JP3860097B2 - エリスロポエチン生体内活性強化融合蛋白質 - Google Patents
エリスロポエチン生体内活性強化融合蛋白質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3860097B2 JP3860097B2 JP2002253938A JP2002253938A JP3860097B2 JP 3860097 B2 JP3860097 B2 JP 3860097B2 JP 2002253938 A JP2002253938 A JP 2002253938A JP 2002253938 A JP2002253938 A JP 2002253938A JP 3860097 B2 JP3860097 B2 JP 3860097B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- epo
- gene
- fusion protein
- eltp
- estp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 60
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims description 57
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims description 57
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title claims description 57
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 28
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 52
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150054956 LTP gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 101150056707 stp gene Proteins 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 101150058391 CTP gene Proteins 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新薬貧血治療剤であるエリスロポエチン(erythropoietin：以下、‘ＥＰＯという)の生体内(in vivo)活性が増進された融合蛋白質(fusion protein)に関するものである。より具体的には、本発明はＥＰＯ分子に半減期(half-life)増加活性を持つ、生体内由来の特定ペプチドを融合させることによって、生体内半減期が増加してエリスロポエチン活性が画期的に増大した融合蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＥＰＯは、分子量３０,０００〜３４,０００の糖蛋白質として、赤血球の生成および分化を促進する因子である。この蛋白質は、赤血球前駆細胞の受容体に結合して作用し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の増加およびヘモグロビン生成刺激などを起こす。この刺激因子ＥＰＯは、腎臓病患者の貧血、未熟児の貧血、甲状腺機能低下症(hypothyroidism)による貧血、栄養失調による貧血等の治療のために用いられる。組換ヒトＥＰＯの臨床的利用は拡大しつつある。しかし、半減期が短いために、平均週３回の投与を必要とするので幾らかの不便さとコストが高くなる。従って、ＥＰＯの生体内活性を長期間維持させれば、ＥＰＯの投与回数を大きく減少させることができる。
【０００３】
ＥＰＯの生体内活性度は、生体内半減期と比例する。生体内での半減期はＥＰＯが持つ糖鎖の末端に位置するシアリン酸(sialic acid)の含量と相関関係があることが知られている。従って、ＥＰＯの生体内活性は、糖鎖の存在によって大きく左右される。糖鎖の形態は細胞の種類によって、それぞれ異なって現れるので、同じ糖蛋白質を異なる種類の細胞で発現させれば、それぞれの種々の糖鎖の形態を呈する。最近、いくつかのバクテリアの種類は、糖鎖を付けることができることが明らかになったが、一般的にバクテリア、例えば、大腸菌(E.coli)は蛋白質に糖鎖を付けることができないことが知られている。大腸菌で発現される蛋白質には糖が付加されていないので、大腸菌で発現されるＥＰＯは糖鎖を含まず、この場合、インビトロ(in vitro)では活性が確認出来るが、生体内では全く活性を持っていない。その理由は、脱グリコシル化ＥＰＯは体内で急速に除去されて、その半減期がきわめて短いためである。結論として、糖鎖の存在の有無は、ＥＰＯの活性に非常に重要な役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯの活性を増加させるために多くの研究が行われてきた。主な研究方法は、突然変異誘発方法(mutagenesis)でＥＰＯ遺伝子に突然変異を誘発させることによって、いくつかのアミノ酸を置換する方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２５７(名称：エリスロポエチン類似体、出願人：アムジェン)には突然変異誘発を通じてＥＰＯの糖含量を増加させることによって、体内半減期を増加させる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体(dimer)形成によって、ＥＰＯの生体内半減期を増加させる試みもあった(A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778)。また、公知の他の方法は、遺伝b子工学的方法を用いてＥＰＯ分子と新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含量、すなわち、ＥＰＯのシアリン酸の含量を増加させることによって、生体内活性度を増進させる方法等がある。しかし、この目的のために、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは異質な蛋白質断片を使用することはできない。多くの場合、このような修飾は蛋白質固有の活性を低下または喪失させる結果を招き、生体内で用いられる時に抗原性の問題を引き起こし得るからである。
【０００５】
ＥＰＯに関するものではないが、融合蛋白質またはキメラ蛋白質(chimeric protein)などが研究されており、例えば、性ホルモンの一種である卵胞形成ホルモンに関したものがある(参照：Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol)。しかし、遺伝子工学を用いた蛋白質の修飾は多くの危険性があるので、それらの方法は実際の産業には適用されなかった。すなわち、専門的技術無しではその目的蛋白質自体を得ることも容易ではなく、反対に、多くの場合、新しいアミノ酸の添加または置換によって蛋白質本来の活性が喪失するか、減少し得るからである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の開示
本発明者らは、ＥＰＯ分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含量を増加させることによって、その生体内活性度を強化し得る新しい方法を開発するために鋭意研究を行ってきた。その結果、体内に既に存在する蛋白質である血小板産生因子(thrombopoietin、以下、‘ＴＰＯ’という)のカルボキシ末端に位置するペプチド断片(carboxy terminal peptide、以下、‘ＣＴＰ’という)をＥＰＯのカルボキシ末端に融合させて得た融合蛋白質がＥＰＯ本来の活性をそのまま保有しながら、糖鎖形成部位(glycosylationsite)を増加させる多数のアミノ酸によって、生体内半減期が画期的に増加する一方、体内適用時の抗原性も誘発しないという事実を見出した。その結果、本発明者らは発明を完成した。
【０００７】
従って、本発明の目的はＴＰＯのＣＴＰをヒトＥＰＯのカルボキシ末端に融合させた、ヒトＥＰＯの生体内活性が増強した融合蛋白質を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は上記融合蛋白質をコードする核酸、上記核酸を含有する組換えベクターおよび上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は上記形質転換体を培養して増強したヒトＥＰＯ活性を持つ融合蛋白質を製造する方法を提供することである。
【００１０】
第１に、本発明はヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＴＰＯのＣＴＰを融合させた、生体内ヒトＥＰＯ活性が強化融合蛋白質に関するものである。上記ＣＴＰは配列番号１に記載されたＴＰＯの１７６〜３５３の位置のアミノ酸(以下、‘ＬＴＰ’という)またはその一部、特に配列番号２に記載されたＴＰＯの３３７〜３５３の位置のアミノ酸(以下、‘ＳＴＰ’という)を含むことが望ましい。
【００１１】
特に、本発明にかかる融合蛋白質は、配列番号３または４に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００１２】
第２に、本発明は上記融合蛋白質をコードする核酸、核酸を含有する組換えベクター、上記組換えベクターで形質転換された宿主細胞株、好ましくはＣＨＯ(Chinese hamster ovary)細胞に関するものである。
【００１３】
第３に、本発明は上記形質転換細胞株を培養することによって増強されたヒトＥＰＯの活性を持つ融合蛋白質を製造する方法に関するものである。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１４】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、目的とする融合蛋白質の遺伝子の製造およびクローニング、目的遺伝子の発現ベクターの構築、動物細胞の形質転換、発現、分離および生物学的検定の段階を含む。
【００１５】
(１)遺伝子の製造
ＥＰＯ cＤＮＡは、ヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン(Invitrogen)社)で予め製作されたＥＰＯ cＤＮＡ末端(ＥＰ１およびＥＰ２)の相補的プライマーを用いて通常のＰＣＲ(バイオニアー(Bioneer Co.)のＰＣＲプリミックスキット(PreMix Kit))技術を行うことによって得ることができる。ＴＰＯ cＤＮＡも上記と同様の方法によってＴＰＯcＤＮＡ末端(Ｔ１およびＴ２)の相補的なプライマーを使用して得られる。
【００１６】
EP1：ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号５)
EP2：GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号６)
T1：ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC(配列番号７)
T2：TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA(配列番号８)
【００１７】
ＰＣＲで得られたＥＰＯ cＤＮＡとＴＰＯ cＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ(Promega)社)にそれぞれクローニングした。このpＧＥＭ−ＥＰＯおよびpＧＥＭ−ＴＰＯは、塩基配列を確認した後、以後作業の鋳型として用いる。
【００１８】
本発明で利用されるＴＰＯのＣＴＰ遺伝子であるＬＴＰは、pＧＥＭ−ＴＰＯを鋳型としてプライマーＥＬ１とＴ２を使用してＰＣＲを行うことによって得られる。
EL1：GAGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC(配列番号９)
【００１９】
プライマーＥＬ１にはＥＰＯの３'末端部位に位置する制限酵素ＳtuＩ位置に至る遺伝子と、ＬＴＰ遺伝子(ＴＰＯの１７６〜３５３番アミノ酸)の５'末端の一部分とを同時に含んでいる。一方、pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１とＥＰ２を使用してＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得る。このようにして得たＥＰＯ遺伝子とＬＴＰ遺伝子を制限酵素ＳtuＩでそれぞれ処理した。その後、ＥＰＯとＬＴＰ遺伝子の断片を結合(ligation)して、結合生成物を鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を使用してＰＣＲを行って約１１１３bpsの遺伝子断片ＥＬＴＰを得る。
EP11：TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号１０)
L2：TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC(配列番号１１)
【００２０】
この遺伝子をクローニングベクターのpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＬＴＰ図３(ａ))。
【００２１】
また、本発明で利用される遺伝子ＳＴＰは合成およびＰＣＲセルフ−プライミング過程によって得る。合成された遺伝子断片は、下記ＥＳ１、Ｓ２、Ｓ３および上記Ｌ２である。
ES1：AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA(配列番号１２)
S2：GTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG(配列番号１３)
S3：TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC(配列番号１４)
【００２２】
これらの４つ遺伝子断片を1μlずつ採って(５０pモル／μl)、ＢＭ社の高正確度Taq(high fidelity Taq)システムを使用してＰＣＲを行った。
【００２３】
１％アガロースゲルで、約５０bpの遺伝子断片(ＳＴＰ遺伝子)を確認した。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７個のアミノ酸(３３７〜３５３位置のアミノ酸)をコードする(図１)。
【００２４】
pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＥＰ２を使用してＰＣＲを行い、ＥＰＯ遺伝子のみを得る。このＥＰＯ遺伝子とＳＴＰ遺伝子を同時に鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を使用してＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用するＰＣＲを行うことによって、約６３０bpsの所望の融合遺伝子のＥＳＴＰ遺伝子を得る。この遺伝子をクローニングベクターリンpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＳＴＰ、図３(ｂ))。
【００２５】
(２)発現ベクターの構築
発現ベクターはインビトロジェン(Invitrogen)社のｐcＤＮＡ３.１ベクターを用いる。
【００２６】
ｐcＤＮＡ３.１ベクターを制限酵素Ｈind IIIおよびＢamＨＩで処理して直線状ベクターを得た後、pＧＥＭ−ＥＬＴＰとpＧＥＭ−ＥＳＴＰをそれぞれ同じ制限酵素であるＨind IIIおよびＢamＨＩで処理する。アガロースゲル上でキアゲン(Qiagen)抽出キットを用いて消化されたｐcＤＮＡ３.１、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰ遺伝子を分離した。その後、それぞれ遺伝子を結合(ligation)させて、結合物は大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した後、生成したコロニーからプラスミドを分離して制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩを処理した。その後、１％アガロースゲル電気泳動でＥＬＴＰおよびＥＳＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別する。このプラスミドをそれぞれｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰと称した(図３(ａ)および(ｂ))。
【００２７】
(３)ＣＨＯ細胞の形質転換および発現
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞(ＤＧ４４)を培養して４０〜８０％(１〜４×１０５細胞／６０mm皿)の集密となるようにする。ＢＭ社のスーパーフェクション試薬(superfection reagent)３μlと細胞培養培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、これに、pcＤＮＡ−ＥＬＴＰ(０.１μg／ μl以上、約２μg)、およびdhfr遺伝子が含まれるベクターpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加した。混合物を室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製した上記細胞に加えた。一日経過後、Ｇ４１８を５００μg／mlの培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。ついで、この培地を約７〜１０日間５００μg／μlのＧ４１８培地で交換すると、この間にＧ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロール細胞は完全に死滅する。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＢＭ社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを用いて培養液から発現されたＥＬＴＰ蛋白質を確認する。このような方法をＥＳＴＰ発現ベクターを同様に適用した後、ＥＳＴＰ融合蛋白質の発現もまた確認した。
【００２８】
(４)発現されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの精製
抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(Ｒ＆Ｄ社製)を用いて分離精製用親和性樹脂(affinity resin)を下記のように製作する。
【００２９】
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ０.３ｇを１mM ＨＣｌで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mM ＨＣｌで洗浄する。樹脂を４mlのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ３、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ８.３)で洗浄した後、直ぐに４mlカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)と混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ ８.０)にリフレッシュした後、常温で２時間チューブを振りながら反応させる。６.５mlのカップリング緩衝液、６.５mlの酢酸緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ４)および６.５mlのカップリング緩衝液で順次洗浄する。このように調製された樹脂を用いてカラムを製作し、次のように精製を実施する。
【００３０】
細胞を血清無含有培地で１日培養した後、培養液のみをセントリプレップ(Centriprep、ＭＷＣＯ １０,０００、ミリポア(Milipore)社製)を用いて約５分の１に濃縮する。約２０ml／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに添加して再びＰＢＳで洗浄した。カラムおよび溶離液に適用された抽出緩衝液(０.１Ｍ グリシン、pＨ ２.８)は、直ぐに１Ｍトリス(Tris)でpＨ７.５となるように滴定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は最小９７％以上である(図４)。
【００３１】
(５)バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾臓細胞を用いるバイオアッセイ試験で、発現および適当に精製されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰはＥＰＯより高い活性を示す。ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰと融合させたカルボキシ末端がＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができる。
【００３２】
(６)薬物動態学試験
製造されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰが実際生体内で長い半減期を持っているかの否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。このとき、合計４匹のマウスに対し、候補物質を１匹当たり２０ユニットの投与量で静脈内(iv)投与する。経時的血中濃度を確認するために、３０分間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社のＥＩＡキットを使用して濃度を測定した。マウス薬物動態学試験で候補物質ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは対照薬物であるＥＰＯより遥かに長い半減期を持っていることがわかった(図５)。
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記実施例は本発明を説明するものと理解されるべきであって、本発明の範囲をいかなる方法によっても制限するものではない。
【００３４】
実施例１：遺伝子調製
ＥＰＯ cＤＮＡをヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で、予め製作されたＥＰＯ cＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１、ＥＰ２)を５０pmolの量で使用して通常のＰＣＲ(バーイオニア社のＰＣＲプリミックスキット)を行って得た。ＴＰＯ cＤＮＡをＴＰＯ cＤＮＡの両末端に相補的なプライマーＴ１およびＴ２)を使用して同様の方法によって得た。ＢＭ社の高正確度Taq(high fidelity Taq)システムを使用して、５２℃でアニーリング(annealing)４０秒、７２℃で５５秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルのＰＣＲを行ってＥＰＯ cＤＮＡとＴＰＯ cＤＮＡを得た。これをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)にそれぞれクローニングした。すなわち、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルから抽出してpＧＥＭ−Ｔに結合させた後、大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。形質転換された大腸菌は、Ｘ−gal／ＩＰＴＧを塗抹したＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した。白色コロニーからプラスミドを精製して制限酵素(ＳacＩ、ＳacII)と反応させ、それぞれのcＤＮＡが含まれているコロニーを選別した。この段階で得たベクターをpＧＥＭ-ＥＰＯおよびpＧＥＭ−ＴＰＯとそれぞれ命名して塩基配列を確認した後、以後作業の鋳型として用いた。
【００３５】
本発明で用いられるＴＰＯのＣＴＰ遺伝子であるＬＴＰはpＧＥＭ−ＴＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＬ１とＴ２(５０pmol)を用いてＢＭ社の高正確度タグシステムを使用して５０℃でアニーリング４０秒、７２℃で４５秒、９４℃で２０秒の条件で総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって得た。プライマーＥＬ１にはＥＰＯ３'末端付近に存在する制限酵素ＳtuＩ位置から３'末端までの遺伝子とＬＴＰ遺伝子の５'末端の一部分を同時に含んでいる。１％アガロースゲルで約５３４bpsの遺伝子断片を確認した(ＬＴＰ遺伝子)。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７８個(１７６〜３５３番)のアミノ酸をコードする(図１)。
【００３６】
他方では、pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１とＥＰ２を使用して上記と同じ条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。
【００３７】
得られたＥＰＯ遺伝子とＬＴＰ遺伝子を制限酵素ＳtuＩでそれぞれ処理して、キアゲン抽出キットを使用して精製した後、リガーゼ(ligase)で結合させた。遺伝子ＥＰＯの断片とＬＴＰ断片が結合遺伝子を鋳型として使用し、プライマーＥＰ１１とＬ２を用いて(５０pmol)ＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用して５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で６０秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルを行って約１１１３bpsの所望の融合遺伝子であるＥＬＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＬＴＰと命名、図３(ａ))。
【００３８】
遺伝子ＳＴＰは、合成およびＰＣＲセルフ−プライミングを用いて得た。合成された遺伝子断片はＥＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｌ２である。これらの４つのＤＮＡ断片を１μlずつ採って(５０pmol／μl)、ＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用して５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で４０秒、９４℃で２０秒の条件で、総１５サイクルのＰＣＲを行った。１％アガロースゲルで約５０bpの遺伝子断片を確認した(ＳＴＰ遺伝子)。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７個のアミノ酸(３３７〜３５３番)をコードする(図１)。
【００３９】
pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＥＰ２を使用して上記と同一条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。このＥＰＯ遺伝子とＳＴＰ遺伝子を同時に鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を用いてＢＭ社の高正確度タグシステムを使用し、５８℃でアニーリング４０秒、７２℃で５０秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって、約６３０bpの所望の融合遺伝子のＥＳＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターリンpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ-ＥＳＴＰと命名、図３(ｂ))。
【００４０】
実施例２：発現ベクターｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの調製
発現ベクターとしてインビトロジェン社のｐcＤＮＡ３.１ベクターを用いた。pＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングされている遺伝子ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは末端にそれぞれ制限酵素Ｈind IIIおよびＢamＨＩの認識部位を含む。ｐcＤＮＡ３.１、pＧＥＭ−ＥＬＴＰおよびpＧＥＭ−ＥＳＴＰをそれぞれ制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩで処理した。アガロースゲル上で直線状ｐcＤＮＡ３.１とＥＬＴＰ、ＥＳＴＰ遺伝子をキアゲン抽出キットを用いて得た後、ｐcＤＮＡ３.１にＥＬＴＰまたはＥＳＴＰ遺伝子をそれぞれ結合させ大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した後、生成したコロニーからプラスミドを分離して制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩを処理し、１％アガロースゲル電気泳動でＥＬＴＰ、ＥＳＴＰ遺伝子が含まれたコロニーのみを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ３.１−ＥＳＴＰとそれぞれ命名した(図３)。
【００４１】
実施例３：ＣＨＯ細胞の形質転換および発現
６０mm細胞培養皿でＣＨＯ細胞(ＤＧ４４)を培養して、４０〜８０％(１〜４×１０５細胞／６０mm皿)集蜜となるようにした。ＢＭ社のスーパーフェクション試薬３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無含有血清、無含有抗生物質)９７μlをよく混合し、プラスミドｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰ(＝０.１μg／μl、約２μg)、およびdhfr遺伝子を含むｐＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加した。混合物を室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製した細胞に加えた。一日経過後、培地をＧ４１８を５００μg／ml含む培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ ＦＢＳ)に交換した。約７〜１０日間Ｇ４１８を５００μg／ml含む培地に交換すると、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞は完全に死滅した。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＢＭ社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを用いて培養液から発現されたＥＬＴＰ蛋白質を確認した。ｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの場合も同様に進行した。
【００４２】
実施例４：発現された融合蛋白質の精製
Ｒ＆Ｄシステム社の抗−ＥＰＯモノクロナール抗体を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように調製した。
【００４３】
ＣＮＢｒ活性化されたセファロース４Ｂ ０.３ｇを１mM ＨＣｌで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mM ＨＣｌで洗浄した。樹脂を４mlのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ３、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ８.３)で洗浄した後、直ぐに４mlカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合して常温で２時間反応させた。このとき、チューブをよく振った。遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ ８.０)でリフレッシュした後、常温で２時間振りながら反応させた。６.５mlカップリング緩衝液、６.５ml酢酸緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ４)および６.５mlカップリング緩衝液で順次洗浄した。調製された樹脂を用いてカラムを製作して次のように精製した。
【００４４】
細胞を血清無含有培養液で１日間培養した後、培養液のみをミリポア社のセントリプレップ(Centriprep、ＭＷＣＯ １０,０００)を用いて約５分の１に濃縮させた。約２０ml／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。抽出緩衝液(０.１Ｍグリシン、pＨ２.８)をカラムに添加した後、溶出液を直ぐ１ＭトリスでpＨ７.５で滴定した。精製されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００４５】
実施例５：バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンをマウスに１日１回、２日間６０mg／kgずつ注射した。３日経過後、拡張した脾臓を分離してホモジナイザーで破砕して脾臓細胞を得た。脾臓細胞を６×１０６細胞／mlで希釈して９６ウェルプレートに細胞溶液１００μlずつ導入した。導入された各ウェルに標準ＥＰＯ(０〜５００mU／ml)と発現された融合蛋白質を１００mU／mlの濃度でそれぞれ加えた後、プレートを３７℃ＣＯ２インキュベーターで２２時間放置した。各ウェルにジメチル ３[Ｈ]−チミジン(２０μＣi／ml)を５０μlずつ加えた後、同じインキュベーターで２時間さらに反応させ、反応液を各ウェル別にグラスフィルタ(Ｎunc １−７３１６４)に吸着させた。濾過物を生理食塩水で３回洗浄し、βカウンター用いて各フィルターの放射能量を測定した。融合蛋白質ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの活性を標準ＥＰＯと比較して測定した時、融合蛋白質の活性が標準ＥＰＯに類似するか、若干高く現れた。ＥＰＯに添加されたカルボキシ末端の存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができた。
【００４６】
実施例６：薬物動態学試験
製造された候補物質が、実際に生体内で長い半減期を持っているか否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。実施例５に記載された方法によって精製された融合蛋白質をそれぞれ合計４匹のマウスに対し、１匹当たり２０ユニットで静脈内(iv)投与した。経時的血中濃度を確認するために、マウスから３０分間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム社のＥＩＡキットを使用して濃度を測定した。その結果を図５に示した。図５に示すように、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは対照薬物のＥＰＯよりそれぞれ約３倍(ＥＰＯ半減期 ２２分、ＥＬＴＰ ６０分、ＥＳＴＰ ５７分)の遥かに長い半減期を示すことがわかった。
【００４７】
産業上の利用可能性
本発明にかかる融合蛋白質は、ＥＰＯの固有活性自体には影響を与えず、糖鎖を増加させるアミノ酸の存在によってＥＰＯの生体内半減期を画期的に増加させる。また、融合蛋白質は融合したペプチド、すなわち、ＬＴＰ又はＳＴＰが体内に存在するペプチドであるので体内に適用時に抗原性を誘発しない。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 FIGURE １(a)は、血小板産生因子(ＴＰＯ)のカルボキシ末端ペプチド(ＬＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図２】 FIGURE １(b)は、血小板産生因子(ＴＰＯ)のカルボキシ末端ペプチド(ＳＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図３】 FIGURE ２(ａa)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＬＴＰの融合蛋白質ＥＬＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図４】 FIGURE ２(ab)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＬＴＰの融合蛋白質ＥＬＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図５】 FIGURE ２(b)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＳＴＰの融合蛋白質ＥＳＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図６】 FIGURE３(a)は、発現ベクターｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図７】 FIGURE３(b)は、ｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図８】 FIGURE４は、発現ベクターＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの電気泳動写真である。
【図９】 FIGURE５は、ＥＰＯ、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの薬物動態学的結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新薬貧血治療剤であるエリスロポエチン(erythropoietin：以下、‘ＥＰＯという)の生体内(in vivo)活性が増進された融合蛋白質(fusion protein)に関するものである。より具体的には、本発明はＥＰＯ分子に半減期(half-life)増加活性を持つ、生体内由来の特定ペプチドを融合させることによって、生体内半減期が増加してエリスロポエチン活性が画期的に増大した融合蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＥＰＯは、分子量３０,０００〜３４,０００の糖蛋白質として、赤血球の生成および分化を促進する因子である。この蛋白質は、赤血球前駆細胞の受容体に結合して作用し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の増加およびヘモグロビン生成刺激などを起こす。この刺激因子ＥＰＯは、腎臓病患者の貧血、未熟児の貧血、甲状腺機能低下症(hypothyroidism)による貧血、栄養失調による貧血等の治療のために用いられる。組換ヒトＥＰＯの臨床的利用は拡大しつつある。しかし、半減期が短いために、平均週３回の投与を必要とするので幾らかの不便さとコストが高くなる。従って、ＥＰＯの生体内活性を長期間維持させれば、ＥＰＯの投与回数を大きく減少させることができる。
【０００３】
ＥＰＯの生体内活性度は、生体内半減期と比例する。生体内での半減期はＥＰＯが持つ糖鎖の末端に位置するシアリン酸(sialic acid)の含量と相関関係があることが知られている。従って、ＥＰＯの生体内活性は、糖鎖の存在によって大きく左右される。糖鎖の形態は細胞の種類によって、それぞれ異なって現れるので、同じ糖蛋白質を異なる種類の細胞で発現させれば、それぞれの種々の糖鎖の形態を呈する。最近、いくつかのバクテリアの種類は、糖鎖を付けることができることが明らかになったが、一般的にバクテリア、例えば、大腸菌(E.coli)は蛋白質に糖鎖を付けることができないことが知られている。大腸菌で発現される蛋白質には糖が付加されていないので、大腸菌で発現されるＥＰＯは糖鎖を含まず、この場合、インビトロ(in vitro)では活性が確認出来るが、生体内では全く活性を持っていない。その理由は、脱グリコシル化ＥＰＯは体内で急速に除去されて、その半減期がきわめて短いためである。結論として、糖鎖の存在の有無は、ＥＰＯの活性に非常に重要な役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯの活性を増加させるために多くの研究が行われてきた。主な研究方法は、突然変異誘発方法(mutagenesis)でＥＰＯ遺伝子に突然変異を誘発させることによって、いくつかのアミノ酸を置換する方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２５７(名称：エリスロポエチン類似体、出願人：アムジェン)には突然変異誘発を通じてＥＰＯの糖含量を増加させることによって、体内半減期を増加させる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体(dimer)形成によって、ＥＰＯの生体内半減期を増加させる試みもあった(A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778)。また、公知の他の方法は、遺伝b子工学的方法を用いてＥＰＯ分子と新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含量、すなわち、ＥＰＯのシアリン酸の含量を増加させることによって、生体内活性度を増進させる方法等がある。しかし、この目的のために、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは異質な蛋白質断片を使用することはできない。多くの場合、このような修飾は蛋白質固有の活性を低下または喪失させる結果を招き、生体内で用いられる時に抗原性の問題を引き起こし得るからである。
【０００５】
ＥＰＯに関するものではないが、融合蛋白質またはキメラ蛋白質(chimeric protein)などが研究されており、例えば、性ホルモンの一種である卵胞形成ホルモンに関したものがある(参照：Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol)。しかし、遺伝子工学を用いた蛋白質の修飾は多くの危険性があるので、それらの方法は実際の産業には適用されなかった。すなわち、専門的技術無しではその目的蛋白質自体を得ることも容易ではなく、反対に、多くの場合、新しいアミノ酸の添加または置換によって蛋白質本来の活性が喪失するか、減少し得るからである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の開示
本発明者らは、ＥＰＯ分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含量を増加させることによって、その生体内活性度を強化し得る新しい方法を開発するために鋭意研究を行ってきた。その結果、体内に既に存在する蛋白質である血小板産生因子(thrombopoietin、以下、‘ＴＰＯ’という)のカルボキシ末端に位置するペプチド断片(carboxy terminal peptide、以下、‘ＣＴＰ’という)をＥＰＯのカルボキシ末端に融合させて得た融合蛋白質がＥＰＯ本来の活性をそのまま保有しながら、糖鎖形成部位(glycosylationsite)を増加させる多数のアミノ酸によって、生体内半減期が画期的に増加する一方、体内適用時の抗原性も誘発しないという事実を見出した。その結果、本発明者らは発明を完成した。
【０００７】
従って、本発明の目的はＴＰＯのＣＴＰをヒトＥＰＯのカルボキシ末端に融合させた、ヒトＥＰＯの生体内活性が増強した融合蛋白質を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は上記融合蛋白質をコードする核酸、上記核酸を含有する組換えベクターおよび上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は上記形質転換体を培養して増強したヒトＥＰＯ活性を持つ融合蛋白質を製造する方法を提供することである。
【００１０】
第１に、本発明はヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＴＰＯのＣＴＰを融合させた、生体内ヒトＥＰＯ活性が強化融合蛋白質に関するものである。上記ＣＴＰは配列番号１に記載されたＴＰＯの１７６〜３５３の位置のアミノ酸(以下、‘ＬＴＰ’という)またはその一部、特に配列番号２に記載されたＴＰＯの３３７〜３５３の位置のアミノ酸(以下、‘ＳＴＰ’という)を含むことが望ましい。
【００１１】
特に、本発明にかかる融合蛋白質は、配列番号３または４に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００１２】
第２に、本発明は上記融合蛋白質をコードする核酸、核酸を含有する組換えベクター、上記組換えベクターで形質転換された宿主細胞株、好ましくはＣＨＯ(Chinese hamster ovary)細胞に関するものである。
【００１３】
第３に、本発明は上記形質転換細胞株を培養することによって増強されたヒトＥＰＯの活性を持つ融合蛋白質を製造する方法に関するものである。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１４】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、目的とする融合蛋白質の遺伝子の製造およびクローニング、目的遺伝子の発現ベクターの構築、動物細胞の形質転換、発現、分離および生物学的検定の段階を含む。
【００１５】
(１)遺伝子の製造
ＥＰＯ cＤＮＡは、ヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン(Invitrogen)社)で予め製作されたＥＰＯ cＤＮＡ末端(ＥＰ１およびＥＰ２)の相補的プライマーを用いて通常のＰＣＲ(バイオニアー(Bioneer Co.)のＰＣＲプリミックスキット(PreMix Kit))技術を行うことによって得ることができる。ＴＰＯ cＤＮＡも上記と同様の方法によってＴＰＯcＤＮＡ末端(Ｔ１およびＴ２)の相補的なプライマーを使用して得られる。
【００１６】
EP1：ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号５)
EP2：GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号６)
T1：ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC(配列番号７)
T2：TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA(配列番号８)
【００１７】
ＰＣＲで得られたＥＰＯ cＤＮＡとＴＰＯ cＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ(Promega)社)にそれぞれクローニングした。このpＧＥＭ−ＥＰＯおよびpＧＥＭ−ＴＰＯは、塩基配列を確認した後、以後作業の鋳型として用いる。
【００１８】
本発明で利用されるＴＰＯのＣＴＰ遺伝子であるＬＴＰは、pＧＥＭ−ＴＰＯを鋳型としてプライマーＥＬ１とＴ２を使用してＰＣＲを行うことによって得られる。
EL1：GAGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC(配列番号９)
【００１９】
プライマーＥＬ１にはＥＰＯの３'末端部位に位置する制限酵素ＳtuＩ位置に至る遺伝子と、ＬＴＰ遺伝子(ＴＰＯの１７６〜３５３番アミノ酸)の５'末端の一部分とを同時に含んでいる。一方、pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１とＥＰ２を使用してＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得る。このようにして得たＥＰＯ遺伝子とＬＴＰ遺伝子を制限酵素ＳtuＩでそれぞれ処理した。その後、ＥＰＯとＬＴＰ遺伝子の断片を結合(ligation)して、結合生成物を鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を使用してＰＣＲを行って約１１１３bpsの遺伝子断片ＥＬＴＰを得る。
EP11：TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号１０)
L2：TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC(配列番号１１)
【００２０】
この遺伝子をクローニングベクターのpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＬＴＰ図３(ａ))。
【００２１】
また、本発明で利用される遺伝子ＳＴＰは合成およびＰＣＲセルフ−プライミング過程によって得る。合成された遺伝子断片は、下記ＥＳ１、Ｓ２、Ｓ３および上記Ｌ２である。
ES1：AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA(配列番号１２)
S2：GTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG(配列番号１３)
S3：TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC(配列番号１４)
【００２２】
これらの４つ遺伝子断片を1μlずつ採って(５０pモル／μl)、ＢＭ社の高正確度Taq(high fidelity Taq)システムを使用してＰＣＲを行った。
【００２３】
１％アガロースゲルで、約５０bpの遺伝子断片(ＳＴＰ遺伝子)を確認した。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７個のアミノ酸(３３７〜３５３位置のアミノ酸)をコードする(図１)。
【００２４】
pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＥＰ２を使用してＰＣＲを行い、ＥＰＯ遺伝子のみを得る。このＥＰＯ遺伝子とＳＴＰ遺伝子を同時に鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を使用してＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用するＰＣＲを行うことによって、約６３０bpsの所望の融合遺伝子のＥＳＴＰ遺伝子を得る。この遺伝子をクローニングベクターリンpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＳＴＰ、図３(ｂ))。
【００２５】
(２)発現ベクターの構築
発現ベクターはインビトロジェン(Invitrogen)社のｐcＤＮＡ３.１ベクターを用いる。
【００２６】
ｐcＤＮＡ３.１ベクターを制限酵素Ｈind IIIおよびＢamＨＩで処理して直線状ベクターを得た後、pＧＥＭ−ＥＬＴＰとpＧＥＭ−ＥＳＴＰをそれぞれ同じ制限酵素であるＨind IIIおよびＢamＨＩで処理する。アガロースゲル上でキアゲン(Qiagen)抽出キットを用いて消化されたｐcＤＮＡ３.１、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰ遺伝子を分離した。その後、それぞれ遺伝子を結合(ligation)させて、結合物は大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した後、生成したコロニーからプラスミドを分離して制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩを処理した。その後、１％アガロースゲル電気泳動でＥＬＴＰおよびＥＳＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別する。このプラスミドをそれぞれｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰと称した(図３(ａ)および(ｂ))。
【００２７】
(３)ＣＨＯ細胞の形質転換および発現
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞(ＤＧ４４)を培養して４０〜８０％(１〜４×１０５細胞／６０mm皿)の集密となるようにする。ＢＭ社のスーパーフェクション試薬(superfection reagent)３μlと細胞培養培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、これに、pcＤＮＡ−ＥＬＴＰ(０.１μg／ μl以上、約２μg)、およびdhfr遺伝子が含まれるベクターpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加した。混合物を室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製した上記細胞に加えた。一日経過後、Ｇ４１８を５００μg／mlの培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。ついで、この培地を約７〜１０日間５００μg／μlのＧ４１８培地で交換すると、この間にＧ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロール細胞は完全に死滅する。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＢＭ社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを用いて培養液から発現されたＥＬＴＰ蛋白質を確認する。このような方法をＥＳＴＰ発現ベクターを同様に適用した後、ＥＳＴＰ融合蛋白質の発現もまた確認した。
【００２８】
(４)発現されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの精製
抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(Ｒ＆Ｄ社製)を用いて分離精製用親和性樹脂(affinity resin)を下記のように製作する。
【００２９】
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ０.３ｇを１mM ＨＣｌで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mM ＨＣｌで洗浄する。樹脂を４mlのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ３、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ８.３)で洗浄した後、直ぐに４mlカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)と混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ ８.０)にリフレッシュした後、常温で２時間チューブを振りながら反応させる。６.５mlのカップリング緩衝液、６.５mlの酢酸緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ４)および６.５mlのカップリング緩衝液で順次洗浄する。このように調製された樹脂を用いてカラムを製作し、次のように精製を実施する。
【００３０】
細胞を血清無含有培地で１日培養した後、培養液のみをセントリプレップ(Centriprep、ＭＷＣＯ １０,０００、ミリポア(Milipore)社製)を用いて約５分の１に濃縮する。約２０ml／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに添加して再びＰＢＳで洗浄した。カラムおよび溶離液に適用された抽出緩衝液(０.１Ｍ グリシン、pＨ ２.８)は、直ぐに１Ｍトリス(Tris)でpＨ７.５となるように滴定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は最小９７％以上である(図４)。
【００３１】
(５)バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾臓細胞を用いるバイオアッセイ試験で、発現および適当に精製されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰはＥＰＯより高い活性を示す。ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰと融合させたカルボキシ末端がＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができる。
【００３２】
(６)薬物動態学試験
製造されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰが実際生体内で長い半減期を持っているかの否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。このとき、合計４匹のマウスに対し、候補物質を１匹当たり２０ユニットの投与量で静脈内(iv)投与する。経時的血中濃度を確認するために、３０分間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社のＥＩＡキットを使用して濃度を測定した。マウス薬物動態学試験で候補物質ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは対照薬物であるＥＰＯより遥かに長い半減期を持っていることがわかった(図５)。
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記実施例は本発明を説明するものと理解されるべきであって、本発明の範囲をいかなる方法によっても制限するものではない。
【００３４】
実施例１：遺伝子調製
ＥＰＯ cＤＮＡをヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で、予め製作されたＥＰＯ cＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１、ＥＰ２)を５０pmolの量で使用して通常のＰＣＲ(バーイオニア社のＰＣＲプリミックスキット)を行って得た。ＴＰＯ cＤＮＡをＴＰＯ cＤＮＡの両末端に相補的なプライマーＴ１およびＴ２)を使用して同様の方法によって得た。ＢＭ社の高正確度Taq(high fidelity Taq)システムを使用して、５２℃でアニーリング(annealing)４０秒、７２℃で５５秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルのＰＣＲを行ってＥＰＯ cＤＮＡとＴＰＯ cＤＮＡを得た。これをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)にそれぞれクローニングした。すなわち、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルから抽出してpＧＥＭ−Ｔに結合させた後、大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。形質転換された大腸菌は、Ｘ−gal／ＩＰＴＧを塗抹したＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した。白色コロニーからプラスミドを精製して制限酵素(ＳacＩ、ＳacII)と反応させ、それぞれのcＤＮＡが含まれているコロニーを選別した。この段階で得たベクターをpＧＥＭ-ＥＰＯおよびpＧＥＭ−ＴＰＯとそれぞれ命名して塩基配列を確認した後、以後作業の鋳型として用いた。
【００３５】
本発明で用いられるＴＰＯのＣＴＰ遺伝子であるＬＴＰはpＧＥＭ−ＴＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＬ１とＴ２(５０pmol)を用いてＢＭ社の高正確度タグシステムを使用して５０℃でアニーリング４０秒、７２℃で４５秒、９４℃で２０秒の条件で総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって得た。プライマーＥＬ１にはＥＰＯ３'末端付近に存在する制限酵素ＳtuＩ位置から３'末端までの遺伝子とＬＴＰ遺伝子の５'末端の一部分を同時に含んでいる。１％アガロースゲルで約５３４bpsの遺伝子断片を確認した(ＬＴＰ遺伝子)。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７８個(１７６〜３５３番)のアミノ酸をコードする(図１)。
【００３６】
他方では、pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１とＥＰ２を使用して上記と同じ条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。
【００３７】
得られたＥＰＯ遺伝子とＬＴＰ遺伝子を制限酵素ＳtuＩでそれぞれ処理して、キアゲン抽出キットを使用して精製した後、リガーゼ(ligase)で結合させた。遺伝子ＥＰＯの断片とＬＴＰ断片が結合遺伝子を鋳型として使用し、プライマーＥＰ１１とＬ２を用いて(５０pmol)ＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用して５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で６０秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルを行って約１１１３bpsの所望の融合遺伝子であるＥＬＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ−ＥＬＴＰと命名、図３(ａ))。
【００３８】
遺伝子ＳＴＰは、合成およびＰＣＲセルフ−プライミングを用いて得た。合成された遺伝子断片はＥＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｌ２である。これらの４つのＤＮＡ断片を１μlずつ採って(５０pmol／μl)、ＢＭ社の高正確度Taqシステムを使用して５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で４０秒、９４℃で２０秒の条件で、総１５サイクルのＰＣＲを行った。１％アガロースゲルで約５０bpの遺伝子断片を確認した(ＳＴＰ遺伝子)。この遺伝子はＴＰＯのカルボキシ末端１７個のアミノ酸(３３７〜３５３番)をコードする(図１)。
【００３９】
pＧＥＭ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＥＰ２を使用して上記と同一条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。このＥＰＯ遺伝子とＳＴＰ遺伝子を同時に鋳型として用い、プライマーＥＰ１１とＬ２を用いてＢＭ社の高正確度タグシステムを使用し、５８℃でアニーリング４０秒、７２℃で５０秒、９４℃で２０秒の条件で、総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって、約６３０bpの所望の融合遺伝子のＥＳＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターリンpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、塩基配列を確認した(pＧＥＭ-ＥＳＴＰと命名、図３(ｂ))。
【００４０】
実施例２：発現ベクターｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの調製
発現ベクターとしてインビトロジェン社のｐcＤＮＡ３.１ベクターを用いた。pＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングされている遺伝子ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは末端にそれぞれ制限酵素Ｈind IIIおよびＢamＨＩの認識部位を含む。ｐcＤＮＡ３.１、pＧＥＭ−ＥＬＴＰおよびpＧＥＭ−ＥＳＴＰをそれぞれ制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩで処理した。アガロースゲル上で直線状ｐcＤＮＡ３.１とＥＬＴＰ、ＥＳＴＰ遺伝子をキアゲン抽出キットを用いて得た後、ｐcＤＮＡ３.１にＥＬＴＰまたはＥＳＴＰ遺伝子をそれぞれ結合させ大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した後、生成したコロニーからプラスミドを分離して制限酵素Ｈind IIIとＢamＨＩを処理し、１％アガロースゲル電気泳動でＥＬＴＰ、ＥＳＴＰ遺伝子が含まれたコロニーのみを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＬＴＰおよびｐcＤＮＡ３.１−ＥＳＴＰとそれぞれ命名した(図３)。
【００４１】
実施例３：ＣＨＯ細胞の形質転換および発現
６０mm細胞培養皿でＣＨＯ細胞(ＤＧ４４)を培養して、４０〜８０％(１〜４×１０５細胞／６０mm皿)集蜜となるようにした。ＢＭ社のスーパーフェクション試薬３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無含有血清、無含有抗生物質)９７μlをよく混合し、プラスミドｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰ(＝０.１μg／μl、約２μg)、およびdhfr遺伝子を含むｐＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加した。混合物を室温で５〜１０分間反応させた後、上記で調製した細胞に加えた。一日経過後、培地をＧ４１８を５００μg／ml含む培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ ＦＢＳ)に交換した。約７〜１０日間Ｇ４１８を５００μg／ml含む培地に交換すると、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞は完全に死滅した。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＢＭ社のＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを用いて培養液から発現されたＥＬＴＰ蛋白質を確認した。ｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの場合も同様に進行した。
【００４２】
実施例４：発現された融合蛋白質の精製
Ｒ＆Ｄシステム社の抗−ＥＰＯモノクロナール抗体を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように調製した。
【００４３】
ＣＮＢｒ活性化されたセファロース４Ｂ ０.３ｇを１mM ＨＣｌで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mM ＨＣｌで洗浄した。樹脂を４mlのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ３、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ８.３)で洗浄した後、直ぐに４mlカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合して常温で２時間反応させた。このとき、チューブをよく振った。遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ ８.０)でリフレッシュした後、常温で２時間振りながら反応させた。６.５mlカップリング緩衝液、６.５ml酢酸緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣｌ、pＨ ４)および６.５mlカップリング緩衝液で順次洗浄した。調製された樹脂を用いてカラムを製作して次のように精製した。
【００４４】
細胞を血清無含有培養液で１日間培養した後、培養液のみをミリポア社のセントリプレップ(Centriprep、ＭＷＣＯ １０,０００)を用いて約５分の１に濃縮させた。約２０ml／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。抽出緩衝液(０.１Ｍグリシン、pＨ２.８)をカラムに添加した後、溶出液を直ぐ１ＭトリスでpＨ７.５で滴定した。精製されたＥＬＴＰおよびＥＳＴＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００４５】
実施例５：バイオアッセイ法による活性測定
フェニルヒドラジンをマウスに１日１回、２日間６０mg／kgずつ注射した。３日経過後、拡張した脾臓を分離してホモジナイザーで破砕して脾臓細胞を得た。脾臓細胞を６×１０６細胞／mlで希釈して９６ウェルプレートに細胞溶液１００μlずつ導入した。導入された各ウェルに標準ＥＰＯ(０〜５００mU／ml)と発現された融合蛋白質を１００mU／mlの濃度でそれぞれ加えた後、プレートを３７℃ＣＯ２インキュベーターで２２時間放置した。各ウェルにジメチル ３[Ｈ]−チミジン(２０μＣi／ml)を５０μlずつ加えた後、同じインキュベーターで２時間さらに反応させ、反応液を各ウェル別にグラスフィルタ(Ｎunc １−７３１６４)に吸着させた。濾過物を生理食塩水で３回洗浄し、βカウンター用いて各フィルターの放射能量を測定した。融合蛋白質ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの活性を標準ＥＰＯと比較して測定した時、融合蛋白質の活性が標準ＥＰＯに類似するか、若干高く現れた。ＥＰＯに添加されたカルボキシ末端の存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができた。
【００４６】
実施例６：薬物動態学試験
製造された候補物質が、実際に生体内で長い半減期を持っているか否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。実施例５に記載された方法によって精製された融合蛋白質をそれぞれ合計４匹のマウスに対し、１匹当たり２０ユニットで静脈内(iv)投与した。経時的血中濃度を確認するために、マウスから３０分間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム社のＥＩＡキットを使用して濃度を測定した。その結果を図５に示した。図５に示すように、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰは対照薬物のＥＰＯよりそれぞれ約３倍(ＥＰＯ半減期 ２２分、ＥＬＴＰ ６０分、ＥＳＴＰ ５７分)の遥かに長い半減期を示すことがわかった。
【００４７】
産業上の利用可能性
本発明にかかる融合蛋白質は、ＥＰＯの固有活性自体には影響を与えず、糖鎖を増加させるアミノ酸の存在によってＥＰＯの生体内半減期を画期的に増加させる。また、融合蛋白質は融合したペプチド、すなわち、ＬＴＰ又はＳＴＰが体内に存在するペプチドであるので体内に適用時に抗原性を誘発しない。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 FIGURE １(a)は、血小板産生因子(ＴＰＯ)のカルボキシ末端ペプチド(ＬＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図２】 FIGURE １(b)は、血小板産生因子(ＴＰＯ)のカルボキシ末端ペプチド(ＳＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図３】 FIGURE ２(ａa)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＬＴＰの融合蛋白質ＥＬＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図４】 FIGURE ２(ab)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＬＴＰの融合蛋白質ＥＬＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図５】 FIGURE ２(b)は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)とペプチドＳＴＰの融合蛋白質ＥＳＴＰの塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図６】 FIGURE３(a)は、発現ベクターｐcＤＮＡ−ＥＬＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図７】 FIGURE３(b)は、ｐcＤＮＡ−ＥＳＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図８】 FIGURE４は、発現ベクターＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの電気泳動写真である。
【図９】 FIGURE５は、ＥＰＯ、ＥＬＴＰおよびＥＳＴＰの薬物動態学的結果を示すグラフである。
Claims (3)
- 配列番号２のアミノ酸配列よりなるトロンボポエチン（ＴＰＯ）のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）とヒトＥＰＯのカルボキシ末端で融合している融合タンパク質。
- 請求項１に記載の融合タンパク質をコードしている核酸。
- 請求項２に記載の核酸を含む組み換えベクターで形質転換された宿主細胞株を培養し、生体内ヒトＥＰＯ活性強化融合タンパク質を製造する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0074975A KR100467750B1 (ko) | 2001-11-29 | 2001-11-29 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| KR2001-074975 | 2001-11-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003169671A JP2003169671A (ja) | 2003-06-17 |
| JP3860097B2 true JP3860097B2 (ja) | 2006-12-20 |
Family
ID=36821313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002253938A Expired - Fee Related JP3860097B2 (ja) | 2001-11-29 | 2002-08-30 | エリスロポエチン生体内活性強化融合蛋白質 |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7098318B2 (ja) |
| EP (1) | EP1319712B1 (ja) |
| JP (1) | JP3860097B2 (ja) |
| KR (1) | KR100467750B1 (ja) |
| CN (1) | CN100390201C (ja) |
| AR (1) | AR036384A1 (ja) |
| AT (1) | ATE460483T1 (ja) |
| AU (1) | AU2002300359B2 (ja) |
| BR (1) | BRPI0203394B1 (ja) |
| CA (1) | CA2394572C (ja) |
| DE (2) | DE60235603D1 (ja) |
| ES (1) | ES2339426T3 (ja) |
| FR (1) | FR2832716B1 (ja) |
| GB (1) | GB2382580B (ja) |
| IT (1) | ITMI20021803A1 (ja) |
| MX (1) | MXPA02008131A (ja) |
| MY (1) | MY122935A (ja) |
| NZ (1) | NZ520442A (ja) |
| RU (1) | RU2225220C1 (ja) |
| SG (1) | SG117416A1 (ja) |
| TW (1) | TWI237056B (ja) |
| WO (1) | WO2003046013A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA200206172B (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7345019B1 (en) * | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
| US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| US20030072737A1 (en) * | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
| CA2539440A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-04-14 | Warren Pharmaceuticals, Inc. | Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions |
| US7625564B2 (en) | 2006-01-27 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo |
| US8946155B2 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-03 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US10221228B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-03-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US9458444B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-10-04 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8048849B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US20150038413A1 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| US7553941B2 (en) * | 2006-02-03 | 2009-06-30 | Modigene Inc | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| US10351615B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-07-16 | Opko Biologics Ltd. | Methods of treatment with long-acting growth hormone |
| US8067548B2 (en) | 2007-07-26 | 2011-11-29 | Novagen Holding Corporation | Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region |
| CN101863982A (zh) * | 2009-04-17 | 2010-10-20 | 哈药集团生物工程有限公司 | 一种用于升高血小板的融合蛋白及其制备方法 |
| US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| CN103864913A (zh) * | 2012-12-18 | 2014-06-18 | 联亚生技开发股份有限公司 | 重组蛋白 |
| WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
| US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| AU2016280867B2 (en) | 2015-06-19 | 2020-02-27 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| CA3030533A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Oren HERSHKOVITZ | Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU648020B2 (en) * | 1989-02-21 | 1994-04-14 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5856298A (en) * | 1989-10-13 | 1999-01-05 | Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
| ZA946122B (en) * | 1993-08-17 | 1995-03-20 | Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
| GB2285446B (en) * | 1994-01-03 | 1999-07-28 | Genentech Inc | Thrombopoietin |
| ITFI940106A1 (it) * | 1994-05-27 | 1995-11-27 | Menarini Ricerche Sud Spa | Molecola ibrida di formula gm-csf-l-epo o epo-l-gm-csf per la stimolaz ione eritropoietica |
| AU4658596A (en) * | 1995-02-03 | 1996-08-21 | G.D. Searle & Co. | Novel c-mpl ligands |
| US6242570B1 (en) * | 1997-07-10 | 2001-06-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Production and use of recombinant protein multimers with increased biological activity |
| AU8182298A (en) * | 1997-07-10 | 1999-02-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins |
| EP1881005B1 (en) * | 1997-07-14 | 2013-04-03 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of G-CSF and related proteins |
| US6342220B1 (en) * | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
| WO1999057147A1 (fr) * | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Kirin Brewery Company, Limited | Mutants de la thrombopoietine humaine |
| EP1200124B1 (en) * | 1999-07-13 | 2008-09-10 | Bolder Biotechnology, Inc. | Erythropoietin-immunoglobulin fusion proteins |
| CA2391080A1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Erythropoietin forms with improved properties |
-
2001
- 2001-11-29 KR KR10-2001-0074975A patent/KR100467750B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-07-24 CA CA002394572A patent/CA2394572C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-26 WO PCT/KR2002/001420 patent/WO2003046013A1/en active Search and Examination
- 2002-07-26 TW TW091116686A patent/TWI237056B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-07-30 AU AU2002300359A patent/AU2002300359B2/en not_active Ceased
- 2002-07-30 NZ NZ520442A patent/NZ520442A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-07-30 MY MYPI20022857A patent/MY122935A/en unknown
- 2002-08-01 ES ES02016953T patent/ES2339426T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-01 AT AT02016953T patent/ATE460483T1/de active
- 2002-08-01 DE DE60235603T patent/DE60235603D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-01 EP EP02016953A patent/EP1319712B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-01 DE DE10235248A patent/DE10235248B4/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-01 SG SG200204673A patent/SG117416A1/en unknown
- 2002-08-02 FR FR0209867A patent/FR2832716B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-02 ZA ZA200206172A patent/ZA200206172B/xx unknown
- 2002-08-06 GB GB0218252A patent/GB2382580B/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-08 IT IT001803A patent/ITMI20021803A1/it unknown
- 2002-08-20 BR BRPI0203394A patent/BRPI0203394B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-08-21 MX MXPA02008131A patent/MXPA02008131A/es active IP Right Grant
- 2002-08-23 CN CNB021301557A patent/CN100390201C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-29 US US10/230,454 patent/US7098318B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-30 AR ARP020103279A patent/AR036384A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-08-30 JP JP2002253938A patent/JP3860097B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-08-30 RU RU2002123438/15A patent/RU2225220C1/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3860097B2 (ja) | エリスロポエチン生体内活性強化融合蛋白質 | |
| JP3946638B2 (ja) | 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質 | |
| JP4035400B2 (ja) | 生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質 | |
| US8008454B2 (en) | Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin | |
| US8268588B2 (en) | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia | |
| JPH06502987A (ja) | Ｏ―グリコシル化ｉｆｎ―アルファ | |
| HU210608A9 (hu) | Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050628 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050927 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051206 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060330 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20060516 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060905 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060920 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 3 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 3 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 3 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100929 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100929 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110929 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110929 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120929 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120929 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130929 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |