DE10235248B4

DE10235248B4 - Fusionsprotein mit verstärkter in vivo-Aktivität von Erythropoietin

Info

Publication number: DE10235248B4
Application number: DE10235248A
Authority: DE
Inventors: Dong-Eok Lee; Myung-Suk Icheon Oh; Bo-Sup Anyang Chung; Ji-Sook Park; Ki-Wan Kim
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: HK Inno N Corp
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2002-08-01
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2022-08-02
Also published as: JP3860097B2; ITMI20021803A1; BRPI0203394B1; EP1319712B1; FR2832716A1; KR100467750B1; NZ520442A; EP1319712A3; GB2382580B; TWI237056B; FR2832716B1; AU2002300359B2; ZA200206172B; EP1319712A2; CA2394572C; RU2002123438A; JP2003169671A; MY122935A; US7098318B2; AR036384A1

Abstract

Ein Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet, daß ein carboxyterminales Peptid (CTP) umfassend wenigstens die Aminosäuren 337-353 des Thrombopoietins (TPO) mit dem Carboxyterminus von humanem Erythropoietin (EPO) verbunden ist.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein mit einer verstärkten in vivo Aktivität von Erythropoietin (EPO), was eine neues Medikament für die Behandlung von Anämie ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein mit einer stark verstärkten in vivo Halbwertszeit und Aktivität von Erythropoietin durch Fusion des EPO-Moleküls mit einem gewissen Peptid, das eine Halbwertszeitverlängerungsaktivität besitzt und welches vom menschlichen Körper abgeleitet ist.

Hintergrund und Stand der Technik

EPO, ein Glykoprotein mit dem Molekulargewicht von 30 000 bis 34 000 ist ein Faktor, der die Produktion und Differenzierung der roten Blutzellen stimuliert. Dieses Protein agiert durch Binden an Rezeptoren auf Erythrozytenvorläuferzellen, was in einer Erhöhung der Calciumionenkonzentration in einer Zelle, in einem Anstieg der DNA-Biosynthese und in einer Stimulierung zur Bildung von Hämoglobin und ähnlichem resultiert. Dieses EPO kann für die Behandlung einer Anämie durch Nierenversagen, einer Anämie eines frühgeborenen Babys, einer Anämie durch Hypothyreose, einer Anämie durch Fehlernährung, usw. verwendet werden. Die klinische Verwendung von rekombinantem humanem EPO steigt an. Jedoch kann so eine Verwendung einige Unbequemlichkeiten und hohe Kosten verursachen, da es durchschnittlich drei mal in der Woche aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit verabreicht werden sollte. Daher könnte, wenn die in vivo Aktivität des EPO für eine lange Zeit erhalten bliebe, die Verabreichungshäufigkeit von EPO deutlich gesenkt werden.

Die Wirksamkeit von EPO ist proportional zu dessen in vivo Halbwertszeit. Es ist bekannt, daß die in vivo Halbwertszeit von EPO mit dem Sialinsäure-Gehalt korelliert, die sich am Ende der Kohlenhydratketten des EPOs befindet. Deshalb hängt die Wirksamkeit von EPO stark von der Gegenwart der Kohlenhydratketten ab. Da die Form der Kohlenhydrate abhängig von der Art der Zellen, in denen EPO exprimiert wird, unterschiedlich zu sein scheint, können die gleichen Glykoproteine unterschiedliche Kohlenhydratstrukturen haben, wenn sie in unterschiedlichen Zellen exprimiert werden. Auch wurde kürzlich demonstriert, daß einige Bakterien Kohlenhydratketten anhaften können, wogegen bekannt ist, daß typische Bakterien, z.B. E. coli dies nicht tun. Proteine, die in E. coli exprimiert werden, enthalten keine Kohlenhydratketten und daher zeigt E. coliabgeleitetes EPO, welches keine Kohlenhydratketten enthält, positive in vitro Aktivität, aber keine in vivo Aktivität. Dies geschieht, da deglykolisiertes EPO schnell aus dem humanen Körper eliminiert wird und eine extrem kurze Halbwertszeit hat. Daraus läßt sich schließen, daß die Kohlenhydratketten eine sehr wichtige Rolle bei der Aktivität von EPO spielen.

Viele Studien wurden durchgeführt, um die Aktivität von EPO zu verstärken. Der Hauptansatz ist die Substitution einiger Aminosäuren des EPO durch Mutagenese des EPO-Gens. Zum Beispiel PCT/US94/09257, eingericht von Amgen und betitelt "Erytropoietin Analoga" offenbart ein Verfahren, um die in vivo Halbwertszeit von EPO durch Erhöhung des Kohlenhydratgehalts durch Mutagenese zu erhöhen. Ebenfalls wurde ein Versuch gemacht, die in vivo Halbwertszeit von EPO durch Bildung von EPO-Dimeren zu erhöhen. Siehe A.J. Sytkowski et al., J.B.C. Vol. 274, Nr. 35, pp 24773–24778. Außerdem ist ein anderes bekanntes Verfahren, die in vivo Aktivität von EPO zu erhöhen, das Anfügen neuer Aminosäuren, Peptide oder Proteinfragmente an das EPO Molekül nach Verfahren des genetischen Engineering und Erhöhen des Kohlehydratgehaltes, d.h. des Sialinsäuregehaltes des EPO. Jedoch können nicht alle Aminosäuren, Peptide oder heterogene Proteinfragmente für diesen Zweck verwendet werden. In den meisten Fällen können solche Modifikationen in einem Absinken oder einem Verlust der inherenten Aktivität des Proteins resultieren und können ein Problem der Antigenizität verursachen, wenn sie in vivo verwendet werden.

Auch wenn es nicht mit EPO verwandt ist, wurden Fusionsproteine oder chimerische Proteine beispielsweise für follikelstimulierendes Hormon, das eine Art Geschlechtshormon ist, studiert. Siehe Furuhashi et al, 1995, Mol. Endocrinol. Jedoch wurden diese Verfahren in der Industrie nicht angewendet, da Proteinmodifikationen unter Verwendung eines Verfahrens des genetischen Engineereings viele Risiken bergen. Diese sind in den meisten Fällen, daß das Zielprotein nicht einfach ohne professionelle Begabungen erhalten werden kann und daß im Gegensatz die inherente Aktivität des Proteins durch die Hinzufügung oder Substitution von neuen Aminosäuren abgesenkt werden oder verloren werden könnte.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegenden Erfinder haben neue Verfahren zum Verstärken der in vivo Aktivität des EPOs durch Anfügen neuer Aminosäuren, Peptide oder Proteinfragmente an das EPO Molekül, um so dessen Kohlenhydratgehalt zu erhöhen, gründlich studiert. Als ein Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder entdeckt, daß ein Fusionsprotein von EPO, erhalten durch die Anfügung eines carboxyterminalen Peptids (hierunter CTP) umfassend wenigstens die Aminosäuren 337–353 des Thrombopoitetins (hierunter TPO), einem Protein, das bereits in dem menschlichen Körper existiert, an das carboxyterminale Ende von EPO die in vivo Halbleitszeit aufgrund vieler Aminosäuren, die die Anzahl der Glykolisierungssites ohne Verlust der inherenten Aktivität des EPO erhöhen, stark verlängert haben und keinerlei Antigenizität verursacht, wenn es auf den menschlichen Körper angewendet wird. So haben die vorliegenden Erfinder die vorliegende Erfindung vervollständigt.

Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Fusionsprotein zur Verfügung zu stellen, welches eine verstärkte in vivo Aktivität des humanen EPO aufweist und welches TPO als CTP angefügt an humanes EPO an dessen carboxyterminalem Ende enthält.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen, die für das Fusionsprotein kodiert, einen rekombinanten Vektor, der diese Nukleinsäure enthält und eine Wirtszellinie, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert ist.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Herstellung des Fusionsproteins mit verstärkter in vivo Aktivität des humanen EPO durch Kultivieren der transformierten Zellinie zur Verfügung zu stellen.

Zunächst betrifft die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein gemäß Patentanspruch 1 mit verstärkter in vivo Aktivität von humanem EPO und welches TPO als CTP an humanem EPO an dessen carboxyterminalem Ende angefügt enthält. Das CTP umfaßt vorzugsweise die Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1, die zu den Aminosäuren an Positionen 176 bis 353 (hierunter LTP) oder Teilen davon korrespondieren, insbesondere die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, die zu den Aminosäuren und Positionen 337 bis 353 (hierunter STP) korrespondiert.

Insbesondere kann das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 oder 4 umfassen.

Zweitens betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert, einen rekombinanten Vektor, der die Nukleinsäure enthält und eine Wirtszellinie, vorzugsweise CHO (Chinese hamster ovary) Zellen, die mit dem rekominanten Vektor transformiert sind.

Drittens betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Fusionsproteins mit verstärkter in vivo Aktivität des humanen EPO durch Kultivieren der transformierten Zellinie.

Hierunter wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die 1a und 1b zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der carboxyterminalen Petptide (LTP, STP) des TPO;

Die 2aa und 2ab zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresquenzen von ELTP, was ein Fusionsprotein aus EPO und dem Peptid LTP ist, und 2b zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von ESTP, das ein Fusionsprotein aus EPO und dem Peptid STP ist.

Die 3a und 3b sind Schemata, die die Verfahren zur Herstellung der Expressionsvektoren, pcDNA-ELTP und pcDNA-ESTP darstellen;

4 ist eine Fotografie eines Ergebnisses eines Elektrophoreseexperimentes mit exprimiertem ELTP und ESTP; und

5 ist ein Graph, der die pharmakokinetischen Ergebnisse von EPO, ELTP und ESTP zeigt.

Bestes Verfahren für die Ausführung der Erfindung

Die Konzentrationsangaben "mM" und "M" beziehen sich auf mMol/l bzw. Mol/l.

Die vorliegende Erfindung umfaßt die Schritte der Herstellung und des Klonierens des Gens des gewünschten Fusionsproteins, die Konstruktion eines Expressionsvektors der das gewünschte Gen enthält, die Transformation einer Tierzelle, die Expression, die Aufreinigung und einen biologischen Assay.

(1) Herstellung des Gens

EPO cDNA kann durch Ausführung der konventionellen PCR Technik (PCR PreMix Kit von Bioneer Co.) unter Verwendung der komplementären Primer der EPO cDNA-Enden (EP1 und EP2) aus der cDNA-Bibliothek aus human-abgeleiteter fötaler Leber (Invitrogen Co.) erhalten werden. TPO cDNA kann unter Verwendung der komplementären Primer der TPO cDNA-Enden (T1 und T2) gemäß desselben Verfahrens erhalten werden.

EPO cDNA und TPO cDNA, erhalten durch PCR, werden in pGEM-T (Promega Co.), ein Kloningvektor, kloniert. pGEM-EPO und pGEM-TPO werden dann sequenziert und als ein Template für die folgenden Verfahren verwendet.

LTP, ein CTP Gen des TPO, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch die Ausführung einer PCR unter Verwendung von pGEM-TPO als Template und der Primer EL1 und T2 erhalten werden.

Der Primer EL1 enthält ein Gen, daß sich bis zu der Position des Restriktionsenzyms StuI erstreckt, welches sich in der Nähe des 3' terminalen Endes von EPO befindet, und enthält gleichzeitig einen Teil des 5' Terminus des LTP Gens (Aminosäuren der Position 176 bis 353 von TPO). Andererseits wird die PCR unter Verwendung von pGEM-EPO als Template und den Primern EP1 und EP2 ausgeführt, um nur das EPO Gen zu erhalten. Die erhaltenen EPO- und LTP Gene werden mit Restriktionsenzym StuI behandelt. Dann werden die Fragmente der EPO und LTP Gene ligiert und das Ligationsprodukt wird als Template in dem PCR Verfahren unter Verwendung der Primer EP11 und L2 verwendet, um ein Genfragment ELTP zu ergeben, das etwa 1113 Basenpaare hat.

Dieses Gen wird in einen Kloningvektor pGEM-T kloniert und dann sequenziert (pGEM-ELTP, 3a).

Weiterhin kann das STP Gen, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch Synthese und durch ein self-priming PCR-Verfahren erhalten werden. Die synthetisieren Genfragmente sind die folgenden ES1, S2, S3 und das obige L2.

1 μl ( 50 pMol/μl) von jeden 4 Genfragmenten wird genommen, und PCR wird unter Verwendung eines High Fidelity Taq Systems von BM Co. ausgeführt.

Das Genfragment von etwa 50 Basenpaaren (STP Gen) wird auf einem 1%igen Agarosegel identifiziert. Dieses Gen kodiert für die 17 Aminosäuren (Aminosäuren der Positionen 337 bis 353) des carboxyterminalen Endes von TPO (1).

PCR wird unter Verwendung von pGEM-EPO als Template und der Primer EP11 und EP2 ausgeführt, um nur das EPO Gen zu ergeben. Dieses EPO Gen und das STP Gen werden als Templates gleichzeitig verwendet und die Primer EP11 und L2 werden in einer PCR unter Verwendung des High Fidelity Taq System von BM Co. verwendet, um das gewünschte Fusionsgen, das ESTP Gen mit etwa 630 Basenpaaren zu ergeben. Dieses Gen wird in pGEM-T, einen Kloningvektor, kloniert und dann sequenziert (pGEM-ESTP, 3b).

(2) Konstruktion eines Expressionsvektors

Der pcDNA3.1 Vektor von Invitrogen Co. wird als Expressionsvektor verwendet.

Der pcDNA3.1 Vektor wird mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt, um den Vektor zu linearisieren und pGEM-ELTP und pGEM-ESTP werden ebenso mit denselben Restriktionsenzymen, HindIII und BamHI behandelt. Die verdauten pcDNA3.1, ELTP und ESTP Gene werden unter Verwendung des Qiagen Extraktions Kits auf Agarosegel isoliert. Nach jeder Ligation der Gene wird das Ligationsprodukt in E. coli NM 522 eingeführt. Plasmide werden aus den Kolonien isoliert, die aus der Kultivierung der transformierten E. coli in LB- Ampicillinplatten über Nacht gebildet wurden und mit den Restriktionsenzymen, HindIII und BamHI behandelt. Kolonien, die das ELTP oder ESTP Gen enthalten, wurden durch eine 1%ige Agarosegelelektrophorese gescreent. Diese Plasmide werden als pcDNA-ELTP und pcDNA-ESTP bezeichnet (3a und 3b).

(3) Transformation von CHO Zellen und Expression

CHO Zellen (DG44) werden bis zu einer Konfluenz von 40^~80% (1^~4 × 10⁵ Zellen pro 60 mm Platte) auf einer 60 mm Zellkulturplatte kultiviert. 3 μl des Superfection Reagenzes (BM Co.) und 97 μl Zellkulturmedium (α-MEM mit Medium, kein Serum, keine Antibiotika) werden gut vermischt und pcDNA-ELTP (= 0.1 μg/μl, etwa 2 μl) und Vektor pLTRdhfr26 (ATCC37295,0.2 μg) mit dem dhfr Gen, werden dazugegeben. Die Mischung wird 5–10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt und dann zu den Zellen, die wie oben hergestellt wurden, hinzugegeben. Nach einem Tag wird das Medium mit einem Medium, das G418 in einer Menge von 500 μg/ml (α-MEM ohne Medium, 10% FBS) enthält, erneuert. Das Medium wird dann mit dem G418 Medium, welches 500 μg/ml G418 enthält für 7–10 Tage erneuert, während dessen Zellen ohne G418 Resistenzgen und negative Kontrollzellen vollständig getötet werden. Die auf dem G418 Medium ausgewählten Zellen werden ausreichend kultiviert und ein exprimiertes ELTP Protein wird unter Verwendung des EPO ELISA Kits von BM Co. identifiziert. Dasselbe Verfahren wird auf den ESTP Expressionsvektor angewendet und dann wird ein exprimiertes ESTP Fusionsprotein auch auf dieselbe Art und weise identifiziert.

(4) Aufreinigung des exprimierten ELTP und ESTP

Affinitätsmaterial für die Isolierung und Aufreinigung wird unter Verwendung von anti-EPO monoklonalen Antikörpern (R&D Co.) wie folgt hergestellt:
0,3g Cyanbromid aktivierte Sepharose 4B wird 20 min in 1 mM HCl aufgeschwämmt und das Medium wird in eine Säule gegeben und mit 1 mM HCl gewaschen. Das Medium wird mit 4 ml Kupplungspuffer (0.1M NaHCO₃, 0.5M NaCl, pH 8.3) gewaschen und sofort mit anti-EPO monoklonalen Antikörpern (500μg/Viole) enthalten in 4ml Kupplungspuffer vermischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Bewegung des Säulenkörpers umgesetzt. Erneuert mit Blockierungspuffer (0,2 M Glycin, pH 8,0) wird das Medium bei Raumtemperatur 2h unter Bewegung des Säulenkörpers umgesetzt. Dann wird das Medium mit 6,5 ml Kupplungspuffer, 6,5 ml Acetatpuffer (0,1 M Essigsäure, 0,5 M Natriumchlorid, pH 4) und 6,5 ml Kupplungspuffer in dieser Reihenfolge gewaschen. Eine Säule wird unter Verwendung eines auf diese Weise erhaltenen Mediums hergestellt und die Aufreinigung wird durchgeführt wie hierunter beschrieben.

Zellen werden in einem Serumfreien Medium einen Tag lang kultiviert und das Medium wird unter Verwendung von Centripreps (Millipore MWCO 10.000) etwa 5-fach aufkonzentriert. Dieses Konzentrat wird auf eine Säule geladen, die vorher mit PBS bei einer Flußrate von 20 ml/h equilibriert wurde und nochmal mit PBS gewaschen wurde. Elutionspuffer (0,1 M Glycin, pH 2,8) wird auf die Säule aufgetragen und der Eluent wird sofort mit 1 M Tris auf pH 7,5 titriert. Die Reinheit beträgt mindestens 97% wenn mit SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert wird (4).

(5) Aktivitätsmessung durch ein Bioassayverfahren

In dem Bioassaytest unter Verwendung von Mausmilzzellen, behandelt mit Phenylhydrazin, zeigen die ELTP und ESTP, die exprimiert und ordentlich auf gereinigt wurden, eine höhere Aktivität als EPO. Das demonstriert, daß die fusionierten Carboxytermini in ELTP und ESTP möglicherweise nicht die Aktivität von EPO selbst inhibieren.

(6) Pharmakokinetische Experimente

Pharmakokinetische Experimente werden mit Mäusen durchgeführt, um zu bestimmen, ob das hergestellte ELTP und ESTP tatsächlich eine verlängerte in vivo Halbwertszeit besitzt. Die zu prüfende Substanz wird intravenös 4 Mäusen in einer Menge von 20 Einheiten pro Maus verabreicht. Um die Konzentationsänderungen im Blut mit der Zeit zu identifizieren, wurde den Mäusen in 30 Minuten-Intervallen Blut entnommen und die Konzentrationen wurden unter Verwendung des EIA Kits von Boehringer Mannheim Co. gemessen. In den pharmakokinetischen Experimenten mit Mäusen zeigen die Testsubstanzen ELTP und ESTP deutlich längere Halbwertszeiten als das Kontroll-EPO (5).

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen genauer erklärt werden. Jedoch sollte verstanden werden, daß die folgenden Beispiele gedacht sind, die vorliegende Erfindung zu illustrieren, aber nicht um den Umfang der vorliegenden Erfindung auf irgendeine Art und Weise einzuschränken.
Beispiel 1: Herstellung des Gens
EPO cDNA wurde durch Ausführen der konventionellen PCR (PCR PreMix Kit von Bioneer Co.) unter Verwendung der Primer EP1 und EP2, die komplementär zu den Termini der EPO cDNA sind, in Mengen von 50 pMol, aus einer cDNA Bibliothek aus human abgeleiteter fötaler Leber (Invitrogen Co.) erhalten. TPO cDNA wurde unter Verwendung der Primer T1 und T2, die komplementär zu den Termini der TPO cDNA sind, auf dieselbe Art und Weise erhalten. Insgesamt wurden 30 PCR Zyklen unter Verwendung von High Fidelity Taq System von BM Co. unter Bedingungen von 52°C 40 Sekunden lang zum Annealen, 72°C 55 Sekunden lang und 94°C 20 Sekunden lang ausgeführt, um EPO cDNA und TPO cDNA zu erhalten. Diese wurden in pGEM-T (Promega Co.), einen Kloningvektor, kloniert. D.h. die PCR Produkte wurden aus einem 1%gen Agarosegel eluiert und in pGEM-T ligiert, welcher dann in E. coli NM 522 eingeführt wurde. Die transformierten E. coli wurden über Nach auf einer LB-Ampicillinplatte, die X-gal/IPTG enthält, kultiviert. Plasmide wurden aus den weißen Kolonien auf gereinigt und mit den Restriktionsenzymen SacI und SacII behandelt, um die Kolonien, die die entsprechenden cDNRs enthalten, zu screenen. Die Vektoren, die in diesem Stadium erhalten wurden, wurden als pGEM-EPO und pGEM-TPO bezeichnet, welche dann sequenziert wurden und als Templates für die folgenden Verfahren verwendet wurden.
LTP, CTP Gen von TPO, verwendet in der vorliegenden Erfindung wurde durch Ausführen von insgesamt 30 PCR Zyklen unter Verwendung High Fidelity Taq System von BM Co. und unter Verwendung von pGEM-TPO als ein Template und den Primern EL1 und T2 (50 pMol) unter den Bedingungen von 50°C 40 Sekunden zum Annealen, 71°C 45 Sekunden lang und 94°C 20 Sekunden lang erhalten. Der Primer EL1 enthält ein Gen von der Position des Restriktionsenzyms StuI, welche in der Nähe des 3' Terminus von EPO angeordnet ist zu dem 3' Ende und gleichzeitig einen Teil des 5' Endes des LTP Gens. Ein Genfragment von etwa 534 Basenpaaren wurde auf einem 1%igen Agarosegel (LTP Gen) identifiziert. Dieses Gen kodiert für die 178 Aminosäuren des Carboxyterminus von TPO (Aminosäuren der Positionen 176-353) (1).
Weiterhin wurde PCR unter Verwendung von pGEM-EPO als Template und den Primern EP1 und EP2 ausgeführt, um nur das EPO Gen zu erhalten.
Die so erhaltenen EPO und LTP Gene wurden mit Restriktionsenzym StuI behandelt. Dann wurden die Fragmente der EPO und LTP Gene durch Qiagen Estraktions Kit aufgereinigt und mit Ligase ligiert. Das Ligationsprodukt der EPO und LTO Gene wurde als Template in einem PCR Verfahren mit insgesamt 30 Zyklen unter Verwendung der Primer EP11 und L2 (50 pMol) und unter Verwendung des High Fidelity Taq Systems von BM Co. unter den Bedingungen von 55°C für 40 Sekunden zum Annealen, 72°C für 60 Sekunden und 94°C für 20 Sekunden verwendet, um das gewünschte Fusionsgen ELTP mit etwa 1113 Basenpaaren zu ergeben. Das Gen wurde in einen Kloningvektor pGEM-T auf dieselbe Art und Weise wie oben kloniert und dann sequenziert (pGEM-ELTP, 3a).
Das STP Gen wurde durch Synthese und durch ein selfpriming PCR Verfahren erhalten. Die synthesierten DNA Fragmente waren ES1, S2, S3 und L2. 1 μl (50pMol/μl) von jedem der 4 DNA Fragmente wurde genommen und insgesamt 15 PCR Zyklen wurden unter Verwendung des High Fidelity Taq Systems von BM Co. unter den Bedingungen von 55°C für 40 Sekunden zum Annealing, 72°C für 40 Sekunden und 94°C für 20 Sekunden ausgeführt. Ein Genfragment von etwa 50 Basenpaaren wurden auf einem 1%igen Agarosegel identifiziert (STP Gen). Dieses Gen codiert für die 17 Aminosäuren des Carboxyterminus von TPO (Aminosäurenpositionen 337 bis 353) (1).
PCR wurde unter Verwendung von pGEM-EPO als Template und den Primern EP11 und EP2 auf die selbe Art und Weise wie oben ausgeführt, um nur das EPO Gen zu ergeben. Dieses EPO Gen und das STP Gen wurden als Templates gleichzeitig verwendet und die Primer EP11 und L2 wurden in insgesamt 30 PCR Zyklen unter Verwendung des High Fidelity Taq Systems von BM Co. und unter Bedingungen von 58°C für 40 Sekunden zum Annealen, 72°C für 50 Sekunden und 94°C für 20 Sekunden verwendet, um das gewünschte Fusionsgen, das ESTP Gen mit etwa 630 Basenpaaren zu ergeben. Dieses Gen wurde in pGEM-T, einen Kloningvektor, kloniert und dann sequenziert (pGEM-ESTP, 3b)
Beispiel 2: Konstruktion der Expressionsvektoren pcDNA und pcDNA-ESTP
Der pcDNA3.1 Vektor von Invitrogen Co. wurde als Expressionsvektor verwendet. Die ELTP und ESTP Gene, die in den pGem-T Vektor kloniert sind, enthalten HindIII und BamHI Erkennungssequenzen jeweils an den Enden. pcDNA3.1, pGEM-ELTP und pGEM-ESTP wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt. Die linearisierten pcDNA3.1, ELTP und ESTP Gene wurden unter Verwendung des Quiagen Extraktions Kits auf Agarosegel isoliert. Nach der Ligation von pcDNA3.1 mit ELTP oder ESTP wurde das Ligationsprodukt in E. coli NM 522 eingeführt. Plasmide wurden aus den Kolonien isoliert, die durch die Kultivierung der transformierten E. coli auf LB-Amplicillinplatten über Nacht gebildet wurden und wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt. Kolonien, die das ELTP oder ESTP Gen hatten, wurden dann durch 1%ige Agarosegelelektophorese gescreent. Diese Plasmide wurden als pcDNA-ELTP und pcDNA-ESTP bezeichnet (3).
Beispiel 3: Transformation von CHO Zellen und Expression
CHO Zellen (DG44) wurden bis zu einer Konfluenz von 40^~80% (1^~4 × 10⁵ Zellen pro 60 ml Platte) in einer 60 mm Zellkulturschale kultiviert. 3 μl des Superfectionreagenzes (BM Co.) und 97 μl des Zellkulturmediums (α-MEM mit Medium, kein Serum, kein Antibiotikum) wurden gut gemischt und der Plasmid cDNA-ELTP (= 1,2 μg/μl, etwa 2 μg) und Vektor pLTRdhfr26 (ATCC 37295, 0,2 μg) der das dhfr Gen enthält, wurden hinzugegeben. Die Mischung wurde 510 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt und dann zu den Zellen, die wie oben hergestellt wurden, hinzugegeben. Nach einem Tag wurde das Medium mit einem Medium erneuert, das G418 in einer Menge von 500 μg/μl (α-MEM ohne Medium, l0%FBS) enthält. Das Medium wurde dann mit dem G418 Medium, enthaltend 500 μg/μl G418 7^~10 Tage lang erneuert, während dessen Zellen ohne G418 Resistenzgen und negative Kontrollstellen vollständig getötet wurden. Die auf G418 Medium ausgewählten Zellen wurden ausreichend kultiviert und ein exprimiertes ELTP Protein wurde unter Verwendung des EPO ELISA Kits von BM Co. identifiziert. Dasselbe Verfahren wurde auf pcDNA-ESTP angewendet.
Beispiel 4: Aufreinigung der exprimierten Fusionsproteine
Affinitätsmedium für die Isolierung und Aufreinigung wurde unter Verwendung von anti-EPO monoklonalen Antikörpern (R&S Systems Co.) wie folgt hergestellt:
0,3g Cyanbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde 20 min. in 1 mM HCl aufgeschwämmt, und das Medium wurde in eine Säule gegegeben und mit 1 mM HCl gewaschen. Das Medium wurde gewaschen mit 4 ml Kupplungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,5M NaCl, pH 8,3), augenblicklich mit anti-EPO monklonalen Antikörpern (500 μg/Viole), enthalten in 4 ml Kupplungspuffer in einem Säulenkörper gemischt, und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Bewegen des Säulenkörpers umgesetzt. Erneuert mit Blockadepuffer (0,2 M Glycin, pH 8,0) wurde das Medium bei Raumtemperatur 2 h unter Bewegen des Säulenkörpers umgesetzt. Dann wurde das Medium mit 6,5 ml Kupplungspuffer, 6,5 ml Acetatpuffer (0,1 M Essigsäure, 0,5M NHCL, pH 4) und 6,5 ml Kupplungspuffer in dieser Reihenfolge gewaschen. Eine Säule wurde unter Verwendung des so erhaltenen Mediums präpariert und die Aufreinigung wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium einen Tag lang kultiviert, und das Medium wurde etwa 5-fach unter Verwendung von Centriprep (Millipore, MWCO 10.000) aufkonzentriert. Dieses Konzentrat wurde auf eine Säule, die vorher mit PBS bei einer Flußrate von 20 ml/h equilibriert wurde, aufgetragen und nochmal mit PBS gewaschen. Elutionspuffer (0,1 M Glycin, pH 2,8) wurde auf die Säule angewendet und der Eluent wurde sofort mit 1 M Tris auf pH 7,5 titriert. SDS-Page Resultate des aufgereinigten ELTP und ESTP sind in 4 gezeigt. Die Reinheit betrug wenigstens 97%, wie analysiert durch SDS-Page und Silberfärbung.
Beispiel 5: Aktivitätsmessung durch Bioassayverfahren
Phenylhydrazine wurde in eine Maus einmal täglich zwei Tage lang mit einer Dosis von 60 mg/kg injiziert. Nach drei Tagen wurde die vergrößerte Milz abgetrennt und mit einem Homogenisator vermahlen, um Milzzellen zu erhalten. Die Milzzellen wurden bis auf 6 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt und 100 μl von der Zellösung wurden in jede Vertiefung einer 96-Vertiefungsplatte gegeben. 0^∼500 mU/ml von authentischer EPO und 100 mU/ml des exprimierten Fusionsproteins wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platte wurde bei 37 °C 22 h lang in einem CO₂ Inkubator ruhen gelassen. 50 μl Dimethyl-³[H]-Thymidin (20 μCi/ml) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, weitere 2 h in demselben Inkubator umgesetzt und dann wurde die Reaktionslösung vertiefungsweise auf einem Glasfilter absorbiert (Nunc 1-73164). Die Filter wurden mit physiologischer Salinlösung 3 mal gewaschen und die Menge an Radioaktivität jedes Filters wurden unter Verwendung eines β-Strahlungszählers gemessen. Die Aktivitäten der Fusionsproteine ELTP und ESTP wurden gezeigt, vergleichbar oder höher zu sein als die von authentischer EPO, was demonstrierte, daß die Carboxytermini, die mit EPO verbunden sind, nicht die EPO Aktivität selbst behinderten.
Beispiel 6: Pharmakokinetsche Experimente
Pharmakokinetische Experimente wurde mit Mäusen ausgeführt, um zu bestimmen, ob die hergestellte Testsubstanz tatsächlich die in vivo Halbwertszeit verlängert hat. Das auf gereinigte Fusionsprotein gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 wurde intravenös 4 Mäusen in einer Menge von 20 Einheiten pro Maus verabreicht. Um den zeitabhängigen Verlauf der Konzentration im Blut zu bestimmen, wurde den Mäusen in einem 30-Minuten-Intervall Blut entnommen und Konzentrationen wurden unter Verwendung des EIA Kits von Boehringer Mannheim Co. gemessen. Die Resultate sind in 5 gezeigt. Wie aus 5 gesehen werden kann, zeigen ELTP und ESTP eine etwa 3 mal längere Halbwertszeit als die Kontrolle, EPO, (Halbwertszeit von EPO war 22 Minuten, die von ELTP war 60 Minuten und die von ESTP war 57 Minuten).
Industrielle Anwendbarkeit
Die Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung haben eine stark erhöhte in vivo Halbwertszeit von EPO aufgrund der Gegenwart von Aminosäuren, die die Anzahl der Kohlenhydratketten erhöhen, ohne die inherente Aktivität von EPO zu beeinflussen. Weiterhin verursachen die Fusionsproteine keine Antigenizitäts-Probleme, wenn sie auf den menschlichen Körper angewendet werden, da das fusionierte Peptid, LTP oder STP, ein Peptid ist, das bereits im Körper existiert.

Claims

Ein Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet, daß ein carboxyterminales Peptid (CTP) umfassend wenigstens die Aminosäuren 337-353 des Thrombopoietins (TPO) mit dem Carboxyterminus von humanem Erythropoietin (EPO) verbunden ist.
Das Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das carboxyterminale Peptid die mit SEQ ID Nr. 2 beschriebene Sequenz umfaßt.
Das Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, wobei das carboxyterminale Peptid die Aminosäuren der Positionen 176 bis 353 von TPO umfaßt, deren Sequenz in SEQ ID Nr. 1 beschrieben ist.
Eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1–3 kodiert.
Ein Verfahren für die Herstellung eines Fusionsproteins mit verstärkter in vivo Aktivität des humanen EPO, was die Kultivierung einer Wirtszellinie, transformiert mit dem rekombinanten Vektor, der die Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 enthält, umfaßt.