HU210608A9 - Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik. - Google Patents

Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik. Download PDF

Info

Publication number
HU210608A9
HU210608A9 HU9400026P HU9400026P HU210608A9 HU 210608 A9 HU210608 A9 HU 210608A9 HU 9400026 P HU9400026 P HU 9400026P HU 9400026 P HU9400026 P HU 9400026P HU 210608 A9 HU210608 A9 HU 210608A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
sequence
protein
igf
insulin
Prior art date
Application number
HU9400026P
Other languages
English (en)
Inventor
William I Wood
Robert C Baxter
Original Assignee
Genentech Inc
Cent Sydney Area Health Serv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc, Cent Sydney Area Health Serv filed Critical Genentech Inc
Priority to HU9400026P priority Critical patent/HU210608A9/hu
Publication of HU210608A9 publication Critical patent/HU210608A9/hu

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya egy inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint eszközök és eljárás ennek terápiás szempontból jelentős mennyiségben történő előállítására.
Az inzulinszerű növekedési faktor (IGF) család peptidjeit és ezek rekombináns előállítását például a következő szabadalmi dokumentumban ismertették: Lee et al 128 733 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1984.12.19-én). A megfigyelések szerint a peptidek a keringésben, más testfolyadékokban és a tenyésztett sejtek által kondicionált közegekben kötőproteinekkel társult formában vannak. Eddig két, különböző folyadékokban talált IGF-kötő proteint azonosítottak és jellemeztek. Hintz, R. L. (1984) Clinics in Endo. and Métából., 13 : 3M2; Martin, J. L. és Baxter, R. C. (1986) J. Bioi. Chem., 261: 8754-8760; Povoa et al. (1984) Evr. J. Biochem. 144:199-204. Ezek egyike a felnőtt szérumban dominál, míg a másik az amniotikus folyadékban található nagy koncentrációban. Baxter et al. (1987) J. Clin. Endo. and Métából., 65: 423-431.
Megfigyelték, hogy a felnőtt szérumban lévő kötőprotein-koncentrációk visszatükrözik a növekedésihormon (growth hormon; GH) hiányos vagy az acromegaliás egyedek GH-állapotát. Eszerint a kötőprotein nagy koncentrációja a nagy GH-koncentrációval áll összefüggésben. Martin és Baxter (1985), J. Clin. Endo and Métából. 61 : 799-801. Ezt a kötőproteint GH-függő IGF-kötő proteinnek nevezték el. Az egyszerűsítés érdekében a továbbiakban a humán plazmából származó GH-függő kötőproteint BP53 jelzéssel, míg az első ízben az amniotikus folyadékból izolált kötőproteint BP28 jelzéssel látjuk el, illetve a továbbiakban ezeknek megfelelően hivatkozzuk az említett kötőproteineket. A jelzések egyben indikálják a nemredukáló nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) útján tisztított proteinek méretét.
A BP53 egy olyan, a humán plazmában lévő, 120150 kD (kilodalton) molekulatömegű glikoproteinkomplex savval szemben stabil komponense, amely az endogén IGF-ek legtöbbjét hordozza, s amelyet a GH is szabályoz. White et al. (1981) J. Clin. Endo. and Métából. 53: 49. oldaltól; Hintz et al. (1981) J. Clin. Endo. and Métából. 53:1 00. oldaltól; valamint Daughaday et al. (1982) J. Clin. Endo. and Métából. 55: 916. oldaltól. A komplex kötőkomponense - megsavanyítás után tisztítva - SDS-PAGE szerint 43 kD-os (redukált) és 53 kD-os (nemredukált) molekulatömeggel rendelkezik. A tisztított proteinnek az IGF-I-gyel és az IGF-II-vel szemben jelentős affinitása van (Ka = 20-40 nM’1). Martin és Baxter, J. Bioi. Chem., op. cit. A BP53 koncentrációja normál felnőtt plazmában 6,1 mg/1 értékű. Az acromegaliás alanyokban a BP53 koncentrációja egészen 13,5 mg/1 értékre felmegy, míg a GH-hiányos alanyok esetén 2-3 mg/1 értékre csökken. Baxter és Martin, (1986) J. Clin. Invest., 78: 1504— 1542. Habár az amniotikus folyadékban a BP28 dominál, az amniotikus folyadékban körülbelül 4,6 mg/1 koncentrációban a BP53 is megtalálható. A BP53 patkányhomológját megtisztították, és megállapították, hogy az figyelemre méltó N-terminális aminosavszekvencia-homológiát mutat a humán proteinnel. Baxter és Martin (1987) Biochem. Biophys. Rés. Comm., 147: 408^415.
Gélfiltrációs kromatográfia alapján meghatározva a BP28 35-40 kD-os molekulatömeggel rendelkezik [Drop et al. (1984) J. Clin. Endo. and Métából., 59: 899. oldaltól), hasonlóan az SDS-PAGE útján nyert 32 kD-os (redukált) és 28 kD-os (nemredukált) értékekhez. A tisztított protein az IGF-I-et és az IGF-U-t egyaránt köti, azonban a BP53-énál kisebb affinitással (Ka = 3-7 nM'1). Az amniotikus folyadékban a BP28 esetén Baxter et al. (fentebb) 37-148 mg/1 koncentrációértékekről számoltak be. Miközben a felnőtt szérumban a BP53 dominál, a BP28 is jelen van a szérumban, mégpedig 0,02-0,35 mg/1 koncentrációtartományban, jellegzetesen 06.00 és 08.00 óra közötti napi maximummal rendelkező ciklusnak megfelelően. Baxter és Cowell (1987) J. Clin. Endo. and Métából., 65: 432-440. A BP53 esetében nem találtak ilyen jellegű napi változást. Az N-terminális aminosav-szekvencia adatai azt mutatják, hogy két további humán protein, nevezetesen a placentából izolált PP12 [Koistinen et al. (1986) Endocrin., 118: 1375. oldaltól) és egy hepatoma sejtvonal (HEP-G2) tenyésztőközegéből izolált IGFkötő protein [Povoa et al. (1985) Biochem. Biophys. Rés. Comm., 128 : 1071. oldaltól) ugyanolyan, mint a BP28, illetve ahhoz nagyon hasonló. A BRL-3A patkánysejtvonal tenyésztőközegéből is izoláltak egy IGF-kötő proteint. Lyons és Smith (1986) Mól. Cell. Endo. 45: 263-270; Mottola et al. (1986) J. Bioi. Chem. 261: 11180-11188. A hasonló mérettulajdonságok, a nagy magzati szérumkoncentráció és a proteinszekvencia bizonyos hasonlósága alapján úgy tűnik, hogy ez az IGF-kötő protein a BP28 patkányhomológja.
Jóllehet - amint az a fentiekben látható - a BP53 izolálását és tisztítását már leírták a szakirodalomban, a proteinnek a humán plazmában lévő alacsony koncentrációja és a magas költség miatt a korábbiakban nem állt rendelkezésre olyan eljárás, amelynek segítségével megoldható lett volna a tisztított proteinnek a plazmából történő kereskedelmi mennyiségű kinyerése. Ez megakadályozta a proteinnek - akár önmagában, akár IGF-fel együttesen - széles körben történő alkalmazhatóságát.
Az előbbiekkel összhangban a találmány egyik tárgya eljárás BP53-at kódoló DNS izolálására, valamint eljárás a proteinnek egy terápiás szempontból elfogadható forrásból, kereskedelmileg alkalmazható mennyiségben történő előállítására.
A találmány egy további tárgya egy a natív BP53mal együttjáró glikozilezéstól mentes formában lévő BP53 előállítása.
Ugyancsak a találmány részét képezi a BP53 aminosav-szekvenciájának és olyan, egyéb variánsainak előállítása, amelyek észrevehetően nem befolyásolják hátrányosan a protein biológiai aktivitását.
A találmány egy még további tárgya eljárás más, természetes előfordulású (forrású) proteinektől teljesen mentes BP53 előállítására.
A találmánynak ezek és további tárgyai egészükben a leírás további részeiből tűnnek ki.
HU 210 608 A9
A találmány szerinti megoldást BP53-nak rekombináns sejttenyészetekben végzett expresszálása útján valósítjuk meg, amely eljárás alapvetően a következő lépésekből áll: BP53-at kódoló nukleinsavat állítunk elő, a BP53-kódoló nukleinsavval gazdasejteket transzformálunk, majd a protein expresszálása érdekében a sejteket a gazdasejttenyészetben tenyésztjük.
Az egyik egyedi megoldás értelmében a találmány magában foglalja egy olyan DNS izolálását, amely tartalmaz egy a BP53-at kódoló szekvenciát, s ahol a DNS-szekvenciát a következő csoportból választjuk ki:
(a) a 3. ábrán összefoglalt DNS-szekvenciák; és (b) olyan DNS-szekvenciák, amelyek szigorúan meghatározott körülmények között az (a) pontban definiált DNS-szekvenciává hibridizálódnak, valamint legalább körülbelül 10 nukleotidot tartalmaznak.
A DNS-szekvenciát úgy is jellemezhetjük, hogy egy olyan proteint kódoló szekvenciát tartalmaz, amelynek aminosav-szekvenciája kellőképpen duplikatív a BP53 aminosavszekvenciájára nézve, lehetővé téve, hogy a protein a következő biológiai tulajdonsággal rendelkezzen: (1) IGF-kötő jelleg vagy (2) immunológiai keresztreakció egy a megfelelő natív protein legalább egy epitopjával szemben kialakuló antitesttel.
A találmány más megoldásai közé tartoznak a következők: (1) jelölt DNS-szekvenciák vizsgálati célokra, (2) egy promotorhoz kötött működőképes DNSszekvenciák, (3) a fentiekben ismertetett DNS-szekvenciát működőképesen kötött állapotban tartalmazó expresszáló vektorok, amelyek a vektorral transzformáit gazdasejt által felismert szekvenciák kontrolljára szolgálnak, valamint (4) a fentiekben ismertetett expresszáló vektorral transzformált gazdasejtek. A BP53at és IGF-et is tartalmazó expresszáló vektorokat ugyancsak figyelembe vesszük, mivel ezek a vektorok a gazdasejt segítségével képesek mindkét protein együttes expresszálására.
A találmány további részét képezik a BP53 új formái, köztük az olyan BP53, amelyet nem érint a natív glikozilezés, valamint amely a 3. ábrán bemutatott érett protein aminosav-szekvenciájával legalább 80%-os homológiát mutat, továbbá amely a következő biológiai tulajdonságok közül legalább eggyel rendelkezik: (a) IGF-kötő jelleg vagy (b) immunológiai keresztreakció a megfelelő natív kötőprotein legalább egy epitopjával. Az ilyen BP53-at általában egy heterológ rekombináns sejttenyészetben történő expresszió termékeként nyerjük.
A találmány egy további tárgya egy az IGF megkötésére alkalmas gyógyászati készítményre vonatkozik, amely készítmény egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóban a találmány szerinti BP53 protein gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét tartalmazza.
A találmány kiterjed az emlősök anyagcsere-szabályozására alkalmas gyógyászati készítményekre, amely készítmények egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóban inzulinszerű növekedési faktor és a találmány szerinti BP53 protein gyógyászati szempontból hatásos mennyiségeit tartalmazzák.
A találmány magában foglalja a keringő humán plazmában lévő inzulinszerű növekedési faktor koncentrációinak vizsgálatára alkalmas diagnosztikai készítményeket is, amelyek a találmány szerinti BP53-at egy detektálható jelölőegységhez (label moiety) kovalens módon kötött állapotban tartalmazzák.
A jelen találmány lehetővé teszi a BP53 és/vagy a BP53 származékainak rekombináns technikák segítségével történő előállítását, valamint biztosítja az előbbi előállítással kapcsolatos anyagokat és eljárásokat. A BP53 rekombináns módon történő kinyerését magukban foglaló eljárásokat nem egyenes úton végeztük, mivel az első 15 aminosavra vonatkozó, Martin és Baxter, op. cit. által megadott N-terminális szekvenciainformációk nem bizonyultak elegendőnek ahhoz, hogy a korrekt kiónok számára szolgáló könyvtárak szkrínelésére alkalmas próbát nyeljünk. A BP53 számára szolgáló komplett aminosavszekvencia nem volt korábban ismert. A BP53-at kódoló szekvenciákkal rendelkező kiónok azonosításához szükséges hibridizációs próbák előállításához egy hosszabb belső szekvencia kellett. Ezen túlmenően, a korrekt kiónok azonosítása csak úgy volt elvégezhető, amihez négy egyidejűleg végzett próba három-három elkülönített sarzsát kellett alkalmazni, és a korrekt kiónokat reprezentáló foltok így is gyengék voltak.
A találmány alkalmas egy membránrögzítéssel társult állapotban lévő BP53 előállítására is, amelynek eredményeképpen lehetőség nyílik arra, hogy az inzulinszerű növekedési faktor nagyobb hatékonysággal jusson el egy célsejthez (target cell). Az ilyen BP53 előállítását úgy valósíthatjuk meg, hogy a BP53 protein C-terminálisánál rekombináns úton vagy más hasonló módon egy az IGF-I vagy az IGF-II számára szolgáló normál receptor transzmembránját vagy membránkötő doménjét, illetve egy foszfolipid rögzítő (anchor) doménjét felépítő aminosav-szekvenciát vezetünk be. Ebben az esetben a BP53 variánst gazdasejtmembrán-preparátumokból nyerjük ki. Alternatív módon a BP53 a gazdasejt extracelluláris közegébe szekretálható.
A BP53 protein és a BP53 protein variánsai az in vitro és in vivő jelen lévő inzulinszerű növekedési faktor (IGF) speciesek megkötésére alkalmazhatók. Véleményünk szerint a BP53 felhasználható az inzulinszerű növekedési faktor keringési felezési idejének növelésére. Anélkül, hogy bármely elméleti magyarázathoz mereven ragaszkodnánk, úgy véljük, hogy ez a növekedés az IGF-nek a BP53 általi sequestratiójának a következménye, amely az IGF számára mint kontrollált felszabadulási tároló szolgál.
Ezenkívül a BP53 felhasználást nyerhet az IGFkoncentráciők meghatározására szolgáló diagnosztikai szerekben is. Továbbá a jelen találmány szerinti BP53 immunológiai szempontból keresztreaktív egy olyan antitest-preparátummal, amely egy a megfelelő natív BP53 által felismerhető epitoppal rendelkezik, miáltal a jelen találmány szerinti BP53 alkalmassá válik az ilyen antitestek számára szolgáló diagnosztikai reagensként történő felhasználásra is.
A BP53 további felhasználási lehetőségeit az ezen a területen jártas szakember könnyen felismeri.
HU 210 608 A9
AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE
1A-D. Ábra: Ezek az ábrák bemutatják egyrészt a BP53-hoz szükséges cDNS kiónok számára szolgáló humán máj könyvtárak szkrínelésére alkalmazott oligonukleotid próba szekvenciákat, másrészt a kapott cDNS-szekvenciákhoz történő összehasonlítást.
2. Ábra: Ez az ábra bemutatja a BP53 cDNS és az áthelyezett (transziáit) aminosav-szekvencia diagramját. A keretezett üres rész jelzi az érett BP53-at kódoló régiót, és a keretezett fekete rész a vélelmezett szignálszekvenciát. A hidropatiás görbét Kyte és Doolittle módszerének [7. Mól. Bioi., 157: 105-132 (1982)] segítségével nyertük, tíz csoportos ablak alkalmazásával.
3. Ábra: Ez az ábra bemutatja az ibp. 118 cDNS kiónból származó humán BP53 nukleotid- és várt aminosavszekvenciáját. A protein várt aminosavjai a DNSszekvencia alatt láthatók, és számozásuk a proteinszekvencia N-terminálisának első csoportjától kezdődik. A negatív aminosavszámok a feltételezett vezető szignálszekvenciára vagy preproteinre vonatkoznak, míg a pozitív számok az érett proteint jelölik. A szekventált peptidek elhelyezkedését aláhúzással jelöljük. Az aminosav-szekvencia meghatározása során bizonytalan vagy azonosítatlan csoportokat egy alattuk elhelyezett ponttal jelöljük.
4. Ábra: Ez az ábra a végleges expresszáló vektor összeállításához alkalmazott pF8CIS kiindulási expresszáló vektor felépítését mutatja be.
5. Ábra: Ez az ábra az olyan Factor VIII számára szolgáló pCIS2.8c24D intermedier vektor felépítését mutatja be, amelyben a Clal helyre a dam metilezés nem hat. Ugyancsak látható egy fúziós plazmid felépítésére szolgáló Factor VIII kódoló régiója 408 és 416 bp-s fragmentumainak a szubklónozása.
6. Ábra: Ez az ábra egy pUC vektorban lévő Factor Vili variáns fúziós régióját tartalmazó pUC.8d28 intermedier plazmid felépítését mutatja be.
7. Abra: Ez az ábra egy Factor VIII variáns pCIS2.8c28 D proteint kódoló intermedier expresszáló vektor felépítését mutatja be.
8. Ábra: Ez az ábra annak a pRK5 expresszáló vektornak a felépítését mutatja be, amelybe BP53-at kódoló DNS-t inzertáltunk (szúrtunk be).
9. Ábra: Ez az ábra a BP53 termelése érdekében a transzformált emlős gazdasejtekhez felhasznált pRK5.ibp.l expresszáló vektor felépítését mutatja be.
10. Ábra: A lOa-d. Ábra a BP53 emlős sejtekben végzett expresszálásának vizsgálati eredményeit mutatja be. A 10a. Ábra a BP53 esetén elvégzett radioimmun-analízis diagramja, amelyben a körök, a négyzetek és a háromszögek jelentése - az előbbi sorrendnek megfelelően - a következő: tisztított BP53 hozzáadása (ng); pRK5.ibpl.l-gyel transzfektált tenyészközeg hozzáadása (μΐ); és kontrollanyaggal transzfektált tenyészközeg hozzáadása (μΐ). Á 10b. ábra a BP53-nak a jelzett IGF-I-hez (fekete szimbólumok) vagy IGF-Πhöz (üres szimbólumok) való kötődésének a diagramja, amelyben a körök, a négyzetek és a háromszögek jelentése - az előbbi sorrendnek megfelelően - a következő: tisztított BP53 hozzáadása (ng); pRK5.ibpl.lgyel transzfektált tenyészközeg hozzáadása (μΐ); és kontrollanyaggal transzfektált tenyészközeg hozzáadása (μΐ). A 10c. Ábra a jelzett IGF-I-nek a pRK5.ibpl.lgyel transzfektált tenyészközeghez való kötődésének a jelzetlen IGF-I-gyel való kompetitív vizsgálatának a diagramja. A diagramban látható kisebb diagram ugyanazon adatoknak a Scatchard-féle ábrázolása. A lOd. Ábra ugyanaz, mint a 10c. Ábra, azzal az eltéréssel, hogy a kötésvizsgálatot IGF-I helyett a megfelelő IGF-H-vel végeztük.
AZ ELŐNYÖS MEGOLDÁSOK ISMERTETÉSE
A leírásban alkalmazott „inzulinszerű növekedési faktort kötő protein” vagy „BP53” kifejezés egy a 3. Ábra szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező, emlős inzulinszerű növekedési faktort kötő proteinre, valamint ennek a natív BP53 biológiai aktivitásával rendelkező' analógjaira és variánsaira vonatkozik. A natív BP53 biológiai aktivitásával bír valamennyi olyan analóg vagy variáns, amely képes az IGF (szokásosan az IGF-I vagy az IGF-II) specifikus kötésére, illetve rendelkezik egy olyan immun epitoppal, amely immunológiai szempontból keresztreaktív egy a natív protein legalább egy epitopjával szemben kialakuló antitesttel. A molekuláris szerkezet szempontjából az analógokat és a variánsokat úgy definiálhatjuk, hogy ezek molekuláiban a natív BP53 aminosav-szekvenciáját, glikozilezését vagy más jellemzőit kovalens vagy nemkovalens jelleggel módosítottuk. Ennek megfelelően a variánsok (redukálószer, például β-merkapto-etanol vagy ditiotreit hiányában végrehajtott SDS-PAGE szerint meghatározva) 53 kD-os vagy ettől eltérő molekulatömeggel rendelkezhetnek. Például a natív érett szekvenciával rendelkező, nemglikozilezett BP53 molekulatömege a nemredukáló SDS-PAGE alapján körülbelül 28,7kD lesz. Az aminosav-szekvencia variánsok nemcsak a 3. Ábra szerinti szekvencia alléljeit foglalják magukban, hanem ennek az előre meghatározott mutációit is. Általában a változtatható aminosav-szekvencia variánsok olyan aminosav-szekvenciával rendelkeznek, amelyek legalább 80%-ban, még inkább legalább 90 %-ban homológok a 3. Ábra szerinti natív BP53 aminosav-szekvenciájával. Az előbbiek értelmében tehát a BP53 kifejezés - más megjegyzés híján - a natív szekvenciát vagy egy variánsformát jelent.
A jelen találmány oltalmi körébe tartoznak a következő, BP53 aktivitást mutató BP53 proteinek: amelyek rendelkeznek a natív glikozilezéssel és aminosav-szekvenciájuk megegyezik a 3. Ábra szerintivel; a más állati speciesekből, például szarvasmarhából, lóból, sertésből, juhból, kutyából, patkányból, egérből, macskából stb. származó BP53 analógok; az ilyen BP53 proteinek deglikozilezett és nemglikozilezett származékai; a BP53 biológiailag aktív aminosav-szekvencia variánsai, köztük az allélek; és a BP53 in vitro képzett kovalens származékai.
A BP53 aminosav-szekvencia variánsai magukban foglalják például a 3. Ábra szerinti BP53 aminosavszekvencia esetén végzett csoporttörléseket (deléciókat), csoportbeszúrásokat (inzerciókat) vagy csoport4
HU 210 608 A9 helyettesítéseket (szubsztitúciókat). Amennyiben a végső konstrukció rendelkezik a kívánt aktivitással, ennek megalkotása során a deléciók, inzertálások és helyettesítések bármely kombinációja is végrehajtható. Nyilvánvaló, hogy a variáns BP53-at kódoló DNS-ben végrehajtandó mutációk nem érinthetik a leolvasási szakasz szekvenciáját, mimellett előnyösen nem alkotnak olyan komplementer régiókat, amelyek szekunder mRNS szerkezetet hozhatnak létre (lásd a 75 444. számú európai szabadalmi bejelentést).
Ezeket a variánsokat szokásosan a BP53-at kódoló DNS-ben lévő nukleotidok helyre irányuló mutagenezisével állítjuk elő, miáltal a variánst kódoló DNS-t állítunk elő, majd ezt követően a DNS-t rekombináns sejttenyészetben expresszáljuk. Ugyanakkor azonban a legfeljebb körülbelül 100-150 csoportból álló BP53 variáns fragmentumokat kényelmesen előállíthatjuk in vitro szintézis útján is. A variánsok általában ugyanolyan minőségű biológiai aktivitást mutatnak, mint a természetesen előforduló analógok.
Mivel az aminosav-szekvencia változásának bevezetésére szolgáló hely előre meghatározott, a mutációt önmagában nem kell előre meghatározni. Például egy adott helyen végrehajtandó mutáció optimalizálása érdekében a random (véletlenszerű) mutagenezist össze lehet kapcsolni a cél kodonnal vagy régióval, és az expresszált BP53 variánst a kívánt aktivitás optimális kombinációjára nézve szkrineljük. Az ismert szekvenciájú DNS előre meghatározott helyein végrehajtandó szubsztitúciós mutációk végrehajtására szolgáló technikák a szakterületen jól ismertek; ilyen például az M13 primer mutagenezis.
Az aminosav-szekvencia deléciói (kiiktatásai) általában 1-30 csoportból, előnyösen 1-10 csoportból álló tartományokra terjednek ki, mimellett ezek az aminosavak jellegzetesen egymás mellettiek.
Az aminosav-szekvencia inzerciói (beszúrásai) magukban foglalják az egyetlen aminosavcsoporttól a lényegében változatlan hosszúságú polipeptidig terjedő méretű amino- és/vagy karboxilterminális fúziókat, valamint egyetlen vagy több aminosavcsoportnak az intraszekvenciális (szekvencián belüli) inzertálását (beszúrását). Az intraszekvenciális (azaz az érett BP53 szekvencián belüli) inzertálás általában 1-10 aminosavcsoportra, előnyösebben 1-5 aminosavcsoportra terjed ki. Az egyes terminális inzertálásra példa lehet egy olyan érett BP53, amely egy N-terminális metionilcsoporttal rendelkezik. Ez a variáns a BP53 rekombináns sejttenyészetben végzett direkt expressziójának mesterséges terméke, azaz olyan expresszálásé, amely az érett BP53 szekréciójára vagy sejtmembránnal történő asszociációjára irányuló szignálszekvencia nélkül történik. A terminális inzertálás további példái közé tartoznak a következők: (1) az érett BP53 rekombináns gazdasejtekből történő szekréciójának elősegítése érdekében heterológ vagy homológ szignálszekvenciáknak az érett BP53 N-terminálisához történő fúziói, (2) immunogén polipeptidek (azaz olyan polipeptidek, amelyek kellőképpen nagyok ahhoz, hogy immunogenicitást kölcsönözzenek a célszekvenciának), például bakteriális polipeptidek, így béta-laktamáz, béta-galaktozidáz vagy egy az E. coli trp helye által kódolt enzim fúziói, valamint (3) sejtfelületi kötőanyagokkal, például membránrögzítőkkel (membránhorgonyokkal;
membráné anchors) történő fúziók.
A sejtfelületi kötőanyagokkal végzett fúziókat nem szükséges rekombináns módszerekkel végezni, viszont a BP53- mai alkotott kovalens vagy nemkovalens asszociációs termékeket így lehet előállítani. Például egy az IGF-I vagy az IGF-II számára szolgáló normál sejtfelületi receptorból származó transzmembrán dómén vagy az érett hanyatlásgyorsító faktor [mature decay accelerating factor; mDAF; 244 267. számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987. 11. 04.)] C-terminálisán lévő foszfolipidhorgony dómén kovalens módon kötődhet a BP53 C-terminálisához vagy rekombináns sejttenyészetben a BP53 C-terminálisával fuzionálva expresszálódhat. így tehát a BP53 rekombináns sejttenyészetben mint a pre-BP53 mDAF-fal alkotott fúziós terméke expresszálható. Például összeállítható egy olyan fúziós protein, amelyben az összefonódott (spliced) cDNS alapján várható membrán DAF utolsó 37 aminosavja az olyan pre BP53 glikoprotein C-terminálisával van fuzionálva, amely rendszerint alkotórészként a tenyésztőközeghez van szekretálva. A fúziós konstrukciót a sejtmembránhoz kerül és a foszfatidil-kolin horgony hatására rögzítve ott is marad.
A variánsok harmadik csoportjába azok tartoznak, amelyekben a BP53 molekulából legalább egy aminosavcsoportot, előnyösen csak egy aminosavcsoportot előzetesen eltávolítottunk és egy eltérő csoportot inzertáltunk az eltávolított csoport helyére. Abban az esetben, ha a BP53 végső jellemzőit módosítani kívánjuk, az ilyen szubsztitúciókat általában az alábbiakban következő 1. Táblázatnak megfelelően végezzük.
1. TÁBLÁZAT
Eredeti csoport Példaszerű helyettesítők
Ala gly; ser
Arg lys
Asn gin; his
Asp glu
Cys ser
Gin asn
Glu asp
Gly ala; pro
His asn; gin
Ile leu; val
Leu ile; val
Lys arg; gin; glu
Met leu; tyr, ile
Phe met; leu; tyr
Ser thr
Thr ser
Trp tyr
Tyr trp; phe
Val ile; leu
HU 210 608 A9
A helyettesítőknek az 1. Táblázatban megadottaknál kevésbé konzervatív kiválasztásával alapvető változásokat lehet létrehozni a funkcionális vagy immunológiai jellegben. Például a nagyobb mértékben eltérő csoportok választása esetén ezek jelentős hatást gyakorolhatnak (a) a polipeptidgerinc szerkezetére a szubsztitúció területén, például a sík vagy helikális konformációra; (b) a molekula törtésére vagy hidrofób jellegére a célhelyen; vagy (c) az oldallánc térkitöltésére. A BP53 tulajdonságaiban várhatóan a legnagyobb változásokat eredményező szubsztitúciók közé tartoznak általában a következők: (a) glicin és/vagy prolin helyettesítése más aminosavval, illetve ezek kiiktatása (deléciója) vagy beszúrása (inzerciója); (b) egy hidrofil csoport, például szerilcsoport vagy treonilcsoport helyettesít egy hidrofób csoportot, például leucil-, izoleucil-, fenil-alanil-, valil- vagy alanilcsoportot (és fordítva);
(c) egy ciszteincsoport vagy egy prolincsoport helyettesít bármely más csoportot (és fordítva); (d) egy elektropozitív oldallánccal rendelkező csoport, például lizil, arginil- vagy hisztidilcsoport helyettesít egy elektronegatív csoportot, például glutamilcsoportot vagy aszpartilcsoportot (és fordítva); vagy (e) egy nagy térkitöltésű oldallánccal rendelkező csoport, például fenil-alanil-csoport helyettesít egy ilyen oldallánccal nem rendelkező csoportot, például glicilcsoportot (és fordítva).
A legtöbb törlés és beszúrás, de különösen helyettesítés esetén nem várhatók gyökeres változások a BP53 molekula jellemzőiben. Ugyanakkor azonban, ha a helyettesítés, beszúrás vagy törlés egzakt hatását nagyon bonyolult előre valószínűsíteni, például amikor egy IGF-kötő dómén vagy egy immunepitop módosításáról van szó, az ezen a területen jártas szakember számára nem jelent gondot a hatás rutin szkrínelő vizsgálatok segítségével végzett értékelése. Például egy ilyen vizsgálat végrehajtható a következő lépések elvégzésével: a natív BP53-at kódoló nukleinsav jellegzetesen helyspecifikus mutagenezisével létrehozunk egy variánst, a nukleinsav variánst rekombináns sejttenyészetben expresszáljuk és adott esetben a sejttenyészetből például egy nyúl poliklonális anti-BP53 oszlopon végzett immunaffinitás adszorpcióval tisztítjuk (ahol a variánst legalább egy visszamaradó immunepitop segítségével abszorbeáljuk). A sejtlizátum vagy a tisztított BP53 variáns aktivitását ezt követően egy alkalmas szkrínelő vizsgálatban a kívánt jellemzőkre nézve szkríneljük. Például a BP53 immunológiai jellemzőiben, így egy adott antitesttel szembeni affinitásában történő változásokat egy kompetitív típusú immunvizsgálat segítségével határozzuk meg. Az immunmodulátor-aktivitásban bekövetkező változásokat a megfelelő vizsgálattal méijük. A protein olyan tulajdonságainak, mint a redox vagy termális stabilitás, a hidrofobicitás, a proteolitikus degradációval szembeni hajlam, illetve a hordozóval vagy multimerekké történő aggregációs tendencia változását az ezen a területen jártas szakember számára jól ismert vizsgálati módszerekkel lehet meghatározni.
A BP53-at kódoló DNS-t a humán forráson kívül más forrásból is kinyerhetjük úgy, hogy (a) egy c DNS könyvtárt nyerünk ki az egyedi emlős BP53 mRNS-ét expresszáló szövetekből, (b) a homológ szekvenciákat tartalmazó cDNS könyvtárban lévő kiónok detektálása érdekében a humán BP53-at kódoló jelzett DNS-sel vagy ennek (általában 100 bázispámál nagyobb hoszszúságú) fragmentumaival hibridizációs analízist végzünk, és (c) a teljes hosszúságú kiónok azonosítása érdekében a kiónokat restrikciós enzimanalízissel és nukleinsavszekventálással analizáljuk. Amennyiben teljes hosszúságú kiónok nincsenek jelen a könyvtárban, akkor egy a BP53-at kódoló teljes hosszúságú klón összeállítása érdekében az első ízben ezen a helyen ismertetett nukleinsav-szekvencia információ alkalmazásával a különféle kiónokból megfelelő fragmentumokat nyerünk és ligálunk a klónokkal közös restrikciós helyeknél. Alternatív módon genom könyvtárak biztosítják a kívánt DNS-t.
A BP53 bármely ismert technikával, köztük szintetikus és rekombináns módszerekkel előállítható. A leírásban alkalmazott izolált DNS kifejezés alatt olyan származékokat is értünk, mint a kémiai úton szintetizált DNS, cDNS, kromoszomális vagy extrakromoszómális DNS, 3’ és/vagy 5’ szegélyező régiókkal vagy ezek nélkül. Előnyösen a BP53-at rekombináns sejttenyészetben végzett szintézissel állítjuk elő. Az ilyen szintézis számára elsődlegesen azt a nukleinsavat kell biztosítani, ami a BP53-at kódolja. Vizsgálataink során jelentős erőfeszítéseket tettünk arra, hogy egy humán cDNS könyvtárból azonosítsunk valamilyen a BP53-at kódoló nukleinsavat. A BP53-at kódoló humán DNS szekvenciáját végül is a 3. Ábrán látható módon határoztuk meg. Az eljárásnak az utóbbi időben elvégzett reprodukciója során nem jelentkeztek a korábbi nehézségek, mivel a 3. Ábra szerinti szekvenciából tökéletesen komplementer próbák nyerhetők. Miután a DNS-t számos szintetikus próba hibridizálásának alkalmazásával azonosítottuk, a könyvtárból izolált DNS-t a további klónozás vagy az expresszálás céljából egy replikálható vektorba ligáljuk.
A szekvenciameghatározás érdekében emlős plazmából natív BP53-at nyerünk, amelynek tisztítását általában a Cohn IV frakciójából végezzük. A natív BP53 izolálására és tisztítására leggyakrabban a következő szakirodalmi helyen leírt eljárást alkalmazzuk: Martin és Baxter, J. Bioi. Chem., 261: 8754-8760 (1986). Ennek lényegét az alábbiakban lehet összefoglalni. A Cohn-pasztát összekeverjük ecetsavval, nátrium-klorid-oldatot és a kapott homogenizátumot 30 percen keresztül 4200 fordulat/perc mellett centrifugáljuk. A felülúszónak pH 3,0 értékre beállított homogenizáló pufferrel ekvilibrált SP-Sephadex C-25-tel történő összekeverésével eltávolítjuk az endogén IGF-et. A kevertetést 72 óra elteltével leállítjuk, a gélt hagyjuk kiülepedni, és a felülúszót óvatosan dekantáljuk. A felülúszót ezt követően pH 4,0 értékre állítjuk be, és a kapott precipitátumot centrifugálással eltávolítjuk. Az így nyert felülúszó pH-ját ezt követően 6,5 értékre állítjuk be, majd a keveréket ismételten centrifugáljuk. A kapott felülúszót egy gondosan elkészített agarózIGF-Π affinitáskromatográfiás oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot p H 6,5 érték mellett nátrium-foszfát-pu6
HU 210 608 A9 ferrel mossuk. A proteint pH 3,0 értéken 1 ml/perc áramlási sebességű ecetsavval eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, majd az egyesített frakciókat egy 15% acetonitrilt tartalmazó 0,1 % koncentrációjú trifluor-ecetsavval ekvilibrált reverz (fordított) fázisú nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás oszlopra visszük. Azonnal egy 60 % acetonitril-koncentrációig terjedő lineáris gradienst alkalmazunk, amit 1,5 ml/perc áramlási sebesség mellett 30 percen keresztül folytatunk. A kívánt proteint egyetlen csúcs formájában nyerjük.
A rekombináns expresszáló rendszerek egyik példájában a BP53-at érett proteint nem fejlesztő és szekretáló prokariótákban expresszáljuk oly módon, hogy egy BP53-at kódoló DNS-t tartalmazó expresszáló vektorral végzünk transzformációt. Előnyösen olyan gazdasejteket transzformálunk, amelyek képesek a fejlesztést úgy végrehajtani, hogy a tenyészközegben vagy a gazdasejt periplazmájában nyeljük a BP53-at. A BP53-at kódoló DNS-sel végzett transzformáció során a BP53 fejlesztésére és az érett BP53 kiválasztására jellegzetesen a magasabb rendű eukarióta gazdasejtek, így például az emlős sejtek az alkalmasak.
A kiválasztott (szekretált) érett BP53-at úgy nyerhetjük, hogy az érett BP53-at kódoló DNS 5’ végét a gazdasejt által felismert szignálszekvenciát kódoló DNS 3’ végéhez ligáljuk. A gazdasejtek transzformációjához egy a ligáit DNS-szekvenciát tartalmazó expresszáló vektort alkalmazunk. A gazdasejt a szignálszekvencia és a BP53 első aminosavja közötti peptidkötés proteolitikusan végzett hasításával végrehajtja az expresszált fúziót, majd az érett BP53-at - a kérdéses gazdasejttől függően - a gazdasejt-periplazmába vagy a médiumba választja ki (szekretálja). Például egy prokariőta jellegű expresszáló vektor konstrukciójában a BP53 szekréciós vezetőt - azaz a -27-től a -1-ig terjedő aminosavakat - a bakteriális alkálikus foszfatáz vagy a hőstabil enterotoxin II vezetők helyettesítik, míg élesztő esetén a BP53 vezetőt az élesztőinvertáz, α-faktor vagy savas foszfatáz vezetők helyettesítik. A BP53 homológ szignál fúzióval transzformált Gramnegatív organizmusok az érett BP53-at a sejtperiplazmába választják ki, míg az élesztő vagy a Bacillus sp. a tenyészközegbe szekretálják az érett BP53-at.
A vektorok a kompatíbilis gazdasejtekkel együttműködve (egy gazdasejt/vektor rendszerben) két funkció betöltésére alkalmasak. Az egyik funkció a BP53-at kódoló nukleinsav klónozásának, azaz a nukleinsav használható mennyiségekben történő előállításának az elősegítése. A másik funkció a BP53 expresszálására irányul. Ezen funkciók egyikét vagy mindegyikét a gazdasejt/vektor rendszer hajtja végre. Az általuk végrehajtandó funkciótól, valamint a klónozásra vagy expresszálásra kiválasztott gazdasejttől függően a vektorok különféle komponenseket tartalmaznak.
Valamennyi vektor tartalmaz olyan nukleinsavat, ami a BP53-at kódolja (lásd fentebb). Jellegzetesen ez egy olyan DNS, ami az érett formában lévő, az aminoterminálisánál egy szekréciós szignálhoz kapcsolt BP53-at kódolja. Ez a szekréciós szignál előnyösen a
BP53 preszekvenciája, amely normálisan a BP53-nak a humán sejtekből in vivő történő szekréciójára irányul. Ugyanakkor azonban az alkalmas szekréciós szignálok magukban foglalják még a más állatok BP53-jából származó szignálokat, a virális szignálokat, illetve az ugyanazon vagy rokon speciesek szekretált polipeptidjeiből származó szignálokat is.
Az expresszáló és klónozó vektorok tartalmaznak egy olyan nukleinsav-szekvenciát, amely egy vagy több választott gazdasejtben alkalmas a vektor replikációjára. Általában a klónozó vektorokban ez a szekvencia olyan, ami lehetővé teszi a vektor gazdasejt-kromoszómától független replikációját, miközben replikációs origókat vagy független replikálószekvenciákat foglal magában. Ilyen szekvenciák számos baktérium, élesztő és vírus esetében jól ismertek. A legtöbb Gram-negatív baktérium számára alkalmas a jól ismert pBR322 plazmidból [Bolivár et al., Gene, 2: 95-113 (1977)] származó replikációs origó; az emlős sejtekben lévő vektorok klónozására jól alkalmazható, illetve alkalmazhatók az élesztő esetén a 2 μ plazmidorigó és a különféle virális origók (SV40, polióma, adenovírus, VSV vagy BPV). Az emlős expresszáló vektorok számára nem szükségesek origók (a példákban csak azért alkalmazzuk az SV40 origót, mivel ez tartalmazza a korai promotort). A legtöbb expresszáló vektor „ingázó” („shuttle”) vektor, azaz legalább egy organizmusosztályban alkalmasak replikációra, de expressziós céllal egy másik organizmusba is transzfektálhatók. Például egy vektor E. coli-ban van klónozva és ezt követően ugyanazt a vektort expressziós céllal élesztő vagy emlős sejtekbe transzferáljuk, annak ellenére, hogy a vektor nem alkalmas a gazdasejt-kromoszómáktól független replikációra.
A DNS a gazdasejt genomjába végzett inzertálással is klónozható. Ezt a klónozást bacillus speciesekkel hajthatjuk végre, például oly módon, hogy egy vektorba egy olyan DNS-szekvenciát foglalunk bele, amely komplementer egy a bacillus genomos DNS-ében talált szekvenciával. A bacillusnak ezzel a vektorral végzett transzfektálása a genommal és a BP53 DNS inzertálásával együttjáró homológ rekombinációt eredményez. Ugyanakkor azonban a BP53-at kódoló genomos DNS kinyerése bonyolultabb, mint egy exogén módon replikáit vektor kinyerése, mivel a BP53 DNS kimetszéséhez restrikciós enzimmel végzett emésztésre van szükség. Egy a BP53 expresszálására szolgáló stabil sejtvonal vagy mikroba előállítása érdekében általában DNS-t inzertálunk egy gazdasejt genomjába.
Az expressziós és klónozó vektoroknak tartalmazniuk kell egy szelekciós gént vagy más néven szelektálható markert. Ez egy olyan gén, ami egy a vektorral transzformált gazdasejt túléléséhez vagy növekedéséhez szükséges proteint kódol. Ennek a génnek a jelenléte biztosítja, hogy a növekedésben a transzformált gazdasejttel szemben egyetlen, a vektort kiiktató gazdasejt sem élvez előnyt. A jellegzetes szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, amelyek (a) antibiotikumokkal vagy más toxinokkal - amilyen például az ampicillin, neomycin, methotrexate vagy a tetracycline
HU 210 608 A9
- szemben rezisztenciát biztosítanak, (b) az auxotróf hiányosságokat kipótolják, vagy (c) pótolják a komplex közegből nem hozzáférhető kritikus tápanyagokat, például a bacillusok számára szükséges n-alanin-recemázt kódoló gént.
Egy az élesztőben történő felhasználásra alkalmas szelekciós gén az YRp7 élesztőplazmidban [Stinchcomb et al. (1979) Natúré, 282: 39; Kingsman et al. (1979) Gene, 7:141; Tschemper et al. (1980) Gene, 10: 157) jelenlévő trpl gén. A trpl gén szelekciós markerként szolgál olyan mutáns élesztőtörzsek számára, amelyekből hiányzik a triptofánban történő növekedés képessége; ilyen például az ATCC 44076 vagy a PEP41 törzs [Jones (1977) Genetics, 85:12]. A trpl károsodása - mint az élesztő gazdasejt genom jellemzője azután hatásos körülményeket biztosít a transzformálás létrejöttének kimutatására a triptofán nélküli növekedés segítségével. Hasonlóképpen a Leu2-hiányos élesztőtörzseket (ATCC 20 622 vagy 38 626) a Leu2 gént hordozó ismert plazmidokkal egészítjük ki.
Az emlős sejtek számára megfelelő szelekciós markerek példái közé tartozik a dihidrofolát reduktáz (DHFR) vagy a timidin kináz. Az ilyen markerek alkalmasak az olyan sejtek azonosítására, amelyek képesek voltak a BP53 nukleinsav felvételére. Az emlős sejttranszformánsokat szelekciós nyomás alá helyezzük, amelynek eredményeként csak azok a transzformánsok alkalmasak a túlélésre, amelyek a markért előzetesen már felvették. A szelekciós nyomást a transzformánsok olyan körülmények közötti tenyésztésével alakítjuk ki, amely körülmények között a közegben lévő szelekciós ágens koncentrációja kellőképpen megváltozik, miáltal a szelekciós gén és a BP53-at kódoló DNS amplifikációját eredményezi. Az amplifikáció az a folyamat, amelynek segítségével a növekedés szempontjából kritikus protein termelése számára nagyobb mértékben szükséges gének a rekombináns sejtek egymást követő generációinak kromoszómáin belül egymás után megújulnak. A BP53 megnövelt mennyiségeit az amplifikált DNS-ből szintetizáljuk.
Például a DHFR szelekciós génnel transzformált sejteket először úgy azonosítjuk, hogy az összes transzformánst olyan tenyésztőközegben tenyésztjük, amelyből hiányzik a hipoxantin, a glicin és a timidin. Ebben az esetben például megfelelő gazdasejt egy DHFR aktivitás nélküli kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonal, amelyet úgy állíthatunk elő és úgy szaporíthatunk, ahogyan azt a következő szakirodalmi helyen korábban leírták: Urlaub és Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77 : 4216. Különösen jól használható DHFR az olyan mutáns DHFR, amely nagymértékben rezisztens az MTX-re (117 060. számú európai szabadalmi bejelentés) nézve. Ez a szelekciós ágens - az endogén DHFR jelenléte ellenére - bármely más alkalmas gazdasejttel, például ATCC CCL61 CHO-Kl-gyel együtt alkalmazható. A DHFR-t és a BP53-at kódoló DNS-t ezt követően úgy amplifikáljuk, hogy egy a DHFR-t inaktiváló ágens (methotrexate vagy MTX) hatásának vetjük alá. A sejt nagyobb DHFR igényét (és ebből következően valamennyi exogén DNS amplifikációját) úgy biztosítjuk, hogy a kiválasztást csak olyan sejtek közül végezzük, amelyek képesek az egyre nagyobb MTX koncentrációk egymás utáni ciklusaiban növekedni.
A klónozó vektoroktól eltérő expresszáló vektoroknak tartalmazniuk kell egy olyan promotort, amelyet a gazdaszervezetek felismernek (elfogadnak) és amely működőképesen kötődik a BP53 nukleinsavhoz. A promotorok egy (általában körülbelül 100 és 1000 bp közötü) strukturális gén startkodonjától felfelé elhelyezkedő nemtranszlált szekvenciák, amelyek az ellenőrzésük alatt a nukleinsav-szekvenciák transzkripcióját és transzlációját kontrollálják. Ezek a promotorok jellegzetesen két osztályba sorolhatók, s ennek megfelelően indukáló, illetve konstitutív jelzőt kapnak. Az indukáló promotorok olyan promotorok, amelyek kontrolijuk alatt iniciálják a tenyésztési körülményekben bekövetkező valamely változásra - például egy tápanyag jelenléte vagy hiánya, illetve egy hőmérsékleti változás - adott válaszként fellépő fokozott mértékű, DNS-ből történő transzkripciót. A konstitutív promotorok a tenyésztési körülményekben bekövetkező változások hatására nem indukálódnak. Ez idő szerint igen nagyszámú, a különféle potenciális gazdasejtek által felismert és elfogadott promotor vált már közismertté. Ezek a promotorok úgy kötődhetnek működőképesen a BP53-at kódoló DNS-hez, hogy eredeti génjükből restrikciós enzimmel végzett emésztéssel eltávolítjuk, majd ezt követően a BP53 számára szolgáló startkodon 5’ helyére inzertáljuk őket. Ez azonban nem azt jelenti, hogy a genomos BP53 promotor nem alkalmazható. Ugyanakkor azonban a BP53-mal heterológ promotorok általában az expresszált BP53 nagyobb transzkripcióját és magasabb hozamát eredményezik.
A prokarióta gazdaszervezetekkel történő alkalmazásra megfelelő promotorok magukban foglalják a következőket: β-laktamáz és laktóz promotorrendszerek [Chang et al. (1978), Tature, 275: 615; és Goeddel et al. (1979), Natúré, 281: 544], alkálikus foszfatáz, egy triptofán (trp) promotorrendszer [Goeddel (1980), Nucleic Acids Rés. 8: 4075; és a 36 776. számú európai szabadalmi bejelentés], valamint hibrid promotorok, amilyen például a tac promotor [H. de Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80: 21-25). Ugyanakkor más ismert bakteriális promotorok is megfelelnek a kívánt célnak. Ezek nukleotidszekvenciáját korábban már közölték, így az ezen a területen jártas szakember képes arra, hogy bármely kívánt restrikciós hely [Suebenlist et al. (1980), Cell, 20: 269] biztosítása érdekében linkerek és adapterek alkalmazásával az anyagokat működőképesen a BP53- at kódoló DNS-hez [Suebenlist et al. (1980), Cell, 20: 269] ligálja. A bakteriális rendszerekben történő felhasználásra alkalmas promotorok tartalmaznak még egy a BP53-at kódoló DNShez működőképesen hozzákötött Shine-Dalgamo (SD) szekvenciát is.
Az élesztő gazdaszervezetekkel történő felhasználásra alkalmas promotor szekvenciák magukban foglalják a 3- foszfoglicerát kináz [Hitzeman et al. (1980), J. Bioi. Chem., 255: 2073] vagy más glikolitikus enzimek
HU 210 608 A9 [Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149; valamint Holland (1978), Biochemistry, Yl: 4900], például enoláz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz, illetve glükokináz számára szolgáló promotorokat.
Más élesztő promotorok - amelyek a növekedési körülmények által kontrollált transzkripció további előnyeivel rendelkeznek - magukban foglalják az olyan promotor régiókat, amelyek az alkohol dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfatáz, nitrogénanyagcserével kapcsolatos degradatív enzimek, metallotionein, gliceraldehid-3-foszfatáz dehidrogenáz, valamint a maltóz és galaktóz számára felhasználható megfelelő enzimek [Holland (1978), Biochemistry, 17: 4900] számára szolgálnak. Az élesztőben történő expresszálás során történő felhasználásra alkalmas vektorok és promotorok további ismertetését például a következő szabadalmi dokumentumban találhatjuk meg: R. Hitzeman et al., 73 657. számú európai szabadalmi bejelentés. Élesztő fokozókat is előnyösen alkalmazhatunk az élesztő promotorokkal együttesen.
A vektorokból emlős gazdasejtekben történő BP53 transzkripció kontrollálását különféle fonásokból nyert promotorokkal végezzük; ilyen promotorfonások például a vírusok, így polioma, Simian Vírus 40 (SV40), adenovírus, retrovírusok, hepatitis-B vírus és legelőnyösebben citomegalovírus genomjai. A promotorokat nyerhetjük heterológ emlős promotorokból, így bétaaktin promotorból is. Az SV40 vírus korai és késői promotorjait kényelmesen nyerhetjük SV40 restrikciós fragmentumként, amely ugyancsak tartalmazza az SV40 virális replikációs origót [Fiers et al. (1978), Natúré, 273: 113], A humán citomegalovírus közvetlen korai promotorját mint egy Hindin E restrikciós fragmentumot [Greenaway et al. (1982), Gene, 18: 355360] nyerhetjük egyszerűen. Természetesen a gazdasejtből vagy az ezzel rokon speciesekből származó promotorokat is fel lehet használni a kívánt cél elérése érdekében.
ABP53-at kódoló DNS magasabb rendű eukarióták által végzett transzkripcióját növelhetjük oly módon, hogy a vektorba egy fokozószekvenciát inzertálunk. Ilyen fokozók a DNS szokásosan körülbelül 10-300 pb értékű cisz-hatású elemei, amelyek úgy hatnak a promotorra, hogy fokozzák annak transzkripciós iniciáló képességét. A fokozók viszonylag független orientációjúak és helyzetűek, s a következő helyeken találhatók: egy intronon [Banerji, J. L. et al. (1983), Cell, 33: 729] belül a transzkripciós egység 5’ helyénél [Laimins, L. et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993] és a transzkripciós egység 3’ helyénél [Lusky, M. L. et al. (1983) Mól. Cell Bio., 3: 1108], valamint magán a kódoló szekvencián belül [Osbome, T. F. et al. (1984), Mól. Cell Bio., 4: 1293). Az emlős génekből (globin, elasztáz, albumin, α-foetoprotein és inzulin) számos fokozószekvencia jól ismert. Jellegzetesen mégis egy eukarióta sejtvírusból származó fokozót alkalmazunk. A példák közé tartoznak a következők: a replikáció origó (100-270 bp) végső oldalán lévő SV40 fokozó, a replikációs origó végső oldalán lévő citomegalovírus korai promotorfokozó, valamint az adenovirális fokozók. A fokozót a BP53-at kódoló szekvencia 5’ vagy 3’ helyzetében lehet beilleszteni a vektorba, előnyösen azonban a promotorból származó 5’ helynél helyezkedik el.
Az eukarióta gazdasejtekben (élesztő-, gomba-, rovar-, növény-, állati, humán vagy nukleált sejtekben) alkalmazott expresszáló vektorok tartalmazhatnak olyan szekvenciákat is, amelyek a transzkripció befejezéséhez (terminációjához) szükségesek, s amelyek a mRNS expressziójára gyakorolnak hatást. Ezek a régiók mint poliadenilezett szegmensek vannak átírva a BP53-at kódoló mRNS nemtranszlált részébe. A 3’ nemtranszlált régiók transzkripciós termináló (befejező) helyeket is magukban foglalnak.
A heterológ proteinek rekombináns gerinces sejttenyészetben történő szintézise céljára adaptálható további vektorokat ismertetnek a következő szakirodalmi, illetve szabadalmi dokumentumokban: M. J. Gething et al. (1981), Natúré, 293 : 620-625; N. Mantei et al. (1979), Natúré, 281: 40-46; 117 060. számú európai szabadalmi bejelentés (A. Levinson et al.), valamint 117 058. számú európai szabadalmi bejelentés (A. Levinson et al.). A BP53 emlős sejttenyészetben végzett expresszálására szolgáló kiindulási plazmidok közül különösen jól alkalmazható a pUC118, amelyet a következő szakirodalmi helyen ismertettek: Vieira és Messing (1987), Meth. Enzymol., 153: 3-11. Röviden összefoglalva a pUC118 egy 3,2 kb-os plazmid, amely ampicillin rezisztenciával és M13 IG régióval, valamint egy a klónozás számára szolgáló egyedi restrikciós helyeket tartalmazó lacZ pepiidet kódoló szekvenciával rendelkezik. ApUCl 18 egy olyan pUC18 [Norrander et al. (1983), Gene, 26: 101), amely a pUC egyedi Ndel helyénél (2499) inzertálva az M13-nak a HgiAI helyétől (5465) a Dral helyéig (5941) térj edő IG régiójával rendelkezik. Az M13 IG régió orientációja olyan, hogy a lac régiónak az ssDNS-ként csomagolt szála ugyanolyan legyen, mint amilyen az M13mp vektorokban.
A vektorok klónozására vagy expresszálására szolgáló alkalmas gazdasejtek a prokarióták, élesztősejtek vagy magasabb rendű eukarióta sejtek. A prokarióták magukban foglalják a Gram-negatív vagy Gram-pozitív organizmusokat, például az E. coli-t vagy baktériumokat. Az egyik előnyös klónozó gazdaszervezet az E. coli 294 (ATCC 31 446), de más olyan szervezetek is felhasználhatók, mint a Gram-negatív vagy Grampozitív prokarióták, amilyen például az E. coli Β, E. coli XYJ16 (ATCC 31 537), E. coli W3110 (P, A', prototróf, ATCC 27 325), a bacillusok, például Bacillus subtilis, Salmonella tryphimurium, Pseudomonas speciesek vagy a Serratia Marcesans. Amennyiben az expresszálás céljára szolgáló gazdaszervezetként egy prokarióta sejtet alkalmazunk, az expresszáló vektor előnyösen egy a proteinnek a tenyésztőközegbe történő transzportját biztosító szignálszekvenciát is tartalmaz. Máskülönben a 18 ciszteincsoportot tartalmazó protein
HU 210 608 A9 olyan, törékeny testek formájában termelődik, amelyek különleges kezelést igényelnek a protein kinyeréséhez (közte a protein ismételt visszahajtását),
A prokariótákon kívül eukarióta mikrobák, így filament gombák vagy élesztő is alkalmas gazdaszervezetek a BP53-at kódoló vektorok számára. A leggyakrabban alkalmazott eukarióta mikroorganizmus a Saccharomyces cerevisiae vagy közönséges sütőélesztő, de számos más törzs is könnyen hozzáférhető. A Saccharomycesben történő expresszálás céljára legáltalánosabban az YRp7 plazmidot [Stinchcomb et al. (1979) Natúré, 282: 39; Kingsman et al. (1979) Gene, 7: 141; Tschemper et al. (1980) Gene, 10: 157] alkalmazzuk. Ez a plazmid már magában foglalja azt a trpl gént, amely szelekciós markerként szolgál olyan mutáns élesztőtörzsek számára, amelyekből hiányzik a triptofánban történő növekedés képessége; ilyen például az ATCC 44076 vagy a PEP4-1 törzs [Jones (1977) Genetics, 85: 12], A trpl károsodása - mint az élesztő gazdasejt genom jellemzője - azután hatásos körülményeket biztosít a transzformálás létrejöttének kimutatására a triptofán nélküli növekedés segítségével.
A BP53 expresszálására szolgáló előnyös gazdasejtek multicelluláris organizmusokból származnak. Amint azt a fentiekben már említettük, a BP53-ban lévő ciszteincsoportok nagy száma arra utal, hogy a gazdasejt optimálisan inkább egy magasabb filogenetikai rendbe tartozó, semmint egy prokarióta sejt abban az esetben, ha az a cél, hogy a rekombináns protein a natív BP53-mal optimális konformációs azonosságot mutasson. Szükség van a BP53 glikozilezésének biztosítására is. Ezeknek a funkcióknak az összességét legjobban magasabb rendű eukarióta sejtek segítségével tudjuk megvalósítani. Noha elvileg bármely magasabb rendű sejttenyészet működőképes, függetlenül attól, hogy gerinces vagy gerinctelen sejttenyészetről van szó, mégis az emlősökből, így majomból, patkányból, hörcsögből és humán szervezetből származó sejtek alkalmazása az előnyös Az ilyen sejtek tenyészetben végzett szaporítása önmagában jól ismert. Lásd például: Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973). Az alkalmas emlős gazdasejtvonalak példái közé tartoznak - egyebek mellett - a következők: SV40-nel (COS-7, ATCC CRL 1651) transzformált majomvese CV1 vonal; 293 humán embrionális vese sejtvonal [Graham, H. L. et al. (1977), J. Gén. Virol., 36:59]; hörcsögkölyök vesesejtek (BHK, ATCC CCL10); kínai hörcsög petefészeksejtek-DHFR [CHO, Urlaub és Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77: 4216] ; egér Sertoli-sejtek [TM4, Mather, J. P. (1980), Bioi. Repród., 23: 243-251) ; majom vesesejtek (VERO-76, ATCC CRL-1587); humán méhnyakkarcinoma sejtek (HELA, ATCC CCL 2); kutya vesesejtek (MDCK, ATCC CCL 34); bivalypatkány (buffalo rat) májsejtek (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humán tüdősejtek (W138, ATCC CCL 75); humán májsejtek (Hep G2, HB 8065); egér emlőtumorsejtek (MMT 060562, ATCC CC1 51), valamint TRI sejtek [Mather, J. P. et al. (1982), Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68].
A kívánt kódoló és kontrollszekvenciákat tartalmazó alkalmas vektorok összeállítását standard ligáló módszerek segítségével végezzük. A szükséges plazmidok kialakítása érdekében az izolált plazmidokat vagy DNS-fragmentumokat hasítjuk, szabjuk, majd a kívánt formának megfelelően visszaligáljuk.
Az összeállított plazmidokban lévő korrekt szekvenciák megerősítése érdekében végzett analízis céljából a ligálási keverékekkel E. coli KI2 törzs 294 (ATCC 31 446) vagy más alkalmas gazdaszervezet transzformálását végezzük el. Az eredményes transzformánsokat az ampicillin-, tetraciklin- vagy más antibiotikus rezisztencia segítségével, illetve a plazmid konstrukciójától függő más markerek alkalmazásával szelektáljuk. A transzformánsokból ezt követően Clewell módszerével [Clewell, D. B., et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 62 :1159] plazmidokat állítunk elő, majd adott esetben kloramfenikolos amplifikációt végzünk [Clewel, D. B. (1972), J. Bacteriol. 110: 667]. Az izolált DNS-t ezután restrikcióval és/vagy Messing didezoxi-módszerének [Messing et al. (1981), Nucleic Acids Rés., 9: 309] vagy a Maxam-féle módszer [Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology, 65: 499] segítségével végzett szekventálással analizáljuk.
A gazdasejteket a találmány szerinti expresszáló vektorokkal transzformálhatjuk és tenyészthetjük annak megfelelően módosított hagyományos tápközegben, ahogyan az a promotorok indukálása, a transzformánsok kiválasztása vagy a gének amplifikációja érdekében célszerű. Az alkalmas tenyésztési körülmények, így a hőmérséklet, pH stb. azonosak azokkal, amelyeket előzetesen a gazdasejt klónozásra vagy expresszálásra történő kiválasztásánál alkalmaztunk; az adott esetben megfelelő értékek megválasztása a szakember számára nem jelenthet nehézséget.
A BP53-at előnyösen mint szekretált (kiválasztott) proteint nyerjük ki a tenyészközegból vagy periplazmából. Kinyerhető a gazdasejtlizátumokból is, abban az esetben, ha a BP53-at szekréciós szignál nélkül, közvetlenül expresszáljuk, amikor is első lépésként a szemcsés sejttöredékek eltávolítása érdekében a tenyészközeget vagy lizátumot lecentrifugáljuk. A BP53 a szennyező oldékony proteinektől is megtisztítható, például oly módon, hogy egy szelekciós, például ConA oszlopon adszorbeáltatjuk, majd erről eluáljuk, illetve úgy, hogy egy anti-BP53 immunaffinitás-oszlopon adszorbeáltatjuk, majd eluáljuk. A BP53-nak a szennyezőanyagoktól történő elválasztására alternatív módon más eljárások is felhasználhatók; ilyen például az alkil-Sepharose-on, szilikagélen, anion- vagy kationcserélő gyantán végzett kromatográfiás, illetve a gélelektroforetikus elválasztás. Azokat a BP53 variánsokat, amelyekben egy membránkötő hely kapcsolódik a BP53 proteinhez, ugyanúgy nyerhetjük ki, mint magát a BP53-at.
Szükséges esetben - stabilizációs célokkal - a tisztítás időtartama alatt kismennyiségű nemionos felületaktív anyagot, például Tween-t vagy polietilénglikolt adhatunk a BP53-hoz. A proteolitikus degradáció gátlása érdekében hasznos lehet egy proteáz inhibitor alkalmazása is, illetve a mellékes szennyezőanyagok növekedésének gátlására antibiotikumokat is felhasználhatunk.
HU 210 608 A9
Az ezen a területen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy szükség lehet a natív BP53 tisztítására alkalmas módszerek bizonyos módosítására, tekintettel arra, hogy a rekombináns sejttenyészetben végzett expresszálás során a BP53-nak vagy variánsainak tulajdonságaiban változások történnek. Például egy prokarióta sejttenyészetben termelt BP53 polipeptid nem adszorbeálódik a Con-A Sepharose-on, mivel az ilyen polipeptid nemglikozilezett jellegű. Ebben az esetben más típusú elválasztási módszereket, például gélelektroforézist, ioncserélő vagy immunaffinitási tisztítást kell alkalmazni. A megfelelő tisztítási módszereknek a - szóban forgó egyedi rekombináns BP53 jellemzőinek ismeretében történő - kiválasztása a szakterületen kellő jártassággal rendelkező gyakorlati szakember számára nyilvánvaló.
A példák és az igénypontok egyszerűbbé tétele érdekében bizonyos gyakrabban előforduló kifejezésekre és módszerekre rövid címszavakkal utalunk.
A „transzfektálás” vagy „transzfekció” kifejezés egy expressziós vektornak egy gazdasejt általi felvételére utal, függetlenül attól, hogy kódoló szekvenciák ténylegesen expresszálódnak-e vagy sem. Az ezen a területen jártas szakember számára számos transzfekciós módszer ismert, például a CaPO4 és az elektroporációs eljárás. Ha prokarióta sejteket vagy jelentős sejtfalkonstrukciókat tartalmazó sejteket alkalmazunk, a transzfekció előnyös módszere a kalciumos kezelés, kalcium-klorid oly módon történő alkalmazásával, ahogyan ezt a következő szakirodalmi helyen korábban ismertették: Cohen et al. (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69: 2110. A transzfektálás sikere általában akkor válik bizonyossá, amikor a vektor működésének valamilyen jele észlelhető a gazdasejten belül.
A „transzformálás” vagy „transzformáció” kifejezés egy DNS-nek egy organizmusba oly módon történő bevezetésére utal, amelynek eredményeképpen a DNS extrakromoszómális elemként vagy kromoszómális integrációval reprodukálható. Az alkalmazott gazdasejttől függően a transzformációt az adott sejteknek megfelelő standard módszerek felhasználásával hajtjuk végre. A kalciumos kezelést kalcium-klorid alkalmazásával, annak megfelelően végezzük, ahogyan azt a korábbiakban a következő szakirodalmi helyen már ismertették: Cohen et al. (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110. Ezt az eljárást általában prokarióták vagy más olyan sejtek esetében alkalmazzuk, amelyek lényeges sejtfal részeket tartalmaznak. Az ilyen típusú sejtfalak nélküli emlős sejtek esetében előnyösen a következő szakirodalmi helyen ismertetett, úgynevezett kalcium-foszfátos precipitációs módszert használjuk: Graham, F. és van dér Eb, A. (1978), Virology, 52: 456-457. Az emlős gazdasejtrendszerekkel végzett transzformációk általános vonatkozásait a korábbiakban Axel ismertette a következő szabadalmi dokumentumban: 4 399 216. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (nyilvánosságra került 1983. 08. 16-án). Az élesztőbe történő transzformációkat jellegzetesen a következő szakirodalmi helyeken ismertetett módszereknek megfelelően végezzük: Van. Solingen,
P. et al. (1977), J. Bact. 130: 946; valamint Hsiao, C. L. et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829. Ugyanakkor azonban a DNS sejtekbe történő bevezetésére más módszerek ugyancsak alkalmazhatók; felhasználható például a sejtmagba történő injektálás vagy a protoplasztfúzió is.
A jelen leírásban és igénypontokban alkalmazott „szigorúan meghatározott körülmények közötti hibridizálás” kifejezés olyan, a találmány oltalmi körébe tartozó DNS-szekvenciákat ír le, amelyeket 50%-os formamidban 5 x SSC mellett 42 °C hőmérsékleten hibridizálunk, és a szűrleteket 0,2 X SSC-ben 60 C hőmérsékleten mossuk (1 x SSC jelentése 0,15 M NaCl, 0,015 M nátrium-citrát). Ezeket a körülményeket annak érdekében alkalmazzuk, hogy kizárjuk azokat a szekvenciákat, amelyek a BP28 szekvenciává hibridizálnak.
A „helyre irányuló mutagenezis” egy a szakterületen standardként alkalmazott eljárás, amelynek során egy olyan, szintetikus oligonukleotid prímért használunk, amely komplementer egy a kívánt mutációt reprezentáló egyszálú DNS fággal, kivéve a korlátozott hibás illeszkedésekkel. Röviden összefoglalva a szintetikus oligonukleotidot primerként használjuk egy a fággal szálkomplementer közvetlen szintézishez, és az így nyert kettős szálú DNS-t egy fághordozó gazdabaktériumba transzformáljuk. A transzformált baktériumok tenyészetét csúcs (top) agarra oltjuk, lehetővé téve az egyedi sejtekből olyan telepek kialakulását, amelyek megkötik a fágot. Elméletileg az új telepek 50%-a tartalmazza a mutált formával egyetlen szálként rendelkező fágot; 50 % az eredeti szekvenciával rendelkezik. A telepeket kinázzal kezelt szintetikus primerrel hibridizáljuk olyan hőmérsékleten, amelynél lehetővé válik a pontos illeszkedés, azonban amelynél az eredeti szállal történő hibás illeszkedések elegendőek a hibridizáció megakadályozásához. A próbával hibridizáló telepeket ezt követően szelektáljuk és tenyésztjük, majd a DNS-t kinyerjük.
A „működőképesen kötött” kifejezés olyan csatlakozó helyzetre (juxtapozícióra) utal, amelyben a komponensek képesek eleget tenni normál funkcióiknak. Ennek megfelelően egy a kontrollszekvenciákhoz „működőképesen kötött” kódoló szekvencia egy olyan konfigurációra utal, amelyben a kódoló szekvencia ezeknek a szekvenciáknak a kontrollja alatt expresszálható, valamint amelyekben a kötött DNS-szekvenciák folytonosak, továbbá - egy szekréciós vezető esetében - folytonosak és leolvasási fázisban vannak. Például egy preszekvencia vagy szekréciós vezető számára szolgáló DNS akkor van egy polipeptid számára szolgáló DNS-hez működőképesen kötve, ha olyan preproteinként expresszálódik, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában; egy promotor vagy fokozó akkor kötődik működőképesen egy kódoló szekvenciához, ha hatással van a szekvencia transzkripciójára; illetve egy riboszómakötő hely akkor van működőképesen kötve egy kódoló szekvenciához, ha úgy helyezkedik el, hogy elősegítse a transzlációt. A kötéseket a jól hozzáférhető restrikciós helyeknél végrehajtott ligálással
HU 210 608 A9 hozhatjuk létre. Amennyiben ilyen helyek nem léteznek, akkor a hagyományos gyakorlatnak megfelelően szintetikus oligonukleotid adaptereket vagy linkereket alkalmazunk.
A „kontrollszekvenciák” kifejezés az olyan DNSszekvenciákra utal, amelyek egy működőképesen kötött kódoló szekvenciának egy adott gazdaszervezetben történő expressziójához szükségesek. A prokarióták számára alkalmas kontrollszekvenciák például magukban foglalják a következőket: egy promotor, adott esetben egy operátorszekvencia, egy riboszómakötő hely és esetleg más, egyelőre kevéssé ismert szekvenciák. Az eukarióta sejtek esetében ismert, hogy felhasználják a promotorokat, a poliadenilező szignálokat és a fokozókat.
Az „expresszáló rendszer” kifejezés az olyan DNSszekvenciákra vonatkozik, amelyek egy kívánt kódoló szekvenciát és kontrollszekvenciákat oly módon működőképes kötésben tartalmaznak, amelynek eredményeképpen az ezekkel a szekvenciákkal transzformált gazdaszervezetek alkalmasak a kódolt protein termelésére. A transzformáció végrehajtásához az expresszáló rendszert egy vektor tartalmazhatja; ugyanakkor azonban a releváns DNS-t is integrálhatjuk a gazdakromoszómába.
A leírásban és az igénypontokban a „sejt”, „sejtvonal” és „sejtkultúra” vagy „sejttenyészet” kifejezést egymással felcserélhető módon alkalmazzuk, s valamennyi ilyen megjelölés kiteljed a származékokra (utódokra) is. Ennek megfelelően a „transzformánsok” vagy „transzformált sejtek” magukban foglalják az első generációs sejteket, valamint - az áttételek számától függetlenül - az ezekből származó kultúrákat. Nyilvánvaló, hogy a DNS-tartalomra nézve a szándékos vagy véletlen mutációk következtében nem lehet valamenynyi utód pontosan azonos, illetve ugyanolyan. Az eredetileg transzformált sejtekkel azonos funkcionalitással rendelkező mutáns utódokat az eredeti sejtek körébe tartozónak tekintjük. Ahol ettől eltérő megkülönböztetés alkalmazása szükséges, azt egyértelműen megadjuk, illetve kifejtjük a leírásban.
A „plazmidok” jelölésére kis p betűt alkalmazunk, amelyet egy alfanumerikus jelzés követ. Az általunk használt kiindulási plazmidok legtöbbje kereskedelmi forgalomban beszerezhető, korlátozás nélkül nyilvánosan hozzáférhető vagy a nyilvánosság számára közölt szakirodalmi eljárások segítségével ilyen plazmidokból előállíthatók. Ezen túlmenően a korábban már említettekkel ekvivalens plazmidok is ismertek a szakterületen, s ezek megfelelő kiválasztása az ezen a területen kellőképpen jártas szakember számára nem jelenthet nehézséget.
A DNS esetében alkalmazott „emésztés” kifejezés a DNS-nek egy olyan restrikciós enzimmel végzett katalitikus hasítására utal, amely enzim csak a DNS-ben lévő meghatározott szekvenciáknál fejti ki hatását. Az általunk alkalmazott restrikciós enzimek legtöbbje a kereskedelmi forgalomban beszerezhető, s az ezekkel kapcsolatos reakciókörülmények, kofaktorok és más követelmények megválasztása során az ezen a területen jártas szakember ismeretanyagának alapján járunk el, például követjük a gyártó által megadott utasításokat. Analitikai célokra jellegzetesen 1 pg plazmidot vagy DNS-fragmentumot alkalmazunk az enzim körülbelül 2 egységnyi mennyiségével, körülbelül 20 pl pufferoldatban. A DNS-fragmentumoknak a plazmidkonstrukció számára szolgáló izolálása céljából jellegzetesen a DNS 5-50 pg-nyi mennyiségét az enzim 20-250 egységnyi mennyiségével emésztjük, nagyobb térfogatban. Az adott enzimek esetében alkalmas puffereket és szubsztrátmennyiségeket a gyártó által megadott utasításoknak megfelelően választjuk meg. A 37 °C hőmérsékleten végzett inkubáció idejét a szokásoknak megfelelően általában 1 órában szabjuk meg, azonban a gyártó utasításaival összhangban ez az érték változhat. Az általunk kívánt fragmentum izolálása érdekében az emésztés után a reakciókeveréket egy poliakrilamid gélen közvetlenül elektroforézisnek vetjük alá.
A „defoszforilezés” kifejezés arra az eljárásra utal, amelynek során bakteriális alkálikus foszfatázzal (BAP) végzett kezelés segítségével eltávolítjuk az 5’ terminális foszfátokat. Ez az eljárás meggátolja annak a lehetőségét, hogy a DNS-fragmentum két, restrikciós úton hasított vége cirkularizálódjon (gyűrűbe záródjon), illetve azt, hogy egy olyan zárt hurok alakuljon ki, amely lehetetlenné teszi egy másik DNS-fragmentumnak a restrikciós helyen történő inzercióját (beszúrását). A defoszforilezés céljára a hagyományos eljárásokat és reagenseket alkalmazzuk [T. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), pp. 133-134). Annak érdekében, hogy az enzimpreparációk során előforduló valamennyi exonukleáz aktivitását elnyomjuk, a bakteriális alkálikus foszfatáz (BAP) alkalmazásával végzett reakciókat 50 m MTris-ben, 68 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. A reakciók egy órán keresztül folytatódhatnak. A reakciót követően a DNS-fragmentumokat oly módon nyerhetjük ki, hogy a reakció során nyert preparátumot, azaz a reakcióelegyet fenol/kloroform keverékkel extraháljuk, majd etanol hozzáadásával precipitációt végzünk. A defoszforilezés esetén alternatív módon úgy is eljárhatunk, hogy a vektorokban történő religálás megakadályozása érdekében további restrikciós enzim hozzáadásával, úgynevezett kettős emésztés útján elbontjuk a nemkívánt fragmentumokat.
A DNS egy adott fragmentumának egy restrikciós emésztményból történő „kinyerése” vagy „izolálása” azt jelenti, hogy az emésztményt poliakrilamid- vagy agarózgélen elektroforetikus úton szeparáljuk, ismert molekulatömegfl jelzett DNS-fragmentumok mobilitásával történő összehasonlítás alapján azonosítjuk a kérdéses fragmentumot, a kívánt fragmentumot tartalmazó gélrészletet eltávolítjuk, majd a gélt elkülönítjük a DNS-től. Ez az eljárás a szakterületen általánosan ismert. Lásd például a következő szakirodalmi forrásokat: R. Lawn et al. (1981), Nucleic Acids Rés. 9: 6103-6114; valamint D. Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Rés. 8:4057.
A „Southem-analízis” egy olyan módszer, amelynek
HU 210 608 A9 segítségével megállapítható, illetve bizonytható a DNSszekvenciák jelenléte egy emésztményben vagy DNStartalmú kompozícióban; ennek során úgy járunk el, hogy ismert, jelzett oligonukleotiddá vagy DNS-fragmentummá történő hibridizálást hajtunk végre. Amenynyiben másként nem jelöljük, a jelen felhasználás során a Southem-analízis azt jelenti, hogy az emésztményeket 1%-os agarózon szeparáljuk, denaturáljuk és nitro-cellulózra visszük át a Southern-féle eljárásnak [E. Southern (1975),/. Mól. Bioi., 98:503-517] megfelelően, majd a hibridizációt Maniatis módszere [T. Maniatis et al. (1978), Cell, 15: 687-701] végezzük.
A „ligálás” kifejezés a kétszálú nukleinsav-fragmentumok közötti foszfodiészter-kötések kialakítására vonatkozó eljárásokat jelöli [T. Maniatis et al. (1982), Molecular Clonitig: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), 146], Amenynyiben másképpen nem jelöljük, a ligálást ismert pufferek és körülmények alkalmazása mellett úgy hajtjuk végre, hogy a ligálandó DNS-fragmentumok 0,5 ggnyi (hozzávetőleg ekvimoláris) mennyiségére vonatkoztatva a T4 DNS-ligáz („ligáz”) 10 egységnyi mennyiségét használjuk. Az „éles vég” (sticky-end) ligálást rendszerint 0 °C hőmérsékleten végezzük, míg a „tompa vég” (Blunt-end) ligálásokat szokásosan 14 C hőmérsékleten hajtjuk végre.
A „feltöltés” (filling) vagy „tompítás” (blunting) kifejezés olyan eljárásokra vonatkozik, amelyek segítségével egy restrikciós enzimmel hasított nukleinsav kohezív terminálisában lévő egyszálú véget egy kettős szállá alakítunk át. Ez az eljárás eliminálja a kohezív terminálist és egy tompa véget alakít ki. Az eljárás sokoldalú eszközt jelent egy olyan, restrikciós úton hasított vég átalakítására, amely csak egy vagy néhány más restrikciós enzim segítségével kialakított végekkel lehet kohezív, s amely átalakítás eredményeként egy olyan terminális jön létre, amely kompatíbilis bármely tompa hasítású restrikciós endonukleázzal vagy más feltöltött kohezív terminálissal. Jellegzetesen a tompítást úgy végezzük, hogy körülbelül 37 °C hőmérsékleten inkubálást hajtunk végre a következő anyagok megadott mennyiségeivel: a target DNS 2-15 pg-nyi mennyisége 10 mM MgCl2-ban, 1 mM ditio-treit, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5) puffer, DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumának 8 egységnyi mennyisége és a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát mindegyikének 250 pg-nyi mennyisége. Az inkubációt általában 30 perc elteltével fejezzük be, majd a reakciókeveréket fenollal és kloroformmal végrehajtott extrakciónak, s ezt követően etanollal végzett precipitációnak vetjük alá.
A DNS transzformánsokból történő „előállítása” vagy „preparálása” azt jelenti, hogy a mikrobiális tenyészetből plazmid DNS-t izolálunk. Amennyiben másképpen nem jelöljük, a Maniatis-féle alkálikus/SDS módszert (T. Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), 90] alkalmazzuk.
Az „oligonukleotidok” olyan, rövid vagy hosszú, egy- vagy kétszálú polidezoxi-nukleotidok, amelyeket ismert módszerek felhasználásával kémiai úton szintetizálunk, majd amelyeket a szintézist követően poliakrilamid-géleken tisztítunk.
ABP53-nak rekombináns úton általunk végzett előállításának folyamatát röviden a következők szerint foglalhatjuk össze:
1. Humán plazmából nyert, tisztított BP53-at részlegesen szekventáltunk.
2. Kémiai úton oligonukleotid próbák sorozatát szintetizáltuk és jelöltük 32P-izotóppal, amely oligonukleotid próbák minedegyike a BP53 amino-terminális részének és a BP53 belső szekvenciái sz’ztának megfelelő aminosavak mindegyikének számára egyetlen kodont jelentenek.
3. Az aXgtlO vektorban két felnőtt máj cDNS könyvtárt hoztunk létre, amelyek egyike egy oligo(dT)primált könyvtár és a másik egy véletlenszerűen (random) prímáit könyvtár.
4. Mindegyik könyvtárt három próbasarzsban szkríneltük. Az egyes könyvtárak esetén a próbák mindegyik sarzsa 300-1000, különböző intenzitású foltot adott. A foltok közül 38-at a három próbasarzs közül kettővel duplikáltunk; két folt triplikátumként jelent meg, mindkettő az oligo(dT)-pirmált könyvtárból származott. A kiónok közül kettőt a három próbasarzzsal és egy negyedik szintetizált próbával végzett hibridizálás segítségével azonosítottunk. Néhány duplikátum és triplikátum kiónt szubklónoztunk és feltérképeztünk.
5. A mind a négy próbasarzzsal hibridizált két szubklón egyikét szekventáltuk és meghatároztuk a BP53 teljes DNS-szekvenciáját.
6. A BP53-at kódoló teljes hosszúságú cDNS-t egy plazmidban állítottuk össze és replikáitok. Megjegyzendő, hogy a 3. Ábra szerinti teljes DNSszekvencia ismeretében extrém módon hosszú olyan próbákat lehet előállítani, amelyek a BP53 cDNS-sel tökéletes homológiával rendelkeznek, miáltal a más speciesekből származó próba cDNSek vagy genomos könyvtárak hatékonysága jelentősen megnő, miközben a folyamat egyszerűbbé válik. Emellett mellőzhetővé válik a BP53 tisztítása, szekventálása és a próbasarzsok előállítása.
7. A BP53-at kódoló cDNS-t kimetszettük a kódoló plazmidból és egy expresszáló közegbe vittük, amelyet egy olyan gazdaszervezet transzformálására használtunk, amely gazdaszervezetet ezt követően - a kívánt BP53 termelése érdekében - egy tenyészetben növesztettünk.
8. Az előző eljárás szerint előállított, biológiailag aktív, érett BP53 264 aminosavcsoporttal rendelkezik, amelyek közül 18 cisztein.
A következő példák csak a jelen találmány gyakorlatában jelenleg legjobbnak tartott eljárásokat ismertetik, de ezek nem tekinthetők korlátozó jelegűnek.
I. PÉLDA
A BP53-at kódoló cDNS kiónok azonosítása és humán szérum BP53 klónozása
Amennyiben a teljes DNS-szekvencia - a humán
HU 210 608 A9 májból származó mRNS reverz transzkriptjeinak szkrínelése vagy bármilyen sejtekből származó genomos könyvtárak szkrínelése útján - ismert, a BP53-at kódoló DNS kémiai szintézissel nyerhető. Tekintettel arra, hogy a jelen találmány kidolgozásának idején sem a BP53 protein teljes aminosav-szekvenciája, sem pedig a BP53 protein teljes DNS-szekvenciája nem volt ismert, a BP53-at kódoló komplett DNS-szekvencia kémiai szintézissel történő előállítására abban az időben nem volt lehetőség.
A BP53-at kötő humán szérumot a Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne, Australia cégtől beszerzett humán plazma Cohn IV frakció pasztából végzett tisztítással nyertük, annak megfelelő eljárással, amelyet a 5 korábbiakban a következő szakirodalmi helyen ismertettünk: Martin és Baxter, J. Bioi. Cem. 261: 8754-8760 (1986). Az egyetlen nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) csúccsal jellemzett, tisztított BP53-at izoláltuk, majd ebből az anyagból a 2. Táblázatban látható ami10 nosav-szekvenciákat állapítottuk meg.
2. TÁBLÁZAT
A BP53 peptidek aminosav-szekvenciája
Közelítő kezdeti hozam (pmol) Pozíció a cDNS-szekvenciában
N-terminális
N: A GASSGGLGPVVRCEPCDARALA QCAPPPAVCAELVREPG(C)G(CC) L(L)XAL(C)EGQP(P)XXX(T)(E)(R) 185 1-60
CNBr: EXTLNHLKFLNVLSPRGVHIP NXDXKGFY 66 191-219
Tripszin peptidek
T15-3: AYLLPAPPAPG[N]ASESEES (D) 32 98-117
T2-6: SAGSVESPSVSSTHR 60 118-132
T7:FHPLHSK 33 138-144
T3-18: IIIIK 64 145-149
T3-14:YKVBYESQSTDTQ []) FSSE (E) K 35 159-178
T2-12:EMEDTLNHLK 64 189-198
T4-19:FLNVLSPR 129 199-206
T2-10-8a:GVHlPN (N) B (W) K 18 207-216
T2-10-es:ETEYGP (Y) R 14 180-187
T2-2:GFYK 84 217-220
T2-20a: GF(C)WXVDKYGQPLPGYTTK 17 233-251
T2-20b:GKE DVHXYSMQS 16 252-263.
Lizin C-peptidek
KC-20a: FLNVLSPRGVHIPNXD 89 199-214
KC-20b: GASSGGLGPVVXXEPXDA 45 1-18
KC-20c: RETEYGP (YRK) EMED (T) LNH 13 179-196
KC-9: YGQPLPGYTTK 28 241-251
Az aminosavak jelölésére a szakterületen jól ismert egybetűs kódokat alkalmaztuk. X azokat a csoportokat jelöli, amelyeket nem tudtunk azonosítani. A kerek zárójelek - () - a bizonytalan csoportokat jelölik. A szögletes zárójelek - [] - azokat az Asn csoportokat jelölik, amelyek nem adtak semmiféle szekvenciát, azaz amelyek ennélfogva glikozilezve lehetnek. A T210-8, T2-20 és KC-20 keverékszekvenciát a cDNSszekvencia segítségével tudtuk megfejteni.
A kapott, 60 aminosavból álló N-terminális szekvencia hozzáillett a korábbiakban már ismertetett [Baxter és Martin (1987), Biochem. Biophys. Rés. Comm., 147: 408-415] 15 aminosavból álló szekvenciához, azzal az eltéréssel, hogy az 5-ös pozícióban ko- 60 rábban alanincsoportot találtak. A jelenlegi szekvencia közel azonos arányú alanin- és glicinhozamokat adott, ami arra utal, hogy a jelenleg izolált protein egy olyan 50 keverék, amelyben ezen a helyen mindkét csoport előfordul. Miután a 60 csoportból álló N-terminális szekvencia teljessé vált, a szekventor szűrőjén visszamaradt proteint cianogén-bromiddal hasítottuk, annak megfelelően, ahogyan azt a korábbiakban a következő szak55 irodalmi helyen ismertették: Gross és Witkup (1961), J. Am. Chem. Soc., 83:1510-1511. Ezt követően egy egyértelmű, tiszta belső szekvenciát találtunk (lásd a 2. Táblázatban: CNBr).
A protein tripszin és C-lizin proteolitikus hasítása, majd ezt követően a peptidek reverz (fordított) fázisú
HU 210 608 A9 kromatográfiával végzett izolálása egy további kilenc belső peptid számára szolgáló egyedi szekvenciát, valamint három keverék szekvenciát adott. A tripszines emésztés érdekében a tisztított BP53 8,4 g-nyi mennyiségét 100 μΐ 10 mM ammónium-hidrogén-karbonátban lévő 0,5 μg tripszinnel, 10 mM kalcium-klorid jelenlétében 24 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A lizin-C peptidázzal végzett emésztés érdekében a tisztított BP53 6 μg-nyi mennyiségét 0,3 μg lizin-C peptidázzal 100 1 térfogatú 100 mM ammónium-hidrogén-karbonát, 0,1% SDS, 10 mM ditio-treit (DTT) jelenlétében 24 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Ezeknek a fragmentumoknak az elválasztását úgy oldottuk meg, hogy az emésztményt Sychropack 300 A C4 HPLC oszlopra (2 x 100 mm) vittük, majd ezt követően 0,1 %-os trifluor-ecetsav-oldatban lévő 1-70 %-os acetonitril vagy 1-propanol lineáris gradiensének megfelelő oldószerelegy-összetétel mellett eluáltuk. Az emésztést és az RP-HPLC tisztítást nagyobb részletességgel ismertették korábban a következő szakirodalmi helyen: Aggarwal et al. (1985), J. Bioi. Chem. 260: 2334-2344. A BP53 aminosav-szekvencia szegmenseit egy 120A PTH aminosav-analizátorral és egy Nelson 300 adatrendszerrel ellátott 470A Applied Biosystems gázfázisú szekventorral nyertük, annak megfelelően, ahogyan azt a korábbiakban a következő szakirodalmi helyen már ismertették: Henzel et al. (1987), Chromatography, 404: 41-52.
A BP53 kiónjainak szkrínelésére egy XgtlO vektorban lévő két, felnőtt humán máj cDNS-könyvtárt használtunk. Ezek egyike egy véletlenszerűen prímáit könyvtár volt, amelyet a következő szakirodalmi helyen ismertetett módszernek megfelelően állítottunk elő: Leung et al. (1987), Natúré, 330: 537-543. A másikat, egy humán máj oligo(dT)-primált cDNS-könyvtárt általában máj RNS-ből állítottuk elő, mégpedig egy olyan oligo(dT)-primer alkalmazásával, amely 12-18 nukleotid hosszúságú és AMV reverz transzkriptáz. A kapott RNS-DNS komplex DNase-mentes RNase-Aval végzett kezelését követően a második DNS szál ismert módszerekkel történő szintéziséhez a DNS-polimeráz I Klenow-ffagmentumát és a további AMV reverz transzkriptázt egyaránt felhasználtuk. Az így előállított kettős szálú cDNS-t (ds-cDNS) SÍ nukleázzal emésztettük és DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával kezeltük. A most már letompított végű dscDNS-t egyrészt egy olyan, foszforilezett, 16 nukleotidból álló oligomerhez, másrészt egy olyan, nemfoszforilezett, 20 nukleotidból álló oligomerhez ligáltuk, amely oligomerek a Sáli, SstI, valamint az Xhol számára restrikciós helyeket, továbbá egy EcoRI kiálló véget tartalmaznak. Az említett oligomerek a következő szekvenciával rendelkeznek:
tagú oligomer:
’-AATTCTCGAGCTCGTCGACC
Foszforilezett 16 tagú oligomer:
5’-GGTCGACGAGCTCGAG
Az így nyert ligálási terméket a XgtlO EcoRI helyébe inzertáltuk, annak megfelelően, ahogyan az a kereskedelmi forgalomban beszerezhető DNS csomagoló kithez (Stratagene; San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok; katalógusszám: GT-10) mellékelt használati utasításban ismertetésre került; a módszert Maniatis és munkatársai szakirodalmi helyen is közölték: T. Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), pp. 133-134.
Az N-terminális aminosav-szekvenciák mindegyikének és számos belső (mind a C-terminális régióhoz, mind az N-terminális régióhoz tartozó) szekvencia számára szolgáló egyedi kodont reprezentáló oligonukleotid-próbák négy sarzsát szintetizáltuk. Ezek a szintetikus oligomerek a fentiekben található 2. Táblázatban bemutatott aminosav-szekvencia adatokon alapultak. A próbák - együttesen a korrekt cDNS kiónokhoz való illeszkedésükkel - az 1. Ábrán láthatók.
Az 1. Ábrán valamennyi összeállítás esetén a felső szekvencia a tisztított BP53-ból meghatározott aminosavszekvencia. A felső nukleotidszekvencia az, amelyet az oligonukleotid-próbák (oibp. 6, 7, 8, 9 és 2) számára az aminosav-szekvencia adatai alapján Lathe módszerének [Lathe, R. (1985), J. Mól. Bioi. 183:1-12] megfelelően szintetizáltunk. A szekvencia jelzett BP53 a klónozott cDNS DNS-szekvenciája, és at alsó aminosav-szekvencia a BP53 transziáit szekvenciája. A pontok a próba és a cDNS-szekvenciák közötti illeszkedést jelzik.
Az A. sarzs három átfedő oligonukleotid (6.1, 6.2 és 6.3) sarzsa, amely oligonukleotidok - az előbbi sorrendnek megfelelően - 69, 69 és 70 nukleotid hosszúságúak. Az oligonukleotidok a BP53 különféle átlapoló, a 2. Táblázatban látható triptikus, lizin-C és CNBr fragmentumainak egy 60 aminosavból álló szekvenciáján alapulnak. Ezeknek a fragmentumoknak a lokációja a felső aminosav-szekvencia felett látható. A T3-14 fragmentum végén lévő két aminosavas átlapolás (Y,K) inkorrektnek bizonyult, s jelenlegi véleményünk szerint ez a peptid a proteinben valahol máshol helyezkedik el. Ennek megfelelően a 41-60 aminosavak alatt egy második alsó szekvencia látható.
A B. sarzs két oligonukleotid, nevezetesen az oibp. 7 és 8 sarzsa, amelyek - az előbbi sorrendnek megfelelően - 45 és 36 nukleotid hosszúságúak.
A C. sarzs három átfedő oligonukleotid, nevezetesen az oibp. 9.1,9.2 és 9.3 sarzsa, amelyek - az előbbi sorrendnek megfelelően - 63, 63 és 64 nukleotid hosszúságúak.
A D. sarzs egyetlen oligonukleotidot tartalmaz, nevezetesen az oibp. 2-t, amely hosszúságát tekintve 60 nukleotidból áll.
Ezeket az újonnan szintetizált oligomereket 32P jelzéssel láttuk el, majd az A., B. és C. sarzsot a fentiekben ismertetett humán máj cDNS-könyvtárak szkrínelésére alkalmaztuk.
Az oligonukleotid próbák három sarasával triplikátumban az oligo(dT)-primált könyvtár 600 000 kiónját és a véletlenszerűen prímáit humán máj cDNS-könyvtár 600 000 kiónját szkríneltük. A 32P-végjelzett próbák sarasaival triplikátum nitro-cellulóz szűrőket hibridizáltunk. A hibridizációt egy olyan pufferben végeztük,
HU 210 608 A9 amelynek összetétele a következő volt: 20% formamid, 10% dextrán-szulfát, 5 x SSC, 50 mM nátrium-foszfát (pH 6,5), 5 x Denhardt-féle oldat, 2 mM nátrium-pirofoszfát, 0,1% SDS, valamint 0,04 mg/ml forralt, ultrahanggal kezelt lazac sperma DNS (salmon sperm DNA). A hibridizációt követően a szűrőket két alkalommal 1 x SSC-vel mostuk 37 °C hőmérsékleten, 2 órán keresztül, annak megfelelően, ahogyan az korábban Maniatis ismertette (T. Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), pp. 133-134).
Az A., B. és C. sarzsok mindegyike 300-1000 különböző intenzitású hibridizált pozitívot adott mindegyik könyvtárral. A három sarzs közül kettővel 38 hibridizáló duplikátum pozitívot figyeltünk meg. Az oligo(dT)-primált könyvtárral két hibridizáló triplikátum pozitívot figyeltünk meg mind a négy sarzzsal. Ezek közül a duplikátum és triplikátum kiónok közül számosat teleptisztításnak vettetünk alá, majd a didezoxi láncterminálás segítségével végzett DNS-szekventálásra [Messing et al. (1981), Nucleic Acids Rés., 9: 309-321] szolgáló pUC118 [Vieira és Messing (1987), Meth, Enzytnol., 153: 3-11) vektorokba szubklónoztunk. A kiónok közül néhányat feltérképeztünk, és a restrikciós térképezés, valamint a szekvenciaanalízis alapján egy klón, nevezetesen az ibp. 118 jelzésű esetében volt látható, hogy BP53-at tartalmaz (lásd a 2. Ábrát). Amint az a 3. Ábrán látható, ez a klón magában foglalta a BP53 kódoló és 3’-nemtranszIált régióit.
II. PÉLDA
ABP53 cDNS DNS-szekvenciája
A BP53 cDNS klón teljes nukleotidszekvenciája a
3. Ábrán látható. A szekventált kód egy metionincsoporttal kezdődő, 873 bp-s önálló hosszúságú leolvasható (open reading) részletet tartalmaz. A tisztított proteinből meghatározott belső szekvenciák és az aminoterminális mind a 18 tagja ebben a leolvasási részletben van jelen, mimellett a 2. Táblázatban felsorolt peptidek a proteinszekvencia körülbelül 75%-át reprezentálják. A tisztított proteinből meghatározott aminosav-szekvenciák tökéletesen megegyeznek a cDNS kiónon alapuló BP53 leszármaztatott aminosav-szekvenciájával, azzal az eltéréssel, hogy néhány csoport csak bizonytalanul volt aszignálható, illetve nem volt hozzárendelhető (2. Táblázat). A BP53 amino-terminális szekvenciáját egy metioninnal kezdődő 27 tagból álló aminosavszekvencia vezeti be. A szekvencia tartalmaz egy olyan, 14 aminosavból álló hidrofób magot, amelyet egy szekréciós szignálszekvenciára indikatív, töltéssel rendelkező csoportok határolnak [Perlman és Halvor5 són (1983), J. Mól. Bioi. 167: 309]. A feltételezett iniciáló ATG harmadik 5’ nukleotidja egy purin, amint az a transzlációs kezdő együttműködő szekvenciákból várható [Kozák (1984), Nucl. Acids Rés., 12: 857-872). A nyílt leolvasású részlet az 5’ vég közelében tartalmaz egy olyan, hozzávetőleg 2500 bp értékű messenger RNS-t, amely egy 1500 bp-s 3’-nemtranszlált régiót foglal magában. Az izolált BP53 kiónok közül három (köztük az ibp. 118) tartalmaz a 3’ végénél AAATAAA poli(A) addíciós szignállal kezdődő poli (A) szekven15 ciát.
A BP53-nak a cDNS klónokból levezetett teljes hosszúságú érett szekvenciája 264 olyan csoportból áll, amelyek közül 18 cisztein, ami azt jelzi, hogy a protein ciszteinben gazdag. A ciszteincsoportok közül 12 az 20 N-terminálishoz közel, 6 pedig a C-terminális közelében felhalmozódik (lásd a 2. Ábrát). A szekvencia transziáit molekulatömege 28,7 kD, lényegesen kisebb, mint a redukált SDS-PAGE segítségével meghatározott 43 Kd-os molekulatömeg. Feltételezhető, hogy a mole25 kulatömeg esetében fellépő különbség az eltérő glikozilezettség számlájára írható. A natív protein megköti a lektin Concanavalin A-t [Martin, J. L. és Baxter, R. C. (1986), J. Bioi. Chem. 261: 8754-8760), és az aminosav-szekvencia három potenciális N-kötésű glikozile30 zési helyet (NXS vagy T) tartalmaz, valamint a szerinés treonincsoportok két olyan felhalmozódását foglalja magában, amelyek felhasználhatók az O-kötésű glikozilezés számára [amint azt a következő szakirodalmi helyen a korábbiakban valószínűsítették: Russel et al. 35 (1984), Cell, 37: 577-585). A T15-3 és a T3-14 peptidek (2. Táblázat) aminosav-szekvenciájában a 109 és a 172 aminosavnál az aszparagin szignál hiánya arra utal, hogy a három potenciális N-kötésű glikozilezési hely közül legalább kettő felhasználásra kerül.
A BP53 aminosav-szekvenciája hasonló a patkány
BRL-3 A sejtek által termelt IGF-kötésű protein korábban már ismertetett szekvenciájához [lásd: Lyons és Smith (1986), Mól. Cell. Endo. 45:263-270; valamint Mottola et al. (1986), J. Bioi. Chem. 261: 11180-11188). Ezek összehasonlítását az alábbiakban adjuk meg. A szekvenciában csillaggal jelöltük azokat a helyeket, ahol homológ szekvencíarészletek fordulnak elő:
BP53
20 30 40
GASSGGLGPWRCEPCDARALAQCAPPP-AVCAELVREPGC **********
Patkány BRL-3A protein
FRCPPCTPERLAACGPPPDAPCAELVREPGC
20 30
A patkány kötőprotein számára szekventált 34 aminosav közül 21 összeillik a humán BP53 szekvenciájával. Úgy véljük, hogy a patkány protein a BP28-nak, egy humán IGF-kötésű proteinnek a homológja, amely antigén jellegöen és metabolikusan különbözik a BP53-tól (lásd: Baxter et al. (1987) J. Clin. Endo. and Métából., 65: 423-431; valamint Baxter és Martin (1987) Biochem. Biophys. Rés. Comm., 147: 408-415).
HU 210 608 A9
Több, számítógéppel támogatott proteinszekvenciaadatbázisban (Protein Identification Resource, National Biomedical Research Foundation, Georgetown Univ. Med. Center, Washington, D. C. 20007, Amerikai Egyesült Államok; valamint GenBank, Bolt, Bernnek and Newman, Inc., Cambridge, Mass. 02231, Amerikai Egyesült Államok) végzett kutatás alapján azt találtuk, hogy nem található egyértelmű hasonlóság egyetlen ismert proteinnel sem. Különösképpen az IGF-I és IGF-Π receptorkötő doménekkel nem található hasonlóság.
Ez ellentétben áll a növekedési hormon receptorral kapcsolatban az utóbbi időben végzett kutatás eredményével, ahol azt demonstrálták, hogy a receptor extracelluláris hormont kötő doménje azonos egy keringési növekedési hormont kötő proteinnel [Leung et al. (1987), Natúré, 330: 537-543].
III. PÉLDA
A humán BP53 expresszálása
A pRK5.ibpl.l jelzésű végső expresszáló vektort a
9. Ábra szerint építettük fel, pibp.l 18.1-ből és pRK5ből. Ezeknek a plazmidoknak és a végplazmidnak a felépítését az alábbiakban részletesen ismertetjük.
A. Apibp.118.1 felépítése
A teljes hosszúságú humán BP53 protein cDNS a Xibp.ll8 kiónon belül helyezkedik el. Ezt a cDNS inzertet a Xibp. 118 EcoRI emésztésével szubklónoztuk, a 2585 bp-s EcoRI fragmentum agaróz gélelektroforézisével izoláltuk, majd ennek a fragmentumnak a T4 ligázának alkalmazásával EcoRI-emésztett pUC118-ba ligáltuk, s így a pibp.l 18.1 plazmidot nyertük (9. Ábra).
B. A pRK5 felépítése
B.l. A pF8CIS felépítése
Ap FBCIS kiindulási plazmid kezdeti három részes felépítését az alábbiakban ismertetjük, illetve a 4. Ábrán mutatjuk be.
1.) A végső vektor ampicillin rezisztens markerét és replikációs origóját a pML plazmid [Lusky, M. és Botcheri, M. (1981), Natúré, 293: 79] egy variánsából, a pUC13pML kiindulási plazmidból nyertük. A pUC13pML-t úgy állítottuk elő, hogy a pUC13 [Vieira, J. és Messing, J. (1982), Gene, 19: 259] polilinkerét a pML EcoRI és HindlII helyeihez transzferáltuk. Egy második kiindulási plazmid, a pUC8-CMV volt a CMV fokozó, promotor és kapcsoló donor szekvencia forrása. ApUC8-CMV-t úgy építettük fel, hogy a CMV fokozó, promotor és kapcsoló donor szekvencia számára szolgáló hozzávetőleg 800 nukleotidot a pUC8-nak a letompított PstI és Sphl helyeibe inzertáltuk [Vieira, J. és Messing, J. (1982), Gene, 19: 259]. Szintetikus BamHI-HindlH linkereket (kereskedelmi forgalomban beszerezhetők a New England Biolabs-től) a kohezív BamHI-hez ligáltunk, s így egy HindlII helyet hoztunk létre. A ligálást követően egy HindlH-HincH emésztést hajtottunk végre. Az emésztés egy olyan, körülbelül 800 bp-s fragmentumot eredményezett, amely tartalmazta a CMV fokozót, promotort és kapcsoló donor helyet. Gélen végzett izolálást követően ezt a 800 bp-s fragmentumot a pUC13pML egy 2900 bp-s darabjához ligáltuk. A pF8CIS felépítéséhez szükséges fragmentumot úgy nyertük, hogy a fenti intermedier plazmidot Sáli és HindlII segítségével emésztettük. Ez a 3123 bp-s darab tartalmazta az ampicillin számára szolgáló rezisztencia markert, a pUC13pML-ból történő replikáció origóját, valamint a CMV számára szolgáló kontrolszekvenciákat, köztük a fokozót, promotort és a kapcsoló donor helyet.
2. ) Az lg variábilis régió intron és a kapcsoló akceptor szekvencia összeállítását egy szintetikus oligomer felhasználásával végeztük, annak megfelelően, ahogyan az a 4. Ábra középső részletében látható. Kémiai úton szintetizáltuk a 99 tagú és a 30 tagú oligomert, amelyek a következő szekvenciával rendelkeztek az igG intron és kapcsoló akceptor hely számára [Bothwll et al. (1981), Natúré, 290: 65-67):
5' AGTAGCAAGCTTGACGTGTGGCAGGCTTGA... 31 GATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA... 60 CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT... 88 GTCCACTCCCAG 3'
3' CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA 5' DNS-polimeráz I-et (Klenow fragmentumot) töltöttünk a szintetikus darabba és egy kettős szálú fragmentumot hoztunk létre [Wartell, R. M. és Reznikoff, W. S.
(1980), Gene, 9: 307]. Ezt követte a PstI és a HindHI kettős emésztése. Ezt a szintetikus linkért a PstI és HindlII helyeknél pUC13-ba (Vieira és Messing, op. cit.). A szintetikus oligonukleotidot, a jelzett pUCIg.10et tartalmazó kiónt PstI segítségével emésztettük. Egy Pstl-Clal linker alkalmazásával egy Clal helyet adtunk ehhez a fragmentumhoz. Hind ΠΙ-mal végzett emésztést követően gélen egy 118 bp-s darabot izoláltunk, amely tartalmazta az lg intron és az lg variábilis régió kapcsoló akceptor részét.
3. ) A konstrukciós vázlat harmadik része a hepatitis felületi antigén 3’ véget az SV40 korai régiójának poliadenilező helyével és transzkripciós terminációs helyével helyettesíti. Egy az 5V40 szekvenciákat tartalmazó vektort, a pUC.SV40-et a BamHI helynél pUC8-ba inzertáltunk, ammak megfelelően, ahogyan az a korábbiakban már ismertetésre került (Vieira és Messing, op. cit.). A pUC.SV40-et ezt követően EcoRI és Hpal segítségével emésztettük. Az emésztményből gélen egy az SV40 poliadenilező szekvenciát tartalmazó, 143 bp-s fragmentumot izoláltunk. A pSVE.8clD (160 457. számú európai szabadalmi bejelentés) ezt követő emésztése után gélen két további fragmentumot izoláltunk. Az EcoRI és Clal segítségével létrehozott 4,8 kb-s fragmentum tartalmazta az SV40-DHFR transzkripciós egységet, a pML replikációjának origóját, valamint az ampicillin rezisztencia markert. A Clal és Hpal segítségével végzett ezt követő emésztés útján előállított 7,5 kb-s fragmentum a Factor VHI számára szolgáló cDNS-t tartalmazta. A három részből álló ligálás a pSVE.8c24D-t eredményezte. Ezt az intermedier plazmidot Clal és Sáli segítségével emésztettük, s így egy olyan, 9611 bp-s fragmentumot kaptunk, amely egy SV40 poli A hellyel a Factor VIII számára szolgáló cDNS-t, és ezt követően az SV40-DHFR transzkripciós egységet tartalmazta.
HU 210 608 A9
Végül a pF8CIS előállítása érdekében a három részes ligálás során a következőket használtuk fel: a) a replikációs origót, az ampicillin rezisztencia markert, valamint a CMV fokozót, promotort és kapcsoló donor helyet tartalmazó, 3123 bp-s SalI-HinsIII fragmentum; b) az lg intront és kapcsoló donor akceptor helyet tartalmazó, 118 bp-s Hindffl-Clal fragmentum; és c) egy a Factor VIII számára szolgáló cDNS-t, az 5V40 poliadenilező helyet és az 5V40 DHFR transzkripciós egységet tartalmazó, 9611 bp-s Clal-Sall fragmentum.
B.2. A pCIS2.8c28D felépítése
A pCIS2.8c28D egy 73 kd-os Factor VIII alegységhez kapcsolódó 90 kd-os Factor VIII alegységet tartalmaz. A 90 kd-os alegység az 1-740 aminosavakat, míg a 73 kd-os alegység az 1690-2332 aminosavakból áll. Ezt a szerkezetet a következő fragmentumok három részből álló ligálásával állítottuk elő: a) a pF8CIS 12607 bp-s Clal-SstlI fragmentuma (egy anyaszálból izolálva és BAP-pal kezelve); b) a p FBCIS 216 bp-s SstlI-PstI fragmentuma; valamint c) egy rövid PstlClal szintetikus oligonukleotid, amelyet kinázzal kezeltünk (lásd az 5. ábrát, ahol a csillag a megváltozott nukleotidot jelzi).
Az 5. Ábra bemutatja a pSVEFVIIII [160 457. számú európai szabadalmi bejelentés) 408 bp-s BamHIHindlII és 416 bp-s BamHI-PstI fragmentumainak a szubklónozását is; ezek a fragmentumok tartalmazzák a pCIS2.8c28D előállításához fúzionálandó Factor VIII 5’ és 3’ régiókat.
A 6. Ábra bemutatja a pCIS2.8c28D fúziós régiójának felépítéséhez alkalmazott, három részből álló ligálást. Ugyanabba a pUC118 BamHI-PstI BAP vektorba két eltérő, A és B fragmentumot klónoztunk. Az A fragmentum a pUC408BH 408 bp-s BamHI-HindlII fragmentuma volt, míg a B fragmentum egy HindlIIPstl oligonukleotid volt. A kettős szálú oligonukleotid a 6. Ábrán látható. Míg a 6. Ábrán a terminális restrikciós helyeknél lévő teljes DNS-szekvencia megadásra kerül, az aktuális oligonukleotid nem foglalja magában a restrikciós helyeknél vonalakkal körülrajzolt bázisokat. Ezt az oligonukleotidot - az oligonukleotid ligálás alatti polimerizációjának meggátlására szolgáló - kinázos kezelés nélkül használtuk fel.
Az A és B fragmentumoknak a vektorba történő, a
6. Ábrán látható ligálása után a várt találkozási szekvenciákat a nukleotidok által körülvett régiók DNSszekventálása útján igazoltuk.
A pCIS2.8c28D plazmidot egy négy lépésből álló ligálással építettük fel, annak megfelelően, ahogyan azt a 7. Ábra bemutatja. A 6. Ábra szerint nyert fúziós plazmidot BamHI és PstI segítségével hasítottuk, majd a 443 bp-s fragmentumot izoláltuk. A négy lépéses ligálás további három fragmentumát a következők jelentették: 1.) a pSVEFVIII (160 457. számú európai szabadalmi bejelentés) 1944 bp-s Clal-BamHI fragmentuma; 2.) a pSVEFVIII egy 2202 bp-s BamHIXbal fragmentuma, amelyet még PstI segítségével részlegesen emésztettünk, majd a kapott, 1786 bp-s Pstl-Xbal fragmentumot izoláltuk; valamint 3.) a 6. Ábra szerinti pCIS2.8c24D 5828 bp-s Xbal-Clal BAP fragmentuma. Meghatároztuk a kapott variánsnak a pCIS2.8c28D pontos fúziós találkozási régiójában lévő transziáit DNS-szekvenciáját, majd ezt összehasonlítottuk a 6. Ábrán látható szekvenciával.
B.3. ApRK5 felépítése
A pRK5 felépítését a 8. Ábra mutatja be. A pRK5 összeállítására szolgáló kiindulási plazmid a pCIS2.8c28D volt. Az 1-6. sorszámú bekezdésben szereplő bázisszám a CMV promotorhoz vezető EcoRI hely egyik első T bázisával közös pCIS2.8c28D-re vonatkozik. A citomegalovírus korai promotor, az intron, az 5V40 origó és a poli A szignál külön plazmidokban került elhelyezésre.
1. A citomegalovírus korai promotort egy a pCIS2.8c28D-ból (9999-1201) származó EcoRI-fragmentumként a fentiekben ismertetett pUC118 EcoRI helyébe klónoztuk. Tizenkét telepet kiválasztottunk, majd ezeket arra az orientációra nézve szkríneltük, amely orientációban a pUC 118-ból készített egyszálú DNS figyelembe veszi az 1201-nél lévő EcoRI helyről a 9999-nél lévő EcoRI helyre történő szekvenciaváltozást. Ennek a kiónnak a pCMV E/P jelzést adtuk.
2. A pCMVE/P-ből egyszálú DNS-t készítettünk, annak érdekében, hogy az így nyert DNS-t helyre irányuló mutagenezissel egy SP6 [Green, M. R. et al. (1983), Cell, 32: 681-694] promotorba inzertáljuk. Egy az SP6 promotor szekvenciájának a -69 és +5 közötti részét tartalmazó, 110 tagból álló, szintetikus oligomert [lásd: Nucleic Acids Rés., 12: 7041 (1984); valamint az 1. Ábrát] alkalmaztunk a CMVE/P szekvenciáknak megfelelő oligomer egyik végén lévő 18 bp-s fragmentumokkal, illetve azok mentén. A mutagenezist standard módszerek segítségével végeztük, majd a szkrínelés során nagyfokú és kevésbé nagyfokú szigorúság (stringency) mellett egy jelzett, 110 tagú oligomert alkalmaztunk. Hat potenciális kiónt választottunk ki (szelektáltunk) és szekventáltunk. Azonosítottunk egy pozitív kiónt, amelyet a pCMVE/PSP6 jelzéssel láttunk el.
3. Az SP6 promotort ellenőriztük és aktívnak bizonyult, például abban az esetben, amikor SP6 RNS polimerázt adtunk hozzá és a megfelelő méretű RNS-re nézve vizsgálatot végeztünk.
4. A pCMVE/P-ben (1. lépés) és a pCMVE/PSP6ban (2. lépés) lévő pUC118 Clal helyétől (912) a Smal helyéig terjedő lokációjának körülvétele érdekében egy Cla-Notl-Sma adaptert szintetizáltunk. Ezt az adaptert a pUC118 Call-Smal helyébe ligáltuk, majd a korrekt kiónokra nézve szkríneltünk. A linkért mindkét esetben szekventáltuk, és a kiónokat a pCMVE/PSP6-L és a pCMVE/P-L jelzéssel láttuk el.
5. A pCMVE/PSP6-L-t Smal segítségével (a linker/pUC118 talákozásánál) és Hindin segítségével (a pUC118ban) kivágtuk. Egy az alábbiakban ismertetendő pSVORAAARI ll-ből származó, Hpal (5573) és HindlII (6136) közötti fragmentumot a pCMVE/PSP6L-nek a Sma I-Hind ΙΠ részébe inzertáltunk. A ligálást szkríneltük, majd izoláltunk egy olyan kiónt, amelyet a pCMVE/PSP6-L-SVORAAARI jelzéssel láttunk el.
a) Az SV40 origót és a poli A szignált a
HU 210 608 A9 pCIS2.8c28D-ből származó XmnI (5475) - Hind ΠΙ (6136) fragmentumként izoláltuk és a pUC119 Hind ΙΠ-tól Smal helyéig terjedő részbe klónoztuk annak megfelelően, ahogyan az a korábbiakban már ismertetésre került (Vieira és Messing, op. cit.). Ezt a kiónt a pSVORAA jelzéssel láttuk el.
b) EciRI segítségével végzett részleges emésztés útján eltávolítottuk az 5716-nál lévő EciRI helyet, majd Klenow segítségével betöltöttük. A betöltés utáni önligálásból nyert telepeket szkríneltük, majd a korrekt kiónt izoláltuk és a pSVORAAARI 11 jelzéssel láttuk el. Az eltávolított EcoRI helyet szekventálással ellenőriztük; korrektnek bizonyult.
c) A pSVORAAARI 11-nek a Hpal (5573)-tól a Hindin (6136)-ig terjedő fragmentumát izoláltuk és a pCMVE/PSP6-L kiónba (lásd a fenti 4. pontot) inzertáltuk.
6. EcoRI segítségével a 9999-nél kivágtuk az 5. pontban nyert pCMVE/PSP6-L-SVORAAAI kiónt, tompítottuk és önligáltuk. Egy EcoRI hely nélküli kiónt azonosítottunk, amelyet pRK névvel láttunk el.
7. A pRK kiónt Smal és BamHI segítségével kivágtuk. Klenow-val betöltöttük és religáltuk. A telepeket szkríneltük. Azonosítottunk egy pozitív kiónt, amelyet a pRKABam/Sma3 jelzéssel láttunk el.
8. A pRKABam/Sma3 HindlII helyét egy konverter alkalmazásával Hpal hellyé alakítottuk át. (Konverternek nevezzük a DNS azon részét, amelynek alkalmazásával egy restrikciós helyet egy másik restrikciós hellyé tudunk átalakítani. Ebben az esetben az egyik végnek komplementernek kell lennie egy HindlII éles véggel (sticky end), míg a másik végnek egy Hpal-felismerő hellyel kell rendelkeznie.) Azonosítottunk egy pozitív kiónt, amelyet pRKABam/Sma, HIII-Hpal 1 jelzéssel láttunk el.
9. PstI és NotI segítségével kivágtuk a pRKABam/Sma, ΗΙΠ-HpaI 1 kiónt, majd egy EcoRIHind ΙΠ linkért és HindlII-EcoRI linkért ligáltunk bele. Mindegyik linker esetében találtunk kiónokat. Ugyan5 akkor azonban azt is meghatároztuk, hogy a Hpal konverterek közül túlságosan sok jutott be (két vagy több konverter egy PvuII helyet hoz létre). Emiatt ezeket a kiónokat Hpal segítségével ki kellett vágni és önligálni kellett.
10. Hpal segítségével RI-HIII klón 3-at és HIII-RI klón 5-öt vágtunk ki, majd ezeket hígítottuk és önligáltuk. Pozitívokat azonosítottunk. Az RI-ΗΙΠ kiónt a pRK5 jelzéssel láttuk el.
C. A pRK5.ibpl.l felépítése
A pRK5.ibpl.l felépítését, illetve felépítésének folyamatát a 9. Ábra mutatja be. Izoláltuk a pRK5 kiónnak egy 4710 bp-s EcoRI/Smal fragmentumát. A pRK5 fragmentum izolálása után a pibp.H8.1-ból egy olyan, 934 bp-s PflMI/PvuII fragmentumot izolál20 tünk, amely a BP53 kódoló régió csaknem egészét tartalmazta. Ezt a fragmentumot úgy hoztuk létre, hogy először (egy szomszédos fragmentum eltávolítása érdekében) BamHI-vel, továbbá PvuII segítségével hasítottuk a pibp.118.l-et, majd ezt követően
PflMI segítségével emésztést végeztünk. A PvuII és a PflMI helyek átfednek közvetlenül a kódoló régió 3’ részénél, s így a PvuII segítségével végzett első hasítás meggátolja a pFIMI-vel történő ezt követő hasítást, miközben a 934 bp-s izolált fragmentumon egy tompa még marad vissza. Mivel a kódoló régió 5’ végénél lévő Pfl MI hasítás eltávolítja az ATG iniciáló kodont, az 5’ terminálist egy olyan oibp.ll oligonukleotid alkalmazásával rekonstruáltuk, amely oibp.ll oligonukleotid szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg:
PflMI
CGCGACCCAC GCT-3' GCGGTGGGTG-5'
EcoRI '-AATTCCACC ATGCAGCGGG 3'-GGTGG TACGTCGCCC
Ezen a fragmentumok a három részből álló ligálásának eredményeképpen a pRK5.ibpl.l expresszáló vektort nyertük.
D. A humán BP53 expresszálása
Humán embrionális vesesejteket a Graham és munkatársai által korábban már leírt [Graham et al. (1977), J. Gen.Virol.,36: 59-73] Ela dn Elb (293s) adenovírussal transzformáltunk. Ezeket a sejteket és majom vesesejteket a Gorman-féle kalcium-foszfátos módszer [DNA Cloning, D. M. Glover, ed. (IRC Press, Oxford, 1985) vol. 2, pp. 143-190] útján a fentiekben ismertetett pR5.ibpl.l expresszáló vektorral {vagy a korábban már ismertetett [Leung et al. (1987), Natúré, 330: 537-543] humán nökedési hormon receptornak egy szekretált formáját expresszáló kontroll plazmiddal] transzfektáltuk. Huszonnégy óra elteltével a sejteket további 48 órás időtartamra egy szérummentes közegbe cseréltük. Ezt követően ezt a szérummentes médiumot vizsgáltuk a BP53-ra nézve (10. Ábra).
IV. PÉLDA
BP53 vizsgálatok
A BP53 izotópos immunológiai vizsgálatát (radioimmunoassay) (10a. Ábra) Baxter és Martin módszerének [Baxter és Martin, (1986) J. Clin. Invest., 78:15041542] alkalmazása útján R-7 antiszérummal {további vérvétel ugyanazon nyúlból, ami Rl-4 antiszérumot eredményezett [Martin és Baxter (1985), J. Clin. Endo and Métából. 61: 799-801]} 1: 10 000 véghígítás mellett végeztük. Hozzáadott radioaktivitás: 7633 cpm (minden vizsgálat esetén); nemspecifikus háttér: 343 cpm; 100 %-os specifikus kötés: 1711 cpm. A kötési és a kötéskompetitív vizsgálatokat (lOb-lOd. Ábra) annak megfelelően végeztük, ahogyan azt Martin és Baxter a korábbiakban már ismertette [Martin, J. L. és Baxter, R. C. (1986) J. Bioi. Chem. 261 : 8754-8760]. A szabad és a kötött ligandokat immunprecipitációs úton, 1 : 300 véghígítású R-7 antiszérummal választottuk szét. A hozzáadott radioaktivitás értéke a 125I-IGF-I 14 500 cpm-je (200 Ci/g-ja) vagy a 125I-IGF-II 6300
HU 210 608 A9 cpm-je (80 Ci/g) volt. Scatchard-analízist végeztünk a LIGAND számítógépprogram segítségével, annak megfelelően, ahogyan azt a korábbiakban Munson és Rodbard ismertette [Munson és Rodbard (1980), Anal. Biochem., 107: 220-239], Az átmentileg (tranziens módon) expresszált BP53 protein Scatchard adatait a 10c. Ábra és a lOd. Ábra mutatja be.
V. PÉLDA
Az IGF proteinkötésének vizsgálata
A következő vizsgálati előírások alkalmazása mellett a BP53-at felhasználhatjuk annak kimutatására, hogy az IGF-I vagy az IGF-Π képes-e kötődni egy mintában jelenlévő BP53-hoz. A vizsgálatot sokféleképpen elvégezhetjük. Például a BP53-at hozzákapcsolhatjuk egy 96 lyukú mikrotiterlemezhez, majd a minták IGF-I-et vagy IGF-II-t tartalmazó részleteit a kötött BP53-mal inkubálhatjuk, mégpedig a biotinnal kapcsolt autentikus IGF-I vagy IGF-II rögzített menynyiségének a jelenlétében. Négy-hat órás inkubálást követően az oldatokat eltávolítjuk, és a nemkötött IGFI vagy IGF-II eltávolítása érdekében a lemezeket mossuk. Torma peroxidázhoz (HRP) kapcsolt avidin hozzáadása útján az IGF-biotin konjugátummal komplexet képezünk. A lemezeket ismételten mossuk, majd újra torma peroxidázt adunk hozzá. Az IGF nélküli mintákat tartalmazó lyukak legtöbbjében színfejlődés tapasztalható. Amint folytatjuk a minta inkubálását, a biotin-IGF konjugátum csökkenő mértékben kötődik; emiatt a színfejlődés is visszaszorul. Ez egy olyan, dózisfüggő választ nyújt, amelyet ismert koncentrációjú autentikus IGF-I vagy IGF-II alkalmazásával kalibrálhatunk.
Az ilyen típusú vizsgálat rendelkezik a radioreceptor vizsgálatok előnyeivel, magában foglalva a receptorhoz kötődni képes aktív ligand specifitását, valamint az ELISA antitest vizsgálat érzékenységét és egyszerűségét, mimellett nélkülözi ezek hátrányos tulajdonságait (például a radioaktív tracert, az aktív proteinre vonatkozó nemspecifikus jelleget).
Gyógyszerkészítmények
A BP53-at - és kívánt esetben az IGF-et - a gyógyászatilag alkalmazandó kompozíciók előállítására szolgáló ismert eljárásokkal formálhatjuk, amelyek szerint a BP53-at (és kívánt esetben az IGF-et) összekeveréssel kombináljuk valamely gyógyászatilag elfogadható hordozó segédanyaggal. Alkalmas hordozó segédanyagokat - köztük más humán proteineket, például humán szérum albumint is -, és az ezekkel végzett formálást úja le például a következő szakirodalmi forrás: Remington’s Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin). A BP53 tárolását általában foszfát-pufferelt szalinban vagy liofilizálva egy kötőanyag (excipient) jelenlétében oldhatjuk meg; a kötőanyagok közé tartoznak egyebek mellett a következők: cukoralkoholok, amilyen például a mannit vagy a szorbit; monoszacharidok, amilyen például a glükóz, mannóz, galaktóz vagy a fruktóz; oligoszacharidok, amilyen például a maltóz, laktóz vagy a szacharóz; valamint proteinek, amilyen például a humán szérum albumin.
Az előbbi kötőanyagok fokozhatják is a BP53-nak az inaktiválódással szembeni vagy vizes oldatban történő tárolás esetén a precipitációval szembeni stabilitását. A kötőanyagokat más, önmagukban ismert stabilizálószerekkel együttesen is alkalmazhatjuk. Az ilyen stabilizálószerek közé tartoznak - egyebek mellett - a következők: kelátképző ágensek, amilyen például az EDTA; antioxidánsok, amilyen például az aszkorbát vagy a ditio-treit; aminosavak; valamint nemionos felületaktív anyagok, amilyen például a polietilénglikol vagy a polietilénglikol és a polipropilénglikol blokkkopolimerei.
A BP53 humán vagy állati szervezetekbe történő beadásának az a célja, hogy az in vivő jelen lévő keringő vagy membránkötött IGF-et megkössük és lehetőség szerint meghosszabbítsuk az in vivő IGF felezési idejét, annak megfelelően, ahogyan a korábbiakban ismertettük. Ezen túlmenően az emlősök keringési rendszerének metabolikus úton történő befolyásolása érdekében a BP53-at IGF-fel, előnyösen IGF-I-gyel és/vagy IGF-II-vel együttesen is beadhatjuk. A BP53-at felhasználhatjuk olyan céllal is, hogy az IGF-I-et vagy az IGF-II-t hatékonyabban juttassuk be a szövetekbe.
A gyógyászati célú BP53 kompozíciók a BP53 gyógyászati szempontból hatásos dózisát egy gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagban tartalmazzák. A dózis, a hordozóanyag, valamint a kiválasztott beadási mód és program jelentősen függ egyéb tényezők mellett - a kezelendő rendellenessétől vagy állapotttól, a beteg orvosi előéletétől, továbbá a kiválasztott BP53 variáns aktivitásától. A kezelést végző orvos számára a kúra alatt ezeknek a tényezőknek a meghatározása és megfigyelése könnyen elvégezhető feladat. A husszán gyógyászatban egy - a fenti tényezők figyelembevételével - jellegzetesnek tekinthető dózistartomány a következő: körülbelül 50 és körülbelül 200 pg/kg, előnyösen 80-150 lg/kg. Amennyiben a BP53-at és az IGF-et együttesen alkalmazzuk, a két komponenst jellegzetesen ekvimoláris mennyiségekben használjuk, így az IGF moláris dózisa körülbelül ugyanolyan értékű, mint a beadott BP53 moláris dózisa.
A BP53 parenterális beadására szolgáló hordozóanyag egy steril izotóniás vizes oldat, például injekciós szalin vagy 5%-os dextrózoldat. Ezeket a készítményeket injekciós vagy infúziós úton, intranazálisan, szubkután, intravénásán, intraperitoneálisan vagy más, hagyományos beadási módon juttathatjuk be a szervezetbe.
A BP53-at késleltetett felszabadulású készítményekként is formálhatjuk. Az alkalmas példák közé tartoznak a megfelelő alakú áruk formájában lévő szemipermeábilis polimer mátrixok, például kúpok vagy mikrokapszulák. A beültethető vagy mikrokapszulázott, késleltetett felszabadulású mátrixok magukban foglalják például a következőket: polilaktidok (3 773 919. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 58 481. számú európai szabadalmi bejelentés), L-glutaminsav és gamma-etil-L-glutamát ko20
HU 210 608 A9 polimerei [U. Sidman et al. (1983), Biopolymers, 22 (1): 547-556], poli(2-hidroxi-etil-metakrilát) [R. Langer et al. (1981), Biomed. Mater. Rés., 15: 167-277; valamint R. Langer (1982), Chem. Tech., 12: 98-105], etilén-vinil-acetát [R. Langer et al. (1981), Biomed. Mater. Rés. 15: 167-277), vagy poli-D-(-)-3-hidroxi-vajsav (133 988. számú európai szabadalmi bejelentés). A késleltetett felszabadulású BP53 kompozíciók közé tartoznak a liposzomálisan bezárt BP53-at tartalmazó készítmények is. A BP53-at tartalmazó liposzómák önmagukban ismert módszerekkel állíthatók elő: 3 218 121. számú német szövetségi köztársasági szabadalmi bejelentés; Epstein et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 3688-3692; Hwang et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77: 4030-^034; 52 322, 36 676, 88 046, 102 324, 143 949 és 142 641. számú európai szabadalmi bejelentés; 83-118 008. számú japán szabadalmi bejelentés; 4 485 045 és 4 544 545. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Humán inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, amelyet nem kísér glikozilezés, és amely a 3.
    Ábrán látható érett protein aminosav-szekvenciáját foglalja magában.
  2. 2. Inzulinszerű növekedési faktor megkötésére alkalmas gyógyszerkészítmény, amely készítmény egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóban az 1. igénypont szerinti protein gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét tartalmazza.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, amely izotóniás.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti készítmény, amely sterilen szűrt.
  5. 5. Anyagcsere-szabályozásra alkalmas gyógyszerkészítmény, amely gyógyszerészeti szempontból hatásos mennyiségekben inzulinszerű növekedési faktort és az 1. igénypont szerinti proteint, továbbá egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, ahol az inzulinszerű növekedési faktor IGF-I vagy IGF-II.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti készítmény, ahol a készítmény steril, valamint az inzulinszerű növekedési faktor és a kötőprotein hozzávetőlegesen ekvimoláris arányban van jelen.
  8. 8. A keringő humán plazmában jelenlévő inzulinszerű növekedési faktor koncentrációjának vizsgálatára alkalmas diagnosztikai készítmény, amely az 1. igénypont szerinti proteint egy detektálhatóan jelzett csoporthoz kovalensen kötött állapotban tartalmazza.
HU9400026P 1994-09-06 1994-09-06 Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik. HU210608A9 (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9400026P HU210608A9 (hu) 1994-09-06 1994-09-06 Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9400026P HU210608A9 (hu) 1994-09-06 1994-09-06 Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU210608A9 true HU210608A9 (hu) 1995-05-29

Family

ID=10984381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400026P HU210608A9 (hu) 1994-09-06 1994-09-06 Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik.

Country Status (1)

Country Link
HU (1) HU210608A9 (hu)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5328891A (en) Insulin-like growth factor binding protein and pharmaceutical compositions
EP0409472B1 (en) Bone morphogenetic protein
KR970002915B1 (ko) 제ⅷ인자 활성을 가지는 신규한 단백질 : 유전공학-제조 세포를 사용하는 그의 제조방법 및 그것을 함유하는 의약 조성물
EP0192392B1 (en) Insulin receptor, its purification, its production in recombinant cells, dna therefor, antibodies to insulin receptor and their preparation, and pharmaceutical compositions containing them
JP4341859B2 (ja) 酵母での異種タンパク質の発現の方法
JP3946638B2 (ja) 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質
RU2232192C2 (ru) Слитый белок с увеличенной эритропоэтиновой активностью, нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, и способ получения слитого белка
JP2541761B2 (ja) ミュレル管抑制物質様ポリペプチドおよびその製造方法
JPH02504467A (ja) リン脂質アンカードメインとの新規融合ポリペプチドの合成のための核酸および方法
JP3860097B2 (ja) エリスロポエチン生体内活性強化融合蛋白質
BG60256B2 (bg) Рекомбинантен метод за получаване на лимфотоксин
JPS63102699A (ja) 新規なｄａｆの製造のための核酸
HU210608A9 (hu) Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik.
KR20180003677A (ko) 인간 성장호르몬 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
AU629820C (en) Production of insulin-like growth factor binding protein
EP3711772A1 (en) Recombinant proteins and fusion proteins
AU612594B2 (en) Human prorelaxin
JPS63119679A (ja) インヒビンのα鎖またはβ鎖をコ−ドしている核酸、並びにその様な核酸を用いてポリペプチドを合成する方法
JP2713871B2 (ja) ヒトインヒビンβ▲Ａ▼鎖の合成方法
AU2023210789A1 (en) Iga protease truncation, fusion protein comprising iga protease truncation, and use thereof
JPH1080277A (ja) 変異型ヒト成長ホルモンとその用途
HU217102B (hu) Tisztított neurotróf faktor és eljárás előállítására