CN105985524A - 针对特定靶标具备指纹识别特征的多肽复合物分子的构建方法 - Google Patents

Abstract

针对特定靶标具备指纹识别特征的多肽复合物分子的构建方法，其原理是利用已知或者各种筛选技术如噬菌体展示技术得到的数条或者数十条能结合特定靶标的不同多肽构建多重多价复合物分子。复合物分子中所嵌合的每一条多肽作为特定靶标的一条识别指纹，以不具备同源性和序列相似性为佳，多肽氨基酸数目可以各异，分别与受体靶标的不同表面区域和表面位点结合，这些识别指纹组合在一起构成了针对特定靶标的指纹识别系统，能以极高的选择性和特异性识别靶标，有望应用于大分子跟踪、生物成像和疾病的靶向治疗等领域。

Description

针对特定靶标具备指纹识别特征的多肽复合物分子的构建方法

技术领域

本发明涉及针对特定靶标的具备指纹识别特征多肽复合物分子的构建方法及其应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由5-100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，但相对分子质量较低。多肽普遍存在于生物体内，广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。近年来，利用现代生物技术筛选、合成得到的功能性多肽已成为药物研发的热点之一，多肽目前已广泛应用于各种疾病的预防、诊断和治疗。

经筛选和合成得到的短肽，能特异性结合蛋白、病毒、细菌、细胞甚至组织等。有多种方法获得具有针对某一特定受体，具有靶向亲和能力的活性短肽。其中噬菌体展示技术是寻找与靶蛋白有结合关系的多肽或蛋白的强效工具，它的最大优点是直接将可呈现的表现型和其基因型联系在一起，利用其配体的特异性亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肽筛选出来。目前，噬菌体展示技术可对含有数十亿克隆的肽库进行快速高通量筛选，已经成为多肽药物研究的有力工具。该技术可从肽库内筛选与特定蛋白、病毒、细菌、宿主细胞甚至组织等受体结合的多肽。噬菌体展示技术筛选结合肽的另一个显著优点是不需要预先了解受体蛋白、病毒、细菌、细胞表面的结构，甚至不需要知道结合的受体是那种蛋白分子。因为艾滋病毒、癌症细胞表面分子的高度变异和快速分子进化，开发靶向性小分子药物面临很大的挑战。噬菌体展示技术可“与时俱进”的筛选出靶向跟踪癌细胞的结合肽，为个性化、阶段针对性治疗提供可能。

影响多肽在分子和细胞生物学研究以及医学应用的制约因子，包括多肽的免疫原性、毒副作用、水溶性、体内作用时间短、与靶向目标亲和力低等。目前克服上述缺陷的一个重要手段是多肽修饰，它主要通过改变肽链的主链结构和侧链基团，从而改善肽类化合物的物理化学性质，提高其在体内的有效利用，明显改善了药物的疗效。常见的多肽修饰有C末端修饰(如酰胺化、硫酸酯化等)，N末端修饰(乙酰化、脂肪酸化等)，中间残基修饰(与Ser、Tyr、Asn、Thr结合的糖基化修饰和与Ser、Tyr、Thr结合的磷酸化修饰等)以及环化修饰等。天然结构的多肽在血中和其他组织内可被迅速降解，限制了其作为放射性药物的应用潜力。引入非生物降解的多肽骨架，用稳定的氨基酸衍生物取代天然氨基酸及环化作用可增加多肽的稳定性。多肽的内化作用可使多肽在体内滞留更长的时间。

用各种方法，如噬菌体展示技术可筛选得到一系列不同的、具备一定亲和性的多肽链，但单一的多肽链与受体蛋白分子的结合常数往往较小，对靶标的亲和力和选择特异性都较低。为了克服单一多肽与受体结合常数往往较小，对靶标的亲和力较低的缺点，常用的改进方法是合成多价多肽(Multivalent Peptides)。具体原理是利用噬菌体多肽展示技术、抗体展示技术等方法筛选得到的能特异性结合靶标受体的单一多肽(往往选取与靶标结合最紧的多肽)制备成单一多价复合物分子。单一多价亲和肽(Multivalent Peptides)与单价亲和肽(Monovalent Peptide)相比，与特定靶标的结合常数随着价态数目增加而呈指数增加。目前广泛采用的是筛选出一条与靶标受体最具亲和力的多肽制备成多价形式，可以称之为单一多价多肽(Homo-Multivalent Peptides)。这种多价复合物分子的特点是与目标受体的亲和力强，结合常数大，但因其选择的是单一结合肽，而单一多肽除了与靶标有特异性结合外，很多时候与其他非靶标受体也有着一定亲和力。因此，由单一多肽构建的多价多肽虽然与目标受体的亲和力强，但一个显著的缺陷是特异性和选择性欠佳。

发明内容

本专利针对单一多价多肽(Homo-Multivalent Peptides)与靶标受体的选择性和特异性都较低的缺点，开发具备指纹识别特征的多肽复合物(FingerprintPeptide Complex，FPC)的构建方法。具体原理是利用噬菌体多肽展示技术、抗体展示技术等方法筛选得到数条甚至数十条不同的能结合特定靶标受体的多肽(或抗体)，构建成多价复合物分子。复合物分子中所嵌合的每一条多肽作为特定靶标的一条识别指纹，这些识别指纹组合在一起构成针对特定靶标的指纹识别系统。指纹识别特征的多肽复合物(FPC)的每一条分支可和受体靶标的不同表面区域和表面位点结合，与单一多价多肽(Homo-Multivalent Peptides)相比，对靶标受体的结合特异性和选择性能大大增加。构建针对特定靶标的具备“指纹识别”特征的多肽复合物(FPC)分子一方面能以极高的选择性和特异性结合靶标，另一方面因结合了噬菌体展示技术的优点，能机动灵活的适应病毒、癌症等靶标的快速分子进化，可以做到随机应变、与时俱进的跟踪和结合靶标，甚至对靶标受体的某些位点进行屏蔽而调控其分子生物学功能，具有广阔的应用前景，有望应用于大分子跟踪、生物成像和疾病的靶向治疗等领域。

本专利的内容包括：1，针对特定靶标受体的多重亲和肽的筛选；2，指纹识别特征的多肽复合物(FPC)分子的构建。

1，针对特定靶标受体的多重亲和肽的筛选，其靶标可包括蛋白、病毒、细菌、细胞甚至组织等，多肽的选择可以是已知的对靶标具备亲和力的多肽，也可通过各种筛选方法，如噬菌体随机多肽展示、抗体展示、cDNA展示技术筛选得到。选择得到的对靶标具备一定亲和力和结合特异性的多肽必须是多条不同序列的多肽，较优选择是数条、数十条甚至几十条，它们应不具备同源性和序列相似性，氨基酸的数目可以各异。可适当减少淘洗次数，扩大多肽氨基酸数目的筛选范围(比如从5肽到12肽)，得到数十条甚至几十条不具备序列同源性且能特异性结合靶标的多肽分子。它们往往结合在靶标的不同位点和表面识别区域，每一条不具备同源性的多肽相当于一条指纹，每一个由数条或数十条结合肽组合而成的复合物分子便构成了一个针对特定靶标的“多肽识别指纹系统”。为了充分发挥“指纹识别”效果，构建针对特定靶标有极强特异性和选择性的指纹识别特征的多肽复合物(FPC)时，筛选出的不同序列多肽以不具备同源性为佳，而且多肽的条数尽可能多为宜(数条或数十条)。筛选得到的多肽，其氨基酸残基的数目可在一定范围内，比较适宜的为5～12肽。短肽免疫原性较低，但与靶标的特异性较差；长肽与靶标的结合特异性较强，免疫原性也增加了。

2，指纹识别特征的多肽复合物(FPC)分子的构建是将所选取的与靶标有特异性结合的多条不同结合肽链接在复合物分子骨架上。多肽与复合物骨架(backbone)的链接方式包括酰胺键、碳硫键、酯键、肽键、巯基-乙基砜(S-vinylsulfone)和巯基-马来酰亚胺(S-Mal)的碳-硫键等，链接反应可包括缩合反应、加成反应等。较优选择是筛选得到的多条不同多肽(每一条多肽作为识别靶标的一条指纹)在多肽侧链基团保护条件下，依次嵌合链接，此种构建方法可以确保每一个指纹识别特征的多肽复合物(FPC)分子上链接有所有的不同多肽片段。另一个选择是聚合物骨架和分支单链可以预先合成，然后加入不同的多肽进行链接，多条不同的多肽链同时进行链接反应。第二种构建方式简单，但不能保证每个复合物分子链接上完全不同的多肽片段。对于第二种构建方式，如果筛选出的多肽条数较少，容易导致单个复合物的分支中存在几条相同的肽，显著降低复合物分子对特定靶标的特异性而丧失指纹识别效应。为了使构建指纹识别特征的多肽复合物(FPC)分子对特定的靶标形成“指纹式识别”，在第二种构建方式中应减少噬菌体展示筛选技术中的淘洗次数，扩大多肽氨基酸数目的变化范围，尽可能筛选出数条甚至数十条与靶标有一定亲和能力的不同多肽，且适当增加聚合物骨架的分支数，以达到对特定靶标的指纹式和特异性识别效果。比如，扩大针对某一个靶标的多肽筛选范围，若筛选到15条不同多肽，则建立的六价混合指纹体系中将有91％以上的复合物分子中嵌入了5条完全不同序列多肽，对特定靶标的识别特异性和选择性将显著增强，可对该靶标显示出极强的指纹识别特征。

所构建的复合物结构包含分子骨架，延长支链，以及构成识别指纹的结合肽。复合物骨架的小分子单体可为乙二醇、乙二胺、肽聚糖、赖氨酸、谷氨酸、次氮基三乙酸酯、乙烯亚胺等，或者上述几种的组合。构建的聚合物分子骨架可为聚乙二醇(PEG)、肽聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚酰胺-胺聚合物(PAMAM)、聚乙基恶唑啉、聚乙烯亚胺(PEI)等与生物组织有一定相容性的单一聚合物骨架，或者上述聚合物嵌合而成的嵌合型聚合物。聚合分子相互嵌合的键合方式可以为酰胺键、酯键、肽键、巯基-乙基砜(S-vinylsulfone)和巯基-马来酰亚胺(S-Mal)的碳-硫键等。聚合物分子骨架可以设计为树枝状、丛状、梳子形、线形、环形、星形、网状等。延长支链的长度不限，可以数纳米到数十、数百纳米，分支个数不限，以4-20条为佳。对于微米尺寸的靶标如真核细胞，一般情况下某一条结合肽的受体蛋白在细胞表面有数百到数万个拷贝，复合物延长支链在纳米尺度可以触及到其特定结合位点。

指纹识别特征的多肽复合物(FPC)的应用可包括大分子跟踪、生物成像和疾病的靶向治疗等领域。应用于大分子跟踪和生物成像时，构建指纹识别特征的多肽复合物分子的过程中可补充链接上荧光分子或者含有放射性同位素的分子；用于疾病治疗，则可链接细胞毒素分子、药物分子、免疫功能细胞、能释放α-粒子和β射线的放射性核素；生物跟踪和治疗的靶标受体可包括蛋白、病毒、细菌、细胞和组织等。实施例中以针对E.coli ATCC 700928为例，详述了构建能特异性结合E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(Fingerprint PeptideComplex，FPC)分子的方法。特别说明的是，本实施例中构建指纹识别特征的多肽(FPC)复合物分子的方法不限于针对E.coli ATCC 700928，其方法可适用于针对任意靶标(可包括蛋白、病毒、细菌、细胞和组织等)的指纹识别特征多肽(Fingerprint Peptide Complex，FPC)复合物构建，前提条件是构建过程中所链接的多条不同序列的多肽是针对该特定靶标筛选到的结合肽。

附图说明

图1 PAMAM-(NH₂)₄为骨架构建FPC混合指纹体系的方法流程图

图2寡聚赖氨酸(Lys)₆和寡聚谷氨酸(Glu)₆为骨架构建FPC混合指纹体系的方法流程图

图3寡聚半胱氨酸(Cys)₆为骨架构建FPC纯指纹复合物的方法流程图

图4寡聚赖氨酸(Lys)₆为骨架构建FPC纯指纹复合物的方法流程图

图5构建针对E.coli ATCC 700928荧光或者同位素标记FPC的方法流程图

具体实施方式

下述实施例如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1针对特定靶标受体的多重亲和肽的筛选

多肽的选择可以是已知的对靶标具备亲和力的多肽，也可通过各种筛选方法，如噬菌体随机多肽展示、抗体展示、cDNA展示技术筛选得到。噬菌体随机多肽筛选为常规方法，详述如下：利用NaHCO₃缓冲液将靶标蛋白、病毒或细胞包被在酶标板上，用TBST溶液洗涤若干次，加入噬菌体库(可从New England BiolabCorp.购买，可选肽库包括5-12随机多肽库)，37℃结合1h，倾去噬菌体，用TBST洗涤。再用合适的洗脱液如(0.2M Glycine-HCl(pH2.2)和1mg/ml BSA)洗脱7-9min，洗脱液加至离心管中，加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和。洗脱液进行噬菌体滴度测定、扩增、纯化后重复上述步骤，进行下一轮筛选。经过4-6轮淘洗，挑取单克隆并提取噬菌体单链DNA进行测序。对测序得到的序列进行比对分析，得到与靶蛋白结合的多肽序列。筛选到的噬菌体与靶标结合特性经ELISA法鉴定。

所选择得到的对靶标具备一定亲和力和结合特异性的多肽必须是多条不同序列的多肽，较优选择是数条或者数十条，它们应不具备同源性和序列相似性、氨基酸的数目可以各异。可通过适当减少淘洗次数，扩大多肽的氨基酸数目的筛选范围(比如5-12肽)，得到数十条甚至几十条不具备序列同源性且能特异性结合靶标的多肽分子。它们往往结合在靶标的不同位点和表面识别区域，每一条不具备同源性的多肽相当于一条指纹，每一个由数条或数十条多肽组合的复合物分子便构成了一个针对特定靶标的“多肽识别指纹系统”。本实施例中所选取的六条多肽是已知的对E.coli ATCC 700928具备亲和力的多肽，已经由美国FDA的Mohan K.V.K.和Atreya C.D.通过噬菌体展示技术筛选得到。能结合E.coliATCC 700928的六条不同源十二肽为：SGHQLLLNKMPN，RLLFRKIRRLKR，MDMRTTDIRDTS，RNHPATLTGTGG，GILSELGKALGG，GAPALSTPPLSR，其中RLLFRKIRRLKR与E.coli ATCC 700928具有最大结合常数。

实施例2构建针对E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(FPC)(PAMAM-(NH₂)₄为骨架，混合指纹体系)。

针对E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(Fingerprint PeptideComplex，FPC)的构建步骤简述如下：先选择或构建复合物分子的丛状或梳子骨架，比如四齿聚酰胺-胺聚合物(PAMAM)、寡聚赖氨酸、寡聚谷氨酸、寡聚半胱氨酸，在每个分支上链接聚乙二醇(比如PEG₄₀₀，PEG₆₀₀，PEG₆₀₀，PEG₁₅₀₀等)，然后分别合成六条不同的十二肽，并同时链接在丛状或梳形骨架分子的PEG末端。以PAMAM-(NH₂)₄为骨架构建FPC混合指纹体系的流程见图1所示，详细过程描述如下：

1，四齿聚酰胺-胺聚合物-(聚乙二醇-马来酰亚胺)₄[PAMAM-(PEG-Mal)₄]骨架的合成：四齿聚酰胺-胺聚合物PAMAM和末端马来酰亚胺和羧基衍生化的聚乙二醇(HOOC-PEG₆₀₀-Mal)分别由威海晨源公司和Sigma-Aldrich公司提供。羧基衍生化的聚乙二醇HOOC-PEG₆₀₀-Mal的羧基先用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化，具体活化是HOOC-PEG₆₀₀-Mal溶于乙腈溶液中，与相同当量的吡啶和N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，搅拌过夜，蒸发后产物溶于乙基乙酸酯，过滤残渣并用NaHCO₃溶液洗涤，得到NHS-PEG₆₀₀-Mal。另外，NHS-PEG-Mal也可从PierceBiotech直接购买。加入4个当量的NHS-PEG₆₀₀-Mal和一个当量的四齿PAMAM链接，二氯甲烷CH₂Cl₂+TEA溶剂条件下反应得到PAMAM-(PEG-Mal)₄。

2，Fmoc常规固相多肽合成(北京中科亚光生物科技有限公司，AppliedBiosystems automatic synthesizer)分别合成上述六条十二肽SGHQLLLNKMPN，RLLFRKIRRLKR，MDMRTTDIRDTS，RNHPATLTGTGG，GILSELGKALGG，GAPALSTPPLSR，且在C末端连接上半胱氨酸Cys。其大致过程是在树脂上，按多肽分子的氨基酸(Fmoc氨基保护和其他侧链基团保护)序列，从羧基端开始，依次将氨基酸连接成特定的多肽分子。重复缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。基本操作步骤：一、去保护：Fmoc保护的单体用哌啶溶剂(30％piperidine，DMF)去除氨基的保护基团。二、激活和交联：下一个氨基酸的羧基被DMF活化。活化的单体与游离的氨基反应交联(PyBOP/HOBt/DIPEA)，形成肽键。循环：前两步反应反复循环直到合成完成。三、洗脱和脱保护：多肽从树脂上洗脱下来，其保护基团被脱保护剂(TFA/TES/H₂O)洗脱和脱保护。

3，上述合成的六条十二肽-Cys(SGHQLLLNKMPN，P₁；RLLFRKIRRLKR，P₂；MDMRTTDIRDTS，P₃；RNHPATLTGTGG，P₄；GILSELGKALGG，P₅；GAPALSTPPLSR，P₆)一起加入，与1.5摩尔当量的PAMAM-(PEG₆₀₀-Mal)₄在PBS缓冲液/10mM EDTA(pH 7)中反应2h，生成PAMAM-(PEG₆₀₀-Mal-Cys-P_1～6)₄聚合物分子，膜透析除去杂质。因为上述六条十二肽随机嵌合于PAMAM-(PEG-Mal)₄的4个分支中，实际上生成的是PAMAM-(PEG₆₀₀-Mal-Cys-P_1～6)₄的混合指纹体系。随机概率计算90％复合物分子链接了至少3条不同的十二肽，因此该多肽结合E.coli ATCC 700928有较高的特异性和选择性，对该菌株显示出指纹识别特征。如果扩大针对E.coli ATCC 700928的多肽筛选范围(比如多肽的长度从5肽至12肽)筛选到10条不同多肽，则上述四齿混合指纹体系中70％以上嵌入的是完全不同的四条多肽，多肽的指纹识别特征将显著增加。

实施例3构建针对E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(FPC)(寡聚赖氨酸、寡聚谷氨酸或者寡聚半胱氨酸为骨架，混合指纹体系)。

以六聚赖氨酸(Lys)₆为骨架构建FPC混合指纹体系的流程如图2所示，详细过程描述如下：按上述Fmoc常规固相多肽合成寡聚赖氨酸，Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，(Lys)₆，用TFA去ε-NH₂上的BOC保护。按实施例2中所述，HOOC-PEG₆₀₀-Mal的羧基经N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化得到NHS-PEG₆₀₀-Mal。加入6个当量的NHS-PEG₆₀₀-Mal和一个当量的(Lys)₆，二氯甲烷CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)溶剂条件下固相合成链接，反应得到Lys₆-(PEG-Mal)₆的复合物骨架。重复实施例2的方法，合成六条N-末端结合Cys的不同十二肽，分别为(SGHQLLLNKMPN，P₁；RLLFRKIRRLKR，P₂；MDMRTTDIRDTS，P₃；RNHPATLTGTGG，P₄；GILSELGKALGG，P₅；GAPALSTPPLSR，P₆)，与1摩尔当量的Lys₆-(PEG-Mal)₆在PBS缓冲液/10mMEDTA(pH 7)中反应2h，，生成Lys₆-(ε-N-PEG₆₀₀-Mal-Cys-P_1～6)₆聚合物分子。Fmoc基团用DMF脱保护，TFA/TES/H₂O将从树脂上洗脱下来。同理，上述六条十二肽随机嵌合于Lys₆-(PEG-Mal)₆的6个分支中，实际上生成的是Lys₆-(PEG₆₀₀-Mal-Cys-P_1～6)₆的混合指纹体系。随机概率计算大部分复合物分子链接了至少3条完全不同的十二肽，因此该多肽结合E.coli ATCC 700928有较好的特异性和选择性。

以六聚谷氨酸(Glu)₆为骨架构建FPC混合指纹体系的流程如图2所示。以寡聚谷氨酸为骨架构建(Glu)₆时，δ-COOH的保护基团叔丁氧羰基BOC经TFA/TES/H₂O去保护后用6个当量的NHS活化，且PEG₆₀₀使用氨基衍生化的聚乙二醇(NH₂-PEG₆₀₀-Mal)。后续过程与Lys₆-(PEG₆₀₀-Mal-Cys-P_1～6)₆类似，合成得到Glu₆-(PEG₆₀₀-Mal-Cys-P_1～6)₆的混合指纹体系，特异性和选择性的结合E.coliATCC 700928。扩大针对E.coli ATCC 700928的多肽筛选范围，筛选到15条不同多肽，则上述6齿混合指纹体系中91％以上嵌入了5条完全不同序列多肽，结合E.coli ATCC 700928特异性和选择性将显著增强，可对该菌株能显示出极强的指纹识别特征。

实施例3和实施例2相比，因复合物骨架的构建是固相合成方式，优势在于最终产物提纯可以用洗脱的方式。

实施例4构建针对E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(FPC)(六聚半胱氨酸(Cys)₆为骨架构建针对E.coli ATCC 700928的纯指纹复合物分子)。

与实施例2、3构建的混合指纹体系不同的是，实施例4是针对E.coli ATCC700928构建纯指纹配合物分子。为实现纯指纹配合物的合成，与上述合成过程的显著差异在于每一条多肽是按顺序依次链接，且复合物的骨架构建和多肽链接同时进行。具体过程以六聚半胱氨酸(Cys)₆、六聚谷氨酸(Glu)₆、六聚赖氨酸(Lys)₆为骨架，构建针对E.coli ATCC 700928的具备指纹识别特征的纯多肽复合物(FPC)为例。

以六聚半胱氨酸(Cys)₆为骨架构建FPC纯指纹复合物的流程如图3所示。按实施例2羧基衍生化的聚乙二醇HOOC-PEG₆₀₀-Mal的羧基先用NHS活化，得到NHS-PEG₆₀₀-Mal.按实施例2用Fmoc常规固相多肽合成法，分别合成上述六条多肽(SGHQLLLNKMPN，P₁；RLLFRKIRRLKR，P₂；MDMRTTDIRDTS，P₃；RNHPATLTGTGG，P₄；GILSELGKALGG，P₅；GAPALSTPPLSR，P₆)，十二肽的N末端用用哌啶溶剂(30％piperidine，DMF)去除氨基的保护基团后，分别与同当量NHS-PEG₆₀₀-Mal在二氯甲烷CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)溶剂条件下反应，生成六条不同的P_1～6-PEG₆₀₀-Mal单链聚合物分子，分别为P₁-PEG₆₀₀-Mal，P₂-PEG₆₀₀-Mal，P₃-PEG₆₀₀-Mal，P₄-PEG₆₀₀-Mal，P₅-PEG₆₀₀-Mal，P₆-PEG₆₀₀-Mal。特别说明：如果多肽序列中含有半胱氨酸时(本实施例P₁-P₆指纹序列中不含Cys)，需要对指纹序列中的巯基进行保护，且确保在多肽合成过程中保护基团不被脱除，可选用的保护基为t-Bu，Bom，stBu，Bzl等。

上述P_1～6-PEG₆₀₀-Mal单链聚合物分子在PBS缓冲液/10mM EDTA(pH 7)中分别与半胱氨酸(Cys)反应2h链接，温和条件下切割(确保P₁-P₆指纹序列中的保护基团不被脱除)，得到巯基被P_1～6-PEG₆₀₀-Mal单链修饰的Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P_1～6)，。再按照Fmoc常规固相多肽合成法在树脂球上链接任意一个氨基酸，并依次分别链接Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P₁)，Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P₂)，Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P₃)，Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P₄)，Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P₅)，Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P₆)，(或者Cys-(S-Mal-PEG₆₀₀-P_1～6)上半胱氨酸α-COOH经NHS活化后在CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)条件下依次链接)得到针对E.coli ATCC 700928的Cys₆-(S-Mal-PEG₆₀₀-P_1～6)₆纯指纹复合物分子。

另外一种依次链接的方式是在多肽固相合成树脂上接第一个Cys，PBS缓冲液/10mM EDTA(pH 7)条件下侧链巯基链接上Mal-PEG₆₀₀-P₁；固相延伸第二个Cys，侧链巯基链接上Mal-PEG₆₀₀-P₂；持续上述过程，依次类推。为了减少支链之间的位阻，可在半胱氨酸之间嵌入其它氨基酸X，合成得到(X-Cys)₆-(S-Mal-PEG₆₀₀-P_1～6)₆指纹分子。

实施例5构建针对E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(FPC)(六聚赖氨酸Lys₆或六聚谷氨酸Glu₆为骨架，构建针对E.coli ATCC 700928的纯指纹复合物分子)。

以六聚赖氨酸(Lys)₆为骨架构建FPC纯指纹复合物的流程如图4所示。左右两端都羧基衍生化的聚乙二醇(HOOC-PEG₆₀₀-COOH)由Sigma-Aldrich公司提供。按照实施例2的方法，HOOC-PEG₆₀₀-COOH经NHS活化得到NHS-PEG₆₀₀-NHS。按照实施例4的方法，分别固相合成六条多肽(SGHQLLLNKMPN，P₁；RLLFRKIRRLKR，P₂；MDMRTTDIRDTS，P₃；RNHPATLTGTGG，P₄；GILSELGKALGG，P₅；GAPALSTPPLSR，P₆)，其中十二肽的N末端用用哌啶溶剂(30％piperidine，DMF)去除氨基的保护基团后，分别与同当量NHS-PEG₆₀₀-NHS在二氯甲烷CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)溶剂条件下反应，生成六条不同的P_1～6-PEG₆₀₀-NHS单链聚合物分子，分别为P₁-PEG₆₀₀-NHS，P₂-PEG₆₀₀-NHS，P₃-PEG₆₀₀-NHS，P₄-PEG₆₀₀-NHS，P₅-PEG₆₀₀-NHS，P₆-PEG₆₀₀-NHS。继续在相同溶剂体系中，使P_1～6-PEG₆₀₀-NHS分别链接在Lys的ε-NH₂上(Fmoc保护α-N的氨基)，温和条件下切割(确保P₁-P₆指纹序列中的保护基团不被脱除)，得到六条不同的P_1～6-PEG₆₀₀-ε-N-Lys单链分子。在树脂球上按照Fmoc常规固相多肽合成法依次分别链接P₁-PEG₆₀₀-ε-N-Lys，P₂-PEG₆₀₀-ε-N-Lys，P₃-PEG₆₀₀-ε-N-Lys，P₄-PEG₆₀₀-ε-N-Lys，P₅-PEG₆₀₀-ε-N-Lys，P₆-PEG₆₀₀-ε-N-Lys，(或者P_1～6-PEG₆₀₀-ε-N-Lys上赖氨酸α-COOH经NHS活化后在CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)条件下依次链接)得到针对Ecoli ATCC700928的Lys₆-ε-N-(PEG₆₀₀-P_1～6)₆纯指纹复合物分子。另外一种依次链接的方式是在多肽固相合成树脂上接第一个Lys，活化侧链ε-NH₂与P₁-PEG₆₀₀-NHS反应，链接上ε-NHCO-PEG₆₀₀-P₁；固相延伸第二个Lys，活化侧链ε-NH₂与P₂-PEG₆₀₀-NHS反应，链接上ε-NHCO-PEG₆₀₀-P₂；持续上述过程，依次类推。为了减少支链之间的位阻，可在赖氨酸之间嵌入其它氨基酸X，合成得到(X-Lys)₆-ε-N-(PEG₆₀₀-P_1～6)₆纯指纹复合物。

以寡聚谷氨酸(Glu)6为骨架构建时，购买两端功能基分别是氨基和羧基的聚乙二醇NH₂-PEG₆₀₀-COOH。按实施例2分别合成上述六条十二肽SGHQLLLNKMPN，RLLFRKIRRLKR，MDMRTTDIRDTS，RNHPATLTGTGG，GILSELGKALGG，GAPALSTPPLSR，十二肽的N末端用用哌啶溶剂(30％piperidine，DMF)去除氨基的保护基团后，分别与同当量Fmoc-NH₂-PEG₆₀₀-COOH在PyBOP/HOBt/DIPEA条件下继续固相合成，得到Fmoc-NH₂-PEG₆₀₀-P_1～6。在二氯甲烷CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)溶剂条件下，继续延伸一个δ-COOH基团被NHS活化后的谷氨酸Glu-^δC-NHS，然后温和条件下切割(确保P₁-P₆指纹序列中的保护基团不被脱除)，得到六条Glu-^δC-PEG₆₀₀-P_1～6单链分子，分别为Glu-^δC-PEG₆₀₀-P₁，Glu-^δC-PEG₆₀₀-P₂，Glu-^δC-PEG₆₀₀-P₃，Glu-^δC-PEG₆₀₀-P₄，Glu-^δC-PEG₆₀₀-P₅，Glu-^δC-PEG₆₀₀-P₆。再按照Fmoc常规固相多肽合成法在树脂球上链接任意一个氨基酸并依次分别链接上述谷氨酸衍生单体(或者按照Glu-^δC-PEG₆₀₀-P_1～6上谷氨酸α-COOH经NHS活化后在CH₂Cl₂+TEA(或者DMF+DIPEA)条件下依次链接)，得到针对E.coli ATCC 700928的Glu₆-^δC-(PEG₆₀₀-P_1～6)₆纯指纹复合物分子。同理，另外一种依次链接的方式是在多肽固相合成树脂上接上第一个Glu，活化侧链^δC-COOH为^δC-NHS，与NH₂-PEG₆₀₀-P₁反应，链接上^δC-CONH-PEG₆₀₀-P₁；固相延伸第二个Glu，活化侧链^δC-COOH为^δC-NHS，与NH₂-PEG₆₀₀-P₂反应，链接上^δC-CONH-PEG₆₀₀-P₂；依次类推持续上述过程。为了减少支链之间的位阻，可在谷氨酸之间嵌入其它氨基酸X，合成得到(X-Glu)₆-^δC-(PEG₆₀₀-P_1～6)₆纯指纹复合物。

实施例6构建针对E.coli ATCC 700928的指纹识别特征的多肽复合物(荧光或者同位素标记)(Fluorescent-or Isotope-labeled FPC)

构建针对E.coli ATCC 700928荧光或者同位素标记的FPC过程如图5所示。针对E.coli ATCC 700928具备指纹识别特征的多肽复合物按照上述实施例2-5合成得到，其复合物骨架中N末端氨基，用来链接1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N，N-四乙酸(DOTA)或者1，4，7-Triazacyclononane-N，N′，N″-triaceticacid(NOTA)。DOTA的三个羧基用tBu保护，得到DOTA tris(tBu ester)-OH，在多肽固相合成条件下(HOBT，HBTU，DIEA)形成酰胺键，再加入^{111，113，115}InCl₃或者In(NO₃)₃，醋酸缓冲液中(pH 5.5，40℃，1h)载入铟离子。NOTA的两个羧基用tBu保护，与DOTA的配合方式类似，多肽固相合成条件下(HOBT，HBTU，DIPEA)形成酰胺键，再载入⁶⁴Cu或者⁶⁸Ga离子。荧光基团的载入在此实施例中用2，6-二甲酰-4-甲基苯酚为例，两个甲酰基中的一个与上述指纹多肽复合物骨架的N末端氨基，在乙醇溶剂中60℃生成酰胺键，嵌入指纹多肽复合物体系中。

Claims (10)

1.针对特定靶标具备指纹识别特征的多肽复合物的构建方法，其原理是利用已知的或者各种筛选技术如噬菌体展示技术得到的数条或者数十条能结合特定靶标的不同多肽，构建具备指纹识别特征的多肽复合物，高选择性和高特异性结合特定靶标。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特定靶标包括各种蛋白、病毒、细菌、细胞甚至生物组织等。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多肽是已知的或者各种筛选技术如噬菌体展示技术得到的数条或者数十条能结合特定靶标的不同多肽；为了针对特定靶标形成指纹识别特征，构建复合物的多肽须以不具备同源性和序列相似性为佳，多肽氨基酸数目可以各异，筛选出的多肽数量以达到数条、数十条甚至几十条为佳，它们分别与同一靶标受体的不同表面区域和表面位点结合，以达到对特定靶标的指纹识别。

4.根据权利要求1所述的多肽复合物，链接上荧光、同位素标记、药物分子或者免疫细胞后，可应用于分子跟踪、生物成像和疾病的靶向治疗。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所构建的复合物结构包含分子骨架，延长支链，以及构成识别指纹的多肽。复合物骨架和延长支链包括聚酰胺-胺聚合物(PAMAM)、寡聚赖氨酸、寡聚谷氨酸、寡聚半胱氨酸、聚乙二醇(PEG)、肽聚糖、聚乙基恶唑啉、聚乙烯亚胺(PEI)等单一聚合物骨架，或者上述聚合物组成的嵌合型骨架和延长支链；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分子骨架、延长支链、指纹多肽相互链接的方式包括酰胺键、酯键、肽键、巯基-乙基砜(S-vinylsulfone)和巯基-马来酰亚胺(S-Mal)的碳-硫键等；复合物可以设计为树枝状、丛状、梳子形、线形、环形、星形、网状等；延长支链的长度不限，可为数纳米到数十、数百纳米，分支个数不限，以4-20条为佳。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，构建针对特定靶标具备指纹特征的复合物，包括混合指纹体系和纯指纹体系的复合物；前者特征在于先构建复合物骨架并链接上延长支链，然后同时链接所有的不同序列多肽；后者在于骨架和支链拼接和多肽链接同时完成，不同序列多肽按先后顺序链接。

8.根据权利要求7所述的混合指纹体系，其特征在于，为了构建与靶标形成指纹识别的多肽复合物，所筛选出的多肽条数大于延长支链的数目为佳；其差值越大，骨架上嵌入完全不同多肽的几率越大，结合靶标的指纹特征将越显著。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以构建针对E.coli ATCC700928具备指纹识别特征的多肽复合物为例，选择并固相合成已知的能特异性结合E.coli ATCC700928的六条不具备序列同源性的十二肽，构建丛状PAMAM骨架(四齿)(或者六聚赖氨酸、六聚谷氨酸和六聚半胱氨酸骨架)，以PEG-Mal为延长支链，随机链接上述六条多肽，合成对E.coli ATCC700928具备指纹识别特征的混合型多肽复合物。

10.根据权利要求1～8任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以构建针对E.coli ATCC700928具备指纹识别特征的纯多肽复合物为例，选择并分别固相合成已知的能特异性结合E.coli ATCC700928的六条不具备序列同源性的十二肽，链接PEG延长支链，与半胱氨酸(或者赖氨酸、谷氨酸)的支链基团巯基(或者ε-NH₂、δ-COOH)链接，主链再以肽键依次链接；或者构建六聚半胱氨酸(或者六聚赖氨酸、六聚谷氨酸)骨架过程中，肽键延长和支链基团如巯基(或者ε-NH₂、δ-COOH)上PEG-多肽单链的修饰间隔进行，得到对E.coli ATCC700928具备指纹识别特征的纯多肽复合物。