CN101180393A

CN101180393A - 核糖体展示方法或mRNA展示方法以及对蛋白质改进的稳定性进行的选择

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Publication number: CN101180393A
Application number: CNA2006800072126A
Authority: CN
Inventors: 安德鲁·布坎南; 卢茨·杰姆图斯
Original assignee: Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2005-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2008-05-14
Also published as: GB2422606B; DK1833965T3; EP1833965A1; US20070298430A1; GB0600147D0; AU2006204424A1; GB0500099D0; US8288123B2; GB2422606A; AU2006204424B2; JP2008526191A; WO2006072773A1; JP5154947B2; ATE538199T1; ES2379189T3; EP1833965B1; US20060183200A1; CA2593151C; CA2593151A1

Abstract

一种利用RNA表达体系，通过翻译和选择而获得比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体的方法，其中在翻译过程中同时使用两种或更多种稳定性选择压力，在选择过程中同时使用两种或更多种稳定性选择压力，或在翻译过程中且继续在选择过程中使用至少一种稳定性选择压力，且在选择过程中使用至少另外一种稳定性选择压力。

Description

核糖体展示方法或mRNA展示方法以及对蛋白质改进的稳定性进行的选择

本发明涉及选出、获得或制备稳定性改进的多肽变体的方法。本发明还涉及所述变体在选择后的制备和用途，例如在治疗中的用途。

本发明利用展示技术，结合体外翻译，以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接(non-covalentlinkage)，来选出比亲本多肽稳定性改进且保持功能活性的多肽变体。

核糖体或多核糖体(polysome)展示和选择涉及构建核酸文库，筛选结合，鉴定出目标结合实体。通过合成多样化序列的DNA库，将该库转录产生mRNA库，制得所述文库。体外翻译用于产生需要展示的编码多肽或蛋白，所需的结合用固相靶抗原选出。编码所述结合实体的mRNA可用于制备cDNA并将该cDNA扩增，可以重复该过程，使编码结合物的基因数大增。随后，可以克隆各个编码序列并进行DNA测序，从而鉴定出所选蛋白。

所述技术已有多方面的综述(Hanes等，(2000)Meth.Enzymol.328，403-430；Plückthun等，(2000)Adv.Prot.Chem.55，367-403；Lipovsek和Plückthun(2004)J.Immunological Methods 290，51-67)。

该技术已用于展示抗体片段、肽和各种蛋白，包括周质蛋白和胞质蛋白，如β-内酰胺酶和锚蛋白-重复蛋白。

从多核糖体复合体中回收mRNA首先报道于1973年的论文中，该论文描述了利用抗体和固定的寡胸苷来捕获编码小鼠免疫球蛋白L链的mRNA的方案(Schechter(1973)PNAS USA 70，2256-2260)。Payvar和Schimke对多核糖体免疫沉定反应方案进行了改进(Eur.J.Biochem.(1979)101，271-282)，在利用单克隆抗体对多核糖体进行免疫沉淀后，获得了HLA-DR抗原的重链cDNA克隆(PNAS USA(1982)79，1844-1848)。Kawasaki提出并取得了利用核糖体展示来制备抗体文库的专利(美国专利号5,643,768和美国专利号5,658,754，EP-B-0494955)。

已有多个利用真核或原核翻译体系进行核糖体展示的应用实例。利用大肠杆菌提取物选择肽配体是由Mattheakis等首个论证的(PNAS USA(1994)91，9022-9026和Methods Enzymol(1996)267，195-207)。该小组利用给定抗体作为选择底物，证实选出了与给定抗体的已知肽表位很相似的肽配体。结合前列腺特异性抗原的高亲和力肽配体，利用小麦胚芽(wheat germ)提取物翻译体系，从肽文库经多核糖体筛选而鉴定出(Gersuk等，(1997)Biotechand Biophys.Res.Com.232，578-582)。有报道称，原设计用于增加三元复合体(ternary complex)产量、且允许形成二硫键的大肠杆菌翻译体系，被用来筛选功能性抗体片段(Hanes和Pluckthun，PNAS USA(1997)94，4937-4942)。该实验计划随后被用于从鼠文库中筛选抗体，结果表明，因PCR误差和筛选的组合效力，致使筛选期间发生了亲和成熟。获得了一种解离常数约为10^-11M的ScFv片段(Hanes等，PNAS USA(1998)95，14130-50)。还有人利用兔网织红细胞裂解物的提取物，从混合抗体群富集特异性抗体(He和Taussig(1997)NAR，5132-5234)。

mRNA展示与核糖体展示一样，利用mRNA与所编码的多肽之间的复合体作为基本筛选单元。mRNA展示不同于核糖体展示之处是，mRNA与蛋白之间连接的共价特性。这种连接通过小衔接分子实现，所述分子通常是嘌呤霉素(Nemoto等，(1997)FEBS Lett 414：405；Roberts和Szostak，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297；Takahashi等，(2003)Trends Biochem.Sci.28：159)。mRNA展示并不限于4℃，而这是核糖体展示的常用温度。通常，筛选所用温度受蛋白靶标稳定性的限制。已有人用mRNA展示对肽和抗体进行亲和筛选(参见Lipovsek和Plückthun，(2004)J Immunological Methods290：51-97)。

本发明提供了适于利用展示技术，结合体外翻译，以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接，来选出比亲本多肽稳定性改进且保持功能活性的多肽变体的方法。本发明的方法加入了多种此前未在核糖体展示或mRNA展示中一起使用的特征。

在本发明的实施方案中，同时使用了两种或多于两种的稳定性选择压力(stability selection pressure)，尤其是允许筛选稳定多肽的两种或多于两种的稳定性选择压力。

稳定性选择压力可以是任何可在展示技术中使用的、允许基于稳定性选出变体多肽的因素，所述展示技术结合了体外翻译，以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接。稳定性一般可定义为，分子以其折叠、活性状态存在的倾向。稳定性选择压力可以破坏或妨碍多肽进行正确折叠，从而使其不能保持活性状态或完全活性状态。稳定性选择压力可以影响多肽保持其折叠、活性状态的能力。稳定性选择压力可以以某种方式区分出折叠、活性状态的多肽和非折叠、非活性状态的多肽。

例如，稳定性选择压力可以是化学变性剂，如尿素，盐酸胍(GuHCl)或硫氰酸盐，如硫氰酸钠。稳定性选择压力可以是还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇或谷胱甘肽。稳定性选择压力可以是物理变性剂，如pH或温度，尤其是增高的温度。选择压力可以是蛋白酶或能降解蛋白的酶。选择压力可以是消耗伴侣分子或小分子蛋白折叠抑制剂。

稳定性选择压力可以是使用疏水相互作用层析(HIC)。

疏水相互作用层析(HIC)是基于生物分子的表面疏水性差异来分离这些分子的技术。HIC技术已被用作蛋白纯化策略的一部分，同时还是检测蛋白构象改变的分析工具(综述见Queiroz等，(2001)J.Biotech.87，143-159；Fulton和Vanderburgh(1996)Biomolecule Chromatography PerSeptiveBiosystems)。HIC基于HIC基质和蛋白分子间的疏水引力。HIC基质由与亲水聚合物骨架(如交联葡聚糖或琼脂糖)相连的非极性小基团(丁基、辛基或苯基)组成。很多一般被认为是亲水的蛋白也具有足量的可与HIC基质相互作用的疏水基团。HIC的灵敏度使其足以与通常被埋藏在蛋白三级结构中、但因错误折叠而暴露的非极性基团反应。这种相互作用的强度由基质类型，盐类型和盐浓度，pH，助剂和温度决定。

本文描述本发明人的工作是，利用核糖体展示或mRNA展示等展示技术首次证实，同时利用至少两种选择压力，如DTT，HIC和增高的温度，可改进治疗性蛋白的药理学特性，尤其是提高保存期(shelf-life)稳定性。

使用至少两种选择压力，尤其是同时使用至少两种选择压力，与使用单一选择压力或先后使用多种选择压力相比，有多个优点，其中之一是使方案更具普遍性(generic)且更有效(robust)。根据发明人的经验，一些蛋白并不容易受单独一种选择压力的影响(即单独一种压力并不使其明显不稳定)，但易受两种压力影响，尤其是当同时使用两种压力时。例如，发明人发现，DTT可能对其自身不足以起作用，而仅对特定类型的蛋白如含有二硫键的蛋白有用。因此，利用选择进行的本发明，允许获得更严格的选择方法、并基于稳定性来筛选任何蛋白。

在本发明方法中，可以构建编码多肽变体的基因文库。在制备多肽变体时，例如在有DTT的条件下翻译多肽变体时，可以对多肽变体施用稳定性选择压力。稳定性选择压力可以在多肽的翻译过程中，在初生多肽折叠过程中和/或多肽折叠过程后起作用。

可用于多肽制备过程(即初生的多肽翻译和折叠过程)的稳定性选择压力包括：DTT，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍，伴侣分子耗竭，pH，和小分子蛋白折叠抑制剂。伴侣分子的作用是帮助多肽折叠。因此，伴侣分子的消耗会影响多肽的正确折叠能力。利用免疫沉定(IP)可以从无细胞提取物中除去伴侣分子。抗所有主要伴侣分子(如GroEL/GroES，DnaJ，DnaK)的抗体是可商购的，它们可以用在核糖体展示体系中基于IP去除特定组分。已证实这种方法可以从无细胞提取物中除去磷酸酶，从而提高ATP丰度和共有序列表达产量(Shen等(1998)Biochem.Eng.J.2：23-28)。折叠也可以被特别设计的小分子抑制(Gestwicki等(2004)Science 306：865-869)。小分子蛋白折叠抑制剂可以是能破坏或阻止蛋白正确折叠的任何小分子。

可以在制备变体(如在翻译过程中)和选择(如通过结合或生物活性进行选择)的整个过程中同时使用两种选择压力。优选在选择过程中使用一种或多于一种的选择压力，更优选在选择过程中使用两种选择压力或多于两种的选择压力。可以有一种或多于一种的选择压力在翻译过程中使用，并且有一种或多于一种的选择压力在选择过程中使用。

可以选出更稳定、且仍结合其关联(cognate)配体、受体或特异性结合配对物的变体。使变体在同时有两种或多于两种稳定性选择压力的情况下进行保温。在本发明的方法中，所用的稳定性选择压力(优选同时使用)可以是例如HIC和增高的温度。改进的活性变体借助其关联配体、受体或特异性结合配对物而被捕获。选择压力可以在捕获活性变体时存在，或者在使变体与其关联配体、受体或特异性结合配对物一起保温之前除去。

可用的稳定性选择压力包括DTT，谷胱甘肽，TCEP，巯基乙醇，尿素，GuHCl，硫氰酸钠，蛋白酶，HIC和增高的温度。

HIC可以使用疏水相互作用层析基质或任何其它的适合疏水性基质，如反相层析使用的基质。例如，适合HIC的基质是丁基-Sepaharose^TM(Amersham)。

“增高的温度”是指，高于通常进行展示技术的温度且至少部分地使蛋白去稳定化(destabilising)的温度。

例如，如本文所述，核糖体展示通常是在4℃进行，以便能保证核糖体/mRNA/多肽复合体的稳定性。因此，在利用核糖体展示的方法中增高的温度是高于4℃的温度。例如，增高的温度可以是高于15℃，或在室温或高于室温，即约20℃-30℃之间的任何温度。增高的温度可以是约20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30℃。优选，增高的温度是25℃或者约是25℃。优选，本发明方法使用在室温进行、优选在约25℃进行的HIC。

同时如本文所述，mRNA展示通常是在约25℃进行。因此，在利用mRNA展示的方法中增高的温度是高于25℃的温度。所述温度可以是25-30℃，25-35℃，30-35℃，25-40℃，30-40℃，35-40℃，25-50℃，30-50℃，或35-50℃，或者上述温度范围内，或者是或约是25，30，35，40，45或50℃。

优选，增高的温度是比展示方法的常用温度高至少20℃，以便用作稳定性选择压力。

还原剂DTT在核糖体展示中作为选择压力来改进含二硫键的蛋白的稳定性的应用公开在Jermutus等，(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：75-80中。

在进行选择前，HIC从随机序列文库中除去未折叠和错折叠肽的应用由Keefe和Szostak(2001)Nature 410：715-718，Matsuura和Pluckthun(2003)FEBS Letters 539：24-38公开。

蛋白酶作为选择压力的应用也有记载(Matsuura和Plückthun 2004 FEBSLetters 539：24-38)。

于25℃用GuHCl进行mRNA展示的应用描述在Chaput和Szostak(2004)Chem Biol 11：865-874中。

因此，选择压力早已单独或顺序地用于糖体展示和mRNA展示中。但，是本发明首次在展示技术中利用两种或更多种稳定性选择压力，所述展示技术是结合了体外翻译、以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接的展示技术。

本发明的选择方案不同于核糖体展示或mRNA展示中的常规方案。

例如，核糖体展示选择是在4℃进行，以保证核糖体/mRNA/蛋白复合体的稳定性(Hanes等，(2000)Meth Enzymol 328：404)。而HIC是随温度而定的，增高的温度会增加HIC基质和蛋白间的疏水相互作用。为了将HIC选择压力最大化，按照本发明实施方案中与HIC基质一起进行的保温是在室温进行。这样，可以联合使用HIC和增高的温度这两种选择压力选出稳定的多肽变体。结果意外发现，这些核糖体复合体在室温是稳定的，因此这种选择方案是可行的。

本发明还提供了利用三种稳定性选择压力(如DTT，HIC和增高的温度)进行选择的方案。

选择压力可在初生多肽折叠过程中起作用和/或对折叠的蛋白起作用。

对正在折叠的多肽起作用、但对已折叠的分子可能无效的那些压力应在翻译过程中使用并在翻译后维持。这些压力包括：DTT，谷胱甘肽，TCEP，硫氰酸钠，巯基乙醇，尿素，GuHCL，pH，小分子折叠抑制剂和消耗的伴侣分子。

使折叠的蛋白去稳定化的那些压力可以在翻译过程中使用，或者在翻译后步骤中加以限制。这些压力：包括尿素，GuHCL，HIC，温度和蛋白酶。

本发明的用途和效力的证明可参考关于人促红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新变体的举例说明。

Lin等，Proc Natl Acad Sci USA(1985)82：7582-4和Jacobs K等，Nature313：806-810(1985)首次报导了人EPO的克隆和氨基酸序列。

EPO是一种全球销量高达三十亿美元的重要生物药产品。它主要用于增加患者的红细胞和红细胞生成，以便治疗与慢性肾衰竭、癌化疗、HIV感染、儿科用途、早产儿相关的贫血症，减少贫血症患者在接受并非急需的(elective)非心脏、非血管手术时输血的必要。

人EPO是一种酸性糖蛋白，分子量约30400道尔顿。它由恒定的165个氨基酸的单链多肽组成，其中有四个半胱氨酸残基(在位置7，29，33和161)，它们形成内部二硫键(Lai等，J Biol Chem 1986 261：3116-3121；Recny等，J Biol Chem 1987 262：17156-17163)。已知半胱氨酸7和161之间的二硫键是生物活性所必需的。EPO的糖部分由位于Asn24，38和83的三个N联糖链和位于Ser126的O联糖组成(Browne JK等，Cold spring Harb sympQuant Biol 1986 51：693-702 Egrie JC等，，Immunobiology 1986 172：213-224.)。

人EPO的结构已有报道(Cheetham等，1988 Nat Struct Biol 5：861-866；Syed等，1998 Nature 395：511-516)。人EPO是一个四螺旋束，这在造血生长因子家族成员中是典型的。与恒定的氨基酸序列相比，糖结构是可变的，该特征称作微不均一性(micro-heterogeneity)。糖部分在分支模式、复杂度大小和电荷方面的差异，对EPO药物动力学和药代动力学具有深远影响。不同糖基化模式的影响已研究清楚(Darling等，2002 Biochemistry 41：14524-14531；Storring等，1998 Br J Haematol 100：79-89；Halstenson等，1991Clin Pharmacol Ther 50：702-712；Takeuchi等，1990 J Biol Chem 265：12127-12130)。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种调节骨髓细胞(myeloidcell)的生成、效应细胞功能和存活的细胞因子。

人GM-CSF用于骨髓移植、骨髓移植物植活(engraftment)失败或延迟、迁移后的骨髓再生，自体外周血祖细胞移植后的骨髓再生，以及在老年急性髓性白血病患者中引入化疗后的骨髓再生。GM-CSF可从商品名leukine(Amgen)和leucomax(Schering-Plough)购得。

Cantrell等第一个报道了人GM-CSF的克隆和氨基酸序列(Cloning，sequence，and expression of a human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.Proc Natl Acad Sci U S A.(Sep 1985)；82(18)：6250-4)。

GM-CSF是127个氨基酸的单体蛋白，有两个糖基化位点。该蛋白被合成为144个氨基酸的前体，它在氨基末端有疏水分泌信号序列。哺乳动物细胞中产生的GM-CSF被发现是不同的糖基化形式，大小为14-35KDa不等。糖部分并不是完整的生物活性谱所必需的。GM-CSF的结构是一种四螺旋束(Diederichs，K.，Boone，T.& Karplus，P.A.(1991).Novel fold and putativereceptor binding site of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.Science，254，1779-1782)，这与其它四螺旋细胞因子相似。它编码四个半胱氨酸残基，它们形成两个二硫键(位置54/96和88/121)。

在接受骨髓抑制性癌症化疗药物、并有重症中性粒细胞减少症伴发热的高发病率的患者内，人G-CSF用于降低与发热性中性粒细胞减少症(丧失中性粒细胞)相关的感染的发病率。使用G-CSF产品可以帮助医生及时地按照计划给予化疗剂量，并改进临床后果。G-CSF可从商品名Neupogen，Neulasta(PEG化G-CSF)和Granocyte购得。

Nagata等首次克隆并表达了人G-SCF(The chromosomal gene structureand two mRNAs for human granulocytes colony stimulating factor.Nature 5：575-581(1986))。

成熟G-CSF是一种174个氨基酸的单体蛋白，有一个O-糖基化位点位于Thr133，还有两个分子内二硫键(Cys36-Cys42和Cys65-Cys74)。G-CSF的结构是一种四螺旋束(Hill等1993 Proc Natl Acad Sci USA 90；5167-5171)。糖基化使分子稳定，但并非生物活性所必需(Oh-eda等1990 J Biol Chem265：11432-11435)。已有人在大肠杆菌中制得重组G-CSF，收获了包含体(inclusion body)，并使G-CSF重新折叠(US 5,849,883)。

有多篇文献报道了稳定性提高的G-CSF变体，如Bishop等2001Reengineering Granulocyte colony-stimulating factor for enhanced stability JBiol Chem 276：33465-33470；Lou等2002 Development of a cytokine analogwith enhance stability using computational ultrahigh throughput screeningProtein Science 11：1218-1226；Fuji等1997 Structure of KW-228，a tailoredhuman granulocyte colony stimulating factor with enhanced biological activityand stability FEBS Letters 410：131-135。

但是，所有关于在大肠杆菌中产生G-CSF的报道都是使用胞质表达，获得包含体，从该包含体重新折叠生成G-CSF。目前尚无在大肠杆菌中成功表达可溶性人G-CSF的报道，有一篇报道(Jeong和Lee 2001 ProteinExpression and Purification 23：311-318)例外，它利用了芽孢杆菌信号肽、组氨酸六聚物和凝血因子Xa切割位点。这导致可溶性表达，但N末端组氨酸标签没被切除，而且未证实生物活性。

G-CSF变体在大肠杆菌中表达时，产生可溶性单体活性蛋白。这使表达和纯化过程简化，无需重折叠步骤，因此优化了制备方法，而且可能对效力和储存特性有利。

本发明提供了本文证实的方法，它们提供稳定性提高的EPO、GM-CSF和G-CSF变体，从而使患者和生产商受益。变体稳定性提高一般导致在下游过程中获得更高的表达和更高的产量，从而改进商品成本(COG)。另外，稳定性改进的变体，它的保存期也延长。保存期延长也会影响商品成本，因而是有益的。另一益处是减少冷储存的需要，有助于商品分发、以及患者在自己家中服药。

稳定性改进的变体因半衰期延长，可以使体内效力增强。另外，稳定性改进的变体可以更适合皮下给药等给药途径，理由是聚集减少，这不仅增加效力，而且降低中和或结合所激发的抗体的风险。

本发明同样可以应用于其它多肽并且选出稳定性提高的多肽变体。

如本文所述，使用多重选择压力，尤其是同时使用，可以用更普遍的选择方案基于稳定性选出各种多肽。本发明多肽的优选特征在本文描述。本发明多肽应该能用与体外翻译，以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接相结合的展示技术进行展示。因此，多肽必需可以在无细胞表达体系翻译，并能在该体系中折叠成其正确的三级结构。

本发明多肽可以是单顺反子，或由相同亚单位组成(同多亚基)。可以使用由单顺反子表达的与一个多肽链融合的二亚基分子，如单链Fv抗体分子。多肽优选含有能形成二硫键的半胱氨酸残基，或对折叠和稳定性重要的其它残基。可以根据不同条件，优选地去除或影响多肽中对折叠和稳定性重要的组件(element)，所述条件如添加还原剂或定点诱变。

本发明多肽的实例还包括，但不限于，四种反平行α-螺旋束蛋白的家族成员，如干扰素或白细胞介素，以及复杂受体如肿瘤坏死因子受体II(TNFRII)的胞外区。

稳定性通常可以定义为，分子保持其折叠和活性状态的倾向。天然产生的分子通常因其新陈代谢而稳定性有限，而它们的快速新陈代谢常常是它们在机体内的固有作用机理的关键特征。

一般情况下，处于折叠和天然结构状态的稳定蛋白不会被蛋白酶或其他机制降解。这归因于两种关键的脱离稳定状态的途径，它们是通常情况下将蛋白从体内消除的途径。这两种途径是解折叠和聚集。它们通常是相关联的。解折叠是将折叠的活性分子转变成较少折叠的状态的途径。聚集是错误折叠的结果，导致分子不可逆地转变成非活性状态。解折叠和聚集都能明显增加蛋白对蛋白水解或其他消化作用的敏感性。

蛋白聚集是大肠杆菌表达的可溶性功能型重组蛋白的主要缺陷。重组蛋白的聚集很可能是由于伴侣分子的量有限。在这些条件下，折叠不完全，部分地折叠的中间体含有暴露的疏水表面，它们进入解离途径(off-pathway)，发生自我结合。自我结合是蛋白聚集和形成包含体的基础(参见综述Baneyx(1999)Recombinant protein expression in Escherichiia coli.Curr Opin Biotechnol 10：411-421；Carrio和Villaverde(2002)J Biotech 96，3-12；Geogiou和Valaw(1996)Curr Opin Biotech 7，190-197)。

已知大肠杆菌胞质表达的GM-CSF会形成不可溶聚集体(Greenberg等，(1988)Curr Microbiol 17：321-332)。周质表达也会使大部分产物在不可溶组分内(Lundell等，(1990)Biotechnology and Applied Biochemistry 12：567-578)。

针对更易于在表达过程中发生聚集的蛋白产生更稳定的变体，得到可溶性单体蛋白。这种蛋白能更有效的折叠，不太可能解折叠，因此具有较少的能引起聚集的暴露性疏水表面。这将增加从大肠杆菌表达的产量，而且不再需要重折叠过程。

此前已有多种提高蛋白的可溶性表达的尝试。例如，改变培养条件，使用伴侣分子，产生融合蛋白和改造蛋白，采用GuHCl筛选等，它们已经取得了不同程度的成功。

在本发明实施方案的方法中，所述多肽的折叠和解折叠途径被改变，致使所得实体更稳定。尽管此前已对蛋白热力学稳定性增强的演变进行了论证(Jermutus等，(2001)Proc Natl Acad Sci 98：75-80)，但本文是首次描述体外演变，此过程引起的氨基酸变化可为生物疗法带来实实在在的好处。

本发明的实施方案通过以下实施例的举例，包括参考附图，进行更详细描述，但它们绝非限制。

附图说明

图1示变体F07(变体1(Var.1))和野生型产生的GM-CSF的western印迹。样品如本文所述来制备。泳道1是来自细胞裂解物的F07总GM-CSF。泳道2是经4000rpm离心获得的F07周质制品(periprep)。泳道3是经15000rpm离心获得的F07周质制品。泳道4来自细胞裂解物的野生型总GM-CSF。泳道5是经4000rpm离心获得的野生型周质制品。泳道6是经15000rpm离心获得的野生型周质制品。泳道7是Magic Marker(Invitrogen)。

图2示野生型(WT)和变体(Var1)的G-CSF产物的银染凝胶。Var1泳道中，约25kDa的明显泳带是单体G-CSF。样品如实施例6和7所述来制备。

图3示野生型(WT)和变体(Var1)50ml周质表达的SEC示踪和产量。样品如实施例8所述来制备。在Var1中，箭头(1)指示聚集的G-CSF，箭头(2)指示单体G-CSF。在单体G-CSF(箭头(2))中，下部峰值是在O.D 254测定的，上部峰值是在O.D 280测定的。

本发明一方面提供了一种提供比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体的方法，所述方法包括：

(a)提供多个mRNA分子，每一mRNA分子包含编码目标多肽变体的核苷酸序列且缺失框内终止密码子；

(b)保温所述mRNA分子，所用的保温条件致使所述mRNA分子发生核糖体翻译，产生所编码的目标多肽变体，由此形成多个复合体，每个复合体都至少含有mRNA和所编码的目标多肽变体；

(c)将这些复合体与结合所述亲本目标多肽的受体、配体或特异性结合配对物接触，选出一个或多个复合体，它们每一个都在该选择条件下展示出与所述受体、配体或特异性结合配对物结合的目标多肽变体；

其中，如下进行步骤(i)，(ii)和(iii)中的一步或多步；

(i)在步骤(b)的翻译过程中，同时使用两种或更多种稳定性选择压力；

(ii)在步骤(c)的选择过程中，同时使用两种或更多种稳定性选择压力；

(iii)至少一种稳定性选择压力在步骤(b)的翻译过程中、继而在步骤(c)的选择过程中使用，且至少一种另外的稳定性选择压力在步骤(c)的选择过程中使用；和

(d)确定所选的一或多种目标多肽变体的稳定性，从而获得比亲本目标多肽稳定性改进的一种或多种目标多肽变体。

本发明的方法利用了与体外翻译，以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接联合的选择或展示技术，来选出比亲本多肽稳定性改进、但仍保留功能活性的多肽变体。

本发明的方法可以利用例如核糖体展示技术或mRNA展示技术。在核糖体展示的情况下，用本发明方法形成的复合体还包含核糖体。

稳定性选择压力可选自二硫苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍(GuHCl)，伴侣分子耗竭，pH，小分子蛋白折叠抑制剂，蛋白酶，硫氰酸钠，疏水相互作用层析(HIC)和温度。(使用增高的温度可以在稳定性方面提供选择压力)。

变体多肽翻译过程中的稳定性选择压力可以是二硫苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍(GuHCl)，伴侣分子耗竭，pH和小分子蛋白折叠抑制剂。任选地，稳定性选择压力可以不出现在翻译过程中。优选，在翻译过程中使用DTT作为选择压力。

在本发明的方法中，同时使用至少两种稳定性选择压力来选出多肽变体。两种或更多种稳定性选择压力可选自二硫苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍(GuHCl)，蛋白酶，硫氰酸钠，HIC和温度。优选地，同时使用的选择压力，在选择阶段包括HIC和温度，在包括翻译阶段使用DTT的过程中也优选如此。用作选择压力的温度可以是室温，优选约25℃。

一种或多种稳定性选择压力可以在捕获选出的变体时存在，所述变体是能与结合亲本目标多肽的受体、配体或特异性结合配对物相结合的变体。或者，可以在用所述受体、配体或特异性结合配对物捕获选出的变体之前，除去两种选择压力中的一种或多种。有无选择压力至少部分取决于选择压力是否影响或破坏所选变体和受体、配体或特异性结合配对物间的相互作用。例如，当用蛋白酶作为选择压力时，优选在引入受体、配体或特异性结合配对物之前将蛋白酶去除或使蛋白酶失活，以便避免受体、配体或特异性结合配对物被蛋白酶降解。

在本发明的方法中，可以比较所选出的一或多种目标多肽变体在有和无选择压力(如DTT)的条件下被展示出来时，结合受体、配体或特异性结合配对物的能力，由此确定稳定性。

在本发明上下文中，对稳定性的计量值可以用比值表示，所述比值是，变体与受体、配体或特异性结合配对物结合的能力在有二硫苏糖醇(DTT)(如10mM DTT)的条件下与在无DTT的条件下，经同样的放射免疫分析(RIA)测定的比值。该比值越高，变体的稳定性就越高，其在还原环境中的折叠形式就越多。

与野生型多肽相比，变体的该比率提高了约或至少约5倍，更优选约或至少约10倍，15倍，20倍，25倍或30倍。

在本发明的方法中，可以将所选的一或多种目标多肽变体的聚集与亲本目标多肽的聚集进行比较，来确定稳定性。

因此，另一种可用于本发明的稳定性计量值是变体多肽与野生型多肽在一段时间内的聚集的比较值。例如，可将野生型和变体多肽在一定温度范围内(如5℃-45℃)储存，然后用本领域常规方法分析降解产物和聚集物。稳定蛋白更好地保持其折叠状态，且更不易降解和聚集。

评估聚集可借助对可溶性蛋白的表达进行的筛选，例如，包括表达蛋白，然后离心，利用PAGE和免疫印迹进行分析。当经检测发现，有与经离心可除去的拖尾(smear)或条带不同的、经离心未被除去的单个的条带时，说明存在可溶蛋白而非聚集体。

多肽变体的稳定性可以通过在生物活性试验中确定变体的功能或活性来进行测定。

稳定性改进的变体多肽，可以在比野生型蛋白保留90％残余活性的温度高出2-10℃(如高出2、3、4、5、6、7、8、9或10℃)的温度，仍保持90％的残余活性。残余(即折叠且有活性的)蛋白的百分比，可利用常规生物化学技术(如HPLC，SDS PAGE)进行测定，或通过结合试验等活性试验或激发细胞反应来测定。

本发明的方法可以包括从选定的复合体回收mRNA。故，可以分离出选定的一或多种复合体的mRNA，和/或用其提供DNA来用该DNA产生所编码的特异性结合配对物，和/或在利用核糖体展示、mRNA展示、或其他体系(如噬菌体展示、酵母展示)进行的新一轮筛选中使用。

一般情况下，提供多样化mRNA序列的文库、群体或全体(repertoire)，其编码具有形成目标多肽的潜力的多样化肽或多肽的文库、群体或全体。

在本发明方法中使用的核糖体翻译体系可以是原核的或真核的。它们都已在本领域用于展示和选择大量不同的结合分子。参见如：Mattheakis等，(1994)PNAS USA 91，9022-9026；Mattheakis等，(1996)Methods Enzymol 267，195-207；Gersuk等，(1997)Biotech and Biophys Res Com 232，578-582；Hanes和Pluckthun(1997)PNAS USA 94，4937-4942；Hanes等，(1998)PNAS USA95，14130-50；He和Taussig(1997)NAR 5132-5234.(Hanes等(2000)Meth.Enzymol.328，403-430，Plückthun等(2000)Adv.Prot.Chem 55，367-403)。

用于核糖体展示的构建体可以包含RNA聚合酶启动子(如T7聚合酶启动子)，核糖体结合位点，Kozak共有序列，起始密码子，以及多肽、肽或蛋白的编码序列。编码一或多种检测标记的一种或多种核苷酸序列也可以包括在内，使产生的多肽、肽或蛋白还包括一或多种检测标记(如组氨酸标记)。还可将一或多种其它特征引入用于核糖体展示的构建体中，参见WO01/75097。

在本发明的方法中使用的mRNA翻译体系可以是已有的任何合适体系。可使用原核或真核的翻译体系，如大肠杆菌或小麦(如由Roche，Invitrogen提供)粗制裂解物，兔网织红细胞裂解物(如由Ambion，Promega提供)或重建体系如PURE(由Shimizu等，Cell-free translation reconstitutedwith purified components，Nat.Biotechnol.19(2001)751-755报道)。

在本发明的一些实施方案中，在翻译体系中保温的mRNA分子是通过RT-PCR反应获得的，该反应中至少一种RT-PCR引物是诱变引物，其编码包含在所述mRNA编码区的指定区域内的多种不同序列。例如，指定区域可以是编码抗体分子CDR(优选抗体VH区CDR3)的区域。

进行突变的指定区域可以包括对总体蛋白稳定性而言必需的残基(Proba等，(1998)J.Mol.Biol.2 75，245-253)，或很可能参与早期聚集事件的蛋白区，如暴露的环。

如本文所述，本发明方法可用于任何能在体外体系中产生的蛋白。

在优选实施方案中，需要展示的目标多肽是抗体分子，通常是单链抗体分子，如scFv抗体分子、VH、Fd(由VH和CH1区组成)、或dAb分子。

在另一优选实施方案中，使用非抗体目标多肽，包括受体、酶、肽和蛋白配体。目标多肽的实例包括但不限于，四种反平行α-螺旋束蛋白家族的成员，如干扰素或白细胞介素，以及复杂受体(如肿瘤坏死因子受体II(TNFRII))的胞外区。

在本发明方法中，从展示所选目标多肽变体的选定复合体回收的mRNA可以被扩增，并拷贝到编码所选目标多肽变体的DNA中。

DNA可以提供在产生产物的表达体系中，所述产物是所选目标多肽变体或其多肽链。编码所选目标多肽变体或其多肽链的DNA可以提供在核苷酸序列中，以提供编码融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白含有与其它氨基酸融合的所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链。包含编码所述融合蛋白的所述核苷酸序列的DNA可以提供在产生产物的表达体系中，所述产物是该融合蛋白。本发明的方法还可以包括对产物进行分离或纯化，所述产物可配制成含有至少一种其它组分的组合物。

编码所展示的目标多肽变体的核酸被选出并回收后，可用于提供编码的目标多肽或提供另外的核酸(如通过PCR等扩增反应来提供)。选出的mRNA可进行RT-PCR，产生cDNA拷贝。编码目标多肽变体的组成成分的核酸可用于提供另外的分子，比如重排的抗体分子，融合蛋白，免疫粘附素等。因此，例如，编码所选scFv抗体分子的VH和VL区的核酸，可用于构建编码其它形式的抗体分子(如Fab分子或完整抗体)的序列。

在本发明方法中，编码所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链的DNA可以进行突变，使其编码的多肽含有不同于所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链的氨基酸序列。编码所述多肽的突变DNA可以提供在产生产物的表达体系中，其中的产物是所述多肽。所述方法还可以包括分离或纯化产物，任选地，将产物配制成含有至少一种其它组分的组合物。

另外，可以用本领域已有的任何技术使核酸序列改变或突变。这可以用于提供衍生序列。可以提供编码所选目标多肽变体或其组分的衍生物的序列，所述衍生物例如含有不同于所选目标多肽变体或其组分的氨基酸序列，是通过添加、删除、插入和/或取代一个或多个氨基酸序列而得的。提供这种衍生物的方法还可以提供融合蛋白或偶联物，其中，另外的肽或多肽部分(如毒素或标记物)与所述目标多肽变体或其组分相连。

编码核酸，无论重构与否，都可以利用本领域可得的任何技术来制备编码的多肽或肽，从而通过重组表达来获得多肽和肽。

本文描述了本发明的进一步方面和实施方案，优选的方面和实施方案是下文包括的权利要求。

本发明通过以下方法举例说明，其中的亲本目标多肽是野生型促红细胞生成素(EPO)。具体地，所述亲本目标多肽是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的人野生型EPO。

本文所述方法提供了在SEQ ID NO：2所示的人野生型序列中包括选自下述突变组合中的一组突变的目标多肽变体：

(1)L16I I25F T27M V61A R139H T157V

(2)D8V T26A T27A S126P G158E

(3)D8V T27A Y49N W64R V82A E89G 126P G158E

(4)T26A W64R A135V G158E

(5)D8V V74F T107A N147D。

另外，本发明通过以下方法举例说明，其中的亲本目标多肽是野生型粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。具体地，所述亲本目标多肽是具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的人野生型GM-CSF。

本文描述的方法提供了，在SEQ ID NO：4所示的人野生型序列中包含R4S L15H A18V I43V K63T T102A这组突变的目标多肽变体。

另外，本发明通过以下方法举例说明，其中的亲本目标多肽是野生型粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。具体地，所述亲本目标多肽是具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的人野生型G-CSF。

本文描述的方法提供了，在SEQ ID NO：6所示的人野生型序列中包含C17G W58R Q70R F83L这组突变的目标多肽变体。

一般而言，在本发明的各个方面和实施方案中，亲本多肽包含折叠的蛋白结构域，且最优选具有生物活性。生物活性可以包括，与关联结合配偶体(如受体或配体)结合的能力，也可以包括触发受体活性或生物应答的能力，对催化反应的能力等。

如本文所述，在本发明上下文中使用的稳定性计量值可以用比值表示，所述比值是指，由mRNA翻译产生的目标多肽变体，在有二硫苏糖醇(DTT)或任何其它稳定性选择压力(如增高的温度或使用HIC基质)的条件下，经放射免疫分析(RIA)测定的，结合关联受体、配体或其它特异性结合配对物的能力，与由mRNA翻译产生的目标多肽变体，在无任何选择压力的条件下，经同样的放射免疫分析测定的，结合目标多肽受体、配体或其它特异性结合配对物的能力的比值。翻译可以在有³⁵S-Met的条件下进行，以产生放射性标记的蛋白。通过使翻译混合物与非关联受体和/或无关抗原如BSA接触，并测量在这些表面的残余放射活性，可以确定非特异性结合或背景结合。

本发明上下文中用到的所选目标多肽变体如EPO变体的稳定性计量值可以用比值表示，所述比值是，变体如EPO变体，在有二硫苏糖醇(DTT)如10mM DTT的条件下，经放射免疫分析(RIA)测定的，结合其受体、配体或特异性结合配对物(如对EPO变体而言是EPO受体)的能力，与变体如EPO变体，在无DTT的条件下，经同样的放射免疫分析测定的，结合受体、配体或特异性结合配对物(如对EPO变体而言是EPO受体)的能力的比值。该比值越高，变体如EPO变体的稳定性就越高，其在还原环境的折叠形式就越多。

与野生型EPO相比，EPO变体的该比值提高了约或至少约5倍，更优选约或至少约10倍，15倍，20倍，25倍或30倍。

以下实施例证实，本发明提供了稳定性改进且保持功能性的变体。例如参见表1，其提供了在有和无DTT的条件下与EPO受体结合的比值，野生型EPO为0.00，各种EPO变体为0.1至0.33不等。

如本文所述，本发明上下文中采用的稳定性计量值可以是聚集。因此，可以比较一段时间内EPO变体与野生型EPO各自的聚集，从而确定稳定性。例如，可将野生型EPO和变体EPO在一定温度范围内(如5℃-45℃)储存，然后用本领域常规方法分析降解产物和聚集物。稳定蛋白更好地保持其折叠状态，且更不易降解和聚集。

稳定性改进的EPO变体多肽，可以在比野生型蛋白保持90％残余活性的温度高出2-10℃(如高出2、3、4、5、6、7、8、9或10℃)的温度，仍保持90％的残余活性。残余(即折叠且有活性的)蛋白的百分比，可利用常规生物化学技术(如HPLC，SDS PAGE)进行测定，或通过结合试验等活性试验或激发细胞反应来测定。

例如，评估聚集可借助对可溶性蛋白的表达进行的筛选，例如，包括表达蛋白，然后离心，利用PAGE和免疫印迹进行分析。经免疫印迹检测到与拖尾不同的单个的条带时，说明存在可溶蛋白而非蛋白聚集体。

具有改进的表达谱的GM-CSF变体可以用本发明的方法鉴定。GM-CSF变体的产物经检测主要是单个的条带，这与野生型产物的梯状拖尾(ladderedsmear)不同。G-CSF变体的产物经检测也是单个的条带。

多肽变体的稳定性可以通过在生物活性试验中确定变体的功能或活性来评估。

例如，GM-CSF变体的稳定性可以在TF1细胞增殖试验中评定；G-CSF变体的稳定性可以在OCI/AML5细胞增殖试验中评定。用于确定稳定性的生物活性试验本身的特性当然是由目标多肽的功能或活性来决定的。分析具体蛋白活性的合适方法是本领域已知的。

以下实施例证实，本发明提供了稳定性改进且保持功能性的变体。例如，参见表2，其提供了TF1增殖试验中GM-CSF变体与野生型GM-CSF比较的结果，表3提供了OCI/AML5细胞增殖试验中G-CSF变体与野生型G-CSF比较的结果。

本发明的目标多肽变体可以是，与起始多肽或亲本多肽相比，包含一或多种另外的变化，所述起始多肽或亲本多肽可以是野生型或天然蛋白或此前获得的多肽变体。已知可对目标多肽进行多种不同修饰(包括天然发生的突变和人工产生的变体)，它们产生与野生型相比改变的特性。这些特性中的一种或多种可以保留或提供至本发明的目标多肽变体中。

目标多肽变体按照本发明的方法制成后，比如从编码核酸(见下文)表达出来后，可进行分离和/或纯化(如利用抗体进行)。因而，制得的多肽可以不含或基本不含杂质。一种多肽可以不含或基本不含其它多肽。经过分离和/或纯化的多肽可以用于配制组合物，所述组合物可以包含至少一种另外的组分，如药物组合物包含可药用赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)或载体(carrier)。Hanyou本发明多肽的组合物可以如下述用于预防性和/或治疗性疗法中。

制备本发明多肽的一种便捷方式是，在表达体系中使用编码所述多肽的核酸，使该核酸表达。因此，本发明还包括制备多肽的方法(如所公开的)，该方法包括从编码多肽的核酸(通常是本发明的核酸)进行表达。这可以通过在引起或允许所述多肽表达的适宜条件下，使含有所述载体的宿主细胞在培养基中生长而方便地实现。多肽还可以表达在体外体系如网织红细胞裂解物中。

在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的体系是熟知的。适合的宿主细胞包括细菌，真核细胞如哺乳动物和酵母，以及杆状病毒体系。本领域已有的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括，中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼年仓鼠肾细胞、COS细胞等。常用的优选细菌宿主是大肠杆菌。可以挑选或构建适合的载体，其可含有适宜的调节序列，包括启动子序列，终止子片段，聚腺苷酸化序列，增强子序列，标记基因和其它需要的序列。载体可以是质粒，病毒，如噬菌体或噬菌粒，取决于需要。详述参见如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：3rd edition，Sambrook和Russell，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。许多操作核酸的已知技术和方案，如制备核酸构建体，诱变，测序，将DNA导入细胞和基因表达，分析蛋白，都详述在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等eds.，John Wiley& Sons，1992中。

编码目标多肽变体的核酸可以根据本发明的方法制备。

一般而言，本发明的核酸是分离物，分离和/或纯化的形式，或无杂质或基本无杂质。核酸可以是完全或部分合成的，并可包括基因组DNA，cDNA或RNA。

本发明提供的核酸可以是可复制载体的一部分，本发明还提供了一种包括编码本发明目标多肽变体的核酸的载体，特别是提供了能在合适的条件下表达所编码的多肽的任何表达载体，和含有任何所述载体或核酸的宿主细胞。在此语境中的表达载体是一种核酸分子，其含有编码目标多肽的核酸和合适的调节序列，所述调节序列适于在网织红细胞裂解物等体外表达体系织，或在真核细胞(如COS或CHO细胞)或原核细胞(如大肠杆菌)等体内体系中表达所述多肽。

宿主细胞可以包括本文所公开的核酸。可将该核酸整合到宿主细胞基因组(染色体)内。利用常规技术导入能促进与基因组重组的序列，可以增强整合。核酸可以在细胞内的染色体外载体上。

可将核酸导入宿主细胞中。导入通常(特别是对体外导入而言)称为“转化”或“转染”但无任何限制，其可以使用任何已有的技术。对于真核细胞来说，适合的技术包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染，以及用逆转录病毒或其它病毒(如痘苗病毒，对于昆虫细胞来说用杆状病毒)进行的转导。对于细菌细胞来说，适合的技术包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体进行的转染。

标记基因如抗生素抗性或敏感基因可用来鉴定含有目标核酸的克隆，如本领域所熟知的那样。

导入后，可以在适合基因表达的条件下，引起或允许核酸表达，如通过培育宿主细胞(其包括实际转化的细胞，但更可能是该转化细胞的后代细胞)来表达，从而产生编码多肽。如果该多肽与合适的信号前导肽一起表达，那么就可能让该多肽从细胞分泌到培养基中去。在表达完成之后，可依具体情况从宿主细胞和/或培育基中分离和/纯化多肽，然后根据需要使用，如用于配制成组合物，其包括一种或多种其它组分，如包括一种或多种可药用赋形剂、媒介物或载体的药学组合物见下文)。

在通过表达来生成目标多肽变体之后，可常规测试其活性，如结合目标多肽受体或配体或其它特异性结合配对物的能力。

本发明另一方面提供了一种获得比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体的方法，该方法包括：

通过从编码核酸进行表达，产生目标多肽变体，其中所述产生是在有和无DTT的条件下通过翻译而进行的，而且所述产生发生在核糖体展示体系中，导致产生多个核糖体复合体，它们每一个都含有目标多肽变体和编码目标多肽变体的mRNA；

测定包含在核糖体复合体中的目标多肽变体比亲本目标多肽改进的稳定性，所用的稳定性计量值例如是，在有DTT的条件下翻译时，经放射免疫分析测定的，结合目标多肽受体、配体或特异性结合配对物的能力，与在无DTT的条件下翻译时，经相同的测定法测定的，结合目标多肽受体、配体或特异性结合配对物的能力的比值，其中结合能力是在有室温进行的疏水相互作用层析存在的条件下测定的。

如本文其它地方所述，该比率可以提高约或至少约5倍或更多。

本发明的方法包括制备比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体多肽的方法，该方法包括：

在有和无DTT的条件下，通过从编码的核酸进行表达，在核糖体展示体系中产生目标多肽变体；

在室温，利用疏相互作用层析，比较在有和无DTT的条件下生成并展示在核糖体上的目标多肽变体与关联受体、配体或特异性结合配对物的结合，由此测试改进的稳定性。

本发明的方法包括在对编码亲本目标多肽的核酸进行检测和/或突变之前，分离出所述目标多肽变体的步骤，以便在从编码目标多肽变体的核酸进行表达之前提供该核酸。

所述方法可以任选地在目标多肽变体产生之后和测试之前，包括分离和/或纯化目标多肽变体。

操作本方法的人可以额外地先进行一步提供目标多肽变体的步骤，方法是，通过例如如所述取代和/或插入一个或多个氨基酸，来改变目标多肽变体的氨基酸序列。可以提供各种不同的变体并测试所需活性，比如为了从大量变体中鉴定出具有本发明所需特性的一种或多种变体。通常，目标多肽的氨基酸序列改变可以通过改变编码目标多肽的核酸的编码序列来实现。可以改变一个或多个核苷酸，从而改变一个或多个密码子，并因此改变编码的氨基酸。如本文别处所述，且如本领域技术人员所显而易见的，可以使用任何适合的诱变技术，尤其是定向或定点诱变，来改变目标多肽变体的编码序列，并因此改变编码的氨基酸序列。综述见cPherson和Moller(2000)PCR.The Basics from Background to Bench；BIOS Scientific PublishersLtd。

根据本发明选择稳定性改进的目标多肽变体，可以利用核糖体展示，在有和无DTT的条件下在核糖体展示体系中翻译，并在室温利用HIC选出在复合体中与核糖体和mRNA结合的目标多肽变体。

本发明另一方面提供了一种制备、鉴定或获得比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体的方法，该方法包括：

对编码亲本目标多肽的核酸进行突变，以提供一种或多种核酸，其编码具有改变的氨基酸序列的一种或多种目标多肽变体(“目标多肽变体”)；

在核糖体展示体系中将所述一或多种核酸表达为mRNA，通过翻译该mRNA，产生所编码的一或多种目标多肽变体，其中该翻译是在有DTT和无DTT的条件下进行的；

利用疏水相互作用层析，选出如此产生的、比亲本目标多肽稳定性改进的一或多种目标多肽变体；

其中所述疏水相互作用层析是在室温进行的。

室温是指温度处在或高于20℃且处在或低于30℃，优选约25℃。

可以制备变体的文库或多样化群体，并测试所需能力。

突变可以发生在本文公开的一组突变范围内指定的任何残基，任何半胱氨酸和/或发生N-糖基化的任何残基中，或者按照本文描述的任何方式发生。

进行突变的目标多肽可以是野生型多肽或现有变体，如以前基于所需特性(如改进或增高的稳定性)选出的变体。

可鉴定或选出一或多种具有所需特性的目标多肽变体。

在鉴定或获得本发明目标多肽变体之后，它可以以分离和/或纯化的形式提供，它可以根据需要使用，而且可以配制成含有至少一种其它组分(如可药用赋形剂或载体)的组合物。编码目标多肽变体的核酸可用于制备适合随后使用的变体。如所述，这种核酸可以例如从最初提供的文库或多样化群体中分离，所述文库或多样化群体是从中产生并鉴定出所述目标多肽变体的那些。

本发明的目标多肽变体可用于诊断或治疗人或动物体(优选人)的方法中。

因此，本发明另一方面提供了治疗方法，包括施用本文提供的目标多肽变体，含有所述目标多肽变体的药物组合物，以及所述目标多肽变体在制备药物中的用途，例如，在制备药物或药物组合物的方法中的用途，包括将所述目标多肽变体与可药用赋形剂一起配制。

关于可以使用目标多肽变体的临床表征(clinical indications)是使用所述目标多肽具有疗效的那些。

按照本发明，可将目标多肽变体给予一个体，优选通过以“预防有效量”或“治疗有效量”施用(根据具体情况而定，尽管预防可以认为是治疗)，该量足以显示对个体的有效性。实际施用量，和施用速度和时间过程，都决定于正治疗患者的特性和严重性。治疗处方，如剂量选择等，都在一般医师和其它医疗人员的职责范围内。

组合物可以单独施用，或者与其它治疗组合施用，可以同时或顺序地施用，取决于所治疗的状态。

本发明的药物组合物，以及用于本发明的药物组合物，除活性成分外可包括可药用赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它原料。这些原料应该是无毒的，而且不会干扰活性成分的效力。载体和其它原料的准确特性取决于施用途径，施用途径可以是任何适合的途径，但最可能是注射，尤其是静脉注射。

对于静脉、表皮或皮下注射，或在疼痛点注射来说，活性成分将以肠胃外可接受的液体溶液形式存在，该液体溶液无热源而且具有合适的pH，等渗性和稳定性。那些本领域的相关技术人员可以很好地利用如等渗载体制成合适的溶液，如Sodium Chloride Injection，Ringer′s Injection，或LactatedRinger′s Injection。如果需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂。

在本公开文本的启发下，包括下述实施例，本发明的进一方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

将本说明书中所有地方提及的文献都引入本文作为参考。

实施例

实施例1

构建EPO变体文库和选出稳定性改进的EPO变体

文库构建

EPO cDNA从Invitrogen获得。将成熟序列重排(reformat)至线性核糖体展示模板中，随后用该模板生成文库。在DNA水平上，将T7启动子添加到5’-端，以便有效转录出mRNA。在mRNA水平上，构建体包括原核生物核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)。在3’端，添加gIII的一部分作为间隔(Hanes等，(2000)Meth Enzymol 328：.404)。按照操作手册(BD Bioscience)，利用易错PCR生成变体文库，误差率为8.1个核苷酸突变/分子。这使得导入4个突变/分子，并获得约2.5×10¹⁰个变体分子的文库。

稳定性筛选

使用至少两种同时发生的稳定性选择压力(包括DTT、HIC和增高的温度)来进行筛选，接着再筛选功能活性。

在翻译和选择过程中有还原剂二硫苏糖醇(DTT)。DTT防止形成二硫键，此键是EPO稳定性的关键组成。翻译后，将翻译混合物与DTT一起于疏水相互作用层析(HIC)基质中25℃保温。与常规的4℃相比，DTT、HIC和增高至25℃的温度的组合导致捕获并除去因所述选择压力而未折叠和或错折叠的、稳定性较差的变体。HIC基质通过离心或过滤等方法从混合物中除去。在进行功能选择之前，可能还需要进行缓冲液交换步骤。

在有和无DTT的条件下，按Jermutus等(2001)所述进行体外翻译和选择，不同之处如下：

1.翻译在30℃进行10分钟；

2.用HIC和增高的温度作为添加的选择压力。在有和无DTT的条件下进行翻译之后，在含KCl(1M增加到3M)以及浓度与翻译过程中等同的DTT的缓冲液中终止翻译。然后，将翻译混合物与1ml柱床体积的HIC珠(丁基-、辛基-和苯基-Sepharose，Amersham)保温。在25℃晃动30分钟之后，室温离心除去HIC珠。

3.然后将上清液冷却至4℃，进行功能选择，其中将经过稳定性选择的文库与EPO受体融合蛋白一起保温，之后捕获该融合蛋白，利用磁分离回收结合的复合体，并同时洗除未结合的复合体。然后，用RT-PCR回收编码EPO结合变体的mRNA，并重复所述选择步骤。用DTT、HIC和增温三者的导致更不稳定化的组合进行4轮选择。

将第4轮获得的PCR产物克隆至体外表达载体pIVEX2.3d(Roche)中。简言之，经PCR扩增，在产物5’导入Nco1限制性位点、3’端导入终止密码子以及紧接的Not1限制性位点。终止密码子允许无标记的变体EPO表达。产物经凝胶纯化，用Not1和Nco1(New England Biolabs)进行双酶消化并进行凝胶纯化。将消化后的产物连接到经Not1 Nco1消化的pIVEX2.3d中，转化大肠杆菌TG1细胞。挑取单菌落至96孔板，进行筛选和测序。

实施例2

在初级稳定性RIA中筛选单个EPO变体

按Jermutus等，(2001)所述，用初级稳定性RIA(放射性免疫分析)筛选EPO变体的稳定性。简言之，扩增并转录每一变体的线性DNA模板，将所得mRNA在G25 Sephadex柱上纯化并定量。在有³⁵S-标记的蛋氨酸的条件下，将每一变体取平行双份于30℃体外翻译30分钟，其中一份为非还原剂条件，另一份在10mM DTT(二硫苏糖醇)中。翻译用含0.05％Tween 20的PBS终止，所述PBS中还有与翻译时等量的DTT。翻译混合物在EPO受体包被板上室温保温1小时。平板用含0.05％Tween 20的PBS洗3次，并用PBS洗3次。残余的放射活性用0.1M三乙胺洗脱，通过液体闪烁计数来定量。将10mM DTT中的RIA信号除以无DTT时的RIA信号，算出变体的稳定性。变体越稳定，该比值就越大，即在DTT中无活性时该比值＝0，在DTT中具有全部活性时该比值＝1。

从第4轮获得的48个经克隆的EPO变体如上述进行筛选，鉴定出5个EPO变体比WT更稳定(表1)。

表15种变体的稳定性RIA结果，有非还原剂条件(DTT-)下的RIA绝对信号，以及如上述算出的稳定性计量值(DTT+/DTT-)。

EPO变体的序列分析

对第4轮所得EPO变体进行测序，5种更稳定的变体与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的WT EPO在氨基酸水平上的序列差异如下：

变体1 L16I I25F T27M V61A R139H T157V

变体2 D8V T26A T27A S126P G158E

变体3 D8V T27A Y49N W64R V82A E89G S126P G158E

变体4 T26A W64R A135V G158E

变体5 D8V V74F T107A N147D

实施例3

构建GM-CSF变体文库并筛选稳定性以便改进表达

文库构建

对人GM-CSF cDNA进行克隆，并将成熟序列重排至线性核糖体展示模板中，随后用该模板生成文库。在DNA水平上，将T7启动子添加到5’-末端，以便有效转录出mRNA。在mRNA水平上，构建体包含原核核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)。在3’末端添加gIII的一部分作为间隔(Hanes等，(2000)Meth Enzymol 328：.404)。按照操作手册(BD Bioscience)，用易错PCR生成变体文库，误差率为8.1个核苷酸突变/分子。这导致引入3个突变/分子。

稳定性筛选

如实施例1所述，使用至少两种同时发生的稳定性选择压力(包括DTT、HIC和增高的温度)来进行筛选，再通过结合GM-CSF受体融合蛋白来筛选功能活性。用DTT、HIC和增温三者的导致更不稳定化的组合进行4轮筛选。

将第4轮获得的PCR产物克隆至周质表达载体pcantab6(McCafferty等，Appl Biochem Biotechnol.(May-Jun 1994)47(2-3)：157-71；discussion 171-3)。简言之，经PCR扩增，在产物5’导入Nco1限制性位点，3’端导入Not1限制性位点。将产物凝胶纯化，用Not1和Nco1(New England Biolabs)双酶消化并进行凝胶纯化。将消化后的产物连接到经Not1 Nco1消化的pcantab6中，转化大肠杆菌HB2151(Biostat Diagnostics)。挑取单菌落至96孔板，进行筛选和测序。

实施例4

在初级表达筛选中筛选单个GM-CSF变体

GM-CSF变体的可溶表达利用96孔表达、PAGE和免疫印迹进行筛选。简言之，可溶表达用Overnight Express^TM Autoinduction System(MerckBioscience)实现，产物在E-PAGE蛋白电泳系统(Invitrogen)上电泳。在周质提取情况中，离心收细胞。周质材料因渗压休克而释出，碎片经离心去除，表达的蛋白保留在上清中。从提取的蛋白中取样，在可以同时对96个样品进行电泳的E-PAGE(Invitrogen)SDS-PAGE系统中电泳。然后，将凝胶印迹到PVDF膜上，用多克隆抗人GM-CSF抗体(Chemicon)探查，用抗兔IgG HRP偶联物(Dako UK)、ECL Plus化学发光剂(Amersham)检测，用Lumi Imager(Boehringer Mannheim)获取图像。

第4轮所得88个GM-CSF变体如上述进行筛选，鉴定出表达特性改进的GM-CSF变体，它们的产物经抗GM-CSF抗体检测主要是单一条带，而同等条件下野生型的产物为梯状拖尾。

实施例5

GM-CSF变体的可溶表达

GM-CSF变体和野生型的周质产物取平行双份进行对比。用OvernightExpress^TM Autoinduction System(Merck Bioscience)，在250ml Erylenmeyer烧瓶中的50ml体积中，使大肠杆菌HB2151(Biostat Diagnostics)中的pCANTAB6表达重组蛋白。在600nm波长(OD₆₀₀)测定1∶10稀释的培养物的吸光度，获得最终的培养密度。将所有培养物按照OD₆₀₀ 1.0的标准归一化1(normalise)。离心收获细胞，周质材料经渗压休克(使用200mM Tris[pH8.04℃]，1mM EDTA，0.5M蔗糖)释出，碎片在微管中经4000rpm低速离心去除。不可溶的蛋白在微管中经15000rpm高速离心从周质提取物中去除。样品在NuPAGE Bis-Tris凝胶系统(Invitrogen)中用1xMES缓冲液电泳。将凝胶印迹到PVDF膜上，接着用多克隆抗人GM-CSF抗体(Chemicon)探查，并用抗兔IgG HRP偶联物(Dako UK)、ECL Plus化学发光剂(Amersham)检测，用Lumi Imager(Boehringer Mannheim)获取图像。

GM-CSF变体1(F07)在周质中产生可溶蛋白，见图1。GM-CSF野生型不产生可溶蛋白(图1)，与预料的一样(Lundell等，1990)。

变体和野生型的生物活性在TF-1细胞增殖试验中评价。TF-1细胞从R&D Systems获得，并按说明书维持。试验培养基包含RPMI-1640、GLUTAMAX I、5％胎牛血清和1％丙酮酸钠。在每次试验前，先将TF-1细胞300xg离心5分钟使之沉淀，吸出培养基，将细胞重悬在试验培养基中。重复该步骤3次，使重悬细胞的终浓度为1×10⁵/ml试验培养基。在试验培养基中将GM-CSF变体(一式两份)稀释到所需浓度。然后，将100μl重悬细胞加到各试验点，使试验总体积为200μl/孔。试验板于37℃、5％CO₂保温72小时。然后，各试验点加20μl氚化胸苷(5μCi/ml，NEN)，将试验板放回培育箱中再保温4小时。用细胞采集器在玻璃纤维过滤板(Perkin Elmer)上收集细胞。胸苷掺入用Packard TopCount微板液体闪烁计数器测定。数据用Graphpad Prism软件分析。

在TF1增殖试验中，GM-CSF变体1比野生型GM-CSF活性更强(表2)：

样品	EC50(nM)
样品	EC50(nM)	WT	1.179
变体1	0.032	WT	1.179

表2、TF1增殖试验中GM-CSF野生型(WT)和变体1的EC₅₀。

GM-CSF变体的序列分析

对变体1进行测序，其与具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的WTGM-CSF在氨基酸水平上的序列差异如下：

变体1 R4S L15H A18V I43V K63T T102A

实施例6

G-CSF变体文库的构建和筛选稳定性以便改进表达

文库构建

对人G-CSF cDNA进行克隆，将成熟序列重排至线性核糖体展示模板中，随后用该模板生成文库。在DNA水平上，将T7启动子添加到5’-末端，以便有效转录出mRNA。在mRNA水平上，构建体包含原核核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)。在3’末端添加gIII的一部分作为间隔(Hanes等，2000 Meth Enzymol 328：.404)。按照操作手册(BD Bioscience)，用易错PCR生成变体文库，误差率为8.1个核苷酸突变/分子。这导致引入3个突变/分子。

稳定性筛选

如实施例1所述，使用至少两种同时发生的稳定性选择压力(包括DTT、温度和HIC)来进行筛选，再通过结合生物素化G-CSF受体(RnD目录号381-ER-05)来筛选功能活性。用DTT、HIC和温度的导致更不稳定化的组合进行4轮筛选。

将第4轮获得的PCR产物克隆入周质表达载体pcantab6内(McCafferty等，Appl Biochem Biotechnol.1994 May-Jun 47(2-3)：157-71；discussion171-3)。简言之，经PCR扩增，在产物5’导入Nco1限制性位点，3’端导入Not1限制性位点。将产物凝胶纯化，用Not1和Nco1(New England Biolabs)双酶消化并进行凝胶纯化。将消化后的产物连接到经Not1 Nco1消化的pcantab6中，转化大肠杆菌HB2151(Biostat Diagnostics)。挑取单菌落至96孔板，进行筛选和测序。

实施例7

在初级表达筛选中筛选G-CSF变体

G-CSF变体的可溶表达在96孔小规模表达筛选中进行测试。简言之，G-CSF变体蛋白用pCANTAB6表达载体和大肠杆菌HB2151细胞(BiostatDiagnostics)表达。在96孔master block(Greiner Bio-One)中一式三份进行表达筛选，所述master block每孔500ml中含有2xTY肉汤(broth)，0.2％葡萄糖，100mM氨苄青霉素。除第12列孔之外的各孔加1ml G-CSF变体甘油储液(glycerol stock)，第12列孔加1ml野生型G-CSF甘油储液。将这些板在HiGro培养箱(Genemachines，Inc)中37℃/600rpm保温6小时。然后加IPTG，使各孔终浓度为1mM，平板37℃/600rpm保温过夜。2500xg离心10分钟，收集细胞。沉淀在含200mM Tris pH8.0、1mM EDTA、0.5M蔗糖，0.1％Tween的200ml溶液中4℃重悬浮，并在冰上保温20分钟，使周质物质释出。细胞碎片以2500xg离心10分钟除去。将每个克隆的三份样本合并，取1400ml加到20ml NiNTA PhyNexus吸头(PhyNexus，Inc)中。所述吸头用含50mM Tris pH7.4，300mM NaCl，0.1％Tween的340ml溶液洗涤，接着用含50mM Tris pH7.4，300mM NaCl，0.1％Tween，30mM咪唑的100ml溶液洗涤。然后，用含50mM Tris pH7.4，300mM NaCl，0.1％Tween的170ml溶液洗涤，再用100mM HEPES pH3.0、140mM NaCl、0.2％Tween洗脱结合的G-CSF。洗脱出的样品用25ml的200mM HEPES pH8.0中和。样品在12％NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上用1xMES缓冲液进行电泳，凝胶用SilverXpress银染试剂盒(Invitrogen)染色。

从第4轮获得的88个G-CSF变体如上所述进行筛选，鉴定出一种表达特性改进的G-CSF变体，它的产物经银染检测主要是单一条带，而同等条件下野生型的产物基本上无法测出(图2)。

实施例8

G-CSF变体的大规模表达和纯化

比较G-CSF变体和野生型G-CSF的周质大规模生成。将每种G-CSF的单菌落接种到2L锥瓶内400ml的2xTY肉汤、0.2％葡萄糖、100mM氨苄青霉素中。将培养物37℃/300rpm保温6小时，之后加入IPTG至终浓度1mM。将培养物37℃/300rpm保温过夜。以16800xg离心10分钟，收集细胞。每种沉淀在含200mM Tris pH8.0、1mM EDTA、0.5M蔗糖、0.1％Tween的25ml溶液中4℃重悬，并在冰上保温20分钟，使周质物质释出。以12000xg离心10分钟除去细胞碎片。用KTA Explorer(GE Healthcare)进行纯化。每次纯化时，使周质样品流过已在50mM Tris pH8.0、300mM NaCl、0.1％Tween中平衡的5ml HisTrap HP柱(GE Healthcare)。用含50mM Tris pH8.0、300mM NaCl、0.1％Tween、30mM咪唑的50ml溶液洗柱，之后用50mM TrispH8.0、300mM NaCl、0.1％Tween、200mM咪唑将结合的G-CSF洗脱。使洗脱的样品流过已在2xPBS、0.1％Tween中平衡的Superdex 75 16/30凝胶过滤柱(GE Healthcare)。

G-CSF变体(变体1)产生可溶性单体蛋白，产量为8mg/L，见图3。野生型不产生单体蛋白，产生少量二聚体G-CSF或聚集的G-CSF，产量为8μg/L(图3)。

实施例9

G-CSF的生物活性

变体和野生型的生物活性在OCI/AML5细胞增殖试验中测定。从德国微生物和细胞培养物保藏中心获得OCI/AML5细胞(DSMZ，Braunschweig.ACC 247)，按照说明进行维持。试验培养基包含MEMA和16.6％v/v胎牛血清。每次试验前，OCI/AML5细胞进行300xg离心5分钟而沉淀，吸出培养基，细胞用试验培养基重悬。重复该步骤3次，使重悬浮细胞的终浓度为1×10⁵/ml试验培养基。G-CSF变体(一式两份)用试验培养基稀释到所需浓度。然后，各试验点加100μl重悬细胞，使试验总体积为200μl/孔。试验板于37℃、5％CO₂保温72小时。然后，各试验点加20μl氚化胸苷(5Ci/ml，NEN)，将试验板放回培育箱中再保温4小时。用细胞采集器在玻璃纤维过滤板(Perkin Elmer)上收集细胞。胸苷掺入用Packard TopCount微板液体闪烁计数器测定。数据用Graphpad Prism软件分析。

在OC1/AML5增殖试验中，G-CSF变体1比野生型G-CSF活性更强(表3)。

样品	EC50(nM)
样品	EC50(nM)	WT	6
变体1	2.6	WT	6

表3、G-CSF的野生型(WT)和变体1在OC1/AML5增殖试验中的EC₅₀。

G-CSF变体的序列分析

对变体1进行测序。该变体与具有SEQ ID No 6所示氨基酸序列的WTG-CSF在氨基酸水平的序列差异如下：

变体1 C17G W58R Q70R F83L

SEQ ID NO：1编码WT人EPO的核苷酸序列

SEQ ID NO：2 WT人EPO的氨基酸序列

GCCCCACCACGCTTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAG

CGGGGTGGTGCGAAGTAGACACTGTCGGCTCAGGACCTCTCCATGGAGAACCTCCGGTTC

A P P R F I C D S R V L E R Y L L E A K

10 20

GAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACT

CTCCGGCTCTTATAGTGCTGCCCGACACGACTTGTGACGTCGAACTTACTCTTATAGTGA

E A E N I T T G C A E H C S L N E N I T

30 40

GTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCC

CAGGGTCTGTGGTTTCAATTAAAGATACGGACCTTCTCCTACCTCCAGCCCGTCGTCCGG

V P D T K V N F Y A W K R M E V G Q Q A

50 60

GTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTG

CATCTTCAGACCGTCCCGGACCGGGACGACAGCCTTCGACAGGACGCCCCGGTCCGGGAC

V E V W Q G L A L L S E A V L R G Q A L

70 80

TTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGT

AACCAGTTGAGAAGGGTCGGCACCCTCGGGGACGTCGACGTACACCTATTTCGGCAGTCA

L V N S S Q P W E P L Q L H V D K A V S

90 100

GGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGGAGGAAGCCATCTCC

CCGGAAGCGTCGGAGTGGTGAGACGAAGCCCGAGACCCTCGGGTCCTCCTTCGGTAGAGG

G L R S L T T L L R A L G A Q E E A I S

110 120

CCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAA

GGAGGTCTACGCCGGAGTCGACGAGGTGAGGCTTGTTAGTGACGACTGTGAAAGGCGTTT

P P D A A S A A P L R T I T A D T F R K

130 140

CTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC

GAGAAGGCTCAGATGAGGTTAAAGGAGGCCCCTTTCGACTTCGACATGTGTCCCCTCCGG

L F R V Y S N F L R G K L K L Y T G E A

150 160

TGCAGGACAGGGGACAGA

ACGTCCTGTCCCCTGTCT

C R T G D R

SEQ ID NO：3编码WT人GM-CSF的核苷酸序列

SEQ ID NO：4 WT人GM-CSF的氨基酸序列

GCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAG

CGTGGGCGGGCGAGCGGGTCGGGGTCGTGCGTCGGGACCCTCGTACACTTACGGTAGGTC

A P A R S P S P S T Q P W E H V N A I Q>

10 20

GAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTA

CTCCGGGCCGCAGAGGACTTGGACTCATCTCTGTGACGACGACTCTACTTACTTTGTCAT

E A R R L L N L S R D T A A E M N E T V>

30 40

GAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAG

CTTCAGTAGAGTCTTTACAAACTGGAGGTCCTCGGCTGGACGGATGTCTGGGCGGACCTC

E V I S E M F D L Q E P T C L Q T R L E>

50 60

CTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATG

GACATGTTCGTCCCGGACGCCCCGTCGGAGTGGTTCGAGTTCCCGGGGAACTGGTACTAC

L Y K Q G L R G S L T K L K G P L T M M>

70 80

GCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATT

CGGTCGGTGATGTTCGTCGTGACGGGAGGTTGGGGCCTTTGAAGGACACGTTGGGTCTAA

A S H Y K Q H C P P T P E T S C A T Q I>

90 100

ATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGAC

TAGTGGAAACTTTCAAAGTTTCTCTTGGACTTCCTGAAAGACGAACAGTAGGGGAAACTG

I T F E S F K E N L K D F L L V I P F D>

110 120

TGCTGGGAGCCAGTCCAGGAG

ACGACCCTCGGTCAGGTCCTC

C W E P V Q E>

SEQ ID NO 5编码WT人G-CSF的核苷酸序列

SEQ ID No 6 WT人G-CSF的氨基酸序列

ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAGCAA

TGGGGGGACCCGGGACGGTCGAGGGACGGGGTCTCGAAGGACGAGTTCACGAATCTCGTT

T P L G P A S S L P Q S F L L K C L E Q

10 20

GTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGCTGTGTGCCACCTACAAG

CACTCCTTCTAGGTCCCGCTACCGCGTCGCGAGGTCCTCTTCGACACACGGTGGATGTTC

V R K I Q G D G A A L Q E K L C A T Y K

30 40

CTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCCCCTGGGCTCCC

GACACGGTGGGGCTCCTCGACCACGACGAGCCTGTGAGAGACCCGTAGGGGACCCGAGGG

L C H P E E L V L L G H S L G I P W A P

50 60

CTGAGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTGAGCCAACTCCATAGC

GACTCGTCGACGGGGTCGGTCCGGGACGTCGACCGTCCGACGAACTCGGTTGAGGTATCG

L S S C P S Q A L Q L A G C L S Q L H S

70 80

GGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCTGGAAGGGATCTCCCCCGAGTTGGGT

CCGGAAAAGGAGATGGTCCCCGAGGACGTCCGGGACCTTCCCTAGAGGGGGCTCAACCCA

G L F L Y Q G L L Q A L E G I S P E L G

90 100

CCCACCTTGGACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGACTTTGCCACCACCATCTGGCAGCAG

GGGTGGAACCTGTGTGACGTCGACCTGCAGCGGCTGAAACGGTGGTGGTAGACCGTCGTC

P T L D T L Q L D V A D F A T T I W Q Q

110 120

ATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTGCAGCCCACCCAGGGTGCCATGCCGGCCTTC

TACCTTCTTGACCCTTACCGGGGACGGGACGTCGGGTGGGTCCCACGGTACGGCCGGAAG

M E E L G M A P A L Q P T Q G A M P A F

130 140

GCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGGGTCCTGGTTGCCTCCCATCTGCAGAGCTTC

CGGAGACGAAAGGTCGCGGCCCGTCCTCCCCAGGACCAACGGAGGGTAGACGTCTCGAAG

A S A F Q R R A G G V L V A S H L Q S F

150 160

CTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGCCACCTTGCCCAGCCC

GACCTCCACAGCATGGCGCAAGATGCGGTGGAACGGGTCGGG

L E V S Y R V L R H L A Q P

170

Claims

1.一种提供比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体的方法，该方法包括：

其中，如下进行步骤(i)，(ii)和(iii)中的一步或多步；

2.权利要求1的方法，其中形成了复合体，所述复合体包含mRNA、编码的目标多肽变体和核糖体。

3.前述任一权利要求的方法，其中稳定性选择压力选自下组：二硫苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍(GuHCl)，伴侣分子耗竭，pH，小分子蛋白折叠抑制剂，蛋白酶，硫氰酸钠，疏水相互作用层析(HIC)和温度。

4.前述任一权利要求的方法，其中步骤(b)中的稳定性选择压力选自下组：二硫苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍(GuHCl)，伴侣分子耗竭，pH和小分子蛋白折叠抑制剂。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤(c)的选择过程中使用两种或更多种稳定性选择压力。

6.前述任一权利要求的方法，其中步骤(c)中的稳定性选择压力选自下组：二硫苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)，巯基乙醇，尿素，盐酸胍(GuHCl)，蛋白酶，硫氰酸钠，HIC和温度。

7.前述任一权利要求的方法，其中二硫苏糖醇(DTT)在步骤(b)中用作稳定性选择压力。

8.前述任一权利要求的方法，其中HIC和/或温度在步骤(c)中用作稳定性选择压力。

9.权利要求1的方法，其中DTT在步骤(b)中用作稳定性选择压力，HIC和温度在步骤(c)中用作稳定性选择压力。

10.权利要求8或9的方法，其中温度是室温。

11.前述任一权利要求的方法，其中，通过比较所选一或多种目标多肽变体在有和无DTT的条件下被展示出来时，对受体、配体或特异性结合配对物的结合能力，测出稳定性。

12.权利要求1-10之一的方法，其中稳定性是通过将所选的一或多种目标多肽变体的聚集与亲本目标多肽的聚集进行比较而测出的。

13.前述任一权利要求的方法，其中在翻译体系中保温的mRNA分子是通过RT-PCR反应获得的，在该PCR中至少一种RT-PCR引物是诱变引物，其编码包含在编码目标多肽变体的核苷酸序列的指定区域内的多种不同序列。

14.前述任一权利要求的方法，还包括从所选复合体中回收mRNA。

15.权利要求14的方法，其中对从展示所选目标多肽变体的所选复合体中回收的mRNA进行扩增，并将其拷贝到编码该所选目标多肽变体的DNA中。

16.权利要求15的方法，其中所述DNA是在用于制备产物的表达体系中提供的，所述产物是所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链。

17.权利要求16的方法，还包括分离或纯化所述产物。

18.权利要求17的方法，还包括将所述产物配制成含有至少一种其它组分的组合物。

19.权利要求15的方法，其中编码所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链的DNA是在核苷酸序列提供的中，以便获得编码融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白包含与其它氨基酸融合的所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链。

20.权利要求19的方法，其中包含编码所述融合蛋白的所述核苷酸序列的DNA是在制备产物的表达体系中提供的，所述产物是所述融合蛋白。

21.权利要求20的方法，还包括分离或纯化所述产物。

22.权利要求21的方法，还包括将所述产物配制成含有至少一种其它组分的组合物。

23.权利要求15或19的方法，其中将编码所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链的DNA突变，以便编码含有与所选目标多肽变体或所选目标多肽变体的多肽链不同的氨基酸序列的多肽。

24.权利要求23的方法，其中编码所述多肽的突变DNA是在用于制备产物的表达体系内提供的，所述产物是所述多肽。

25.权利要求24的方法，还包括分离或纯化所述产物。

26.权利要求25的方法，还包括将所述产物配制成含有至少一种其它组分的组合物。

27.前述任一权利要求的方法，其中所述亲本目标多肽是抗体分子。

28.权利要求27的方法，其中所述抗体分子是单链抗体分子。

29.权利要求28的方法，其中所述抗体分子是scFv，V_H，Fd或dAb分子。

30.权利要求1-26任一项的方法，其中所述亲本目标多肽是四种反平行α-螺旋束蛋白组成的家族的成员。

31.权利要求1-26任一项的方法，其中所述亲本目标多肽是复合物受体的胞外区。

32.权利要求1-26任一项的方法，其中所述亲本目标多肽是促红细胞生成素(EPO)。

33.权利要求32的方法，其中所述亲本目标多肽是具有SEQ ID NO：2所示序列的人野生型EPO。

34.权利要求33的方法，其中目标多肽变体在人野生型序列SEQ ID NO：2中包括选自下组突变中的一组突变：

(1)L16I I25F T27M V61A R139H T157V

(2)D8V T26A T27A S126P G158E

(3)D8V T27A Y49N W64R V82A E89G 126P G158E

(4)T26A W64R A135V G158E

(5)D8V V74F T107A N147D。

35.权利要求1-26任一项的方法，其中亲本目标多肽是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

36.权利要求35的方法，其中所述亲本目标多肽是具有SEQ ID NO：4所示序列的人野生型GM-CSF。

37.权利要求36的方法，其中目标多肽变体在人野生型序列SEQ ID NO：4中包括一组突变：R4S L15H A18V I43V K63T T102A。

38.权利要求1-26任一项的方法，其中所述亲本目标多肽是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

39.权利要求38的方法，其中所述亲本目标多肽是具有SEQ ID NO：6所示序列的人野生型G-CSF。

40.权利要求39的方法，其中目标多肽变体在人野生型序列SEQ ID NO：6中包括一组突变：C17G W58R Q70R F83L。

41.一种制备比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体多肽的方法，该方法包括：

在核糖体展示体系中，通过在有和无DTT的条件下从编码的核酸中进行表达而产生目标多肽变体；

42.权利要求41的方法，其中稳定性是用稳定性计量值进行测试的，所述计量值是，在有DTT时翻译出的多肽在放射免疫测定中测出的与目标多肽受体、配体或特异性结合配对物结合的能力，与在无DTT时翻译出的多肽在相同测定法中测出的与目标多肽受体、配体或特异性结合配对物结合的能力的比值。

43.权利要求41或42的方法，包括在测试前分离目标多肽变体的步骤。

44.权利要求41-43之一的方法，包括对编码亲本目标多肽的核酸进行突变，以便在从编码目标多肽变体的核酸进行表达之前提供该编码目标多肽变体的核酸。

45.一种鉴定或获得比亲本目标多肽稳定性改进的目标多肽变体的方法，所述方法包括：

对编码亲本目标多肽的核酸进行突变，从而获得一种或多种核酸，它们具有编码一种或多种目标多肽变体的序列，所述目标多肽变体有改变的氨基酸序列；

在有和无DTT的条件下表达所述一种或多种核酸，从而在核糖体展示系统中生成所述一种或多种目标多肽变体；

在室温，利用疏水相互作用层析，比较有和无DTT的条件下生成并展示在核糖体上的目标多肽变体与关联受体、配体或特异性结合元件的结合，由此测试这样制备的所述一或多种目标多肽变体比亲本目标多肽改进的稳定性。

46.权利要求45的方法，包括制备目标多肽变体文库，和测试所述文库中变体的改进的稳定性。

47.权利要求46的方法，包括鉴定稳定性改进的一种或多种目标多肽变体。

48.权利要求47的方法，包括分离出所述一种或多种目标多肽变体。

49.权利要求47或48的方法，包括分离出编码所述一种或多种目标多肽变体的核酸序列。

50.权利要求49的方法，包括将所述一种或多种分离的目标多肽变体配制成含有至少一种其它组分的组合物。