KR101248252B1 - 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도 - Google Patents

변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101248252B1
KR101248252B1 KR1020097013574A KR20097013574A KR101248252B1 KR 101248252 B1 KR101248252 B1 KR 101248252B1 KR 1020097013574 A KR1020097013574 A KR 1020097013574A KR 20097013574 A KR20097013574 A KR 20097013574A KR 101248252 B1 KR101248252 B1 KR 101248252B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
polypeptide
amino acid
epo
polypeptides
Prior art date
Application number
KR1020097013574A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100014291A (ko
Inventor
티에리 귀용
쥘 보렐리
사비에르 갈레
릴라 드리딴티
마뉴엘 베가
Original Assignee
한올바이오파마주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한올바이오파마주식회사 filed Critical 한올바이오파마주식회사
Publication of KR20100014291A publication Critical patent/KR20100014291A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101248252B1 publication Critical patent/KR101248252B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/26—Iron; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

변형된 에리스로포이에틴 (EPO) 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드가 제공된다. EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 각각 상응하는 비변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 비변형된 치료용 폴리펩티드와는 상이한 물리적 특성 및 활성을 나타낸다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 상기 폴리펩티드를 사용한 치료 및 진단 방법이 또한 제공된다.
에리스로포이에틴 변이체, 단백질분해효소 저항성

Description

변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도{MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF FOR TREATMENT}
[관련출원]
"변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 용도"란 표제로 2006년 11월 28일자로 출원된Thierry Guyon, Giles Borrelly, Xavier Gallet, Lila Drittanti 및 Manuel Vega의 미국 가출원 제60/861,615호를 우선권으로 청구한다.
본 출원은 "변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 용도"란 표제의 Thierry Guyon, Giles Borrelly, Xavier Gallet, Lila Drittanti 및 Manuel Vega의 미국 특허 출원으로 attorney docket no 제17109-021001/931호와 관련 있다. 본 출원은 "높은 안정성을 위한 추론적 진화, 사이토카인 및 암호화 핵산 분자"란 표제로 2003년 9월 8일자로 출원되고 미국 공개 번호 제 US-2004-0132977-A1호로 공개된 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 및 Lila Drittanti의 미국 특허 출원 제10/658,834호의 계속 출원인 "높은 안정성을 위한 추론적 진화, 사이토카인 및 암호화 핵산 분자"란 표제로 2005년 7월6일자로 출원되고 미국 출원공개번호 제US-2006-0020116호로 공개된 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 및 Lila Drittanti의 미국 특허 출원 제11/176,830호와 관련 있다. 본 출원은 또한, "이차원적 추론적 돌연변이유발 스캐닝을 이용한 추론 지향적 단백질 진화"란 표제로 2003년 9월 8일자로 출원되고 미국 출원 공개 번호 제US-2005-0202438호로 공개된 Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 및 Lila Drittanti의 미국 특허출원 제10/658,355호의 계속 출원인 "이차원적 추론적 돌연변이유발 스캐닝을 이용한 추론 지향적 단백질 진화"란 표제로 2005년 8월 2일자로 출원되고, 미국 출원 공개 번호 제US-2006-0020396-A1호로 공개된 Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 및 Lila Drittanti의 미국 특허출원 제11/196,067호와 관련 있다.
본 출원은 또한, "높은 안정성을 위한 추론적 진화, 사이토카인 및 암호화 핵산 분자"란 표제의 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 및 Lila Drittanti의 2003년 9월8일자로 출원된 미국 특허출원 제10/658,834호 및 국제 PCT 출원 제WO2004/022593호에 관한 것이다. 본 출원은 또한, "이차원적 추론적 돌연변이유발 스캐인을 이용한 추론 지향적 단백질 진화"란 표제의Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 및 Lila Drittanti의 2003년 9월8일자로 출원된 미국 특허출원 제10/658,355호 및 국제PCT 출원 제WO2004/022747호에 관한 것이다.
허용되는 경우, 상기 참조된 출원서의 각각의 내용은 그대로 참조로 추가된다.
변형된 에리스로포이에틴(EPO) 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 제공한다. EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형 EPO 폴리펩티드와 다른 비변형 치료용 폴리펩티드 각각에 대해 상이한 물리적 특성 및 활성 을 부여하기 위해 변형하였다. 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 또한 제공한다. 또한 이러한 폴리펩티드를 사용하는 치료 및 진단 방법을 제공한다.
임상용 치료학적 단백질의 효과적인 전달은 약제 과학의 난제이다. 혈류에서, 이들 단백질은, 신장의 여과(예:사구체) 또는 혈중 단백질 분해와 같은 단백질 제거를 위한 정상 경로를 사용한 제거뿐만 아니라 대사작용을 포함하는, 상이한 생리학적 과정에 의해 단시간 내에 순환으로부터 지속적으로 제거된다. 위장관 내강에서, 이러한 단백질은 내강 단백질분해효소에 의해 지속적으로 분해된다. 후자는 경구 투여, 피하 투여, 및 정맥 내 또는 근육 내 주사시 치료제로서 사용된 단백질의 반감기에 영향을 주는 제한적 경로이다. 이러한 단백질의 투여 경로와 관련된 문제는 익히 공지되어 있으며 이러한 문제를 해결하기 위한 시도로서 다양한 전략들이 사용되어 왔다. 더욱이, 많은 치료용 단백질은 당화되어 있고, 당화된 치료용 단백질 생산은 고가이고, 매우 가변적이고 생산이 어려운 경우가 자주 있다. 그런 단백질들의 비-당화된 형태의 생산은 단백질의 분해 때문에 불가능한 경우가 자주 있다.
많은 임상 연구의 집중을 받았으며 투여 및 생물 동화를 향상시키고자 노력 해왔던 단백질 계열은 에리스로포이에틴(EPO)를 포함하는 사이토카인 계열이다. 재조합적으로 생산된 EPO 폴리펩티드는 신부전, 만성 염증, 암 및 AIDS 에 의해 유발되는 다양한 빈혈의 치료 목적으로 승인되었다. 그러나 여전히 더 안정한 형태의 치료용 에리스로포이에틴에 대한 절박한 요구가 남아 있다. 에리스로포이에틴은 상 대적으로 짧은 혈장내 반감기를 가지고 있다(Spivak, J. L. and Hogans, B. B., Blood 73(1): 90-99 (1989); McMahon, F. G., 등., Blood 76(9): 1718-1722 (1990)). 이로 인해 치료적 혈장 농도가 빠르게 소실되어 반복적인 정맥 투여가 이루어져야 한다. 천연 발생 변이체는 목적하지 않는 부작용뿐만 아니라, 투여, 생체이용성 및 짧은 반감기의 문제까지 가질 수 있기 때문에 생물학적 치료제로서 사용하기 위해 EPO의 특성을 향상시킬 필요가 있다. 따라서, 본원의 목적 가운데, 증가된 치료학적 특성을 갖는 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 치료학적 폴리펩티드를 제공하는 것이 한가지 목적이다.
[요약]
본원에서는 비변형 치료용 폴리펩티드에 비해 증가된 단백질 안정성을 나타내는 변형된 에리스로포이에틴(EPO)와 그 외 변형된 치료용 폴리펩티드의 약제학적 조성물이 제공한다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 그외 변형된 치료용 폴리펩티드는 상응하는 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해효소에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 본원에서 제공된 증가된 단백질 안정성을 보이는 변형된 EPO 폴리펩티드와 그 외 다른 치료용 폴리펩티드는 그에 상응하는 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교해서 생체 내 또는 시험관 내에서 증가된 단백질 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드는 경구 투여 또는 주사에 따른 혈중 및/또는 저장 조건에서의 안정성을 나타낸다. 본원에 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 그 외 다른 치료용 폴리펩티드의 증가된 안정성은 단백질분해효소에 의한 소화에 대해 증가된 저항성으로 나타날 수 있다. 이러한 증가된 안정성은 혈액, 소화관 또는 다른 단백질분해효소에 대한 저항성로 평가된 안정성을 포함한다.
본원에서는 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해효소에 대해 증가된 저항성을 나타낸다. 비-당화되고 증가된 단백질분해효소 저항성을 보이며 변형된 치료용 폴리펩티드에는, 비-당화되고 증가된 단백질분해효소 저항성을 보이는 변형된 에리스로포이에틴(EPO) 폴리펩티드가 포함된다. 다른 대표적인 치료용 폴리펩티드의 예로는 인터류킨-1 베타 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-9 (IL-9), 인터페론-베타 (IFN-β), 인터페론-감마 (IFN-γ), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포-콜로니 자극인자 (M-CSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 백혈병 억제인자 (LIF), 줄기세포 인자 (SCF), 온코스타틴 엠 (OSM) 및 혈관 내피 성장인자 (VEGF)가 포함되나, 이것에 국한되지 않는다.
변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 증가된 단백질 안정성을 보이는 변형된 EPO 폴리펩티드일 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 증가된 단백질 안정성을 나타내는 EPO의 돌연변이 변이체들이다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 당화되거나 탈-당화된 것일 수 있다. 경우에 따라서는, 증가된 단백질 안정성을 나타내는 변형된 EPO 폴리펩티드는 탈-당화된 것이다.
본원에서는 변형된 치료용 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공하는데, (i) 상기 변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, (ii) 변형된 치료용 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 통해 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내고, (iii) 비변형된 치료용 폴리펩티드는 적어도 하나의 당화 위치를 포함하고, 당화는 비변형된 치료용 폴리펩티드의 치료용 활성에 요구되고, 및 (iv) 변형된 치료용 폴리펩티드는 당화되지 않고 치료 치료용 활성을 나타낸다. 또한 본원에서는 변형된 치료용 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공하는데 상기 (i) 변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형된 치료용 폴리펩티드에 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고 (ii) 변형된 치료용 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 통해 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내고, (iii) 비변형된 치료용 폴리펩티드는 최소한 하나의 당화 위치를 포함하며, (iv) 변형된 치료용 폴리펩티드는 당화되지 않고 인터페론-알파가 아니다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 모든 당화 위치를 제거하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 경우에 따라서는, 변형된 치료용 폴리펩티드는 비-천연적 당화 위치를 도입하는 변형을 포함할 수 있다. 경우에 따라서는, 폴리펩티드는 E.coli 와 같은 원핵성 균주에서 생산되어, 상기 폴리펩티드는 당화되지 않는다. 경우에 따라서는 변형된 치료용 폴리펩티드는 사이토카인이다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 에리스로포이에틴 (EPO), 인터류킨-1β (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨 (IL-9), 인터페론-베타 (IFN-β), 인터페론-감마 (IFN-γ), 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포-콜로니 자극인자 (M-CSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 백혈병 억제인자 (LIF), 줄기세포 인자(SCF), 온코스타틴 엠 M (OSM) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드의 전구체 형태 또는 성숙한 형태일 수 있다. 일반적으로, 변형된 치료용 폴리펩티드는 이것과 같은 조건에서 생산된 비변형된 치료용 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 활성을 유지한다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 완전히 당화된 비변형된 치료용 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 활성을 유지할 수 있다. 변형된 치료용 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 활성은 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 감소될 수 있다. 경우에 따라서는, 변형된 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드의 활성 부분 내지 단편을 포함하며, 상기 활성 부분 내지 단편은 비변형된 치료용 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 활성을 유지하고, 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 본원에서는 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 위치에서 변형된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 치료용 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서는 비변형 치료용 폴리펩티드와 비교하여 증가된 단백질 안정성을 나타내는 변형된 치료용 폴리펩티드를 제공한다. 경우에 따라서는, 변형된 치료용 폴리펩티드는 혈청, 혈액, 타액, 소화액 또는 시험관 내 상의 하나 이상의 단백질분해효소에 의한 단백질분해에 대해 증가된 저항성을 나타낸다. 단백질분해효소는 예를 들면, 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 아미노펩티다제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 알파-키모트립신, 카르복시펩티다제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로티나제 Lys-C, 내강 펩신, 미세융모 엔도펩티다제, 디펩티딜 펩티다제, 엔테로펩티다제 및 하이드롤라제, NS3, 혈액응고인자 Xa(factor Xa), 그랜자임 B, 트롬빈, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA 중 어느 하나일 수 있다. 단백질분해에 대한 증가된 저항성은 변형된 폴리펩티드를 정맥, 경구, 비강, 경폐 투여하거나 소화관에 존재하게 하는 경우 변형된 폴리펩티드에 의해 나타난다. 그러한 변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 단백질분해효소에 의한 단백질 분해에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 경우에 따라서는, 변형된 치료용 폴리펩티드는 추가적으로 변형되며, 그 변형은 하나 이상의 카르복시화(carboxylation), 수산화(hydroxylation), 해실화(hasylation), 카르바밀화(carbamylation), 황화(sulfation), 인산화(phosphorylation), 알부민화(albumination), 산화(oxidation) 또는 폴리에틸렌글라이콜(PEG) 잔기의 접합을 포함한다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 비변형 치료용 폴리펩티드의 변경된 면역원성(altered immunogenicity), 카르복실화(carboxylation), 수산화(hydroxylation), 해실화(hasylation), 카르바밀화(carbamylation), 황화(sulfation), 인산화(phosphorylation), 산화(oxidation), 페길레이션(PEGylation) 또는 변형된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성에 기여하는 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형을 포함한다.
경우에 따라서는, 변형된 치료용 폴리펩티드는 에리스로포이에틴(EPO) 폴리펩티드이다. EPO인 비변형된 치료용 폴리펩티드의 성숙한 형태는 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열 또는 그것의 대립유전자형 내지 종간 변이체를 포함한다. 경우에 따라서는, 대립유전자형 또는 종간 변이체는 서열번호 2 또는 237 에 제시된 폴리펩티드와, 아미노산 변형을 제외하고, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성를 가진다. EPO폴리펩티드인 변형된 치료용 폴리펩티드는, 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드에서 또는 그의 대립유전자형 또는 종간 변이체의 상응하는 잔기에서 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, K20Q, K20T, K20N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H 및 R166Q 위치 중 임의의 하나에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 갖는다.
EPO폴리펩티드인 변형된 치료용 폴리펩티드는 N-당화 위치인 N24,N38 및 N83 과 같은 하나 이상의 당화 위치에서 아미노산 변형을 포함한다. 예를 들면, 그러한 폴리펩티드는 N24H, N38H 및 N83H에서 선택된 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 이와 동일한 조건에서 생산된 비변형된 치료용 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다. 경우에 따라서는, 변형된 치료용 폴리펩티드는 완전히 당화된 비변형된 치료용 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다.
본원에서는 아미노산 위치 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 23, 29, 31, 35, 37, 42, 43, 45, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 62, 64, 67, 69, 70, 72, 75, 76, 80, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 96, 97, 102, 103, 105, 108, 109, 110, 112, 116, 117, 121, 122, 123, 129, 130, 131, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 148, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 165, 및 166에 상응하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 여기서, 변형된 아미노산 위치는, 서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 가지는 성숙한 인간 EPO폴리펩티드에 상응하거나 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드의 대립유전자 또는 종간 변이체, 성숙한 인간 EPO폴리펩티드에 65%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 EPO 폴리펩티드, 또는 상기 언급된 하나 이상의 변형을 포함하고 완전한 길이 EPO의 적어도 하나의 활성을 유지하거나 EPO활성을 나타내는 그들의 단편에서의 상응하는 위치에 있다.
예를 들면, 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환은 P2, P3, R4, L5, C7, D8, R10, L12, E13, R14, Y15, L16, L17, E18, K20, E21, E23, C29, E31, L35, E37, P42, D43, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, P121, P122, D123, P129, L130, R131, D136, F138, R139, K140, L141, F142, R143, Y145, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165, 및 R166 위치 중에 임의의 치환을 포함한다.
본원에서는 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V,L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H, 및 R166Q에 상응하는 변형을 가진 EPO 폴리펩티드의 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 여기서, 변형된 아미노산 위치는 서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 가지는 성숙한 인간 EPO폴리펩티드에 상응하거나 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드의 대립유전자 또는 종간 변이체, 성숙한 인간 EPO폴리펩티드에 65%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 EPO 폴리펩티드, 또는 상기 언급된 하나 이상의 변형을 포함하고 완전한 길이 EPO의 적어도 하나의 활성을 유지하거나 EPO활성을 나타내는 그들의 단편에서의 상응하는 위치에 있다. 상세한 예로써, EPO 폴리펩티드의 변형은 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7V, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13H, E13N, R14H, Y15H, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, D43H, K45T, W51H, K52T, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, R143H, R143Q, Y145H, F148I, L149I, L149V, R150H, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154N, L155V, L155I, Y156H, E159Q, E159H, E159N, D165H, R166H, 및R166Q 중에 선택된다. 본원에서는 2 이상의 위치에서 변형에 상응하는 2 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 변형된 아미노산 위치는 서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 가지는 성숙한 인간 EPO폴리펩티드에 상응하거나 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드의 대립유전자 또는 종간 변이체, 성숙한 인간 EPO폴리펩티드에 65%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 EPO 폴리펩티드, 또는 상기 언급된 하나 이상의 변형을 포함하고 완전한 길이 EPO의 적어도 하나의 활성을 유지하거나 EPO활성을 나타내는 그들의 단편에서의 상응하는 위치에 있다. 예를 들어, 임의의 2 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N,P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L1.08V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H, 및 R166Q 중에 임의의 치환들을 포함할 수 있다.
본원에서는 P2, P3, R4, L5, C7, D8, R10, L12, E13, R14, Y15, L16, L17, E18, K20, E21, E23, C29, E31, L35, E37, P42, D43, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, P121, P122, D123, P129, L130, R131, D136, F138, R139, K140, L141, F142, R143, Y145, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165, 및 R166 아미노산 위치에 상응하는 하나 이상의 위치 중에서 추가적으로 변형된 임의의 상기의 변형된 EPO 폴리펩티드가 제공한다. 여기서 변형된 아미노산은 서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 갖는 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드에서의 위치를 참조한다. 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 아미노산 위치 중 어느 하나에서 아미노산 치환은 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, 및 R166H의 어느 하나의 치환을 포함할 수 있다.
본원에서는 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 EPO 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드에서 상응하는 잔기에서의 K20Q 및/또는 R139H 아미노산 치환에 상응하는 변형을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 경우에 따라서는, K20Q 또는 R139H가 유일한 변형이다. 다른 예로는, 하나 이상의 아미노산 위치들에서의 하나 이상의 추가적인 변형도 변형된 EPO 폴리펩티드에 포함된다. 예를 들어, 그 변형은 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 23, 29, 31, 35, 37, 42, 43, 45, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 62, 64, 67, 69, 70, 72, 75, 76, 80, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 96, 97, 102, 103, 105, 108, 109, 110, 112, 116, 117, 121, 122, 123, 129, 130, 131, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 148, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 165, 및 166 중에 하나 이상의 아미노산 위치에서 일 수 있다. 그러한 위치들에서의 추가적인 변형은 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V,C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H, 및 R166Q와 같은 아미노산 치환일 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 EPO 폴리펩티드는 R139H/R4H, R139H/L93I, R139H/K20Q, R139H/E159N, R139H/K52N, R139H/L153V, R139H/L93V, R139H/L80I, R139H/L93I, K20Q/L80I/R139H, K20Q/L93I/R139H, K20Q/L93V/R139H, R4H/K20Q/R139H/L80I, E159N/K20Q/R139H/L93I, K20Q/R139H/L153V, L153V/K20Q/R139H/L80I 및 E159N/K20Q/R139H/L80I 와 같이 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것들 일 수 있으며, 이에 국한되지는 않는다.
본원에서는 A30N, H32T, P87V, W88N 및/또는 P90T 와 같은 하나 이상의 추가적인 아미노산의 변형을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 당화 또는 탈-당화될 수 있다. 탈-당화된 EPO 폴리펩티드는 E.coli와 같은 원핵성 균주에서 생산될 수 있다. 경우에 따라서는 변형된 EPO 폴리펩티드는 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 천연 당화 위치를 또는 모든 당화 위치를 제거하는 하나 이상의 변형을 가진다. 변형은 S126와 같은 O-당화 위치 및/또는 N24, N38 및/또는 N83 와 같은 N-당화 위치에서 일 수 있다. 예를 들면, 변형된 EPO 폴리펩티드는 N24H, N38H 및 N83H의 아미노산 치환 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 이와 같이, 본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드는 N38H/R139H, N38H/R139H/R4H, N38H/R139H/L93I, N38H/R139H/K20Q, N38H/R139H/E159N, N38H/R139H/K52N, N38H/R139H/L153V, N38H/N83H/R139H, K20Q/N38H/N83H/R139H, N38H/ N83H/R139H/L93V, N38H/ N83H/R139H/L80I, N38H/ N83H/R139H/L93I, K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H, K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H, K20Q/N38H/N83H/L93V/R139H, N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, N24H/N38H/N83H/R139H/L93V, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V, R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V, L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I 및E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I 와 같은 변형들을 포함한다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 서열번호 1(전구체 형태) 또는 서열번호 2(성숙한 형태)에서 제시된 아미노산 서열을 가지는 천연형 인간 EPO 폴리펩타이드의 변형과 같은 전구체 및 성숙한 형태를 포함한다. 대표적인 변형된 EPO 폴리펩티드는 서열번호 3에서 201까지 제시된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. EPO 폴리펩티드의 아미노산 변형은 서열번호 2 또는 237의 대립유전자형, 종간, 또는 동종형 변이체에 존재할 수 있는데, 상기 대립유전자형 또는 종간 변이체는 서열번호 2 또는 237에 제시된, 폴리펩티드에 변형된 위치를 제외하고, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 것으로 이해된다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 또는 비-인간 폴리펩티드일 수 있다. 변형된 위치는 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 갖는 알려진 비변형된 성숙한 EPO 폴리펩티드의 아미노산 번호부여를 참조하여 동정된다. 당업자는 변화되지 않은 잔기의 정렬에 의한 개별 폴리펩티드 상에 해당하는 위치들을 용이하게 결정할 수 있다. 게다가, 특히 활성을 보유하는 양 말단 중 하나에 아미노산 삽입 또는 결실이 있는 짧아지거나 길어진 변이체는, 쉽게 제조할 수 있고 상응하는 돌연변이에 대한 위치가 동정될 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 위치들에서 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드와 비교하여 증가된 단백질 안정성을 나타낸다. 본원에서는 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 1차 서열 변형의 결과로써 변형된 폴리펩티드의 증가된 단백질 안정성을 갖는 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 증가된 단백질 안정성은 단백질분해효소에 대한 증가된 저항성으로 명백해진다. 몇가지 예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드가 나타내는 증가된 단백질 안정성은 혈청, 혈액, 타액, 소화액, 또는 시험관내에서 하나 이상의 단백질분해효소에 노출된 단백질 분해에 대한 증가된 저항성에 기인한다. 단백질분해에 대한 증가된 저항성은 변형된 폴리펩티드가 정맥, 경구, 비강, 경폐투여 또는 소화관내에 존재할 때 나타난다. 그러한 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 단백질분해효소에 의한 단백질 분해에 증가된 저항성을 나타낸다. 예를 들면, 단백질 분해 효소는 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 아미노펩티다제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 알파-키모트립신, 카르복시펩티다제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로티나제 Lys-C, 내강 펩신, 미세융모 엔도펩티다제, 디펩티딜 펩티다제, 엔테로펩티다제 및 하이드롤라제, NS3, factor Xa, 그랜자임 B, 트롬빈, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA 중 임의의 것일 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 나출형(naked) 폴리펩티드 사슬 또는 번역 후에 변형된 것일 수 있다. 대표적인 번역 후 변형은 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화, 또는 알부민 또는 폴리에틸렌 글라이콜잔기에의 접합(conjugation)을 포함한다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 위치에서 추가적으로 변경될 수 있는데, 상기 변경은 변경된 면역원성, 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화, 페길레이션화 또는 변형된 EPO 단백질의 단백질분해효소 저항성에 기여한다. 대표적인 아미노산 변형은 천연 아미노산, 비천연 아미노산 및 천연 아미노산과 비천연 아미노산의 조합에 의한 치환을 포함한다. 그러한 변형은 EPO 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다.
본원에서는 하나 이상의 가성-천연형 돌연변이를 추가적으로 포함하는 상기한 바와 같은 임의의 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 예에서, 가성(pseudo)-천연형 돌연변이는 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 증가된 단백질 안정성을 나타내며 비변형된 EPO 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다. 본원에서는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 증가된 활성을 나타내는 상기한 바와 같은 임의의 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 감소된 활성을 나타내는 상기한 바와 같은 임의의 변형된 EPO 폴리펩티드가 제공한다. 예를 들어, EPO 폴리펩티드의 활성은 시험관내 또는 생체내 적혈구세포 생산 활성 또는 조직 보호 활성의 측정을 통해 평가될 수 있다. 이와 같은 분석 결과는 생체내 활성, 따라서 생물학적 활성과 관련되어 있다. 경우에 따라서는, 변형된 EPO 폴리펩티드는 적혈구세포 생산을 촉진한다. 경우에 따라서는, 변형된 EPO 폴리펩티드는 조직 손상을 지연시키거나 방지한다. 경우에 따라서는, 변형된 EPO 폴리펩티드는 적혈구세포 생산을 촉진하고 조직 손상을 지연하거나 방지한다. 본원에서는 생체내 또는 시험관내 상에서 증가된 반감기를 통해 증가된 단백질 안정성이 명백해지는 임의의 상기 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 예에서, 증가된 안정성은 대상체에 투여되었을 때 증가된 반감기를 통해 명백해진다. 다른 예에서, 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 는 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO의 반감기와 비교하여 최소 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상으로 증가된 반감기를 가진다. 또 하나의 예에서, 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO는 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO의 반감기와 비교하여 최소 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배 및 1000 배, 또는 그 이상으로 증가된 반감기를 가진다.
본원에서는 신호 펩티드를 포함하는 전구체 폴리펩티드인 임의의 상기한 바와 같은 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 예에서, 신호서열은 서열번호 1에 제시된 전구체 EPO 분자의 아미노산 서열의 1-27 아미노산들이다. 본원에서는 신호 폴리펩티드를 갖지 않는 임의의 상기한 바와 같은 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서는 신호 펩티드가 없는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 성숙한 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드라 한다. 경우에 따라서는, 본원에서 제공된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 분비된다. 그러한 분비된 폴리펩티드는 분비 이전에 분리되는 신호서열을 가진다. 그러한 분비된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 당화, 카르복실화, 수산화, 황화 또는 인산화와 같은 다른 번역-후 변형을 포함한다. 경우에 따라서는, C-말단 아미노산(예: R166) 은 제거되거나 단백질분해에 의해 절단된다. 다른 예에서, 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아미노산들이 추가적으로 절단된다.
본원에서는 본원에서 기술된 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 103, 104 또는 그 이상의 변형된 EPO 폴리펩티드를 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드의 집합 (또는 라이브러리)가 제공한다.
본원에서는 본원에서 기술된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본원에서는 본원에서 기술된 대다수의 분자를 포함하는 핵산 분자의 집합 (또는 라이브러리)을 제공한다.
본원에서는 본원에서 기술된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터를 제공한다. 대표적인 벡터들로는, 원핵성 벡터, 바이러스성 벡터, 또는 진핵성 벡터가 있으며, 이에 제한되지 않는다. 대표적인 바이러스성 벡터들로는 아데노바이러스, 아데노-관련-바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 및 사이토메갈로바이러스 벡터가 포함된다. 경우에 따라서는, 벡터의 핵산은 바이러스성 프로모터 또는 진핵성 프로모터와 같은 프로모터에 작동가능하게(operably) 연결된다. 그러한 프로모터들은 항시성(constitutive) 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터일 수 있다. 본원에서는 본원에서 기술된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 103, 104 또는 그 이상의 벡터들을 포함하는 집합(또는 라이브러리)을 제공한다.
본원에서는 본원에서 기술된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자들을 포함하는 세포를 제공한다. 본원에서는 본원에서 기술된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터들을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포들은 원핵성 세포 또는 진핵성 세포일 수 있고, 상기 세포들은 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
본원에서는 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드에 특이적인 항체를 제공한다.
본원에서는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 발현하는 방법을 제공한다. 그러한 방법들은 i) 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 단계 ii) 암호화된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드가 발현되는 조건에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 하나의 예에서, 세포들은 진핵 세포이다. 다른 예에서, 세포들은 원핵 세포이다. 하나의 예에서, 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 번역 후 변형된다. 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 발현하는 다른 방법으로는, 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 를 암호화하는 핵산 분자 또는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 무세포 번역 시스템(cell-free translation system)에 도입함으로써 암호화된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 상기 발현 방법들에서, 상기 방법은 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드을 검출하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서는 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 외래의 핵산을 함유하는 비-인간 형질전환 동물을 제공한다. 대표적인 비-인간 형질전환 동물은 돼지, 염소, 양, 토끼, 쥐 및 소를 포함한다. 본원에서는 비-인간 형질전환 동물에서 변형된 EPO 폴리펩티드를 발현하는 방법과 발현된 변형된 EPO 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 비-인간 형질전환 동물의 혈청, 젖 또는 알과 같은 조직 또는 체액에서 분리될 수 있다. 그러한 발현된 변형된 EPO 폴리펩티드는 번역 후에 변형될 수 있다. 예를 들면, 변형된 EPO 폴리펩티드는 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화, 알부민화, 또는 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG) 잔기의 접합이 이루어질 수 있다.
본원에서는 본원에서 기술된 임의의 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 경우에 따라서는, 변형된 EPO 폴리펩티드는 서열번호 3에서 201 및 247에서 272에 제시된 임의의 아미노산들이다.
본원에서는 국소(local), 전신 또는 피부(topical)로 투여를 위해 제형화된 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 경구, 비강, 경폐, 구강, 점막, 경피, 피하, 십이지장내, 직장, 비경구, 정맥 또는 근육내 투여용으로 제형화 될 수 있다. 상세한 예로는, 약제학적 조성물은 경구 투여를 위해 제형화된다.
본원에서는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공하는데, 상기 폴리펩티드는 단백질분해효소에 대해 저항적이도록 그 1차 구조에서의 한 개 이상의 아미노산의 치환에 의해 변경되고, 상기 조성물은 경구 투여를 위해 제제화된다.
본원에서는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공하는데, 변경된 EPO 폴리펩티드는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 변형을 갖는다. 본원에서는 오직 폴리펩티드의 1차 구조만 변형된 결과 증가된 단백질 안정성을 나타내는 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드로 구성된 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물은 단백질분해 절단 위치의 제거를 포함할 수 있다.
본원에서는 증가된 단백질 안정성이 단백질 분해에 대한 증가된 저항성으로 명백해지는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 몇 가지 예에서, 약제학적 제형 내의 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 타액에 대한 노출, 위장관내 단백질분해효소들에 대한 노출 및 낮은 pH 조건에의 노출 중 선택된 조건하에 위장관내에서 증가된 단백질 안정성을 나타낸다. 몇 가지 예에서, 단백질 분해에 대한 증가된 저항성은 혈청, 혈액, 타액, 소화액 또는 하나 이상의 단백질 효소들에 노출되는 시험관내 상에서 나타난다. 단백질분해효소들은 내강 펩신(luminal pepsin), 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 아미노펩티다제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 알파-키모트립신, 카르복시펩티다제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로티나제 Lys-C, 내강 펩신, 미세융모 엔도펩티다제, 디펩티딜 펩티다제, 엔테로펩티다제 및 하이드롤라제, NS3, factor Xa, 그랜자임 B, 트롬빈, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA 중 하나 이상을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 몇 가지 예에서, 약제학적 제형 중의 변형된 EPO 폴리펩티드는 경구 투여되거나 소화관내에 존재할 때 증가된 단백질분해효소에 대한 저항성을 나타낸다.
본원에서는 나출형 치료용 폴리펩티드 또는 나출형 EPO 폴리펩티드인 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물 또는 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화, 알부민화, 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 잔기에 접합된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드와 같이 번역 후에 변형된 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 변경된 면역원성, 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화, 알부민화, 또는 페길레이션 또는 변형된 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성에 기여하는 하나 이상의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산들의 조합 중에 선택되는 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형을 가지는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서는 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형으로 증가된 펩티드의 안정성을 나타내는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 비변형된 폴리펩티드의 아미노산 잔기(들)의 삽입, 결실 및 치환을 포함하는 하나 이상의 가성-천연형 돌연변이를 추가적으로 포함하는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 비변형된 치료용 폴립펩티드와 비교하여 증가된 단백질 안정성을 나타내고 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지하는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서는 적혈구 세포의 증식을 촉진하는 변형된 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 생체내 또는 시험관내 상에서 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 증가된 단백질 반감기를 나타나게 하는 증가된 단백질 안정성을 가지는 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 증가된 단백질 안정성은 피험차에 투여한 뒤 증가된 단백질 반감기를 나타나게 한다. 단백질의 반감기는 비변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드와 비교하여 그 양으로, 최소 약 또는1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상으로 증가 될 수 있다. 대안적으로, 단백질의 반감기는 비변형된 단백질과 비교하여 그 양으로 최소 6배, 최소 7배, 최소 8배, 최소 9배, 최소 10배, 최소 20배, 최소 30배, 최소 40배, 최소 50배, 최소 60배, 최소 70배, 최소 80배, 최소 90배, 최소 100배, 최소 200배, 최소 300배, 최소 400배, 최소 500배, 최소 600배, 최소 700배, 최소 800배, 최소 900배 또는 최소 1000배 또는 그 이상으로 증가될 수 있다. 한 가지 예에서, 약제학적 조성물 중의 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO는 위장관내에서 증가된 단백질 반감기 또는 생체이용율을 나타낸다.
본원에서는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가적으로 함유하는 조성물을 함유하는 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서는 부형제가 결합제, 충진제, 활택제, 붕해제 또는 습윤제인 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 상세한 예로, 부형제는 무수 결정질 말토스 또는 마그네슘 스테아레이트이다. 본원에서는 첨가제가 현탁화제, 유화제, 비수성 비히클 또는 보존제인 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 액제, 환제, 정제, 로젠지제 및 캡슐제 중 선택된 형태로 투여하기 위해 제형화된 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다. 상세한 약제학적 조성물에서, 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드가 위장관에 경구적으로 전달된다. 일반적으로, 그러한 경구 제형은 섭취되고 하부 위장관에 전달된다. 대표적인 환제, 정제 또는 캡슐제의 약제학적 조성물은 장용 코팅을 포함한다. 다른 약제학적 조성물 중, 환제 또는 정제는 씹을 수 있거나 혀 또는 구강의 타액에 노출되었을 때 용해된다. 다른 약제학적 조성물 중 캡슐은 액체 형태이다. 대표적인 액체 형태의 약제학적 조성물은 액제, 시럽제 또는 현탁제이다. 몇가지 약제학적 조성물 중 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드는 제어된 방출을 위해 제형화된다.
본원에서는 보우맨-버크(Bowman-Birk) 억제제, 접하된 보우맨-버크 억제제, 아프로티닌(aprotinin) 및 카모스타트(camostat)와 같은 단백질분해효소 억제제를 사용하지 않고 제조된 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에서는 보호적인 화합물 없이 제형화된 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 본원에서 기술된 임의의 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 또는 본원에서 기술된 임의의 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 치료용 폴리펩티드로 치료되어야 할 질환 또는 상태에 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서는 본원에서 기술된 임의의 약제학적 조성물의 투여를 통해 EPO가 매개된 질환의 증상을 보이거나, 그 질환 또는 상태에 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 그러한 약제학적 조성물은 서열번호 3에서 201 및 247에서 272에 제시된 아미노산 서열을 가지는 변형된 EPO 폴리펩티드를 포함한다. 경우에 따라서는, EPO가 매개된 질환 또는 상태는 활성형 EPO 폴리펩티드의 투여를 통해 치료된다. 일반적으로, 이 약제학적 조성물을 이용한 치료는 그 질환 또는 상태와 연관되어 있는 증상을 개선하거나 완화시킨다. 본원에서는 EPO가 매개된 질환이나 상태와 연관되어 있는 증상의 변화를 관찰하는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, EPO가 매개된 질환 또는 상태는 신부전, 후천성면역결핍증(AIDS), 악성종양 및 만성적인 염증에 의한 빈혈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료해야할 질환이 빈혈인 경우에는, 그 질환 또는 상태는 선척적이거나 후천적일 수 있다. 적혈구세포의 증식이 증가되는 것이 필요할 때는(예: 빈혈), 세포 분화를 촉진하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 투여한다.
한가지 예에서, EPO가 매개된 질환 또는 상태는 손상에 대한 보호 또는 반응하는 포유동물 세포, 조직 또는 기관에 대한 손상에 따른 기능의 회복을 위해 EPO 폴리펩티드의 조직 보호적인 활성을 이용하는 질병 또는 상태를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 그러한 질병이나 상태는 발작장애, 다발성 경화증, 뇌졸증, 저혈압, 심장마비, 허혈, 심근경색, 염증, 노화에 따른 인지기능의 소실, 방사선 손상, 뇌성마비, 퇴행성 신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 리씨 증후군(Leigh Disease), 후천성면역결핍증, 치매,기억상실, 근위측성 측삭경화증, 알콜중독, 기분장애, 불안장애, 집중력장애, 정신분열증, 자폐증, 크로이츠펠트 야곱병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈, 심장-폐 바이패쓰, 만성 두부 부전, 시력감퇴, 독소-유발성 신경장해, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막성 허혈, 또는 망막 외상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서는 변형된 EPO 폴리펩티드와 추가적인 인자를 투여하여 EPO가 매개된 질병이나 상태의 증상을 보이거나, 그 질병 또는 상태에 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서는 EPO가 매개된 질환 또는 상태의 치료를 위해 변형된 EPO 폴리펩티드와 하나 이상의 추가적인 인자의 복합제를 제공한다.
본원에서는 포장 재료와 포장재료에 본원에서 기술된 변형된 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물이 포함되어있는 제품이 제공되나, 이에 제한되지 않는다. 한 가지 예에서, 제품에 포장된 약제학적 조성물은 EPO가 매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적이며, 포장재료는 변형된 EPO가 EPO가 매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용됨을 나타내는 라벨을 포함한다.
본원에서는 본원에서 기술한 변형된 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드의 약제학적 조성물, 이것을 투여하기 위한 장치 및 투여를 위한 임의적인 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 본원에서는 변형된 치료용 폴리펩티드 및 EPO 폴리펩티드의 조성물의 용도 역시 제공한다. 그러한 용도는 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드로 치료할 필요가 있는 질환 또는 상태를 치료하는 것, 및 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 폴리펩티드로 치료할 필요가 있는 질병 또는 상태를 치료하기 위한 약제를 제형화하는 것을 포함한다.
본원에서는 증가된 단백질분해효소 저항성을 통해 증가된 단백질 안정성이 명백해지는 진화된 예정된 특성을 가지는 변형된 EPO 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 그러한 예에서, 진화된 EPO 폴리펩티드의 증가된 단백질 안정성은 펩티드의 1차 서열이 변형되어 그 특성을 수여하는 아미노산 변형에 기인한다. 경우에 따라서는, 그 방법은 변형된 EPO 폴리펩티드의 변경된 면역원성, 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화 또는 페길레이션에 기여하는 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형을 포함한다.
또한, 본원에서는 비-당화 또는 탈-당화된 치료용 폴리펩티드에서 노출되어 있는 단백질분해효소에 민감한 위치를 변형함으로서 완전히 당화된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 비-당화 또는 탈-당화된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.
개요
A. 정의
B. 에리스로포이에틴 (EPO)
C. EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 대표적 변형 방법
1. 비-제한 추론적 돌연변이유발 일차원적 (1D)-스캐닝
2. 2차원 (2D) 추론적 스캐닝 (제한된 추론적 돌연변이유발)
a. 인-실리코 HIT 의 동정
b. 치환할 아미노산의 동정
c. 돌연변이 단백질의 제조 및 생물학적 검정
3. 3차원적 (3D) 스캐닝
a. 상동성
b. 3D-스캐닝 (구조적 상동성) 방법
4. 슈퍼-LEAD 및 부가적 방향성 돌연변이유발 (additive directional mutagenesis, ADM)
5. 다중-중복된 프라이머 신장
D. 증가된 단백질 안정성을 보이는 변형된 EPO 폴리펩티드
1. 단백질분해효소 저항성
a. 세린 단백질분해효소
b. 매트릭스 메탈로프로티나제
c. 단백질분해 위치의 제거에 의해 증가된 단백질분해 저항성
d. 증가된 단백질분해 저항성을 보이는 변형된 EPO 폴리펩티드
e. 단백질분해에 증가된 저항성을 가지는 EPO 변이들의 평가
2. 슈퍼-LEAD
3. 다른 EPO 변형
a. 면역원성
b. 당화
c. 부가적인 변형들
E. 증가된 단백질분해효소 저항성을 위한 당화된 치료용 폴리펩티드의 비당화 혹은 부분-당화된 형태의 변형
1. 단백질분해효소 민감성 위치의 변형
2. 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드의 제작
3. 변형을 위한 당화된 치료용 폴리펩티드의 예시
4. 기타 변형
a. 용해성을 향상시키기 위한 변형
5. 표적화된 변형에 의해 부분-당화 또는 비-당화된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 방법
a. 탈-당화에 의해 노출된 단백질분해효소 민감성 위치의 표적화된 변형
F. EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 생산
1. 발현 시스템
a. 원핵세포 발현
b. 효모
c. 곤충 및 곤충 세포
d. 포유동물 세포
e. 식물
2. 정제
3. 융합 단백질
4. 폴리펩티드 변형
5. 뉴클레오티드 서열
G. 변형된 EPO 폴리펩티드의 특성 및 활성의 평가
1. 시험관내 분석
2. 비-인간 동물 모델
3. 임상 분석
H. 제형/포장/투여
1. 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 투여
2. 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 투여 (유전자치료)
I. 치료학적 용도
1. 빈혈증
2. 조직 보호적인 치료
J. 진단적 용도
K. 병용 치료법
L. 제품 및 키트
M. 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드에 대한 항체
N. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학용어는 본 발명(들)이 속하는 당업계의 숙련자가 통상적으로 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 전체에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 공보, GenBank 서열, 웹사이트 및 다른 공개된 자료는, 달리 언급되지 않으면, 그 전문이 참조로서 인용된다. 본원의 용어에 대한 다수의 정의가 있는 경우에는 이 섹션에 있는 정의가 우선한다. URL 또는 다른 이러한 식별자 또는 어드레스를 참조한 경우, 이러한 식별자가 변경될 수 있고 인터넷 상의 특정 정보가 달라질 수 있지만, 인터넷 또는 다른 정보원을 검색하여 동등한 정보를 찾을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이를 참조하는 것은 이러한 정보의 입수용이성 및 대중적 보급성을 증명한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료용 폴리펩티드"는 질병이나 장애의 치료를 위해 인간과 같은 동물에 투여하는 폴리펩티드이다. 치료용 폴리펩티드는 당업계에 알려진 바와 같이 통상적으로 사이토카인(예: 에리스로포이에틴)과 같이 생체내에서 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 그러한 폴리펩티드는 어떠한 방법으로도 만들어 질 수 있으며 따라서 재조합에 의해 생산되거나 합성에 의해 생산되거나 세포 또는 조직 그리고 다른 공급원들로부터 추출한 치료용 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
어떠한 공급원들로부터 정제되었거나 생산되었거나, 성숙한 치료용 폴리펩티드는 길이에 있어서 불균일할 수 있다. 치료용 폴리펩티드의 불균일성은 치료용 폴리펩티드의 공급원에 따라서 다를 수 있다. 따라서 치료용 폴리펩티드에 대한 언급은 생산되거나 또는 정제된 불균일한 집합체를 의미한다. 균일한 시료가 의도된 때에는 그렇게 명기될 것이다. 본원에서 사용하는 치료용 폴리펩티드의 표준물질들은 그들의 단량체, 이량체 또는 기타 적절한 다중체를 의미한다.
인간 치료용 폴리펩티드는 대립유전자형 변이체 동종형, 암호화하는 핵산분자로부터 생산된 합성분자, 인간의 조직과 세포로부터 정제된 단백질, 합성 단백질 그리고 그것들의 변형된 형태들을 포함한다. 대표적인 비변형된 성숙한 인간 치료용 폴리펩티드에는, 비변형되고 천연의(즉 야생형) 치료 폴리펩티드, 신호 펩티드 및/또는 프로펩티드를 포함하는 비변형 및 천연 전구체 치료용 폴리펩티드, 및 다형의(polymorphic) 천연 치료용 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 기타 예시적인 인간 치료용 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단이 절단된 것들이다.
치료용 폴리펩티드를 언급하는 것에는 또한 치료용 폴리펩티드의 대립유전자형 또는 종간 변이체들, 및 그것들의 절단형 내지 단편들, 그리고 단백질분해효소 저항성을 향상시키는 변이에 추가적인 변형을 포함하는 형태들을 포함한다. 치료용 폴리펩티드는 인간과 다른 포유동물들과 같은 비-인간 동물종들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 동물들을 포함하는 다른 종들로부터 유래한 상동성 폴리펩티드를 포함한다. 인간 치료용 폴리펩티드의 경우와 마찬가지로, 비-인간 치료용 폴리펩티드 또한 완전한 길이의 성숙한 폴리펩티드의 최소한 한가지 활성을 지니는 적당한 영역을 포함하거나 충분한 길이를 가지는 치료용 폴리펩티드의 불균일한 길이, 단편 또는 부분들을 포함한다.
비-인간 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드, 대립유전자형 변이체 동종형, 뉴클레오티드로부터 준비한 합성분자, 비-인간 조직 또는 세포로부터 정제된 단백질 그리고 그러한 것들의 변형된 형태들을 표함한다. 인간으로부터 유래되지 않은 치료용 폴리펩티드는 소, 양, 돼지, 말, 생쥐, 토끼, 개, 고양이, 조류 그리고 침팬지나 짧은 꼬리 원숭이와 같은 기타 영장류를 포함하지만 제한되지는 않는 공급원으로부터 유래한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연형 치료용 폴리펩티드"는 인간 또는 기타 동물들을 포함하는 자연에 있는 생물체에 존재하며 자연적으로 발생하는 유전자에 의해 암호화되는 치료용 폴리펩티드를 의미한다. 천연형 치료용 폴리펩티드 중에는 암호화된 전구체 폴리펩티드, 그것들의 단편, 번역 전-이나 번역 후-수식 뿐만 아니라 신호서열이 제거된 성숙한 형태와 같은 가공된 형태들 또는 그것들의 변형된 형태들을 포함한다. 천연형 치료용 폴리펩티드들에 또한 포함된 것들에는, 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 및 인산화에 의한 변형을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 번역 후 변형된 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 비-당화된 폴리펩티드는 당화가 없는 폴리펩티드이다(다시 말해, 해당 단백질 내의 당화 위치에 붙은 탄수화물 잔기를 가지고 있지 않은 것이다). 그러한 비-당화된 폴리펩티드는 폴리펩티드를 당화시키지 않는 원핵생물 숙주와 같은 숙주에서의 발현에 의해서 생산되거나 모든 당화 위치를 제거(예를 들면, 당화 위치의 돌연변이) 함으로써 생산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 당화 위치는 탄수화물 잔기가 부착할 수 있는 폴리펩티드내의 아미노산 위치를 의미한다. 통상적으로, 당화된 단백질은 아스파라긴이나 세린과 같은 탄수화물 잔기의 부착을 위한 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 완전히 당화된 폴리펩티드는 해당 폴리펩티드 내의 모든 천연형 당화 위치가 당화된 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 탈-당화된 폴리펩티드는 그것이 돌연변이에 의해 최대로는 모든 당화 위치들이 제거되어 폴리펩티드에 부착된 탄수화물 잔기를 보다 덜 가지고 있기 때문에 천연형 당화 단백질과 비교하여 줄어든 당사슬을 가지고 있다. 탈당화된 폴리펩티드는 또한 화학적 또는 효소적인 분해에 의해 제거되거나 또는 부분적으로 제거된 하나 이상의 탄수화물 잔기들을 가진 폴리펩티드들을 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 천연형 당화 위치는 천연형 폴리펩티드가 야생에서 만들어졌을 때 그 천연형 폴리펩티드에 탄수화물 잔기가 부착된 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연형 폴리펩티드"는 인간이나 기타 동물들을 포함하는 자연에 있는 생물체에 존재하는 유전자로부터 자연적으로 만들어지는 유전자에 의해 암호화 되는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "같은 조건에서 생산된"의 의미는 각각의 폴리펩티드를 만들어내기 위해 같은 생산 방법을 사용하여 2개 이상의 폴리펩티드를 생산하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "에리스로포이에틴" 폴리펩티드 (본원에서 또한 EPO 라고도 언급된)는 어떠한 에리스로포이에틴 폴리펩티드도 의미하며 재조합 방법으로 만들어진 폴리펩티드, 합성적으로 만들어진 폴리펩티드, 천연형 EPO 폴리펩티드 그리고 세포나 조직으로부터 추출된 에리스로포이에틴 폴리펩티드를 포함하지만, 여기에 제한되지는 않는다. 여기서 조직은 비장, 간, 뇨 및 혈액을 포함하지만, 여기에 제한되지는 않는다. 에리스로포이에틴과 상호교환적으로 사용되는 대체 이름은 에포이에틴(epoietin)을 포함한다. 에리스로포이에틴에 대한 줄임말은 EPO, hEPO (인간 에리스로포이에틴) 그리고 rhuEPO (재조합 인간 에리스로포이에틴)을 포함한다.
에리스로포이에틴은 다른 종으로부터 유래한 관련된 폴리펩티드를 포함하며 다른 종은 인간과 비-인간 유래를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 인간 에리스로포이에틴(hEPO)은 에리스로포이에틴, 대립유전자형 변이체 동종형, 핵산으로부터 유래된 합성분자, 인간 조직 및 세포로부터 정제된 단백질 그리고 그것들의 변형된 형태들을 포함한다. 변형된 성숙한 인간 에리스로포이에틴 폴리펩티들의 예시는 비변형된 그리고 천연형의 에리스로포이에틴 폴리펩티드 (서열번호 2 또는 237로 기재된 서열을 포함하는 폴리펩티드 등)와 신호서열을 포함하는 비변형된 그리고 천연형 전구체 에리스로포이에틴 폴리펩티드(예: 서열번호 1번으로 기재된 전구체 EPO 폴리펩티드)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 숙련된 당업자들은 성숙한 에리스로포이에틴 폴리펩티드(서열번호 2)의 기재된 위치들이, 신호 펩티드 서열을 가지고 있는 에리스로포이에틴 폴리펩티드인 전구체 EPO폴리펩티드(서열번호 1)와 비교했을 때 27개 아미노산 잔기의 차이가 있음을 인식할 것이다. 그러므로, 서열번호 2번의 첫번째 아미노산 잔기는 서열번호 1번의 28번째 아미노산 잔기에 "상응한다". "에리스로포이에틴" 라는 용어는 또한 C-말단의 아르기닌 아미노산 잔기가 단백질 분해에 의해 절단된 성숙한 EPO 폴리펩티드(서열번호 2)로부터 또는, C-말단 아르기닌이 제거된 재조합 EPO 폴리펩티드(서열번호 236번(전구체)과 237번(성숙체)로 기재)로부터 생산된 에리스로포이에틴 폴리펩티드를 또한 포함한다.
본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드는 화학적 변형이나 번역-후 변형 등에 의해 추가적으로 변형될 수 있다. 그러한 변형은 페길레이션, 알부민화, 당화, 파니실화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화, 인산화, 그리고 당업계에 알려진 기타 폴리펩티드 변형들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산의 제거, 추가 또는 치환에 의해 그 1차 아미노산 서열이 변형됨으로써 추가적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 에리스로포이에틴은 인간과 비인간 종들을 포함하는 어느 종으로부터 유래한 에리스로포이에틴도 포함한다. 비인간 유래의 EPO폴리펩티드는 쥐, 개, 고양이, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, ranine 및 다른 영장류 EPO 폴리펩티드들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 비인간 유래의 예시적인 EPO 폴리펩티드는 예를 들면, 짧은 꼬리 원숭이(Macaca mulatta, e.g., 서열번호 202), 생쥐(Mus musculus, e.g., 서열번호 203), 래트(Rattus norvegicus, e.g., 서열번호 204), 돼지(Sus scrofa, e.g., 서열번호 205), 개(Canis familiaris, e.g., 서열번호 206), 고양이(Felis catus, e.g., 서열번호 207), 토끼(Oryctolagus cuniculus , e.g., 서열번호 208), 황소(Bos taurus , e.g., 서열번호 209), 말(Equus caballus, e.g., 서열번호 210), 양(Ovis aries, e.g., 서열번호 211), 침팬지(Pan troglodytes, e.g., 서열번호 212), 제브라 피쉬(Danio rerio, e.g., 서열번호 213), 일본 복어(Takifugu rubripes, e.g., 서열번호 214), 오랑우탄(Pongo pygmaeus, e.g., 서열번호 225), 고릴라(Gorilla gorilla, e.g., 서열번호 226) 기타(e.g., 서열번호 215-224)를 포함한다.
통상적으로 인간 EPO 폴리펩티드의 종 변이체들은 인간 EPO 폴리펩티드와 비교했을 때 최소한 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 갖는다.
인간 및 비인간 EPO 폴리펩티드는 EPO 폴리펩티드, 대립유전자형 변이체 동종형, 조직-특이적인 동종형 그리고 그것들의 대립유전자형 변이체들, 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 치환, 결실, 삽입, 또는 추가를 가진 합성 변이체들, 핵산을 번역함으로써 제조된 합성분자들, 인간 및 비인간 조직과 세포로부터 추출한 단백질들, 키메라 EPO 폴리펩티드 및 그것의 변형된 형태들을 포함한다.
인간 및 비인간 EPO는 또한 충분한 길이이거나 완전한 길이의 성숙한 폴리펩티드의 최소한 한가지 활성을 유지하는 적절한 부위를 포함하는 EPO의 단편들 또는 부분들을 포함한다. 추가적으로, 본원에서 사용되는 바와 같이, 제공되는 변형된 EPO 폴리펩티드의 단편들 또는 부분들은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 변형을 구성한다(예: 표3에 기재된 아미노산 변형들).
본원에서 사용되는 바와 같이, "성숙한 에리스로포이에틴"은 신호서열이 없는 EPO 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 신호서열들은 소포체-골지체 경로를 따라 단백질이 분비되도록 보내주고 번역되는 동안 소포체 안으로 들어간 뒤에 잘려지게 된다. 따라서, 성숙한 EPO 폴리펩티드는 일반적으로 분비된 단백질이며, 한 실시예에서, 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드는 서열번호 2번으로 기재되어 있다. 서열번호 2번에 기재된 아미노산 서열은 서열번호 2번은 서열번호 1번의 1번부터 28번까지의 잔기들을 포함하는 신호서열을 가지고 있지 않은 점에서 서열번호 번호 1번으로 기재된 전구체 폴리펩티드 서열과 상이하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연형 에리스로포이에틴"은 인간 또는 다른 동물을 포함하는 자연계내의 생물체에 존재하는 자연적으로 발생되는 EPO 유전자로부터 유전자로부터 암호화되어 있는 EPO 폴리펩티드를 의미한다. 천연형 EPO 폴리펩티드중에는 암호화된 전구체 폴리펩티드, 그것들의 단편들, 그리고 그것들의 어떠한 번역 전, 또는 번역 후 가공된 것뿐 아니라 신호 펩티드가 제거된 성숙한 형태 등의 가공된 형태들, 또는 그것들의 변형된 형태들을 포함한다. 예를 들어, 인간은 EPO를 발현한다.
천연형 인간 EPO 서열의 대표적인 예시는 서열번호 1번(신호펩티드가 있는 전구체 EPO)과 서열번호 2번(신호펩티드가 없는 성숙한 EPO)에 기재되어 있다. 천연형 EPO 폴리펩티드 중에는 번역후 변형된 것으로서 이것은 당화, 카르복실화, 수산화, 해실화, 카르바밀화, 황화 및 인산화에 의한 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 천연형 EPO 폴리펩티드는 또한 서열번호 2의 R166 위치가 단백질 분해반응에 의해 잘려진 것을 포함한다. 다른 동물들도 천연형 EPO를 생산하며 이 동물들에는 영장류, 생쥐, 래트, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 닭, 소, 양, 개구리 및 물고기를 포함하지만 이에 제한된 것은 아니다. 대표적인 다른 동물들로부터 유래한 천연형 EPO서열의 예시는 서열번호 202-226에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질분해효소 저항성 폴리펩티드"는 천연형 또는 야생형 폴리펩티드에 비하여 그것의 아미노산 일차서열에 하나 이상의 변형을 가지고 있으면서, 하나 이상의 아미노산 변형이 없는 천연형 또는 야생형의 폴리펩티드에 비해 단백질분해에 대해 증가된 저항성을 보이는 단백질이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 1차 구조에서의 변화에 의해 단백질분해효소 저항성있는 변형된 폴리펩티드는, 그 폴리펩티드의 1차 서열상의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변형되어 단백질분해효소 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 의미한다.
이러한 것들 중에는 그 위치의 번역 후 변형에 변화를 가져오지 않는 변화들도 있다.
단백질분해효소에 대한 증가된 저항성은 위장관 내 및/또는 혈청내에 존재하는 특정한 단백질분해효소에 노출시킨 뒤 활성을 평가함으로써 분석할 수 있다. 통상적으로 단백질분해효소 저항성의 향상은 그 저항성을 부여하는 아미노산 서열상의 변화가 없는 같은 폴리펩티드와 비교했을 때 적어도 최소한 약 1%, 2%, 3%, 4%,5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상이다.
다른 예에서, 본원에서 제공된 경구형 제제로 사용하기 위한 변이체 폴리펩티드의 단백질분해효소에 대한 저항성은, 그 저항성을 부여하는 아미노산 서열상의 변화가 없는 같은 폴리펩티드와 비교했을 때 최소한 , 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배 또는 그 이상의 양으로 증가되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질분해에 대한 저항성"은 단백질분해효소와 같은 단백질분해성 물질에 의한 폴리펩티드의 감소 정도를 의미한다. 이것은 특정 단백질분해효소에 의해 절단되기 쉬운 폴리펩티드에서의 특정 아미노산 잔기를 동일한 단백질분해효소에 의하여 같은 조건하에서 변형되지 않은 폴리펩티드의 절단에 비하여, 절단에 덜 용이하도록 변형시킴으로서 달성될 수 있다. 단백질분해에 증가된 저항성을 보이는 변형된 폴리펩티드는, 그 아미노산 변형(들)이 없는 같은 폴리펩티드와 비교했을 때, 예를 들면, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 단백질분해에 대한 저항성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질분해효소(프로테아제)" "프로티나제" 또는 "펩티다제"들은 공유결합성 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어 단백질분해효소는 세린프로테아제와 매트릭스 메탈로프로티나제를 포함한다. 세린 프로테아제 또는 세린 엔도펩티다제는 그 효소의 활성 중심에 세린 잔기가 존재하는 것으로 특징지어지는 한 분류의 펩티다제를 구성한다. 세린 프로테아제는 혈액응고, 염증반응뿐만 아니라 원핵생물 및 진핵생물에서의 소화효소를 포함하는, 체내에서 넓은 영역의 기능에 관여한다. "세린 프로테아제"에 의한 절단의 작용기전은 세린에 의한 표적화된 펩티드 결합의 친전자성 공격에 기반을 두고 있다. 시스테인, 트레오닌, 또는 아스파테이트와 결합한 물분자 또는 금속들 또한 이러한 역할을 수행할 수 있다. 세린, 히스티딘, 아스파테이트의 잔기들의 배열된 측쇄는 대부분의 세린 프로테아제에서 일반적인 촉매 3중체(catalytic triad)를 형성한다. 세린 프로테아제의 활성위치는 폴리펩티드 기질이 결합하는 틈 모양으로 생겼다. 아미노산 잔기들은 폴리펩티드 기질의 N 말단에서 C말단 방향으로 표기되어 있다(Pi, ..., P3, P2, P1, P1', P2', P3', ..., Pj). 각각의 결합의 sub-site는 (Si,..., S3, S2, S1, S1', S2', S3',..., Sj)으로 표기되어 있다. 절단은 P1과 P1' 사이의 위치에서 촉매된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 세포외 기질 (ECM) 구성물들을 분해하는 아연과 같은 금속 의존적인 엔도펩티다제의 군의 어느 하나를 의미한다. MMP는 4개의 클래스를 포함한다: 콜라게나제, 스트로멜리신, 막-타입 메탈로프로티나제 및 젤라티나제이다. MMP들의 단백질 분해 활성과 플라스미노겐 활성인자들과 그것의 저해제들은 ECM의 온전성을 유지하는데 중요하다. 세포와 ECM의 상호작용은 다양한 종류의 세포들의 증식, 분화, 흡착 그리고 이동을 포함하는 광범위의 과정들에 영향을 미치고 매개한다.
MMP들은 또한 다수의 세포표면 사이토카인, 수용체 그리고 다른 수용성 단백질들을 처리하며 상처치유, 임신 그리고 혈관신생과 같은 조직 리모델링 과정에도 관련되어 있다. 생체내의 생리적인 조건하에서 MMP들은 불활성형태의 전구체(자이모겐)으로서 합성되고, 절단되어 활성형태로 생산된다. 추가적으로, 그 효소들은 매트릭스 메탈로프로테아제 조직 억제제(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs))라 불리는 내재적인 저해제에 의해 특이적으로 조절된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상응하는 잔기"들은 대립유전자형 변이체 또는 종간 변이체들 또는 다른 동종형인 폴리펩티드들 사이에 비교되는 잔기들을 의미한다. 당업계의 숙련자는 그러한 폴리펩티드들 중에서 상응하는 잔기들을 쉽게 파악해 낼 수 있다. 예를 들어 당업계 숙련자는 보존적이고 동일한 아미노산 잔기들을 가이드로 사용하여 EPO 폴리펩티드의 서열을 정렬함으로써 상응하는 잔기들을 동정해 낼 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2번 (성숙한 에리스로포이에틴)의 A1은 서열번호 1번(신호펩티드 서열을 가지고 있는 전구체 에리스로포이에틴)의 A28에 상응한다. 또 다른 예로서, 상응하는 부위(region)들이 동정될 수 있다. 당업계 종사자는 또한 보존된 아미노산 잔기들을 가이드로서 이용하여 인간과 비인간 서열들 사이에서 상응하는 아미노산 잔기들을 찾아낼 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1번의 전구체 인간 EPO에 있는 P148 잔기는 서열번호 203번의 전구체 생쥐 EPO의 P147에 상응한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 에리스로포이에틴(EPO)폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 "활성 부분 또는 단편"은 본원에서 제공하는 최소한 한 개 이상의 변형을 포함하며 완전한 길이의 폴리펩티드의 하나 내지 그 이상의 활성 또는 또다른 활성을 나타내는 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 예를 들어, EPO 폴리펩티드의 경우, 그러한 활성들은 적혈구 생성 또는 조직 보호적인 활성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 활성은 완전한 길이의 폴리펩티드의 활성의 어떤 백분율이(이상 또는 이하) 될 수 있으며, 완전한 길이의 활성에 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 활성을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니나, 그러한 활성들은 실험적으로 결정될 수 있다. EPO폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 변형된 형태의 기능이나 활성을 결정하는 검정법들은 당업계 숙련자들에게 잘 알려진 방법들을 포함하며, 예시적인 검정법들이 본원에 포함된다. EPO 폴리펩티드에 대한 검정법은 예들 들어, 적혈구세포, 증식 분석법, 세포생존 분석법 또는 치료효과를 측정하기 위한 임상적 검정법들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 활성은 또한 완전한 길이의 폴리펩티드나 변형되지 않은 EPO 폴리펩티드가 가지고 있지 않은 EPO 폴리펩티드의 단편 또는 변형된 형태의 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 활성을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비변형된 타겟 단백질," "비변형된 단백질," "비변형된 폴리펩티드," "비변형된 EPO," "비변형된 치료용 폴리펩티드" 그리고 그것들의 문법적인 변이들은 본원에서 제공된 변형을 위해 선택되어진 개시폴리펩티드를 의미한다. 개시 표적 폴리펩티드는 자연적으로 발생할 수 있으며 폴리펩티드의 야생형 형태이다. 추가적으로, 개시 표적 폴리펩티드는 변형되거나 돌연변이체가 될 수 있으며 천연형(야생형)의 동종형과는 다르지만 그럼에도 불구하고 본원에서 추가적으로 변형된 폴리펩티드에 대해 상대적인 개념으로 본원에서는 개시 비변형된 표적 단백질이라고 언급한다. 그러므로 비변형된 표준단백질들에 비해 특정한 활성 또는 특성이 의도적으로 증가 또는 감소된 당 업계에 알려진 존재하는 단백질들은 개시 비변형된 표적 단백질로 선택되고 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단일 아미노산 변화로 그것의 천연형으로부터 변형되고 증가 또는 감소한 의도된 특성(예: 감소된 면역원성)을 갖거나 (미국 등록 특허 제 2004-0063917호, 제 2005-0220800호, 제2006-035322호, 그리고 제2006-0073563호 참조), 또는 당화를 변경하는 하나의 아미노산 잔기 또는 잔기들에서 변화를 갖는 단백질이 동일하거나 상이한 특성의 추가적 변형을 위한 (본원에서 비변형된 것으로서 언급되는) 표적 단백질일 수 있다. 당업계에 알려진 예시적인 변형된 EPO 폴리펩티드는 예를 들면 미국특허번호. 제4,703,008호, 제4,835,260호, 제5,457,089호, 제5,614,184호, 제5,856,298호, 제6,831,060호, 제6,555,343호, 제6,831,060호, 그리고 제7,041,794호 미국특허 공개번호 제2004-0063917호, 제2005-0107591호, 제2005-0176627호, 제2006-029094호, 그리고 제2006-0008872호 그리고 국제특허 공개 번호WO8603520, EP0640619, WO04003176, EP1228214, WO05103076, WO9424160 WO9012874에서 기술되고 있는 어떠한 EPO 폴리펩티드도 포함한다.
비변형되거나 표준 단백질과 비교하여 특정 생물학적 활성 또는 특성에서 이 증가 또는 감소와 같은 바람직한 변형을 갖도록 변형된 종래당 업계에 알려진 단백질들을 본원에서 구조적 동종인 위치나 다른 구조적 동종인 표적 단백질을 제공하는데 선택하거나 이용하였다. 예를 들어, 하나 이상의 단일 아미노산 치환에 의해 변형하고 의도된 특성 또는 활성(예: 단백질분해에 대한 저항성)증가 또는 감소된 단백질은, 적당한 치환 아미노산으로 치환되고 의도된 활성이 증가 또는 감소하였는지를 시험해 볼 수 있는 구조적으로 상동적인 위치에 상응하는, 구조적으로 상동인 표적 단백질을 동정하는데 본원에서 제공된 방법들로 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 "활성" 또는 "기능적인 활성"은 해당 폴리펩티드에 의해 나타나는 어떠한 활성을 의미한다. 그러한 활성들은 실험적으로 결정될 수 있다. EPO 폴리펩티드의 경우에는 그러한 활성들은 적혈구 생성 또는 조직 보호적인 활성을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 활성은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 인식되어진 검정법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, EPO 폴리펩티드의 경우에, 시험관 내 또는 생체 내에서 적혈구의 세포증식을 측정함으로써 활성을 평가할 수 있다. 폴리펩티드의 활성을 나타내는 그러한 검정법의 결과들은 생체내에서의 그 폴리펩티드의 활성에 관련될 수 있으며 생체내 활성은 치료 활성 또는 생물학적 활성을 의미할 수 있다. 변형된 폴리펩티드의 활성은 비 변형된 폴리펩티드의 어느 수준의 활성의 백분율일 수도 있으며 비변형된 폴리펩티드의 활성과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 활성이 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. EPO의 변형된 형태의 기능성 또는 활성 결정 분석법은 당업계에 공지되어 있다. EPO 폴리펩티드의 활성 측정의 대표적 분석은 적혈구 증식을 측정하고 실시예에 기술된 적혈구생성 분석을 포함한다.
본원에서 사용된 "치료 활성"은 치료용 폴리펩티드의 생체내 활성을 의미한다. 일반적으로, 치료 활성은 질병이나 상태를 치료하는데 사용되는 활성이다. 변형된 폴리펩티드의 치료용 활성은 비변형 폴리펩티드와 비교하여 비형된 치료 활성 대비 백분율 수준으로 나타낼 수 있으며 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상이 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료용 활성을 위해 당화가 필요하다" 거나 "치료용 활성을 위해 중요하다"는 것은 그 폴리펩티드의 당화된 형태가 치료용 폴리펩티드의 탈당화된 또는 비당화된 형태(다시 말해, 박테리아 숙주에서 발현된 폴리펩티드와 같이 당화되지 않은 형태의 폴리펩티드)보다 높은 치료용 활성(투여 했을 시 생체내 활성)을 가진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 만약에 당화된 폴리펩티드의 치료용 활성이 비 당화된 형태(특히, 치료적으로 사용되지 못할 때)에 비해 치료용 활성이 높다면 당화는 치료용 활성을 위해 필요하다. 그러한 활성의 차이는 해당 단백질에 의존적이지만, 당 업계에 숙련자는 특정한 단백질이 치료용 용도를 위해 적합한지 인식할 수 있다. 그러한 단백질의 대표적인 예시가 에리스로포이에틴 (EPO)로서 이것은 당화된 단백질이며 당화된 단백질로서 치료용으로 투여된다. 당화된 형태의 치료용 단백질과 당화되지 않은 형태 사이의 활성에서의 차이는 상기 기술한 바와 같이 해당 단백질에 의존적이지만 15%, 25%, 30%, 50%, 100%, 그 이상일 수 있고, 탈당화 또는 비당화된 형태의 치료용 폴리펩티드의 치료용 활성보다 최소한 또는 대략 1배, 최소한 또는 대략 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 또는 그 이상의 배수로 더 높은 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "최소한 하나의 활성을 보이는" 또는 "최소한 하나의 활성을 유지하는"은 변형을 포함하지 않는 폴리펩티드에 비교하여, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드와 같은 변형된 폴리펩티드에 의해서 보여지는 활성을 의미한다.
비변형된 폴리펩티드의 활성을 유지하고 있는 변형된 폴리펩티드는 증가된 활성 또는 유지된 활성(예: EPO 폴리펩티드에 대해 적혈구세포 생성 촉진 또는 조직 보호 효과)을 보일 수 있다. 일부 예에서는 변형된 폴리펩티드가 비변형된 폴리펩티드에 비교하여 증가된 활성을 유지할 수 있다. 일부 경우에는 변형된 폴리펩티드가 비변형된 폴리펩티드에 비교해서 감소된 활성을 가질 수 있다. 변형된 폴리펩티드의 활성은 비변형된 폴리펩티드에 비교했을 때 비변형된 폴리펩티드의 활성에 대비한 백분율 수준으로서 어떠한 수준도 가질 수 있으며 그 활성의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상을 포함하지만, 이에 제한적이지만은 않다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드의 활성에 비해 최소한 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%,8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 최소한 99%의 활성을 유지한다. 다른 예에서는, 활성의 변화는 최소한 약 비변형된 폴리펩티드에 비해 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배 또는 그 이상으로 높다.
활성 유지를 위한 검정법은 유지되어야 하는 활성에 의존적이다. 그러한 검정법들은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 활성은 예를 들어, 당업계에 알려진 검정법을 이용하고 세포증식 및 세포생존 활성 측정법 등의 하기 실시예에 기술된 방법에 따라 측정될 수도 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 비변형된 폴리펩티드에 비해변형된 폴리펩티드의 활성은 또한 생체내 치료용 또는 생물학적인 활성 또는 해당 폴리펩티드를 투여한 후의 결과에 따라 분석될 수도 있다. 예를 들어, EPO 폴리펩티드의 경우에는, 그러한 활성들은 혈구 수치의 변화, 망상적혈구 수치, 적혈구 매스, 혈장내 철 전환율, 골수 전이 시간 또는 헤모글로빈 농도(헤모글로빈 C 합성 촉진) 또는 망상적혈구 반응의 자극 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 에리스로포이에틴 폴리펩타이드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 "특성"이란 에리스로포이에틴 폴리펩타이드 또는 치료용 폴리펩타이드에 의해서 나타내어지는 어떠한 특성을 의미한다. 그러한 특성으로는 단백질 안정성, 단백질분해에 대한 저항성, 구조적인 안정성, 열역학적인 내성, 그리고 pH 조건에 대한 내성 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 특성의 변화들은 해당 폴리펩티드의 "활성"을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소에 대한 저항성의 변화는 생체내 치료용 폴리펩티드를 바꿀 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질 안정성"은 단백질분해효소에 노출, 상승된 온도, 특정 pH 조건 및/또는 변성 성분들에 대한 노출을 포함하지만 이에 제한적이지만은 않은 하나 이상의 조건하에서 단백질 반감기가 증가된 것을 의미한다. 폴리펩티드에 의해 나타내어지는 증가된 단백질 안정성은 증가된 단백질분해효소 저항성, 또는 온도, pH, 변성성분 등에 대한증가된 저항성 등의 증가한 구조적인 안정성에 의해 명백해질 수 있다.
시험관 내에서 또는 생체내에서 증가한 단백질 안정성을 보여주는 변형된 폴리펩티드는 예를 들어, 비변형된 폴리펩티드에 비해1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상으로 안정하다.
폴리펩티드의 단백질안정성은, 예를 들면, 단백질분해효소 저항성 또는 구조적인 안정성 (다시 말해, 온도 변화에 따른 저항성)의 검정법으로 평가될 수 있으며 하기의 실시예에서 기술된 바와 같이 해당 폴리펩티드의 활성이 바뀌었는지로 결정할 수 있다. 예를 들면, 야생형 폴리펩티드에 비교하여 변형된 폴리펩티드의 단백질분해효소(예: 알파-키모트립신, 카르복시펩티다제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 및 트립신)에 의한 효소적 절단에 대한 저항성은, 해당폴리펩티드를 단백질분해효소와 함께 처리하여 시간에 따라 남아있는 기능적인 활성(예: 적혈구 생성 또는 조직 보호적인 활성 등)을 시험함으로써 실험적으로 시험될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혈청 안정성"이란 혈청내에서의 단백질 안정성을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질분해에 대한 저항성"이란 단백질분해효소와 같은 단백질 분해성 물질에 의해 폴리펩티드의 절단이 감소되는 어떠한 정도를 의미한다. 이것은 특정한 단백질분해효소에 의해 절단되기 쉬운 특정 아미노산 잔기를 변경함으로써 같은 조건에서 같은 단백질분해효소에 의한 절단에 비교하여 절단되는 정도를 덜 민감하게 함으로써 달성될 수 있다. 단백질분해에 대한 증가한 저항성을 보이는 변형된 폴리펩티드들은 비변형된 폴리펩티드에 비해 단백질 분해의 저항성이, 예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상인 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질분해효소에 민감한 위치"란 특정한 단백질분해효소에 의하여 절단되기 쉬운 폴리펩티드 내에서의 아미노산의 위치를 의미한다. 단백질분해효소에 민감한 위치는 본원에서 단백질분해효소 인식위치 또는 단백질분해효소 절단위치와 함께 혼용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "구조적 안정성"이란 변성에 대한 폴리펩티드의 어떠한 크기의 증가된 저항성도 의미한다. 이것은 변성 조건에 취약한 특정 아미노산 잔기를 변경함으로서 같은 조건하에서 변성에 보다 덜 취약하게 만들어 줌으로써 달성될 수 있다. 구조적 안정성은 폴리펩티드의 온도 또는 pH에 대한 저항성과 같은 변성조건에 대한 저항성 또는 감수성을 평가함으로써 결정할 수 있다. 증가된 구조적 안전성을 발현하는 변형된 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드에 비교하여 예를 들면, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 변성에 대한 저항성을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변성"이란 단백질의 구조에 있어서 비공유성인 어떠한 변화도 의미한다. 이 변화는 해당 폴리펩티드 분자의 2차, 3차, 및/또는 4차 구조를 변경할 수 있다. 폴리펩티드의 변성은 예를 들면 우레아 및 구아니딘 히드로클로리드와 같은 캐이오트로픽(chaotropic) 물질, 세제, 온도, pH, 및 디티오트레이톨(dithiothreitol) 또는 디티오트레이톨과 같은 이황화 결합을 절단하는 시약들에 대한 노출에 의해 야기될 수 있지만, 이에 제한적이지만은 않다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "열역학적인 내성"이란 단백질 안정성의 변화에 디%더 온도에 영향을 받거나 의존적인 어떠한 것도 의미한다. 예를 들어, 증가한 온도 내성과 같은 변화는 같은 조건하에서 변경된 (특히 증가한) 온도에 노출된 후에 폴리펩티드의 변성이 감소된양으로 반영될 수 있다. 증가한 온도 내성을 나타내는 변형된 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드에 비교하여 다양한 온도하에서 예를 들면, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 안정성을 가진다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드에 비하여 대상체에 투여했을 때 증가한 생체내의 온도 내성을 보일 수 있으며, 이로 인해 증가된 혈청내 반감기를 보여준다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "EC50"란 최대 반응의 1/2를 나타내는데 필요한 치료용 폴리펩티드의 효과적인 농도를 의미한다. 본원의 목적상, 측정되는 반응은 EPO폴리펩티드의 임의의 활성으로, 여기에는 에리스로포이에틱 검정법, 또는 조직 보호 검정법에서의 활성 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "반감기"란 폴리펩티드 분자의 효능, 활성, 및 유효 농도와 같은 측정되어진 상수에 대해 요구되는 그것의 최초의 수준에서 절반으로 떨어지는데 필요한 시간을 의미한다. 이는 0시간에서의 그것의 원래 효능 또는 효과 농도의 1/2을 의미한다. 그러므로 폴리펩티드 분자의 효능, 활성 또는 유효농도와 같은 상수들은 시간에 따라 측정되어진다. 본원의 목적상 반감기는 생체내에서 또는 시험관 내에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 치료용 폴리펩티드 또는 변형된 치료용 폴리펩티드의 반감기는 특정한 조건(예: 단백질분해효소나 또는 온도나 pH의 변성 조건 등)에 시간 경과에 따라 배양한 후 그것의 활성(예: 적혈구 생성 활성, 또는 조직 보호 활성)을 평가함으로서 시험관내에서 측정될 수 있다. 또다른 예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 변형된 치료용 폴리펩티드의 반감기는 생체내에서 인간 또는 다른 동물들에게 폴리펩티드를 투여(예: 혈관, 피하, 십이지장내, 경구)한 후에 시간에 따른 혈액 채취에 의해 혈액시료내에 폴리펩티드의 잔존 유효 농도 및/또는 활성을 측정함으로써 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료용 폴리펩티드 매개된 질병 또는 장애"란 치료용 폴리펩티드(또는 변형된 치료용 폴리펩티드)의 치료(처치)가 해당 질병이나 장애의 어떠한 증상이나 발현을 완화시키는 질병이나 장애를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "에리스로포이에틴- 또는 EPO-매개된 질병 또는 장애"는 에리스로포이에틴(또는 변형된 에리스로포이에틴)이 해당 질병이나 장애에 처방되었을 때 어떠한 증상이나 발현을 완화시키는 질병이나 장애를 의미한다. 대표적인 에리스로포이에틴-매개된 질병이나 장애는 만성 염증, 신부전, 후천성면역결핍증, 및 암의 빈혈과 같은 빈혈, 또는 상해에 대한 보호 또는 반응하는 포유동물 세포, 조직, 또는 기관에 대한 손상 후의 기능 회복에 대한 EPO 폴리펩티드의 조직 보호적 활성을 이용하는 질병 또는 질환을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 환자의 질병이나 상태를 "치료하는" 것은 환자의 증상이 부분적으로 또는 완전히 완화되었거나 치료 후에 정적으로 유지되었다는 것을 의미한다. 그러므로 치료는 예방, 치료, 및/또는 치유를 포함한다. 예방(prophylaxis)은 잠재적인 질병 또는 조건의 방지 및/또는 증상악화 또는 질병이나 상태의 진전의 방지를 포함하는 개념이다. 질병이나 상태의 방지(prevention)는 질병이나 상태의 발전에 대한 하나 이상의 위험 인자를 완화 또는 제거하는 것을 포함한, 치료(treatment)는 또한 변형된 치료용 폴리펩티드와 본원에서 제공된 경구형 조성물들의 어떠한 약제학적인 사용도 포함하는 개념이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료는 예방, 치료, 및/또는 치유을 포함한다. 예를 들어 치료는 본원에서 제공된 어떠한 변형된 에리스로포이에틴 또는 다른 치료용 폴리펩티드 및 조성물들의 어떠한 약제학적 용도도 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 예방(prophylaxis)은 잠재성이 있는 질병 및/또는 증상악화의 예방 또는 질병의 진전을 미리 막는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 방지(prevention)는 특정한 질병 또는 장애의 절대적인 방지를 의미한다. 통상적으로 특정 질병이나 장애가 절대로 발달되지 않았다고 확신하는 것은 불가능하므로 방지는 또한 질병 또는 장애를 발달시키거나 가지는 위험을 감소시키는 개념을 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 외부에서 첨가해주는 단백질분해효소를 포함하지 않는 조성물은 단백질분해효소 첨가없이 제제화된 조성물이다. 조성물에 존재하는 추가적인 단백질분해효소는 어떤 것이라도 제제화 방법으로부터 기원한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "투여된 치료학적 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량"은 단위 제제에서 약제, 화합물, 물질의 최소한 환자에게 치료적인 효과를 만들어내기에 충분한 양이다. 통상적으로 그 양은 혈중에서 치료적으로 효과적인 양에 도달하기에 충분히 높은 양이다. 혈중에서 도달하고자 하는 치료적으로 효과적인 양은 비변형된 단백질들에 대해 유효용량이 확립된 방법 및 단위 제제에 쓰인 많은 치료용 폴리펩타이드에 대해 알려져 있다. 그 변형된 단백질에 대해 그 투여용량들은 동일한 효과를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 치료 용도의 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드의 치료적으로 유효한 양은 치료되는 특정 상태, 치료받는 환자의 연령 및 물리적인 조건, 상태의 중증도, 치료의 기간, 병용요법의 성질, 처방되는 특정 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드, 특정 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담당 의사의 지식과 숙련도에 따라 다양하게 달라질 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "약제학적으로-허용되는 부형제들"은 당업계에서 알려진 생리학적으로 비활성이고 약물학적으로 비활성인 물질을 포함하며, 이는 사용을 위해 선택된 특정 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드의 물리 및 화학적 특징과 양립가능하다.
약제적으로 허용되는 부형제들에는 폴리머, 레진, 가소제, 충진제, 윤활제, 용매, 용매, 완충시스템, 계면활성제, 보존제, 감미제, 향료, 약제학적 순도의 염료 및 색소, 및 점증제 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기술된 약제학적 조성물에 함유되는 전부 또는 일부 약제적으로 허용되는 부형제는 장용코팅의 일부분이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료용 폴리펩티드의 "경구투여" 또는 "경구 전달"은 치료용 폴리펩티드를 위장관 내로 섭취에 의한 투여를 의미한다. 통상적으로 본원에서 제공된 경구투여를 위한 조성물은 해당 폴리펩티드가 혈류로 흡수되게 하기 위하여 하부의 장관내로 전달된다는 점에서 본원에서 제공된 점막 전달과는 구분이 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하부 위장관"은 소장과 대장을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료용 폴리펩티드의 "점막투여" 또는 "점막 전달"은 치료용 폴리펩티드의 비강, 폐, 질, 항문, 요도, 그리고 설하 또는 구강전달을 포함하는 점막표면으로 투여하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "경구점막의"란 경구 및/또는 비강인두내를 덮고 있는 점막조직을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "장용코팅"은 단백질분해효소 저항적인 폴리펩티드에 적용, 조합, 혼합되거나 또는 그렇지 않으면 첨가되는 약제적으로 허용되는 부형제의 혼합물과 관련 있다. 장용코팅은 하부장관에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드의 방출에 영향을 미치거나 정제, 캡슐 또는 다른 경구 투약 형태의 초기 소화 또는 분해를 방지한다. 코팅은 압축된 정제, 젤라틴 캡슐, 및/또는 비드, 과립, 입자, 또는 단백질분해효소 저항적인 폴리펩티드의 동결건조된 가루에 적용될 수 있으며, 이들은 전분 또는 젤라틴 캡슐에 캡슐화되거나, 정제로 압축될 수 있다.
따라서, 장용 코팅은 과립, 입자, 또는 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드의 동결건조 분말을 포함하는 압축된 정제에 적용될 수 있지만, 과립 및 입자가 정제로 압축되기 전에 자체적으로 장용 코팅되는 경우에는 압축된 정제의 장용 코팅은 선택적이다. 장용 코팅은 또한 전분 또는 젤라틴 캡슐로 캡슐화될수 있는 치료용 폴리펩티드의 비드 또는 소입자에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐제는 장용 코팅으로 코팅될 수 있다. 장용 코팅으로 인하여, 이들 경구 제형은 상부 위장관 내, 특히 입, 인후 및 식도의 상부위장관 점막 및 상피 조직으로의 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드의 바람직하지 않은 전달을 방지할 수 있다. 코팅은 또한 코팅을 구성하는 첨가체, 그것의 형태 및/또는 두께를 선택함으로써 당업계의 전문가에 의해 조작될 수 있는 하부 위장관 내 지점으로의 전달을 달성한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지연형-방출" 용어는 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드의 전달을 뜻한다. 이는 약제학적 조성물의 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 제형화함으로써 이루어져 치료용 폴리펩티드 전달에 아무 변경이 없었다면 달성되지 않았을 더 말단인 하부 장관의 일반적으로 예측 가능한 어떤 위치에서 방출이 일어나게 한다. 활성 성분의 지연형-방출에 영향을 미치는 대표적인 방법은 장관 내 특정 목적된 지점에 도달할 때까지 활성 성분을 방출하기 위해서 장관 내액에 의해 흡수되지 않거나 또는 분해되지 않은 물질로 활성 성분을 코팅(또는 그 외에 캡슐화)하는 것을 포함한다. 본원의 용도를 위한 지연형-방출 제형의 대표적인 형태는 일반적인 소장의 pH에서는 분해되나, 일반적인 구강, 인후, 식도 또는 위의 pH에서는 분해되지 않는 pH-의존성 물질과 함께 활성 성분의 정제, 캡슐, 또는 입자, 과립 또는 비드를 코팅함으로써 얻어진다. 그러나, 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 경구 투여를 통해 대장 또는 소장에서부터 시작하는 장관 내 전 길이에의 국소 전달에 영향을 주고자 목적한다면, 코팅 물질 및/또는 코팅 방법 또는 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드와 선택된 코팅 물질 또는 약제학적으로 허용된 부형제의 조합방법은 본원에서 제시한 바와 같이 또는 당업계의 전문가에 의해 알려진 어떤 방법으로도 다양화되거나 변경될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료용 효과" 또는 "치료용 이점"은 증상 치료의 긍정적인 결과를 뜻하며, 통증 감소, 피로 감소, 증가된 활력 또는 행복감 촉진과 같은 대상체의 지표뿐만 아니라, 예를 들면, EPO 폴리펩티드 치료의 경우에,적혈구 세포 수(red blood cell count (RBC)), 혈소판 수(platelet count), 헤마토크리트(hematocrit (HCT)), 헤모글로빈 수치(hemoglobin level (hemoglobin C))과 같은 임상 지표의 이로운 변화를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "반응 세포"는 변형된 치료용 폴리펩티드에 노출 인하여 그것의 기능 또는 생존력이 유지, 촉진, 향상, 재생 또는 어떤 방식으로든 이롭게 되는 동물세포를 뜻한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료되는 "대상체"에는 인간 및 인간 또는 비-인간 동물이 포함된다. 포유동물에는 영장류(예: 인간, 침팬지, 고릴라 및 원숭이); 가축(예: 개, 말, 고양이, 돼지, 염소, 소); 및 설치류(예: 마우스, 래트, 햄스터 및 저빌(gerbil))등이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료될 "환자" 또는 "대상체"에는 인간 및 인간 또는 비-인간 동물이 포함된다. 포유동물에는 영장류(예: 인간, 침팬지, 고릴라 및 원숭이); 가축(예: 개, 말, 고양이, 돼지, 염소, 소); 및 설치류(예: 마우스, 래트, 햄스터 및 저빌(gerbil))가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지향적 진화 방법"은 천연 단백질 또는, 합성 단백질을 포함하는 단백질 또는 단백질 도메인이, 상이한 또는 현존하는 천연 또는 인공의 화학적 또는 생물학적 환경에서 작용하는 능력 및/또는 새로운 기능을 유도하는 능력 및/또는 주어진 활성을 증가시키거나 감소시키는 능력 및/또는 주어진 특징을 조절하는 능력과 같은, 변화된 부분(portion)을 갖도록 "개조"시키는 방법을 의미한다. 대표적인 지향적 진화 방법에는 특히 미국 공개 출원 제 US 2003-0134351 A1호, 제 US-2004-0132977 A1호에 기술된 추론적 지향적 진화 방법이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "2차원 추론적 돌연변이유발 스캐닝(2D 스캐닝)"은 특정 단백질 서열의 2차원을 스캐닝하는 본원에 제공된 방법을 의미한다: (1) 1차원은 상이한 아미노산으로 치환시킬 특정 아미노산 잔기(is -HIT 표적 위치로 지칭됨)를 단백질 서열을 따라 동정하는 것이고, (2) 2차원은 특정 is -HIT 표적을 치환시키기 위해 선별된 아미노산 유형(치환 아미노산으로 지칭됨)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인-실리코(in silico)"는 컴퓨터를 사용하여 수행하는 연구 및 실험을 의미한다. 인-실리코 방법에는 분자 모델링 연구 및 생체분자적 도킹(docking) 실험이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "is -HIT"는 i) 진화시킬 특정 단백질 특성, ii) 아미노산의 단백질 서열 및/또는 iii) 개개의 아미노산의 공지된 특성에 기초하여 동정된 표적 단백질 서열을 따라 인-실리코로 동정된 아미노산 위치를 의미한다. 단백질 서열 상의 이러한 is -HIT 위치는 실험적 생물학적 방법을 사용하지 않고 동정된다. 예를 들면, 일단 최적화시킬 단백질 특징(들)이 선별되면, 다양한 정보원 또는 선행 지식(즉, 단백질 1차, 2차 또는 3차 구조, 문헌, 특허)을 활용하여, 상이한 아미노산으로 치환시킴으로써 단백질 적합성을 향상시키는데 적당한 아미노산 위치를 결정한다. 이 단계는 단백질 분석 "인-실리코"를 사용한다. 진화시키는 특징과 관련될 수 있는 표적 단백질의 1차 서열에 따르는 모든 가능한 후보 아미노산 위치는, 본원에서 "인-실리코 HIT"("is-HIT")로 지칭된다. 이 단계 동안 동정된 모든 is -HIT의 집합(라이브러리)은 본원에서 제공된 2차원 스캐닝 방법의 제1 차원(표적 잔기 위치)을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, is -HIT를 동정하는 것과 관련하여 "진화된 예정된 특성 또는 활성을 제공하기에 적당한"은, 인-실리코 분석에 따라, 치환되는 경우 진화시킬 바람직한 활성을 초래하는 특성 또는 특징을 지니는 것으로 고려되는 단백질 상의 아미노산 위치를 의미한다. 치환 아미노산을 동정하는 것과 관련하여 "진화된 예정된 특성 또는 활성을 제공하기에 적당한"이란 어구는, 인-실리코 분석에 따라, 비변형 시작 단백질의 본래 아미노산을 치환하기 위해 사용되는 경우 목적하거나 미리 선택된 활성의 진화를 초래하는 특성 또는 특징을 지니는 것으로 고려되는 특정 아미노산 유형을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "고효율 스크리닝(HTS; High-Throughput Screening)"은 관심대상의 구조를 동정하거나 변이체 단백질 또는 이를 함유하는 세포와 상호작용하는 검사 화합물을 동정하기 위해, 검사 단백질 시료 또는 관심대상의 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 세포 시료와 같은 다수의 시료를 검사하는 는 방법을 의미한다. HTS 작동은 자동화에 적당하고 통상적으로 컴퓨터화되어 샘플 제조, 검정 과정 및 대량의 데이터의 후속적 처리를 취급한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제한된"이라는 용어는, 아미노산 치환을 위하여 선별된 단백질의 아미노산 잔기를 따라 is-HIT 아미노산 위치를 동정 및/또는 치환 아미노산의 동정과 관련하여, 단백질 골격 상의 모든 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 아미노산 치환을 위하여 선별 및/또는 비변형 시작 단백질에 존재하는 본래 아미노산을 치환하는데 이용할 수 있는 나머지 19개 아미노산 전부보다 적은 수의 아미노산이 치환을 위하여 선별된다는 것을 의미한다. 본원에 제공된 방법의 특정한 양태에서, is -HIT 아미노산 위치는 단백질 골격 상의 모든 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 아미노산 치환을 위하여 선별되도록 제한된다. 다른 양태에서, 치환 아미노산은 비변형 시작 단백질에 존재하는 천연 아미노산을 치환하는데 이용할 수 있는 나머지 19개 아미노산 전부보다 적은 수의 아미노산이 치환 아미노산으로서 선별되도록 제한된다. 대표적인 양태에서, is -HIT 아미노산 위치 및 치환 아미노산을 동정하기 위한 스캔 모두는, 단백질 골격 상의 모든 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 아미노산 치환을 위하여 선별되고 천연 아미노산을 치환하는데 이용할 수 있는 나머지 19개 아미노산 전부보다 적은 수의 아미노산이 치환을 위하여 선별되도록 제한된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "후보 LEAD"는 변경이 의도된 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성 또는 활성이 통상적으로 미리 결정되거나 미리 선별된 특성, 활성 또는 다른 속성에서 잠재적으로 변경되도록 고안된 돌연변이 단백질이다. 변경은 폴리펩티드의 특성 또는 활성, 또는 다른 속성을 추가, 변경, 제거 또는 변화시킬 수 있다. 본원의 방법에서, 후보 LEAD는 일반적으로 단백질 또는 이의 도메인의 is -HIT 위치를, 통상적으로, 예를 들면, PAM 분석을 사용하여 수득되는 등의, 나머지 19개 아미노산의 제한된 서브세트 또는 전부를 사용하여 체계적으로 치환시킴으로써 생성된다. 후보 LEAD는, 본원의 고효율 방법에 의해 검사된 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "LEAD"는 특성, 활성 또는 다른 속성이 변경, 최적화, 향상, 추가, 제거된 "후보 LEAD"이다. 본원의 목적상 "LEAD"는 통상적으로 그런 활성 또는 특성을 발현하는 비변형된 폴리펩티드에서 관심대상인 특성 또는 활성에 대해 비변형된 폴리펩티드 또는 비변형 및/또는 야생형(천연형) 단백질이 가지는 활성 또는 속성과 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 상이한 활성을 갖는다. 특정 양태에서 활성의 변화는 비변형 및 천연형 단백질 의 활성보다 2배,3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배 또는 그 이상이다. 활성의 증가 또는 감소일 수 있는 목적하는 변경은 관심있는 기능 또는 특성에 따라 달라진다(예: 약10%, 약 20% 등). LEAD를 동일 단백질 분자 상의 다수(2개 이상)의 "is-HIT" 표적 위치의 치환에 의해 추가로 최적화시켜 "슈퍼-LEAD"를 생성시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "슈퍼-LEAD"라는 용어는 2개 이상의 LEAD 분자에 존재하는 단일 돌연변이를 단일 단백질 분자 내로 첨가시킴으로써 수득된 단백질 돌연변이체(변이체)를 의미한다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 단백질과 관련하여, "하나이상의 단일 아미노산 치환을 포함하는 단백질"이라는 어구는 하나의 각각의 단백질에 대해 본원에 기술된 2개 이상의 돌연변이의 첨가를 포함한다. 예를 들면, 하나이상의 단일 아미노산 치환을 함유하는 본원에서 제공된 변형된 단백질은 공개된 치환 위치에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상 중 임의의 수의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 슈퍼-LEAD 돌연변이 분자의 집합은 어드레스가능한 어레이에서 한번에 하나씩 생성하고, 검사하고, 표현형 면에서 특성화 될 수 있다. 슈퍼-LEAD 돌연변이 분자는 다양한 수 및 종류의 LEAD 돌연변이를 함유하는 분자이다. 진화되는 특정한 특징에 대해 추가로 향상된 적합성을 나타내는 이들 분자를 슈퍼-LEAD로 지칭한다. 슈퍼-LEAD는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 생성시킬 수 있고 본원의 고효율 방법에 의해 검사할 수 있다. 본원의 목적상, 슈퍼-LEAD는 통상적으로 관심대상의 기능에 대해 LEAD의 변경된 활성 (또는 신규 활성 또는 제거된 활성)과 목적하는 양만큼, 예를 들면 , 이것이 유래되는 LEAD 돌연변이체보다 최소한 약1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상만큼의 상이한 활성을 갖는다. LEAD에서와 같이, 슈퍼-LEAD에 대한 활성의 변화는 "진화된" 활성에 따라 달라진다. 활성의 증가 또는 감소일 수 있는 목적하는 변경은 관심대상의 기능 또는 특성에 따라 달라진다. 목적하는 변경은 특성 또는 활성의 추가 또는 제거일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변경된 위치"라는 어구는 상이한 치환 아미노산으로 치환되어 목적하는 표현형 또는 활성이 변경된, LEAD 또는 슈퍼-LEAD 내의 is -HIT 아미노산 위치를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "노출된 잔기"는 표면의 15% 이상이 용매에 노출된 잔기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "구조적 상동성"이라는 어구는 2개 이상의 단백질 골격 간의 공간적 일치 정도를 의미한다. 동일한 단백질 구조를 채택하고 접혀서 공간에서 3차원 구조 중첩 시 유사성을 나타내는 단백질 골격은 구조적으로 상동이라고 생각할 수 있다. 구조적 상동성은 서열 상동성에 따른 것이 아니라, 3차원 상동성에 따른 것이다. 두 단백질 간의 구조적 상동성에 따라 상동이라고 하는 2개의 상이한 단백질에 있는 2개의 아미노산이 반드시 서열-기반 상동성 영역에 있어야 할 필요는 없다. 예를 들면, 서로 간에 주어진 공간 위치 또는 정해진 영역에서 제곱근 평균 제곱(RMS) 편차가 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.7 또는 1.5Å 미만인 단백질 골격은, 그 영역에서 구조적으로 상동이라고 생각할 수 있고, 본원에서 골격 간 "높은 일치성"을 갖는다고 지칭된다. 본원에서는 특정 정도의 구조적 상동성을 공유하는 2개 이상의 상이한 단백질 서열 상에 위치하는 실질적으로 동등한(예: "구조적으로 관련된") 아미노산 위치는 유사한 기능적 임무를 갖는다고 고려되고: 본원에서 "구조적으로 상동인 위치"로도 지칭된다. 이러한 2개의 아미노산은, 서열을 정렬했을 때 아미노산 서열 상의 이들의 정확한 1차 선형 위치가 서로 매치되지 않더라도, 서로 "구조적으로 유사하거나" "구조적으로 관련된다"고 할 수 있다. "구조적으로 관련된" 아미노산은, 전통적인 서열 상동성의 규칙에 따라 서열을 정렬시키면, 1차 단백질 서열에서 서로 멀리 떨어져 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "구조적 동족체"는 구조적 상동성에 의해 인지되는 단백질이다. 대표적인 EPO의 구조적 동족체는 많은 다른 사이토카인으로 예를 들면, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4, 인터류킨-5 (IL-5), 인터 류킨-13 (IL-13), Flt3 리간드 및 줄기세포 인자 (SCF)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2 개의 EPO 폴리펩티드 또는 EPO 의 구조적 동족체인 다른 폴리펩티드와 같은 2개 이상의 폴리펩티드 상의 "상응하는 구조적으로 관련된" 위치는, 폴리펩티드 간 또는 그 중에서 3차원 중첩을 최대화하는 구조적 상동성에 따라 결정되는 아미노산 위치를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체", "치료용 폴리펩티드 변이체", "변형된 치료용 폴리펩티드" 및 "변형된 치료용 단백질"은 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 하나이상의 돌연변이를 갖는 치료용 폴리펩티드를 의미한다. "에리스로포이에틴 변이체," "변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드" 및 "변형된 에리스로포이에틴 단백질"은 비변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 비교하여 하나이상의 돌연변이를 갖는 EPO 폴리펩티드를 의미한다. 하나이상의 돌연변이는 하나이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실 및 이의 임의의 조합일 수 있다. 통상적으로 변형된 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 1차 서열에 하나이상의 변형의 갖는다. 예를 들면, 본원에서 제공된 변형된 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 천연형 폴리펩티드와 관련하여 적어도 하나 이상의 활성을 나타내는 결과 폴리펩타이드의 길이 만큼의 임의의 길이의 폴리펩티드가 고려된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단일 아미노산 치환"은 하나의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 치환되는 것을 의미한다. 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 단백질 내에서 하나의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 치환되는 경우, 단백질의 총 아미노산 수는 변화하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "오직 하나의 아미노산 치환이 각각의 표적 단백질에서 일어난다"라는 어구는 단일 아미노산 변화에 의해 표적 단백질의 비변형 형태와 상이한 표적 단백질이 변형을 의미한다. 예를 들면, 한가지 양태에서, 단백질 골격 상의 오직 하나의 is-HIT 표적 위치에서 단일 아미노산 잔기를 치환시킴으로써 돌연변이 유발을 수행하여(예: 어드레스가능한 어레이에서 "한번에 하나씩"), 생성된 각 개개의 돌연변이체가 각각의 단일 돌연변이 유발반응의 단일 생성물이 되도록 수행한다. 각각의 is-HIT 표적 위치에서 선별된 각각의 치환 아미노산에 대해 단일 아미노산 치환 돌연변이유발 반응을 반복한다. 따라서, 다수의 돌연변이 단백질 분자가 생산되며, 이에 의해 각각의 돌연변이 단백질은 오직 하나의 is-HIT 표적 위치에만 단일 아미노산 치환을 함유한다.
단일 또는 다중 아미노산 치환과 관련하여 본원에서 사용된 "가성-야생형"이라는 어구는, 주어진 아미노산 위치에서 본래의(예: 천연의) 아미노산과 상이하지만, 특정 단백질 활성의 측정가능한 변화를 도입시키지 않으면서 상기 위치에서 천연 아미노산을 치환시킬 수 있는 그런 아미노산이다.
돌연변이 분자의 집합을 암호화하는 핵산 분자의 세트의 집단(라이브러리)을 생성시키고 표현형 면에서 특성화하여, 본래 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 갖지만 본래 단백질과 실질적으로 동일한 수준(즉, 단백질에 따라 최소한 약 10%, 50%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상) 및 유형의 목적하는 활성을 여전히 유도하는 단백질을 선별한다. 집단(또는 라이브러리)은 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 103, 104 개 또는 그 이상의 변형된 치료용 폴리펩티드를 함유한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질의 "위치들에서 또는 아미노산 위치에 상응하는 위치들에서"는 명시된 참조 단백질과 서열 및/또는 구조적 정렬에 따라 서로 상응하는 것으로 결정되는 아미노산 위치를 의미한다. 예를 들면, 서열 번호 2에 제시된 인간 EPO의 아미노산 위치에 상응하는 위치는, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 관심대상의 특정 EPO 폴리펩티드와 함께 정렬시킴으로써 실험적으로 결정할 수 있다. 당업자는 수동식 정렬을 사용하거나 이용가능한 많은 정렬 프로그램(예: BLASTP)을 사용하여 이러한 정렬에 의해 상응하는 위치를 결정할 수 있다. 상응하는 위치는 또한, 예를 들면, 단백질 구조의 컴퓨터 모의 정렬을 사용함으로써 구조적 정렬에 기초할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산이 공개된 서열의 아미노산에 상응한다는 언급은, GAP 알고리듬과 같은 표준 정렬 알고리듬을 사용하여 동일성 또는 상동성(보존된 아미노산이 정렬되는 경우)이 최대화되도록 공개된 서열과 함께 폴리펩티드를 정렬시 동정되는 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "~에 상응하는 위치에서"는, 다른 참조 핵산 분자 또는 단백질의 위치에 상대적인 핵산 분자 또는 단백질의 관심대상의 위치(즉, 염기 번호 또는 잔기 번호)를 의미한다. 다른 참조 단백질에서 위치에 대한 관심대상의 위치는, 예를 들면, 전구체 단백질, 대립유전자형 변이체, 이종 단백질, 다른 종(즉, 종 변이체)의 동일한 단백질 유래의 아미노산 서열 등에 있을 수 있다. 서열을 비교하고 정렬하여 대응하는 뉴클레오티드 또는 잔기의 수를, 예를 들면, 서열 간의 동일성이 95%를 초과, 바람직하게는 96%를 초과, 보다 바람직하게는 97%를 초과, 보다 더 바람직하게는 98%를 초과하고 가장 바람직하게는 99%를 초과하도록 최대화시킴으로써, 상응하는 위치를 결정할 수 있다. 이어서, 참조 핵산 분자에 할당된 번호를 관심대상의 위치에 부여한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성" 및 "동일성"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되지만, 단백질의 상동성에는 보존적 아미노산 변화가 포함될 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 동정하기 위하여 아미노산 서열을 정렬하여 가장 높은 정도의 매치를 수득한다(참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073).
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일성"은 검사된 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 간의 비교에서 동일한 아미노산(또는 뉴클레오티드 염기)의 수를 의미한다. 상동성 폴리펩티드는 동일하거나 상동인 아미노산 잔기의 미리 결정된 수를 의미한다. 상동성에는 동일한 잔기 뿐만 아니라 보존적 아미노산 치환도 포함된다. 서열 동일성은 표준 정렬 알고리듬 프로그램을 각 공급업체에서 설정한 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)와 함께 사용하여 측정할 수 있다. 상동 핵산 분자는 동일하거나 상동인 뉴클레오티드의 미리 결정된 수를 의미한다. 상동성에는 동일한 잔기 뿐만 아니라 암호화된 아미노산을 변화시키지 않는 치환(예: "침묵 치환")이 포함된다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 통상적으로 중간 엄중도(stringency) 또는 높은 엄중도에서 핵산의 전체 길이에 걸쳐 또는 관심대상의 전체 길이 핵산 분자의 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에 걸쳐 하이브리드화한다. 또한 하이브리드화 핵산 분자의 코돈 대신에 축퇴성 코돈을 함유하는 핵산 분자도 고려된다(단백질의 상동성 측정을 위하여, 동일한 아미노산뿐만 아니라 보존적 아미노산도 정렬시킬 수 있고, 이 경우에 동일성 백분률 및 상동성 백분율이 달라진다). 임의의 2개의 핵산 분자(또는 임의의 2개의 폴리펩티드)가 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일한" 뉴클레오티드 서열(또는 어느 두 폴리펩티드가 갖는 아미노산 서열)을 갖는지의 여부는 "FASTA" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리듬을 사용하여, 예를 들면, 문헌([Pearson 등. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)])에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 결정할 수 있다 (다른 프로그램에는 GCG 프로그램 패키지(참조: Devereux, J., 등., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)], BLASTP, BLASTN, FASTA[참조: Atschul, S.F., 등., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), 및 Carillo 등. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988))가 포함된다). 예를 들면, National Center for Biotechnology Information 데이터베이스의 BLAST 기능을 사용하여 동일성을 측정할 수 있다. 시판되거나 공공중이 입수가능한 다른 프로그램에는 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG) "Gap" 프로그램(Madison WI)이 포함된다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 상동성 또는 동일성 백분율은, 예를 들면, GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 측정할 수 있다(참조: Needleman 등. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), as revised by Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). 간략히 설명하면, GAP 프로그램은 유사한 정렬된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 2개의 서열 중 짧은 서열의 기호의 총 수로 나눈 값으로서 유사성을 정의한다. GAP 프로그램의 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일한 경우 1의 값, 동일하지 않은 경우 0의 값을 함유한다) 및 문헌(참조: Gribskov 등. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986))의 가중 비교 매트릭스 (이는 문헌(참조: Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979))에 기술되어 있다); (2) 각각의 갭의 경우 3.0의 페널티 및 각각의 갭에 있는 각 기호의 경우 추가적인 0.10 페널티를 포함할 수 있고 (3) 말단 갭의 경우 페널티를 포함하지 않을 수 있다.
그러므로, 본원에서 사용되는 바와 같이, "동일성"이라는 용어는 검사 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 간의 비교를 나타낸다. 한 가지 비제한적 실시예에서, "~와 적어도 90% 동일한"은 참조 폴리펩티드에 대한 90 내지 100%의 동일성 백분율을 의미한다. 90% 이상 수준의 동일성은, 예시 목적으로 100개 아미노산 길이의 검사 및 참조 폴리뉴클레오티드를 비교한다고 가정할 때, 검사 폴리펩티드의 10%(즉, 100개 중 10개) 이하의 아미노산이 참조 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사하게 검사 및 참조 폴리뉴클레오티드 간에 비교할 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타나거나, 허용되는 최대 길이(예: 10/100 아미노산 차이(대략 90% 동일성)) 이하의 다양한 길이의 하나이상의 위치에 밀집되어 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 약 85 내지 90% 이상의 상동성 또는 동일성 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트와 독립적이어야 하고, 이러한 높은 동일성 수준은 종종 소프트웨어에 의존하지 않고서 쉽게 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열-관련 단백질"이라는 어구는 서로 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% , 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 비관련 단백질 또는 "서열-비관련 단백질"의 군은 서로 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만의 아미노산 동일성 또는 상동성을 갖는 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"이라는 용어는 당업자가 이해하는 바와 같은 범주에 따라 달라진다는 것을 또한 이해하여야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "나출형 폴리펩티드 사슬"은 번역 후 변형되거나 달리 화학적으로 변형되지 않고 오직 공유 결합된 아미노산만을 함유하는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이,폴리펩티드 복합체에는 화학적 변형 또는 번역 후 변형에 의해 생산되는 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 변형에는 페길레이션화, 알부민화, 당화, 파니실화(fanysylation), 해실화, 카르바밀화, 황화, 카르복실화, 수산화, 인산화 및 당 업계에 공지된 다른 폴리펩티드 변형이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "출력 시그날"은 시간에 걸쳐 추적하여, 임의로, 정량화될 수 있는 파라미터를 의미한다. 예를 들면, 재조합 단백질을 세포 내로 도입하는 경우, 재조합 단백질을 함유하는 세포는 많은 변화를 겪는다. 모니터하여 형질전환 또는 형질감염을 평가하는데 사용될 수 있는 임의의 이러한 변화가 출력 시그날이고, 당해 세포를 리포터 세포로 지칭하며 암호화 핵산을 리포터 유전자로 지칭하고, 암호화 핵산을 포함하는 제작물은 리포터 제작물이다. 출력 시그날에는 효소 활성, 형광, 발광, 산물의 생산량 및 다른 이러한 시그날이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 출력 시그날에는 플라스미드 바이러스 내로 삽입된 이종 유전자(전이유전자(transgene))를 포함하는, 유전자 또는 유전자 산물의 발현이 포함된다. 출력 시그날은 시간("t")의 함수이며 조성물에 사용되는 단백질의 양과 관련된다. 보다 높은 농도의 단백질의 경우, 출력 시그날은 보다 높거나 낮을 수 있다. 임의의 특정 농도의 경우, 출력 시그날은 편평기(plateau)에 도달할 때까지 시간의 함수로서 증가한다. 출력 시그날은 또한 세포 간 및 이종 유전자의 발현 및 생물학적 제제간 상호작용을 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 돌연변이체의 집합(라이브러리)을 암호화하는 핵산 분자의 세트의 집단은 유전자 변이체를 보유(즉, 암호화)하는 플라스미드 또는 다른 비히클의 집합을 의미한다. 따라서, 개개의 플라스미드 또는 다른 개개의 비히클은 개개의 유전자 변이체를 보유한다. 집합의 각 요소(또는 구성원)는 적절한 어드레스가능한 어레이에서 서로 물리적으로 분리되어 있고 독립적 돌연변이유발 반응의 단일 산물로서 생성된다. 이러한 단백질의 집합(또는 라이브러리)이 고려되는 경우, 이도 마찬가지일 것이다. 집합(또는 라이브러리)은 3, 4, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 103, 104 개, 또는 그 이상이 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 변형된 치료용 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "리포터 세포"는 조건에 대해 반응하여 변화되는 세포이다. 예를 들면, 단백질 또는 바이러스에 대한 노출 또는 외부 또는 내부 환경의 변화에 대해 반응하여, 리포터 세포는 "보고한다"(즉, 변화를 표시하거나 나타낸다).
본원에서 사용되는 바와 같이, "리포터" 또는 "리포터 잔기"는 세포에 의해 발현되는 단백질과 같은 관심대상의 분자를 검출할 수 있도록 하는 임의의 잔기를 의미한다. 리포터 잔기에는 형광 단백질(예: 적색, 청색 및 녹색 형광 단백질), LacZ 및 다른 검출가능한 단백질 및 유전자 산물이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포에서의 발현의 경우, 리포터 잔기를 암호화하는 핵산은 관심대상의 단백질과 함께 융합 단백질로서 발현되거나 관심대상의 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현형은 유전자형(유전자의 서열)의 물리적, 생리학적 또는 다른 발현을 의미한다. 본원의 방법에서, 유전자형의 변경으로부터 야기되는 표현형이 평가된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 배양 배지는 생체외에서 포유동물의 생존력, 성장 및/또는 분화를 지지하는데 적당한 임의의 배지이다. 임의의 이러한 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 배양 배지의 예에는, X-Vivo15( BioWhittaker), RPMI 1640, DMEM, Ham's F12, McCoys 5A 및 Medium 199가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지에는 혈청, 혈청 단백질, 성장 억제 물질 및 성장 촉진 물질(예: 미토겐 모노클로날 항체) 및 유전적으로 조작되거나 변형된 세포를 선별하기 위한 선별제를 포함하는 추가적인 성분이 보충될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 제공된 다양한 아미노산 서열에 나타나는 아미노산은 공지된 3문자 또는 1문자 약어에 따라 식별된다(표 1). 다양한 핵산 단편에 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에서 통상적으로 사용되는 표준 1문자 명칭으로 명명한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산"은 아미노 그룹 및 카복실산 그룹을 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적상, 아미노산에는 20개의 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉,α-탄소가 측사슬을 갖는 아미노산)가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 보호 그룹, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는, 달리 나타내지 않으면, 이들의 통상적인 용법, 공인된 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature ((1972) Biochem. 11: 1726)에 따른다. 각각의 천연 L-아미노산은 표준 3문자 코드(또는 1문자 코드) 또는 preEPO "L-"이 붙은 표준 3문자 코드(또는 1문자 코드)로 식별되고, preEPO "D-"는 아미노산의 입체이성질체 형태가 D라는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산 잔기"는 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 분해(가수분해)시 형성되는 아미노산을 의미한다. 본원에서 기술된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태인 것으로 가정한다. "D"로 명명된 "D" 이성질체 형태의 잔기는, 폴리펩티드가 목적하는 기능적 특성을 보유하는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. "NH2"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 그룹을 의미한다. "COOH"는 폴리펩티드의 카복시 말단에 존재하는 유리 카복시 그룹을 의미한다. 문헌(참조: J. Biol . Chem., 243: 3552-3559 (1969))에 기술되고 37 C.F.R. ㎣ 1.821-1.822에 채택된 표준 폴리펩티드 명명법에 따라, 아미노산 잔기에 대한 약어를 표 1에 제시한다:
Figure 112009039361308-pct00001
공식에 의해 본원에 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단에서 카복시 말단으로의 전통적인 방향으로 좌측에서 우측으로 배향한다는 점을 유의하여야 한다. 또한, "아미노산 잔기"라는 어구는 대응표(표 1)에 열거된 아미노산 및 변형되고 드문 아미노산(예: 본원에 참조로서 인용된 37 C.F.R. ㎣ 1.821-1.822에 언급된 바와 같은 아미노산)을 포함하는 것으로 광범위하게 정의된다. 게다가, 아미노산 잔기 서열의 처음 또는 끝에 대시(dash)는, NH2와 같은 아미노 말단 그룹 또는 COOH와 같은 카복시 말단 그룹에 대한, 하나이상의 아미노산 잔기의 추가적인 서열에 대한 펩티드 결합을 나타낸다는 점을 유의하여야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 아미노산"은 폴리펩티드에 나타나는 20개의 L-아미노산을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비천연 아미노산"이라는 용어는 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만 구조적으로 변형되어 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하는 유기 화합물을 의미한다. 따라서 비천연 아미노산에는, 예를 들면, 20개의 천연 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산 유사체가 포함되고, 아미노산의 D-이소입체이성체가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 비천연 아미노산은 본원에 기술되어 있고 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산에는 DNA, RNA 및 단백질 핵산(PNA) 및 이의 혼합물을 포함하는 이의 유사체가 포함된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브 또는 프라이머(검출가능한 표지(예: 형광 또는 방사성표지)로 임의로 표지된)를 언급하는 경우, 단일 가닥단일 가닥 분자가 고려된다. 이러한 분자는 통상적으로 라이브러리를 프로빙하거나 프라이밍하기 위하여 낮은 카피 수(통상적으로 5개 미만, 일반적으로 3개 미만)로 통계적으로 고유하게 하는 길이이다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심대상의 유전자에 대해 상보적이거나 동일한 적어도 10, 15, 20, 25 또는 30개 이상의 연속적인 서열을 함유한다. 프로브 및 프라이머는 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 이상, 20개 또는 이상, 30개 또는 이상, 50개 또는 이상, 100개 또는 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 이종 또는 외래 핵산(예: DNA 및 RNA)은 상호교환적으로 사용되고, 이것이 존재하는 게놈의 일부로서 자연적으로 발생하지 않거나 자연에 존재하는 게놈 내의 위치 또는 위치들과 상이한 위치 또는 위치들에서 발견되는 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이종 핵산에는, 이것이 도입되는 세포에 대해 내인성이 아니고 다른 세포로부터 수득되었거나 합성에 의해 제조된 핵산이 포함된다. 일반적으로, 필수적은 아니지만, 이러한 핵산은 이것이 발현되는 세포에 의해 일반적으로 생산되지 않는 RNA 및 단백질을 암호화한다. 본원에서 이종 DNA는 당업자가 이것이 발현되는 세포 또는 위치에 대해 이종이거나 외래의 것으로서 인식하거나 고려하는 임의의 DNA 또는 RNA를 포함한다. 이종 DNA 및 RNA는 또한 전사, 번역 또는 다른 조절가능한 생화학적 과정에 영향을 줌으로써 내인성 DNA의 발현을 매개하거나 변경시키는 RNA 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 이종 핵산의 예에는 추적가능한 마커 단백질(예: 약물 저항성을 부여하는 단백질)을 암호화하는 핵산, 치료학적으로 유효한 물질(예: 항암제)을 암호화 하는 핵산, 효소 및 호르몬을 암호화하는 핵산, 및 다른 종류의 단백질(예: 항체)을 암호화하는 DNA가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본원의 이종 DNA 또는 외래 DNA에는 게놈에서 발견되는 대응물 DNA 분자와 정확한 배향 및 위치에 존재하지 않는 DNA 분자가 포함된다. 이는 또한 다른 유기체 또는 종으로부터의(즉, 외인성) DNA 분자를 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 분자 또는 폴리펩티드 또는 다른 생물분자와 관련하여 분리된"은, 핵산 또는 폴리펩티드가 당해 폴리펩티드 또는 핵산을 수득한 유전적 환경으로부터 분리되었다는 것을 의미한다. 이는 또한 자연 상태로부터 변경된 것을 의미할 수 있다. 예를 들면, 당해 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이 아니지만, 이의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이다. 따라서, 재조합 숙주 세포 내에 생산되고/되거나 함유된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 분리된 것으로 고려한다. 또한, 재조합 숙주 세포 또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 "분리된 폴리펩티드" 또는 "분리된 폴리뉴클레오티드"로서 의도된다. 예를 들면, 재조합에 의해 생산된 화합물 버전은 문헌[참조: Smith 등., Gene, 67: 31-40 (1988)]에 기술된 1단계 방법에 의해 실질적으로 정제할 수 있다. 분리된 및 정제된 이라는 용어는 상호교환적으로 사용할 수 있다.
따라서, "분리된"은, 핵산이 유기체의 천연 게놈에서(만약 있다면), 관심대상의 핵산을 암호화하는 유전자의 바로 측면에 위치하는 유전자의 암호화 서열을 함유하지 않는 것을 의미한다. 분리된 DNA는 단일 가닥단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 게놈 DNA, cDNA, 재조합 하이브리드 DNA 또는 합성 DNA일 수 있다. 이는 시작 DNA 서열과 동일하거나, 하나이상의 뉴클레오티드의 결실, 부가 또는 치환에 의해 이러한 서열과 상이할 수 있다.
생물학적 세포 또는 숙주로부터 제조된 "정제된" 제제는, 관심대상의 DNA 또는 단백질의 정제하지 않은 추출물을 포함하는 제시된 DNA 또는 단백질을 함유하는 세포 추출물을 의미한다. 예를 들면, 단백질의 경우, 정제된 제제는 개개의 기술 또는 일련의 제조용 또는 생화학적 기술에 따라 수득될 수 있고, 관심대상의 DNA 또는 단백질은 이러한 제제에 다양한 정도의 순도로 존재할 수 있다. 상기 방법에는 암모늄 설페이트 분획화, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리 및 전기영동이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"실질적으로 순수한" 또는 "분리된" DNA 또는 단백질의 제제는 이러한 DNA 또는 단백질과 자연에서 일반적으로 관련되어 있고 일반적으로 5% 이하의 다른 불순물을 포함하는 천연적으로 생긴 물질이 없는 제제를 의미한다.
관심대상의 DNA 또는 단백질을 함유하고 있는 세포 추출물은 관심대상의 단백질을 발현하거나 관심대상의 DNA를 함유하는 세포로부터 수득된 균질한 제제 또는 세포-비함유 제제를 의미한다. "세포 추출물"이라는 용어는 배양 배지, 특히 세포가 제거된 사용된 배양 배지를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적화제"는 항체, 수용체 또는 리간드와 같은 또 다른 표적 분자에 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "수용체"는 다른 분자에(또는 다른 분자와) 특이적으로 결합하는 생물학적으로 활성인 분자를 의미한다. "수용체 단백질"이라는 용어를 사용하여 특정 수용체의 단백질성 성질을 더 구체적으로 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합체"는 유전자 조작의 결과로서 형성된 임의의 자손을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터 영역"은 이것이 작동적으로 연결된 DNA의 전사를 제어하는 유전자의 DNA의 일부분을 의미한다. 프로모터 영역에는 RNA 폴리머라제 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 DNA의 특정 서열이 포함된다. 이러한 프로모터 영역의 일부분을 "프로모터"로 지칭한다. 또한, 프로모터 영역에는 이러한 RNA 폴리머라제의 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열이 포함된다. 조절의 성질에 따라 프로모터는 구성적(constitutive)이거나, 시스(cis) 작용 또는 트랜스(trans) 작용 인자에 의해 조절될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 분자에 대한 참고로 "조작적으로 연결된"이라는 어구는, 서열 또는 단편이 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 DAN조각에 공유 결함됨으로써, 하나의 단편 상의 제어 또는 조절 서열이 다른 단편의 발현 또는 복제 또는 다른 이러한 제어를 조절하거나 가능하게 하는 것을 의미한다. 2개의 단편은 반드시 연속적이지는 않다. 유전자 발현의 경우, DNA 서열 및 조절 서열(들)은 적절한 분자(예: 전사 활성화제 단백질)가 이러한 조절 서열(들)에 결합하면 유전자 발현을 제어하거나 가능하게 하는 방식으로 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 DNA 방법을 사용함에 의한 재조합 수단에 의한 생산"은 클로닝된 DNA에 의해 암호화된 단백질을 발현하기 위한 주지의 분자 생물학 방법의 용도를 의미하고, 이에는 유전자의 클로닝 발현 및 방법이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 스플라이스 변이체는 한 종류 이상의 mRNA를 생성하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차별적 프로세싱에 의해 생산된 변이체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물은 2가지 이상의 생성물 또는 화합물(예: 제제, 조절인자, 조정인자 등)의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액제, 현탁액제, 액제, 산제, 페이스트제, 수성, 비-수성 제형 또는 이의 임의의 배합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조합(복합제)은 2개 이상의 품목 간의 임의의 회합을 의미한다. 대상체 투약을 위한 복합제 품목은 독립적으로 또는 함께 투여가능하고, 동시에 또는 연속적으로 사용가능하고, 함께 포장 되거나 독립적으로 포장될수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "제품"은 제조되어 시판되는 산물이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 당해 용어는 포장된 제품에 함유된 본원에서 기술된 바와 같은 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 변형된 치료용 폴리펩티드 및/또는 핵산인 약제학적 조성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "키트(Kit)"는 본원에서 기술하는 바와 같이 본원에서 제공된 약제학적 조성물과 투약, 진단, 및 본원에서 기술된 폴리펩티드의 활성 또는 특성 평가를 포함하지만 여기에 국한되지 않는 목적을 위한 또다른 품목(item)을 제공하는 변형된 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 조합을 의미한다. 키트들은 선택적으로 사용설명서를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생성물과 실질적으로 동일한"은 관심대상의 특성이 충분히 변하지 않을 정도로 충분히 유사하여 실질적으로 동일한 생성물을 생성물 대신에 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터" 용어는 이에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 대표적인 벡터의 한 종류는 에피좀으로 즉, 염색체 외부에서 복제 가능한 핵산이다. 대표적인 벡터는 자율적인 복제가 가능 및/또는 연결되어 있는 핵산의 발현이 가능한 것들이다 이러한 벡터는 통상적으로 복제 오리진을 포함한다. 벡터는 또한 숙주 염색체 내로 통합되도록 고안 될 수 있다. 벡터들과 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터들은 본원에서 "발현벡터"로 지칭된다. 발현벡터는 종종 "플라스미드" 형태이고 이것은 일반적으로 환형 이중-가닥DNA 루프를 의미하며, 이는 이는 이들의 벡터 형태에서 염색체에 결합되어 있지 않다. 플라스미드는 벡터로 가장 통상적으로 사용되어 "플라스미드" 및 "벡터"로 상호교환적으로 사용한다. 발현벡터의 다른 이러한 형태는 동등한 기능을 제공하고 이것에 관하여 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터는 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터" 또한 포함한다. 바이러스성 벡터는 외인성 유전자를 세포 내로 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동적으로 연결된 (비히클 또는 셔틀로서) 조작된 바이러스이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대립유전자"는 본원에서 "대립유전자 변이체"와 집단 내에서 상호교환적으로 사용되고, 집단 중에서 유전자 또는 개체 가운데 그것의 일부의 대안적 형태를 의미한다. 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일한 유전자좌 또는 위치를 점유한다. 대상체가 유전자에 2개의 동일한 대립유전자를 갖는 경우, 대상체는 당해 유전자 또는 대립유전자에 대해 동형접합성이라고 한다. 대상체가 유전자의 2개의 상이한 대립유전자 갖는 경우, 대상체는 당해 유전자에 대해 이종접합성이라고 한다. 특정 유전자의 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 또는 수개의 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있고, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립유전자형은 또한 돌연변이를 함유하는 유전자의 형태일 수 있다. 일반적으로 대립유전자 변이체는 적어도 야생형 및/또는 같은 종으로부터 주된 형태와 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자" 또는 "재조합 유전자" 용어는 개방 판독 프레임(open reading frame)을 함유하고 적어도 하나 이상의 엑손 및 선택적으로 인트론-암호화 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 유전자는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 유전자에는 암호화 영역에 선행하는 영역 및 후행하는 영역(리더 및 트레일러)이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인트론"은 주어진 유전자에 존재하여 mRNA 성숙화 동안에 스플라이싱(splicing)되는 DNA 단편을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열"은 특정 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 가닥의 상보적 가닥의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"상보적 가닥"이라는 용어는 본원에서 "상보체" 용어와 상호교환적으로 사용된다. 핵산 가닥의 상보체는 암호화 가닥의 상보체 또는 비암호화 가닥의 상보체일 수 있다. 이중-가닥 핵산을 언급하는 경우, 특정 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 상보체는 특정 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 가닥의 상보적 가닥 또는 특정 핵산 서열의 상보적 가닥의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 임의의 핵산 분자를 의미한다. 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일가닥 핵산 분자를 언급하는 경우, 상기 핵산의 상보체는 특정 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "암호화 서열"이라는 용어는 단백질에 존재하는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "암호화 서열" 용어는 단백질에 존재하는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "센스 가닥" 용어는 이중-가닥 핵산 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호화하는 mRNA의 서열을 갖는 이중-가닥 핵산 분자의 가닥을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "안티센스 가닥" 용어는 이중가닥 핵산 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호화하는 mRNA의 서열의 상보체인 이중가닥 핵산 분자의 가닥을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "어레이"는 3개 또는 그 이상의 구성원을 함유는 핵산 분자와 같은 요소들의 집합을 의미한다. 어드레스 가능한 어레이는, 통상적으로 고체상 지지체 상의 위치에 의해 또는 색상, 형광, 전기적 시그날(즉, RF, 마이크로파 또는 관심대상의 분자의 상호작용을 실질적으로 변형시키지 않는 주파수), 바코드 또는 다른 기호, 화학적 또는 다른 이러한 표지와 같은 동정가능하거나 검출가능한 표지에 의해, 어레이의 구성원을 동정할 수 있는 어레이이다. 특정 양태에서, 어레이의 구성원은 고체상의 표면 상에 분리된 동정가능한 위치에 고정되어 있거나 직접적 또는 간접적으로 동정가능한 표지에 연결되어 있거나 또는 결합되는데, 예를 들어 미세구체 또는 다른 미립자 지지체(본원에서 비드로 지칭됨)에 부착되어 있고 용액에 현탁되어 있거나 표면 위에 도포되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지지체"(예: 매트릭스 지지체, 매트릭스, 불용성 지지체 또는 고체 지지체 등)는 관심대상의 분자(예: 생물학적 분자, 유기 분자 또는 생물특이적 리간드)가 연결되거나 접촉되는 임의의 고체 또는 반고체 또는 불용성 지지체를 의미한다. 이러한 물질에는 화학적 및 생물학적 분자 합성 및 분석을 위한 친화도 매트릭스 또는 지지체로서 사용되는 임의의 물질이 포함되며, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 나일론, 유리, 덱스트란, 키틴, 모래, 부석(pumice), 아가로스, 다당류, 덴드리머(dendrimer), 버키볼(buchyball), 폴리아크릴아미드, 규소, 고무, 및 고체상 합성, 친화도 분리 및 정제, 하이브리드화 반응, 면역검정 및 다른 이러한 적용을 위한 지지체로서 사용되는 다른 물질이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원의 매트릭스는 미립자이거나 연속적 표면(예: 미세역가 디쉬 또는 웰, 유리 슬라이드, 규소 칩, 니트로셀룰로스 쉬트, 나일론 메쉬 또는 다른 이러한 물질)의 형태로 있을 수 있다. 미립자인 경우, 통상적으로 입자는 5 내지 10mm 범위 또는 더 작은 1차원 이상을 갖는다. 본원에서 "비드"로 총칭하는 이러한 입자는 종종 구형이지만, 반드시 그런 것은 아니다. 하지만, 이러한 언급은 매트릭스의 기하학을 제한하지 않고, 이는 랜덤형, 침상형, 섬유형 및 연장된 형태를 포함하는 임의의 모양일 수 있다. 액체상에서 사용될 수 있는 대략 구형인 "비드", 특히 미세구체 또한 고려된다. 추가적인 성분이 본원의 방법 및 분석을 방해하지 않는 한, "비드"에는 자성 또는 상자성 입자(예를 들면 디나비드(Dynabeads)(제조:Dynal, Oslo, Norway)와 같은 추가적인 성분이 포함되어 자석을 사용하여 분리할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 매트릭스 또는 지지체 입자는 분리된 입자의 형태로 있는 매트릭스 물질을 의미한다. 입자는 임의의 모양과 차원을 갖지만, 통상적으로 100mm 또는 그 이하, 50mm 또는 그 이하, 10mm 또는 그 이하, 1mm 또는 그 이하, 100 또는 그 ㎛ 이하, 50㎛ 이하인 1차원 이상을 갖고, 통상적으로 100mm3 또는 그 이하, 50mm3 또는 그 이하, 10mm3 또는 그 이하 및 1mm3 이하, 또는 그 100㎛3 이하인 크기를 갖고 ㎛3의 차수일 수 있다. 이러한 입자를 총칭하여 "비드"라고 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 보호 그룹, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는, 달리 나타내지 않으면, 이의 통상적인 용법, 공인된 약어 또는IUPAC-IUB (Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem., 11: 942-944)에 따른다.
B. 에리스로포이에틴 ( EPO )
에리스로포이에틴 (EPO)은 호르몬으로 작용하는 조혈 성장 인자 군의 한 종류이다. 이것은 적혈구세포 생산조절과 적절한 범위에서 신체의 적혈구 양을 조절하는데 관여한다. EPO생산은 신장동맥 순환에서 감소된 산소함량에 의해 자극되고, 산소-민감 전사인자에 의해 매개된다. EPO는 신장의 세뇨관 모세혈관 코팅세포에서 주로 생산된다. 분비된 EPO는 골수 적혈구 전구체 표면의 EPO 수용체에 부착되고, 그 결과 급격한 복제와 기능적인 적혈구세포로의 성숙된다. 이 자극으로 적혈구세포 수가 급격히 증가 되고 결과로 헤마토크리트(혈중 적혈구 세포의%)(D'andrea 등. (1989) Cell 57: 277-285; Lodish 등. (1995) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60: 93-104)에서 증가된다.
인간 EPO는 Lin 등(1985) Proc Nat Acad Sci USA82: 7582-4 과 Jacobs 등. (1985) Nature 313: 806-810에 의해 처음 클로닝되고 아미노산 서열이 보고되었다. 인간EPO는 약 30,400 달톤의 분자량을 가지는 산성 당단백질이다. 이것은 내부의 이황화 연결(disulphide bridge)을 형성하는(Lai 등. (1986) J Biol Chem 261: 3116-3121; Recny 등. (1987) J Biol Chem262: 17156-17163) 4개의 시스테인 잔기(위치 7, 29, 33, 161)를 포함하는 165개의 아미노산으로 구성되었다. 7번과 161번 시스테인 사이의 이황화 연결은 적혈구생성 활성에 중요하다. 인간EPO의 구조는 Cheetham 등에 의해 (1988) Nat Struct Biol 5:861-866 and Syed 등. (1998) Nature 395:511-516 보고되고 기술되었다. 인간 EPO는 조혈 성장인자군의 대표적인 종류로 네 개의 나선 다발(four helix bundle)로 되어있다.
생체내, EPO는 번역후 당화에 의해 변형된다. EPO의 탄수화물 부분은 아스파라긴 24, 38 와 83의 세 개의 N-연결 (N-linked) 당쇄와 세린 126번의 하나의 O-연결(O-lnked) 당으로 구성되어 있다( Browne 등. (1986) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51: 693-702; Egrie 등.(1986) Immunbiology 172: 213-224 참조). EPO에 부착된 탄수화물의 구조는 다양하고, 이 특징은 미세-이질성(micro-heterogeneity)이라 불린다. 탄수화물 잔기 부분의 차이는, 분지형태, 다양한 크기와 전하의 관점에서 EPO의 약물동태학 및 약력학에 깊은 영향을 준다. 다른 당화 양식의 영향이 널리 연구되고 있다. (예, Darling 등. (2002) Biochemistry 41: 14524-14531; Storring 등. (1998) Br J Haematol 100: 79-89; Halstenson 등.(1991 Clin Pharmacol Ther 50: 702-712; Takeuchi 등.(1990) J Biol Chem 265: 12127-12130).
다음의 EPO 폴리펩티드는 재조합 인간EPO (rhEPO)로 동일한 아미노산 서열을 갖고 이들을 구분 짓는 생산방법 및 당화 방법에서 편차를 가진다. 에포에틴 알파 ((Epoetin α) (염색체 DNA로부터 만들어진)) 및 에포에틴 베타((epoetin β) (cDNA로부터 만들어진))는 미국특허등록 제 4,703,008호 및 제 5,955,422호에 기술 되어있다. 이들 폴리펩티드는 인간 EPO와 같은 아미노산 서열을 가지고 있고 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 생산된다. 에포에틴 알파는 프로크리트(Procrit? Ortho Biotech), 에프렉스(Eprex? Johnson & Johnson), 에포진 (Epogin? Chugai) 또는 에포젠(Epogen? Amgen)의 상품명으로 사용된다. 에포에틴 베타는 네오레코몬 또는 레코몬(Neorecormon? or Recormon? Hoffmann-La Roche)의 상품명으로 사용된다. 이것은 제네틱스연구소에서 신장 질환과 연관된 빈혈 치료를 위해 개발되었다. 미국 특허 제 5,688,679호에 기술된 에포에틴 오메가(Epoetin ω)는 인간 EPO와 같은 아미노산 서열을 가지고 애기 햄스터 신장(baby hamster kidney)세포 (BHK-21)에서 생산되었다. 에포에틴 오메가는 에포맥스(Epomax? Elanex)란 상품명으로 사용된다.
다베포에이틴 알파(Darbepoetin α)(새로운 적혈구 생성 자극 단백질 (NESP) 로 알려짐)은 암젠에 의해 개발되어 아라네스프 (Aranesp? Macdougall (2002) Kidney Int Suppl . 80:55-61)란 상품명으로 사용된다. 이것은 다섯개의 N-연결 탄수화물 사슬(rhEPO보다 2개 많음)을 가지는 것으로 고안되었다. 아라네스프의 아미노산 서열은 다섯 아미노산의 치환(A30N, H32T, P87V, W88N, P90T)으로 rhEPO의 서열과 다르므로, 30번과 88번 위치의 아스파라긴 잔기에 부가적인 다당 부착이 가능하다. 탄수화물 함량의 증가로 인하여 아라네스프는 높은 분자량(30,400 달톤과 비교하여 37,100달톤), 시알산 함량 (14 시알산 잔기와 비교하여 22개), 및 증가된 음전하의 결과로 rhEPO와 다르다. 아라네스프의 증가된 탄수화물 함량은 정맥주사 (i.v.)나 피하주사 (s.c) 경로로 투여하였을 때 특히 다른 잔존 에리스로포이에틴 보다 3배 이상 긴 순환 반감기의 독특한 생화학적 및 생물학적 특성을 설명한다. 그러나, 상대적 EPO 수용체 결합력은 탄수화물 함량과 반비례하였고 rhEPO에 대한 EPO 수용체의 결합력 대비 4.3배 낮은 상대적 결합력을 나타내었다. 피하 투여 후, 아라네스프의 흡수는 느리고 속도-제한적이며, 평균 54시간 후 최고 혈청 농도에 도달한다. 최고 농도까지의 시간이 보고된 rhEPO 것보다 더 길어진 것은 아마도 아라네스프의 증가된 분자 크기에 기인한다. 최근에, 아라네스프의 연장된 순환 반감기는 아라네스프의 복용 빈도의 감소로 프로크리트?를 능가하는 중요한 임상적 이점이 된다.
디네포(Dynepo, 에포에틴 델타 (Epoetin δ); (트랜스카리오틱 테라피즈(Transkaryotic Therapies)에 의해 개발된 (아벤티스 파마(Aventis Pharma )와 제휴))는 신부전을 가진 환자의 빈혈 치료를 위해 인간 세포 배양으로 생산된 유전자-활성화된 인간 에리스로포이에틴이다. 연속적인 에리스로포이에틴 수용체 활성자 (CERA;로슈에 의해 개발), 또는 R-744,는 화학치료요법과 연관된 빈혈의 잠재적 치료를 위한 2세대 에리스로포이에틴이다. CERA는 이 약품의 반감기를 연장하는 약 30킬로 달톤의 한개의 메톡시폴리에틸렌 글라이콜중합체(methoxypolyethylene glycol polymer)를 포함한다.
EPO는 전세계적으로 미화 30억 달러 판매된 주된 바이오의약품이다. 이것은 주로 적혈구의 증대와 만성 신부전증, 암 화학치료, HIV 감염, 소아과 사용, 미숙아와 연관된 빈혈 치료를 위한 적혈구세포 형성에 주로 사용되고 심장과 혈관 수술을 선택하지 않은 빈혈환자의 수혈 요구를 줄이는데 사용된다. 인간에서, EPO투여 치료는 안전하고 잘 받아들여진다고(well-tolerated) 밝혀졌다.
최근에, 몇몇 증거들은 사이토카인 슈퍼패밀리의 일종으로 에리스로포이에틴이 에리스로포이에틴 수용체(EPOR)과의 상호작용을 통한 또 다른 중요한 생리학적 작용을 한다고 제안한다. 이 작용은 유사분열, 평활근 세포와 신경세포 안으로의 칼슘 유입 조절, 적혈구의 생산, 혈소판의 고활성화, 혈소판의 생성, 매개 대사작용에 대한 영향을 포함한다. 에리스로포이에틴은 저산소의 세포내 미세환경의 특성뿐만 아니라 대사 스트레스에 의해 유발되는 프로그램된 세포사멸을 개선하는 상보적 반응 역할을 제공한다. 따라서, 적혈구 생성 활성에 더하여, EPO는 조직 보호능도 나타낸다. 더 나아가, 이런 조직보호 활성은 이것의 조혈기능과 독립적으로 보인다.
EPO는 경구로, 전신으로, 구강으로, 경피로, 정맥으로, 근육으로, 피하로 투여 가능하고, 대체로, 다중 투여가 치료 처방으로 사용된다. 제형은 일반적으로 활성 유지를 위해 냉장(2-8℃) 조건에 보관된다. 그러므로, 개선된 EPO 안정성 (반감기)은 혈청에서의 안정성과 같은 투약조건(생체내)에서 및 시험관내 (즉, 생산기간 동안, 정제 및 저장조건)에서 약으로써의 활용과 효력을 개선시킬 수 있다.
본원에서는 단백질분해효소들(혈액, 장내 등)에 대한 저항성 및/또는 증가된 열적내성 및/또는 pH 조건에 평가에 의한 안정성을 나타내는 EPO 폴리펩티드 변이체를 제공한다. 여기서 변이체들은 증가된 단백질 반감기를 나타낸다. 증가된 안정성을 나타내는 EPO 변이체들은 혈중, 위장관, 낮은 pH 조건 (즉, 위), 구강, 인후와 같은 투약조건 및/또는 저장조건하에서 증가된 안정성을 지닌다.
C. EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드변형을 위한 대표적인 방법
본원에서는 단백질분해에 대한 증가된 저항성에 의한 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 반감기와 안정성 증가를 위한 방법을 제공한다. 본원에서는 단백질분해효소(혈액, 혈청, 위장관, 등)에 의한 단백질분해에 저항성을 증가시키기 위한 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 단백질의 변형 방법을 제공함으로써 변형된 폴리펩티드는 시험관내 및/또는 생체내에서 증가된 반감기를 나타낸다. 본원에서는 단백질 안정성을 부여하기 위해 일차 아미노산 서열이 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서는 제공하는 아미노산 변형 중 하나는 폴리펩티드의 단백질분해 절단을 감소시키기 위해 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 일차 서열의 아미노산 치환을 포함하는 변형이다. 변형된 EPO 폴리펩티드와 치료용폴리펩티드의 추가적인 변형은 탄수화물, 인산, 황, 수산기, 카르복시기와 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 잔기의 부가등을 포함하지만, 여기에 한정하는 것은 아니다. 그러므로, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용폴리펩티드는 예를 들어 당화, 인산화, 황화, 수산화, 카르복시화 및/또는 페길레이션에 의해 추가적인 변형 가능하다. 이런 변형은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
본원에서는 단백질분해효소에 의한 단백질 분해에 대한 저항성 증가시키기 위해 치료용 폴리펩티드를 변형하는 방법 및 단백질분해효소와 펩타이드 저해제를 접촉시킴으로써 단백질분해효소의 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 또한 본원에서는 상기 방법에 의해 만들어지는 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서는 단백질분해효소 저항성에 의해 평가된 개선된 안정성을 나타내는 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드를 제공하며, 상기 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드는 이러한 특성을 지녀 시험관내 또는 생체내에서 증가된 단백질 반감기를 나타낸다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드(여기서는 변이체로도 기술됨)는 변형되지 않은 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형되지 않은 치료용 폴리펩티드와 비교하여 더 안정하다. 증가된 안정성(즉, 생체내에서 단백질의 반감기)은 혈청에서 충분한 약물 농도를 유지하기 위해 필요한 주사 빈도를 감소시킬 수 있어, i) 치료 대상체(특히 인간 대상체)에 대한 높은 편안함과 수용성, ii) 필적하는 생물학적 활성을 달성하기 위해 필요한 낮은 투여량과 iii) 그 결과로 (용량-의존적) 이차 효과의 감쇠가 가능하다.
EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 증가된 안정성은, 예를 들어, 단백질분해효소 표적 잔기 또는 서열의 파괴 및/또는 구조적 안정성에 기여하고, 온도, pH, 또는 변성시약에 의한 변성에 민감한 잔기의 변형에 의해 달성될 수 있다. 안정성 증가를 위한 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 변형은 비변형 또는 야생형 치료용 폴리펩티드와 비교하여 바뀌지 않은 활성을 유지하면서 달성될 수 있다. 대안적으로, EPO 또는 다른 치료용 폴리펩티드 안정성의 변형은 비변형 또는 야생형 치료용 폴리펩티드와 비교하여 활성을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 당 업계에 공지된 어떤 방법들도 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드 제조에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법들에서, 변형은, 예를 들어, 국제특허 출원공개 WO 2004/022747 와 WO 2004/0225932에 기술된 2D-스캐닝 돌연변이유발 방법 사용이 선택된다.
원칙적으로, 돌연변이유발에 기초한 단백질-지향적 진화에 관해 기술된 몇몇 일반적인 접근법들이 있다. 이들 방법은 단독 또는 조합으로 EPO 폴리펩티드나 다른 치료용 폴리펩티드의 안정성 및/또는 단백질분해에 대한 저항성 증가를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 무작위 돌연변이유발을 포함되고, 이때 시작 단백질 서열의 아미노산을 20개 아미노산의 전부(또는 그룹)로 치환시키며, 단일 치환 또는 상이한 아미노산 위치에서의 다수의 치환이 동일한 분자 상에서 동시에 생성된다.
또 다른 방법, 즉 제한된 무작위 돌연변이유발은, 모든 20개 아미노산 또는 DNA-편중된(DNA-biased) 잔기를 도입시킨다. 편중은 "진화되는" 활성과 관련이 있는 것으로 이미 공지된 단백질의 제한되거나 미리 한정된 영역 내에서, 각각 확률적 또는 반-확률적 방식으로 단백질의 서열에 기초하는 것이 아니라DNA의 서열에 기초한다.
추가적으로, 1D-스캐닝, 2D-스캐닝 및 3D-스캐닝을 포함하는 추론적 돌연변이유발 방법은 변형된 EPO 변이체들 제작을 위해 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다.
1. 비-제한 추론적 돌연변이유발 일차원 (1D) - 스캐닝
추론적 돌연변이유발(1D-스캐닝이라고도 함)은 2단계 과정이고 동시 계류 중인 미국 출원 제10/022,249호(미국 공개번호 제2003/0134351-A1호)에 기술되어 있다. 1D-스캐닝은 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드 변형과, 부가적으로, 2D-와 3D-스캐닝 같은 다른 방법에 의한 추가적 변형을 위한 위치를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 간략히 1 단계로 전체-길이 아미노산 스캐닝이 수행되는데, 여기서 시작 치료용 폴리펩티드 서열(예로, 서열 번호 2의 EPO 폴리펩티드) 전체 또는 각각의 아미노산은 명시된 참조 아미노산 (예, 알라닌)에 의해 치환된다. 오직 하나의 아미노산이 한번에 각각의 단백질 분자에 치환된다.
하나의 아미노산 치환을 가지는 단백질 분자의 집합이 생성되며 각 분자들은 치환이 일어난 아미노산 위치에 의해 서로 상이하다. 돌연변이 DNA 분자는 각각 돌연변이유도와 클로닝에 의해 개별적으로 고안되고 생성되는데, 이를테면 어드레스가능한 어레이에서, 각각 물리적으로 서로 분리되고 개개의 하나는 독립적인 돌연변이유도 반응 산물이다. 돌연변이 핵산 분자 집합에서 유래된 돌연변이 단백질 분자는 또한 예를 들어 어드레스 가능한 어레이 형식화에 의해 물리적으로 서로 분리되어 있다. 각각의 단백질 분자에 대한 활성 평가는 치환되었을 때 활성이 떨어지는 아미노산 위치 동정을 가능하게 한다. 따라서 진화되는 특별한 특징에 적합하게 하는 단백질의 생물학적인 활성 및/또는 입체형태에 특별한 아미노산 위치의 연관성을 나타낸다. 이러한 아미노산 위치를 HIT로 칭한다.
2단계에서, 각 분자의 새로운 집합을 생성되므로 각의 분자가 1단계에서 동정된 개개의 HIT 위치에 존재하는 아미노산이 서로 상이하다. 모든 20개의 아미노산 (19개 남음)을 1단계에서 동정된 각각의 HIT 위치에 도입시키고 이때 각 개개의 분자는 원칙적으로 오직 한 개의 아미노산 치환만을 함유한다. 돌연변이 DNA 분자는 각각 돌연변이유도와 클로닝에 의해 개별적으로 고안되고 생성되는데, 이를테면 어드레스 가능한 어레이에서, 각각 물리적으로 서로 분리되고 개개의 하나는 독립적인 돌연변이유도 반응 산물이다. 돌연변이 핵산 분자 집합에서 유래된 돌연변이 단백질 분자는 또한 예를 들어 어드레스 가능한 어레이 형식화에 의해 물리적으로 서로 분리되어 있다. 그 후 각각의 돌연변이 분자에서 개별적인 활성을 평가한다. 단백질 활성의 목적하는 변경 (예로 향상)을 유도하는 새롭게 생성된 돌연변이체를 LEAD로 지칭한다.
당해 방법은, 시작 단백질보다 더 나은 바람직한 활성 또는 변경된 활성을 나타내는 단백질을 생산하기 위해 단백질의 몇몇 예상되지 않은 영역의 새로운 예상되지 않은 아미노산의 서열의 연구에서, 하나의 추론 아미노산 치환 및 한번에 하나의 아미노산 위치에서의 서열변경에 기초하여, 특성이나 활성 변경에 대한 (예: 향상된 단백질분해효소에 대한 저항성과 같은 향상된 안정성)에 관해 간접적인 조사를 가능케 한다.
당해 접근에서, 아미노산 위치뿐만 아니라 아미노산 유형도 제한되지 않는다. HIT 위치를 동정하기 위한 1단계에서 전체 길이 단백질 스캐닝이 수행되고, LEAD 서열을 동정하기 위해 HIT 위치 각각에서 20개의 아미노산 모두가 시험되는 데, 여기서, 시작점으로, 각각의 분자상에 한번에 하나의 아미노산을 치환한다. 2단계를 위한 표적영역(HIT와 주변 아미노산)의 선별은 1단계에서 얻어진 활성에 관한 실험적 데이터에 기초한다. 따라서, 단백질 구조 및/또는 기능에 관한 사전 지식이 필요하지 않다. 이 접근법을 이용하여, LEAD 서열이 변경된 특별한 생물학적 활성에 관여한다고 종래 알려지지 않은 단백질의 영역에 위치한 단백질상에서 발견되므로, 적합성 개선을 위한 표적으로 예측불가능한 영역 (HIT)을 발견하는 이 접근법의 능력이 강조된다.
2. 이차원 (2D) 추론적 스캐닝 (제한된 추론적 돌연변이유발)
단백질 추론적 진화를 위한 2D-스캐닝 (또는 제한된 추론적 돌연변이유발) 방법 (참조: 동시 계류중인 미국 출원 공개 제 US 2005-0202438 A1 및US-2004-0132977-A1 및 국제 출원 공개 제 WO 2004/022593 및WO 2004/022747)은 2차원 상에서 스캐닝에 기초한다. 제1 차원은 is -HIT 표적 위치를 동정하기 위한 단백질 서열에 따른 아미노산 위치이다. 제2 차원은 특정 is -HIT 아미노산 위치를 치환시키기 위하여 선별된 아미노산 유형을 스캐닝하는 것이다. 본원에 제공된 2D-스캐닝 방법의 장점은, 최소한 하나 이상의, 통상적으로 아미노산 위치 및/또는 치환 아미노산이 제한되어, 단백질 골격 상의 모든 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 아미노산 치환을 위해 선별되고/되거나, 본래의(예: 천연) 아미노산을 치환하는데 이용할 수 있는 나머지 모든 19개 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 치환을 위해 선별될 수 있다.
특별한 양태에서, i) 진화될 특정 단백질 특성(예: 단백질분해에 대한 저항성), ii) 단백질의 아미노산 서열 및 iii) 개개의 아미노산의 공지된 특성에 근거하여, 단백질 서열에 따른 많은 표적 위치를, 인-실리코로, "is-HIT 표적 위치"로서 선별한다. 이러한 is -HIT 표적 위치의 수는 합리적으로 가능할 만큼 커서, 진화되는 특정 특징에 대해 모든 합리적으로 가능한 표적 위치가 포함된다. 특히, 제한된 수의 is -HIT 표적 위치가 치환을 위하여 선별되는 양태에서, 최적화되는 특정 단백질 상의 is -HIT 표적 위치를 치환하기 위하여 선별되는 아미노산은 모든 나머지 19개 아미노산 또는, 보다 흔하게는, 단백질 활성에 바람직한 효과를 미치는 것으로 고려되는 선별된 아미노산을 포함하는 보다 제한된 그룹일 수 있다. 또 다른 양태에서, 제한된 수의 치환 아미노산이 사용되는 한, 단백질 골격을 따른 모든 아미노산 위치는 아미노산 치환을 위한 is -HIT 표적 위치로서 선별될 수 있다. 이어서, 단백질 골격 상의 특정한 is -HIT 표적 위치에서 단일 아미노산 잔기를 치환시킴으로써(예: 어드레스가능한 어레이에서 "한번에 하나씩") 돌연변이유발을 수행하여, 생성된 각 개개의 돌연변이체가 각각의 단일 돌연변이유발 반응의 단일 생성물이 된다.돌연변이 DNA 분자는 각각 돌연변이유도와 클로닝에 의해 개별적으로 고안되고 생성되는데, 이를테면 어드레스 가능한 어레이에서, 각각 물리적으로 서로 분리되고 개개의 하나는 독립적인 돌연변이유도 반응 산물이다. 돌연변이 핵산 분자 집합에서 유래된 돌연변이 단백질 분자는 또한 예를 들어 어드레 스가능한 어레이 형식화에 의해 물리적으로 서로 분리되어 있다. 따라서, 다수의 돌연변이 단백질 분자가 생산된다. 각각의 돌연변이 단백질은 오직 하나의 is -HIT 표적 위치에서 단일 아미노산 치환을 함유한다. 이어서, 단백질 발현 및 적절한 활성의 측정 후, 각 개개의 단백질 돌연변이 분자에 대해 활성 평가를 개별적으로 수행한다. 이러한 방법의 예시는 돌연변이 EPO 분자를 생산하는 하기 실시예에 제시되어 있다.
변경된, 통상적으로 증가된 표적 단백질 활성을 유도하는 새롭게 생성된 단백질을 LEAD로 지칭한다. 당해 방법은 특정 활성 (단백질분해에 대한 증가된 저항성) 에 대한 단백질 향상에 관한 간접적 조사에 의존하고, 이는 단일 또는, 또 다른 양태에서는, 제한된 수의 아미노산 위치에서의 동시적 아미노산 치환 및 서열 변화에 기초한다. 그 결과로서, (특정 표적 활성 또는 다른 특성에) 시작 아미노산보다 우수하거나 상이한 단백질에 따라 일부 영역에 변형된 아미노산 서열을 갖는 최적화된 단백질이 동정되고 분리된다.
단백질분해에 대한 증가된 저항성을 포함하는 단백질 안정성이 증가된 변이체를 생성하는데 EPO에 대한 2D-스캐닝을 사용되었다. 이러한 변형을 실시하기 위하여, EPO의 인-실리코 분석을 사용하여 아미노산 위치를 선별하였다.
a. 인- 실리코 HIT 의 동정
단백질의 지향적 진화를 위한 2D-스캐닝 방법에는 진화되는 특징에 직접적 또는 간접적으로 관련된 것으로 고려되는 단백질 서열을 따라 특정한 아미노산 및 아미노산 위치(본원에서 is -HIT로 지칭됨)를 (인-실리코 분석을 사용하여) 동정하고 선별하는 것이 포함된다. 언급한 바와 같이, 제공된 2D-스캐닝 방법에는 다음의 두 단계가 포함된다. 제1 단계는 진화시킬 활성의 표적일 수 있는 모든 가능한 아미노산 위치를 동정하기 위해 단백질의 표적 아미노산 서열을 인-실리코로 조사하는 것이다. 이 단계는, 예를 들면, 단백질 상의 변경될 특성(들)에 대한 아미노산 잔기의 효과를 임의의 공지된 표준 소프트웨어를 사용하여 평가함으로써 실시한다. 인-실리코 분석의 상세 사항은 변형될 특성과 관계가 있다.
일단 동정되면, 이들 아미노산 위치 또는 표적 서열을 "is -HIT"(인-실리코 HIT)로 지칭한다. 인-실리코 HIT는 단백질분해에 대한 증가된 저항성 같은 "진화하는"에 잠재적으로 관련된 이들 아미노산 위치(또는 표적 위치)로서 정의된다. 단백질 서열내 모든 아미노산 위치 중에서 is -HIT를 구별하는 것은 단백질 2차 또는 3차 구조에 관한 정보 외에도 각 위치의 아미노산 유형에 기초할 수 있다. 인-실리코 HIT는 돌연변이 분자의 집합을 구성하여, 특징을 진화시키는데 잠재적으로 관련된 모든 가능한 아미노산, 아미노산의 위치, 또는 표적서열이 제시된다. 이 단계에서는 아미노산 또는 아미노산 위치 중에서 강력한 이론적 구별이 이루어지지 않는다. 인-실리코 HIT 위치는 단백질 서열의 전체 길이에 걸쳐 퍼져있다. 단일 또는 제한된 수의 is -HIT 아미노산을 표적 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드 상에서 한번에 치환시킨다.
다양한 파라미터를 분석하여 단백질 상의 특정 아미노산이 진화 특징과 연관이 있는지 여부를 결정 할 수 있고, 통상적으로 제한된 수의 초기 전제(initial premisies, 통상적으로 2개 이하)를 사용하여 인-실리코 HIT를 결정한다. 예를 들면, 본원에서 기술된 바와 같이, EPO폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위하여, 첫번째 조건은 단백분해효소적 절단에 참여하는 것과 같은 분자의 안정성과 연관된 아미노산의 성질이다. 예를 들어, 두번째 전제는 단백질 구조에 따른 아미노산의 특정 위치에 관한 것이다.
본원에서 제공된 방법에 따라 is -HIT를 동정하는 첫번째 단계 동안, 단백질 서열에 따른 각 개개의 아미노산을 개별적으로 고려하여 is -HIT의 후보인지의 여부를 평가한다. 이러한 조사는 한번에 하나씩 수행하고, 아미노산이 is -HIT의 후보로 고려되는지에 관한 결정은 (1) 아미노산 유형 (2) 공지된 경우, 단백질 및 단백질 구조내의 위치 및 (3) 서열 및 공간에서 상기 아미노산 및 이의 주변 간의 예측된 상호작용에 기초한다.
단백질분해효소 민감 부위의 제거/변경과 같은 단백질 안정성에 기여하는 EPO의 많은 특성에 대해 is -HIT를 동정하였다. 이러한 변경은 단백질 안정성에 기여하며, 시험관내, 생체내, 생체외(ex vivo)에 제공된 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 반감기를 증대시킨다.
b. 치환할 아미노산의 동정
일단 is -HIT 표적 위치가 선별되면, 다음 단계는 진화되는 특정 특징에 대한 활성 수준을 변경할 각 is -HIT 위치에 있는, 천연과 같은, 본래의 아미노산을 치환할 아미노산을 동정하는 것이다. 각 is -HIT 위치에 있는, 천연 같은, 본래의 아미노산을 치환시키는데 사용될 치환 아미노산의 세트는 특정 is -HIT 위치마다 상이하고 이에 대해 특이적일 수 있다. 치환 아미노산의 선택은, 필수적인(예: 촉매하는, 결합하는 등) 잔기의 소수성, 전하 및 극성과 같은 물리화학적 특성들을 보존시키고 단백질의 일부 다른 특성(예: 단백질 안정성)을 변경시킬 필요성을 고려한다. 특정 is -HIT 표적 위치를 치환하는데 사용할 수 있는 나머지 19개의 비-천연(또는 비-본래의) 아미노산 중 치환 아미노산의 수는 특정 변형을 위한 특성에 따라 1 내지 약 19개 및 이 사이의 범위이다.
치환 아미노산(본원에서 "치환체 아미노산"으로도 지칭됨)의 많은 선별 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 단백질 화학자들은 특정 아미노산 치환이 상이한 종으로부터의 관련 단백질에서 일반적으로 일어난다고 결정하였다. 이러한 치환을 갖는 단백질이 여전히 기능을 하기 때문에, 치환된 아미노산은 단백질 구조 및 기능에 적합할 수 있다. 종종, 이러한 치환은 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환이고, 상대적으로 드물지만, 다른 유형의 변화가 일어날 수도 있다.
많은 수의 단백질에서 최대한 통상적이고 최소한 통상적인 변화의 유형을 아는 것은 단백질 서열의 임의의 세트에 대한 정렬 및 아미노산 치환을 예측하는데 도움이 될 수 있다. 이러한 목적을 위하여 아미노산 치환 매트릭스를 사용한다. 많은 매트릭스가 이용가능하다. 이러한 매트릭스의 상세한 설명은 동시 계류 중인 미국 출원 공개 제 US 2005-0202438 A1호 및 US-2004-0132977-A1호 및 국제 출원 공개 제WO 2004/022593호 및 제WO 2004/022747호 (각각 그 전문이 본원에서 인용됨) 에서 찾을 수 있다. 이러한 매트릭스는 또한 당업계에, 예를 들면, 하기 열거한 참조문헌에 공지되어 있으며 이용가능하다.
아미노산 치환 매트릭스에서, 아미노산은 수평 및 수직으로 열거되어 있으며, 각각의 매트릭스 위치는 한 아미노산이 관련 단백질 서열의 정렬에서 얼마나 빈번하게 다른 아미노산과 쌍을 이룰 것인지를 반영하는 스코어로 채워져 있다. 아미노산 "A"가 아미노산 "B"로 변화될 확률은 아미노산 "B"가 아미노산 "A"로 변화될 확률의 역수와 동일한 것으로 가정된다. 임의의 두 서열에 있어서, 계통수 (phylogenetic tree)에서 선조 아미노산이 일반적으로 공지되어 있지 않기 때문에 이러한 가정을 세운다. 또한, 치환 가능성은 두 아미노산의 발생 빈도의 곱 및 이들의 화학적 및 물리적 유사성에 의존적일 것이다. 이러한 모델의 예측은 아미노산 빈도가 진화 시간에 걸쳐 변화하지 않을 것이라는 것이다(참조: Dayhoff 등, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3): 345-352, 1978).수개의 대표적인 아미노산 치환 매트릭스에는, 블록 치환 매트릭스 (BLOSUM)( Henikoff 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 10915-10919 (1992); Jones 등. Comput . Appl . Biosci., 8: 275-282 (1992); Gonnet 등. Science, 256: 1433-1445 (1992); Fitch, J. Mol . Evol., 16(1): 9-16 (1966); Feng 등. J. Mol . Evol., 21: 112-125, (1985); McLachlan, J. Mol. Biol., 61: 409-424 (1971); Grantham, Science, 185: 862-864 (1974); Miyata, J. Mol . Evol., 12: 219-236 (1979); Rao, J. Pept . Protein Res., 29: 276-281 (1987); Risler, J. Mol . Biol., 204: 1019-1029 (1988); Johnson 등. J. Mol . Biol ., 233: 716-738 (1993)] 및 포인트 허용 돌연변이(PAM; Point Accepted 돌연변이)(Dayhoff 등., Atlas Protein Seq . Struct .5: 345-352 (1978))가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
Dayhoff와 그의 동료는 백분율 허용 돌연변이 매트릭스 (PAM) 불리며 폭넓게 사용되는 치환 매트릭스 한 셋을 개발하는 단백질 진화 모델을 개발하였다 (Dayhoff 등, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3):345-352 (1978)). 이들 매트릭스로 유래에서, 특별한 위치에 있는 현재의 아미노산의 개개의 변화는 그 위치의 선행된 돌연변이와 독립적이라 추정된다. 따라서 일종의 아미노산 A에서 B로의 변경 가능성은 그 위치에서의 선행 변경 및 단백질 서열에서 아미노산 A 위치에 상관없이 같다.
Dayhoff 접근법에서, 치환율은 적어도 85% 이상 동일한 단백질 서열의 일치로부터 유래한다 이 제한은 특이적인 돌연변이가 연속적인 돌연변이의 셋 결과가 되는 가능성이 낮다는 것을 보증한다. 왜냐하면 이런 변경이 가깝게 연관된 단백질에서 관찰되기 때문에, 이것들은 단백질의 기능을 중요하게 변경하지 않는 아미노산을 나타낸다. 여기서 이것들은 "허용된 돌연변이"라고 불리고 자연선택에 의해 수용되는 아미노산의 변경으로 정의된다.
인-실리코로 수행된 상기 제시된 두 단계의 결과는 (1) 돌연변이유발을 위한 표적 아미노산 위치(is -HIT로 지칭됨)가 동정되고 (2) is -HIT에 있는 천연과 같은 본래의 아미노산에 대한 치환 아미노산이 동정되어, 천연 분자와 상이하게 작용할 것으로 예상되는 후보 LEAD 돌연변이 분자의 집합을 제공한다. 목적하는 최적화된 (또는 향상되거나 변경된) 활성에 대하여 이들을 검정한다.
c. 변형된 단백질의 제작 및 생물학적 검정
일단 상기 제시한 바와 같이 is -HIT가 선별되면, 치환 아미노산을 도입시킨다. 돌연변이 단백질은 통상적으로 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조하고, 최적화된 특정 활성(특징)에 대한 적절한 생물학적 검정에서 평가한다. 돌연변이 단백질을 제조하는 대표적인 방법은 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 천연 같은 본래의 유전자를 돌연변이를 유발시키는 것이다. 돌연변이 분자를 어드레스 가능한 어레이 같은 것에서 한번에 하나씩 생성시켜, 생성된 각 개개의 돌연변이체가 각각의 단일 및 독립적인 돌연변이유발 반응의 단일 생성물이 되게 한다. 개개의 돌연변이유발 반응은 이들이 서로 물리적으로 분리되어 있는 어드레스가능한 어레이에서와 같이 개별적으로 수행한다. 일단 각각의 돌연변이 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 세트의 집단이 제조되면, 각각 적절한 세포내로 한번에 하나씩 개별적으로 도입시켜 상응하는 돌연변이 단백질을 생산한다. 이는 또한, 예를 들면, 각각의 돌연변이 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 각 세트를 다중-웰 미세역가 플레이트의 웰 내 같은 분리된 위치에 한정된 세포내로 도입시키는 어드레스가능한 어레이에서 수행할 수 있다. 각 개개의 돌연변이 단백질을 개별적으로 표현형 면에서 특성화하고, 최적화되는 특징(즉, 진화되는 특징)에 적절한 검정을 사용하여 성능을 정량적으로 평가한다. 또한, 상기 단계는 어드레스 가능한 어레이에서 수행할 수 있다. 천연 같은 본래의 분자와 비교하여 목적하는 증가되거나 감소된 성능을 나타내는 돌연변이체를 동정하고 LEAD로 명명한다. 돌연변이 DNA 분자를 생성하는 과정의 시작에서부터 성능 결과의 판독 및 분석까지, 각각의 후보 LEAD 돌연변이체를, 어드레스가능한 어레이에서의 이의 개별적인 어드레스와 같이, 개별적으로 생성하고, 생산하고, 분석한다. 당해 과정은 자동화 가능하다.
3. 3차원적 (3D) 스캐닝
동시 계류 중인 미국 공개 출원 제2005-0202438 A1 및 제2004-0132977-A1호, PCT 공개 출원 제WO 2004/022747호 및 제WO 2004/022593호에 기술된 바와 같은 3D-스캐닝은, 돌연변이유발을 위한 잠재적 표적 부위(is-HIT)의 동정에 기초하는 단백질의 추가적인 추론적 진화 방법이다. 당해 방법은 비교되는 단백질의 기본적인 서열과 관계없이, 구조적으로 관련된 단백질 간의 단백질 골격 접힘 패턴의 비교를 사용한다. 일단 관심대상의 단백질 상에 구조적으로 관련된 아미노산 위치가 동정되면, PAM 분석과 같은 적당한 아미노산 치환 기준을 사용하여 작제 및 스크리닝을 위한 후보 LEAD를 동정할 수 있다.
예를 들어 수많은 관련된 사이토카인 들 중에서 "구조적 동질성"의 분석은 여러가지 사이토카인 패밀리에서 구조적으로 유사하거나 구조적으로 관계된 아미노산 위치와 잔기들을 동정될수 있다.
예를 들어 3D 스캐닝은 향상된 안정성을 위해 변형되어 온 사이토카인 돌연변이에서 발견되는 것들에 구조적으로 유사하거나 구조적으로 관계된 EPO에서의 아미노산 위치를 동정하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어 사이토카인은 과립성 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-13 (IL-13), Flt3 리간드와 줄기세포 인자 (SCF)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기술된 3D-스캐닝 방법을 이용하여, 단백질 군에서 하나의 단백질(예: 사이토카인 군에서 EPO)이 LEAD 돌연변이를 제작하기 위하여 본원에서 제공되는 방법이 사용되어 동정되면, is-HITs은 본원에서 서술한 바와 같이 구조적 유사성 분석(치환을 위해 상응하는 잔기를 동저아기 위해, 본래의 단백질과 패밀리 구성원의 3D 구조의 비교를 통하여)을 사용하여 상응하는 아미노산 위치를 동정함으로써 특정 군 중 다른/모든 단백질에서 찾아 낼 수 있다. 이러한 방법으로 찾아진 패밀리 구성원을 위한 is-HITs은 치환하는 아미노산을 찾고 다음 단계에 제시되고, 본원에서 서술된 것과 같이 LEAD 또는 슈퍼-LEAD를 얻기 위해 분석이 더 진행될 수 있다. 유사하게 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨 -3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨 -5 (IL-5), 인터류킨-13 (IL-13), Flt3 리간드 그리고 줄기세포인자(SCF)와 같은 사이토카인에서 2D-스캐닝으로부터 얻은 정보가 EPO 폴리펩티드를 최적화하기 위해 사용된다.
이 방법은 예컨대 미국 공개 출원 제 2003-0134351 A1 또는 본원에서 서술된 2-차원적 스캐닝 방법의 추론 지향적 진화 방법(rational directed evolution procedure)와 같은 진화 방법에 적용하는 출발 물질로서 사이토카인과 같은 임의의 단백질을 사용하여 바람직한 표현형에 적용될 수 있다. 비슷한 표현형 변경을 가진 추가적인 싸이토 카인을 생산하기 위해 군의 구성원에서 구조적으로 상응하는 잔기를 변경한다.
a. 상동성
일반적으로, 단백질들간의 상동성은 백분율에 기초한 그들의 아미노산 서열 수준또는 서열이 일반적으로 시작 코돈에 의해 암호화된 잔기의 기준으로부터 시작되어 정렬될 때 아미노산 대 아미노산, 각각의 아미노산의 일치 수준에서 비교된다. 예를 들어 두가지 단백질은 그들의 개별적 아미노산 서열들이 정렬 비교에서 어떤 정도 일치하는가를 보여줄 때마다, "상동적"이다라고 말하거나 어느 정도의 유사성을 갖고 있다고 한다. 비교 분자 생물학은 처음으로 이러한 접근에 기초로 한다. 아미노산 서열들 간의 유사성 정도 또는 일치로부터 둘 이상의 단백질 서열과 생물학적 체계 사이의 진화적인 간격의 결론을 만들 수 있다.
"수렴 진화"의 개념은 계통발생학적으로 무관한 유기체 또는 생물학적 체계가 주변환경과 생물체로부터의 일반적 힘, 제약과 진화적인 요구에 대한 반응으로 그들의 해부학, 생리학 및 구조에 관련된 특징을 공유하기 위하여 진화하는 현상을 설명하는데 사용된다. 대안적으로 "발산 진화"는 강하게 계통발생학적으로 관련된 유기체 또는 생물학적 체계가 발산력, 제약과 주변환경과 생물체로부터의 진화적인 요구에 대한 반응으로 동일성 또는 유사성으로부터 발산하도록 진화하는 현상을 설명하는데 사용된다.
대표적인 전통적 동종 단백질의 분석에서 i) "수렴 진화"와 ii) "발산 진화"에 상응하는 두가지 개념적 편중이 있다. 나열된 두가지 단백질의 아미노산 서열은 서로가 잘 일치가 되지 않을 때, 이러한 단백질들은 서로 "관계없다" 또는 "관련이 적은"이라고 할 수 있으며, 서로 다른 계통 발생의 기원을 같는다. 이러한 단백질 사이에는 상동성이 없으며 (또는 낮으며) 이들의 개별적 유전자가 일치하지 않는다 (또는 낮은 상동성을 보여준다). 만약에 연구에 있어서 두개의 "비-상동성" 단백질들이 어떤 공통 기능적 특징(예, 다른 특정 분자들과의 상호작용 또는 활성)을 공유하고 있다면, 그들은 "수렴 진화"(즉, 그들의 비-상동성 아미노산 서열의 진화에 의해, 기능적으로 "관련된" 구조를 생성하는 것과 같이)에 의해 생성된 것이 결정된다.
다른 한편으로는, 나열된 두가지 단백질들의 아미노산 서열이 서로 어느 정도 일치할 때마다, 이러한 단백질들은 "관련된" 것으로 인식되며, 공통 계통 발생의 기원을 갖는다. 주어진 상동성의 정도는 이러한 두 단백질들 사이에서 정해지며 그들의 각 유전자들 또한 상응하는 상동성 정도를 갖는다. 이들의 초기 높은 상동 아미노산 서열이 진화하는 동안, "관련이 적은" 서열 및 관련이 적은 기능을 생성하도록 하는 방식으로 충분한 변화가 축적될 수 있다. 연구 중에 이러한 두 "상동성의" 단백질들 간에 완벽한 일치로부터 발산은 "발산 진화"로부터 온다고 말한다.
b. 3D-스캐닝 (구조적 상동성 ) 방법
구조적 상동성은 두 단백질들의 위상학과 삼차원 구조 사이의 상동성을 말한다. 구조적 상동성은 "수렴 진화" 또는 "발산 진화"에 필수적으로 관계된 것은 아니며 근원적인 아미노산 서열에 관계되지 않는다. 오히려, 구조적인 상동성은 그것의 환경에 의해 부과된 특정 구조 요구를 맞추기 위한 단백질의 필요에 의해 (자연적진화에 의해) 이루어 진 것과 같다. 심지어 고유의 근원적인 서열이 분기가 될 때에도, 특별히 구조적으로 일치하는 "지점" 또는 "위치" 는 구조적으로 본래 구조로부터 분기되지 않는다. 이러한 구조적인 상동성은 본원에서 돌연변이를 위한 위치를 확인하기 위해 개발되었다.
단백질의 아미노산 서열에는 독자적 또는 샤페론 -보조 방법에 의해 독특한 입체적 접힘을 이루는 적절한 생화학적 및 구조적 신호가 있다. 실제로, 이러한 독특한 입체적 접힘은 궁극적으로 단백질 특성과 활성을 결정한다. 단백질은 보통 그들의 특별한 위상학과 공간적인 입체형태를 통해 다른 단백질과 분자들간에 상호작용한다. 원칙적으로, 이러한 상호작용은 수반된 위상학 또는 입체형태에 기초로한 정확한 아미노산 서열에 전적으로 의존하지 않는다. 단백질 특성, 활성(행동 및 표현형) 및 상호작용이 단백질의 위상학과 입체형태에 의존하고 있다면, 단백질에 작용하는 친화력과 제약은 위상학과 입체형태에 작용하고 있다고 예상할 수 있다. 유사한 기능을 공유하는 단백질은 위상학과 입체형태를 형성하는 근본적인 아미노산서열에도 불구하고, 그들의 위상학과 입체형태에서 대등한 특성을 공유할 것이다.
4. 슈퍼- LEAD 와 부가적 지향적 돌연변이유발 ( ADM )
EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 변형은 또한 두개 이상의 돌연변이 결합을 포함한다. 예를 들어, 부가적 지향적 돌연변이유발(ADM)은 슈퍼-LEAD 돌연변이 단백질을 만들기 위해 개별적인 LEAD 분자에 있는 다중의 돌연변이를 한 개의 돌연변이 단백질에 모을 수 있다(동시 계류중인 미국 공개 출원 제2005-0202438 A1호 및 제2004-0132977-A1호 및 공개 PCT 출원 제 WO 2004/022747호 및 WO 2004/022593호 참조). ADM은 계속된 슈퍼-LEAD 돌연변이 단백질을 만들기 위해 이전의 LEAD 돌연변이 단백질에 처음의 LEAD 돌연변이 단백질 생성 후 각 단계에서 새로운 LEAD 돌연변이를 부가하는 반복적인 다단계 과정이다. ADM은 유전자 재조합 기전 또는 셔플링(shuffling) 방법에 근거하지 않는다. 대신 같은 분자내에 원하는 돌연변이의 전체 숫자가 될 때까지 한번에 하나의 돌연변이를 필요한 수만큼 반복하는 단순한 과정이다. 주어진 숫자의 한 개 돌연변이를 같은 분자에 구성함으로써 가능한 조합의 숫자가 지수적으로 증가되는 것을 피하는 방법을 본원에서 제공하며, 비록 모든 조합 가능한 공간을 포함하지 않더라도 여전히 조합 잠재력의 큰 부분을 차지한다. "조합"은 본원에서 수학적 의미(즉, 어떤 가능한 순서에서 요소들의 일부를 포함하는 요소 그룹의 부분집합)로 사용되고 분자생물학 또는 지향적 진화(즉, 그들의 구성 성분들의 무작위 혼합에 의한 분자들의 집합, 혼합물, 또는 집합물)를 의미하지 않는다.
새로운 슈퍼-LEAD 돌연변이분자의 집합을 암호화하는 핵산 분자 셋트의 집단은 어드레스로 불러낼 수 있는 배열에서 하나씩 차례로 생성되고. 시험되고, 표현형적인 특성화된다. 슈퍼-LEAD 돌연변이 분자는 각각의 분자가 LEAD 돌연변이의 다양한 숫자와 형태를 포함하는 것이다. 진화되어지는 부가적으로 개선된 적합성을 보여주는 이러한 분자들은 슈퍼-LEAD 라고 부른다. 슈퍼-LEAD는 당업자에게 알려지고 본원에서의 고효율 방법에 의해 시험된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다. 본원의 목적상, 슈퍼-LEAD는 전형적으로 관심대상의 기능 또는 생물학적 활성과 관련해 LEAD의 증가된 활성과 목적하는 양만큼, 예를 들면, 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 양만큼 그것이 유래한 LEAD 돌연변이와 상이한 활성을 갖는다. 또 다른 예에서, 활성의 변화는 그것이 유래하는 하나 이상의 LEAD 분자보다 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배 또는 그 이상이다. LEAD에서와 같이, 슈퍼-LEAD에 대한 활성의 변화는 "진화될" 특성에 따라 좌우된다. 특성 또는 특징의 증가 또는 감소일 수 있는 목적하는 변경은 관심대상의 기능 또는 특성에 따라 좌우된다.
하나의 양태에서 ADM 방법은 많은 반복적인 단계를 채택하며, 따라서, 각 단계에서 새로운 돌연변이가 주어진 분자에 부가된다. 비록 여러 다른 방법이 각 LEAD 돌연변이를 슈퍼-LEAD 단백질로 조합하는 것이 가능하지만, 새로운 돌연변이(예: 돌연변이 1 (m1), 돌연변이 2 (m2), 돌연변이 3 (m3), 돌연변이 4 (m4), 돌연변이 5 (m5), 돌연변이 n (mn)) 을 부가하는 대표적인 방법은 다음의 도해와 상응한다:
m1
m1+m2
m1+m2+m3
m1+m2+m3+m4
m1+m2+m3+m4+m5
m1+m2+m3+m4+m5+...+mn
m1+m2+m4
m1+m2+m4+m5
m1+m2+m4+m5+...+mn
m1+m2+m5
m1+m2+m5+...+mn
m2
m2+m3
m2+m3+m4
m2+m3+m4+m5
m2+m3+m4+m5+...+mn
m2+m4
m2+m4+m5
m2+m4+m5+...+mn
m2+m5
m2+m5+...+mn
..., 등 ....
5. 다중 중복된 프라이머 신장
두개 이상의 돌연변이의 조합을 생성하기 위하여 사용될 수 있는 또 다른 방법은 "다중 중복된 프라이머 신장"이라 불리는 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이유발이다. 이 방법은 슈퍼-LEAD를 형성하기 위해 돌연변이 LEAD의 합리적인 조합을 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 작은 단백질 또는 공지된 서열의 단백질 영역 전체에 걸쳐 여러 돌연변이를 동시에 삽입하도록 한다. 전형적으로 약 20염기영역에서 서로 겹치게 하는 것처럼 일반적으로 약 70 염기 길이의 (더 긴 올리고뉴클레오티드는 오류를 증가시킨다) 올리고뉴클레오티드들을 겹치는 것은 돌연변이 LEAD 단백질을 암호화하는 DNA서열(유전자)로부터 고안된다. 비록 중복 올리고뉴클레오티드를 생성시키기 위해 전형적으로 약 70개 염기가 사용되지만, 사용하기 위한 부가적 중복 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 30개 염기 내지 약 100개 염기 범위일 수 있다. 마찬가지로, 중복 올리고뉴클레오티드의 중복 영역이 전형적으로 약 20개 염기이지만, 본원에서 사용되는 다른 중복 영역의 길이는 약 5개 염기 내지 약 40개 염기의 범위일 수 있다. 이들 중복 올리고뉴클레오티드(점 돌연변이를 포함하거나 이를 배제함)를 PCR(예상밖의 돌연변이를 피하기 위한 교정(proofreading) 폴리머라제, 예를 들면, Pfu DNA 폴리머라제를 사용함)의 제1 단계에서 주형 및 프라이머로써 사용하여 소량의 전체길이 유전자를 생성한다. 이어서, 제1 PCR로부터 생성된 전체길이 유전자를 각각이 후속적 클로닝을 촉진하기 위해 제한 부위로 태그된 플랭킹(flanking) 프라이머를 사용하여 PCR의 제2 단계에서 선택적으로 증폭시킨다. 1회의 다중-중복된 신장 과정으로 LEAD 돌연변이 단백질로부터 유래된, 내부에 다수의 돌연변이를 갖는 후보 슈퍼-LEAD 단백질을 암호화하는 전체길이(다중-돌연변이된) 핵산 분자가 산출된다.
D. 증가된 단백질 안정성을 보이는 변형된 EPO 폴리펩티드
본원에서는 증가된 단백질 안정성(단백질분해효소 저항성이 증가된 또는 구조적 안정성이 증가된, 예를 들어 온도 또는 pH변화에 의해 변성되는 것에 더 저항성이 있게한 폴리펩티드)을 보여주는 변형된 EPO 폴리펩티드 (본원에서 EPO 변이체로도 언급됨) 를 제공한다. 본원에서는 시험관내(예: 생산, 정제, 보관 중에) 또는 생체 내(예: 대상에 투여후)에서 증가된 반감기로 단백질 안정성 증가를 보여주는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어 증가된 반감기는 사람과 같은 대상에 상기 폴리펩티드의 투여 후 발생할 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드의 증가된 반감기는 비변형 EPO 폴리펩티드의 반감기와 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 양으로 증가될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 EPO 폴리펩티드의 증가된 반감기는 비변형된 EPO 폴리펩티드의 반감기와 비교해 적어도 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배 및 1000배 또는 그 이상의 양만큼 증가될 수 있다. 그러므로 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 혈청 중 충분한 약물 수준을 유지하기 위해 필요한 주사 횟수를 감소시키는 장점을 부여해서 대상체에 대한 편의성 및 허용성을 달성하고, 더 낮은 복용량으로 동등한 생물학적 효과 및 2차적 효과의 감소를 달성한다.
본원에서는 단백질분해효소 저항성과 같은 단백질 안정성을 증가시키도록 임의의 하나 이상의 EPO특성을 바꾸는 변형 및 이들의 변형의 조합을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드를 제공한다. 증가된 단백질 안정성은 아미노산 치환에 의해 달성될 수 있으며, 아미노산 치환에 의한 단백질 분해효소 저항성은 단백질분해효소의 표적 잔기 또는 서열을 직접 파괴 또는 아미노산 치환으로 성취될 수 있다. 일반적으로 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형 EPO 폴리펩티드의 하나 내지 그 이상의 활성을 유지한다. 예를 들면, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형 또는 야생형 EPO와 비교하여 실질적으로 변하지 않은 (적어도 1%, 5% 또는 10% 이하로 변하는) 하나 이상의 활성을 나타낸다. 다른 예로써 변형된 EPO 폴리펩티드의 활성은 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 혹은 감소된다. 예를 들어 활성은 적혈구 생성 또는 조직 보호활성을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 활성은 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있으며, 비변형된 EPO, 예를 들어 성숙한, 야생형 천연 EPO 폴리펩티드(서열번호 2 또는 237), 야생형 전구체 EPO 폴리펩티드 (서열번호 1), 또는 당업자에게 출발물질로 사용되는 것으로 알려진 어떤 다른 EPO 와 비교될 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 성숙한 EPO 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 가진 성숙한 EPO 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형될 수 있다. EPO 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 가지는 전구체 또는 성숙한 EPO 폴리펩티드와 비교하여 각각 변형될 수 있다. EPO 폴리펩티드는 C-말단 아르기닌이 제거된 전구체 또는 성숙한 EPO 폴리펩티드, 예컨대, 서열번호 236 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 가진 전구체 또는 성숙한 EPO 폴리펩티드와 비교하여 변형될 수 있다. 또한 본원에서 제공하는 변형된 EPO 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 인간 EPO(hEPO) 변이체를 포함한다. 예로써 hEPO 변이체는 성숙한 hEPO 폴리펩티드의 아미노산 위치 C7, Y15, D43, Y49, G77, S120, Y145에서 일어나며, 여기서, 아미노산 변형은 C7H, Y15F, D43N, Y49F, G77S, S120C, Y145F (예 미국 특허 제 4,703,008호 및 제7,041,794호 서열번호 238-243 참조)이다. hEPO 폴리펩티드는 어떠한 사람 조직 또는 세포 형태의 기원에 있을 수 있다. 본원에서 제공하는 변형된 EPO 폴리펩티드는 비인간 기원의 EPO 변이체도 포함한다. 이러한 정렬과 위치 선택은 hEPO와 다른 EPO 폴리펩티드를 정렬시키고 변형을 위한 상응하는 위치를 선택하여 이루어진다. 예를 들어 변형된 EPO 폴리펩티드는 비인간 EPO의 변이체 일 수 있으며, 마우스, 래트, 기니피그, 암소, 양, 개, 고양이 닭, 돼지, 토끼, 어류 및 침팬지 EPO를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 예로써 비변형된 비-인간 EPO 폴리펩티드는 서열번호 202-226에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 또한 변형된 EPO 폴리펩티드는 재조합으로 만들어지거나, 합성되거나 공지된 폴리펩티드에 기초하여 알려진 다른 방법에 의해 구축된 합성 EPO 폴리펩티드를 포함한다.
일반적으로 변형은 본원에서 설명하고 있는 아미노산 잔기의 교체(예: 치환), 부가, 삭제 또는 이들의 조합을 포함한다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 변형된 위치를 가질 수 있다. 보통, 상기 변형은 비변형된 EPO 폴리펩티드의 적혈구 생성 또는 조직 보호 활성과 같은 하나 이상의 활성의 상실 없이(즉, 본원에서 정의된 바와 같이 적어도 하나의 활성을 유지) 증가된 안정성을 가져온다. 비변형된 EPO와 비교하여, is -HIT 위치에서 한개의 아미노산 변화를 포함하는 단백질 안정성이 증가된 변형된 EPO를 LEAD라 부른다. EPO 폴리펩티드 후보 LEAD 폴리펩티드는 본원에서 기술하고 있는 방법 또는 PAM 분석과 같은 기존의 기술을 통하여 선택되어진 하나 이상의 is-HIT 위치에서 아미노산 치환 또는 치환들을 포함할 수 있다. 예로써 단백질분해효소 저항성과 관련하여 단백질 안정성이 증가되도록 할 수 있는 성숙한 EPO 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 변형이 표3에 나와있다. 하기 표3에서 서열 식별자(서열번호)가 각 치환 옆에 괄호 안에 표시되어 있다.
또한 본원에서 제공된 변이체 중에 천연형 또는 야생형 EPO와 비교하여 두개 이상의 변형을 가지는 변형된 EPO 폴리펩티드가 있다. 상기 변형된 EPO 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 변형된 위치를 갖는다. 두개 이상의 변형은 같은 특성의 두개 이상의 변형, 예컨대, 단백질분해효소에(혈액, 장등) 대한 저항성을 변형하는 두개의 변형을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서 두개 이상의 변형은 EPO안정성에 각각 기여하는 특성들의 조합을 포함한다. 예를 들어 EPO 변이체는 단백질분해효소 민감성 위치를 제거하는 하나 이상의 변형과 EPO구조적 안정성을 변화시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 한개 보다 많은 is -HIT위치에서 교체를 가지며 증가된 안정성을 보이는 EPO 변이체를 슈퍼-LEAD 라고 부른다. 예를 들어 EPO 슈퍼-LEAD는 야생형 또는 비변형된 EPO에 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 예로써 변형된 EPO 폴리펩티드 후보 슈퍼 LEAD는 표3에 제시된 변형에서 선택된 두개 이상의 변형을 포함할 수 있다.
1. 단백질분해효소 저항성
환자에게의 안정한 펩티드 및 단백질 약물의 전달은 약제 산업의 주요한 도전이다. 인체 내에서 이러한 형태의 약들은 내재화, 사구체 여과 및 단백질분해와 같은 서로 다른 생리학적 과정에 의해 끊임없이 배출되거나 순환혈로부터 제거된다. 후자는 종종 경구 투여 및 정맥 또는 근육 주사시 치료 약물로 사용되는 단백질의 반감기에 영향을 미치는 제한 단계이다. 따라서, 단백질분해효소에 의한 소화에 대한 증가된 저항성으로 나타나는 단백질 안정성을 증가시키는 치료용 단백질은 흥미로운 것이다. 치료용 단백질을 위한 변형 가운데는 치료제로서 또는 치료용 활성을 파괴하거나 제거하지 않고 단백질분해효소에 대한 보호를 향상시키는 것들이 있다. 이러한 변화는 지속성 치료용 단백질 생산에 유용하다. 따라서, 본 발명의 한 국면에서는, 본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드는 단백질 분해에 저항성이 증가되도록 변형되며, 그로 인해 시험관내 (예 생산, 가공, 저장, 분석 등) 또는 생체내 (예 혈청 안정성)에서 변형된 EPO 폴리펩티드의 반감기가 증가된다.
단백질분해효소, 프로티나제 또는 펩티다제는 공유적 펩티드 결합의 가수분해를 촉진한다. 본원에 제공된 변형된EPO 폴리펩티드는 타액, 혈액, 혈청, 장, 위, 혈액, 세포 용해물 및 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 체액 및 조직 내에서 발생하는 것들을 포함하는, 단백질분해효소에 의한 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 예를 들어 세린 프로티나제와 매트릭스 메탈로프로티나제와 같은 모든 단백질분해효소를 포함한다.
EPO 폴리펩티드의 변형은, 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 아미노펩티다제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, α-키모트립신, 카복시펩티다제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로티나제 Lys-C. 내강 펩신, 미세융모 엔도펩티다제, 디펩티딜 펩티다제, 엔테로펩티다제, 가수분해효소, NS3, 엘라스타제, Xa 인자, 그랜자임 B, 트롬빈, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 단백질분해효소에 대한 저항성을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는, 특히 혈청, 혈액, 창자, 구강 및 다른 체액에 존재하는 효소에 의한, 단백질 분해에 대해 증가된 저항성을 나타낸다이러한 저항성 증가는 하나 이상의 단백질 분해 효소를 포함하는 생체내 (인간 혈액, 인간 혈청, 타액, 소화액, 장관 등) 또는 시험관내 혼합물에서 비변형된 또는 야생형 EPO 폴리펩티드에 비교하여, 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 양으로 EPO 폴리펩티드의 반감기 증가로 나타난다. 일반적으로 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 시험관내 또는 생체내 반감기는 하나 이상의 단백질분해 효소를 포함하는 혈액, 혈청 또는 시험관내 혼합물에서 비변형된 또는 야생형 EPO의 반감기와 비교할 때 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 양으로 증가된다.
일반적으로 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 또는 야생형 EPO와 비교하여 실질적으로 변화되지 않은(1%, 5%, 또는 10% 미만의 변화) 적어도 하나의 활성을 나타낸다. 일부 예에서 활성은 비변형된 EPO와 비교하여 증가된다. 예를 들어, 활성은 적혈구 생성 활성 또는 조직 보호 활성을 포함하며, 이들은 성숙한 야생형 천연형 EPO 폴리펩티드 (서열번호 2 또는 237), 야생형 전구체 EPO 폴리펩티드 (서열번호 1 또는 236), 또는 다른 EPO 폴리펩티드와 같은, 출발 물질로 사용되는 비변형된 폴리펩티드와 비교될 수 있다.
a. 세린 단백질분해효소( 프로티나제 )
세린 단백질분해효소는 원핵성 생물 및 진핵성 생물 둘다에서 혈액 응고, 염증뿐만 아니라 소화효소를 포함하는 체내의 광범위한 기능에 관여한다. 세린 단백질분해효소는 서열 특이적이다. 단백질분해효소 활성화의 연속증폭단계는 혈액 응고 및 보체를 제어하는 한편, 다른 단백질분해효소는 상이한 세포 또는 세포외 구획에서 신호 전달경로, 효소 활성화 및 분해 기능에 관련한다.
세린 단백질분해효소에는 키모트립신, 트립신, 엘라스타제, NS3, 혈액응고인자 Xa, 그랜자임 B, 트롬빈, 플라스민, 우로키나제, tPA 및 PSA가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 키모트립신, 트립신 및 엘라스타제는 췌장 포상 세포에 의해 합성되고, 소장으로 분비되며 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 역할을 한다. 이들 세 효소는 모두 X-선 구조를 통해 밝혀진 바와 같이 구조가 유사하다. 이들 소화성 세린 단백질분해효소는 각각, 절단 부위 주변의 아미노산 잔기 및 측쇄에 기초하여, 폴리펩티드 사슬의 상이한 영역을 표적으로 한다. 세린 단백질분해효소의 활성 부분은 폴리펩티드 기질이 결합하는 틈새(cleft)와 같은 모양을 가진다. 아미노산 잔기들은 N 말단으로부터 C 말단 방향으로, 폴리펩티드 기질(Pi, ..., P3, P2, P1, P1', P2', P3', ..., Pj) 및 이들의 각각의 결합의 하위 위치(sub-site) (Si, ..., S3, S2, S1, S1', S2', S3', ..., Sj)로 표지된다. 절단은 P1과 P1' 사이에서 촉매된다. 키모트립신은 크기가 큰 소수성 아미노산 잔기가 측면에 위치하는 펩티드 결합을 가수분해한다. 특정 잔기에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 포함되고, 이는 꼭 맞는 소수성 포켓 속에 들어맞는다. 트립신은 양전하를 띠는 아미노산 잔기가 측면에 위치하는 펩티드 결합을 가수분해한다. 키모트립신의 소수성 포켓을 갖는 대신에, 트립신은 포켓의 뒷면에 아스파르트산 잔기를 갖고 있으며, 이는 아르기닌 및 리신과 같은 양전하를 띠는 잔기와 상호작용할 수 있다. 엘라스타제는 알라닌, 글리신 및 발린과 같은 작은 중성 아미노산 잔기가 측면에 위치하는 펩티드 결합을 가수분해한다. 트립신 및 키모트립신과 대조적으로, 엘라스타제는 발린 및 트레오닌이 정렬되어 있어 단순한 함몰을 만들고, 이는 이러한 작은 아미노산 잔기를 수용할 수 있다. 세린 단백질분해효소는 원핵성 생물 및 진핵성 생물에 편재하고 지혈, 섬유소분해, 보체 형성 및 식이 단백질의 소화와 같은 중요하고 다양한 생물학적 기능을 한다.
세린 단백질분해효소 군에 속하는 엘라스타제는 트립신, 키모트립신과같이 알려진 다른 세린 단백질분해효소와 넓은 범위의 서열 상동성을 보여준다. 세린 엘라스타제는 통상적으로는 알라닌, 발린 및 메치오닌에, 조금 덜하게는 루신 및 이소루신 등의 지방족 아미노산 잔기에 인접해 있는 폴리펩티드를 선택적으로 절단한다. 인간은 엘라스타제 1 (ELA-1, 췌장 엘라스타제, PE 로도 알려짐), 엘라스타제 2 (호중구 엘라스타제, NE, PMN엘라스타제 골수 세린 단백질분해효소, 메둘라신(medullasin), 인간 백혈구 엘라스타제, HLE 로도 알려짐), 엘라스타제 2A (ELA-2A), 엘라스타제 2B (ELA-2B), 엘라스타제3A (ELA-3A, 엘라스타제 IIIA, 단백질분해효소 E), 및 엘라스타제 -3B (ELA-3B, 엘라스타제IIIB, 단백질분해효소 E)와 같이 구조적으로 유사한 단백질을 암호화하는 6개의 엘라스타제 유전자를 가지고 있다. 엘라스타제 활성을 가지고 있는 다른 세린 단백질분해효소에는 프로티나제-3 (PR-3), 내인성 혈관 엘라스타제(EVE) 그리고 내피세포 엘라스타제(ECE)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
호중구 1차 호아주르과립(Neutrophil primary azurophil granule)은 호중구 활성화시 분비되는NE (ELA-2) 와 PR-3을 운반한다. NE는 엘라스틴, 연골프로테오글리칸, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin)의 파괴 및 식작용에 의해 세포내로 도입된 물질의 소화를 포함하는, 세포외 매트릭스(ECM)의 파괴에 관여된다. NE는 또한 면역글로블린 과 표면활성 아포단백질과 같은 단백질의 소화를 돕는다. NE는 선택적으로Val-X 결합과 조금 덜하게는Ala-X결합을 끊는다. NE의 이상적이거나 과량의 방출은 결합조직 수명(turnover), 관절염 및 염증에 있어서 함과 관련된다. NE같이 PR-3도 메탈로프로티나제와 TNF-α, IL-1β및 인터루킨-8 (IL-8)와 같은 사이토카인 등의 전효소(proenzyme)을 활성화하는 기능을 한다.
췌장 엘라스타제(ELA-1)는 선택적으로 Ala-X 결합을 절단하고, 피부 케라티노사이트(keratinocyte)에서 1차적으로 발현된다. ELA의 발현은 그 발현으로 종종 췌장암 진단을 위해 사용되긴 하지만, 성인췌장에서 일반적으로 발견되지는 않는다. . 정상적 췌장의 엘라스타제 활성은 ELA-2A 와 ELA-2B로부터 기인한다. ELA-2A 와 ELA-2B는 선택적으로Leu-X, Met-X 및 Phe-X 결합을 절단한다.
몇몇 병리학 상태는 엘라스타제와 그것의 내인성 억제제 간의 불균형의 결과로 믿어진다. 호중구 엘라스타제, 특히 ELA-2에 의한 조절되지 않은 단백질 가수 분해는 폐기종, 급성 호흡 부전 증후군, 패혈증 충격, 다발성 기관부전, 류마티스성 관절염 및 낭포성 섬유증과 같은 다수의 병리학적 조건에 밀접한 영향을 주어왔다.
높은 농도의 엘라스타제는 위장과 혈관에서 발견될 수 있다. 그러므로 이러한 경로로 투여되어야 하는 효과적인 치료는 엘라스타제 절단 위치의 변형을 통해 달성될 수 있다.
b. 매트릭스 메탈로프로티나제
매트릭스 메탈로프로티나제(MMP)는 세포외 기질(ECM)의 성분을 분해하는 Zn+2- 및 칼슘-의존적 엔도펩티다제의 계열이다. 또한, MMP는 또한 많은 세포 표면 사이토카인, 수용체 및 다른 가용성 단백질을 프로세싱할 수 있다. 이들은 상처 치유, 임신 및 혈관신생과 같은 정상 조직 리모델링 과정에 관련되어 있다. 생리학적 조건 하에서, MMP는 불활성 전구체(지모겐)로서 생성되고 프로세싱되어 활성형이 된다. 추가적으로, 상기 효소는 매트릭스 메탈로프로티나제의 조직 억제제(TIMP)라고 하는 내인성 억제제에 의해 특이적으로 조절된다. MMP의 단백질분해 활성은 생리학적 및 병리학적 조건에서 조직 리모델링의 효과 기전(effector mechanism)으로서 작용하고, 염증의 조절인자로서 작용한다. 이러한 단백질의 과잉 합성 및 생산은 ECM 분해의 가속화를 유도하는데 이는 예를 들면, 골 항상성, 관절염, 암, 다발성 경화증 및 류마티스 관절염과 같은 다양한 질병 및 상태와 관련된다. 신경염증성 질환의 범주에서, MMP는 (a) 혈액-뇌 장벽(BBB) 및 혈액-신경 장벽 열림(blood-nerve barrier opening), (b) 혈액-유래 면역 세포에 의한 신경 조직의 침투, (c) 사이토카인 및 사이토카인 수용체의 제거(shedding), 및 (d) 말초 및 중추 신경계 질환에서 직접적인 세포 손상과 같은 과정에 관련되어 있다(참조: Leppert et al. Brain Res. Rev. 36(2-3): 249-57 (2001); Borkakoti et al. Prog. Biophys. Mol. Biol. 70(1): 73-94 (1998)).
MMP군의 구성원은 콜라게나아제, 젤라티나아제, 스트로멜리신, 매트릴리신(matrilysin) 및 막 결합MMP를 포함한다. 대부분의 MMP는 불활성화된 전효소 형태로 분비된다. 분비된 전효소 MMP는 여러 산화제, 엘라스타제, 플라스민 및 트립신과 같은 단백질분해효소 그리고 다른 MMP와 같은 염증유발(proinflammatory) 물질에 의하여 활성화 될 수 있다(참조: Cuzner and Opdenakker. J. Neuroimmunol. 94(1-2): 1-14 (1999)). 조직에서 생리적 MMP 활성화제는 조직 또는 혈장 단백질분해효소 또는 기회감염된 세균의 단백질분해효소를 포함한다. 예를 들어 우로키나제(u-Pa) 및 조직형 플라스미노겐 활성화제(t-Pa)에 의해 편재하는 플라스미노겐을 포함하는, 플라스미노겐 활성화제/플라스민 계는 병리학적 상태에서 pro-MMP의 활성화제로서 매우 중요하다. MMP 활성은 메탈로프로테이즈(TIMP)의 조직 억제제, 세린 단백질분해효소 억제제(serpin), 및 2-macroglobulin 와 같은 비 특이적 단백질분해효소 억제제에 의해 억제될 수 있다. TIMP는 MMP의 활성 아연-결합 위치의 비 공유적인 결합을 통해 MMP활성을 억제한다.
MMP 및 플라스미노겐 활성화제의 단백질분해 활성, 및 이들의 억제제는, 세포-ECM 상호작용이 광범위한 과정(예: 다양한 세포 유형의 증식, 분화, 부착 및 이동)에 영향을 주고 매개하기 때문에, ECM의 완전성을 유지하는데 있어 중요하다. 매트릭스 메탈로프로티나제의 과잉 생산은 조직 손상 및 상처 치유, 염증 장애, 증식 장애 및 자가면역 질환에 관련되어 있다(참조: St-Pierre et al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2(3): 206-215 (2003); Opdenakker, G. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 59(6): 489-514 (1997)).
c. 단백질분해 위치의 제거에 의해 증가된 단백질분해 저항성
2D 스캐닝 방법은 단백질분해효소(혈액, 위장관 등), 혈액 용해물 또는 혈청에 노출되었을 때 안정성 증가를 가져올 수 있는 hEPO에서 아미노산 변화를 동정하는데 사용되었다. 본원에서 단백질분해효소(혈액, 용해물, 장 혈청등)에 대한 단백질 안정성 증가는 특별한 단백질 분자에 대한 생체내에서 더 긴 반감기를 갖도록 하여 대상체에 대한 투여 횟수를 줄일 수 있도록 생각되어졌다.
단백질분해효소에 저항성 있는 hEPO의 고안에서 첫번째 단계에는 단백질 서열을 따라서 단백질분해에 취약한 위치를 동정함이 포함된다. 고려되는 선택된 혈액, 장 또는 임의의 다른 유형의 단백질분해효소의 목록(표 2)에 기초하여, 이러한 단백질분해효소에 의해 표적화될 수 있는 hEPO 내의 모든 아미노산 및 아미노산 서열의 목록을 먼저 인-실리코로 결정하였다. 단백질분해효소 표적(hEPO 폴리펩티드의 아미노산 또는 아미노산 서열)을 인-실리코 HIT(is-HIT)라고 명명한다. 체내 단백질분해효소 혼합물은 조성물 중에서 매우 복잡하기 때문에, 주어진 단백질 서열 내의 대다수의 잔기가 단백질분해에 대해 표적화될 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
단백질분해에 대해 저항성인 hEPO 돌연변이체의 고안에서 두번째 단계에는, 적절한 치환 아미노산을 동정함이 포함되어, 이들이 is-HIT에서 hEPO 내의 천연 아미노산을 치환시킨 경우, 단백질이 (i) 단백질분해에 대해 저항성을 갖고 (ii) 야생형 hEPO 폴리펩티드와 적어도 유사한 활성 수준을 유도하게 된다. 치환 아미노산의 선택은 특정 단백질분해효소에 대한 광범위한 표적 특이성 및 hEPO에서 필수적인 잔기의 소수성, 전하, 및 극성과 같은 물리화학적 활성 (예: 촉매, 결합 활성 등)을 보존시켜야 할 필요성을 고려해야 한다.
"포인트 허용 돌연변이"(PAM Dayhoff 등, 1978)를 2D-스캐닝 접근법의 일부분으로서 사용할 수 있다. 본래 단백질 서열 간에 정렬을 생성하기 위해 개발된 PAM 값은 아미노산 간의 진화적 거리를 반영하는 확률 매트릭스의 형태로 이용할 수 있다. 참조 서열 내의 잔기의 보존적 치환은 상응하는 참조 잔기와 물리적으로 그리고 기능적으로 유사한 치환을 말하는 데, 즉, 유사한 크기, 모양, 전기적 전하 및/또는 화학적 특성(예: 공유 결합 또는 수소 결합 및 다른 이러한 상호작용을 형성하는 능력)을 갖는 치환이다. 보존적 치환은 허용 포인트 돌연변이의 형태에서 PAM 매트릭스 기준에 부합하는 최고 스코어를 나타낸다. PAM250 매트릭스를 2D-스캐닝의 프레임에서 사용하여, 단백질 기능에 영향을 주지 않는 보존적 돌연변이를 생성하기 위한, is-HIT에 대한 후보 치환 아미노산을 동정한다. 보존적 치환 또는 허용 포인트 돌연변이에 상응하는 PAM250 매트릭스에서 최고값을 갖는 2 이상의 아미노산을 각각의 is-HIT에서의 치환을 위하여 선별하였다. 아미노산을 시스테인 잔기로 치환하는 것은 명백하게 회피되는데, 이러한 변화가 잠재적으로 분자간 이황화 결합의 형성을 유도하기 때문이다.
간략히 설명하면, 알고리즘 PROTEOL(infobiogen.fr 및 bioinfo.hku.hk/services/analyseq/cgi-bin/proteol_in.pl에서 온라인)을 사용하여, 표 2의 단백질분해효소(혈액, 장 등)에 대한 기질로서 인식될 수 있는, 166개의 아미노산의 성숙한 hEPO 폴리펩티드(서열번호 2)에 따르는 잔기목록을 확립하였다. 당해 알고리즘은 입력하는 단백질분해효소, 단백질분해효소의 단백질분해 감수성 및 폴리펩티드 아미노산 서열의 목록에 기초하여 단백질분해성 분해 지도를 생성한다.
표 2에는 선택된 단백질분해효소 및 화학적 처리를 사용한 단백질분해에 대해 표적이 되는 아미노산 위치의 인-실리코 동정이 제시되어 있다.
Figure 112009039361308-pct00002
is-HIT를 동정하고, EPO의 단백질분해에 대한 보다 높은 저항성을 위한 LEAD를 생성시켰다. 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 위한 각각의 is-HIT 위치의 천연 아미노산 및 치환 아미노산에는 Y, A, L, S, T, I, V, F, Q 및 M 중 어느 아미노산을 E, D, K, R, N, Q, S 및 T 중 어느 아미노산으로 치환하는 것이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. is-HIT 및 LEAD에는 단백질분해에 민감한 영역에서의 변형이 포함될 수 있다.
d. 증가된 단백질분해 저항성을 보이는 변형된 EPO 폴리펩티드
본원에서 기술한 방법을 이용하여 다음 is-HIT 위치가 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소 민감성 부위를 제거하고 단백질 안정성을 항상시키기 위해 동정되었다: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 23, 29, 31, 35, 37, 42, 43, 45, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 62, 64, 67, 69, 70, 72, 75, 76, 80, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 96, 97, 102, 103, 105, 108, 109, 110, 112, 116, 117, 121, 122, 123, 129, 130, 131, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 148, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 165, 및 166. 아미노산 치환(들)은 서열번호 2로서 명시된 성숙한 EPO 폴리펩티드의 아미노산 위치인 P2, P3, R4, L5, C7, D8, R10, L12, E13, R14, Y15, L16, L17, E18, K20, E21, E23, C29, E31, L35, E37, P42, D43, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, P121, P122, D123, P129, L130, R131, D136, F138, R139, K140, L141, F142, R143, Y145, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165, 및 R166에 상응하는 하나 이상의 위치가 포함될 수 있다.
한가지 양태에서 위치는 일반적으로 다음과 같이 치환된다: D는 N 또는 Q로 치환, E는 H, Q 또는 N으로 치환, F는 I 또는 V으로 치환, K는 Q 또는 N으로 치환, L은 I또는 V으로 치환, M은 I또는 V으로 치환, N은 Q 또는 S로 치환, P는 A 또는 S로 치환, R은 H또는 Q로 치환, W는 H또는 S로 치환, Y는 I 또는 H로 치환, A, G, I, S, T, 또는 V는 Q, H, 또는 N으로 치환.
한가지 양태에서, hEPO에 상응하는 위치를 선별하고(is-HIT) 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 갖는 아미노산 치환체를 생성하는 데(LEAD), 이는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 생성되는 표 3에 제시된 세트에 상응하는 치환이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 표 3은 성숙한 EPO 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 치환의 비제한적 예를 제공하며, 이것은 단백질분해 효소 저항성이 증가시킴으로써 단백질 안정성을 증가시킨다.
이러한 돌연변이체에 대한 언급에 있어서, 첫번째 아미노산(1문자 약어)은 치환되는 아미노산에 상응하고, 숫자는 서열번호 2를 참조한 hEPO 폴리펩티드 서열 내의 위치에 상응하며, 두번째 아미노산(1문자 약어)은 첫번째 아미노산을 당해 위치에서 치환시키는 선별된 아미노산에 상응한다. 표3에서 서열인식자(서열번호)는 각 치환 다음에 괄호안에 있다. 변형을 위하여 사용되는 EPO 폴리펩티드는 다른 포유동물 EPO 폴리펩티드를 포함하는 임의의 EPO 폴리펩티드일 수 있다. 적절한 정렬에 의해 평가된 바와 같은, 상응하는 위치는 본원에서 기술된 바와 같이 동정되고 변형된다.
Figure 112009039361308-pct00003
본원에서 제공된 단백질분해효소에 대해 저항성이 증가된 변형된 EPO는 P2S (예: 성숙한 인간 EPO (예 서열번호 2)의 아미노산 위치2에 상응하는 위치에서 P를 S로 치환), P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H 및 R166Q 치환에서 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환이 포함 될 수 있으며, 변형된 폴리펩티드는 증가된 단백질 분해에 저항성을 보인다. 한가지 예에서 변형은 서열번호 :2 또는 237에서의 아미노산 서열을 갖는 EPO와 같은 비변형된 EPO에서 이루어진다. 대표적인 변형된 EPO LEAD 후보 폴리펩티드는 서열번호 3-201중 어느 하나 나타난다.
부가적으로 위에 나타난 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 일반적으로 변형된 EPO 폴리펩티드 는 비변형된 EPO 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다.
e. 단백질분해 저항성이 증가된 EPO 변이체 평가
EPO 변이체의 단백질 분해에 대한 저항성 증가는 단백질 안정성, 내열성, 단백질분해효소 민감성 및 저항성 및/또는EPO 활성을 평가하는 당업계 공지된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어 단백질분해효소 저항성은 하나 이상의 단백질분해효소와 변형된 EPO 폴리펩티드를 같이 반응한 후에 처리하지 않은 대조군과과 남아있는 활성을 측정한다. 특별한 변이체가 비변형된 EPO보다 많이 활성이 유지 되는지 확인하기 위하여 유사한 조건하에서 변형된 EPO는 비변형된 및/또는 야생형 천연형 EPO와 비교될 수 있다. 활성은 예를 들어 적혈구 생산 또는 조직 보호 활성을 측정함으로써 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해서 평가 될 수 있다.
또한 단백질분해효소 저항성의 속도론적 평가가 변형된 EPO 폴리펩티드 평가를 위해 이용 될 수도 있다. 예를 들어 변형된 EPO 폴리펩티드를 하나 이상의 단백질분해효소와 배양하고 일련의 시간별로 시료를 취한다. 각각의 시점에서 단백질분해효소는 불활성화시키고 나서, 시료의 EPO활성을 측정한다. 한가지 예에서 변형된 폴리펩티드는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 또는 그 이상 단백질분해에 저항성을 갖는다.
한가지 대표적인 예에서, 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 아미노펩티다제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, α-키모트립신, 카복시펩티다제, 엔도프로티나제 Arg-C, 엔도프로티나제 Asp-N, 엔도프로티나제 Glu-C, 엔도프로티나제 Lys-C, 내강 펩신, 미세융모 엔도펩티다제, 디펩티딜 펩티다제, 엔테로펩티다제, 하이드롤라제, NS3, 엘라스타제, 인자 Xa, 그랜자임 B, 트롬빈, 트립신, 플라스민, 우로키나제, tPa 및 PSA를 포함하는 단백질분해효소의 혼합물 및 단백질분해 조건을 사용하여, EPO변이체를 단백질분해효소 저항성에 대해 평가한다. 예를 들어 세포증식분석은 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 변형된 EPO 폴리펩티드의 적혈구 생산 활성 측정에 이용될 수 있다. 특히 EPO의 적혈구 세포 증식 활성은 TF-1 증식 분석과 같은 적혈구 세포증식 분석에서 세포증식을 유도하는 변형된 EPO 폴리펩티드의능력을 검증할 수 있다. 야생형 EPO와 비교하여 효소적 절단에 대한 변형된 EPO 폴리펩티드의 저항성은 EPO 폴리펩티드를 단백질분해효소와 혼합시킴으로써 분석할 수 있다. 단백질분해효소에 노출된 후에 적혈구 생산 또는 조직 보호 활성이 평가 될 수 있다.
한가지 예에서 변형된 EPO의 적혈구 생산 활성은 시료에 넣었을 때 세포 증식을 조절하는 변형된 EPO의 능력을 측정함으로 평가된다. 활성측정에 앞서, 혈청, 혈액, 타액 또는 소화 분석(시험관내 분석)과 같은 유사 투여 조건 및/또는 마우스 또는 인간(생체내 분석) 등의 대상체에서의 직접 투여 조건에서 시간 경과에 따라 EPO 폴리펩티드는 단백질분해효소(혈액, 장 등)로 노출될 수 있다. 측정된 활성은 단백질분해효소 혼합물에 노출된 후 남아 있는 활성에 상응한다. 활성은 단백질분해효소 안정성과 활성에서의 변형효과를 측정함으로써 비변형된 EPO와 비교될 수 있다. 한가지 예에서 비변형된 EPO는 야생형 천연형 EPO이다. 또 다른 예에서 비변형된 EPO는 추가적인 변형을 도입하기 위한 출발 물질로서 사용된 EPO 변이체다. 또한 변형된 EPO 폴리펩티드는 단백질분해효소 감수성, 내열성 및/또는 어떠한 다른 활성을 비교하기 위하여 공지된 어떤 시험을 통해 어떤 알려진 EPO와 비교 될 수 있다.
2. 슈퍼-LEAD
EPO 폴리펩티드의 변형에는 두개 이상의 변형을 조합하는 것이 또한 포함될 수 있다. 변형된 EPO 슈퍼-LEAD 폴리펩티드는 두개 내지 그 이상의 각 변형된 EPO LEAD 폴리펩티드들에 있는 하나의 아미노산 변형의 조합이다. 그래서, 변형된 EPO 슈퍼-LEAD 폴리펩티드는 두개 내지 그 이상의 각 변형된 EPO LEAD에서부터 유래한 두개 내지 그 이상의 단일 아미노산 치환을 갖는다. 위에 언급한 바를 아래에서 자세히 설명하면, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 단백질분해에 대해 저항성이 증가되는 것으로 나타나는 증가된 단백질 안정성을 보여준다. 일반적으로 만들어진 변형된 EPO LEAD 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드의 하나의 is-HIT 위치에서 단일 아미노산 치환 변형에 의해 그들의 성질은 최적화되었다.
변형된 EPO 슈퍼-LEAD 폴리펩티드는 서로 다른 is-HIT 위치에서 두개 이상의 EPO LEAD 변형을 포함하는 폴리펩티드로써 제조된다. 단백질분해 저항성을 증가시키는 변형은 본원에서 제공되거나 단백질분해 저항성이 증가되는 것으로 공지된 다른 변형에 부가될 수 있다. 한가지 예에서 안정성을 증가시키는 변형은 본원에서 제공되거나 단백질 안정성이 증가되는 것으로 공지된 다른 변형에 부가될 수 있다. 또 다른 예에서 안정성을 증가시키는 변형은 본원에서 제공되거나 단백질분해 저항성이 증가되는 것으로 공지된 다른 변형에 부가될 수 있다. 단백질분해효소 저항성 및/또는 안정성을 증가시키는 변형은 또한 활성을 포함하는 다른 기능성을 변경하는EPO 에 대한 변형, 번역-후 단백질 변형에 영향을 미치는 변형, 및 당업계에 공지된 다른 임의의 변형에 부가될 수 있다.
예로 들어 일단 변형된 LEAD 폴리펩티드는 2D 스캐닝 방법을 이용하여 동정되어지면, 슈퍼-LEAD는 재조합, 돌연변이 그리고 DNA 셔플링(shuffling)과 같이 공지된 방법을 이용한 두개 이상의 각각의 LEAD 의 조합에 의하여, 그리고 위에서 제공된 것과 같이 지향성 돌연변이, 3D 스캐닝 그리고 다중-중복된 프라이머 신장에 의해 만들어질 수 있다.
예로써 단백질 안정성이 증가된 변형된 EPO 슈퍼-LEAD 폴리펩티드는 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 두개 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 한가지 예로 EPO 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 내지 그 이상의 변형된 위치를 포함한다. 일반적으로 얻어진 EPO 폴리펩티드는 증가된 단백질 안정성을 보이며, 비변형된 EPO 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 위 표3에서 나타낸 두개 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 변형된 EPO 폴리펩티드는 서열번호 2에 제시된 성숙한 EPO 폴리펩티드의 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I,L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H 및 R166Q 중에서 선택된 두개 이상의 변형에 상응하는 두개 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 경우에 따라서는 상기 변형은 서열번호 237에 제시된 아미노산 서열을 가지는 비변형된 EPO 폴리펩티드 내에 있다.
본원에서 제공된 대표적인 변형된 EPO 폴리펩티드는 한개 보다 많은 변형을 가지며, 이러한 변형은 R139H/R4H, R139H/L93I, R139H/K20Q, R139H/E159N, R139H/K52N, R139H/L153V, R139H/L93V, R139H/L80I, R139H/L93I, K20Q/L80I/R139H, K20Q/L93I/R139H, K20Q/L93V/R139H, R4H/K20Q/R139H/L80I, E159N/K20Q/R139H/L93I, K20Q/R139H/L153V, L153V/K20Q/R139H/L80I 및 E159N/K20Q/R139H/L80I를 포함하나, 이것에 제한되지 않는다.
3. 다른 EPO 변형
본원에서 제공된 하나 이상의 아미노산 변형에 추가로, 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 페길레이션(PEGylation), 고-당화 (hyperglycosylation), 탈-면역원화(deimmunization), 및 다른 방법과 같은 당업자에게 공지된 것들을 포함한 하나 이상의 추가적인 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(참조: 예, 미국 특허번호 제5, 856, 298호 미국 특허 공개 번호 제2003-0120045호, 제2004-0063917호, 제2005-0220800호, 제2005-0107591호, 제2006-0035322호, 및 제2006-0073563호 및 PCT 국제 공개번호 WO 01/81405호). 일반적으로 변형은 비변형된 EPO 폴리펩티드 의하나 이상의 활성, 예컨대, 적혈구세포 생성 또는 조직 보호 활성을 잃지 않고(즉, 본원에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 활성이 유지됨), 증가된 안정성을 초래한다. 예를 들어, EPO 폴리펩티드에 다른 추가적 변형은 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형 및/또는 하나 이상의 화학적인 변형을 포함한다.이러한 변형은 면역원성, 당화, 활성, 또는 EPO폴리펩티드의 다른 공지된 특성을 변경하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 예로, 화학적인 변형은 단백질 번역-후 변형, 예를 들면 탄수화물 부위에 의한 당화, 아실화(acylation) (예, 아세틸화(acetylation) 또는 숙신화(succinylation), 메틸화(methylation), 인산화(phosphorylation), 해실화(hasylation), 카르바밀화(carbamylation), 황화(sulfation), 프레닐화(prenylation), 산화(oxidation), 구아니딜화(guanidination), 아미딘화(amidination), 카르바밀화(carbamylation) (예, 카르바모일화(carbamoylation)), 트리니트로페닐화(trinitrophenylation), 질산화(nitration), 페길레이션(PEGylation), 또는 이것들의 조합을 포함한다. 추가적으로, 단백질 변형은 또한 폴리펩티드의 검출, 정제, 및 분석 개발을 쉽게하기 위한 변형, 예를 들어 단백질의 일차 아민에 공유결합을 위한 술포-NHS-LC-_바이오틴과 폴리펩티드의 변형, 또는 형광, 비-동위성 또는 방사성 표지를 위한 다른 유사한 변형을 포함 할수있다. 대표적인EPO폴리펩티드에 추가적인 변형은 아래에 기술하였다. 콘쥬게이트이거나/이고 표지된 변형된 폴리펩티드가 또한 제공된다. 예를 들어 PEG 부위와 콘쥬게이션되거가 폴리펩티드 상에 하나 이상의 당화 자리에 공유적으로 연결된 탄수화물 부위를 포함하는 변형된 폴리펩티드가 본원에서 제공된다.
다른 구현예로, EPO 폴리펩티드의 다른 공지된 특성이 본원에서 제공된 임의의 하나 이상의 아미노산 변형에로 추가로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 EPO폴리펩티드의 적혈구세포 생성 또는 조직 보호 활성의 변경이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 생성된 변형된 EPO 폴리펩티드는 본원에서 기술한 임의의 분석법을 사용하여, 단백질 안정성(예, 단백질분해효소에 대한 저항성 증가)과 같은 폴리펩티드 특성, 또는 적혈구세포 생산 또는 조직 보호 활성과 같은 폴리펩티드 활성과 같은 폴리펩티드 활성을 평가하기 위한 하나 이상의 파라미터로 평가될 수 있다.
a. 면역원성
치료용 단백질의 효능은 많은 경우 치료용 단백질에 대한 원치않는 면역반응에 의해 제한된다. EPO와 같은 치료용 단백질에 대한 면역반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로에 의해 일어난다. 외래성 단백질은 삼켜져 (engulfed) DR, DQ, 또는 DP 형태의 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 제시를 위하여 가공된다. MHC 클래스 II 분자는 다른 것들 중 대식세포와 수지상세포와 같은 전문적인 항원제시세포(APCs)에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 임의의 다른 공-수용체에의 교차 결합과 함께 T-세포 표면에 있는 T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 결합은 T 세포 내 활성화된 상태를 유도한다. 활성화는 사이토카인의 배출을 초래하고, 추가로 B 세포와 같은 다른 림프구를 활성화시켜 항체를 생산하거나 전체적인 세포성 면역반응으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다. APC 표면에 제시를 위한 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드(T 세포 에피토프)의 능력은 여러가지 요인들 중 가장 현저하게는 그의 1차 서열에 따라 결정된다. 이는 단백질분해적 절단에 대한 그의 성향, 및 MHC 클래스 II 분자의 펩티드 결합 틈새 내에서 결합을 위한 친화력에 영향을 줄 것이다. APC 표면 위 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 상기 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자의 노출된 잔기에 의해 제공된 결정자를 인식할 수 있는 특정 T 세포 수용체 (TCR)에 대한 결합 표면을 제시한다.
치료용 EPO 폴리펩티드의 억제 항체 형성은 이 분야에서는 알려진 사실이다 (예를 들면, Casadevall 등(2002) N. Engl.J.Med.346:469-475; Macdougall (2004) Curr. Med. Res. Opin 20:83-86; Verhelst 등(2004) Lancet 363:1768-1771; Locatelli And Del Vecchio (2003) J.Nephrol. 16:461-466). 그러므로 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 전체적인 면역원성을 감소시키기 위한 변형을 가진 변형된 EPO 폴리펩티드 조합은 EPO 폴리펩티드의 치료적 특성을 증가시킬수 있다. T 세포 에피토프의 확인은 이 분야에서 알려져 있는 방법에 의해 수행될 수 있으며(예, 미국 특허 공개 번호 제2004-0063917호, 제2005-0220800호,제 2006-0035322호, 및 제2006-0073563호), MHC 클래스 II 분자에 EPO 펩티드의 결합 경향을 확인하는데 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 추가적인 변형은 단백질로부터 하나 이상의 T세포 에피토프의 활성의 실질적 감소 또는 제거, 즉, 폴리펩티드의 탈면역화를 초래하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 포함 할수 있다. 임의의 MHC 클래스 II 리간드의 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 변형은 인간 숙주와 같은 숙주에 치료제로서 투여하였을 때, 감소된 면역원성을 가지는 탈면역원화된 EPO 폴리펩티드를 초래할 수 있다.
T 세포 에피토프(epitope) 및 이에 의해 감소된 면역원성 잠재력을 지닌 탈면역원화된 EPO 폴리펩티드의 변형을 위한 대표적인 아미노산 위치는 다음 위치에 해당하는 하나 이상의 아미노산의변형을 포함한다: 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 EPO 폴리펩티드의 R4, L5, I6, D8, S9, R10, V11, L12, E13, R14, Y15, L16, L17, E18, A19, K20, E21, A22, E23, N24, I25, T27, G28, A30, C33, L35, N38, I39, T40, V41, D43, V46, F48, Y49, W51, K52, R53, M54A, M54C, M54D, M54E, M54G, M54, E55, V56, G57, Q58, Q59, A60, V61, E62, V63, W64, Q65, G66, L67, A68, L69P, L70, S71, E72, A73Q, A73, V74, L75, R76, G77, A79, L80, L81, V82, W88, E89, L91, Q92, L93, H94, V95, D96, K97, A98, V99, S100, G101, L102, R103, S104, L105, T107, L108, L109, R110, L112, G113, A114, Q115, K116, E117, A118, A118K, I119, S120, A124, A125, A127, L130, I133, A135, D136, F138, R139, K140, L141, F142, R143, V144, Y145, S146, N147, F148, L149, R150, G151, K152, L153E, K154, L155, Y156, T157, G158, E159, A160, C161, R162, T163 및 G164.
T 세포 에피토프 및 이에 의해 감소된 면역원성 잠재력을 지닌 탈면역원화된 EPO 폴리펩티드의 변형을 위한 대표적인 아미노산 치환은 다음을 포함하는 아미노산 변형을 포함한다: 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 EPO 폴리펩티드의R4A, R4C, R4G, R4P, L5A, L5C, L5D, L5E, L5G, L5H, L5K, L5N, L5P, L5Q, L5R, L5S, L5T, I6A, I6C, I6D, I6E, I6G, I6H, I6K, I6N, I6P, I6Q, I6R, I6S, I6T, I6M, I6W, D8A, D8C, D8G, D8P, S9P, S9T, R10A, R10C, R10G, R10P, V11A, V11C, V11D, V11E, V11G, V11H, V11K, V11N, V11P, V11Q, V11R, V11S, V11T, V11F, V11I, V11M, V11W, V11Y, L12A, L12C, L12D, L12E, L12G, L12H, L12K, L12N, L12P, L12Q, L12R, L12S, L12T, L12F, L12I, L12M, L12V, L12W, L12Y, E13A, E13C, E13G, E13P, R14A, R14C, R14G, R14H, R14P, R14T, Y15A, Y15C, Y15D, Y15E, Y15G, Y15H, Y15K, Y15N, Y15P, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15T, L16A, L16C, L16D, L16E, L16G,L16H, L16K, L16N, L16P, L16Q, L16R, L16S, L16T, L16W, L16Y, L17A, L17C, L17D, L17E, L17G, L17H, L17K, L17N, L17P, L17Q, L17R, L17S, L17T, L17F, L17I, L17M, L17V, L17W, L17Y, E18A, E18C, E18G, E18P, E18T, A19H, A19P, A19T, K20H, K20P, K20T, E21A, E21C, E21G, E21P, A22C, A22D, A22E, A22G, A22H, A22K, A22N, A22P, A22Q, A22R, A22S, A22T, E23P, E23T, N24A, N24C, N24G, N24P, I25A, I25C, I25D, I25E, I25G, I25H, I25K, I25N, I25P, I25Q, I25R, I25S, I25T, T27A, T27C, T27G, T27P, G28H, G28T, A30D, A30H, A30P, C33H, C33T, L35A, L35C, L35D, L35E, L35G, L35H, L35K, L35N, L35P, L35Q, L35R, L35S, L35T, L35M, L35W, L35Y, N38T, I39A, I39C, I39D, I39E, I39G, I39H, I39K, I39N, I39P, I39Q, I39R, I39S, I39T, T40D, T40H, V41A, V41C, V41D, V41E, V41G, V41H, V41K, V41N, V41P, V41Q,V41R, V41S, V41T, V41I, V41Y, D43T, V46A, V46C, V46D, V46E, V46G, V46H, V46K, V46N, V46P, V46Q, V46R, V46S, V46T, V46M, V46W, V46Y, F48A, F48C, F48D, F48E, F48G, F48H, F48K, F48N, F48P, F48Q, F48R, F48S, F48T, F48M, F48W, Y49A, Y49C, Y49D, Y49E, Y49G, Y49H, Y49K, Y49N, Y49P, Y49Q, Y49R, Y49S, Y49T, Y49M, Y49W, W51A, W51C, W51D, W51E, W51G, W51H, W51K, W51N, W51P, W51Q, W51R, W51S, W51T, K52A, K52C, K52G, K52H, K52P, K52T, K52E, K52D, R53A, R53C, R53G, R53H, R53P, R53Q, R53N, R53H, R53S, R53E, R53A, R53D, M54A, M54C, M54D, M54E, M54G, M54H, M54K, M54N, M54P, M54Q, M54R, M54S, M54T, M54F, M54I, M54L, M54V, M54W, M54Y, E55A, E55C, E55G, E55P, E55T, V56, V56A, V56C, V56D, V56E, V56G, V56H, V56K, V56N, V56P, V56Q, V56R, V56S, V56T, V56F, V56I, V56L, V56W, V56Y, G57C, G57D, G57E, G57H, G57K, G57N, G57P, G57Q, G57R, G57S, G57T, Q58A, Q58C, Q58G, Q58P, Q59A, Q59C, Q59G, Q59H, Q59P, Q59T, Q59K, Q59R, Q59M, Q59W, Q59L, Q59Y, Q59F, Q59N, Q59E, Q59I, Q59A, A60C, A60D, A60E, A60G, A60H, A60K, A60N, A60P, A60Q, A60R, A60S, A60T, V61A, V61C, V61D, V61E, V61G, V61H, V61K, V61N, V61P, V61Q, V61R, V61S, V61T, V61W, E62H, E62P, E62S, E62T, V63A, V63C, V63D, V63E, V63G, V63H, V63K, V63N, V63P, V63Q, V63R, V63S, V63T, V63F, V63I, V63M, V63W, V63Y, W64A, W64C, W64D, W64E, W64G, W64H, W64K, W64N, W64P, W64Q, W64R, W64S, W64T, Q65A, Q65C, Q65G, Q65P, G66D, G66E, G66H, G66K, G66N, G66P, G66Q, G66R, G66S, G66T, L67A, L67C, L67D, L67E, L67G, L67H, L67K, L67N, L67P, L67Q, L67R, L67S, L67T, L67F, L67I, L67H, L67V, L67W, L67Y, A68C, A68D, A68E, A68G, A68H, A68K, A68N, A68P, A68Q, A68R, A68S, A68T, L69A, L69C, L69D, L69E, L69G, L69H, L69K, L69N, L69P, L69Q, L69R, L69S, L69T, L69F, L69I, L69M, L69W, L69Y, L70A, L70C, L70D, L70E, L70G, L70H, L70K, L70N, L70P, L70Q, L70R, L70S, L70T, L70Y, S71A, S71C, S71G, S71H, S71P, S71T, E72H, E72P, E72T, A73E, A73H, A73P, A73Q, A73T, V74A, V74C, V74D, V74E, V74G, V74H, V74K, V74N, V74P, V74Q, V74R, V74S, V74T, V74F, V74I, V74W, V74Y, L75A, L75C, L75D, L75E, L75G, L75H, L75K, L75N, L75P, L75Q, L75R, L75S, L75T, L75F, L75I, L75V, L75W, L75Y, R76A, R76C, R76G, R76P, G77H, G77P, G77T, A79H, A79P, L80A, L80C, L80D, L80E, L80G, L80H, L80K, L80N, L80P, L80Q, L80R, L80S, L80T, L80F, L80I, L80Y, L81A, L81C, L81D, L81E, L81G, L81H, L81K, L81N, L81P, L81Q, L81R, L81S, L81T, V82A, V82C, V82D, V82E, V82G, V82H, V82K, V82N, V82P, V82Q, V82R, V82S, V82T, W88A, W88C, W88D, W88E, W88G, W88H, W88K, W88N, W88P, W88Q, W88R, W88S, W88T, E89A, E89C, E89G, E89P, L91A, L91C, L91D, L91E, L91G, L91H, L91K, L91N, L91P, L91Q, L91R, L91S, L91T, L91F, L91I, L91M, L91V, L91W, L91Y, Q92A, Q92C, Q92G, Q92P, L93A, L93C, L93D, L93E, L93G, L93H, L93K, L93N, L93P, L93Q, L93R, L93S, L93T, L93M, L93W, L93Y, H94P, H94T, V95A, V95C, V95D, V95E, V95G, V95H, V95K, V95N, V95P, V95Q, V95R, V95S, V95T, V95F, V95I, V95M, V95W, V95Y, D96A, D96C, D96G, D96H, D96P, D96T, K97A, K97C, K97G, K97P, A98C, A98D, A98E, A98H, A98K, A98N, A98P, A98Q, A98R, A98S, A98T, V99A, V99C, V99D, V99E, V99G, V99H, V99K, V99N, V99P, V99Q, V99R, V99S, V99T, V99W, V99Y, S100D, S100H, S100N, S100P, S100Q, G101D, G101E, G101H, G101K, G101N, G101P, G101Q, G101R, G101S, G101T, L102A, L102C, L102D, L102E, L102G, L102H, L102K, L102N, L102P, L102Q, L102R, L102S, L102T, L102F, L102I, L102W, L102W, L102Y, R103D, R103E, R103H, R103N, R103P, R103Q, R103S, R103T, R103 K, R103I, R103M, S104H, S104P, S104A, S104T, L105A, L105C, L105D, L105E, L105G, L105H, L105K, L105N, L105P, L105Q, L105R, L105S, L105T, L105I, L105Y, L105V, T107H, T107 K, T107R, T107N, T107G, T107D, T107E, L108A, L108C, L108D, L108E, L108G, L108H, L108K, L108N, L108P, L108Q, L108R, L108S, L108T, L108W, L108Y, L109A, L109C, L109D, L109E, L109G, L109H, L109K, L109N, L109P, L109Q, L109R, L109S, L109T, L109F, L109I, L109M, L109V, L109W, L109Y, R110A, R110C, R110G, R110P, R110 K, R110N, R110H, R110Q, R110T, R110D, R110Y, L112A, L112C, L112D, L112E, L112G, L112H, L112K, L112N, L112P, L112Q, L112R, L112S, L112T, L112F, L112I, L112M, L112V, L112W, L112Y, G113H, G113T, A114C, A114D, A114E, A114G, A114H, A114K, A114N, A114P, A114Q, A114R, A114S, A114T, Q115P, Q115T, K116A, K116C, K116G, K116P, E117H, E117P, E117T, A118C, A118D, A118E, A118G, A118H, A118K, A118N, A118P, A118Q, A118R, A118S, A118T, I119A, I119C, I119D, I119E, I119G, I119H, I119K, I119N, I119P, I119Q, I119R, I119S, I119T, I119W, I119Y, S120P, S120T, A124D, A124H, A124P, A125P, A125T, A127H, A127P, A127T, L130A, L130C, L130D, L130E, L130G, L130H, L130K, L130N, L130P, L130Q, L130R, L130S, L130T, L130M, L130W, L130Y, I133A, I133C, I133D, I133E, I133G, I133H, I133K, I133N, I133P, I133Q, I133R, I133S, I133T, I133W, I133Y, A135H, A135P, D136P, D136T, F138A, F138C, F138D, F138E, F138G, F138H, F138K, F138N, F138P, F138Q, F138R, F138S, F138T, F138M, F138W, F138Y, R139A, R139C, R139G, R139P, R139T, R139 H, R139K, R139Q, R139N, R139D, R139E, R139D, R139S, R139A, K140A, K140C, K140G, K140P, K140 D, K140E, L141A, L141C, L141D, L141E, L141G, L141H, L141K, L141N, L141P, L141Q, L141R, L141S, L141T, L141F, L141I, L141H, L141V, L141W, L141Y, F142A, F142C, F142D, F142E, F142G, F142H, F142K, F142N, F142P, F142Q, F142R, F142S, F142T, F142W, R143A, R143C, R143G, R143H, R143P, R143 M, R143L, R143K, R143Q, R143E, R143W, R143D, R143N, R143A, R143T, R143S, V144A, V144C, V144D, V144E, V144G, V144H, V144K, V144N, V144P, V144Q, V144R, V144S, V144T, Y145A, Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145H, Y145K, Y145N, Y145P, Y145Q, Y145R, Y145S, Y145T, Y145W, S146D, S146H, S146P, S146T, S146 F, S146L, S146Y, S146E, S146W, S146A, S146M, S146K, S146Q, S146G, S146N, N147P, N147T, N147D, F148A, F148C, F148D, F148E, F148G, F148H, F148K, F148N, F148P, F148Q, F148R, F148S, F148T, F148M, L149A, L149C, L149D, L149E, L149G, L149H, L149K, L149N, L149P, L149Q, L149R, L149S, L149T, L149F, L149I, L149H, L149V, L149W, L149Y, R150A, R150C, R150D, R150G, R150H, R150P, R150T, R150 K, R150E, R150Q,G151E, G151H, G151N, G151P, G151Q, G151S, G151T, G151A, K152A, K152C, K152D, K152G, K152N, K152P, K152Q, K152S, K152T, L153A, L153C, L153D, L153E, L153G, L153H, L153K, L153N, L153P, L153Q, L153R, L153S, L153T, L153F, L153I, L153M, L153V, L153W, L153Y, K154A, K154C, K154D, K154E, K154G, K154H, K154N, K154P, K154Q, K154S, K154T, K154F, K154W, K154L, K154M, K154Y, L155A, L155C, L155D, L155E, L155G, L155H, L155K, L155N, L155P, L155Q, L155R, L155S, L155T, L155F, L155I, L155M, L155V, L155W, L155Y, Y156A, Y156C, Y156D, Y156E, Y156G, Y156H, Y156K, Y156N, Y156P, Y156Q, Y156R, Y156S, Y156T, Y156M, Y156W, Y156Y, T157A, T157C, T157F, T157G, T157I, T157L, T157M, T157P, T157V, T157W, T157Y, T157N, T157D, T157E, G158C, G158D, G158E, G158F, G158H, G158I, G158K, G158M, G158N, G158P, G158Q, G158R, G158S, G158T, G158V, G158W, G158Y, E159A, E159C, E159F, E159G, E159I, E159L, E159M, E159P, E159T, E159V, E159K, E159Y, A160D, A160F, A160H, A160I, A160L, A160P, A160V, A160W, A160Y, C161D, C161E, C161F, C161H, C161I, C161K, C161L, C161N, C161P, C161Q, C161R, C161S, C161T, C161V, C161W, C161Y, R162T, T163A, T163C, T163F, T163G, T163I, T163L, T163M, T163P, T163V, T163W, T163Y, G164F, G164H, G164I, G164N, G164P, G164Q, G164S, G164T, G164V, G164W, 및 G164Y.
EPO 폴리펩티드의 면역원성을 감소시키는데 기여할 수 있는 대표적인 아미노산 변형은 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 EPO폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는, 표 4에 제시된 하나 이상의 변형에 상응하는 임의의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
Figure 112009039361308-pct00004
Figure 112009039361308-pct00005
Figure 112009039361308-pct00006
b. 당화( glycosylation )
치료적 활성을 가진 많은 단백질들은 하나 이상의 당화 위치, 즉 진핵 세포에 의해 당화되는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어 아미노산 서열은 진핵성 세포에 의해 당화된다. 치료용 단백질의 당화 정도는 1) 면역원성 감소 2) 단백질의 투여 회수 감소 3) 혈청내 반감기(half-life) 증가와 같은 단백질 안정성 증가 및 4) 염증 반응과 같은 부작용 감소를 위해 바꿀수 있다. 당화 위치(들)은 당화능이 있는 진핵세포에서 대상 폴리펩티드가 생산될 때 당화되는 대상 폴리펩티드에 탄수화물 부위의 결합을 위한 위치를 제공한다. EPO 폴리펩티드의 추가적 당화는 혈청 반감기 증가 면역원성 감소 생체 내 반감기 증가 위장관 조건, 예를 들어 위장관 단백질분해효소에 의한 분해 감소 및 장 상피세포의 흡수율 증가를 포함한 하나 이상의 장점을 부여한다. 장 상피세포에 의한 흡수율 증가와 위장관 조건에 의한 분해 감소는 EPO 폴리펩티드의 장용 (예, 경구) 제형에 있어 중요하다.
당화는 안정성, 용해성 증가와 단백질의 면역원성 감소에 의해 폴리펩티드의 혈청내 반감기를 증가시킬수 있다. 당화는 단백질분해효소에 의한 단백질분해를 감소시켜 단백질의 안정성을 증가시키고, 열 변성, 변성화제에의 노출, 산소 자유 라디칼(oxygen free radical)에 의한 손상, 그리고 pH 변화로부터 단백질을 보호할 수 있다. 당화는 또한 표적 단백질이 세포 표면 수용체를 포함한 다른 단백질과의 결합을 포함하는 제거 메커니즘을 회피하도록 할 수 있다. 시알산을 포함하는 탄수화물 부위는 단백질의 용해성에 영향을 줄 수 있다. 시알산 부위는 표적 단백질의 소수성 잔기를 차폐 할수 있다. 이는 표적 단백질의 침전과 응집을 감소시킨다. 감소된 응집은 또한 표적 단백질에 대항하는 면역반응의 회피를 돕는다. 탄수화물은 더욱이 면역체계로부터 면역원성 서열을 차폐할수 있다. 탄수화물 부위에 의해 차지된 공간의 부피는 면역 체계에 의해 전망되는 이용 가능한 표면 지역을 감소시킬 수 있다. 이러한 특징들은 표적 단백질의 면역원성을 감소시킨다.
단백질의 당화는 폴리펩티드에 올리고당의 공유결합에서 기인하는 당단백질의 형성을 초래한다. 당단백질에서 발견된 탄수화물 변형은 O-글리코시딕(glycosidic) 또는 N-글리코시딕(glycosodic) 결합을 통해 상기 단백질 구성요소와 결합된다. 포유동물 세포의 당단백질에서 현저한 탄수화물 부착은 N-글리코시딕(glycosidic) 결합에 의한다. N-글리코시딕(glycosidic) 결합은 아스파라긴(asparagines) 의 아마이드(amide) 그룹의 질소에 의한다. N-결합 당단백질의 탄수화물 부착 위치는 아미노산 공통 서열 N-X-S/T 내에서 발견되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. N-결합 당화에서 단백질에 직접적으로 부착되는 탄수화물은 14-잔기의 올리고당, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이다. 당전이효소(Glycotransferase)는 결과적으로 부착된 올리고당을 변형시켜 성숙한 N-글리칸을 형성한다. N-결합 올리고당은 만노즈, N-아세토글루코사민을 포함하고, 전형적으로 몇 개의 탄수화물 가지를 포함하고, 각각은 음전하를 띄는 시알산 잔기로 종결된다. 단백질 2차 구조는 당화를 위한 목표로서 공통 위치의 이용 가능성에 영향을 줄 수 있다. 당화는 매우 숙주세포-의존적이라고 알려져 있기 때문에, 단백질의 N-결합 당화와 관련된 당 사슬들은 상이할 수 있다. (Kagawa 등,(1998) JBC 263:17508-17515). O-글리코시딕 결합은 세린, 트레오닌, 또는 히드록시리신의 수산기에서 일어난다. Ser 또는 Thr- 형태 O-결합 당단백질에서 단백질에 직접적으로 부착된 탄수화물은 N-아세틸갈락토사민 (GalNac) 또는 갈락토스와 같은 단당류이다. 당전이효소는 결과적으로 변형된 잔기에 추가적인 탄수화물 부위를 붙여 성숙한 O-글리칸을 형성하며, 이는 전형적으로 하나에서 네개의 당잔기를 갖는다. O-결합 당화는 전형적으로 확장된 베타 턴(beta turn)과 같은 단백질 2차 구조에 의해 정해진 위치에서 일어난다. O-결합 당화 위치의 수는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, Ten Hagen 등(1999) J.Biol. Chem., 274:27867-74; Hanish등 (2001) Glycobiology, 11:731-740; 및 Ten Hagen등 (2003) Glycobiology, 12:1R-16R 참조.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 EPO 폴리펩티드에서 발견되지 않은 적어도 하나의 비-천연 당화 위치에 공유적으로 결합된 탄수화물 부위 또는 비변형된 EPO 폴리펩티드에서 발견되나 당화되지 않은 적어도 하나의 천연 당화 위치에 공유적으로 결합된 탄수화물 부위 때문에 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교해 볼 때 더 당화될 수 있다. EPO 폴리펩티드는 하나 이상의 위치에서 변형되어 폴리펩티드의 당화에 영향을 줄 수 있다 (즉, 고당화). 고당화된 EPO 폴리펩티드는 O-결합 당화, N-결합 당화 및/또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 경우에 따라서는 고당화된 EPO 폴리펩티드는 당화 1, 2, 3, 4, 5 이상의 탄수화물 부위를 포함 할수 있으며, 각각은 다른 당화 자리에 연결된다. 다른 예에서, 고당화된 폴리펩티드는 한 개의 비-천연 당화위치에서 당화될 수 있다. 다른 예로, 고당화된 폴리펩티드는 비-천연 당화자리에서 당화 할 수 있다. 예를 들어 고당화된 EPO 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5 이상의 비-천연 당화 위치에서 당화될 수 있다. EPO 폴리펩티드에 당화 위치를 생성하거나, 변형하거나, 제거 또는 재배열할 수 있다. 예를 들어 천연 당화 위치는 당화를 향상 또는 감소시키거나 당화를 막기 위해 변형될 수 있으며, 반면에, EPO폴리펩티드의 다른 위치는 새로운 당화 위치를 만들거나 또는 존재하는 위치의 당화를 향상 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 경우에 따라서는 EPO 폴리펩티드의 탄수화물 함량은 변형 될수 있다. 예를들면, EPO 폴리펩티드에 추가된 탄수화물 부위의 탄수화물 연결의 위치 번호, 결합 세기, 구조 및 조성(즉, 탄수화물의글리코시딕 결합 또는 가지의 특성에 기초한 탄수화물의 구조)을 바꿀 수 있다. 이러한 특성은 상이한 공지된 재조합 에리스로포이에틴, 예를 들면 에포에틴-α, 에포에틴-β, 에포에틴-ω 및 에포에틴-δ, 비뇨기 인간 에리스로포이에틴 사이에서 다양하다. 한 예로, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 시알산 부위의 수는 변형되었다.
본원에서 제공된 당화된 EPO 폴리펩티드의 시알산 함량을 포함하는 탄수화물 함량은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 변경될 수 있으나, 다른 당화 패턴 생산을 위한 EPO 폴리펩티드 일차서열의 변형, 효소에 의한 또는 화학적인 변형, 다른 숙주세포 또는 변형된 숙주세포에서 생산, 및 특정 당화 프로파일을 가진 EPO 폴리펩티드를 풍부하게 하기 위한 정제 방법을 포함하며, 이것에 제한되지 않는다.
이러한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 출원 번호 제 2004-0137557호,제2005-0153879호, 제2005-0181359호, 제2005-0192211호, 제2005-0288220호, 제2006-0088906호 및 제2006-0121611에 기재된 것과 같은 변형된 EPO 폴리펩티드를 포함한다. 추가적으로, 숙주세포가 변형된 EPO 폴리펩티드를 발현하는 성장 조건(예, 배지조성)은 당화, 특히 시알산 함량의 제공된 변화로 변경될 수 있다 (예, 미국 특허 출원 번호 제2004-0115768호 참조).
EPO 폴리펩티드를 포함한 상업적인 제품은 예를 들어 당화 위치의 수를 변화시키거나, 당화 패턴 또는 EPO폴리펩티드에 부착된 탄수화물 성분의 함량을 변화시킴으로써 EPO폴리펩티드의 당화가 다르게 발전되어 왔다. 예를 들어 에포젠(암젠)은 분자량이 30,400 달톤, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생산된 22개의 시알산 잔기를 갖는 α-당화된 형태이며, 네오레코몬?(또는 리코몬? 로슈)은 더 큰 분자량 및 더 낮은 수의 시알산화 글리칸 잔기를 가지는 큰 중국 햄스터 난소세포(CHO)에서 생산된 EPO의 b-당화된 형태이며 에포맥스? (엘라넥스), 또는 에포에틴-ω은 분자량이 35kDa이며 BHK세포에서 생산되고, 당화의 양, 특히 상이한 시알산화(sialylation)의 양에서 α 및 β 형태와 상이하다.
경우에 따라서는, 고당화된 EPO 폴리펩티드는 천연 당화 위치에서 당화된다. 예를 들어, EPO, 예를 들어 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 EPO는 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 EPO 폴리펩티드와 관련하여 N24, N38, 및 N83에 N-결합 당화 위치를 가지며, S126에 O-결합 당화 위치를 포함한다. EPO 폴리펩티드는 단일 또는 그이상의 천연형 당화 위치에서 당화 될 수 있다. EPO 폴리펩티드는 하나의 천현 당화 위치에서, 또는 하나 이상의 천연 당화 위치, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 이상의 천연 당화 위치에서 당화될 수 있다. 고당화된 EPO 폴리펩티드는 또한 천연 당화 위치와 비-천연 당화 위치에서 당화될 수 있다. 고당화 EPO 폴리펩티드는 또한 다수의 천연 및 비-천연 당화 위치에서 당화될 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 N- 및/또는 O-결합 단백질 당화를 할 수 있는 진핵 세포에서 합성될 때 비변형된 EPO 폴리펩티드에서 발견되지 않는 적어도 하나의 추가적인 탄수화물 부위를 가질 수 있다. 따라서 예를 들면 고당화 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10 또는 이상의 추가적인 탄수화물 부위를 가질 수 있다. 예를 들어 비변형된 EPO 폴리펩티드가 하나의 공유적으로 결합된 탄수화물 부위을 가지는 경우 고당화된 EPO 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 공유적으로 결합된 탄수화물 부위를 가질 수 있다. 경우에 따라서는, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 고당화된 EPO 폴리펩티드는 비-천연 당화 위치에 공유적으로 결합하는 탄수화물 부위를 결여하고 있으며, 대신에 천연 당화 위치에 부착할 수 있는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 그 이상의 추가적인 탄수화물 부위를 가지고 있다. 다른 예로 고당화된 EPO 폴리펩티드는 천연 당화 위치에 공유적으로 결합하는 탄수화물 부위를 결여하며 대신에 비-천연 당화 위치에 부착할 수 있는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 탄수화물 부위를 가지고 있다.
탄수화물 부위를 부착하기 위한, 당화 위치 변형을 위한 본원에서 고려된 대표적인 아미노산 위치는 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 EPO 폴리펩티드의 N24, N38, N83 및 S126과 같은 천연 위치에 상응하는 위치를 포함한다. 경우에 따라서는 변형된 EPO 폴리펩티드는 모든 당화 위치 또는 하나, 둘, 셋 또는 네개의 천연 당화 자리를 제거하는 하나 이상의 변형을 가지고 있다. 당화를 막거나, 새로운 당화 위치를 만들거나, 기존의 위치에 당화를 증가, 감소시키거나, 또는 그것들의 조합을 위해 변형될 수있는 아미노산 치환 또는 치환들이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 아미노산 변형은 다음의 하나 이상의 비제한적 예를 포함할 수 있다: 서열번호 2 또는 237에 제시된 성숙한 EPO폴리펩티드의
N38H/R139H, N38H/R139H/R4H, N38H/R139H/L93I, N38H/R139H/K20Q, N38H/R139H/E159N, N38H/R139H/K52N, N38H/R139H/L153V, N38H/N83H/R139H, K20Q/N38H/N83H/R139H, N38H/ N83H/R139H/L93V, N38H/ N83H/R139H/L80I, N38H/ N83H/R139H/L93I, K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H, K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H, K20Q/N38H/N83H/L93V/R139H, N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, N24H/N38H/N83H/R139H/L93V, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V, R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V, L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, A30N, W51N, G57N, L69N, W88N, E89N, D136N, F138N, K52N/M54T, R53N/E55T, A30N/H32T/P87V/W88N/P90T, A30N/H32T/P87V/W88N/P90T/A125T, A30N/H32T/R53N/E55T/P87V/W88N/P90T, E55N/G57T, Q86N/P87V/W88T, P87A/W88N/P90T, P87V/W88N/P90S, P87V/W88N/E89G/P90T, A30N/H32T/R53N/E55T, A114N/K116T, A30N/H32T/A114N/K116T, A30N/H32T/R53N/E55T/P87V/W88N/P90T/A114N/K116T,
A30N/H32T/ E55N/G57T, A30N/H32T/E55N/G57T/P87V/W88N/P90T, A30N/H32T/E55N/G57T/A114N/K116T, A30N/H32T/P87V/W88N/P90T/A114N/K116T, A30N/H32T/E55N/G57T/P87V/W88N/P90T/A114N/K116T, A30N/H32T/E55N/G57T/P87V/W88N/P90T/A124P/A125T/S126T, A30N/H32T/E55N/G57T/A114N/K116T/A124P/A125T/S126T, R4N/I6S, S9N/V11S, L69N, A124N, A125N/A127S, T163N/D165S, A125T, A125T/A124P, L69N/S71T, L69N/A68S/S71T, A125N/A127T, A125N/A127T/R131T, A125N/A124P/A127S, A125N/A124P/A127T, A125T/S126T, A125T/A124P/S126T/R131S, A30N/H32T, A30N/H32T/ P87V/W88N/P90T, W51N/R53T, P87V/W88N/P90T, P87S/W88N/P90T, P87S/W88N/E89G/P90T, P87S/W88N/P90T/Q92T, P87S/W88N/P90T/R162A, L69N/S71T/P87S/W88N/P90T, L69N/S71T/P87V/W88N/P90T, E89N/P90I/L91T, P87S/E89N/P90I/L91T, D136N/F138T, F138N/K140T, A125T, A124P/A125T, N24Q/P87S/W88N/P90T, N38Q/P87S/W88N/P90T, N83Q/P87S/W88N/P90T (예, 미국 특허 번호. 제5, 856,298호, 미국 특허 공개 번호 제2003-0120045호 국제 특허 공개 번호 유럽 제0640619호). 경우에 따라서는, 아미노산 변형은 N38과 같은 천연 당화 위치를 성숙한 EPO의 W51, G57, L69, W88, E89, D136, 또는 F138과 같은 다른 위치로 재배치할 수 있다 (예, PCT 공개 WO 01/81405, 참조). 상세한 예로써, 변형된 EPO 폴리펩티드의 고당화에 공헌하는 아미노산 치환 또는 치환들은 아스파라긴(N)이나 트레오닌(T)에 의한 치환이다. 아미노산 변형의 다른 특별한 예는 다음의 변형 어느 하나 또는 모두로부터 선택할 수 있다: A30N/H32T 및 P87V/W88N/P90T (Elliot 등(2004) J. Biol. Chem. 279(16): 16854-16862; Elliott 등 (2003) Nat. Biotechnol. 21: 414-421.). 본원에서 제공된 임의의 변형은 고당화된 에리스로포이에틴 유사체를 만드는 임의의 변형과 조합될 수 있다. 하나의 비제한적 고당화 에리스로포이에틴 유사체는 새로운 적혈구세포 생성 자극 단백질이며 (NESP), 아미노산 변형 A30N, H32T, P87V, W88N, P90T 을 포함한다 (예, PCT 공개번호 WO 00/24893, 아라네스프? (암젠)).
대상 EPO 폴리펩티드가 N-결합 및/또는 O-결합 당화를 가지고 있는지는 표준 기술을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어 효소처리, 전기영동 분석, 등전점전기영동, 및 면역조직화학 (예, "Techniques in Glycobiology" R. Townsend and A. Hotchkiss, eds. (1997) Marcel Dekker; and "Glycoanalysis Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 76)"E. Hounsell, ed. (1998) Humana Press. 참조), 화학적 또는 효소적인 탈당화처리(예 엔도글라이코시다아제, 및/또는 엑소글라이코시다아제) 전과 후의 단백질의 정전기적인 이동의 변화는 일반적으로 단백질의 당화 상태를 결정하는 데 사용된다. 효소적 탈당화는 다음을 포함하는 다양한 효소를 이용하여 수행하지만, 이에 제한되지 않는다: 펩티드-N4-(N-아세틸-β-D-글라이코사미닐) 아스파라긴 아미다아제 (PNGase F); 엔도글라이코시다제 F1, 엔도글라이코시다제F2, 엔도글라이코시다제 F3, (2,6,8,9) 뉴라미니다아제(neuraminidase), 등. 예를 들어, PNGase F로 전처리하거나 처리하지 않은 단백질의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)이 수행된다. PNGase F 처리 후 이동 위치의 변화 및 밴드 폭의 현저한 감소는 N-결합 당화의 특징으로 고려된다. 당화된 단백질의 탄수화물 함량은 단백질 블랏(예, SDS-PAGE로 분리하고 나일론 멤브레인과 같은 지지체에 전달된 단백질)의 렉틴 분석을 이용하여 검출할수 있다. 다양한 식물 조직에서 탄수화물 결합 단백질인 렉틴은 당단백질 글리칸에서 발견되는 넓은 범위의 정의된 당 에피토프에 대한 높은 친화력 및 좁은 특이성을 가지고 있다 (Cummings (1994) Methods in Enzymol. 230:66-86). 렉틴은 검출하도록 표지되어 (직접 또는 간접) 당화된 단백질의 탄수화물에 렉틴 결합의 검출을 가능하게 한다. 예를 들어, 바이오틴(biotin)이나 디옥시제닌(digoxigenin)과 콘쥬게이션되었을 때, 당화된 단백질에 결합된 렉틴은 검출가능한 생성물질의 수득을 위해 알카라인 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제 (horse raddish peroxidase)와 같은 효소와 콘쥬게이션된 아비딘이나 항-디옥시제닌 항체를 이용한 반응을 통해 멤브레인 블랏으로 쉽게 확인될 수 있다. 정의된 특이성을 가진 일련의 렉틴을 이용한 스크리닝은 당단백질의 탄수화물 보충에 대한 정보를 제공한다.
앞서 언급했듯이, 당화된 또는 고당화된 재조합 EPO 형태를 포함하여 당화된 또는 고당화된 EPO폴리펩티드가 상업적으로 개발되었다. 이런 당화된 형태는 비당화된 EPO폴리펩티드에 비해 생체내에서 더 높은 생체 내 증식 활성을 가지는 것으로 발견되었으며, 이는 비-당화된 형태의 급속한 제거에 기인할 것이다(예, Lukowsky and Painter (1972) Can. J. Biochem. 60: 909-917; Goldwasser 등 (1974) J. Biol. Chem. 249, 4202-4206; Sasaki (1987) Methods Enzymol. 147: 328-340; Goto 등 (1988) Bio/technology 6: 67-71). 그럼에도 불구하고, 당화가 감소되었거나 없는 EPO 폴리펩티드 일부 형태는 생체 내 더 낮은 증식 활성을 보이지만, 또한 야생형 당화된 EPO 와 다른 당화된 형태의 EPO에 비해 시험관 내 검정에서 더 높은 증식 활성 및 EPO 수용체에 대한 더 큰 결합을 가지는 것으로 보고 되었다.(예, Yamaguchi 등 (1991) 266(30): 20434-20439). 따라서, 본원에서 제공된 변형된 EPO의 발현을 위한 시스템(예, 박테리아, CHO 또는 BHK 같은 포유동물 세포)을 EPO 폴리펩티드의 적용을 고려하여 특정 EPO 당화 또는 비당화를 생산하기 위해 선택할 수 있다. 비-당화 형태의 변형된 EPO폴리펩티드는 예를 들면 EPO 대조군으로서 시험관 내 분석, EPO 수용체 농도의 검출을 위해 유용하거나, 또는 EPO 저해제의 분석 또는 스크리닝에 사용된다.
c. 부가적인 변형들
본원에서 제공된 폴리펩티드의 부가적인 변형에는 폴리펩티드의 화학적 유도체화를 포함하여, 아세틸화 및 카르복실화 페길레이션, 또는 다른 변경에 민감한 단백질을 만들거나 EPO 폴리펩티드의 특성을 바꾸는 아미노산 서열의 변경을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. EPO 폴리펩티드의 변형을 위한 부위(moiety)는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 중합체, 카르복시메틸셀룰로즈, 덱스트란,폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘 또는 폴리프롤린을 포함하여 고려되지만, 이에 제한되지 않는다 (Abuchowski 등 (1981); Newmark 등 (1982); and Katre 등 (1987)). 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 성분을 사용하여 변형(페길레이션)될 수 있다. 활성화된 PEG 유도체는 EPO 폴리펩티드와 직접 반응하기 위해 사용될 수 있으며, 카르복실산 또는 카르보네이트 유도체의 활성 에스테르, 특히 이탈기 (leaving group)가 N-히드록시숙신이미드, p-니트로페놀, 이미다졸 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-술포네이트인 것들을 포함한다. 설프히드릴 그룹의 변형을 위해 말레이미도 또는 할로아세틸 그룹을 포함하는 PEG 유도체를 사용할 수 있으며, 탄수화물 그룹의 과요오드산 산화에 의해 생성된 알데히드를 변형하기 위해 하이드라진 또는 하이드라자이드 그룹을 함유하는 PEG 시약을 사용할 수 있다. 경우에 따라서는, 본원에서 제공된 변형된 EPO폴리펩티드는 감소된 혈청 제거를 가진 PEG-유도체화된 폴리펩티드를 제공할 수 있도록 조작된 하나 이상의 비-천연 발생 페길레이션 위치를 포함할 수 있다. 페길레이션을 생성하기 위한 대표적인 아미노산 변형은 성숙한 EPO 폴리펩티드의 A1C, P2C, P3C, R4C, D8C, S9C, N24C, I25C, T26C, T27C, G28C, A30C, E31C, H32C, S34C, N36C, N38C, I39C, T40C, D43C, T44C, K45C, N47C, A50C, K52C, E55C, G57C, Q58C, G77C, Q78C, A79C, N83C, S84C, S85C, Q86C, W88C, E89C, T107C, R110C, A111C, G113C, A114C, Q115C, K116C, E117C, A118C, S120C, P121C, P122C, D123C, A124C, A125C, A127C, A128C, T132C, K154C, T157C, G158C, E159C, A160C, T163C, G164C, 및 D165C를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(예, 미국 특허 공개번호 제2005-0107591호 및 국제 특허 공개번호WO 90/12874 참조). 추가적으로, PEG 부위등의 작용기 부착을 위한 자유 티올(free thiol) 그룹을 생산하기 위해 EPO폴리펩티드에 N-말단 시스테인을 추가할 수 있다(예, 미국 특허 공개번호 제2005-0170457호 참조).
또한 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌 과같은 인산화된 아미노산 잔기를 가지는 변형된 EPO폴리펩티드 서열이 고려된다(예,미국 특허 번호 제6,335,176호 참조).
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 다른 적절한 부가적인 변형은 단백질분해효소에 의한 분해 저항성을 향상시키거나, 용해성을 최적화하거나 치료제로서 적합성을 보다 증가시키기 위한 통상의 화학적 기술을 이용하여 변형된 폴리펩티드이다. 예를 들어, 안정성을 높이기 위해 펩티드의 골격(backbone)을 고리화 할수 있다 (예, Friedler 등 (2000) J. Biol. Chem. 275:23783-23789 참조). 다른 대표적인 변형으로서 본원에서 제공된 변형된 EPO폴리펩티드에 히드록시알킬스타치 (HAS) 부위를 첨가가 있다. EPO 폴리펩티드의 해실화(hasylation)의 대표적인 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예로서 미국 특허출원 번호 제2006-0019877호에 기술되어 있다. 그러나, 다른 대표적인 변형은 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 또는 아미노산의 1차 아민의 카르바밀화를 포함한다. EPO폴리펩티드의 카르바밀화의 대표적인 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예로서 미국 특허 출원번호 제 2006-0135754호에 기술되어 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO폴리펩티드에 비천연 아미노산이 결합될 수 있다. 본원에서 확인된 단백질분해효소 저항성을 증가시키기 위한 위치에 비천연 아미노산이 삽입될 수 있다. 천연 발생 L-아미노산 이외의 잔기예를 들면, D-아미노산 또는 비-천연 발생 합성 아미노산을 포함하는 유사체를 사용할 수 있다. 대표적인 비-천연 발생 합성 아미노산은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 티로신 아미노산의 비천연 유사체; 글루타민 아미노산의 비천연 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 비천연 유사체; 세린 아미노산의 비천연 유사체; 트레오닌 아미노산의 비천연 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 하이드라진, 하이드라자이드, 하이드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 설포닐, 셀레노, 에스테르, 티올산, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 히드록실아민, 케토, 또는 아미노 치환 아미노산 또는 그것들의 조합; 광활성화가능 교차-연결자를 가지는 아미노산; 스핀-표지된 아미노산; 형광성 아미노산; 비천연 관능기를 가진 아미노산; 다른 분자와 공유 또는 비공유 결합하는 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속-포함 아미노산; 방사성 아미노산; 광포획(photocaged) 및/또는 광이성질화가능(photoisomerizable) 아미노산; 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함한 아미노산; 당화된 또는 탄수화물 변형된 아미노산; 케토를 포함하는 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 중원자 치환 아미노산; 화학적으로 절단할 수 있거나, 또는 광분해가능한 아미노산; 연장된 측쇄를 가진 아미노산; 독성기를 포함하는 아미노산; 당 치환된 아미노산, 예를들면, 당 치환 세린 등; 탄소-연결 당-포함 아미노산; 산화환원-활성인 아미노산; α-수산기가 있는 산; 아미노 티오 산을 포함한 아미노산; α, α 이중치환 아미노산; β-아미노산; 및 프롤린 이외의 고리화된 아미노산. 예를 들면, 비천연 아미노산은 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, a 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAc β-세린, L-도파, 불소화 페닐알라닌, 아이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 파라-아세틸-페닐알라닌 (pAcF), L-디플루오로메티오닌 (DFM), 및 아이소프로필-L-페닐알라닌을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
비천연 아미노산은 다음을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드 내로 혼입될 수 있지만 이에 한정되지는 않는다: 반응성 측쇄가 있는 아미노산의 유도체화, 화학 합성, 효소적 결찰(ligation), 자연적인 화학 결찰, 억제자 tRNA가 화학적 또는 효소적으로 비천연 아미노산으로 아실화되는 시험관내 생합성 방법, 억제자 tRNA의 선택적인 압력 결합에 의해 아미노산으로 아실화된 생체내 방법 , 비천연 아미노산을 tRNA에 결합하도록 하는 교정 메커니즘을 가지는 합성효소의 변형, 단백질에 비천연 아미노산이 결합되도록 하는 tRNA 미세주사 기술, 또는 오르쏘고날 tRNA 합성효소를 이용한 비천연 아미노산을 운송하는 변형된 오르쏘고날 tRNA의 생체 합성법 (참조:Dawson and Kent, (2000) Annu. Rev. Biochem. 69: 923; Cor nish 등(1995) Chem. Int. Ed. Engl. 34:621; Nor en 등(1989) Science 244: 182-188; Bain 등 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-8014; Budisa 등 (1999) FASEB J., 13:41; Nowak 등 (1995) Science 268: 439; Dougherty (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 645; Brunner (19993) Chem. Soc. Rev. 22: 183 - 89; U.S. 특허 출원 번호 2006-0233744 및 2006-0153860).
본원에서 제공된 EPO폴리펩티드 변형은 또한 EPO 폴리펩티드의 번역 후 프로세싱을 개선하기 위한 변형과 결합될 수 있다. 예를 들면, EPO는 상기 논의한 바와 같이, 당화와 같은 번역 후 변형을 개선하거나, 신호 서열의 단백질분해적 절단을 개선하기 위하여 변형될 수 있다.
본원에서 제공된 EPO폴리펩티드의 변형은 EPO폴리펩티드의 안정성, 결합 특성, 및 혈청 반감기를 더욱 증가시키기 위한 아미노산 변형과 조합될 수 있다. 예를 들어 추가적 변형은 EPO 수용체 (EPOR) 또는 2차 수용체와 같은 EPO 수용체와 결합하는 EPO 폴리펩티드의 능력에 영향을 주는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를들면, 아미노산 변형은 EPO폴리펩티드와 그 수용체 사이의 분자의 접촉 지역에서 일어날 수 있다.이와 같은 변형들은 수용체와 상호 작용을 증가, 또는 감소시키거나 또는 EPO에 의한 수용체의 활성화를 증가, 또는 감소시킬 수 있다. EPO와 수용체의 상호작용에 영향을 미치는 대표적인 아미노산 변형에는 다음의 임의의 비-제한적인 예들을 포함할 수 있다: C7A, R14A/Y15A, L16A, P42A, D43A, F48A, Y49A, T132A, I133A, T134A, N147A, P148A, R150A, K152W,G151A, G158A, C161A, R162A, F48V, F138V F142V, F148V D8S, S9A, S9N, R10A, E13A, R14L, Y15F, L16A, L16S, L17A, L17S, K20A, K20I, K20R, K45A, K45R, N47A, F48I, F48S, Y49F, Y49S, K52S, K52R, K52Q, Q78A, Q78E, Q78R, D96A, K97R, S100A, S103K, T107A, T107L, T107S, R110T, R131T, K140A, K140R, K140M, K140T, R143E, K154A, K154R, K154S, R10I, V11S, R14A, R14E, R14Q, Y15I, K20E, T44I, K45I, K45D, V46A, F48G, K52E, D96R, K97A, K97E, V99A, V99S, S100R, S100E, S100T, S103A, S103E, S103H, S103N, S103Q, S104A, S104I, L108A, L108K, R110E, R143A, N147A, N147K, R150A, R150Q, R150E, G151A, L155A, 및 L155N (참조, 미국 특허공개번호 2004-0122216, 2005-0176627, 2006-0008872; Syed (1998) Nature 395:511-516).
본원에 제공된 EPO 폴리펩티드의 변형은 EPO 폴리펩티드의 특성을 개선할 수 있는 카르복실-말단의 연장과 또한 조합될 수 있다. 제한되지 않는 한 예로써, 사람 융모막의 성선자극호르몬의 C-말단 종결에서 유도된 단백질 (SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ; 참조: 미국 특허공개번호 2003-0120045)의 연장이다. 제한되지 않는 다른 예로서, 본원에 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 카르복실기 말단 지역에 양전하로 대전된 염기성 아미노산의 첨가는 EPO의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다(미국 특허 5457089 참조). 제한되지 않는 예로서, 하나 이상의 아르기닌 또는 리신 잔기가 본원에서 제공된 변형된 EPO폴리펩티드의 C-말단에 첨가된다(예, R166/R167, R166/R167/A168, R166/R167/K168/R169, R166/R167/K168/R169/A170, R166/R167-176(다중 리신), R166/R167-176(다중 리신)/A177).
본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드 변형은 또한 안정성 증가, 혈청 내 반감기 증가, 순도 증가, 또는 적혈구 생성 활성 또는 조직 보호 활성의 변경을 포함하는 활성을 개선한 EPO 폴리펩티드를 만드는 다른 변형들과 또한 조합 가능하다. 다음의 변형들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: I6A, C7A, C7S, C7H, S9A, R10A, R10I, V11S, L12A, E13A, R14A, R14L, R14E, R14Q, Y15F, Y15A, Y15I, L16A, L17A, E18A, K20A, K20E, E21A, N24Q, N38Q, N24K, C29S, C29Y, A30N, H32T, C33S, C33Y, N38K, P42N, P42A, D43A, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, F48S, Y49A, Y49S, Y49F, Y49A, A50S, A50S, W51F, W51N, W51S, K52A, K52S, M54L, Q59A, Q59N, E62A, E62T, W64A, Q65A, G66A, L67S, L69A, L70A, S71A, E72A, A73G, R76A, Q78A, N83K, N83Q, Q92A, L93A, H94A, V95A, D96R, D96A, K97A, S100A, S100R, S100E, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, R103D, R103N, R103E, R103Q, R103H, R103L, R103K, S104A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108A, L108K, L109A, K116A, E117G, S126A, S126T, S126G, T132A, I133A, T134A, D136A, R139A, R139C, K140A, F142I, R143A, Y145F, Y145A, S146A, N147A, N147K, F148Y, L149A, R150A, R150E, G151A, K152A, K152W, L153A, K154A, L155A, Y156A, Y156F, T157A, G158A, E159A, C160S, C161A, R162A, R166G, K45D/S100E, A30N/H32T, K45D/R150E, R103E/L108S, K140A/K52A, K140A/K52A/K45A, K97A/K152A, K97A/K152A/K45A,K97A/K152A/K45A/K52A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A, N24K/N38K/N83K, N24K/Y15A, C33X/R139C/ΔR166, R139C/ΔR166(미국 특허번호 4,703,008, 4,835,260, 5,457,089, 5,614,195, 6,048,971, 6,489,293; 미국 특허 공개번호 2005-0176627; 국제 특허공개번호. WO 86/03520, WO 94/25055, WO 94/24160, WO 2001/36489, WO 2004/003176, WO 2005/103076 참조).
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 추가적인 변형은 적어도 하나의 EPO 폴리펩티드 활성을 유지하는 변형된 EPO 폴리펩티드의 결실을 포함한다. 이와 같은 결실은 펩티드의 어느 말단에서의 절단 또는 내부 결실을 포함한다. 이러한 결실은 공지되어 있으며, 예컨대, EPO 폴리펩티드의 C-말단(예, A160, C161, R162, T163, G164, D165, R166 잔기), EPO 폴리펩티드의 N-말단 (예, P2, P3, R4, L5, I6 잔기)에서 절단 및 내부 결실(예, T27~E55)을 포함한다(미국 특허 4,703,008, 5,457,089 참조).
당업계에 알려진 적혈구세포 생성 활성이나 조직 보호 활성과 같은 EPO 폴리펩티드의 특성이나 활성을 변화시키는 임의의 추가적인 변형은 본원에서 제공된 변형들과 함께 조합될 수 있다. EPO 폴리펩티드의 하나 이상의 특성은 하나의 변형 또는 변형법들의 조합의 결과로서 변경될 수 있다. 제한되지 않는 예로서 나열된 적혈구세포 생성 활성을 증가시키는 EPO 수용체와의 결합 위치의 변형을 포함하며, 이들 중 일부는 상기에 나열되었다.
본원에서 제공된 EPO폴리펩티드의 변형은 또한 천연 발생 EPO 변이체와 조합되거나 EPO의 단일염기변이(SNPs)로부터 유도될 수 있다. 대표적인 천연 변이체는 예를 들어 C7H, Y15F, Y49F, Y145F, S126M, D43N, G77S, 및 S120C를 포함한다(미국 특허 4,703,008; 5,955,422 및 7,041,794 참조).
E. 증가된 단백질분해 저항성을 위한 당화된 치료용 폴리펩티드의 비- 당화된 혹은 부분적으로 당화된 형태의 변형
비-당화되거나 또는 당화 위치의 수가 감소한 변형된 치료용 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 치료용 단백질은 변형의 부재와 비교하여 증가된 단백질분해효소 저항성을 나타내기 위해 일차 서열에서 변형된다. 또한, 치료용 폴리펩티드는 생체내에서 당화되거나 하나 이상의 당화 위치를 포함하는 것들이다. 당화의 감소 또는 제거는 임의의 적절한 방법, 예컨대, 원핵 숙주 내 발현, 또는 돌연변이, 예컨대, 하나 이상의 당화 위치를 제거하기 위해 당화 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하여 달성된다.
일반적으로, 당화된 치료용 단백질은 생체내 효과적인 투여를 위해 당화를 요구한다. 예를 들면, 변형된 당화된 치료용 폴리펩티드나 변이체는 생체내 투여를 위해 세균에서 발현될 수 있다. 단백질분해효소 저항성은 당화의 부재하 충분한 혈청 안정성을 부여한다. 이러한 폴리펩티드는 치료적으로 유효하기 위한 충분한 활성을 가진다. 또한, 당화 위치나 당화의 제거는 보통 당화에 의해 차폐되거나 보호되는 단백질분해효소 표적인 위치의 확인을 가능하게 한다. 따라서 단백질분해효소 표적인 위치를 확인하는 방법이 제공된다. 이런 위치의 변형은 스크리닝하는 방법에 의해 확인할 수 없는 단백질분해효소 저항성 돌연변이를 제공한다. 따라서, 치료용 폴리펩티드의 부분적으로 당화되거나 비-당화된 형태의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 당화된 치료용 폴리펩티드의 변이체가 제공된다. 또한, 이런 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 제공된 비변형된, 천연 치료용 폴리펩티드는 생체 내에서 일반적으로 당화되어 있다. 당화된 치료용 단백질은 단백질의 아스파라긴 (N-연결) 또는 세린 (O-연결) 아미노산 잔기와 같은 특정 위치에서 탄수화물 부위의 결합을 위한 하나 이상의 위치를 포함한다. 당화는 전형적으로 단백질 생성 동안 분비 경로의 단백질분해효소에 의하여, 또는 분비 후 세포외 단백질분해효소에 의한 분해로부터 천연 단백질을 보호한다. 또한, 당화는 혈액 또는 치료용 투여 후 소화계의 단백질분해효소에 의한 분해로부터 치료용 폴리펩티드를 보호할 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 치료용 단백질은 치료용 단백질의 당화가 없거나 (예를 들면, 세균, 예컨대, 대장균과 같은 원핵성 생물에서 단백질 생산), 또는 제거되는 경우 (예를 들면, 생체내에서 하나 이상의 당화 위치의 변형 또는 탄수화물의 제거), 단백질분해효소에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.
변형된 치료용 폴리펩티드의 대표적인 것은 사이토카인이다. 사이토카인의 대표적인 것은 EPO이다. EPO의 생산, 발현, 및 변형을 위한 방법은 임의의 다른 치료용 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 변형을 위한 위치 확인 방법은 알려져 있고 사용될 수 있다(참조, 예를 들면, 국제 PCT 출원 WO 04/022593호 및 WO 04/022747호). 대표적인 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 본원에 다른 곳에 기술되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다.
단백질분해효소 저항성을 나타내는 본원에서 제공된 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드는 증가된 단백질분해효소 저항성을 위한 아미노산 변형을 갖고 있지 않은 비-당화된 형태와 비교하여 시험관내(예를 들면, 생산, 정제 그리고 저장 동안)에서 또는 생체내(예를 들면, 대상체에게 투여 후)에서 치료용 폴리펩티드의 반감기 증가 또는 혈청 안정성을 증가시킬 수 있다. 당화 부재시 생체내에서 불안정한 일부 치료용 단백질에 대하여 단백질분해효소에 대한 저항성 증가를 위하여 변형되지 않은 폴리펩티드의 당화된 형태와 반감기가 유사한 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들면, 증가된 반감기는 대상체, 예컨대, 인간 대상체에게 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드의 투여 후에 나타난다. 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드의 증가된 반감기는 비-당화된 비변형된 치료용 폴리펩티드와 비교하여 적어도 약1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 양으로 증가될 수 있다. 일부 예에서, 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드의 증가된 반감기는 비-당화된 비변형된 치료용 폴리펩티드의 반감기와 비교할 때 적어도 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 또는 그 이상의 양으로 증가될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 변형된 비-당화된 폴리펩티드는 혈청에서 충분한 약물 수준을 유지하기 위해 필요한 주사 횟수의 감소를 포함한 장점을 제공하며, 따라서, 예를 들면, 더 높은 환자 순응도 및 편리성, 대등한 생물학적 효과를 달성할 수 있는 더 낮은 투여량 및 이차적인 효과의 감소를 초래한다. 이러한 장점은 폴리펩티드의 당화 필요 없이도 이룰 수 있다.
단백질분해효소 저항성을 증가시키는 변형을 포함하는 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 증가된 단백질분해효소 저항성은 단백질분해효소 표적 잔기 또는 서열의 직접적 파괴에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 변형은 본원에서 기술한 아미노산 잔기의 대체(즉, 치환), 첨가, 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 변형된 위치를 가지는 것들을 포함한다. 일반적으로, 비-당화된 변형된 치료용 폴리펩티드는 천연 치료용 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 유지한다.
일반적으로, 생성된 변형된 치료용 폴리펩티드는 비변형된 폴리펩티드의 하나 이상의 치료적 활성을 유지한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 탄수화물 부위의 제거는 단백질의 활성에 영향을 줄 수 있다(예를 들면, 단백질-단백질 상호작용, 예컨대, 수용체와의 상호작용의 증가 또는 감소). 이런 경우에, 추가적인 변형은 이러한 효과를 보상하기 위해 치료용 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 그런 변형은 당업계에 알려져 있고 본원에서 제공된다(예를 들면, EPO 수용체와 EPO의 상호작용을 증가시킬 수 있는 대표적인 아미노산 변형이 본원의 다른 곳에서 제공된다).
1. 단백질분해효소 민감성 위치의 변형
치료용 폴리펩티드가 당화되지 않거나 폴리펩티드에 부착된 탄수화물 부위의 수의 감소를 가지는 경우, 단백질분해효소로부터 저항성을 증가시키기 위해 일차 서열이 변형된 당화된 치료용 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 비-당화된 치료용 폴리펩티드는 생체 내에서 증가된 단백질분해 때문에 부분적으로 종종 불안정하다. 따라서, 당화의 제거를 보충하는, 증가된 단백질분해효소 저항성을 위한 변형이 제공된다. 변형된 치료용 폴리펩티드는 변형 부재 치료용 폴리펩티드와 비교하여 증가된 단백질분해효소 저항성을 나타낸다. 제공된 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드의 하나 이상의 단백질분해효소 민감성 위치의 치환 또는 제거에 의해 변형된다. 상기 제공된 치료용 단백질은 하나 이상의 단백질분해효소 민감성 위치의 변형에 의해 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 본원에서 제공된 치료용 단백질의 아미노산 변형은 단백질분해효소에 대한 저항성을 증가시켜 당화의 부재시 상기 변형된 단백질이 비-변형 폴리펩티드와 비교하여 더욱 단백질분해효소에 대한 저항성이도록 한다. 일부 예에서, 탄수화물 부위의 전체 또는 부분의 제거는 단백질분해적 공격에 대한 단백질분해효소 민감성 위치를 노출시킴으로써 단백질분해효소에 의해 분해되는 치료용 폴리펩티드의 민감성을 증가시킨다. 폴리펩티드의 당화된 형태에서 당화는 상기 단백질분해효소 민감성 위치를 차폐하거나 가림으로서 분해로부터 치료용 폴리펩티드를 보호할 수 있다. 예를 들면, 당화는 탄수화물 부위에 의한 물리적 방해 또는 단백질 구조의 변화에 의해 단백질분해효소 민감성 위치에 대한 접근을 막을 수 있다.하나 이상의 단백질분해효소 민감성 위치가 완전히 당화된 폴리펩티드와 비교하여 비-당화되거나 부분적으로 당화된 치료용 폴리펩티드가 단백질분해적 공격에 민감한 경우, 치료용 폴리펩티드 내 하나 이상의 단백질분해효소 민감성 위치가 제거 또는 치환에 의해 변형된 치료용 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 비-당화된 폴리펩티드 또는 부분적으로 당화된 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 변이체를 조작함으로써, 단백질의 당화된 형태 및 비-당화된 형태 모두가 분해로부터 보호된다. 당화된 단백질이 요구된다면, 제공된 변형은 생체내에서 치료용 단백질이 비-당화되는 경우 분해로부터 치료용 단백질을 보호할 것이다. 당화된 치료용 단백질의 탈-당화는 순환계 및 소화계의 세포외 글루코시다아제(예, 락타아제,뉴라미니다아제, 아밀라아제)에 노출됨으로서 생체 내에서 일어날 수 있다. 시알리다제(sialidase), 예컨대 뉴라미니다제에 의한 말단 시알산 잔기의 제거는 갈락토스 잔기를 노출시키며, 이는 순환으로부터 당단백질의 제거를 매개하는 간세포 내 갈락토스-특이적 다른 당-특이적 수용체 (예, N-아세틸글루코사민, 만노즈,퓨코즈, 및 인산만노즈)에 의해 인식되고 결합된다(Ashwell and Harford (1982) Ann . Rev. Biochem . 51 : 531에서 리뷰됨). 본원에서 제공된 아미노산 변형은 투여 후 하나 이상의 탄수화물 부위의 생체 내 제거에 기인한 분해에 대한 저항성을 가지는 당화된 치료용 폴리펩티드의 생성을 허용한다. 또한, 본원에서 제공된 아미노산 변형은 탄수화물 부위를 인식하는 제거 기전에 의한 분해를 회피하는 비-당화된 치료용 폴리펩티드의 생산을 가능하게 한다.
2. 비- 당화된 변형된 치료용 폴리펩티드의 제작
본원에서 제공된 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 방법은 생체내에서 일반적으로 당화된 치료용 폴리펩티드의 비-당화 형태의 생산을 가능하게 한다. 진핵세포에서 당화된 단백질의 생산은 대개 당 잔기의 높은 정도의 변이성을 초래한다. 기(group)의 이질성은 생체내에서 투여될 때 원하지 않는 항체의 생산을 야기할 수 있다. 따라서, 비-당화된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 제공된 변형은 또한 치료용 제품의 균일성을 증가시킨다. 보다 균일한 치료용 제품을 생산하는 능력은 치료용 폴리펩티드생산 비용을 줄이는 것만큼 제품의 면역원성을 줄일 수 있다.
비-당화된 단백질의 생산은 단백질을 당화할 수 없는 체계에서 변형된 치료용 폴리펩티드를 발현함으로써, 또는 치료용 폴리펩티드가 당화될 수 없도록 치료용 폴리펩티드를 추가적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 치료용 폴리펩티드는 세균(예, 대장균)과 같은 원핵생물에서 생산될 수 있다. 이러한 시스템은 본원의 다른 곳에 상세히 기술되어 있다. 치료용 폴리펩티드는 또한 단백질의 당화를 막는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 당화를 위한 하나 이상의 결합 위치를 포함하는 (예, 아스파라긴 (N), 또는 세린 (S)), 하나 이상의 당화 위치에서 변형될 수 있다. 한 예로, 변형된 치료용 폴리펩티드로는 변형된 EPO 폴리펩티드가 있으며, 변형된 EPO 폴리펩티드는 N24, N38, N83 및 S126의 하나 이상을 변형시킴으로써 변형될 수 있다. 다른 예로, 변형된 치료용 단백질은 변형된 EPO 단백질이 있으며, N24, N38 및 N83이 변형된다. 또 다른 특별한 예로, EPO 폴리펩티드의 N24, N38 및 N83 잔기는 히스티딘(H)으로 치환된다(예, 서열번호 307 또는 308). 또 다른 특별한 예로, EPO 폴리펩티드의 N24, N38 및 N83 잔기는 리신(K)으로 치환된다(예, 서열번호 309 또는 310). 이러한 변형된 EPO 폴리펩티드는 변형을 위한 단백질분해효소 민감성 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본문의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 다양한 발현 방법이 당업계에 알려져 있고 비-당화된 치료용 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 이런 방법은 숙주 세포 또는 숙주 동물로 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 도입 및 시험관내 또는 생체내에서 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자로부터의 발현 또는 무세포 시스템에서의 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 포함한다. 발현 숙주는 세균 (예, 대장균), 효모, 식물, 곤충세포, 사람 세포주와 유전자 도입 동물을 포함하는 포유동물세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 변형된 치료용 단백질의 비-당화된 형태는 세균과 같은 원핵 생물에서 생산될 수 있거나 당화를 막기 위한 하나 이상의 당화 위치를 변형시킴으로써 조류(algae) 또는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에서 생산될 수 있다.
3. 변형을 위한 당화된 치료용 폴리펩티드의 예시
천연형에서 당화된 치료용 단백질은 제공된 방법을 사용하여 비-당화되거나 부분적으로 당화된, 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드 생산을 위해 변형될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 제공된 방법을 사용하여 변형된 치료용 폴리펩티드는 당화된 형태에서 더 높은 생체 내 치료활성을 가진다. 예를 들면, 치료용 단백질의 탈당화된 형태는 투여 후에 더욱 빨리 분해되고, 이는 더 낮은 치료적 활성을 초래한다. 대표적인 당화된 치료용 폴리펩티드는 호르몬(예, 인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜아민, 성선자극호르몬, 영양 호르몬, 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 소 성장 호르몬 또는 렙틴), 성장 호르몬(예, 사람 성장 호르몬), 성장 인자(예, 상피 성장 인자, 신경 성장 인자 또는 인슐린 유사 성장 인자), 성장 인자 수용체, 사이토카인 및 면역 체계 단백질(예를 들면, 인터루킨, 콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 또는 인터페론-감마와 같은 인터페론, 에리스로포이에틴, 인테그린, 어드레신, 셀렉틴, 귀환 수용체 (homing receptor), T 세포 수용체, 면역 글로불린, 용해성 주조직복합체 (major histocompatibility) 항원, 세균, 기생, 또는 바이러스 항원 또는 알레르겐 또는 자기 항원과 같은 면역적 활성 항원, 효소 (예, 조직 플라스미노젠 활성제, 스트렙토키나아제, 콜레스테롤생합성 또는 분해 효소, 스테로이드 합성 효소, 키나아제, 포스포다이에스터라아제, 메틸라제, 탈-메틸라제, 탈수소효소, 셀룰라아제, 단백질분해효소, 리파아제, 포스포리파아제, 아로마타제, 싸이토크롬, 아데닐레이트 또는 구아닐레이트 사이클라제 및 뉴라미다아제), 수용체(예, 스테로이드 호르몬 수용체 또는 펩티드 수용체), 결합 단백질(예, 스테로이드결합 단백질, 성장 호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질), 전사 또는 번역 인자, 종양단백질 또는 원시종양단백질(예, 세포 주기 단백질), 근육 단백질(예, 미오신 또는 트로포미오신), 미엘로단백질, 신경활성 단백질, 종양 성장 억제 단백질(예, 안지오스타틴또는 엔도스타틴), 항-부패 단백질(예, 살균 투과성-증가 단백질), 구조 단백질(예, 콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 액틴 또는 미오신), 혈액 단백질(예, 트롬빈, 혈청 알부민, Factor VII, Factor VIII, 인슐린, Factor IX, Factor X, 조직 플라스미노겐 활성제, 단백질 C, 폰 빌러브란트 인자, 항트롬빈, 글루코세레브로시다아제, 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF) 또는 변형된 Facor VIII, 후리딘과 같은 항응고제)들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
대표적인 변형된 치료용 폴리펩티드는 사이토카인이다. 당화된 사이토카인을 포함하는, 대표적인 사이토카인 패밀리는 인터페론, 인터루킨,헤마토포에이틴, 및 케모카인을 포함한다. 대표적인 당화된 사이토카인은 에리스로포이에틴 (EPO), 트롬보포에이틴 (TPO), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포-콜로리 자극 인자 (M-CSF), 백혈병 억제 인자 (LIF), IL-1베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, OSM, 줄기 세포 인자 (SCF), IFN-β, IFN-γ 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 .
a. EPO
당화된 사이토카인의 대표적인 것은 에리스로포이에틴(EPO)이다. 상기 논의된 바와 같이 EPO는 신장에서 주로 생산되며 적혈구 생산의 주된 조절자이다. EPO유전자는 193개의 아미노산으로 된 단백질 전구체를 암호화하며 (서열번호 1) N-말단에 27개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함한다. 프로세싱된 결과로 당화된 성숙된 EPO 단백질은 166개의 아미노산을 가지거나 (서열번호 2), 만일 C-말단 아르기닌 잔기가 잘리면 165 개의 아미노산을 갖는다 (서열번호 237). EPO 폴리펩티드는 서열번호 2 및 237에 제시된 성숙된 EPO 서열의 N24, N38 및 N83,그리고 서열번호 1에 제시된 전구체 폴리펩티드의 N51, N65 및 N110에 상응하는 3개의 N-당화 위치를 포함한다. 또한, 서열번호 2 및 237에 제시된 성숙된 단백질의 136번 아미노산 잔기에 위치한 O-당화 위치 (서열번호 1에 제시된 전구체 폴리펩티드의 153번 아미노산 잔기에 상응)가 있다. EPO의 중요한 기능 중 하나는 적혈구의 분화와 성장을 촉진시키며 헤모글로빈의 생산을 개시하는 것이다. EPO는 골수 에리스로이드 전구체 상의 수용체와 결합함으로써 작용하여, 성숙된 적혈구로 전환시키기 위해 자극한다.
비-변형되고 비-당화된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 비-당화된 EPO 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 대표적인 단백질분해효소 저항성 EPO 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 치환에 상응하는 표 5에 제시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 단백질분해효소에 대한 저항성을 더 증가시킨다. 본원에서 제공된 비-당화된 변형된 EPO 폴리펩티드는 숙주 세포로서 대장균을 사용하는 발현 시스템과 같은 원핵 생물 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 다른 예로, 단백질분해효소-저항성 EPO 폴리펩티드는 하나 이상의 당화 위치의 변형에 의해 비-당화된 단백질로 생산될 수 있다. 예를 들면, 성숙된 EPO 폴리펩티드(서열번호 2 및 237)의 아미노산 위치 N24 및 N37의 하나 또는 모두의 변형은 비-당화된 단백질을 초래할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 그러므로 비-당화된 단백질분해효소 저항성 EPO 폴리펩티드는 일반적으로 EPO에 의해 치료되는 상태 및 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 재조합 EPO는 만성 신부전증과 관련된 빈혈증, 후천성 면역 결핍 증후군의 아지도티미딘(AZT) 치료에 이차적인 빈혈증, 및 암과 관련된 빈혈증의 치료를 위하여 인정받고 있다. EPO는 또한 발작성 장애, 다발성 경화증, 뇌졸중, 저혈압, 심박 정지, 국소 빈혈, 심근 경색, 염증, 노화와 연관된 인식기능의 상실, 방사선 손상, 뇌성 마비, 신경퇴행 질환, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 라이병, 후천성 면역 결핍증 치매, 기억 상실, 근위축성 측방 경화증, 알코올 중독, 감정 장애, 신경성 불안증, 주의력 결핍증, 정신 분열증, 자폐증, 야콥병, 두뇌 또는 척수 외상 또는 국소 빈혈 심장-폐우회, 만성 머리기능 상실, 황반 변성, 독소 신경병, 당뇨 신경변증, 당뇨 망막증, 녹내장, 망막 국소 빈혈, 또는 망막 외상과 같은 심장보호와 신경보호에 사용될 수 있다.
Figure 112009039361308-pct00007
b. GM - CSR
과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 림프세포, 내피세포, 비만 세포, 섬유아세포, 단핵세포, 및 일부 악성 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 세포에 의해 생산된 당단백질이다. GM-CSF유전자는 17개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함하는 144개의 아미노산으로 된 전구체 단백질을 암호화한다(서열번호 273). 번역-후 프로세싱은 127개 아미노산 길이의 당화된 성숙한 GM-CSF 단백질을 생성한다(서열번호 274). 성숙한 GM-CSF는 서열번호 274에 제시된 성숙한 GM-CSF서열의 N27및 N37, 및 서열번호 273에 제시된 전구체 폴리펩티드의 N44 및N54 에 상응하는 두개의 위치에서 N-당화가 만들어진다. 또한 성숙한 단백질의 N-말단에 위치한, 서열번호 274에 제시된 서열의 아미노산 위치 S5, S7, S9 및T10 (서열번호 273에 제시된 전구체 폴리펩티드의 S22, S24, S26 및 T27에 상응)에 4개의 O-당화 위치가 있다. GM-CSF는 호중성 백혈구, 호산성 백혈구 및 단핵구 기원의 조혈 전구세포의의 증식 및 분화를 자극할 수 있는 복수의 계통(multilineage)의 콜로니-자극 인자이다. 예를 들면, 이처럼 GM-CSF는, 골수 이식 또는 골수 이식 생착 실패 또는 지연 후, 자가 조직 말초 혈액 전구세포의 이식후, 및 급성 골수성 백혈병을 가진 고령자에게 유도 화학요법 후의 골수의 재건에 치료적으로 사용될 수 있다.
비-변형된 비-당화된GM-CSF 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 비-당화된 GM-CSF 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 대표적인 단백질분해효소-저항성 GM-CSF 폴리펩티드는 서열번호 274에 제시된 아미노산 치환에 상응하는 표 6에 제시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 치환은 단백질분해효소에 대한 더 큰 저항성을 가진다. 본원에서 제공된 비-당화된 변형된 GM-CSF 폴리펩티드는 숙주 세포로서 대장균을 사용하는 발현 시스템과 같은 원핵 생물 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 다른 예로, 단백질분해효소 저항성 GM-CSF 폴리펩티드는 하나 이상의 당화 위치의 변형에 의하여 비-당화된 단백질로 생산될 수 있다. 예를 들면, 성숙한 GM-CSF 폴리펩티드(서열번호 274)의 아미노산 위치 N27 및 N37의 하나 또는 모두의 변형은 비-당화된 단백질을 초래한다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 GM-CSF 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 그러므로 비-당화된 단백질분해효소 저항성 GM-CSF 폴리펩티드는 일반적으로 화학요법 또는 골수 이식 후의 호중성 백혈구 및 단핵구의 재건을 포함하나, 이에 포함되지 않는 GM-CSF에 의해 정상적으로 치료되는 상태 또는 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
Figure 112009039361308-pct00008
c. M- CSF
M-CSF 는 림프구, 단핵구, 섬유아세포, 내피세포, 근아세포 및 골아세포를 포함한 다양한 세포에 의해 생산된 당화된 사이토카인이다. 차별적 스플라이싱(splicing) 결과로써 M-CSF 유전자는 세가지의 다른 동종형을 생산한다. 동종형 1은 32개의 아미노산으로 된 신호 서열을 포함하는 554개의 아미노산 전구체 (서열번호 275)로서 발현된다. 성숙한 동종형 1 M-CSF 단백질은 522개의 아미노산으로 되어 있으며, 서열번호 276에 제시되어 있다. 동종형 2는 32개의 아미노산으로 된 신호 서열을 포함하는 438개의 아미노산 전구체(서열번호 277)로서 발현된다. 성숙한 동종형 2 M-CSF 단백질은 406개의 아미노산으로 되어 있고, 서열번호 278에 제시되어 있다. 동종형 3 은 32개의 아미노산으로 된 신호 서열을 포함하는 256개의 아미노산 전구체 (서열번호 279)로서 발현된다. 성숙한 동종형 3 M-CSF 단백질은 224개의 아미노산으로 되어 있고, 서열번호 280에 제시되어 있다. M-CSF는 두개의 N-당화 위치( 서열번호 275, 277 및 279 각각에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 잔기 154 및 172, 및 서열번호 276, 278 및 280 각각에 제시된 성숙한 폴리펩티드의 아미노산 122 및 140에 상응)를 가지고 있다. M-CSF는 세포의 증식, 분화, 및 혈액 단핵구, 조직 대식세포, 및 그들의 전구세포의생존의 핵심 조절자이다. M-CSF는 또한 진피의 두께, 및 암수 수정을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
단백질분해효소-저항성이 있는 비-당화된 M-CSF 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 M-CSF 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 변형을 가지는 것들을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 단백질분해효소에 대한 저항성을 증가시킨다. M-CSF 폴리펩티드의 단백질분해효소에 대한 증가된 저항성 효과를 위해 변형될 수 있는 아미노산 위치는 미국 특허 공보 제 20050202438호에 기술된 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 M-CSF 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵 생물 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 생산될 수 있다. 또 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 M-CSF 사이토카인은 폴리펩티드의 당화 위치의 하나 이상, 전부를 돌연변이시킴으로써 생산될 수 있다. 예를들면, 단백질분해에 대한 저항성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 가진 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 위치 N122 및/또는 N140의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 M-CSF 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 일반적으로 M-CSF가 치료에 사용되는 질병 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병 또는 장애로는 골수이식후에 조혈 회복을 포함하는 악성종양, 아테롬성 동맥 경화증 및 균감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
d. G- CSF
대표적인 당화된 사이토카인은 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)이다. G-CSF는 30개의 아미노산으로 된 신호서열을 포함하는 207개의 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호 281)로서 단핵세포, 대식세포, 호중성 백혈구, 섬유아세포 및 내피세포에 의해 생산된다. 서열번호 282에 제시된 177개의 아미노산으로 된 성숙한 단백질은 신호서열의 절단 후에 생산된다. G-CSF mRNA의 차별적 스플라이싱 (splicing) 은 다른 전구체 변이체, 204개의 아미노산으로된 동종형 b (서열번호 283)를 초래한다. 신호서열의절단은 174개의 아미노산으로 된 성숙한 동종형b G-CSF 폴리펩티드를 초래한다 (서열번호 284). G-CSF는 서열번호 282에 제시된 성숙한 폴리펩티드의 아미노산 위치 T136 (서열번호 281의 전구체 폴리펩티드의 T166; 서열번호 284의 성숙한 동종형 b 폴리펩티드의 T133; 서열번호 283의 전구체 동종형 b 폴리펩티드의 T163에 상응)에서 O-연결 당화되어 있다. 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)는 과립구 생성의 주된 세포외 조절자이며 증식과 특별한 골수 전구 세포의 증식과 생존 및 이들의 과립구로의 분화를 자극함으로서 호중성 백혈구의 생성을 조절한다.
단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 비-당화된 G-CSF 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 대표적인 단백질분해효소 저항성 G-CSF 폴리펩티드는 서열변호 282의 아미노산 치환에 상응하는 표 7에 제시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 하나 이상의 치환은 단백질분해효소에 대한 저항성을 더욱 증가시킨다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 G-CSF 사이토카인은 예를 들면 대장균과 같은 원핵 생물 숙주를 포함한 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 얻을 수 있다. 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 G-CSF 사이토카인은 폴리펩티드의 O-당화 위치의 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 예를들면, 서열번호 282의 아미노산 치환에 상응하는 표 7에 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 아미노산 위치 T136의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 G-CSF 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 일반적으로 G-CSF가 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병이나 장애로는 크론병, 심장병, 후천적인 호중성 백혈구 감소증, 예컨대 화학요법에 의해 유도된 것, 선천적인 호중성 백혈구 감소증 및 천식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 .
Figure 112009039361308-pct00009
e. LIF
백혈병 억제 인자 (LIF)는 당단백질이다. LIF 유전자는 22개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함한 202개의 아미노산으로 된 전구체 단백질(서열번호 285)을 암호화한다. 번역 후 프로세싱은 180개의 아미노산으로 된 당화된 성숙한 LIF 단백질을 초래한다 (서열번호 286). 성숙한 LIF는 서열번호 286 에 제시된 성숙한 LIF 서열의 N7, N34, N63, N73, N96 및 N116(서열번호 285의 전구체 폴리펩티드의 N31, N56, N85, N95, N118 및 N138)에 상응하는 복수의 N-당화 위치를 포함한다. LIF는 혈소판 형성, 일부 조혈세포의 증식, 골 형성, 지방세포 지질 수송, 부신피질자극 호르몬 생성, 뉴런의 생존 및 형성, 근육 위성 세포 증식, 및 간세포에 의한 급성기 생산을 위한 자극으로서 작용하는 것을 포함한 넓은 범위의 작용을 한다. LIF는 낭포 이식 및 해마 및 후각기 수용체 뉴런의 정상적인 발달에 필수적이다.
비-변형된 비-당화된LIF 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 비-당화된 LIF 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 대표적인 단백질분해효소 저항성 LIF 폴리펩티드는 서열번호 286의 아미노산 치환에 상응하는 표 8에 제시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 단백질분해효소에 대한 저항성을 더욱 증가시킨다. 본원에서 제공된 비-당화된 변형된 LIF 폴리펩티드는 숙주세포로서 대장균을 사용하는 발현 시스템과 같은 원핵성 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 한 예로, 단백질분해효소 저항성 LIF 폴리펩티드는 하나 이상의 당화 위치를 변형시킴으로써 비-당화된 단백질로서 생산될 수 있다. 예를 들면, 성숙한 LIF 폴리펩티드(서열번호 286)의 아미노산 위치 N7, N34, N63, N73, N96 및 N116 의 하나 이상의 변형은 비-당화된 단백질을 만들 수 있다. 본원에서 제공한 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 LIF 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 그러므로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 LIF 폴리펩티드는 화학요법이나 골수 이식 후에 호중성 백혈구나 단핵세포의 재건을 포함한 일반적으로 LIF에 의해 치료되는 상태 및 질병에 사용되지만 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00010
f. 인터루킨- 1 베타
인터루킨-1 베타(IL-1β) 는 116개의 아미노산으로 된 프로펩티드를 포함한 268개의 아미노산 전구체(서열번호 287)로 합성된다. 성숙한 IL-1β의 서열은 서열번호 288에 제시되어 있으며 152개의 아미노산으로 되어 있다. IL-1β은 서열번호 287에 제시된 전구체 폴리펩티드의 123번 아미노산 및 서열번호 288에 제시된 성숙한 폴리펩티드의 7번 아미노산과 상응하는 하나의 N-연결 당화 자리를 가지고 있다. IL-1β는 단핵세포, 조직 대식세포, 각질형성세포 그리고 다른 내피 세포를 포함한 다양한 세포에서 생산된 염증 유발 사이토카인이다. IL-1α 및 IL-1β 모두 같은 수용체에 결합하며 동일하지 않다면 유사한 생물학적 특성을 가지고 있다. 이러한 사이토카인은 IL-2 방출 유도에 의한 흉선세포 증식, B-세포 성숙과 증식, 미토겐 FGF-유사 활성 및 활액세포로부터 프로스타글란딘과 교원질분해효소의 방출을 자극하는 능력의 자극을 포함한 넓은 범위의 활성을 가지고 있다.
단백질분해효소 저항성인 비-당화된 IL-1β 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이런 IL-1β 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 변형을 가지는 것들이며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 단백질분해효소-저항성을 초래한다. M-CSF 폴리펩티드의 단백질분해효소에 대한 증가된 저항성 효과를 위해 변형될 수 있는 아미노산 위치는 미국 특허 공개 제 20050202438호에 기술된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-1β 폴리펩티드는 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함한 당화할 수 없는 숙주세포에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 얻을 수 있다. 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 IL-1β 사이토카인은 폴리펩티드의 당화 위치를 하나 이상, 전부를 돌연변이시킴으로서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 288의 아미노산 치환에 상응하는 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 N7 아미노산 위치의 변형을 추가적으로포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 IL-1β 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 일반적으로 IL-1β가 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병이나 장애로는 화학요법 후 면역시스템을 회복시키기 위하여 IL-1β의 사용을 포함하는, 암, 한, 국소빈혈/재관류 손상, 및 후천성 및 선천성 호중성 백혈구 감소증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
g. 인터루킨- 2
인터루킨-2 (IL-2)는 항원성 또는 미토겐성 자극에 대한 반응에서 T-세포에 의해 생산된 당단백질이다. IL-2 유전자는20개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함한 153개의 아미노산으로 된 전구체 단백질(서열번호 289)을 암호화한다. 번역-후 프로세싱은 당화된 133개의 아미노산으로 된 당화된 성숙한 IL-2 단백질(서열번호 290)을 초래한다. 성숙한 IL-2는 서열번호 290에 제시된 성숙한 IL-2의 T3및 서열번호 289에 제시된 전구체 폴리펩티드의 T23에 상응하는 위치자리에서 O-당화되어 있다. IL-2는 T-세포 증식 및 면역 반응의 조절에 중요한 다른 활성을 필요로 한다. 이는 B-세포, 단핵구, 림포카인-활성화된 킬러 세포, 자연살해 세포 및 신경교종 세포를 자극할 수 있다.
비-변형된 비-당화된 IL-2 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 비-당화된 IL-2 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 대표적인 단백질분해효소 저항성 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 290의 아미노산 치환에 상응하는 표 9에 제시된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 단백질분해효소에 대한 저항성을 더욱 증가시킨다. 본원에서 제공된 비-당화된 변형된 IL-2 폴리펩티드는 숙주 세포로서 대장균을 사용하는 발현 시스템과 같은 원핵성 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 예로, 단백질분해효소-저항성 IL-2 폴리펩티드는 하나 이상의 당화 위치를 변형시킴으로서 비-당화된 단백질로 제조될 수 있다. 예를들면, 성숙한 IL-2 폴리펩티드 (서열번호 290)의 T3에서 변형은 비-당화된 단백질을 초래한다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소-저항성이 없는 완전히 당화된 IL-2 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 그러므로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 IL-2 폴리펩티드는 HIV및 거대세포 바이러스 감염과 같은 감염, 림프구 감소증 및 전이 흑색종과 전이 신장암을 포함하는 암을 포함하는 일반적으로 IL-2 에 의해 치료되는 질병과 상태를 치료하는데 사용할 수 있다.
Figure 112009039361308-pct00011
h. 인터루킨-3
대표적인 당화된 사이토카인으로 인터루킨-3 (IL-3)가 있다. IL-3는 19개의 아미노산으로 된 신호 서열을 포함한 152개의 아미노산으로 된 전구체 폴리펩티드 (서열번호 291)로서 활성화된 T 세포, 단핵세포/대식세포 및 스트로마 세포에의해 생산된다. 서열번호 292에 제시된 133개의 아미노산으로 된 성숙한 단백질은 신호 서열의 분리 후에 생산되어 진다. IL-3 폴리펩티드는 서열번호 292 에 제시된 성숙한 폴리펩티드의 N15 및N70위치(서열번호 291의 전구체 폴리펩티드의 N34 및 N89에 상응)에 N-연결 당화 위치를 포함한다. IL3는 골수, 적혈구 및 거핵세포 계통의 생산 전구 세포의 성장과 분화를 조절하고, 성숙한 호중성 백혈구 및 대식세포를 기능적으로 활성화시키는 다능성 조혈 성장 인자이다. 이러한 IL-3는 조혈 세포 개체군을 확장하는데 사용될 수 있다.
단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 비-당화된 IL-3 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 대표적인 단백질분해효소-저항성 IL-3 폴리펩티드는 서열번호 292의 아미노산 치환에 상응하는 표 10에 제시된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 단백질분해효소에 대한 저항성을 더욱 증가시킨다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-3 사이토카인은 예를들면, 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 생성될 수 있다. 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 IL-3 사이토카인은 폴리펩티드의 하나 내지 전부의 N-당화 위치를 돌연변이시킴으로서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 292의 아미노산 치환에 상응하는 표 10에 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 N15 및/또는 N70 위치의 아미노산 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 IL-3 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 일반적으로IL-3가 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병이나 장애는 선천성 또는 후천성 호중성백혈구 감소증 및 저혈소판증, 예컨대, 화학요법에 의해 유도되는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00012
i. 인터루킨- 4
대표적인 당화된 사이토카인에는 인터루킨-4 (IL-4)가 있다. IL-4는 24개의 아미노산 신호 펩티드를 포함하는 153개의 아미노산의 전구체 (서열번호 293)로 합성된다. 성숙한 IL-4 의 서열은 서열번호 294이며 (유니프로트(Uniprot) 번호 P05112) 129개의 아미노산으로 되어 있다. IL-4는 두개의 N-연결 당화 위치 (서열번호 293에 제시된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 62 및, 129, 및 서열번호 294에 제시된 성숙한 폴리펩티드의 아미노산 38및 105에 상응)를 가지고 있다. IL-4는 또한 이황화 결합 형성에 관여하는 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. IL-4는 순수 헬퍼 T 세포의 Th2 세포로의 분화를 유도한다. IL-4는 또한 활성화된 B-세포의 자극 및 T 세포를 증식하는 역할을 한다. 따라서, IL-4는 체액성 및 적응성 면역의 조절자이다.
단백질분해효소- 저항성인 비-당화된 IL-4 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 IL-4 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 것들이며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 더 큰 단백질분해효소-저항성을 초래한다. 대표적인 이러한 변형은 서열번호 294에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 치환에 상응하는 표 11에 나타난 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-4 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 얻을 수 있다. 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-4 사이토카인은 폴리펩티드의 당화 위치를 하나 이상, 전부까지 돌연변이시킴으로서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 294의 아미노산 치환에 상응하는 표 11에서 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 아미노산 위치 N38 및/또는 N105의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 IL-4 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 일반적으로 IL-4가 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병이나 장애로는 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대, 콜라겐-유도 관절염, 자가면역 당뇨병, 다발성 경화증 및 염증성창자질환과 같은 자가면역질환 그리고 이에 제한되지 않지만 결장암과 유방암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00013
j. 인터루킨- 5
대표적인 당화된 사이토카인에는 IL-5가 있다. IL-5는 호산구 백혈구의 증식, 분화, 및 활성화를 촉진시키는 동종이합체 당단백질이다. IL-5는 또한 B세포 성장을 자극하는 기능을 하고,면역글로불린 분비를 증가시킨다. IL-5는19개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함하는 134개의 아미노산전구체(서열번호 134)로서 합성된다. 성숙한 IL-5의 서열은 서열번호 296에 제시되어 있으며 115개의 아미노산으로 되어 있다. IL-5는 두개의 시스테인(서열번호 296에 제시된 아미노산 서열의 C44와 C86에 상응)에 의해 연결된 역평행 이합체이다. IL-5는 또한 서열번호 296에 제시된 아미노산 서열에 상응하는 T3 및 N28 위치에서 각각 O-연결 그리고 N-연결 당화에 의해 당화되어 있다(Minamitake 등 (1990) J. Biochem., 107:2:292-297). 단백질분해효소 저항성인 비-당화된 IL-5 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 IL-5 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 변형을 가지는 것들이며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 단백질분해효소에 대한 저항성을 증가시킨다. 대표적인 이러한 변형으로 서열번호 296에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 치환에 상응하는 표 12에 나타난 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-5 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 예로 포함하는 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 얻을 수 있다. 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 IL-5 사이토카인은 폴리펩티드의 당화 위치의 하나 이상, 전부를 돌연변이시킴으로서 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 서열번호 296에 제시된 아미노산 치환에 상응하는 표 12에 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는아미노산 위치 T3 및/또는 N28에서 하나 이상의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공한 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 IL-5 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 예를 들어 호산구 증가증이 예후에 공헌하는 임의의 경우를 포함한 일반적으로 IL-5가 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병에는 대장암, 위암, 그리고 폐, 방광, 자궁목 및 머리와 목의 암종 및 이식 거부를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00014
k. 인터루킨-6
당화된 사이토카인의 대표적인 것에는 인터루킨-6 (IL-6)이 있다. IL-6은 다면발현성 사이토카인이며, 많은 조혈 세포 발달, 증식, 및 성숙을 자극할 수 있다. IL-6는 또한 면역글로불린-분비세포로 B세포 성숙에 요구된다. IL-6는 또한 신경 세포의 분화, 골의 대사작용 및 간세포에서 급성기 단백질의 유도 작용을 한다. IL-6는 29개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함한 212개의 아미노산전구체 (서열번호 297) 로 합성된다. 성숙한IL-6의 서열은 서열번호 298에 제시되어 있으며, 183개의 아미노산으로 구성되어 있다. IL-6는 T 세포, 대식세포, 섬유아세포, 내피세포 및 각질형성세포에 의해 발현된다. 발현의 근원에 종속하여, 성숙한 분비된 사람 IL-6는 183에서 186개의 잔기를 포함한다. 예를 들면, 섬유아세포-유래 IL-6의 아미노 말단은 서열번호 297의 아미노산 서열의 Ala28이다. IL-6는 N-연결과 O-연결 당화에 의해 번역후에 변형된다. 예를 들면, Thr166는 O-연결 당화 위치이고 Asn73 및 Asn172은 서열번호 297 에 제시된 전구체 서열의 잔기에 상응하는 N-연결 당화 자리이다(각각 서열번호 298의 137, 44 및143 잔기에 상응).
단백질분해효소-저항성인 비-당화된 IL-6 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 IL-6 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 단백질분해효소에 대한 더 큰 저항성을 초래한다. 대표적인 이러한 변형은 서열번호 298에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 치환에 상응하는 하기 표 13의 나타낸 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-6 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주세포에서 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드를 생산함으로서 얻을 수 있다. 다른 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IL-6 사이토카인은 폴리펩티드의 당화 위치의 하나 이상, 전부를 돌연변이시킴으로서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 298의 아미노산 치환에 상응하는 표 13에 제시된 하나 이상의 변형을 가진 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 아미노산 위치 T137, N44 및/또는 N143 에서 하나 이상의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 IL-6 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이러한 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 일반적으로 IL-6가 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애의 치료에 사용될 수 있다. 대표적인 이러한 질병에는 암, 및 화학 요법에 의해 유도되는, 저혈소판증 및 호중성백혈구 감소증, 염증성 질병 (사구체신염 제외), 예컨대, 다발성 경화증, 패혈성 쇼크, 관절염 상태, 특히 병원체에 의해 유도되는 관절염 상태, 예를 들면 라임병관절염, 세균유도 관절염, 및 폴리오관절염 다발성 경화증 및 기타 탈수초 질병 (즉, 신경, 뇌 및/또는 척수에서 탈수초에 의해 특성화된 질병, 예컨대, 다발성경화증, 급성 파종성 뇌척수염, 또는 뇌염, 시신경척수염, 이명, 미만성 뇌경화증, 쉴더병, 부신백색질형성장애증, 삼차 라임 질환, 열대 경련성 파라포에시스(parapoesis), 및 특히 자가면역-매개 탈수초가 주된 증상인 기타 질병); 범스(bums), 감염 쇼크, 수막염, 및 폐렴과 같은 급성 중증 염증 및 다발연골염, 경화부종, 베게너육아종증, 피부근육염, 만성활동간염, 중증근육무력증, 건선, 건선성 관절염, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루우(sprue), 자가면역 염증성창자병 (예, 궤양대장염, 크론병), 내분비샘 눈병, 그레이브스병, 사코이드증(sarcoidosis), 일차 담관성간경화증, 소아당뇨병 (당뇨병 제 I형), 포도막염(전방 그리고 후방), 건조각막결막염 및 봄철 각막결막염, 및 간질성 폐섬유증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00015
L. 온코스타틴 M
대표적인 당화된 사이토카인은 온코스타틴 M (OSM)이다. 자극된 OSM은 T세포와 단핵구에 의해 합성된 다면발현성 사이토카인이며, 간 발달, 조혈, 염증 및 중추신경 발달에 관여한다. OSM은 25개의 아미노산으로 된 신호 펩티드를 포함하는 252개의 아미노산 전구체(서열번호 299)로 합성된다. 성숙한 OSM 서열은 서열번호 300에 제시되고, 길이가 227개인 아미노산이다. 티로신 유사 절단 위치에서 31 카르복시-말단 아미노산 부위는 OSM 의 완전히 활성화된 196 잔기를 제공한다. OSM 서열 내 5개의 시스테인 잔기 중 4개는 이황화 결합에 관여한다(즉, 서열번호 299에 제시된 잔기에 상응하는 C31 및 C152 C74 및 C192 위치에서 시스테인 사이), 나선 A 및 B (C74및 C192) 사이의 이황화 결합은 OSM 활성에 필수적이다. 시스테인이 없는 잔기 (C105)는 OSM의 이합체화를 조절하지 못한다. OSM은 N-연결 당화에 의해 번역-후 추가 변형된다. 예를 들어, Asn100 및 Asn217는 서열번호 299에 제시된 전구체 서열 내 잔기에 상응하는 N-연결 당화 위치이다(및 서열번호 300에서 제시된 잔기 75 및 192에 각각 상응). 단백질분해효소 저항성이 있는 비-당화된 OSM이 본원에서 제공된다. 이와 같은 OSM 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형을 가지며, 상기 하나 이상 아미노산 변형은 더 큰 단백질분해효소-저항성을 초래한다. 이러한 변형의 예는 서열번호 300에서 제시된 아미노산 서열에서의 아미노산 치환에 상응하는 아래 표 14에서 보여주는 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 OSM 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드의 생산에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 예에서, 비- 당화된 단백질분해효소-저항성 OSM 사이토카인은 폴리펩티드 내의 당화 위치의 하나 이상, 모두의 변형에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 300 의 아미노산 치환에 상응하는 표 14에 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 위치 N75 및 N192의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성이 없는 완전히 당화된 OSM 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이런 비-당화된 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 일반적으로 OSM이 치료에 사용되는 질병이나 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 이런 질병이나 치료의 예는 만성염증질환, 급성 및 만성 위장관 염증, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증 및 조직손상억제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00016
m. 줄기세포인자
대표적인 당화된 사이토카인은 줄기세포인자(SCF)이다. SCF (또한 "스틸 인자(steel factor)" 또는 "c-키트 리간드"로 알려져 있다)는 CD 117(c-키트)과 결합한 사이토카인이고 조혈 줄기세포 및 다른 조혈 전구세포의 생존, 증식, 및 분화에 중요하다. 이들 기능의 하나는, 예를 들어 적혈구 계열내 초기 적혈구 전구체인 BFU-E (파열-형성 단위 적혈구)를 CFU-E (콜로니-형성한 단위적혈구) 세포로 변화시키는 것이다. SCF는 25개 아미노산으로 된 신호펩티드를 포함하는 273개 아미노산 전구체(서열번호 301)로서 합성된다. 성숙한 SCF의 서열은 서열번호 302에 제시되고 그 길이는 아미노산 248개이다. SCF는 세포표면에 결합한 SCF 및 용해성 (또는 자유) SCF의 두가지 형태로 존재한다. 수용성 SCF는 메탈로단백질분해효소에 의해 표면에 결합한 SCF를 절단함으로써 제조되어, 서열번호 301의 26내지 214의 아미노산에 상응하는 189 아미노산 폴리펩티드를 생산한다. SCF는 서열번호 301에 제시된 전구체 서열 내 잔기에 상응하는 C29 및 C114 및 C68 및 C163 위치의 시스테인 사이에 두개의 이황화 결합을 가지고 있다. SCF는 N-연결 당화에 의해 번역 후에 추가 변형된다. 예를 들면, Asn90, Asn97, Asn118, Asn145, 및 Asn195 는 서열번호 301에서 제시된 전구체 서열 내 잔기에 상응하는 N-연결 당화 위치이다(서열번호 302의 65, 72, 93, 120 와170잔기에 각각 상응).
단백질분해효소 저항성이 있는 비-당화된 SCF 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 SCF 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형을 가지며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 더 큰 단백질분해효소-저항성을 초래한다. 그런 변형의 예는 서열번호 302에 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환에 상응하는 아래 표 15에 나타난 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 예로, 비-당화된 단백질분해효소 저항성 SCF 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함한 당화능이 없는 숙주 세포 내 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드의 생산에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 예에서, 비- 당화된 단백질분해효소-저항성 SCF사이토카인은 폴리펩티드 내의 당화 위치의 하나 이상, 모두의 변형에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 302의 아미노산 치환에 상응하는 표 15에 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소 저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 위치 N65, N72, N93, N120 및/또는 N 170의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소-저항성이 없는 완전히 당화된 SCF폴리펩티드의 활성을 유지한다. 이런 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 SCF가 일반적으로 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애를 치료하는 데 사용된다. 이런 질병이나 치료의 예는 간손상, 천식, 조혈 생착(hematopoietic engraftment)을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00017
n. 인터페론- 베타
대표적인 당화된 사이토카인은 인터페론-베타(IFN-β)이다. 인터페론의 1형 클래스의 구성원인 IFN-β는 5개의 알파 나선을 포함하는 구상단백질이다. 일반적으로, IFN-β는 항염증 분자로서, 이의 다양한 면역세포(예,T 세포, NK 세포, 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포)에 대한 관찰된 효과는 예를 들어 다음을 포함한다: T-세포 세포독성 강화 ; 항체 생성 조절 T 세포 증식 및 이동 저해 접착분자의 하향 조절 종양-결합 표면항원의 발현 증가, MHC 클래스 I 항원과 같은 표면분자의 자극, 친-세포자멸(pro-apoptotic) 유전자 및 단백질 (예, 종양괴사인자-연관 세포사멸-유도 리간드, 카스파제(caspases), Bak, Bax, 및p53)의 유도 및활성화, 항-세포자멸유전자(예, Bcl-2, 세포사멸 단백질의 저해제)의 억제, 및 혈관신생의저해. (Pestka 등 Immunological Reviews 202: 8-32 (2004); Holten 등, (2002), Arthritis Research, 4: 346-352).
IFN-β는 21개의 아미노산 신호 펩티드를 포함한 187개의 아미노산의 전구체(서열번호 303)로서 합성된다. 성숙한 IFN-β 폴리펩티드는 가변적 길이일 수 있으며, 전형적으로 166개의 아미노산(서열번호 304), 164 및 165 아미노산 길이의 폴리펩티드를 포함한다. IFN-β는 서열번호 303에서 제시된 전구체 서열 잔기에 상응하는 C52와 C162 위치 시스테인 사이에 하나의 이황화 결합을 가진다. IFN-β는 N-연결된 당화에 의해 번역-후에 추가적으로 변형된다. 예를 들면, Asn101은 N-연결 당화 위치(서열번호 303에서 제시된 전구체 서열 중 101번 잔기에 상응하고, 서열번호 304의 80번 잔기에 상응). IFN-β의 상업적인 형태는 상표 AVONEX?, BETASERON? 및 Rebif?로 판매되고 있는 것을 포함한다.
IFN-β-1a(Avonex? Biogen Inc, CA, USA, 및 Rebif? Serono Inc., Geneva, Switzerland)는 IFN-β를 암호화하는cDNA를 도입한 CHO 세포에서 생산된다. IFN-β-1a는 길이가 166개의 아미노산이며, 80위치의 아스파라긴 잔기에서 당화를 포함한 (Nelissen 등 Brain 126: 1371-1381 (2003)) 섬유아세포-유래 인간 IFN- β와 동일하다. Rebif? IFN-β-1a 는 근육 내 투여보다 피부(즉, 피하)에 투여를 위해 제형화된 점에서 Avonex? IFN-β-1a 와 상이하다. IFN-β-1b (Betaseron? Berlex 연구소, Richmond, CA, USA)는 인간 IFN-β를 암호화하는 유전적으로 조작된 플라스미드를 가지는 대장균에서 생산된다. 상기 생성된 발현된 IFN-β-1b 제품은 비-당화되어 있으며, 아미노말단 메티오닌이 결핍되어 있으며, (서열번호 304의) 17번 위치 의 시스테인 잔기가 세린으로 변형되었다. IFN-β-1b는 165개 아미노산 길이이고 천연 인간 IFN-β (Nelissen 등 Brain 126: 1371-1381 (2003))에서 발견된 탄수화물 측쇄가 포함되어 있지 않다.
단백질분해효소-저항성이 있는 비-당화된 IFN-β 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 IFN-β 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 더 큰 단백질분해효소-저항성을 부여한다. 상기 변형의 예는 서열번호 304에 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환에 상응하는 아래 표 16에서 나타난 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 예로, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IFN-β 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주세포에서 단백질분해효소 저항성이 있는 폴리펩티드의 생산에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 예에서, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IFN-β 사이토카인은 폴리펩티드 내의 당화 위치의 하나 이상의 변형에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들면, 서열 304의 아미노산 치환에 상응하는 표 16에서 제시된 하나 이상의 변형을 가지는 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 아미노산 위치 N80의 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 비-당화된 단백질분해효소-저항성을 갖는 폴리펩티드는 단백질분해효소-저항성이 없는 완전히 당화된 IFN-β 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 상기 비-당화된 단백질분해효소-저항성을 갖는 폴리펩티드는 IFN-β가 일반적으로 치료를 위해 사용하는 질병이나 장애를 치료하는 데 사용된다. 이런 질병이나 치료의 예는 바이러스 감염, 증식 장애, 자가면역질환, 및 염증성 장애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치료되는 질병이 자가면역질환인 한 예에서, 상기 질병이나 상태는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 만성 바이러스 간염, A형 간염, B형 간염, 및 심근 바이러스 감염 중 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 치료 되는 질병이 증식 장애인 다른 예에서, 이 질병 또는 질환은 암 또는 뼈 장애일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 제공되는 약제학적 조성물로 치료되는 암의 예는 포도막, 흑색종, 결장암, 간암 또는 전이암이 포함된다. 뼈 장애의 예는 골다공증과 골감소증이다. 치료되는 질병이 염증 장애인 추가 예에서이며, 이 질병 또는 상태는 천식, 길랑-바레 증후군, 및 궤양대장염 또는 크론병과 같은 염증성 창자병일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 질병이 바이러스성 감염인 부가적인 예에서, 감염은 만성 바이러스성 간염이나 심근감염일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00018
Figure 112009039361308-pct00019
Figure 112009039361308-pct00020
o. 인터페론 감마
대표적인 당화된 사이토카인이 인터페론 감마(IFN-γ)이다. 일반적으로, IFN-γ는 활성화된 T세포 및 NK 세포를 포함한 면역세포에서 생산되는 다면발현성 사이토카인이다. IFN-γ 및 이를 생산한 세포는 다양한 세포 형태에 항바이러스, 항증식 및 면역조절 효과를 미침으로써 숙주방어에서 중추적인 역할을 한다. 예를 들면, IFN-γ는 대식세포의 기능적인 활성을 향상시키고, T 및 B세포 분화를 촉진하고, 다양한 세포에서 클래스 I 및 II MHC 그룹 항원 발현을 조절하고, 천연 킬러 세포 및 중성구를 활성화시키고, 중성구 생존을 연장하는 능력을 가진다. IFN-γ 폴리펩티드는 다양한 아미노산 서열 길이로 구성된 비균질성 폴리펩티드이며, 재조합적으로 생산된 폴리펩티드, 합성적으로 생산된 폴리펩티드 및 세포 및 조직, 예컨대, T 림프구 및 천연 킬러 (NK) 세포에서 추출된 IFN-γ 일 수 있다. 일반적으로, IFN-γ는 신호서열의 절단으로 더 작은 폴리펩티드로서 성숙화되는 더 큰 폴리펩티드로 생산된다. 성숙한 IFN-γ 폴리펩티드는 신호서열 절단 후에 통상적으로 124-146개의 아미노산 길이로 이루어진다. 인간 IFN-γ의 전구체 형태는 166개의 아미노산 폴리펩티드이고(예, 서열번호 305), 절단되는 신호 서열(즉, 아미노산 1-20)을 포함하며, 서열번호 306에 제시된 146개의 아미노산의 성숙한 폴리펩티드와 같은 성숙한 폴리펩티드를 초래한다. IFN-γ는 N-연결 당화에 의해 추가적으로 번역후에 번형된다. 예를 들면, Asn48과 Asn120는 서열번호 305에서 제시된 전구체 서열의 잔기에 상응 (및 서열번호 306 내의 28번 및 100번의 잔기에 상응)하는 N-연결 당화 위치들이다.
추가로, 성숙한 IFN-γ은 146개의 아미노산 길이보다 더 작은, 예를 들어 124, 125, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 및 145 개의 아미노산 길이인 형태로 존재할 수 있다. IFN-γ 폴리펩티드의 이종형은 C-말단에서 일어나는 IFN-γ 의 자연적인 절단에서 기인하며, 예를 들어 분비 전과 후에 단백질분해효소 분해에 기인한다. 예를 들면, 절단은 숙주세포에 의해서 생산된 내인성-/ 또는 외인성 단백질분해효소 활성에 기인한다. 일부 경우, 분비 후에 단백질분해효소적 분해는 배양 배지 내의 단백질분해효소 존재에 기인한다.
IFN-γ의 N-말단 아미노산 잔기 결실 또한 보고되어 있다. 일부 경우에, N-말단 잔기의 결실은 번역-후 변형 때문이다. IFN-γ의 출처에 종속하여, IFN-γ의 번역-후 변형은 서열번호 306에 제시된 성숙한 폴리펩티드로부터 최초 세개의 아미노산 Cys-Tyr-Cys 의 제거를 포함한다(The Cytokine FactsBook, (1994) Callard R., and Gearing A., (eds) pp.157-158).
본원의 목적을 위해서, IFN-γ 폴리펩티드의 변형은 아미노산 146개의 길이를 가진 IFN-γ 폴리펩티드(서열번호 306)를 기준으로 하였다. 그러나, 본원에서 제공된 변형 IFN-γ 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있으며, 다양한 길이로 제조될 수 있다고 이해된다. 따라서, 본원에서 제공된 변형된 IFN-γ 폴리펩티드는 146개의 아미노산 길이인 것들(예, 서열번호 306에 제시된 성숙한 IFN-γ 폴리펩티드 내의 아미노산 변형을 포함), N- 또는 C-말단에서 다양하게 잘린 이들의 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 필요하다면, IFN-γ 폴리펩티드를 원하는 길이로 동질성 있게 정제할 수 있다.
단백질분해효소 저항성이 있는 비-당화된 IFN- γ 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 IFN- γ 단백질분해효소-저항성을 갖는 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형을 가지며, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 더 큰 단백질분해효소-저항성을 부여한다. 그런 변형의 예는 서열번호 306에 제시된 아미노산 서열 내 아미노산 치환에 상응하는 아래 표 17에서 나타난 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 예에서, 비-당화된 단백질분해효소-저항성 IFN- γ 사이토카인은 예를 들어 대장균과 같은 원핵성 숙주를 포함하는 당화능이 없는 숙주 세포에서 단백질분해효소 저항성이 있는 폴리펩티드의 생산에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 예에서 비-당화된 단백질분해효소 저항성이 있는 IFN- γ 사이토카인은 폴리펩티드내의 당화 위치의 하나 이상, 모두의 변형에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들면, 단백질분해효소-저항성이 있는 폴리펩티드는 서열번호 306 내 아미노산 치환에 상응하는 표 17에 제시된 하나 이상의 아미노산 위치N28및 N100의 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 비-당화된 단백질분해효소-저항성 폴리펩티드는 단백질분해효소-저항성이 없는 완전히 당화된 IFN- γ 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 상기 비-당화된 단백질분해효소-저항성을 갖는 폴리펩티드는 IFN-β가 일반적으로 치료를 위해 사용되는 질병이나 장애를 치료하는 데 사용된다. 상기 질병이나 치료의 예는 바이러스성 감염(예, C형간염, 후천성 면역 결핍증), 세균성 감염, 진균 감염(예, 아스펠르길루스증, 칸디다혈증, 암성 상태(cancerous conditions)(예, 호중구감소증, 조혈세포이식), 암, 간질환, 폐질환 또는 상태, 악성골다공증 또는 만성 육아종을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00021
4. 치료용 폴리펩티드의 기타변형
본원에서 제공된 단백질분해효소 저항성 증가를 위한 임의의 하나 이상의 아미노산 변형에 추가로, 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 부가적인 변형을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변형은 치료용 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성의 손실 없이 안정성 증가를 초래한다.
예를 들면, 치료용 폴리펩티드 내 다른 추가적인 변형은 하나 이상의 부가적인 아미노산 변형 및/또는 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 면역원성, 당화, 활성 또는 치료용 폴리펩티드의 임의의 다른 알려진 성질을 변경하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서 아미노산 변형은 치료용 폴리펩티드의 성질을 변경하며, 이는 그의 활성을 위해 요구된다. 예를 들면, 아미노산 변형은 수용체와 같은 다른 폴리펩티드와 치료용 폴리펩티드의 상호작용을 증가시키거나 감소시킨다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 어느 성질의 상실을 동반한다. 예를 들면, 하나의 아미노산 변형이 수용체 결합과 같은 성질을 감소시켰다면, 다른 위치에서의 추가적인 아미노산 변형이 상기 결합을 회복시킬수 있다.
치료용 폴리펩티드 내의 다른 추가적인 변형은 하나 이상의 부가적인 아미노산 변형 및/ 또는 하나 이상의 화학적 변형 또는 부가적인 화학적 변형을 허용하는 하는 하나 이상의 부가적인 아미노산 변형(예, 화학적 변형을 위한 자리의 발생) 을 포함한다. 그런 변형은 페길레이션, 비면역화, 아실화(예, 아세틸화 또는 숙신화), 메틸화, 인산화, 해실화, 황화, 프레닐화, 산화, 구아니딜화, 아미딘화, 카르바밀화(예 카르바모일화), 트리니트로페닐화, 질산화, 당업자에게 알려진 다른 것들(예 미국 특허 제5,856,298호 미국 공개 번호2003-0120045, 2004-0063917, 2005-0220800, 2005-0107591, 2006-0035322, 및 2006-0073563; 및 국제 PCT 공개번호: 제WO 01/81405호) 또는 이와 같은 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 제공된 변형된 치료용 폴리펩티드는 당화 없이 단백질분해효소-저항성을 증가시키기 위해 조작되는 반면, 치료용 폴리펩티드내 비-천연 위치에 당화를 원한다면, 상기 변형된 치료용 폴리펩티드는 탄수화물 부위의 부착을 위한 하나 이상의 비-천연 당화 위치를 도입하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다. 부가적인 당화 위치를 도입하기 위한 EPO 변형의 대표적 방법은 본원의 다른 곳에 제공되었으며, 상기 제공된 변형 치료용 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
추가적으로, 단백질 변형은 폴리펩티드의 탐지, 정제, 및 분석 개발을 용이하게 하는 단백질의 1차 아민에 공유 결합을 위해 술포-NHS-LC-바이오틴 을 가지는 폴리펩티드의 변형, 또는 형광, 비-동위원소, 또는 방사능 표지 부착을 위한다른 변경을 포함한다. 변형된 치료용 단백질은 또한 치료적 용도, 탐지, 정제, 및 분석법 개발을 위한 폴리펩티드의 표적화를 용이하게 하는 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 치료를 위한 다른 치료용 단백질에 융합될 수 있다.
a. 용해성을 향상시키기 위한 변형
상기 제공된 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 단백질의 용해성을 증가시키기 위해서 추가적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 활성을 위해 요구되지 않는 표면의 극성 잔기는 세균 내에서 생산되는 경우 폴리펩티드의 응집을 방지하기 위하여 변형될 수 있다(Narhi 등 (2001) Prot . Eng . 14(2) 135-140). 일반적으로, 잔기는 상기 단백질이 변형되지 않은 치료용 단백질의 하나 이상의 활성을 유지하도록 변형된다. 변형을 위한 잔기는 단백질 당화 위치인 아스파라긴 잔기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 중성의 아스파라긴 잔기는 리신 또는 히스티딘과 같은 염기성 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 하나의 예에서, 변형된 치료용 단백질은 변형된 EPO 단백질이며, 아미노산 N 24, N38 및 N83로부터 선택된 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 변형되어 있다. 특별한 예에서, EPO 폴리펩티드 내 N24, N38, 및 N83 잔기는 리신으로 대체할 수 있다(예, 서열번호 309 또는310).
5. 표적화된 변형에 의해 부분-당화 또는 비-당화된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 증가시키는 방법
단백질분해효소-저항성을 증가시키는 치료용 폴리펩티드의 변형을 위한 위치를 확인하는 방법은 본원의 다른 곳에서 언급되었으며, 당업계에 알려져 왔다(공개된 국제공개번호 제WO 04/022593호 및 WO 04/022747). 단백질분해효소-저항성을 증가를 수여하는 변형은, 비-당화 또는 부분-당화된 폴리펩티드로서 생성되거나 변형되어 하나 이상의 당화 위치가 제거된 임의의 당화된 치료용 폴리펩티드 내에 생성될 수 있다. 비 당화 또는 부분-당화된 치료용 폴리펩티드에서, 단백질분해효소-저항성 증가를 수여하는 변형은 탄수화물 부위의 제거에서 기인하는 단백질 변성 증가를 보상한다. 변형된 치료용 폴리펩티드 내 단백질분해효소-저항성을 위한 예시적 변형은 표 3, 5-17에서 나타나 있다.
하나 이상의 단백질분해효소 민감성 위치가 당화에 의해 가려진 경우, 당화된 치료용 단백질 내 단백질분해효소 민감성 위치의 표적화된 확인 및 변형을 위한 방법이 또한 제공된다. 그런 변형은 치료용 폴리펩티드의 완전히 당화된, 부분-당화된, 비-당화된 형태로 생성될 수 있다. 치료용 폴리펩티드가 당화된 형태로 존재할때, 상기 변형은 또한 하나 이상의 탄수화물 부위가 투여후 생체 내에서 단백질로부터 제거된다면, 변성으로부터 폴리펩티드를 보호할 수 있다.
a. 탈- 당화에 의해 노출된 단백질분해효소 민감성 위치의 표적화된 변형
번역-후 변형, 예컨대 당화에 의해 감춰진 단백질분해효소 민감성 위치의 확인 및 변형에 의한 치료용 단백질의 단백질분해효소-저항성을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공된 방법을 사용하여, 완전히 당화된 천연의 치료용 폴리펩티드와 대등한 단백질 분해 민감성을 가진 치료용 폴리펩티드의 비-당화된 변이체가 달성될 수 있다.
비-당화된 폴리펩티드의 단백질분해효소-저항성을 증가시키기 위한 아미노산 변형의 선택은 천연 폴리펩티드의 탄수화물 결합 위치로부터 일정한 거리 내에서 일어나는 단백질분해효소 민감성 위치의 확인에 기초한다. 전형적으로, 단백질분해효소 민감성 위치는 당화 위치 내 또는 약 0-25에 위치한다. 치료용 폴리펩티드의 삼차원적 구조를 이용하여, 당화 위치로부터 정해진 거리 내 잠재적인 단백질분해효소 민감성 위치를 확인할 수 있다. 잠재적인 단백질분해효소 민감성 위치 (LEAD)의 초기목록은 본원의 다른 곳에 기재된 2차원- 및 3차원 스캐닝 방법 같은 확인 방법에 의해 생성될 수 있다. 당화 위치로부터 정해진 거리 내에서 발생한 위치에LEADs는 시험을 통하여 선택될 수 있다.
비-당화된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소-저항성을 증가시키는 변형을 확인하기 위하여, 치료용 폴리펩티드는 당화 위치에서 최초 변형되어 상기 위치에 당화를 막는다. 일반적으로, 당화 위치는 탄수화물 부위의 결합을 위한 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 전형적으로, 상기 치환된 아미노산은 단백질의 구조적인 일관성을 변경하지 않도록 선택된다. 예를 들면, N-연결 당화 위치의 아스파라긴은 히스티딘 또는 리신으로 치환된다.
이어서, 각각 선정된 LEAD는 성숙한 돌연변이된 당화 위치를 지닌 폴리펩티드 내로 도입된다. 이어서, 각각 변형된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소-저항성은 실시예 및 본원의 다른 곳에 기재된 방법을 사용하여 측정되고, 상기 당화 위치 돌연변이 및/또는 완전히 당화된 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성과 비교된다. 일단 탈-당화된 단백질의 단백질분해효소-저항성의 증가를 수여하는 변형이 확인되면, 변형된 치료용 단백질은 단백질분해효소-저항성 변형 단독 또는 당화 위치 변형과 조합되어 생성될 수 있다.
특별한 치료용 폴리펩티드가 복수의 당화 위치를 가지는 경우, 상기 방법의 단계는 각각의 당화 위치에 대해 개별적으로, 동시에, 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 예를 들면 두개 이상의 당화 자리는 동시에 변형될 수 있고, 단백질분해효소-저항성을 위한 변형은 복수의 당화 위치 돌연변리를 포함한 치료용 폴리펩티드에 대해 시험된다. 다른 예에서, 첫번째 당화 위치는 치료용 폴리펩티드 내에서 변이되고, 상응하는 첫번째 단백질분해효소에 저항성을 지닌 돌연변이체가 확인된다. 이어서, 두번째 당화 위치내의 돌연변이는 이중 돌연변이체로 도입될 수 있으며, 상응하는 두번째 단백질분해효소-저항성 돌연변이체가 확인된다. 다른 예에서, 첫번째 당화 위치가 치료용 폴리펩티드 내에서 돌연변이되고, 상응하는 첫번째 단백질분해효소-저항성을 지닌 돌연변이가 확인된다. 이어서, 두번째 당화 위치가 별개의 치료용 폴리펩티드내에서 돌연변이 될 수 있으며, 상응하는 두번째 단백질분해효소-저항성 변이체가 확인된다. 각각의 당화 위치에 대한 단백질분해효소-저항성 변이체의 확인에 이어, 상기 변형을 포함하는 변형된 치료용 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 일부 예에서, 단백질분해효소-저항성을 위한 변경(들) 및 당화 위치 돌연변이(들) 모두를 가지는 치료용 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 다른 예에서,오직 단백질분해효소-저항성을 위한 변경(들)만을 가지는 치료용 폴리펩티드가 생성될 수 있다.
단백질분해효소-저항성 증가를 수여하는 추가적인 변형은 변형된 치료용 폴리펩티드 내 하나 이상의 추가적인 변형의 도입에 의해 확인될 수 있다. 그런 변형은 본원에 다른 곳에 기재된 2D- 또는 3-D 스캐닝 방법과 같은 방법으로부터 잠재적인 단백질분해효소-저항성을 지닌 변형의 목록에서 선택될 수 있다. 치료용 폴리펩티드의 단백질분해효소-저항성 증가를 위해 확인된 임의의 변형은 또한 다른 동종의 치료용 폴리펩티드내 상응하는 위치에서 조작될 수 있다.
대표적인 치료용 폴리펩티드 (EPO) 잠재적 단백질분해효소 민감성 위치의 확인은 본원의 실시예에서 제공된다. EPO는 세개의 N-연결 당화 위치, N24, N38, 및 N83, 및 S126에 한 개의 O-연결 당화 위치를 포함한다. 도 1은EPO 폴리펩티드의 삼차원적 구조 및 N-연결된 당화 자리의 위치를 묘사하고 있다. 표 18에 나타난 바와 같이, 각각의 당화 위치 10 개 미만 또는 15 개 미만에서 발생하는 잠재적 단백질분해효소 민감성 위치가 확인될 수 있다. 상기 방법을 수행하기 위하여, EPO 폴리펩티드의 N-연결 당화 위치는 아스파라긴을 히스티딘 또는 리신 같은 아미노산으로 치환하여 변형될 수 있다.
EPO 폴리펩티드가 N24 위치에서 탈-당화되는 경우, 단백질분해효소-저항성을 증가시키는EPO 폴리펩티드의 변형을 위한 잠재적 위치는 L17, K20, E21, E23, F142, R143, R14, L16, E18, E31, W88, E89, P90, L91, L93, K97, F138, R139, K140, L141 및 Y145을 포함하나 이에 제한되지 않는다. EPO 폴리펩티드가 N38에서 탈-당화되는 경우, 단백질분해효소-저항성을 증가시키는 EPO 폴리펩티드의 변형의 잠재적 위치는 L35, E37, R76, L80, D136, F138, K140, P42, D43, L69, L70, E72, L75, L81, P129, L130, R131, R139, L141및F142을 포함하나 이에 제한되지 않는다. EPO 폴리펩티드가 N83 위체에서 탈-당화되는 경우, 단백질분해효소-저항성을 증가시키는 EPO 폴리펩티드 변형을 위한 잠재적 위치는 L35, L75, R76, L80, L81, E37, E72, P87, W88, P90, L91, L93 및 D96을 포함하나 이에 제한되지 않는다. EPO 폴리펩티드가 S126에서 탈-당화되는 경우 단백질분해효소-저항성을 증가시키는 EPO 폴리펩티드변형을 위한 잠재적 위치는 L69, E72, P121, P122, D123, P129, L130, P42, E62, W64, L67, L70, L75, R76 및 R131을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단백질분해효소-저항성을 위한 변형은 2-D 스캐닝 방법에 의하여 확인된 EPO LEADs를 사용한 상기 자리에서 선택되었다. (예, 표 3 참조) 각각의 당화 위치를 위한 상응하는 변형은 실시예에서 기재된 바와 같이 확인된다. N24에서 탈당화된 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 주는 EPO 폴리펩티드의 변형은 K20이다. N38에서 탈당화된 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성을 주는 EPO 폴리펩티드의 변형은 N139이다. N83에서 탈당화된 EPO 폴리펩티의 단백질분해효소 저항성을 주는 EPO 폴리펩티드의 변형은 L801, L931, 및 L93V를 포함한다. 단백질분해효소-저항성을 위한 변형예의 각각의 위치는 도1에서 묘사되었다. 변형된 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소-저항성 증가를 위한 추가적인 변형은 R4H, K52N, L153V및 E159V를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00022
F. EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 생산
1. 발현 시스템
(변형된 및 비-변형된) EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드는 단백질 생산을 위해 당업계에서 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있으며, 이는 EPO폴리펩티드또는 다른 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자의 숙주 세포, 숙주 동물로의 도입, 및 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드를 암호화 하는 핵산 분자의 시험관내 발현을 포함한다. 발현숙주는 대장균, 효모, 식물, 곤충세포, 인간 세포주나 유전자삽입(transgenic) 동물을 포함한 포유동물세포가 포함된다. 발현 숙주는 그들의 단백질 생산 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역-후 변형 형태에 있어 다를 수 있다. 발현 숙주는 상기 및 다른 요소들, 예컨대, 규정 및 안전성 고려, 생산 비용 및 정제의 필요 및 방법에 기초를 하여 선택할 수 있다.
진핵성 숙주 내 발현은 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스트로리(Pichia pastrori)와 같은 효모, 초파리세포 및 나방(lepidopteran) 세포와 같은 곤충세포, 담배, 옥수수, 쌀, 조류, 개구리밥(lemna)과 같은 식물 세포에서의 발현이 포함될 수 있다. 발현을 위한 진핵세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 애기 햄스터 신장 (BHK) 세포와 같은 포유동물 세포주가 또한 포함된다. 진핵성 발현 숙주는 유전자삽입 동물 내 생산, 예들 들면 혈청, 뇨, 우유 및 달걀에서의생산을 포함한다. 야생형 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드 또는 EPO 융합 단백질 및 다른 치료용 융합 폴리펩티드의 제조를 위한 유전자삽입 동물은 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 제공된 변형된EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 제조를 위해 적응될 수 있다(예컨대,Mikus 등 (2004) Transgenic Res . 13(5): 487-98; Korhonen 등 (1997) Eur . J. Biochem. 245: 482-489; Kwon 등 (2006) Transgenic Res . 15(1): 37-55 참조).
많은 발현 벡터가 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현시스템에 영향을 받는다. 이는 당업자의 수준에서 잘 선택된다. 통상, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 선택적으로는 인핸서(enhancer), 번역 신호, 및 전사 및 번역 말단 신호를 포함할 수 있다. 발현벡터는 안정한 형질전환을 위해 사용되고 전형적으로 형질전환된 세포의 선택과 유지를 위해서 선택 마커를 가진다. 일부 경우에서, 복제(replication)의 기원(origin)은 세포 내 백터의 복제 수를 증폭하기 위해 사용될 수 있다.
EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 제조 방법은 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드의 생성을 도울수 있는 하나 이상의 부가적인 이종 폴리펩티드의 동시발현을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 신호 펩티드의 절단 또는 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 분비 또는 번역-후 프로세싱(예,당화)의 보조에 기여한다. 상기 하나 이상의 부가적인 폴리펩티드는 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드와 동일한 벡터 또는 다른 벡터로부터 발현될 수 있다.
a. 원핵세포 발현
원핵 세포, 특히 대장균은 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 대량으로 생산을 위한 시스템을 제공한다(예, Plastis 등 (2003) Protein Exp. Purif. 31(2):222-30 및 Khalizzadeh 등 (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69 참조). 대장균 형질 전환은 당업자에게 널리 공지된 단순하고 신속한 기술이다. 대장균의 발현 벡터는 고수준의 단백질 발현을 유도하고 숙주 세포에 대한 약간의 독성을 나타내는 단백질을 발현하는데 유용한 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. 유도성 프로모터의 예에는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절성 L 프로모터가 포함된다.
EPO폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드는 대장균의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원성 환경으로서, 일부 분자에 대하여 이는 불용성 봉입체(inclusion body)의 형성을 초래할 수 있다. 디티올트레이톨 및 b-머캅토에탄올 같은 환원제 및 과 변성화제(예, 구아니딘-HCL 및 우레아) 는 단백질을 재가용화시키기 위해 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 용해성 단백질의 생산을 초래하는 산화성 환경 및 샤페로닌-유사 및 이황화물 아이소머라아제(disulfide isomerase)를 제공하여 세균의 주변세포질(periplasmic) 공간에서 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료적 폴리펩티드의 발현이다. 전형적으로, 단백질을 주변세포질로 보내는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 상기 리더는 주변세포질 내에서 시그널 펩티다제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적화 리더 서열의 예에는 펙테이트 리아제(pectate lyase) 유전자로부터의 pelB 리더 및 알칼린 포스파타제 유전자로부터 유래된 리더가 포함된다. 일부 경우에서, 주변세포질 발현은 발현된 단백질의 배양 배지로 누출되게 한다. 단백질의 분비는 배양물 상청액으로부터의 신속하고 간단한 정제를 가능하게 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에서 단백질은 불용성이 될 수 있고, 변성화제 및 환원제를 사용하여 가용화 및 재접힘을 촉진시킬 수 있다. 유도 및 성장의 온도는 또한 발현 수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있다. 통상적으로 25℃ 내지 37℃의 온도를 사용한다. 또한 돌연변이가 발현된 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로, 세균은 비-당화(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 단백질의 기능을 위하여 당화가 필요로 하는 경우, 숙주 세포로부터 정제 후 시험관 내에서 당화를 첨가할 수 있다.
b. 효모
사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이스세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 파치아 파스토리스(Pichia paseris)와 같은 효모는 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드를 위한 유용한 발현 숙주이다(참조: Skoko 등 (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65). 효모는 에피좀 복제 벡터를 가지거나, 또는 상동 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 통상적으로 유도성 프로모터를 사용하여 유전자 발현을 조절한다. 이러한 프로모터의 예에는 GAL1, GAL7 및 GAL5 및 메탈로티오네인 프로모터(예, CUP1)가 포함된다. 발현 벡터에는 종종 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3과 같은 선택 마커가 포함된다. 효모에서 발현되는 단백질은 종종 용해성이고, 샤페로닌, 예컨대, Bip 및 단백질 이황화물 이소머라제와의 공동 발현은 발현 수준 및 용해도를 향상시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 사카로마이세스 세레비지애로부터의 효모 교배형 알파-인자 분비 시그날과 같은 분비 시그날 펩티드 융합 및 효모 세포 표면 단백질, 예컨대, Aga2p 교배 부착 수용체 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivirans) 글루코아밀라제와의 융합을 사용하여 분비되도록 지시될 수 있다. 단백질분해효소 절단 위치(예, Kex-2 단백질분해효소)를 조작하여 이들이 분비 경로를 빠져나갈 때 융합된 서열이 폴리펩티드로부터 제거되게 할 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 당화될 수 있다.
c. 곤충 및 곤충 세포
곤충 및 곤충 세포, 특히 배크로바이러스 발현 시스템을 사용하는 것은 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 발현시키는데 유용하다(참조: Quelle 등 (1992) Protein Expr . Purif . 3(6): 461-9). 헤모림프(haemolymph)에서의 발현을 포함하는, 곤충 세포 및 곤충 유충은 고수준의 단백질을 발현하고 고등 진핵세포에 의해 사용되는 대부분의 번역-후 변형이 가능한다. 배클로바이러스는 제한적 숙주 범위를 갖고 있어 안정성을 향상시키고 진핵성 발현의 규제적 염려를 감소시킨다. 통상적으로, 발현 벡터는 고수준 발현을 위한 배클로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배클로바이러스 시스템에는배클로바이러스, 예컨대, 오토르파 칼리포니아(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV) 및 봄빅스 모리(bombyx m ori) 핵 폴리헤드로시스 바이서스(BmNPV), 및 곤충 세포주, 예컨대, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래된 Sf9, 슈달레티아 우니펀크타(Psuedlaetia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(DpN1)를 포함한다. 고수준 발현을 위하여, 발현되는 분자의 뉴클레오티드 서열은 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 하류에 즉시 융합된다. 포유동물 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질이 배양 배지로 분비되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 세포주 슈달레티아우니펀크타(Psuedlaetia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(DpN1)은 포유동물 세포 시스템과 유사한 당화 패턴을 가진 단백질을 생산한다. 곤충 세포에서의 대안적 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 세포를 사용하는 것이다. 세포주 스키니에더(Schnieder) 2(S2) 및 Kc 세포(드로소필라 멜라노가스터(Drosophilla melanogaster)) 및 C7 세포(애더스 알보픽투스(Aedes albopictus))와 같은 세포주를 발현용으로 사용할 수 있다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터를 사용하여 카드뮴 또는 구리를 사용한 중금속 유도의 존재 하에서 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 통상적으로 네오마이신 및 하이그로마이신과 같은 선택 마커를 사용하여 발현 벡터를 유지시킨다.
d. 포유동물 세포
포유동물 발현 시스템을 사용하여 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 발현 제작물은, 아데노바이러스 또는 벡시니아 바이러스와 같은 바이러스성 감염에 의해, 또는 리포좀, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과같은 직접적 DNA 전달에 의해, 및 전기천공 및 미세주입과 같은 물리적 수단에 의해 포유동물 세포로 전달될 수 있다. 포유동물 세포용 발현 벡터에는 통상적으로 mRNA 캡 위치, TATA 박스, 번역 개시 서열(코작(Kozak) 공통 서열) 및 폴리아데닐화 요소가 포함된다. 이런한 벡터에는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들면 SV40 프로모터-인핸서, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 긴 말단 반복부가 포함된다. 이들 프로모터-인핸서는 많은 세포 유형에서 활성이 있다. 조직 및 세포-유형 프로모터 및 인핸서 영역을 또한 발현을 위하여 사용할 수 있다. 대표적인 프로모터/인핸서 영역에는 엘사스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방 종양 바이러스, 알부민, 알파-태아단백질, 알파 1-항트립신, 베타-글로빈, 미엘린 기초 단백질, 미오신 경사슬-2 및 성선자극호르몬 방출 호르몬 유전자 제어와 같은 유전자로부터의 것들이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 선별가능 마커를 사용하여 발현 구축물을 가지는 세포를 선별 및 유지할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자의 예에는 하이그로 마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 티미딘 키나제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 표면 신호전달 분자 예컨대, TCR-ζ 및 FcεRI-γ와의 융합은 세포 표면에서 활성 상태인 단백질의 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 래트, 사람, 원숭이, 및 닭 및 햄스터 세포를 포함하는, 많은 세포주가 포유동물 발현을 위하여 이용가능하다. 대표적인 세포주에는 CHO, VERO, BHK, MDCK, W138, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비-분비성) 및 다른 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, RPMI 17898, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, EBNA-1 및 HKB 세포가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다(예, 미국특허번호 5,618,698, 6,777,205 참조). 세포 배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 촉진하는 무혈청 배지에 순응된 세포주를 또한 이용할 수 있다(예: EBNA-1, Pham 등, (2003) Biotechnol . Bioeng . 84:332-42). 한가지 이러한 예는 무혈청 EBNA-1 세포주(참조: Pham 등, (2003) Biotechnol . Bioeng. 84:332-42)이다. 소변-유래 EPO와 유사한 번역-후 탄수화물 변경 및 구조를 나타내는 재조합 야생형 EPO 폴리펩티드가 당업계에 공지되어 있고, 이의 일부는 시알 부위 결합에서 차이를 나타낸다 (예: Takeuchi 등 (1988) J. Biol. Chem. 263(8): 3657-3663; Inoue 등 (1995) Biotechnol . Annu . Rev .1: 297-313). 최적의 EPO 발현을 위한 방법도 당업계에 알려져 있다(예: Tsao 등 (1992) Ann N Y Acad Sci. 665: 127-36; Wang 등(2002) Biotechnol Bioeng. 77: 194-203; Sethuraman and Stadheim (2006) Curr. Opin. Biotech. 17:341-346; Yoon 등 (2001) Biomed. Life Sci. 37(2) 119-132)
e. 식물
EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 발현을 위하여 유전자삽입된 식물 세포 및 식물을 사용할 수 있다. 통상적으로 미세입자 투사법 및 PEG-매개 원형질체 내로의 전달과 같은 직접적 DNA 전달 및 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 발현 구축물을 식물로 전달한다. 발현 벡터에는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 요소 및 번역 제어 요소(예컨대, Ti 플라스미드)가 포함될 수 있다. 발현 벡터 및 형질전환 기술은 일반적으로 애기장대(Arabidopsis) 및 담배와 같은 쌍자엽 숙주, 및 옥수수 및 벼와 같은 단자엽 숙주 사이에서 구분된다. 발현을 위하여 사용되는 식물 프로모터의 예에는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 리보스 비포스페이트 카복실라제 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터가포함된다. 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마신 포스포트랜스퍼라제와 같은 선별 마커를 흔히 사용하여 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 한다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(유합조직)로서 배양물 중에 유지되나 전체 식물로 재생될 수 있다. 유전자삽입된 식물 세포에는 또한 단백질을 생산하도록 조직된 조류가 포함될 수 있다(예, Mayfield 등 (2003) PNAS100:438-442 참조). 식물세포 발현 시스템은 또한 예를 들어 모란채 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV)와 같은 바이러스 발현 벡터에 감염된 식물을 포함된다. 식물은 포유동물 세포와 상이한 당화 패턴을 갖기 때문에, 이는 상기 숙주에서 EPO를 생산하기 위한 선택에 영향을 줄 수 있다.
2. 정제
숙주 세포로부터 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드를 정제하는 방법은 선택된 숙주 세포 및 발현 시스템에 따라 달라진다. 분비되는 분자의 경우, 일반적으로 세포를 제거한 후 배양 배지로부터 단백질을 정제한다. 세포내 발현의 경우, 세포를 용해(lysis)시키고 단백질을 추출물로부터 정제할 수 있다. 발현을 위하여 유전자삽입 식물 및 동물과 같은 유전자삽입 유기체를 사용하는 경우, 조직 또는 기관을 시작 물질로서 사용하여 융해된 세포 추출물을 수득할 수 있다. 또한, 유전자삽입된 동물 제조에는 수거될 수 있는 유즙 또는 난에서의 폴리펩티드의 생산이 포함될 수 있고, 필요에 따라 당업계의 표준 방법을 사용하여 추가로 단백질을 추출하고 정제할 수 있다.
EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드는 다음을 포함하는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: SDS-PAGE, 분별침강, 정용여과, 초여과, 컬럼 전기포커싱, 평반(flat-bed) 전기포커싱, 겔여과, 이소타코포레시스(isotachophoresis), 크기 분별, 황산암모늄 침전, 고성능 액체 크로마토그래피, 킬레이트 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 분자배제 크로마토그래피. 또한 친화도 정제 기술을 사용하여 제조 효율 및 순도를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 친화도 정제에서 EPO 또는 다른 치료용 폴리펩티드에 결합하는 항체, 수용체 및 다른 분자를 사용할 수 있다. 또한 발현 구축물을 조작하여 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6와 같은 친화도 태그, 및 myc 항체, 글루타티온 수지, 및 니켈-수지를 사용하여 정제된 친화도를 각각 단백질에 추가 할 수 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색 및 분광광도측정 기술을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. EPO 폴리펩디드 및 다른 치료용 폴리펩디드 정제의 예시적 기술은 예를 들면, 미국 특허 제4,377,513호, 제4,667,016호, 제4,677,195호, 제5,733,761호, 제6,682,910호, 제7,012,130호 Miyake 등 (1977) J. Biol. Chem. 252(15) 5558-5564; Spivak 등 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(10): 4633-4635 에서 찾을 수 있다.
3. 융합 단백질
일부 구현예에서, 변형된 EPO 폴리펩디드 또는 다른 치료용 폴리펩디드는 융합 단백질을 형성하기 위한 외래의 폴리펩디드(예, 융합 파트너)를 추가로 혼합하거나, 링커 예컨대 화학적 수단에 의해 폴리펩디드와 연결된다. 적합한 융합 파트너는 생체내에서의 증가된 안정성을 수여하는 펩티드 및 폴리펩티드(예, 혈청 반감기 증가); 정제의 용이함을 제공하는 펩티드 및폴리펩티드, 예컨대, 히스티딘 태그(His)n (예: 6xHis 및 유사물); 세포로부터 융해 단백질의 분비를 제공하는 펩티드 및폴리펩티드 에피토프 태그를 제공하는 펩티드 및 폴리펩티드(예, GST, 헤마글루티닌(HA), FLAG, c-myc 및 유사물) 탐지가능한 신호 (탐지가능한 산물을 생산하는 효소(예, 베타-칼락토시다아제, 루시퍼라아제)), 또는 자가 검출이 가능한 단백질(예, 녹색 형광 단백질(GFP) 등)을 제공하는 펩티드 및 폴리펩티드 중합체를 제공하는 펩티드 및 폴리펩티드(예, 면역글로불린의 Fc 부분과 같은 중합체 부분) 등을 포함한다.
표적 시약 및 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 단백질을 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 예를 들어 특히 경구 투여와 같이 적절한 경로에 의한 투여를 고려하여 제제화된 상기 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 융합 단백질은 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 단백질과 제제, 예컨대, 항체 또는 이의 단편, 성장인자, 수용체, 리간드, 및 표적 세포 또는 조직으로 돌연변이 단백질을 보내기 위한 기타의 제제를 임의의 순서로 연결하여 생성된다. 연결은 링커를 통해 직접 혹은 간접적으로 이루어진다. 융합 단백질은 재조합적으로, 또는 화학적 연결, 예컨대, 이종이작용성(heterobifunctional) 제제 또는 티올 연결 또는 기타 연결에 의해 화학적으로 제조될 수 있다. 상기 융합단백질은 종종 단백질 콘쥬게이트라고 언급된다. 화학적으로 연결된 콘쥬게이트에 적합한 링커 및 연결은 이황화 결합, 티오에테르결합, 방해된(hindered) 이황화 결합, 아민과 티올 그룹과 같은 자유 반응 그룹 사이의 공유결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 결합은 폴리펩티드의 하나 또는 모두 사이에 반응적인 티올 기를 생산하는 이종이작용성 제제의 이용 하에, 이이서, 한 폴리펩티드의 티올 기를, 반응성 말레이미도 기나 티올기가 다른 폴리펩티드에 결합될 수 있는 반응성 티올기 또는 아민기와 반응시켜 제조된다. 이종이작용성 교차-결합 제제에서 사용되는 예시적 기는 전형적으로 아릴 아자이드, 말레이미드, 카르보디이미드, N-하이드록시숙신이미드(NHS)-에스테르, 하이드라지드, PFP-에스테르, 하이드록시메틸 포스핀, 프소라렌, 이미도에스테르, 피리딜 이황화물, 이소시아네이트 및 비닐 설폰을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
융합 단백질은 용해성, 접힘, 정제 및 세포의 단백질 유일 돕는 대장균 말토오즈 결합 단백질(MBP)과 같은 추가적 성분을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 변형된 EPO는 알부민과 같이 안전성을 증가시키는 폴리펩티드와 융합된다(참조: 미국 특허 공개 번호 제6,987,006호, 제6,548,653호, 제7,101,971호 미국 특허 공개 번호제2004-0063635호, 제2006-0058236호 Albupoietin? CoGenesys).
선택적으로 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드는 예를 들어 Fc 융합 단백질로서 발현시키거나, 또는 중합체 도메인 융합시켜 중합체(multimer)로 형태로 제조될 수 있다. EPO 융합 폴리펩티드 및 다른 치료용 융합 폴리펩티드는 또한 융합 두개 이상의 치료용 폴리펩티드의 융합 또는 이량체화/중합체화를 포함할 수 있다(예,미국 특허 번호제5580853호 Sytkowski (1999) J. Biol. Chem . 274(35): 24773-24778). 이량체화 또는 중합체화는 직접적으로 달성되거나(예, 두개 이상의 EPO 분자가 직렬로 배열된 하나의 폴리펩티드), 또는 링커 (예, 헤테로- 또는 호모- 이작용성 교차연결제)를 통해 간접적으로 달성되거나, 또는 이량체화 능력을 가지거나 화학적 수단을 통해 이량제화 될 수 있는 한쌍의 폴리펩티드에 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료적 폴리펩티드의 융합일 수 있다. 후자의 예에서, EPO 또는 다른 치료용 폴리펩티드와 융합된 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드 또는 다른 폴리펩티드일 수있다.(예,서로 결합할 수 있는 두 단백질). 대표적인 중합체화 도메인이 당업계에 공지되어 있으며, Fc 도메인, 또는 유사한 항체-유사 단편, 루이신 지퍼 모티프, 코일드 코일 도메인, 친수성 영역, 소수성 영역, 두개 이상의 중합체화 도메인 사이에 분자내 이황화 결합을 형성하는 자유 티올을 포함하는 폴리펩티드, 또는 "돌기-내-구멍(protuberance-into-cavtity)" 도메인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (참조: 국제특허 제WO 94/10308호 미국 특허. 제5,731,168호, Lovejoy 등 (1993), Science 259: 1288-1293; Harbury 등 (1993), Science 262: 1401-05; Harbury 등(1994), Nature 371:80-83; Hakansson 등(1999), Structure 7: 255-64 참조).
추가적인 전형적인 EPO 융합 단백질 및 다른 치료 융합 폴리펩티드 및 제조 방법은 당업계에 제공되어 있으며 예를 들어, Fc 융합 및 베타-락토글로불린 융합을 포함한다(미국 특허. 제6,992,174호, 제6,165,476호 미국특허 공개번호. 제2003-0064480호, 제2005-0202538호, 제2005-0192211호 K orhonen 등 (1997) Eur. J. Bioch. 245: 482-489). 치료 단백질과 함께 구축시 Fc 도메인은 더 긴 반감기를 제공 하거나 Fc 수용체 결합, 이량체화, 단백질 A 결합, 보체 고정 및 태반 이송과 같은 기능을 제공할 수 있다. 상기 융합 단백질에서, EPO 폴리펩티드및다른 치료용 폴리펩티드의 특성은 하나 이상의 추가적 변경에 의해 추가적으로 개선될 수있다. 비제한적 예에서, Fc-Epo 융합 단백질의 문맥에서 Cys-29-Cys33 에서 Cys-29-Cys88까지의 이황화 결합 패턴의 재배열을 초래하는, EPO 폴리펩티드의 H32G, C33, W88C 및 P90A와 같은 변경은 현저히 개선된 성질을 야기한다 (참조: Way 등(2005) Protein Eng. Des. Sel. 18(3): 111-8). 또한, 본원에서 제공되는 변경된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 융합 단백질은 당업계에 공지되거나, 본원에 기재된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 추가적 변경 (예: 돌연변이, 당화, 페길화, 헤실화 등)과 결합될 수 있다.
4. 폴리펩티드 변형
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 단백질은 나출형 폴리펩티드 사슬로서 또는 복합체로서 제조될 수 있다. 일부 적용의 경우, 번역-후 또는 다른 화학적 변형이 없는 "나출형" 형태인 변형된 EPO 또는 다른 치료 폴리펩티드를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 나출형 폴리펩티드 사슬은 치료용 폴리펩티드를 번역-후 변형시키지 않는 적당한 숙주에서 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 시험관 내 시스템 및 화학적 폴리펩티드 합성을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 적용의 경우, 페길레이션, 알부민화, 당화, 카르복실화, 하이드록실화, 인산화 또는 다른 공지된 변형을 포함하는 특정한 변형이 바람직할 수 있다. 변형은 시험관 내에서 또는, 예를 들면, 이러한 변형을 생산하는 적절한 숙주에서 변형된 EPO 및 다른 치료적 폴리펩티드를 생산함으로써 제조될 수 있다.
5. 뉴클레오티드 서열
원핵성 또는 포유동물세포와 같은 진핵성 세포에서의 발현을 위하여 유도성 프로모터와 같은 프로모터에 조작적으로 연결된 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드 또는 이들의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 또한 제공된다.. 상기 프로모터는 원핵성, 진핵성, 또는 바이러스성 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포내 발현을 위한 프로모터의 선택은 발현에 사용될 세포 유형에 의존적이다. 포유동물세포 내 발현을 위한 예시적인 프로모터에는 CMV 및 SV40 프로모터 아데노바이러스 프로모터, 예컨대, HPV E7 종양단백질에 반응성인 E2 유전자 프로모터 PV 프로모터, 예컨대, PV E2 단백질에 반응하는 PBV p38 프로모터 및 HIV 또는 PV 또는 종양유전자에 의해 활성화되는 다른 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드는 또한 유전자 전달 벡터 내에서 세포로 전달될 수 있다. 전달 벡터는 혈우병, 선천성 질환 및 EPO가 투여되는 다른 질병 또는 장애에 대한 치료를 위한 추가적인 치료제들를 암호화할 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 전달 벡터는 핵산을 대상체에게 투여함으로써 전신적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 전달 벡터는 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터일 수 있다. EPO 또는 다른 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 또한 줄기 세포 내로 혼입될 수 있고, 상기 줄기세포는 예를 들면, 치료법을 위한 위치에 줄기 세포를 이식 또는 생착시킴으로써 대상체에게투여될 수 있다. 예를 들어 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells (MSCs))은 변형된 EPO 및 다른 치료용 폴리펩티드를 발현하도록 조작되어 있으며, 상기 MCS는 치료를 위한 종양 위치에 생착될 수 있다.
G. 변형된 EPO 폴리펩티드의 특성 및 활성의 평가
EPO 활성 및 특성은 시험관 내 및/또는 생체 내에서 평가할 수 있다. 이러한 평가를 위한 분석은 당업자에게 공지되어 있으며, 검사된 활성 및 결과와 치료학적 및 생체 내 활성을 관련시키는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, EPO 변이체는 비-변형 및/또는 야생형 EPO와 비교하여 평가할 수 있다. 또다른 예로, 변형된 EPO 폴리펩티드는 단백질 안전성-변경 조건(예, 단백질분해효소, 또는 온도나 pH와 같은 변성화제에 대한 노출)에 대한 시험관 내 또는 생체 내 노출에 따르는 생물학적 활성으로 평가될 수 있다. 시험관 내 분석은 예를 들어, 세포-기초 분석, 예컨대, 적혈구생성 분석, 세포 생존력 분석, 세포 생존 분석, 단백질 분석 및 분자생물학적 분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 실험실적 분석법이 포함된다. 생체 내 분석은 동물 모델 분석 뿐만 아니라 사람에 투여한 EPO 분석까지 포함한다. 일부 경우 생체 내 EPO 활성은 혈액, 혈청 또는 분석 결정자를 위한 기타 체액을 평가하여 결정될 수 있다. EPO 변이체는 또한 생체 내에서 안정성(예, 반감기)와 같은 특성 또는 활성 및 치료효과를 평가하기 위해 시험될 수 있다. 이러한 분석 결과는 치료적 유효성, 용량 수준, 투약 지침 및 EPO-매개 질병 또는 상태에 대한 유용성과 같은 파라미터를 평가하기 위해 이용될 수 있다.
본원에서 제공되고, 당업계에 알려진 EPO 특성 및 활성 분석은 번역-후 또는 화학적 변형 또는 비변형 EPO 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 변화를 하나 이상의 추가적 변형과 조합되어 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 특성 및 활성 평가에 이용될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 추가적인 변형은 EPO 폴리펩티드 내에 체계적으로 혼입될 수 있으며, 하나 이상의 활성은 실험적으로 결정할 수 있다.
1. 시험관내 분석
대표적인 시험관내 분석은 폴리펩티드의 안정성 및 활성을 평가하기 위한 분석을 포함한다. 안정성 분석은 시험관 내 또는 생체 내에서 단백질분해효소에 대한 저항성 이나 폴리펩디드의 안정성을 지시하는 물리적 성질을 평가하는 분석을 포함한다. 안정성은 또한 당업계에 알려진 단백질의 구조 및 구조 해석을 통해 평가될 수 있다. 활성 분석은 적혈구 세포 증식 분석법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
변형된 EPO 폴리펩티드의 농도는 다음과 같은 당업계에 알려진 방법에 의하여 평가될 수 있다: 효소면역분석법(ELISA), SDS-PAGE Bradford/Lowry/BCA 법 자외선 흡광 및 면역학적, 방사성, 형광 및 관련 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 정량화가능한 단백질 표지법을 포함하나,이에 제한되지 않는다.
EPO 폴리펩티드의 절단을 포함한 단백질분해 반응의 분해 산물 평가는 SDS-PAGE, 면역조직화학법, NH2-말단 시퀀싱, 발색성 기질 절단법, HPLC법, 및 단백질 표지법을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 널리 공지된 표준방법을 사용하여 수행될 수 있다. 단백질분해효소에 노출시킨 EPO 폴리펩티드를 NH2-말단 시퀀싱하여 변형된 EPO 폴리펩티드의 절단 자리의 위치 또는 변화를 결정할 수 있다.
EPO 폴리펩티드는 EPO 수용체와의 결합을 통해 시험될 수 있다. 예를 들어, EPO와, EPO 수용체 혹은 EPO 수용체 단편과의 결합은 면역침강법, 컬럼 정제법, 비환원 SDS-PAGE, 표면 플사스몬 공명법(SRP), 형광 공명 에너지 이동법(FRET), 형광 편광법(FR), 등온 적정 열량측정법(ITC), 순환 2색성법(CD), 단백질 단편 보체 분석법(PCA), 핵자기 공명 (NMR) 분광법, 광산란법, 침강 평형법, 작은-구역(small-zone) 겔 여과 크로마토그래피법, 겔 감속법, 파-웨스턴 블롯(Far-westernblot), 형광 편광법, 하이드록시-라디칼 단백질 풋프린팅법, 상분석법 및 다양한 2-하이브리드 시스템을 포함한 당업계에 공지되어 있으나 이에 제한되지 않는 결합 분석법을 사용하여 평가될 수 있다.
EPO 폴리펩티드의 적혈구 생성 활성은 당업계에 공지되어 있는 분석법을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 상기 분석법의 일부는 TF-1 증식력 분석과 같은 세포기조의 분석법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. TF-1 세포는 EPO 수용체를 발현하는 인간 적백혈병 세포주이다. 삼중수소(3H)-티미딘의 혼입으로 결정되는 TF-1 세포의 증식은 적혈구 생성 활성의 기능이다(Hammerlling 등, (1996) J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 1455; Kitamura 등, (1989) J. Cellular Physiol. 140: 323). FDCP-1 세포주를 이용한 유사한 분석법이 수행될 수 있다.(참조, 예컨대, Dexter 등 (1980) J. Exp. Med.152: 1036-1047). FDCP-1은 WEHI-3 조건 하 배양배지(IL-3가 함유된 배양배지(ATCC No. TIB-68))로 보충시 증식할 수 있으나 분화되지 않는 마우스 유래 다중분화능 성장인자 종속 원시 조혈 전구세포주이다. 상기 시험을 위하여 FDCP-1 세포주는 인간 또는 마우스의 EPO-R로 형질감염되어 FDCP-1-hEPO-R 또는 EPO에 의해 증식하나 분화되지 않는FDCP-1-mEPO 세포주를 각각 생산할 수 있다. 이러한 실험에서 세포는 필수 성장인자 존재하에 절반의 포화 밀도까지 배양된다(예, 미국 특허. 제5,773,569호 와 미국 특허 공개 제2005-0137329호에 기술). PBS에서 세포를 세척한 후 성장인자가 배제된 전체 배지에서 24시간 동안 절식시킨다. 세포의 생존능을 (예, 트리판 블루 염색에 의해) 결정한 후, 배양용액(성장인자만 배제된 전체 배지)을 50μL 당 105개의 세포를 제공하도록 제조한다. 시험될EPO폴리페티드를 96-웰 평판플레이트에서 웰 당 50 μL씩의 최종부피로 연속적 희석을 하였다. 세포(50 μL)를 각 웰에 첨가하고, 상기 세포를 24-48 시간 동안 배양하였으며, 이 시점에 음성대조군은 사멸되거나 정지되어야 한다. 이어서, 세포 증식은 당업계에 공지된 기술, 예컨대 3H-티미딘 주입을 세포 증식의 지표로서 측정하는 MTT 분석법에 의하여 측정한다(예,Mosmann (1983) J. Immunol . Meth . 65: 55-63 참조). EPO 변형 폴리펩티드는 EPO-R 발현 세포주 및 비-발현 모세포주 모두에서 평가된다. 최대 세포 증식의 절반을 생산하는데 필요한 시험 폴리펩티드의 농도를 EC50로 기록하였다.
다른 예시적 분석에서, 세포를 EPO-보충 배지 내 정지상까지 키우고, 수집한 후, 여기에 EPO가 없는 배지에서 추가로 18시간 동안 배양한다. 세포를 동일한 세포 밀도의 세가지 그룹으로 나눈다: 첨가된 폴리펩티드가 없는 그룹(음성 대조군), EPO를 포함한 그룹(양성 대조군), 및 변형된 시험 EPO 폴리펩티드를 포함하는 실험군. 이어서, 여러 시점에서 배양된 세포를 수집하고, 고정한 후, DNA-결합 형광 염료(예: 프로피듐 요오드화물 또는 Hoechst 염료, 모두Sigma에서 시판)으로 염색한다. 이어서, FACS 스캔 유세포 계수기를 사용하여 형광을 측정한다. 이어서, 각 세포주기의 상에 있는 세포의 백분율을 예를 들어 CellFIT 소프트웨어(Becton Dickinson)의 SOBR 모델을 이용하여 결정한다. EPO 또는 변형된 활성 EPO펩디드를 처리한 세포는 음성대조군보다 S 상에 있는 세포의 백분율이 더 높을 것이다(증가된 DNA 함량 지표로서 형광 증가에 의해 결정됨).
다른 예시적 분석에서, 인간 EPO-R 를 발현하고,fos 프로모터-유도 루시퍼라아제 리포터 유전자 구축물로 추가로 형질감염된 마우스 유래 B 전구세포주를 사용할 수 있다. EPO 또는 EPO-R 작용제에 노출시 상기 세포는 루시퍼라아제를 합성하여 반응한다. 루시퍼라아제는 기질인 루시페린 첨가시 빛을 발산한다. 따라서,상기 세포에서 EPO-R의 활성 수준은 루시퍼라아제 활성의 측정을 통해 정량 될 수 있다. 시험 폴리펩디드의 활성은 세포에 상기 시험 폴리펩티드의 연속적 희석물을 첨가하고, 이어서 4시간 동안 배양하여 측정된다. 배양 후 루시페린 기질을 세포에 첨가한 후, 빛 발산을 측정한다. 최고 빛 발산의 절반을 초래한 시험 폴리펩티드의 농도를 EC50로 기록한다.
다른 분석법에서, Krystal (1983) Exp . Hematol 11: 649-660에 제시된 비장세포 내 3H-티미딘의 혼입에 기초한 미세분석법을 사용하여 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 세포 증식 촉진능을 측정할 수있다. 요약하면, B6C3 F1 마우스에 2일간 매일 페닐하이드라진(60 mg/kg)를 주사한다. 3일째 비장세포를 적출하고이의 증식능을 24 시간 동안 MTT 분석법을 이용하여 측정한다.
에리스로포이에틴 민감성 세포주 내 EPO와 EPO-R와의 결합은 수용체 및 Shc, vav, 및 JAK2 키나아제를 포함하는 수많은 세포 내 단백질 모두의 티로신 인산화를 일으킨다. 따라서, 시험관내 분석은 본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드의 EPO-R, 및 세포내 하위 신호전달자 단백질의 티로신 인산화능을 측정한다. 상기 기재된 결합 및 증식 분석법에 의해 확인된, 활성 펩티드는 에리스로포이에틴-민감성 세포 내 EPO의 인산화 패턴과 거의 동일한 인산화 패턴을 나타낸다. 이 분석에서, FDC-P1/ER 세포(Dexter, 등 (1980) J Exp Med 152: 1036-47)는 EPO -보충 배지에서 유지되고 정지상까지 배양된다. 이어서, 상기 세포를 EPO가 배제된 배지에서 24시간 동안 배양한다. 이어서, 제한된 수의 상기 세포를 변형된 EPO 플리펩티드와 함께 37℃에서 약 10분간 배양한다. EPO를 포함한 대조군 시료 또한 각각의 분석을 수행한다. 이어서, 처리된 세포를 원심분리하여 수집하고 SDS 용해버퍼에 재현탁한 후, SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한다. 겔 상에서 전기영동된 단백질을 니트로셀룰로오즈로 이동시키고, 블롯 상에 포스포티로신 포함 단백질을 표준 면역학적 기술에 의하여 시각화한다. 예를 들어, 상기 블롯은 항-포스포티로신 항체(예: 마우스 항-포스포티로신 IgG, Upstate Biotechnology, Inc. 제조)로 표지하고, 세척한 후 2차 항체(예, 페록시다아제가 표지된 염소 항-마우스 면역글로불린 (제조사:Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, D.C.))로 표지한다. 그후에 포스포티로신-포함 단백질은 발색, 화학발광 또는 형광 분석법을 포함하는 표준 기술로 시각화할 수 있다. 예를 들어, 화학발광 분석법은 에머샴의 ECL 웨스턴 블롯팅 시스템을 이용하여 수행할 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 활성을 측정하기 위하여 사용할 수 있는 다른 세포-기초 시험관 내 분석법은 마우스 유래 골수 또는 인간의 말초혈액단핵세포를 이용하는 콜로니 분석법이다. 마우스유래 골수는 마우스의 대퇴골에서얻을 수 있고, 인간 말초혈액단핵세포의 시료는 건강한 기증자에서 얻을 수 있다. 말초혈액단핵세포의 경우, 단핵세포는 예를 들면 Ficoll-Hypaque 구배(Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada))를 이용한 원심분리를 통해 혈액에서 최초 분리된다. 이 분석에서, 유핵세포의 계수는 본래 시료 내 유핵세포의 수 및 농도를 확립하기 위해 수행한다. 제한된 수의 세포를 제조자의 지시에 따라 메틸 셀룰로오즈 상에 플레이팅한다(Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canada)). 실험군을 변형된 EPO 폴리펩티드로 처리하고, 양성대조군을 EPO로 처리하고, 음성대조군은 아무것도 처리하지 않는다. 이어서, 각 그룹의 콜로니 숫자를 정해진 배양기간, 일반적으로 10일에서 18일 배양 후 평가한다. 활성 펩티드는 콜로니 형성을 촉진할 것이다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 활성 측정에 이용되는 다른 시험관내 생물학적 분석법은 다음에 개시되어 있다: Greenberger, 등 (1983) Proc . Natl. Acad. Sci . USA 80:2931-2935 (EPO-종속적 조혈 전구세포주); Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol . Chem. 266:609-614 ( B6SUt.EP 세포 내 단백질 티로신 인산화); Dusanter-Fourt, 등(1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678 (인간EPO-반응성 세포 내 EPO 수용체의 티로신 인산화); Quelle, 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060 (FDC-ER 세포내 세포질 단백질의 티로신 인산화, pp 100); Worthington, 등 (1987) Exp. Hematol. 15:85-92 (헤모글로빈에 대한 발색분석); Kaiho and Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120 (2,7-디아미노플루오렌으로 헤모글로빈 탐지); Patel, 등 (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302 ( c-myb의 발현); Witthuhn, 등 (1993) Cell 74:227-236 (JAK2의 연합 및티로신 인산화); Leonard, 등(1993) Blood 82:1071-1079 (GATA 전사인자의 발현); and Ando, 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575 (D2 및 D3의 고리화에 의한 GI 전이의 조절).
마이크로피지오미터로 알려진, Molecular Devices Corp.에 의해 설계된 기기를 다양한 수용체의 작용제 및 길항제의 효과 측정을 위해 이용할 수 있다. 상기 장치의 원리는 수용체 활성화에 반응성인 세포외 매질의 산성화 속도의 변화를 측정하는 것이다.
또한, 본원에서 제공된 EPO 폴리펩티드의 번역-후 변형의 존재를 측정할 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지되어 있으며, 당화, 수산화, 산화, 황화, 카르복실화 및 인산화를 측정하는 분석을 포함한다. 당화에 대한 예시적 분석에서, 탄수화물 분석은 예를 들면 히드라지노라이시스 또는 엔도글리코시다아제 처리에 노출된 EPO 폴리펩티드의 SDS-PAGE 분석법으로 수행할 수 있다. 히드라지노라이시스는 무수 히드라진과 배양한 당단백질에서 N- 및 O-연결 글리칸을 방출하는 반면, 엔도글리코시다아제 분비는 당단백질에서 N-글리칸을 방출하는 PNGae F를 포함한다. EPO 폴리펩티드의 히드라지노라이시스 또는 엔도글리코시다아제 처리는 형광단 또는 발색단을 표지로 태깅될 수 있는 환원 말단을 생성할 수 있다. 표지된 EPO 폴리펩티드는 FACE(형광단-조력 탄수화물 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis))를 이용하여 분석할 수 있다. 글리칸에 대한 형광 태그는 또한 HPLC를 사용한 단당류 분석, 복잡한 당화 패턴의 프로파일링 또는 핑거프린팅을 위해 이용할 수 있다. 예시적인 HPLC 방법은 친수 결합 크로마토그래피, 전자 결합, 이온-교환, 소수성 결합 크로마토그래피 및 크기-배제 크로마토그피를 포함한다. 예시적인 글리칸 탐침은 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘 (AA-Ac) 및 2-아미노벤조산(2-AA) 이다. 탄수화물 부위는 또한 당화된 EPO 폴리펩티드를 인식하는 특정한 항체를 이용하여 탐지될 수 있다(참조: Cheetham 등(1998) Nat. Struct. Biol. 5: 861-866; Watson 등 (1994) Glycobiology 4(2): 227-237).
변형된 EPO 폴리펩티드의 구조적 특징 역시 평가될 수 있다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드의 X-선 결정학, 핵자기공명(NMR), 및 저온전자 현미경(cryo-EM)은 EPO 폴리펩티드의 3차 구조 및/또는 성질, 예컨대, 다른 수용체 결합 및 탄수화물 변형을 분석하기 위해 수행될 수 있다(참조,Cheetham 등(1998) Nat. Struct. Biol. 5: 861-866; Watson 등 (1994) Glycobiology 4(2): 227-237).
2. 비-인간 동물 모델
비-인간 동물 모델은 변형된 EPO 폴리펩티드의 활성 및 안정성을 평가하는데이용될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 동물 모델은 질병 또는 상태에 대한 모델로 사용될 수 있다. 비-인간 동물 모델에 질병 및/또는 질병의 진행에 대한 효과를 모니터링하기 위해 EPO 투여전에 표현형 유발물질을 주사할 수 있다. 유전학적인 모델 또한 유용하다. 마우스와 같은 동물은 하나 이상의 유전자의 과발현, 발현 저하 또는 제거에 의해 질병 또는 상태와 유사하게 유도할 수 있다. 이러한 동물은 당업계에 잘 알려진 유전자삽입 동물 제조 기술 또는 자연 발생적 또는 유도된 돌연변이 종에 의해 생산할 수 있다. EPO에 관련된 질병의 유용한 비-인간 동물모델의 예는 마우스, 래트, 토끼, 개 및 영장류와 같은 동물에서, 겸상적혈구 빈혈, 후천성 골수 부전증, 베타-지중해성 빈혈, 급성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 악성 빈혈 및 신부전 또는 암에서 유발된 빈혈의 모델을 포함한 빈혈 모델이다(참조 예, Nagel (1998) N. Engl J Med . 339(3): 194-5; Chen (2005) Clin . Med . Res . 3:102-108; Chen 등 (2004) Blood 104: 1671-1678; McMullin 등 (1989) Biochem Med Metab Biol . 41(1): 30-5; Alderuccio 등 (2002) Clin . Immun. 102(1): 48-58; Kawamura 등 (1990) Biotherapy 2(1): 77-85; Bohl 등 (2000) Blood 95: 2793-2798). 상기 비-인간 동물모델은 야생형 EPO 폴리펩티드와 비교하여 EPO 변이형의 활성을 모니터링 하는데 이용될 수 있다.
동물 모델은 또한 변형된 EPO 폴리펩티드의 안정성, 반감기 및 배출을 모니터링 하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 변형된 EPO 폴리펩티드간의 비교 및 추가적 비-인간 동물 및 인간 임상을 위한 용량 및 용량용법을 계산하는데 유용하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드를 마우스 꼬리 미정맥에 주사할 수 있다. 이어서, 혈액시료는 주사후 시간별(투여후, 분, 시간, 날짜)로 얻을 수 있고, 예를 들어 ELISA 또는 방사면역측정법을 이용하여 혈장 또는 혈청을 포함하나 이에 제한되지 않는 체내 시료의 변형 EPO 폴리펩티드의 수준을 특정시간대에 모니터링 할 수 있다.
혈액시료는 조혈활성을 예컨대 적혈구 증식 분석으로 시험할 수 있다.
생체내 시험법의 예로는 헤마토그릿(HCT) 분석법, 철흡수 및 망상적혈구 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(참조 예, Cotes 등(1961) Nature 191: 1065; 미국 특허 제6,099,830호). HCT 분석법은 에리스로포이에틴-처리 동물 혈액 시료에서 적혈구의 부피를 측정하는 것으로, 모세관에서 혈액을 원심분리하고, 침전된 적혈구에 의해 차지된 전체 부피의 분획을 측정하여 수행된다. 망상적혈구 분석법은 최근 전구세포에서 분화되고, 전구세포의 핵산 특징이 남아있는 신생 적혈구 또는 망상 적혈구를 측정하는 것이다. 이 분석법에서 비처리 정상 마우스에 본원에서 제공한 EPO 또는 변형된 EPO 폴리펩티드 중어느 하나를 3일간 연속으로 피하 주사한다. 3일째 덱스트란철을 또한 복강 투여한다. 5일째 쥐로부터 채혈한다. 혈액에서 망상적혈구의 백분율(%)은 아크리딘 오렌지 또는 티아졸 오렌지와 같은 핵산 염료로 염색한 후 FACS 분석(retic-cout program)에 의해 결정한다. 망상 적혈구는 양성적으로 염색된 망상적혈구분획을 계수하여 측정한다. 추가적으로 헤마토크릿은 수동으로 결정된다.
변형된 EPO 폴리펩티드의 효능을 평가하기 위해 사용되는 다른 예시적인 생체내 기능성 분석법은 적혈구증가성 전-저산소성(polycythemic exhypoxic) 마우스 생물학적 정량법이 있다. 이 분석법을 위해 마우스에 며칠간 교차 조건화 주기를 가한다. 이 주기에서 마우스는 저기압 조건과 대기압 조건 간의 변화를 가진다. 그 후 마우스는 시험 시료의 투여에 앞서 2-3일간 대기압 조건에서 유지된다. 양성 대조군 마우스의 경우에서, 변형된 EPO 폴리펩티드 시료 또는 EPO 표준물이 상기 조건화된 마우스에 피하투여된다. 방사능표지된 철(59Fe)을 2일 후 투여하고 방사능표지된 철 투여 2일 후 채혈한다. 이어서, 표준적인 방법으로 각 혈액시료의 헤마토크리트와 방사능 수치를 측정한다. 활성 시험 펩티드를 투여한 마우스의 혈액 시료는 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 천연 EPO 의 비투여 마우스보다 더 높은 방사능수치(적혈구 헤모글로빈에 59Fe 결합으로 유발)를 나타낼 것이다.
변형된 EPO 폴리펩티드가 또한 동물 모델을 사용하여 면역저항성을 위해 시험될 수 있다. 영장류 및 설치류 모델을 포함한 면역저항성 동물 모델은 EPO 폴리펩티드 투여 또는 유전자 운반 벡터의 투입을 통해 EPO의 장기간 발현을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 투여 후 각 시간별로 채취된 혈액 시료는 항 EPO 항체의 생산을 위해 평가될 수 있다.
3. 임상 분석
임상용 EPO의 활성을 평가하기 위하여 많은 분석법을 이용할 수 있다. 이러한 분석법에는 적혈구세포 생성 활성, 조직 보호 활성, 단백질 안정성 및 생체내 반감기의 평가 및 표현형 분석이 포함될 수 있다. 표현형 분석 및EPO 처리의 치료효과를 측정하는 분석은 혈중 EPO 수준(예: 체질량지수(BMI)를 고려한 투여전 및 초회 투여, 마지막 투여후 즉시, 및 투여간 시점을 포함하는 투여 후 시점의 혈청 EPO의 측정), 비변형된 및/또는 야생형 EPO 또는 플라스보로 처리된 대상체와 비교하여 시간에 따른 증상의 완화를 포함하는 EPO 처리에 대한의 표현형 반응을 포함한다. EPO 활성을 평가하는 임상 실험의 예는, 예를 들어 Marsden(2006) Ann Clin Biochem 43: 97-104; Gascon (2005) Eur J Cancer 41(17): 2601-12; ANNA J. (1989) Aug;16(5):344-8 에서 찾을 수 있다. 환자는 일상적 또는 반복된 투여의 일정기간 동안 약물 투여에 따르는 급성 증상, 예컨대, 출혈, 외상 또는 외과적 경과가 정기적으로 모니터링되었다.
H. 제형/포장/투여
본원에 기술된 방법으로 제조된 최적화된 EPO 변이체 또는 다른 치료용 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은, EPO 변이체(변형된) 폴리펩티드, 변형된 EPO 융합 단백질 또는 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제와 폴리펩티드의 선택된 양을 혼합하여 의해 통상적 방법으로 제형화 될 수 있다. 운반체 또는 부형제의 선택은 다수 매개 변수에게 따른 전문적 투여 기술에 의한다. 예를 들어 이는 치료될 질병 및 투여모드 (예컨대, 전신(예, 정맥내 또는 복강내), 경구, 비강, 경폐, 경피, 비경구, 직장, 국소, 외용 또는 기타 모드)를 포함한다. EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드의 조성물은 치료되는 질병 또는 상태에 유용한 하나 이상의 치료제와 같은 부가적인 성분을 첨가하여 제형화할 수 있다. 상기 제공된 조성물에 사용되는 치료제의 조합은 본원에 다른 곳에 기재되어 있다.
본원에서 제공된 약제학적 조성물은 단회 용량 (직접) 투여 또는 희석 또는 다른 변형을 위해 제형화 될 수 있다. 그 제형 내 화합물의 농도는 투여시 의도한 치료에 효과적인 양의 전달을 위하여 효과적이다. 전형적으로, 상기 조성물은 단회 용량 투여를 위해 제형화된다. 조성물을 제형화하기 위하여, 치료된 상태를 경감하거나 개선하기 위한 효과적인 농도로 선택된 비히클(vehicle) 내 하나의 화합물 또는 그것의 혼합물의 무게 분획을 용해시키거나, 현탁하거나, 분산시키거나, 그렇지 않으면 혼합한다. 본원에서 제공된 화합물의 투여를 위해 적당한 약제학적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방법에 적합한 당업자에게 공지된 임의의 담체를 포함한다.
1. 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 투여
상기 폴리펩티드는 조성물 내 하나의 약제학적으로 활성인 성분으로서 제형화 될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들면 항체 같은 표적화 시약에 콘쥬게이션함으로써 전달을 위해 표적화 될 수 있다. 또한, 조직-표적화된 리포솜을 포함한 리포솜 현탁액은 약제학적으로 허용되는 담체로 적절할 수 있다. 이는 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어 리포솜 제형은 예를 들면 미국 특허 번호 제 6,645,522호 또는 제6,726,924호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 리포솜 운반은 또한 콜라겐 젤과 피브로넥틴으로 변형된 리포솜 (예. Weiner 등 (1985) J Pharm Sci. 74(9):922-5) 같은 약제학적 기재를 포함한 서방형 제제를 포함할 수 있다.
활성 화합물은 치료 대상에 바람직하지않은 부작용 없이 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용된 담체 내에 포함된다. 상기 치료적으로 유효한 농도는 상기 화합물을 본원에 제공된 분석법 같은 알려진 시험관 내 및 생체 내 시스템에서 실험을 통해 실험적으로 결정될 수 있다. 활성 화합물은 임의의 적절한 경로, 예를 들어 경구, 비강, 경폐, 비경국, 정맥, 진피내, 피하 또는 외용으로, 액상, 반액상, 고형으로 투여될 수 있으며, 각 투여 경로에 적절한 방식으로 제형화할 수 있다. 한 특별한 구현예에서, EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드는 경구로 투여된다.
변형된 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드 및 생리학적으로 허용되는 염 및 용매화물(solvate)은 흡입 (구강 또는 비강 내), 경구, 경피, 경폐, 비경구 또는 직장 투여를 위하여 제형화할 수 있다. 흡입 투여를 위해 변형된 EPO 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 압축된 팩 또는 적당한 추진체, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로 로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소또는 다른 적당한 기체를 포함하는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시의 형태로 전달될 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양을 운반하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 젤라틴 등의 약포는 유당 또는 전분 같은 적합한 가루 기제와 치료용 화합물의 가루믹스를 포함하여 제형화될 수 있다.
폐로의 경폐 투여를 위해, 변형된 EPO 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 적당한 추진체를 사용하는 분무기, 터보분무기 또는 마이크로프로세서-조절 측정 투여량의 경구 흡입기로부터의 에어로졸 스프레이 제시(arerosol spray presentation)의 형태로 체내에 운반될 수 있다. 일반적으로, 입자 크기는 0.5에서 5 마이크론의 범위로 작다. 경폐 투여를 위해 제형화된 약제학적 조성물의 경우, 세제 계면활성 성분은 전형적으로 사용되지 않는다. 경폐 약물 전달은 전신 투여의 유망한 비-침습성 방법이다. 폐는 약물 전달을 위한 매력적인 경로를 제시하며, 이는 흡수를 위한 표면적이 넓고, 폐포 상피는 얇으며, 혈관이 광범위하게 분포하고, 간 초회 대사가 없으며, 상대적으로 대사 활성이 낮은데 기인한다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 결합제(예를 들면 전젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드로옥시프로필 메틸셀룰로오스), 첨가제(예를 들어 유당, 미세결정 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로겐포스페이트), 활택제(예를 들어 마그네슘 스테아르산염, 탈크 또는 실리카), 붕해제(예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리코레이트), 침윤제(예, 나트륨 라우릴 황산염) 등의 약제학적으로 허용되는 부형제를 이용하여 통상적 방법으로 제조된 정제, 환약, 현탁액 또는 캡슐제의 형태를 가질 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 예를 들어, 물약, 시럽, 또는 혼탁액의 형태를 취하거나 사용전 물 또는 다른 적당한 비히클과의 구성을 위해 건조된 제품으로서 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 약제학적으로 허용되는 식염수 또는 현탁제(예, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(예, 레시틴 또는 아카시아), 비수용성 부형제(예, 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 증류된 식물성 기름), 보존제(메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빅산) 등의 약학적으로 허용되는 첨가제를 가지고 통상적 방법으로 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 적절한 완충염, 향료, 색소, 감미료가 포함될 수 있다.
경구 투여를 위한 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 제공하기 위해 적절히 제형화될 수 있다. 구강정(buccal) 투여를 위하여, 조성물은 통상적 방법으로 제형화된 로젠제(lozenges)나 정제의 형태를 가질 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 폴리펩티드는 위장관 내에서 단백질분해에 대한 저항성 및 반감기 증가를 보여준다. 따라서, 경구 투여를 위한 제제는 Bowman-Birk 억제제, 접합된 Bowman-Birk 억제제, 아프로티닌 및 카모스테트 같은 단백질분해 효소 억제제의 사용이 없이 적절하게 제형화될 수 있다. 하지만, 상기 화합물은 상기 제공된 조성물 내 사용으로부터 배제되지 않는다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 이런 지속형 제형은 이식 (예, 피하 또는 근육 내 투여) 또는 근육내 주사를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면 치료용 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어 사용가능한 오일 내에 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체, 난용성 염을 사용하여 제형화될 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료영 폴리펩티드는 주사 (예, 볼러스 주사, 또는 연속적 주입)에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 첨가된 방부제와 함께 단위 복용량 형태(예, 앰플 내 또는 다-복용량 용기내) 내에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 현탁액, 물약, 유성 또는 수성의 비히클 내 유화제의 형태를 가질 수 있으며, 안정제, 분산제 및/또는 현탁제 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 대안적으로 활성 성분은 사용전 적합한 비히클 (예컨대, 증류된 발열원 없는 물)과의 구성을 위한 동결건조-분말의 형태일 수 있다.
상기 활성 제제는 피부(경피), 및 눈 같은 점막에 외용 적용과 같은 국소, 외용 적용을 위하여 겔, 크림, 및 로오숀의 형태로, 눈에 적용을 위하거나 수조내, 또는 척수강내 적용을 위하여 제형화될 수 있다. 이런 물약은, 특별히 점안 사용을 위해 0.01%-10% 의 등장액 및 적당한 염으로 약 pH 5-7 를 가지도록 제형화될 수 있다. 이 화합물은 외용 적용을 위해 제형화될 수 있다(미국 특허 제4,044,126호, 제 4,414,209호 및 제4,364,923호, 염증 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드의 전달을 위한 에어로졸을기술하며, 각각은 전체로 참고로서 편입됨).
상기 약물 조성물에 포함되는 활성 화합물의 농도는 상기 활성 화합물의 흡수, 비활성화, 및 배설률, 그리고 투약 일정 및 투여량 뿐만 아니라 당업자에게 알려져 있는 다른 요인들에 따라 달라진다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 투여량은 비변형된 EPO또는 다른 비변형된 치료용 폴리펩티드의 투여를 위해 당업계에 널리 알려진 투여량, 및 비변형된 및/또는 천연 EPO 또는 다른 비변형된 및/또는 천연 치료용 폴리펩티드와 비교한 상기 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 특성 및 활성 (예, 안정성 및 활성)의 비교를 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다.
원한다면, 상기 조성물은 활성 성분을 포함한 하나 이상의 단위 용량 형태를 포함할 수 있는 포장, 키트, 또는 분배 장치 내에 제공될 수 있다. 예를 들어, 포장은 금속 또는 블리스터팩 같은 플라스틱 호일이 포함된다. 팩이나 분배 장치는 투여를 위한 지침서를 포함할 수 있다. 활성 성분을 포함한 조성물은 포장 재료, 본원에 제공된 제제 및 제제가 제공되는 질병을 지시하는 라벨을 포함한 물품으로서 포장될 수 있다.
본원에서 제공된 변형한 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형한 치료 폴리펩티드의 일부는 경구 운반를 위해 수정 가능한 상태로 안정성을 증가시키기 위해 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형한 치료용 폴리펩티드이다. 경구 전달은 입 및/또는 위장관으로 투여를 포함한다. 이러한 변형은 침에 노출, 위장관 내 단백질 분해 효소에 노출, 위의 낮은 pH 및/또는 장 내 pH 같은 특정 pH 조건에 노출과 같은 하나 이상의 조건 하 단백질- 반감기 증가를 포함할 수 있다. 변형에는 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 아미노펩타다아제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 알파 키모트립신, 카르복실펩타다아제, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 및 트립신, 루미날 펩신, 마이크로빌라 엔도펩티다아제, 디펩티딜 펩티다아제, 엔테로펩티다아제, 가수분해효소, NS3, 엘라스타아제, factor Xa, 그랜자임 B, 트롬빈, 트립신, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA 와 같은 하나 이상의 단백질 분해 효소에 저항성을 포함할 수 있다. 또한 변형은 내열성, 혼합 및 통기(예, 씹기)에 따른 저항성과 잠재적 변성 또는 구조-변경 조건에 대한 종합적 안정성을 높이는 것을 포함한다.
경구 전달 적합성을 위한 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 치료용 폴리펩티드는 본원에 기술한 임의의 방법을 사용해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 논리적인 진화를 위한 2D- 및 3D-스캐닝 돌연변이 유발법 (함께-계류중인 미국 특허 공개 제2005-0202438 A1호, 및 미국 공개 제2004-0132977-A1호 및 공개된 국제 출원 WO 2004/022593 및 WO 2004/022747 참고)이 변형된 EPO 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 경구 전달 적합성을 위한 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 변형은 단백질 구조의 전체적인 안정성 증가 및/또는 단백질분해 소화 위치의 제거를 포함될 수 있다. 이런 EPO 변이체 및 다른 변형된 치료용 변이체들은 하나 이상의 경구 전달 조건에서 비변형된 및/또는 야생형 천연 EPO 또는 다른 비변형된 및/또는 야생형 천연 치료용 폴리펩티드에 비해 단백질의 반감기의 증가를 보인다. 예를 들어 변형된 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 구강, 인후(예, 점막 통과), 위장관 또는 전신 순환에 있어서 증가된 단백질의 반감기 및 생체이용률을 가진다.
한 구현예에서, 본원에 제공된 변형된EPO 폴리펩티드의 반감기는 하나 이상의 경구 전달 조건에 노출된 천연 EPO의 반감기에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% , 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 양으로 증가한다. 다른 구현예에서, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 반감기는 하나 이상의 경구 전달 조건에 노출된 천연 EPO의 반감기에 비해 적어도 6배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배 또는 그 이상의 양으로 증가한다.
다른 예에서, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 폴리펩티드의 반감기는 펩신, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 아미노펩타다아제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 알파 키모트립신, 카르복실펩타다아제, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 트립신, 루미날 펩신, 마이크로빌라 엔도펩티다아제, 디펩티딜 펩티다아제, 엔테로펩티다아제, 가수분해효소, NS3, 엘라스타아제, factor Xa, 그랜자임 B, 트롬빈, 트립신, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA 와 같은 하나 이상의 단백질 분해 효소의 존재 하에 증가된 반감기에 의해 평가된다. 변형된 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 하나 이상의 단백질 분해 효소와 혼합하고 이어서 적당한 반응 시간 후에 단백질 구조 및/또는 활성을 측정할 수 있다. 또한, 반감기의 평가는 대상의 체온과 같은 온도의 증가에 노출 위액 및/또는 유사 위액에 노출 특정 pH 조건에 노출, 및/또는 두가지 이상의 조건의 조합을 포함하여 평가된다. 하나 이상의 조건에 노출에 이어, 단백질 구조의 평가 및/또는 활성은 적합한 대조군(즉, 비변형된 및/또는 야생형의 EPO 폴리펩티드)와 비교하여 변형된 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 반감기를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 정제, 캡슐, 액제 또는 경구 투여에 적합한 다른 비히클과 같은 경구 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 경구 전달을 위한 변형된 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 포함한 약제학적 조성물의 제조는 본원에 기술되고 널리 알려져 있는 경구 제제를 가지고변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 제형화하는 것을 포함할 수 있다. 상기 제형화된 조성물은 단백질분해효소 억제제 및/또는 단백질분해효소, pH, 및 경구 전달의 다른 조건에 노출시 비변형된 및 야생형 치료용 폴리펩티드의 안정화에 필요한 다른 성분들의 첨가를 필요로 하지 않는다. 예를 들어 상기 조성물은 액티노닌 또는 에피액티노닌 및 그것의 유도체 Bowman-Birk 억제제 및 그것의 콘쥬게이트 아프로티닌및 카모스테트와 같은 화합물의 부재시 안정성을 나타낸다. 그러나 상기 제공된 조성물에서 이러한 화합물의 사용을 배제하지 않는다.
게다가 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 증가된 단백질의 안정성을 나타내기 때문에, 이들의 비변형된 대응물 보다 약제학적 조성물의 투여에 있어서 더 융통성이 있다. 전형적으로, 경구로 섭취된 폴리펩티드는 아침 식사 전(즉, 소화효소가 활성화되기 전)에 복용된다. 본원에서 제공된 변형된 폴리펩티드는 소화효소에 대해 단백질 분해 저항성을 가지며, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드가 포함된 약제학적 조성물은 일과 중 다른 시기, 및 소화효소가 존재하고 활동하는 조건에서도 투여가 가능하다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 결합제(예를 들면 전젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드로옥시프로필 메틸셀룰로오스), 충진제(예를 들어 유당, 미세결정 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로겐포스페이트), 활택제(예를 들어 마그네슘 스테아르산염, 탈크 또는 실리카), 붕해제(예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리코레이트), 침윤제(나트륨 라우릴 황산염)과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제를 가지고 통상적 방법으로 제조된 정제나 캡슐의 형태를 가질 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 물약, 시럽, 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 사용 전 물 또는 다른 적당한 비히클과 함께 구성되기 위한 건조된 제품으로서 제공될 수 있다.
상기 액체 제제는 현탁제(예, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(예, 레시틴 또는 아카시아), 비수용성 부형제(예, 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 증류된 식물성 기름) 및 보존제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빅산) 등의 약제학적으로 허용되는 첨가제를 가지고 통상적 방법으로 제조될 수 있다. 상기 제제는 적절한 완충염, 향료, 색소, 및/또는 감미료가 포함될 수 있다.
경구 투여를 위한 제제는 제어되거나, 지속된 방출, 또는는 활성 화합물의 위장 통과 후 또는 소장관 내 방출을 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위하여 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 액제, 로젠제(lozenges), 및 경구 투여에 적합한 다른 형태를 가질 수 있다. 경구 투여에 적합한 제형은 로젠제 및 구강, 인후, 및/또는 위장관의 점막으로 약제학적 조성물을 전달하는 제형을 포함한다. 로젠제는 무수 맥아당 및 마그네슘 스테아르산염과 같은 부형제를 포함한 적절한 성분으로 제형화될 수 있다. 언급한 바와 같이, 본원에 기재된 변형된 폴리펩티드는 혈액이나 소장 내의 단백질 분해 효소에 저항성을 보이고, 다른 보호 화합물 또는 추가적인 단백질분해 효소 억제제 없이 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위한 제제는 단백질분해에 저항성을 가지는 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 포함하여 단백질분해효소 저항성을 수여하거나, 특정 pH 조건과 같은 다른 조건에서 안정성을 부여하는 하나 이상의 추가적 성분을 가지고 제형화될 수 있다.
2. 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 투여 (유전자 치료)
변형된 EPO폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화한 핵산 분자 및 유전자 치료를 위해 적합한 이들이 암호화된 발현 백터의 조성물이 또한 제공된다. 단백질을 수송하는 것보다 오히려, 핵산은 전신으로, 또는 다른 경로에 의하여 생체 내에서(in vivo) 또는, 임프구를 포함한, 세포의 적출, 그 안으로 핵산을 도입, 그리고 숙주나 적절한 수여체에 재도입에 의하는 것과 같은 생체 밖에서(ex vivo) 투여될 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 핵산분자의 발현에 의해 세포 및 조직 내로 전달될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 생체 밖 기술 및 직접직인 생체 내 발현을 포함한, 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드가 암호화되어 있는 핵산으로서 투여될 수 있다. 발현을 위해 골격근 조직 같은 조직 내로 나출형 DNA를 직접 주입 (Rizzuto 등 (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 6417-6422)을 포함한 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 핵산을 세포 및 조직 내로 전달할 수 있다. 분리된 핵산 서열은 추가적 조작을 위해 벡터 내에 통합될 수 있다. 본원에 사용되는 것과 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 발현 또는 복제를 위한 세포 내로 외래의 DNA를 도입하는데 사용되는 별개의 요소를 말한다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 용이하다.
암호화된 핵산 분자의 발현에 의한 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 투여 방법은 재조합 벡터의 투여법을 포함한다. 벡터는 예를 들면 복제의 기원의 포함에 의해, 에피솜에 남도록 설계되거나, 세포 내 염색체 안에 통합되도록 설계될 수 있다. 또한, 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 비-바이러스성 벡터를 이용한 생체 외 유전자 발현 치료법에 사용될 수 있다. 예를 들어 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하고 있는 핵산을 제어 서열에 조작적으로 연결되거나, 유전자의 위치 내에서 제어 서열과 조작적으로 연결되어 위치하도록 유전자의 위치 내에 통합시켜, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 발현하도록 세포를 조작할 수 있다. 이어서, 상기 세포는 대상, 예를 들어 치료를 요하는 환자에게 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 아데노바이러스, 아데노바이러스-관련바이러스(AAV), 폭스파이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 그리고 다른 유전자 치료를 위한 것을 포함한 바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 에피솜(episomal)에 남을 수 있거나, 치료 대상의 염색체 안으로 통합될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 치료를 요하는 환자에게 투여된 바이러스에 의해 발현 될 수 있다. 유전자 치료에 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노바이러스관련 바이러스, 렌티바이러스, 우두바이러스 및 위에 언급된 다른 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 기술은 당업계에 널리 알려져 있으며, 아데노바이러스 제조 및 투여법 또한 잘 알려져 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 항원형은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)에서 입수 가능하다. 아데노바이러스가 생체 외에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 세포는 치료를 요하는 환자에게서 분리되어, 변형된 EPO 폴리펩티드-발현 아데노바이러스 벡터로 형질도입된다. 적절한 배양기간 후, 상기 형질도입된 세포는 대상에게 국소적, 및/또는 전신으로 투여된다. 대안적으로, 변형된 치료용 폴리펩티드-발현 아데노바이러스 소립자를 분리하여, 대상의 상태 또는 질병의 치료, 예방, 또는 개선을 위해 치료적으로 효과적인 양의 전달을 위해 약제학적으로 허용되는 담체 내에 제형화될 수 있다. 전형적으로, 아데노바이러스 소립자는 환자 무게 킬로그램 당 1개의 입자에서 1014개의 입자, 일반적으로 환자 무게 킬로그램 당 106 또는 108개에서 1012 개의 입자의 범위의 복용량으로 전달된다. 일부 상황에서, 핵산 원료에 세포를 표적으로 하는 시약(예를 들어, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적 항체, 또는 표적 세포 상 수용체에 대한 리간드)을 제공하는 것이 바람직하다. EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 특정 세포 종류에 전달되기 위해 표적화 될 수 있다. 예를 들어, EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드가 암호화되어 있는 아데노바이러스 벡터는 분화되지 않는 세포, 예를 들어 간 또는 근육 세포 내 안정한 발현을 위해 사용될 수 있다(Tipathy 등 (1994) Proc Natl Acad Sci U S A. 91(24): 11557-11561; Svensson 등 (1997) Hum Gene Ther 8: 1797; Setoguchi 등 (1994) Blood 84(9): 2946-2953; 미국 특허 제 6,613,319호). 또 다른 예에서, 암호화된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터는 순차적 전달을 위한 분리된 세포 내로 형질도입될 수 있다. EPO 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 발현 및 전달을 위한 부가적인 세포 종류는 당업계에 알려져 있고, 췌장세포, 폐의 상피세포 및 중피세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다(Fenjves 등 (2004) Transplantation 77(1): 13-8; Davis 등 (2004) Mol Ther . 10(3): 500-6).
핵산 분자는 인공적인 염색체 및 다른 비-바이러스성 벡터내에 도입될 수 있다. ACES (Lindenbaum 등 Nucleic Acids Res. 2004 Dec 7;32(21):e172 참조) 같은 인공 염색체는 동종형(isoform)을 암호화하고 발현하도록 조작될 수 있다. 간략하게, 포유동물의 인공 염색체(MACs)는 자가 복제하고, 비-통합 형태로 세포 내로 많은 양의 유전적 정를 도입시키는 수단을 제공한다. MACs 중에 독특한 포유동물 위성 DNA-기초 염색체 발현(Artificial Chromosome Expression: ACE)은 다른 종의 세포주에서 새로이 재생산가능하게 생성되고, 숙주 세포의 염색체로부터 쉽게 정제될 수 있다. 정제된 포유동물 ACE는 이어서 다양한 수여자 세포주 내로 재도입되며, 여기서 이들은 ACE 계를 사용하는 선택적 압력 부재 하 연장된 기간 동안 안정하게 유지된다. 이 접근을 사용하여, 하나 또는 두 개의 유전자 표적의 특정한 로딩이 LMTK(-)와 CHO 세포 내에서 달성된다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 도입시키는 다른 방법은 효모 내 2-단계 유전자 치환 기술이며, 이는 효모 인공 염색체 (YAC) 내 클로닝된 완전한 아데노바이러스 게놈 (Ad2; Ketner 등 (1994) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 91: 6186-6190), 및 YAC 클론 내 특정 지역을 표적화 하기 위한 아데노바이러스 서열, 관심있는 유전자를 위한 발현 카세트, 및 양성 및 음성의 선택 마커를 포함하는 플라스미드를 가지고 시작된다. YAC는 더 큰 유전자와 결합을 허용하기 때문에 특히 관심있다. 이 접근은 포유동물 세포 또는 전체 동물로의 유전자 전달을 위하여 상기 기재된 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 오느 것을 암호화하는 핵산을 운반하는 아데노바이러스-기반 벡터의 구축을 위해 사용될 수 있다.
핵산은 리포솜과 같은 비히클 내로 캡슐화되거나,세균세포, 특히 약해진 세균과 같은 세포 내로 도입되거나, 바이러스성 벡터에 도입될 수 있다. 예를 들어, 리포좀을 사용시, 식세포 작용이 연계된 세포 표면 막 단백질과 결합한 단백질은 예를 들어, 특정 세포 종류에 향성(向性)인 캡시드 단백질 또는 그것의 단편, 순환에서 내부화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치화를 표적화하고, 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적화하거나/하고 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
생체 외 및 생체 내 방법을 위해, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자는 적당한 공여자 또는 치료될 환자로부터 얻은 세포에 도입된다. 핵산이 치료 목적으로 도입된 세포는 예를 들어 치료될 질병이나 상태에 적합한 임의의 원하는 이용가능한 세포 종류를 포함하며, 이는 상피세포, 내피세포, 각질형성세포, 섬유아세포, 근육세포, 간세포 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포, 과립구 등과 같은 혈액세포 다양한 줄기 세포, 또는 전구세포, 특히 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 예컨대, 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아의 간 및 이들의 다른 근원들에서 얻어지는 줄기세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
생체 외 치료를 위해, 치료되는 대상, 또는 세포 치료되는 대상에 적합한 기부자로부터 얻어진 세포를 적출하고, 핵산을 분리된 세포 내에 도입하고, 변형된 세포를 상기 대상에 투여한다. 치료는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내 캡슐화되는 것과 같은 직접적인 투여를 포함한다(미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조, 각각 전체가 참조로서 본워에 첨부됨). 시험관 내 에서 핵산을 포유동물 세포로 이전하기 위해 적절한 기술은 리포솜 및 양이온성 지질(예, DOTMA, DOPE 그리고 DC-Chol)의 사용, 전기천공법 미세주사, 세포융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘침전법을 포함한다. DNA 전달 방법은 생체 내에서 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 발현을 위해 사용할 수 있다. 이 방법은 전기천공법, 초음파법, 및 인산칼슘 수송을 이용하는 것과 같은 국소적 및 전신적 전달을 포함하는, 핵산의 리포솜 수송 및 나출성 DNA 전달을 포함한다. 다른 기술들은 미세주사, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 운반, 미세세포- 매개 유전자 운반 및 스페로플라스트 융합법을 포함한다.
변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 생체 내 발현은 부가적인 분자들의 발현에 연계될 수 있다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 발현은 조작된 바이러스 내 또는 세포독성 바이러스에서 발현되는 것과 같은 세포독성 산물의 발현에 연계될 수 있다. 이러한 바이러스는 치료적 효과를 위한 표적인 특정 세포 유형에 표적화 될 수 있다. 상기 발현된 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 바이러스의 세포독성을 강화시킬 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 생체 내 발현은 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터와 같은 특정 조절 서열과 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 조작적으로 결합하는 것을 포함할 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 표적세포의 종류 및/또는 조직에 특이적으로 감염하고/하거나 복제하는 벡터로부터 발현될 수 있다. 유도성 프로모터는 변형된 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 조절 발현계는 골격근 내에서 재조합 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드 발현을 조절하기 위해 사용되는 미페프리스톤, 독시사이클린 및 테트라사이클린 유전자 발현계를 포함하나, 이에 한정된 것은 아니다(Serguera 등 (1999) Human Gene Therapy 10(3): 375-383; Bohl 등 (1998) Blood 2(5): 1512-1517 Rizutto 등 (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(11): 6417-6422; Rendahl 등 (2002) Human Gene Therapy 13(2): 335-342).
나출형 핵산으로서 또는 벡터 안에 있는 핵산 분자, 인공 염색체, 리포솜 및 다른 비히클은 대상에게 전신 투여, 외용, 국소 및 다른 투여 경로로 투여될 수 있다. 생체 내 및 전신의 경우, 핵산분자 또는 핵산 분자를 포함하는 비히클이 세포로 표적화 될 수 있다.
투여는 또한 조직 또는 세포를 전형적으로 표적화하는 벡터 또는 세포를 투여하는 것과 같이 직접적일 수 있다. 예를 들어, 암세포 및 분화중인 세포는 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 생체 내 발현을 위한 세포로 표적화될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 생체 내 발현을 위해 사용되는 세포는 또한 환자 자가 세포를 포함한다. 이 세포를 환자로부터 적출하여, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산을 도입하고, 예컨대, 주사 또는 생착시킴으로써 환자에게 투여된다.
본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 및 발현된 벡터는 임의의 적절한 방법으로 만들어질 수 있다. 서열번호 3-201 중 어느 하나에 제시된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 서열 또는 이의 단편을 포함한, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 핵산과 벡터가 추가로 제공된다. 상기한 바와 같은 핵산 분자를 포함한 핵산 벡터와 이 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
I. 치료학적 용도
본원에서 제공된 변형EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드 그리고 핵산 분자는 비변형된 EPO 또는 비변형된 치료용 폴리펩티드가 사용되는 어떠한 조건의 치료에도 사용될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 단독 또는 다른 약제와 조합하여, 치료 효과를 가진다. 본원에서 제공된 변형된 폴리펩티드는 치료효과를 유지하기 위해 디자인되었으나, 변형된 특성, 특히 안정성이 증가됨을 보인다. 예를 들어, 이런 변형된 특성은 폴리펩티드 치료효과를향상시키거나, 경구 투여 같은 추가적인 경로를 통한 투여를 가능케 한다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 폴리펩티드 그리고 암호화된 핵산 분자는 비변형된 EPO 또는 비변형된 치료용 단백질이 사용되는 어떠한 조건의 치료에도 사용될 수 있다. 이 장에서는 투여 방법과 전형적인 사용법을 제공한다. 여기 설명된 치료법은 예시로써, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 적용에 제한되지 않는다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 EPO 또는 치료용 폴리펩티드가 사용되는 진단법 뿐만 아니라 다양한 치료법에 사용될 수 있다. 이 방법은 아래 표에 기술한 생리학적이고 의학적 상태의 치료에 사용되는 치료법을 포함하며 이에 한정된 것은 아니다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 유사한 천연형의 치료용 폴리펩티드와 비교하여, 낮은 투여용량에서 동일한 효능, 약효 더 연장, 투여와 치료의 면에서 기타 개선 등, 생체 내 활성 및 치료 효과가 개선됨을 보인다.
본원에 기술된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 단백질 안정성 증가 및 반감기를 개선을 보여준다. 그러므로, 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 치료용 폴리펩티드는 더 오래 지속되고, 안정적인 치료를 위해 사용될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 사용으로 인한 치료 효과 개선의 예는 저용량 투여 가능, 투여 빈도수 감소, 부작용 감소, 치료효과 증가 등이며, 이는 상기 예로 한정되는 것은 아니다.
특히, 변형된 EPO 폴리펩티드는 치료를 위해 사용되는 EPO 의 치료법에 이용하기 위한 것이다. 이 방법은 신부전, 후천성면역결핍증, 악성종양, 만성 염증에 수반되는 빈혈증과 같은 빈혈증 등의 질병, 질환의 치료 방법을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형된 EPO 폴리펩티드로 치료하는 추가적인 빈혈의 예는 지중해성 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, 미숙아 빈혈, 백금 화학요법(cis-platinium chemotherapy)에 수반되는 빈혈, 및 집중적인 방사선 치료, 및/또는 화학치료와 골수 이식으로 생긴 빈혈을 포함한다.
본원에서 제공된 변형된EPO 폴리펩티드는 세포 생존, 증식, 분화를 조절하는데 유용하다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드와 변형된 EPO 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 적혈구를 만드는 전구체의 증식을 촉진시키는데, 유용하고, 생체 내, 생체 외, 원위치 (in situ) 내 또는 시험관 내 에서 사용 될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3-201 중에서 선택된 하나 이상의 변형된 인간 EPO 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 개인으로부터 적혈구를 만드는 전구 세포를 얻은 후, 체외에서 세포 증식을 시키고 다시 환자에게 투여 할 수 있다. 본원에서 제공된 적혈구 생성 활성(erythropoietic activity)을 보이지 않는 변형된 EPO 폴리펩티드는 조직보호 활성과 같은 EPO 관련 질환 치료에 유용한 EPO 활성을 여전히 가질 수 있거나, 본래의 에리스로포이에틴의 길항제(예를 들어, 다혈구 혈증 또는 에리스로포이에틴의 과생성을 포함한 상태의 치료), 또는 진단법에서 사용될 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 이용한 질병 그리고 상태의 치료는 본원에 기술된 적당한 제형을 사용하여, 주사, 경폐, 경구 그리고 경피 투여를 포함한 적합한 어떤 투여 경로로도 효과적일 수 있으며, 상기 예에 한정된 것은 아니다. 필요하다면, 특정 투여량, 투여기간이나 치료 절차가 경험적으로 결정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 또는 본래의EPO 폴리펩티드 또는 다른 치료용 폴리펩티드의 전형적인 용량은 적정 용량을 결정하는데 시작점으로 사용될 수 있다. 체내에서 더 안정적이고, 생체 내에서 증가된 반감기를 가지는 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 경감된 투여량과 투여 빈도에서 효과적일 수 있다. 예를 들어, 혈장 안정성 같이 개선된 특성 때문에, 비변형된 EPO나 비변형된 치료용 폴리펩티드에 비해 투여량이 감소할 수 있다. 비변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 비변형된 치료용 폴리펩티드의 투여 용량은 유사한 변형된 폴리펩티드의 투여량 결정를 위한 모범사례로 사용될 수 있다. 비변형된 폴리펩티드와 비교된 변형된 폴리펩티드의 반감기 및 활성의 수치 같은 요소들은 이런 결정을 내리는데 사용될 수 있다. 특정 투여용량과 방법은 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드 중 어떤 것이라도, 치료 효능을 가지는 특정의 투여용량은 당업계에 잘 알려진 다양한 기술을 사용하여 초기에 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양법에서, 세포 배양에서 결정된 IC50 를 포함한 순환 농도 범위를 얻어서 실험모델에서 용량이 계산될 수 있다. 인간에 투여하기 위한 적정 용량 범위는 세포 배양 실험과 동물 실험을 통해 얻어진 자료를 사용하여 결정될 수 있다.
용량 수치와 투여계획은 알려진 용량과 투여계획에 기초하고, 필요하다면 변형된 폴리펩티드의 성질의 변화를 기초로 한 추론 및/또는 다양한 요소들에 기초한 경험에 의해 결정될 수 있다. 이러한 요소들은 개인의 체중, 일반적 건강 상태, 연령, 복용된 특정 약물의 활성, 성별, 식사, 투여 시간, 배설률, 약물의 복합, 질병의 정도와 진행 정도, 그리고 질병과 치료 의사의 판단에 대한 환자의 성향 등을 포함한다. 용량을 결정하는 다른 요인으로 적혈구 수치 같은 생물학적 활성 또는 결과의 요구 수치를 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다. 활성성분인 폴리펩티드는 전형적으로 약제학적 담체와 결합할 수 있다.단일 용량제형 또는 다용량 제형을 생산하기 위해 담체와 결합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 주체와 특정 투여 방법에 따라 다양할 수 있다.
환자의 상태의 개선시, 필요에 따라 물질과 조성물의 유지 용량이 투여될 수 있으며, 투여량, 투여 형태, 투여 빈도, 또는 그것의 복합 투여는 수정될 수 있다. 어떤 경우에서, 대상체에게 질병 증상의 어떤 재발 또는 예정 용량에 기초하여 장기간 간헐적인 치료가 요구될 수 있다. 어떤 경우에는 출혈, 외상, 외과 수술 같은 급성 상황에 대한 대응시 추가적인 투여가 필요할 수 있다.
투여법을 위한 효과적이고 독성이 없는 용량의 선택은 당업계에서 일반적인 기술로 알려진 요인들에 기초하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 요인의 예는 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드의 특정 형태 생체이용률, 대사, 반감기(당업자에게서 제공된) 등과 같은 변형된 EPO 폴리펩티드의 약물동태학적 파라미터 치료되어야 할 질병 또는 상태 정상 개체에서 달성될 장점 환자의 체중 투여 방법, 투여 빈도 (예를 들어 만성, 급성, 간헐성) 병용 약물 그리고 투여된 약물의 효과에 영향을 미친다고 알려져 있는 요소를 포함한다. 그러므로 정확한 투여량은 의사의 판단과 특정 환자의 상황에 따라서 결정되어야 한다.
EPO 폴리펩티드의 투여를 위한 전형적인 투여량은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 투여량 결정에 기초자료로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 EPO 폴리펩티드는 빈혈 치료를 위한 적혈구 생성 활성을 가지며, 환자에게서 추천되는 적혈구 범위를 회복시키기 위해, 재조합 인간 EPO는 전형적으로 50-150 단위/kg 체중의 초기 투여량으로 일주일에 3번, 6-8 주 동안, 정맥 또는 피하 투여된다. 환자가 요구되는 적혈구 수치(예를 들어 30~36 % 범위의 양)에 도달한 후에, 철의 결핍이나 다른 수반된 질환이 없는 경우, EPO의 초기 투여에 의해 얻어진 정상 적혈구 수치를 유지하는데 적합한 빈도와 충분한 량을 투여하여, 적혈구 수치는 EPO의 유지용량에 의해 지속될 수 있다. 투여 요구량은 환자의 개인적인 필요에 따라서 다양해 질 수 있으며, 일반적으로 유지용량은 주당 약 3회로 투여된다(만약 좀더 높은 농도에서는 더 적은 빈도로 사용된다). 유효량은 약물 투여후에 혈청에서 대략 10,000, 15,000, 또는 20,000 mU/ml보다 큰 약물의 혈청 레벨을 달성하기에 충분하여야 한다. 이와 같은 혈청의 수준은 투여후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간에서 달성될 수 있다. 이와 같은 용량들은 필요한 만큼 반복될 수 있다. 예를 들어, 투여는 임상학적으로 필요한 만큼 매일 반복될 수도 있고 또는 적당한 간격으로 매 1주에서 12주까지, 그러나 바람직하게는 매 1주에서 3주로 반복적 일 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 단백질분해효소에 대한 저항성을 증가시켜서 혈청의 반감기를 증가시킬 수 있다. 그러므로 체내에서의 유효성 또한 증가된다. 그 결과, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 재조합 EPO 조성물의 빈도, 양과 비교하여 더 적은 빈도나 더 적은 양으로 투여될 수 있다.
이하는 EPO를 단독 또는 다른 물질과 병용하여 치료제로 이용하는 몇가지 예이다.
1. 빈혈증
EPO와 관련된 빈혈증과 같은 질병의 치료에 사용할 수 있는 정제된EPO 치료제 중에는 Epogen?, Procrit?, Eprex?, Erypo?, Epopen?, Epoxitin?, Globuren?, Epoade? and Espo?과 같은 제품을 포함하는 Epoietin α 동종형 Rec또는 mon? Ne 또는 ec 또는 mon?, Epogin?, Epoch?, Eritrogen?, Erantin? and Marogen? 같은 제품을 포함하는 Epoietin β 동종형 Epomax? and Hemax? 같은 Epoietin ω 동종형 Dynepo? 같은 제품들을 포함한 Epoietin δ 동종형 Aranesp?과 같은 제품들을 포함한 Darbepoietin α 동종형R-744 연속적인 에리스토포이에틴 수용체 활성 성분 (CERA) 및 합성 적혈구 생성 단백질(SEP)이 있다. 이와 같은 모든 제품은 본원에서 설명된 것 처럼 변형 및/또는 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드로 대체될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 적혈구 세포의 결핍과 관련된 상태의 치료를 포함한 빈혈증의 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 적혈구 생성을 촉진하고 적혈구 재생과 같은 예에도 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드에 의해 치료할 수 있는 전형적인 빈혈증은 신부전, 후천성면역결핍증, 악성종양 그리고 만성적인 염증에 의해서 야기되는 빈혈증을 포함한다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 이용한 부과적인 빈혈증의 예는 지중해빈혈과 겸상적혈구장애와 같은 이상혈색소종, 조숙성 빈혈, 철저장 장애, 시스형-백금 또는 방사능과 같은 화학치료제의 처리에 의해서 야기되는 빈혈증, 아플리틱(aplitic) 빈혈증, 리바비린과 같은 C형 감염에 치료를 위한 치료용 약물에 의한 빈혈증, 악성의 질병(예로써 고형암, 전이된 유방암, 백혈병, 림파종 또는 다발성 골수종을 포함하는 혈액 암의 모든 유형)과 연계된 빈혈증, 과도한 혈액 세포 파괴(용혈, 용혈성 빈혈, 적혈구사멸(eryptosis)), 과도한 혈액 손실 (적혈구 파괴 같은 급성손실 또는 적은-부피 손실과 같은 만성적 손실), 노화, 만성 신장 질환(CDK), 간염, 신장의 쇠약(failure), 후천성 면역 결핍증 환자에서의 지노부딘 치료요법(예를 들어 아지도티미딘(AZT) 처치), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 포낭의 섬유종, 당뇨병성 신장질환, 패혈증, 뇌의 저산소증/허혈, 류마티스성 질환, 골수이형성증후군, 울혈성심장기능상실(CHF), 고오셔 질환, Castleman 질환, 그리고 골수 이식과 집중적인 방사선 요법 및/또는 화학요법에 의한 빈혈증이 포함된다(참고 예 Little 등 (2006) Haematologica 91(8): 1076-83; Eisenstaedt 등 (2006) Blood Rev. 20(4): 213-26; Rodgers and Lessin (1989) Blood 73(8): 2228-9; Boogaerts 등 (2005) Oncology. 69 Suppl 2: 22-30; Regnier 등 (1989) ANNA J. (7): 512-3, Olsson 등 (2002) Acta Oncol. 41(6): 517-24; Ritz and Haxsen (2005) Eur J Clin Invest. 35 Suppl 3: 66-74, Nurko (2006) Cleveland Clin. J. Med. 73(3): 289-297; Koltwasser 등 (2001) J Rheumatol. 28(11): 2430-6; Kuehl and No ormohamed (1995) Ann Pharmacother. 29(7-8): 778-9; Singer 등 (2005) Ann N Y Acad Sci. 1054: 250-6). 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 협심증, 폐질환, 저혈압, 울혈성심장기능상실 또는 일과성 뇌허혈 발작과 관련된 빈혈증 치료에도 또한 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 과도한 혈액 손실의 위험성이 있는 비-심장의 또는 비-혈관의 수술과 같은 수술 이전, 수술 진행동안, 또는 수술이후에 같은 수술을 받는 환자의 치료에도 사용이 될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 철 또는 비타민 보조요법과 함께 철결핍 빈혈증과 엽산 결핍 빈혈증과 같은 영양분 결핍 빈혈증 치료에도 사용될 수 있다.
빈혈증 치료와 더하여 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 철 과다 장애(iron overload disorder)의 처치를 위한 치료법에 사용될 수 있다. 철과다장애를 가지는 환자는 적혈구 생산 증가를 위해 변형된 EPO 폴리펩티드가 투여되고, 그 후에 여분의 생산된 적혈구를 제거하기 위해 방혈(phlebotomize)된다(참조 예, 미국 특허 제 5,013,718호).
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 비정상적 지혈(hemostasis)의 치료법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드는 응고, 혈소판, 또는 혈관에 선천적으로 또는 획득된 장애를 가진 환자, 항응고제나 항혈소판제을 치료상으로 과량복용해야 하는 환자에게서 출혈을 치료, 조절 또는 예방할 때 사용될 수 있다(미국 특허 제 6,274,158호).
서열번호 3-201에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 매질을 포함하는 효과적인 양의 조성물을 대상 전체에게 투여하여 대상체의 대상체의 적혈구를 증가시키는 방법이 있다. 예를 들어 개인에서의 적혈구 수는 헤마토크릿(hematocrit)을 사용하여 측정된다. 또한, 서열번호 3-201에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 매질을 포함하는 효과적인 양의 조성물을 대상 전체에게 투여하여 대상체의 대상체의 적혈구를 증가시키는 방법에서, 상기 대상체는 빈혈인 방법을 제공한다. 예를 들어, 변형된 EPO폴리펩티드 또는 변형된 EPO 폴리펩티드의 조성물은 빈혈 환자의 적혈구 수치를 증가시키기에 효과적인 양이 투여될 수 있다. 빈혈은 건강 이상 뿐만 아니라 식이, 유전적인 요소를 포함한 몇몇의 요인에 의해서 야기될 수 있다. 예를 들면, 빈혈증은 만성 신부전에 의해서도 야기되거나 암에 걸린 개인의 화학 처치법의 부작용으로도 유발될 수 있다.
본원의 변형된 EPO 폴리펩티드는 증가된 단백질 안전성과 증가된 단백질 반감기를 제공한다. 특별한 흥미가 있는 것은 단백질분해효소에 저항성을 가지는 EPO 폴리펩티드라는 것이다. 그러므로 변형된 EPO 폴리펩티드는 빈혈증 치료시 더욱 오래 지속되고, 더욱 안정되게 사용될 수 있다. 예를 들어 이와 같은 폴리펩티드는 서열번호 3-201로부터 선택된 것이다. 변형된 EPO 폴리펩티드를 이용한 치료 개선의 예는, 용량 감소, 소수 및/또는 적은 빈도의 투여, 부작용 감소, 치료 효과의 증가를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 예를 들어 동물 모델을 이용하여 치료 효과를 시험할 수 있다. 예를 들어 빈혈증 쥐, 또는 빈혈증의 동물 모델로 잘 알려진 다른 어느 것이라도 변형된 EPO 폴리펩티드로 처리할 수 있다. 질환 증후의 진행과 표현형은 변형된 EPO 폴리펩티드의 효과를 평가하기 위해 측정될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 플라시보 대조군 및/또는 비-변형 EPO를 사용한 대조군과 비교하여 생체내에서의 유효성을 평가하기 위해서 임상 시험에서와 같은 대상체들 뿐만 아니라 동물 모델에도 투여될 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드는 오랜 지속력과 더욱더 안정된 빈혈 치료를 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 또는 천연형 EPO 폴리펩티드 또는 위에서 언급된 에포에틴(Epoietin) α, β, ω, δ, 및 다베포이에틴(Darbepoietin) α 동종형과 같은 다른 EPO 재조합형보다 낮은 농도 및/또는 적은 빈도로 투여될 수 있으며, 하나 이상의 치료용 활성 및/또는 하나 이상의 적은/감소된 부작용을 가진다.
2. 조직 보호적인 치료
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 손상에 대한 예방 또는 반응성 포유류 세포, 조직, 또는 기관에 대한 손상에 따른 기능 회복을 위한 치료법에 사용될 수 있다. 전형적인 반응성 포유류 세포는 뉴런, 뇌, 척수, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신 피질, 부신 수질, 모세혈관, 내피, 정소, 난소, 자궁내막 또는 줄기세포를 포함한다. 부가적인 반응성 포유류 세포의 예는 광수용기, 신경절, 양극세포(bipolar), 수평세포(horizontal), 무축삭(amacrine), 뮬러(Muller), 심근, 박동기(pace maker), 동방심방결절, 동결절, 방실결절, 히스근속, 간세포, 별세포(stellate), 쿠퍼(Kupffer), 혈관사이세포(mesangial), 배상세포(goblet), 장선, 소화관, 내분비, 사구층(glomerulosa), 군세포(fasciculate), 그물세포(reticularis), 친크롬, 혈관주위세포, 레이디히(Leydig), 세스톨리(Sestoli), 정자, 그라프난포, 원시난포, 자궁속막기질 그리고 자궁내막세포가 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 주로 신경학상의 또는 정신의학상의 증후군, 안과질병(ophthalmic diseases), 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기질환, 신장, 비뇨 질환, 생식 질환(reproductive diseases), 골질환(bone diseases), 피부 질환, 위장 질환, 및 내분비계 및 대사 불균형을 가지는 중추신경계또는 말초신경계의 질환들과 관련된 상태를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 이와 같은 상태로 인한 기능 장애의 회복 또는 재생, 또는 대상체의 세포, 조직 그리고 기관의 국지적 또는 조직적 보호를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
특히, 이러한 상태와 질환은 예를 들어 뇌, 심장, 또는 망막/눈과 같은 중추신경계조직, 말초 신경계 조직 또는 심장 조직 또는 망막 세포내의 흥분성 반응성 조직 (excitable tissues)과 같은 흥분성,반응성 조직(excitable tissues)에 해롭게 영향을 주는 저산소증 상태를 포함한다. 신경 조직으로의 산소의 이용성을 감소시켜 스트레스, 손상, 그리고 마침내 신경 세포 사멸을 야기시키는 어떠한 상태도 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 투여에 의해서 치료될 수 있다. 일반적으로 저산증 및/또는 국소빈혈이라고 불리는 이러한 상태는, 이로써 제한되는 것은 아니나, 뇌졸증, 혈관폐색, 출생 전 또는 출생 후 산소 결핍, 질식, 숨막힘, 천식, 익수 사고(near drowning), 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 수술과 방사성 치료를 포함한 외상, 기절, 간질, 저혈당, 만성폐사슬폐병, 기종, 성인성 호흡곤란증후군, 저혈압 쇼크, 패혈성 쇼크, 과민성 쇼크, 인슐린 쇼크, 겸상적혈구 빈혈, 심장 정지, 율동 부정, 질소중독, 및 심폐 우회절차(heart-lung bypass procedures)에 의해서 야기된 신경성 결손으로부터 기인하거나 포함한다.
따라서, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화 하는 핵산은 주로 신경학상의 또는 정신의학상의 증상, 안과질병(ophthalmic diseases), 심잘혈관 질환, 심폐 질환, 호흡질환, 신장, 비뇨 질환, 번식 질환(reproductive diseases), 골질환(bone diseases), 피부 질환, 위장 질환, 및 내분비계와 대사 불균형을 가지는 중추신경계 또는 말초신경계 인간 질환의 치료용 또는 예방용 처치를 위해서 일반적으로 유용하다. 특히, 그 중에서도 그러한 상태와 질환은 뇌, 심장, 또는 망막/눈과 같은 중추신경계 조직, 말초 신경계 조직 또는 심장 조직 또는 망막 세포내의 흥분성 반응성 조직(excitable tissues)과 같은 흥분성 반응성 조직 (excitable tissues)에 해로운 영향을 주는 저산소증 상태를 포함한다.
그러므로 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 다양한 조건과 환경에서 저산소증 상태가 원인이 되는 흥분성 조직(excitable tissue)의 손상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 투여는 발작 질환, 다발성 경화증, 뇌졸증, 저혈압, 심장마비, 국소빈혈, 심근 경색, 염증, 노화에 의한 인식 능력의 퇴화, 정신분열증을 갖는 대상체에서 인식 거부(cognitive decline), 방사성 손상, 뇌성마비, 신경변성질환,알츠하이머병, 파킨슨병, 리씨 증후군, 에이즈 치매, 기억력 감퇴, 근위축성 측상경화증, 알코올 중독, 기분장애, 불안장애, 주의 결여 장애, 정신분열증, 자폐성, 광우병(Crentzfeld-Jakob disease), 뇌 또는 척추 외상 또는 국소빈혈, 심장-폐의우회(heart-lung bypass), 만성적인 머리 손상, 황반변성, 독소에의해 유도된 신경장애, 당뇨병성 말초신경병증, 당뇨망막병증, 녹내장, 망막 국소빈혈 또는 망막 외상과 같은 상해에 대한 보호를 위해서 사용될 수 있다(see e.g. Grasso 등 (2006) J Neurosurg Spine 4(4):310-80; Boogaert 등 (2005) Oncology. 69 Suppl 2:22-30; Krebs 등 (2006) Expert Opin Pharmacother. 7(7): 837-48).
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 3-201에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 변형된 EPO 폴리펩티드와 약제학적으로 허용가능한 매질(acceptable medium)을 포함하는 조성물을 유효한 양을 대상체에 투여함으로써, 환자에서의 신경학적인 상황의 처치를 위한 치료법에 사용될 수 있다. 예를 들어 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 신경학적 상황의 위험이 있는 개인에게 예방차원에서 처치 될 수도 있고 뇌졸중이나 다른 신경학적인 손상과 같은 상황 후에 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, 신경학적인 상황은 신경계의 신경 또는 아교세포에 영향을 주는 병리학적인 상황이 될 수 있다. 신경 또는 아교세포에 영항을 주는 병리학적인 상황은 국소빈혈, 세포사멸, 세포 괴사, 산화 손상 또는 자유라디칼 손상과 흥분세포 독성을 포함한다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 신경학적인 상태는 대뇌 및 척수허혈, 급성 뇌 손상, 척수의 손상, 망막 질환, 및 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅턴병, 및 루게릭병과 같은 신경변성질환을 포함한다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 증가된 단백질 안전성과 증가된 단백질 반감기를 제공한다. 특별히 흥미가 있는 것은 단백질분해효소에 저항성을 가지는 EPO 폴리펩티드이다. 그러므로 변형된 EPO 폴리펩티드는 빈혈증에서의 더욱 오래 지속되고, 더욱 안정적으로 손상에 대한 보호 또는 반응성 포유류 세포, 조직 또는 기관 손상으로 인한 기능 회복에 사용될 수 있다. 예를 들어 이와 같은 폴리펩티드는 서열번호 3-201로부터 선택된 변형된 EPO 폴리펩티드이다. 변형된 EPO 폴리펩티드를 이용한 치료 개선의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 적은 용량, 소수 및/또는 적은 빈도의 투여, 부작용 감소, 치료 효과의 증가를 포함한다. 변형된EPO 폴리펩티드는 예를 들어 변형된 EPO 폴리펩티드로 치료가능한 동물 모델을 이용하여 치료 유효성을 시험할수 있다. 예를들어 질환 증후의 진행과 표현형은 변형된 EPO 폴리펩티드의 효과를 평가하기 위해 측정될 수 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 플라시보 대조군 및/또는 비-변형된 EPO를 사용한 대조군과의 비교로 생체내에서의 유효성을 평가하기 위해서 임상 시험에서와 같은 대상체 뿐만 아니라 동물 모델에도 투여될 수 있다.
변형된 EPO 폴리펩티드는 반응성 포유류 세포(responsive mammalian cells), 조직, 또는 기관의 상해에 따른 기능의 회복 또는 손상에 대한 예방을 위해서 오랜 지속력과 더욱더 안정된 치료법을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 비변형된 또는 천연형EPO 폴리펩티드 또는 위에서 언급된 에포에틴 α, β, ω, δ, 및 다베포에틴 α 동종형과 같은 다른 EPO 재조합형보다 낮은 농도 및/또는 적은 빈도로 투여될 수 있으며, 하나 이상의 치료용 활성 및/또는 하나 이상의 적은/감소된 부작용을 가진다.
J. 진단적 용도
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 진단상의 목적으로 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 변형된 EPO 폴리펩티드는 필요에 따라 에리스토포이에틴 수용체의 존재를 측정하고 그 양을 측정하기 위해서 또는 적혈구 생성을 유도하는 성분의 활성을 비교하기 위해서 분석 과정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 향상된 활성을 갖는 변형된 EPO 폴리펩티드는 수용체에 결합과 관련된 분석의 민감도를 증가시키고 분석 시간을 감소시키는데 유용할 것이다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 에리스로포이에틴 단백질이 그 수용체에 결합에 대한 새로운 약물의 영향을 결정하기 위한 시험관 내 결합 분석에 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 에리스로포이에틴과 에리스로포이에틴 수용체와의 구조적/기능적인 연관성 뿐만 아니라 적혈구 생성에서의 에리스로포이에틴의 역할을 더욱 밝히기 위해서 유용한 연구 약물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 EPO 폴리펩티드는 적혈구 전구세포의 성장과 분화를 조절하는 능력을 가진 물질을 평가하기 위해서 사용될 수 있다. 적혈구 전구세포의 성장과 분화를 조절하는 능력을 가진 물질을 평가하기 위한 분석법의 일예는 에리스로포이에틴 수용체와 물질의 결합과 변형된 EPO 폴리펩티드와 에리스로포이에틴 수용체와의결합을 비교하는 것이다. 만약 시험 물질(평가될 물질)의 에리스로포이에틴 수용체와의 결합이 변형된 EPO 폴리펩티드의 에리스로포이에틴 수용체와의 결합과 대등하다면, 시험 물질의 결합은 적혈구 전구세포의 성장과 분화를 조절하는 시료의 능력은 대략적으로 변형된 분비된 에리스로포이에틴 돌연변이체와 동등한 능력일 것을 시사한다. 에리스로포이에틴 수용체와의 결합은 당업계에서 익히 공지된 방법과 유사한 수많은 방법들 중에서 임의적인 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 본원에 통합된 참고문헌으로 Yonekura 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1-5; Chern 등(1990)Blood 76(11): 2204-2209; and Krystal (1983) Exp. Hematol. 11: 649-660 에 설명된 것과 같은 방법이 사용될 수 있다.
K. 병용 치료법
본원에서 언급된 임의의 변형된 EPO 폴리펩티드와 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 이에 제한되는 것은 아니나, 다른 생물제제, 작은 분자형 화합물 및 수술을 포함하는 치료용 약물이나 시술 이전에, 이와 함께 간헐적으로, 또는 이보다 후에 복합으로 투여될 수 있다. 상기 예시된 모든 질환 또는 상태, EPO가 지시되거나 사용되고 있고, 다른 약제 및 치료가 이용 가능한 임의의 질환 또는 상태의 경우, EPO를 이와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 변형된 폴리펩티드는 유사하게사용할 수 있다. 게다가 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 유사하게 사용될 수 있다. 치료할 질환 또는 상태에 따라 전형적인 병용투여는 이에 제한되는 것은 아니나, 콜로니 자극인자, 헤모글로빈, 화학치료용 약물 (예를 들어 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 광감각제, 방사성핵종, 독소, 대사길항물질, 신호조절자, 항암성 항생제, 항함성 항체, 항암성 올리고펩티드, 신생혈관 생성 저해제, 방사능 치료, 화학적 치료용 화합물, 또는 그것의 조합물) 또는 철 (예를 들어 타브론(Tabron), 페로졸(Ferosol), 색원체, 니페렉스(Niferex), 황산철(II) 또는 푸마르산철(II)의 조성물, 덱스트란철)과 병용될 수있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 겸상적혈구 빈혈증 또는 헤모글로빈 E(Hb E)-β0-지중해빈혈와 같은 이상혈색소증 환자에게 이로써 제한되는 것은 아니나 클리트리아졸과 같이 적혈구세포의 탈수를 막는 약물이나 하이드록시우레아, 소듐 페닐부티레이트와 같은 태아의 헤모글로빈의 내인성 생산을 향상시키는 약물과 재조합형 헤모글로빈과 함께 투여를 할 수 있다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(예 sargramostim, LEUKINE?, PROKINE?, 과립구 콜로니 자극인자(예 filgrastim, NEUPOGEN?, c-mpl 리간드 (또한 트롬보포이에틴 (TPO) 또는 MGDF으로 잘 알려짐), 대식세포 콜로니 자극인자(CSF-1으로 잘 알려짐), IL-1, IL-4, IL-2, IL-3, IL-5, IL 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, LIF, 인간성장호르몬, B 세포 성장 인자, B세포 분화 인자, 산호성백혈구 분화 인자 그리고 줄기세포인자(SCF, c-kit ligand, steel factor), PIXY321 (a GMCSF/IL-3 fusion protein), 또는 인터페론-감마와 같은 인터페론을 포함하는 사이토카인, 림포카인, 인터루킨, 혈액성장인자들의 하나 이상의 부가적인 콜로니 성장인자를 병용 투여하거나순차적으로 투여할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 다른 에리스로포이에틴 형태(epoetin alfa, EPOGEN?, PROCRIT?와 병용되어 사용될 수 있다. 이러한 요소들과 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드의 병용은 펩티드 각각의 일반적인 활성을 가지거나 각 성분과 변형된 EPO 폴리펩티드의 단독에 대한 부가적인(additive) 활성보다 큰 생물학적인 또는 생리학적인 활성을 가질수도 있다. 병용투여는 또한 활성의 효과를 증대시키거나 EPO나 부가적인 요소의 존재에 의해서 기되대는 것과는 다른 활성을 제공할 수도 있다. 병용요법은 또한 천연형 인간 EPO와 관련된 원하지 않는 생물학적 활성의 감소를 포함한 활성 측면을 향상시킬 수도 있다. 위의 목록 뿐만 아니라, 각 성분들의 변형된 형태들 또한 이처럼 병용되어 사용될 수 있다(예를 들어 보면 제WO 94/12639호, 제WO 94/12638호, 제WO 95/21197호, 및 제WO 95/21254호에서의 IL-3 변이체들 제WO 97/12977호에서의 G-CSF 수용체 작용제 제WO 97/12978호에서의 c-mpl 수용체 작용제 제WO 97/12979 IL-3호 수용체 작용제 제WO 97/12985호에서의 다기능성 수용체 작용제). 본원에서 사용되는 바와 같이 "IL-3 변이체"는 제WO 94/12639호 및 제WO 94/12638호에서 교시하는 IL-3 변이체를 언급한 것이다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한 빈혈증을 유발시키는 치료용 화합물이나 약제 투여에 의한 질환과 장애에도 병용 요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, C형감염(HCV)의 감염에서의 치료는 리바비린(RBV)과 인터페론-알파(IFN-α)를 종종 병용 투여한다. 이와 같은 치료법은 용량을 감소하거나 치료를 중단할 정도로 심각한 빈혈증이 발생될 수 있고(처방된 사람의 10%) 만큼의 3그램/데시리터 이상의 헤모글로빈을 감소시킨다(리바비린과 인터페론 알파를 함께 처리한 인간의 54%에서 발생). 리바비린(RBV)과 인터페론-알파(IFN-α)의 병용 투여는 치료법에 의해서 유발되는 빈혈증의 문제점을 덜어 줄 수 있다(미국특허 제 6,833,351호). 따라서, 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드는 리바비린(RBV)와 인터페론-알파(IFN-α)의 투여에 의해서 유발되는 빈혈증을 치료하기 위한 병용치료법으로 사용될 수 있다.
L. 제품 및 키트
변형된 EPO폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드, 또는 변형된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 그의 유도체, 또는 생물학적인 활성 부분의 약제학적 화합물은 포장 재료, EPO-매개된 질환 또는 장애 또는 치료용 폴리펩티드 관련 질병 또는 장애를 치료하는 약제학적 조성물, 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 핵산 분자가EPO 관련 질병 또는 장애 치료를 위해 사용되거나, 또는 치료용 폴리펩티드-관련 질병 또는 장애를 치료하기 위해 사용되어진다는 것을 지시하는 라벨을 포함하는 제품으로 포장될 수 있다.
본원에서 제공된 제조품은 포장 재료를 포함한다. 약제학적 제품을 포장하는데 사용하는 포장 재료는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면 그 전문이 본원에 통합된 미국 특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,352호를 참조할 수 있다. 약제학적 포장 재료의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제형 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장 재료가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 제공된 화합물 및 조성물의 광범위한 제형은 임의의 EPO-관련 질환 또는 장애 혹은 치료용 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 대한 다양한 치료로서 고려된다.
변형된 EPO 폴리펩티드, 다른 변형된 치료용 폴리펩티드, 변형된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트에는 본원의 약제학적 조성물 및 투여용 아이템이 포함될 수 있다. 예를 들면, 변형된 EPO 또는 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 주사기, 흡입기, 용량 컵, 점적기 또는 어플리케이터와 같은 투여용 장치로 공급될 수 있다. 키트에는, 임의로, 용량, 투여 방법 및 투여 방식에 관한 지시를 포함하는 투여 지침서가 포함될 수 있다. 키트에는 또한 본원에서 기술된 약제학적 조성물 및 진단용 아이템이 포함될 수 있다. 예를 들면, 이러한 키트에는 EPO또는 다른 치료용 폴리펩티드의 농도, 양 또는 활성 또는 EPO 조절된 시스템을 측정하기 위한 아이템이 포함될 수 있다
M. 변형된 EPO 폴리펩티드 및 다른 변형된 치료용 폴리펩티드에 대한 항체
본원에서 제공된 변형된 치료용 폴리펩티드와 다른 변형된EPO 폴리펩티드를 인지하는 항원이 생산될 수 있다 . 예를 들면 항체는 단일클론항체, 다클론항체, 단일가닥 항체, 키메릭 항체, 이중 기능의 또는 이중 특유성질의 항체(bifunctional or bispecific antibodies), 인간화 항체, 인간 항체, 및 상보성결정영역(CDR) 또는 항원 결합 서열을 포함하는 화합물을 포함하는 상보성결정영역(complementary determining region(CDR))-이식항체(CDR-grafted antibodies)를 포함한다. 상기 항체는 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드 또는 변형된 치료용 폴리펩티드의 특이적으로 결합한다. 또한 본원에서는 Fab, Fab, Fab', F(ab').sub.2 그리고 Fv를 포함하는 항체 단편 또한 제공한다. 본원에서 제공된 항체의 특이적인 또는 독점적인 결합을 결정하는 선별 분석법(screening assay)은 당업자에게 익히 공지되어 있다(참조, Harlow 등 (Eds), Antibodies A LaboratoryManual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)).
항체는 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩다이드 또는 그의 단편을 이용하여 당업자에게 익히 공지된 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 면역성의 폴리펩티드는 자연적인 원천, 재조합형 숙주 세포로부터 분리할 수도 있고 화학적으로 합성될 수도 있다. 변형된 EPO 폴리펩티드와 다른 변형된 치료용 폴리펩티드는 또한 면역원성을 증가시키기 위해서 keyhole limpet hemocyanin (KLH)와 같은 합텐(hapten)과 결합시킬 수도 있다. 그러한 펩타이드의 합성 방법은 예를 들어Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2154; Krstenansky, 등 (1987) FEBS Lett. 211:10에 개시되어, 당업계에 익히 공지되어 있다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드나 다른 변형된 치료용 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 변형된 EPO 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 이용한 면역을 통해서 제조될 수 있다 (참조 예 Fan 등 (1999) Nat. Biotech. 17:870-872). 변형된 EPO 폴리펩티드나 다른 변형된 치료용 폴리펩티드를 암호화 하는 DNA는 나출형 플라스미드 DNA 의 국소 투여에 의하거나 예로써DNA의 근육내 주사와 같은 주사에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
비-인간 항체는 당업계에 알려진 방법으로 인간화될 수 있다. 어떤 방법에서는, 비-인간상보성결정영역(CRD)은 인간 항체 또는 공통의 항체 구조 배열에 삽입될 수 있다. 친화도나 면역원성을 조절하기 위해 추가적인 변환이 항체틀 서열에 도입될 수 있다. 더 나아가 항체는 플라스틱(plastic) 항체나 분자 각인 고분자 (molecularly imprinted polymers (MIPs))를 포함한다(Haupt and Mosbauch (1998) TIBTech 16:468-475). 이런 형태의 항체는 예를 들어 면역감지센서로의 이용과 화학적인 또는 생물학적인 라이브러리를 스크리닝하기 위한 면역 친화성의 분리, 크로마토그래피, 고체상 추출법 , 면역측정법에 이용할 수 있다. 이러한 형태의 항체의 이점은 동물 면역화가 필요하지 않다는 것과, 상대적으로 생산하는 비용이 덜 들고, 유기 용매에 저항성이 있으며 오랜 기간 동안 재사용 가능하다는 것이다.
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드나 다른 변형된 치료용 폴리펩티드가 결합하는 항체는 진단 방법이나 치료 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 특정한 세포, 조직이나, 혈청에서의 발현 측정시 생체 내, 시험관 내 또는 제자리(in situ)에서 변형된 치료용 폴리펩티드의 유무 또는 양을 측정하는 진단분석법에 사용될 수 있다. 당업자에게 널리 알려진 다양한 진단 분석 기술은 경합결합측정법, 직접적인 또는 간접적인 샌드위치 측정법(direct or indirect sandwich assays), 이질상 또는 동질상에서 행해지는 면역침강측정법과 같은 당업계에 알려진 다양한 진단분석 기술을 사용할 수 있다(Zola (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. 147-158).
본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 인지하는 항체는 변형된 EPO 폴리펩티드에 특이적일 수 있다. 본원에서 설명된 것처럼 변형된 EPO 폴리펩티드에 특이적인 항체는 야생형 EPO 폴리펩티드, 다른 종으로부터의 EPO 폴리펩티드(즉, 종간 변이체) 또는 다른 변형된 EPO 폴리펩티드에 비해 높은 친화력으로 변성된 EPO 폴리펩티드와 결합할 수 있다. 변형된EPO 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 항체는 천연형 EPO 폴리 펩티드, 다른종으로 부터의 EPO 폴리펩티드((즉 종간 변이체) 또는 다른 변형된 EPO 폴리펩티드와 특별히 변형된 EPO 폴리펩티드를 구별하는 진단 분석법에 사용될 수 있다. 게다가 항체는 화학요법의 약물과 같은 치료 부분(therapeutic moiety)으로 라벨될 수 있고, 예를 들어 이러한 폴리펩티드를 내재화 할 수 있는 세포의 수를 줄이기 위해 사용될 수 있다. 더 나아가 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드를 인지하는 항체는 에리스로포이에틴 활성을 방해하거나 줄이기 위해 경쟁적이거나 주된 우성음성(dorminant negative)적 방식으로 작용할 수 있다.
진단분석법에 사용되는 항체는 측정을 신속하게 하기 위한 측정 가능한 부분(moiety)으로 표지할 수 있다. 측정가능한 부분은 직접적으로 또는 간접적으로 측정할 수 있는 신호를 생산할 수 있다. 예를 들어, 측정할수 있는 부분은 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I 와 같은 방사성동위원소, 플로오레세인 아이소싸이오사이아네이트, 로다민 또는 루시페린과 같은 형광성 또는 화학발광형 화합물, 알칼라인 포스파타아제, 베타 갈락토시다아제, 또는 양고추냉이 페록시디아제와 같은 효소가 있다. 항체를 측정할 수 있는 부분에 결합하기 위해 당업계에 알려진 방법을 적용할 수있다. 상기 방법은 Hunter 등 (1962) Nature, 144: 945; David 등 (1974) Biochemistry, 13:1014; Pain 등(1981) J. Immunol. Meth., 40: 219; and Nygren (1982) Histochem. and Cytochem. 30: 407에서 설명된 방법을 포함한다. 형광성 분자와 같은 부분(moiety)은 폴리펩티드 내의 어떤 위치에서도 변형된 EPO 폴리펩티드를 인지하는 항체를 포함하는 변형된 치료용 폴리펩티드와 연결될 수 있다. 폴리펩티드와 다양한 부분들(moiety)의 결합에 사용되는 화학은 당업계에 알려져 있다. 측정부분으로써 부분(moiety)은 예를 들어 카르보디이미드 결합을 이용하여 항체를 포함한 변형된 치료용 폴리펩티드와 연결될 수 있다(Bauminger and Wilchek (1980) Meth . Enzymol. 70:151-159). 카르보디이미드는 R과 R'가 지방족이거나 방향족 화합물일 수 있는 R-N=C=N-R'의 일반식을 갖는 화합물의 군을 포함하며, 폴리펩티드 본드의 합성에 이용된다. 예비적인 준비 절차는 간단하고 상대적으로 빠르며 온화한 상태하에서도 수행될 수 있다. 카르보디이미드 화합물은 카르복실기 기가 자유 아미노기의 반응 자리로 변화되도록 공격한다. 카르보디이미드 결합은 다양한 화합물이 항체생산을 위한 담체에 결합하도록 하기 위해 사용되어 왔다. 수용성의 카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)는 본원에서 제공된 항체를 포함한 폴리펩티드에 부분(moiety)을 결합시키는데 유용하다. 본원에서 제공된 변형된 EPO 폴리펩티드나 다른 치료용 폴리펩티드에 결합하는 항체는 또한 재조합 세포 배양이나 자연적인 원천으로부터 변형된 치료용 폴리펩티드의 친화도 정제에 이용될 수 있다. 이러한 과정에서, 변형된 치료용 폴리펩티드에 대한 항체는 당업계에게 익히 공지된 방법을 이용하여 세파덱스 레진(Sephadex resin) 또는 거름 종이와 같은 적합한 지지체에 고정된다. 고정된 항체는 그후에 정제의 대상이 되는 변형된 치료용 폴리펩티드를 포함한 시료와 접촉되고, 그 이후에 지지체는 고정된 항체에 결합한 변형된 치료용 폴리펩티드를 제외한 모든 물질을 시료에서 충분히 제거할 수 있는 적합한 용매로 씻어낸다. 마지막으로, 지지체는 항체로부터 변형된 치료용 폴리펩티드를 방출할 수 있는 또 다른 적당한 용매로 씻어낸다.
본원의 변형된 EPO 폴리펩티드나 변형된 치료용 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 약제학적 조성물의 형태로 다양한 장애의 처치를 위해서 투여될 수 있다. 본원의 제형은 또한 서로에게 부정적인 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 가지는 우호적인 물질들과 함께 처치되어지는 특별한 처방을 위해 필요한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 상호 역효과를 나타내지 않는 상보적인 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 대체하거나 추가로, 조성물은 예를 들어 세포독성물질, 사이토카인, 화학적치료용 약물, 또는 성장저해약물과 같은 그 기능을 강화하는 물질을 포함할 수 있다. 이와 같은 분자는 의도한 목적에 유효성있는 양으로 복합물 중 적절하게 존재한다.
N. 실시예
다음의 실시예는 단지 예시적 목적으로 포함되며 본원에서 제공된 양태의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1. EPO 돌연변이체 클로닝 및 생산
EPO 돌연변이체 클로닝 및 생산
1. EPO를 암호화하는 cDNA 클로닝 및 포유동물 발현 벡터로의 삽입
인간 에리스로포이에틴을 암호화 하는 서열을 포함하는 염기서열을 (서열번호 229) 당업자에게 표준 기술로 널리 알려진 중합 효소 연사슬 반응(PCR)을 이용하여 ResGen OR F Expression Positive Gollection으로부터 얻은 Genestorm? Human Clone ID RG001720 (판매원 ; Invitrogen, Catalog #H-K1000)에서 증폭하였다. 염기서열은 포유동물 발현 플라스미드인 pcDNA3.1/GS(판매원; Invitrogen, 서열번호 230)에 삽입하였다. 이때 사용한 프라이머는 아래와 같다.
EPO BamHI 순방향 프라이머: 5'GGAATTCCATATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGG-3'(서열번호 231).
EPO NdeI 역방향 프라이머: 5'GGGATCCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTCCC-3'(서열번호 232).
증폭되어진 에리스로포이에틴 cDNA 서열은 pTOPO-TA 벡터(판매원: Invitrogen)에 클론닝하여 pTOPO-TA-hEPO 플라스미드를 제작하였다. EPO cDNA 서열은 자동 DNA 서열 분석 방법을 사용하여 확인하였다. 그 후 pTOPO-TA-hEPO 플라스미드를 NotI과 SpeI 제한효소를 사용하여 절단하고, hEPO 단편을 NotI과 XbaI으로 절단한 pNAUT에 서브클로닝하여 pNAUT-hEPO (서열번호 233)를 생성시켰다. 이 EPO-cDNA 염기 서열은 아래의 프라이머를 사용하여 염기 서열 분석 방법으로 확인하였다.
pNAUT 순방향 프라이머: 5'TATAAGCAGAGCTCTCTG-3'(서열번호 234)
pNAUT 역방향 프라이머: 5'CACAGTCGAGGCTGATCAG-3'(서열번호 235)
암호화된 성숙한 형태의 EPO 폴리펩티드는 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
2. EPO 돌연변이체의 생산
미리 고안된 표적화된 돌연변이체의 집단을 생성시켜, 어드레스가능한 어레이에서 각 개개의 돌연변이체가 생성되고 개별적으로 프로세싱되고, 서로 물리적으로 분리되게 하였다. 본원에 기술되고 또한 미국 출원 공개 제 2004-0132977-A1호 및 미국 출원 공개 제 2005-0202438 A1호에 기술된 2D-스캐닝 기술을 사용하여, 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 갖는 EPO 돌연변이체를 고안하고 수득하였다. (1)진화될 단백질 특성 (예: 단백질분해에 대한 저항성 또는 안정성); (2)아미노산 서열 및 (3) 개개의 아미노산의 특성에 따라 is-HIT가 동정되었다.
단백질분해에 저항성을 증가시키기 위해 생산된 EPO LEAD
2D-스캐닝을 사용하여 단백질분해에 대한 저항성을 부여하는 위치를 동정하기 위해 변이체가 고안되었다. hEPO (서열번호 2) 상에서 선택된 위치(is-HIT)는 다음과 같다(번호매김은 신호 서열을 제외한 서열번호 2의 성숙한 hEPO 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응한다): P2, P3, R4, L5, D8, R10, L12, E13, R14, Y15, L16, L17, E18, K20, E21, E23, E31, L35, E37, P42, D43, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, P121, P122, D123, P129, L130, R131, D136, F138, R139, K140, L141, F142, R143, Y145, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165, R166.
위에서 열거된 is-HIT 위치에서의 천연형 아미노산은 표 19에 나열된 아미노산 잔기로 각각 치환되었다.
Figure 112009039361308-pct00023
단백질분해 증가된 저항성을 시험시키기 위해 생성된 EPO 변이체는 표 20 (서열번호 3-201)에 열거하였다. 생성된 변이체는 다음과 같다. P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H, 및 R166Q.
Figure 112009039361308-pct00024
실시예 2
포유동물세포에서 천연형 및 변형된 인간 EPO 폴리펩티드(단백질) 생산
및 수율 결정
중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FCS)가 포함된 Dulbecco? Modified Eagle? 배지(DMEM, 판매원: Invitrogen)에서 성장시켰다.
형질감염 하루전에 CHO 세포를 10% FCS를 포함한 (항생제 제외) DMEM 배지에서 웰 당 5x105 세포 농도로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 익일 형질감염 시에는 50~90% 포화도의 세포 농도가 되도록, 37℃, 7% CO2 조성을 포함한 습윤한 대기하에서 배양하였다.
CHO 세포는 제조사에서 제시한 방법에 따라 퍼펙틴(Perfectin) 시약(제조사: Ozyme)을 사용하여 EPO 돌연변이 DNA 2ug으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 세포 플레이트는 37℃, 7% CO2 조성을 포한한 습윤한 대기하에서 Opti-MEM? 환원 혈청 배지(제조사: Invitrogen)에서 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후 형질감염된 배지를 1% FCS가 포함된 새로운 DMEM 배지 1mL로 교환하였다. 96시간 후에 세포 상청액을 수거하였고, 96웰 플레이트에 분주하여 -80℃에 보관하였다.
수거한 세포 상청액의 hEPO 변이체 폴리펩티드 농도는 인간 에리스로포이에틴 특이적인 ELISA 키트(제조사: IBL, Hamburg, Germany)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다. hEPO 변이체의 농도를 단백질분해효소 저항성 분석을 위해 표준화하였다.
실시예 3
TF -1 증식 검출법에 의한 인간 EPO 의 비활성 결정
각각의 키네틱 포인트 시료에서 잔여 증식활성(EC50)을 결정하기 위해 인간 에리스로류케미아(erythroleukemia ) TF-1 세포주 생분석에서 단백질분해효소 분해 키네틱스의 상이한 시간에서 얻어진 각각의 분주된 시료에 대해 증식 분석을 수행하였다. TF-1 세포주를 T175 (175cm2) 폴리스티렌 조직 배양 플라스크에서 37℃, 7% CO2 /95% 공기 조성을 포함한 습윤한 대기하에서 10% FCS, 2mM L-글루타민, 및 2ng/ml 인간 재조합GM-CSF가 포함된 RPMI 1640 배지 (제조사: Invitrogen)에 유지하고 일주일에 두번씩 계대배양하였다. 증식 검정 24시간 전에, 세포는 차가운 PBS로 두번 세척하였고, GM-CSF가 포함되지 않은 2mM 글루타민과 10% FCS를 포함한 RPMI배지에서 16시간 재현탁하였다.
TF1 세포를 GM-CSF가 포함되지 않은 2mM 글루타민과 10% FCS를 포함한 RPMI배지 70ul에 웰당 4x104 세포로 96웰 플레이트에 분주하였다. 각 분획된 시료를 96웰 deep-플레이트에서 2배씩 연속 희석하였고, EPO 희석액(30ul)을 최종 농도 70000pg/mL에서 34.2pg/mL 범위까지 70ul TF-1 세포가 들어있는 각 웰에 첨가하였다. 각 EPO 시료 희석액은 3회 반복으로 평가하였다. 비-증식 세포의 기본 흡광도를 측정하기 위해 평평-바닥 96웰 플레이트의 마지막 열 ("G" 열)에는 GM-CSF를 첨가하지 않았다. 제2 국제 표준 EPO (NIBSC, 88/574)와 제1 국제 표준품 GM-CSF (NIBSC, 88/646) 모두를 포함하는 내부 대조군을 2배씩 연속 희석(70000에서 34.2 pg/mL)을 거치고, 증식 결과를 표준화하기 위해 분석 플레이트에 3회 반복으로 첨가하였다.
플레이트를 7% CO2 조성을 포함한 습윤한 대기를 유지하며 37℃에서 48시간 배양하였다. 성장 48시간 후에, Cell titer 96 Aqueous one solution reagent(제조사: Promega) 20 ul를 각 웰에 첨가하고 7% CO2 조성을 포함한 대기하에서 37℃에서 3시간 배양하였다. MTS 세포적 환원에 의해 나타나는 색을 띠는 가용성의 포르마잔의 양을 측정하기 위해, 염료의 흡광도를 490nm 파장에서 ELISA 플레이트 측정기(Spectramax?)를 사용하여 측정하였다.
490nm에서 측정된 교정된 흡광도("G"열의 기본값 공제)를 사이토카인 농도에 따라 그래프로 나타내었다. EC50값은 최대흡광도와 최소 흡광도 간 차이의 1/2에 상응하는 X-축 값으로 결정함으로써 계산하였다 (EC50 = 최대 반응의 절반을 부여하기위해 요구되는 사이토카인의 농도).
실시예 4
단백질분해 저항성
EPO 변이체의 단백질분해효소 저항성을 평가하였다. 천연형 EPO 대비 EPO 돌연변이체의 보호 효과를 평가하기 위해, 37℃에서 상이한 시간에 효소 분해를 수행하였다. 천연형 EPO와 각각의 EPO 돌연변이체에 대해, 알파-키모트립신, 엔도프로티나제- Glu C 및 트립신 (제조사: Sigma)을 각각 포함하는 1.5% 단백질분해효소 혼합액 (wt/wt)을 혈청이 없는 RPMI 배지 400 ul에 혼합함으로써 단백질분해효소 혼합 용액을 준비하였다. 키네틱 분석을 위해 1% FCS를 포함하는 DMEM 배지 (CHOK1 배양 배지) 300ul에 들어있는 각각의 EPO 돌연변이체 또는 천연형 단백질 557.2 ng에 단백질분해효소 혼합 용액을 첨가함으로써 단백질분해효소에 의한 분해를 개시하였다. 배양 시간은 다음과 같다: 0 h, 0.5 h, 1 h, 2, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 및 7 h. 상이한 키네틱 시점에서 각각의 시료에 대해 70ul의 분획을 취하고, 단백질분해효소 반응을 중단시키기위해 항단백질분해효소 혼합액(mini EDTA free, 제조사: Roche - 한 정제를 10% FCS를 포함하는 10mL RPMI 배지에서 용해하였다) 10ul씩 첨가하였다. 시료는 남아있는 증식 활성 측정 전까지 -80?에 보관하였다.
처리된 시료의 세포 증식 유도 활성은 각 시점에 남아있는 증식 활성을 결정하기 위해 실시예 3에 개시된 바 대로 분석하였다. 대표적인 비-제한적 변형된 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소에 대한 저항성은, 동일한 단백질분해효소 처리 조건 하에서 천연형 EPO의 잔여 증식 활성과 비교하여 "변화 없음" 또는 "단백질분해효소에 대해 증가된 저항성"으로서 표 21에 표시하였다.
이 자료는 모든 단백질분해효소를 대표하는 것을 의미하지 않으며, 이는 예시적인 자료로써 상기한 단백질분해효소를 포함하는 대표적인 단백질분해효소 칵테일에 대한 단백질분해에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서 이 자료는 포괄적이지 않으며, 다른 EPO 폴리펩티드는 단백질분해효소 저항성을 갖지 않는다는 것을 의미하지 않는다.
Figure 112009039361308-pct00025
Figure 112009039361308-pct00026
Figure 112009039361308-pct00027
두번째 실험에서는 더 높은 단백질분해효소 농도에서 단백질분해 저항성을 측정하였다. 이 분석의 실험과정은 단백질 분해를 위해 α-키모트립신, 엔도프로티나제 Glu C 및 트립신 (제조사: Sigma) 각각을 포함하는 3% 단백질분해효소 혼합액(wt/wt)을 사용한 것을 제외하면 상기한 바와 동일하다. 이 실험의 결과는 표 22에 표시하였다. 이 표는 각 시료간의 단백질분해효소에 대한 상대적인 저항성으로 표현되었다: (+), (++), 또는 (+++),(+++)은 가장 단백질분해효소 저항성이 높은 것을 말한다.
Figure 112009039361308-pct00028
Figure 112009039361308-pct00029
Figure 112009039361308-pct00030
EPO LEAD 선별을 위해, 잔여 증식 활성과 단백질분해효소 처리후에 분해되지 않은 EPO 단백질의 농도를 비교하였다. 위 실험을 위한 EPO 단백질 농도(표 22에 표시됨)는 제조사에서 제시한 방법에 따라 인간 특이적인 ELISA 키트(제조사: R&D Systems)를 사용하여 측정하였다. Lead는 단백질분해효소 저항성이 증가된 EPO 폴리펩티드를 결정하기 위해 시료에서 EPO 단백질 양에 남아있는 증식 활성 수준을 상대적으로 비교하여 두 분석의 연관관계에 의해 선택하였다. 선택된 EPO LEAD 결과는 표 23에 나타내었다. 이 결과는 선택된 EPO LEAD간의 상대적인 단백질분해효소 저항성으로 표시하였다: (+), (++), 또는 (+++),여기서 (+++)는 가장 높은 단백질분해효소 저항성을 갖고 있음을 의미한다.
Figure 112009039361308-pct00031
표에 나타낸 자료는 예시적인 자료로써 상기한 바와 같이 단백질분해효소를 포함하는 대표적인 단백질분해효소 칵테일을 사용하는 특별한 실험에서 단백질분해에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서 이 자료는 포괄적이지 않으며, 다른 EPO 폴리펩티드가 단백질분해효소 저항성을 갖지 않는다는 것을 의미하지 않는다.
실시예 5
당화에 의해 가려진 단백질분해가 가능한 위치 동정
( Identification of possible sites for proteolysis that are hidden by glycosylation )
천연형 EPO에서 당화에 의해 가려질 수 있는 단백질 분해에 민감한 위치를 결정하기 위해, N24H (서열번호 244), N38H (서열번호 245) 또는 N83H (서열번호 246) 아미노산 치환을 포함하는 EPO 변이체를 각각 생산하여 단백질분해에 대한 저항성을 실험하였다. 각 탈-당화된 변이체는 CHO 세포에서 발현되었다. 간단하게, 형질감염 하루전에 CHO 세포를 10% FCS를 포함한 DMEM 배지(INtrogen, CA)에서 5x105 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트에서 접종한 후 37℃, 습윤한 대기하에서 배양하였다.
CHO 세포는 제조사에서 제시한 방법에 따라 퍼펙틴 시약(제조사: Ozyme)을 사용하여 EPO 돌연변이 DNA 2ug으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 37oC 습윤한 대기하에서 Optimem 배지(제조사: Invitrogen)에서 4시간동안 배양하였다. 그 후 형질감염된 배지를 1% FCS가 포함된 새로운 DMEM 배지 1mL로 교환하였다. 96시간 후에 EPO 폴리펩티드를 함유하는 세포 상청액을 수거하고 분주하여 -80℃에 보관하였다. 각 EPO 변이체 농도는Quantikine IVD human EPO ELISA 키트(제조사:R&D Systems, UK)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 표준화되었다.
각 변이체의 단백질분해효소에 대한 민감도를 완전히 당화된 천연형 EPO 폴리펩티드와 비교하여 평가하기 위해 단백질분해효소 집합(set)을 사용하여 배양하는 동안 효소적 절단 반응을 수행하였다. α-키모트립신, 엔도프로티나제 Glu C 및 트립신 (제조사: Sigma)을 포함하는 1.5% 단백질분해효소 혼합액을(wt/wt) 400ul 혈청이 없는 RPMI 배지에 혼합하여 단백질분해효소 혼합 용액을 준비하였다. 단백질 분해 키네틱은 1% FCS (CHOK1 배양 배지)를 포함하는 DMEM 배지에 있는 각 EPO 폴리펩티드에 단백질분해효소 혼합 용액을 첨가하여 시작하였다. EPO 폴리펩티드는 37℃ 에서 단백질분해효소와 배양하였다. 상이한 키네틱 시점(0 hr, 0.5 hr, 1 hr, 2r, 3 hr, 4 hr, 5 hr, 6 hr, and 8 hr)에서 각 시료의 분획을 얻었으며 단백질분해를 중단시키기 위해 항단백질분해효소 혼합액(mini EDTA free, 제조사: Roche 한 정제를 10% FCS를 포함하는 10mL RPMI에 녹였다)을 첨가하였다. 각 시료는 -80℃에 냉동시켰고, 각 시료의EPO 농도는 ELISA로 상기한 바와 같이 측정하였다.
EPO 변이체에서 N38 당화 위치의 돌연변이가 단백질분해에 매우 민감한 것으로 관찰되었다. EPO 변이체에서N83과 N24 당화 위치의 돌연변이는 각각 중간 또는 낮은 수준에서 단백질분해에 민감한 것으로 나타났다. 따라서N38이 가장 민감한 위치로 확인되었고, N83은 중간 수준으로, N24는 덜 민감한 위치로 고려된다.
어느 is-HITs가 당화된 EPO 폴리펩티드에서 "숨겨질"수 있지만 탈-당화시 단백질분해효소에 노출될 수도 있는지를 결정하기 위해, N-당화 위치로부터 단백질 분해효소에 민감한 위치로서 실시예 1.2에서 동정된 is-HITs까지의 거리 분석이 시행되었다. 표 24는 당화 위치로부터 10 또는 15의 반경이내에 위치한 is-HIT 위치를 보여준다(신호 서열 없는 서열번호 2의 성숙한 hEPO 폴리펩티드에서 아미노산 위치에 상응하여 번호 매김).
Figure 112009039361308-pct00032
실시예 6
단백질분해에 증가된 저항성을 가지는 탈-당화된 EPO 변이체 생산
단백질분해에 대한 증가된 저항성을 갖는 탈-당화된 EPO 변이체를 생산하기 위해 선택된 하나 내지 그 이상의 is-HIT 위치에서 당화가 감소된 EPO 폴리펩티드를 변형하였다. 아래의 섹션 1-3에서 설명한 바와 같이, 세개의 초기 과정은 부분적으로 탈-당화된 EPO 돌연변이체에 대한 보호 효과를 가지는 돌연변이를 규명하기 위해 사용되었다. EPO 폴리펩티드는 N38 및 N83 중의 하나의 일련의 돌연변이(serial mutation)에 의해 증진적으로 탈-당화되었다. 각 탈-당화 단계에서, 단백질분해에 대한 민감한 위치를 제거하기 위해 선택된 is-HIT 위치에서 돌연변이를 폴리펩티드에 도입하였고, 어떤 돌연변이가 N38 및 N83위치에서 탈-당화된 변이체를 보호할 수 있는지 결정하였다. 이런 돌연변이체는 실시예 1-4에서 단백질분해에 대한 보호적 효과를 가지는 것으로 동정된 LEAD에 의해 보유되는(carried)R139H, K20Q, E159N, L153V, K52N, L80I, L93I, L93V, 및 R4H 아미노산 치환을 포함한다. EPO 변이체는 단백질분해효소 저항성을 평가하였고, 단백질분해효소 저항성이 증가된 변이체는 새로운 돌연변이를 도입하기 위한 주형으로 사용되었다. 아래의 섹션 4에 설명된, 이 과정의 마지막 단계는 마지막 N-당화 위치, N-24 ,의 돌연변이를 포함하고 이러한 돌연변이 도입이 단백질분해에 대한 보호작용이 있는 N-당화 없는 EPO 변이체를 보호한다는 것을 보여준다.
상기 실시예 1 및 2에 개시된 방법으로 EPO 변이체를 만들고, 발현시켰으며, 상기한 바와 같은 ELISA 방법으로 농도를 측정하였다. 완전히 당화된 천연형EPO 폴리펩티드 또한 생산하였다. 완전히 비-당화된 EPO 폴리펩티드는 당화된 EPO 단백질(European pharmacopeia (EP) reference standard; E1515000, Batch 3.0)을 탈-당화함으로써 생산하였다. 탈-당화는 제조사에서 제시한 방법에 따라 GlycoPro Enzymatic De-glycosylated Kit (제조사: Prozyme, GK80110)을 사용하여 효과적으로 수행하였다. 간단하게 설명하면, 1 > 107 pg/ml EPO를 N-glycanase PNGase F, Sialidase A, O-Glycanase, Galactosidase b (1-4) 및 b-N-Acetyl Glucosaminidase를 포함하는 1 × 배양 완충액과 함께 37℃에서 밤새도록 배양하였다.
EPO 돌연변이체와 대조 폴리펩티드(완전히 당화된 천연형 EPO, 및 완전히 탈-당화된 EPO)의 단백질분해 저항성을 평가하기 위해, 37℃에서 일정 기간 동안 효소적 절단 반응을 수행하였다. α-키모트립신, 엔도프로티나제 Glu C 및 트립신 (제조사: Sigma)을 포함하는 1.5% 단백질분해효소 혼합액을(wt/wt) 400ul FCS가 없는 RPMI 배지에 혼합하여 단백질분해효소 혼합 용액을 준비하였다. 단백질 분해 키네틱은 1% FCS(CHOK1 배양 배지)를 포함하는 DMEM 배지에 있는 각 EPO 폴리펩티드에 단백질분해효소 혼합 용액을 첨가하여 시작하였다. EPO 폴리펩티드는 37℃ 에서 단백질분해효소와 배양하였다. 상이한 키네틱 시점에서 각 시료의 분획을 얻었으며 단백질분해를 중단시키기 위해 항단백질분해효소 혼합액(mini EDTA free, 제조사: Roche - 한 정제를 10% FCS를 포함하는 10mL RPMI에 녹였다)을 첨가하였다. 각 시료는 -80℃에서 냉동시키고, 각 시료의 남아있는 EPO 농도는 Quantikine IVD human EPO ELISA kit(제조사: R&D Systems, UK)를 사용하여 측정하였다. 그 후 단백질분해 전 초기 농도에 따른 백분율을 결정하였다.
1. 단백질분해에 증가된 저항성을 가지는 부분적으로 탈-당화된 N38H EPO 변이체 생산
첫번째 실험 과정으로 N38H 돌연변이체에 기인하여 부분적으로 탈-당화된 단백질분해효소에 저항성이 있는 EPO 폴리펩티드를 규명하였다. N38H 돌연변이체를 포함하는 부분적으로 탈-당화된 EPO 폴리펩티드에서 확인된 단백질분해 민감성을 회복시키기 위해, 실시예 2 내지 4에서 동정된 선택된 LEAD 돌연변이를 N38H 변이체 폴리펩티드로 순차적으로 삽입하였고, 단백질분해에 대한 저항성을 실험하였다. 완전히 당화되거나 당화가 없는 (예, 완전히 탈-당화) EPO 폴리펩티드를 함께 실험하였다.
R139H 돌연변이체가 N38H/R139H EPO 변이체 (서열번호 247)를 생산하기 위해 N38H 변이체에 첫번째로 삽입되었다. 상기한 바와 같이, N38H 변이체, 완전히 당화된 폴리펩티드, 탈-당화된 폴리펩티드 또한 단백질 분해에 대한 저항성이 분석되었다. N38H와 R139H 돌연변이체 모두를 포함하는 EPO 변이체는 완전히 당화된 천영형EPO와 유사한 정도의 단백질분해 민감도를 보였다. 단백질 분해 1시간 후에 존재하는 완전히 당화된 EPO와 부분적으로 탈-당화된 N38H/R139H EPO 변이체의 농도는 각각 초기 농도의 48%, 44% 였다. 비교하면, 보호되지 않은 N38H 변이체의 17% 만이 단백질분해 1시간후에 남아있었다. 기본적으로 완전히 탈-당화된 모든 EPO 폴리펩티드는 반응 1시간 동안 단백질분해효소에 의해 절단되었다. 단백질분해 2시간 후에는 보호되지않은 N38H 변이체는 단지 2%만이 남아있었고, 반면 완전히 당화된 EPO와 부분적으로 탈-당화된 N38H/R139H EPO 변이체는 각각 15%와 14%가 남아있었다. 이 결과는 R139H 돌연변이가 N38 아미노산 위치에서의 당화가 EPO 폴리펩티드에 부여하는 보호적 효과를 대체할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 2 내지 4에서 규명되어 LEAD에 포함된 추가적인 돌연변이체를 N38H와 R139H 돌연변이를 포함하는 EPO 변이체에 삽입하여 세자리의 돌연변이 EPO 폴리펩티드를 만들었다. N38H/R139H 두자리의 돌연변이와 R4H (서열번호 248), L93I (서열번호 249), K20Q (서열번호 250), E159N (서열번호 251), K52N (서열번호 252) 및 L153V (서열번호 253) 각각을 포함하는 EPO 폴리펩티드를 만들고, 다양한 단백질분해에 대한 민감성을 평가하였다. 몇몇 경우에, 추가적인 단백질분해효소에 민감한 위치를 제거하기 위해 수행한 N38H/R139H EPO 변이체로의 LEAD 돌연변이 삽입은 N38H/R139H 두자리 돌연변이체, 그리고 완전히 당화된 천연형EPO와 비교하여 단백질분해 저항성이 증가되는 결과를 보였다. 단백질분해 1시간 후에 N38H/R139H 변이체와 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드는 약 46%가 남아있었다. N38H/R139H/R4H, N38H/R139H/K52N 또는 N38H/R139H/L93I 돌연변이를 포함하는 변이체에서는 유사하거나 또는 약간 더 좋은 결과가 얻어졌다. 단백질분해 1시간 후의 부분적으로 탈-당화된 N38H/R139H/L153V및 N38H/R139H/E159N 변이체의 농도는 초기 농도의 약 60% 였다. 세자리의 N38H/R139H/K20Q 변이체는 단백질분해 1시간 후에 64%의 단백질이 남아있어 단백질분해에 가장 저항성이 높은 변이체로 확인되었다. 단백질분해효소와 2시간 반응후 N38H/R139H 돌연변이체와 완전히 당화된 천연형 EPO가 각각 약 14%, 18% 남아있는 반면 N38H/R139H/K20Q 변이체는 43%가 남아있었다.
2. 단백질분해에 증가된 저항성을 가지는 부분적으로 탈-당화된 N38H/N83H EPO 변이체 생산
두번째 실험 단계는 N38과 N83 모두의 돌연변이에 의해 부분적으로 탈-당화된 단백질분해효소-저항성 EPO 폴리펩티드를 규명하였다. R139H 돌연변이를 N38H/N83H 두자리가 돌연변이된EPO 변이체 안으로 삽입하였다. 이를 통해 얻은 N38H/N83H/R139H 변이체(서열번호 254)가 네자리 돌연변이 K20Q/N38H/N83H/R139H (서열번호 255)를 만들기 위해 K20Q와 같은 추가적인 돌연변이가 도입되는 주형으로 사용되었다. EPO 변이체는 CHO 세포에서 발현되어 상기한 바와 같이 단백질분해 저항성을 분석하였다. 한자리에서의 N38H 돌연변이 또는 두 자리에서의 N38H/R139H돌연변이, 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드, 및 부분적으로 탈-당화된EPO 폴리펩티드를 포함하는 EPO 변이체들에 대한 단백질분해효소 저항성을 분석하였다. N38H/R139H 변이체와 완전히 당화된 EPO 단백질이 단백질분해 1시간 후에 각각45%와 49% 남아있었던 반면, N38H/N83H/R139H 변이체는 단지 17% 가 전자들과 비교하였을 때 단백질분해 저항성이 감소한 것으로 보였다. 이는 N83 위치에서의 당화가 EPO 폴리펩티드에 단백질분해에 대한 보호효과를 얼마나 크게 부여하는지를 알려준다. 그러나, 이 보호 효과는 K20Q 돌연변이 삽입을 통해 회복되어졌다. 네자리에서의 K20Q/N38H/N83H/R139H 돌연변이체는 N38H/R139H 변이체와 완전히 당화된 EPO 단백질에서 관찰될 정도의 단백질분해 저항성을 보였다. 단백질분해 1시간 후에 K20Q/N38H/N83H/R139H 변이체의 48%가 남아있었다. 단백질분해 2시간 후에는 21%가 남았으며, 이는 N38H/R139H 변이체(16%)보다 약간 높고 완전히 당화된 EPO 단백질(25%)보다는 약간 낮았다.
3. 단백질분해에 증가된 저항성을 가지는 부분적으로 탈-당화된 N38H/N83H EPO 변이체의 생산
세번째 실험 과정은 단백질분해 저항성을 증가시키기위한 이 돌연변이체들의 능력을 평가하기 위하여, N38H/N83H/R139H 변이체를 주형으로 사용하여 추가적인 돌연변이를 삽입하였 다. N38H/N83H/R139H와 L93V (서열번호 256), L80I (서열번호 257) 또는 L93I (서열번호 258)을 각각 포함하는 EPO 변이체들을 제작하고 CHO 세포에서 발현하였다. 변이체들에 대한 단백질분해효소에 대한 저항성을 분석하였으며, 이때 N38H/N83H/R139H 변이체, 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드 및 부분적으로 탈-당화된 EPO 폴리펩티드들도 분석하였다. N38H/N83H/R139H에 L93V, L80I, L93I 돌연변이 중 어떤 것을 삽입하여도 N38H/N83H/R139H돌연변이체와 비교하여 단백질분해효소에 저항성이 증가하였다. 단백질분해 1시간 후에 N38H/N83H/R139H의 26%가 남아있었고, 완전히 당화된 천연형 EPO는 46% 남아있었다. 이와 비교하면, N38H/N83H/R139H/L93I, N38H/N83H/R139H/L80I 및 N38H/N83H/R139H/L93V 변이체는 각각 30%, 37%, 45%가 단백질분해효소와 1시간 반응 시킨 후에도 남아있었다. 단백질분해 2시간 후에 완전히 당화된 단백질은 14% 및 N38H/N83H/R139H 변이체는 4% 남아있던 반면, N38H/N83H/R139H/L80I 및N38H/N83H/R139H/L93V는 8%, N38H/N83H/R139H/L93I변이체는 3% 남아있었다.
네자리에서의 돌연변이체 (N38H/R139H/N83H/L80I (서열번호 257), N38H/R139H/N83H/L93I (서열번호 258) and N38H/R139H/N83H/L93V (서열번호 256)) 각각은 "Umbrella 83" 변이체로 명명하였고, K20Q 치환을 삽입하는 추가적인 돌연변이를 위한 주형으로 사용되었다. 이를 통해 다음의 변이체를 제조하였다:
K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H (서열번호 259);
K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H (서열번호 260);
및K20Q/N38H/N83H/L93V/R139H (서열번호 261).
이 변이체들 또한 상기한 바와 같은 분석을 통해 단백질분해효소 저항성이 평가되었다. Umbrella 83 변이체로 K20Q 돌연변이를 삽입하였을 때 N38H/N83H/R139H 변이체와 비교하여 EPO 폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성이 증가하였다. 단백질분해 1시간 후에 N38H/N83H/R139H변이체는 초기 농도의 37%가 남아 있었다. 이와 비교하면, K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H와 K20Q/N38H/N83H/L93V/R139H변이체는58%, K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H 변이체는 71%가 남아있었다. 단백질분해효소 저항성에 대한 이 수준은 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드(71% 잔존)와 동등한 수준이었다.
4. 단백질분해에 증가된 저항성을 가지는 완전히 탈-당화된N24H/N38H/N83H EPO 변이체 생성
상기의 1-3에서 개시된 세 과정을 통해 부분적으로 탈-당화된 EPO 폴리펩티드에 현저한 단백질분해효소 저항성을 부여하는 돌연변이체들을 확인하였다. 특히 K20 is-HIT 위치는 단백질분해에 중요한 위치로 나타났으며, 이 위치의 적절한 돌연변이는 N38 및/또는 N83 위치의 돌연변이를 포함하는 부분적으로 탈-당화된 EPO 폴리펩티드에 증가된 단백질분해효소 저항성을 부여할 수 있다는 것을 보여준다. 다른 N-당화 위치, 즉 N24에 가까운 접근성 때문에, K20H 돌연변이는 24 위치에서의 탈-당화에 대한 보호 효과를 보일지도 모른다. 탈-당화된 EPO폴리펩티드의 단백질분해효소 저항성 부여에 관여하는 K20H 돌연변이와 다른 LEAD 돌연변이의 능력을 평가하기위해 각 N-당화 위치를 돌연변이 시킨 일련의 변이체들을 제조하였다.
첫번째 일련의 변이체는 Umbrella 83 변이체 (상기 실시예 6.3)에 N24H 돌연변이를 삽입하였다. 그 결과로 만들어진 완전히 탈-당화된 EPO 변이체는 다음의 돌연변이체를 포함한다:
N24H/N38H/N83H/R139H/L80I (서열번호 262);
N24H/N38H/N83H/R139H/L93I (서열번호 263); 또는 N24H/N38H/N83H/R139H/L93V (서열번호 264).
이 변이체들과 N38H, N38H/R139H, 및 N38H/N83H/R139H 변이체, 완전히 당화된 천연형 폴리펩티드, 탈-당화된 폴리펩티드를 함께 단백질분해효소 저항성을 평가하였다. 돌연변이유발에 의한 N-24 당화 위치의 제거는 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드와 부분적으로 탈-당화된 N38H/R139H 변이체와 비교하여 EPO 변이체의 저항성을 감소시켰다. 그러나 특징적으로 완전히 탈-당화된 대조 EPO 폴리펩티드와 비교하면 저항성이 높은 것으로 나타났다. 완전히 당화된EPO와 부분적으로 탈-당화된 N38H/R139H와 N38H EPO변이체의 단백질분해 1시간후에 남아있는 농도는 초기 농도 대비 각각 70%, 62%, 27% 였다. 단지 완전히 탈-당화된 천연형EPO 폴리펩티드의 4%만이 반응 1시간 후에 단백질분해효소에 의해 절단되지 않고 남아있었다. 이와 비교하면 탈-당화된 N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, N24H/N38H/N83H/R139H/L80I 및N24H/N38H/N83H/R139H/L93V 변이체는 반응 1시간후에 21%, 22%, %가 남아있었다.
상기한 바와 같이 완전히 탈-당화된 변이체에 대한 K20Q 돌연변이의 보호적 효과를 평가하기 위해 N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, 또는 N24H/N38H/N83H/R139H/L93V 변이체들을 주형으로 하여 K20Q 돌연변이를 제조하였다. 이를 통해 얻은 탈-당화된 EPO 변이체는 다음의 돌연변이체를 포함한다:
K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I (서열번호 265); K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I (서열번호 266); 또는
K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V (서열번호 267).
이 변이체들과 N38H, N38H/R139H, N38H/N83H/R139H 변이체, 완전히 당화된 천연형 폴리펩티드, 탈-당화된 폴리펩티드를 함께 단백질분해에 대한 저항성을 평가하였다. 탈-당화된K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, 및 K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V 변이체는, 단백질분해효소에 의해 절단되지 않고 남아있는 폴리펩티드의 양이 35 내지 42%로써, N38H/N83H/R139H 변이체에서 관찰된 것과 유사한 단백질분해효소 저항성을 보였다. 이와 같은 저항성 수준은 보호적 돌연변이를 전혀 포함하지 않는 완전히 탈-당화된 EPO 폴리펩티드(4% 잔존)에서 관찰된 것보다 훨씬 높은 것이다. 그러나 완전히 당화된 천연형 EPO폴리펩티드 (71% 잔존)와 부분적으로 탈-당화된 N38H/R139H 변이체 (62% 잔존)에서 보여지는 것보다 낮았다.
완전히 당화가 제거된 EPO 폴리펩티드가 단백질분해로부터 보호될 수 있는지 확인하기 위해 추가적인 LEAD 돌연변이를 탈-당화된 변이체에 도입하였다. 이를 통해 얻은 탈-당화된 EPO 변이체는 다음을 포함한다:
R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I (서열번호 268); E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I (서열번호 269); K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V (서열번호 270); L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I (서열번호 271) 및 E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I (서열번호 272).
이 변이체들과 N38H, N38H/R139H, N38H/N83H/R139H 변이체, 천연형 완전히 당화된 폴리펩티드, 탈-당화된 폴리펩티드를 함께 단백질분해 저항성을 평가하였다. 새로운 변이체들 각각은 완전히 당화된 천연형 EPO 폴리펩티드와 비교하였을 때 동등하거나 약간 더 높은 정도의 단백질분해 저항성을 보였다. 단백질분해 1시간 후에 폴리펩티드의 초기 농도 대비 잔존량 백분율은
E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I는 75%, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V는 76%, R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I와 L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I는 79%, 그리고 E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I는 81%였다.
비교하면, 단지 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드는 단백질분해 1시간 후에 71%가 남아있었고, 완전히 탈-당화된 EPO는 단지 4%만이 남아있었다. 단백질분해 2.5시간 후에 남아있는 EPO의 초기 농도 대비 백분율은 K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V는24 %, L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I와 E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I 와 E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I는 25%, 그리고R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I는 27%였다.
비교하면, 완전히 당화된 EPO 폴리펩티드의 2시간 반응 후에 남아있는 양은 23%이며 완전히 탈-당화된 EPO는 전혀 남아있지 않았다.
변형은 당업자에게 명백하기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정되어야 한다.
도1은 에리스로포이에틴 구조의 두가지 모습 (A와 B)을 리본형 구조(ribbon representation)로 나타낸다. N24, N38, 그리고 N83의 3개의 N-연결 당화 위치들과 단백질분해효소 저항성을 위한 변형을 위해 선택된 대표적인 상응하는 잔기들 (각 각 K20Q, R139H 그리고 L80I)은 공간채움형 구조로 나타내었다. 단백질분해효소 저항성을 위해 선택된 추가적인 잔기들 또한 공간채움형 구조(space filling representation)로 나타내졌다(예: R4H, L153V, E159N).
<110> Nautilus Biotech, S.A. <120> MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF FOR TREATMENT <130> P09-056-HAN <150> US60/861,615 <151> 2006-11-28 <160> 310 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(193) <223> human EPO - immature protein <400> 1 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> Human EPO - mature protein <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_1_P2S <400> 3 Ala Ser Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_2_P2A <400> 4 Ala Ala Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_3_P3S <400> 5 Ala Pro Ser Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 6 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_4_P3A <400> 6 Ala Pro Ala Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 7 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_5_R4H <400> 7 Ala Pro Pro His Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 8 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_6_R4Q <400> 8 Ala Pro Pro Gln Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 9 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_7_C7S <400> 9 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Ser Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 10 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_8_C7V <400> 10 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Val Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 11 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_9_D8Q <400> 11 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Gln Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 12 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_10_D8H <400> 12 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys His Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 13 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_11_R10H <400> 13 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser His Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 14 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_12_R10Q <400> 14 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Gln Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 15 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_13_L12V <400> 15 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Val Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 16 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_14_L12I <400> 16 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Ile Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 17 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_15_E18Q <400> 17 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 18 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_16_E18H <400> 18 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu His Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 19 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_17_K20Q <400> 19 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 20 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_18_K20T <400> 20 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Thr Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 21 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_19_E21Q <400> 21 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Gln Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 22 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_20_E21H <400> 22 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys His Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 23 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_21_E23Q <400> 23 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Gln Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 24 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_22_E23H <400> 24 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala His Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 25 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_23_C29S <400> 25 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Ser Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 26 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_24_C29V <400> 26 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Val Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 27 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_25_E31Q <400> 27 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Gln His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 28 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_26_E31H <400> 28 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala His His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 29 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_27_L35V <400> 29 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Val Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 30 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_28_L35I <400> 30 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Ile Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 31 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_29_E37Q <400> 31 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Gln Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 32 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_30_E37H <400> 32 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn His Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 33 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_31_P42S <400> 33 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Ser Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 34 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_32_P42A <400> 34 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Ala Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 35 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_33_D43Q <400> 35 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Gln Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 36 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_34_D43H <400> 36 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro His Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 37 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_35_K45Q <400> 37 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Gln Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 38 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_36_K45T <400> 38 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Thr Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 39 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_37_F48I <400> 39 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ile 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 40 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_38_F48V <400> 40 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Val 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 41 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_39_Y49H <400> 41 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 His Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 42 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_40_Y49I <400> 42 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Ile Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 43 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_41_W51S <400> 43 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Ser Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 44 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_42_W51H <400> 44 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala His Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 45 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_43_K52Q <400> 45 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Gln Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 46 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_44_K52T <400> 46 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Thr Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 47 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_45_R53H <400> 47 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys His Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 48 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_46_R53Q <400> 48 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Gln Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 49 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_47_M54V <400> 49 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Val Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 50 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_48_M54I <400> 50 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Ile Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 51 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_49_E55Q <400> 51 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Gln Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 52 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_50_E55H <400> 52 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met His Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 53 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_51_E62Q <400> 53 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Gln Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 54 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_52_E62H <400> 54 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val His Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 55 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_53_W64S <400> 55 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Ser 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 56 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_54_W64H <400> 56 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val His 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 57 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_55_L69V <400> 57 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Val Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 58 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_56_L69I <400> 58 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Ile Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 59 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_57_E72Q <400> 59 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Gln Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 60 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_58_E72H <400> 60 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser His Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 61 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_59_L75V <400> 61 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Val Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 62 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_60_L75I <400> 62 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Ile Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 63 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_61_R76H <400> 63 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu His Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 64 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_62_R76q <400> 64 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Gln Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 65 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_63_L80V <400> 65 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Val 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 66 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_64_L80I <400> 66 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 67 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_65_P87S <400> 67 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Ser Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 68 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_66_P87A <400> 68 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Ala Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 69 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_67_W88S <400> 69 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 70 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_68_W88H <400> 70 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro His Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 71 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_69_E89Q <400> 71 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Gln Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 72 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_70_E89H <400> 72 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp His Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 73 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_71_P90S <400> 73 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Ser Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 74 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_72_P90A <400> 74 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Ala Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 75 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_73_L93V <400> 75 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Val His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 76 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_74_L93I <400> 76 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 77 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_75_D96Q <400> 77 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Gln 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 78 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_76_D96H <400> 78 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val His 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 79 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_77_K97Q <400> 79 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Gln Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 80 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_78_K97T <400> 80 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Thr Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 81 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_79_L102V <400> 81 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Val Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 82 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_80_L102I <400> 82 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Ile Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 83 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_81_R110H <400> 83 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu His Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 84 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_82_R110Q <400> 84 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Gln Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 85 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_83_L122V <400> 85 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Val 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 86 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_84_L122I <400> 86 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Ile 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 87 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_85_K116Q <400> 87 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Gln Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 88 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_86_K116T <400> 88 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Thr Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 89 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_87_P121S <400> 89 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Ser Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 90 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_88_P121A <400> 90 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 91 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_89_P122S <400> 91 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Ser Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 92 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_90_P122A <400> 92 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 93 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_91_D123Q <400> 93 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Gln Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 94 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_92_D123H <400> 94 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro His Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 95 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_93_P129S <400> 95 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Ser Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 96 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_94_P129A <400> 96 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 97 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_95_L130V <400> 97 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Val Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 98 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_96_L130I <400> 98 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Ile Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 99 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_97_R131H <400> 99 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu His Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 100 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_98_R131Q <400> 100 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Gln Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 101 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_99_D136Q <400> 101 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Gln Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 102 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_100_D136H <400> 102 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala His Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 103 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_101_R143H <400> 103 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe His Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 104 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_102_R143Q <400> 104 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Gln Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 105 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_103_Y145H <400> 105 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 His Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 106 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_104_Y145I <400> 106 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Ile Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 107 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_105_R150H <400> 107 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu His Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 108 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_106_R150Q <400> 108 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Gln Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 109 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_107_K152Q <400> 109 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Gln Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 110 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_108_K152T <400> 110 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Thr Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 111 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_109_K154Q <400> 111 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Gln Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 112 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_110_K154T <400> 112 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 113 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_111_L155V <400> 113 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 114 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_112_L155I <400> 114 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Ile Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 115 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_113_E159Q <400> 115 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Gln Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 116 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_114_E159H <400> 116 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly His Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 117 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_115_R162H <400> 117 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys His Thr Gly Asp Arg 165 <210> 118 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_116_R162Q <400> 118 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Gln Thr Gly Asp Arg 165 <210> 119 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_117_C29A <400> 119 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Ala Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 120 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_118_C29I <400> 120 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Ile Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 121 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_119_C29T <400> 121 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Thr Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 122 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_120_C7A <400> 122 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Ala Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 123 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_121_C7I <400> 123 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Ile Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 124 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_122_C7T <400> 124 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Thr Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 125 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_123_D123N <400> 125 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asn Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 126 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_124_D136N <400> 126 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asn Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 127 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_125_D43N <400> 127 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asn Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 128 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_126_D96N <400> 128 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asn 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 129 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_127_E159N <400> 129 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Asn Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 130 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_128_E18N <400> 130 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Asn Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 131 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_129_E21N <400> 131 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Asn Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 132 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_130_E23N <400> 132 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Asn Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 133 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_131_E31N <400> 133 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Asn His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 134 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_132_E37N <400> 134 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Asn Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 135 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_133_E55N <400> 135 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Asn Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 136 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_134_E62N <400> 136 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Asn Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 137 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_135_E72N <400> 137 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Asn Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 138 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_136_E89N <400> 138 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Asn Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 139 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_137_K116N <400> 139 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Asn Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 140 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_138_K152N <400> 140 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Asn Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 141 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_139_K154N <400> 141 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Asn Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 142 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_140_K20N <400> 142 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Asn Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 143 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_141_K45N <400> 143 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Asn Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 144 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_142_K52N <400> 144 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Asn Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 145 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_143_K97N <400> 145 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Asn Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 146 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_144_D8N <400> 146 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asn Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 147 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_145_D165Q <400> 147 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Gln Arg 165 <210> 148 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_146_D165H <400> 148 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly His Arg 165 <210> 149 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_147_D165N <400> 149 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asn Arg 165 <210> 150 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_148_R166H <400> 150 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp His 165 <210> 151 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_149_R166Q <400> 151 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Gln 165 <210> 152 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_354_L5I <400> 152 Ala Pro Pro Arg Ile Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 153 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_355_L5V <400> 153 Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 154 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_356_E13Q <400> 154 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Gln Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 155 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_357_E13H <400> 155 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu His Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 156 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_358_E13N <400> 156 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Asn Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 157 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_359_R14H <400> 157 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu His Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 158 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_360_R14Q <400> 158 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Gln Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 159 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_361_Y15H <400> 159 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg His Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 160 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_362_Y15I <400> 160 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ile Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 161 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_363_L16I <400> 161 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 162 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_364_L16V <400> 162 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Val 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 163 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_365_L17I <400> 163 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Ile Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 164 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_366_L17V <400> 164 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Val Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 165 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_367_L67I <400> 165 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Ile Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 166 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_368_L67V <400> 166 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Val Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 167 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_369_L70I <400> 167 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Ile Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 168 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_370_L70V <400> 168 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Val Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 169 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_371_L81I <400> 169 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Ile Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 170 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_372_L81V <400> 170 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Val Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 171 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_373_L91I <400> 171 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Ile Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 172 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_374_L91V <400> 172 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Val Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 173 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_375_R103H <400> 173 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu His Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 174 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_376_R103Q <400> 174 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Gln Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 175 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_377_L105I <400> 175 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Ile Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 176 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_378_L105V <400> 176 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Val Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 177 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_379_L108I <400> 177 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ile Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 178 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_380_L108V <400> 178 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 179 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_381_L109I <400> 179 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Ile Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 180 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_382_L109V <400> 180 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Val Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 181 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_383_E117Q <400> 181 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Gln Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 182 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_384_E117H <400> 182 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys His Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 183 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_385_E117N <400> 183 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Asn Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 184 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_386_F138I <400> 184 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ile Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 185 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_387_F138V <400> 185 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Val Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 186 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_388_R139H <400> 186 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 187 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_389_R139Q <400> 187 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Gln Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 188 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_390_K140N <400> 188 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Asn Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 189 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_391_K140Q <400> 189 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Gln Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 190 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_392_L141I <400> 190 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Ile Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 191 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_393_L141V <400> 191 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Val Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 192 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_394_F142I <400> 192 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Ile Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 193 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_395_F142V <400> 193 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Val Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 194 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_396_F148I <400> 194 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Ile Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 195 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_397_F148V <400> 195 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Val Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 196 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_398_L149I <400> 196 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Ile Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 197 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_399_L149V <400> 197 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Val Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 198 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_400_L153I <400> 198 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Ile Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 199 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_401_L153V <400> 199 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 200 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_402_Y156H <400> 200 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu His Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 201 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO_403_Y156I <400> 201 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Ile Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 202 <211> 192 <212> PRT <213> Macaca mulatta <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Rhesus macaque EPO <400> 202 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Val Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Val Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ser Glu Ser Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Ile Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Val Leu Ala Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Phe Glu Pro Leu Gln Leu His Met Asp Lys Ala Ile Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Ile Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Glu Ala 130 135 140 Ile Ser Leu Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr 145 150 155 160 Ala Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 203 <211> 192 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Mouse EPO <400> 203 Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Pro Glu Thr Leu Gln Leu His Ile Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Val Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Arg Thr Leu Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 204 <211> 192 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Rat EPO <400> 204 Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Lys Val Glu Glu Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Gln Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Pro Glu Ser Leu Gln Leu His Ile Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Val Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Met Ser Pro Pro Asp Ala Thr Gln Ala Ala Pro Leu Arg Thr Leu Thr 145 150 155 160 Ala Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 205 <211> 194 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(194) <223> Pig EPO <400> 205 Met Gly Ala Arg Glu Cys Pro Ala Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Gly 35 40 45 Glu Asn Ala Thr Met Gly Cys Ala Glu Ser Cys Ser Phe Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Glu Val Gln Gln Gln Ala Met Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Gln Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Ala Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Pro Asp Ala Ser Pro Ser Ser Ala Thr Pro Leu Arg Thr 145 150 155 160 Phe Ala Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Asn Tyr Ser Asn Phe 165 170 175 Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Arg 180 185 190 Asp Arg <210> 206 <211> 206 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(206) <223> Dog EPO <400> 206 Met Cys Glu Pro Ala Pro Pro Lys Pro Thr Gln Ser Ala Trp His Ser 1 5 10 15 Phe Pro Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp 35 40 45 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn 50 55 60 Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr 65 70 75 80 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val 85 90 95 Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu 100 105 110 Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro Ser 115 120 125 Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Met Ser 145 150 155 160 Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp 165 170 175 Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys 180 185 190 Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 195 200 205 <210> 207 <211> 192 <212> PRT <213> Felis silvestris catus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Cat EPO <400> 207 Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Gly Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 208 <211> 195 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(195) <223> Rabbit EPO <400> 208 Met Gly Val Arg Gly Arg Leu Ala Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Val Leu Ala Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Ala Arg 20 25 30 Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Leu Gly 50 55 60 Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe His His Trp Lys 65 70 75 80 Lys Ser Glu Ala Gly Arg His Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala 85 90 95 Leu Leu Ser Glu Ala Met Leu Arg Ser Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser 100 105 110 Ser Gln Leu Pro Glu Thr Leu Gln Val His Val Asp Lys Ala Val Ser 115 120 125 Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Val Gln Lys 130 135 140 Glu Ala Val Ser Pro Pro Glu Ala Ala Ser Ser Ala Ala Pro Leu Arg 145 150 155 160 Thr Val Ala Ala Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn 165 170 175 Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg 180 185 190 Gly Asp Arg 195 <210> 209 <211> 192 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Bovine EPO <400> 209 Met Gly Ala Arg Asp Cys Thr Pro Leu Leu Met Leu Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Phe Pro Leu Gly Phe Pro Val Leu Gly Ala Pro Ala Arg Leu Ile Cys 20 25 30 Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu 35 40 45 Asn Ala Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Asn Glu Asn Ile 50 55 60 Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu 65 70 75 80 Val Gln Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser 85 90 95 Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Glu Ala Leu Arg Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile 130 135 140 Ser Leu Pro Asp Ala Thr Pro Ser Ala Ala Pro Leu Arg Ala Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Ala Leu Ser Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 210 <211> 192 <212> PRT <213> Equus caballus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Horse EPO <400> 210 Met Gly Val Arg Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Gly Glu Asn 50 55 60 Val Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ser Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Glu Val Glu Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Gln Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Leu Arg Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Ala 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 211 <211> 194 <212> PRT <213> Ovis aries <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(194) <223> Sheep EPO <400> 211 Met Gly Ala Arg Asp Cys Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Phe 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ala Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gln Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Ile Phe Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser 100 105 110 Gln Pro Cys Glu Ala Leu Arg Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Pro Leu Pro Asp Ala Thr Pro Ser Ala Ala Pro Leu Arg Ile 145 150 155 160 Phe Thr Val Asp Ala Leu Ser Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe 165 170 175 Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly 180 185 190 Asp Arg <210> 212 <211> 133 <212> PRT <213> Pan troglodytes <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(133) <223> Chimpanzee EPO (fragment) <400> 212 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn 1 5 10 15 Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr 20 25 30 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 35 40 45 Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu 50 55 60 Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Leu 65 70 75 80 Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 85 90 95 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser 100 105 110 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp 115 120 125 Thr Phe Arg Lys Leu 130 <210> 213 <211> 183 <212> PRT <213> Brachydanio rerio <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(183) <223> Zebrafish EPO <400> 213 Met Phe His Gly Ser Gly Leu Phe Ala Leu Leu Leu Met Val Leu Glu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Pro Gly Leu Ser Ser Pro Leu Arg Pro Ile Cys Asp Leu 20 25 30 Arg Val Leu Asp His Phe Ile Lys Glu Ala Trp Asp Ala Glu Ala Ala 35 40 45 Met Arg Thr Cys Lys Asp Asp Cys Ser Ile Ala Thr Asn Val Thr Val 50 55 60 Pro Leu Thr Arg Val Asp Phe Glu Val Trp Glu Ala Met Asn Ile Glu 65 70 75 80 Glu Gln Ala Gln Glu Val Gln Ser Gly Leu His Met Leu Asn Glu Ala 85 90 95 Ile Gly Ser Leu Gln Ile Ser Asn Gln Thr Glu Val Leu Gln Ser His 100 105 110 Ile Asp Ala Ser Ile Arg Asn Ile Ala Ser Ile Arg Gln Val Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Ser Ile Pro Glu Tyr Val Pro Pro Thr Ser Ser Gly Glu Asp 130 135 140 Lys Glu Thr Gln Lys Ile Ser Ser Ile Ser Glu Leu Phe Gln Val His 145 150 155 160 Val Asn Phe Leu Arg Gly Lys Ala Arg Leu Leu Leu Ala Asn Ala Pro 165 170 175 Val Cys Arg Gln Gly Val Ser 180 <210> 214 <211> 185 <212> PRT <213> Fugu rubripes <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(185) <223> Japanese pufferfish EPO <400> 214 Met Leu Gln Lys Thr Gly Arg Gly Leu Leu Ala Phe Leu Leu Ile Val 1 5 10 15 Leu Glu Trp Thr Gln Pro Ser Leu Pro Ser Pro Leu Arg Pro Ile Cys 20 25 30 Asp Leu Arg Val Leu Asn His Phe Ile Lys Glu Ala Gln Asp Ala Glu 35 40 45 Ala Ala Met Lys Leu Cys Ser Glu Gly Cys Thr Leu Ser Asp Ser Val 50 55 60 Ile Val Pro Gln Thr Thr Val Glu Phe Asp Val Trp Glu Lys Lys Ser 65 70 75 80 Ala Leu Ala Lys Ala Gln Glu Val Gln Ser Gly Leu Trp Leu Leu Gln 85 90 95 Glu Ala Phe Asn Phe Leu Arg Thr Ser Val Thr Asn Thr Ala Leu His 100 105 110 Ser His Ile Asp Asn Ser Val Arg Asn Leu Leu Ser Val Asn Ala Val 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Asn Ile Gln Glu Phe Thr Pro Pro Ala Ser Ala Ala 130 135 140 Glu Ile Glu Gly Thr Trp Arg Val Ser Thr Ala Thr Glu Leu Leu Gln 145 150 155 160 Val His Ile Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Arg Leu Ile Leu Leu Asp 165 170 175 Ala Gln Ala Cys Gln Gln Asp Val Ser 180 185 <210> 215 <211> 192 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Crab eating macaque (Cynomolgus monkey) EPO <400> 215 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Val Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ser Glu Ser Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Val Leu Ala Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Phe Glu Pro Leu Gln Leu His Met Asp Lys Ala Ile Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Ile Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Glu Ala 130 135 140 Ile Ser Leu Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr 145 150 155 160 Ala Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 216 <211> 152 <212> PRT <213> Oryzias melastigma <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(152) <223> Indian medaka EPO (fragment) <400> 216 Pro Arg Val Leu Lys His Phe Ile Gln Glu Ala Gln Asp Ala Glu Val 1 5 10 15 Ala Met Arg Ser Cys Arg Glu Gly Cys Gly Leu Ser Gln Thr Val Ser 20 25 30 Val Pro Gln Thr Thr Val Asn Tyr Asp Asp Trp Glu Lys Lys Asp Gly 35 40 45 Leu Glu Lys Ala Gln Glu Val Gln Thr Gly Leu Trp Leu Leu Gln Gln 50 55 60 Ala Leu Asp Leu Leu Gly Pro Ser Val Thr Asn Thr Ala Leu Asn Asn 65 70 75 80 His Ile Asp Asn Thr Val Arg Asn Leu Val Ser Ile Asn Ala Val Leu 85 90 95 Arg Ser Leu Asn Phe Gln Glu Tyr Thr Pro Pro Thr Asn Val Thr Ser 100 105 110 Leu Asp Gly Thr Trp Arg Val Ser Ser Ala Thr Glu Leu Leu Gln Val 115 120 125 His Val Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Gly Leu Leu Leu Ser Gly Ala 130 135 140 Pro Ala Cys Gln His Asn Val Ser 145 150 <210> 217 <211> 182 <212> PRT <213> Cyprinus carpio <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(182) <223> Common carp EPO-I <400> 217 Met Gln Ile Thr Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Met Val Leu Glu Trp 1 5 10 15 Thr Arg Pro Gly Leu Ser Ser Pro Leu Arg Pro Ile Cys Asp Leu Arg 20 25 30 Val Leu Asp His Phe Ile Lys Glu Ala Trp Asp Ala Glu Ala Ala Met 35 40 45 Arg Ala Cys Lys Asp Ala Cys Ser Ile Ala Thr Asn Phe Thr Val Pro 50 55 60 Leu Thr Arg Val Asp Phe Asp Val Trp Glu Ala Met Asn Ile Glu Glu 65 70 75 80 Arg Ala Gln Glu Val Gln Ser Gly Leu His Val Leu Asn Glu Ala Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Ser Asn Gln Thr Asp Val Leu Gln Ser His Val 100 105 110 Asp Ala Ser Ile Ser Asn Ile Ala Ser Ile Arg Gln Val Leu Arg Ser 115 120 125 Leu Ser Ile Pro Glu Tyr Val Pro Pro Thr Ser Gly Gly Glu Asp Lys 130 135 140 Glu Met Gln Ile Val Ser Ser Ile Ser Glu Leu Phe Gln Val His Ile 145 150 155 160 Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Arg Leu Leu Thr Arg Ser Ala Pro Ile 165 170 175 Cys His Gln Gly Val Ser 180 <210> 218 <211> 136 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(136) <223> Rainbow trout EPO (fragment) <400> 218 Ile Cys Asp Leu Ser Val Leu Asn His Phe Ile Lys Glu Ala Trp Asp 1 5 10 15 Ala Glu Ala Ala Met Arg Ala Cys Lys Asp Ala Cys Ser Ile Ala Thr 20 25 30 Asn Phe Thr Val Pro Leu Thr Arg Val Asp Phe Asp Val Trp Glu Ala 35 40 45 Met Asn Ile Glu Glu Arg Ala Gln Glu Val Gln Ser Gly Leu His Val 50 55 60 Leu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Ala Ser Asn Gln Thr Asp Val 65 70 75 80 Leu Gln Ser His Ile Asp Ala Ser Ile Ser Asn Ile Ala Ser Ile Arg 85 90 95 Gln Val Leu Arg Ser Leu Ser Ile Pro Glu Tyr Val Pro Pro Thr Ser 100 105 110 Gly Gly Glu Asp Lys Glu Met Gln Ile Val Ser Ser Ile Ser Glu Leu 115 120 125 Phe Gln Val His Ile Asn Phe Leu 130 135 <210> 219 <211> 183 <212> PRT <213> Cyprinus carpio <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(183) <223> Common carp EPO <400> 219 Met Phe His Gly Ser Gly Leu Phe Ala Leu Leu Leu Ile Val Leu Glu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Pro Gly Leu Ser Ser Pro Leu Arg Pro Ile Cys Asp Leu 20 25 30 Arg Val Leu Asp His Phe Ile Lys Glu Ala Trp Asp Ala Glu Ala Ala 35 40 45 Met Arg Ala Cys Lys Asp Ala Cys Ser Ile Ala Thr Asn Phe Thr Val 50 55 60 Pro Leu Thr Arg Val Asp Phe Asp Val Trp Glu Ala Met Asn Ile Glu 65 70 75 80 Glu Arg Ala Gln Glu Val Gln Ser Gly Leu His Val Leu Asn Glu Ala 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Ser Asn Gln Thr Asp Val Leu Gln Ser His 100 105 110 Ile Asp Ala Ser Ile Ser Asn Ile Ala Ser Ile Arg Gln Val Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Ser Ile Pro Glu Tyr Val Pro Pro Thr Ser Gly Gly Glu Asp 130 135 140 Lys Glu Met Gln Ile Val Ser Ser Ile Ser Glu Leu Phe Gln Val His 145 150 155 160 Ile Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Arg Leu Leu Leu Ala Asn Ala Pro 165 170 175 Val Cys His Gln Gly Val Ser 180 <210> 220 <211> 185 <212> PRT <213> Epinephelus coioides <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(185) <223> Orange-spotted grouper EPO <400> 220 Met Leu Gln Lys Arg Gly Arg Gly Leu Leu Val Leu Leu Leu Met Leu 1 5 10 15 Leu Glu Trp Thr Arg Pro Gly Leu Leu Ser Pro Leu Arg Pro Ile Cys 20 25 30 Asp Leu Arg Val Leu Asn His Phe Ile Lys Glu Ala Arg Asp Ala Glu 35 40 45 Val Ala Met Lys Ser Cys Thr Glu Gly Cys Ser Leu Ser Glu Ser Val 50 55 60 Thr Val Pro Gln Thr Arg Val Asp Phe Asp Val Trp Glu Lys Lys Asn 65 70 75 80 Gly Leu Glu Gln Ala Gln Glu Val Gln Ser Gly Leu Trp Leu Leu Gln 85 90 95 Gln Ala Leu Asn Leu Leu Arg Thr Ser Val Thr Asn Thr Ala Leu His 100 105 110 Ser His Ile Asp Asn Ser Ile Arg Asn Leu Leu Ser Ile Asn Ala Val 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Asn Ile Gln Glu Tyr Thr Pro Pro Ala Ser Thr Val 130 135 140 Ala Leu Glu Gly Thr Trp Arg Val Ser Ser Ala Thr Asp Leu Leu Gln 145 150 155 160 Val His Val Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Arg Leu Leu Leu Leu Asp 165 170 175 Ala Gln Ala Cys Gln Gln Asp Val Ser 180 185 <210> 221 <211> 192 <212> PRT <213> Spalax galili <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Mole rat EPO precursor <400> 221 Met Gly Val Pro Asp Cys Leu Ala Leu Pro Leu Leu Val Thr Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ser Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Ile Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Phe Asn Glu Asn 50 55 60 Phe Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Thr Met 65 70 75 80 Gly Val Glu Glu Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu 85 90 95 Phe Glu Ala Ile Leu Arg Ala Gln Ala Val Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Met Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Ile Ser Pro Pro Asp Thr Thr Gln Val Ile Pro Leu Arg Arg Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 222 <211> 192 <212> PRT <213> Spalax judaei <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> Blind subterranean mole rat EPO precursor <400> 222 Met Gly Val Pro Asp Cys Leu Ala Leu Pro Leu Leu Val Thr Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ser Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Ile Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Phe Asn Glu Asn 50 55 60 Phe Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Thr Met 65 70 75 80 Gly Val Glu Glu Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu 85 90 95 Phe Glu Ala Ile Leu Arg Ala Gln Ala Val Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Met Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Ile Ser Pro Pro Asp Thr Thr Gln Val Ile Pro Leu Arg Arg Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190 <210> 223 <211> 195 <212> PRT <213> Tetraodon nigroviridis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(195) <223> Green puffer EPO <400> 223 Met Gly Leu Leu Met Cys Val Cys Val Val Val Phe Val Ser Gly Met 1 5 10 15 Thr Gly Leu Leu Ala Phe Leu Leu Ile Val Leu Glu Trp Thr Arg Pro 20 25 30 Ser Leu Pro Ser Pro Leu Arg Pro Ile Cys Asp Leu Arg Val Leu Asn 35 40 45 His Phe Ile Lys Glu Ala Gln Asp Ala Glu Ala Ala Met Lys Thr Cys 50 55 60 Arg Glu Gly Cys Thr Leu Ser Glu Ser Val Val Val Pro Gln Thr Thr 65 70 75 80 Val Asp Phe Asp Val Trp Glu Lys Lys Asn Ala Ser Ala Lys Ala Glu 85 90 95 Glu Val Gln Ser Gly Leu Trp Leu Leu Gln Gln Ala Phe Asn Phe Leu 100 105 110 Arg Thr Ser Val Thr Asn Ala Ala Leu His Ser His Ile Asp Asn Ala 115 120 125 Val Arg Asn Leu Leu Ser Val Asn Ala Val Leu Arg Ser Leu Asn Ile 130 135 140 Gln Glu Phe Thr Pro Gln Ala Asn Gly Ala Glu Ile Glu Gly Thr Trp 145 150 155 160 Arg Ala Ser Ser Ala Ala Glu Leu Leu Gln Val Tyr Val Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Ala Arg Leu Leu Leu Leu Asp Ala Gln Ala Cys Gln Gln 180 185 190 Asp Val Ser 195 <210> 224 <211> 133 <212> PRT <213> Saguinus oedipus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(133) <223> Cotton-top tamarin EPO (fragment) <400> 224 Ser Gly Val Leu Glu Arg Tyr Val Leu Glu Gly Lys Glu Ala Glu Asn 1 5 10 15 Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Ser Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr 20 25 30 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Lys Met Glu Phe 35 40 45 Gly Gln Gln Ala Val Asp Val Trp Gln Gly Leu Thr Leu Leu Ser Glu 50 55 60 Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Thr Gln Pro Arg 65 70 75 80 Glu Pro Leu Gln Leu His Met Asp Arg Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 85 90 95 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Glu Ala Thr Ser Pro 100 105 110 Pro Asp Ala Ala Pro Ser Ala Val Pro Leu Gln Thr Ile Thr Ala Asp 115 120 125 Thr Phe Ser Lys Leu 130 <210> 225 <211> 131 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(131) <223> Orangutan EPO (fragment) <400> 225 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn 1 5 10 15 Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro 20 25 30 Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln 35 40 45 Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val 50 55 60 Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro 65 70 75 80 Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr 85 90 95 Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ser Ser Pro Pro 100 105 110 Asp Ala Ala Leu Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe 115 120 125 Arg Lys Phe 130 <210> 226 <211> 133 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(133) <223> Gorilla EPO (fragment) <400> 226 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn 1 5 10 15 Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr 20 25 30 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 35 40 45 Arg Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu 50 55 60 Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp 65 70 75 80 Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 85 90 95 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser 100 105 110 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp 115 120 125 Thr Phe Arg Lys Leu 130 <210> 227 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amgen ARANESP immature <400> 227 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 228 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amgen ARANESP mature <400> 228 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 229 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(339) <223> coding sequence of human erythropoietin <400> 229 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 60 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 120 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 180 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 240 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 300 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacaga 339 <210> 230 <211> 4020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA3.1/GS <400> 230 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagt 900 taagctcgcc cttaagggcg agcttcgagg tcacccattc gaaggtaagc ctatccctaa 960 ccctctcctc ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attgagttta 1020 aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 1080 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 1140 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 1200 ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 1260 tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg 1320 tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 1380 cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 1440 ctttccccgt caagctctaa atcggggcat ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 1500 gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 1560 atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 1620 ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 1680 ggggatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta 1740 attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc aggcaggcag 1800 aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc 1860 cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc 1920 cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 1980 ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca 2040 gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg 2100 tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc 2160 ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac cagtgccgtt 2220 ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg 2280 ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg 2340 ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg 2400 cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac 2460 gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg 2520 cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg acacgtgcta 2580 cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg 2640 gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc 2700 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 2760 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 2820 tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 2880 tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 2940 aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 3000 ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 3060 gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 3120 cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 3180 tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 3240 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 3300 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3360 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 3420 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 3480 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 3540 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 3600 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 3660 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 3720 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 3780 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 3840 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 3900 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 3960 tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 4020 4020 <210> 231 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO BamHI forward primer <400> 231 gggaattcca tatgggggtg cacgaatgtc ctgcctgg 38 <210> 232 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO NdeI reverse primer <400> 232 cgggatcctc atctgtcccc tgtcctgcag gcctccc 37 <210> 233 <211> 3889 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNAUT-EPO <400> 233 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctgcta 60 ggggttcctt gtagttaatg attaacccgc catgctactt atctactatg ccaagtacgc 120 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 180 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 240 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 300 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 360 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 420 aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg 480 aaattaatac gactcactat agggagaccc aagcttggta ccgagctcgg atccactagt 540 aacggccgcc agtgtgctgg aattctgcag atatccatca cactggcggc cgcgaattcg 600 cccttgggaa ttccatatgg gggtgcacga atgtcctgcc tggctgtggc ttctcctgtc 660 cctgctgtcg ctccctctgg gcctcccagt cctgggcgcc ccaccacgcc tcatctgtga 720 cagccgagtc ctggagaggt acctcttgga ggccaaggag gccgagaata tcacgacggg 780 ctgtgctgaa cactgcagct tgaatgagaa tatcactgtc ccagacacca aagttaattt 840 ctatgcctgg aagaggatgg aggtcgggca gcaggccgta gaagtctggc agggcctggc 900 cctgctgtcg gaagctgtcc tgcggggcca ggccctgttg gtcaactctt cccagccgtg 960 ggagcccctg cagctgcatg tggataaagc cgtcagtggc cttcgcagcc tcaccactct 1020 gcttcgggct ctgggagccc agaaggaagc catctcccct ccagatgcgg cctcagctgc 1080 tccactccga acaatcactg ctgacacttt ccgcaaactc ttccgagtct actccaattt 1140 cctccgggga aagctgaagc tgtacacagg ggaggcctgc aggacagggg acagatgagg 1200 atcccgaagg gcgaattcgt ttaaacctgc aggactagag ggccctattc tatagtgtca 1260 cctaaatgct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 1320 tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 1380 ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 1440 tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 1500 tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagg tagataagta gcatggcggg 1560 ttaatcatta actacacagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 1620 aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 1680 tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 1740 agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 1800 tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 1860 tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 1920 aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 1980 tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 2040 gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 2100 atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 2160 cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 2220 tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 2280 caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 2340 ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 2400 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 2460 taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 2520 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 2580 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 2640 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 2700 taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 2760 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 2820 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 2880 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 2940 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 3000 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 3060 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 3120 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 3180 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 3240 gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 3300 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 3360 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 3420 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 3480 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 3540 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 3600 ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 3660 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 3720 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 3780 tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 3840 gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaaga 3889 <210> 234 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNAUT forward primer <400> 234 tataagcaga gctctctg 18 <210> 235 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNAUT reverse primer <400> 235 cacagtcgag gctgatcag 19 <210> 236 <211> 192 <212> PRT <213> Hom sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(192) <223> EPO immature form deltaR193 <400> 236 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 <210> 237 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(165) <223> Human EPO - mature deltaR166 <400> 237 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 238 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(193) <223> Human EPO D70S variant- immature <400> 238 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Ser Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 239 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> Human EPO D70S (D43S) - mature <400> 239 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Ser Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 240 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(193) <223> Human EPO G104S - immature <400> 240 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Ser Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 241 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> Human EPO G104S(G77S) - mature <400> 241 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Ser Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 242 <211> 193 <212> PRT <213> Honmo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(193) <223> Human EPO S147C - immature <400> 242 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Cys Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg <210> 243 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> Human EPO S147C(S120C) - mature <400> 243 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Cys Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 244 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N24H <400> 244 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 245 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H <400> 245 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 246 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N83H <400> 246 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 247 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H <400> 247 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 248 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H/R4H <400> 248 Ala Pro Pro His Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 249 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H/L93I <400> 249 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 250 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H/K20Q <400> 250 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 251 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H/E159N <400> 251 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Asn Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 252 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H/K52N <400> 252 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Asn Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 253 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/R139H/L153V <400> 253 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 254 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/N83H/R139H <400> 254 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 255 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N38H/N83H/R139H <400> 255 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 256 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/N83H/R139H/L93V <400> 256 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Val His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 257 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/N83H/R139H/L80I <400> 257 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 258 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N38H/N83H/R139H/L93I <400> 258 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 259 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H <400> 259 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 260 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H <400> 260 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 261 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N38H/N83H/L93V/R139H <400> 261 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Val His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 262 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N24H/N38H/N83H/R139H/L80I <400> 262 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 263 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N24H/N38H/N83H/R139H/L93I <400> 263 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 264 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N24H/N38H/N83H/R139H/L93V <400> 264 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Val His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 265 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I <400> 265 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 266 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I <400> 266 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 267 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V <400> 267 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Val His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 268 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I <400> 268 Ala Pro Pro His Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 269 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO E159H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I <400> 269 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Ile His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Asn Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 270 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V <400> 270 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 271 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I <400> 271 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Val Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 272 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I <400> 272 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Gln Glu Ala Glu His Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu His Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Ile 65 70 75 80 Leu Val His Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe His Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Asn Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 273 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(144) <223> GM-CSF precursor <400> 273 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 274 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(127) <223> GM-CSF mature <400> 274 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 275 <211> 554 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(554) <223> M-CSF Isoform 1 precursor <400> 275 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 180 185 190 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 225 230 235 240 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 270 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 305 310 315 320 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 325 330 335 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 355 360 365 Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro 370 375 380 Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 385 390 395 400 Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro 405 410 415 Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 420 425 430 Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp 435 440 445 Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 450 455 460 Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly 465 470 475 480 His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser 485 490 495 Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val 500 505 510 Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro 515 520 525 Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 530 535 540 Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 545 550 <210> 276 <211> 522 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(522) <223> M-CSF Isoform 1 mature <400> 276 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 165 170 175 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 180 185 190 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 195 200 205 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 210 215 220 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 225 230 235 240 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 245 250 255 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 260 265 270 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 275 280 285 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 290 295 300 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 305 310 315 320 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 325 330 335 Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro 340 345 350 Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 355 360 365 Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro 370 375 380 Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 385 390 395 400 Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp 405 410 415 Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 420 425 430 Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly 435 440 445 His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser 450 455 460 Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val 465 470 475 480 Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro 485 490 495 Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 500 505 510 Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 515 520 <210> 277 <211> 438 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(438) <223> M-CSF Isoform 2 precursor <400> 277 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 180 185 190 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 225 230 235 240 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 270 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 305 310 315 320 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 325 330 335 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly His Glu Arg Gln 355 360 365 Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu 370 375 380 Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu 385 390 395 400 Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp 405 410 415 Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg 420 425 430 Gln Val Glu Leu Pro Val 435 <210> 278 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(406) <223> M-CSF Isoform 2 mature <400> 278 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 165 170 175 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 180 185 190 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 195 200 205 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 210 215 220 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 225 230 235 240 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 245 250 255 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 260 265 270 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 275 280 285 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 290 295 300 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 305 310 315 320 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly His Glu Arg Gln 325 330 335 Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu 340 345 350 Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu 355 360 365 Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp 370 375 380 Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg 385 390 395 400 Gln Val Glu Leu Pro Val 405 <210> 279 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(256) <223> M-CSF Isoform 3 precursor <400> 279 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 20 25 30 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 35 40 45 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 50 55 60 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 85 90 95 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 180 185 190 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 195 200 205 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 210 215 220 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 225 230 235 240 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 245 250 255 <210> 280 <211> 224 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(224) <223> M-CSF Isoform 3 mature <400> 280 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 <210> 281 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(207) <223> G-CSF precursor <400> 281 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 65 70 75 80 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 85 90 95 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 100 105 110 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 115 120 125 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 130 135 140 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 145 150 155 160 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 165 170 175 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 180 185 190 Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 205 <210> 282 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(177) <223> G-CSF mature <400> 282 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu 35 40 45 Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu 50 55 60 Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln 65 70 75 80 Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu 85 90 95 Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp 100 105 110 Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly 115 120 125 Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala 130 135 140 Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu 145 150 155 160 Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln 165 170 175 Pro <210> 283 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(204) <223> G-CSF Isoform b precursor <400> 283 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 85 90 95 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 <210> 284 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(174) <223> G-CSF Isoform b mature <400> 284 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 285 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(202) <223> LIF precursor <400> 285 Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His 1 5 10 15 Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala 20 25 30 Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile 35 40 45 Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys 65 70 75 80 Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly 85 90 95 Thr Glu Lys Ala Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu 100 105 110 Gly Thr Ser Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro 115 120 125 Ser Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu 130 135 140 Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His 145 150 155 160 Val Gly His Val Asp Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp 165 170 175 Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys 180 185 190 Gln Ile Ile Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe 195 200 <210> 286 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(180) <223> LIF mature <400> 286 Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile Arg His 1 5 10 15 Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gln 20 25 30 Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln 35 40 45 Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn Val 50 55 60 Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Ala Lys Leu 65 70 75 80 Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu Gly Thr Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro Ser Ala Leu Ser Leu His 100 105 110 Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu Arg Gly Leu Leu Ser Asn 115 120 125 Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Gly His Val Asp Val 130 135 140 Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Val Leu 165 170 175 Ala Gln Ala Phe 180 <210> 287 <211> 269 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(269) <223> IL-1beta precursor <400> 287 Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met 20 25 30 Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile 35 40 45 Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala 50 55 60 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 65 70 75 80 Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe 85 90 95 Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala 100 105 110 Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp 115 120 125 Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala 130 135 140 Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met 145 150 155 160 Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu 165 170 175 Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp 180 185 190 Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys 195 200 205 Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn 210 215 220 Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr 225 230 235 240 Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 260 265 <210> 288 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(153) <223> IL-1beta mature <400> 288 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys 1 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln 20 25 30 Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln 35 40 45 Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 <210> 289 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(153) <223> IL-2 precursor <400> 289 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 290 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(133) <223> IL-2 mature <400> 290 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 291 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(152) <223> IL-3 precursor <400> 291 Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30 Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln 35 40 45 Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln 50 55 60 Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80 Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile 85 90 95 Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 110 Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln 130 135 140 Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe 145 150 <210> 292 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(133) <223> IL-3 mature <400> 292 Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys 1 5 10 15 Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro Pro Leu 20 25 30 Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln Asp Ile Leu 35 40 45 Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe Asn Arg Ala 50 55 60 Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile Leu Lys Asn 65 70 75 80 Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro 85 90 95 Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr 100 105 110 Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln Thr Thr Leu 115 120 125 Ser Leu Ala Ile Phe 130 <210> 293 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(153) <223> IL-4 precursor <400> 293 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 294 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(129) <223> IL-4 mature <400> 294 His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser 1 5 10 15 Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile 20 25 30 Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala 35 40 45 Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg 50 55 60 Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile 65 70 75 80 Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu 85 90 95 Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe 100 105 110 Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser 115 120 125 Ser <210> 295 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(134) <223> IL-5 precursor <400> 295 Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu 20 25 30 Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu 35 40 45 Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr 50 55 60 Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln 65 70 75 80 Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys 85 90 95 Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val 100 105 110 Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr 115 120 125 Glu Trp Ile Ile Glu Ser 130 <210> 296 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(115) <223> IL-5 mature <400> 296 Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg 20 25 30 Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile 35 40 45 Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr 50 55 60 Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp 65 70 75 80 Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe 85 90 95 Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile 100 105 110 Ile Glu Ser 115 <210> 297 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(212) <223> IL-6 precursor <400> 297 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 298 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(183) <223> IL-6 mature <400> 298 Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln 1 5 10 15 Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu 20 25 30 Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met 35 40 45 Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 50 55 60 Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 65 70 75 80 Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr 85 90 95 Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg 100 105 110 Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys 115 120 125 Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala 130 135 140 Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met 145 150 155 160 Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 180 <210> 299 <211> 252 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(252) <223> OSM precursor <400> 299 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser 20 25 30 Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu 35 40 45 Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly 50 55 60 Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala 65 70 75 80 Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu 85 90 95 Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp 100 105 110 Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu 115 120 125 Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu 130 135 140 Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser 145 150 155 160 Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro 165 170 175 Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys 180 185 190 Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val 195 200 205 Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro 210 215 220 His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys 225 230 235 240 Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln Leu Pro Arg 245 250 <210> 300 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(227) <223> OSM mature <400> 300 Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 25 30 Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 40 45 Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 55 60 Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln 85 90 95 Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln 100 105 110 Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120 125 Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135 140 Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe 145 150 155 160 Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe 165 170 175 Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn 180 185 190 Arg Ser Arg Arg His Ser Pro His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg 195 200 205 Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln 210 215 220 Leu Pro Arg 225 <210> 301 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(273) <223> SCF precursor <400> 301 Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg 20 25 30 Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro 35 40 45 Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu 50 55 60 Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser 65 70 75 80 Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser 85 90 95 Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val 100 105 110 Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys 115 120 125 Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe 130 135 140 Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr 145 150 155 160 Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg 165 170 175 Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser 180 185 190 Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro 195 200 205 Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe 210 215 220 Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg 225 230 235 240 Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu 260 265 270 Val <210> 302 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(248) <223> SCF mature <400> 302 Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr 1 5 10 15 Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr 20 25 30 Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met 35 40 45 Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser 50 55 60 Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val 65 70 75 80 Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys 85 90 95 Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro 100 105 110 Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp 115 120 125 Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu 130 135 140 Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu 145 150 155 160 Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn 165 170 175 Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala 180 185 190 Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly 195 200 205 Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu 210 215 220 Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu 225 230 235 240 Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu Val 245 <210> 303 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(187) <223> IFN-beta precursor <400> 303 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 <210> 304 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> IFN-beta mature <400> 304 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 305 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> IFN-gamma precursor <400> 305 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln 165 <210> 306 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(146) <223> IFN-gamma mature <400> 306 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe 20 25 30 Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys 50 55 60 Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met 65 70 75 80 Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu 85 90 95 Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala 100 105 110 Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys 115 120 125 Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala 130 135 140 Ser Gln 145 <210> 307 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> Human EPO glycosylation variant <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> Xaa= Asn, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (38) <223> Xaa= Asn, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (83) <223> Xaa= Asn, Lys or His <400> 307 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Xaa Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Xaa Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Xaa Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 308 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(165) <223> Human EPO (deltaR166) glycosylation variant <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> Xaa= Asn, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (38) <223> Xaa= Asn, Lys or His <220> <221> VARIANT <222> (83) <223> Xaa= Asn, Lys or His <400> 308 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Xaa Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Xaa Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Xaa Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 309 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(166) <223> EPO N24K/N38K/N83K <400> 309 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 310 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(165) <223> EPO (deltaR166) N24K/N38K/N83K <400> 310 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165

Claims (196)

  1. 서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 갖는 성숙한 에리스로포이에틴(EPO) 폴리펩티드에서 아미노산 치환 K20Q를 포함하며,
    상기 치환을 포함하지 않는 비변형된 EPO 폴리펩티드와 비교하여 단백질분해에 대한 증가된 저항성을 나타내는
    변형된 EPO 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 160, 161, 162, 163, 164, 165 또는 166 개의 아미노산 길이를 갖는 EPO 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 165 또는 166 개의 아미노산 길이를 갖는 EPO 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 202-213, 215, 217-222 또는 224-226 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하며:
    서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 EPO 폴리펩티드의 20번 위치에 상응하는 위치의 변형된 EPO 폴리펩티드의 아미노산은 Q로 치환되며;
    서열번호 2 또는 237에 제시된 서열의 성숙한 EPO 폴리펩티드의 139 위치에 상응하는 위치의 변형된 EPO 폴리펩티드의 아미노산은 H로 치환되고;
    상응하는 위치는 서열 정렬에 의해 결정되는
    변형된 EPO 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 2 또는 237에 제시된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 EPO 폴리펩티드에서 K20Q 및 R139H를 포함하는, 변형된 EPO 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, A30N, H32T, P87V, W88N, 및 P90T 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드.
  8. 제6항에 있어서, 165 또는 166 개의 아미노산 길이를 갖는 EPO 폴리펩티드.
  9. 제6항에 있어서, K20Q 및 R139H이 변형된 서열번호 2, 228, 309, 310 또는 237 중 어느 하나에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드이거나, 서열번호 2, 228, 309, 310 또는 237 중 어느 하나에서 제시된 아미노산 서열의 K20 및 R139에 상응하는 위치에 각각 아미노산 치환 Q 및 H를 포함하는 변이체인 EPO 폴리펩티드.
  10. 삭제
  11. 제6항에 있어서, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 23, 29, 31, 35, 37, 42, 43, 45, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 62, 64, 67, 69, 70, 72, 75, 76, 80, 81, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 96, 97, 102, 103, 105, 108, 109, 110, 112, 116, 117, 121, 122, 123, 129, 130, 131, 136, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 148, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 165, 또는 166 중에서 선택된 아미노산 위치에서 또다른 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 위치는 서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 갖는 성숙한 인간 EPO 폴리펩티드의 위치를 참조하고, 상기 아미노산 치환은 P2S, P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I, E37Q, E37H, E37N, P42S, P42A, D43Q, D43H, D43N, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, E72N, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, P121S, P121A, P122S, P122A, D123Q, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H, 또는 R166Q 중에서 선택된 변형된 EPO 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 변형된 EPO의 아미노산 치환은 R139H/K20Q, K20Q/L80I/R139H, K20Q/L93I/R139H, K20Q/L93V/R139H, R4H/K20Q/R139H/L80I, E159N/K20Q/R139H/L93I, K20Q/R139H/L153V, L153V/K20Q/R139H/L80I 또는 E159N/K20Q/R139H/L80I 중에서 선택된 변형된 EPO 폴리펩티드.
  13. 제6항에 있어서, 하나 내지 모든 당화 위치가 제거되는 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 아미노산 변형이 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 천연 및 비천연 아미노산의 조합 중에서 선택된 변형된 EPO 폴리펩티드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 당화 위치가 O-당화 위치 또는 N-당화 위치인 변형된 EPO 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 당화 위치가 O-당화 위치이고, S126인 변형된 EPO 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 상기 당화 위치가 N-당화 위치이고, N24, N38 및 N83 중에서 선택된 변형된 EPO 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 N24H, N38H, N83H, N24K, N38K, N83K, N38H/N83H 및 N24H/N38H/N83H 중에서 선택된 변형된 EPO 폴리펩티드.
  19. 제6항에 있어서, EPO 폴리펩티드의 성숙한 형태 또는 EPO 폴리펩티드의 전구체 형태인 변형된 EPO 폴리펩티드.
  20. 제1항의 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 신부전, 후천성면역결핍증 (AIDS), 악성종양 및 만성적인 염증에 의한 빈혈, 발작장애, 다발성경화증, 뇌졸증, 저혈압, 심장마비, 허혈, 저산소증, 심박 정지, 국소 빈혈, 심근경색, 염증, 노화에 따른 인지기능의 소실, 방사선 손상, 뇌성마비, 퇴행성 신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 리씨 증후군(Leigh Disease), 후천성면역결핍증, 치매, 기억상실, 근위측성측삭경화증, 알콜중독, 기분장애, 불안장애, 집중력장애, 정신분열증, 자폐증, 크로이츠펠트 야곱병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈, 심장-폐 바이패쓰, 만성 두부 부전, 시력감퇴, 독소-유발성 신경장해, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막성 허혈, 또는 망막 외상을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 제6항의 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 신부전, 후천성면역결핍증 (AIDS), 악성종양 및 만성적인 염증에 의한 빈혈, 발작장애, 다발성경화증, 뇌졸증, 저혈압, 심장마비, 허혈, 저산소증, 심박 정지, 국소 빈혈, 심근경색, 염증, 노화에 따른 인지기능의 소실, 방사선 손상, 뇌성마비, 퇴행성 신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 리씨 증후군(Leigh Disease), 후천성면역결핍증, 치매, 기억상실, 근위측성측삭경화증, 알콜중독, 기분장애, 불안장애, 집중력장애, 정신분열증, 자폐증, 크로이츠펠트 야곱병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈, 심장-폐 바이패쓰, 만성 두부 부전, 시력감퇴, 독소-유발성 신경장해, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막성 허혈, 또는 망막 외상을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 액제, 환제, 정제, 로젠지제 및 캡슐제 중 선택된 제형으로 경구투여를 위해 제형화된 약제학적 조성물.
  23. 변형된 EPO 폴리펩티드로서,
    서열번호 2 또는 237에 제시된 서열을 갖는 성숙한 EPO 폴리펩티드에서 N38H/R139H/K20Q, K20Q/N38H/N83H/R139H, K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H, K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H, K20Q/N38H/N83H/L93V/R139H, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V, R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I, E/159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I, K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V, L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I 또는 E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I 중에서 선택된 아미노산 치환을 포함하는
    변형된 EPO 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, A30N, H32T, P87V, W88N, 또는 P90T 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 변형된 EPO 폴리펩티드.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 삭제
  114. 삭제
  115. 삭제
  116. 삭제
  117. 삭제
  118. 삭제
  119. 삭제
  120. 삭제
  121. 삭제
  122. 삭제
  123. 삭제
  124. 삭제
  125. 삭제
  126. 삭제
  127. 삭제
  128. 삭제
  129. 삭제
  130. 삭제
  131. 삭제
  132. 삭제
  133. 삭제
  134. 삭제
  135. 삭제
  136. 삭제
  137. 삭제
  138. 삭제
  139. 삭제
  140. 삭제
  141. 삭제
  142. 삭제
  143. 삭제
  144. 삭제
  145. 삭제
  146. 삭제
  147. 삭제
  148. 삭제
  149. 삭제
  150. 삭제
  151. 삭제
  152. 삭제
  153. 삭제
  154. 삭제
  155. 삭제
  156. 삭제
  157. 삭제
  158. 삭제
  159. 삭제
  160. 삭제
  161. 삭제
  162. 삭제
  163. 삭제
  164. 삭제
  165. 삭제
  166. 삭제
  167. 삭제
  168. 삭제
  169. 삭제
  170. 삭제
  171. 삭제
  172. 삭제
  173. 삭제
  174. 삭제
  175. 삭제
  176. 삭제
  177. 삭제
  178. 삭제
  179. 삭제
  180. 삭제
  181. 삭제
  182. 삭제
  183. 삭제
  184. 삭제
  185. 삭제
  186. 삭제
  187. 삭제
  188. 삭제
  189. 삭제
  190. 삭제
  191. 삭제
  192. 삭제
  193. 삭제
  194. 삭제
  195. 삭제
  196. 삭제
KR1020097013574A 2006-11-28 2007-11-27 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도 KR101248252B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86161506P 2006-11-28 2006-11-28
US60/861,615 2006-11-28
PCT/GB2007/004520 WO2008065372A2 (en) 2006-11-28 2007-11-27 Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100014291A KR20100014291A (ko) 2010-02-10
KR101248252B1 true KR101248252B1 (ko) 2013-03-27

Family

ID=39189560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097013574A KR101248252B1 (ko) 2006-11-28 2007-11-27 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8252743B2 (ko)
EP (1) EP2120998B1 (ko)
JP (1) JP2010510794A (ko)
KR (1) KR101248252B1 (ko)
CN (1) CN101678079B (ko)
AR (1) AR074032A1 (ko)
WO (1) WO2008065372A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190038528A (ko) * 2017-02-27 2019-04-08 재단법인대구경북과학기술원 에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포손상방지에 효과를 통한 활용

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
US20060020396A1 (en) * 2002-09-09 2006-01-26 Rene Gantier Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
EP2084274A2 (en) 2006-06-19 2009-08-05 Nautilus Technology LLC Modified coagulation factor ix polypeptides and use thereof for treatment
US8759297B2 (en) 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
ES2327170T3 (es) * 2007-02-22 2009-10-26 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Proteina de fusion de eritropoyetina.
WO2008124086A2 (en) * 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
CA2694762A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
WO2009046377A2 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Medistem Laboratories, Inc. Compositions and methods of stem cell therapy for autism
KR101275950B1 (ko) * 2008-05-29 2013-06-25 한올바이오파마주식회사 증가된 단백질분해효소 저항성을 나타내는 변형된 에리스로포이에틴（ｅｐｏ） 폴리펩티드 및 이의 약제학적 조성물
AU2013200271B2 (en) * 2008-09-26 2014-08-28 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
KR101647164B1 (ko) * 2008-09-26 2016-08-09 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도
CA2748889A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
ES2725200T3 (es) 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
CA2777700A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Aileron Therapeutics, Inc. Improved peptidomimetic macrocycles
CN103044539B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组促红细胞生成素及制备方法
CN101870735B (zh) * 2010-06-02 2013-06-12 北京精益泰翔技术发展有限公司 一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白
JP2013535467A (ja) 2010-07-28 2013-09-12 スマートセルズ・インコーポレイテツド 組換えにより発現されたインスリンポリペプチドおよびその使用
US9732132B2 (en) 2011-01-14 2017-08-15 Vanderbilt University Therapeutic compositions and methods for disorders associated with neuronal degeneration
MY190604A (en) * 2011-02-10 2022-04-27 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
KR101931403B1 (ko) 2011-09-23 2018-12-21 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 개선된 유전자 치료 방법
EP4338797A3 (en) 2011-12-02 2024-06-12 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
AP2015008365A0 (en) 2012-12-05 2015-04-30 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting epo
CN103864913A (zh) * 2012-12-18 2014-06-18 联亚生技开发股份有限公司 重组蛋白
CA2896053A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Ocata Therapeutics, Inc. Methods for production of platelets from pluripotent stem cells and compositions thereof
US20150335714A1 (en) * 2013-01-25 2015-11-26 Tammy Z. Movsas Use of human chorionic gonadotropin to inhibit development or minimize severity of cerebral palsy and/or its co-morbidities
SG11201600294QA (en) * 2013-07-17 2016-02-26 Araim Pharmaceuticals Inc Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage
CN103804484B (zh) * 2014-01-24 2016-03-16 南京必优康生物技术有限公司 一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用
EP3139955B1 (en) 2014-04-30 2024-03-20 President and Fellows of Harvard College Fusion proteins for treating cancer and related methods
CN105372214B (zh) * 2014-08-18 2019-06-28 中国科学院上海有机化学研究所 一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的n-连接寡糖结构的方法
EP3194429A4 (en) * 2014-09-18 2018-06-13 Askgene Pharma, Inc. Novel feline erythropoietin receptor agonists
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
CN107922975B (zh) 2015-08-12 2022-06-28 诺华股份有限公司 治疗眼科病症的方法
EP3757119A1 (en) * 2015-11-16 2020-12-30 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
AU2018300069A1 (en) 2017-07-11 2020-02-27 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
CA3071013A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
CN107880109B (zh) * 2017-11-01 2019-08-30 复旦大学附属中山医院 一种促红细胞生成素来源肽及其制备方法和用途
CN107898812A (zh) * 2017-12-06 2018-04-13 广州瑞铂茵健康管理咨询有限公司 一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液
WO2019173283A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Marquette University Method and apparatus for non-invasive hemoglobin level prediction
EP3765856B1 (en) * 2018-03-13 2023-09-27 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
CN113423721A (zh) * 2018-12-12 2021-09-21 金德雷德生物科学股份有限公司 兽用促红细胞生成素类似物
BR112021014415A2 (pt) 2019-02-06 2021-09-21 Synthorx, Inc. Conjugados de il-2 e métodos de uso dos mesmos
US20230151071A1 (en) * 2020-04-09 2023-05-18 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Compositions comprising recombinant epo and methods of use thereof
WO2022106888A2 (en) * 2020-11-18 2022-05-27 Chulabhorn Foundation Erythropoietin variants and uses thereof
CN115607653B (zh) * 2022-07-09 2023-09-26 曹霞 低剂量白介素2在治疗孤独症中的应用
CN117100905A (zh) * 2023-10-25 2023-11-24 润方（北京）生物医药研究院有限公司 促进伤口愈合的敷料

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005103076A2 (en) 2004-04-23 2005-11-03 Cambridge Antibody Technology Limited Erythropoietin protein variants

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
JPS6045849B2 (ja) 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
JPS57149228A (en) 1981-03-11 1982-09-14 Ajinomoto Co Inc Novel erythropoietin and its preparation
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US5013718A (en) 1986-11-21 1991-05-07 Amgen, Inc. Method for treating iron overload using EPO
US4835260A (en) 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
DE3923963A1 (de) 1989-07-20 1991-01-31 Behringwerke Ag Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
JPH03151399A (ja) 1989-11-07 1991-06-27 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 変異ヒトエリスロポエチン
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
AU6709794A (en) * 1993-04-21 1994-11-08 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity
HUT73876A (en) 1993-04-29 1996-10-28 Abbott Lab Erythropoietin analog compositions and methods
IL110669A (en) 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
PT653489E (pt) 1993-11-12 2003-06-30 Akzo Nobel Nv Vacina contra a coccidiose em aves domesticas
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US6099830A (en) 1994-08-09 2000-08-08 Zymogenetics, Inc. Methods for stimulating erythropoiesis using hematopoietic proteins
IL116085A (en) 1994-12-16 1999-12-31 Ortho Pharma Corp Spray dried erythropoietin
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5854049A (en) * 1995-06-09 1998-12-29 President And Fellows Of Harvard College Plasmin-resistant streptokinase
WO1998007878A2 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Arch Development Corporation Long-term expression of gene products by transforming muscle cells
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
ES2297889T3 (es) * 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
WO1999011242A1 (en) 1997-09-04 1999-03-11 Biozone Laboratories, Inc. Oral liposomal delivery system
JP4220125B2 (ja) 1997-12-03 2009-02-04 ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 高い比活性を有するエリスロポエチン
US6274158B1 (en) 1998-02-04 2001-08-14 Veronica L. Zaharia Czeizler Treatment with recombinant human erythropoietin of bleeding in patients with normal and abnormal hemostasis
ES2224299T3 (es) 1998-02-23 2005-03-01 Cilag Ag International Dispersion liposomal de eritroyetina.
WO1999066054A2 (en) 1998-06-15 1999-12-23 Genzyme Transgenics Corp. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
CA2352538A1 (en) * 1998-11-30 2000-06-08 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US6171620B1 (en) 1999-04-27 2001-01-09 Health Research, Inc. Method of enhancing the efficacy of anti-tumor agents
US6555343B1 (en) 1999-05-07 2003-04-29 Genentech Inc. Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6831060B2 (en) 1999-05-07 2004-12-14 Genentech, Inc. Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same
CN1367701A (zh) 1999-05-11 2002-09-04 奥索－麦克尼尔药物公司 红细胞生成素给药的药代动力学和药效模型
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
FR2802645B1 (fr) 1999-12-16 2002-03-08 Meillat Roland Methode d'evaluation de la performance d'un ensemble d'agents biologiques dans des cellules cibles vivantes et ses applications
WO2001081405A2 (en) 2000-04-21 2001-11-01 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
FR2808804B1 (fr) 2000-05-09 2002-08-02 Nautilus Biotech Procede de determination du titre d'agents biologiques en temps reel dans des cellules cibles vivantes et ses applications
US20030072737A1 (en) 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
HUP0400703A3 (en) * 2001-02-06 2006-06-28 Merck Patent Gmbh Modified erythropoietin (epo) with reduced immunogenicity
WO2002066514A2 (en) 2001-02-19 2002-08-29 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
AU2002303431C1 (en) 2001-04-19 2008-03-06 The Regents Of The University Of California Methods and composition for the production of orthoganal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs
US6833351B2 (en) 2001-05-21 2004-12-21 Douglas T. Dieterich Method of treating anemia caused by ribavirin treatment of hepatitis C using erythropoietin alpha
US20030129203A1 (en) 2001-08-27 2003-07-10 Nautilus Biotech S.A. Mutant recombinant adeno-associated viruses
US7647184B2 (en) * 2001-08-27 2010-01-12 Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd High throughput directed evolution by rational mutagenesis
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
CN102180944A (zh) 2001-10-10 2011-09-14 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
AU2002351746A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-15 Maxygen Aps Erythropoietin conjugates
US20030224404A1 (en) 2002-02-25 2003-12-04 Manuel Vega High throughput directed evolution of nucleic acids by rational mutagenesis
AU2003217758A1 (en) 2002-05-01 2003-12-22 Genencor International, Inc. Cytokines and cytokine receptors with reduced immunogenicity
EP1552298A4 (en) * 2002-07-01 2006-11-08 Kenneth S Warren Inst Inc RECOMBINANT TISSUE-PROOFING CYTOKINS AND NUCLEIC ACIDS COORDINATING THEREOF FOR THE PROTECTION, RECOVERY AND IMPROVEMENT OF CELLS, TISSUE AND ORGANS THEREOF
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
PT1543106E (pt) 2002-07-15 2007-05-31 Immunex Corp Métodos e meios para controlar a sialilação de proteínas produzidas por células de mamíferos
JP2006515161A (ja) 2002-08-09 2006-05-25 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング エリスロポエチンのｔ細胞エピトープ
US20050176627A1 (en) 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
US20060020396A1 (en) 2002-09-09 2006-01-26 Rene Gantier Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning
US20050202438A1 (en) 2002-09-09 2005-09-15 Rene Gantier Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning
BR0314107A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
US20040091961A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
EA008670B1 (ru) 2003-05-09 2007-06-29 Круселл Холланд Б.В. Культуры e1-иммортализованных клеток и способы их культивирования с целью повышения выхода их продукции
CA2525568C (en) 2003-05-12 2017-07-25 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
KR100632985B1 (ko) 2003-07-26 2006-10-11 메덱스젠 주식회사 생리활성 조절 단백질의 효능 향상 방법 및 그 예시변이체들
EP1670492A4 (en) 2003-09-29 2009-07-08 Warren Pharmaceuticals Inc FABRIC PROTECTION CYTOKINES FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF SEPTICEMIA AND THE FORMATION OF ADHESIONS
JP2008504008A (ja) 2003-12-31 2008-02-14 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
WO2005065239A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 Centocor, Inc. Novel recombinant proteins with n-terminal free thiol
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
US20060135754A1 (en) 2004-07-07 2006-06-22 H. Lundbeck A/S Novel carbamylated EPO and method for its production
US20060073563A1 (en) 2004-09-02 2006-04-06 Xencor, Inc. Erythropoietin derivatives with altered immunogenicity
JP2008512385A (ja) 2004-09-03 2008-04-24 アルザ コーポレイション アルブミンの内因的に形成された結合体
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
GB0500099D0 (en) * 2005-01-05 2005-02-09 Cambridge Antibody Tech Methods and means relating to protein variants
EP1877434A2 (en) 2005-05-04 2008-01-16 Nautilus Biotech Modified interferon-gamma polypeptides and methods for using modified interferon-gamma polypeptides
US8703445B2 (en) 2005-12-29 2014-04-22 Abbott Point Of Care Inc. Molecular diagnostics amplification system and methods
WO2007092252A2 (en) 2006-02-03 2007-08-16 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
US20080260820A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Gilles Borrelly Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides
KR101275950B1 (ko) 2008-05-29 2013-06-25 한올바이오파마주식회사 증가된 단백질분해효소 저항성을 나타내는 변형된 에리스로포이에틴（ｅｐｏ） 폴리펩티드 및 이의 약제학적 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005103076A2 (en) 2004-04-23 2005-11-03 Cambridge Antibody Technology Limited Erythropoietin protein variants

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190038528A (ko) * 2017-02-27 2019-04-08 재단법인대구경북과학기술원 에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포손상방지에 효과를 통한 활용
KR102345605B1 (ko) 2017-02-27 2021-12-31 주식회사 사이루스 에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포손상방지에 효과를 통한 활용

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008065372A3 (en) 2008-10-23
US20090238789A1 (en) 2009-09-24
EP2120998B1 (en) 2013-08-07
EP2120998A2 (en) 2009-11-25
US8252743B2 (en) 2012-08-28
KR20100014291A (ko) 2010-02-10
JP2010510794A (ja) 2010-04-08
CN101678079A (zh) 2010-03-24
WO2008065372A2 (en) 2008-06-05
CN101678079B (zh) 2013-12-25
AR074032A1 (es) 2010-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101248252B1 (ko) 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도
KR20110022638A (ko) 증가된 단백질분해효소 저항성을 나타내는 변형된 에리스로포이에틴（ｅｐｏ） 폴리펩티드 및 이의 약제학적 조성물
JP5117563B2 (ja) 修飾成長ホルモン
FI121573B (fi) Menetelmä eristetyn mpl-ligandipolypeptidin valmistamiseksi
KR101483723B1 (ko) 장기 작용 폴리펩티드 및 그의 생산 및 투여 방법
US8008454B2 (en) Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
JP4035400B2 (ja) 生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質
Bonin-Debs et al. Development of secreted proteins as biotherapeutic agents
EP1342730B1 (en) Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin
EA010099B1 (ru) Пептиды, которые связываются с рецептором к эритропоэтину, и способы их применения
JPS61501627A (ja) ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａ
JPH06502987A (ja) Ｏ―グリコシル化ｉｆｎ―アルファ
CN114591445B (zh) 新型人血清白蛋白突变体
EP1319712B1 (en) Fusion protein having enhanced in vivo activity of erythropoietin
Hedayati et al. Molecular design, expression and evaluation of PASylated human recombinant erythropoietin with enhanced functional properties
AU2006245916A1 (en) Erythropoietin variants
JP2002536018A (ja) グリコシル化レプチン組成物および関連する方法
CA2209298C (en) Mpl ligand analogs
KR101330033B1 (ko) 인간 과립구 콜로니 자극 인자(ｇ-ｃｓｆ)의 변이체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160309

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170302

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180307

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200310

Year of fee payment: 8