BRPI0203394B1 - proteína de fusão, ácido nucleico, e, processo para a preparação de uma proteína de fusão tendo atividade intensificada in vivo da epo humana - Google Patents

Abstract

"proteína de fusão, ácido nucleico, e, processo para a preparação de uma proteína de fusão tendo atividade intensificada in vivo da epo humana". a presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão que tem atividade de eritropoietina intensificada in vivo, em que um fragmento de peptídeo de carbóxi terminal de trombopoietina é fundido com o carbóxi terminal da eritropoietina humana. esta proteína de fusão tem meia-vida altamente intensificada in vivo devido ao teor de carboidrato aumentado sem perda da atividade inerente de eritropoietina, e não causa qualquer antigenicidade quando aplicada ao corpo humano.

Description

“PROTEÍNA DE FUSÃO, ÁCIDO NUCLEICO, E, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO TENDO ATIVIDADE INTENSIFICADA IN VIVO DA EPO HUMANA” CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão que tem atividade de eritropoietina (EPO, abaixo) intensificada in vivo, que é um novo medicamento para o tratamento da anemia. Especificamente, a presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão que possui meia-vida altamente intensificada in vivo e atividade de eritropoietina mediante fusão da molécula de EPO com um determinado popetídeo que possui a atividade de alongamento da meia-vida e é derivado do corpo humano.

FUNDAMENTO DA TÉCNICA A EPO, uma glicoproteína que tem o peso molecular de 30.000 a 34.000, é um fator que estimula a produção e diferenciação dos glóbulos vermelhos (eritrócitos). Esta proteína atua por ligação a receptores nas células precursoras dos eritrócitos para resultar em aumento da concentração de íons de cálcio em uma célula, aumento da biossíntese de DNA, e estímulo para a formação de homoglobina e outros. Esta EPO pode ser usada para o tratamento da anemia proveniente da insuficiência renal, anemia de um bebê prematuro, anemia proveniente de hipotireodismo, anemia proveniente da desnutrição, etc. O uso clínico da EPO recombinante humana refere-se ao estímulo. No entanto, tal uso pode causar alguma inconveniência e altos custos, porque ela deve ser administrada em média três vezes por semana, devido à sua meia-vida curta. Assim, se a atividade in vivo da EPO for mantida por um longo tempo, a freqüência de administração da EPO pode ser grandemente reduzida. A eficácia da EPO é proporcional à sua meia-vida in vivo. É sabido que a meia-vida da EPO in vivo é correlacionada com o teor de ácido siálico que se acha localizado no terminal das cadeias de carboidratos da EPO.

Portanto, a eficácia da EPO é altamente dependente da presença de cadeias de carboidratos. Tendo em vista que as formas de carboidratos aparecem diferentemente dependendo da espécie de células em que a EPO seja expressa, as mesmas glicoproteínas podem ter diferentes estruturas de carboidratos se elas forem expressas em diferentes células. Não obstante tenha sido recentemente demonstrado que algumas bactérias podem ligar as cadeias de carboidratos, sabe-se que bactérias típicas, por exemplo E. coli, não o fazem. As proteínas expressas em E. coli não contêm as cadeias de carboidratos e, assim, a EPO derivada de E. coli, que não contém as cadeias de carboidratos, apresenta atividade in vitro positiva, mas nenhuma atividade in vivo. Isto se dá porque a EPO desglicosilada é rapidamente eliminada do corpo humano e tem meia-vida extremamente curta. Em conclusão, as cadeias de carboidrato desempenham um papel muito importante na atividade da EPO.

Muitos estudos têm sido feitos para intensificar a atividade da EPO. A principal abordagem é a substituição de alguns aminoácidos da EPO por mutagênese sobre o gene da EPO. Por exemplo, a PCT/US 94/09257, depositada por Amgen e intitulada “Erythropoietin analogs”, apresenta um método para aumentar a meia-vida da EPO in vivo mediante aumento do conteúdo de carboidratos através da mutagênese. Igualmente, uma tentativa de aumentar a meia-vida da EPO in vivo foi feita pela formação do dímero da EPO. Ver A. J. Sytkowski et al., J. B. C., vol. 274, n° 35, pp. 24773-24778. Além disso, outro método conhecido é intensificar a atividade da EPO in vivo pela fusão de novos aminoácidos, peptídeos ou fragmentos de proteínas com a molécula de EPO no estilo da engenharia genética e aumentar o conteúdo de carboidratos, isto é, o conteúdo de ácido siálico da EPO. No entanto, todos os aminoácidos, peptídeos ou fragmentos heterogêneos de proteína não pode ser usados para esta finalidade. Na maior parte dos casos, tais modificações podem resultar em decréscimo ou perda da atividade inerente da proteína e podem causar um problema de antigenicidade quando usadas in vivo.

Embora não se relacionem com a EPO, as proteínas de fusão ou proteínas quiméricas têm sido estudadas, por exemplo, quanto ao hormônio folículo-estimulador, que é uma espécie de hormônio sexual. Ver Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol. Entretanto, os métodos não têm sido aplicados à indústria, uma vez que as modificações protéicas usando-se um método da engenharia genética têm muitos riscos. Isto é, na maioria dos casos, a proteína alvo pode não ser facilmente obtida sem a experiência profissional e, ao contrário, a atividade inerente da proteína pode ser reduzida ou perdida pela adição ou substituição de novos aminoácidos. APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO Os presentes inventores estudaram extensivamente novos métodos para intensificar a atividade in vivo da EPO mediante fusão de novos aminoácidos, peptídeos ou fragmentos de proteínas, com a molécula da EPO, e assim aumentando o seu conteúdo de carboidrato. Como um resultado, os presentes inventores verificaram que a proteína de fusão da EPO obtida por fusão de um peptídeo de carbóxi terminal (CTP, abaixo) da trombopoietina (TPO, abaixo), uma proteína que já existe no corpo humano, com o carbóxi terminal da EPO, intensificou altamente a meia-vida in vivo por cause de muitos dos aminoácidos que aumentam o sítio de glicosilação sem perda da atividade inerente da EPO e não causa qualquer antigenicidade quando aplicada ao corpo humano. Por conseguinte, os presentes inventores completaram a presente invenção.

Portanto, o objeto da presente invenção é prover uma proteína de fusão que tenha atividade in vivo intensificada da EPO humana e contendo CTP da TPO fundida com a EPO humana no seu carbóxi terminal.

Outro objeto da presente invenção é prover um ácido nucleico codificando a proteína de fusão, um vetor recombinante contendo o ácido nucleico, e uma linhagem de células hospedeiras transformadas com o vetor recombinante.

Outro objeto da presente invenção é prover um processo para a preparação da proteína de fusão que tenha atividade intensificada in vivo da EPO humana, mediante cultivo da linhagem de células transformadas.

Primeiramente, a presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão que possui atividade intensificada da EPO humana in vivo e que contenha CTP da TPO fundida com a EPO humana no seu carbóxi terminal. O CTP preferivelmente compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, que corresponde aos aminoácidos das posições 176 a 353 (LTP, abaixo) ou partes destes, particularmente a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 que corresponde aos aminoácidos das posições 337 a 353 (STP, abaixo).

Particularmente, a proteína de fusão em conformidade com a presente invenção pode compreender a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NOs: 3 ou 4.

Em segundo lugar, a presente invenção diz respeito a um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão, um vetor recombinante que contém o ácido nucleico, e uma linhagem de células hospedeiras, preferivelmente a célula de CHO (ovário de hamster chinês), transformadas com o vetor recombinante.

Em terceiro lugar, a presente invenção diz respeito a um processo para a preparação da proteína de fusão que possui atividade da EPO humana in vivo intensificada, mediante o cultivo da linhagem de células transformadas.

Abaixo, a presente invenção será explanada em mais detalhes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras la e lb mostram as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos dos peptídeos de carbóxi terminal (LTP, STP) da TPO;

As Figuras 2aa e 2ab mostram as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de ELTP, que é uma proteína de fusão da EPO com o peptídeo LTP, e a Figura 2b mostra as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de ESTP que é uma proteína de fusão da EPO com o peptídeo STP;

As Figuras 3a e 3b são esquemas mostrando os procedimentos para preparar os vetores de expressão, pcDNA-ELTP e pcDNA-ESTP;

A Figura 4 é uma fotografia da eletroforese de ELTP e ESTP expressos; e A Figura 5 é um gráfico mostrando os resultados da farmacocinética da EPO, ELTP e ESTP.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO A presente invenção compreende as etapas de preparação e clonagem de um gene da proteína de fusão desejada, a construção de um vetor de expressão contendo o gene desejado, a transformaçao de uma célula de animal, a expressão, purificação e ensaio biológico. (1) Preparação do gene o cDNA da EPO pode ser obtido realizando-se a técnica da PCR convencional (Kit PreMix de PCR da Bioneer Co.) usando-se os iniciadores complementares dos terminais de cDNA da EPO (EP1 e EP2) da biblioteca de cDNA de fígado fetal derivado de seres humanos (Invitrogen Co.). O cDNA da TPO pode ser obtido usando-se os iniciadores complementares dos terminais de cDNA da TPO (TI e T2) de acordo com a mesma maneira.

EP1: ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG (SEQ ID NO: 5) EP2: GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT (SEQ ID NO: 6) Tl: ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC (SEQ ID NO: 7) T2: TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA (SEQ ID NO: 8) O cDNA da EPO e o cDNA da TPO obtidos por PCR são clonados em pGEM-T (Promega Co.), um vetor de clonagem, respectivamente. Os pGEM-EPO e pGEM-TPO são então seqüenciados e usados como um gabarito para os seguintes procedimentos. LTP, um gene CTP da TPO usado na presente invenção, pode ser obtido realizando-se a PCR usando-se pGEM-TPO como um gabarito e os iniciadores ELI e T2. ELI: AGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC (SEQ ID NO: 9) O iniciador ELI contém um gene estendido até a posição da enzima de restrição Stul, que fica localizada perto do terminal 3 ’ da EPO, e uma parte do terminal 5’ do gene LTP (aminoácidos de posições 176a353 da TPO) ao mesmo tempo. Por outro lado, a PCR é realizada usando-se pGEM-EPO como um gabarito e os iniciadores EP1 e EP2 para dar o gene de EPO apenas. Assim obtidos, os genes de EPO e LTP são tratados com a enzima de restrição Stul, respectivamente. A seguir, os fragmentos dos genes de EPO e LTP são ligados e o produto da ligação é usado como um gabarito no procedimento da PCR usando-se os iniciadores EP11 e L2 para dar um fragmento ELTP do gene tendo cerca de 1113 pares de bases.

EP11: TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT (SEQ ID NO: 10) L2: TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC (SEQ ID NO: 11) Este gene é clonado em um vetor de clonagem de pGEM-T e, então, seqüenciado (pGEM-ELTP, Figura 3a).

Além disso, o gene STP usado na presente invenção pode ser obtido por síntese e procedimento de PCR auto-iniciador. Os fragmentos do gene sintetizado são os seguintes ESI, S2, S3 e o L2 acima. ESI: AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA (SEQ ID NO: 12) S2: GTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG (SEQ ID NO: 13) S3: TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC (SEQ ID NO: 14) 1 μΐ (50 pmoles/μΐ) de cada dos 4 fragmentos do gene é tomado e a PCR é realizada usando-se o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. O fragmento do gene de cerca de 50 pares de base (gene STP) é identificado em gel de agarose a 1%. Este gene codifica os 17 aminoácidos (aminoácidos de posições 337 a 353) do carbóxi terminal da TPO (Figura 1). A PCR é realizada usando-se pGEM-EPO como um gabarito e os iniciadores EP11 e EP2 para dar o gene EPO apenas. Este gene EPO e o gene STP são usados como gabaritos ao mesmo tempo e os iniciadores EP11 e L2 são usados em uma PCR usando-se o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. para dar o gene de fusão desejado, o gene ESTP, de cerca de 630 pares de base. Este gene é clonado em pGEM-T, um vetor de clonagem, e em seguida seqüenciado (pGEM-ESTP, Figura 3b). (2) Construção do vetor de expressão O vetor pcDNA3.1 da Invitrogen Co. é usado como um vetor de expressão. O vetor pcDNA3.1 é tratado com as enzimas de restrição Hinálll e BamHl para produzir um vetor linear, e pGEM-ELTP e pGEM-ESTP são também tratados com as mesmas enzimas de restrição Hinálll e BamHl, respectivamente. Os genes digeridos pcDNA3.1, ELTP e ESTP são isolados usando-se o kit de extração Qiagen em gel de agarose. Após cada ligação dos genes, o produto da ligação é introduzido em NM522 de E. coli. Os plasmídeos são isolados das colônias que tenham sido formadas do cultivo do E. coli transformado em placa de LB-ampicilina durante a noite, e são tratados com as enzimas de restrição, Hinálll e BamHl. As colônias tendo o gene ELTP ou o ESTP são então tríadas por eletroforese em gel de agarose a 1%. Estes plasmídeos são designados como pcDNA-ELTP e pcDNA-ESTP, respectivamente (Figuras 3a e 3b). (3) Transformação da célula de CHO e expressão Células de CHO (DG44) são cultivadas até uma confluência de 40 a 80% (1 a 4 x 105 células/placa de 60 mm) em uma placa de cultura celular de 60 mm. 3 μΐ de reagente de superfection (BM Co.) e 97 μΐ de meio de cultura celular (α-MEM com meio, sem soro, sem antibióticos) são bem misturados, e pcDNA-ELTP (=0,1 μg/μl, cerca de 2 μg) e o vetor pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0,2 μg) tendo o gene dhff, são a eles adicionados. A mistura é reagida por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente e depois adicionada às células como acima preparadas. Após um dia, o meio é avivado com um meio contendo G418 em uma quantidade de 500 pg/ml (a-MEM sem meio, FBS a 10%). O meio é então avivado com o meio G418 contendo 500 pg/ml de G418 por 7 a 10 dias, durante os quais as células sem o gene de resistência G418 e as células de controle negativas são completamente mortas. As células selecionadas em meio G418 são cultivadas suficientemente e uma proteína ELTP expressa é identificada usando-se o kit EPO ELISA da BM Co. O mesmo processo é também identificado da mesma maneira. (4) Purificação das ELTP e ESTP expressas A resina de afinidade para isolamento e purificação é preparada usando-se anticorpo monoclonal anti-EPO (R&D Co.) como segue: 0,3 g de Sepharose 4B ativado com CNBr é intumescido por 20 minutos em HC11 mM, e a resina é passada para uma coluna e lavada com HC1 1 mM. A resina é lavada com 4 ml de tampão de acoplamento (NaHC03 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3), imediatamente misturada com anticorpo monoclonal anti-EPO (500 pg/ffasco) contido em 4 ml de tampão de acoplamento, e reagida por duas horas em temperatura ambiente com agitação do tubo. Reavivada com tampão de bloqueio (glicina 0,2 M, pH 8,0), a resina é reagida em temperatura ambiente por 2 horas com agitação do tubo.

Em seguida, a resina é lavada com 6,5 ml de tampão de acoplamento, 6,5 ml de tampão de acetato (ácido acético 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4) e 6,5 ml de tampão de acoplamento, na ordem. A coluna é preparada usando-se tal resina obtida e a purificação é conduzida como descrito abaixo.

As células são cultivadas em meio livre de soro por um dia, e o meio é concentrado a cerca de 5 vezes usando-se Centriprep (Millipore MWCO 10.000). Este concentrado é carregado em uma coluna equilibrada antecipadamente com PBS em um índice de fluxo de 20 ml/h, e lavada novamente com PBS. O tampão de elução (glicina 0,1 M, pH 2,8) é aplicado à coluna e o eluente é imediatamente titulado com Tris 1M em pH de 7,5. A pureza é de pelo menos 97% quando analisada por SDS-PAGE e manchamento de prata (Figura 4). (5) Medição da atividade pelo método de bioensaio No teste de bioensaio usanto células esplênicas de camundongo tratadas com fenilidrazina, os ELTP e ESTP, que são expressos e apropriadamente purificados, apresentam atividade mais elevada do que a EPO. Isso demonstra que os terminais carbóxi fundidos nos ELTP e ESTP podem não inibir a atividade da própria EPO. (6) Experiências de farmacocinética Experiências de farmacocinética são realizadas em camundongos para determinar se os ELTP e ESTP preparados realmente haviam prolongado a meia-vida in vivo. A substância candidata é administrada por via intravenosa a 4 camundongos em uma quantidade de 20 unidades/camundongo. De modo a identificar a concentração no sangue no decorrer do tempo, é extraído sangue dos camundongos em um intervalo de 30 minutos e as concentrações são medidas usando-se o kit EIA da Boehringer Mannheim Co. Nas experiências farmacocinéticas em camundongos, as substâncias candidatas, ELTP e ESTP, apresentam meia-vida muito mais longa do que a EPO de controle (Figura 5). A presente invenção será mais especificamente explanada nos seguintes exemplos. Entretanto, deve ficar entendido que os seguintes exemplos se destinam a ilustrar a presente invenção, mas a não limitar de qualquer maneira o escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DO GENE O cDNA da EPO foi obtido executando-se a PCR convencional (Kit PreMix de PCR da Bioneer Co.) usando-se os iniciadores EP1 e EP2 que são complementares aos terminais do cDNA da EPO, em uma quantidade de 50 pmoles, respectivamente, da biblioteca de cDNA de fígado fetal derivado de seres humanos (Invitrogen Co.). O cDNA da TPO foi obtido usando-se os iniciadores TI e T2, complementares aos terminais do cDNA da TPO, de acordo com a mesma maneira. 30 ciclos totais de PCR foram realizados usando-se o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. sob a condição de 52°C durante 40 segundos para recozimento, 72°C durante 55 segundos, e 94°C durante 20 segundos, para dar o cDNA da EPO e o cDNA da TPO. Eles foram clonados no pGEM-T (Promega Co.), um vetor de clonagem, respectivamente. Isto é, os produtos da PCR foram eluídos de gel de agarose a 1% e ligados no pGEM-T, que foi então introduzido no NM522 de E. coli. O E. coli transformado foi cultivado durante a noite em placa de LB-ampicilina contendo X-gal/IPTG. Os plasmídeos foram purificados das colônias brancas e tratados com enzimas de restrição, Saci e Sacll, para triar as colônias contendo os cDNAs respectivos. Os vetores obtidos neste estágio foram designados como pGEM-EPO e pGEM-TPO, os quais foram então seqüenciados e usados como gabaritos para os seguintes procedimentos.

LTP, o gene CTP de TPO usado na presente invenção, foi obtido pela realização de 30 ciclos totais de PCR usando-se o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. e usando-se pGEM-TPO como um gabarito e os iniciadores, ELI e T2 (50 pmoles), sob a condição de 50°C por 40 segundos para recozimento, 72°C por 45 segundos, e 94°C por 20 segundos. O iniciador ELI contém um gene da posição da enzima de restrição Síul, que é localizado perto do terminal 3’ da EPO, para o terminal 3’, e uma parte do terminal 5’ do gene LTP ao mesmo tempo. Um fragmento do gene de cerca de 534 pares de base foi identificado sobre o gel de agarose a 1% (gene LTP). Este gene codifica os 178 aminoácidos do carbóxi terminal da TPO (aminoácidos de posições 176 a 353) (Figura 1).

Por outro lado, a PCR foi realizada usando-se pGEM-EPO como um gabarito e os iniciadores EP1 e EP2 para dar o gene EPO apenas.

Os genes EPO e LTP assim obtidos foram tratados com a enzima de restrição Stul, respectivamente. A seguir, os fragmentos dos genes EPO e LTP foram purificados pelo kit de extração da Qiagen e ligados com uma ligase. O produto da ligação dos genes EPO e LTP foi usado como um gabarito no total de 30 ciclos do procedimento da PCR usando-se os iniciadores EP11 e L2 (50 pmoles) e usando o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. sob a condição de 55°C durante 40 segundos para recozimento, 72°C por 60 segundos, e 94°C por 20 segundos, para dar o gene de fusão desejado de ELTP tendo cerca de 1113 pares de base. Este gene foi clonado em um vetor de clonagem de pGEM-T da mesma maneira como acima e, depois, seqüenciado (pGEM-ELTP, Figura 3a). O gene STP foi obtido por síntese e o procedimento de PCR auto-iniciador. Os fragmentos de DNA sintetizados foram os ESI, S2, S3 e L2. 1 μΐ (50 pmoles/μΐ) de cada um dos 4 fragmentos de DNA foi tomado e 15 ciclos totais de PCR foram realizados usando-se o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. sob a condição de 55°C durante 40 segundos para recozimento, 72°C por 40 segundos, e 94°C por 20 segundos. Um fragmento do gene de cerca de 50 pares de base foi identificado no gel de agarose a 1% (gene STP). Este gene codifica os 17 aminoácidos do carbóxi terminal da TPO (aminoácidos das posições 337 a 353) (Figura 1). A PCR foi realizada usando-se pGEM-EPO como um gabarito e os iniciadores EP11 e EP2 da mesma maneira como acima para dar o gene EPO apenas. Este gene EPO e o gene STP foram usados como gabaritos ao mesmo tempo, e os iniciadores do EP11 e do L2 foram usados no total de 30 ciclos de PCR usando o sistema Taq de alta fidelidade da BM Co. sob a condição de 58°C por 40 segundos para recozimento, 72°C por 50 segundos, e 94°C por 20 segundos, para dar o gene de fusão desejado, o gene ESTP, de cerca de 630 pares de base. Este gene foi clonado em pGEM-T, um vetor de clonagem, e depois seqüenciado (pGEM-ESTP, Figura 3b).

EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DOS VETORES DE

EXPRESSÃO pcDNA-ELTP E pcDNA-ESTP O vetor pcDNA3.1 da Invitrogen Co. foi usado como um vetor de expressão. Os genes ELTP e ESTP que são clonados no vetor pGEM-T contêm os sítios de reconhecimento Hindlll e BamHl nos terminais, respectivamente. Os pcDNA3.1, pGEM-ELTP e pGEM-ESTP foram tratados com enzimas de restrição, Hindlll e BamHl, respectivamente. Os genes pcDNA3.1, ELTP e ESTP linearizados foram isolados usando-se o kit de extração Qiagen em gel de agarose. Após a ligação do pcDNA3.1 com ELTP ou ESTP, o produto da ligação foi introduzido em NM522 de E. coli. Os plasmídeos foram isolados das colônias que haviam sido formadas do cultivo do E. coli transformado em placa de LB-ampicilina durante a noite, e foram tratados com as enzimas de restrição, HinddlH e BamHl. As colônias tendo o gene ELTP ou ESTP foram então tríadas por eletroforese em gel de agarose a 1%. Estes plasmídeos foram designados como pcDNA-ELTP e pcDNA-ESTP, respectivamente (Figura 3).

EXEMPLO 3: TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA DE CHO E EXPRESSÃO Células de CHO (DG44) foram cultivadas a uma confluência de 40 a 80% (1 a 4 x 105 células/placa de 60 mm) em uma placa de cultura celular de 60 mm. 3 μΐ do reagente de superfection (BM Co.) e 97 μΐ de meio de cultura celular (α-MEM com meio, sem soro, sem antibióticos) foram bem misturados, e o plasmídeo pcDNA-ELTP (= 0,1 pg/pl, cerca de 2 pg) e o vetor pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0,2 pg) tendo o gene dhfr, foram a ela adicionados. A mistura foi reagida por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente e depois adicionados às células como preparadas acima. Após um dia, o meio foi reavivado com um meio contendo G418 em uma quantidade de 500 pg/ml (α-MEM sem meio, FBS a 10%). O meio foi então reavivado com o meio G418 contendo 500 pg/ml de G418 por 7 a 10 dias, durante os quais as células sem o gene de resistência G418 e as células de controle negativas foram completamente mortas. As células selecionadas em meio G418 foram cultivadas suficientemente e uma proteína ELTP expressa foi identificada usando-se o kit EPO ELISA da BM Co. O mesmo processo foi aplicado ao pcDNA-ESTP.

EXEMPLO 4: PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO EXPRESSAS A resina de afinidade para isolamento e purificação foi preparada usando-se o anticorpo monoclonal anti-EPO (R&D Systems Co.) como segue: 0,3 g de Sepharose 4B ativada com CNBr foi intumescido por 20 minutos em HC1 1 mM, e a resina foi passada para uma coluna e lavada com HC1 1 mM. A resina foi lavada com 4 ml de tampão de acoplamento (NaHC03 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3), imediatamente misturada com anticorpo monoclonal anti-EPO (500 pg/frasco) contido em 4 ml de tampão de acoplamento em um tubo, e reagida por duas horas em temperatura ambiente com agitação do tubo. Reavivada com tampão de bloqueio (glicina 0,2 M, pH 8,0), a resina foi reagida em temperatura ambiente por 2 horas com agitação do tubo. Em seguida, a resina foi lavada com 6,5 ml de tampão de acoplamento, 6,5 ml de tampão de acetato (ácido acético 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4) e 6,5 ml de tampão de acoplamento, na ordem. Uma coluna foi preparada usando-se tal resina obtida e a purificação foi conduzida como descrito abaixo.

As células foram cultivadas em meio livre de soro por um dia, e o meio foi concentrado a cerca de 5 vezes usando-se Centriprep (Millipore MWCO 10.000). Este concentrado foi carregado em uma coluna equilibrada antecipadamente com PBS em um índice de fluxo de 20 ml/h, e lavada novamente com PBS. O tampão de eluição (glicina 0,1 M, pH 2,8) foi aplicado à coluna e o eluente foi imediatamente titulado com Tris 1M em pH de 7,5. Os resultados de SDS-PAGE dos ELTP e ESTP purificados são apresentados na Figura 4. A pureza foi de pelo menos 97% quando analisada por SDS-PAGE e manchamento de prata.

EXEMPLO 5: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE PELO

MÉTODO DE BIOENSAIO

Fenilidrazina foi injetada em um camundongo uma vez por dia durante 2 dias em uma dose de 60 mg/kg. Após 3 dias, o baço aumentado foi separado e moído com um homogeneizador para se obter as células esplênicas. As células esplênicas foram diluídas em 6 x 106 células/ml e 100 μΐ da solução de células foram introduzidos em cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios, De 0 -500 mU/ml de EPO autêntica e 100 mU/ml da proteína de fusão expressa foram adicionadas a cada reservatório, e a placa foi deixada descansar em 37 °C por 22 horas em um incubador de CO2. 50 μΐ de 3[H]-timidina de dimetila (20 μΟί/ηιΙ) foi adicionado a cada reservatório, depois reagido por 2 horas no mesmo incubador, e a solução de reação foi então absorvida em um filtro de vidro (Nunc 1-73164) per cada reservatório. Os filtros foram lavados com soro fisiológico três vezes e a quantidade de radioatividade de cada filtro foi medida usando contador β. As atividades das proteínas de fusão, ELTP e ESTP foram mostradas serem comparáveis ou mais elevadas do que aquela da EPO autêntica, a qual demonstrou que os terminais carbóxi fundidos na EPO não inibiram a atividade da própria EPO. EXEMPLO 6: EXPERIÊNCIAS FARMACOCINÉTICAS As experiências de farmacocinética são realizadas em camundongos para determinar se a substância candidata preparada realmente tem prolongado a meia-vida in vivo. A proteína de fusão purificada de acordo com o processo do Exemplo 5 foi administrada por via intravenosa a 4 camundongos em uma quantidade de 20 unidades/camundongo. De modo a identificar a concentração no sangue no decorrer do tempo, foi extraído sangue dos camundongos em um intervalo de 30 minutos e as concentrações foram medidas usando-se o kit EIA da Boehringer Mannheim Co. Os resultados são mostrados na Figura 5. Como pode ser visto da Figura 5, as ELTP e ESTP apresentam meia-vida cerca de três vezes mais longa do que o controle, EPO, respectivamente (meia-vida da EPO foi de 22 minutos, aquela da ELTP foi de 60 minutos, e aquela da ESTP foi de 57 minutos). APLICABILIDADE INDUSTRIAL As proteínas de fusão de acordo com a presente invenção possuem meia-vida in vivo grandemente aumentada de EPO devido à presença de aminoácidos que aumentam as cadeias de carboidrato sem influenciar a atividade inerente da EPO. Além disso, as proteínas de fusão não causam qualquer problema de antigenicidade quando aplicadas ao corpo humano visto que o peptídeo fundido, LTP ou STP, é um peptídeo que já existe no corpo. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS <110> Cheil Jedang Corporation <120> Proteína de fusão tendo a atividade de eritropoietina intensificada in vivo <130 PC01-0368-JUD <160 14 <170 Kopatentln 1.71 <210 1 <211> 178 <212> PRT <213> Homosapiens <220 <221> PEPTÍDEO <222> (1)..(178) <223> Aminoácidos nas posições de 176 a 353 de trombopoietina humana (TPO) <400> 1 Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr 15 10 15 Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin 35 40 45 Gly Phe Arg Ala Lys lie Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser 50 55 60 Leu Asp Gin lie Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn 65 70 75 80 Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala 85 90 95 Pro Asp lie Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn 100 105 110 Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin 115 120 125 Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Vai Vai Gin 130 135 140 Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr 145 150 155 160 Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin 165 170 175 Glu Gly <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDEO <222> (1)..(17) <223> Aminoácidos nas posições de 337 a 353 de trombopoietina humana (TPO) <400> 2 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 370 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão (ELTP) de eritropoietina (EPO) e peptídeo de carbóxi terminal (LTP) de trombopoietina humana <400> 3 Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 15 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Vai Gly Gin Gin Ala Vai Glu Vai Trp Gin Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Vai Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Vai Asn Ser Ser 100 105 110 Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu 130 135 140 Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr 195 200 205 Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe 210 215 220 Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin 225 230 235 240 Gly Phe Arg Ala Lys lie Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser 245 250 255 Leu Asp Gin lie Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn 260 265 270 Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala 275 280 285 Pro Asp lie Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn 290 295 300 Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin 305 310 315 320 Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Vai Vai Gin 325 330 335 Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr 340 345 350 Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin 355 360 365 Glu Gly 370 <210> 4 <211> 209 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína de fusão (ELTP) de eritropoietina (EPO) e peptídeo de carbóxi terminal (STP) de trombopoietina humana <400> 4 Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 15 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Vai Gly Gin Gin Ala Vai Glu Vai Trp Gin Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Vai Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Vai Asn Ser Ser 100 105 110 Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu 130 135 140 Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu 195 200 205 Gly <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador EP1 tendo os complementares da sequência de nucleotídeo à sequência terminal de cDNA da EPO <400> 5 atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador EP2 tendo os complementares da sequência de nucleotídeo à sequência terminal de cDNA da EPO <400> 6 gtcccctgtc ctgcaggcct <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

Claims (3)

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que um peptídeo de earbóxi terminal (CTP) da trombopoietina (TPO) consistindo da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 é fundida com o earbóxi terminal da eritropoietina humana (EPO).

2. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de fusão como definida na reivindicação 1.

3. Processo para a preparação de uma proteína de fusão tendo atividade intensificada in vivo da EPO humana, caracterizado pelo fato de compreender o cultivo de uma linhagem de células transformadas com um vetor recombinante contendo o ácido nucleico corno definido na reivindicação 2.