CN105189747A - 多肽的修饰 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种在离子交换树脂上进行的用于将展示于遗传展示系统的肽缀合于分子支架的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生产具有期望的结合活性的多肽配体的方法。特别地，本发明涉及多肽的生产，所述多肽共价结合于分子支架，从而两个或更多肽环在支架的附着点之间相对。分子支架与多肽的附着在纯化树脂上进行，纯化树脂可以为磁性树脂珠粒的形式。
背景技术
环肽能够以高亲和性结合并特异性地靶向蛋白靶标，因而是用于治疗开发的有吸引力的分子类型。实际上，数个环肽已经成功用于临床，例如，抗菌肽万古霉素，免疫抑制药物环孢霉素或抗癌药物奥曲肽(ocreotide)(Driggers等人，NatRevDrugDiscov2008，7(7)，608-24)。良好的结合特性来自肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面，以及降低的环状结构构象柔性。通常，大环结合数百平方埃的表面，例如，环肽CXCR4拮抗剂CVX15(；Wu,B.等人，Science330(6007)，1066-71)，结合整合素αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的环肽()(Xiong,J.P.等人，Science2002，296(5565)，151-5)、或结合尿激酶型纤溶酶原激活物的环肽抑制剂upain-1(；Zhao,G.等人,JStructBiol2007,160(1),1-10)。
由于其环状构型，大环肽比线性肽柔性低，导致了在结合靶标时熵损失较少，得到了较高的结合亲和性。降低的柔性还导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比增加了结合特异性。该效果已经被基质金属蛋白酶8(MMP-8)有效的选择性抑制剂例证了，其中当所述抑制剂的环打开时，失去了对其他MMP的选择性(Cherney,R.J.等人，JMedChem1998，41(11)，1749-51)。通过大环化实现的有利的结合特性，甚至在具有一个以上肽环的多环肽中更显著，例如，在万古霉素、乳酸链球菌肽(nisin)或放线菌素中。
之前不同的研究小组将带有半胱氨酸残基的多肽连接至合成的分子结构上(Kemp,D.S和McNamara,P.E.,J.Org.Chem,1985；Timmerman,P.等人，ChemBioChem,2005)。Meloen和合作者使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速且定量地环化至合成的支架上，用于蛋白表面的结构化模拟(Timmerman,P.等人，ChemBioChem,2005)。生成候选药物化合物的方法公开于WO2004/077062和WO2006/078161中，其中通过将含有半胱氨酸的多肽连接至例如三(溴甲基)苯的分子支架生成所述化合物。
WO2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。特别地，该文献公开了包括第一和第二反应基团的各种支架分子，以及使所述支架与另外的分子接触，来在偶联反应中在支架和另外的分子之间形成至少两个连接。
WO2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和模拟肽。该文献公开了来自现有蛋白的肽的各种集合的人工合成。之后将这些肽与恒定的合成肽组合以生成组合文库，其中恒定的合成肽具有某些引入的氨基酸改变。通过由化学连接将这种多样性引入来区分以各种氨基酸改变为特征的肽，为发现期望的结合活性提供了增加的机会。该文献的附图1显示了各种环肽构建体的合成的示意图。该文献中公开的构建体依赖-SH功能化肽，典型地包含半胱氨酸残基，和支架上的杂芳基，典型地包含苄基卤素取代基如二-或三-溴苯基苯。这样的基团发生反应，在肽和支架之间形成硫醚连接。
Heinis等人最近开发了基于噬菌体展示的组合方法，来产生和筛选兴趣靶标的双环肽的大文库(Heinis等人,NatChemBiol2009,5(7),502-7；也可参见国际专利申请WO2009/098450)。简言之，将线性肽的组合文库在噬菌体上展示，其中线性肽含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的两个区域，并通过半胱氨酸侧链共价连接至小分子(三(溴甲基)苯)进行环化。在对人蛋白酶组织蛋白酶G和血浆激肽释放酶(PK)的亲和性选择中，分离的双环肽具有纳摩尔级的抑制常数。最好的抑制剂PK15以3nM的Ki抑制人PK(hPK)。在数个分离双环肽的氨基酸序列中的相似性表明两个肽环均有助于结合。在最高测试浓度(10μM)下，ΡΚ15既不抑制大鼠PK(81％序列同一性)，也不抑制同源的人类丝氨酸蛋白酶因子XIa(hfXIa；69％序列同一性)或凝血酶(36％序列同一性)(Heinis等人,NatChemBiol2009,5(7),502-7)。这一发现表明双环抑制剂拥有对其靶标高度的亲和性，并且是高度特异的。
尽管Heinis等人公开的方法对于展示的多肽配体的修饰来产生双环肽是有效的，但其效率非常低。例如，以每初始噬菌体颗粒350分之1的比例生成感染性噬菌体。因此我们开发了一种改进的方法，用于修饰遗传展示系统上展示的多肽配体。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种方法，用于将遗传展示系统上展示的肽与分子支架缀合，包括步骤：
(a)将在遗传展示系统上展示的多肽与纯化树脂相组合，使得展示系统结合树脂，并用还原剂处理结合的展示系统；
(b)使结合的展示系统接触分子支架；
(c)从结合的展示系统中去除未反应的分子支架；以及
(d)从纯化树脂上洗脱展示系统。
Heinis等人的原始方法在自由溶液(freesolution)中实施肽和分子支架(TBMB)的缀合。之后通过离心分离携带有缀合于(或未缀合)TBMB支架的肽的噬菌体。通过将噬菌体缀合于固相纯化树脂，我们获得了改进的结果，纯化树脂之后可用于分离噬菌体。例如，该树脂可以通过离心分离，或保留在柱子中；在一个优选的实施方式中，该树脂是磁性的并且可以通过施加磁场来分离。
Heinis等人使用无二硫化物噬菌体(disulphide-freephage)获得了更好的肽和分子支架(TBMB)缀合结果。使用本文所述的技术，通过将多肽缀合于野生型pIII外壳蛋白使得其展示在噬菌体颗粒上，我们获得了改进的结果，比Heinis等人获得的结果更好。
虽然野生型pIII受制于在将分子支架偶联于多肽的步骤中使用的还原剂造成的二硫键降解，我们发现相比于无二硫化物噬菌体，携带野生型pIII的噬菌体的增强的感染性大大弥补了二硫键降解造成的任何活性损失。
优选地，多肽通过融合于fd噬菌体(如fd-tet噬菌体)的pIII蛋白上来展示。
在实施方式中，遗传展示系统选择自噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展示和细菌展示。在一个实施方式中，遗传展示系统是噬菌体展示。
在一个实施方式中，在加入分子支架前，紧随步骤(a)的是洗涤步骤。例如，可以用还原剂的溶液进行洗涤，例如步骤(a)中使用的还原剂。有利地，洗涤步骤中使用的还原剂比步骤(a)中使用的还原剂不那么强或更稀。
优选地，包括低于500mM，优选低于200mM，有利地低于100mM浓度的步骤(a)中所用的还原剂。例如，还原剂存在的浓度为10mM或更低，如1mM。
优选地，包括低于500μM，优选低于200μM，有利地低于100μM浓度的步骤(b)中的还原剂。例如，还原剂存在的浓度为10μM或更低，如1μM。
结合于树脂的多肽可以以纯化的形式暴露于还原剂，或者可以出现在培养中。遗传展示系统涉及在细胞如细菌或酵母中复制；这些细胞可以经纯化去除，在这种情况下步骤(a)可以包含洗涤步骤，在洗涤步骤中结合于树脂的多肽在缓冲液中洗涤，并与细胞培养杂质相分离。
一种合适的还原剂是TCEP。其他还原剂，如DTT，如本文所述可以使用。
还原和缀合反应优选在室温下实施，如25℃。在一些实施方式中，缀合反应可以在30℃下实施。在前述的Heinis等人的方法中，反应在高于室温的温度下实施，例如42℃。
还原和缀合反应有利地实施少于一小时的一段时间。例如，反应可以实施30分钟、20分钟、15分钟或10分钟。
多肽优选是含有至少三个反应基团的多肽，其被至少两个序列隔开，当缀合于分子支架时可以形成多肽的“环”。这些环可以是任何合适的长度，如二、三、四、五、六、七或更多氨基酸长。这些环可以是同样长度，或不同。优选地，至少提供两个环。在一些实施方式中，可以出现三、四、五、六或更多的环。
多肽中的反应基团能够与支架形成共价连接。最常见地，反应基团包括半胱氨酸残基。
肽与纯化树脂相组合，纯化树脂可以是作为固相用于蛋白质材料纯化的任何合适树脂。许多树脂，如包括珠粒和色谱材料的离子交换树脂，在本领域公知可用于这种目的。
在一个有利的实施方式中，该树脂是磁性树脂，其允许结合在遗传展示系统上的多肽的磁分离。
支架可以是为多肽反应基团提供多个附着点的任何结构。典型的支架在下面描述。支架分子缀合于多肽，同时多肽掺入遗传展示系统中，使得遗传展示系统展示包含分子支架的多肽配体。多余的支架被去除。
支架缀合于多肽上之后，从树脂上洗脱掺入了多肽配体的遗传展示系统。该多肽之后可以以缀合形式在遗传展示系统上展示，以及通过已知的方法选择。
在实施方式中，多肽配体是多特异性的。在第一架构中，例如，通过多肽与分子支架相互作用形成的多肽环能够结合于一个以上的靶标。在这种架构中，在一个实施方式中可以单独选择环来结合期望的靶标，之后进行组合。在另一个实施方式中，环作为单独结构的一部分被一起选择，来结合不同的期望靶标。
在第二架构中，功能基团可以附着至多肽的N或C末端，或两端。该功能基团可以采用能结合于靶标的结合基团的形式，如多肽，包括抗体结构域、Fc结构域或如上面描述的其他结构化的肽。此外，其可以采用能化学键合于靶标的反应基团的形式。再者，其可以为效应基团，包括大的血浆蛋白，如血清白蛋白，以及细胞穿透肽。
在第三架构中，功能基团可以附着至分子支架自身。功能基团的示例是如前述的架构。
在其他实施方式中，多肽配体包含以n个附着点连接于分子支架的多肽，其中所述多肽被环化，并形成n个分开的环，分开的环在分子支架上所述n个附着点之间相对，其中n大于或等于2。
多肽优选通过N-到C-末端融合来环化，并且可以在附着于分子支架之前或之后进行环化。优选附着先于环化。
用于肽环化的一些方法是本领域已知的。例如，多肽通过N-C交联环化，使用交联剂如EDC。
在另一个实施方式中，肽可以设计成包含保护的Nα或Cα衍生氨基酸，并且通过保护的Nα或Cα衍生氨基酸的去保护来环化，进而将所述氨基酸偶联至多肽的对向末端。
在优选的实施方式中，多肽通过酶的方法环化。
例如，该酶是转谷氨酰胺酶，例如微生物转谷氨酰胺酶，如茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)转谷氨酰胺酶。为了利用酶环化，有必要在多肽中为酶掺入N-和/或C-末端底物序列。一些或全部的底物序列能够在酶反应中除去，意味着环化的多肽在其最终架构中可能不会含有底物序列。
在再进一步的实施方式中，根据本发明的多肽配体特异于人类激肽释放酶，并且包含含有至少三个反应基团的多肽，被至少两个环序列分隔开，以及与多肽的反应基团形成共价键的分子支架，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，其中肽配体的环包含三、四或五，但少于六个氨基酸。
令人惊讶地，我们发现在各环中包含少于6个氨基酸的肽对激肽释放酶具有更高的结合亲和性。
在一个实施方式中，肽配体的环包含三个氨基酸，并且多肽有共有序列GrFxxGrRVxGr，其中Gr是反应基团。
在另一个实施方式中，肽配体的环包含五个氨基酸，并且第一环包含共有序列GrGGxxNGr，其中Gr是反应基团。
例如，多肽的两个相邻的环可以包含共有序列GrGGxxNGrRxxxxGr。
在一个实施方式中，肽配体的环包含五个氨基酸，并且第一环包含基序GrxW/FPxK/RGr，其中Gr是反应基团。在本上下文中，提及“第一”环时，并不一定指序列中环的特定位置。不过，在一些实施方式中，第一环可以是氨基末端到羧基末端肽序列中的近端环。例如，多肽进一步包含第二远端环，其含有基序Gr T/LHQ/TxLGr。第一环的序列的示例包括GrxWPARGr，GrxWPSRGr，GrxFPFRGr和GrxFPYRGr。在这些示例中，x可以是任何氨基酸，但例如是S或R。
在一个实施方式中，肽配体的环包含五个氨基酸，并且第一环包含基序GrxHxDLGr，其中Gr是反应基团。
在一个实施方式中，肽配体的环包含五个氨基酸，并且第一环包含基序GrTHxxLGr，其中Gr是反应基团。
在一个实施方式中，多肽包含两个邻近的环，其包含基序GrxW/FPxK/RGr T/LHQ/TDLGr。
在本文的实施例中，数字表示环中的位置，并且忽略反应基团。因此，在GrxW/FPxK/RGr T/LHQ/TDLGr中，x在位置1，T/L在位置6。
在前述实施方式中，反应基团优选是反应性氨基酸。优选地，反应性氨基酸是半胱氨酸。
如上所述，可通过鉴定对突变有用的那些残基并通过制备在那些位置上包含突变的文库，制备根据本发明这一方面的多肽变体。
在另一方面中，提供了根据本发明的前述方面的多肽配体，其包含一个或更多非天然氨基酸取代，并且抵抗蛋白酶降解。
我们发现某些非天然氨基酸允许以nMKi来结合血浆激肽释放酶，同时显著增加在血浆中的停留时间。
在一个实施方式中，非天然氨基酸选自N-甲基精氨酸、高精氨酸(homo-arginine)和羟脯氨酸。优选地，精氨酸的N-甲基和同型(homo-)衍生物被用来取代精氨酸，另外优选地脯氨酸3可以被羟脯氨酸、氮杂环丁烷羧酸(azetidinecarboxylicacid)、或α取代氨基酸如氨基异丁酸(aminoisobutyricacid)取代。在另一个实施方式中，精氨酸可以被胍基-苯丙氨酸(guanidyl-phenylalanine)取代。
在一个实施方式中，多肽包含含有基序GrxWPARGr的第一环，其中P被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代；和/或R被胍基-苯丙氨酸取代。
在一个实施方式中，多肽包含含有基序GrxFPYRGr的第一环，其中R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代，并且其中脯氨酸被氮杂环丁烷羧酸取代；和/或R被胍基-苯丙氨酸取代。
在一个实施方式中，多肽配体可以进一步包含肌氨酸聚合物，用作接头来将多肽配体连接在一起，或连接一个或更多功能基团。
在一些实施方式中，多肽配体可以是蛋白酶抗性的。蛋白酶抗性的缀合物可以通过筛选多肽配体库的蛋白酶抗性来选择。
附图说明
图1：评估连接噬菌体展示的肽和三(溴甲基)苯(TBMB)的反应条件。(A)与20mMNH4HCO3中的10μMTBMB、5mMEDTA、pH8、20％ACN在30℃持续反应1小时前后通过质谱法确定的GCGSGCGSGCG-D1-D2融合蛋白的分子质量。反应的和未反应的肽融合蛋白的质量差异对应于小分子核心均三甲苯的质量。(B)经过20mMNH4HCO3中的不同浓度的TBMB、5mMEDTA、pH8、20％ACN在30℃持续1小时还原(reduced)和处理的噬菌体的滴度(转导单位)。显示了来自fdg3p0ss21(黑色)和来自文库1(白色)的噬菌体的滴度。
图2：三官能化合物TBMB与含有一个或两个半胱氨酸的肽的化学反应。(A)TBMB与含有两个半胱氨酸残基的肽融合蛋白的可能的反应机理。(B)与TBMB反应前后有两个半胱氨酸的肽融合蛋白的质谱图。(C)TBMB与含有一个半胱氨酸残基的肽融合蛋白的可能的反应机理。(D)与TBMB反应前后有一个半胱氨酸的肽融合蛋白的质谱图。
图3：显示了树脂加工修饰的多肽配体与激肽释放酶的结合。
图4：不同缓冲液对修饰过程的效果的影响。(A)不同修饰缓冲液的影响，NaHCO3和NH4CO3。(B)不同pH不同浓度的NaCl洗脱缓冲液的影响。(C)在一个两步洗脱过程中，不同浓度的NaCl洗脱缓冲液和不同pH对第一和第二步洗脱的影响。
图5：洗脱液的靶标结合测定，洗脱液来自用不同缓冲液处理和不同pH下洗脱的不同样品。
图6：快速和长磁性修饰方案的图解。
图7：携带PK15的噬菌体修饰的快速和长方案的比较。(A)通过qPCR进行的噬菌体滴度的比较，和(B)激肽释放酶结合的功能比较。
图8：显示总噬菌体滴度的柱状图，比较了野生型和Schmid噬菌体。
图9：在噬菌体制备和修饰中每ml的噬菌体颗粒数量(A)和总量(B)，比较了野生型和Schmid噬菌体。在图中，左边的柱为PK15，接着是PEP48WT，右边是PEP48Schmid。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域(例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域)普通技术人员所通常理解的相同含义。将标准技术应用于分子生物学、遗传学和生物化学的方法(见Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第三版，2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY：Ausubel等人，ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)第四版，JohnWiley&Sons，Inc.)，其通过引用并入到本文中。
本文所提及的(多)肽配体或(多)肽缀合物是指与分子支架共价结合的多肽。典型地，这类多肽包含能够与所述支架形成共价键的两个或更多个反应基团，和在所述反应基团之间相对的序列，其被称为环序列，因为它在肽与支架结合时形成环。在当前情况下，该多肽包含至少三个反应基团，并在支架上形成至少两个环。
反应基团是能够与分子支架形成共价键的基团。典型地，反应基团存在于肽的氨基酸侧链上。示例是包含氨基的基团如半胱氨酸、赖氨酸和硒代半胱氨酸。
在本文的上下文中，特异性指配体结合或与其同类(cognate)靶标相互作用、而排除与所述靶标相似的实体的能力。例如，特异性可以指配体抑制人类酶的相互作用、但不抑制来自不同物种的同源酶的相互作用的能力。使用文中描述的方法，可以调控(即增加或降低)特异性，从而使配体与预期靶标的同系物或旁系物的相互作用能力更强或更弱。特异性与活性、亲和性或活力并非同义词，配体对其靶标的作用效力(如，例如结合亲和性或抑制水平)并不一定与其特异性相关。
如文中使用的结合活性，指来自结合试验的定量结合测量，例如文中所描述的。因此，结合活性指在给定靶标浓度下结合的肽配体的量。
多特异性是结合两种或更多种靶标的能力。典型地，由于它们的构象性质，结合肽能够结合单个靶标，例如对于抗体来说是表位。然而，可以开发可结合两种或更多种靶标的肽；例如双特异性抗体。在本发明中，肽配体能够结合两种或更多种靶标，因而是多特异性的。优选地，它们结合两种靶标，是双特异性的。结合可以是独立的，这将意味着肽上对靶标的结合位点不被靶标之一或其他的结合在结构上阻碍。在这种情况下，两种靶标可以独立地结合。更一般地，预期的是，一种靶标的结合将至少部分地阻碍另一种的结合。
靶标是肽配体所结合的或相互作用的分子或其部分。尽管结合被看作是大多数活性类型的先决条件，其自身就是一种活性，还可以设想其他活性。因此，本发明不要求直接或间接地测量结合。
分子支架是任何分子，只要其能够在多个点连接肽来为肽赋予一个或更多个结构特征。它不是交联接头，因为它不仅仅置换二硫键；相反，它为肽提供了两个或更多个附着点。优选地，分子支架包含与肽的至少三个附着点，称为支架反应基团。这些基团能够与肽上的反应基团反应来形成共价键。分子支架的优选结构描述如下。
针对结合活性(或任何其他所需活性)的筛选是根据本领域众所周知的方法进行的，例如来自噬菌体展示技术。例如，可使用固定于固相的靶标以鉴定和分离库中的结合成员。筛选容许根据所需特性来选择库的成员。
术语文库是指异质多肽或核酸的混合物。文库由不同的成员组成。在这种程度上，文库与库同义。文库成员间的序列差异是造成文库中存在多样性的原因。文库可呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或可呈转化有核酸文库的生物体或细胞(例如细菌、病毒、动物或植物细胞等)的形式。优选地，每个单独的生物体或细胞均包含仅一个或有限数目的文库成员。
在一个实施方式中，核酸被并入表达载体中，以容许核酸编码的多肽的表达。在优选的方面，因而，文库可以采取宿主生物体的群体的形式，每个生物体含有表达载体的一个或更多个拷贝，该表达载体含有核酸形式的文库的单个成员，其可以被表达来产生它的相应的多肽成员。因此，宿主生物体的群体具有编码遗传多样性多肽变体的大的库的潜力。
在一个实施方式中，核酸的文库编码多肽的库。文库的每个核酸成员优选地具有与文库的一个或更多个其他成员相关的序列。相关的序列是指与文库的至少一个其他成员具有至少50％的同一性、例如至少60％的同一性、例如至少70％的同一性、例如至少80％的同一性、例如至少90％的同一性、例如至少95％的同一性、例如至少98％的同一性、例如至少99％的同一性的氨基酸序列。跨越至少3个氨基酸，例如至少4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，例如至少12个氨基酸，例如至少14个氨基酸，例如至少16个氨基酸，例如至少17个氨基酸的连续片段或参考序列的全长判断同一性。
库是变体(在此情况下为多肽变体)的集合，该变体在它们的序列方面有差异。通常，反应基团的位置和性质不变，但形成它们间的环的序列可随机化。库在大小方面有差异，但应认为其包含至少102个成员。可构建1011个或更多个成员的库。
本文使用的一套多肽配体是指数个多肽配体，其可以进行前述方法的选择。可能地，一套可以是一个库，但其也可以是小的多肽集合，从至少2到10、20、50、100或更多。
本文使用的一组多肽配体是指两个或更多配体。在一个实施方式中，一组配体仅包含共享至少一个靶标特异性的配体。通常，一组由至少2、3、4、5、6、7、8、9或10、20、50、100或更多配体组成。在一个实施方式中，一组由2个配体组成。
(i)分子支架
分子支架描述于，例如，WO2009098450和其中引证的参考文献，特别是WO2004077062和WO2006078161中。
如前述文件中指出的，分子支架可以是小分子，如小的有机分子。
在一个实施方式中分子支架可以是，或可以基于天然的单体，如核苷、糖或类固醇。例如，分子支架可以包含这样的实体的短的聚合物，如二聚体或三聚体。
在一个实施方式中分子支架是己知毒性的、例如低毒性的化合物。适合的化合物的示例包括胆固醇、核苷酸、类固醇或现有的药物，例如tamazepam。
在一个实施方式中分子支架可以是大分子。在一个实施方式中分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化物组成的大分子。
在一个实施方式中分子支架包含能够与多肽的功能基团反应来形成共价键的反应基团。
分子支架可以包含化学基团，如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、链烯、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤和酰基卤。
在一个实施方式中，分子支架可以包含或由三(溴甲基)苯，特别是1,3,5-三(溴甲基)苯(“TBMB”)或其衍生物组成。
在一个实施方式中，分子支架是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。它类似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但是含有附着到苯环的另外三个甲基。其具有的优点是，另外的甲基可以形成与多肽的进一步接触，从而增加额外的结构限制。
其他的分子支架包括1,3,5-三丙烯酰-1,3,5-三嗪(triazinane)(TATA)、N,N’,N”-(苯-1,3,5-三基)-三(2-溴乙酰胺)(TBAB)和N,N’,N”-苯-1,3,5-triyltrisprop-2-烯酰胺(TAAB)。参见Chen等人，ChemBioChem2012,13,1032–1038。
本发明的分子支架含有化学基团，其容许本发明的编码文库的多肽的功能基团与分子支架形成共价连接。所述化学基团选自大范围的官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、链烯、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤和酰基卤。
(ii)多肽
多肽的反应基团可以通过天然或非天然氨基酸的侧链来提供。多肽的反应基团可以选自硫醇基团、氨基基团、羧基基团、胍基团、苯酚基团或羟基基团。多肽的反应基团可以选自叠氮化物、酮羰基、炔烃、乙烯基或芳基卤基团。用于与分子支架连接的多肽的反应基团可以是多肽的氨基或羧基末端。
在一些实施方式中，用于与分子支架连接的多肽的每个反应基团是相同类型的。例如，每个反应基团可以是半胱氨酸残基。进一步的细节在WO2009098450中提供。
在一些实施方式中，用于连接分子支架的反应基团可以包括两种或更多种不同类型，或可以包括三种或更多种不同类型。例如，反应基团可以包含两个半胱氨酸残基和一个赖氨酸残基，或可以包含一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基和一个N-末端胺。
可以应用半胱氨酸，因为其具有的优点是，它的反应性是与所有其他氨基酸最为不同的。在分子支架上可以用来与半胱氨酸的硫醇基团反应的支架反应基团是烷基卤(或也称为卤素代烷或卤代烷)。示例有溴甲基苯(以TBMB为例的支架反应基团)或碘乙酰胺。用于选择性地将化合物偶联到蛋白质中的半胱氨酸的其他支架反应基团是马来酰亚胺。可以用作本发明中的分子支架的马来酰亚胺的示例包括：三-(2-马来酰亚胺基乙基)胺、三-(2-马来酰亚胺基乙基)苯、三-(马来酰亚胺基)苯。硒代半胱氨酸也是具有与半胱氨酸类似反应性的天然氨基酸，可以用于相同的反应。因此，除非上下文另外指明，当提及半胱氨酸时，一般可接受的是取代硒代半胱氨酸。
赖氨酸(和肽的N-末端的伯胺)也适合作为反应基团来通过与分子支架连接来修饰噬菌体上的肽。然而，相比半胱氨酸它们在噬菌体蛋白质中更丰富，存在着噬菌体颗粒可能变为交联、或它们可能失去它们的感染性的更高的风险。尽管如此，现已发现赖氨酸在分子内反应中是特别有用的(例如，当分子支架己经连接到噬菌体肽时)，来与分子支架形成第二个或连续的连接。在这种情况下，分子支架与展示的肽的赖氨酸优先地反应(特别是非常接近的赖氨酸)。与伯胺选择性反应的支架反应基团是琥珀酰亚胺、醛或烷基卤。在许多附随的实施方式中使用的溴甲基基团中，苯环的电子可以稳定阳离子过渡态。因此这个特别的芳基卤反应性是烷基卤的100-1000倍。用作分子支架的琥珀酰亚胺的示例包括三-(琥珀酰亚胺基氨基三乙酸酯)、1,3,5-苯三乙酸。用作分子支架的醛的示例包括三甲酰基甲烷。用作分子支架的烷基卤的示例包括1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三甲基苯、1,3,5-三(溴甲基)苯、1,3,5-三(溴甲基)-2,4,6-三乙基苯。
具有用于连接分子支架的反应基团的氨基酸可以位于多肽内的任何适合的位置。为了影响产生的特定结构或环，具有反应基团的氨基酸的位置可以由熟练的操作员来改变，例如通过操纵编码多肽的核酸以使产生的多肽发生突变。通过这样的方法，环长度可以依照本教导来操纵。
例如，多肽可以包含序列AC(X)nC(X)mCG，其中X代表随机的天然氨基酸，A代表丙氨酸，C代表半胱氨酸，以及G代表甘氨酸，以及n和m(可以相同或不同)是3到6之间的数字。
(iii)多肽的反应基团
本发明的分子支架可以通过多肽上的功能或反应基团结合于多肽。这些通常从多肽聚合物中存在的特定氨基酸的侧链形成。这样的反应基团可以是半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链、或N-末端胺基或任何其他合适的反应基团。再次，细节可以在WO2009098450中找到。
天然氨基酸反应基团的示例为半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基、精氨酸的胍基、酪氨酸的酚基或丝氨酸的羟基。非天然氨基酸可提供广泛的反应基团，包括叠氮化物、酮羰基、炔基、乙烯基或芳基卤基团。多肽末端的氨基和羧基也可作为反应基团来与分子支架/分子核心形成共价键。
本发明的多肽包含至少三个反应基团。所述多肽也可以包含四个或更多个反应基团。使用越多的反应基团，可在分子支架上形成越多的环。
在一个优选的实施方式中，产生了具有三个反应基团的多肽。所述多肽与具有三重旋转对称的分子支架/分子核心的反应产生了单一的产物异构体。单一的产物异构体的产生因一些原因是有利的。化合物文库的核酸仅编码多肽的一级序列，而不是在多肽与分子核心反应时形成的分子的异构态。如果可以形成仅一种产物异构体，核酸到产物异构体的分配是明确限定的。如果形成多种产物异构体，核酸不能给出关于在筛选或选择过程中分离的产物异构体性质的信息。如果要合成本发明的文库的特定成员，单一的产物异构体的形成也是有益的。在这种情况下，多肽与分子支架的化学反应产生单一的产物异构体，而非异构体的混合物。
在本发明的另一个实施方式中，产生了具有四个反应基团的多肽。所述多肽与具有四面体对称性的分子支架/分子核心的反应产生了两种产物异构体。即使两种不同的产物异构体由一个且相同的核酸编码，分离的异构体的异构性质可以通过化学合成两种异构体、分离两种异构体以及测试两种异构体与靶标配体的结合来确定。
在本发明的一个实施方式中，多肽的至少一个反应基团与其余反应基团是正交的。正交的反应基团的使用允许将所述正交的反应基团指引到分子核心的特定位点。涉及正交的反应基团的连接策略可以用于限制形成的产物异构体的数量。换句话说，对于至少三个键的一个或更多个，通过选择区别于或不同于所述至少三个键的其余键的反应基团，可以有效地实现将多肽的特定反应基团结合到或者指引到分子支架上特定位置的特定顺序。
在另一个实施方式中，本发明的多肽的反应基团与分子接头反应，其中所述接头能够与分子支架反应，从而该接头在最终的键合状态下将插入在分子支架和多肽之间。
在一些实施方式中，多肽文库或套的成员的氨基酸可以被任何天然或非天然的氨基酸替代。从这些可交换的氨基酸中排除的是带有用于将多肽交联到分子核心的功能基团的那些，这样仅环序列是可交换的。可交换的多肽序列具有随机序列、恒定序列，或有随机和恒定氨基酸的序列。具有反应基团的氨基酸位于多肽内的限定位置，因为这些氨基酸的位置决定环的尺寸。
在一个实施方式中，有三个反应基团的多肽具有序列(X)lY(X)mY(X)nY(X)o，其中Y代表具有反应基团的氨基酸，X代表随机氨基酸，m和n是3到6之间的数字，限定了插入的多肽片段的长度，m和n可以相同也可以不同，以及l和o是0到20之间的数字，限定了两侧多肽片段的长度。
硫醇介导的缀合的替代可以用于通过共价相互作用将分子支架附着到肽。作为替代，在根据本发明选择和分离更多的部分(例如不同于分子支架的感兴趣的小分子)之后，这些技术可以用于修饰它们或将它们附着到多肽上—在这个实施方式中明显的是，附着不必是共价的，可以包括非共价的附着。通过产生噬菌体，或者通过在选择/分离阶段后制备分子时将非天然氨基酸并入到化学或重组合成的多肽中，可以使用这些方法代替(或组合)硫醇介导的方法，其中所述的噬菌体展示带有具备必需的化学反应基团的非天然氨基酸的蛋白质和肽，并组合上带有互补的反应基团的小分子。更多细节可以在WO2009098450或Heinis等人,NatChemBiol2009,5(7),502-7中找到。
(iv)环的组合以形成多特异性分子
有利的是，通过对并入组合环的多肽进行测序和从头合成，将来自肽配体或来自肽配体库的环进行组合。作为替代，可以合成编码这样的多肽的核酸。
当要组合库时，特别是单环库，编码该库的核酸有利地被消化和重新连接，以形成新的库，新的库具有来自组成型库的环的不同组合。噬菌体载体可以包括多聚接头和限制性内切酶的其他位点，其可以提供用于切割和降级(relegation)载体的独特点，以产生期望的多特异性肽配体。对于抗体来说，操纵噬菌体文库的方法是公知的，也可以在当前情况下应用。
(v)效应基团和功能基团的附着
效应和/或功能基团可以附着至，例如，多肽的N或C末端，或分子支架。
适当的效应基团包括抗体和其部分或片段。例如，除了一个或更多个恒定区结构域之外，效应基团可以包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域、或其任何组合。效应基团也可以包括抗体的绞链区(这样的区域通常见于IgG分子的CH1和CH2结构域之间)。
在本发明该方面的进一步优选的实施方式中，根据本发明的效应基团是IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团包含或由肽配体Fc融合蛋白(fusion)组成，融合蛋白具有一天或更久、两天或更久、3天或更久、4天或更久、5天或更久、6天或更久或7天或更久的tβ半衰期。最有利地，根据本发明的肽配体包含或由具有一天或更久的tβ半衰期的肽配体Fc融合蛋白组成。
通常，功能基团包括结合基团、药物、用于附着其他实体的反应基团、帮助将大环肽摄取入细胞的功能基团，等等。
肽透入细胞的能力将容许针对细胞内靶标的肽产生效果。可以被具有透入细胞的能力的肽接近的靶标包括转录因子、细胞内信号分子如酪氨酸激酶，以及参与细胞凋亡途径的分子。允许细胞穿透的功能基团包括己经添加到肽或分子支架的肽或化学基团。肽，例如衍生自例如VP22、HIV-Tat、果蝇(触角足(Antennapedia))的同源框蛋白的那些，例如在Chen和Harrison,BiochemicalSocietyTransactions(2007)35卷,第4部分,p821“Cell-penetratingpeptidesindrugdevelopment:enablingintracellulartargets”和Gupta等人AdvancedDrugDiscoveryReviews(2004)57卷9637“Intracellulardeliveryoflargemoleculesandsmallpeptidesbycellpenetratingpeptides”中描述的。己经显示了在穿过质膜的易位中有效的短肽的示例包括来自果蝇触角足蛋白的16氨基酸穿膜肽(penetratinpeptide)(Derossi等人(1994)JBiol.Chem.269卷p10444“ThethirdhelixoftheAntennapediahomeodomaintranslocatesthroughbiologicalmembranes”)、18氨基酸的“模式两亲性肽”(Oehlke等人(1998)BiochimBiophysActs1414卷p127“Cellularuptakeofanalpha-helicalamphipathicmodelpeptidewiththepotentialtodeliverpolarcompoundsintothecellinteriornon-endocytically”)和HIVTAT蛋白的富精氨酸区域。非肽的方法包括利用可以容易地附着于生物分子的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)NatureMethods4卷p153‘Small-moleculemimicsofana-helixforefficienttransportofproteinsintocells’)。将胍基团添加到分子的其他化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)JBiolChem282卷p13585“GuanidinylatedNeomcyinDeliversLargeBioactiveCargointocellsthroughaheparinSulphateDependentPathway”)。小分子量分子如类固醇可以添加到分子支架以增强细胞摄取。
可以附着于肽配体的一类功能基团包括抗体及其结合片段，例如Fab、Fv或单结构域片段。特别地，可以使用结合于能够延长肽配体的体内半衰期的蛋白质的抗体。
也可以并入结合存在于许多细胞上的整联蛋白的RGD肽。
在一个实施方式中，根据本发明的肽配体-效应基团具有选自以下的tβ半衰期：12小时或更久、24小时或更久、2天或更久、3天或更久、4天或更久、5天或更久、6天或更久、7天或更久、8天或更久、9天或更久、10天或更久、11天或更久、12天或更久、13天或更久、14天或更久、15天或更久或20天或更久。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团或组合物将具有12到60小时范围内的tβ半衰期。在进一步的实施方式中，它将具有一天或更久的t半衰期。在更进一步的实施方式中，它将在12到26小时范围内。
功能基团包括药物，如用于癌症治疗的细胞毒性剂。这些包括烷化剂，例如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物(硫唑嘌呤和巯嘌呤)或嘧啶类似物；植物碱和类萜(terpenoid)，包括长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素和它的衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇，原来称为紫杉酚；拓扑异构酶抑制物，包括喜树碱：伊立替康和托泊替康，以及II型抑制物，包括安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷。更多的试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素(其用于肾脏移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素及其他。
可能的效应基团还包括酶，例如，用于酶/前体药物治疗的羧肽酶G2，其中肽配体替换ADEPT中的抗体。
(vi)肽修饰
为了将双环肽(双环(Bicycles)；缀合于分子支架的肽)开发为合适的类药分子，无论是注射、吸入、经鼻、经眼、口服或局部施用，许多特性需要考虑。以下列出至少需要设计到给定先导双环中的：
·蛋白酶稳定性，无论这涉及对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、胞内蛋白酶等等的双环稳定性。应当在不同的物种之间维持蛋白酶稳定性，从而可以在动物模型中开发双环先导候选物，并有把握向人类施用。
·氧化敏感残基的取代，为了改善分子的药物稳定性谱，如具有抗氧化类似物的色氨酸和蛋氨酸。
·期望的溶解度谱，其是带电和亲水性残基相对于疏水性残基比例的函数，其对制剂和吸收目的而言很重要。
·调整带电残基相对于疏水残基的平衡，因为疏水残基影响血浆蛋白结合的程度，从而影响血浆中游离的可用部分(fraction)的浓度，而带电的残基(特别是精氨酸)可能会影响肽与细胞表面磷脂膜的相互作用。二者组合可能影响半衰期、分布体积和肽药物的暴露，并且可以根据临床端点进行定制。此外，合适的组合和带电残基相对于疏水残基的数值可以减少在注射部位的刺激(为皮下施用的肽药物)。
·根据临床指征和治疗方案定制的半衰期。可能在急性疾病管理设置中明智地开发未修饰的分子用于短期暴露，或开发具有增强血浆半衰期的化学修饰的双环肽，因此对于较慢性疾病状态的管理是最佳的。
稳定治疗性肽候选物以对抗蛋白水解降解的方法有许多种，并且与模拟肽领域重叠(参见综述，Gentilucci等人，Curr.PharmaceuticalDesign,(2010),16,3185-203,和Nestor等人Curr.MedicinalChem(2009)，16,4399-418)。
其包括
·肽的环化
·N-和C-末端加帽，通常是N-末端乙酰化和C-末端酰胺化。
·丙氨酸扫描，以显示和潜在地去除蛋白水解攻击位点。
·D-氨基酸取代，以探测氨基酸侧链的空间要求，通过空间阻碍，以及通过D-氨基酸稳定β转角构象的倾向，来增加蛋白水解的稳定性(Tugyi等人(2005)PNAS,102(2),413-418)。
·N-甲基/N-烷基氨基酸取代，以通过易断裂酰胺键的直接修饰给予蛋白水解保护(Fiacco等人，Chembiochem.(2008),9(14),2200-3)。N-甲基化还强烈地影响肽键的扭转角，并被认为有助于细胞穿透和口服利用度(Biron等人(2008)，Angew.Chem.Int.Ed.,47,2595-99)。
·非天然氨基酸的并入，即，通过采用
-等比容(isosteric)/等电子侧链，其不被蛋白酶识别，而对靶标效力没有影响
-受限制的氨基酸侧链，使得附近肽键的蛋白水解在构象上和空间上受到阻碍。特别地，其涉及脯氨酸类似物、大型侧链、Cα-双取代衍生物(其中最简单的衍生物是Aib，H2N-C(CH3)2-COOH)、和环氨基酸，一个简单的衍生物是氨基环丙基羧酸)。
·肽键替代物，示例包括
-N-烷基化(见以上，即CO-NR)
-还原的肽键(CH2-NH-)
-类肽(N-烷基氨基酸，NR-CH2-CO)
-硫代酰胺(CS-NH)
-氮杂肽(azapeptide)(CO-NH-NR)
-反式烯烃(RHC＝C-)
-逆翻转(retro-inverso)(NH-CO)
-尿素替代物(NH-CO-NHR)
·肽支架长度的调控
-即β2/3-氨基酸，(NH-CR-CH2-CO、NH-CH2-CHR-CO)，
·氨基酸上α碳的取代，其限制了骨架构象，最简单的衍生物是氨基异丁酸(Aib)。
应当明确地指出，这些修饰中的一些也可以用于有意地改进肽对靶标的效力，或，例如用于鉴定氧化敏感氨基酸的强效取代(Trp和Met)。
(B)肽配体的库、套和组
(i)文库的构建
用于选择的文库可以使用本领域已知的技术来构建，例如在WO2004/077062中描述的，或生物系统，包括本文所描述的噬菌体载体系统。其他载体系统是本领域己知的，包括其他噬菌体(例如，噬菌体lambda)、细菌质粒表达载体、基于真核细胞的表达载体，包括酵母载体，等等。例如，参见WO2009098450或Heinis等人,NatChemBiol2009,5(7),502-7。
非生物系统如在WO2004/077062中描述的那些，基于的是常规的化学筛选方法。它们是简单的，但是缺乏生物系统的能力，因而不可能，或至少对于筛选大的肽配体文库是不切实际地繁重的。不过，例如，仅需要筛选少量的肽配体时，它们是有用的。然而，通过这种个体分析的筛选可能是耗时的，而且可以测试对特定靶标的结合的独特分子的数量一般不超过106个化学实体。
相比之下，生物学筛选或选择方法通常容许大得多数量的不同分子的采样。因而，生物学方法可以用于本发明的应用中。在生物学操作中，分子在单个反应容器中分析，并且具有有利的性质(即，结合)的分子与非活性分子物理地分离。选择策略是有效的，其容许同时产生和分析超过1013个单独化合物。强大的亲和性选择技术的示例是噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展示、细菌展示或RNA/DNA适体方法。这些生物学体外选择方法共同地具有由DNA或RNA编码的配体库。它们容许通过测序对选择的配体进行增殖和鉴定。例如，噬菌体展示技术已被用于分离对实际上任何靶标具有非常高结合亲和性的抗体。
当使用生物系统时，一旦选择了载体系统，并且编码感兴趣的多肽的一个或更多个核酸序列被克隆到文库载体中，人们可以通过在表达之前进行诱变来产生克隆的分子中的多样性；作为替代，编码的蛋白质可以在诱变之前被表达和选择，并进行额外轮次的选择。
编码结构上优化了的多肽的核酸序列的诱变通过标准的分子方法来进行。特别有用的是聚合酶链式反应，或PCR(Mullis和Faloona(1987)MethodsEnzymol.,155:335，通过引用合并在此)。利用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶所催化的多个循环的DNA复制来扩增感兴趣的目标序列的PCR是本领域公知的。各种抗体文库的构建已在Winter等人(1994)Ann.Rev.Immunology12,433-55和其中引证的参考文献中有所讨论。
作为替代，考虑到根据本发明的多肽的短链长度，变体优选地从头合成并插入到适合的表达载体中。肽合成可以通过本领域已知的标准技术来进行，如上所述。自动化肽合成仪是广泛可得的，例如AppliedBiosystemsABI433(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)。
(ii)遗传编码的多样性
在一个实施方式中，感兴趣的多肽是遗传编码的。这提供了增强多样性和便于操作的优点。遗传多肽文库的示例是mRNA展示文库。另一个示例是可复制的遗传展示包(rgdp)文库，例如噬菌体展示文库。在一个实施方式中，感兴趣的多肽是作为噬菌体展示文库遗传编码的。因此，在一个实施方式中，本发明的复合物包含可复制的遗传展示包(rgdp)，例如噬菌体颗粒。在这些实施方式中，核酸可以被噬菌体基因组包含。在这些实施方式中，多肽可以被噬菌体包衣包含。
在一些实施方式中，本发明可以用于产生多肽的遗传编码的组合文库，其是通过将一定数量的核酸翻译成相应的多肽，并将所述分子支架的分子连接到所述多肽来产生的。
多肽的遗传编码的组合文库可以通过噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、细菌展示或mRNA展示来产生。
实施噬菌体展示的技术和方法可以在WO2009098450中找到。
在一个实施方式中，筛选可以通过用靶标接触多肽配体的文库、套或组，并分离结合所述靶标的一个或更多个成员来进行。
在另一个实施方式中，所述文库、套或组的单独的成员在筛选中与靶标接触，鉴定与所述靶标结合的所述文库的成员。
在另一个实施方式中，所述文库、套或组的成员同时地与靶标接触，选择与所述靶标结合的成员。
靶标可以是肽、蛋白质、多糖、脂质、DNA或RNA。
靶标可以是受体、受体配体、酶、激素或细胞因子。
靶标可以是原核蛋白质、真核蛋白质或古细菌(archeal)蛋白质。更具体地，靶标配体可以是哺乳动物蛋白质或昆虫蛋白质或细菌蛋白质或真菌蛋白质或病毒蛋白质。
靶标配体可以是酶，例如蛋白酶。
需要注意的是，本发明还包含从根据本发明的筛选分离的多肽配体。在一个实施方式中，本发明的筛选方法进一步包括步骤：制造能够与所述靶标结合而分离的一定量的多肽。
本发明还涉及具有超过两个环的肽配体。例如，连接到分子支架的三环多肽可以通过将连接到根据本发明分子支架的双环多肽的N-和C-末端相连接来产生。这样，连接的N和C末端产生第三环，得到三环多肽。这个实施方式不需要在噬菌体上进行，但是可以在此处所述的多肽分子支架缀合物上进行。连接N-和C-末端是常规肽化学问题。在需要任何指导的情况下，C-末端可以被活化，和/或N-和C-末端可以延伸，例如，向每个末端添加半胱氨酸，然后通过二硫键将其连接。作为替代，连接可以通过并入到N/C末端中的接头区域的应用来实现。作为替代，N和C末端可以通过常规的肽键连接。作为替代，可以采用用于连接N和C末端的任何其他适合的方法，例如，N-C-环化可以通过标准技术进行，例如在Linde等人PeptideScience90,671-682(2008)“Structure-activityrelationshipandmetabolicstabilitystudiesofbackbonecyclizationandN-methylationofmelanocortinpeptides”，或如在Hess等人J.Med.Chem.51,1026-1034(2008)“backbonecyclicpeptidomimeticmelanocortin-4receptoragonistasanovelorallyadministereddrugleadfortreatingobesity”中所公开的。这样的三环分子的一个优点是避免游离末端的蛋白降解，特别是被外切蛋白酶的作用。这种性质的三环多肽的另一个优点是，第三环可以用于一般地可应用的功能，例如，BSA结合、细胞进入或输送效应、标签化或任何其他这样的应用。应当指出的是，这个第三环一般将不可用于选择(因为它不在噬菌体上产生，仅在多肽-分子支架缀合物上产生)，因而它对于其他这样的生物学功能的用途仍然有利地保留了环1和2用于特异性的选择/产生。
(iii)噬菌体纯化
根据本发明，与分子支架反应之前的噬菌体纯化是可选择的。在需要纯化的情况下，可以使用纯化噬菌体的任何合适的方法。标准技术可以应用于本发明中。例如，噬菌体可以通过过滤或通过沉淀如PEG沉淀来纯化；噬菌体颗粒可以生产并通过如之前描述的聚乙二醇(PEG)沉淀来纯化。细节可以在WO2009098450中找到。
在需要进一步指导的情况下，参考Jespers等人(ProteinEngineeringDesignandSelection200417(10):709-713.Selectionofopticalbiosensorsfromchemisyntheticantibodylibraries.)。在一个实施方式中，噬菌体可以如其中所教导来纯化。对于噬菌体纯化的方法，这个出版物的文本通过引用特别地合并在此；特别地，参考Jespers等人的材料和方法小节开始部分到709页右栏。
此外，噬菌体可以如Marks等人J.Mol.Biol222卷pp581-597所公开的进行纯化，对于如何进行噬菌体生产/纯化的具体描述，通过引用特别地合并在此。
如果不需要噬菌体纯化，含有噬菌体的培养基可以直接与纯化树脂和还原剂(如TCEP)混合，如本文实施例所述。
(iv)反应化学
相比于Heinis等人在WO2009098450中描述的情况，本发明使用的反应化学提供了一种展示于噬菌体的多肽配体的快速和高效的生产。本发明使用的反应条件优选包含以下步骤，全部优选在室温下实施：
1.已去除细菌细胞的培养基，其包含表达期望多肽的噬菌体，培养基与缓冲液、还原剂和在缓冲液中平衡的树脂混合。
2.树脂被分离和重新混悬于缓冲液和稀释的还原剂中。
3.多肽暴露于分子支架并与其反应，使得分子支架与多肽形成共价键。
4.洗涤样品以去除过量的未反应的支架。
5.将噬菌体从树脂上洗脱。
缓冲液优选为pH8.0；在最终溶液中没有必要调节缓冲液的pH。合适的缓冲液包含NaHCO3，最初为pH8.0。可以使用替代的缓冲液，包含pH在生理范围内的缓冲液，包含NH4CO3、HEPES和三羟甲基氨基乙烷(Tris-hydroxymethylaminoethane)、Tris、Tris-醋酸盐或MOPS。NaHCO3缓冲液优选在1M浓度下使用，加入1ml至树脂混悬液以平衡树脂。
树脂优选是离子交换树脂。离子交换树脂在本领域已知，包括任何本领域已知的适合阴离子交换色谱的材料，例如基于琼脂糖的色谱材料(例如琼脂糖，如FastFlow或Capto)、聚合的合成材料(例如聚甲基丙烯酸酯，如Toyopearls)、聚苯乙烯/二乙烯基苯(例如Poros、Source)、或纤维素(例如Cellufine)。在一个优选的实施方式中，阴离子交换树脂材料包括但不限于携带伯胺作为配体的树脂，例如氨基己基琼脂糖、苄脒琼脂糖、赖氨酸琼脂糖、或精氨酸琼脂糖。在另一个优选的实施方式中，阴离子交换树脂材料包括，但不限于中性PH的具有带正电部分的树脂，例如烷基氨基乙烷，如二乙基氨基乙烷(DEAE)、二甲基氨基乙烷(DMAE)或三甲基氨基乙基(TMAE)、聚乙烯亚胺(PEI)、季氨基烷基、季氨基乙烷(QAE)、季铵(Q)，等等。
在步骤(1)中，还原剂添加至浓度为1mM。在步骤(2)中使用的稀释的还原剂优选浓度为1μM。两个浓度是对TCEP而言的，其他值可以应用于其他还原剂。稀释的还原剂用来在与分子支架反应前使多肽保持在还原状态。优选地，络合剂包含于洗涤步骤中。例如，可以包含EDTA。
替代的还原剂可以选自二硫苏糖醇、巯基乙酸、硫代乳酸、3-巯基丙酸、硫代苹果酸、2,3-二巯基琥珀酸、半胱氨酸、N-甘氨酰基-L-半胱氨酸、L-半胱氨酰甘氨酸以及其酯和盐、硫代甘油、半胱胺和其C1-C4酰基衍生物、N-甲磺酰基半胱胺、N-乙酰半胱氨酸、N-巯基烷基酰胺糖如N-(巯基-2-乙基)葡糖酰胺、泛酰巯基乙胺、N-(巯基烷基)-共聚-羟烷基酰胺(例如在专利申请EP-A-354835中所述的那些)、N-单-或N,N-二烷基巯基-4-丁酰胺(例如在专利申请EP-A-368763中所述的那些)、氨基巯基烷基酰胺(例如在专利申请EP-A-432000中所述的那些)、N-(巯基烷基)琥珀酰胺酸和N-(巯基烷基)琥珀酰亚胺(例如在专利申请EP-A-465342中所述的那些)、烷基胺巯基烷基酰胺(例如在专利申请EP-A-514282中所述的那些)、2-羟丙基巯基乙酸和(2-羟基-1-甲基)乙基巯基乙酸的共沸混合物(如在专利申请FR-A-2679448中所述)、巯基烷基氨基酰胺(例如在专利申请FR-A-2692481中所述的那些)、以及N-巯基烷基烷二酰胺(例如在专利申请EP-A-653202中所述的那些)。
在TBMB和反应基团为硫醇活性的其他支架的情况下，分子支架的缀合优选在乙腈存在下实施。乙腈优选为约20％的最终浓度。
TBMB的替代的支架在本文中讨论。
未反应的分子支架通过洗涤从噬菌体上去除。随后，噬菌体可以从树脂上洗脱，并如之前所述进行选择。
额外的步骤也可以包含在程序中。这些步骤不是强制的，并且不会显著增加该方法的产率或效率。
例如，与树脂组合的、含有噬菌体的培养基，可以在用还原剂还原之前进行洗涤。还原剂自身可以在两个步骤中添加；以浓缩的形式，来实现还原，之后以稀释的形式(步骤2之前)，将展示的多肽维持在还原态。
步骤的时间安排也可以变化，不会显著改变程序的效率。例如，我们发现在TCEP中还原20分钟与还原30分钟同样有效。同样地，与TBMB反应10分钟并未产生比反应30分钟显著降低的结合水平。
(v)磁分离
在一个有利的实施方式中，树脂是磁性的。这样容许通过磁分离来分离携带多肽的噬菌体。磁性树脂珠粒，如磁性琼脂糖珠粒，可以商售获自例如，BangsLaboratories、Invitrogen、Origene和GEHealthcare。还参见US2,642,514和GB1239978。施加磁场使得能够分离珠粒，其导致结合于珠粒上的多肽从容纳其的介质中纯化。
在一个实施方式中，通过向介质中插入磁性探针将磁珠粒与介质分离。珠粒被保留在磁性探针上，并可以被转移至洗涤装置，或不同的介质中。或者，可以通过向容纳其的容器施加磁场将珠粒分离，并在珠粒被固定后去除介质。
在本发明的方法中，磁分离提供了更快、更高效的树脂处理方法。(C)根据本发明的多肽配体的用途
根据本发明的方法选择的多肽配体可以在体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外分析和试剂应用等等中采用。有经选择的特异性水平的配体在包含非人类动物检测的应用中，其中交叉反应性是有利的，或在与同源物或旁系同源物的交叉反应性需要仔细控制的诊断应用中，是有用的。在一些应用中，如疫苗应用，可以利用引起对预定范围的抗原的免疫应答的能力来定制疫苗以针对特定的疾病和病原体。
至少90到95％同质性的基本上纯的肽配体对于向哺乳动物施用是优选的，98到99％或更高的同质性对于药物用途是最优选的，特别是当哺乳动物是人类时。一旦如所期望地被部分纯化或纯化到同质，选定的多肽可以在诊断或治疗上使用(包括体外的)，或在开发和进行分析程序、免疫荧光染色等等中使用(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)ImmunologicalMethods,I和II卷,AcademicPress,NY)。
本发明的肽配体通常将在防止、抑制或治疗炎性状态、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染以及自体免疫性失调(其包括但不限于，I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病和重症肌无力)方面发现用途。
在当前的应用中，术语“预防”涉及在疾病的诱导之前保护性组合物的施用。“抑制”是指在诱导事件之后、但在疾病的临床表现之前组合物的施用。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后保护性组合物的施用。
可以用于筛选肽配体在保护避免或治疗疾病方面的有效性的动物模型系统是可获得的。动物模型系统的使用受到本发明的促进，其容许能够开发与人类和动物靶标交叉反应的多肽配体，以容许动物模型的使用。
在易感小鼠中全身性红斑狼疮(SLE)的测试方法是本领域己知的(Knight等人(1978)JExp.Med.,147:1653；Reinersten等人(1978)NewEng.J:Med.,299:515)。重症肌无力(MG)通过用来自另一物种的可溶AchR蛋白诱导该疾病，在SJL/J雌性小鼠中测试(Lindstrom等人(1988)Adv.lnzn7unol.,42:233)。关节炎通过注射II型胶原蛋白在敏感易感品系小鼠中诱导(Stuart等人(1984)Ann.Rev.Immunol.,42:233)。通过在易感大鼠中注射分枝细菌热激蛋白诱导的佐剂型关节炎的模型已被描述(VanEden等人(1988)Nature,331:171)。如所描述的，甲状腺炎通过施用甲状球蛋白在小鼠中被诱导(Maron等人(1980)J.Exp.Med.,152:1115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)天然地发生，或可以在小鼠的某些品系中诱导，例如在Kanasawa等人(1984)Diabetologia,27:113中所描述的那些。小鼠和大鼠中的EAE充当了人类中MS的模型。在这种模型中，髓鞘脱失病通过施用髓磷脂碱性蛋白来诱导(参见Paterson(1986)TextbookofImmunopathology,Mischer等人编辑，GruneandStratton,NewYork,pp.179-213；McFarlin等人(1973)Science,179:478；和Satoh等人(1987)J.Immunol.,138:179)。
一般地，当前的肽配体将以纯化的形式与药理学合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水性或醇/水性溶液，乳剂或混悬液，任何包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外的载体包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化的Ringer’s。如果有必需保持混悬液中的多肽复合物，适合的生理学可接受的佐剂，可以选自增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内的载体包括流体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于Ringer’s葡萄糖的那些。也可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、络合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington’sPharmaceuticalSciences,第16版)。
本发明的肽配体可以用作分别施用的组合物或与其他试剂一起使用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、以及免疫毒素(immunotoxin)。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其他试剂的“混合物(cocktails)”，连同本发明的选定的抗体、受体或其结合蛋白质，或甚至具有不同特异性的根据本发明选定的多肽的组合，如使用不同的靶标配体选择的多肽，无论它们是否在施用之前被合并。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员公知的那些的任一种。对于治疗，无限制地包括但不限于免疫治疗，本发明的选定的抗体、受体或其结合蛋白可以根据标准技术施用给任何患者。施用可以通过任何合适的方式，包括胃肠外、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮(transdermally)、通过肺部的途径、或适当地，通过导管直接输注。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时施用、禁忌症以及临床医师考虑的其他参数。
本发明的肽配体可以冻干来保存和并且在使用前在适合的载体中重构重新配制。这种技术已经显示了是有效的，可以采用本领域已知的冻干和重新配制重构技术。本领域技术人员将理解的是，冻干和重新配制重构可以产生不同程度的活性损失，使用水平可能需要上调以进行补偿。
含有当前肽配体的组合物或其混合物的组合物可以被施用用于预防性和//或治疗处理。在一些治疗应用中，实现选定细胞群体的至少部分抑制、压制、调节、杀伤或一些其他可测量参数的适当的充足的量被定义为“治疗有效剂量”。实现这种剂量需要的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状况，通常范围从每公斤体重0.005到5.0mg选定的肽配体，0.05到2.0mg/kg/剂的剂量更常用。对于预防性应用，含有当前肽配体或其混合物的组合物也可以以类似的或稍低的剂量施用。
含有根据本发明的肽配体的组合物可以在预防和治疗情境中使用，以帮助改变、灭活、杀伤或除去哺乳动物中选定的靶标细胞群体。此外，在此描述的选定的多肽库可以体外地(extracorporeally)或体外(invitro)选择性地使用以从细胞的异源集合中杀伤、耗尽或以有效地除去靶标细胞群体。根据标准的技术，来自哺乳动物的血液可以在体外与选定的肽配体组合，从而非期望的细胞被杀伤或从血液中除去，用于返回该哺乳动物。
(D)多肽的突变
通常，通过在一个或多个位置改变选择的分子以生成期望的多样性。选择待改变的位置，从而针对环序列中各独立位置构建文库。合适时，可从选择过程中忽略一个或更多个位置，例如，如果很明显这些位置中不存在不损失活性的突变。
随后变异可以通过随机化获得，在其间原位氨基酸被任何氨基酸或其类似物，天然或合成的，所取代，产生非常大量变体，或者可通过用一个或更多个限定的氨基酸亚系列(subset)取代原位氨基酸，产生数量更有限的变体。
己经报道了引入这种多样性的各种方法。用于使所选位置突变的方法也是本领域公知的，包括使用错配的寡核苷酸或简并的寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过靶向抗原结合环的突变，产生了一些合成的抗体文库。在本发明的上下文中可以使用相同的技术。例如，人破伤风类毒素结合Fab的H3区域已被随机化而产生一系列新的结合特异性(Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4457)。随机或半随机H3和L3区域已被附加到种系V基因片段以产生具有突变的框架区的大文库(Hoogenboom-&Winter(1992)RMol.Biol.，227:381；Barbas等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457；Nissim等人(1994)EMBOJ，13:692；Griffiths等人(1994)EMBOJ,13:3245；DeKruif等人(1995)J.Mol.Biol.,248:97)。该多样化己经扩展到包括一些或全部其他抗原结合环(Crameri等人(1996)NatureMed.,2:100；Riechmann等人(1995)BiolTechnology,13:475；Morphosys,W097/08320，见上)。
但是，由于本发明所使用的多肽比抗体更小，优选的方法是从头合成突变的多肽。
结构化多肽的诱变连同文库的构建在上文描述了。
参照以下实施例进一步描述本发明。
实施例
比较实施例1：
该实施例来自WO2009/098450。
在该实施例中，我们展示了将噬菌体展示肽附着至小分子上。该实施例中的多肽是噬菌体展示肽。核酸被噬菌体颗粒所包含。该实施例中的分子支架是小分子(TBMB)。
通常，1011-1012t.u.的PEG纯化的噬菌体在20ml的20mMNH4HCO3，pH8与1mMTCEP中在42℃还原1小时。噬菌体在vivaspin-20过滤器(MWCO为10000)中以4000rpm旋转，使还原缓冲液的体积减少至1ml，并用10ml冰冷的反应缓冲液(20mMNH4HCO3，5mMEDTA，pH8)洗涤两次。还原的噬菌体的体积使用反应缓冲液调节至32ml，并加入8mlACN中的50μM的TBMB，以获得10μM的最终的TBMB浓度。反应在30℃孵育1小时，之后通过用1/5体积的20％PEG、2.5M的NaCl在冰上沉淀噬菌体，以及以4000rpm离心30分钟，以去除未反应的TBMB。
我们使用小的有机化合物三(溴甲基)苯(TBMB)作为支架来固定包含三个半胱氨酸残基的肽(Kemp,D.S.和McNamara,P.E.,J.Org.Chem,1985；图1B)。在室温下水溶剂中，缀合于芳香族支架的卤代烷烃特异地与半胱氨酸的硫醇基团反应(Stefanova,H.I.,Biochemistry,1993)。Meloen与合作者在之前使用溴甲基取代的合成支架用于有多个半胱氨酸的肽的固定(Timmerman,P.等人,ChemBioChem,2005)。取代反应所需的温和条件方便地避开了噬菌体的功能(Olofsson,L.等人,J.ofMolecularRecognition,1998)。我们选择半胱氨酸作为固定点，因为其侧链具有20种天然氨基酸中最突出的反应性。而且，在噬菌体外壳的蛋白质中半胱氨酸残基是稀少的(pIII中有8个半胱氨酸，pVI、pVII和pIX中有一个半胱氨酸；Petrenko,V.A.和Smith,G.P.,PhageDisplayinBiotechnologyandDrugDiscovery,2005)。TBMB分子的三重旋转对称确保了在与肽中的三个半胱氨酸反应时，唯一的结构与空间异构体的形成。
接下来详述噬菌体上肽的修饰的反应条件。因为似乎用现有的技术来探测噬菌体上化学修饰的肽有困难，我们表达了肽NGCGSGCGSGCGC作为N末端，与较小的(minor)噬菌体外壳蛋白pIII的两个可溶性结构域D1和D2进行融合，并通过质谱分析了与TBMB反应前后蛋白的分子量。将肽中的三个半胱氨酸选择性连接于支架，但避开pIII的D1和D2结构域的三个二硫桥(C7-C36，C46-C53，C188-C201)的尝试失败了。这促使我们利用SchmidtF.X.与合作者近期开发的无二硫化物基因-3-蛋白(disulfide-freegene-3-protein)(Kather,I.等人,J.Mol.Biol.,2005)。融合于无半胱氨酸gIII蛋白N末端结构域的肽被三(羧乙基)膦(TCEP)还原。由于该还原剂被发现与TBMB支架的溴甲基基团反应，在向蛋白质加入TBMB之前将其去除。去除TCEP之后硫醇基团的再次氧化可以通过反应缓冲液除气和用5mM的EDTA络合金属离子来防止。硫醇基团与各种浓度的TBMB的反应以及产物的质谱分析显示了，浓度为10μM的TBMB对在30℃持续1小时的肽定量修饰是充分的。主要地，形成了具有期望分子质量的一个产物(Δ期望质量＝114Da；图1A)。当没有融合肽的无二硫化物D1-D2与TBMB孵育时，其质量没有变化，表明与其他氨基酸的非特异性反应没有发生。向反应中加入噬菌体颗粒(1010t.u.每毫升)显示了容器中噬菌体外壳蛋白的高密度不妨碍肽与TBMB的反应。意外地，我们发现TBMB与仅包含两个半胱氨酸残基的肽(NAGSGCGSGCGC-D1-D2)反应生成了一个产物，其分子质量与剩余的溴甲基基团与N末端的伯胺反应相一致(图2A和2B)。相似地，当赖氨酸的伯胺和N末端与剩余的两个溴甲基基团反应时(图2C和2D)，TBMB与有一个半胱氨酸和一个赖氨酸的肽(NAGSGKGSGCGC-D1-D2)反应生成了期望的分子质量。
实施例2
在修饰中野生型tet和schmid噬菌体的比较
通过使用野生型(WT)FdTet与突变的Schmid噬菌体(其无二硫化物)相对比，研究TCEP和TBMB修饰方法对噬菌体感染性的影响。Schmid被认为通常有较低的滴度，但是可能对化学修饰有更强的抗性。
测试了以下噬菌体：
○WTFdTet中的PEP48肽，获得自S.Luzi(LMB,Cambridge)
○Schmid噬菌体中的PEP48肽，获得自S.Luzi
○WTFdTet中的PK15，来自EdwardWalker(BicycleTherapeutics,Cambridge)
PEP48和PK15是两个不同的肽，各包含三个半胱氨酸残基。PK15特异于激肽释放酶(kallikrein)；PEP48特异于mdm2。参见欧洲专利申请EP2464727。
这些噬菌体的甘油储液(stock)在四环素板(WT四环素(tet)构建体)或氯霉素(chlor)板(Schmid构建体)上划线。
从板中挑取出每个构建体的单一菌落，并用来接种1ml的2YT/tet或chlor。
培养物在37℃孵育，以250rpm振荡，持续3小时，之后在2L无挡板摇瓶中将每个补足至600ml。
培养物在37℃孵育过夜，以250rpm振荡。
之后3×600ml培养物按下面处理以纯化噬菌体：
-将每个600ml培养物分配至2×500ml离心瓶中(一共6瓶)
-瓶子在JA-10转子中以7500rpm(＝～10000g)在4℃旋转20分钟
-上清转移至新的500ml瓶子中，样品保留供qPCR
-将80ml冷的PEG-NaCl加入到每个～300ml部分
-噬菌体在冰上孵育～1小时
-噬菌体在JA-10转子中以7500rpm(＝～10000g)在4℃旋转30分钟
-去除上清
-噬菌体沉淀物重新混悬于5ml(每构建体)TE中，样品保留供qPCR。
纯化的噬菌体通过qPCR测定颗粒滴度，如下：
-制备扩增子的连续稀释：
○以100μM＝6×10^13分子每1μl提供扩增子
○在水中进行扩增子的10倍连续稀释。产生共6个稀释液，从10^6分之1到10^11分之1。它们储存于-20C供之后使用。
-制备引物储液，如下：20μl的gene7F2+20μl的gene7R2+60μl的水(∴20μM每个引物)
-制备噬菌体样品的10倍连续稀释，从在水中的10^3分之1到10^6分之1
-制备PCRmastermix：
1μl引物溶液
1.75μlSigmaH2O
0.25μl1μM荧光素
12μlSYBRgreenJumpstartTaqReadymix(Sigma)
共15μl每个样品
将15μlmastermix加入至96孔PCR板的每个孔中
-将10μl扩增子稀释液或噬菌体稀释液加入至孔中；将板密封并插入BioRad实时PCR仪
-运行如下程序：
-当完成时手动停止程序
-从qPCR仪提取数据至Excel，并重新整理以形成扩增子相对于Ct值的柱状图
-从标准曲线插值得到样品Ct值。
前述的实验显示在无TBMB培养中，野生型和Schmid噬菌体有相当的生长潜力(参见图8)。
我们之后测试了野生型和Schmid噬菌体修饰的相对效率作为暴露于TBMB的结果，使得TBMB与展示的多肽相复合。
为了均衡用于修饰的噬菌体浓度，每个纯化噬菌体的部分用NH4CO3/EDTA缓冲液{20mMNH4CO3；5mMEDTA；～pH8.3(未调节)；已除气}稀释，以便最终噬菌体浓度与PK15培养上清的(即3.4×10^11每ml)相等。需要2.2ml稀释的噬菌体溶液：
○PK15/WTFdTet：17.6μl噬菌体+2128μl缓冲液＝2.2ml的3.4×10^11/ml
○PEP48/WTFdTet：179μl噬菌体+2021μl缓冲液＝2.2ml的3.4×10^11/ml
○PEP48/Schmid：649μl噬菌体+1551μl缓冲液＝2.2ml的3.4×10^11/ml
相对于Heinis等人，修饰条件进行了改进。噬菌体修饰在1mlNH4CO3/EDTA缓冲液(包含10μl的1MTris，pH8)中进行。噬菌体与1mMTCEP接触持续30分钟而非1小时，在室温下而非42℃，随后噬菌体被分离并重新混悬于1μMTCEP中，然后立即再次分离。最后，将噬菌体混悬于800μlNH4CO3/EDTA缓冲液+199μl乙腈±60μMTBMB中，持续30分钟，然后分离，并重新混悬于50μl柠檬酸盐缓冲液中。
在噬菌体分离的每个阶段，噬菌体回收不是定量的。未保留在分离步骤中的“剩余的”噬菌体，保留以供分析。
保留噬菌体洗脱液(在柠檬酸盐缓冲液中)。对于每个构建体，噬菌体样品用TCEP/TBMB修饰，或在不存在TCEP/TBMB的情况下处理。
剩余输入溶液(处理前)也被保留。
来自纯化步骤和修饰步骤的所有噬菌体样品，通过qPCR(如前所述)进行测定以确定出现在每一步的噬菌体总数量。
来自修饰步骤的噬菌体样品(输入、剩余、修饰的、以及未修饰的)测定感染性滴度，如下：
感染性滴度：
-大肠杆菌(E.coli)HB2151株的等分试样在2YT中生长，直至OD600＝～0.5
这代表～2.5×10^8细胞/ml
-噬菌体样品在2YT中稀释为1000分之1
-将1μl稀释的样品加入至1mlHB2151(2.5x10^8细胞)
-样品在37℃孵育1小时，以250rpm振荡
-在2YT中进行7×10倍连续稀释(neat→10^-7)
-每个20μl滴在干燥的四环素琼脂板上
-板在37℃孵育过夜
分析颗粒和感染性滴度数据(参见图9A和9B)
总噬菌体颗粒
| PK15 | PEP48 WT tet | PEP48 Schmid | |
| 上清 | 3.01E+14 | 5.63E+13 | 2.52E+13 |
| 纯化的噬菌体 | 2.54E+14 | 2.67E+13 | 7.86E+12 |
| Mod'n输入 | 3.22E+11 | 8.21E+11 | 3.82E+11 |
| Mod'n剩余 | 1.91E+11 | 3.53E+11 | 2.42E+11 |
| Mod'n输出 | 1.47E+10 | 5.13E+09 | 8.18E+09 |
| 无mod'n输出 | 2.95E+10 | 9.64E+09 | 7.70E+09 |
这些结果证实WT和Schmid噬菌体在修饰方案中表现相当，从每个程序步骤中可分离的噬菌体数目相似。
我们进行了第二个实验，在其中获得了相当的噬菌体滴度。我们也比较了得到的噬菌体感染性滴度。我们发现Schmid噬菌体的感染性显著弱于野生型噬菌体，即使没有修饰。当修饰时，相比于野生型噬菌体，Schmid噬菌体的感染性降低。
结论
前述实验表明野生型和Schmid噬菌体可以用于在噬菌体文库中展示肽。我们也指出，在修饰和未修饰条件下，Schmid噬菌体的感染性显著不如野生型噬菌体。
实施例3
在树脂上噬菌体的修饰
PK15是包含三个半胱氨酸的肽(H-ACSDRFRNCPADEALCG-NH2)，当与TBMB偶联时，其是特异和有效的人类血浆激肽释放酶抑制剂。这个肽可以作为与噬菌体基因3蛋白的融合蛋白被展示，如果被TBMB正确地修饰，将导致可以特异性结合于激肽释放酶的噬菌体。噬菌体上无修饰的PK15或噬菌体的交联不会产生噬菌体结合至激肽释放酶的特异性结合信号。
阴离子交换树脂用来捕获噬菌体，容许缓冲液的快速和简单的更换，在修饰过程中噬菌体与缓冲液接触。也滴定了噬菌体的颗粒数量和感染性，以表明修饰过程并未使噬菌体的感染性显著变弱。
材料和方法
1.将1ml1M的NaHCO3加入至任一50μl、100μl或150μl的约50％的强阴离子交换树脂匀浆，以平衡树脂。
2.每个样品在微量离心管中以3000rpm旋转一分钟，之后小心移除上清。
3.将已通过离心去除大肠杆菌的1ml过夜培养物(包含PK15表达噬菌体)加入至每个样品，随后加入10μlNaHCO3和1μl1MTCEP。加入NaHCO3以升高溶液的pH，使噬菌体结合至树脂，TCEP是还原剂。样品通过旋转20分钟以混合。
4.样品如之前一样离心，并小心移除上清。
5.将1ml20mMNaHCO3、5mMEDTA(包含1μMTCEP)加入以重新混悬树脂，同时在加入TBMB之前洗涤去除大多数任何剩余的TCEP。
6.将样品离心，并小心移除上清。
7.将1ml20mMNaHCO3中的20％乙腈、5mMEDTA(包含60μMTBMB)加入至每个样品。样品通过旋转10分钟以混合。
8.样品如之前一样离心，并小心移除上清。
9.将1ml20mMNaHCO3、5mMEDTA加入至每个样品。
10.样品如之前一样离心，并小心移除上清。
11.将100μl50mMpH5.0的柠檬酸盐、1.5M的NaCl加入至每个样品，样品在摇床上混合5分钟。
12.每个样品在微量离心管中以13000rpm旋转一分钟，之后小心移除并保留上清。上清重新离心，以去除树脂的任何残留痕迹，小心移除并保留上清。
13.进行噬菌体与激肽释放酶的结合。
从树脂上洗脱的噬菌体特异性地结合激肽释放酶，证明修饰程序在噬菌体上成功地产生了TBMB偶联双环肽(参见图3)。
噬菌体滴度
样品的颗粒和感染性滴度进行了比较，以观察修饰程序是否“损伤”了噬菌体，并使得它们比修饰之前感染性变弱。
在我们实验室使用上述标准程序，颗粒滴度比感染性滴度高大致10倍是典型的噬菌体预修饰(pre-modification)比例。因此，修饰过程并未显著损伤噬菌体。
实施例4
使用磁分离进行的噬菌体上的多肽修饰
描述了磁分离工作站的应用，其用于分离展示多肽的噬菌体。此外，在本实施例中，评估了以下：
○不同的结合缓冲液(即噬菌体输入溶液)
○不同的结合/洗涤缓冲液(即修饰中的缓冲液)
○不同的洗脱缓冲液
对磁性TCEP/TBMB修饰方法的效率和产率的影响。所使用的多肽是PK15，展示于野生型FdTet上。
材料和方法
使用在琼脂板上新鲜划线的大肠杆菌菌落(包含PK15/WTFdTet)，以接种25ml2TY/tet或LB/tet，培养物在37C孵育过夜，250rpm振荡。
制备以下溶液：
洗脱缓冲液：
柠檬酸盐溶液＝100mM(2×)→pH2.0(未调节)
20ml部分的100mM柠檬酸盐缓冲液用水按照2分之1(1-in-2)进行稀释，之后(使用NaOH)调节pH至
○pH3.5
○pH4
○pH5
10ml部分的各pH溶液用NaCl补充至
○1M
○1.5M
○2M
结合/洗涤/修饰缓冲液：
比较的缓冲液是NH4CO3和NaHCO3。
1M(50×)NaHCO3溶液达到pH9.0(未调节)。
加入了20mMNaHCO3缓冲液(使用1M溶液)和5mMEDTA达到pH9.0(未调节)。20mMNaHCO3缓冲液除气1小时。
使用1MNaHCO3制备将在NaHCO3缓冲液中处理的样品。
两个PK15培养物处理如下：
-测定的OD600：2TY中的PK15＝1.95LB中的PK15＝2.056
-测定的pH:2TY中的PK15＝pH8.5LB中的PK15＝pH7.5
-将用于NH4CO3缓冲液中样品的1MTrispH8(最终至10mM)，或用于NaHCO3中样品的1MNaHCO3(最终至20mM)加入至培养基物，测定的pH：
PK15/2TY/Tris＝pH8
PK15/2TY/NaHCO3＝pH9
PK15/LB/NaHCO3＝pH8
制备如下具有特定pH的溶液：
实施了色谱磁分离，在适当情况下保留珠粒或上清。
A部分：
对于每个样品，将20μl磁性离子交换珠粒在1mlNH4CO3/EDTA缓冲液中冲洗，并重新混悬于10μl的相同缓冲液中。之后样品处理如下：
A.980μl噬菌体溶液+10μl洗过的珠粒+10μl1MTrispH8
B.样品混合20分钟，之后珠粒从溶液中磁分离并被保留。
C.用1mlNaHCO3或NH4CO3/EDTA缓冲液和1分钟的混合来洗涤珠粒，之后珠粒被磁性捕获。
D.用1mlNaHCO3或NH4CO3/EDTA+1mMTCEP缓冲液和20分钟的混合来洗涤珠粒，之后珠粒被磁性捕获。用1mlNaHCO3或NH4CO3/EDTA+1μMTCEP缓冲液和1分钟的混合来洗涤珠粒，之后珠粒被磁性捕获
E.之后将珠粒加入800μlNaHCO3或NH4CO3/EDTA缓冲液+200μl乙腈/300μMTBMB(60μMTBMB最终浓度)中，并容许混合30分钟，之后珠粒被磁性捕获
F.用1mlNaHCO3或NH4CO3/EDTA缓冲液和1分钟的混合来洗涤珠粒，之后珠粒被磁性捕获
G.之后将珠粒加入至50μl50mM柠檬酸盐洗脱缓冲液(pH3.5/4/5；NaCl1M/1.5M/2M)，混合1分钟。
H.之后珠粒被磁性捕获，保留上清。
最后，将10μl1M的TrispH8加入至50μl洗脱液以将其中和。
进行的样品：
保留噬菌体洗脱液(在柠檬酸盐缓冲液中)。
为了观察各个不同洗脱缓冲液是否遗留了任何结合于珠粒的未被洗脱的噬菌体，使用相同的洗脱缓冲液进行了第二次洗脱。
样品通过qPCR测定了颗粒滴度。结果显示于图4中。
结论：
·培养基(2TY或LB)的性质不会显著影响输入噬菌体滴度(观察到的2倍差异可能在qPCR测定的变异性以内)。
·结合缓冲液(Tris或NaHCO3)的性质不会显著影响洗脱的噬菌体的数量
·洗涤/修饰缓冲液的性质不会显著影响洗脱的噬菌体的数量
·对于通常从pH41.5M缓冲液中洗脱的全部种类的输入/洗涤，30-40％的输入噬菌体被洗脱，之后修饰。
·关于哪种pH或[NaCl]对于洗脱最好并没有清楚的趋势，但：
○pH3.5洗脱缓冲液通常不好
○2MNaCl通常不好
·在第一次洗脱中高效洗脱的洗脱缓冲液，通常在第二次洗脱中洗脱良好(尽管可以预期在第一次洗脱后留在珠粒上的噬菌体较少)。
为了检查上述样品的修饰，洗脱的噬菌体对激肽释放酶结合进行筛选。
对上述洗脱的样品进行了靶标结合筛选，如图5所示。无明显趋势是可见的，即使在重复测定中。
洗脱缓冲液的分析
使用不同的洗脱缓冲液对结合/洗脱和修饰步骤进行了重复。
进行的样品如下所述：
结论：
在来自不同输入样品的洗出液之间观察到一个趋势：
NH4CO3/Tris/TY<NaHCO3/NaHCO3/TY<NaHCO3/NaHCO3/LB
但是，它们之间的差异似乎并不显著。
同样地，在使用不同洗脱缓冲液的洗出液之间观察到一个趋势：
○不考虑[NaCl]，pH3.5带来不好的洗脱
○当使用1.5M或2MNaCl时，pH5带来最好的洗脱
○在较低盐时，pH4带来良好的洗脱
pH5带来最好的洗脱，但必须与高盐使用。
实施例5
“快速”和“长”磁性噬菌体修饰方案的比较
噬菌体修饰方法已从“长”方案中优化。本文中长方案的结果与缩短的方案进行了比较。
使用如实施例3中来自划线的PK15/WTFdTet板的菌落以接种25ml2TY/tet。培养物在37℃孵育过夜，以250rpm振荡。
进行长和快速方案。这些在图6中举例说明。
快速方案如下
-将20μl磁性离子交换珠粒在1ml1MNaHCO3缓冲液中冲洗，并重新混悬于10μl相同缓冲液中。
A.1ml输入溶液(培养物/珠粒/TCEP)，混合20分钟并磁性捕获珠粒。
B.通过混合珠粒与缓冲液，在1mlNaHCO3/EDTA缓冲液+1μMTCEP中洗涤珠粒，并立即重新磁性捕获珠粒
C.在磁性捕获珠粒前，在NaHCO3/EDTA缓冲液+(TBMB在ACN中)(其中[ACN]最终＝20％；[TBMB]最终＝60μM)中混合珠粒10分钟
D.通过混合珠粒与缓冲液，在1mlNaHCO3/EDTA缓冲液中洗涤珠粒，并立即重新磁性捕获珠粒
E.在磁性捕获珠粒并保留上清前，通过与50μl50mM柠檬酸盐1.5MNaClpH5混合1分钟，将噬菌体从珠粒上洗脱。
-最后，将10μl1MTrispH8加入至50μl洗脱液以将其中和。
长方案如下：
A部分：
-将20μl磁性离子交换珠粒在1ml1MNaHCO3中冲洗，并重新混悬于10μl相同缓冲液中。
A.980μl噬菌体溶液+10μl洗涤的珠粒+10μl1MNaHCO3，混合20分钟并磁性捕获珠粒。
B.通过混合珠粒与缓冲液，在1mlNaHCO3/EDTA缓冲液中洗涤珠粒，并立即重新磁性捕获珠粒
C.在1mlNaHCO3/EDTA缓冲液±1mMTCEP中混合珠粒30分钟，并磁性捕获珠粒。
D.通过混合珠粒与缓冲液，在1mlNaHCO3/EDTA缓冲液±1μMTCEP中洗涤珠粒，并立即重新磁性捕获珠粒
E.在NaHCO3/EDTA缓冲液+(TBMB在乙腈中)(其中[ACN]最终＝20％；[TBMB]最终＝60μM)中混合珠粒30分钟，并磁性捕获珠粒。
F.通过混合珠粒与缓冲液，在1mlNaHCO3/EDTA缓冲液中洗涤珠粒，并立即重新磁性捕获珠粒
G.在磁性捕获珠粒并保留上清前，通过与50μl50mM柠檬酸盐1.5MNaClpH5混合1分钟，将噬菌体从珠粒上洗脱。
-最后，将10μl1MTrispH8加入至50μl洗脱液以将其中和。
包含省略了TCEP和TBMB的样品(“未修饰的”)。
输出样品和输入(培养物上清)的感染性滴度测定如下：
-大肠杆菌HB2151在2YT中生长和等分，直至OD600＝～0.5
这代表～2.5×10^8细胞/ml
-噬菌体样品在2YT中按照1000分之1进行稀释
-将1μl稀释的样品加入至1mlHB2151(2.5x10^8细胞)
-样品在37C孵育1小时，以250rpm振荡
-在2YT中进行7×10倍连续稀释(neat→10^-7)
-每个20μl滴在干燥的四环素琼脂板上，并在37C孵育过夜
-通过qPCR分析样品。结果显示在图7A中。
为了检查成功的环化，对样品进行激肽释放酶结合测定。结果显示在图7B中
结论：
·“快速”和“长”方案生成了在激肽释放酶结合测定中给出相似信号水平的修饰噬菌体。
·“长”方案的使用比“快速”方案对噬菌体的感染性更有害。如在输入中所见，快速方案保留～10分之1(1-in-10)感染性噬菌体；长方案降低感染性至100分之1(1-in-100)。
·见于长方案中的部分噬菌体损伤可以归因于更长的处理时间(即长方案未修饰的样品显示了一些感染性损失)。
总的来说，新的“快速”噬菌体修饰方法的使用导致了没有感染性损失的好的环化反应。
除非另有说明，与本文所述相似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试。适用于这种用途的方法、装置、和材料在上面描述。本文引用的所有出版物以参考的方式整体并入本文，旨在描述和公开可能与本发明联用的所述出版物所报道的方法、试剂以及工具。
Claims (14)
1.一种用于将展示于遗传展示系统的肽缀合于分子支架的方法，包括步骤：
(a)将展示于遗传展示系统的多肽与纯化树脂组合，使得展示系统结合于树脂并用还原剂处理结合的展示系统；
(b)使结合的展示系统接触分子支架；
(c)从结合的展示系统去除未反应的分子支架；和
(d)从纯化树脂洗脱展示系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述展示系统是噬菌体展示。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述噬菌体是野生型噬菌体。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中在加入所述分子支架前步骤(a)之后是洗涤步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述展示系统在还原剂的稀溶液中洗涤。
6.根据步骤5所述的方法，其中所述洗涤溶液进一步包含络合剂。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述还原剂是TCEP。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述支架是TBMB。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中在乙腈水溶液存在的情况下加入所述分子支架。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述树脂是阴离子交换树脂。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述树脂是磁性的。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤(a)和(b)中的一个或两个在室温(25℃)进行。
13.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤(a)进行20分钟。
14.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤(b)进行10分钟。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111741771A (zh) * | 2017-12-19 | 2020-10-02 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特异于epha2的双环肽配体 |
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|---|---|---|---|---|
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| GB201810316D0 (en) * | 2018-06-22 | 2018-08-08 | Bicyclerd Ltd | Peptide ligands for binding to EphA2 |
| BR112021004590A2 (pt) | 2018-09-12 | 2021-05-25 | Silverback Therapeutics, Inc. | composições para o tratamento de doença com conjugados imunoestimuladores |
| JP2022500404A (ja) | 2018-09-12 | 2022-01-04 | シルバーバック セラピューティックス インコーポレイテッド | 置換ベンゾアゼピン化合物、そのコンジュゲートおよび使用 |
| JP2022514618A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-14 | バイスクルテクス・リミテッド | Ｐｄ－ｌ１に特異的な二環式ペプチドリガンド |
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| GB201914233D0 (en) | 2019-10-02 | 2019-11-13 | Bicyclerd Ltd | Phage cyclisation assay |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102405060A (zh) * | 2009-02-04 | 2012-04-04 | 医疗研究局 | 多特异性肽 |
-
2013
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-
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-
2015
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102405060A (zh) * | 2009-02-04 | 2012-04-04 | 医疗研究局 | 多特异性肽 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHRISTIAN HEINIS等: "Phage-encoded combinatorial chemical libraries based on bicyclic peptides", 《NATURE CHEMICAL BIOLOGY》 * |
| DON L. SIEGEL等: "Isolation of cell surface-specific human monoclonal antibodies using phage display and magnetically-activated cell sorting:applications in immunohematology", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 * |
| LAWRENCE GOODRIDGE等: "Simultaneous Water Quality Monitoring and Fecal Pollution Source Tracking in the Colorado Big Thompson Water Project", 《COMPLETION REPORT》 * |
| MICHAEL D. FINUCANE等: "Core-Directed Protein Design. I. An Experimental Method for Selecting Stable Proteins from Combinatorial Libraries", 《BIOCHEMISTRY》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111741771A (zh) * | 2017-12-19 | 2020-10-02 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特异于epha2的双环肽配体 |
| CN111787955A (zh) * | 2017-12-19 | 2020-10-16 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特异于EphA2的双环肽配体 |
| CN111787955B (zh) * | 2017-12-19 | 2024-06-04 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特异于EphA2的双环肽配体 |
| CN111741771B (zh) * | 2017-12-19 | 2024-08-06 | 拜斯科技术开发有限公司 | 特异于epha2的双环肽配体 |
| CN113439088A (zh) * | 2019-01-15 | 2021-09-24 | 拜斯科技术开发有限公司 | 整联蛋白αvβ3特异性的双环肽配体 |
| CN113543813A (zh) * | 2019-01-15 | 2021-10-22 | 拜斯科技术开发有限公司 | Cd38特异性的双环肽配体 |
| CN113543813B (zh) * | 2019-01-15 | 2024-03-29 | 拜斯科技术开发有限公司 | Cd38特异性的双环肽配体 |
Also Published As
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