理可以影响噬菌体的感染性。因而，当感染性受牵连时，优选的是将噬菌体DNA转染到细胞中。
这样的载体的表达可以被配置以产生，例如，在细菌噬菌体颗粒的表面上，用于选择的可变域。这容许选择展示的可变区，因而使用本发明的方法选择双特异性轭合物。
第二架构
根据本发明的第二架构，另外的结合或功能活性可以连接到与分子支架共价连接的肽的肽N或C末端。因此，本发明提供了包含与分子支架共价连接的多肽、轭合到一个或更多个官能团的肽配体。
所述官能团是，例如，选自以下构成的组：能够结合延长肽配体的体内半衰期的分子的基团，以及延长肽配体的体内半衰期的分子。这样的分子可以是，例如，HSA或细胞基质蛋白质，所述能够结合延长肽配体的体内半衰期的分子的基团是特异于HSA或细胞基质蛋白质的抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，所述官能团是结合分子，选自由包含与分子支架共价连接的多肽的第二肽配体，以及抗体或抗体片段构成的组。连接包含与分子支架共价连接的多肽的肽配体提供了产生双特异性分子的可选择的方式，其中具有期望的特异性的肽配体被连接在一起，优选的N末端到C末端，来形成多特异性分子。2、3、4、5个或更多个肽配体可以这样连接在一起。这些配体的任何两个或更多个的特异性可以是相同的或不同的；如果它们是相同的，将形成多价的结合结构，相比单价的结合分子其具有对靶的提高的亲和性。此外，分子支架可以是相同的或不同的，可以对向相同或不同数量的环。
官能团此外可以是效应物基团，例如，抗体Fc区。
连接到N或C末端可以在将肽结合到分子支架之前或之后进行。因而，可以产生（合成地，或通过核酸的表达）肽，其中N或C末端多肽基团已就位。然而优选的，向N或C末端添加在肽与分子主干组合形成轭合物之后进行。因而，有益地，能够结合期望的官能团的基团被连接到肽，来允许官能团自身的随后的连接。例如，芴甲氧羰基氯化物可以用于在多肽的N-末端导入Fmoc保护基团。Fmoc以高亲和性结合包括HSA的血清白蛋白，Fmoc-Trp或FMOC-Lys以提高的亲和性结合。例如在实施例3中所示的，可以合成肽，其中保留Fmoc保护基团，然后通过半胱氨酸与支架联结。Fmoc基团为二环的肽赋予了人血清白蛋白结合功能。做为选择，如实施例6中描述的，可以产生带有支架的肽的轭合物，然后在N-末端修饰，例如，用胺-和巯基反应性接头N-e-马来酰亚胺己酰氧基）琥珀酰亚胺酯（EMCS）。通过这个接头，肽轭合物可以连接到其他多肽，例如，抗体Fc片段。
结合功能可以是结合到分子支架的另一个肽，产生多聚体；另一个结合蛋白，包括抗体或抗体片段；或任何其他期望的实体，包括血清白蛋白或效应物基团，例如，抗体Fc区。
第三架构
在第三架构中，另外的结合或功能活性直接结合到分子支架。
有益地，分子支架包含反应基团，另外的活性可以结合到所述反应基团上。优选的，这个基团相对于分子支架上的其他反应基团是正交的，以避免与肽的相互作用。在一个实施方式中，反应基团可以是保护的和脱保护的，在轭合其他的活性所必要时。
因而，本发明提供了制备轭合到一个或更多个结合或官能团的肽配体的方法，所述肽配体包含共价连接到分子支架的多肽，所述方法包括步骤
(a) 生产所述多肽；
(b) 将它与所述分子支架轭合；和
(c) 将所述一个或更多个官能团连接到所述分子支架上。
共同方面
本发明的某些方面适合于其每个架构。例如，本发明进一步提供了至少包含根据本发明的双特异性肽配体的试剂盒。
在进一步的方面中，本发明提供了包含可通过本发明的方法获得的双特异性肽配体，以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
此外，本发明提供了使用根据本发明的双特异性肽配体或组合物治疗疾病的方法。
在本发明的一个实施方式中，所述疾病是癌症。例如，桥接双特异性肽配体可以用于征募细胞毒性T细胞到癌症标志物，或结合癌细胞表面上两个不同的靶，从而提高与细胞表面结合的亲和性或特异性。做为选择，如果一个靶的结合替换另一个，这样的抗体可以用于在癌细胞表面标志物的结合时释放药物。
在进一步的方面中，本发明提供了利用根据本发明的双特异性肽配体或组合物的诊断，包括疾病的诊断的方法。因而一般地，可以利用被分析物与双特异性肽配体的结合来替换试剂，所述试剂在替换时引起信号的产生。例如，被分析物（第二靶）的结合可以替换与肽配体结合的酶（第一靶），提供结合分析的基础，特别是如果所述酶通过它的活性位点保持在所述肽配体上。
本发明的多肽轭合物的特别的优点是小于现有技术的多特异性结合试剂。一般地，这样的配体具有小于5000道尔顿的分子量；优选的小于4000道尔顿；优选的小于3000道尔顿。要理解的是，如本发明的第二架构中描述的通过“菊花式链接(daisy-chaining)”肽配体构建的多特异性配体将具有更高的分子量。此外，结合分子例如HSA的肽配体将具有更高得多的分子量。
配体的小尺寸来自小分子支架的运用，一般质量是500道尔顿。肽本身优选的长度小于27个氨基酸，根据将其连接到分子支架的N-末端和C-末端连接点之间来测量的。当然，进一步的肽可以存在或连接到连接点的外侧，延长肽结构。多肽的每个环优选的在长度0到9个氨基酸之间，在邻近的连接点之间测量的。有益地，任何肽配体中的环独立地是长度3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
附图的简要描述
附图1显示了噬菌体克隆10和48（实施例1）对MDM2的结合，作为环状轭合物或非轭合的肽，没有用DTT预处理的，用DTT预处理的，以及用DTT和随后的糜蛋白酶预处理的。
附图2显示了肽PEP10和PEP48的荧光各向异性曲线，表明对MDM2的亲和性。参见实施例1。
附图3显示了包含来自PEP48和PK15的环的双特异性肽的荧光各向异性曲线（实施例2）。
附图4显示了Fmoc衍生物与BSA的结合的荧光各向异性曲线。
附图5显示了Fmoc-Phe-OH与HSA的结合的荧光各向异性曲线。
附图6显示了五肽Fmoc衍生物与BSA的荧光各向异性曲线。
附图7A和7B显示了合成的肽，Fmoc-WGGGACVRFGWTCSDRFRNCG-NH2的质谱和HPLC分析。
附图7C和7D显示了在与TBMB轭合之前和之后多肽的质谱。附图7E显示了轭合物的HPLC分析。参见实施例3。
附图8显示了轭合的肽通过Fmoc基团与BSA的结合。
附图9显示了轭合的双特异性肽与MDM2的结合。
发明的详细说明
除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语具有例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域中普通技术人员通常理解的相同含义。使用分子生物学、遗传学和生物化学方法的标准技术（参见ambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology（1999）4th ed., John Wiley & Sons, Inc.），通过引用将其合并在本文中。
在此提及的肽配体是指共价结合到分子支架的肽。一般地，这样的肽包含能够与支架形成共价键的两个或更多个反应基团，以及所述反应基团之间对向的序列，其被称为环序列，因为当所述肽与支架结合是它形成环。
反应基团是能够与分子支架形成共价键的基团。一般地，反应基团存在于肽的氨基酸侧链上。优选的是含有氨基的基团，例如，半胱氨酸、赖氨酸和硒代半胱氨酸。
多特异性是结合两种或更多种靶的能力。一般地，结合肽能够结合单种靶，例如，对于抗体来说是表位，由于它们的构象性质。然而，可以开发可结合两种或更多种靶的肽；双特异性抗体，例如，上文提及的本领域已知的。在本发明中，肽配体能够结合两种或更多种靶，因而是多特异性的。优选的，它们结合两种靶，是双特异性的。结合可以是独立的，这将意味着所述肽上对靶的结合位点不被靶之一或其它的结合在结构上阻碍。在这种情况下，两种靶可以独立地结合。更一般地，预期的是，一种靶的结合将至少部分地阻碍另一种的结合。
多特异性肽可以通过将结合单独靶的肽配体的单独的环连接在一起来形成。连接在一起的环可以是邻近的环，或可以由第三环、或甚至进一步的环所分隔。当环在多特异性肽中直接相邻时，优选的是限定环之一的反应基团之一被省略，以避免在一个位置上反应基团的实际的加倍。
靶是肽配体结合的分子或其部分。一般地，靶将类似于表位，因而可以采取同一分子上不同表位的形式，或不同分子上不同的表位的形式。当靶在同一分子上时，双特异性配体的使用将提高配体对分子的亲合力，由于分子的交联或分子的限定功能部分的占据，可能赋予其他性质。
分子支架是任何分子，其能够在多个点连接肽来为肽赋予一个或更多个结构特征。它不是交联接头，因为它不仅仅置换二硫键；相反，它为肽提供了两个或更多个连接点。优选的，分子支架包含肽的至少三个连接点，称为支架反应基团。这些基团能够与肽上的反应基团反应来形成共价键。分子支架的优选的结构描述如下。
集合是变体的集合，在这种情况下为多肽变体，其在它们的序列上不同。一般地，反应基团的位置和性质将不会改变，但是形成它们之间的环的序列可以是随机化的。
结合活性（或任何其他期望的活性）的筛选根据本领域公知的方法来进行，例如，来自噬菌体展示技术的。例如，固定到固相的靶可以用于鉴定和分离集合的结合成员。筛选容许根据期望的特征选择集合的成员。
术语文库是指异源的多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员具有单独的多肽或核酸序列。为此，文库与集合是同意的。文库成员之间的序列差异对文库中存在的多样性负责。文库可以采取多肽或核酸的简单混合物的形式，或可以是用核酸的文库转化的生物体或细胞的形式，例如，细菌、病毒、动物或植物细胞等等。优选的，每个单独的生物体或细胞含有仅一个或有限数量的库成员。
有益地，核酸被掺入表达载体中，以容许核酸编码的多肽的表达。在优选的方面，因而，文库可以采取宿主生物体的群体的形式，每个生物体含有表达载体的一个或更多个拷贝，所述表达载体含有核酸形式的文库的单个成员，其可以被表达来产生它的相应的多肽成员。因而，宿主生物体的群体具有编码遗传发生的各种多肽变体的大的集合的潜力。
优选的，核酸的文库编码多肽的集合。文库的每个核酸成员优选地具有与文库的一个或更多个其他成员相关的序列。相关的序列是指与文库的至少一个其他成员具有至少50%的同一性、适合地至少60%的同一性、适合地至少70%的同一性、适合地至少80%的同一性、适合地至少90%的同一性、适合地至少95%的同一性、适合地至少98%的同一性、适合地至少99%的同一性的氨基酸序列。适合地跨越至少3个氨基酸，适合地至少4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，适合地至少12个氨基酸，适合地至少14个氨基酸，适合地至少16个氨基酸，适合地至少17个氨基酸或参考序列的全长上判断同一性。
连接于肽配体的官能团是一种基团，例如，其介导进一步的结合活性，或允许效应物基团的结合。因而，官能团包括抗体和其结合片段，进一步的在此描述的肽配体，化学反应基团，等等。
效应物基团是连接到肽配体的具有特定活性的基团。例如，它可以是提高肽配体的半衰期的蛋白质，例如，人血清白蛋白（HSA）。效应物基团还包括药物，例如，细胞毒类药物，免疫效应物，例如，抗体Fc区，以及符合以下参数的化合物：至多5个氢键供体（具有一个或更多个氢原子的氮或氧原子）；至多10个氢键接受体（氮或氧原子）；分子量低于500道尔顿；以及小于5的辛醇-水分配系数log P。
多特异性肽配体
根据本发明的肽配体可以通过现有技术中已知的或在此描述技术来制备。配体的成分，特别是分子支架和多肽成分是根据Timmerman et al., 2005 ChemBioChem 6:821-824, 以及WO2004/077062、WO2006/078161和WO2008/013454已知的。选择与分子支架复合的多肽的噬菌体展示的运用在Heinis et al., 2009, Nature Chemical Biology 5, 502-507以及我们共同待决的未公开国际专利申请PCT/GB09/000301中描述了。这些文献的每一个通过引用合并在此。构建根据本发明的的多特异性分子的优选的方法以及噬菌体展示的运用以下更详细地描述。
一般地，通过（a）融合来自两个单独的单特异性肽配体的两个环；（b）融合两个完全单特异性的肽配体；（c）在N或C末端将结合基团连接到肽配体上或分子支架上；或（d）直接化学地连接官能团或效应物基团到肽配体上，优选的在分子支架上，可以构建根据本发明的多特异性分子。
（A）肽配体的构建
（i）分子支架
分子支架有时被称为“分子核心”或“连接化合物”。适合地，分子支架具有分子对称性。
适合地，分子支架具有三个支架反应基团，并具有三重对称性。这具有仅产生单个反应产物的优点。如果分子支架不是对称分子，则可以产生多种反应产物。这可以引起复杂化，或需要从其他反应产物中分离期望的同分异构体。
用于将肽轭合到分子支架的优选的反应基团是半胱氨酸。然而，当存在三个或更多个反应基团用于到分子支架的至少三个分离的共价键时，所述反应基团不必每个都是半胱氨酸。例如，三个反应基团可以包含一个半胱氨酸以及两个进一步的适合的反应基团，其可以是例如包含赖氨酸、硒代半胱氨酸或其他。最适合地，所有三个反应基团都是半胱氨酸。
在已知的技术中，充其量交联剂被导入或连接到多肽，例如遗传编码的多肽。相反，本发明提供了用于同一多肽的不同部分的多种协作的分子支架。
适合地，分子支架可以是小分子。适合地，分子支架是小的有机分子。
适合地，分子支架可以是，或可以基于天然的单体，例如，核苷、糖类或类固醇。适合地，分子支架可以包含这样的实体的短的聚合物，例如，二聚体或三聚体。
适合地，所述分子支架是已知毒性的、适合地低毒性的化合物。适合的化合物的实例包括胆固醇、核苷酸、类固醇或现有的药物，例如tamazepam。
适合地，分子支架可以是大分子。适合地，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化物组成的大分子。
适合地，分子支架包含能够与多肽的官能团反应来形成共价键的反应基团。
分子支架可以包含化学基团，如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸类、酯、链烯、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤和酰基卤。
适合地，分子支架可以包含或由三（溴甲基）苯，特别是 1,3,5-三（溴甲基）苯（TBMB）或其衍生物组成。
适合地，分子支架具有3重旋转对称，从而多肽的三个官能团与分子支架的反应产生单独的产物同分异构体。
在某些实施方式中，分子支架可以具有四面体的几何结构，从而编码的多肽的四个官能团与分子支架的反应产生至多两种产物同分异构体。
适合的分子支架是 2,4,6-三（溴甲基）均三甲苯。它类似于 1,3,5-三（溴甲基）苯，但是含有连接到苯环的另外三个甲基。这具有优点是，另外的甲基可以形成与多肽的进一步的接触，从而增加另外的结构限制。
本发明的分子支架选自小分子或大分子结构。所述分子支架由有机的、无机的，或有机和无机成分组成。
在优选的实施方式中，分子支架是小的有机分子，例如线性烷烃。更适合地，分子支架是支链烷烃，环状烷烃、多环的烷烃、芳香烃、杂环烷烃或杂环芳香烃，其提供了较低柔性的优点（即，更为刚性）最适合地,分子支架包含苄基基团。
在另一个实施方式中，所述分子支架选自大分子结构，例如，多肽、多核苷酸或多糖。
本发明的分子支架含有化学基团，其容许本发明的编码文库的多肽的官能团与分子支架形成共价连接。所述化学基团选自大范围的官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸类、酯、链烯、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤和酰基卤。
（ii）多肽
编码的多肽的反应基团通过天然或非天然氨基酸的侧链来适合地提供。编码的多肽的反应基团适合地选自硫醇基团、氨基基团、羧基基团、胍基团、苯酚基团或羟基基团。编码的多肽的反应基团可以适合地选自叠氮化物、酮基-羰基、炔烃、乙烯基或芳基卤基团。用于与分子支架连接的编码的多肽的反应基团适合地可以是多肽的氨基或羧基末端。
在某些实施方式中，用于与分子支架连接的所述多肽的每个反应基团是相同类型的。例如，每个反应基团可以是半胱氨酸残基。
在某些实施方式中，用于连接分子支架的反应基团可以包括两种或更多种不同类型，或可以包括三种或更多种不同类型。例如，反应基团可以包含两个半胱氨酸残基和一个赖氨酸残基，或可以包含一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基和一个N-末端胺。
半胱氨酸是最适合的氨基酸，因为它具有优点是，它的反应性是与所有其他氨基酸最为不同的。在分子支架上可以使用来与半胱氨酸的硫醇基团反应的支架反应基团是烷基卤（或也称为卤素代烷或卤代烷）。实例有溴甲基苯（TBMB所例示的支架反应基团）或碘乙酰胺。用于选择性地将化合物偶联到蛋白质中的半胱氨酸的其他支架反应性基团是马来酰亚胺。可以用作本发明中的分子支架的马来酰亚胺的实例包括：三-（2-马来酰亚胺基乙基）胺、三-（2-马来酰亚胺基乙基）苯、三-（马来酰亚胺基）苯。硒代半胱氨酸也是具有与半胱氨酸类似反应性的天然氨基酸，可以用于相同的反应。因而，当提及半胱氨酸时，一般可接受的是取代硒代半胱氨酸，除非上下文另外提议了。最适合地，使用半胱氨酸。
赖氨酸（和肽的N-末端的伯胺）也适合作为反应基团来通过与分子支架连接修饰噬菌体上的肽。然而，相比半胱氨酸它们在噬菌体蛋白质中更丰富，存在着噬菌体颗粒变为交联、或它们可能失去它们的感染性的更高的风险。尽管如此，发现的是赖氨酸在分子内反应中是特别有用的（例如，当分子支架已经连接到噬菌体肽时），以与分子支架形成第二个或连续的连键。在这种情况下，分子支架与展示的肽的赖氨酸优先地反应（特别是紧密接近的赖氨酸）。与伯胺选择性反应的支架反应基团是琥珀酰亚胺、醛或烷基卤。在附随的许多实施例中使用的溴甲基基团中，苯环的电子可以稳定阳离子过渡态。这个特别的芳基卤因而反应性为烷基卤的100-1000倍高。用作分子支架的琥珀酰亚胺的实例包括三-（琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯）、1,3,5-苯三乙酸。用作分子支架的醛的实例包括三甲酰基甲烷。用作分子支架的烷基卤的实例包括 1,3,5-三（溴甲基）-2,4,6-三甲苯、1,3,5-三（溴甲基）苯、1,3,5-三（溴甲基）-2,4,6-三乙苯。
在某些实施方式中，在分子支架的连接之前，分子接头或修饰可以添加到（或产生）编码的多肽的反应基团，其中所述接头或修饰能够与分子支架反应。
具有用于连接分子支架的反应基团的氨基酸可以位于编码的多肽内的任何适合的位置。为了影响产生的特定结构或环，具有反应基团的氨基酸的位置可以由熟练的操作员来改变，例如通过操纵编码多肽的核酸以突变产生的多肽来改变。
编码的多肽的每个氨基酸可以是诱变的靶（例如，限制的变异诱变），根据技术人员的需要或本发明的应用目的。明显地，在目标多肽上需要用于键合到分子支架的至少三个反应基团。除了键合到分子支架所需的氨基酸之外的氨基酸可以根据操作员需要自由地改变，被称为“可变氨基酸”。编码的多肽（例如，多肽库成员）的所述可变氨基酸可以是随机的、部分随机的或恒定的。
所述多肽包括分子支架结合段。这是分子支架连接的区域。适合地，关于多肽上反应基团的注解被应用于该结合段。适合地，多肽的分子支架结合段包含1到27个氨基酸残基，适合地5到20个氨基酸残基。适合地，多肽的分子支架结合段包含少于10个氨基酸。这具有优点是，当多肽段连接到分子支架上时强加在多肽段上的进一步的构象约束。
多肽适合地包含序列AC（X）6C（X）6CG，其中X代表随机的天然氨基酸，A代表丙氨酸，C代表半胱氨酸，G代表甘氨酸。
所述多肽适合地包含序列（X）IY（X）mY（X）nY（X）o，其中Y代表具有反应基团的氨基酸，X代表随机氨基酸，m和n是1到20之间的数字，限定了插入的多肽段的长度，I和o是0到20之间的数字，限定了侧翼多肽段的长度。
在某些实施方式中，本发明的肽配体可以包含具有序列AC（X）6C（X）6CG的多肽。在一个实施方式中，本发明的库成员或肽配体可以包括均三甲苯分子支架以及具有序列AC（X）6C（X）6CG的多肽，其中所述多肽通过与其形成三个硫醚键的多肽的半胱氨酸残基，拴系在分子支架的外-环甲基上，其中X代表氨基酸（适合地，天然氨基酸），A代表丙氨酸，C代表半胱氨酸，G代表甘氨酸。均三甲苯支架的使用向肽配体的结构中引入了柔性程度。
（iii）多肽的反应基团
本发明的分子支架可以通过多肽上的功能或反应基团结合到多肽。这些一般从多肽聚合物中存在的特定氨基酸的侧链形成。这样的反应基团可以是半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链、或N-末端胺基或任何其他适合的反应基团。
适合地，至少一个反应基团是半胱氨酸基团。在方便的时间框架内，基团例如赖氨酸或N-末端胺自身一般不是足够反应性的以与分子支架键合。然而，一旦分子支架已经被吸引或键合到至少一个半胱氨酸，则普通的反应动力学意味着赖氨酸或胺键可以在此后快速和稳定地形成。因此，适合地，至少一个反应基团是半胱氨酸基团。
如果半胱氨酸/赖氨酸/胺基以外的多肽上的反应基团是期望的，则可以选择不同的分子支架以与多肽上所选的特定功能性反应基团配对。
适合地，半胱氨酸、赖氨酸或胺基被用作目标多肽上的功能或反应基团。
适合地，至少三个共价键在分子支架和目标多肽之间形成。
在某些实施方式中，四个键或甚至更多键可以在分子支架和目标多肽之间形成。然而，如果使用超过四个键，则一般地所形成的产物混合物变得越来越复杂，可能阻碍随后的使用或应用。为此，分子支架和目标多肽之间三个键或四个键是优选的。在任何实施方式中，分子支架的分子对称性是优选的。最优选的是分子支架具有三个功能或反应基团。最优选的是分子支架具有三重分子对称性。
本发明的遗传编码的多肽的反应基团能够与分子支架/分子核心形成共价键。反应基团是在天然或非天然氨基酸内的原子的特定群。优先地，具有独特的化学反应性的反应基团被用于连接多肽和分子支架以形成本发明的复合物。所述独特的反应基团的使用允许分子支架/分子核心专性地与多肽的指定反应基团、而不是与多肽的多样性元件、核酸或复合物的其他成分的其他化学基团键合。
天然氨基酸的适合的反应基团是半胱氨酸的硫醇基团，赖氨酸的氨基基团，天冬氨酸或谷氨酸的羧基基团，精氨酸的胍基团，酪氨酸的酚基团，或丝氨酸的羟基基团。非天然氨基酸可以提供广泛的反应基团，包括叠氮化物、酮基-羰基、炔烃、乙烯基或芳基卤基团。多肽的末端的氨基和羧基基团也可以充当反应基团来与分子支架/分子核心形成共价键。
本发明的编码的多肽适合地含有至少三个反应基团。所述多肽也可以含有四个或更多个反应基团。使用越多的反应基团，越多样性片段可以拴系到分子支架/分子核心上。然而，过度数量的反应基团与分子支架/分子核心的连接不是建议的，因为这可能导致难以处理的数量的产物同分异构体。适合地，使用对分子支架的三个、四个或五个共价键；最适合地三个或四个共价键；最适合地三个共价键。
在优选的实施方式中，产生具有三个反应基团的编码的多肽。所述多肽与具有三重旋转对称的分子支架/分子核心的反应产生单一的产物同分异构体。单一的产物同分异构体的产生因几种原因是有利的。化合物文库的核酸仅编码多肽的一级序列，而不是在编码的多肽与分子核心反应时形成的分子的同分异构态。如果可以形成仅一种产物同分异构体，核酸到产物同分异构体的分配是明确限定的。如果形成多种产物同分异构体，核酸不能给出关于在筛选或选择过程中分离的产物同分异构体性质的信息。如果要合成本发明的库的特定成员，单一产物同分异构体的形成也是有益的。在这种情况下，多肽与分子支架的化学反应产生单一的产物同分异构体，而不是同分异构体的混合物。
在本发明的另一个实施方式中，产生具有四个反应基团的编码的多肽。所述多肽与具有四面体对称性的分子支架/分子核心的反应产生两种产物同分异构体。即使两种不同的产物同分异构体由一个且相同的核酸（“遗传密码”）编码，分离的同分异构体的同分异构性质可以通过化学合成两种同分异构体、分离两种同分异构体以及测试两种同分异构体与目标配体的结合来确定。
在本发明的一个实施方式中，多肽的至少一个反应基团与其余反应基团是正交的。正交的反应基团的使用允许所述正交的反应基团到分子核心的特定位点的定向。涉及正交的反应基团的连接策略可以用于限制形成的产物同分异构体的数量。换句话说，对于至少三个键的一个或更多个，通过选择与所述至少三个键的其余键独特或不同的反应基团，多肽的特定反应基团与分子支架上特定位置键合或定向的特定顺序可以有用地实现。
在另一个实施方式中，本发明的编码的多肽的反应基团与分子接头反应，其中所述接头能够与分子支架反应，从而所述接头在最终的键合状态下将插入在分子支架和多肽之间。
遗传编码的组合化学文库的成员的适合的氨基酸可以被任何天然或非天然的氨基酸替代。从这些可交换的氨基酸中排除的是带有用于将多肽交联到分子核心的官能团的那些。可以改变的一组邻近的氨基酸被定义为多肽段。单个多肽段的大小适合地从1到20个氨基酸。多肽段具有随机序列、恒定序列，或具有随机和恒定氨基酸的序列。具有反应基团的氨基酸位于本发明的编码的多肽内的限定的或随机的位置。
在一个实施方式中，由带有用于与分子支架/分子核心键合的反应基团的两个氨基酸所划界的多肽段是10个或更少氨基酸的短氨基酸序列。所述编码的多肽序列与分子核心的反应产生具有高度构象约束的库成员。构象约束的配体一般是更为特异性的，具有更高的结合亲和性。构象约束也可以保护配体免于蛋白水解降解，例如，在体液内。
在一个实施方式中，具有三个反应基团的编码的多肽具有序列（X）IY（X）mY（X）nY（X）o，其中Y代表具有反应基团的氨基酸，X代表随机氨基酸，m和n是1到20之间的数字，限定了插入的多肽段的长度，I和o是0到20之间的数字，限定了侧翼多肽段的长度。
在优选的实施方式中，本发明的编码的多肽文库具有序列AC（X）6C（X）6CG，其中A代表丙氨酸、C代表半胱氨酸、X代表随机的天然的氨基酸，G代表甘氨酸。
作为对硫醇介导的轭合的替代可以用于通过共价相互作用将分子支架连接到肽。做为选择，这些技术可以用于修饰或连接进一步的部分（例如，不同于分子支架的感兴趣的小分子）到多肽上，其在根据本发明进行选择和分离它们之后，在这个实施方式中，明显的是，连接不必是共价的，可以包括非共价的连接。通过产生噬菌体，可以使用这些方法代替（或组合）硫醇介导的方法，所述噬菌体展示带有具备必需的化学反应基团的非天然氨基酸的蛋白质和肽，与带有互补的反应基团的小分子组合，或者当在选择/分离阶段之后制备分子时，通过将非天然氨基酸掺入到化学地或重组合成的多肽中。
掺入到噬菌体上的肽和蛋白质中的非天然氨基酸可以包括 1）酮反应基团（在对或间乙酰基-苯丙氨酸中存在的），其可以与肼、羟胺和它们的衍生物特异性反应（Addition of the keto reactive group to the genetic code of Escherichia coli. Wang L, Zhang Z, Brock A, Schultz PG. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jan 7；100（1）:56-61；Bioorg Med Chem Lett. 2006 Oct 15；16（20）:5356-9. Genetic introduction of a diketone-containing amino acid into proteins. Zeng H, Xie J, Schultz PG），2）叠氮化物（在p-叠氮-苯丙氨酸中存在的），其可以通过铜催化的“click化学作用”或压力促进的（3+2）环加成来与炔烃反应形成相应的三唑（Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Chin JW, Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7；124（31）:9026-7；Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Deiters A, Cropp TA, Mukherji M, Chin JW, Anderson JC, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Oct 1；125（39）: 11782-3），或叠氮化物，其可以通过Staudinger连接与芳基膦反应（Selective Staudinger modification of proteins containing p-azidophenylalanine. Tsao ML, Tian F, Schultz PG. Chembiochem. 2005 Dec；6（12）:2147-9），形成相应的酰胺，4）炔烃，可以与叠氮化物反应形成相应的三唑（In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli. Deiters A, Schultz PG. Bioorg Med Chem Lett. 2005 Mar 1；15（5）:1521-4），5）硼酸（硼酸盐），其可以与含有超过一个适当地间隔的羟基基团的化合物特异性反应，或经历与卤代化合物的钯介导的联结（Angew Chem Int Ed Engl. 2008；47（43）:8220-3. A genetically encoded boronate-containing amino acid., Brustad E, Bushey ML, Lee JW, Groff D, Liu W, Schultz PG），6）金属螯合氨基酸，包括带有二吡啶的那些，其可以特异性地配位金属离子（Angew Chem Int Ed Engl. 2007；46（48）:9239-42. A genetically encoded bidentate, metal-binding amino acid. Xie J, Liu W, Schultz PG）。
非天然氨基酸可以掺入到噬菌体上展示的蛋白质和肽上，通过用带有以下的质粒或质粒组合转化大肠杆菌： 1）响应于密码子指导非天然氨基酸的掺入的正交(orthogonal)氨酰tRNA合成酶和tRNA，2）噬菌体DNA或噬菌粒质粒，其被改变以含有在非天然氨基酸掺入位点处的选定密码子（Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Nov 18；105（46）: 17688-93. Protein evolution with an expanded genetic code. Liu CC, Mack AV, Tsao ML, Mills JH, Lee HS, Choe H, Farzan M, Schultz PG, Smider W；A phage display system with unnatural amino acids. Tian F, Tsao ML, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2004 Dec 15；126（49）: 15962-3）。所述正交氨酰tRNA合成酶和tRNA可以来自Methancoccus janaschii酪氨酰对或合成酶（Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Chin JW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Aug 20；99（17）: 11020-4）以及天然地掺入吡咯赖氨酸的tRNA对（Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N（epsilon）-（o-azidobenzyloxycarbonyl）lysine for site-specific protein modification. Yanagisawa T, Ishii R, Fukunaga R, Kobayashi T, Sakamoto K, Yokoyama S. Chem Biol. 2008 Nov 24；15（11）: 1187-97；Genetically encoding N（epsilon）-acetyllysine in recombinant proteins. Neumann H, Peak-Chew SY, Chin JW. Nat Chem Biol. 2008 Apr；4（4）:232-4. Epub 2008 Feb 17）。用于掺入的密码子可以是琥珀密码子（UAG）或另一种终止密码子（UGA，或UAA），做为选择可以是四碱基密码子。氨酰tRNA合成酶和tRNA可以从现有的载体产生，包括pBK载体系列，pSUP（Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Ryu Y, Schultz PG.Nat Methods. 2006 Apr；3（4）:263-5）载体和pDULE载体（Nat Methods. 2005 May；2（5）:377-84. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Farrell IS, Toroney R, Hazen JL, Mehl RA, Chin JW）。使用的大肠杆菌菌株将表达F'菌毛（一般通过tra操纵子）。当使用琥珀抑制时，大肠杆菌菌株自己将不会含有活性的琥珀抑制物tRNA基因。氨基酸将添加到生长培养基，优选的以1 mM或更大的终浓度。氨基酸掺入的效力可以通过使用具有正交核糖体结合位点的表达构建体，并用ribo-X翻译基因来增强（Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Wang K, Neumann H, Peak-Chew SY, Chin JW. Nat Biotechnol. 2007 Jul；25（7）:770-7）。这可以容许非天然氨基酸的高效的多位点掺入，提供对配体的多个连接位点。
（iv）环的组合以形成多特异性分子
来自肽配体或肽配体的集合的环通过掺入组合环的多肽的测序和从头合成来有益地组合。做为选择，编码这样的多肽的核酸可以被合成。
当要组合集合时，特别是单体环集合，编码所述集合的核酸有益地被消化和重新连接，以形成具有来自组分性集合的环的不同组合的新的集合。噬菌体载体可以包括多聚接头和限制性内切酶的其他位点，其可以提供用于切割和降级(relegation)载体的特征点，以产生期望的多特异性肽配体。对于抗体来说，操纵噬菌体文库的方法是公知的，也可以在当前情况下应用。
（v）连接后修饰
在某些实施方式中，多肽-分子支架复合物可以在连接之后的时间被修饰。
蛋白酶裂解
在某些实施方式中，一旦被拴系到分子支架/分子核心上，本发明的多肽元件被蛋白水解裂解。裂解产生具有拴系到分子支架/分子核心的分离的肽片段的配体。这种方法可以便于来自单独肽配体的环的组合，来形成根据本发明的多特异性肽配体。
例如，多肽的一个或更多个酰胺键可以在将多肽拴系到分子核心之后蛋白水解裂解。这具有产生短的多肽的优点，每个多肽通过至少一个共价键连接到分子支架，但是其表现不同的分子结构，所述分子结构保留在包含编码亲本肽的核酸的复合物中。多肽裂解通过本领域已知的任何合适的手段来适当地催化，例如，受控的水解，或更适合地，通过适合的蛋白酶的酶裂解。蛋白酶可以是任何适合的蛋白酶，但是优选的是具有特异性多肽识别序列或基序的蛋白酶。这有益地导致更为确定的和/或更为可预测的多肽裂解产物的产生。实际上，在这个实施方式中，蛋白酶识别序列可以系统性地添加或从多肽除去，例如，通过操纵编码多肽的核酸。这有益地提供了更大程度的控制，允许在根据本发明展示的分子中产生更大的多样性。最适合地，多肽包含至少一个蛋白酶识别位点。适合地，每个所述裂解位点被包含在多肽上用于共价键合到分子支架的反应基团之间的氨基酸序列内。适合地，每个所述识别位点被包含在多肽上用于共价键合到分子支架的反应基团之间的氨基酸序列内。
肽环被在特定氨基酸位置识别和加工多肽的蛋白酶适合地裂解，例如胰蛋白酶（P1位置中的精氨酸或赖氨酸）或嗜热菌蛋白酶（P1位置中的脂肪族的侧链）。在允许展示的分子的肽环的有效加工、但是不伤害噬菌体颗粒的浓度下使用酶。最佳条件可以取决于多肽环的长度和使用的蛋白酶而改变。例如胰蛋白酶一般在TBS-Ca缓冲液（25 mM Tris HCl/137 mM NaCl/1 mM CaCl2, pH 7.4）中以200 nM在10℃使用10分钟。适合于修饰展示的多肽而不伤害噬菌体的一整套蛋白酶在Kristensen, P. and Winter, G.（Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages；Fold Des. 1998；3（5）:321-8）中描述了。噬菌体上肽的酶处理可以是“部分蛋白水解”，因为不能排除的是有限数量的噬菌体包衣蛋白被裂解。因而在条件的优化中，适合地选择靶的最大裂解与噬菌体颗粒的最大不伤害之间的最佳平衡。
适合地，多肽包含至少一个这样的蛋白水解裂解位点。适合地，多肽包含至少两个这样的蛋白水解裂解位点。
适合地，多肽包含至少三个这样的蛋白水解裂解位点。
在每个这样的蛋白水解实施方式中，适合地，所述蛋白酶位点位于分子支架对向的多肽环内。这具有优点是，分子支架被保持在复合物上，不然多肽-分子支架复合物可能与编码多肽的核酸分离，这对于本发明的大部分应用是不希望的。
短的环的使用（短是例如6个氨基酸残基或更少）可能损害某些蛋白酶在环内裂解的能力。在这种情况下，可能希望的是选择可能被蛋白酶更可及的更长的环。此外，在环被内切蛋白酶裂解之后，可能希望的是进一步用其他内切蛋白酶或实际上通过外切蛋白酶，例如，羧肽酶或氨基肽酶回切所述环。
当多肽包含超过一个这样的蛋白酶位点时，适合地，每个位点在多肽和分子支架之间产生的两个共价键之间存在。如有必要，多个裂解位点可以在键之间存在。
蛋白酶抗性
在另一个实施方式中，多肽可以是对蛋白酶裂解有抗性的。一般地，紧密折叠的多肽结构对蛋白酶更有抗性，因为蛋白酶不能物理上接近多肽来裂解它。因此，通过影响多肽环的折叠，在肽配体中支架和支架链接的操作可以调节蛋白酶敏感性。
如在先前的小节中表明的，蛋白酶步骤可以引入以裂解连接到化学支架的环内可接近的位点。如果肽轭合物的集合在噬菌体上展示，这引起肽各自通过至少一个共价键连接到化学支架上，但保持在包含编码亲本多肽的核酸的复合物中。在用抗原选择之前用蛋白酶处理化学修饰的噬菌体，预计得到带有具有裂解的环的肽轭合物的噬菌体，以及由于缺乏裂解位点、或对裂解有抗性而带有具有未裂解的环的肽轭合物的噬菌体。如果一种结合抗原而另一种不结合，通过比较在蛋白酶处理之前和之后选定的噬菌体克隆对目标抗原的结合，有可能区别这些种类。因而，具有裂解的环的种类预计将在蛋白酶处理之后，而不是之前结合；而蛋白酶抗性种类预计将在处理之前和之后都结合。注意到，如果轭合物结合裂解和未裂解的环（如激肽释放酶裂解后的PK15，参见Heinis et al, 2009），它可能被不正确地鉴定为蛋白酶抗性的。这显示了使用直接方法来核对裂解的重要性，例如，通过化学地合成肽轭合物并检查裂解的证据，例如，通过质谱法。
如果裂解的环轭合物倾向于是蛋白酶抗性轭合物，有益的是在第一轮选择之前用蛋白酶处理化学修饰的噬菌体集合，在随后的轮次中继续使用相同的蛋白酶，或具有常见的切割位点的蛋白酶。然而，做为选择，蛋白酶抗性轭合物可能是期望的。这样的肽可以用于口服施用以存活于肠蛋白酶，或者另外地经历血液、组织或细胞中的蛋白水解攻击的那些。在这种情况下，没有蛋白酶的第一轮选择，随后使用蛋白酶的选择轮次，将帮助抗性种类的选择。
蛋白酶的运用在选择过程期间具有进一步的实用性。例如，某些未形成的环（序列的线性部分）可能在文库中存在，因为（a）核苷酸合成中的误差未能编码需要的半胱氨酸残基，或（b）需要的半胱氨酸残基与溶液中游离的半胱氨酸构成了二硫键（可能是由于不充分的还原或重新氧化），或以不可逆的方式反应了（例如，被氧化成磺基丙氨酸，或所需的半胱氨酸之一已与支架的不同分子反应成其它的）。相比环，序列的线性部分对蛋白酶攻击更为敏感，则，易受存在的裂解位点的影响，可能的是使用蛋白酶避免这样的结合物。
蛋白酶步骤（在存在还原剂的情况下）对于消除通过所需的半胱氨酸之间的二硫化物、而不是通过化学支架形成的环是有益的。如果在噬菌体上有半胱氨酸的不充分的还原（或随后的再次氧化），这是可以预期的。为此，我们在化学交联步骤期间使用了脱气的缓冲液；我们还在与TBMB反应期间保持了低水平的还原剂（TCEP）以维持还原环境。尽管如此，在第一轮选择之后，我们发现包括四个半胱氨酸残基（三个需要的半胱氨酸残基，以及环中进一步的半胱氨酸残基）的许多序列，例如PEP21（CFNSEWSCLQSCSNC）。这种额外的半胱氨酸预计存在于肽集合中，因为合成的核苷酸文库包括随机的密码子（NNK多样性：其中N代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的每一种25%的混合物，K代表胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸的每一种50%的混合物）。在一些条件下，例如，如果存在不充分的还原，或需要的半胱氨酸与化学支架的不完全反应（可能由于氨基基团或水对支架的竞争反应），在氧化条件下，额外的半胱氨酸可以预计与三个需要的半胱氨酸之一形成二硫化物环。做为选择，额外的半胱氨酸可以与支架反应，留下两个需要的半胱氨酸形成二硫化物闭环。
它们的生成背后的确切机制无论是什么样，这样的二硫化物闭环可能与支架-闭环竞争，并且占优势。应该可能的是通过使用构建自三联体、而不是单体的合成核苷酸文库来降低额外的半胱氨酸的频率，以避免环中的半胱氨酸密码子；和/或确保在存在还原剂的情况下的选择，以打开二硫化物闭环。更方便地，我们发现了，在存在还原剂（例如，二硫苏糖醇或TCEP）的情况下用蛋白酶处理化学地修饰的噬菌体集合，以打开并然后裂解环，帮助了最小化这些种类的影响。
因此，在一个实施方式中，本发明的肽配体是基本上蛋白酶抗性的。在相对于靶选择之后将肽配体暴露于裂解，将帮助鉴定对蛋白酶裂解有抗性的结合肽配体。不能完全地排除的是，某些肽配体将在裂解之后保持结合靶的能力，然而，这样的配体的发生率是低的。因而本发明提供了选择具有提高的蛋白酶抗性的肽配体的方法，包括步骤：
(a) 提供多肽的第一集合；
(b) 将所述多肽轭合到分子支架上，所述分子支架在两个或更多个氨基酸残基处结合所述多肽，来形成多肽轭合物的集合；
(c) 筛选所述集合对靶的结合，选择结合所述靶的所述第一集合的成员；
(d) 任选地，用还原剂处理所述选择的集合
(e) 用蛋白酶处理所述集合；和
(f) 进一步筛选所述集合对靶的结合。
在另一个实施方式中，本发明的肽配体基本上被蛋白酶裂解。蛋白酶步骤在集合的筛选之前包括，这将帮助鉴定以裂解形式结合靶的肽配体。因而本发明提供了选择被蛋白酶裂解的肽配体的方法，包括步骤：
(a) 提供多肽的第一集合；
(b) 将所述多肽轭合到分子支架上，所述分子支架在两个或更多个氨基酸残基处结合所述多肽，来形成多肽轭合物的集合；
(c) 任选地用还原剂处理所述集合
(d) 用蛋白酶处理所述集合；和
(e) 在用蛋白酶处理之后，筛选所述集合对靶的结合，选择结合所述靶的所述第一集合的成员。
蛋白酶抗性的筛选可以简单地采取用蛋白酶限制性消化的形式，来鉴定集合中其结合对蛋白酶敏感、或需要蛋白酶作用的那些成员。最期望的是使用蛋白酶，所述蛋白酶在将要使用二环肽的条件下是活性的，例如，在存在血清的情况下。
（vi）效应物基团和官能团的连接
效应物和/或官能团可以连接到多肽的N或C末端，或连接到分子支架，如上所述。
适合的效应物基团包括抗体和其部分或片段。例如，除了一个或更多个恒定区结构域之外，效应物基团可以包括抗体轻链恒定区（CL），抗体CH1重链结构域，抗体CH2重链结构域，抗体CH3重链结构域，或其任何组合。效应物基团还可以包括抗体的绞链区（这样的区域通常在IgG分子的CH1和CH2区域之间存在）。
在本发明的这个方面进一步优选的实施方式中，根据本发明的效应物基团是IgG分子的Fc区。有益地，根据本发明的肽配体-效应物基团包含或由肽配体Fc融合物组成，具有一天或更久、两天或更久、3天或更久、4天或更久、5天或更久、6天或更久或7天或更久的tβ半衰期。最有益地，根据本发明的肽配体包含或由具有一天或更久的tβ半衰期的肽配体Fc融合物组成。
一般地，官能团包括结合基团、药物、用于其他实体的连接的反应基团、帮助大环的肽进入细胞的摄取的官能团，等等。
肽透入细胞的能力将容许针对细胞内靶的肽产生效果。可以被具有透入细胞的能力的肽接近的靶包括转录因子、细胞内信号分子，例如酪氨酸激酶，以及涉及细胞凋亡途径的分子。允许细胞穿透的官能团包括已经添加到肽或者分子支架的肽或化学基团。肽，例如衍生自VP22、HIV-Tat、果蝇的同源框蛋白质的那些（触角足（Antennapedia）），例如在Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions（2007）Volume 35, part 4, p821 "Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets" 和 Gupta et al.的 "Intracellular delivery of large molecules and small peptides by cell penetrating peptides"，Advanced Drug Discovery Reviews（2004）Volume 57 9637中描述的。已经显示了在穿过质膜的转位中有效的短肽的实例包括来自果蝇触角足蛋白质的16氨基酸penetratin肽（Derossi et al（1994）J Biol. Chem. Volume 269 p10444 "The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes"），18氨基酸的“模式两亲性肽”（Oehlke et al（1998）Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127 "Cellular uptake of an alpha-helical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non-endocytically"）和HIV TAT蛋白质的富精氨酸区域。非肽的方法包括利用可以容易地连接于生物分子的小分子模拟物或SMOCs（Okuyama et al（2007）Nature Methods Volume 4 p153 'Small-molecule mimics of an a-helix for efficient transport of proteins into cells'）。将胍基团添加到分子的其他化学的策略也增强细胞穿透（Elson-Scwab et al（2007）J Biol Chem Volume 282 p13585 "Guanidinylated Neomcyin Delivers Large Bioactive Cargo into cells through a heparin Sulphate Dependent Pathway"）。小分子量分子例如类固醇可以添加到分子支架以增强细胞摄取。
可以连接于肽配体的一类官能团包括抗体和其结合片段，例如，Fab、Fv或单结构域片段。特别地，可以使用结合能够提高肽配体的体内半衰期的蛋白质的抗体。
结合存在于许多细胞上的整联蛋白的RGD肽也可以掺入。
在一个实施方式中，根据本发明的肽配体-效应物基团具有选自以下构成的组的tβ半衰期：12小时或更久、24小时或更久、2天或更久、3天或更久、4天或更久、5天或更久、6天或更久、7天或更久、8天或更久、9天或更久、10天或更久、11天或更久、12天或更久、13天或更久、14天或更久、15天或更久或20天或更久。有益地，根据本发明的肽配体-效应物基团或组合物将具有12到60小时范围内的tβ半衰期。在进一步的实施方式中，它将具有一天或更久的t半衰期。在再进一步的实施方式中，它将在12到26小时范围内。
官能团包括药物，例如，用于癌症治疗的细胞毒性试剂。这些包括烷化剂，例如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物（硫唑嘌呤和巯嘌呤）或嘧啶类似物；植物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素和它的衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇，原来称为紫杉酚；拓扑异构酶抑制物，包括喜树碱；伊立替康和托泊替康，以及II型抑制物，包括安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷。进一步的试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素（其用于肾脏移植）、多柔比星、表柔比星、博来霉素及其他的。
可能的效应物基团还包括酶，例如，用于酶/前体药物治疗的羧肽酶G2，其中肽配体替换ADEPT中的抗体。
（vii）合成
要注意的是，一旦根据本发明分离或鉴定了目标多肽，则只要可能，它随后的合成可以简化。例如，可以测定目标多肽的序列，通过标准技术、随后在体外与分子支架反应来合成地制造。当进行时，可以使用标准的化学作用，因为不再需要保留遗传编码的载体颗粒的功能性或完整性。这允许用于进一步的下游实验或批准的可溶物质的快速大规模制备。就此来说，通过本发明的方法鉴定的候选物或前导物的大规模制备可以使用常规的化学作用，例如在Timmerman et al.中公开的那些来实现。
因而，本发明还涉及如在此阐述选择的多肽或轭合物的制造，其中所述制造包括以下解释的任选的进一步步骤。最适合地，这些步骤对通过化学合成制造的终产物多肽/轭合物进行，而不是对噬菌体进行。
任选的，当制造轭合物或复合物时，例如，在起初的分离/鉴定步骤之后，目标多肽中的氨基酸残基可以被取代。
肽还可以被延伸，以掺入例如其他环并因而引入多特异性。
为了延伸肽，可以简单地使用标准的固相或液相化学作用在它的N-末端或C-末端化学地延伸。标准的蛋白质化学作用可以用于导入可活化的N-或C-末端。做为选择，添加可以通过片段缩合或天然化学连接例如，（Dawson PE, Muir TW, Clark-Lewis I, Kent, SBH. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779）中描述的，或通过酶，例如，使用（Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins Chang TK, Jackson DY, Burnier JP, Wells JA Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 20；91（26）: 12544-8 或Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Tags for labelling protein N-termini with subtiligase for proteomics Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003 Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics；Hikari A.I. Yoshihara, Sami Mahrus and James A. Wells）中描述的subtiligase来进行。
做为选择,肽可以通过二硫键的进一步轭合来延伸。这具有容许一旦处在细胞的还原环境内时第一和第二肽相互分开的优点。在这种情况下，分子支架（例如，TBMB）可以在第一肽的化学合成期间添加，以便与三个半胱氨酸基团反应；进一步的半胱氨酸因而能够附加到第一肽的N-末端，从而这种半胱氨酸仅与第二肽的游离半胱氨酸反应。
相似的技术同样地应用于两个二环的和双特异性的大环的合成/偶联，潜在地产生四特异性分子。
此外，添加其他官能团或效应物基团可以同样的方式实现，使用合适的化学作用、偶联在N-或C-末端或通过侧链。适合地，偶联以这样的方式进行从而它不阻断任一实体的活性。
（B）肽配体的集合
（i）文库的构建
用于选择的文库可以使用本领域已知的技术来构建，例如，如在 WO2004/077062 中阐述的，或使用生物系统，包括在此描述的噬菌体载体系统来构建。其他载体系统是本领域已知的，包括其他噬菌体（例如，噬菌体lambda）、细菌质粒表达载体、基于真核细胞的表达载体，包括酵母载体，等等。
非生物系统例如在 WO2004/077062 中描述的那些是基于常规的化学筛选方法。它们是简单的，但是缺乏生物系统的能力，因而不可能，或至少对于筛选大的肽配体文库是不切实际地繁重的。然而，例如，仅需要筛选少量的肽配体时，它们是有用的。然而，通过这种个体分析的筛选可能是耗时的，可以测试对特定靶的结合的独特分子的数量一般不超过106个化学实体。
相比之下，生物学筛选或选择方法一般容许大得多数量的不同分子的采样。因而，生物学方法更适合用于本发明的应用中。在生物学操作中，分子在单个反应容器中分析，具有有利的性质（即，结合）的分子从非活性分子物理地分离。选择策略是有效的，其容许同时地产生和分析超过1013个单独化合物。强大的亲和选择技术的实例是噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展示、细菌显示或RNA/DNA适体方法。这些生物学体外选择方法共同地具有由DNA或RNA编码的配体集合。它们容许通过测序对选择的配体的扩增和鉴定。噬菌体展示技术例如被用于具有对实际上任何靶的非常高亲和性的抗体的分离。
当使用生物系统时，一旦选择了载体系统，编码感兴趣的多肽的一个或更多个核酸序列被克隆到文库载体中，人们可以通过在表达之前进行诱变来产生克隆的分子内的多样性；做为选择，编码的蛋白质在诱变之前被表达和选择，进行另外轮次的选择。
对于在此描述的肽配体的亲合成熟，特别地指出了这样的方法。例如，结合第一和第二靶的肽配体的第一和第二集合可以组合，产生的第三集合通过编码集合的核酸库成员的诱变来进行亲合成熟。
编码结构上优化了的多肽的核酸序列的诱变通过标准的分子方法来进行。特别有用的的是聚合酶链式反应，或PCR（Mullis and Faloona（1987）Methods Enzymol., 155: 335，通过引用合并在此）。利用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶所催化的DNA复制的多个循环来扩增感兴趣的目标序列的PCR是本领域公知的。各种抗体文库的构建已经在Winter et al.（1994）Ann. Rev. Immunology 12, 433-55和其中引证的参考文献中讨论了。
使用模板DNA（至少lfg；更有用地，1-1000 ng）和至少25 pmol的寡核苷酸引物进行PCR；当引物库是严重地异源的时候，有益的是使用大量的引物，因为每个序列仅由库分子的小部分代表，数量在后期的扩增循环中变得有限。典型的反应混合物包括：2 μl DNA，25 pmol寡核苷酸引物，2.5 μl 10X PCR缓冲液1（Perkin-Elmer，Foster City , CA），0.4 μl 1.25 μM dNTP，0.15 μl（或2.5单位）的Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Foster City , CA）和去离子水到总体积25 μl。覆盖矿物油，使用可编程的热循环仪进行PCR。PCR循环的每个步骤的长度和温度，循环的数量根据实际上严格度要求来调整。退火温度和时间取决于预计与模板退火的引物的效力以及要忍耐的错配的程度；明显地，当同时地扩增和诱变核酸分子时，需要错配，至少在第一轮合成中。优化引物退火条件的严格度的能力充分在本领域中等技术人员的认知内。使用30℃和72℃之间的退火温度。模板分子的起始的变性通常在92℃和99℃之间发生4分钟，随后是由变性（94-99℃15秒到1分钟）、退火（如以上讨论的确定温度；1-2分钟）和延伸（72℃ 1-5分钟，取决于扩增的产物的长度）的20-40个循环。最终延伸一般在72℃进行4分钟，可以跟随着4℃下的无定数的（0-24小时）步骤。
做为选择，给定根据本发明的多肽的短链长度，变体优选地从头合成并插入到适合的表达载体中。肽合成可以通过本领域已知的标准技术来进行，如上所述的。自动化肽合成仪是广泛可获得的，例如，Applied Biosystems ABI 433（Applied Biosystems , Foster City , CA, USA）。
（ii）遗传编码的多样性
目标多肽适合地是遗传编码的。这提供了增强多样性和便于操作的优点。遗传编码的多肽文库的实例是mRNA展示文库。另一个实施例是可复制的遗传学展示包（rgdp）文库，例如噬菌体展示库。适合地，目标多肽是作为噬菌体展示库遗传地编码的。
因而，适合地，本发明的复合物包含可复制的遗传学展示包（rgdp）例如，噬菌体颗粒。在这些实施方式中，适合地，核酸被噬菌体基因组包含。在这些实施方式中，适合地，多肽被噬菌体包衣包含。
在某些实施方式中，本发明被用于产生多肽的遗传编码的组合文库，其通过将一定数量的核酸翻译成相应的多肽，并将所述分子支架的分子连接到所述多肽来产生。
多肽的遗传编码的组合文库可以通过噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、细菌展示或mRNA展示来产生。
适合地，多肽的遗传编码的组合文库是通过噬菌体展示产生的。在噬菌体展示实施方式中，适合地，多肽根据已建立的技术，例如如下所述的，来展示在噬菌体上。最适合地，这样的展示伴随着目标多肽与工程化的基因的融合，所述基因容许目标多肽的外部展示；适合地，所述工程化的基因包含噬菌体的工程化的基因9（p9或基因IX）、基因8（基因VIII）、基因7（p或基因VII）、基因6（p6或基因VI）或基因3（p3或基因III）。这些蛋白质提供了优势是，它们含有更少的或不含半胱氨酸，半胱氨酸可以与分子支架例如TMBM反应和产生副产物。对于p6，有益的的是突变半胱氨酸84到丝氨酸。p7和p9中的半胱氨酸最可能被掩埋，因而可能不必突变或除去它们。p8提供了优势是它不含有半胱氨酸残基。因而，更适合地，所述工程化的基因包含噬菌体的工程化的基因8（基因VIII）、基因6（基因VI）或基因3（基因III）。
最适合地，这样的展示伴随有目标多肽与工程化的基因3蛋白质的融合，所述基因3蛋白质缺乏结构域1和2中的半胱氨酸残基。这种融合可以通过本领域已知的任何适合的技术来实现，例如，通过操作编码噬菌体基因III蛋白质的核酸来将编码半胱氨酸的密码子改变为编码其他氨基酸的密码子，和通过将编码多肽的核酸序列按阅读框插入到基因III编码序列中，从而它作为基因III融合蛋白展示在噬菌体颗粒的外侧。
本发明的益处是，产生的工程化的基因保留了噬菌体传染性，即，能够感染和繁殖。即使当工程化的基因是基因3以外的基因时（例如，基因6或基因8），仍然期望的是工程化基因3来除去一个或更多个半胱氨酸残基（例如，所有的半胱氨酸残基）。
在优选的实施方式中，本发明的遗传编码的多肽通过翻译核酸和将产生的多肽联系到所述编码来产生。表型与基因型的联系容许增殖或解码编码的配体集合。各种技术可以用于将多肽联系到它的多核苷酸编码。所述技术包括噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展示和细菌展示，以及其他的。包含达到1013个独立成员的编码的多肽集合已经用所述方法产生。根据本发明的可以产生的单独配体的数量明显地比常规的筛选中一般地分析的单独分子的数量更多。
在优选的实施方式中，噬菌体展示技术被用于遗传编码本发明的多肽。噬菌体展示是一种方法，其中多肽的基因被融合到噬菌体包衣蛋白的基因。当噬菌体在细菌细胞中产生时，所述多肽作为包衣蛋白的融合物被表达。在噬菌体颗粒的装配时，所述多肽被展示在噬菌体的表面上。通过用固定的抗原接触噬菌体集合，某些噬菌体保持与抗原结合，而其他的通过洗涤被除去。噬菌体可以被洗脱和增殖。编码选择的噬菌体的多肽的DNA可以被测序。噬菌体展示可以用于编码超过1010个单独的多肽。噬菌体展示的有利的方面是遗传编码，单链的DNA被包装在外壳中。包衣可以保护DNA免于与分子核心反应。
在另一个优选的实施方式中，本发明的多肽文库作为基因3蛋白质融合物展示在噬菌体上。每个噬菌体颗粒具有所述噬菌体包衣蛋白的约3到5个拷贝。作为修饰的多肽的多个拷贝展示的结果，具有微摩尔的亲和性的配体（弱结合物）也可以在噬菌体选择中分离。做为选择，噬菌粒被用于降低每个噬菌体的多肽数量以避免亲和性效应和选择具有更高亲和性的配体。
在另一个优选的实施方式中，具有修饰的包衣蛋白的噬菌体被用于编码本发明的多肽文库。特别地，使用包衣蛋白中缺乏或具有降低数量的特定类型氨基酸的噬菌体。当分子核心与所述具体类型的氨基酸是反应性的时，使用所述包衣蛋白可能是有益的。当用于交联分子核心的展示的多肽的反应基团是天然氨基酸，相同类型的天然氨基酸存在于噬菌体包衣中表面暴露的区域上时，这是明确的。使用具有修饰的包衣蛋白的所述噬菌体可以防止噬菌体颗粒通过多个噬菌体的氨基酸与同一分子核心的反应的交联。此外，使用所述噬菌体可以降低多肽中反应基团的氨基酸侧链和噬菌体包衣蛋白与同一分子核心两者的交联。
在又一个优选的实施方式中，具有基因3蛋白质的噬菌体在本发明中使用来展示多肽文库，所述基因3蛋白质缺乏结构域1和2中的二硫键C7-C36、C46-C53、C188-C201的半胱氨酸残基。具有在基因3蛋白质中在所述位置（C7C、C36I、C46I、C53V、C188V C201A）的突变和另外14个突变（T13I、N15G、R29W、N39K、G55A、T56I、I60V、T101I、Q129H、N138G、L198P、F199L、S207L、D209Y）以补偿降低的热稳定性的噬菌体由Schmidt F. X.和同事（Kather, I. et al., J. Mol. Biol., 2005）产生了。如果用于将多肽交联到分子核心的一个或更多个功能性氨基酸是半胱氨酸残基，在所述微小的包衣蛋白中没有硫醇基团的噬菌体是适合的。噬菌体包衣蛋白中半胱氨酸残基的取出防止了它们干扰多肽和分子支架之间的键合反应。
现在更详细地描述用于本发明的应用的这种示范性的噬菌体。
FX Schmid的无二硫化物噬菌体（结构域D1-D2）包含来自载体fCKCBS（Krebber, C, 1997, J. Mol. Biol.）的fd噬菌体。载体fCKCBS是基于来自美国典型培养物保藏所（ATCC: 15669-B2）的fd噬菌体载体。
野生型fd噬菌体的p3的结构域1和2的氨基酸序列是公众可获得的，例如在PubMed数据库中。为了便于参照，示范性的序列是：
Figure 758479DEST_PATH_IMAGE002
FX Schmid和同事通过突变4个氨基酸进化性地稳定了这种噬菌体的p3（Martin, A. and Schmid, FX., 2003, J. Mol. Biol.）。在继续的工作中，FX Schmid和同事突变了6个半胱氨酸来消除3个二硫化物桥，插入额外的突变来补偿稳定性的损失（Kather, I. and Schmid FX., 2005, J. Mol. Biol.）。在多次进化循环中，它们产生了克隆19、20、21和23，其全部具有无二硫化物的p3，具有变化的热稳定性。
突变体21（“克隆21”）可以如描述的产生，或简单地从FX Schmid和同事处获得。根据FX Schmid的公开，这个克隆含有结构域1和2中的以下突变：C7S, T13I, N15G, R29W, C36I, N39K, C46I, C53V, G55A, T101I, Q129H, C188V, F199L, C201A, D209Y.。此外，当我们测序克隆和与野生型fd噬菌体比较时，我们发现结构域1和2中的以下突变：P11S和P198L。不希望受到理论的限制，假定的是这些突变已经存在于载体fCKCBS的噬菌体中。
克隆21的结构域D1和D2具有以下氨基酸序列：
Figure 957379DEST_PATH_IMAGE003
在一个实施方式中，筛选可以通过用靶接触本发明的文库并分离结合所述靶的一个或更多个库成员来进行。
在另一个实施方式中，所述文库的单独的成员在筛选中与靶接触，鉴定与所述靶结合的所述文库的成员。
在另一个实施方式中，所述文库的成员同时地与靶接触，选择与所述靶结合的所述文库的成员。
靶可以是肽、蛋白质、多糖、脂质、DNA或RNA。
靶可以是受体、受体配体、酶、激素或细胞因子。
目标配体可以是原核蛋白质、真核蛋白质或archeal蛋白质。更具体地，目标配体可以是哺乳动物蛋白质或昆虫蛋白质或细菌蛋白质或真菌蛋白质或病毒蛋白质。
目标配体可以是酶，例如，蛋白酶。
要注意的是，本发明还涵盖从根据本发明的筛选分离的库成员。适合地，本发明的筛选方法进一步包括步骤：制造能够与所述靶结合而分离的一定量的本发明的复合物。
本发明还涉及库成员，其是通过根据本发明筛选分离的、或能够通过根据本发明筛选分离，其中随后产生/制造所述成员，而不进一步使用编码所述多肽的、作为本发明的复合物的部分的核酸。例如，本发明的方法适合地进一步包含通过将分子支架连接到多肽上来制造一定量的多肽的另外的步骤，所述多肽是通过本发明的方法分离或鉴定的，其中所述多肽是重组表达的或化学合成的。例如，当在这个实施方式中多肽是重组地合成的时，本来作为本发明的复合物的部分编码它的核酸不再直接存在，而是存在于中间步骤中，例如，复合物的原始核酸的PCR扩增或克隆，引起模板核酸的产生，从模板核酸中可以在这个另外的步骤中合成多肽。
本发明还涉及具有超过两个环的肽配体。例如，连接到分子支架的三环的多肽可以通过将二环的多肽的N-和C-末端连接到根据本发明分子支架来产生。照这样，连接的N和C末端产生第三环，得到三环的多肽。这个实施方式适合地不在噬菌体上进行，但是适合地在本发明的多肽-分子支架轭合物上进行。连接N-和C-末端是常规肽化学作用的问题。在需要任何指导的情况下，C-末端可以被活化，和/或N-和C-末端可以延伸，例如，来添加半胱氨酸到每个末端，然后通过二硫键连接它们。做为选择，连接可以通过掺入到N/C末端中的接头区来实现。做为选择，N和C末端可以通过常规的肽键连接。做为选择，可以采用用于连接N和C末端的任何其他适合的方法，例如，N-C-环化可以通过标准技术进行，例如在Linde et al.中Peptide Science 90, 671-682（2008）"Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides", 或如Hess et al. J. Med. Chem. 51, 1026-1034（2008）" backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4 receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity"中公开的。这样的三环的分子的一个优点是避免游离末端的蛋白水解降解，特别是在外切蛋白酶作用中。这种性质的三环的多肽的另一个优点是，第三环可以用于一般地可应用的功能，例如，BSA结合，细胞进入或输送效应、标签化或任何其他这样的应用。注意到的是，这种第三环将一般不可用于选择（因为它不在噬菌体上产生，仅在多肽-分子支架轭合物上产生），因而对于其他这样的生物学功能的它的用途仍然有益地保留了环1和2用于特异性的选择/创造。因而本发明还涉及这样的三环的多肽和它们的制造和用途。
本发明提供了进一步的方法用于使遗传编码的化合物文库与目标配体接触，和用于鉴定与所述目标配体结合的配体。遗传编码的化合物文库通过筛选或选择步骤来分析。
在筛选过程中，分析文库的单独的成员。例如，文库的多个拷贝的独立成员与目标配体孵育。在接触文库的成员之前或之后，目标配体被固定，通过洗涤除去未结合的成员。例如，结合的配体在酶联免疫吸附测定（ELISA）中检测。与目标配体结合的文库的成员的氨基酸序列通过遗传密码的测序来确定。
在选择过程中，编码的化合物文库的多个成员与一个或更多个靶接触。在接触文库的成员之前或之后，靶被固定，通过洗涤除去未结合的成员。结合的配体的遗传密码进行测序。做为选择，选择的配体进行增殖来进行进一步的选择轮次。
在本发明的一个实施方式中，化合物文库由噬菌体展示来编码，选择通过噬菌体淘选来进行。
（iii）噬菌体纯化
可以使用纯化噬菌体的任何合适的方法。标准技术可以应用于本发明中。例如，噬菌体可以通过过滤或通过沉淀例如PEG沉淀来纯化；可以产生噬菌体颗粒，通过如早先描述的聚乙二醇（PEG）沉淀来纯化。
在需求进一步指导的情况下，参考Jespers et al（Protein Engineering Design and Selection 2004 17（10）:709-713. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries.）。适合地，噬菌体可以如其中教导来纯化。对于噬菌体纯化的方法，这个公开的文本通过引用特别地合并在此；特别是参考Jespers et al.的材料和方法小节开始部分到709页右栏。
此外，噬菌体可以如Marks et al J.Mol.Biol vol 222 pp581-597所公开的纯化，对于如何进行噬菌体生产/纯化的特别的描述，通过引用特别地合并在此。
在需要任何进一步的指导的情况下，噬菌体可以如以下的还原和纯化的。大约5×1012个噬菌体颗粒在室温下与1 mM二硫苏糖醇（DTT）反应30分钟，然后PEG沉淀。在用水清洗之后，丸粒重悬浮在1 mL反应缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液，1 mM EDTA，pH7.8）中。噬菌体然后任选地与50 μl 1.6 mM N[（2-碘乙氧基）乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑（NBDIA）（Molecular Probes）在室温下反应2小时，更适合地与在此描述的分子支架反应。反应通过噬菌体颗粒的PEG沉淀来终止。
再更进一步的途径中，其中噬菌体可以如Schreier and Cortese（A fast and simple method for sequencing DNA cloned in the single-stranded bacteriophage M13. Journal of molecular biology 129（1）: 169-72, 1979）所教导的生产/纯化。该公开内容涉及Sanger et al.（1977）的链终止DNA测序操作，其需要单链的DNA作为模板。M13噬菌体DNA作为单链存在，因而M13中的每个克隆的DNA序列可以以这种形式容易地获得。Schreier和Cortese显示了，足够纯以作为序列测定的模板的M13单链DNA可以通过噬菌体颗粒的简单离心和用苯酚提取来制备。对于噬菌体的纯化方法，Schreier和Cortese公开内容通过引用特别地合并在此。为了避免引起怀疑，对于产生根据本发明复合物，不进行苯酚提取，因为那是为了核酸纯化的目的。因而Schreier和Cortese的苯酚步骤被适合地省略。仅到纯化的噬菌体颗粒根据Schreier和Cortese的方法。
因而，本领域公知无数的技术用于噬菌体的纯化。在本发明的上下文中，这样的纯化被用于除去还原剂，所述还原剂被用于还原目标多肽中的反应基团用于与分子支架结合，特别是当这样的结合是通过半胱氨酸残基时。
任选的，噬菌体纯化的特别有益的技术可以如下文的反应化学作用小节中讨论来进行。应当明确指出的是，这些技术不被认为是对本发明关键的，但是可以代表生产本发明的噬菌体颗粒的特别有帮助的方法，或甚至最好的方式。然而，在连接分子支架之前除去还原剂的阶段，需要注意避免噬菌体上还原的功能/反应基团的再次氧化，原则上可以使用任何技术来实现这一点。所描述的过滤技术是有效的，但是比标准技术更复杂，因而操作员将选择最适合他们的本发明的特定工作的技术。
（iv）反应化学作用
用于多肽修饰的现有技术涉及严格的化学作用和独立的多肽修饰反应。相反，本发明利用化学条件来修饰多肽，其有益地保持了产物的遗传编码元件的功能和完整性。具体地，当遗传编码元件是展示在编码它的噬菌体表面上的多肽时，化学作用有益地不损害噬菌体的生物学完整性。在此公开的是，存在着条件的狭窄窗口，这些化学反应可以由于其被增强或促进。特别地，将在下文更详细地解释的，使用的溶剂和温度对于高效的反应是重要的。此外，使用的试剂的浓度也有助于促进正确的键合，同时改善或消除被修饰的多肽部分的交联或破坏。
特别地，公开的是，多肽中半胱氨酸的还原是最高效的反应所需的。明显地，用于化学地还原那些半胱氨酸的还原剂必需被除去以进行期望的连接。一种已知的技术是使用二硫苏糖醇（DTT）或三羧基乙基膦（TCEP）用于半胱氨酸的还原，以及用于还原剂的除去，以在沉淀反应中沉淀颗粒，例如噬菌体颗粒。这样的沉淀反应一般地涉及20%聚乙二醇（PEG）和2.5摩尔NaCl，其引起噬菌体颗粒的沉淀。然而重要的是避免重氧化。以下将更详细地公开的是，在一系列策略中找到解决方案，包括使用脱气的缓冲液，在反应混合物中使用螯合剂，以及使用过滤以提取颗粒，或在存在TBMB的情况下使用低浓度的TCEP。
例如，用于分子支架到多肽的连接的反应条件应当小心地选择。条件的选择可以取决于本发明的应用而变化。当多肽被噬菌体颗粒包含时需要特别小心。在整个说明书和实施例小节中提供了指导。
应当选择反应条件如反应温度、分子支架浓度、溶剂和/或pH值，以容许多肽的反应基团与分子支架的高效的反应，但是在条件中留下编码多肽的核酸，其容许解码（例如，测序）和/或增殖分离的分子（例如，通过PCR，或通过噬菌体增殖，或任何其他适合的技术）。此外，反应条件应当使噬菌体包衣蛋白留在容许增殖噬菌体的条件。
噬菌体编码的多肽的硫醇基团可以在分子支架连接之前用还原剂来还原。在这样的实施方式中，特别是在噬菌体展示实施方式中，或特别是当还原剂是TCEP时，过量的还原剂适合地通过过滤除去，例如，噬菌体的过滤。
在本发明中，应用反应条件，一方面容许有效地将编码的多肽连接到分子支架，另一方面使附加的核酸（和噬菌体包衣蛋白）留在容许它的增殖或解码的条件。所述反应条件例如，反应温度、分子支架浓度、溶剂成分或pH值。
在本发明的一个实施方式中，半胱氨酸残基的硫醇基团被用作反应基团来将多肽连接到分子核心。对于某些化学反应，多肽的硫醇基团需要被还原。噬菌体展示的多肽中的硫醇基团通过添加还原剂例如三（羧乙基）膦（TCEP）来有效地还原。因为过量的还原剂可能干扰连接反应，通过噬菌体的过滤，或通过PEG沉淀来很大程度上除去它，然而低浓度（10微摩尔的或更少）可能是期望的，以在连接反应期间维持还原条件。
硫醇基团的重新氧化可以通过在肽与分子支架的反应中包括TCEP来阻止。
硫醇基团的重新氧化通过反应缓冲液的脱气来适合地阻止。
硫醇基团的重新氧化还通过螯合的金属离子复合物形成来适合地阻止，例如用乙二胺四乙酸（EDTA）螯合。
最适合地，硫醇基团的重氧化通过在分子支架的反应中包括TCEP，通过螯合，以及通过使用脱气的缓冲液来防止或抑制。
在本发明的一个实施方式中，多肽到分子支架的连接伴随着使多肽的反应基团例如噬菌体编码的多肽的硫醇基团与分子支架反应1小时。
适合地，它们在30℃下反应。
适合地，它们在10 μM到40 μM的浓度下与分子支架（例如，三（溴乙基）苯）反应。
适合地，反应在水性缓冲液中。
适合地，反应是在pH 8下。
适合地，反应缓冲液含有乙腈。适合地，反应缓冲液含有20%乙腈。
最适合地，反应特征在于两种或更多种上述条件。适合地，反应特征在于三种或更多种上述条件。适合地，反应特征在于四种或更多种上述条件。适合地，反应特征在于五种或更多种上述条件。适合地，反应特征在于六种或更多种上述条件。适合地，反应特征在于每一种上述条件。
优化这些反应条件来定量地反应多肽的硫醇基团和三（溴甲基）苯的反应基团。在同样的反应条件下，约20%的噬菌体颗粒保留了传染性，以将遗传密码带入用于增殖和解码的细菌细胞中。
在一个实施方式中，通过在含有20%乙腈的水性缓冲液pH8中，在存在10 μM TCEP的情况下，多肽的硫醇基团在30℃下与10 μM TBMB（即，三（溴甲基）苯）反应一小时，分子支架，例如，TBMB，可以连接到多肽，例如，噬菌体编码的多肽，在另一个实施方式中，反应在同样的缓冲液中在存在30 μM TCEP的情况下使用40 μM TBMB进行。
发明人还公开了在反应中分子支架的浓度对噬菌体感染性的影响。特别地，本发明适合地最小化了反应中使用的分子支架的浓度。换句话说，在与噬菌体的多肽反应之时使用的分子支架的浓度越低越好，条件是足够的分子支架连接到噬菌体多肽。照这样最小化存在的分子支架的优点是在分子支架的偶联之后噬菌体感染性的优越的保存。例如，当分子支架是TBMB时，大于100 μM的分子支架的浓度可能损害感染性。因而适合地，当分子支架是TBMB时，则适合地，在结合多肽时存在的TBMB的浓度小于100 μM。
（C）根据本发明的双特异性配体的用途
根据本发明的方法选择的多特异性肽配体可以在体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外分析和试剂应用等等中采用。
如上文间接提到的，根据本发明选择的分子在诊断、预防和治疗操作中有用。一般地，双特异性肽配体的用途可以替换双特异性抗体的用途。根据本发明选择的双特异性抗体在通过标准的免疫组织化学操作的western分析和原位蛋白质检测中是诊断性有用的；为了用于这些应用，选定的集合的抗体可以根据本领域已知的技术来标记。此外，当复合到层析支持物，例如，树脂时，这样的抗体多肽可以在亲和层析操作中制备性地使用。所有这样的技术是本领域技术人员公知的。根据本发明肽配体具有类似于抗体的结合能力，可以替代这样的分析中的抗体。
根据本发明的双特异性配体的诊断用途包括被分析物的同质性分析，其利用了双特异性肽配体竞争结合两种靶的能力，从而两种靶不能同时地结合（闭合的构象），或作为选择，它们同时地结合两个靶的能力（开放构象）。
真正同质的免疫分析形式是药物发现和开发中使用的诊断和研究分析系统的厂家热切地寻求的。主要的诊断市场包括医院、医生办公室和临床上、商业参考实验室、血库和家庭的人类测试，非人类诊断（例如，食品测试、水测试、环境测试、生物防御和兽医测试），以及最后是研究（包括药物开发；基础研究和学术研究）。
目前，所有这些市场利用了根据化学发光、ELISA、荧光或偶尔的放射免疫分析技术而构建的免疫分析系统。这些分析形式的每一种都需要分离步骤（从不结合的试剂中分离结合的试剂）。在某些情况下，需要几个分离步骤。增加这些额外的步骤增加了试剂和自动操作，耗费时间，影响分析的最终结果。在人类诊断中，分离步骤可以自动化，其屏罩了问题，但是不解决它。机器人、另外的试剂、另外的孵育时间等等增加了相当大的成本和复杂性。在药物开发中，例如，高通量筛选中，其中以非常低水平的测试分子一次性测试差不多数百万样品，增加另外的分离步骤可以消除进行筛选的能力。然而，避免分离产生了读出中的过多噪声。因而，需要真正同质的形式，其提供了在当前分析形式下可获得的范围内的敏感性。有益地，分析具有完全定量的读出结果，具有高敏感性和大动态范围。敏感性是重要要求，这降低了需要的样品的量。这两种特征都是同质的系统提供的特征。对于小心的测试，以及在样品宝贵的药物开发中，来说这是非常重要的。本领域当前可用的异质的系统需要大量的样品和昂贵的试剂。
同质的分析的应用包括癌症测试，其中最大的分析是对于前列腺特异性抗原，用于筛选前列腺癌症的男性。其他应用包括生殖力测试，其为试图怀孕的女性提供了一系列测试，包括对于妊娠的beta-hcg。传染性疾病的测试，包括肝炎、HIV、风疹和其他病毒和微生物以及性传播的疾病。测试是血库使用的，特别是对于HIV，A、B、C、非A非B型肝炎。治疗药物监督测试包括为了效力和为避免毒性监视患者中开处方的药物的水平，例如，用于心律不齐的地高辛，精神病例中的苯巴比妥水平；用于哮喘的茶碱。
诊断测试此外在滥用药物测试中是有用的，例如，可卡因、大麻等等的测试。代谢测试被用于测量甲状腺功能、贫血症和其他生理失调和功能。
同质的结合分析形式此外在标准的临床化学分析的制造中是有用的。在同一仪器中包括免疫分析和化学分析在诊断测试中是高度有益的。适合的化学测定包括测试葡萄糖、胆固醇、钾，等等。
同质的结合分析的进一步主要的应用是药物发现和开发：高通量筛选包括在非常高的体积中针对靶测试组合化学文库。检测信号，阳性组任何分成更小的组，最终在细胞、然后在动物中测试。同质的分析可以在所有这类测试中使用。在药物开发中，特别是动物研究和临床试验中，进行了免疫分析的重度使用。同质的分析大大地加速和简化这些操作。其他应用包括饮食测试：测试肉和其他食物的大肠杆菌、沙门氏菌属等等；水测试，包括测试水生植物的所有类型的污染物，包括大肠杆菌；以及兽医学测试。
在广阔的实施方式中，本发明提供了包含可检测试剂的结合分析，所述可检测试剂结合到根据本发明的双特异性肽配体，它的可检测的性质通过被分析物与所述双特异性肽配体的结合被改变。
这样的分析可以以几种不同的方式配置，每种方式采用了双特异性肽配体的上述性质。
其中双特异性配体处于闭合构象时，分析依靠被分析物对试剂的直接或间接的替换(displacement)，产生试剂的可检测性质的改变。例如，当试剂是能够催化具有可检测终点的反应的酶时，所述酶可以被所述肽配体结合，以阻塞它的活性位点，从而灭活所述酶。也被所述双特异性配体结合的被分析物替换酶，通过活性位点的释放使得它有活性。酶然后能够与底物反应，产生可检测的事件。在可选择的实施方式中，肽配体可以在活性位点外结合酶，影响酶的构象并因而改变它的活性。例如，活性位点的结构可以通过配体的结合而被限制，或活性所必需的辅助因子的结合可以被阻止。
分析的物理实现可以采用本领域已知的任何形式。例如，双特异性肽配体/酶复合物可以在测试条上提供；底物可以在测试条的不同区域中提供，含有被分析物的溶剂允许迁移通过配体/酶复合物，替换酶，携带它到达底物区域来产生信号。做为选择，配体/酶复合物可以在测试棒或其他固相上提供，浸入被分析物/底物溶液中，响应于被分析物的存在将酶释放到溶液中。
由于被分析物的每个分子潜在地释放一个酶分子，分析是定量的，取决于溶液中被分析物的浓度在给定时间内产生信号的强度。
进一步的，在闭合构象中使用被分析物的架构是可能的。例如，双特异性配体可以被配置以在变构位点中结合酶，从而活化所述酶。在这样的实施方式中，酶在不存在被分析物的情况下是活性的。被分析物的添加置换酶并且解除变构激活作用，因而灭活所述酶。
在上述实施方式的情境中，其采用酶活性作为被分析物浓度的度量，酶的活化或灭活是指酶的活性的提高或降低，作为酶催化信号产生反应的能力所测量的。例如，酶可以催化不可检测底物向其可检测的形式转化。例如，辣根过氧化酶在本领域中与商业上可获得的产色或化学发光的底物一起广泛地使用。酶活性的提高或降低的水平可以在10%到100%之间，例如，20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%；对于活性的提高来说，提高可以是超过100%，即，200%、300%、500%或更多，或如果被抑制的酶的基线活性是不可检测的，可以不按照百分比来测量。
在进一步的架构中，双特异性配体可以结合酶/底物对的底物，而不是酶。因而底物对于酶是不可获得的，直到通过被分析物的结合从双特异性配体上释放。
这种架构的实现与结合酶的架构一样。
此外，分析可以被配置以结合一定构象中的荧光分子，例如，荧光素或其他荧光团，从而在与配体结合时荧光被淬灭。在这种情况下，被分析物与配体的结合将置换荧光分子，因而产生信号。在本发明中有用的荧光分子的可选择项包括发光试剂，例如，萤光素/萤光素酶和显色剂，包括通常在免疫分析例如HRP中使用的试剂。
分析此外可以使用处于“开放”构象的双特异性配体来配置。在这种构象中，双特异性配体能够同时地结合两种靶。例如，在第一实施方式中，分析可以被配置，从而双特异性配体结合酶和底物，其中酶具有对底物的低亲和性；酶或底物的任一个是被分析物。
当底物和酶两者通过双特异性配体结合在一起时，两者之间的相互作用被强化，产生增强的信号。
做为选择，双特异性配体可以结合荧光分子，如上述的，其通过被分析物的结合被淬灭。因而，在这个实施方式中，荧光在不存在被分析物的情况下是可检测的，但是在存在被分析物的情况下被淬灭。
这样的分析的基础的实施与上文对闭合构象分析所提供的一样。
根据本发明制备的双特异性配体的治疗和预防用途涉及向接受者哺乳动物，例如，人类施用根据本发明选择的配体。双特异性可以容许肽配体以大的亲和性结合多聚的抗原。双特异性肽配体可以容许两个抗原的交联，例如，在征募细胞毒性T细胞以介导肿瘤细胞系的杀伤时。
双特异性还容许产生肽配体，所述肽配体可以对抗两种或更多种靶的生物学活性，其在医学状况的治疗中在某些情况下是有益的。双特异性还容许产生肽配体，所述肽配体可以作为两种或更多种靶的激动剂，其在医学状况的治疗中在某些情况下是有益的。
至少90到95%同质性的基本上纯的肽配体对于向哺乳动物施用是优选的，98到99%或更高的同质性对于药物用途是最优选的，特别是当哺乳动物是人类时。一旦如希望的被部分地纯化或纯化到同质，选定的多肽可以诊断或治疗地使用（包括身体外的），或在开发和进行分析程序、免疫荧光染色等等中使用（Lefkovite and Pernis,（1979 and 1981）Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY）。
本发明的肽配体一般地将在防止、抑制或治疗炎性状态、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染以及自体免疫性失调（其包括但不限于，I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病和重症肌无力）方面找到用途。
在当前的应用中，术语“预防”涉及在疾病的诱发之前施用保护性的组合物。“抑制”是指在诱发事件之后、但在疾病的临床出现之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得显明之后保护性组合物的施用。
可以用于筛选肽配体在保护对抗或治疗疾病方面的有效性的动物模型系统是可获得的。
在敏感的小鼠中全身性红斑狼疮（SLE）的测试方法是本领域已知的（Knight et al.（1978）J Exp. Med., 147: 1653；Reinersten et al.（1978）New Eng. J: Med., 299: 515）。重症肌无力（MG）通过用来自其他物种的可溶的AchR蛋白质诱导疾病在SJL/J雌性小鼠中测试（Lindstrom et al.（1988）Adv. lnzn7unol., 42: 233）。关节炎通过II型胶原蛋白的注射在小鼠敏感品系中诱导（Stuart et al.（1984）Ann. Rev. Immunol., 42: 233）。已经描述了通过分枝细菌热激蛋白的注射在敏感大鼠中诱导的佐剂关节炎的模型（Van Eden et al.（1988）Nature, 331: 171）。如描述的，通过甲状球蛋白的施用在小鼠中诱导甲状腺炎（Maron et al.（1980）J. Exp. Med., 152: 1115）。胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）天然地发生，或可以在小鼠的某些品系中诱导，例如，Kanasawa et al.（1984）Diabetologia, 27: 113所描述的。小鼠和大鼠中的EAE充当了人类中MS的模型。在这种模型中，髓鞘脱失病通过髓磷脂碱性蛋白的施用来诱导（参见 Paterson（1986）Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213；McFarlin et al.（1973）Science, 179: 478: and Satoh et al.（1987）J ；Immunol., 138: 179）。
一般地，当前的肽配体将以纯化的形式与药理学合适的载体一起使用。一般地，这些载体包括水性或醇/水性溶液，乳剂或悬浮液，任意包括盐水和/或缓冲液介质。胃肠外的运载体包括氯化钠溶液、Ringer ' s葡萄糖 葡萄糖和氯化钠以及乳酸化的Ringer ' s。如果必需保持悬浮液中的多肽复合物，适合的生理学可接受的佐剂，可以选自增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内的运载体包括流体和营养物补充物和电解质补充物，例如，基于Ringer ' s葡萄糖的那些。防腐剂和其他添加物，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体，也可以存在（Mack（1982）Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition）。
本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物或与其他试剂一起使用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如，环孢霉素、甲氨蝶呤、亚德里亚霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性试剂或其他试剂的“混合物（cocktails）”，连同本发明的选定的抗体、受体或其结合蛋白质，或甚至根据具有不同特异性的本发明选定的多肽的组合，例如，使用不同的目标配体选择的多肽，无论它们是否在施用之前被集中。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是普通技术人员公知的那些的任一种。
对于治疗，无限制地包括免疫治疗，本发明的选定的抗体、受体或其结合蛋白可以根据标准技术施用给任何患者。施用可以通过任何适合的方式，包括胃肠外、静脉内、肌内注射、腹膜内、穿表皮、通过肺部的途径、或适当地，通过导管直接输注。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况，其他药物的并发施用，禁忌症以及临床医师考虑的其他参数。
本发明的肽配体可以冻干用于保存和在使用前在适合的载体中重构。这种技术已经显示了是有效的，可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解的是，冻干和重构可以产生不同程度的活性损失，使用水平可能必需上调以进行补偿。
含有当前肽配体的组合物或其混合物可以被施用用于预防和/或治疗处置。在某些治疗应用中，实现选定细胞群体的至少部分抑制、压制、调节、杀伤或某些其它可测量参数的适当的量被定义为“治疗有效剂量”。实现这种剂量需要的量将取决于疾病的严重度和患者自身免疫系统的一般状态，一般地从0.005到5.0 mg选定的肽配体每公斤体重，0.05到2.0 mg/kg/剂的剂量是更通常地使用的。对于预防性应用，含有当前肽配体或其混合物的组合物还可以以类似的或稍微低的剂量施用。
含有根据本发明的肽配体的组合物可以在预防和治疗情境中利用，以帮助改变、灭活、杀伤或除去哺乳动物中选定的目标细胞群体。此外，在此描述的多肽的选定的集合可以身体外地或体外地使用以从细胞的异源集中选择性地杀伤、耗尽或另外有效地除去目标细胞群体。根据标准的技术，来自哺乳动物的血液可以身体外地与选定的肽配体组合，从而非期望的细胞被杀伤或以另外的方式从血液中除去，用于返回所述哺乳动物。
实施例
实施例 1. 针对 MDM2 的蛋白酶抗性的二环肽
MDM2是一种酶（E3遍在蛋白连接酶），其识别p53的反式-活化结构域，是通过蛋白体引起p53的遍在化和降解的肿瘤抑制物。p53-MDM2相互作用的nutlin抑制物可以引起p53途径的体内活化，已经表明这种试剂可能具有作为抗癌试剂的潜力。在此我们描述了针对目标“抗原”MDM2的两个二环的肽（PEP10和PEP48）的选择。每个合成肽的亲和性是亚微摩尔的，在250-750 nM的范围内。至少一个所述肽通过竞争性ELISA显示了结合与早先显示了阻断p53-MDM2 相互作用的线性肽相同的位点。
方案一般地根据在Heinis et al., 2009, Nature Chemical Biology 5, 502-507中较早描述的那些，除非另有陈述。在Heinis等的工作中，两种靶，激肽释放酶和组织蛋白酶G是蛋白酶，激肽释放酶抑制物对激肽释放酶的蛋白水解作用十分有抗性，虽然它包括激肽释放酶裂解位点。MDM2不是蛋白酶，因而不清楚的是选择的肽是否也将对蛋白酶有抗性。对于这一点和其他理由（详细参见下文）,在噬菌体肽集合与TBMB的反应（在氧化或还原条件下）之后和在针对MDM2的集合选择之前，我们包括了一个或更多个蛋白酶（糜蛋白酶）步骤。两种选出的噬菌体肽PEP10和PEP48表现了对蛋白水解作用的抗性，如噬菌体ELISA所显示的。
噬菌体产生和纯化
如早先描述的和带有几个修改，制备具有至少4×109个克隆的多样性的噬菌体肽文库，轭合TMBM。
1. 早前描述的噬菌体的cx6文库（其从TG1细胞制备）用于感染非抑制物株系HB2151（Carter, Bedouelle & Winter. 1985. Nucleic Acids Res. 13:4431-43），将感染的细胞铺板。从平板上刮下细菌置于约8 ml 2×TY培养基、30 μg/ml氯霉素、10%甘油（v/v）中。
2. 约0.8 ml的储备物添加到800 ml带有30 μg/ml氯霉素的2xTY培养基，来获得600 nm下约0.1的OD。培养物在30℃孵育，在2升烧瓶中在200rpm摇晃16小时。
3. 细胞培养物在4,000rpm（Heraeus Megafuge 2R）在4℃离心30分钟。上清液转移到200 ml冷的20% PEG、2.5 M NaCl中。混合物保持在冰上1小时。
4. 沉淀的上清液/噬菌体混合物在4℃旋转沉淀30分钟，丢弃上清液。
5. 噬菌体重悬浮在35 ml PBS、5 mM EDTA中，随后在4000 rpm旋转15分钟（Heraeus Megafuge 2R）来除去细胞碎屑。上清液转移到新的50 ml Falcon试管中。
噬菌体用 TBMB 修饰
1. 5 ml的8 mM TCEP（在H2O中）添加到噬菌体来获得终浓度1 mM TCEP。试管翻转几次来混合，在42℃水浴孵育1小时。
2. TCEP通过第二次PEG沉淀来除去。添加10 ml的20% PEG、2.5 M NaCl（脱气的溶液），混合，在冰上孵育45分钟，在4℃、4000 rpm旋转30分钟。
3. 上清液小心地除去，团粒重悬浮在12 ml PBS、5 mM EDTA、10 μM TECP（脱气的缓冲液）中。
4. 乙腈中3 ml的50 μM TBMB添加到12 mL的还原的噬菌体来获得10 μM的最终的TBMB浓度。试管翻转几次，在水浴中在30℃保持1小时。噬菌体在冰上冷却，用1/5体积的20%PEG、2.5 M NaCl沉淀30分钟。噬菌体通过在4000 rpm旋转（Hereaus Megafuge 2R）20分钟来采集。除去上清液，噬菌体重悬浮在4 ml PBS中。噬菌体转移到2 ml Eppendorf试管中，在13000 rpm（Eppendorf benchtop离心机）旋转10分钟。上清液转移到新的Eppendorf试管中，测量噬菌体感染性。
噬菌体选择：一般方案
第一轮选择
1. 上述纯化的和化学地轭合的噬菌体针对固定在链霉抗生物素蛋白包被的Dynabeads（Dynal Biotech）表面上生物素化的MDM2（bio-MDM2）肽（res2-125）来选择。80 μl的珠子首先洗涤，用PBS（PBSM）中的2%（w/v）Marvell奶粉阻断40分钟，随后在1 ml的总体积中与100 nM bio-MDM2孵育20分钟。
2. 化学地修饰的噬菌体（1010-1011 TU）与PBSM孵育40分钟。
3. 来自步骤1的阻断的Ag包衣的珠子用PBS中0.1% Tween（PBST）从过量的Ag中洗下，与阻断的噬菌体在1 mL的总体积中孵育30分钟。
4. 未结合的噬菌体用PBST洗涤10×，随后用PBS洗涤2×。在每三个洗涤步骤之后，噬菌体包被的珠子转移到新的Eppendorf试管中。
5. 噬菌体通过与500 μl的50 mM甘氨酸pH2.2在旋转轮上孵育10分钟来洗脱。洗脱的噬菌体用250 μl的1 M Tris、pH 7.5来中和。
6. 375 μl噬菌体与10 ml HB2151细胞在37℃不摇晃地孵育90分钟。
7. 感染的细胞然后在37℃摇晃30分钟，然后平铺在氯霉素平板上（20× 20 cm）。
8. 菌落从平板上刮下，到如上所述的2xTY、氯霉素、10%甘油中，作为甘油储备物在-80℃保存。细胞的一部分用于制备用于第二轮选择的噬菌体。
第二轮选择
第二轮选择类似于第一轮地进行，除了少数修改之外。
1. 使用Neutravidin包被的磁性珠子代替链霉抗生物素蛋白的。
2. 选择中使用的抗原的量是20 nM。
3. 化学修饰的噬菌体（1010-5×1010 TU）首先用50 μg/ml的糜蛋白酶处理2分钟，随后用PBSM阻断40分钟。
4. 未结合的噬菌体用PBST洗涤15×，随后用PBS洗涤2×，其他如上一样。
噬菌体选择：变体方案
使用上述的一般方案选择克隆48，而作为引入的修改方案的结果开发了克隆10。修饰是以下的：
1. 第一轮化学地修饰的噬菌体用50 μg/ml糜蛋白酶预处理2分钟，随后用PBSM阻断40分钟。
2. 在第二轮中，化学地修饰的噬菌体首先用5 mM DTT还原20分钟，随后与50 μg/ml的糜蛋白酶孵育2分钟，用PBSM阻断40分钟。
肽合成
合成来自噬菌体克隆48和噬菌体克隆10的编码的肽，带有游离的N-和C-末端。
Figure 190039DEST_PATH_IMAGE004
合成通过在CEM Liberty微波肽合成仪上通过Fmoc-肽合成，在0.1 mmol Fmoc-Gly-PEG PS树脂上使用5倍过量的用在DMF中的PyBop以及在NMP中的DIPEA活化的Fmoc-氨基酸（分别1当量和2当量）来进行。侧链保护基团如下： Arg（Pbf）；Asn（Trt）；Asp（OtBu）；Cys（Trt）；Glu（OtBu）；Lys（Boc）；Ser（tBu）；Thr（tBu）；Trp（Boc）。Fmoc-脱保护使用含20% v/v哌啶/DMF的0.1 M HOBt来进行。H-肽酰基-树脂用DMF洗涤，然后用丙-2-醇洗涤，在真空中干燥。侧链保护基团和从支持物上的裂解使用94:2.5:2.5:1 v/v/v/v TFA/EDT/H2O/iPr3SiH作用2小时。过滤肽/TFA混合物来除去支持物，肽/TFA混合物用水稀释，用Et20（5次）洗涤，水层冻干。
在Phenomenex Jupiter 5μ C18 300A 250x4.6mm柱上进行反相HPLC。缓冲液A：0.1% TFA H20；缓冲液B：含有CH3CN的10%缓冲液A。柱用10%缓冲液B等度地洗脱2分钟，然后用10-90%的线性梯度在25分钟内洗脱。检测在215/230 nm进行；流动速度1.5 ml/分钟。
肽进行冻干，通过质谱法检查。PEP10 MALDI-TOF质量（M+H）: 2099.9Da（理论：2098.4Da）PEP48 MALDI-TOF质量（M+H）: 2043.8Da（Theory: 2042.8Da.）。如实施例2描述的肽与TBMB轭合。
结合分析
噬菌体 ELISA 分析。
0.6μg/ml的生物素化的MDM2肽（res 2-125）固定在链霉抗生物素蛋白包被的平板（Roche）上。平板用PBSM阻断（但是奶粉4%）线性的或TBMB轭合的噬菌体（在存在或缺少5 mM DTT的PBSM中107 TU/反应孔）在室温下在平板上孵育50分钟。类似地，噬菌体首先在5 mM DTT中还原20分钟，用糜蛋白酶处理（PBS中50 μg/ml）2分钟，与PBSM（终浓度）混合，在平板上在室温下孵育50分钟。使用抗-M13-HRP单克隆抗体（1:5000, Amersham）检测噬菌体。
结果（附图1）定性地显示了，两种噬菌体克隆10和克隆48都结合MDM2，作为环状的轭合物，而不是作为未轭合的肽（不论是否用DTT预处理）。此外，轭合的肽的结合抵抗蛋白水解作用。注意到，DTT可以还原糜蛋白酶的二硫键，引起它作为蛋白酶的灭活。为了确保在分析的条件下糜蛋白酶是活性的，我们孵育了带线性肽的对照噬菌体，所述线性肽在如上用DTT预处理后结合MDM2。在我们的实验的条件下，对照噬菌体的结合活性在蛋白水解作用时丧失。在其他实验中，我们在存在糜蛋白酶（0.1 mg/ml-1 mg/ml）的情况下使用了达到0.2 mM-5 mM的TCEP在PBS中在室温下2分钟。这些条件也容许我们区分噬菌体上线性和环状的肽。
荧光各向异性测量
滴定实验在装备有由实验室软件控制的Hamilton Microlab滴定器的Horiba Jobin Yvon荧光计上进行。使用的λex和λem分别是295 nm和350 nm。激发和发射的隙缝宽度是5 nm和15 nm，对每个测量使用积分时间是10 s。肽10、48中色氨酸固有的荧光用于测量它们对MDM2（res 2-125）的结合亲和性。实验在PBS、5 mM DTT中在23℃进行。通常，250 μl的MDM2（150 μM）滴定到1.2 mL的肽（1 μM）中。通过使用二次解法来平衡Kd= [ A] [ B]/[ AB]，用标准的1：1结合模型分析滴定数据。Kd是离解速率，[A]和[B]分别是指滴定剂（MDM2）和荧光肽10和48的浓度。拟合方程含有额外的项来说明线性漂移。
结果（附图2和下文的）表明，每种肽的亲和性是亚微摩尔的，处于250-750 nM的范围内。对PEP48重复测量。
PEP10+MDM2, 测量的λex=295nm，Kd=267nM；
PEP48+MDM2, 测量的λex=280nm，Kd=760nM；
PEP48+MDM2, 测量的λex=295nm，Kd=567nM
竞争分析
PEP48噬菌体与MDM2的结合被肽pMI（TSFAEYWNLLSP）竞争，肽pMI以Kd = 3.3 nM在p53位点结合MDM2（Pazgier et. al., 2009 PNAS, 106, 4665-4670）。0.6 μg/ml的生物素化的MDM2肽（res 2-125）固定在链霉抗生物素蛋白包被的平板（Roche）上。平板用PBSM阻断。TBMB轭合的噬菌体（1%的PBSM中107 TU/反应孔）与一系列浓度的pDI（从6.94 nM到 1 μM）预混合，在室温下在平板上孵育75min。使用抗-M13-HRP单克隆抗体（1:5000, Amersham）检测噬菌体。PEP48噬菌体与MDM2的结合通过添加pMI肽来抑制，估计的IC50=125 nM。
实施例 2. 结合两个或更多个靶的环状肽
Heinis et al.（2009）的工作展现了针对激肽释放酶（PK15）的二环的肽（PK15）的分离。PK15通过两阶段过程来制造。产生第一个二环的集合，在两个环中都具有多样性。在用激肽释放酶反复选择之后，一组共有序列在第一环中出现，其中PK2是代表性的。然后产生第二集合，保持第一环中的PK2序列，使第二环多样化。在用激肽释放酶反复选择之后，一组共有序列在第二环中出现。两阶段的过程引起了结合亲和性的改进。
PK2第一环中共有序列的出现表明，这个环对结合产生了显著的贡献。这没有排除第二环也对PK2中的结合产生显著贡献的可能性。实际上，PK15中第二环共有序列的出现表明，第二环确实对PK15中的结合产生显著的贡献。
尽管如此，我们想知道是否可能构建二环的肽，通过组合来自不同特异性的二环肽的单独的环带有对两个靶的结合特异性。虽然我们预计看到每个靶的结合亲和性的显著的损失，我们认为，进一步的诱变应当产生具有改进的结合亲和性的变体。
因而，我们按照Heinis et al.（2009）早先描述的方式或通过以下描述的方法，首先合成了位于TBMB核心上PK15的第一环的多种变体，其中我们尝试模拟用于TBMB与噬菌体的轭合的反应条件。对于三环，采取进一步的化学步骤来连接二环肽的N-和C-末端。二环的肽通过HPLC纯化，通过质谱法检查，通过冻干来干燥。表格概述了每种变体肽的激肽释放酶活性的抑制作用的IC50。
在每个变体中PK15的第一环是下划线的，与针对组织蛋白酶G的CG4肽（Heinis et al, 1990）（双下划线的）的第一环组合，或与针对MDM2的PEP48的第一环组合（虚线的）（参见WO 2009/098450）。
Figure 183403DEST_PATH_IMAGE005
结果显示了，当与来自针对第二靶的二环的（或三环的）肽的环组合时，PK15的第一环能够抑制激肽释放酶活性。然而，抑制活性比与它相关环组合时低得多，根据非相关的环的序列和/或次序而变化。
对于与PK15组合的PEP48的第一环的结合我们也获得了结果（附图3）。因而，PK15L1-PEP48L1二环的肽具有对MDM2的结合亲和性（Kd= 1.55 μM），仅为对整个PEP48L1-PEP48L2二环肽的结合亲和性的1/2或1/3（实施例1，Kd= 500-800 nM）。此外，如以后在实施例3中显示的，FmocPEP48L1-PK15L1肽估计具有<1 μM的结合亲和性。这展现了，有可能组合不同靶特异性的两个二环肽的环，从而产生具有两种靶特异性的二环的肽。
有可能改善这些二环肽的结合亲和性，例如通过（a）合成编码具有“突出(spiked)”的寡核苷酸的肽的突变DNA盒，（b）在噬菌体上展示所述突变的肽集合，和（c）将所述噬菌体集合在逐渐严格的条件下经历数轮的选择，例如，使用更低浓度的抗原，或结合靶的噬菌体的更广泛的洗涤。此外，通过逐个针对每种靶选择集合（有或者没有插入细菌生长的轮次，取决于噬菌体产量），应当可能的是确保对两种靶都维持选择压力。产生双特异性噬菌体的其他策略的进一步的讨论在实施例4中描述。
TBMB- 肽轭合物的合成
进行起始的反应来模拟在噬菌体选择期间使用的条件。一般地，5 mg纯化的肽溶于1 ml水中，添加0.8 ml 50mM NH3HCO3，随后添加40 μl TCEP。溶于MeCN中的TBMB（根据肽的重量3当量）添加到反应中。反应保持1.5小时，然后通过HPLC监视。在完成时，反应通过HPLC纯化。一般地，获得0.5到1.5 mg的最终产物。这种方法产生了许多副产品，主要的产物为期望的质量+250 amu。这相应于TCEP向期望的产物的添加，这个产物的产量随着反应时间而提高。此外，与添加第二个TBMB相应的其它更高质量的产物由MALDI-TOF质谱法观察到，但是没有分离。
根据TCEP加合物的形成，开发了优选的方法。在肽从树脂裂解之后，它直接通过HPLC纯化，或在HPLC纯化之前用TCEP预处理15分钟。HPLC洗脱缓冲液（一般6mL）中来自HPLC反应的产物用50 mM NH3HCO3（4 mL）中和，如上述添加MeCN中的TBMB。10% THF的添加产生清液，因而加快了反应。反应通过质谱法来监视，但是一般在1-2小时中完成。来自这个反应有最小的副产物（然而，产物+16的存在由质谱法观察到）。在HPLC纯化之前，反应需要浓缩来除去有机溶剂，不然产物倾向于随溶剂前沿洗脱。这个方法的产物的产量一般是从3 mg肽产生0.5到1.5 mg，但是这没有被优化。
三环的肽的合成
三环的肽CG4L1-PK15L1-PK15-L2如下合成：大约1 mg的二环的X-CG4L1-PK15L1-Y（其中X和Y代表PK15L2的部分）溶于2 ml的20 mM NH3HCO3中，用EDC处理（100μl水中0.8 mg，10当量），在微波合成仪中在50W加热从0℃开始到37℃。反应进展在15分钟和30分钟监视，此时环化的产物是主要产物，但是也观察到水的第二损失。反应通过HPLC（半制备的）纯化，来得到单个峰的三环的轭合物，产量0.5 mg。
激肽释放酶分析
酶购自Sigma Aldrich，底物购自Bachem AG。分析缓冲液由10 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，10 mM MgCl2，1 mM CaCl2，0.1% BSA，0.01% Triton X100和5% DMSO组成。在添加底物之前，酶在RT与抑制物孵育30分钟。所有实验在30℃记录90分钟。
在BMG Pherastar平板读取器上在exc/em 350/450 nm的波长下进行分析。激肽释放酶作为1080 μg/mL的溶液购买，在分析缓冲液中稀释到0.3 nM的工作浓度。底物Z-Phe-Arg-amc以10 mM储备浓度溶解在DMSO中，用分析缓冲液稀释到300 μM的工作浓度。抑制物溶解在分析缓冲液中至储备浓度60 μM。50 μL的每种试剂导入反应孔中，每个反应孔最终体积150 μl。分析中激肽释放酶的终浓度是0.1 nM，底物是100 μM。
抑制物的终浓度是：0.5 nM、1 nM、2 nM、5 nM、8 nM、10 nM、20 nM、50 nM、80 nM、100 nM、200 nM、500 nM、800 nM、1 μM、2 μM、5 μM、8 μM、10 μM和20 μM。反应的初始速率通过标绘荧光=f（时间）数据和通过对每种抑制物浓度拟合线性趋势线来获得。通过标绘初始速率=f（[I]）获得抑制曲线，可以评估IC50值。
实施例 3. 向二环的肽添加血清白蛋白结合功能来提供同一肽内的三个功能
本发明的配体可以将轭合物包括一个或更多个官能团。官能团可以直接连接到肽或连接到支架。官能团可以包括天然的肽或化学基团或两者。在此我们描述了官能团，其可以与本发明的配体连接以赋予对血清白蛋白的结合，从而延长配体的血清半衰期。
血清白蛋白的X射线晶体结构已经在与warfarin的复合物中分辨（Petitpas et.（2001）J. Biol. Chem. 276, 22804-22809）。warfarin坐落在结构中疏水性口袋的深处。我们想知道相似结构的其他化学实体是否可以赋予对肽的结合。我们注意到，在肽合成期间用于保护氨基基团的芴甲氧羰基基团（Fmoc）可能是适合的；同样地，甲氧基--香豆素（Mca），其被用于荧光标记肽。
因而，我们用Fmoc和/或Mca产生了赖氨酸和简单的肽轭合物，在与血清白蛋白的结合中测试了这些。以下的实验显示了，Fmoc结合血清白蛋白，但是Mca不结合；此外，Fmoc-Trp或Fmoc-Phe引起结合亲和性的提高。我们预计，带有芴环的其他轭合物也将结合血清白蛋白；例如，芴乙酸，预计其对水解是更稳定的。
我们还显示了Fmoc-Trp与模型的二环肽的用途。因而，N-末端Fmoc-Trp和甘氨酸间隔区被附加到二环的肽（PEP48L1-PK15L1）。这个二环的肽包含来自两种不同特异性的二环肽的环。第一环是来自PEP48的第一环（L1），PEP48是结合MDM2的二环的肽，如在实施例1中描述的。第二环是来自PK15的第一环（L1），PK15是抑制激肽释放酶的二环的肽，如早先描述的（Heinis et al.，2009）。荧光滴定显示了，二环的肽能够以约60 nM的亲和性结合血清白蛋白，很好地位于适合血清中的半衰期延长的范围内（Nguyen et al.（2006）PEDS19, 291-297）。
这种二环的肽的结合亲和性也对MDM2进行测量。初步数据显示了，所述肽能够以< 1 μM的亲和性结合MDM2。进一步的初步实验（如实施例2中描述的）揭示了这个肽的激肽释放酶抑制的IC50是约17微摩尔。因而，该二环的肽具有三个功能：由Fmoc肽赋予的结合血清白蛋白，通过第一肽环结合MDM2，以及通过第二肽环结合激肽释放酶。
这个实施例中的结合功能可以各自在治疗药物中具有某些实用性，但是我们不意图暗示这三种功能在同一药物中的组合将是特别有益的。然而对于要递送给血流内（例如，对于激肽释放酶的抑制作用）、或细胞内（例如，阻断p53-MDM2相互作用）的靶的药物，可能有益的是具有血清中延长的半衰期。
Fmoc- 氨基酸与牛血清白蛋白的结合
对于测定荧光团对靶蛋白质的亲合常数（Kd），我们选择了荧光各向异性滴定。在此，提高量的牛血清白蛋白（BSA）被滴定到荧光肽中，如果结合发生，观察到逐渐被BSA复合的肽的典型的饱和曲线（作为各向异性(r)方面的改变的函数所记录的）。对结合平衡Kd=A*B/[AB]使用二次解法，可以确定Kd（Teufel et al,（2007）PNAS 104, 7009-7014）。
• Fmoc-Lys-Mca
在A324下使用12900/M/cm的消光系数，可以估计Fmoc-Lys-Mca（获自Nova Biochem）上荧光团甲氧基-香豆素（或Mca，其联结到Lys的□-NH2）的浓度。BSA的A280是0.667 AU/mg/mL。使用Horiba Jobin Yvon荧光计（Longjumeau Cedex, France），1.2 ml PBS（25 mM磷酸钾，125 mM NaCl, pH 7.4）中的500 nM的Fmoc-Lys-Mca用总共250 μl的15 μM BSA（在PBS中）的40份不断提高的等分量来滴定，作为BSA的提高的浓度的函数记录r的改变。激发是特异于香豆素的（328 nm），发射在393 nm。积分时间通常设置为至少10秒，激发/发射隙缝宽度取决于荧光团的浓度和量子产量来调整：在此对于激发是2 nm，发射是10 nm。在拟合数据之后，实验显示了，Fmoc-Lys-Mca以340 +/-40 nM的Kd紧密地结合BSA（附图4）。
• Lys-Mca
为了确定Mca或Fmoc是否对BSA的结合负责，Fmoc基团通过DMF中的20%哌啶来除去。照这样处理的Fmoc-Lys-Mca添加到醚中的10倍体积，沉淀Lys-Mca。冻干沉淀物，再溶解，在分析性C18反向柱上使用乙腈/H2O/0.1% TFA作为溶剂来纯化。纯的Lys-Mca的证据是缺乏A299处Fmoc的特征性光吸收峰，以及质谱上Fmoc-Lys-Mca的质量的缺乏（使用MALDI TOF，Voyager, Applied Biosystems）。使用如上同样的荧光计设置，对于Lys-Mca没有观察到结合（即，各向异性中的改变），表明Fmoc部分对结合事件负责（附图4）。
• Mca-OH
测试Mca-OH（Nova Biochem）来验证上述发现。如Lys-Mca一样，Mca-OH不结合BSA，证据是缺乏在用BSA滴定期间的各向异性变化（附图4）。
• Fmoc-Gly-OH
为了确定Fmoc上邻近的基团（在此，Gly）是否影响对BSA的结合，用Fmoc-Gly-OH（Nova Biochem）进行了类似的实验。Fmoc的内在的发荧光性质被用于各向异性实验。Fmoc展现了288和299 nm处的两个独特的吸收峰。通过在限定量的DMF中称重限定的量，在PBS中稀释1000倍，在288和299nm记录它的吸收来测定的，Fmoc-Gly-OH的消光系数在A288和A299分别是4800和5300/M/cm。Fmoc-Gly-OH具有在315 nm处的最大荧光，因而，荧光各向异性滴定实验在288激发和315发射波长下进行，隙缝宽度分别5和7 nm。比色杯中Fmoc-Gly-OH的浓度是0.5 μM，如前一样（在1.2 ml中），总共250 μl的62.7 μM BSA滴度到其中。Kd是420 +/-40 nM，其几乎相同于Fmoc-Lys-Mca。
• Fmoc-Phe-OH
为了确定邻近的疏水性大体积基团是否对BSA结合具有增强的或不利非作用，如上测试了Fmoc-Phe-OH。在此测定的消光系数是在A288处4240/M/cm。因为结合是更紧密的，荧光团（Fmoc-Phe-OH）的浓度必需被降低到100 nM用于Kd的更精确的测定，其用250 □l的15.7 μM BSA滴定。Kd是~100 nM，因而明显比Fmoc-Gly-OH更紧密，表明邻近的疏水基团（苯基环）对Fmoc对BSA的结合具有积极作用（附图4）。
Fmoc-Phe-OH 对人血清白蛋白（ HSA ）的结合
Fmoc-Phe-OH以高亲和性结合牛血清白蛋白，我们测试了对于人类同源物HSA是否可以观察到同样的。12.6 μM的250 μl HSA（使用36600/M/cm的消光系数，Moreno et al）滴定到200 nM的 Fmoc-Phe-OH中。亲和性比用BSA（Kd~100 nM）显著地更高的（Kd ~10 nM），结合是稍微协作的(cooperative)（因此，Hill方程被用于数据拟合）（附图5）。然而，Kd不能精确地测定，因为荧光团浓度显著地高于Kd；更精确的Kd测定将需要具有更好量子产量的荧光团，通过化学地修饰Fmoc或通过向苯丙氨酸的C-末端添加更好的荧光团（同时它不应当干扰HSA结合）。
将 Fmoc- 五肽结合到牛血清白蛋白
Fmoc-5-mer 衍生物的合成和纯化：
肽Fmoc-GGSGD-NH2、Fmoc-FGGGD-NH2、Fmoc-FGSGD-NH2和Fmoc-WGSGD-NH2用CEM微波肽合成仪（NC，USA）在0.1 毫摩尔规模下，利用厂家提供的标准方案来合成。采用的固相树脂是来自 Applied Biosystems的PAL-PEG-PS。合成后保护基团的去除和树脂的裂解下来用95%三氟乙酸（TFA）、2.5 %三异丙基硅烷和2.5 % H2O摇晃树脂3小时来实现。所有的肽用N-末端Fmoc和C-末端酰胺（NH2）带帽。在裂解之后，肽进行冻干，溶解在5 mL DMF中。100 μl的这种溶液加载到使用Waters HPLC的分析性C18柱上，使用甲醇和水（都存在0.1 % TFA）作为溶剂。Fmoc肽在>80 %甲醇时洗脱，没有混杂物。
• Fmoc-GGSGD-NH2
肽浓度通过在A299处Fmoc的消光系数5300/M/cm来估计（参见上文）。比色杯中的肽浓度是200 nM。这用13.1 μM的250 μl BSA滴定，激发和发射波长分别使用使用299和315nm。这种肽对BSA的亲和性是1300±380 nM，其弱于相应的Fmoc-Gly-OH。这表明，另外的氨基酸GSGD对结合BSA具有副作用（附图6）。
• Fmoc-FGSGD-NH2
我们测定了邻近于Fmoc的苯丙氨酸的对结合BSA的增强作用是否也在五肽Fmoc-FGSGD-NH2中可观察到。在与Fmoc-GGSGD-NH2一样的浓度和设置下，Kd是160 +/-20 nM，因而为甘氨酸变体的8倍紧密。这确认了Phe（邻近于Fmoc）也在更长的肽序列的环境下增强结合（附图6）。
• Fmoc-FGGGD-NH2
制备这种肽，具有中央的甘氨酸而不是丝氨酸（参见Fmoc-GGSGD-NH2用于对比），看看是否额外的丝氨酸侧链的缺乏对BSA结合有显著影响。滴定实验显示了稍微更小的亲和性（Kd=200 ± 40 nM），表明氨基酸3（从Fmoc基团开始数）上不同的侧链对结合BSA（附图6）具有影响。
• Fmoc-WGSGD-NH2
进行这个实验来看看Fmoc的C-端的Trp（而不是Phe或Gly）是否具有对Fmoc结合BSA的进一步增强作用。在此，使用0.4 μM的肽，13.1 μM的250 μl BSA（如上）。激发在299 nm（以最小化Trp吸收），发射在320 nm。隙缝宽度分别是5和12 nm。亲和性（Kd~60±8 nm）为Fmoc-FGSGD-NH2的3 倍紧密，表明更大的疏水基团有益于结合BSA。因而，在所有研究的序列中，Fmoc-Trp-GSGD是结合BSA最佳的（附图6）。
FMOC 二环的肽与血清白蛋白和两种其他靶的结合
肽合成和纯化
使用CEM微波合成仪如前所述合成肽。序列是 Fmoc-WGGGACVRFGWTCSDRFRNCG-NH2。所有的Cys和Arg在室温下偶联30分钟，最后的5个残基（WGGGA）在偶联步骤之后盖帽。在冻干之后，肽溶于80/20 DMF/H2O中，并离心。5 mL的上清液加载到同样的Waters系统的C18制备柱上。溶剂是乙腈/H2O/0.1% TFA，> 90 %纯的肽的洗脱在~50%乙腈下发生。产量是36 ml ~300 μM的肽（附图7A、B）。
用 TBMB 衍生化
上述获得的HPLC级分中含有的肽直接与TBMB反应。首先，使用Fmoc作为发色团在A299下估计浓度（300 μM）。向10 ml这种溶液中，添加H2O中的1 M碳酸氢铵0.4 ml，来获得40 mM的终浓度，其足以中和溶液中存在的TFA，并且足够过量（32mM）以作为新生的HBr的清除剂，新生的HBr作为TBMB与肽之间的反应的结果形成。向这其中，添加乙腈中100 mM TBMB 40 μl，来得到400 μM的TBMB终浓度。反应继之以质谱法，在3分钟之后完成，没有起始材料剩余，没有产生主要的副产物（附图7D）。TBMB偶联的肽然后通过上述HPLC纯化，其中反应混合物直接加载到C18制备柱上（附图7E）。产量：13ml的92 μM二环的Fmoc-WGGGA-PEP48L1-PK15-L1。
二环的 Fmoc-WGGGA-PEP48L1-PK15L1 对 BSA 的活性
由于二环的肽不良地溶于水中，它首先溶解在DMF中，然后稀释到PBS中。对于实验，总共250 μl的13.5 μM BSA以提高的等分量滴定到1.2 mL的500 nM肽中。肽浓度通过299 nm处的光吸收来估计，使用4700/M/cm的消光系数。在299 nm处激发，发射设置在320 nm，隙缝宽度分别5和12 nm。数据可以拟合到标准的配体结合方程之一（r =F*[c]/（Kd + [c]）+偏移量，其中r是各向异性的观测值，F是定标因子，[c]滴定剂的浓度（在此为BSA）），解离常数Kd是62 +/-14 nM。因而，当与二环肽PEP48L1-PK15-L1连接时，Fmoc-Trp-GGG部分在结合BSA方面是完全功能性的（附图8）。
二环的 Fmoc-WGGGA-PEP48L1-PK15L1 对 Mdm2 的活性
Mdm2以良好的亲和性结合完整的PEP48肽。我们现在测定在Fmoc-Trp-接头-二环衍生物内Mdm2结合是否仍然是功能性的。250 μl的18.8 μM Mdm2（如Teufel et al, PNAS 2007中描述的表达和纯化的）滴定到1.2 ml的500 nM肽中。发生强结合事件（Kd<1 μM），然而，数据不能拟合，因为Kd远远低于实验中采用的肽的浓度（附图9）。由于技术限制不能使用肽的更低的浓度。这种肽对Mdm2的解离常数的精确测定将需要比Fmoc（参见上文）更好的荧光团，或不同的方法，例如等温滴定量热法（ITC）。
实施例 4. 通过集合的改组创造双特异性三环的肽
在实施例2中，显示的是，来自针对两种不同靶的单独二环的肽的环的组合可以产生具有双特异性的二环的肽。然而，存在着结合亲和性的不可预见的损失。一般的选择是组合环的集合而不是单个的环，存在着多种方式来进行。
第一种方法是使用支架来构建二环的肽的集合（在两个环中都具有多样性），例如，能够与肽的三个半胱氨酸形成三个共价键的三溴甲基苯。集合然后可以针对靶A选择至少一个轮次，或直到选定的克隆的测序揭示了第一（或第二）环中共有序列的证据。适当时在共同的半胱氨酸处，第一（或第二）环集合然后可以与相似的首次用于实验的第二（或第一）环集合组合，在三价的支架上组合的两个环的集合针对靶B选择至少一个轮次。通过交替随后的两种靶之间组合的集合的选择，有可能产生具有双特异性的二环的肽。
第二种方法是如上述产生二环的肽的集合，然后针对靶A选择它，相似的集合单独地针对靶B选择，在每种情况下至少一个轮次。适当时在共同的半胱氨酸处，靶A的第一（或第二）环集合然后将与靶B的第二（或第一）环集合组合，来得到三价的支架上两个环的组合的集合。通过两种靶之间组合的集合的交替选择，有可能产生具有双特异性的二环的肽。
第三种方法是使用支架例如能够与肽的两个半胱氨酸形成两个共价键的二溴甲基苯产生单环的肽的集合（具有环中的多样性），然后针对靶A选择它，相似的文库单独地针对靶B选择，在每种情况下至少一个轮次。靶A的环集合然后在半胱氨酸处与靶B的环集合组合，然后轭合到三价的支架，例如三溴甲基苯。通过两个靶之间组合的两个环集合的交替选择，也有可能产生具有双特异性的二环的肽。这种策略的变体是通过容许环的碱基上半胱氨酸之间的配对来产生单环的肽集合（在这种情况下噬菌体可以简单地从培养物收获，容许二硫化物通过空气氧化天然地形成）。
在所有三种可能性中，可能的是，二环的肽的结合亲和性对于每种靶将不是最佳的。这些可以通过合成编码肽的、具有突出的寡核苷酸的DNA，从而在与三价支架反应之后在噬菌体上产生突变的二环的肽的集合来改善。所述集合可以如上述用两种靶进行选择，只是在更严格的条件下（例如，长洗涤时间，或更低的靶浓度）。
使用可以插入和取出的环产生肽集合的能力需要设计合适的载体。这些可以构建在限制性位点中，或邻近环的核苷酸的保守段中，适合于通过合成的DNA引物PCR扩增。为了阐释的目的，我们以下描述了限制性位点的使用，但是关键的模块特征对于PCR策略是类似的。
第一文库-单个环（用于靶A）包含单个环的第一肽文库可以根据通式N端-C-X1-C-R1-融合物-R2来设计，用于载体内的表达盒。在盒内，N端是指单环文库的N-末端侧翼序列，C是指半胱氨酸残基，X1是指随机化的氨基酸残基的第一序列，R1是指第二半胱氨酸残基的C-末端的一个或更多个氨基酸，由形成第一限制性位点的DNA序列编码，融合物是指与肽融合的多肽的至少一部分，最后R2是指由形成第二限制性位点的DNA编码的氨基酸。第二半胱氨酸残基可以与R1一起形成第一限制性位点。
第一文库-两个环（用于靶A）。包含两个环的第一肽文库可以根据通式N端-C-X1-C-R1-X2-C-融合物-R2来设计，用于载体内的表达盒。盒中的符号如前述，而X2代表随机化的氨基酸的第二序列。
第二文库-单个环（用于靶B）。包含单个环的第二肽文库可以根据通式N端-C-R1-Y1-C-融合物-R2来设计，用于载体内的表达盒。盒中的符号如前述，而Y1代表随机化的氨基酸残基的第三序列。
第二文库-两个环（用于靶B）。包含两个环的第二肽文库可以根据通式N端-C-R1-Y1-C-R3-Y2-融合物-R2来设计，其中Y2代表随机化的残基的第四序列（其他符号如前述）。
注意到，在这些设计中，第一和第二单个环的文库可以容易地衍生自相应的两个环的文库。例如，使用两个环的文库，在目标选择之后，第二环可以通过用特异于位点R1和R2的限制性内切酶消化来除去（对于盒N端-C-X1-C-R1-X2-C-融合物-R2），或在用特异于位点R3和R2的限制性内切酶消化来除去（对于盒N端-C-R1-Y1-C-R3-Y2-C-融合物-R2）。消化之后是通过部分盒R1-融合物-R2或R3-融合物-R1的DNA的连接来插入（其可以通过用适合的引物的PCR来制备），产生设计N端-C-X1-C-R1-融合物-R2或N端-C-R1-Y1-C-R3-融合物-R2的单个环的文库。
文库还可以通过在三个限制性位点的适合的切割和粘贴来容易地重组。来自第一文库的选择的靶特异性的（噬菌体的）克隆的库的载体DNA从表达噬菌体的库的细菌中制备。也制备至少包含第二文库的表达盒的DNA，例如，通过从选定噬菌体的库PCR扩增DNA。来自第一文库的载体DNA和至少包含第二文库的表达盒的DNA用特异于编码R1和R2的DNA的限制性内切酶消化，随后连接并转化到用于表达的细菌中。这产生包含第一（靶A选择的）文库的X1环和随后的第二（靶B选择的）文库的Y1环的组合文库。产生的文库中的克隆将带有产生的表达盒N端-C-X1-C-R1-Y2-C-融合物-R2或N端-C-X1-C-R1-Y2-C-R3-融合物-R2（符号如上文的）。
实施例 5. 二环的肽的蛋白酶抗性
Heinis et al., 2009的二环的肽PK15和CG4是分别针对蛋白酶激肽释放酶和组织蛋白酶G选择的，不令人惊讶的是如果所述二环的肽对这些蛋白酶的消化有抗性，特别是支架的限制性质将帮助对抗蛋白酶水解攻击的保护。
我们用激肽释放酶和其他蛋白酶比较了线性的PK15（用碘乙酰胺处理的半胱氨酸）和轭合到TBMB支架的PK15，参见下表（标度范围从+++（基本上完整的）到-（完全裂解的）。如预计的，与TBMB轭合的PK15比线性的对激肽释放酶的攻击更有抗性。如所示通过比较不同浓度的酶，因数是约100倍。
对于其他蛋白酶，因数在10到100倍的范围内，取决于蛋白酶。我们还比较了二环的CG4L1-PK15L1（实施例2）对蛋白水解作用的抗性。在这种情况下，因数在1到超过100倍之间，取决于蛋白酶。因而，轭合物具有对蛋白酶的提高的抗性，除了对在选择过程期间暴露的蛋白酶（激肽释放酶）之外。
根据蛋白酶的抗性的变异表明，期望的是在选择或筛选过程中包括蛋白水解步骤，如在实施例1中已经描述的。最期望的是使用蛋白酶，所述蛋白酶在将要使用二环肽的条件下是活性的，例如，在存在血清的情况下。出于兴趣，我们检查了PK15对血清的抗性。这显示了在37℃在2小时内线性的PK15被血清中的蛋白酶消化。然而，PK15轭合物抵抗蛋白水解作用至少48小时；更久的时间有待测试。
表：各种蛋白酶的肽轭合物消化
Figure 49DEST_PATH_IMAGE006
Figure 737061DEST_PATH_IMAGE007
数字相应于每个反应中酶的μg数。
方法
线性肽（PK15和CG4L1-PK15L1）在消化研究之前首先用碘乙酰胺处理。肽（约3-4 mg）通过HPLC纯化（如一般方法中描述的半制备Proteo柱），HPLC级分（约3 ml）用等体积的50mM碳酸氢铵中和。添加乙腈（1 mL）中的碘乙酰胺（3 mg，约9当量），反应保持在室温下直到质谱法显示反应的完成（一般2-3小时）。浓缩反应混合物（旋转蒸发器），如上述通过HPLC重新纯化。
肽（线性的和轭合的）以1 mg/ml的浓度溶于水中，得到~0.5 mM有效浓度的贮备溶液。2 μl肽轭合物（取决于实际的分子量在反应中~30 μM），当溶于总反应体积30 μl的反应缓冲液（见下文）时，随后是蛋白酶，样品在37℃孵育1小时。10 μl等分量淬灭到MeCN/H20（1：1）中的20 μl 10%二氯乙酸中，保存在-20℃30分钟，在4℃（13000rpm）离心5分钟，然后点样到MALDI-TOF质谱仪平板上用于分析。
所有反应在37℃。组织蛋白酶G和激肽释放酶反应在10 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1 mM CaCl2、0.1% BSA、0.01% Triton X100、5% DMSO中进行。糜蛋白酶反应在100 mM Tris pH 7.4、10mM CaCl2中进行。链霉蛋白酶和蛋白酶K反应在100mM Tris pH 7.4、0.5% SDS中进行。枯草蛋白酶反应在50mM KH2PO4 pH 7.5中进行。胰蛋白酶反应在67mM磷酸钠pH 7.6中进行。血清的反应条件涉及在1×PBS（总体积24 μl）中溶解肽，6 μl人类血清添加到反应中。
实施例 6 ：二环的肽 -Fc 片段轭合物
二环的肽化学地轭合到抗体的Fc片段来延长它的循环半衰期。抗体的Fc结构域结合新生Fc受体（FcRn），调节IgG再循环，因而在循环中保持其蛋白质和轭合物长时间（一般几天）。结合到FcRn也介导跨越内皮和上皮障碍的跨细胞，允许IgG和Fc和其轭合物的气雾剂递送。
马来酰亚胺 - 功能化的二环的肽 PK15 的制备
二环的肽PK15（轭合到TBMB的NH2-ACSDRFRNCPADEALCG-NH2）在N-末端用胺-和巯基-反应性接头（N-e-马来酰亚胺己酰氧基）琥珀酰亚胺酯）（EMCS）修饰。溶于DMSO中的50 mL的接头（2 mM）添加到在50 mM Tris pH 8、100 mM NaCl的950 ml PK15（50 mM）中，混合并在25℃孵育1小时。反应产物色谱地纯化。
Fc 片段的制备
通过用木瓜蛋白酶消化蛋白和链间的二硫键的选择性还原（Stevenson, G.T. et al., Journal of Immunology, 1997）或通过在哺乳动物中Fc片段的重组表达，Fc γ1片段从人类正常的IgG1制备。在后一情况中，硒代半胱氨酸被掺入以获得二环肽在化学反应中可以选择性连接的把手（Hofer, T., et al., PNAS, 2008）。
对于Fc片段的酶制品，20 mg/ml IgG在存在0.5 mM 2-巯基乙醇的情况下与木瓜蛋白酶（0.5 mg/ml）在37℃和pH6.7孵育20分钟。在这个条件下，大多数IgG裂解，没有检测到链间的二硫键的还原。Fc片段从Fab和未消化的IgG分离。片段的两个链间的键（在铰链处）通过暴露于1,4-二硫苏糖醇（DTT；2 mM）pH 8和25℃ 15分钟来还原。除去DTT，缓冲液交换为0.1 M 乙酸盐缓冲液，pH 5。通过添加0.75当量的NEM并在37℃孵育2小时，还原的半胱氨酸之一与N-乙基马来酰亚胺（NEM）反应。二硫键之一然后重构，其余的半胱氨酸残基与马来酰亚胺活化的二环的肽PK15反应，通过使用固定的人血浆激肽释放酶的亲和层析和凝胶过滤来纯化。
对于带有C-末端硒代半胱氨酸残基的Fc片段的重组表达，编码人类IgG衍生的Fc片段、TGA密码子、六组氨酸标签和人类硒蛋白硫氧还蛋白还原酶1基因的3'UTR的基因插入到哺乳动物表达载体中。蛋白质在含有硒代半胱氨酸来源（Na2SeO3；1 mM）的无血清培养基中悬浮的HEK 293细胞中表达，通过镍亲和层析纯化。纯化的Fc-硒代半胱氨酸蛋白质与马来酰亚胺功能化的二环的肽PK15在25℃在100 mM磷酸钠缓冲液pH 5.2中在存在0.1 mM DTT的情况下孵育1小时，产生肽与Fc片段的位点选择性的连接。Fc片段-环状肽轭合物通过使用固定的人血浆激肽释放酶的亲和层析和通过凝胶过滤来连续地纯化。
实施例 7 ：穿透细胞的二环的肽轭合物
制备了Pep48衍生物的许多荧光素或甲氧基-香豆素修饰的形式，在它们的C-末端含有各种细胞穿透肽（CPP）序列或对照序列。荧光团总是与N-末端连接。序列如下：
Figure 322763DEST_PATH_IMAGE008
CPP序列通常含有几个连续的精氨酸（参见Pep48-R3、Pep48T-1和-3），这些聚精氨酸可以通过采用它们的D-型的精氨酸（Pep48T-2）来进一步稳定化（Schmidt et al, FEBS Letters 2009, PMID: 19925791）。Pep48T-4和Pep48T-5分别含有CPP序列HIV-tat和Penetratin。两种CPP都很好地证明了促进目标分子的细胞摄取（Wadia et al, Nat Med. 2004 10（3）:310-5, and Dom et al, Nucleic Acids Res. 2003, 31（2）:556-61）。
Pep48序列相应于能够以Kd~1.2 μM结合Mdm2的序列（作为TBMB轭合物），如实施例1中描述的。Pep48T序列相应于随后选择的、具有估计的100 nM Kd的更紧密结合亲和性成熟的Pep48衍生物。在每种情况下第一环的序列是相同的。
两个细胞系，HeLa和HCT116用于这些实验。HeLa是人类黑人宫颈上皮样癌，HCT116是人类结肠癌。两种细胞类型都是广泛地可获得的；例如，HeLa细胞可从UK HPA以产品号93021013获得。HCT116可从UK HPA以产品号91091005获得。
细胞播种到Lab-Tek仓室的硼硅酸盐盖片（Nunc）中。在培养48小时（细胞达到40-60%汇合）之后，除去培养基，将补充有10 μM肽的新鲜培养基添加给细胞。细胞进一步培养3.5小时或24小时。在孵育时间的末尾，细胞洗涤3× DMEM，最后重悬浮在补充有10 mM HEPES缓冲液的DMEM完全培养基中。活细胞成像在激光扫描显微镜（LSM 710，Zeiss）上进行，采集微分干涉相差（DIC）和荧光图像。
荧光素Pep48-R3和Pep48-D3 TBMB轭合物肽与HCT116细胞的孵育显示了“R3”肽、而非“D3”肽的细胞内部的荧光染色。这显示了二环的肽可以穿透细胞，与上文引证的文献一致，几个精氨酸残基可以促进它。
在HeLa细胞上使用其他的带有TBMB的荧光素肽轭合物（Pep48T1-5）的随后的实验表明它们全部穿透细胞。一般地，染色是点状的，表明肽可在内涵体中积累。
与TBMB的香豆素肽轭合物看起来也选择性地进入细胞（如用相应的“R3”和“D3”轭合物显示的），但是荧光发射信号是更弱的，使得解释图像更为困难。
方法
Pep48T-1到Pep48T-5以0.25 毫摩尔规模如上所述合成，如实施例3中描述的，最后10个残基在每次偶联步骤之后盖帽。5种细胞穿透肽的每种的树脂然后分成相等的部分，用DMF中20%的哌啶脱保护，与5,6羰基荧光素琥珀酰亚胺（5,6-FAM）（Biotium）或Fmoc-Lys甲氧基香豆素（Lys-Mca）（Novabiochem）反应。对于前者，300 mg的5,6-FAM溶于5.1 mL DMF中，添加1.02 ml的激活物基质（来自34.5 mL二异丙基乙胺和65.5 mL N-甲基吡咯烷酮的储备物）。1.22 mL的这种混合物与脱保护的DMF洗涤的肽树脂反应，在RT摇晃16小时。树脂然后导出，用DMF、DCM洗涤，用TFA/三异丙基硅烷/H2O如前所述裂解。Lys-Mca在RT使用标准偶联方案偶联到肽合成仪上的N-末端1小时。荧光化的Pep48-R3和Pep48-D3如上制备，只是以0.1毫摩尔的规模。
这些肽然后如实施例3中描述的与TBMB轭合，如下。1）裂解的冻干的肽在6 M 盐酸胍+DTT（0.2 g/5 mL）中溶解，2）利用H2O/乙腈/0.1%七氟丁酸梯度的HPLC，3）MALDI-TOF来鉴定正确的级分，4）在存在40 mM碳酸氢铵的情况下偶联到TBMB，5）冻干, 6）溶解在6M 盐酸胍中，6）如2）中进行HPLC，7）如3）中进行MS，8）最终的冻干。荧光化的肽的浓度通过使用66,000 M-1cm-1的消光系数在荧光素的492 nm下估计。类似地，香豆素标记的肽浓度使用E = 12,000 M-1cm-1在324 nm下测定。
细胞在补充有10%（v/v）热灭活的胎儿牛血清、2mM L－谷氨酰胺、10 U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素（DMEM完全培养基）的Dulbecco ' s改良的Eagle ' s 培养基（DMEM，GIBCO）中在37℃在5% CO2气氛中培养。
上文说明书中提及的所有公开文件通过引用合并在此。不背离本发明的范围和精神的本发明的描述的方面和实施方式的各种修改和变体对于本领域的技术人员是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，应当理解的是要求权利的本发明不应过度局限于这种特定的实施方式。实际上，对于本领域的技术人员明显的、用于进行本发明的描述的模式的各种修改，意图在以下权利要求的范围之内。

Claims (38)

1.一种提供多特异性肽配体的方法，所述多特异性肽配体包含在三个或更多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的、能够结合两种或更多种独立的靶的多肽，所述方法包括步骤：
（a）提供多肽的第一集合，每个多肽包含能够与分子支架共价连接的两个或更多个反应基团，以及至少一个环，所述环包含在所述反应基团的两个之间对向的两个或更多个氨基酸的序列；
（b）提供如（a）中描述的多肽的第二集合；
（c）将所述第一集合的一个或更多个成员的至少一个环连接到所述第二集合的一个或更多个成员的至少一个环，来形成包含两个环的至少一个多肽，和
（d）在至少三个氨基酸位置将所述复合的多肽轭合到分子支架上。
2.根据权利要求1的方法，其中筛选所述第一和第二集合对第一和第二靶的结合来分离步骤（c）中使用的所述一个或更多个成员。
3.根据权利要求2的方法，其中所述第一和第二集合通过以下来筛选结合：
（i）将所述第一或第二集合的成员轭合到分子支架，筛选针对所述第一或第二靶的结合；或
（ii）通过所述反应基团交联所述第一或第二集合的成员；
和筛选针对所述第一或第二靶的结合。
4.根据权利要求3的方法，其中所述第一和/或第二集合的成员与分子支架轭合以形成单个环。
5.根据权利要求3的方法，其中所述第一集合的成员轭合到分子支架来形成两个或更多个环，其中其单个环与所述第二集合的成员的至少一个环连接。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤（c）引起肽配体的第三集合的形成。
7.根据权利要求6的方法，其中所述第一和第二集合之一是首次用于实验的。
8.一种提供多特异性肽配体的方法，所述多特异性肽配体包含在三个或更多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的、能够结合两种或更多种独立的靶的多肽，所述方法包括步骤：
（a）提供多肽的第一集合；
（b）将所述多肽轭合到分子支架上，所述分子支架在两个或更多个氨基酸残基处结合所述多肽形成至少一个环，来形成多肽轭合物的第一集合；
（c）针对与第一靶的结合筛选所述第一集合，选择结合所述第一靶的所述第一集合的成员；
（d）用多肽的第二集合重复步骤（a）到（c），产生结合第二靶的多肽轭合物的第二集合；
（e）分离来自所述第一和所述第二集合的成员的环，组合它们来形成多肽轭合物的第三集合，其中所述多肽在至少三个氨基酸处结合所述分子支架，选择能够结合第一和第二靶两者的分子。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中一个或更多个集合的多肽轭合物用蛋白酶处理。
10.根据权利要求9的方法，其中一个或更多个集合的所述多肽轭合物用还原剂和蛋白酶处理。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中多肽的一个或更多个集合由核酸分子的一个或更多个文库编码。
12.根据权利要求11的方法，其中所述集合的筛选使用遗传展示系统进行。
13.根据权利要求12的方法，其中所述遗传展示系统是噬菌体展示。
14.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述多特异性肽配体是双特异性的。
15.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述第三集合的成员与所述第一和第二靶的结合可以同时地发生。
16.根据权利要求1到14的任一项的方法，其中所述第三集合的成员与第一和第二靶的结合不能同时发生。
17.根据权利要求16的方法，其中所述第三集合的成员针对所述第一靶来筛选，结合的那些然后针对所述第二靶来筛选。
18.根据权利要求17的方法，其中在针对与所述第一靶的结合的所述第一次筛选之后，扩增所述第三集合，然后针对所述第二靶进行筛选。
19.多特异性肽配体，包含在至少三个氨基酸位置处与分子支架共价连接的多肽，所述多特异性肽配体能够结合两种或更多种靶。
20.根据权利要求19的多特异性配体，其能够同时地结合两种或更多种靶。
21.根据权利要求19或权利要求20的多特异性肽配体，可通过根据权利要求1到13的任一项的方法获得。
22.一种肽配体，包含轭合到一个或更多个官能团的、与分子支架共价连接的多肽。
23.根据权利要求19到21的任一项的肽配体，轭合到一个或更多个官能团。
24.根据权利要求22或权利要求23的肽配体，其中所述官能团连接到选自多肽的N末端、多肽的C末端和分子支架的一个或更多个位置。
25.根据权利要求22到24的任一项的肽配体，其中所述官能团是结合延长所述肽配体的体内半衰期的分子的配体。
26.根据权利要求25的肽配体，其中所述延长肽配体的体内半衰期的分子是HSA或细胞基质蛋白质。
27.根据权利要求26的肽配体，其中结合延长肽配体的体内半衰期的分子的配体是特异于HSA或细胞基质蛋白质的抗体或抗体片段。
28.根据权利要求22到24的任一项的肽配体，其中所述官能团是选自由与分子支架共价连接的多肽、小于1000道尔顿的化学基团、以及抗体或抗体片段构成的组的配体。
29.根据权利要求22到24的任一项的肽配体，其中所述官能团是效应物基团。
30.根据权利要求29的肽配体，其中所述效应物基团是抗体Fc区。
31.根据权利要求22到24的任一项的肽配体，其中所述效应物基团是细胞穿透肽。
32.根据权利要求31的肽配体，其中所述细胞穿透肽选自由聚精氨酸、VP-22、触角足、HIV-tat和penetratin构成的组。
33.一种制备根据权利要求22到32的任一项的肽配体的方法，包括步骤
（a）生产所述多肽；
（b）将它与所述分子支架轭合；和
（c）将所述一个或更多个官能团连接到所述多肽的N或C末端。
34.根据权利要求33的方法，其中所述官能团是FMOC。
35.一种制备根据权利要求22到32的任一项的肽配体的方法，包括步骤
（a）生产所述多肽；
（b）将它与所述分子支架轭合；和
（c）将所述一个或更多个官能团连接到所述分子支架上。
36.根据权利要求19到32的任一项的肽配体，其具有小于3000道尔顿的分子量。
37.根据权利要求19到32的任一项的肽配体，其具有小于5000道尔顿的分子量。
38.根据权利要求19到32的任一项的肽配体，其中所述多肽与分子支架连接的任何两个相邻的点之间对向的多肽环的长度在0到9个氨基酸之间，第一个和最后一个所述附着点之间多肽序列的长度是小于27个氨基酸。
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