DE60217804T2

DE60217804T2 - Fusionsprotein mit erhöhter in vivo Erythropoietinaktivität

Info

Publication number: DE60217804T2
Application number: DE60217804T
Authority: DE
Inventors: Dong-Eok Songpa-gu Lee; Myung-Suk Yicheon-City Oh; Ki-Wan Seodaemun-gu Kim; Bo-Sup Anyang-City Chung; Ji-Sook Nowon-gu Park
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2002-08-14
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2022-08-15
Also published as: KR20030045341A; RU2232192C2; ZA200206879B; CA2400908A1; DE60217804D1; AU2002300734B2; EP1316561A1; JP4035400B2; US7091326B2; EP1316561B1; JP2003189853A; BR0203386A; US20030113871A1; TWI243827B; CN1422870A; CN100400548C; KR100467751B1; ES2280487T3; MXPA02008454A; ATE352565T1

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, das eine erhöhte in vivo Aktivität eines Arzneistoffes gegen Perniziöse Anämie, Erythropoietin (nachstehend auch bezeichnet als "EPO"), aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Fusionsprotein, das eine erhöhte EPO-Aktivität aufweist, indem seine in vivo Halbwertszeit mit seinen eigenen Aminosäure-Sequenzen erhöht wird, das heißt, ohne den Glykosylierungsgehalt zu erhöhen, wobei das Fusionsprotein ein EPO-Molekül enthält, das an ein bestimmtes Peptid, das natürlich im lebenden Organismus vorkommt, geknüpft ist.
2. Beschreibung des Standes der Technik
EPO ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30.000 bis 34.000 Da und ein hämatopoietischer Faktor, der die Produktion und Differenzierung von roten Blutzellen unterstützt. Das Glykoprotein bindet an einen Rezeptor von Vorläuferzellen von roten Blutzellen, um seine hämatopoietische Aktivität auszulösen, und führt zu einer Erhöhung der Mengen von intrazellulären Calciumionen, einer Steigerung der DNA-Biosynthese und der Anregung der Hämoglobinbildung. Rekombinantes menschliches EPO(rhEPO) wurde auch für die Behandlung von Anämie in Verbindung mit Nierenversagen, Frühreife, Schilddrüsenunterfunktion, Mangelernährung und so weiter zugelassen, und die klinische Verwendung von rhEPO nimmt ständig zu. Die umfassende Verwendung von rhEPO könnte jedoch durch Schwierigkeiten und hohe Kosten eingeschränkt werden, da rhEPO aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit etwa dreimal pro Woche verabreicht werden sollte. Somit könnte die Häufigkeit der rhEPO-Verabreichung zur Behandlung reduziert werden, indem eine in vivo EPO-Aktivität über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten wird.
Die in vivo biologische Aktivität von EPO ist proportional zu seiner in vivo Halbwertszeit, was bekanntermaßen mit dem Gehalt an Sialinsäure zusammenhängt, die sich am Ende von Zuckerketten in EPO befindet. Somit ist die in vivo biologische Aktivität von EPO stark von dem Vorhandensein oder dem Nichtvorhandensein von Zuckerketten abhängig. Die Arten von Zuckerketten variieren in Abhängigkeit von den Zelltypen. Wenn das gleiche Glykoprotein in verschiedenen Zellen exprimiert wird, sind somit die Arten der Zuckerketten des Proteins in Abhängigkeit von den Zelltypen charakteristisch verschieden. Es ist bekannt, dass Bakterienzellen, zum Beispiel E. coli, keine Zuckerketten an ihre Proteine anlagern können. Da es bekannt ist, dass in E. coli exprimierte Proteine keine Zuckerketten haben, enthält in E. coli exprimiertes EPO keine Zuckerketten. In diesem Fall wurde nachgewiesen, dass EPO in vitro biologisch aktiv ist, aber in vivo überhaupt nicht aktiv ist. Das liegt daran, dass EPO ohne Zuckerketten, im Vergleich zu EPO mit Zuckerketten, schneller aus dem Körper ausgeschieden wird, was zu einer extrem kurzen Halbwertszeit führt. Folglich spielt das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Zuckerketten im EPO eine wichtige Rolle für die biologische Aktivität von EPO.
Bis heute wurden viele Untersuchungen nachdrücklich durchgeführt, um die biologische Aktivität von EPO zu erhöhen. Die meisten dieser Untersuchungen konzentrieren sich auf die Ersetzung von einigen Aminosäuren durch das Herbeiführen der Mutation von EPO-Genen unter Verwendung von Mutagenesemethoden. Das Patent PCT/US94/09257 mit dem Titel "Erythropoietin Analogs", eingereicht durch Amgen Inc., offenbarte ein Verfahren zur Erhöhung einer in vivo Halbwertszeit durch die Erhöhung des Zuckerkettengehalts in EPO mittels Mutagenese. Die Erhöhung einer in vivo Halbwertszeit durch EPO-Dimerbildung ist ebenfalls probiert worden (A. J. Sytkowski et al., J.B.C. Bd. 274, Nr. 35, S. 24773-24778). Andere Verfahren zur Erhöhung der in vivo biologischen Aktivität von EPO umfassen das Verbinden einer neuartigen Aminosäure, eines Peptids oder Proteinfragments mit EPO-Molekülen unter Verwendung von Gentechnik und die Erhöhung des Zuckerkettengehalts in EPO, insbesondere der Mengen von Sialinsäuren. Die Arten von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinfragmenten, die in diesem Verfahren verwendet werden, sind jedoch sehr begrenzt. In den meisten Fällen können solche genetischen Modifikationen zu einer Verringerung oder dem Verlust der spezifischen Aktivität des Proteins führen oder Antigenprobleme hervorrufen, die häufig auftreten, wenn solche Substanzen in vivo verwendet werden.
Es wurden eher Untersuchungen zu Fusionsproteinen oder Chimärproteinen als zu EPO durchgeführt, und eines der Beispiele davon ist ein Follikel-stimulierendes Hormon, das ein Sexualhormon ist (Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol). Solche Proteine wurden jedoch noch nicht auf dem Gebiet angewendet, da durch Verwendung von Gentechnik genetisch modifizierte Proteine verschiedene Probleme aufwerfen. Es ist nicht leicht, selbst ein modifiziertes Zielprotein zu erhalten, was äußerst fachmännische Qualifikationen erfordert. Auch können in den meisten Fällen die Aktivitäten von Proteinen durch das Hinzufügen von oder Ersetzen durch neue(n) Aminosäuren nicht wünschenswert verringert oder beseitigt werden.
Unter diesen Umständen begannen die jetzigen Erfinder mit umfassenden Studien zu der Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Erhöhung der in vivo Aktivität von EPO durch die Fusion von neuen Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen an EPO-Moleküle. Im Zuge der Durchführung dieser Studien ist herausgefunden worden, dass ein Fusionsprotein, das durch Fusion von C-terminalen Peptidfragmenten (nachstehend auch bezeichnet als "CTP") der β-Untereinheit eines humanen Choriongonadotropins (nachstehend auch bezeichnet als "HCG"), das ein in vivo natürlich vorkommendes Protein ist, an EPO erhalten wurde, die in vivo Halbwertszeit des EPO dramatisch erhöht. Des Weiteren enthält das EPO Aminosäuren, welche die Funktion haben, die Glykosylierungsstellen zu erweitern und dabei die intrinsische Aktivität des EPO zu bewahren (siehe Koreanische Patentanmeldung Nr. 10-2000-0075230).
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die jetzigen Erfinder haben unerwartet entdeckt, dass CTP-Varianten, deren Glykosylierungsstelle in dem Peptid entfernt worden ist, die in vivo Halbwertszeit des EPO auch erheblich erhöhten. Als Ergebnis dieser Erkenntnis wurden CTP-Varianten entwickelt, die die in vivo Stabilität des EPO durch die Verwendung von Aminosäure-Sequenzen erhöhen können, ohne den Gehalt der Zuckerketten im EPO zu erhöhen, was die jetzigen Erfinder die vorliegende Erfindung vollenden ließ.
Die vorliegende Erfindung, in der CTP-Varianten verwendet werden, deren Glykosylierungsstellen entfernt worden sind, ist unterscheidbar von dem Stand der Technik, in dem eine in vivo Halbwertszeit durch die Erhöhung des Gehalts der Zuckerketten in EPO erhöht wird, und basiert auf der Entdeckung von CTP-Varianten, die fähig sind, die in vivo Stabilität von EPO zu erhöhen.
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Fusionsprotein bereitzustellen, das eine erhöhte in vivo Aktivität von menschlichem EPO aufweist, wobei das Fusionsprotein ein EPO-Molekül enthält, das an eine CTP-Variante einer HCG β-Untereinheit an ihrem C-terminalen Ende fusioniert ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure, die das Fusionsprotein kodiert, einen rekombinanten Vektor, der die Nukleinsäure enthält, und eine Zelllinie, die mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert ist, bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Präparation eines Fusionsproteins, das eine erhöhte Aktivität von menschlichem EPO aufweist, durch das Kultivieren der transformierten Zelllinie bereitzustellen.
Aus der Sicht eines Aspektes stellt die vorliegende Erfindung somit ein Fusionsprotein bereit, umfassend menschliches Erythropoietin (EPO), das ein C-terminales Ende aufweist und eine Mutante, die mit dem C-terminalen Ende verknüpft ist, wobei die Mutante eine Aminosäure-Sequenz von Position 7 bis Position 34 in SEQ ID NO:1 hat, mit der Ersetzung von einer bis vier Aminosäuren an den Positionen 10, 16, 21 und 27 von SEQ ID NO:1.
Aus der Sicht eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure bereit, die ein Fusionsprotein kodiert, wie hierin vorstehend definiert.
Aus der Sicht von noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Präparation eines Fusionsproteins bereit, das eine erhöhte in vivo EPO-Aktivität aufweist, umfassend:
das Kultivieren einer transformierten Zelllinie, die mit einem rekombinanten Vektor transfiziert ist, der die Nukleinsäure, wie vorstehend definiert, enthält.
Aus der Sicht von noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein Fusionsprotein wie vorstehend definiert umfasst, zusammen mit einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern, Zusätzen oder Hilfsstoffen.
Aus der Sicht von noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein wie oben definiert zur Benutzung als ein Medikament bereit.
Aus der Sicht von noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Fusionsproteine wie oben definiert zur Benutzung in der Behandlung von Anämie bereit.
Aus der Sicht von noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Fusionsproteins wie oben definiert zur Präparation von einem Medikament zum Behandeln von Anämie bereit.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, das eine erhöhte in vivo Aktivität von menschlichem EPO aufweist, wobei das Fusionsprotein ein EPO-Molekül enthält, das mit einer CTP-Variante einer HCG β-Untereinheit (nachstehend auch bezeichnet als "ATP") an ihrem C-terminalen Ende fusioniert ist. Vorzugsweise enthält das CTP alle oder einige der Aminosäuren entsprechend den Positionen 112-145, vorzugsweise den Positionen 118-145 der HCG β-Untereinheit, wobei die Aminosäuren durch SEQ ID NO: 1 beschrieben werden.
ATP, das eine CTP-Variante ist, hat die Funktion, die Halbwertszeit von dem EPO-Molekül mit seinen eigenen Aminosäure-Sequenzen zu erhöhen, d. h. ohne den Zuckerkettengehalt von EPO zu erhöhen.
Sofern die Wirkung von einem Fusionsprotein, das eine in vivo EPO-Aktivität erhöht, nicht nachteilig beeinflusst wird, sind die Positionen und Arten von Aminosäuren, die einen Positionswechsel innerhalb des oben erwähnten Bereichs erfahren, somit nicht ausdrücklich eingeschränkt. Mit anderen Worten, solange das Fusionsprotein die Aktivi tät der Erhöhung einer in vivo EPO-Aktivität beibehält, können die Aminosäuren an den Positionen, die zu dem oben erwähnten Bereich gehören, an jeder beliebigen Position mit beliebigen Aminosäuren ersetzt werden.
Es wird zum Beispiel bevorzugt, dass ATP Ersetzungen von einer oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 121, 127, 132 und 138 aufweist, und am besten Serin(Ser)-Reste an den Positionen 121, 127, 132 und 138 mit Alanin(Ala)-Resten ersetzt sind (1). In diesem Fall weist das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung die Aminosäure-Sequenz auf, die durch SEQ ID No.2 beschrieben wird. Aus den Erkenntnissen, dass Ser-Reste an den oben erwähnten Positionen mit Ala-Resten ersetzt werden können, ist es einem Fachmann klar, dass jede andere Aminosäure mit einer ähnlichen Größe und Ladung wie Ala, zum Beispiel Glycin (Gly), Ser ersetzen kann.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden eine Nukleinsäure, die das Fusionsprotein kodiert, ein rekombinanter Vektor, der die Nukleinsäure enthält, und eine Zelllinie, die mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert ist, vorzugsweise eine Ovarialzelle des Chinesischen Streifenhamsters (CHO), bereitgestellt.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Präparation eines Fusionsproteins bereitgestellt, das durch das Kultivieren der transformierten Zelllinie eine erhöhte Aktivität von menschlichem EPO aufweist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben erwähnten Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden offensichtlicher durch die detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, wobei:
1 die Basen- und Aminosäure-Sequenzen von ATP als eine CTP-Variante darstellt;
2 die Basen- und Aminosäure-Sequenzen eines Fusionsproteins (EATP) von EPO und ATP darstellt;
3 eine grafische Darstellung ist, die die Herstellung eines Expressionsvektors pcDNA3.1-EATP veranschaulicht;
4 eine Elektrophorese-Aufnahme von gereinigtem EATP ist; und
5 pharmakokinetische Analyseergebnisse von EATP und EPO grafisch darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter beschrieben. Die vorliegende Erfindung wird durch Schritte der Gewinnung und Klonierung von Genen von einem Ziel-Fusionsprotein, der Konstruktion von Expressionsvektoren von einem Zielgen, der Transfektion von Tierzellen und der EATP-Expression sowie der Reinigung von exprimiertem EATP und der Aktivitätsmessung abgearbeitet.
(1) Gewinnung von Genen
Komplementäre DNA (cDNA) von EPO kann durch die Nutzung einer herkömmlichen Methode der Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung eines RT-PCT Premix Kits, das von Bioneer Corp., Korea, erhältlich ist, gewonnen werden, bei der die Primer EP1 und EC2 verwendet werden, die zu beiden terminalen Enden der EPO-cDNA komplementär sind, die zuvor aus einer cDNA-Sammlung der menschlichen embryonalen Leber (erhältlich von Invitrogen Corp.) präpariert wurde.
EP1: ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG (SEQ ID NO: 3)
EC2: GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT (SEQ ID NO: 4)
Die EPO-cDNA wird in einen Klonierungsvektor pGEM-T (Promega Corp.) kloniert, der als pGEM-T-EPO bezeichnet wird, und ihre Basensequenz wird zur Verwendung als Vorlage in nachfolgenden Arbeiten identifiziert.
Die Gene der CTP-Variante einer HCG β-Untereinheit, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, werden durch künstliche Synthese und PCR ohne Primer gewonnen. Die synthetisierten Genfragmente sind EA1, A2, A3 und A4:
EA1: AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCG (SEQ ID NO: 5)
A2: GGMGGGCGGGGGGAGGGGCCTTGGCGGAAGAGGA (SEQ ID NO: 6)
A3: CCGCCCTTCCAAGCCCAGCCCGACTCCCGGGGCCC (SEQ ID NO: 7)
A4: TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCGGCGGGCCCCG (SEQ ID NO: 8)
(Fett gedruckte Abschnitte bezeichnen Anteile für die Aminosäure-Ersetzung.)
Jeweils 1 μL von vier Genen wird (50 pmol/μL) unter Verwendung eines hochgenauen Taq-Systems (Boehringer Mannheim Corp.) der PCR ausgesetzt.
Genfragmente (modifizierte CTP-Gene) mit einer Größe von ungefähr 100 bp werden in einem 1%igen Agarose-Gel identifiziert. Diese Gene kodieren ein Peptid, das durch die Ersetzung von 4 Ser-Resten durch Ala-Reste an den Positionen 121, 127, 132 und 138 unter 28 C-terminalen Aminosäuren an den Positionen 118-145 einer HCG β-Untereinheit gewonnen wird (siehe 1).
Die PCR wird unter Verwendung eines pGEMT-EPO als Template und EP1 und EC2 als Primer durchgeführt, wodurch nur EPO-Gene gewonnen werden. Dann wird die PCR sowohl mit den EPO-Genen als auch den modifizierten CTP-Genen als Templates und unter Verwendung von EP11- und EP22-Primern mit Hilfe des hochgenauen Taq-Systems weiter durchgeführt, wobei ein gewünschtes Fusionsprotein mit Genfragmenten mit annähernd 630 bp (als EATP-Gene bezeichnet) gewonnen wird.
EP11: TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT (SEQ ID NO: 9)
EP22: TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT (SEQ ID NO: 10)
Diese Gene werden in die pGEM-T Klonierungsvektoren kloniert, und anschließend werden Basen-Sequenzen identifiziert (als pGEMT-EATP bezeichnet) (siehe 3).
(2) Konstruktion von Expressionsvektoren
Der pcDNA3.1-Vektor (Invitrogen Corp.) wird als ein Expressionsvektor verwendet. Beide Enden des EATP-Gens haben HindIII und BamH I Restriktionsenzymstellen, erhalten von den Primern EP11 und EP22. Der pcDNA3.1 und das gewonnene pGEMT-EATP werden mit HindIII und BamHI behandelt. Der linearisierte pcDNA-3.1 und das EATP-Gen werden unter Verwendung eines Qiagen Elutionskit aus einem Agarose-Gel gewonnen, mit anschließender Ligation, wobei E. coli NM522 tranformiert wird. Plasmide werden aus den Kolonien isoliert, die nach der Inkubation über Nacht in einem LB-Ampicillin-Festmedium entstanden sind, und mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt. Dann werden nur Kolonien mit eingefügtem EATP durch Elektrophorese mit 1%igem Agarose-Gel selektiert. Die resultierenden Plasmide werden als pcDNA3.1-EATP bezeichnet (siehe 3).
(3) Transfektion von CHO-Zellen und EATP-Expression
CHO-Zellen (DG44) werden in einer 60-mm Schale gezogen, um 40-80 % konfluente Zellen zu präparieren (1 – 4 × 105 Zellen/60 mm Schale). 3 μL eines Superfektionsreagenz (Boehringer Mannheim Corp.) und 97 μL Medien (α-MEM mit Medien, serumfrei und nicht-antibiotisch) werden ausreichend vermischt, und annähernd 2 μg einer PlasmidpcDNA3.1-EATP DNA (mehr als 0,1 μg/μL) und 0,2 μg eines Dihydrofolatreduktase(dhfr)-Gens, das den Vektor pLTRdhfrl6 (ATCC37295) enthält, werden zu der resultierenden Mischung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten umgesetzt, um sie dann den Zellen hinzuzufügen. Nach einem Tag werden die Medien durch α-MEM ohne Medien (500 μg/ml G418 enthaltend) mit 10% FBS ersetzt. Die Zellen werden wieder durch Medien mit 500 μg/mL G418 aufgefüllt und für 7-10 Tage kultiviert. Dann sterben alle Zellen ohne G418-resitente Gene und Zellen der negativen Kontrollgruppe ab. Nachdem die aus den G418-Medien selektierten Zellen ausreichend kultiviert wurden, wird unter Verwendung eines EPO-ELISA Kits (Boehringer Mannheim Corp.) ein EATP-Protein bestimmt, das aus den Medien exprimiert wurde.
(4) Reinigung von exprimiertem EATP
Unter Verwendung eines monoklonalen Anti-EPO-Antikörpers (R&D Inc.) werden Affinitätsharze zur Reinigung wie folgt präpariert.
0,3 g von CNBr-aktivierter Sepharose 4B wird in 1 mM HCl für 20 Minuten gequollen und auf eine Säule aufgetragen und danach mit 1 mM HCl gewaschen. Dann wird das resultierende Harz weiter in 4 mL Kopplungspuffer-Lösung (0,1 M NaHCO₃ und 0,5 M NaCl, pH 8,3) gewaschen, in ein Röhrchen überführt und sofort mit dem monoklonalen Anti-EPO-Antikörper in der Kopplungspuffer-Lösung (500 μg/Fläschchen) vermischt und anschließend bei Raumtemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Während dieser Zeit wird das Röhrchen ausreichend geschüttelt. Dann wird das resultierende Produkt mit einem Blockpuffer (0,2 M Glycin, pH 8,0) ersetzt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Schütteln umgesetzt. Das resultierende Harz wird mit einer 6,5 mL Kopplungspuffer-Lösung, einer 6,5 mL Acetat-Pufferlösung (0,1 M Essigsäure, 0,5 M NaCl, pH 4) und einer 6,5 mL Kopplungspuffer-Lösung sequentiell gewaschen. Das präparierte Harz wird in eine Säule gepackt und dann wie folgt der Reinigung ausgesetzt.
Zellen werden in einem serumfreien Medium für einen Tag gezogen, und dann wird nur das Medium annähernd 5-mal mit Hilfe eines Ultrafiltrationsfilters konzentriert, zum Beispiel Centriprep (mit einer nominalen Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 10.000) (Millipore Corp.). Dann werden die konzentrierten Lösungen auf eine Säule aufgetragen, die mit Phosphat-gepuffertem Kochsalz (PBS) bei einer Flussgeschwindigkeit von etwa 20 mL/Std. äquilibriert ist, und wieder mit PBS gewaschen. Die Zielproteine werden in einer Elutionspufferlösung (0,1 M Glycin, pH 2,8) eluiert und dann sofort mit 1 M Trislösung zur Einstellung auf pH 7,5 titriert. Die Reinheit des gereinigten EATP liegt bei 97% oder höher, wie durch SDS-PAGE und Silberfärbung nachgewiesen wurde (siehe 4).
(5) Aktivitätsmessung durch Bioassay-Test und biochemische Analyse
Die biologischen Aktivitäten des exprimierten und angemessen gereinigten EPO und EATP werden durch einen Bioassay unter Verwendung von Milzzellen einer Maus, die mit Phenylhydrazin behandelt wurde, gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass die Aktivität des EATP höher ist als die des EPO, was nahe legt, dass das Vorhandensein von hinzugefügten C-terminalen Enden im EATP die Aktivität des EPO nicht hemmt.
(6) Pharmakokinetischer Test
Um zu bestimmen, ob die präparierten potentiellen Materialien wirklich eine längere in vivo Halbwertszeit haben, werden pharmakokinetische Tests an Mäusen durchgeführt. Hierbei werden die potentiellen Materialien vier Mäusen intravenös mit Dosierungen von 20 Einheiten für jede Maus verabreicht. Um das Konzentrationsprofil im Blut zu beurteilen, wird den Mäusen Blut abgenommen und die Konzentration in dem abgenommenen Blut unter Verwendung eines EIA Kits (Boehringer Mannheim Corp.) gemessen. Der pharmakoki netische Test, der an Mäusen durchgeführt wird, zeigt, dass das potentielle Material EATP eine viel längere Halbwertszeit als das Kontrollmaterial EPO aufweist (siehe 5).
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen veranschaulicht, die nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend missverstanden werden sollten.
Beispiel 1: Gewinnung von Genen
Die cDNA von EPO wurde durch die Nutzung einer herkömmlichen RT-PCR-Methode unter Verwendung eines RT-PCR Premix Kits (Bioneer Corp., Korea) gewonnen, bei dem die Primer EP1 und EC2 verwendet wurden, die zu beiden terminalen Enden der EPO-cDNA komplementär sind, die zuvor aus einer cDNA-Sammlung der menschlichen embryonalen Leber (Invitrogen Corp.) präpariert wurde. 30 Zyklen von PCR-Reaktionen wurden unter den Bedingungen von 35 Sekunden bei 55°C (Annealing), 40 Sekunden bei 72°C und 20 Sekunden bei 94°C durchgeführt und ergaben EPO-cDNA. Die gewonnene EPO-cDNA wurde in einen Klonierungsvektor pGEM-T (Promega Corp.) kloniert. Mit anderen Worten, das Produkt der PCR wurde aus 1%iger Agarose eluiert, in pGEM-T ligiert, gefolgt von der Transformation von E. coli NM522. Nach der Inkubation über Nacht in einem X-gal/IPTG bestrichenen LB-Ampicillin-Festmedium wurde die Plasmid-DNA aus weißen Kolonien isoliert und mit den Restriktionsenzymen SacI und SacII umgesetzt, um die Kolonien zu selektieren, die EPO-cDNA-Inserts enthielten. Der gewonnene Vektor wurde als pGEMT-EPO bezeichnet, und seine Basen-Sequenz wurde zur Verwendung als Template in nachfolgenden Prozessen identifiziert.
Modifizierte CTP-Gene einer HCG β-Untereinheit wurden durch künstliche Synthese und PCR ohne Primer gewonnen. Die synthetisierten Genfragmente waren EA1, A2, A3 und A4.
Jeweils 1 μL von vier Genen (50 pmol/μL) wurde unter Ver wendung eines hochgenauen Taq-Systems (Boehringer Mannheim Corp.) 15 Zyklen der PCR ausgesetzt, unter Bedingungen von 40 Sekunden bei 55°C (Annealing), 40 Sekunden bei 72°C und 20 Sekunden bei 94°C. Genfragmente mit einer Größe von annähernd 100 bp wurden in einem 1%igen Agarose-Gel (modifizierte CTP-Gene) identifiziert.
Diese Gene kodieren ein Peptid, das durch Ersetzen von 4 Ser-Resten durch Ala-Reste an den Positionen 121, 127, 132 und 138 unter 28 Aminosäuren mit C-terminalen Enden einer HCG β-Untereinheit gewonnen wurde (1).
Die PCR wurde unter Verwendung eines pGEMT-EPO-Templates und EP1- und EC2-Primern durchgeführt, wodurch nur EPO-Gene gewonnen wurden. Dann wurden weitere 30 Zyklen der PCR sowohl mit den EPO-Genen als auch den modifizierten CTP-Genen, die als Templates gewonnen wurden, und unter Verwendung von EP11- und EP22-Primern mit Hilfe des hochgenauen Taq-Systems durchgeführt, unter Bedingungen von 42 Sekunden bei 57°C (Annealing), 60 Sekunden bei 72°C und 20 Sekunden bei 94°C. Somit wurden annähernd 630 bp von fusionierten Genfragmenten (als EATP-Gene bezeichnet) gewonnen. Diese Gene wurden unter Verwendung des oben erwähnten Verfahrens (als pGEMT-EATP bezeichnet) in pGEM-T kloniert, und seine Sequenzen wurden identifiziert.
Beispiel 2: Konstruktion des Expressionsvektors pcDNA3.1-EATP
Der pcDNA3.1-Vektor (Invitrogen) wurde als Expressionsvektor verwendet. Beide terminalen Enden des EATP-Gens im pGEMT-EATP haben HindIII- und BamHI-Restriktionsstellen, abgeleitet von den Primern EP11 und EP22.
Der pcDNA3.1 und das gewonnene pGEMT-EATP wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt. Das linearisierte pcDNA3.1- und EATP-Gen wurden aus einem Agarose-Gel unter Verwendung eines Qiagen Elutionskit gewonnen, mit anschließender Ligation, wobei E. coli NM522 transformiert wurde. Plasmide wurden aus den Kolonien isoliert, die nach der Inkubation über Nacht in einem LB-Ampicillin-Festmedium entstanden sind, und mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI behandelt. Dann wurden nur Kolonien mit eingefügtem EATP durch Elektrophorese mit 1%igem Agarose-Gel selektiert. Die resultierenden Plasmide wurden als pcDNA3.1-EATP bezeichnet (siehe 3).
Beispiel 3: Transfektion von CHO-Zellen und EATP-Expression
CHO-Zellen (DG44) wurden in einer 60-mm Schale gezogen, um 40-80 % konfluente Zellen (1 – 4 × 10⁵ Zellen/60-mm Schale) zu präparieren. 3 μL eines Superfektionsreagenz (Boehringer Mannheim Corp.) und 97 μL Medien (α-MEM mit Medien, serumfrei und nicht-antibiotisch) wurden ausreichend vermischt, und annähernd 2 μg einer Plasmid-pcDNA3.1-EATP-DNA (mehr als 0,1 μg/μL) und 0,2 μg eines Dihydrofolatreduktase(dhfr)-Gens, das den Vektor pLTRdhfr26 (ATCC37295) enthält, wurden zu der resultierenden Mischung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten umgesetzt und anschließend zu den Zellen hinzugefügt. Nach Ablauf eines Tages wurden die Medien mit α-MEM ohne Medien (500 μg/mL G418 enthaltend) mit 10% PBS ersetzt. Die Zellen wurden wieder mit Medien aufgefüllt, die 500 μg/mL G418 enthielten, und für 7-10 Tage kultiviert. Dann starben alle Zellen ohne G418-resistente Gene und Zellen der negativen Kontrollgruppe ab. Nachdem die Zellen, die aus den G418-Medien selektiert wurden, ausreichend kultiviert wurden, wurde das aus den Medien exprimierte EATP-Protein unter Verwendung eines EPO-ELISA Kits (Boehringer Mannheim Corp.) bestimmt.
Beispiel 4: Reinigung von exprimiertem EATP
Unter Verwendung eines monoklonalen Anti-EPO-Antikörpers (R&D Inc.) wurden Affinitätsharze zur Reinigung wie folgt präpariert.
0,3 g von CNBr-aktivierter Sepharose 4B wurde in 1 mM HCl für 20 Minuten gequollen und auf eine Säule aufgetragen und anschließend mit 1 mM HCl gewaschen. Dann wurde das resultierende Harz in 4 mL Kopplungspuffer-Lösung (0,1 M NaHCO₃ und 0,5 M NaCl, pH 8,3) weiter gewaschen, in ein Röhrchen überführt und sofort mit monoklonalem Anti-EPO-Antikörper in der Kopplungspuffer-Lösung (500 μg/Fläschchen) vermischt und anschließend bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Schütteln umgesetzt. Während dieser Zeit wurde das Röhrchen ausreichend geschüttelt. Anschließend wurde das resultierende Produkt mit einem Blockpuffer (0,1 M Glycin, pH 8,0) ersetzt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Das resultierende Produkt wurde mit einer 6,5 mL Kopplungspuffer-Lösung, einer 6,5 mL Acetat-Pufferlösung (0,1 M Essigsäure, 0,5 M NaCl, pH 4) und einer 6,5 mL Kopplungspuffer-Lösung sequentiell gewaschen. Das präparierte Harz wurde in eine Säule gepackt und dann wie folgt der Reinigung ausgesetzt.
Zellen wurden in einem serumfreien Medium für einen Tag gezogen, und dann wurde nur das Medium annähernd 5-mal unter Verwendung eines Ultrafiltrationsfilters von Centriprep (mit einer nominalen Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 10.000) (Millipore Corp.) konzentriert. Anschließend wurden die konzentrierten Lösungen auf eine Säule aufgetragen, die mit PBS bei einer Flussgeschwindigkeit von etwa 20mL/Std ausgeglichen wurde, und wieder mit PBS gewaschen. Die Zielproteine wurden in einer Elutionspufferlösung (0,1 M Glycin, pH 2,8) eluiert und dann sofort mit 1 M Trislösung zur Anpassung an pH 7,5 titriert. Die Reinheit des gereinigten EATP lag bei 97% oder höher, wie durch SDS-PAGE und Silberfärbung nachgewiesen wurde (siehe 4).
Beispiel 5: Aktivitätsmessung durch Bioassay-Test
Einer Maus wurde einmal am Tag zwei Tage lang Phenylhydrazin mit einer Dosis von 60 mg/kg verabreicht. Nach 3 Tagen wurde eine vergrößerte Milz aus der Maus isoliert und mit einem Homogenisator zermahlen, um Milzzellen zu gewinnen. Die Milzzellen wurden auf eine Konzentration von 6 × 106 Zellen/mL verdünnt und jeweils 100 μL der verdünnten Probe wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen transferiert. Standard-EPO (0-500 mU/mL) und das exprimierte EPO und EATP (jeweils 100 mU/mL) wurden den entsprechenden Vertiefungen hinzugefügt. Dann wurde die Platte in einem CO₂-Inkubator gelagert, der für 22 Stunden bei 37°C gehalten wurde. 50 μL Dimethyl-³H-thymidin (20 uCi/mL) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die resultierende Platte wurde 2 Stunden lang weiter umgesetzt, und anschließend wurden die Probelösungen von jeder Vertiefung an einen Glasfilter (Nunc 1-73164) adsorbiert. Der Filter wurde dreimal mit Salzlösung gewaschen, und die Radioaktivität des Filters wurde unter Verwendung eines Beta(β)-Zählers gemessen. Die Messungen zeigten, dass die Aktivität des EATP im Wesentlichen gleich war mit oder leicht höher als der/die des EPO, was nahe legte, dass das Vorhandensein von hinzugefügten C-terminalen Enden im EATP nicht die Aktivität des EPO hemmt.
Beispiel 6: Pharmakokinetischer Test
Um zu bestätigen, ob die präparierten potentiellen Materialien wirklich eine längere Halbwertszeit haben, wurden pharmakokinetische Tests an Mäusen durchgeführt. Hierbei wurde das Fusionsprotein, das durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren gereinigt wurde, vier Mäusen mit Dosierungen von 20 Einheiten für jede Maus intravenös verabreicht. Um das Konzentrationsprofil im Blut zu beurteilen, wurde den Mäusen in regelmäßigen Abständen, das heißt, alle 30 Minuten am Anfang und alle 2 Stunden nach 2 Stunden, Blut abgenommen und die Konzentration in dem abgenommenen Blut unter Verwendung eines EIA-Kits (Boehringer Mannheim Corp.) bestimmt. Das Ergebnis des pharmakokinetischen Tests wird in 5 dargestellt. Wie in 5 gezeigt wird, hatte das zu prüfende EATP-Material eine viel längere (mehr als 2,5-mal längere) Halbwertszeit als das Kontrollmaterial EPO.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die in vivo Aktivität von EPO durch die Erhöhung der in vivo Halbwertszeit erhöht werden, während die Eigenaktivität des EPO mit seiner eigenen Aminosäure bewahrt wird, d. h. ohne die Erhöhung des Zuckerkettengehalts von EPO.

Claims

Fusionsprotein, umfassend humanes Erythropoietin (EPO), mit einem C-terminalen Ende und einer Mutante, die mit dem C-terminalen Ende verknüpft ist, wobei die Mutante eine Aminosäure-Sequenz von Position 7 bis Position 34 wie in SEQ ID NO:1 hat, mit der Ersetzung von einer bis vier Aminosäuren an den Positionen 10, 16, 21 und 27 von SEQ ID NO:1.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin in der Mutante die Serin-Reste an den Positionen 10, 16, 21, und 27 von SEQ ID NO:1 mit Alanin oder Glycin ersetzt sind.
Nukleinsäure, die ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
Verfahren zur Präparation eines Fusionsproteins, das eine erhöhte in vivo EPO-Aktivität hat, umfassend: Kultivieren einer transformierten Zelllinie, transfiziert mit einem rekombinanten Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 3 enthält.
Pharmazeutische Verbindung, umfassend ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, zusammen mit einem oder mehreren physiologisch erträglichen Trägern, Zusätzen oder Arzneiträgern.
Fusionsprotein, definiert nach Anspruch 1 oder 2, zur Benutzung als ein Medikament.
Fusionsprotein, definiert nach Anspruch 1 oder 2, zur Benutzung bei der Behandlung von Anämie.
Benutzung eines Fusionsproteins, definiert nach Anspruch 1 oder 2, zur Präparation eines Medikament zur Behandlung von Anämie.