DE69935071T2

DE69935071T2 - Mutein von humanem Thrombopoietin

Info

Publication number: DE69935071T2
Application number: DE69935071T
Authority: DE
Inventors: 210-1204 Hanshin Apt. Joo Young CHUNG; Kyu Sang PARK; Myoung Sang JU; Kyung Hyea AHN; Wook Seung LIM; Ik Woo CHANG; Kook Seung PARK; Wook Yeo KOH; Soo Ji PARK
Original assignee: Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2007-07-26
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: EP1092029B1; CN1306573A; JP2005046156A; DE69935071D1; AU4655899A; CA2332126A1; BR9911686A; ID27396A; WO2000000612A1; JP2002519031A; ATE353340T1; CA2332126C; JP3646927B2; KR20010078744A; KR20000006549A; CN1145694C; KR100331977B1; EP1092029A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Human-Thrombopoietin-Derivate (hTPO-Derivate) mit hohen Aktivitäten, die die Blutplättchen-Produktion in vivo verstärken, und betrifft ein Verfahren zu deren Herstellung.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue hTPO-Derivate, in denen Zucker-Ketten eingeführt sind durch substituierendes Einführen von Aminosäure wie beispielsweise Asparagin anstelle von Aminosäuren in speziellen Positionen in nativem hTPO; betrifft Nukleotid-Sequenzen, die für die hTPO-Derivate kodieren; betrifft Expressions-Vektoren, die die Nukleotid-Sequenzen enthalten; betrifft ein Verfahren zu deren Konstruktion; betrifft Zell-Linien, die mit den Vektoren transformiert sind; und betrifft ein Verfahren zur Herstellung der hTPO-Derivate damit.
Hintergrund
Thrombozytopenie ist die Krankheit eines Blutplättchen-Mangels, der hervorgerufen wird durch eine Antikrebs-Therapie, eine Knochenmark-Verpflanzung usw.. In dem Verfahren einer Antikrebs-Therapie oder einer Knochenmark-Verpflanzung werden Megakaryocyten-Kolonien bildende Zellen, die Blutplättchen-Vorläufer-Zellen im Knochenmark sind, zerstört, und dies führt zu einem Blutplättchen-Mangel. Ein Thrombozytopenie-Patient erleidet Blutungen als Antwort auf eine leichte Verletzung, und Patienten mit stärkerer Ausprägung der Krankheit werden sogar ohne Verletzung blutend. Das Bluten ist häufig in diesem Fall fatal, da das Blut überhaupt nicht gestillt wird.
Die derzeitige Therapie gegen Thrombozytopenie ist nichts weiter als eine Blutplättchen-Transfusion. Jedoch sind mit dieser Therapie einiger Probleme und Nebenwirkungen verbunden, wie beispielsweise eine nicht ausreichende Zahl von Donoren, eine durch eine Transfusion vermittelte Infektion mit z. B. HIV (Human-Immunodefizienz-Virus) und mit Hepatitis-Viren, das Hervorrufen einer Immun-Antwort usw..
Blutplättchen sind eine Komponente des Bluts und gehen zurück auf Megakaryocyten-Vorläufer-Zellen, und sie spielen eine Rolle in der Unterdrückung einer Blutung. Thrombopoietin (nachfolgend bezeichnet als „TPO"), ein in der Leber oder der Niere synthetisiertes und abgeschiedenes Glycoprotein, reguliert die Blutplättchen-Konzentration im Blut. TPO beschleunigt die Proliferation und Differenzierung der Megakaryoczten-Vorläufer-Zellen, und dem folgt die Blutplättchen-Produktion (Lok et al., Nature, 369: 565-568 (1994); De Savage et al., Nature, 369: 53-568 (1994)).
Da ein Gen, das für TPO kodiert, zuerst vom Menschen im Jahre 1994 isoliert wurde (Lok et al., Nature, 369: 565-568 (1994); De Savage et al., Nature, 369: 533-568 (1994); Miyazaki et al., Experimental Hematol., 22: 838 (1994); WO 95/18,858), wurden klinische Ansätze gegen Thrombozytopenie aufgebaut auf der Funktion von Human-TPO (nachfolgend bezeichnet als „hTPO"), d. h. auf die Regulierung der Blutplättchen-Konzentration.
Drei verschiedene Ansätze wurden verfolgt, um die Aktivität von nativem hTPO zu verbessern.
Das Glycoprotein hTPO wird in Zellen als inaktive Vorstufe exprimiert, die 353 Aminosäuren umfasst, und die Abspaltung eines Signalpeptids (21 Aminosäuren) führt zur Sekretion von aktivem hTPO-Protein (332 Aminosäuren) aus den Zellen. Die Aminosäure-Sequenz von hTPO wird in zwei Bereiche geteilt. Der 151 Aminosäuren umfassende N-terminale Bereich enthält eine katalytische Stelle und zeigt hohe Ähnlichkeit mit demjenigen von Erythropoietin (EPO). Der andere Bereich, der C-terminale Bereich, weist – wie angenommen wird – eine Schlüsselrolle in der extrazellulären Abscheidung und der in-vivo-Stabilität von hTPO auf.
Das erste Verfahren zum Modifizieren von nativem hTPO bezieht sich auf die Streichung des C-terminalen Bereichs oder die Hinzufügung neuer Aminosäuren zu dem aus der Streichung entstandenen hTPO.
In Stützung dieses Ansatzes entwickelte Amgen Inc. Verschiedene hTPO-Derivate wie beispielsweise hTPO₁₅₁ (bestehend aus den Aminosäuren 1-151), hTPO₁₇₄ (bestehend aus den Aminosäuren 1-174) und hTPO₁₆₃, ergänzt durch Methionin-Lysin an seinem N-terminalen Ende. Jedoch zeigte sich, dass diese Derivate eine niedrigere hTPO-Aktivität in vivo aufweisen als natives hTPO, obwohl ihre Aktivitäten in vitro erhalten blieben (WO 95/26,746, WO 95/25,498).
Darüber hinaus stellte Genentech Inc. aus E. coli ein rekombinantes hTPO₁₆₃-Derivat her, das einen N-terminalen Methionin-Rest aufweist (WO 95/18,858). Kirin stellte diverse hTPO-Derivate mit am C-terminalen Ende gestrichenen Resten her, sowie hTPO₁₆₃-Derivate mit Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Resten an einem spezifischen Aminosäure-Rest (WO 95/21,920). Andere hTPO-Derivate mit C-terminaler Deletion bzw. Streichung wurden bereitgestellt von der Firmen Zymogenetics Inc. (WO 95/21,920; WO 95/17,062) sowie von G. D. Searl (WO 96/23,888). Diese Derivate zeigten jedoch keine höhere Aktivität der Blutplättchen-Produktion in vivo als natives hTPO.
Die zweite Verfahrensweise ist verbunden mit der Konjugation von Polyethylenglycol (PEG) mit einem hTPO-Fragment, und ein Beispiel hierfür ist das Produkt hTPO₁₆₃-PEG von der Firma Amgen Inc. (WO 95/26,746).
Die Derivate gemäß dieser Verfahrensweise haben jedoch kritische Nachteile wie beispielsweise eine geringe Stabilität und Sicherheit, da sie nicht einen C-terminalen Bereich enthalten, der für die Stabilität von hTPO wichtig ist, und da eine Immun-Antwort hervorgerufen werden kann durch eine Verschiebung ihrer Faltungs-Strukturen. Darüber hinaus können die Qualitäten von Produkten ungleichmäßig sein, da PEG zu einem einheitlichen Anteil nicht so konjugiert ist.
Die dritte Verfahrensweise macht Gebrauch von der Glycosylierung von hTPO, die die hTPO-Aktivität erhöhen kann.
Amgen Inc. führte eine Mutagenese in der Weise durch, dass ein spezifisches Nukleotid in der cDNS, die für hTPO kodiert, derart substituiert wurde, dass das Produkt eine Aminosäure-Sequenz „Asn-X-Ser/Thr" trägt (worin X für jede beliebige Aminosäure außer Prolin steht). Das mutierte Gen wurde zur Herstellung von hTPO-Derivaten mit einer C-terminalen Deletion bzw. Streichung verwendet, welches 174 Aminosäuren umfasste und in dem eine oder mehrere N-verknüpfte Glycosylierungs-Stellen produziert wurden (WO 96/25,498).
Das Korea Research Institute of Biology and Biotechnology (KRIBB) produzierte ein hTPO-Derivat, in dem eine Zucker-Kette in das intakte native hTPO eingearbeitet ist (Park et al., J. Biol. Chem., 273: 256-261 (1998)), und dieses ist charakteristisch verschieden von Amgens partiellen hTPO-Derivaten.
Jedoch zeigten alle diese Derivate keine signifikant höheren Werte der hTPO-Aktivität.
Wie oben beschrieben, führten trotz der Tatsache, dass verschiedene Strategien eingesetzt wurden, um hTPO-Derivate mit erhöhter biologischer Aktivität zu entwickeln, alle diese nicht zum Erhalt der Derivate mit höheren in vivo-hTPO-Aktivitäten als natives hTPO.
Allgemein existieren zahlreiche Proteine als Proteine, die durch Oligosaccharid-Ketten in einer speziellen Position geschmückt sind, d. h. Glycoproteine. Zwei Arten einer Glycosylierung wurden gefunden. Bei der an O gebundenen Glycosylierung wird eine Zucker-Kette an die Hydroxy-Gruppe eines Ser/Thr-Restes in dem Glycoprotein gebunden. Bei der N-gebundenen Glycosylierung wird eine Zucker-Kette an die Amid-Gruppe eines „Asn-X-Ser/Thr" Restes gebunden (worin X jede beliebige Aminosäure außer Prolin ist).
Die Zucker-Kette in einem Glycoprotein übt verschiedene Wirkungen auf die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften aus, wie beispielsweise Protein-Stabilität und -Abscheidung, insbesondere auf die biologische Aktivität in vivo sowie die pharmokonetischen Eigenschaften (Jenkins et al., Nature Biotechnological., 14: 975-981 (1996), Liu et al., Act. TIBTECH., 10: 114-120 (1992)).
Diese Wirkungen werden beispielhaft dargelegt durch Human-Interferon-γ und ein Glucose-Transport-Protein, wobei eine Aminosäure-Substitution an einer passenden Glycosylierungsstelle Ursache für ein auffallendes Absinken der hTPO-Aktivität war, was nahe legte, dass eine N-gebundene Zucker-Kette signifikante Wirkungen auf die Aktivität des Glycoproteins haben kann (Sareneva et al., Biochem. J. 303: 831-840 (1994); Asano et al., FEBS, 324: 258-261 (1993)).
Jedoch ist die Einführung zusätzlicher Zucker-Ketten nicht immer begleitet von einem Anstieg der katalytischen Aktivität des Glycoproteins, wie in dem früheren Stand der Technik von Amgen Inc. und KRIBB beschrieben wurde (WO 96/25,498; Park et al., J. Biol. Chem., 273: 256-261 (1993)). Obwohl weitere Zucker-Ketten in diese hTPO-Derivate eingeführt wurden, waren die biologischen Aktivitäten der Glycoproteine ziemlich verringert, verglichen mit nativem hTPO. Gemäß dieser Beobachtung ist es nicht die Zahl der Zucker-Ketten, sondern die spezielle Glycosylierungs-Stelle, die entscheidend für die Anhebung seiner katalytischen Aktivität ist.
Wir, die Erfinder der vorliegenden Erfindung, haben verschiedene hTPO-Derivate hergestellt und haben ihre Aktivitäten untersucht. Die vorliegende Erfindung wird durchgeführt, indem man offenbart, dass einige hTPO-Derivate, wie beispielsweise ein Derivat, in dem Asn anstelle von Arg¹⁶⁴ eingesetzt wird; ein Derivat, in dem Asn anstelle von Thr¹⁹³ gesetzt wird; ein Derivat, in dem Asn anstelle von Pro¹⁵⁷ und Arg¹⁶⁴ gesetzt wird; und ein Derivat, in dem Asn anstelle von Leu¹⁰⁶, Agr¹¹⁷ und Arg¹⁶⁴ gesetzt wird, merklich höhere Konzentrationen an Blutplättchen produzieren als dies natives hTPO tut, was bei den derzeitigen hTPO-Derivaten noch nie beobachtet wurde.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue hTPO-Derivate bereitzustellen, die höhere Aktivitäten in der Verstärkung der Blutplättchen-Produktion in vivo zeigen, als dies natives hTPO tut.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden die vorgenannten Aufgaben und Vorteile in einfacher Weise erreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt neue hTPO-Derivate mit höherer Aktivität im Induzieren der Blutplättchen-Produktion in vivo bereit. Zusätzliche Zucker-Ketten werden in die hTPO-Derivate dadurch eingeführt, dass man substituierend Aminosäuren wie beispielsweise Asparagin anstelle von Aminosäuren an speziellen Positionen in nativem hTPO einsetzt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Gene bereit, die für die hTPO-Derivate kodieren.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der hTPO-Derivate bereit, das den Schritt umfasst, dass die Gene in einen passenden Vektor eingesetzt werden, den Schritt umfasst, dass eine Wirts-Zelle mit dem Vektor transfektiert wird, und den Schritt umfasst, in dem die transfektierten Zellen in passendem Medium kultiviert werden.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich offensichtlich aus dem Nachfolgenden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Mutagenese auf PCR-Basis, in der die cDNSs, die für hTPO-Derivate kodieren, produziert werden, worin
„1" durch den durch Seq. ID-Nr. 1 beschriebenen Primer steht;
„2" für den durch Seq. ID-Nr. 2 beschriebenen Primer steht;
N für einen N-Primer steht;
C für einen C-Primer steht;
S für eine Signal-Sequenz steht.
2 zeigt das Verfahren eines Verknüpfens der mutierten Gene mit einem pBlue-Bac4-Vektor.
3 zeigt für das Verfahren eines Konstruierens von tierischen Expressions-Vektoren, dass die mutierten cDNSs in einem pCDT-Vektor subkloniert werden.
4 zeigt das Ergebnis eines Zell-Proliferations-Assays, in dem die Aktivität einer M-07e-Zell-Proliferation in Gegenwart von hTPO-Derivaten gemessen wird, die in tierischen Zellen exprimiert werden.
5 zeigt die in vivo-Aktivität von nativem hTPO, die bestimmt wird durch Messen der Zahl von Blutplättchen in Mause-Blut nach Behandlung mit verschiedenen Dosen von nativem hTPO.
6 zeigt die in vivo-Aktivitäten verschiedener hTPO-Derivate, die bestimmt wurden durch Messen der Zahl von Blutplättchen in Mauseblut nach Behandlung mit den hTPO-Derivaten (36 μg/kg), exprimiert in tierischen Zellen.
7a und 7b zeigen die in vivo-Aktivitäten von verschiedenen hTPO-Derivaten, die bestimmt werden durch Messen der Zahl von Blutplättchen in Mauseblut nach Behandlung mit hTPO-Derivaten (10 μg/kg), exprimiert in tierischen Zellen.
8 zeigt das Verfahren des Konstruierens der dhfr-Expressions-Vektoren, die ein Gen enthalten, das für natives hTPO oder hTPO-Derivate kodiert.
9 zeigt die Ergebnisse eines SDS-PAGE-Versuchs und Anfärben mit Silber bei den verschiedenen Fraktionen, die bei der Reinigung eines hTPO-Derivats erhalten wurden, worin laufen:
auf Spur M der Größen-Marker;
auf Spur 1 der Kultur-Überstand;
auf Spur 2 die Eluate von CM-Ionen-Austausch-Affinitäts-Säulen;
auf Spur 3 Eluate einer Phenylsephrose-Säule;
auf Spur 4 Eluate einer Hydroxyapatit-Säule; und
auf Spur 5 Eluate einer Q-Kartuschen-Säule.
10 zeigt die in vivo-Aktivitäten von nativem hTPO und verschiedener hTPO-Derivate, die bestimmt wurden durch Messen der Zahl von Blutplättchen in Mauseblut nach Behandlung mit nativem hTPO oder gereinigten hTPO-Derivaten (10 μg/kg).
11 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse mit dem gereinigten nativen hTPO und hTPO-Derivaten, worin laufen:
auf Spur M ein Größen-Marker;
auf Spur 1 natives hTPO;
auf Spur 2 das hTPO-Derivat 40433;
auf Spur 3 das hTPO-Derivat 40434;
auf Spur 4 das hTPO-Derivat 40449;
auf Spur 5 das hTPO-Derivat 40458.
12a und 12b zeigen die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse, in der das Thrombin-Verdauungs-Muster von nativem hTPO (12a) oder seines Derivats 40433 (12b) entsprechend der Zeit nach der Verdauung gezeigt ist, worin laufen:
auf Spur M ein Größen-Marker;
auf Spur 1 ein Produkt vor der Verdauung;
auf Spur 2 ein Produkt 30 Minuten nach der Verdauung;
auf Spur 3 ein Produkt 1 Stunde nach der Verdauung;
auf Spur 4 ein Produkt 2 Stunden nach der Verdauung;
auf Spur 5 ein Produkt 3 Stunden nach der Verdauung;
auf Spur 6 ein Produkt 4 Stunden nach der Verdauung;
auf Spur 7 ein Produkt 6 Stunden nach der Verdauung.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung weiter im einzelnen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt neue hTPO-Derivate mit erhöhter Aktivität bereit, die die Blutplättchen-Produktion in vivo induzieren. Zusätzliche Zucker-Ketten werden in die hTPO-Derivate durch substituierendes Einsetzen von Aminosäuren wie beispielsweise Asparagin anstelle von Aminosäuren an speziellen Positionen in nativem hTPO eingeführt.
Damit betrifft die vorliegende Erfindung ein Human-Thrombopoietin-Derivat, das abgeleitet ist von Human-Thrombopoietin (hTPO), wie es durch Seq. ID-Nr 30 beschrieben wird, das wenigstens eine zusätzliche N-verknüpfte Glycosylierungs-Stelle aufweist und das gewählt ist aus der Gruppe, die umfasst: [Asn¹⁴]-hTPO[Asn¹⁹³]-hTPO[Asn¹⁰⁸, Asn¹¹⁷, Asn¹⁶⁴]-hTPO und [Asn¹⁵⁷, Asn¹⁶⁴]-hTPO.
Zur Entwicklung neuer hTPO-Derivate mit erhöhter Aktivität im Induzieren der Blutplättchen-Produktion in vivo wurde eine Vielzahl von hTPO-Derivaten hergestellt, in die eine oder mehrere Zucker-Ketten dadurch eingeführt wurden, dass man eine oder mehrere Aminosäuren substituierend an speziellen Positionen in einem hTPO-Protein einsetzte. Im Ergebnis wird eine N-verknüpfte Glycosylierungs-Stelle „Asn-X-Ser/Thr" (worin X für jede beliebige Aminosäure außer Prolin steht) an den speziellen Positionen geschaffen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde eine Site-spezifische (hinsichtlich der Stelle spezifische) Mutagenese unter Anwendung überlappender PCR (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Soc. USA 91: 5695 (1994)) zur Herstellung der Gene angewendet, die für hTPO-Derivate kodieren, in denen spezifische Aminosäuren an einer speziellen Position substitutionsmäßig eingesetzt sind (siehe 1).
Zuerst wurden die folgenden Primer-Paare, die mutierte Sequenzen enthalten, chemisch synthetisiert. Diese Oligonukleotid-Primer-Paare enthalten die Nukleotid-Sequenzen, die den mutierten Aminosäure-Resten entsprechen, und sie erstrecken sich auf die in 5'-Position oder 3'-Position gelegene Nachbar-Sequenz des mutierten Bereichs in der hTPO-cDNS.
Tabelle 1 Primer-Paare für eine Site-spezifische Mutagenese
Es wurde eine Überlappungs-PCR durchgeführt, in der der etablierte Vektor pBlue404 (Koreanische Anmeldung Nr. 97-7512), der eine hTPO-cDNS enthält, als Matrize verwendet wurde. Einerseits wurden das Oligonukleotid (Seq. ID-Nr. 1), das für das hTPO-Signal-Peptid kodiert, und eines der Oligonukleotide (N-Primer-Reihe in Tabelle 1), die für mutierte Sequenzen kodieren, als PCR-Primer verwendet. Andererseits wurde das Oligonukleotid (Seq. ID-Nr. 2), das den C-terminalen ORF von hTPO und das Stop-Codon enthält, und eines der Oligonukleotide (C-Primer-Reihe in Tabelle 1), das für mutierte Sequenzen kodiert, als PCR-Primer verwendet.
Die Überlappungs-PCR-Produkte enthalten die DNS-Sequenz, die von der N-terminalen Signal-Sequenz zum mutierten Bereich reichen, und die DNS-Sequenzen, die vom mutierten Bereich bis zum C-terminalen Bereich reichen.
Zum Erhalt der hTPO-cDNS-Sequenz voller Länge, die die Target-Stelle für eine Aminosäure-Substitution enthält, wurde eine PCR durchgeführt, in der die beiden Überlappungs-PCR-Produkte als Matrize verwendet wurden und zwei Oligonukleotide (Seq. ID-Nr. 1 und Nr. 2) als PCR-Primer verwendet wurden.
Durch die vorgenannten Prozesse wurden 1.078 Basen-Paare umfassende cDNS-Sequenzen voller Länge, die für hTPO-Derivate kodierten, hergestellt, die eine Vielzahl mutierter Sequenzen enthielten (siehe 1).
In einer weiteren Ausführungsform wurden Vektoren, die cDNSs für hTPO-Derivate enthielten, konstruiert, um die Expressions-Vektoren zu erhalten, die die cDNSs enthalten, und um letztendlich Zell-Linien zu produzieren, die mit den Expressions-Vektoren transfektiert sind.
Insbesondere wurden der etablierte Vektor pBlueBac4 und jede cDNS, die für ein hTPO-Derivat kodierte, mit den Restriktions-Enzymen BglII und EcoRI verdaut. Danach wurden die beiden DNS-Fragmente mit T4-DNS-Ligase verknüpft und so Vektoren konstruiert, die die cDNS des hTPO-Derivats enthalten (siehe 2).
Die resultierenden Vektoren sind in Tabelle 2 veranschaulicht, die die Namen der Vektoren, die mutierten Sequenzen, die für hTPO-Derivate kodieren, und die Aminosäure-Reste angibt, die in Übereinstimmung mit der Mutation modifiziert wurden.
Die Aminosäure-Sequenzen von hTPO-Derivaten gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch ein Verfahren wiedergegeben, in dem sie mit dem substitutionsmäßig eingesetzten Aminosäure-Rest und einer speziellen Position in der Aminosäure-Sequenz von nativem hTPO beschrieben werden (Seq. ID-Nr. 30). Beispielsweise kann ein hTPO-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung, nämlich das Derivat 40430, auch bezeichnet werden als „[Asn¹⁰⁸]-hTPO", das der Aminosäure-Sequenz entspricht, die durch Seq. ID-Nr. 30 beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass Asparagin substitutionsmäßig anstelle des Aminosäure-Restes 108 eingesetzt wurde.
Tabelle 2 Die substituierte Aminosäure und die Nukleotid-Sequenzen in den Vektoren, die cDNSs von hTPO-Derivaten enthalten
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wurden die Expressions-Vektoren, die die cDNS-Sequenzen von hTPO-Derivaten enthalten, konstruiert, um in Tier-Zellen eingeführt zu werden.
Spezifisch wurde ein pCDT-Vektor hergestellt durch Insertion von cDNS für natives hTPO in den etablierten Vektor pCDNA3.1. Der Vektor pCDT sowie die Vektoren, die Gene für hTPO-Derivate enthalten, wie beispielsweise pBlue29, pBlue30, pBlue31, pBlue32, pBlue33, pBlue34, pBlue58, pBlue59, pBlue60, pBlue61, pBlue62 und pBlue63, wurden verdaut mit den Enzymen NheI und EcoRI. Danach wurden diese Fragmente mit T4-DNS-Ligase verknüpft und so tierische Expressions-Vektoren erhalten, die jeweils ein Gen für ein hTPO-Derivat enthalten (siehe 3 und Tabelle).
Tabelle 3 Die substitutionsmäßig eingesetzte Aminosäure und die Nukleotid-Sequenzen in tierischen Expressions-Vektoren, die cDNSs für hTPO-Derivate enthalten
Der Umfang der vorliegenden Erfindung schließt nicht nur DNS-Sequenzen von Tabelle 3 ein, sondern auch andere DNS-Sequenzen, die den Aminosäure-Sequenzen von Tabelle 3 entsprechen, basierend auf der Degeneration des genetischen Codes. Mit anderen Worten: Alle DNS-Sequenzen, die für hTPO-Derivate kodieren, die die modifizierten Aminosäuren von Tabelle 3 enthalten, können als Mutanten-hTPO-Gen verwendet werden.
Beispielsweise schließt ein hTPO-Derivat, das von einem Expressions-Vektor p40433 hergestellt werden kann, ein Polypeptid [Asn¹⁶⁴]-hTPO ein, das kodiert werden kann nicht nur durch die DNS-Sequenz von Seq. ID-Nr. 31, sondern auch durch degenerierte DNS-Sequenzen.
Um die Insertion von mutierten Sequenzen in den Vektor zu bestätigen, kann das DNS-Sequenzieren von PCR-Produkten verwendet werden. Alternativ kann dann, wenn die Überlappungs-PCR-Primer dafür ausgelegt sind, eine neue Restriktions-Stelle zu enthalten oder eine Restriktions-Stelle im Wild-Typ zu streichen, die Restriktions-Mappe des Vektors zur Untersuchung einer Mutagenese verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Expressions-Vektor p40433 eine mutierte Sequenz ACACGT anstelle der Sequenz GAACCT im Wild-Typ aufweist, wird eine AflIII-Restriktions-Stelle in dem Vektor p40433 geschaffen. Damit kann die Verdauung des Vektors p40433 mit AflIII zur Bestätigung in der Einführung mutierter Sequenzen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden hTPO-Derivate mit zwei oder mehr Aminosäure-Modifikationen unter Verwendung der Expressions-Vektoren produziert, um weitere Zucker-Ketten an die modifizierte Aminosäure von nativem hTPO zu binden.
Besonders wurden zwei Arten der Expressions-Vektoren mit passenden Restriktions-Enzymen verdaut, und danach wurden die resultierenden Fragmente in den pCDT-Vektor subkloniert und so Expressions-Vektoren konstruiert, die die Gene für hTPO-Derivate mit zwei oder drei modifizierten Regionen enthalten. Beispielsweise wurde ein Expressions-Vektor p40429 mit den Enzymen NheI und BspMI verdaut und so ein DNS-Fragment erhalten, das in die Aminosäure-Substitution Arg¹¹⁷ → Asn¹¹⁷ involviert ist. Darüber hinaus wurde ein Expressions-Vektor p40431 mit den Enzymen BspMI und Bsu36I verdaut und so ein DNS-Fragment erhalten, das in die Aminosäure-Substitution Gly¹⁴⁷ → Asn¹⁴⁷ involviert ist. Die resultierenden beiden DNS-Fragmente wurden in die BspMI-Bsu36I-Stelle des pCDT-Vektors insertiert und damit ein Expressions-Vektor p40435 konstruiert, der eine DNS-Sequenz enthielt, die für hTPO mit zwei Aminosäure-Substitutionen kodiert, nämlich Arg¹¹⁷ → Asn¹¹⁷ und Gly¹⁴⁷ → Asn¹⁴⁷. In Übereinstimmung mit dieser Verfahrensweise wurden Expressions-Vektoren wie beispielsweise p40436, p40437, p40438, p40439, p40446, p40447, p40448 und p40449 konstruiert (siehe Tabelle 3).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurden Tier-Zellen-Transformanten, die jedes hTPO-Derivat exprimieren, hergestellt.
Speziell wurden die Expressions-Vektoren in eine Tier-Zell-Linie mit der Bezeichnung CHO/K-1 durch das Lipofectamin-Verfahren transfektiert und so eine Tier-Zell-Linie hergestellt, die jedes hTPO-Derivat exprimiert.
Gemäß dem Namen des eingeführten Expressions-Vektors wurden die transfektierten Linien bezeichnet mit CHO K-1/p40429, CHO K-1/p40430, CHO K-1/p40431, CHO K-1/p40432 usw., und die Zell-Lnie CHO K-1/p40433 wurde hinterlegt in der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) unter der Zugangsnummer KCTC 0495BP am 17. Juni 1998.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurden hTPO-Derivate hergestellt durch Züchten bzw. Kultivieren von Tier-Zell-Linien, die mit dem Expressions-Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transfektiert waren.
Speziell wurden die transfektierten Linien in einem Serum enthaltenden Medium im großen Maßstab in Subkultur gezüchtet und dann in ein Sekretions-Medium überführt. Das kultivierte Medium wurde konzentriert und dialysiert, und so wurden hTPO-Derivate erhalten.
Ein hTPO-Derivat, das von der Zell-Linie CHO K-1/p40433 isoliert wurde, ist das Polypeptid [Asn¹⁶⁴]-hTPO, in dem ein Asparagin-Rest substitutionsmäßig anstelle des Rests Arginin¹⁶⁴ in der nativen hTPO-Sequenz eingesetzt wurde.
Ein hTPO-Derivat, das von der Zell-Linie CHO K-1/p40434 isoliert wurde, ist das Polypeptid [Asn¹⁹³]-hTPO, in dem Asn substitutionsmäßig anstelle des Threonin¹⁹³-Restes in einer nativen hTPO-Sequenz ersetzt wurde.
Ein hTPO-Derivat, das von der Zell-Linie CHO K-1/p40449 isoliert wurde, ist das Polypeptid [Asn¹⁰⁶, Asn¹¹⁷, Asn¹⁶⁴]-hTPO, in dem ein Arginin-Rest jeweils substitutionsmäßig anstelle der Reste Leucin¹⁰⁶, Arginin¹¹⁷ und Arginin¹⁶⁴ in einer nativen hTPO-Sequenz ersetzt wurde.
Ein hTPO-Derivat, das von der Zell-Linie CHO K-1/p40458 isoliert wurde, ist das Polypeptid [Asn¹⁵⁷, Asn¹⁶⁴]-hTPO, in dem ein Asparagin-Rest substitutionsmäßig anstelle der Reste Prolin¹⁵⁷ und Arginin¹⁶⁴ in einer nativen hTPO-Sequenz ersetzt wurde.
In Übereinstimmung mit den Namen der Expressions-Vektoren wurden die hTPO-Derivate, die in den Tier-Zellen exprimiert wurden, bezeichnet als 40429 bis 40439, 40446, 40447, 40449 und 40458 bis 40463. Ihre in vitro-Aktivitäten wurden geschätzt durch Messen der Proliferation einer Megakaryocyten-Leukämie-Zell-Linie.
Im Ergebnis zeigten Derivate wie beispielsweise 40429, 40430, 040432, 40433, 40434,0 40437, 40438, 40439 und dergleichen höhere Werte der biologischen Aktivität, als dies natives hTPO tut. Es wurde keine signifikante Beziehung zwischen der Zahl zusätzlicher Zucker-Ketten und den in vitro-Aktivitäten beobachtet, da Aktivitäten erhöht oder gesenkt wurden ohne Rücksicht auf die Zahl der eingeführten Zucker-Ketten (siehe 4).
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden hTPO-Derivate an Mäuse verabreicht, und dann wurden die Konzentrationen an Blutplättchen gemessen, um die biologischen in vivo-Aktivitäten der hTPO-Derivate zu untersuchen.
Im einzelnen wurden 8 Wochen alte Mäuse in vier Gruppen nach ihrem Gewicht unterteilt, und dann wurde eine vorbestimmte Konzentration an hTPO subkutan an die Mäuse verabreicht. Nach der Verabreichung wurde Blut von peripheren Gefäßen der Mäuse abgenommen, und es wurden die Blutplättchen-Konzentrationen im Blut gemessen. Zwar wurde gefunden, dass die meisten Derivate geringere Blutplättchen-Konzentrationen zeigten als dies natives hTPO tat, aber es wurde gefunden, dass die Derivate 40433, 40434, 40449 und 40458 Blutplättchen in ähnlichen oder höheren Wirkungsgraden produzierten (siehe 6, 7a oder 7b).
Diese Ergebnisse legten nahe, dass eine hTPO-Aktivität in vivo nicht von der Zahl eingeführter Zucker-Ketten abhängig ist, sondern von der speziellen Position von Zucker-Ketten. Mit anderen Worten: Um die in vivo-Aktivität von hTPO zu erhöhen, sollten Zucker-Ketten in spezielle Positionen in hTPO eingeführt werden, wie beispielsweise Aminosäure 164, Aminosäure 193 usw.
Höchst bemerkenswert waren Blutplättchen-Konzentrationen in der mit der Zell-Linie 40433 behandelten Gruppe höher als in der mit nativen hTPO behandelten Gruppe, und zwar für 2 Tage von Tag 3 oder 4 nach einer Verabreichung, was demonstriert, dass 40433 als therapeutisches Mittel für Thrombocytopenie verwendet werden kann. Die Maximal-Blutplättchen-Konzentrationen in mit 40433 behandelten Mäusen wurden am Tag 5 nach Verabreichung beobachtet, als ein Wert von 134% der Aktivität von nativem hTPO am Tag 5 erreicht wurde, und mehr als 180% insgesamt.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurden in vivo-hTPO-Aktivitäten in gereinigten hTPO-Derivaten untersucht, die dieselben oder höhere Blutplättchen-Konzentrationen produziert hatten als natives hTPO. Um dies zu tun, wurden dhfr-Expressions-Vektoren, die Gene für hTPO-Derivate enthielten, konstruiert, und die resultierenden Vektoren wurden zur Herstellung von Zell-Linien verwendet, die hTPO-Gene effizient exprimieren.
Insbesondere wurde ein BamHI-Linker mit dem PvuII-SphI-Fragment eines pSV2-dhfr-Vektors verbunden, der ein dhfr-Gen enthielt. Dieses DNS-Fragment mit 1.710 bp, das das dhfr-Gen enthielt, wurde in pCDT insertiert und so ein dhfr-Expressions-Vektor-pDCT hergestellt, der das Gen für natives hTPO enthielt. Danach wurden die Gene für hTPO-Derivate in pDCT anstelle des Gens für natives hTPO insertiert und so die dhfr-Expressions-Vektoren pD40433, pD40434, pD40449 und pD40458 konstruiert (siehe 8).
Die dhfr-Expressions-Vektoren, die hTPO-Derivat-Gene enthielten, können leicht in dem Genom von transfektierten Eukaryonten-Zellen amplifiziert werden durch Anlegen von Unterkulturen der Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wurden diese Vektoren in die Tier-Zell-Linie CHO/dhfr(-) transfektiert. Die neuen transfektierten Zell-Linien wurden bezeichnet als CHO dhfr-/p40433, CHO dhfr-/pD40434, CHO dhfr-/pD40449 bzw. CHO dhfr-/p40458. Die Zell-Linien CHO dhfr-/pD40434, CHO dhfr-/pD40449 und CHO dhfr-/pD40458 wurden bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) am 8. Juni 1999 hinterlegt (Zugangsnummer: KCTC 0630BP, KCTC 0631BP, KCTC 0632BP). Andere dhfr-Vektoren, die hTPO-Derivat-Gene enthalten, und damit transfektierte Zell-Linien können nach derselben Verfahrensweise erhalten werden.
Die transfektierten Zell-Linien können in großem Maßstab gezüchtet bzw. kultiviert werden, und hTPO-Derivate können in Übereinstimmung mit etablierten Verfahrensweisen gereinigt werden. Verschiedene Säulen-Chromotographie-Verfahren können zum Reinigen von hTPO-Derivaten aus Zell-Linien verwendet werden, die mit dhfr-Expressions-Vektoren transfektiert wurden, die die hTPO-Derivat-Gene enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wurden eine CM-Ionenaustausch-Affinitäts-Säule, eine Phenylsepharose-Säule, eine Hydroxylapatit-Säule usw. verwendet (siehe 9).
Zur Bewertung der biologischen in vivo-Aktivitäten der gereinigten hTPO-Derivate wurden die Blutplättchen-Konzentrationen entsprechend der genannten Verfahrenweise gemessen, nachdem die Derivate an Mäuse verabreicht worden waren. In den mit 40433, 40434, 40449 und 40458 behandelten Gruppen erreichten die Blutplättchen-Ausbeuten 177%, 191%, 126% und 179% derjenigen der mit nativem hTPO behandelten Gruppe für einen Zeitraum von 10 Tagen seit der Verabreichung (siehe 10).
Um die Einführung weiterer Zucker-Ketten in hTPO-Derivate zu bestätigen, wurden SDS-PAGE-Analysen und anschließende Western-Blot-Analysen mit dem gereinigten nativen hTPO und mit den gereinigten hTPO-Derivaten durchgeführt. Im Ergebnis waren die Molekulargewichte bei den Derivaten 40433 und 40434 größer als die von nativen hTPO. Die Molekulargewichte von 40458 mit zwei zusätzlichen Zucker-Ketten und 40449 mit drei zusätzlichen Zucker-Ketten waren proportional erhöht, abhängig von der Zahl von Zucker-Ketten (siehe 11).
Um die Stabilität von hTPO-Derivaten zu untersuchen, wurden natives hTPO und das 40433-Derivat mit Thrombin behandelt, und anschließend wurden die Protein-Banden in Western-Blot-Analysen in Übereinstimmung mit der Verdauungs-Zeit beobachtet. Im Ergebnis war das 40433-Derivat stabiler gegen Verdauung mit Thrombin als natives hTPO (siehe 12). Damit war nahegelegt, dass eine erhöhte Stabilität aufgrund einer Glycosylierung zur Erhöhung einer in vivo-hTPO-Aktivität beitragen kann.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die die hTPO-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, kann hergestellt werden in einem herkömmlichen Verfahren und kann allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Bildungsmitteln, Verdünnungsmitteln usw. formuliert werden. Die Zusammensetzung kann in der Formulierung von Pulvern, Granulaten, Tabletten, Kapseln, Injektionen und dergleichen verwendet werden.
Insbesondere kann die Zusammensetzung verwendet werden in Kombination mit Wasser, Phosphat-Puffer, Extroso-Lösung, Albumin-Lösung, Oxidationsinhibitoren, Dextrin und dergleichen. Vorzugsweise kann sie intravenös oder subkutan verabreicht werden.
Die hTPO-Derivate können verabreicht werden in noch geringerer Dosis als natives hTPO, beispielsweise in einer Dosis im Bereich von etwa 0,01000 μg/kg/Tag.
Die hTPO-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Behandlung von Thrombocytopenie, wie sie durch verschiedene Zustände hervorgerufen wird.
Beispielsweise können sie nützlich sein für die Behandlung von Thrombocytopenie, die verursacht wurde durch eine Verabreichung von Antikrebsmitteln, durch Radiotherapie, eine Knochenmark-Verpflanzung, eine Hepatitis, eine Leber-Zirrhose usw.. Zur Behandlung dieser Krankheiten können die hTPO-Derivate verabreicht werden in Kombination mit Antikrebs-Mitteln wie beispielsweise Adriamycin und Cisplatin sowie hematopoietischen Cytokinen wie beispielsweise IL-3, MCSF, SCF und EPO.
Beispiele
Praktisch anwendbare und derzeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind veranschaulicht, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird.
Jedoch wird erkannt, dass Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich in Anbetracht der vorliegenden Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen durchführen können, die innerhalb des Geistes und Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Beispiel 1
Die PCR-Amplifikation von cDNSs, die für hTPO-Derivate kodieren
Zur Einführung einer Site-spezifischen Mutagenese in das Gen, das für natives hTPO kodiert, wurden 12 Paare von Oligonukleotiden hergestellt wie sie in Tabelle 1 gezeigt sind, die die speziellen Nukleotid-Sequenzen enthielten, die den mutierten Aminosäure-Resten entsprachen.
Der etablierte Vektor pBlue404 (Koreanische Patentanmeldung Nr. 97-7512), der die hTPO-cDNS enthält, wurde als Matrize verwendet, auf der das hTPO-Gen amplifiziert wird.
Im einzelnen wurde eine PCR durchgeführt durch Verwenden von 50 ng pBlue404 als Matrize. Als Primer wurden das Oligonukleotid (Seq. ID-Nr. 1), das die hTPO-Signal-Sequenz enthält, und eines der Antisense-Oligonukleotide verwendet, das die mutierten Sequenzen enthält (N-Primer in Tabelle 1). Die PCR-Reaktionen wurden durchgeführt in 100 μl Gesamt-Volumen, das 4 μl der Primer-Lösung (40 pMolμl) und 1 μl Pfu-Polymerase (Pyrococcus-furiosus-Polymerase) (2,5 u/μl; Firma Stratagene, Katalog-Nr. 600153) enthielt. Der Thermozyklus in der PCR war wie folgt: 90 s bei 94°C für eine Vor-Denaturierung; 35 Amplifikations-Zyklen, umfassend 40 s bei 94°C zur Denaturie rung, 60 s bei 55°C für das Zusammenfügen und 120 s bei 72°C für die Verlängerung; und 5 min bei 72°C für die Nach-Verlängerungs-Phase.
Eine weitere PCR wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit der obigen Reaktion. Als PCR-Primer wurden das Oligonukleotid (Seq. ID-Nr. 2), das den ORF vom C-Terminus und das Stop-Codon von hTPO enthielt, und eines der Sense-Oligonukleotide verwendet, das die mutierten Sequenzen enthielt (C-Primer in Tabelle 1).
In der PCR wurden DNS-Fragmente erhalten, die den Bereich von der N-terminalen hTPO-Signal-Sequenz zu der mutierten Sequenz abdecken, und DNS-Fragmente, die den Bereich von der mutierten Sequenz bis zum hTPO-C-Terminus abdecken.
Die PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese in einem 1%igen Agarose-Gel unterworfen, und dann wurden die DNS-Banden von Interesse mit einem Rasiermesser ausgeschnitten und in 50 μl dreimal destillierten Wassers mit einem QIAEX-II-Kit (Firma Qiagen, Katalog Nr. 20021) eluiert.
Um hTPO-cDNSs voller Länge zu erhalten, die für mutiertes hTPO kodieren, wurde eine PCR in einem Endvolumen von 100 μl durchgeführt, worin zwei Reihen von PCR-Produkten (jeweils 10 ng) als Matrizen und zwei Oligonukleotide (Seq. ID-Nr. 1 und Nr. 2) als Primer verwendet wurden. Der Thermo-Zyklus in der PCR war wie folgt: 90 s bei 94°C zur Vor-Denaturierung; 35 Amplifikations-Zyklen, umfassend 40 s bei 94°C zur Denaturierung, 60 s bei 58°C zum Zusammenfügen und 120 s bei 72°C zur Verlängerung; sowie 5 min bei 72°C für die Nach-Verlängerung.
Die PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarose-Gel unterzogen, und danach wurden die DNS-Banden von 1078 bp Größe in 30 μl dreifach destillierten Wassers in Übereinstimmung mit der Verfahrensweise eluiert.
Zur Herstellung von hTPO-Genen, die zwei oder mehr Bereiche von mutierten DNS-Sequenzen enthalten, wurden vier Paare von Primern (die Primer 58-N und 58-C, 60-N und 60-C und 61-N und 61-C, 63-N und 63-C) in der PCR verwendet. Die cDNSs voller Länge, die mutierte Sequenzen enthielten, wurden in Übereinstimmung mit der Verfahrensweise hergestellt und dann erneut einer Site-spezifischen Mutagenese-Prozedur unterzogen, in der ein Primer-Paar 33-N und 33-C verwendet wurde.
Die modifizierten Aminosäure- und Nukleotid-Sequenzen in den resultierenden cDNSs wurden in Tabelle 2 gezeigt.
Beispiel 2
Die Konstruktion von Säuger-Expressions-Vektoren, die cDNSs von hTPO-Derivaten enthalten, und ihre Expression in CHO-Zellen
(2-1) Konstruktion von Transfer-Vektoren
Die Gene, die für hTPO-Derivate kodieren, die in Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden in einem im Handel erhältlichen Vektor mit der Bezeichnung pBlueBac4 subkloniert (Firma Invitrogen, Katalog Nr. V1995-20), und zwar wie folgt:
Die PCR-Produkte, die jedem hTPO-Derivat entsprachen, wurden mit den Enzymen BglII und EcoRI bei 37°C 3 h lang verdaut, und danach wurde ein 1068 bp großes DNS-Fragment von der Reaktionsmischung mittels Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel isoliert. Ein 4771 bp großes DNS-Fragment wurde ebenfalls erhalten von dem Vektor pBlueBac4, der mit den Enyzmen BglII und EcoRI verdaut wurde.
Um für die hTPO-Derivate kodierenden cDNSs in dem pBlueBac4-Vektor zu subklonieren, wurden zwei DNS-Fragmente in einem Mol-Verhältnis von cDNS zu Vektor-DNS-Fragment von 4:1 verbunden, indem man sie mit T4-DNS-Ligase (Firma NEB, Katalog Nr. 2025) bei 16°C 16 h inkubierte. Danach wurden die Ligations-Mischungen verwendet zum Transformieren eines E. coli-Stamms mit der Bezeichnung TOP10F' (Firma Invitrogen, Katalog Nr. C3030-03) mit den resultierenden Transfer-Vektoren zu transformieren. Ein bereits etabliertes Elektroporations-Verfahren wurde zum Erhalt der E. coli-Transformanten verwendet. Nachdem diese Transformanten in 50 ml LB- Medium (10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 10 g NaCl in 1 l Wasser) bei 37°C 18 h lang kultiviert worden waren, wurden die Transfer-Vektoren aus den Kulturen mit einem Wizard-Midiprep-Kit (Firma Promega, Katalog Nr. A7640) erhalten.
Diese hTPO-Derivat-Gene enthaltenden Transfer-Vektoren wurden bezeichnet als pBlue29, pBlue30, pBlue31, pBlue32, pBlue33, pBlue34, pBlue58, pBlue59, pBlue60, pBlue61, pBlue62 und pBlue63 (siehe 2).
(2-2) Konstruktion tierischer Expressions-Vektoren
Um rekombinante tierische Expressions-Vektoren zu konstruieren, die hTPO-Derivat-Gene enthielten, wurde pCDT verwendet, der hergestellt wurde durch Einsetzen des hTPO-Gens des Wild-Typs in einen im Handel erhältlichen Vektor namens pCDNA3.1 (Invitrogen, Katalog Nr. 790-20).
Speziell wurden 5 μg pCDT-Vektor mit den Enzymen EcoRI und NheI bei 37°C 3 h lang verdaut, und danach wurde ein 4958 bp großes DNS-Fragment von der Reaktions-Mischung isoliert durch Laufenlassen des Produkts auf einem 1% Agarose-Gel. Die Transfer-Vektoren von Beispiel 2-1 wurden mit den Enzymen EcoRI und NheI verdaut, und danach wurde 1087 bp großes DNS-Fragment auch von jeder Restriktions-Mischung isoliert.
Um cDNS-Fragmente, die für verschiedene hTPO-Derivate kodieren, in dem pCDT-Vektor zu subklonieren, wurden zwei DNS-Fragmente im Mol-Verhältnis 3:1 gemischt und mit T4-DNS-Ligase (Firma NEB, Katalog Nr. 2025) bei 16°C 18 h lang inkubiert. Danach wurden die Ligations-Mischungen zum Transformieren des E. coli-Stamms TOP10F' (Firma Invitrogen, Katalog Nr. C3030-03) mit den resultierenden Expressions-Vektoren verwendet. Ein bereits etabliertes Elektroporations-Verfahren wurde zum Erhalt der E. coli-Transformanten verwendet (siehe 3). Nachdem diese Transformanten in 50 ml LB-Medium bei 37°C für 18 h kultiviert worden waren, wurden die Expressions-Vektoren von den Kulturen mit einem Wizard-Midiprep-Kit erhalten (Firma Promega, Katalog Nr. A7640). Die tierischen Expressions-Vektoren, die hTPO- Derivat-Gene enthielten, wurden bezeichnet als p40429, p40430, p40431, p40432, p40433, p40434, p40458, p40459, p40460, 40461, p40462 bzw. p40463 (siehe 3). Die isolierte Plasmid-DNS wurde mit den Enzymen NheI, EcoRI, BamHI und Bsu36I verdaut und so die Insertion der cDNSs verifiziert. Die Mutation in den Expressions-Vektoren wurde bestätigt durch Restriktions-Mapping und Sequenzierung. Die Expressions-Vektoren wurden quantitativ nachgewiesen durch DNS-Elektrophorese nach Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)) und wurden zum Tranfektieren einer CHO/K-1 Zell-Linie verwendet.
(2-3) Expression von hTPO-Derivat-Genen in CHO-Zellen
Die Transfektions-Prozedur wurde durchgeführt entsprechend dem Lipofectamin-Verfahren (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. 18324012). Am Tag vor der Transfektion wurden CHO/K-1-Zellen (ATCC CCL-61) in 6-Loch-Mikro-Titer-Platten in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Loch gegeben. Nach 24 h wurden die Zellen einmal mit CHO-S-SFM II-Medium gewaschen (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. 12052-098), und es wurden 0,8 ml frisches Medium der Zellen zugesetzt. Zwischenzeitlich wurden 12 μg jedes Expressions-Vektors in 600 μl CHO-S-SFM II-Medium gegeben, und dies wurde dann mit 600 μl CHO-S-SFM II-Medium gemischt, das 36 μl Lipofectamin enthielt. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert worden war, wurden 200 μl-Aliquots der Mischung pro 1 Loch zu den Zellen in den 6-Loch-Platten gegeben. Danach wurden die Zellen bei 37°C 5 h lang in einer Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, inkubiert. Nach der Zugabe von 1 ml Medium, das 10% FBS enthielt (Firma Gibco-BRL, Katalog-Nr. 16000-036), zu den Zellen wurden diese weiter bei 37°C 24 h lang in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre kultiviert. Das Medium in den Platten wurde durch Ham F-12 ersetzt (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. 11059), das 10% FBS enthielt, und danach wurden die Zellen weiter bei 37°C 72 h lang in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre kultiviert, um eine Kultur in einer vorübergehenden Expression vorzubereiten.
Darüber hinaus wurden, nachdem die Zellen in dem Ham F-12-Medium 48 h lang kultiviert worden waren, die Zellen in einem Loch der 6-Loch-Platten in ein Medium überführt, das 500 μg/ml Zeocin (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. R25001) enthielt, und zwar in Schalen mit einem Durchmesser von 100 mm. Nachdem die Zellen 7 bis 10 Tage kultiviert worden waren, wurden Zeocin-resistente Kolonien durch Betrachten mit einem Mikroskop identifiziert. Ein Klonierungs-Zylinder (Firma Bellco, Katalog Nr. 2090-01010) wurde zum Isolieren von mehr als 12 Kolonien pro ein hTPO-Derivat verwendet. Die Grade der Gen-Expression wurden bestimmt durch ein ELISA-Kit für hTPO (Firma R&D, Katalog Nr. DTP00), und so wurden Zell-Linien, die die höchsten Werte der Expression zeigten, selektiert.
Beispiel 3
Konstruktion von Säuger-Expressions-Vektoren, die hTPO-Derivat cDNSs enthalten, mit zwei oder mehr modifizierten Bereichen, und ihre Expression in CHO-Zellen
Zur Produktion von hTPO-Derivaten mit zwei oder mehr modifizierten Aminosäure-Bereichen wurden Säuger-Expressions-Vektoren von Beispiel 2 untersucht.
Um den Vektor p40435 zu konstruieren, wurde der Expressions-Vektor p40429 mit den Enzymen NheI und BspMI verdaut und so ein 494 bp großes DNS-Fragment isoliert, das für eine ersetzte Aminosäure kodierte (Arg¹¹⁷ zu Asn¹¹⁷). Ein weiterer Expressions-Vektor p40431 wurde mit den Enzymen BspMI und Bsu36I zerschnitten und danach ein 355 bp großes DNS-Fragment isoliert, das für eine ersetzte Aminosäure kodierte (Gly¹⁴⁷ zu Asn¹⁴⁷). Weiter wurde ein tierischer Expressions-Vektor pCDT, der hTPO-cDNS enthielt, mit den Enzymen NheI und Bsu36I verdaut. Die Fragmente von p40429 und p40431 wurden in das Fragment von pCDT insertiert und so der tierische Expressions-Vektor p40435 konstruiert, der eine cDNS enthält, die für das hTPO-Derivat mit zwei modifizierten Bereichen kodiert (Arg¹¹⁷ zu Asn¹¹⁷ und Gly¹⁴⁷ zu Asn¹⁴⁷).
Ein weiterer Expressions-Vektor p40436 ist mit den beiden Aminosäure-Substitutionen verbunden (Arg¹¹⁷ zu Asn¹¹⁷ und Arg¹⁶⁴ zu Asn¹⁶⁴) und wurde hergestellt durch Einsetzen des 494 bp großen Fragments von p40429 und des 593 bp großen BspMI-EcoRI-Fragments p40433 in pCDT.
Expressions-Vektoren wie die Vektoren p40437, p40438 und p40439 wurden hergestellt in Übereinstimmung mit der oben beschriebenen Verfahrensweise, wobei zwei DNS-Fragmente, die für ersatzweise eingeführte Aminosäuren kodieren, in dem entsprechenden Vektor isoliert wurden und in den Expressions-Vektor pCDT eingesetzt wurden (siehe Tabelle 3).
Andere Expressions-Vektoren wie beispielsweise die Vektoren p40446, p40447 oder p40449 wurden hergestellt nach einer Verfahrensweise, in der drei DNS-Fragmente, die für ersatzweise eingeführte Aminosäuren kodieren, von dem entsprechenden Vektor isoliert wurden und in pCDT insertiert wurden (siehe Tabelle 3).
Diese hier erhaltenen acht Vektoren wurden in 6-Loch-Platten in CHO/K-1-Zellen transfektiert. Entsprechend der Verfahrensweise von Beispiel 2 wurden Kulturen für eine vorübergehende Expression hergestellt, und Zeocin-resistente Kolonien wurden entsprechend isoliert.
Beispiel 4
Schätzung von in vitro-Aktivitäten von hTPO-Derivaten: M-07e-Zell-Proliferations-Assay
Zur Herstellung von hTPO-Derivaten wurden die transfektierten Zell-Linien von Beispiel 2 und 3 in einer Cell Factory (Firma Nunc, Katalog Nr. 170009) im 10-Liter Maßstab kultiviert. Jede Gruppe von transfektierten Zellen (5 × 10⁴ Zellen/ml) wurde in Cell Factory überführt, die Ham F-12-Medium enthielt, das mit 10% FBS supplementiert war. Nach Kultivieren für 72 h wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und danach in ExCell-Medium (Firma JRH, Katalog Nr. 14311-10L) kultiviert. Nachdem die Zellen weiter bei 37°C für 96 h in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert worden waren, wurden Überstandsflüssigkeiten von der Kultur erhalten. Die Überstandsflüssigekeiten wurden zuerst mit einer Pelicon-Membran (Firma Milipore, Katalog Nr. 41PEL60) und als zweites mit einer Minitan-Membran (Firma Milipore, Katalog Nr. 80EL004) konzentriert. Nach dem Konzentrieren wurde jede Probe einer Dialyse in 1 × TNT-Puffer (10 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,01% Tween 20, pH 7,4) bei 4°C für 30 h unterzogen, gefolgt von einem dritten Konzentrations-Schritt mit Ultrafree (Firma Millipore, Katalog Nr. UFV2BGC10). Die Proben wurden quantitativ mit einem ELISA-Kit dreimal untersucht.
Die Megakaryocyten-Leukämie-Zell-Linie M-07e wurde in RPMI1640-Medium gehalten (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. 22400-089), das mit GM-CSF (100 μ/ml) und 10% FBS supplementiert war.
Um die Aktivität abzuschätzen, wurde ein Assay-Medium (RPM 1640, supplementiert mit 5% FBS) hergestellt, und die M-07e-Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und danach dreimal mit RPMI1640 gewaschen. Die Zellen wurden in dem Assay-Medium resuspendiert, und ihre Konzentration wurde in einem T-75-Kolben auf 8 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt, und die Proben wurden 24 h lang in einer Atmosphäre mit einem Anteil von 5% CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden erneut gewonnen, und ihre Konzentration wurde auf 1 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt. 100 μl Aliquots der Zell-Suspension wurden in 96-Loch-Platten gegeben. In acht Schritten abgestufte Konzentrationen (100,0 bis etwa 0,78125 ng/ml) an Standard-Material (rhTPO, 25 μg) wurden durch Serien-Verdünnung mit RPMI1640-Medium hergestellt, und von CHO-Zellen abgeleitetes natives hTPO wurde als Kontrolle verwendet. Insgesamt wurden 11 Spezies von hTPO-Derivaten (von 40429 bis 40439) in einer Konzentration von 1,5625, 6,25 und 25 ng/ml hergestellt. Ein 100 μl-Aliquot jeder Probe pro Loch wurde zugesetzt, wodurch die Menge auf 200 μl/Loch eingestellt wurde. Nach Inkubieren für 20 h in einer Atmosphäre mit einem Gehalt von 5% CO₂ wurden die Zellen mit 1 μCi (37 kBq) ³H-Thymidin versetzt und weiter 4 h lang inkubiert. Danach wurden die Zellen unter Ver wendung eines Zell-Ernters gewonnen, der mit einem Glasfaser-Filter ausgestattet war, das mit PBS sieben Mal gewaschen wurde.
Die Filter, in denen Zellen gewonnen wurden, wurden – jeweils eins für sich allein – in Zell-Röhrchen gegeben, und die ³H-Radioaktivitäten, die von jeder Probe emittiert wurden, wurden mit einem Flüssigkeits-Scintillations-Counter gemessen. Eine Riasmart-Software wurde zum Berechnen der halb-maximalen Konzentration von Standards, Kontrollproben und Proben verwendet.
Alle Derivate zeigten ähnliche Muster der Aktivität, die eine M-07e-Zell-Proliferation stimulierten. Bei der Konzentration von 25 ng/ml zeigten 8 Spezies der Derivate 40429, 40430, 40432, 40433, 40434, 40437, 40438 und 40439 ähnlich oder höhere Aktivitäten, als sie natives hTPO zeigte. Ihre Aktivitäten nahmen Werte von 117, 135, 120, 131, 97, 121, 166 und 133% der Aktivität von nativem hTPO (siehe 4) an.
Beispiel 5
In vivo-Aktivitäten von hTPO-Derivaten, die von CHO-Zellen isoliert wurden
Ein in vivo-hTPO-Assay wurde durchgeführt, in dem die Blutplättchen-Konzentrationen in Mäusen bestimmt wurden, die mit verschiedenen hTPO-Derivaten gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt worden waren, und die 6, 7a und 7b zeigen die Ergebnisse. Sieben Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse (Firma Charles River, Japan) wurden in einem Konditionierungs-Raum für eine Woche an bestimmte Verhältnisse angepasst (24 ± 1°C; 55% relative Feuchtigkeit; Beleuchtung 12 h von 7:00 bis 19:00 Uhr). Die acht Wochen alten Mäuse wurden dem Test zugeführt und wurden während des Tests in dem Domestizierungsraum gehalten.
Die Mäuse wurden zufalls-orientiert in zwei Gruppen geteilt, die jeweils 5 Mäuse umfassten, und zwar auf der Basis ihrer Gewichte. Die Gruppen wurden speziell eingeteilt als Gruppe, die nur mit Medium behandelt wurde, Gruppe, die mit nativem hTPO be handelt wurde, Gruppe, die mit dem jeweiligen hTPO-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt wurde, oder Gruppe, die nicht behandelt wurde.
Verschiedene hTPO-Derivate (36 μg/kg oder 10 μg/kg) wurden subkutan an die Mäuse in einer einzigen Injektion verabreicht, und Blut-Proben der Mäuse wurden jeden Tag abgenommen, und zwar vom Tag 0 (Tag der Injektion) bis zum Tag 10. Proben wurden gewonnen von der abdominalen Vena Cava innerhalb von 24 h nach der Verabreichung. Vollblut in einem mit EDTA behandelten Röhren wurde in ein automatisches Hemocytometer eingesetzt (Firma Abbott, Celldyn 3500), durch das Blutplättchen-Konzentrationen in den Proben gemessen wurden. Die Ergebnisse wurden präsentiert in „Mittelwert ± Standard-Abweichung".
Am Tag 3 stimulierte natives hTPO eine Erhöhung der Blutplättchen-Konzentration. Die Blutplättchen-Konzentration erreichte ein Maximum am Tag 5 und kam zu einem Normal-Wert am Tag 10. Es wurde gefunden, dass alle Derivate an Erhöhung der Blutplättchen-Konzentration stimulierten, und die Derivate 40433, 40434, 40449 und 40458 produzierten gleiche oder höhere Blutplättchen-Konzentrationen als dies natives hTPO tat. Speziell zeigte die Probe 40433 eine etwa 34% höhere maximale in vivo-Aktivität der Blutplättchen-Produktion am Tag 5 als natives hTPO, und 80% oder mehr insgesamt.
Vergleichsbeispiel 1
In vivo-Aktivität von nativem hTPO
5 zeigt die Blutplättchen-Konzentration in einer Maus, die mit nativem hTPO behandelt wurde, das von tierischen Zellen abgeleitet war. Sieben Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse (Firma Charles River, Japan) wurden in einem Konditionierungsraum den dort herrschenden Verhältnissen im Verlauf einer Woche angepasst (24 ± 1°C, 55% relative Feuchtigkeit; Beleuchtung für 12 h, nämlich von 7:00 bis 19:00 Uhr). Die acht Wochen alten Mäuse wurden dem Test zugeführt und in dem Domestizierungsraum während des Tests gehalten.
Die Mäuse wurden nach statistischen Gesichtspunkten in zwei Gruppen geteilt, die jeweils fünf Mäuse umfassten, und zwar auf der Basis der Gewichte. Die Gruppen wurden speziell eingeteilt als Gruppe, die nur mit Medium behandelt wurde, Gruppe, die mit nativem hTPO behandelt wurde oder Gruppe, die nicht behandelt wurde. Verschiedene Konzentrationen (1, 5 und 10 μg/kg) an nativem hTPO wurden in einer einzigen Injektion subkutan verabreicht, und Blutproben der Mäuse wurden am Tag 4, 8 und 10 abgenommen (wobei Tag 1 der Tag der Injektion war). Die Proben wurden von der abdominalen Vena Cava innerhalb von 24 h nach der Verabreichung abgenommen. Vollblut in mit EDTA behandelten Röhrchen wurde in ein automatisches Hemocytometer eingesetzt (Firma Abbott, Celldyn 3500), durch das Blutplättchen-Konzentrationen in Proben gemessen wurden. Die Ergebnisse wurden präsentiert als „Mittelwert ± Standard-Abweichung". Natives hTPO stimulierte eine Erhöhung der Blutplättchen-Konzentration vom Tag 4 an. Die Blutplättchen-Konzentration erreichte ein Maximum am Tag 8 und kam auf 80% des Maximal-Werts an Tag 10 herunter.
Beispiel 6
Konstruktion von dhfr-Expressions-Vektoren, die cDNSs für hTPO-Derivate enthalten, und Selektion von Säuger-Zell-Linien, die diese exprimieren
(6-1) Konstruktion von dhfr-Expressions-Vektoren, die cDNSs für hTPO-Derivate enthalten
Entsprechend dem Ergebnis von Beispiel 5 wurden dhfr-Expressions-Vektoren konstruiert, die den Derivaten 40433, 40434, 40449 und 40458 entsprachen.
Zuerst wurde ein BamHI-Linker in pSV-dhfr (ATCC 37146) eingesetzt, der ein dhfr-Gen enthielt. Zur Herstellung des BamHI-Linkers wurden zwei Oligonukleotide (Seq. ID-Nr. 27 und Nr. 28) phosphoryliert und dann miteinander verbunden unter Hybridisierung miteinander. Insbesondere wurde T4-Polynukleotid-Kinase (Firma NEB, Katalog Nr. 2015) in der Phosphorylierungs-Reaktion bei 38°C für 3 h verwendet. In der Zusammenfügungs-Reaktion wurden die äquimolaren Oligonukleotide gemischt und für 2 min bei 94°C behandelt; danach wurde die Mischung schrittweise herunter gekühlt von 65°C auf 37°C, wobei die Temperatur um 0,2°C pro 30 s sank. Der Vektor pSV2-dhfr wurde restriktionsmäßig mit den Enzymen PvuII und SphI behandelt, und danach wurde der BamHI-Linker mit dem Fragment von pSV2-dhfr verbunden. Der resultierende Vektor wurde mit dem Enzym BamHI verdaut, um das 1710 bp große Fragment herzustellen, das das dhfr-Gen enthielt. Nachdem der Expressions-Vektor pCDT, der das hTPO-Gen des Wild-Typs enthielt, mit dem Enzym BglII verdaut worden war, wurde das 1710 bp große Fragment in den Vektor pCDT insertiert. Der resultierende dhfr-Expressions-Vektor, der natives hTPO exprimierte, wurde mit „pDCT" bezeichnet (siehe 8).
Zu den dhfr-Expressions-Vektoren, die den 5 Derivaten entsprachen, wurden zwei Oligonukleotide (Seq. ID-Nr. 29 und Nr. 2) als PCR-Primer zugesetzt. Unter Ausnahme der Primer wurde die PCR unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Amplifizierte DNS-Sequenzen, die für hTPO-Derivate kodierten, wurden mit den Enzymen KpnI und EcoRI geschnitten und danach in die KpnI-EcoRI-Stelle des pDCT-Vektors insertiert. Die resultierenden Vektoren wurden bezeichnet als pD40433, pD40434, pD40449 bzw. pD40458.
(6-2) Transfektion in eine CHO/dhfr(-)-Zell-Linie und Gen-Amplifikation
Die dhfr-Expressions-Vektoren von Beispiel 6-1 wurden in die Tier-Zell-Linie CHO/dhfr(-) transfektiert (ATCC CRL-9096), und zwar entsprechend den Transfektions-Verfahren von Beispiel 2. Das IMDM-Medium (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. 12200-036) wurde für die Transfektion verwendet, und IMDM-Medium, das mit 10% dialysierten FBS supplementiert war (Firma Gibco-BRL, Katalog Nr. 26300-061) wurde für die anschließende Kultur verwendet.
Zum Selektieren transformierter Linien wurden die Zellen in 96-Loch-Mikro-Titer-Platten gegeben (1 × 10⁶ Zellen pro Loch), und zwar 48 h nach der Transfektion, und wurden für 10 bis 14 Tage in Medium kultiviert, das 500 μg/ml Zeocin enthielt. Zeocin resistente Kolonien wurden isoliert, und die 10 bis 20 Zell-Linien, die höhere Expressions-Grade produzierten, wurden durch quantitative ELISA-Bestimmung selektiert.
Die selektierten Zell-Linien wurden in Medium sukultiviert, das 20 nM MTX (Methotrexate, Firma Sigma, Katalog Nr. M8407) enthielt, um das hTPO-Gen zu amplifizieren. Im einzelnen wurden die Zellen in einen T25-Kolben kultiviert, bis der Kolben mit den Zellen gesättigt war. Ein Fünftel der gesättigten Zellen wurde subkultiviert, danach schrittweise 1/10 und 1/15. Die Amplifikation endete, sobald der T25-Kolben mit Zellen gesättigt war, und zwar 3 bis 4 Tage nach der 1/15-Subkultur. Die Zellen, die die höchsten Expressions-Werte produzierten, wurden durch ELISA von amplifizierten Zell-Linien in 20 nM MTX selektiert. Die Zell-Linien wurden verwendet, um Proben für einen in vivo-hTPO-Assay herzustellen.
Beispiel 7
Expression von nativem hTPO und Derivaten davon in CHO/dhfr(-)-Zellen und ihre Reinigung
Zur Herstellung von nativem hTPO und seinen Derivaten wurden die Zell-Linien von Beispiel 6 in einer Cell Factory (Firma Nunc, Katalog Nr. 170069) im 4-Liter-Maßstab kultiviert. Jede Zell-Linie (5 × 10⁴ Zellen/ml) wurde in eine Cell Factory überführt, die IMDM-Medium enthielt, das mit 10% FBS supplementiert war. Nach Kultivieren für 72 h wurden die Zellen einmal mit PBs gewaschen und anschließend in DMEM-Ham F-12-Medium kultiviert. Nachdem die Zellen weiter bei 37°C für 96 h in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre kultiviert worden waren, wurden Überstands-Flüssigkeiten, die von der Kultur erhalten worden waren, Reinigungsschritten unterworfen.
Nachdem eine XK26/20-Säule (Firma Amersham-Pharmacia, Katalog Nr. 18-1000-72) mit 50 ml Harz mit der Bezeichnung CM Affi-Gel blue (Firma Bio-Rad, Katalog Nr. 153-7304) gefüllt worden war, wurde die Säule über Nacht mit Puffer A gewaschen (10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4). 4 l der Kultur-Überstands-Flüssigkeiten wurden auf die Säule geladen und durch diese hindurch geführt, und zwar mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml/min, und das Eluat wurde durch Spektrophotometrie bei der UV-Wellenlänge 280 nm überwacht. Nachdem die gesamte Kultur-Überstands-Flüssigkeit durch die Säule geschickt worden war, wurde die Säule mit Puffer B gewaschen (10 mM Natriumphosphat, 2 M Harnstoff, pH 7,4), bis die UV-Absorption auf einen Basal-Wert abfiel. Auf der Säule gebundene Proteine einschließlich hTPO wurden mit Puffer C eluiert (10 mM Natriumphosphat, 2 M Harnstoff, 1 M Natriumchlorid, pH-Wert: 7,4), und diese Fraktion wurde einer anschließenden Phenylsepharose-Säulen-Chromatographie unterzogen. Eine XK26/20-Säule wurde gefüllt mit 50 ml Phenylsepharose CL4B-Harz (Firma Sigma, Katalog Nr. P7892), und die Säule wurde danach mit Puffer C über Nacht gewaschen. Die von der CM Affi-Gel blue-Säule eluierte Fraktion wurde auf die Phenylsepharose-Säule aufgebracht und durch diese mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min strömen lassen, und das Eluat wurde mittels Spektrophotometrie bei der UV-Wellenlänge von 280 nm überwacht. Nachdem die gesamte Kultur-Überstands-Flüssigkeit durch die Säule gegeben worden war, wurde die Säule mit Puffer C gewaschen, bis die UV-Absorption auf einen Basal-Wert abfiel. An das Harz gebundene Proteine wurden mit Puffer B eluiert, und diese Fraktion wurde einer anschließenden Hydroxylapatit-Säulen-Chromatographie unterzogen. Eine XK16/20-Säule (Firma Amersham-Pharmacia, Katalog Nr. 18-8773-01) wurde mit 10 ml Hydroxylapatit-Harz gefüllt (Firma Bio-Rad, Katalog Nr. 130-0420) und wurde mit Puffer D über Nacht gewaschen (10 mM Natriumphosphat, 2 M Harnstoff, pH 6,8). Die von der Phenylsepharose-Säule eluierte Fraktion wurde auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt, und zwar mit 5 N HCl, und wurde dann auf die Hydroxylapatit-Säule aufgebracht und durch diese mit einer Strömungsrate von 3 ml/min hindurch geführt. Da hTPO nicht an ein Hydroxylapatit-Harz gebunden wird, wurde die ungebundene Fraktion aufgehoben. Die Säule wurde mit Puffer D gewaschen, bis die UV-Absorption auf einen Basal-Wert abfiel. Danach wurden unreine Proteine, die an das Harz gebunden waren, mit Puffer E eluiert (0,5 M Natriumphosphat, 2 M Harnstoff, pH 6,8). Die erhaltene hTPO-Fraktion wurde auf ein 10 ml großes Volumen konzentriert, und zwar unter Verwendung einer Econo-Pac Q-Kartusche (Firma Bio-Rad, Katalog Nr. 732-0021) und wurde dann in 10 mM Natriumphosphat für 24 h dialysiert, um Salze und Harnstoff zu eliminieren. Jede Fraktion in den Reinigungsschritten wurde durch SDS-PAGE visuali siert, sowie durch Silber-Färbung (siehe 9), wobei das Silber-Stain-Plus-Kit (Firma Bio-Rad, Katalog Nr. 161-0449) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
Ein in vivo-hTPO-Assay wurde mit den gereinigten hTPO-Derivaten (Dosis: 10 μg/kg) in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Beispiel 5 durchgeführt. Es wurde gefunden, dass alle Derivate nicht nur eine Erhöhung der Blutplättchen-Konzentration stimulieren, sondern auch höhere Blutplättchen-Konzentrationen produzieren, als dies natives hTPO tat. Insbesondere zeigten die Produkte 40433, 40434, 40449 und 40458 eine um 77%, 91%, 26% bzw. 79% höhere Aktivität für insgesamt 10 Tage nach der Verabreichung als natives hTPO (siehe 10).
Beispiel 8
Charakterisierung von hTPO-Derivaten: Verifizieren der Einführung von Zucker-Ketten und Prüfen der Stabilität von hTPO-Derivaten
Um zu untersuchen, ob weitere Zucker-Ketten in die hTPO-Derivate eingeführt wurden, wurden SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen durchgeführt. Wenn Zucker-Ketten eingeführt werden, sind die Molekulargewichte von hTPO-Derivaten höher als diejenige von nativem hTPO.
Gereinigtes natives hTPO und Derivate davon wurden in Vertiefungen in 10 bis 20% Gradienten-Tricin-Polyacrylamid-Gel gegeben (Firma Novex, Katalog Nr. EC66252), das man bei einer Spannung von 10 V/cm laufen ließ. Nach der Elektrophorese wurden die auf dem Gel fraktionierten Proteine auf ein Nitrocellulose-Filter überführt. Das Filter wurde 1 h lang in TBS (pH 7,5) inkubiert, das 5% kein Fett enthaltende getrocknete Milch enthielt, und wurden dann weiter für 18 h mit einem Ziegen-Anti-hTPO-Antikörper (Polyklonal) inkubiert (Firma R&D System, Katalog Nr. AB-288-NA), der in TBS (1:1.000) verdünnt war. Das Filter wurde anschließend 2 h lang mit einem zweiten Antikörper inkubiert, nämlich an alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Ziegen-IgG (Firma Sigma, Katalog Nr. A4187), verdünnt mit TBS (1:10.000). Das färbende Substrat BCIP/NBT (Firma Sigma, Katalog Nr. B5655) wurde zum Ermitteln der hTPO-Bande verwendet. Im Ergebnis waren die Molekulargewichte der gereinigten hTPO-Derivate schwerer als dasjenige von hTPO, abhängig von der Zahl von eingeführten Zucker-Ketten (11).
Zum Bewerten der Stabilität der hTPO-Derivate wurden natives hTPO und hTPO-Derivat 40433 mit Thrombin verdaut, und danach wurden die Zeit-abhängigen Verdauungsmuster beobachtet. Das hTPO-Derivat (50 μg/ml) wurde mit Thrombin behandelt (5 Einheiten/ml, Firma Sigma, Katalog Nr. T6759), und zwar bei 37°C für die Zeit von 0,5, 1, 2, 3, 4 oder 6 h. Danach wurden SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen durchgeführt, um die Verdauungsmuster zu beobachten. Natives hTPO wurde 30 min nach der Behandlung mit Thrombin stark abgebaut, während das Derivat 40433 in 4 h verdaut wurde (siehe 12). Dieses Ergebnis verifizierte, dass das Derivat 40433 stabiler ist als natives hTPO, was mit den eingeführten Zucker-Ketten erklärt werden kann.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben, induzieren die hTPO-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung die Produktion von Blutplättchen-Vorstufen-Zellen in vivo und sind damit nützlich für die Behandlung von Thrombocytopenie, die mit Anti-Krebs-Therapien oder einer Knochenmark-Verpflanzung verbunden ist. Speziell zeigen die hTPO-Derivate 40433, 40434, 40449 und 40458 eine signifikant höhere Effizienz im Induzieren einer Blutplättchen-Produktion als natives hTPO, was verschiedene Vorteile liefert. Da eine niedrige Dosis von hTPO-Derivaten eine nativem hTPO ähnliche Wirksamkeit zeigt, können kleine Dosen von hTPO seltener an Patienten verabreicht werden, die unter einer Thrombocytopenie leiden. Daher reduziert die Verwendung von Derivaten gemäß der vorliegenden Erfindung die Kosten der Behandlung der Krankheit und erhöht das Wohlbefinden von Patienten sowie die Sicherheit des Arzneimittels, unter Einschluss eines Ausschließens unreiner Proteine aufgrund der angewendeten kleinen Dosis.
Fachleute in diesem technischen Bereich werden erkennen, dass die Konzepte und spezifischen Ausführungsformen, die in der obigen Beschreibung offenbart wurden, leicht als Basis für ein Modifizieren oder ein Entwerfen anderer Ausführungsformen zur Durchführung derselben Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Fachleute in diesem technischen Bereich erkennen auch, dass derartige äquivalente Ausführungsformen nicht vom Geist und Umfang der Erfindung abweichen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen dargelegt ist.
Sequenzliste

Claims

Menschliches Thrombopoietinderivat, welches von menschlichem Thrombopoietin (hTPO), beschrieben durch SEQ ID NO: 30, abgeleitet wurde; welches mindestens einen zusätzlichen N-gebundenen Glycosylierungsstelle aufweist; und welches ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: [Asn¹⁶⁴] hTPO, [Asn¹⁹³] hTPO, [Asn¹⁰⁸, Asn¹¹⁷, Asn¹⁶⁴] hTPO, und [Asn¹⁵⁷, Asn¹⁶⁴] hTPO.
Menschliches Thrombopoietinderivat nach Anspruch 1, nämlich [Asn¹⁹³] hTPO oder [Asn¹⁵⁷, Asn¹⁶⁴] hTPO.
Rekombinantes gen, kodierend für menschliches Thrombopoietinderivat nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
Eukaryotischer Expressionsvektor, der ein rekombinantes Gen nach Anspruch 3 enthält.
Säugetierzelllinie CHO K-1/p40433 (Zugangsnummer: KCTC 0495BP).
Säugetierzelllinie CHO dhfr-/pD4gd3A (Zugangsnummer: KCTC 0630BP).
Säugetierzelllinie CHO dhfr-/pD40449 (Zugangsnummer: 0631BP).
Säugetierzelllinie CHO dhfr-/pD40458 (Zugangsnummer: KCTC 0632BP).
Verfahren zur Herstellung des menschlichen Thrombopoietinderivats nach Anspruch 1, wobei eine das rekombinante Gen nach Anspruch 3 enthaltende Säugetierzelllinie verwendet wird, um das menschliche Thrombopoietinderivat nach Anspruch 1 zu erhalten.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das menschliche Thrombopoietinderivat nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthaltet, welches zur Behandlung von Thrombozytopenie eingesetzt wird.
Verwendung eines menschlichen Thrombopoietinderivats nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Thrombozytopenie.