DE69932592T2

DE69932592T2 - Rekombinante proteine abgeleitet von hgf und msp

Info

Publication number: DE69932592T2
Application number: DE69932592T
Authority: DE
Inventors: Enzo Medico; Paolo Michieli; Chiara Collesi; Gianfranco Caselli; Paolo Comoglio
Original assignee: Dompe PhaRMa SpA
Current assignee: Dompe SpA
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2019-01-28
Also published as: EP1049778A2; US6551991B1; HU226717B1; JP2002501745A; CA2319211C; ITMI980179A1; WO1999038967A3; JP4478329B2; HUP0104598A1; NZ506005A; EP1049778B1; DE69932592D1; ZA99723B; CA2319211A1; ES2270581T3; WO1999038967A2; AU740490B2; HUP0104598A3; IL137564A; AU2424599A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Proteine, die aus der Kombination von Strukturdomänen erhalten wurden, welche von den α-Untereinheiten des Hepatozyten-Wachstumsfaktors ("hepatocyte growth factor") (HGF) und des Makrophagen-stimulierenden Proteins ("macrophage stimulating protein") (MSP) abgeleitet sind.
Insbesondere werden die technisch ausgeführten ("engineered") Faktoren der Erfindung durch Kombination der Haarnadelschleife und der Kringel-Domänen der α-Ketten von HGF oder MSP erhalten, so dass eine Struktur mit zwei Superdomänen mit einer intervenierenden Linker-Sequenz erhalten wird. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf DNA-Sequenzen, die für die oben genannten rekombinanten Proteine codieren, auf die Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen umfassen, und auf Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten. Die rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung sind biologisch aktiv bzw. wirksam, und ihre Aktivität bzw. Wirksamkeit kann durch Bestimmung ihrer Fähigkeit, die Aktivierung des Met-Tyrosinkinase-Rezeptors zu induzieren, ihrer "streuenden" ("scattering") Wirkung auf Epithelzellen und ihrer schützenden Wirkung gegen Zelltod, der durch chemotherapeutische Wirkstoffe (vide infra) induziert wird, gemessen werden. Daher können diese Moleküle zweckmäßigerweise verwendet werden, um die toxischen Nebenwirkungen der chemotherapeutischen Behandlung von Tumoren zu verhindern oder zu behandeln und um eine iatrogene Zellschädigung zu verringern, welche durch andere Typen von Wirkstoffen verursacht wird.
Technologischer Hintergrund
Der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) und das Makrophagenstimulierende Protein (MSP) sind sowohl strukturell als auch funktionell (1 und 2) hoch verwandte Proteine. Beide Faktoren werden als inaktiver Präkursor sezerniert, welcher durch spezifische Proteasen prozessiert wird, die eine Spaltstelle innerhalb des Moleküls erkennen, wobei das Protein in zwei Untereinheiten geteilt wird. Diese Untereinheiten, α-Kette und β-Kette genannt, sind durch eine Disulfidbindung verknüpft. Somit ist der reife Faktor ein α-β-dimeres Protein. Nur die reife (dimere) Form des Faktors ist in der Lage, seinen Rezeptor auf der Oberfläche der Zielzellen (die Met-Tyrosinkinase im Fall von HGF und die Ron-Tyrosinkinase im Fall von MSP) zu aktivieren und daher biologische Reaktionen zu vermitteln (Naldini, L. et al., 1992, EMBO J. 11: 4825–4833; Wang, M. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269; 3436–3440; Bottaro, D. et al., 1991, Science 25: 802–804; Naldini, L. et al., 1991, EMBO J. 10: 2867–2878; Wang, M. et al., 1994, Science 266: 117–119; Gaudino, G. et al., 1994, EMBO J. 13: 3524–3532).
Die α-Kette beider Faktoren enthält eine Haarnadelschleifen ("hairpin loop") (HL)-Struktur und vier Domänen mit einer gewirrartigen ("tangle-like") Struktur, genannt Kringel (K1-K4; Nakamura T. et al., 1989, Nature 342:440–443; Han, S. et al., 1991, Biochemistry 30: 9768–9780). Der Präkursor enthält auch eine Signalsequenz (LS) von 31 Aminosäuren (im Fall von HGF) oder von 18 Aminosäuren (im Fall von MSP), die im rauben en doplasmatischen Retikulum entfernt wird, was das neu gebildete Peptid in den Sekretionsweg lenkt. Die β-Kette enthält eine Box mit einer Sequenz, die homolog zu derjenigen ist, die typisch für Serinproteasen ist, aber sie hat keine katalytische Aktivität (Nakamura T. et al., 1989, Nature 342:440–443; Han, S. et al., 1991, Biochemistry 30: 9768–9780). Sowohl die α- als auch die β-Kette tragen zur Bindung des Wachstumsfaktors an den entsprechenden Rezeptor (Met für HGF und Ron für MSP) bei.
HGF- und MSP-Polypeptide sind in der Lage, eine Vielzahl biologischer Wirkungen neben der Zellproliferation zu induzieren. Die biologischen Hauptaktivitäten dieser Moleküle sind: Stimulierung der Zellteilung (Mitogenese); Stimulierung der Motilität (Streuen); Induktion der Polarisierung und Zelldifferenzierung; Induktion der Tubulusbildung (verzweigte Morphogenese); Erhöhung des Überlebens von Zellen (Schutz vor Apoptose). Die Gewebe, die auf HGF- und MSP-Stimulierung reagieren, sind jene, in denen die Zellen die entsprechenden Met (HGF)- und Ron (MSP)-Rezeptoren exprimieren. Die wichtigsten Zielgewebe dieser Faktoren sind Epithelzellen verschiedener Organe, wie Leber, Niere, Lunge, Brust, Pankreas und Magen, und einige Zellen des hämatopoetischen und des Nervensystems. Eine detaillierte Übersicht über die biologischen Wirkungen von HGF und MSP in den verschiedenen Geweben kann in Tamagnone, L. & Comoglio, P., 1997, Cytokine & Growth Factor Reviews, 8: 129–142, Elsevier Science Ltd.; Zarnegar, R. & Michalopoulos, G., 1995, J. Cell Biol. 129: 1177–1180; Medico, E. et al., 1996, Mol. Biol. Cell, 7: 495–504; Banu, N. et al., 1996, J. Immunol. 156: 52933–2940 gefunden werden.
Im Fall von HGF ist bekannt, dass die Haarnadelschleife und die ersten zwei Kringel die Stellen der direkten Wechselwirkung mit dem Met-Rezeptor enthalten (Lokker NA et al., 1992, EMBO J., 11:2503–2510; Lokker, N. et al., 1994, Protein Engineering 7: 895–903). Zwei natürlich auftretende verkürzte Formen von HGF, die von einigen Zellen durch alternatives Spleißen produziert werden, wurden beschrieben. Die erste umfasst den ersten Kringel (NK1-HGF Cioce, V. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 13110–13115), wohingegen die zweite sich bis zum zweiten Kringel erstreckt (NK2-HGF Miyazawa, K. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 197: 15–22). NK2-HGF induziert Zellstreuung, aber es nicht mitogen, wie es der vollständige Wachstumsfaktor ist (Hartmann, G. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11574–11578). Jedoch gewinnt NK2-HGF in Gegenwart von Heparin, einem Glucosaminoglycan, das HGF durch eine Domäne bindet, die in dem ersten Kringel enthalten ist und die wahrscheinlich die Dimerisierung von NK2-HGF induziert (Schwall, R, et al., 1996, J. Cell Biol. 133: 709–718), wiederum mitogene Aktivität. Darüber hinaus verhält sich NK2-HGF, welches ein partieller Agonist von Met ist, als kompetitiver Inhibitor von HGF, soweit die mitogene Aktivität betroffen ist (Chan, A. et al., 1991, Science 254: 1382–1385). Es wurde auch beschrieben dass NK1-HGF eine partielle Stimulierung von Met und eine kompetitive Inhibierung der mitogenen Aktivität von HGF ausübt (Cioce, V. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 13110–13115). In jedem Fall ist ein verkürzter Faktor mit einer Aktivität ausge-stattet, die merklich geringer als bei den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten Faktoren ist, wie in Beispiel 3 gezeigt wird.
Im Fall von MSP sind die Wechselwirkungsstellen mit dem Ron-Rezeptor weniger gut verstanden: einige vorläufige Untersuchungen schlagen eine Situation entgegengesetzt derjenigen von HGF vor, d.h. die β-Kette bindet den Rezeptor direkt, wohingegen die α-Kette so wirken würde, dass der Komplex sta bilisiert wird (Wang MH et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:16999–17004).
Die therapeutische Verwendung von Molekülen wie HGF und MSP ist möglicherweise in einem weiten Bereich von Pathologien wertvoll (Abdulla, S., 1997, Mol. Med. Today 3:233). Nichtsdestoweniger macht eine Anzahl technischer sowie biologischer Komplikationen die Applikation dieser Moleküle in Kliniken schwierig. Zuerst kann der pleiotrope Charakter dieser Faktoren biologische Reaktionen mit schlechter Selektivität verursachen, welche unerwünschte Nebenwirkungen beinhalten. Zum Beispiel wurde die Verwendung von HGF vorgeschlagen, um einige Nebenwirkungen des chemotherapeutischen Wirkstoffes Cisplatin zu verhindern (Kawaida K. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:4357–4361). Krebspatienten, die mit diesem Wirkstoff behandelt werden, können eine akute Nierenschädigung aufgrund der zytotoxischen Wirkung von Cisplatin auf die Epithelzellen von proximalen Tubuli erleiden. HGF kann diese Zellen gegen den programmierten Tot (Apoptose), der durch Cisplatin induziert wird, schützen, aber zur gleichen Zeit kann es eine unerwünschte Proliferation neoplastischer Zellen induzieren. Andere Probleme, die mit der pharmazeutischen Verwendung von HGF und MSP verbunden sind, sind die Notwendigkeit ihrer proteolytischen Aktivierung und ihre Stabilität, welche technische Probleme verursachen kann. Die verkürzten Formen NK1 und NK2 von HGF erfordern keine proteolytische Aktivierung, aber sie haben eine verminderte biologische Aktivität.
Das Dokument WO 93/23550 beschreibt Konjugate zweier Liganden (Heterodimere), die befähigt sind, an Tyrosinkinase-Rezeptoren zu binden, wobei die zwei Liganden durch einen Linker fusioniert sind und das Konjugat die Rezeptoraktivie rung auslöst (Seite 78, Ansprüche 13 und 15). Insbesondere offenbart es HGF-IgG-Dimere, wie NK2 HGF-IgG, umfassend die NK2-Deletionsvariante von HGF, verbunden mit einer schweren Kette von IgG-γl, wodurch Chimären erzeugt werden, die als Dimere exprimiert werden (Seite 65, Zeile 1 bis Seite 66, Zeile 4). Jede Superdomäne (NK2 HGF) umfasst die HL-, K1- und K2-Domänen der HGF-α-Kette (NK2-Deletionsmutante) (Seite 23, Zeilen 4–10 und Seite 65, Zeilen 1–21). Daher gewinnt die biologisch inaktive HGF-Variante, NK2 HGF, die biologische Aktivität von Wildtyp-HGF zurück, wenn sie als eine dimere Chimäre, HGF-Variante-IgG, an dem Rezeptor bindet (Seite 6, Zeilen 24–28). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das rekombinante Protein in gleicher Weise wie der Wildtyp-Ligand an den HGF-Rezeptor bindet (Seite 66, Zeilen 19–21) und dass es mitogene Aktivität bei Hepatozyten-Kultur aufweist (Seite 67, Zeilen 1–9). Ebenfalls beschrieben sind Nucleotidsequenz, Expressionsvektor, NK2 HGF-IgG-produzierende Zelle und ein Verfahren zum Herstellen von rekombinantem NK2 HGF-IgG (Seite 65, Zeile 1 bis Seite 66, Zeile 21).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Moleküle bereit, die aus einer Kombination von Strukturdomänen gebildet werden, welche aus der α-Kette von HGF oder MSP abgeleitet sind, was die Probleme der Moleküle aus dem Stand der Technik wie oben beschrieben, überwindet. Die Moleküle dieser Erfindung werden aus zwei Superdomänen, die durch einen Linker verknüpft sind, gebildet. Jede Superdomäne besteht aus einer Kombination von HL- und K1-K4-Domänen, die aus der α-Kette von entweder HGF oder MSP abgeleitet sind. Diese technisch ausgeführten Faktoren induzieren selektive biologische Reak tionen, benötigen keine proteolytische Aktivierung, sind stabil und sind aktiver bzw. wirksamer als die zuvor beschriebenen verkürzten Formen von HGF.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Proteine (welche hierin nachstehend in indifferenter Weise als Proteine, Moleküle, technisch ausgeführte oder rekombinante Faktoren bezeichnet werden), gekennzeichnet durch eine Struktur, die zwei Superdomänen umfasst, wobei jede aus einer Kombination von HL- und K1-K4-Domänen besteht, welche aus der α-Kette von entweder HGF oder MSP abgeleitet sind, verknüpft durch eine Spacer-Sequenz oder einen Linker. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Proteine der allgemeinen Formel (I) [A]-B-[C]-(D)_y (I)in der
[A] der Sequenz (LS)_m-HL-K1-(K2)_n-(K3)_o-(K4)_p entspricht, worin (die Nummerierung der folgenden Aminosäuren bezieht sich auf die HGF- und MSP-Sequenzen, wie in 1 bzw. 2 dargestellt):
LS eine Aminosäuresequenz, entsprechend den Resten 1–31 von HGF oder 1–18 von MSP, ist;
HL eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von HGF, die zwischen den Resten 32–70 beginnt und zwischen den Resten 96–127 endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von MSP, die zwischen den Resten 19–56 beginnt und zwischen den Resten 78–109 endet;
K1 eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von HGF, die zwischen den Resten 97–128 beginnt und zwischen den Resten 201–205 endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von MSP, die zwischen den Resten 79–110 beginnt und zwischen den Resten 186–190 endet;
K2 eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von HGF, die zwischen den Resten 202–206 beginnt und zwischen den Resten 283–299 endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von MSP, die zwischen den Resten 187–191 beginnt und zwischen den Resten 268–282 endet;
K3 eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von HGF, die zwischen den Resten 284–300 beginnt und zwischen den Resten 378–385 endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von MSP, die zwischen den Resten 269–283 beginnt und zwischen den Resten 361–369 endet;
K4 eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von HGF, die zwischen den Resten 379-386 beginnt und zwischen den Resten 464–487 endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, abgeleitet von der α-Kette von MSP, die zwischen den Resten 362–370 beginnt und zwischen den Resten 448–481 endet;
m, n, o, p 0 oder 1 sein können;
die Summe n + o + p eine ganze Zahl von 1 bis 3 oder 0 ist, mit der Maßgabe, dass n ≥ o ≥ p;
B die Sequenz [(X)_qY]_r ist, worin X = Gly und Y = Ser oder
Cys oder Met oder Ala;
q eine ganze Zahl von 2 bis 8 ist;
r eine ganze Zahl von 1 bis 9 ist;
[C] der Sequenz HL-K1-(K2)_s-(K3)_t-(K4)_u entspricht, wobei HL, K1-K4 wie oben definiert sind,
s, t, u 0 oder 1 sind; die Summe s + t + u eine ganze Zahl von 1 bis 3 oder 0 ist, mit der Maßgabe, dass s ≥ t ≥ u;
D die Sequenz W-Z ist, wobei W eine konventionelle proteolytische Stelle ist, Z eine beliebige Markierungs- bzw. Tag-Sequenz ist, die für die Aufreinigung und Detektion des Proteins nützlich ist; y 0 oder 1 ist.
Nicht-einschränkende Beispiele von W sind Consensus-Sequenzen für die Enterokinase-Protease, Thrombin, Faktor Xa und die IgA-Protease.
Bevorzugte Proteine der allgemeinen Formel (I) sind jene, in denen die HL-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 32 bis 127 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 19 bis 98 reicht; die K1-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 128 bis 203 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 99 bis 188 reicht; die K2-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 204 bis 294 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 189 bis 274 reicht; die K3-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 286 bis 383 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 275 bis 367 reicht; die K4-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Amino-säuren 384 bis 487 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 368 bis 477 reicht.
Unter den möglichen Kombinationen der Domänen der allgemeinen Formel (I) sind die folgenden (II) und (III) bevorzugt, welche zwei rekombinante Faktoren betreffen, Metron-Faktor-1 ("Metron Factor-1") bzw. Magic-Faktor-1 ("Magic Factor-1") genannt: LS_MSP-HL_MSP-K1_MSP-K2_MSP-L-HL_HGF-K1_HGF-K2_HGF-D (Metron-Faktor-1) (II)und LS_HGF-HL_HGF-K1_HGF-K2_HGF-L-HL_HGF-K1_HGF-K2_HGF-D (Magic-Faktor-1) (III).
Bei beiden Molekülen ist L eine Linker-Sequenz (Gly₄Ser)₃ und D ist eine angehängte bzw. Tag-Sequenz, Asp₄-Lys-His₆.
Bei dem Metron-Faktor-1 ist LS_MSP die Sequenz 1–18 von MSP, HL_MSP ist die Sequenz 19–56 von MSP, K1_MSP ist die Sequenz 99–188 von MSP, K2_MSP ist die Sequenz 189–274 von MSP, HL_HGF ist die Sequenz 32–127 von HGF, K1_HGF ist die Sequenz 128–203 von HGF, K2_HGF ist die Sequenz 204–294 von HGF.
Bei dem Magic-Faktor-1 sind HL_HGF, K1_HGF, K2_HGF wie oben definiert, LS_HGF ist die Sequenz 1–31 von HGF.
Die Hybridmoleküle der Erfindung werden durch Genmanipulationstechniken gemäß der Strategie hergestellt, welche die folgenden Schritte beinhaltet:

a) Konstruktion von DNA, die für das gewünschte Protein codiert;
b) Insertion von DNA in einen Expressionsvektor;
c) Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA (rDNA);
d) Kultur der transformierten Wirtszelle, um das rekombinante Protein zu exprimieren;
e) Extraktion und Aufreinigung des produzierten rekombinanten Proteins.

Die DNA-Sequenzen, welche den HGF- oder MSP-Strukturdomänen entsprechen, können durch Synthese oder ausgehend von DNA, die für die zwei natürlichen Faktoren codiert, erhalten werden. Zum Beispiel kann das Durchmustern von cDNA-Bibliotheken unter Verwendung geeigneter Sonden durchgeführt werden, um HGF- oder MSP-cDNA zu isolieren. Alternativ kann HGF- oder MSP-cDNA durch reverse Transkription von gereinigter mRNA aus geeigneten Zellen erhalten werden.
cDNA, welche für die Fragmente der HGF- und MSP-β-Kette codiert, kann mittels PCR amplifiziert werden (Mullis, K.B. und Faloona, F.A., 1987, Methods in Enzymol. 155, 335–350), und die Amplifikationsprodukte können rekombiniert werden, wobei geeignete Restriktionsstellen verwendet werden, die natürlich in den Faktorsequenzen vorkommen oder künstlich in die zur Amplifikation verwendete Oligonucleotidsequenz eingeführt wurden.
Detaillierter kann eine der oben genannten Strategien die folgende sein:
Die Teile der DNA, die für die LS-, HL-, K1-, K2-, K3- und K4-Domänen codieren, werden mittels PCR von HGF- oder MSP-cDNA amplifiziert und dann rekombiniert, um die Hybridsequenzen zu erhalten, die [A] und [C] entsprechen. Oligonucleotide, die Sequenzen erkennen, welche an den zwei Enden der Domänen, die amplifiziert werden sollen, lokalisiert sind, werden als Primer verwendet. Die Primer werden so konstruiert, dass sie eine Sequenz enthalten, welche die Rekombination zwischen der DNA einer Domäne und der angrenzenden ermöglichen. Die Rekombination kann mittels Endonuclease-Spaltungs- und nachfolgender Ligasereaktion durchgeführt werden oder durch Verwenden der rekombinanten PCR-Methode (In nis, NA et al., 1990, in PCR Protocols, Academic Press, 177–183).
Die Sequenz, welche für die Domäne B (Linker) codiert, kann durch Synthese eines Doppelstrang-Oligonucleotids erhalten werden, welches unter Verwendung geeigneter Restriktionsstellen zwischen [A] und [C] inseriert werden kann.
Die resultierenden drei Fragmente, die für [A], [B] und [C] codieren, werden dann in der korrekten Sequenz in einen geeigneten Vektor inseriert. In diesem Schritt kann entschieden werden, ob die Domäne D (Anhang), erhalten durch Synthese analog zu Domäne B, stromabwärts von Fragment [C] hinzugefügt wird oder nicht.
Der rekombinante Expressionsvektor kann zusätzlich zu dem rekombinanten Konstrukt einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Startcodon, ein Stoppcodon, gegebenenfalls einen Consensusort für Expressionsverstärker enthalten.
Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker zum Isolieren der Wirtszellen, welche das DNA-Konstrukt enthalten, umfassen. Hefe- oder Bakterienplasmide, wie Plasmide, die für Escherichia coli geeignet sind, können als Vektoren verwendet werden, sowie Bakteriophagen, Viren, Retroviren oder DNA.
Die Vektoren werden vorzugsweise in Bakterienzellen kloniert, z.B. in Escherichia coli, wie in Sambrook J., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York beschrieben, und die Kolonien können z.B. durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten Oligonucleotidsonden selektiert werden; nachfolgend wird die rDNA-Sequenz, die aus den posi tiven Kolonien extrahiert wurde, durch bekannte Verfahren bestimmt.
Der Vektor mit dem rekombinanten Konstrukt kann in die Wirtszelle gemäß dem kompetente Zelle-Verfahren, dem Protoplasten-Verfahren, dem Calciumphosphat-Verfahren, dem DEAE-Dextran-Verfahren, dem elektrischer Impuls-Verfahren, dem in vitro-Verpackungs-Verfahren (in vitro packaging method"), dem viraler Vektor-Verfahren, dem Mikroinjektionsverfahren oder anderer geeigneter Techniken eingeführt werden.
Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, wie Bakterien, Hefen oder Säugerzellen, und sie werden so sein, dass sie das rekombinante Protein effektiv produzieren.
Nach der Transformation werden die Zellen in einem geeigneten Medium wachsen gelassen, welches z.B. MEM, DMEM oder RPMI 1640 im Fall von Säuger-Wirtszellen sein kann.
Das rekombinante Protein wird in das Kulturmedium sezerniert, aus dem es mittels verschiedener Verfahren gewonnen und aufgereinigt werden kann, wie Massenausschluss, Absorption, Affinitätschromatographie, Aussalzen, Präzipitation, Dialyse, Ultrafiltration.
Ein einfaches schnelles System für die Produktion der Moleküle der Erfindung ist z.B. vorübergehende ("transient") Expression in Säugerzellen.
Demgemäß wird das Plasmid, welches das rekombinante DNA-Fragment enthält, z.B. PMT2 (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press), in geeignete Empfängerzellen, wie Cos7 (Sambrook, J. et al., sup ra), mittels der Calciumphosphat-Technik oder anderer äquivalenter Techniken transfiziert. Einige Tage nach der Transfektion wird das konditionierte Medium der transfizierten Zellen gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und hinsichtlich seines Gehaltes an dem Faktor analysiert. Für diese Analyse können Antikörper, die gegen HGF oder MSP oder gegen eine beliebige angehängte Sequenz gerichtet sind, verwendet werden: der Überstand wird immunpräzipitiert und dann mittels Western-Blot mit dem gleichen Antikörper analysiert. Der Überstand, welcher den rekombinanten Faktor enthält, kann auch direkt für biochemische und biologische Tests verwendet werden. Das Protein kann z.B. unter Verwendung einer angehängten Polyhistidin-Sequenz durch Adsorption an einer Nickelharzsäule und nachfolgender Elution mit Imidazol gereinigt werden.
Die biochemischen Eigenschaften der rekombinanten Faktoren der Erfindung wurden in Verbindung mit ihrer Fähigkeit, Met- und Ron-Rezeptoren zu aktivieren, getestet.
Es wurde nachgewiesen, dass sub-mikromolare Konzentrationen der Faktoren die Phosphorylierung bei Met-Tyrosin in humanen Epithelzellen, A549, induzieren, wohingegen sie keine Phosphorylierung über den Baisis-Werten in Zellen, die Ron exprimieren, induzieren. Insgesamt wiesen die Tests nach, dass die ersten zwei Kringel von HGF ihre Fähigkeit zum Wechselwirken und zum Aktivieren des Met-Tyrosin-Kinase-Rezeptors behalten, wohingegen die entsprechenden ersten zwei Kringel von MSP nicht ausreichend sind, um die katalytische Aktivität des Ron-Rezeptors zu modulieren. Jedoch kann die Wechselwirkung mit Ron, obwohl bei geringer Affinität, zur Rekrutierung des Faktors an der Zelloberfläche beitragen, wobei er eine ähnliche Rolle wie die Rezeptoren mit geringer Affinität (des reifen Glycoproteins), welche das intakte HGF-Molekül durch die Heparin-bindende Domäne rekrutieren, spielt.
Die Moleküle der Erfindung haben eine merkliche biologische Aktivität, welche mittels der Streuungstests gemessen wird, und eine schützende Aktivität gegen Zellapoptose, welche durch Cisplatin oder Etoposid induziert wird.
Insbesondere wurde festgestellt, dass der Überstand, der den rekombinanten Faktor enthält, das Streuen von Epithelzellen verschiedener Beschaffenheit sogar bei nanomolaren Konzentrationen fördert. In diesen Tests wurden Nierenepithelzellen (MDCK) oder Hepatozyten-Präkursoren (MLP29) verwendet.
In einem in vitro-Versuchssystem, in dem DNA-Fragmentierung, welche typisch für apoptotische Zellen ist, mittels des TU-NEL-Verfahrens bewertet wird (Gavrieli, Y. et al., 1992, J. Cell. Biol. 117, 493–501), schützen die rekombinanten Faktoren gegen Apoptose, welche durch chemotherapeutische Wirkstoffe induziert wird, auf Leveln, die mit HGF vergleichbar und merklich höher als bei MSP sind. Es wurde nachgewiesen, dass die technisch ausgeführten Moleküle bei humanen primären Epithelzellen aus proximalen Tubuli (PTECs), bei einer immortalisierten PTECs-Linie (Loc) und bei den bereits zitierten murinen Hepatozyten-MLP29 wirksam sind.
Unter den Applikationen der rekombinanten Moleküle der Erfindung können die folgenden zitiert werden:

– Prävention von Myelotoxizität; sie können insbesondere für die Expansion von Medulla-Präkursoren, zum Erhöhen der Proliferation der hämatopoetischen Präkursoren oder zum Stimulieren ihres Eintritts in den Kreislauf verwendet werden;
– Prävention von Leber- und Nierentoxizität und von Mukositis, die auf anti-neoplastische Behandlungen folgt; insbesondere können die rekombinanten Faktoren verwendet werden, um Toxizität (Apoptose) bei differenzierten Zellelementen von Leber, Niere und Mukosa des Gastroenteraltraktes zu verhindern und um die staminalen Elemente ("staminal elements") von Kutis und von Mukosa zu stimulieren, um die Regeneration von Keimschichten zu ermöglichen;
– Prävention der Neurotoxizität von Chemotherapeutika.

Im Allgemeinen stellen die Proteine der Erfindung die folgenden Vorteile, verglichen mit den Eltern-Molekülen HGF und MSP, bereit:

– sie sind kleinere Moleküle mit einer kompakteren Struktur;
– sie sind stabiler und werden in höheren Mengen produziert;
– sie benötigen keine endoproteolytische Spaltung zur Aktivierung, welche die HGF- und MSP-Präkursoren in die entsprechenden aktiven Formen transformiert;
– sie können in Kombinationen aus verschiedenen funktionellen Domänen technisch ausgeführt werden, wodurch die biologischen Wirkungen moduliert werden, die günstigen erhöht werden und die unerwünschten vermindert werden (z.B. Schutz vor Apoptose versus Zellproliferation).

Die Erfindung soll auch so betrachtet werden, dass sie auf Aminosäuren- und Nucleotidsequenzen gerichtet ist, auf die sich Formel (I) bezieht, mit Modifikationen, die sich z.B. aus der Degeneration des genetischen Codes, ohne dass dadurch die Aminosäuresequenz modifiziert wird, oder aus der Deletion, Substitution, Insertion, Inversion oder Addition von Nucleotiden und/oder Basen gemäß aller im Fachgebiet bekannter möglicher Verfahren ableiten können.
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Expressionsvektoren, umfassend eine Sequenz, die für ein Protein der allgemeinen Formel (I) codiert, welche Plasmide, Bakteriophagen, Viren, Retroviren oder andere sein können, und auf Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten.
Schließlich bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der rekombinanten Proteine als therapeutische Mittel und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine wirksame Menge der rekombinanten Proteine zusammen mit pharmakologisch annehmbaren Excipientien.
Beschreibung der Figuren
(In den folgenden Legenden bedeutet -His, angeordnet nach dem Namen des Elternfaktors, verkürzt oder rekombinant, oder der Plasmide, dass die entsprechenden Sequenzen einen Polyhistidin-Anhang enthalten.)
1:

a) Nucleotid- und Aminosäuresequenz von humanem HGF (Gene Bank # M73239; Weidner, K.M., et al., 1991, Proc. Acad. Sci. USA, 88:7001–7005). Im Gegensatz zu der zitierten Referenz ist das Nucleotid Nr. 1 in der hierin verwendeten Nummerierung die erste Base des Startcodons (das A des ersten ATG). Die erste Aminosäure ist das entsprechende Methionin. Die nicht-translatierten cDNA-Bereiche an 5' und 3' sind weder dargestellt noch bei der Nummerierung berücksichtigt worden.
b) Nucleotid- und Aminosäuresequenz von humanem MSP (Gene Bank # L11924; Yoshimura, T., et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:15461–15468). Im Gegensatz zu der zitierten Referenz ist das Nucleotid Nr. 1 in der hierin verwendeten Nummerierung die erste Base des Startcodons (das A des ersten ATG). Die erste Aminosäure ist das entsprechende Methionin. Die nichttranslatierten cDNA-Bereiche an 5' und 3' sind weder dargestellt noch bei der Nummerierung berücksichtigt worden.

2:

a) Molekülstruktur von Metron-Faktor-1. Die Signalsequenz wird von den zur Produktion verwendeten Zellen vor der Sezernierung entfernt und fehlt daher in dem reifen Molekül. Der Polyhistidin-Anhang kann durch Verdau mit der Protease-Enterokinase entfernt werden.
b) Nucleotid- und Aminosäuresequenz von Metron-Faktor-1. Die Nucleotidsequenz beginnt mit der EcoRI-Stelle und endet mit der SalI-Stelle (erste sechs Basen bzw. letzte sechs Basen). Das Startcodon (ATG) und das Stoppcodon (TAG) sind unterstrichen.

3:

a) Molekülstruktur von Magic-Faktor-1. Die Signalsequenz wird von den für die Produktion verwendeten Zellen vor der Sezernierung entfernt und fehlt daher in dem reifen Molekül. Der Polyhistidin-Anhang kann durch Verdau mit der Protease-Enterokinase entfernt werden.
b) Nucleotid- und Aminosäuresequenz von Magic-Faktor-1. Die Nucleotidsequenz beginnt mit der SalI-Stelle (erste sechs Basen bzw. letzte sechs Basen). Das Startcodon (ATG) und das Stoppcodon (TAG) sind unterstrichen.

4:
Produktion von Metron-F-1 durch vorübergehende Transfektion von Säugerzellen. Die konditionierten Überstände von BOSC-Zellen, die mit dem Kontrollplasmid (CTRL) oder mit pRK7-Metron-F-1-His transfiziert waren, wurden mit einem polyklonalen Anti-MSP-Antikörper immunpräzipitiert und mittels Western-Blot mit dem gleichen Antikörper detektiert.
5:
Quantifizierung der rekombinanten Proteine mittels Western-Blot. (A) Die Proteine wurden an Sepharose-A-Heparin-Kügelchen adsorbiert und mit einem monoklonalen Anti-Polyhistidin-Antikörper detektiert. (B) Die Proteine wurden mit einem polyklonalen Anti-MSP-Antikörper immunpräzipitiert und mit einem monoklonalen Anti-Polyhistidin-Antikörper detektiert.
6:
Streuungstests, durchgeführt an Nierenepithelzellen (MDCK) unter Verwendung der durch vorübergehende Transfektion hergestellten rekombinanten Proteine. Der Proteingehalt wurde mittels Western-Blot (siehe 5) quantifiziert. (A) Nichtstimulierte Zellen; (B) Zellen, stimuliert mit Kontrollüberstand; (C) Zellen, stimuliert mit HGF-His; (D) Zellen, stimuliert mit NK2-HGF-His; (E) Zellen, stimuliert mit Metron-Faktor-1; (F) Zellen, stimuliert mit Magic-Faktor-1.
7:
Aktivierung (Phosphorylierung) des Met-Rezeptors durch den Hybridfaktor Metron-Faktor-1. Humane Epithelzellen (A549) wurden mit den konditionierten Überständen von BOSC-Zellen, transfiziert mit dem Kontrollplasmid (CTRL) oder mit pRK7-Metron-F-1-His (METRON F-1), bei den angegebenen Verdünnungen stimuliert. Zelllysate aus den stimulierten Zellen wurden mit einem monoklonalen Anti-Met-Antikörper immunpräzipitiert und mittels Western-Blot mit einem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper detektiert.
8:
Schützende Wirkung von Metron-F-1 gegen akutes Nierenversagen, induziert durch HgCl₂ in vivo. Balb-c-Mäusen wurde i.v. Metron-F-1 oder ein Vehikel 0,5 Stunden vor und 6, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der i.v. HgCl₂-Verabreichung injiziert. BUN und histologische Beurteilung der Nierennekrose wurde nach 72 Stunden gemessen.
Die Daten sind als Mittelwert + E.S. von 7 Tieren/Gruppe (BUN) oder 3 Tieren/Gruppe (Histologie) ausgedrückt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung detaillierter.
Beispiel 1a: Herstellung des rekombinanten Konstrukts, das für Metron-Faktor-1 codiert
HGF-cDNA wurde mittels der RT-PCR-Technik (Reverse Transkriptase-PCR; in: Innis, M. A., et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, 21–27) aus einer humanen Lungenfibroblastenzelllinie (MRCS; Naldini, L. et al., 1991, EMBO J. 10: 2867–2878) erhalten. MSP-cDNA wurde mit der gleichen Technik aus humaner Leber (Gaudino, G., et al., 1994, EMBO J. 13: 3524–3532) erhalten.
Das Fragment, welches LS-HL-K1-K2 von MSP entspricht, wurde mittels PCR unter Verwendung von MSP-cDNA als Matrize und der folgenden Oligonucleotiden als Primer amplifiziert:
P1 (Sense)
5' CGCGCGGAATTCCACCATGGGGTGGCTCCCACTCCT 3'
P2 (Antisense)
5' CGCGCGCTCGAGGCGGGGCTGTGCCTCGGACCCGCA 3',
in denen die unterstrichenen Palindromsequenzen die Restriktionsstellen für die Enzyme EcoRI (Oligonucleotid P1) und XhoI (Oligonucleotid P2) sind. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI verdaut und dann mittels Elektrophorese in Agarosegel aufgereinigt.
Das Fragment, welches HL-K1-K2 von HGF entspricht, wurde mittels PCR unter Verwendung von HGF-cDNA als Matrize und der folgenden Oligonucleotide als Primer amplifiziert:
P3 (Sense) 5' CGCGCGTCTAGAGGGACAAAGGAAAAGAAGAAATAC 3'
P4 (Antisense)
5' CGCGCGAAGCTTTGTCAGCGCATGTTTTAATTGCAC 3',
in denen die unterstrichenen Palindromsequenzen die Restriktionsstellen für die Enzyme XbaI (Oligonucleotid P3) und HindIII (Oligonucleotid P4) sind. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII verdaut und dann mittels Elektrophorese in Agarosegel gereinigt.
Für die Linker-Sequenz wurden die folgenden teilweise komplementären Oligonucleotide synthetisiert und sie wurden nachfolgend aneinander angelagert ("annealed"), um ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit klebrigen Enden zu erhalten:
P5 (Sense)
5' TCGAGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCT 3'
P6 (Antisense)
5' CTAGAGRACCGCCACCGCCGGAGCCACCGCCACCAGRACCGCCACCGCCC 3',
in welchen die unterstrichenen Basen die Sequenzen sind, welche mit den Restriktionsstellen für die Enzyme XhoI (Oligonucleotid P5) und XbaI (Oligonucleotid P6) kompatibel sind.
Die resultierenden drei DNA-Fragmente wurden in die EcoRI-HindIII-Stellen des Expressionsvektors pRK7 subkloniert (Gaudino, G., et al., 1994, EMBO J. 13: 3524–3532), um das rekombinante Plasmid pRK7-Metron-F-1 zu erhalten, welches alle Komponenten von Metron-Faktor-1, außer der angehängten Sequenz, enthält.
Für die Insertion der angehängten Sequenz wurden die folgenden teilweise komplementären Oligonucleotide synthetisiert und sie wurden nachfolgend aneinander angelagert, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit klebrigen Enden zu erhalten:
P7 (Sense)
5' AGCTGACGACGACGACARACACCACCACCACCACCACCACTAGGGTCGAC 3'
P8 (Antisense)
5' AGCTGTCGACCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTGTCGTCGTCGTC 3',
in welchen die unterstrichenen Basen mit der HindIII-Restriktionsstelle kompatibel sind, und die verpackten ("boxed") Palindromsequenzen sind die Consensussequenzen für das Enzym SalI. Das resultierende doppelsträngige DNA-Fragment wurde in die Restriktionsstelle HindIII des rekombinanten Plasmids, das im vorigen Schritt erhalten worden war, inseriert (wobei die HindIII-Stelle zerstört wurde und die SalI-Stelle erzeugt wurde), um das Plasmid pRK7-Metron-F-1-His zu erhalten.
Beispiel 1b: Produktion von Metron-Faktor-1
Der Expressionsvektor pRK7 enthält einen Promotor des immediate-early-Gens des humanen Zytomegalovirus (CMV) und einen episomalen Replikationsursprungsort des DNA-Virus SV40. Daher ist dieses Plasmid besonders geeignet für die Expression von Proteinen in Zellen, welche das große T-Antigen des Virus SV40 exprimieren, wie die Nierenepithelzellen BOSC (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Der Metron-Faktor-1 kann dann durch vorübergehende Transfektion des Plasmids pRK7-Metron-F-1-His in BOSC-Zellen produziert werden.
Für die Transfektion werden 10⁶ Zellen am Tag 0 in eine 100 mm-Platte in 90% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-10% bovines Kälberserum (10 ml/Platte) ausplattiert. Am Tag 1 werden die Zellen mit 10 μg/Platte pRK7-Metron-F-1-His durch Lipofektion unter Verwendung des vom Lipofectin-Hersteller (Gibco-BRL) bereitgestellten Protokolls transfiziert. Am Tag 2 wird das DNA-enthaltende Medium durch frisches Medium mit geringem Serumgehalt ersetzt (99,5% DMEM- 0,5% bovines Kälberserum). Am Tag 4 (48 Stunden nach dem Ende der Transfektion) wird das Medium gesammelt, mittels Zentrifugation geklärt und bezüglich seines Gehaltes an Metron-Faktor-1 analysiert.
Diese Analyse kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das in dem geklärten Überstand vorhandene rekombinante Protein mit einem Anti-MSP-Antikörper immunpräzipitiert werden und dann mittels Western-Blot mit dem gleichen Antikörper (4) detektiert werden. In dem in 4 gezeigten Beispiel wurden 500 μl Überstand (mittels Zentrifugation geklärt, gepuffert in 25 mM HEPES und mit einem Proteaseinhibitorengemisch versetzt) immunpräzipitiert (2 Stunden bei 4°C) mit 20 μl Sepharose-A-Kügelchen (Pharmacia), kovalent konjugiert mit 2 μl polyklonalem Anti-MSP-Antikörper. Das Kügelchen-Pellet wurde 3 mal mit 500 μl Waschpuffer gewaschen (20 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,1 Triton X-100; 10% Glycerin), und sie wurden 2 Minuten lang in 100 μl Laemmli-Puffer auf 90°C erhitzt. Die eluierten Proteine wurden mittels SDS-PAGE in 8% BIS-Acrylamidgel getrennt, auf eine Membran übertragen (Hybond-C; Amersham) und mittels Western-Blot analysiert. Für diese Analyse wurde das zur Immunpräzipitation verwendete Kaninchenserum als primärer Antikörper mit einer 1:1000-Verdünnung eingesetzt und Protein A, konjugiert mit Peroxidase (Amersham), wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Das Protein A wurde mittels ECL (Amersham) detektiert, wobei dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll gefolgt wurde.
Alternativ kann das rekombinante Protein mittels Adsorption an Sepharose-A-Kügelchen, konjugiert mit Heparin, und nachfolgender Analyse mittels Western-Blot unter Verwendung von Antikörpern, die gegen den Polyhistidin-Anhang gerichtet sind (5), teilweise aufgereinigt werden.
In dem in 5 gezeigten Beispiel wurden die Sepharose-A-Heparin-Kügelchen (20 μl; Pierce) mit 500 μl Überstand (geklärt mittels Zentrifugation, gepuffert in 25 mM HEPES und mit einem Proteaseinhibitorengemisch versehen) in Gegenwart von 500 mM NaCl inkubiert (4 Stunden bei 4°C), mit einem geeigneten Puffer gewaschen (500 mM NaCl; 20 mM HEPES, pH 7,4; 0,1% Triton X-100; 10% Glycerin) und für 2 Minuten in 100 μl Laemmli-Puffer auf 90°C erhitzt. Die eluierten Proteine wurden mittels SDS-PAGE in 8% Bis-acrylamid-Gel getrennt, auf eine Membran übertragen (Hybond-C; Amersham) und mittels Western-Blot analysiert. Für diese Analyse wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen Polyhistidin (Invitrogen), verdünnt 1:5000, als primärer Antikörper verwendet und ein Anti-Maus-IgG-Schaf-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase (Amersham) wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Der sekundäre Antikörper wurde mittels ECL (Amersham) detektiert, wobei dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll gefolgt wurde.
Die Vorgehensweise der Adsorption an Heparin-Kügelchen kann ebenfalls als Protokoll für eine Semi-Aufreinigung des rekombinanten Proteins verwendet werden. Darüber hinaus kann das Molekül zusätzlich gereinigt werden, indem die Polyhistidin-Affinität für Schwermetalle, wie Nickel, ausgenutzt wird. Das Protein, welches einen Polyhistidinanhang enthält, kann an eine Nickel-Harz-Säule (Invitrogen) adsorbiert werden und nachfolgend mit Imidazol eluiert werden (das detaillierte Protokoll wird vom Hersteller bereitgestellt).
Beispiel 1c: METRON-F-1-Produktion in Insektenzellen
Die für Metron-F1 codierende cDNA wurde in einen geeigneten Expressionsvektor (p-FASTBAC) subkloniert, um ein rekombinantes Plasmid zu erzeugen, welches das Metron-F1-Gen (p-FASTBAC-Metron) enthält. Ein kompetenter E. coli-Stamm (DH10 Bac) wurde mit p-FASTBAC-Metron transformiert, um BAC-MID-DNA zu erzeugen. Die DNA der positiven Kolonien wurde isoliert und mittels PCR wurde geprüft, ob sie die korrekte Integration des Expressionsvektors zeigten. Nachfolgend wurde die DNA aus drei Klonen in Sf9-Insektenzellen mit dem Cell-FECTIN-Reagens transfiziert, um Viruspartikel zu produzieren. Der Virustiter wurde mittels eines Plaque-Assays getestet. Einzelne Plaques wurden isoliert und für eine weitere Vermehrung des Baculovirus verwendet. Die Virus-Stammlösung ("vital stock") wurde nachfolgend in Insektenzellen verbreitet, um die METRON-F-1-Produktion zu vergrößern. Um die Proteinexpression zu verifizieren, wurden die Insektenzellen mit einer Multiplizität der Infektion ("multiplicity of infection") (MOI) von 1 in einem Reaktor mit kleinem Maßstab infiziert. Proben der Überstände wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Western-Blotting.
Um Mengen zu produzieren, die für in vivo-Tests angemessen sind, wurden Insektenzellen in einem 2,5-Liter Rührkessel-Bioreaktor vermehrt. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 1,106 ml^–1 wachsen gelassen, bevor sie mit einer MOI von 1 infiziert wurden. Die Zellsuspension wurde 3 Tage nach der Infektion geerntet. Der Überstand, welcher das rekombinante Protein enthielt, wurde mittels Zentrifugation abgetrennt. Das Vorhandensein von Metron-F-1 in dem Überstand wurde mittels SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting, nachgewiesen. Metron-F-1 wurde mittels einer zweistufigen Affinitätschromatographie an Heparin-Sepharose (Heparin-Hi Trap, Pharmacia) bei 6°C vorgereinigt. Für in vivo-Tests oder für weitere Aufreinigungsschritte wurden die eluierten Fraktionen, welche Metron-F-1 enthielten, mittels Sephadex G-25-Chromatographie (PD-10 oder HiPrep 26/10, Pharmacia) entsalzt. Metron-F-1 wurde weiterhin mittels Chromatographie an HisTrap-Säulen (Pharmacia) gereinigt und mittels eines Imidazol-Gradienten (0–0,5 M) unter Verwendung von entweder einem Niederdrucksystem (Econo System, BIO-RAD) oder einem FPLC-System (Pharmacia) eluiert. Metron-F-1 wurde bei einer Imidazolkonzentration von etwa 0,15 M eluiert. Für in vivo-Tests wurden die eluierten Fraktionen, die Metron-F-1 enthielten, mittels Sephadex G-25-Chromatographie, wie bereits beschrieben, von Imidazol befreit, wobei der Puffer verwendet wurde, der für Tier-Behandlung verwendet werden soll.
Beispiel 2a: Herstellung des rekombinanten Konstruktes, das für Magic-Faktor-1 codiert
HGF-cDNA und das Plasmid pRK7-Metron-F-1-His, wie oben beschrieben, wurden als Ausgangs-DNA verwendet. Das Fragment, welches LS-HL-K1-K2 von HGF entspricht, wurde mittels PCR unter Verwendung von HGF-cDNA als Matrize und der folgenden Oligonucleotide als Primer amplifiziert:
P9 (Sense)
5' CGCGCGGGATCCGCCAGCCCGTCCAGCAGCACCATG 3'
P10 (Antisense)
5' CGCGCGAAGCTTTGTCAGCGCATGTTTTAATTGCAC 3',
in welchen die unterstrichenen Palindromsequenzen die Restriktionsstellen für die Enzyme BamHI (Oligonucleotid P9) und HindIII (Oligonucleotid P10) sind. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut und dann mittels Elektrophorese in Agarosegel gereinigt.
Für den Linker wurden die folgenden partiell komplementären Oligonucleotide synthetisiert und nachfolgend aneinander angelagert, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit klebrigen Enden zu erhalten:
P11 (Sense)
5' AGCTTCGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCT 3'
P12 (Antisense)
5' CTAGAGAACCGCCACCGCCGGAGCCACCGCCACCAGAACCGCCACCGCCCGA 3',
in denen die unterstrichenen Basen die Sequenzen sind, welche mit den Restriktionsstellen für die Enzyme HindIII (Oligonucleotid P11) und XbaI (Oligonucleotid P12) kompatibel sind. Das aus der PCR resultierende Fragment und die doppelsträngige Linker-Sequenz wurden in das Plasmid pRK7-Metron-F-1-His anstelle des Fragmentes EcoRI-XbaI mittels eines EcoRI-BamHI- Adapters inseriert, um das Plasmid pRK7-Magic-F-1-His zu erhalten.
Beispiel 2b: Produktion von Magic-Faktor-1
Der Magic-Faktor-1 wird in einem kleinen Maßstab durch vorübergehende Transfektion von BOSC-Zellen analog zu dem produziert, was für den Metron-Faktor-1 beschrieben wurde. Eine Semi-Aufreinigung wird durch Adsorption an Sepharose-A-Kügelchen, konjugiert mit Heparin, gefolgt von Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Polyhistidin-Antikörpern (5) durchgeführt.
Beispiel 3: Biologische Aktivität (Streuen) bei Epithelzellen
Die biologische Aktivität von rekombinantem HGF, NK2-HGF, Metron-Faktor-1 und Magic-Faktor-1 wurde mittels eines "Streuungs"-Assays ("scatter" assay) an MDCK-Epithelzellen getestet. Für diesen funktionellen Test werden die Zellen am Tag 0 in 96-Well-Platten (10³ Zellen/well) in 90% DMEM – 10 bovines Kälberserum ausplattiert. Am Tag 1 wird das Medium durch frisches Medium ersetzt, welches mit 50 mM HEPES, pH 7,4, gepuffert ist, und der Überstand, welcher das rekombinante Protein enthält, wird in verschiedenen Verdünnungen hinzugefügt. Am Tag 2 werden die Zellen mit DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) gewaschen, in 11% Glutaraldehyd fixiert, mit einer Kristallviolett-Lösung gefärbt und mittels Mikroskopie analysiert. Die Streuungsaktivität wird bewertet, indem die Morphologie der Kolonien beobachtet wird, welche bei der Negativkontrolle (nicht-stimulierte Zellen oder stimuliert mit einem Überstand, der keine Faktoren enthält) zusammengeballt sind, wohingegen sie bei der Positivkontrolle (HGF-His) verstreut sind. Die Morphologie der Zellen selbst variiert auch bei Stimulierung: wie in 6 beobachtet werden kann, weisen die Zellen, die mit HGF-His und Metron-Faktor-1 stimuliert wurden, tatsächlich eine eher längliche, Spindel-gestaltige Form, charakterisiert durch Protrusionen der Zellmembran, die Pseudopoden genannt werden, auf. Diese morphologischen Variationen sind die Konsequenz einer Faktorinduzierten Aktivierung eines genetischen Programms, das die Modifikation einer Serie zellulärer Parameter, wie Verdau der Zellmatrix durch spezifische Proteasen und Erhöhung der Motilität, beinhaltet.
Die Tabelle fasst die Ergebnisse verschiedener Tests zusammen, die mit den Faktoren HGF, NK2-HGF, Metron-Faktor-1 und Magic-Faktor-1 bei MDCK-Zellen erhalten wurden. Die angegebenen Streuungseinheiten ("scattering units") zeigen die maximale Verdünnung des konditionierten, den Faktor enthaltenden Überstandes an, bei der die motogene Aktivität beobachtet werden konnte. Die Werte sind bezüglich des Proteingehaltes, der durch Western-Blotting, wie oben beschrieben (siehe 5), bestimmt wurde, normalisiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Hybridfaktoren Metron-Faktor-1 und Magic-Faktor-1 eine Streuungsaktivität aufweisen, die näherungsweise drei Größenordnungen höher ist als diejenige der verkürzten Form, NK2-HGF-His, und eine Größenordnung höher als diejenige des HGF-His-Elternfaktors.
Tabelle. Streuungsaktivität der Faktoren HGF-His, NK2-HGF-His, Metron-Faktor-1, gemessen an Nierenepithelzellen (MDCK). Die angegebenen Streuungseinheiten zeigen die maximale Verdünnung des konditionierten, den Faktor enthaltenden Überstandes an, bei der eine motogene Aktivität beobachtet werden kann. Die Werte sind bezüglich des Proteingehaltes, bestimmt mittels Western-Blotting, normalisiert.
Beispiel 4a: Test für die Bewertung des Schutzes gegen den programmierten Zelltod (Apoptose)
Eine der am genauesten charakterisierten Nebenwirkungen des chemotherapeutischen Wirkstoffs Cisplatin ist die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) der Epithelzellen der proximalen Tubuli, was zu akutem Nierenversagen ("acute renal failure") (ARF) führt. Somit ist ein Faktor, der gegen Cisplatin-induzierte Zytotoxität schützt, sehr wünschenswert. Ein funktioneller Test, in vitro, wurde verwendet, welcher es ermöglicht, den Prozentsatz Cisplatin-behandelter apoptotischer Zellen in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Überlebensfaktors zu bewerten. Dieses System verwendet eine Zelllinie (LOC), die von Epithelzellen der proximalen Tubuli der menschlichen Niere stammt, immortalisiert durch ektopische Expression des großen T-Antigens von SV40. Für den funktionellen Test werden Zellen am Tag 0 in 96-Well-Platten (103 Zellen/Well) in 90% DMEM – 10% bovines Kälberserum ausplattiert. Am Tag 1 wird das Medium durch Medium ersetzt, welches 0,5% bovines Kälberserum, gepuffert mit 50 mM HEPES, pH 7,4, enthält, was dann mit verschiedenen Verdünnungen des Überstandes, der den rekombinanten Faktor enthält, versetzt wird. Die Zellen werden mit diesen Faktoren 6 Stunden lang vorinkubiert und dann in Gegenwart von 10 μg/ml Cisplatin weiter inkubiert. Am Tag 2 werden die Zellen mit DPBS gewaschen und der Prozentsatz apoptotischer Zellen wird durch die TUNEL-Technik (Boehringer Mannheim) evaluiert. Die gleichen Testarten können unter Verwendung primärer Kulturen humaner Epithelzellen der proximalen Tubuli von Nieren (PTEC) durchgeführt werden. Diese Tests wiesen nach, dass der Metron-Faktor-1 und der Magic-Faktor-1 schützende Aktivität gegen Cisplatin-induzierten programmierten Zelltod haben.
Beispiel 4b: Schutz gegen Cisplatin-induzierte Zytotoxizität durch vorübergehende Genzuführung von Metron-Faktor-1 und Magic-Faktor-1
Der schützende Effekt von Metron-F-1 und Magic-F-1 gegen Cisplatin-induzierte Zytotoxizität wurde weiterhin durch eine vorübergehende Genzuführungs-Herangehensweise gezeigt. Nierenepithelzellen vom Affen (COS) wurden mit einem leeren Vektor zur Kontrolle, einem Expressionsvektor für Metron-F-1 oder einem Expressionsvektor für Magic-F-1 transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen 16 Stunden lang mit Cisplatin (20 μg/ml) behandelt und der Prozentsatz überlebender Zellen bei jeder Transfektion wurde bestimmt. Die Cisplatin-Behandlung wurde so kalibriert, dass der Tod von näherungsweise 20% der Zellen in der Negativkontrolle verursacht wurde. Die ektopische Expression von Metron-F-1 oder Magic-F-1 erhöhte die Überlebensrate auf etwa 92,3% bzw. 94,0%.
Beispiel 5: Aktivierung des Met-Rezeptors durch Metron-Faktor-1 und Magic-Faktor-1
Die Fähigkeit von Metron-Faktor-1 und Magic-Faktor-1, den Met-Rezeptor zu aktivieren, wurde getestet, indem die Fähigkeit der rekombinanten Faktoren, Tyrosin-Phosphorylierung von Met in humanen Epithelzellen (A549) zu induzieren, analysiert wurde. Für diese Analyse wurden A549-Zellen bei 90% Konfluenz in einer 100 mm-Petrischale 10 Minuten lang mit 1 ml konditioniertem Überstand, der Metron-Faktor-1, Magic-Faktor-1 oder keinen Faktor (als Negativkontrolle), verdünnt 1:2,5 oder 1:10 in DMEM, enthielt, stimuliert. Nach der Stimulierung wurden die Zellen in Eis mit PBS gewaschen, in 200 μl Lyse-Lösung lysiert (1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4), mit einem Gemisch von Proteaseinhibitoren versetzt, immunpräzipitiert für 2 Stunden bei 4°C mit 10 μl Sepharose-A-Kügelchen, kovalent konjugiert mit einem monoklonalen Anti-Met-Antikörper (Naldini, L. et al., 1991, EMBO J. 10: 2867–2878), dreimal in der gleichen Lyse-Lösung gewaschen und 2 Minuten auf 90°C erhitzt, um die adsorbierten Proteine zu eluieren. Diese wurden mittels SDS-PAGE in einem 8% BIS-Acrylamid-Gel getrennt, auf eine Membran übertragen (Hybond-C; Amersham) und mittels Western-Blot analysiert. Ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen Phosphotyrosin (UBI), verdünnt 1:10000, wurde als primärer Antikörper verwendet und ein Anti-Maus-IgG-Schaf-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase (Amersham), wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Der sekundäre Antikörper wurde mittels ECL (Amersham) detektiert, wobei dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll gefolgt wurde. Diese Analyse zeigte, dass Metron-F-1 und Magic-F-1 den Met-Rezeptor wirksam aktivieren (7).
Beispiel 6: Schutz gegen Chemotherapie-induziertes Nierenversagen durch Metron-Faktor-1 in vivo
Metron-F-1 wurde in einem Modell für Nephrotoxizität in Balbc-Mäusen getestet. Das verwendete Verfahren war im Wesentlichen wie beschrieben (Kawaida K. et al., 1994, Hepatocyte growth factor prevents acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:4357–4361). Kurz gesagt wurde Nierenversagen in männlichen Balb-c-Mäusen, die 20 bis 25 g wogen, durch eine i.v.-Injektion von 7,5 mg/kg HgCl₂ (7 Tiere/Gruppe) induziert. Der Nierenschaden wurde mittels Analyse des Blut-Harnstoff-Stickstoffs ("Blood Urea Nitrogen") (BUN) und mittels histologischer Beurteilung 72 Stunden nach der HgCl₂-Injektion bewertet. Metron-F-1 wurde in 0,2 M NaCl aufgelöst, enthaltend 0,01% Tween 80 und 0,25% humanes Serumalbumin, und es wurde i.v. (100 μg/kg in einem posologischen Volumen von 6,6 ml/kg) 0,5 Stunden vor und 6, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der HgCl₂-Injektion verabreicht. Kontrolltiere wurden mit der gleichen Menge an Vehikel gemäß dem gleichen Schema behandelt.
Metron-F-1 verhinderte signifikant den Ausbruch von akutem Nierenversagen, induziert durch HgCl₂, welches ausgedrückt als BUN bewertet wurde (8). Die BUN-Werte verliefen eng parallel mit den histologischen Befunden, welche durch einen unabhängigen Untersucher beziffert wurden.
Im folgenden Sequenzprotokoll sind:
SEQ ID NO: 1: Magic-F-1-DNA, codierende Sequenz;
SEQ ID NO: 2: Magic-F-1-Aminosäuresequenz;
SEQ ID NO: 3: Metron-F-1-DNA, codierende Sequenz;
SEQ ID NO: 4: Metron-F-1-Aminosäuresequenz.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinante Proteine, umfassend zwei Superdomänen, getrennt durch eine Spacer-Sequenz (Linker), wobei jede Superdomäne aus einer Kombination von HL- und K1-K4-Domänen besteht, abgeleitet von der alpha-Kette von entweder HGF oder MSP, gemäß der allgemeinen Formel (I) [A]-B-[C]-(D)y (I),in der [A] der Sequenz (LS)_m-HL-K1-(K2)_n-(K3)_o-(K4)_p entspricht, worin: die Nummerierung der folgenden Aminosäuren sich auf die HGF- und die MSP-Sequenzen bezieht, wie in 1 bzw. 2 dargestellt, LS eine Aminosäuresequenz, entsprechend den Resten 1–31 von HGF oder 1–18 von MSP, ist; HL eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 32–70 der HGF-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 96–127 der identischen Kette endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 19–56 der MSP-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 78–109 der identischen Kette endet; K1 eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 97–128 der HGF-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 201–205 der identischen Kette endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 79–110 der MSP-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 186–190 der identischen Kette endet; K2 eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 202–206 der HGF-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 283–299 der identischen Kette endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 187–191 der MSP-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 268–282 der identischen Kette endet; K3 eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 284–300 der HGF-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 378–385 der identischen Kette endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 269–283 der MSP-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 361–369 der identischen Kette endet; K4 eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 379–386 der HGF-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 464–487 der identischen Kette endet; oder es eine Aminosäuresequenz ist, die zwischen den Resten 362–370 der MSP-α-Kette beginnt und zwischen den Resten 448–481 der identischen Kette endet; m, n, o, p 0 oder 1 sind; die Summe n + o + p eine ganze Zahl von 1 bis 3 oder 0 ist, mit der Maßgabe, dass n ≥ o ≥ p; B die Sequenz [(X)_gY]_r ist, worin X = Gly und Y = Ser oder Cys oder Met oder Ala; q eine ganze Zahl von 2 bis 8 ist; r eine ganze Zahl von 1 bis 9 ist; [C] der Sequenz HL-K1-(K2)_s-(K3)_t-(K4)_u entspricht, wobei HL, K1-K4 wie oben definiert sind, s, t, u 0 oder 1 sind; die Summe s + t + u eine ganze Zahl von 1 bis 3 oder 0 ist, mit der Maßgabe, dass s ≥ t ≥ u; D die Sequenz W-Z ist, wobei W eine konventionelle proteolytische Stelle ist, Z eine beliebige Markierungs- bzw. Tag-Sequenz ist, die für die Aufreinigung und Detektion des Proteins nützlich ist; y 0 oder 1 ist.
Rekombinante Proteine gemäß Anspruch 1, in denen die HL-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 32 bis 127 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 19 bis 98 reicht; die K1-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 128 bis 203 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 99 bis 188 reicht; die K2-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 204 bis 294 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 189 bis 274 reicht; die K3-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 286 bis 383 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 275 bis 367 reicht; die K4-Domäne eine Sequenz der HGF-α-Kette ist, die von den Aminosäuren 384 bis 487 reicht, oder eine Sequenz der MPS-α-Kette, die von den Aminosäuren 368 bis 477 reicht.
Rekombinante Proteine gemäß den Ansprüchen 1–2 der Formel (II): LS_MSP-HL_MSP-K1_MSP-K2_MSP-L-HL_HGF-K1_HGF-K2_HGF-D (II),in der LS_MSP die Sequenz 1–18 von MSP ist, HL_MSP die Sequenz 19–56 von MSP ist, K1_MSP die Sequenz 99–188 von MSP ist, K2_MSP die Sequenz 189–274 von MSP ist, HL_HGF die Sequenz 32–127 von HGF ist, K1_HGF die Sequenz 128–203 von HGF ist, K2_HGF die Sequenz 204–294 von HGF ist, L die Sequenz (Gly₄Ser)₃ ist, D die Sequenz Asp₄-Lys-His₆ ist.
Rekombinante Proteine gemäß den Ansprüchen 1–2 der Formel (III): LS_HGF-HL_HGF-K1_HGF-K2_HGF-L-HL_HGF-K1_HGF-K2_HGF-D (III),in der HL_HGF, K1_HGF, K2_HGF. L und D wie in Anspruch 4 definiert sind, LS_HGF die Sequenz 1–31 von HGF ist.
Nucleotidsequenzen, die für die rekombinanten Proteine nach den Ansprüchen 1–4 codieren.
Expressionsvektoren, die die Nucleotidsequenzen nach Anspruch 5 umfassen.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 6.
Verfahren zum Herstellen der rekombinanten Proteine nach den Ansprüchen 1–4, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Konstruktion von DNA, die für das gewünschte Protein codiert; b) Insertion von DNA in einen Expressionsvektor; c) Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA (rDNA); d) Kultur der transformierten Wirtszelle, um das rekombinante Protein zu exprimieren; e) Extraktion und Aufreinigung des produzierten rekombinanten Proteins.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine Nierenepithel-BOSC-Zelle oder eine SF9-Insektenzelle ist.
Rekombinante Proteine nach den Ansprüchen 1–4 zur Verwendung als therapeutische Mittel.
Verwendung der rekombinanten Proteine nach den Ansprüchen 1–4 in der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung von Chemotherapeutikum-induzierter Toxizität.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Chemotherapeutikum-induzierte Toxizität Myelotoxizität, Nierentoxizität, Neurotoxizität, Mukotoxizität und Hepatotoxizität ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge der rekombinanten Proteine nach den Ansprüchen 1–4 enthalten, in Kombination mit pharmakologisch annehmbaren Exzipientien.