DE69633172T2

DE69633172T2 - Ndf-peptide

Info

Publication number: DE69633172T2
Application number: DE69633172T
Authority: DE
Inventors: Françoise Josette CRANAHAN; Shinichi Hara; Sen Hsieng LU; Philip John MAYER; Kiyoshi Stevel YOSHINAGA
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-04-06
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: ATE274054T1; EP0820507A1; US5929032A; EP0820507B8; CA2216165A1; US5849705A; AU5377196A; WO1996031599A1; DK0820507T3; DE69633172D1; CA2216165C; US5670342A; JPH11503321A; ES2224162T3; PT820507E; EP0820507B1; US5686415A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Peptide, die von Polypeptiden der sogenannten NDF/Heregulin-Familie abgeleitet sind. Diese Peptide weisen biologische Eigenschaften als ein mitogener und Differenzierungsfaktor für Colon-Epithelzellen und als ein tropher und mitogener Faktor für Schwannsche Zellen auf.
Hintergrund der Erfindung
Das Protein, das als neu-Differenzierungsfaktor oder "NDF"bezeichnet wird, ist ein 44-Kilodalton-Polypeptid, das ursprünglich von Ratten-Fibroblasten isoliert worden ist, von dem gezeigt wurde, daß es das Wachstum oder die Differenzierung von Epithelzellen induziert; Peles et al., Cell, Band 69, Seiten 205–216 (1992). Sowohl dieses hitzestabile Nagetierprotein als auch sein humanes Homolog, bezeichnet als Heregulin, sind sezernierte Proteine, die ursprünglich mittels Heparin-Bindungschromatographie aus den Medien von kultivierten Krebszellen aufgereinigt wurden; Peles et al., Cell, oben, und Holmes et al., Science, Band 256, Seiten 1205–1210 (1992). Es ist gefunden worden, daß mehrere Gliazellen-Wachstumsfaktoren (GGF), die aus bovinem Hirngewebe isoliert wurden, mit diesen sogenannten NDF/Heregulinen verwandt sind; Marchionni et al., Nature, Band 362, Seiten 312–318 (1993). Ähnlich ist gezeigt worden, daß eine Gruppe von Proteinen, bezeichnet als ARIA, mit einem Molekulargewicht im Bereich von 33 bis 44 Kilodaltons und aus Hühnchenhirngewebe auf der Grundlage ihrer Acetylcholinrezeptor- induzierenden Aktivität aufgereinigt, strukturell mit den NDF/Heregulinen verwandt sind; Falls et al., Cell, Band 72, Seiten 801–815 (1993). Es ist jetzt bekannt, daß die NDF/Heregulin-Familie von Proteinen wenigstens zwölf unterschiedliche Moleküle enthält. Es ist berichtet worden, daß die humanen homologen Mitglieder dieser Familie durch ein einzelnes Gen kodiert werden, das sich auf dem humanen Chromosom 8p¹²-p²¹ befindet, das wenigstens 13 Exons enthält, deren genaue Organisation nicht bestimmt worden ist; Orr-Urtreger et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, Band 90, Seiten 1867–1871 (1993).
Die Zellmembran-gebundenen Precursor-Formen dieser Proteine (in dieser Beschreibung als proNDF/Hereguline"bezeichnet) sind Mosaike von erkennbaren strukturellen Motiven. Sie schließen ein N-terminales hydrophobes Signalpeptid ein, gefolgt von entweder einer sogenannten "kringle"-Domäne (bestehend aus mindestens 250 Aminosäureresten) oder einer N-terminalen nicht-hydrophoben Sequenz (bestehend aus ungefähr 40 Aminosäureresten). Andere Regionen schließen eine Imnunoglobulin(Ig)-artige Domäne (nährungsweise 70 Aminosäurereste), eine sogenannte "spacer"-Domäne, die vielfache Bindungsstellen für N- und O-verknüpfte Glycosylierung enthält, eine epidermale Wachstumsfaktor (EGF)-artige Domäne von ungefähr 60–75 Aminosäureresten, die 6 Cysteinreste einschließt, eine hydrophobe Region von ungefähr 25 Aminosäureresten, die als eine Transmembrandomäne fungiert, und einen "cytoplasmatischen Schwanz" ein, der hinsichtlich seiner Länge variieren kann. Einige dieser Transmembran-Precursorformen durchlaufen eine proteolytische Spaltung in der Zelle, sowohl am N-Terminus als auch in dem kurzen Sequenzabschnitt (juxtamembran), der die EGF-artige Domäne mit der Transmembrandomäne verbindet. Abhängig von der Aminosäuresequenz in dieser Juxtamembran-Region sind die NDF/Hereguline als Subtyp 1, Subtyp 2, Subtyp 3, etc. bezeichnet worden. Zusätzliche Variationen umfassen zwei Formen der C-terminalen Schleife der EGF-artigen Domäne, die als alpha (α) und beta (β) bezeichnet werden, abhängig von der Aminosäuresequenz dieser Region; Wen et al., Molecular and Cellular Biology, Band 14, Nummer 3, Seiten 1909–1919 (1994).
Ursprünglich als eine Familie von Molekülen isoliert, die die Phosphorylierung von Tyrosinresten in dem erbB2/Her2-Proto-Oncogen-Expressionsprodukt induzieren, wurde zuerst gedacht, daß die NDF/Hereguline ein möglicher Ligand für diesen Rezeptor sind; Peles et al., Cell, oben; Wen et al., Cell, Band 69, Seiten 559–572 (1992); Holmes et al., Science, oben, und Bacus et al., Cancer Research, Band 53, Seiten 5251–5261 (1993). Jedoch ist vor kurzem gezeigt worden, daß die NDF/Hereguline an die Rezeptorproteine binden und diese stimulieren, die durch die Gene kodiert werden, die als erbB3/Her3 und erbB4/Her4 kodiert werden; Plowman et al., Band 366, Seiten 473–475 (1993); Kita et al., FEBS Letters, Band 349, Seiten 139–143 (1994); Carraway et al., The Journal of Biological Chemistry, Band 269, Number 19, Seiten 14303–14306 (1994); und Carraway et al., Cell, Band 78, Seiten 5–8 (1994). Die EGF-artigen Domänen der verschiedenen NDF/Hereguline scheinen für die Rezeptorerkennung verantwortlich zu sein und wirken unabhängig von anderen strukturellen Motiven; siehe Holmes et al., Science, oben.
In vitro ist gefunden worden, daß NDF/Hereguline schwach mitogen für verschiedene Epithelzellen sind, einschließlich Mamma, Lungen- und Magen-Epithelzellen; Holmes et al., Science, oben. Jedoch durchlaufen bestimmte Mamma-Tumorzellen offensichtlich einen Wachstumsstillstand in Antwort auf NDF oder sein humanes Homolog; Peles et al., Cell, oben; und Bacus et al., Cell Growth and Differentiation, Band 3, Seiten 401–411 (1992). Behandelte Zellen weisen einen reifen Phänotyp auf, der eine flache Morphologie, Synthese des intrazellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1, und, im Falle von Mamma-Zellen, die Sezernierung von Milchbestandteilen einschließt; Bacus et al., Cell Growth and Differentiation, oben; und Bacus et al., Cancer Research, oben. Es ist beobachtet worden, daß rekombinant produzierte Gliawachstumsfaktoren (GGFs) für kultivierte Schwannsche Zellen mitogen sind, die sich ansonsten sehr langsam sogar in der Anwesenheit von bekannten mitogenen Faktoren teilen; siehe Marchionni et al., Nature, oben. Das Motor-Neuron-abgeleitete NDF/Heregulin-Familienmitglied, das als ARIA bekannt ist, scheint die Synthese von Acetylcholinrezeptoren und möglicherweise anderer Moleküle durch postsynaptische Muskelzellen zu induzieren; siehe Falls, Cell, oben.
Zusammenfassung der Erfindung
Auf der Grundlage von Studien, die im Hinblick auf die Lokalisierung der N- und C-terminalen Enden des extrazellulären („löslichen") Teil von membrangebundenen NDF/Heregulin-Polypetiden durchgeführt worden sind, ist eine vermeintliche C-terminale Verarbeitungsstelle diesen Polypeptiden zugeordnet worden. Dieses C-terminale Ende ist in das Design zweier Formen der Polypeptide mit kürzerer Länge eingebaut worden, die spezifisch auf die EGF-artige Domäne gerichtet sind. Diese Peptide, die biologisch aktiv sind, umfassen einen Aspekt der vorliegenden Erfindung. Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid bereit, das die Aminosäuresequenz hat:
oder ein Peptid der folgenden Aminosäuresequenz:
Die vorliegende Erfindung umfaßt zusätzlich DNA-Moleküle, dir für diese Peptide kodieren, Expressionsvektoren zum Steuern der Expression der kodierten Peptide in Wirtszellen, transformierte oder transfizierte eukaryotische und prokaryotische Wirtszellen, die bei der Produktion der Peptide nützlich sind, ein Verfahren zur rekombinanten Produktion der Peptide, Verfahren zur Verwendung der Peptide bei der Ex-vivo-Behandlung von Zellen, Peptide der Erfindung zur Verwendung bei humaner Therapie, pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend die Peptide als einen biologisch aktiven Bestandteil, und Verwendungen von Peptiden der Erfindung zur Herstellung von Medikamenten zum Überleben von oder Proliferieren von Schwannschen Zellen in vivo, zum Proliferieren, Wachsen und Differenzieren von Colon-Epithelzellen in vivo, zum Behandeln einer Krankheit oder Störung des Colons, zum Fördern der Re-Epithelialisierung des Colons oder zum Behandeln einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.
Diese Erfindung beruht auf der Entdeckung einer wichtigen Unterregion innerhalb der bekannten EGF-artigen Domäne von extrazellulären NDF/Heregulinen, wobei diese Unterregion nahe dem C-terminalen Ende liegt und sich von Aminosäurerest 222 bis Aminosäurerest 228 des extrazellulären NDF/Heregulin erstreckt (entsprechend der Aminosäurenumerierung der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 94/28133, wie in größeren Einzelheiten weiter unten erklärt wird). Genauer ist es jetzt erkannt worden, daß die sieben-Aminosäure-Sequenz von 222 bis 228 in der β-Form von extrazellulären NDF/Heregulinen eine größere biologische Aktivität bei den hier gezeigten Assays als die entsprechende Sequenz von der α-Form von extrazellulären NDF/Heregulinen verleiht, trotz einer Sequenzidentität im Rest des Moleküls. Diese Erkenntnis hat das Design und die Konstruktion von biologisch aktiven Peptiden ermöglicht, die in der Lage sind, die physiologischen Effekte der NDF/Hereguline mit größerer Länge zu verdoppeln, wobei sie gleichzeitig eine größere Verabreichungsleichtigkeit bei bestimmten therapeutischen Verabreichungen wegen ihrer geringeren Größe ermöglichen.
Darüber hinaus, wie anhand der weiter unten dargestellten biologischen Resultate gesehen werden wird, sind die Peptide dieser Erfindung in geeignet wirksamen Mengen als humane Colon-Epithel- und Schwannsche Zell-Wachstumsfaktoren nützlich, die die Fähigkeit besitzen, die Proliferation und Reifung solcher Zellen zu stimulieren. Entsprechend sind diese Peptide als Nährstoffe für das Überleben und das Studium solcher Zellen in Kultur und potentiell als therapeutische Mittel zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen verwendbar, die aus Defizienzen, einer Verschlechterung oder Abnormitäten solcher Zelln im Körper resultieren.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Diese Figur ist eine schematische Zeichnung (nicht im proportionalen Maßstab) der extrazellulären Struktur von humanem NDF/Heregulin, umfassend (distal von dem Ende, das an die Zellmembran bindet): die vermutete N-terminale „Heparin-Bindungs"-Region, eine Immunglobulin (Ig)-artige Domäne, eine Kohlenhydrat-(oder „Spacer)-Domäne und eine EGF-artige Domäne, proximal zum C-terminalen Ende. Die nicht-ausgefüllten Kreise in der Spacer-Domäne stellen O-verknüpfte Zucker dar, und die verzweigten ausgefüllten Kreise stellen N-verknüpfte Zucker dar. Vier Disulfid-Bindungen, von denen eine in der Ig-artigen Domäne und drei in der EGF-artigen Domäne sind, werden ebenso gezeigt. Die Zahlen bezeichnen Aminosäurerest-Positionen an ausgewählten Punkten entlang der Polypetidkette, sequentiell ausgehend vom N-terminalen Ende und in Richtung auf das C-terminale Ende. Die EGF-artige Domäne beginnt näherungsweise bei Aminosäurerestposition 177 (markiert) und endet näherungsweise bei Aminosäurerestposition 228 (nicht markiert).
2. Diese Figur ist eine graphische Darstellung des proliferativen Effekts der Peptide der Erfindung auf menschliche Colon-Epithelzellen in vitro. Diese Peptide werden in den Figuren als EGF-β (SEQ ID NO: 2, oben), dargestellt durch die ausgefüllten Kreise, und als EGF-α/β (SEQ ID NO: 1, oben), dargestellt durch die nicht-ausgefüllten Kreise, bezeichnet. Zum Vergleich sind zwei andere Peptide gleicher Länge eingeschlossen, bezeichnet als EGF-α und EGF-β/α und durch die ausgefüllten bzw. nicht-ausgefüllten Quadrate dargestellt. Die letzteren beiden sind Homologe, basierend auf der EGF-Domäne von extrazellulären NDF-Heregulinen und bestehen aus den weiter unten in diesem Text gezeigten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS: 3 bzw. 4). Die Proliferation wird mit einem Kristallviolettfarbstoff gemessen, der das Zellprotein färbt und auf die Zellzahl hinweist. Die Resultate werden auf der vertikalen Achse in Einheiten der -fachen Stimulation dargestellt, was die Extinktion von Peptidbehandelten Zellen, geteilt durch die Extinktion von unbehandelten Zellen ist. Die pikomolare (pM) Konzentration von Peptid, die verwendet wird, um die Zellen zu behandeln, wird auf der horizontalen Achse gezeigt. Die besten Resultate für die Zellproliferation werden bei EGF-β und EGF-α/β gesehen, in Übereinstimmung mit der Erfindung. Einige gewisse Prolife ration wurde mit EGF-α erhalten, obwohl es deutlich schlechter gegenüber EGF-β und EGF-α/β ist. Kein Effekt wurde bei EGF-β/α gesehen.
3. Diese Figur umfaßt Mikrophotographien von fluoreszierend markiertem Aktin in LIM 1215 humanen Kolon-Epithelzellen, entweder ohne Behandlung (obere Tafel) oder mit Inkubation für drei Tage mit 5% fötalem bovinem Serum (FBS, untere Tafel). In der Abwesenheit einer Behandlung (obere Tafel) erschienen die Zellen klein und abgerundet. Die Zellen zeigten eine gewisse Veränderung mit einer FBS-Behandlung, und sie erscheinen geringfügig größer.
4. Diese Figur umfaßt Mikrophotographien von fluoreszierend markiertem Aktin in LIM 1215 humanen Colon-Epithelzellen, nach Inkubation für drei Tage mit EGF-α (Vergleich, obere Tafel) und EGF-β (diese Erfindung, untere Tafel). Ein Hinweis auf zelluläre morphologische Veränderungen wird für diejenigen Zellen gesehen, die mit EGF-β behandelt werden, aber nicht in Zellen, die mit EGF-α behandelt werden. Alle Peptide wurden in einer 420 picomolaren Konzentration zugegeben.
5. Diese Figur umfaßt Mikrophotographien von fluoreszierend markiertem Aktin in LIM 1215 humanen Colon-Epithelzellen, nach einer Inkubation für drei Tage mit EGF-β/α (Vergleich obere Tafel) und EGF-α/β (diese Erfindung, untere Tafel). Wie bei EGF-β (4, oben), wird ein Hinweis auf Zellentwicklung und -Reifung für Zellen beobachtet, die mit EGF-α/β behandelt worden sind. Im Gegensatz dazu erscheinen diejenigen Zellen, die mit EGF-β/α behandelt worden sind, unverändert. Alle Peptide wurden in einer 420 picomolaren Konzentration zugegeben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Studien, die im Hinblick auf die cDNAs für α- und β-Formen von extrazellulären NDF/Heregulin unternommen wurden, exprimiert in chinesischen Hamster-Eierstockzellen (CHO), waren erfolgreich im Lokalisieren des C-terminalen Endes am Aminosäurerest 228 als die primäre Stelle für proteolytische Spaltung. Unter Verwendung der jeweiligen NDF/Hereguline, bekannt als α2 und β1, wurden mehrere Peptide auf der Grundlage der Identität mit oder Homologie zu den EGF-artigen Domänen in diesen Proteinen entworfen. Wie hierin verwendet, sind die Proteine, die als „α2" und „β1" bezeichnet werden, diejenigen, die in der PCT-Anmeldung WO 94/28133 offenbart worden sind, veröffentlicht am 8. Dezember 1994. Die Sequenz von α2 (von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 462) wird in 32 der PCT-Anmeldung wiedergegeben (siehe auch SEQ ID NR: 8 darin). Die Sequenz von β1 wird teilweise (von Aminosäurerest 95 bis Aminosäurerest 645) in 35 der veröffentlichen PCT-Anmeldung wiedergegeben (siehe auch SEQ ID NR: 14 darin). Die ersten 94 Aminosäurereste (N-terminales Ende) von β1, die nicht in PCT-35 abgebildet sind, sind identisch mit den ersten 94 Aminosäureresten von α2, die in PCT-32 gezeigt werden. Eine Darstellung des extrazellulären („löslichen") Teils der α- und β-Formen von NDF/Heregulin wird in 1 der vorliegenden Beschreibung gezeigt.
Die anfänglichen Studien, auf die hier Bezug genommen wird, verwendeten Peptide, basierend nur auf Sequenzen der EGF-artigen Domäne der vorher erwähnten α2- und β1-Formen von NDF/Heregulin, das heißt, demjenigen Teil des extrazellulären Proteins von Aminosäurerest 177 bis Aminosäurerest 228 (siehe 1 hierin). Studien offenbarten, daß das β-Peptid, das hierin als EGF-β bezeichnet wird, biologisch aktiver war als das α-Peptid (EGF-α) in bestimmten Assays. Der Grund für diesen Unterschied war anfänglich nicht offensichtlich. Jedoch wurde im Verlauf von Peptidkartierungsstudien der EGF-artigen Domänen von NDF/Heregulinen entdeckt, daß die α- und β-Formen mit unterschiedlichen Raten gespalten (abgebaut) wurden, wenn sie einem Verdau durch Endoproteinase-Lys-C unterzogen wurden. Insbesondere war die β-Form gegenüber diesem Enzym resistenter und wurde mit einer geringeren Rate gespalten. Darüber hinaus schien dieses Phänomen auf den Lysinrest an Position 211 beschränkt zu sein. Es gab keinen offensichtlichen Unterschied hinsichtlich der Spaltungsrate zwischen α und β bei irgendeinem anderen Lysinrest im N-terminalen Ende der EGF-artigen Domäne. Diese Beobachtung legte nahe, daß die strukturelle Konformation der Region des Moleküls, enthaltend Lysin-211, zwischen α und β unterschiedlich sein kann, was zu einer schnelleren enzymatischen Spaltung für die α-Form führt.
Weiterhin wurde festgestellt, daß die Aminosäuresequenz in der EGF-artigen Domäne der α- und β-Formen von Aminosäurerestposition 177 bis Aminosäurerestposition 212 identisch sind. Es wurde vermutet, daß der Unterschied hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Spaltung auf Konformationsunterschieden im C-terminalen Ende der EGF-artigen Domäne, von Aminosäurerest 212 bis Aminosäurerest 228 beruht. Diese Überlegung legte nahe, daß das C-terminale Ende für die biologische Aktivität wesentlich sein kann, und führte zur Synthese von zwei Chimären für weiteres Testen und die Bestätigung dieser Hypothese. Genau eruhten diese beiden chimären Peptide auf einem „Umschalten" („switching") der 222–228-Aminosäuresequenz zwischen EGF-α und EGF-β, um den Effekt auf die biologische Aktivität dieser Sequenz zu studieren. Insgesamt wurden vier Peptide synthetisiert, einschließlich der beiden vorher erwähnten chimären Peptide. Die vier Peptide hatten die folgenden Sequenzen:

(1) SHLVK (A) QNYVMAS, oder EGF-α/β (SEQ ID NO: 1)
(2) SHLVK (B) QNYVMAS, oder EGF-β (SEQ ID NO: 2)
(3) SHLVK (A) TENVPMK oder EGF-α (SEQ ID NO: 3)
(4) SHLVK (B) TENVPMK, oder EGF-β/α (SEQ ID NO: 4)

Die relativ kurze Länge dieser Peptide war vorteilhaft bei der Herstellung mittels chemischer Synthese unter Verwendung des folgenden Verfahrens.
Chemische Synthese von Peptiden
Jedes Peptid wurde mit dem Fmoc (Fluorenyl-methoxycarbonyl)/t-butyl-basierenden Festphasenchemieverfahren für die Peptidsynthese hergestellt. Ein ABI-431-Instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA) mit einem einzelnen Kopplungsprogramm, wurde verwendet, um den Peptidkettenaufbau zu bewirken, ausgehend von einem kommerziell erhältlichen Hydroxymethyl-phenylacetyl(HMP)-derivatisierten Polystyrolharz. Die Dicyclohexylcarbodiimid(DDC) vermittelte Kopplung des C-terminalen Restes, FmocLys(t-Boc)OH, wurde mit 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) katalysiert. Alle darauffolgenden Reste wurden entweder als symmetrische Anhydride oder Hydroxybenztriazol (HOBt)-Ester gekoppelt. Nach Abschluß der Synthese wurde jedes Peptidharz über Nacht vakuumgetrocknet, dann einer acidolytischen Entschützung und Spaltung unter Verwendung von 20 ml einer Mi schung, umfassend Trifluoressigsäure : Thioanisol : β-Mercaptoethanol : Wasser : Phenol in einem Verhältnis von 80 : 5 : 5 : 5 : 5, unterzogen. Nach Rühren für vier Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Suspension gefiltert, das Filtrat wurde aufkonzentriert (unter Verwendung eines Rotationsverdampfers), und das Rohpeptid wurde unter Verwendung von kaltem Diethylether ausgefällt.
Das Peptid wurde unmittelbar in 50 ml eines 8M Guanidinpuffers suspendiert, enthaltend 100 mM Dithiothreitol (DTT) und 50 mM TRIS, eingestellt auf pH B. Nach Rühren für mehrere Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Lösung auf eine Vydac C₄-präparative Umkehrphasensäule aufgetragen und mit einem 0–60% Gradienten von 0,1% TFA/Acetonitril über eine Stunde eluiert, unter Verwendung eines Beckman-Lösungsmittelabgabesystems vom Modell 114M. Fraktionen mit dem besten analytischen Profil wurden vereinigt und lyophilisiert.
Optimale Bedingungen für die Peptidfaltung, um ein aktives Produkt zu erhalten, umfaßten das Auflösen des linearen Materials (bei näherungsweise 1 mg/ml) in einem Puffer, bestehend aus 25 mM TRIS, pH 8, 1 mM EDTA, 1 mM (für α-Formen) oder 0,5 mM (für β-Formen) Glutathion (oxidiert) und 1 mM Glutathion (reduziert), und Rühren über Nacht bei Zimmertemperatur. Das oxidierte gefaltete Material wurde unter Verwendung einer präparativen Umkehrphasensäule (YMC Co., Ltd., Japan), ausgestattet mit einer Thermostatumhüllung, äquilibriert bei 40°C, und unter Elution mit einem flachen 0,1% TFA/Acetonitril-gradient isoliert.
Die Homogenität der Endprodukte wurde mittels analytischer HPLC und CZE beurteilt. Eine vollständige Charakterisierung wurde mittels einer Aminosäureanalyse, Elektrospray-Massenspektrometrie, partieller Preview-Sequenzierung und enzymatischer Fragmentierung ermöglicht.
Colon-Zellproliferation

a) Kristallviolett-Proliferationsassay. Die humane Colon-Epithelzellinie, LIM 1215 (Whitehead, R. H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 4: 759–765, 1985) wurde in RPMI-1640-Medium wachsengelassen, supplementiert mit 5% FBS, 1 μg/ml Hydrocortison, 1 μg/ml bovines Insulin, 10 μM alpha-Thioglycerol und 1 × PSG (0,292 mg/ml von 1-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin G, und 100 μg/ml Streptomycinsulfat). Am Beginn des Assays waren die Zellen 30% konfluent und proliferierten rasch. Zellen wurden mit Trypsin freigesetzt, mit PBS gewaschen und in 96-Napf-Platten in 5.000 Zellen/Napf in Medien mit geringem Serumgehalt (0,05%) ausgesät (McCoy's-5A, supplementiert mit 4 μg/ml Transferrin, 10 μg/ml Insulin, 10 mM Selensäure, 4 nM Triiodthyronin und 0,03% BSA). Testpeptidverdünnungen wurden unmittelbar am Tag 0 zugegeben. Das Gesamtvolumen betrug 100 μl. Die Kontrollen schlossen keine Behandlung und serielle Verdünnungen von FBS ein. Die 96-Napf-Platten wurden dann für drei Tage bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Die Medien wurden mittels Aspiration entfernt, und 30 μl 2% Kristallviolett (Difco) in Methanol wurde zu den Zellen für 15 Minuten Färbung zugegeben. Überschüssiger Farbstoff wurde mit destilliertem Wasser weggewaschen. Zu jedem Napf wurden 100 μl 0,04 N HCl in Isopropanol zugegeben, und der Farbstoff wurde durch Mischung resolubilisiert. Die Extinktion wurde bei 595 nm bestimmt und die Werte wurden als -fache Stimulation gegenüber dem Hintergrund (oder keine Behandlung) aufgetragen.
b) Stimulation von Colon-Zellproliferation. LIM-1215-Zellen wurden mit den oben erwähnten Peptiden behandelt, und die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. Wie in der Figur gezeigt, stimulierte EGF-β die Proliferation von LIM-1215-Zellen, während EGF-α als ein Mitogen nicht so potent war. Dies legt in starker Weise nahe, daß eine bedeutende Determinante für mitogene Aktivität in den letzten 16 Aminosäuren des C-terminalen Teils von EGF-β liegt, entsprechend Aminosäuren 213–228 des oben erwähnten extrazellulären NDF/Heregulins voller Länge. Die chimären Peptide halfen, diese Aktivitätsdeterminante auf die sieben Reste, entsprechend Aminosäuren 222–228 des extrazellulären NDF/Heregulins voller Länge, zu fokussieren. Insbesondere besteht EGF-α/β aus den ersten 45 Aminosäureresten von dem N-terminalen Teil von EGF-α und den letzten sieben Aminosäureresten vom C-terminalen Teil von EGF-β (oder α177–221/β222–228, entsprechend der Aminosäurenumerierung des extrazellulären NDF/Heregulins voller Länge). Umgekehrt steht EGF-β/α aus den ersten 45 Aminosäureresten vom N-terminalen Teil von EGF-β und den letzten sieben Aminosäureresten vom C-terminalen Teil von EGF-α (oder β177–221/α222–228, entsprechend der Aminosäurenumerierung des extrazellulären NDF/Heregulins voller Länge). Während EGF-α/β signifikante mitogene Aktivität auf LIM-1215-Colonzellen aufwies, zeigte EGF-β/α keinen nachweisbaren Effekt unter denselben Bedingungen (siehe 2). Diese Resultate zeigen sehr deutlich, daß die mitogene Aktivität der Peptide in dem C-terminalen Ende des Peptids liegt. Genauer ist der höchste Aktivitätsgrad den letzten sieben Aminosäureresten von der EGF-artigen Domäne der β-Form zuzuordnen.
c) Färben von humanem LIM-1215-Colonzellen mit fluoreszierendem Farbstoff. LIM-1215-Zellen wurden in RPMI-1640 Medium wachsen gelassen, supplementiert mit 5% FBS, 1 μg/ml bovinem Insulin, 10 μm alpha-Thioglycerol und 1 × PSG. Zum Zeitpunkt des Assay waren die Zellen mehr als 30% konfluent und proliferierten rasch. Die Zellen wurden in 24-Napf-Platten in 25.000 Zellen/Napf in Serum-freiem Medium ausgesät (McCoy's-5A, supplementiert mit 4 μg/ml Transferrin, 10 μg/ml Insulin, 10 mM Selensäure, 4 mM Triiodthyronin, und 0,03% BSA). Testpeptide wurden in einer Konzentration von 420 picomolar unmittelbar am Tag 0 zugegeben; das Gesamtvolumen betrug 1,0 ml. Kontrollen schlossen keine Behandlung und serielle Verdünnungen von FBS ein. Die 24-Napf-Platten wurden dann für 3 Tage bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert, wonach die Medien durch Aspiration entfernt wurden und die Zellen in 1,0 ml PBS mit 0,5% BSA gewaschen wurden. Alle darauffolgenden Wart. Die Zellen wurden dann in schungen wurden mit diesem Puffer durchgefühOrthopermeafix (Ortho Chemicals Co.) für 30 Minuten bei Zimmertemperatur fixiert und wurden zweimal gewaschen. Dann wurden 200 μl einer 10 nM NBD-Phalloidin-fluoreszierenden Farbstofflösung in PBS zugegeben, und die Zellen wurden im Dunkeln (eingewickelt in Aluminiumfolie) für 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops inspiziert.
d) Morphogene Aktivität von Peptiden auf Colon-Epithelzellen. Nach Behandlung von LIM-1215-Zellen mit dem EGF-β-Peptid war es offensichtlich, daß sich die Morphologie der Zellen dramatisch veränderte. 3 zeigt die Färbung der Actinfilamente der Zellen (siehe oben für die Vorgehensweise), nachdem keine Behandlung durchgeführt wurde (obere Tafel) und nach einer Behandlung mit 5% FBS (untere Tafel). In der Abwesenheit einer Behandlung erschienen die Zellen klein und abgerundet. In der Anwesenheit von FBS wechselten die Zellen ihre Erscheinung, wurden nur geringfügig größer, blieben aber abgerundet. Im Gegensatz dazu durchliefen die Zellen in der Anwesenheit von EGF-β (4, untere Tafel) eine merkbare Veränderung in der Morphologie, wurden größer und nahmen eine Pflasterstein-artige Erscheinung an. Andererseits erzeugte EGF-α (4, obere Tafel) nicht dieselben morphogenen Veränderungen. Da die Zellen in 5% FBS-Serum-enthaltenden Medien rasch proliferierten (3), konnte die einzigartige Morphologie, die durch das EGF-β-Peptid verursacht wurde, nicht allein auf seiner Fähigkeit beruhen, die Proliferation zu stimulieren. Darüber hinaus muß der Unterschied in den morphogenen Aktivitäten zwischen EGF-β und EGF-α seinen Ursprung in den letzten 16 Aminosäuren des C-Terminus gehabt haben, da dies der einzige Unterschied in der Sequenz zwischen den beiden Peptiden ist.

Eine weitere Lokalisierung der morphogenen Aktivität wurde durch Verwendung der chimären Peptide, EGF-β/α und EGF-α/β, erhalten. Wie anhand von 5 gesehen werden kann, verursachte EGF-α/β offensichtliche morphogene Veränderungen in LIM-1215-Zellen (untere Tafel), während EGF-β/α keine merkbare Veränderung erzeugte (obere Tafel). Wiederum ist der einzige Unterschied in der Sequenz zwischen diesen beiden Peptiden die letzten sieben Aminosäuren des C-terminalen Abschnitts.
Eine zusätzliche Bestätigung für die Wichtigkeit dieser Sequenz von sieben Aminosäuren wurde erhalten durch Durchführung einer Bewertung im Hinblick auf verschiedene Markerproteine auf den LIM-1215-Zellen. Ein ACAS-konfokales Bild-Cytometer wurde verwendet, um eine Anzahl von Markern auf den Zellen nachzuweisen, ohne die Zellen von der Kulturschale zu lösen, wie dies normalerweise für eine Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) gemacht wird. Die in Tabelle 1, unten, präsentierten Daten zeigen, daß EGF-β eine erhöhte Expression (+) von karzino-embryonalem Antigen (CEA) und Integrin β4 hervorrief. Umgekehrt war die Villin-Expression durch EGF-β herunterreguliert (–). Die Expression einer Anzahl von anderen Markern war unverändert (0) durch die Behandlung mit EGF-β. Analog zu den vorherigen Resultaten, die starke beobachtbare Morphologieveränderungen charakterisierten, veränderten weder EGF-α noch EGF-β/α die Konzentration dieser Markerproteine, während EGF-α/β die Expression der Markerproteine auf eine Weise veränderte, die ähnlich derjenigen ist, die bei EGF-β gesehen wird.
Tabelle 1 Marker-Proteinexpression
Krebsbehandlungen, die eine Chemo- oder Bestrahlungstherapie beinhalten, führen zu einer schweren Zerstörung der Epithelschicht des Colons. Die vorhergehenden Resultate zeigen an, daß die Peptide der Erfindung eine Re-Epithelialisierung des Colon fördern und die negativen Effekte erleichtern können, die durch eine Schädigung der Intestinal-Epithele verursacht werden.
Überleben und Proliferation von Schwannschen Zellen
Die neurobiologische Aktivität der Peptide wurde ebenso durch Studieren ihrer Effekte auf das Überleben und Wachstum von Schwannschen Zellen bewertet, wie unten beschrieben.
Der Nervus ischiadicus von neugeborenen Ratten wurde verwendet, um eine Primärkultur von Schwannschen Zellen zu erzeugen. Die Zellen wurden über Nacht in 10% ohne Aussetzen gegenüber irgendeinem Wachstumsfaktor ausplattiert. Am folgenden Tag wurden EGF-β, EGF-α/β und EGF-β/α in den in Tabelle 2, unten, gezeigten Konzentrationen in Nanogramm pro Milliliter (ng/ml) zugegeben. 24 Stunden später wurde BrdU zu jeder Testprobe für sechs Stunden zugegeben. BrdU ist ein Thymidinanalog, das in die DNA von sich teilenden Zellen eingebaut wird und mittels Immunchemie-Standardprozeduren nachgewiesen werden kann. Dieses Mittel stellt somit ein Mittel zum Bestimmen der Expansion der Gesamtmenge an DNA in einer Testprobe bereit und ist ein Maß dafür, ob eine Zellproliferation stattgefunden hat. Nach Abschluß der Testperiode wurden die Schwannschen Zellen fixiert und immunhistochemisch analysiert. Die Zellen wurden zuerst auf Nervenwachstumsfaktorrezeptor (NGFR) gefärbt, der ein bekannter Marker für Schwannsche Zellen in Kultur ist, gefolgt von einer Färbung auf BrdU. Die Zellzählung wurde wie folgt durchgeführt: In einem gegebenen Mikroskop-Blickfeld wurden alle erkennbaren Schwannschen Zellen gezählt, dann wurde die Anzahl an Zellen, die sich bei BrdU-Färbung als positiv erwiesen, ebenso gezählt. Für jede Testprobe (oder Napf) wurden zwei oder drei Felder gezählt, was insgesamt auf 200–300 Schwannsche Zellen hinauslief. Das Resultat wird in Tabelle 2 als der prozentuale Anteil von proliferierenden Schwannschen Zellen ausgedrückt.
Tabelle 2 Schwannsche Zell-proliferation
Wie anhand dieser Resultate gesehen werden kann, stimulierten sowohl EGF-β als auch EGF-α/β die Proliferation von Schwannschen Zellen in einem signifikant größeren Ausmaß als EGF-β/α.
Die oben im Hinblick auf EGF-β und EGF-α/β präsentierten Testresultate deuten auf die Nützlichkeit dieser Peptide als Mittel für das Überleben, Wachstum und die Proliferation von Colon-Epithelzellen und Schwannschen Zellen hin. Als ein Minimum werden diese Peptide nützlich sein, um solche Zellen in Kultur für das Studium bei der Forschung und weiterhin für die Herstellung von Gewebe zur Verwendung bei der Implantationstherapie bei dafür bedürftigen Patienten wachsen zu lassen. Von besonderem Interesse werden Patienten sein, die an Zuständen oder Krankheiten leiden, welche Defizienzen in oder Verluste an solchen Zellen beinhalten. Im Falle von Colon-Epithelzellen, insbesondere, schließen solche Zustände Geschwüre und Colitis ein, die beide einen Mangel an oder eine Verschlechterung von Colon-Epithelzellen beinhalten. Die Peptide dieser Erfindung sind vielversprechend als Wachstumsfaktoren für die therapeutische Behandlung solcher Zustände, sei es, daß sie ex vivo verwendet werden, um Ersatzgewebe wachsen zu lassen, oder sei es, daß sie in vivo für die in situ-Erzeugung von solchen Zellen und Geweben verwendet werden.
Im peripheren Nervensystem sind Schwannsche Zellen, die eine Klasse von Glia-Zellen ausmachen, für die Bildung der Myelinscheide verantwortlich, die die Axone in Vertebraten umgeben und diese isolieren. Die funktionelle Wichtigkeit von Myelin ist durch die schwere Beinträchtigung bei motorischen Funktionen unterstrichen worden, die bei sogenannten Demyelinationskrankheiten beobachtet werden, einschließlich Multipler Sklerose und amyotropher Lateralsklerose, die mit einem umfassenden Abbau der Myelinscheide im zentralen Nervensystem assoziiert sind. Eine traumatische Verletzung gegenüber dem peripheren Nervensystem beinhaltet oft die Zerstörung des Myelins, das für eine richtige Heilung repariert werden muß. Wie die gezeigten Resultate deutlich machen, sind die Peptide dieser Erfindung nützlich, um das Überleben, Wachstum und die Proliferation von Schwannschen Zellen in Kultur zu unterstützen, was eine Quelle von solchen Zellen zur Implantierung in demyelinisierten Stelle von peripheren Nervenschäden ermöglicht. Es ist ebenso möglich, daß eine in vivo-Verabreichung dieser Peptide, in geeigneter Weise formuliert, zur Regenerierung und Proliferation von Ersatz-Schwannschen Zellen führen wird, was zu einer Remyelinisierung und Wundheilung führt.
Eine Verwendung der Peptide dieser Erfindung in Übereinstimmung mit den zuvor erwähnten Anwendungsverfahren liegen innerhalb der Fähigkeiten eines geschickten Fachmannes. Die Menge an Peptid, die für die Behandlung einer bestimmten Krankheit oder Zustand in vivo wirksam ist, wird von der spezifischen Natur der Krankheit oder Störung abhängen, und solche Mengen können mittels klinischer Standardtechniken bestimmt werden. Sofern möglich, ist es wünschenswert, die Dosis-Antwort-Kurve und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung zuerst in vitro zu bestimmen, wie etwa in bekannten Bioassay-Systemen und dann in nützlichen Tiermodellsystemen, bevor an Menschen getestet wird. Verfahren zur in vivo-Verabreichung schließen ein, sind aber nicht notwendigerweise beschränkt auf intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, oral oder intradermal.
Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung lokal an das behandlungsbedürftige Gebiet zu verabreichen. Dies kann zum Beispiel durch die lokale Infusion während einer Operation, durch eine Injektion, einen Katheter oder ein Implantat erreicht werden, wobei das Implantat aus einem porösem, nicht-porösem oder gelatinösem Material, einschließlich Membranen, wie etwa sialastischen Membranen oder Fasern ist.
Die Erfindung stellt ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend Peptide, die über Liposomen, Mikropartikel oder Mikrokapseln verabreicht werden. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann es nützlich sein, solche Zusammensetzungen zu verwenden, um eine verzögerte Freisetzung zu erzielen. Die Peptide der Erfindung können in jedem sterilen biokompatiblen Träger verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose und Wasser, als solche, oder, sofern erwünscht, zusammen mit beliebigen geeigneten Zusatzstoffen.
Während die Produktion der Peptide spezifisch im Hinblick auf die chemische Synthese veranschaulicht worden ist, stellen herkömmliche Verfahren der rekombinanten Produktion ein geeignetes alternatives Mittel zu ihrer Herstellung dar. Erläuterungsweise kann eine Nukleotidsequenz, die für das Peptid kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, d. h. einen Vektor, enthaltend die notwendigen Elemente für die Transkription und die Translation der eingefügten Peptid-kodierenden Sequenz. Eine Vielzahl von Wirt-Vektor-Systemen kann verwendet werden, um die Peptid-kodierende Sequenz zu exprimieren. Solche Systeme schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Säugetier-Zellsysteme, die mit einem Virus infiziert worden sind (z. B. Vaccin-Virus, Adenovirus, etc.); Insekten-Zellsysteme, die mit einem Virus infiziert worden sind (z. B. Baculovirus); Mikroorganismen, wie etwa Hefe, enthaltend Hefevektoren, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert worden sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren hinsichtlich ihrer Stärken und Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirt-Vektorsystem kann irgendeines aus einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Ein beliebiges der zuvor für die Einführung von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Verfahren kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen enthalten, bestehend aus geeigneten Kontrollsignalen und Peptid-kodierenden Sequenzen. Diese Verfahren können in vitro-rekombinante DNA-Techniken und synthetische Techniken und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Eine Expression einer Nukleinsäure, die für das Peptid kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so daß das Peptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert worden ist. Zum Beispiel kann eine Expression durch ein beliebiges Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden, das auf dem Gebiet bekannt ist.
Wenn ein geeignetes Wirtssytem und Wachstumsbedingungen etabliert worden sind, können rekombinante Expressionsvektoren fortgepflanzt und in Mengen hergestellt werden. Wie zuvor erklärt, schließen die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden Vektoren oder ihre Derivate: humane oder Tierviren, wie etwa Vaccinia-Virus oder Adenovirus; Insektenviren, wie etwa Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagen-Vektoren (z. B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
Das resultierende exprimierte Peptid kann mittels Standardverfahren isoliert und aufgereinigt werden, einschließlich Chromatographie (z. B. Ionenaustausch, Affinität oder Größensortierende Chromatographie), Zentrifugation, differentieller Löslichkeit oder mittels einer beliebigen anderen Standardtechnik für eine solche Aufreinigung.
Die Verfahren zur rekombinanten Produktion, die in der zuvor erwähnten PCT-Anmeldung WO 94/28133 beschrieben sind, sind zur Verwendung hierin besonders geeignet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Peptid mit der Aminosäuresequenz:
oder ein Peptid, bestehend aus der folgenden Aminosäuresequenz:
Peptid nach Anspruch 1, das das Produkt einer chemischen Synthese ist.
Peptid nach Anspruch 1, das das rekombinante Produkt einer eukaryotischen oder prokaryotischen Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.
Ein DNA-Molekül, das für ein Peptid nach Anspruch 1 kodiert.
Eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 4 stabil transformiert oder transfiziert ist.
Ein biologisch funktionelles zirkuläres Plasmid oder viraler DNA-Vektor, einschließlich einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4.
Eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit einem DNA-Vektor nach Anspruch 6 stabil transformiert oder transfiziert ist.
Transformierte oder transfizierte E. coli-Zelle nach Anspruch 5 oder 7.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das umfaßt: Kultiviren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4 oder einem DNA-Vektor nach Anspruch 6 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen auf eine Weise, die es der Wirtszelle ermöglicht, das Peptid zu exprimieren, und fakultativ Isolieren des Peptids.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger.
Ein ex-vivo-Verfahren zur Lebenserhaltung von Schwannschen Zellen, umfassend das In-Kontakt-Bringen solcher Zellen mit einer wirksamen Menge eines Peptids nach Anspruch 1.
Ein ex-vivo-Verfahren zum Bewirken der Proliferation von Schwannschen Zellen, umfassend das In-Kontakt-Bringen solcher Zellen mit einer wirksamen Menge eines Peptids nach Anspruch 1.
Ein ex-vivo-Verfahren zum Bewirkender Proliferation, des Wachstums und der Differenzierung von Colon-Epithel-Zellen, umfassend das In-Kontakt-Bringen solcher Zellen mit einer wirksamen Menge eines Peptids nach Anspruch 1.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 13, das in Zellkultur durchgeführt wird.
Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Therapie am Menschen.
Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Lebenserhaltung von Schwannschen Zellen in vivo.
Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei dem Bewirken der Proliferation von Schwannschen Zellen in vivo.
Peptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bewirkung der Proliferation, des Wachstums und der Differenzierung von Colon-Epithel-Zellen in vivo.
Peptid nach Anspruch 1 zur Veewendung beim Behandeln einer Krankheit oder Störung des Colons.
Peptid nach Anspruch 19, wobei die Krankheit oder Störung Colitis ist.
Peptid nach Anspruch 19, wobei die Krankheit oder Störung ein Ulcus ist.
Peptid nach Anspruch 1 zum Fördern der Re-Epithelialisierung des Colon.
Peptid nach Anspruch 1 zum Behandeln einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.
Peptid nach Anspruch 23, wobei die Krankheit oder Störung Defekte oder Abnormitäten in Schwannschen Zellen oder eine Verschlechterung oder Verluste von Schwannschen Zellen beinhaltet.
Peptid nach Anspruch 23, wobei die Krankheit oder Störung eine durch Trauma verursachte Nervenschädigung umfaßt.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Lebenserhaltung von Schwannschen Zellen in vivo.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Bewirkung der Proliferation von Schwannschen Zellen in vivo.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Bewirkung der Proliferation, des Wachstums und der Differenzierung von Colon-Epithel-Zellen in vivo.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln einer Krankheit oder Störung des Colon.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Krankheit oder Störung Colitis ist.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Krankheit oder Störung ein Ulcus ist.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Fördern der Re-Epithelialisierung des Colon.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Krankheit oder Störung Defekte oder Abnormitäten in Schwannschen Zellen oder eine Verschlechterung oder Verluste von Schwannschen Zellen beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Krankheit oder Störung eine durch Trauma verursachte Nervenschädigung umfaßt.