JP4035400B2 - 生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、悪性貧血治療剤である、生体内(in vivo)でのヒトのエリスロポエチン(以下、「EPO」とも略する)活性が増進した融合蛋白質に関するものである。より具体的には、本発明は、インビボで自然に生じる(naturally occurring)特定ペプチドにEPO分子が融合されてなる、糖鎖含量を増加させずに、それ自体のアミノ酸配列により生体内(in vivo)半減期を増加することによって、エリスロポエチン活性が増進された融合蛋白質に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
EPOは、分子量30,000〜34,000の糖蛋白質であり、赤血球の生成及び分化を促進する造血因子である。この糖蛋白質は、赤血球系前駆細胞の受容体に結合して造血作用を開始して、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加、DNA生合成の促進及びヘモグロビン生成の刺激などを引き起こす。また、組換え型のヒトエリスロポエチン(rhEPO)は、腎不全、未熟児、甲状腺機能不全、栄養失調などに関連する貧血の治療剤として使われてきた。一方、rhEPOは、半減期が短く、週に3回程度の投与を必要とするので、不便であり、また、コストも高い。このため、rhEPOの広範な使用は制限されている。したがって、これらの生体内活性をより長期間維持させることにより、治療のためのrhEPOの投与頻度を減少させうる。
【0003】
EPOの生体内での生物活性は生体内半減期に比例し、この生体内半減期はEPOの糖鎖の末端に位置するシアル酸の含量と相関関係があることが知られている。したがって、EPOの生体内での生物活性は、糖鎖の存在あるいは不存在により大きく左右される。ところが、糖鎖の形態は細胞のタイプによって各々異なるので、同じ糖蛋白質を相異なる細胞で発現させると、蛋白質の糖鎖の形態は、細胞のタイプによってそれぞれ異なるものとなる。細菌、例えば、大腸菌(E. coli)は蛋白質に糖鎖を付加できないことが知られている。一般に、大腸菌で発現する蛋白質には糖が付加されていないために、大腸菌で発現したEPOは糖鎖を含まない。このような場合でのEPOは、試験管内(in vitro)では活性が確認されるが、生体内では全く活性を有さない。その理由は、糖鎖のないEPOは、糖鎖を有するものに比べて、体内から迅速に除去され、その半減期が非常に短いからである。ゆえに、EPOにおける糖鎖の存在は、EPOの生物学的活性に非常に重要な役割を果たしている。
【0004】
現在まで、EPOの活性を増加させるために多くの研究が盛んに行われてきた。そのうち主流をなしたのは、突然変異誘発技術を用いてEPO遺伝子に突然変異を誘導することによっていくつかのアミノ酸を置換させる方法である。例えば、PCT/US94/09257(発明の名称:Erythropoietin Analogs、出願人:Amgen Inc.)には、突然変異誘発によりEPOの糖鎖含量を増加させることによって生体内半減期を増進させる方法が開示されている。また、EPOの二量体形成により生体内半減期を増加させようとする試みもあった(A.J. Sytkowski et al., J.B.C. vol.274, No.35, pp.24773-24778)。その他にも、遺伝子操作を用いてEPO分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させて、EPOの糖鎖含量、具体的には、シアル酸の含量を増加させることによって、EPOの生体内活性を増進させる方法がある。しかしながら、上記方法に使用されるアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片の種類が非常に制限される。多くの場合、このような遺伝子の修飾は、蛋白質の特定の活性を低下または失活させたり、またはこれらの物質を生体内で使用する際にしばしば生じる抗原性の問題を引き起こす可能性がある。
【0005】
一方、EPOに関するものではないが、融合蛋白質またはキメラ蛋白質に関する研究が行なわれており、これらの例としては、例えば、性ホルモンの一種の卵胞刺激ホルモンに対するものがある(Furuhashi et al., 1995, Mol.Endocrinol.)。しかしながら、このような蛋白質は、遺伝子操作を用いて遺伝子が修飾された蛋白質には問題があるため、実際に適用された例はなかった。また、修飾された蛋白質自体を得ることは容易ではなく、高度の技術が要求される。加えて、新しいアミノ酸の付加または置換によって、蛋白質の活性が減少したりまたは失われたりすることが多かった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、EPO分子をそのカルボキシル末端にHCGβサブユニットのCTP変異体に融合されてなる、ヒトEPOの生体内活性が増進した融合蛋白質を提供することである。
【0007】
本発明の他の目的は、当該融合蛋白質をコード化する核酸、当該核酸を含有する組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞系を提供することである。
【0008】
本発明のさらなる他の目的は、当該形質転換またはトランスフェクションされた細胞系を培養することによる増進したヒトEPO活性を有する融合蛋白質を製造する方法を提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、EPO分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質(断片)を融合することによって、EPOの生体内活性を増進させうる新規な方法を開発することに鋭意検討を行なった結果、EPOに、インビボで自然に生じる(naturally occurring)蛋白質であるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(本明細書中では、「HCG」とも称する)のβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド(本明細書中では、「CTP」とも称する)断片を融合することによって得られる融合蛋白質が、EPOの生体内活性を劇的に促進することを見出した。また、この際のEPOは、EPOの固有の活性を維持しつつ糖鎖部位を増加させる機能を有するアミノ酸を含むものであった(韓国特許出願第10−2000−0075230号を参照)。
【0010】
上記知見に加えてさらに鋭意検討を行なった結果、本発明者らは、驚くべきことに、ペプチド中の糖鎖部位を予め除去したCTP変異体はEPOの生体内半減期を画期的に増加させることを見出した。この知見により、EPOの糖鎖含量を増加させることなく、アミノ酸配列を用いてEPOの生体内安定性を増加できるCTP変異体を開発するに至り、このような知見に基づいて、本発明を完成した。
【0011】
すなわち、配糖化部位を予め除去したCTP変異体を利用する本発明は、EPOの糖鎖含量の増加により生体内半減期を増加させる従来の方法とは有意に異なるものであり、本発明はEPOの生体内安定性を増加できるCTP変異体の発見に基づくものである。
【0012】
すなわち、上記諸目的は、下記(1)〜(6)によって達成される。
【0013】
(1) ヒトエリスロポエチン(EPO)のカルボキシル末端に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(HCG)βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド(CTP)断片のアミノ酸配列の121、127、132及び138番目のセリン残基(Ser)がアラニン残基(Ala)またはグリシン残基(Gly)に置換された変異体が融合した融合蛋白質であって、前記融合蛋白質が下記アミノ酸配列(A)〜(D)のいずれかを有することを特徴とする融合蛋白質。
【0014】
アミノ酸配列(A)
【化5−1】
アミノ酸配列(B)
【化5−2】
アミノ酸配列(C)
【化5−3】
アミノ酸配列(D)
【化5−4】
【0017】
(2) 前記(1)に記載の融合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸。
【0018】
(3) 前記(2)に記載の核酸を含む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法。
【0019】
【発明の実施の形態】
本発明の第一は、ヒトEPOのカルボキシ末端にHCGβサブユニットのCTP断片のアミノ酸が1〜4個置換された変異体(本明細書中では、「ATP」とも称する)が融合された、生体内ヒトEPO活性が増進した融合蛋白質を提供するものである。本発明の融合蛋白質は、従来のものと異なり、EPOの糖鎖含量を増加させずに生体内EPO活性を増進させることができる。前記CTP断片は、下記配列番号:1に記載されたHCGβサブユニットのアミノ酸配列の112〜145番目のアミノ酸またはその一部、特に好ましくは118〜145番目のアミノ酸を含むことが望ましい。なお、下記アミノ酸配列(配列番号:1)は、HCGβサブユニットのアミノ酸配列の112〜145番目のアミノ酸に相当するため、例えば、配列番号1のアミノ酸配列の1番目のアミノ酸は、HCGβサブユニットのアミノ酸配列の112番目のアミノ酸に相当し、配列番号1のアミノ酸配列の34番目のアミノ酸は、HCGβサブユニットのアミノ酸配列の145番目のアミノ酸に相当する。
【0020】
<HCGβサブユニットのアミノ酸配列の112〜145番目のアミノ酸配列(配列番号:1)>
CTP断片の変異体であるATPは、そのアミノ酸配列により、即ち、EPOの糖鎖含量を増加させることなく、EPO分子の生体内半減期を増加させて、ゆえに生体内EPO活性を増進させる機能を有するものである。したがって、ATPにおける変異が起こるアミノ酸置換の特定位置及び置換されるアミノ酸の種類は、融合蛋白質の生体内エリスロポエチン活性増進作用に悪影響がないかぎり、特に制限されるものではない。すなわち、融合蛋白質がエリスロポエチンの生体内活性を増進させる活性を維持するかぎり、該当位置範囲内のアミノ酸はいずれの位置でいずれのアミノ酸でも置換が可能である。
【0021】
例えば、ATPは、配列番号:1に記載されるHCGβサブユニットのアミノ酸配列の121、127、132及び138番目の位置のアミノ酸(Ser残基)のうち一つ以上が置換されたものであることがより好ましく、最も望ましくは、当該配列の121、127、132及び138番目の位置のセリン残基(Ser)がアラニン残基(Ala)またはグリシン残基(Gly)、特に望ましくは図1に示されるようにAla(HCGβサブユニットのアミノ酸配列の121、127、132及び138番目の位置のアミノ酸(Ser残基)は配列番号:1の10、16、21、及び27番目のSer残基であり、それぞれ、図1中の4、10、15及び21番目のAlaに相当)に置換されたものである。本実施態様による融合蛋白質は、下記配列番号:2に記載されたアミノ酸配列を有する。即ち、配列番号2に記載されるアミノ酸配列は、本発明の特に好ましい一実施態様によるEPOとATPとの融合蛋白質(本明細書中では、「EATP」とも称する)のアミノ酸配列を示すものである。ここでは、配列番号:2の196、202、207及び213番目の位置のアミノ酸が、それぞれ、配列番号:1のアミノ酸配列の121、127、132及び138番目の位置のアミノ酸に相当し、SerがAlaに置換されている。前記位置のSerがAlaに置換されうる事実からみて、Alaと類似した大きさ及び電荷を有する他のアミノ酸、例えば、Glyも、Alaと同様にして、置換が可能である。
【0022】
<EPOおよびHCGβサブユニットのCTP断片の変異体(ATP)との融合蛋白質(EATP)アミノ酸配列(配列番号:2)>
本発明の第二は、本発明の融合蛋白質をコード化する核酸、当該核酸を含む組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞系、望ましくはCHO(chinese hamster ovary)細胞株を提供するものである。
【0023】
本発明の第三は、本発明の細胞系(細胞株)を培養することによる、増進したヒトEPO活性を有する融合蛋白質を製造する方法を提供するものである。
【0024】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0025】
本発明の融合蛋白質は、EPOのカルボキシル末端に所望のATPが融合されたものであれば、その製造方法は、特に制限されず公知の方法が使用でき、また、これをコード化する核酸、当該核酸を含む組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞系もまた、特に制限されず公知の方法が使用できる。一般的には、本発明は、目的とする融合蛋白質の遺伝子の確保及びクローニング、目的とする遺伝子の発現ベクターの作製、当該ベクターの動物細胞への形質転換/トランスフェクション及びEATPの発現、ならびに発現されたEATPの分離(精製)及び活性度測定の段階を経る。
【0026】
以下、各工程ごとに説明する。
【0027】
(1) 遺伝子の確保及びクローニング
EPOの相補的DNA(cDNA)は、特に制限されず、公知の方法を用いて得られる。一実施態様によると、ヒト胎児の肝のcDNAライブラリー(Invitrogen Corp.)からあらかじめ調製されたEPO cDNAの両末端と相補的なプライマーEP1、EC2を使用して、RT−PCR PreMix Kit(Bioneer)を用いた公知のRT−PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)技術によって得られる。上記実施態様において使用されるプライマーEP1及びEC2の塩基配列を以下に示す。
【0028】
EP1:ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号:3)
EC2:GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号:4)
次に、このようにして得られたEPO cDNAを、クローニングベクターのpGEM−T(Promega Corp.)にクローニングして、pGEMT−EPOを得、その塩基配列を確認した後、次の操作における鋳型として使用する。なお、上記実施態様においては、特定のクローニングベクターを使用したが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の公知のクローニングベクター及びクローニング方法を使用してもよい。
【0029】
本発明で使用されるHCGβサブユニットのCTP遺伝子変異体の製造方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、HCGβサブユニットのCTP遺伝子変異体は、合成及びセルフプライミングPCR(self-priming PCR)によって得られる。合成された遺伝子断片を、EA1、A2、A3及びA4と称し、その塩基配列を以下に示す。下記塩基配列において、太字で表示した部分は、アミノ酸置換を誘導するための部分である。
【0030】
【化1】
【0031】
上記4つの遺伝子を、それぞれ、1μlずつ取り(50pmole/μl)、高正確度Taqシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)を使用してPCRを行なう。
【0032】
1%アガロースゲルで、約100bpの遺伝子断片(修飾CTP遺伝子)を確認・同定する。これらの遺伝子は、HCGβサブユニット(配列番号:1)の118〜145番目の位置の28個のカルボキシル末端アミノ酸のうち121、127、132及び138番目の4つのSer残基をAla残基に置換して得られた遺伝子をコード化するものである(図1を参照)(HCGβサブユニットのアミノ酸配列の121、127、132及び138番目の位置のアミノ酸(Ser残基)は配列番号:1の10、16、21、及び27番目のSer残基であり、それぞれ、図1中の4、10、15及び21番目のAlaに相当)。
【0033】
pGEMT−EPOを鋳型としてならびに上記EP1及びEC2をプライマーとして使用して、PCRを行なうことによって、EPO遺伝子のみを得る。次に、このEPO遺伝子及び修飾CTP遺伝子双方を鋳型としてならびにプライマーEP11及びEP22を使用して、高正確度Taqシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)によるPCRをさらに行なうことによって、約630bpの遺伝子断片を有する所望の融合遺伝子(「EATP遺伝子」と称する)を得る。なお、ここで使用されたプライマーEP11及びEP22の塩基配列を以下に示す。
【0034】
EP11:TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号:9)
EP22:TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(配列番号:10)
これらの遺伝子をクローニングベクターであるpGEM−Tにクローニングした後、塩基配列を確認する(これを、本明細書中では、「pGEMT−EATP」と称する)(図3を参照)。
【0035】
(2) 発現ベクターの構築
所望の融合遺伝子(EATP遺伝子)を発現させるための発現ベクターは、特に制限されず、発現宿主の種類によって、公知の発現ベクターから適宜選択されて使用できる。例えば、pcDNA3.1ベクター(Invitrogen)が、発現ベクターとして使用される。上記(1)で作製されたpGEMT−EATPのEATP遺伝子の両末端は、プライマーEP11及びEP22由来のHindIII及びBamHIの制限酵素部位を有する。これを利用して、発現ベクターとしてのpcDNA3.1及び上記(1)で得られたpGEMT−EATPを、制限酵素HindIIIとBamHIとで処理する。線形化されたpcDNA3.1及びEATP遺伝子を、Qiagen溶出キットを用いてアガロースゲルから得た後、ライゲーション(連結)して、これを大腸菌 NM522株に形質転換する。LB−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後、現れたコロニーからプラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素HindIII及びBamHIで処理する。さらに、EATP遺伝子が挿入されたプラスミドを、1%アガロースゲル電気泳動によって選択する。このプラスミドをpcDNA3.1−EATPと命名する(図3中では、単に「pcDNA−EATP」)。
【0036】
(3) CHO細胞へのトランスフェクション(形質転換)及びEATPの発現
上記(2)で調製された発現プラスミドからの所望のEATPの発現のために使用される宿主細胞やそれからの所望のEATPの発現方法は、特に制限されず、使用された宿主細胞によって公知の方法が適宜選択できる。以下に、宿主細胞としてCHO(chinese hamster ovary)細胞株を使用する場合の実施態様を記載する。CHO細胞(DG44)を、60mm細胞培養皿で生育させて、40〜80%コンフルエントな細胞(1〜4×105細胞/60mm皿)を調製する。スーパーフェクション試薬(superfection reagent)(Boehringer Manheim Corp.)3μl及び細胞培地(培養基(media)を含むが、血清及び抗生物質を含まないα−MEM)97μlをよく混合する。この混合液に、上記(2)で得られたプラスミドpcDNA3.1−EATP(0.1μg/μl以上)約2μg及びジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子を含むベクターpLTRdhfr26(ATCC37295)0.2μgを添加して、室温で5〜10分間反応させた後、上記で調製されたCHO細胞に加える。1日経過後、培地を、10%FBSを有する培養基(media)を含まないα−MEM(500μg/ml G418を含む)培地に交換する。細胞を、500μg/ml G418が添加される培養基(media)を補充して、7〜10日間培養する。ここで、G418耐性遺伝子を持たない細胞及び陰性対照群の細胞はすべて死滅する。G418培地で選別された細胞を十分に培養した後、培地で発現したEATP蛋白質を、EPO ELISAキット(Boehringer Manheim Corp.)を用いて確認する。
【0037】
(4) 発現したEATP蛋白質の精製
上記(3)で作製されたEATP蛋白質を発現する細胞からの所望のEATP蛋白質の精製方法は、特に制限されず、アフィニティクロマトグラフィー等の公知の方法が使用できる。以下に、その一実施態様を説明する。
【0038】
まず、抗−EPOモノクローナル抗体(R&D社)を用いて、分離精製用のアフィニティ樹脂を下記のようにして調製する。
【0039】
0.3gのCNBrで活性化されたセファロース4B(Sepharose 4B)を、1mM HCl中で20分間、膨潤させて、樹脂をカラムに移した後、1mM HClで洗浄する。次に、このようにして得られた樹脂をさらに4mlのカップリング緩衝液(0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3)で洗浄し、チューブに移した後、直ちにカップリング緩衝液に入っている抗−EPOモノクローナル抗体(500μg/バイアル)とチューブ内で混合して、室温で2時間反応させる。この時、チューブを十分振盪する。さらに、このようにして得られた反応産物を、ブロッキング緩衝液(0.2Mグリシン、pH8.0)で置換した後、攪拌しながら室温で2時間反応させる。このようにして得られた樹脂を、6.5mlのカップリング緩衝液、6.5mlのアセテート緩衝液(0.1M 酢酸、0.5M NaCl、pH4)及び6.5mlのカップリング緩衝液で順次洗浄する。このように調製された樹脂をカラムに充填して、次のように精製を実施する。
【0040】
上記(3)で得られた細胞を、無血清培養液で一日生育させた後、培養液だけをCentriprep(Millipore Corp.製、カットオフ10,000)を用いて約5倍濃縮する。次に、この濃縮液を、約20ml/hrの流速でPBSで平衡化させたカラムにのせて、再びPBSで洗浄する。所望の蛋白質を溶出緩衝液(0.1Mグリシン、pH2.8)で溶出させた後直ちに、1Mトリス(Tris)溶液でpH7.5になるように滴定する。EATPの純度をSDS−PAGE及び銀染色で確認したとところ、97%以上である(図4)。
【0041】
(5)バイオアッセイ法による活性測定及び生化学的分析
上記(4)で精製されたEATP及びコントロールとしてのEPOの生物学的活性の測定及びそれらの生化学的分析が行なわれるが、その際の測定及び分析方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。以下に、その一実施態様を記載する。
【0042】
発現され及び適当に精製されたEPO及びEATPの生物学的活性を、フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾細胞を用いたバイオアッセイによって測定する。その結果、EATPの活性がEPOのものより高く現れることから、EATPで添加されたカルボキシル末端の存在がEPOの活性自体を阻害しないことが示唆される。
【0043】
(6)薬物動態試験
調製された候補物質、即ち、EATPが実際より長い生体内での半減期を有するかどうかを確認するために、薬物動態試験を、例えば、マウスを対象で実施する。この際使用できる確認方法は、特に制限されず公知の方法が使用でき、その対象動物もまたマウスに制限されず、ラットやウサギ等の他の動物が使用できる。以下に、その確認方法の一実施態様を示す。候補物質を、4匹のマウスに1匹当り20ユニットの投与量で静脈内投与する。経時的血中濃度を確認するために、血液をマウスから集め、EIAキット(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、血中濃度を決定する。マウスで行なわれた薬物動態試験から、候補物質であるEATPはコントロール物質であるEPOよりかなり長い半減期を有することが分かる(図5を参照)。
【0044】
【実施例】
以下、本発明を実施例を参照しながらより具体的に説明するが、本発明の範囲は下記実施例によって制限されない。
【0045】
実施例1:遺伝子の確保
EPOのcDNAを、ヒト胎児の肝臓のcDNAライブラリー(Invitrogen Corp.)であらかじめ調製されたEPO cDNAの両末端と相補的なプライマーEP1、EC2を使用した、RT−PCR PreMix Kitを用いた公知のRT−PCR技術(Bioneer Corp., Korea)によって得た。なお、PCR反応は、55℃で35秒(アニーリング)、72℃で40秒、及び94℃で20秒の条件下で、30サイクル行なわれ、これによりEPO cDNAが調製された。また、この際使用されるプライマーEP1及びEC2の塩基配列は、下記のとおりである。
【0046】
EP1:ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号:3)
EC2:GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号:4)
次に、このようにして得られたEPO cDNAを、クローニングベクターのpGEM−T(Promega Corp.)にクローニングした。より詳細に述べると、上記操作で得られたPCR産物を、1%アガロースゲルから溶出して、pGEM−Tに連結した後、大腸菌NM522に形質転換させた。X−gal/IPTGを塗り付けたLB−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後、白色コロニーらからプラスミドDNAを単離し、これを制限酵素SacI、SacIIで処理して、EPO cDNAが挿入されているコロニーを選別した。得られたベクターをpGEMT−EPOと命名して、その塩基配列を確認した後、次の操作における鋳型として使用した。
【0047】
HCGβサブユニットの修飾されたCTP遺伝子を、合成及びセルフプライミングPCRを利用して得た。合成された遺伝子断片は、EA1、A2、A3及びA4を、EA1、A2、A3及びA4と称し、その塩基配列を以下に示す。
【0048】
EA1:AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCG(配列番号:5)
A2:GGAAGGGCGGGGGGAGGGGCCTTGGCGGAAGAGGA(配列番号:6)
A3:CCGCCCTTCCAAGCCCAGCCCGACTCCCGGGGCCC(配列番号:7)
A4:TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCGGCGGGCCCCG(配列番号:8)
これら4つの遺伝子を1μmずつとって(50pmole/(l)、高正確度Taqシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、55℃で40秒(アニーリング)、72℃で40秒及び94℃で20秒の条件下で計15サイクルのPCRを行なった。1%アガロースゲルで約100bpの遺伝子断片を確認した(修飾されたCTP遺伝子)。
【0049】
この遺伝子は、HCGβサブユニットの28個のカルボキシル末端のアミノ酸の121、127、132及び138番目の4個のSer残基がAlaに置換されたペプチドをコード化するものである(図1)(HCGβサブユニットのアミノ酸配列の121、127、132及び138番目の位置のアミノ酸(Ser残基)は配列番号:1の10、16、21、及び27番目のSer残基であり、それぞれ、図1中の4、10、15及び21番目のAlaに相当)。
【0050】
pGEMT−EPOを鋳型としてならびに上記EP1及びEC2をプライマーとして使用して、前記と同じ条件でPCRを行なうことによって、EPO遺伝子だけを得た。次に、このEPO遺伝子及び上記で得られた修飾されたCTP遺伝子双方を鋳型としてならびにプライマーEP11及びEP22を使用して、高正確度Taqシステム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim Corp.)を用いて、57℃で42秒(アニーリング)、72℃で1分、及び94℃で20秒の条件下で30サイクルのPCRをさらに行なうことによって、約630bpの融合遺伝子断片(「EATP遺伝子」と称する)が得られた。なお、ここで使用されたプライマーEP11及びEP22の塩基配列を以下に示す。
【0051】
EP11:TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号:9)
EP22:TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(配列番号:10)
これらの遺伝子を、前記と同じ方法でクローニングベクターであるpGEM−Tにクローニングした後、その塩基配列を確認する(pGEMT−EATPと称する)(図3)。
【0052】
実施例2:発現ベクターpcDNA3.1−EATPの構築
本実施例では、pcDNA3.1ベクター(Invitrogen)を、発現ベクターとして使用した。実施例1で作製されたpGEMT−EATPのEATP遺伝子の両末端は、プライマーEP11及びEP22由来のHindIII及びBamHIの制限酵素部位を有する。
【0053】
これを利用して、発現ベクターとしてのpcDNA3.1及び実施例1で得られたpGEMT−EATPを、制限酵素HindIIIとBamHIで消化した。線形化されたpcDNA3.1及びEATP遺伝子を、Qiagen溶出キットを用いてアガロースゲルから得た後、ライゲーション(連結)して、これを大腸菌 NM522株に形質転換した。LB−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後に現れたコロニーからプラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素HindIII及びBamHIで処理した。さらに、EATP遺伝子が挿入されたプラスミドを、1%アガロースゲル電気泳動によって選択した。このようにして得られたプラスミドをpcDNA3.1−EATPと命名する(図3参照;ただし、図3中では、単に「pcDNA−EATP」として示される)。
【0054】
実施例3:CHO細胞の形質転換及びEATP発現
CHO細胞(DG44)を、60mm細胞培養皿で生育させて、40〜80%コンフルエントな細胞(1〜4×105細胞/60mm皿)を調製した。スーパーフェクション試薬(superfection reagent)(Boehringer Manheim Corp.)3μl及び細胞培地(培養基(media)を含むが、血清及び抗生物質を含まないα−MEM)97μlをよく混合した。この混合液に、実施例2で得られたプラスミドpcDNA3.1−EATP(0.1μg/μl以上)約2μg及びジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子を含むベクターpLTRdhfr26(ATCC37295)0.2μgを添加して、室温で5〜10分間反応させた後、上記で調製されたCHO細胞に加えた。1日経過後、培地を、10%FBSを有する培養基(media)を含まないα−MEM(500μg/ml G418を含む)培地に交換した。細胞を、500μg/ml G418を含む培養基を補充して、7〜10日間培養する。ここで、G418耐性遺伝子を持たない細胞及び陰性対照群の細胞はすべて死滅した。G418培地で選別された細胞を十分に培養した後、培地で発現したEATP蛋白質を、EPO ELISAキット(Boehringer Manheim Corp.)を用いて確認した。
【0055】
実施例4:発現されたEATPの精製
まず、抗−EPOモノクローナル抗体(R&D)社を用いて、分離精製用のアフィニティ樹脂を下記のようにして調製した。
【0056】
0.3gのCNBrで活性化されたセファロース4B(Sepharose 4B)を、1mM HCl中で20分間、膨潤させて、この樹脂をカラムに移した後、1mM HClで洗浄した。次に、このようにして得られた樹脂をさらに4mlのカップリング緩衝液(0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3)で洗浄し、チューブに移した後、直ちにカップリング緩衝液に入っている抗−EPOモノクローナル抗体(500μg/バイアル)とチューブ内で混合して、攪拌しながら室温で2時間反応させた。この時、チューブを十分振盪した。さらに、このようにして得られた反応産物を、ブロッキング緩衝液(0.2Mグリシン、pH8.0)で置換した後、室温で2時間反応させた。このようにして得られた樹脂を、6.5mlのカップリング緩衝液、6.5mlのアセテート緩衝液(0.1M 酢酸、0.5M NaCl、pH4)及び6.5mlのカップリング緩衝液で順次洗浄した。このように調製された樹脂をカラムに充填して、次のように精製を実施した。
【0057】
実施例3で得られた形質転換CHO細胞を、無血清培養液で一日生育させた後、培養液だけをCentriprep(Millipore Corp.製、カットオフ10,000)を用いて約5倍濃縮した。次に、この濃縮液を、約20ml/hrの流速でPBSで平衡化させたカラムにのせて、再びPBSで洗浄した。所望の蛋白質を溶出緩衝液(0.1Mグリシン、pH2.8)で溶出させた後直ちに、1Mトリス(Tris)溶液でpH7.5になるように滴定した。EATPの純度をSDS−PAGE及び銀染色で確認したとところ、97%以上であった(図4)。
【0058】
実施例5:バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンを、マウスに1日1回の割合で2日間、60mg/kg、投与した。3日後、肥大した脾臓をマウスから単離し、ホモゲナイザーで破砕して、脾細胞を得た。この脾細胞を6×106細胞/mlに希釈して、この希釈サンプルを96ウェルのプレートに100μlずつ分取した。それぞれのウェルに、標準EPO(0〜500mU/ml)及び発現されたEPO及びEATP(実施例4)を、それぞれ、100mU/mlの濃度で加えた後、プレートを、37℃に維持されたCO2インキュベーターで22時間、放置した。各ウェルにジメチル−3[H]−チミジン(20μCi/ml)を50μずつ添加した。このプレートを、さらに同じインキュベーターで2時間反応させた後、各ウェルのサンプル溶液をガラスフィルター(Nunc 1-73164)に吸着させた。このフィルターを生理食塩水で3回洗浄して、ベータ(β)カウンターを用いて各フィルターの放射能量を測定して、EPO及びEATPの活性を測定した。測定結果から、EATPの活性はEPOのものと実質的に同等であるあるいは若干高いことが示された。これから、EATPに添加されたカルボキシル末端の存在はEPOの活性を阻害しないことが示唆される。
【0059】
実施例6:薬物動態試験
本実施例では、候補物質が実際より長い生体内での半減期を有するかどうかを確認するために、薬物動態試験をマウスで行なった。すなわち、実施例5で調製・精製された融合蛋白質(EATP)を、4匹のマウスに1匹当り20ユニットの投与量で静脈内投与した。経時的血中濃度を確認するために、始めは30分間隔でおよび2時間以後では2時間間隔でマウスから採血した後、EIAキット(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、血中濃度を測定した。その結果を図5に示す。図5に示されるように、候補物質であるEATPは、コントロール物質であるEPOより、2.5倍以上という有意により長い半減期を有する。
【0060】
【発明の効果】
本発明は、(1)ヒトエリスロポエチン(EPO)のカルボキシル末端に、HCGβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド(CTP)断片のアミノ酸が1〜4個置換された変異体が融合されることを特徴とする融合蛋白質;(2)当該融合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸;ならびに(3)当該核酸を含む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法を提供するものである。したがって、本発明によれば、そのアミノ酸配列によるEPO固有の活性自体には影響を与えずに、即ち、EPOの糖鎖含量の増加させることなく、生体内での半減期を画期的に増加させることによって、EPOの生体内での活性が増進できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】は、本発明の特に好ましい一実施態様によるHCG変異体であるATP(修飾CTP遺伝子)の塩基及びアミノ酸配列を示すものである。
【図2】は、本発明の特に好ましい一実施態様によるEPOとATPとの融合蛋白質(EATP)の塩基及びアミノ酸配列を示すものである。
【図3】は、発現ベクターpcDNA3.1−EATPの作製過程を示す模式図である。
【図4】は、精製されたEATPの電気泳動写真である。
【図5】は、EATP及びEPOの薬物動態結果を示すグラフである。
【配列表】
Claims (3)
- 請求項1に記載の融合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法。
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