ES2339426T3 - Proteina de fusion que tiene actividad in vivo de eritropoyetina mejorada. - Google Patents
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Abstract
Proteína de fusión en la que un péptido carboxilo terminal (CTP) de la trombopoyetina (TPO) que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 se fusiona con eritropoyetina humana (EPO) en el extremo carboxilo terminal de la EPO humana.
Description
Proteína de fusión que tiene actividad in
vivo de eritropoyetina mejorada.
La presente invención se refiere a una proteína
de fusión que tiene actividad in vivo de eritropoyetina
(EPO, a continuación) mejorada que es un nuevo medicamento para el
tratamiento de la anemia. Específicamente, la presente invención se
refiere a una proteína de fusión que tiene semivida y actividad
in vivo de eritropoyetina sumamente mejoradas mediante la
fusión de una molécula de EPO con un determinado péptido que tiene
actividad de prolongación de la semivida y se deriva del cuerpo
humano.
La EPO, una glicoproteína que tiene el peso
molecular de 30.000 a 34.000, es un factor que estimula la
producción y la diferenciación de los glóbulos rojos. Esta proteína
actúa uniéndose a receptores en las células precursoras de
eritrocitos dando como resultado un aumento de la concentración de
iones calcio en una célula, un aumento de la biosíntesis de ADN y
la estimulación para la formación de hemoglobina y similares. Esta
EPO puede usarse para el tratamiento de anemia debida a
insuficiencia renal, anemia de un bebé prematuro, anemia debida a
hipotiroidismo, anemia debida a desnutrición, etc. El uso clínico
de la EPO humana recombinante sigue en aumento. Sin embargo, tal
uso puede provocar cierta incomodidad y altos costes puesto que debe
administrarse en promedio tres veces a la semana debido a su corta
semivida. Por tanto, si se mantiene la actividad in vivo de
la EPO durante un largo tiempo, puede disminuirse enormemente la
frecuencia de administración de la EPO.
La eficacia de la EPO es proporcional a la
semivida in vivo de la misma. Se conoce que la semivida in
vivo de la EPO está correlacionada con el contenido en ácido
siálico que está ubicado en el extremo terminal de las cadenas de
hidrato de carbono de la EPO. Por tanto, la eficacia de la EPO es
depende mucho de la presencia de las cadenas de hidrato de carbono.
Dado que las formas de los hidratos de carbono aparecen de manera
diferente dependiendo del tipo de células en las que se expresa la
EPO, las mismas glicoproteínas pueden tener una estructura de
hidrato de carbono diferente si se expresan en células diferentes.
Aunque se ha demostrado recientemente que algunas bacterias pueden
unirse a las cadenas de hidrato de carbono, se conoce que no lo
hacen bacterias típicas, por ejemplo E. coli. Las proteínas
expresadas en E. coli no contienen las cadenas de hidrato de
carbono, y por tanto, la EPO derivada de E. coli, que no
contiene las cadenas de hidrato de carbono, muestra actividad in
vitro positiva pero no actividad in vivo. Esto se debe a
que la EPO desglicosilada se elimina rápidamente del cuerpo humano
y tiene una semivida extremadamente corta. En conclusión, las
cadenas de hidrato de carbono desempeñan un papel muy importante en
la actividad de la EPO.
Se han realizado muchos estudios para mejorar la
actividad de la EPO. El principal enfoque son las sustituciones de
algunos aminoácidos de la EPO mediante mutagénesis en el gen de la
EPO. Por ejemplo, el documento PCT/US94/09257, presentado por Amgen
y titulado "Erythropoietin analogs", da a conocer un método
para aumentar la semivida in vivo de la EPO aumentando el
contenido en hidratos de carbono a través de mutagénesis. También,
se realizó un intento para aumentar la semivida in vivo de
la EPO mediante la formación de un dímero de EPO. Véase, A. J.
Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, n.º 35, págs.
24773-24778. Además, otro método conocido es
mejorar la actividad in vivo de la EPO fusionando nuevos
aminoácidos, péptidos o fragmentos de proteína con la molécula de
EPO del modo mediante ingeniería genética y aumentando el contenido
en hidratos de carbono, es decir, el contenido en ácido siálico de
la EPO. Sin embargo, no pueden usarse todos los aminoácidos,
péptidos o fragmentos de proteína heterogéneos para este fin. En la
mayoría de los casos, tales modificaciones pueden dar como
resultado una disminución o pérdida de la actividad inherente de la
proteína y pueden provocar un problema de antigenicidad cuando se
usan in vivo.
Aunque no está relacionado con la EPO, se han
estudiado proteínas de fusión o proteínas quiméricas, por ejemplo,
para la hormona estimulante del folículo que es un tipo de hormona
sexual. Véase, Furuhashi et al., 1995, Mol.
Endocrinol. Sin embargo, los métodos no se han aplicado a la
industria dado que las modificaciones de proteínas usando un método
de ingeniería genética tienen muchos riesgos. Es decir, en la
mayoría de los casos, la proteína diana no puede obtenerse
fácilmente sin conocimientos profesionales, y al contrario, la
actividad inherente de la proteína puede disminuirse o perderse
mediante la adición o la sustitución de nuevos aminoácidos.
Los presentes inventores han estudiado
extensamente nuevos métodos para mejorar la actividad in vivo
de la EPO fusionando nuevos aminoácidos, péptidos o fragmentos de
proteína con una molécula de EPO, y aumentando así el contenido en
hidratos de carbono de la misma. Como resultado, los presentes
inventores han descubierto que una proteína de fusión de la EPO
obtenida fusionando un péptido carboxilo terminal (CTP, a
continuación) de la trombopoyetina (TPO, a continuación), una
proteína que ya existe en el cuerpo humano, con el extremo
carboxilo terminal de la EPO tiene una semivida in vivo
sumamente mejorada debido a muchos aminoácidos que aumentan el
sitio de glicosilación sin pérdida de la actividad inherente de la
EPO, y no provoca antigenicidad cuando se aplica al cuerpo humano.
Entonces, los presentes inventores han completado la presente
invención.
Por tanto, el objeto de la presente invención es
proporcionar una proteína de fusión que tiene actividad in
vivo de EPO humana mejorada y que contiene el CTP de TPO
fusionado con EPO humana en el extremo carboxilo terminal de la
misma.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un ácido nucleico que codifica para la proteína de
fusión, un vector recombinante que contiene el ácido nucleico, y
una línea celular huésped transformada con el vector
recombinante.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para la preparación de la proteína de
fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada
cultivando la línea celular transformada.
En primer lugar, la presente invención se
refiere a una proteína de fusión que tiene actividad in vivo
de EPO humana mejorada y que contiene el CTP de TPO fusionado con
EPO humana en el extremo carboxilo terminal de la misma,
consistiendo el CTP en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º 2
que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 337 a 353 (STP,
a continuación).
Particularmente, la proteína de fusión según la
presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID N.º 4.
En segundo lugar, la presente invención se
refiere a un ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión,
a un vector recombinante que contiene el ácido nucleico y a una
línea celular huésped, preferiblemente célula CHO (ovario de
hámster chino), transformada con el vector recombinante.
En tercer lugar, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la preparación de la proteína de
fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana mejorada
cultivando la línea celular transformada.
Se incluye en el presente documento como
referencia un CTP que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID N.º 1 que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 176 a
353 (LTP, a continuación) o partes de la misma, y no es parte de la
presente invención.
A continuación, la presente invención se
explicará con más detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1a y 1b muestran las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de los péptidos carboxilo terminal (LTP,
STP) de TPO;
Las figuras 2aa y 2ab muestran las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de ELTP que es una proteína de fusión de
EPO y el péptido LTP, y la figura 2b muestra las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de ESTP que es una proteína de fusión de
EPO y el péptido STP;
Las figuras 3a y 3b son esquemas que muestran
los procedimientos para preparar los vectores de expresión,
pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP;
pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP;
La figura 4 es una fotografía de electroforesis
de ELTP y ESTP expresadas; y
La figura 5 es un gráfico que muestra los
resultados farmacocinéticos de EPO, ELTP y ESTP.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención comprende las etapas de
preparación y clonación de un gen de la proteína de fusión deseada,
construcción de un vector de expresión que contiene el gen deseado,
transformación de una célula animal, expresión, purificación y
ensayo biológico.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc de EPO puede obtenerse realizando la
técnica de PCR convencional (kit PCR PreMix de Bioneer Co.) usando
los cebadores complementarios de los extremos terminales del ADNc de
EPO (EP1 y EP2) de la biblioteca de ADNc de hígado fetal derivado
de ser humano (Invitrogen Co.). El ADNc de TPO puede obtenerse
usando los cebadores complementarios de los extremos terminales del
ADNc de TPO (T1 y T2) de la misma manera.
| EP1: | ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG | (SEQ ID N.º 5) |
| EP2: | GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT | (SEQ ID N.º 6) |
\newpage
| T1: | ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC | (SEQ ID N.º 7) |
| T2: | TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA | (SEQ ID N.º 8) |
El ADNc de EPO y el ADNc de TPO obtenidos
mediante PCR se clonan en pGEM-T (Promega Co.), un
vector de clonación, respectivamente. Entonces, se secuencian el
pGEM-EPO y el pGEM-TPO, y se usan
como molde para los siguientes procedimientos.
El LTP, un gen de CTP de TPO que no es parte de
la presente invención, puede obtenerse realizando una PCR usando
pGEM-TPO como molde y los cebadores EL1 y T2.
| EL1: | GAGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC | (SEQ ID N.º 9) |
El cebador EL1 contiene un gen que se extiende
hasta la posición de la enzima de restricción StuI, que está
ubicada cerca del extremo terminal 3' de la EPO, y una parte del
extremo terminal 5' del gen de LTP (aminoácidos de las posiciones
176 a 353 de la TPO) al mismo tiempo. Por otro lado, se realiza una
PCR usando pGEM-EPO como molde y los cebadores EP1
y EP2 para dar sólo el gen de la EPO. Los genes de LTP y de la EPO
así obtenidos se tratan con la enzima de restricción StuI,
respectivamente. Entonces, los fragmentos de los genes de LTP y de
la EPO se ligan y el producto de ligamiento se usa como molde en el
procedimiento de PCR usando los cebadores EP11 y L2 para dar un
fragmento génico ELTP que tiene aproximadamente 1113 pb.
| EP11: | TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT | (SEQ ID N.º 10) |
| L2: | TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC | (SEQ ID N.º 11) |
Este gen se clona en un vector de clonación de
pGEM-T y entonces se secuencia
(pGEM-ELTP, figura 3a).
Además, el gen de STP usado en la presente
invención puede obtenerse mediante el procedimiento de PCR de
síntesis y de autocebado. Los fragmentos génicos sintetizados son
los siguientes ES1, S2, S3 y el anterior L2.
| ES1: | AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA | (SEQ ID N.º 12) |
| S2: | GGTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG | (SEQ ID N.º 13) |
| S3: | TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC | (SEQ ID N.º 14) |
Se toma 1 \mul (50 pmol/\mul) de cada uno de
los 4 fragmentos génicos y se realiza una PCR usando el sistema de
Taq de alta fidelidad de BM Co.
El fragmento génico de aproximadamente 50 pb
(gen de STP) se identifica en gel de agarosa al 1%. Este gen
codifica para los 17 aminoácidos (aminoácidos de las posiciones 337
a 353) del extremo carboxilo terminal de la TPO (figura 1).
Se realiza una PCR usando
pGEM-EPO como molde y los cebadores EP11 y EP2 para
dar sólo el gen de la EPO. Este gen de la EPO y el gen de STP se
usan como moldes al mismo tiempo y los cebadores EP11 y L2 se usan
en una PCR que usa el sistema de Taq de alta fidelidad de BM Co.
para dar el gen de fusión deseado, gen de ESTP, de aproximadamente
630 pb. Este gen se clona en pGEM-T, un vector de
clonación, y entonces se secuencia (pGEM-ESTP,
figura 3b).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa el vector pcDNA3.1 de Invitrogen Co. como
vector de expresión.
Se trata el vector pcDNA3.1 con las enzimas de
restricción HindIII y BamHI para preparar un vector
lineal, y también se tratan pGEM-ELTP y
pGEM-ESTP con las mismas enzimas de restricción,
HindIII y BamHI, respectivamente. Se aíslan los genes
de ELTP, ESTP y pcDNA3.1 digeridos usando el kit de extracción de
Qiagen en gel de agarosa. Tras cada ligamiento de los genes, se
introduce el producto de ligamiento en E. coli NM522. Se
aíslan los plásmidos a partir de las colonias que se han formado a
partir del cultivo de E. coli transformado en una placa con
LB-ampicilina durante la noche, y se tratan con las
enzimas de restricción, HindIII y BamHI. Entonces, se
seleccionan las colonias que tienen el gen de ELTP o ESTP mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1%. Estos plásmidos se designan
como pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP,
respectivamente (figuras 3a y 3b).
Se cultivan células CHO (DG44) hasta una
confluencia del 40\sim80% (1\sim4 x 10^{5} células/placa de 60
mm) en una placa de cultivo celular de 60 mm. Se mezclan bien 3
\mul del reactivo Superfection (BM Co.) y 97 \mul del medio de
cultivo celular (\alpha-MEM con medios, sin suero,
sin antibióticos), y se añaden a los mismos
pcDNA-ELTP (= 0,1 \mug/\mul, aproximadamente 2
\mug) y vector pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0,2 \mug) que tiene el
gen dhfr. Se hace reaccionar la mezcla durante 5\sim10 minutos a
temperatura ambiente y se añade entonces a las células preparadas
anteriormente. Después de un día, se renueva el medio con un medio
que contiene G418 en una cantidad de 500 \mug/ml
(\alpha-MEM sin medios, FBS al 10%). Entonces, se
renueva el medio con el medio con G418 que contiene 500 \mug/ml
de G418 durante 7\sim10 días, durante los cuales se destruyen por
completo las células sin el gen de resistencia a G418 y las células
de control negativo. Se cultivan lo suficiente las células
seleccionadas en el medio con G418 y se identifica una proteína ELTP
expresada usando el kit de ELISA para EPO de BM Co. Se aplica el
mismo procedimiento al vector de expresión de ESTP y entonces,
también se identifica de la misma manera una proteína de fusión de
ESTP expresada.
Se prepara una resina de afinidad para
aislamiento y purificación usando anticuerpo monoclonal
anti-EPO (R&D Co.) tal como sigue:
Se someten a hinchamiento 0,3 g de Sepharose 4B
activada por CNBr durante 20 minutos en HCl 1 mM, y se traslada la
resina a una columna y se lava con HCl 1 mM. Se lava la resina con 4
ml de tampón de acoplamiento (NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH
8,3), se mezcla inmediatamente con el anticuerpo monoclonal
anti-EPO (500 \mug/vial) contenido en 4 ml de
tampón de acoplamiento, y se hace reaccionar durante 2 horas a
temperatura ambiente con agitación del tubo. Renovada con tampón de
bloqueo (glicina 0,2 M, pH 8,0), se hace reaccionar la resina a
temperatura ambiente durante 2 horas con agitación del tubo.
Entonces, se lava la resina con 6,5 ml de tampón de acoplamiento,
6,5 ml de tampón acetato (ácido acético 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4) y
6,5 ml de tampón de acoplamiento en ese orden. Se prepara una
columna usando tal resina obtenida y se lleva a cabo la purificación
tal como se describe a continuación.
Se cultivan células en un medio sin suero
durante un día, y se concentra el medio hasta aproximadamente 5
veces usando Centriprep (Millipore, MWCO 10.000). Se carga este
concentrado en una columna equilibrada de antemano con PBS a una
velocidad de flujo de 20 ml/h, y se lava de nuevo con PBS. Se aplica
tampón de elución (glicina 0,1 M, pH 2,8) a la columna y se valora
inmediatamente el eluyente con Tris 1 M hasta pH 7,5. La pureza es
de al menos el 97% cuando se analiza mediante
SDS-PAGE y tinción con plata (figura 4).
En la prueba de bioensayo usando células de bazo
de ratón tratadas con fenilhidrazina, la ELTP y la ESTP, que se
expresan y purifican apropiadamente, muestran mayor actividad que la
EPO. Esto demuestra que los extremos carboxilo terminal fusionados
en la ELTP y la ESTP no pueden inhibir la actividad de la propia
EPO.
Se realizan experimentos farmacocinéticos con
ratones para determinar si la ELTP y la ESTP preparadas tienen
realmente una semivida in vivo prolongada. La sustancia
candidata se administra por vía intravenosa a 4 ratones en una
cantidad de 20 unidades/ratón. Con el fin de identificar la
concentración con el transcurso del tiempo en la sangre, se extrae
sangre del ratón a un intervalo de 30 minutos y se miden las
concentraciones usando el kit de EIA de Boehringer Mannheim Co. En
los experimentos farmacocinéticos con ratones, las sustancias
candidatas, ELTP y ESTP, muestran una semivida bastante más larga
que la EPO de control (figura 5).
La presente invención se explicará más
específicamente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe
entenderse que los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la
presente invención pero no limitar el alcance de la presente
invención de ninguna manera.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se obtuvo ADNc de EPO realizando la PCR
convencional (kit PCR PreMix de Bioneer Co.) usando los cebadores
EP1 y EP2 que son complementarios a los extremos terminales del ADNc
de EPO, en una cantidad de 50 pmol, respectivamente, a partir de la
biblioteca de ADNc de hígado fetal derivado de ser humano
(Invitrogen Co.). Se obtuvo el ADNc de TPO usando los cebadores T1
y T2, complementarios a los extremos terminales del ADNc de TPO, de
la misma manera. Se realizaron 30 ciclos de PCR en total usando el
sistema de Taq de alta fidelidad de BM Co. en las condiciones de
52ºC durante 40 segundos para la hibridación, 72ºC durante 55
segundos y 94ºC durante 20 segundos para dar el ADNc de EPO y el
ADNc de TPO. Se clonaron en pGEM-T (Promega Co.), un
vector de clonación, respectivamente. Es decir, se eluyeron los
productos de PCR del gel de agarosa al 1% y se ligaron en
pGEM-T, que se introdujo entonces en E. coli
NM552. Se cultivó durante la noche el E. coli transformado en
placa con LB-ampicilina que contenía
X-gal/IPTG. Se purificaron los plásmidos a partir de
las colonias blancas y se trataron con las enzimas de restricción,
Sac I y Sac II, para seleccionar las colonias que
contenían los ADNc respectivos. Se designaron los vectores
obtenidos en esta etapa como pGEM-EPO y
pGEM-TPO, que después se secuenciaron, y se usaron
como moldes para los procedimientos siguientes.
Se obtuvo LTP, el gen de CTP de TPO que no es
parte de la presente invención, realizando 30 ciclos de PCR en
total usando el sistema de Taq de alta fidelidad de BM Co. y usando
pGEM-TPO como molde y los cebadores, EL1 y T2 (50
pmol), en las condiciones de 50ºC durante 40 segundos para la
hibridación, 72ºC durante 45 segundos y 94ºC durante 20 segundos.
El cebador EL1 contiene un gen desde la posición de la enzima de
restricción StuI, que está ubicada cerca del extremo
terminal 3' de la EPO, hasta el extremo terminal 3', y una parte del
extremo terminal 5' del gen de LTP al mismo tiempo. Se identificó
un fragmento génico de aproximadamente 534 pb en gel de agarosa al
1% (gen de LTP). Este gen codifica para los 178 aminoácidos del
extremo carboxilo terminal de la TPO (aminoácidos de las posiciones
176 a 353) (figura 1).
Por otro lado, se realizó una PCR usando
pGEM-EPO como molde y los cebadores EP1 y EP2 para
dar sólo el gen de la EPO.
Se trataron los genes de LTP y de la EPO así
obtenidos con la enzima de restricción StuI, respectivamente.
Entonces, se purificaron los fragmentos de los genes de LTP y de la
EPO mediante el kit de extracción de Qiagen y se ligaron con una
ligasa. Se usó el producto de ligamiento de los genes de LTP y de la
EPO como molde en 30 ciclos del procedimiento de PCR en total
usando los cebadores EP11 y L2 (50 pmol) y usando el sistema de Taq
de alta fidelidad de BM Co. en las condiciones de 55ºC durante 40
segundos para la hibridación, 72ºC durante 60 segundos y 94ºC
durante 20 segundos para dar el gen de fusión deseado de ELTP que
tiene aproximadamente 1113 pb. Se clonó este vector en un vector de
clonación de pGEM-T de la misma manera que
anteriormente y entonces se secuenció (pGEM-ELTP,
figura 3a).
Se obtuvo el gen de STP mediante el
procedimiento de PCR de síntesis y autocebado. Los fragmentos de ADN
sintetizado eran ES1, S2, S3 y L2. Se tomó 1 \mul (50
pmol/\mul) de cada uno de los 4 fragmentos de ADN y se realizaron
15 ciclos de PCR en total usando el sistema de Taq de alta fidelidad
de BM Co. en las condiciones de 55ºC durante 40 segundos para la
hibridación, 72ºC durante 40 segundos y 94ºC durante 20 segundos. Se
identificó un fragmento génico de aproximadamente 50 pb en gel de
agarosa al 1% (gen de STP). Este gen codifica para los 17
aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la TPO (aminoácidos de
las posiciones 337 a 353) (figura 1).
Se realizó una PCR usando
pGEM-EPO como molde y los cebadores EP11 y EP2 de la
misma manera que anteriormente para dar sólo el gen de la EPO. Se
usaron este gen de la EPO y el gen de STP como moldes al mismo
tiempo y se usaron los cebadores EP11 y L2 en 30 ciclos de PCR en
total usando el sistema de Taq de alta fidelidad de BM Co. en las
condiciones de 58ºC durante 40 segundos para la hibridación, 72ºC
durante 50 segundos y 94ºC durante 20 segundos para dar el gen de
fusión deseado, gen de ESTP, de aproximadamente 630 pb. Se clonó
este vector en pGEM-T, un vector de clonación, y
entonces se secuenció (pGEM-ESTP, figura 3b).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se usó el vector pcDNA3.1 de Invitrogen Co. como
vector de expresión. Los genes de ELTP y ESTP que se clonan en el
vector pGEM-T contienen sitios de reconocimiento de
HindIII y BamHI en los extremos terminales,
respectivamente. Se trataron pcDNA3.1, pGEM-ELTP y
pGEM-ESTP con las enzimas de restricción,
HindIII y BamHI, respectivamente. Se aislaron los
genes ELTP, ESTP y pcDNA3.1 linealizados, usando el kit de
extracción de Qiagen en gel de agarosa. Tras el ligamiento de
pcDNA3.1 con ELTP o ESTP, se introdujo el producto de ligamiento en
E. coli NM522. Se aislaron los plásmidos a partir de las
colonias que se habían formado a partir del cultivo de E.
coli transformado en una placa con LB-ampicilina
durante la noche, y se trataron con las enzimas de restricción,
HindIII y BamHI. Entonces, se seleccionaron las
colonias que tenían el gen de ELTP o ESTP mediante electroforesis
en gel de agarosa al 1%. Se designaron estos plásmidos como
pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP,
respectivamente (figuras 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se cultivaron células CHO (DG44) hasta una
confluencia del 40\sim80% (1\sim4 x 10^{5} células/placa de 60
mm) en una placa de cultivo celular de 60 mm. Se mezclaron bien 3
\mul del reactivo Superfection (BM Co.) y 97 \mul del medio de
cultivo celular (\alpha-MEM con medios, sin suero,
sin antibióticos), y se añadieron a los mismos el plásmido
pcDNA-ELTP (= 0,1 \mug/\mul, aproximadamente 2
\mug) y el vector pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0,2 \mug) que tenía el
gen dhfr. Se hizo reaccionar la mezcla durante 5\sim10 minutos a
temperatura ambiente y se añadió entonces a las células preparadas
anteriormente. Después de un día, se renovó el medio con un medio
que contenía G418 en una cantidad de 500 \mug/ml
(\alpha-MEM sin medios, FBS al 10%). Entonces, se
renovó el medio con el medio con G418 que contenía 500 \mug/ml de
G418 durante 7\sim10 días, durante los cuales se destruyeron por
completo las células sin el gen de resistencia a G418 y las células
de control negativo. Se cultivaron lo suficiente las células
seleccionadas en el medio con G418 y se identificó una proteína ELTP
expresada usando el kit de ELISA para EPO de BM Co. Se aplicó el
mismo procedimiento a pcDNA-ESTP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se preparó una resina de afinidad para
aislamiento y purificación usando anticuerpo monoclonal
anti-EPO (R&D Systems Co.) tal como sigue:
Se sometieron a hinchamiento 0,3 g de Sepharose
4B activada por CNBr durante 20 minutos en HCl 1 mM, y se trasladó
la resina a una columna y se lavó con HCl 1 mM. Se lavó la resina
con 4 ml de tampón de acoplamiento (NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M,
pH 8,3), se mezcló inmediatamente con el anticuerpo monoclonal
anti-EPO (500 \mug/vial) contenido en 4 ml de
tampón de acoplamiento en un tubo, y se hizo reaccionar durante 2
horas a temperatura ambiente con agitación del tubo. Renovada con
tampón de bloqueo (glicina 0,2 M, pH 8,0), se hizo reaccionar la
resina a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación del
tubo. Entonces, se lavó la resina con 6,5 ml de tampón de
acoplamiento, 6,5 ml de tampón acetato (ácido acético 0,1 M, NaCl
0,5 M, pH 4) y 6,5 ml de tampón de acoplamiento en ese orden. Se
preparó una columna usando tal resina obtenida y se llevó a cabo la
purificación tal como se describe a continuación.
Se cultivaron células en medio sin suero durante
un día, y se concentró el medio hasta aproximadamente 5 veces
usando Centriprep (Millipore, MWCO 10.000). Se cargó este
concentrado en una columna equilibrada de antemano con PBS a una
velocidad de flujo de 20 ml/h, y se lavó de nuevo con PBS. Se aplicó
tampón de elución (glicina 0,1 M, pH 2,8) a la columna y se valoró
inmediatamente el eluyente con Tris 1 M hasta pH 7,5. Los resultados
de SDS-PAGE de las ELTP y ESTP purificadas se
muestran en la figura 4. La pureza era de al menos el 97% cuando se
analizó mediante SDS-PAGE y tinción con plata.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se inyectó fenilhidrazina a un ratón una vez al
día durante 2 días a una dosis de 60 mg/kg. Después de 3 días, se
separó el bazo agrandado y se trituró con un homogeneizador para
obtener las células del bazo. Se diluyeron las células del bazo
hasta 6 x 10^{6} células/ml y se introdujeron 100 \mul de la
disolución de células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Se añadieron a cada pocillo 0\sim500 mU/ml de EPO auténtica y 100
mU/ml de la proteína de fusión expresada, y se permitió que la placa
permaneciera en reposo a 37ºC durante 22 horas en una incubadora de
CO_{2}. Se añadieron a cada pocillo 50 \mul de
dimetil-^{3}[H]-timidina
(20 \muCi/ml), se hizo reaccionar adicionalmente durante 2 horas
en la misma incubadora, y entonces se adsorbió la disolución de
reacción sobre un filtro de vidrio (Nunc 1-73164)
por cada pocillo. Se lavaron los filtros con solución salina
fisiológica 3 veces y se midió la cantidad de radiactividad de cada
filtro usando un contador \beta. Se demostró que las actividades
de las proteínas de fusión, ELTP y ESTP, eran comparables con o
superiores a la de la EPO auténtica, lo que demostró que los
extremos carboxilo terminal fusionados en EPO no inhibían la
actividad de la propia EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se realizaron experimentos farmacocinéticos con
ratones para determinar si la sustancia candidata preparada tiene
realmente una semivida in vivo prolongada. Se administró por
vía intravenosa la proteína de fusión purificada según el
procedimiento del ejemplo 5, a 4 ratones en una cantidad de 20
unidades/ratón. Con el fin de identificar la concentración con el
transcurso del tiempo en la sangre, se extrajo sangre del ratón a
un intervalo de 30 minutos y se midieron las concentraciones usando
el kit de EIA de Boehringer Mannheim Co. Los resultados se muestran
en la figura 5. Tal como puede observarse a partir de la figura 5,
ELTP y ESTP muestran una semivida aproximadamente tres veces más
larga que el control, EPO, respectivamente (la semivida de la EPO
era de 22 minutos, la de ELTP era de 60 minutos y la de ESTP era de
57 minutos).
Las proteínas de fusión según la presente
invención tienen una semivida in vivo de la EPO sumamente
aumentada debido a la presencia de aminoácidos que aumentan las
cadenas de hidrato de carbono sin influir en la actividad inherente
de la EPO. Además, las proteínas de fusión no provocan ningún
problema de antigenicidad cuando se aplican al cuerpo humano dado
que el péptido fusionado, LTP o STP, es un péptido que ya existe en
el cuerpo.
<110> Cheil Jedang Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de fusión que tiene
actividad in vivo de eritropoyetina mejorada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
PC01-0368-JIJD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(178)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácidos en las posiciones 176 a
353 de la trombopoyetina (TPO) humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácidos en las posiciones 337 a
353 de la trombopoyetina (TPO) humana
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión (ELTP) de
eritropoyetina (EPO) y péptido carboxilo terminal (LTP) de la
trombopoyetina humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión (ESTP) de
eritropoyetina (EPO) y péptido carboxilo terminal (STP) de la
trombopoyetina
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiphumana
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador EP1 que tiene la secuencia
de nucleótidos complementaria a la secuencia terminal del ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipde EPO
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador EP2 que tiene la secuencia
de nucleótidos complementaria a la secuencia terminal del ADNc
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\hskip-.1em\dddseqskipde EPO
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador T1 que tiene la secuencia de
nucleótidos complementaria a la secuencia terminal del ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipde TPO
\hfill
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<400> 7
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador T2 que tiene la secuencia de
nucleótidos complementaria a la secuencia terminal del ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipde TPO
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador EL1 para PCR para obtener el
gen deseado LTP
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<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador EP11 para PCR para obtener
el gen de fusión deseado ELTP y ESTP
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador L2 para PCR para obtener el
gen de fusión deseado ELTP y ESTP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ES1 para intercambio en PCR
para obtener el gen deseado STP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador S2 para intercambio en PCR
para obtener el gen deseado STP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador S3 para intercambio en PCR
para obtener el gen deseado STP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
Claims (3)
1. Proteína de fusión en la que un péptido
carboxilo terminal (CTP) de la trombopoyetina (TPO) que consiste en
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 se fusiona con
eritropoyetina humana (EPO) en el extremo carboxilo terminal de la
EPO humana.
2. Ácido nucleico que codifica para la proteína
de fusión según la reivindicación 1.
3. Procedimiento para la preparación de una
proteína de fusión que tiene actividad in vivo de EPO humana
mejorada que comprende el cultivo de una línea celular huésped
transformada con un vector recombinante que contiene el ácido
nucleico según la reivindicación 2.
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