ES2224162T3 - Peptidos ndf. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS PEPTIDOS QUE SON DERIVADOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS DEL DOMINIO SIMILAR A EGF DE LAS NDF/HEREGULINAS Y QUE ESTIMULAN LA PROLIFERACION Y DIFERENCIACION DE CELULAS EPITELIALES DEL COLON Y APOYAN LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE CELULAS DE SCHWANN.
Description
Péptidos NDF.
Esta invención se refiere a péptidos nuevos
derivados de polipéptidos de la familia denominada NDF/heregulina.
Estos péptidos presentan propiedades biológicas como un factor
mitógeno y de diferenciación para las células epiteliales del colon
y como un factor trófico y mitógeno para las células de Schwann.
La proteína llamada factor de diferenciación
neu, o "NDF", es un polipéptido de 44 kilodaltons
aislado originariamente de fibroblastos de rata que se ha visto que
induce el crecimiento o diferenciación de células epiteliales; Peles
et al., Cell, Volumen 69, páginas 205-216
(1992). Tanto esta proteína de roedores estable frente al calor como
su homóloga humana, llamada heregulina, son proteínas secretadas que
se purificaron originariamente mediante cromatografía de unión de
heparina del medio de células cancerosas en cultivo; Peles et
al., Cell, arriba, y Holmes et al., Science, Volumen 256,
páginas 1205-1210 (1992). Se ha demostrado que
diferentes factores de crecimiento de células gliales (GGF) aislados
de tejido de cerebro bovino están relacionados con estas
NDF/heregulinas; Marchionni et al, Nature, Volumen 362,
páginas 312-318 (1993). De manera similar, se ha
demostrado que un grupo de proteínas denominado ARIA, que tienen un
peso molecular de 33 a 44 kilodaltons y que se han purificado de
tejido cerebral de pollo en base a su actividad inductora del
receptor de acetilcolina, están relacionadas estructuralmente con
las NDF/heregulinas; Falls et al., Cell, Volumen 72, páginas
801-815 (1993). Actualmente se sabe que la familia
de proteínas NDF/heregulina contiene al menos doce moléculas
distintas. Se ha publicado que los miembros humanos homólogos de
esta familia están codificados por un único gen, localizado en el
cromosoma humano 8p^{12}-p^{21}, que contiene al
menos 13 exones cuya organización precisa no se ha determinado;
Orr-Urtreger et al., Proceedings of the
National Academy of Science, USA, Volumen 90, páginas
1867-1871 (1993).
Las formas precursoras unidas a la membrana
celular de estas proteínas (referidas en esta memoria como
"proNDF/ heregulinas") son mosaicos de fracciones
estructurales reconocibles. Incluyen un péptido señal hidrofóbico
N-terminal, seguido bien de un dominio denominado
"kringle" (que consiste en aproximadamente 250 restos de
aminoácidos) o de una secuencia no hidrofóbica
N-terminal (que consiste en aproximadamente 40
restos de aminoácidos). Otras regiones incluyen un dominio semejante
al de inmunoglobulina (Ig) (aproximadamente 70 restos de
aminoácidos), un dominio llamado "espaciador" que contiene
numerosos sitios de unión para N- y O-glicosilación,
un dominio semejante al del factor de crecimiento epidérmico (EGF)
de aproximadamente 60-75 restos de aminoácidos que
incluye 6 restos de cisteína, una región hidrofóbica de
aproximadamente 25 restos de aminoácidos que funciona como un
dominio transmembrana, y una "cola citoplasmática" que puede
variar en longitud. Algunas de estas formas precursoras
transmembrana sufren rotura proteolítica en la célula tanto en el
extremo N-terminal como en una secuencia corta
(yuxtamembrana) que conecta el dominio semejante a EGF con el
dominio transmembrana. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos en
esta región yuxtamembrana, las NDF/heregulinas se han designado
subtipo 1, subtipo 2, subtipo 3, etc. Las variaciones adicionales
comprenden dos formas del bucle C-terminal del
dominio semejante a EGF, que se denominan alfa (\alpha) y beta
(\beta), dependiendo de la secuencia de aminoácidos en esa región;
Wen et al., Molecular and Cellular Biology, Volumen 14,
Número 3, páginas 1909-1919 (1994).
Aisladas en un principio como una familia de
moléculas que induce la fosforilación de restos de tirosina en el
producto de la expresión del proto-oncogen
erbB2/Her2, se pensó que las NDF/heregulinas eran un posible ligando
de ese receptor; Peles et al., Cell, arriba; Wen et al.,
Cell, Volumen 69, páginas 559-572 (1992); Holmes
et al., Science, arriba, y Bacus et al., Cancer
Research, Volumen 53, páginas 5251-5261 (1993).
Sin embargo, más recientemente se ha demostrado que las
NDF/heregulinas se unen a y estimulan las proteínas receptoras
codificadas por los genes conocidos como erbB3/Her3 y erbB4/Her4;
Plowman et al., Volumen 366, páginas 473-475
(1993); Kita et al., FEBS Letters, Volumen 349, páginas
139-143 (1994); Carraway et al., The Journal of
Biological Chemistry, Volumen 269, Número 19, páginas
14303-14306 (1994); y Carraway et al., Cell,
Volumen 78, páginas 5-8 (1994). Los dominios
semejantes a EGF de las diferentes NDF/heregulinas parecen ser
responsables del reconocimiento del receptor y actúan de manera
independiente de otras fracciones estructurales; véase Holmes et
al., Science, arriba.
Se ha demostrado que in vitro las
NDF/heregulinas son débilmente mitógenas para diferentes células
epiteliales, incluyendo células epiteliales mamarias, de pulmón y
gástricas; Holmes et al., Science, arriba. Sin
embargo, determinadas células de tumor mamario sufren aparentemente
una parada en su crecimiento en respuesta a NDF o a su homólogo
humano; Peles et al., Cell, arriba; y Bacus et al., Cell
Growth and Differentiation, Volumen 3, páginas
401-411 (1992). Las células tratadas presentan un
fenotipo maduro que incluye una morfología plana, síntesis de la
molécula intracelular de adhesión celular ICAM-1, y
en el caso de células mamarias, la secreción de componentes de la
leche; Bacus et al., Cell Growth and Differentiation, arriba;
y Bacus et al.,Cancer Research, arriba. Se ha visto que los
factores de crecimiento gliales (GGF) producidos por técnicas
recombinantes son mitógenos para células de Schwann en cultivo, que
de otra manera se dividen muy lentamente incluso en presencia de
factores mitógenos conocidos; véase Marchionni et al.,
Nature, arriba. El miembro de la familia NDF/heregulina derivado
de neuronas motoras conocido como ARIA parece que induce la síntesis
de receptores de acetilcolina, y posiblemente de otras moléculas, en
células musculares post-sinápticas; véase Falls,
Cell, arriba.
En base a estudios conducidos respecto a la
localización de los extremos N- y C-terminales de la
porción extracelular ("soluble") de polipéptidos NDF/heregulina
unidos a membrana, se ha asignado un sitio de procesamiento
C-terminal potencial a estos polipéptidos. Este
extremo C-terminal se ha incorporado al diseño de
dos formas de los polipéptidos de menor longitud dirigidas
específicamente al dominio semejante a EGF. Estos péptidos, que son
biológicamente activos, comprenden un aspecto de la presente
invención. Específicamente, la presente invención proporciona un
péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:
SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARCQNYVMAS
(SEC ID NO:1), o
un péptido con la secuencia de aminoácidos
siguiente:
SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMAS
(SEC ID NO:2)
La presente invención comprende además moléculas
de ADN que codifican estos péptidos, vectores de expresión para
dirigir la expresión de los péptidos codificados en las células
anfitrionas, células anfitrionas eucariotas y procariotas
transformadas o transfectadas útiles en la producción de los
péptidos, un método para la producción recombinante de los péptidos,
métodos de utilización de los péptidos en el tratamiento ex
vivo de células, péptidos de la invención para ser utilizados en
terapia humana, composiciones farmacéuticas que contienen los
péptidos como un componente biológicamente activo, y utilizaciones
de los péptidos de la invención para la fabricación de células in
vivo, para producir la proliferación, crecimiento y
diferenciación de células epiteliales de colon in vivo, para
tratar una enfermedad o trastorno del colon, para promover la
reepitelización del colon o para tratar una enfermedad o trastorno
del sistema nervioso.
La invención se basa en el descubrimiento de una
subregión importante en el dominio semejante a EGF conocido de las
NDF-heregulinas extracelulares, encontrándose esta
subregión cerca del extremo C-terminal y
extendiéndose desde el resto de aminoácido 222 al resto de
aminoácido 228 de la NDF/heregulina extracelular (que corresponde a
la numeración de la secuencia de aminoácidos de la solicitud PCT
publicada WO 94/28133, como se explica con más detalle más
adelante). Más específicamente, actualmente se ha aceptado que la
secuencia de siete restos de aminoácidos de 222 a 228 en la forma
\beta de las NDF/heregulinas extracelulares confiere una actividad
biológica mayor en los ensayos mostrados en la presente memoria que
la secuencia correspondiente de la forma \alpha de las
NDF/heregulinas extracelulares, a pesar de la identidad de secuencia
en el resto de la molécula. Este hecho ha permitido el diseño y
construcción de péptidos biológicamente activos que son capaces de
duplicar los efectos fisiológicos de las NDF/heregulinas de mayor
longitud, a la vez que permiten una mayor facilidad potencial de
administración en determinadas administraciones terapéuticas debido
a su menor tamaño.
Más aún, como se verá a partir de los resultados
biológicos presentados más adelante, los péptidos de esta invención
son útiles en cantidades eficaces apropiadas como factores de
crecimiento de células epiteliales de colon humanas y de células de
Schwann, y poseen la capacidad de estimular la proliferación y
maduración de estas células. De acuerdo con esto, estos péptidos se
pueden utilizar como nutrientes para la supervivencia y estudio de
estas células en cultivo, y, de manera potencial, como agentes
terapéuticos para el tratamiento de enfermedades o condiciones que
resultan en deficiencias, deterioro o anormalidades de estas células
en el cuerpo.
Figura 1. Esta figura es un dibujo esquemático
(no está en escala proporcional) de la estructura extracelular de la
NDF/heregulina humana, que comprende (distante del extremo que se
une a la membrana celular): la región potencial
N-terminal que "une heparina", un dominio
semejante a inmunoglobulina (Ig), un dominio de carbohidrato (o
"espaciador"), y un dominio semejante a EGF próximo al extremo
C-terminal. Los círculos abiertos en el dominio
espaciador representan azúcares unidos en O y los círculos cerrados
ramificados representan azúcares unidos en N. También se muestran
cuatro enlaces disulfuro, uno de los cuales está en el dominio
semejante a Ig y tres de los cuales están en el dominio semejante a
EGF. Los números designan las posiciones de los restos de
aminoácidos en puntos seleccionados a lo largo de la cadena
polipeptídica, empezando de manera secuencial desde el extremo
N-terminal y terminando hacia el extremo
C-terminal. El dominio semejante a EGF empieza
aproximadamente en el resto de aminoácido de la posición 177
(marcado) y termina aproximadamente en el resto de aminoácido de la
posición 228 (no marcado).
Figura 2. Esta figura es una representación
gráfica del efecto proliferativo de los péptidos de la invención en
células epiteliales de colon humanas in vitro. Estos péptidos
se designan en la figura como EGF-\beta (SEC ID
NO: 2, arriba), representado por los círculos cerrados, y como
EGF-\alpha/\beta (SEC ID NO: 1, arriba),
representado por los círculos abiertos. Por motivos de comparación,
se incluyen dos péptidos más de igual longitud, designados como
EGF-\alpha y EGF-\beta/\alpha,
y representados por los cuadrados cerrados y abiertos,
respectivamente. Los dos últimos son homólogos basados en el dominio
EGF de NDF/heregulinas extracelulares y consisten en las secuencias
de aminoácidos mostradas más adelante en este texto (SEC ID NOS: 3 y
4, respectivamente). La proliferación se determina con la tinción
cristal violeta que tiñe la proteína celular y es indicativa del
número de células. Los resultados se muestran en el eje vertical en
unidades de veces de estimulación, que es la absorbancia de las
células tratadas con el péptido dividida por la absorbancia de las
células no tratadas. La concentración picomolar (pM) del péptido
utilizado para tratar las células se muestra en el eje horizontal.
Los mejores resultados de proliferación celular se obtienen con
EGF-\beta y EGF-\alpha/\beta,
de acuerdo con la invención. Se obtuvo alguna proliferación con
EGF-\alpha, aunque es claramente inferior a
EGF-\beta y EGF-\alpha/\beta.
No se observó ningún efecto con
EGF-\beta/\alpha.
Figura 3. Esta figura comprende microfotografías
de actina marcada con fluorescencia en células epiteliales de colon
humanas LIM 1215, bien sin tratamiento (panel superior) o incubadas
durante tres días con suero fetal bovino 5% (FBS, panel inferior).
En ausencia de tratamiento (panel superior), las células tienen una
apariencia pequeña y redondeada. Las células mostraron algún cambio
con el tratamiento con FBS, y aparecen ligeramente más grandes.
Figura 4. Esta figura comprende microfotografías
de actina marcada con fluorescencia en células epiteliales de colon
humanas LIM 1215, después de una incubación durante tres días con
EGF-\alpha (comparación, panel superior) y con
EGF-\beta (esta invención, panel inferior). Se
observa evidencia de cambios en la morfología celular en las células
tratadas con EGF-\beta, pero no en las células
tratadas con EGF-\alpha. Todos los péptidos se
añadieron a una concentración de 420 picomolar.
Figura 5. Esta figura comprende microfotografías
de actina marcada con fluorescencia en células epiteliales de colon
humanas LIM 1215, después de una incubación durante tres días con
EGF-\beta/\alpha (comparación, panel superior) y
con EGF-\alpha/\beta (esta invención, panel
inferior). Como en el caso de EGF-\beta (Figura 4,
más arriba), se observa evidencia de desarrollo celular y maduración
en las células tratadas con EGF-\alpha/\beta.
Por el contrario, las células tratadas con
EGF-\beta/\alpha aparecen sin cambios. Todos los péptidos se añadieron a una concentración de 420 picomolar.
EGF-\beta/\alpha aparecen sin cambios. Todos los péptidos se añadieron a una concentración de 420 picomolar.
Los estudios llevados a cabo respecto a los ADNc
para las formas \alpha y \beta de NDF/heregulina extracelular,
expresados en células de ovario de hamster chino (CHO), han tenido
éxito en la localización del extremo C-terminal en
el resto de aminoácido 228 como el sitio principal de rotura
proteolítica. Utilizando las NDF/heregulinas particulares conocidas
como \alpha2 y \beta1, se diseñaron varios péptidos en base a la
identidad con u homología con los dominios semejantes a EGF en esas
proteínas. Como se utiliza en la presente memoria, las proteínas
referidas como "\alpha2" y "\beta1" son aquellas que
han sido descritas en la solicitud PCT WO 94/28133, publicada el 8
de Diciembre de 1994. La secuencia de \alpha2 (desde el resto de
aminoácido 1 hasta el resto de aminoácido 462) se muestra en la
Figura 32 de la solicitud PCT (véase también SEC ID NO: 8 en la
solicitud PCT). La secuencia de \beta1 se muestra parcialmente
(desde el resto de aminoácido 95 hasta el resto de aminoácido 645)
en la Figura 35 de la solicitud PCT publicada (véase también SEC ID
NO: 14 en la solicitud PCT). Los primeros noventa y cuatro restos de
aminoácidos (extremo N-terminal) de \beta1, que no
se muestran en la Figura 35 de PCT, son idénticos a los primeros
noventa y cuatro restos de aminoácidos de \alpha2 mostrados en la
Figura 32 de PCT. En la Figura 1 de la presente descripción se
muestra una representación de la porción extracelular
("soluble") de las formas \alpha y \beta de
NDF/heregulina.
Los estudios iniciales referidos a los péptidos
utilizados en la presente memoria se basaron exclusivamente en
secuencias del dominio semejante a EGF de las formas \alpha2 y
\beta1 de NDF/heregulina mencionadas anteriormente, es decir, la
porción de la proteína extracelular desde el resto de aminoácido 177
hasta el resto de aminoácido 228 (véase la Figura 1 de la presente
memoria). Los estudios revelaron que el péptido \beta, referido en
la presente memoria como EGF-\beta, era más activo
biológicamente que el péptido \alpha
(EGF-\alpha) en determinados ensayos. La razón de
esta diferencia no resultó aparente en un inicio. Sin embargo,
durante los estudios de mapeo peptídico de los dominios semejantes a
EGF de las NDF/heregulinas, se descubrió que las formas \alpha y
\beta se rompían (degradaban) a diferentes velocidades cuando se
sometían a digestión con endoproteinasa Lys-C.
Específicamente, la forma \beta era más resistente a esta enzima y
se rompía a menor velocidad. Más aún, este fenómeno parecía limitado
al resto de lisina en la posición 211. No se observó una diferencia
aparente en la velocidad de rotura entre \alpha y \beta en otros
restos de lisina en el extremo N-terminal del
dominio semejante a EGF. Esta observación sugirió que la
conformación estructural de la región de la molécula que contiene la
lisina 211 puede ser diferente entre las formas \alpha y \beta,
dando lugar a una rotura enzimática más rápida en el caso de la
forma \alpha.
Además, se observó que la secuencia de
aminoácidos en el dominio semejante a EGF de las formas \alpha y
\beta era idéntico desde la posición del resto de aminoácido 177
hasta la posición del resto de aminoácido 212. Se supuso que la
diferencia en la susceptibilidad a la rotura podía ser debida a
diferenciales conformacionales en el extremo
C-terminal del dominio semejante a EGF, desde el
resto de aminoácido 212 hasta el resto de aminoácido 228. Este
razonamiento sugería que el extremo C-terminal podía
ser crítico para la actividad biológica e incitó la síntesis de dos
quimeras para probar y confirmar esta hipótesis. Específicamente,
estos dos péptidos quiméricos se basaron en el "intercambio" de
la secuencia de aminoácidos 222-228 entre
EGF-\alpha y EGF-\beta, con el
fin de estudiar el efecto en la actividad biológica de esta
secuencia. En total, se sintetizaron cuatro péptidos, incluyendo los
dos péptidos quiméricos mencionados anteriormente. Los cuatro
péptidos tenían las secuencias siguientes:
(1) SHLVK (A) QNYVMAS, o EGF-\alpha/\beta | (SEC ID NO:1) |
(2) SHLVK (B) QNYVMAS, o EGF-\beta | (SEC ID NO:2) |
(3) SHLVK (A) TENVPMK, o EGF-\alpha | (SEC ID NO:3) |
(4) SHLVK (B) TENVPMK, o EGF-\beta/\alpha | (SEC ID NO:4) |
en los que "(A)" indica la secuencia de
aminoácido
CAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARC (SEC ID
NO:5),
y
"(B)" indica la secuencia de aminoácido
CAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRC (SEC ID
NO:6).
La longitud relativamente corta de estos péptidos
se presta en sí misma a preparación para síntesis química,
utilizando el método siguiente.
Cada péptido se preparó por el método químico en
fase sólida para la síntesis de péptidos basado en Fmoc
(fluorenil-metoxicarbonilo)/t-butilo.
Se utilizó un instrumento ABI-431 (Applied
Biosystems, Foster City, CA), con un único programa de acoplamiento,
para realizar el ensamblaje de la cadena peptídica empezando con una
resina de poliestireno derivatizada con
hidroximetil-fenilacetilo (HMP) disponible
comercialmente. El acoplamiento del resto C-terminal
mediado por diciclohexilcarbodiimida (DCC), FmocLys
(t-Boc)OH, se catalizó con
4-dimetilaminopiridina (DMAP). Todos los restos
posteriores se acoplaron bien como anhídridos simétricos o como
ésteres de hidroxibenzotriazol (HOBt). Después de terminar la
síntesis, cada resina de péptido se secó en vacío durante toda la
noche, y se sometió después a desprotección acidolítica y rotura
utilizando 20 ml de una mezcla que comprendía ácido trifluoracético:
tioanisol: \beta-mercaptoetanol: agua: fenol en
una proporción 80:5:5:5:5, respectivamente. Después de agitar
durante cuatro horas a temperatura ambiente, se filtró la
suspensión, el filtrado se concentró (utilizando un evaporador con
rotación), y el péptido crudo se precipitó utilizando éter dietílico
frío.
El péptido se resuspendió inmediatamente en 50 ml
de un tampón de guanidina 8 M que contenía 100 mM de ditiotreitol
(DTT) y 50 mM de TRIS, ajustado a pH 8. Después de agitar durante
varias horas a temperatura ambiente, la disolución se aplicó a una
columna preparativa de fase reversa Vydac C_{4} y se eluyó con un
gradiente 0-60% de 0,1% TFA/acetonitrilo durante una
hora, utilizando un sistema de suministro de disolvente Beckman
modelo 114M. Las fracciones con el mejor perfil analítico se
juntaron y se liofilizaron.
Las condiciones óptimas para el plegamiento del
péptido para obtener un producto activo comprendieron disolver el
material lineal (a aproximadamente 1 mg/ml) en un tampón que
consistió en 25 mM de TRIS, pH 8, 1 mM de EDTA, 1 mM (para las
formas \alpha) o 0,5 mM (para las formas \beta) de glutation
(oxidado) y 1 mM de glutation (reducido), y agitación durante toda
la noche a temperatura ambiente. El material oxidado, plegado, se
aisló utilizando una columna preparativa de fase reversa (YMC Co.,
Ltd., Japón) equipada con un termostato equilibrado a 40ºC y se
eluyó con un gradiente 0,1% TFA/acetonitrilo.
La homogeneidad de los productos finales se
evaluó mediante HPLC y CZE analítico. La caracterización completa se
consiguió mediante análisis de aminoácidos, espectrometría de masas
con electropulverización, secuenciación parcial, y fragmentación
enzimática.
Se creció la línea celular epitelial de colon
humana, LIM 1215 (Whitehead, R.H. et al., J. Natl. Cancer
Inst. 4:759-765, 1985) en medio
RPMI-1640 suplementado con 5% FBS, 1 \mug/ml de
hidrocortisona, 1 \mug/ml de insulina bovina, 10 \muM de alfa
tioglicerol, y 1X PSG (0,292 mg/ml de L-glutamina,
100 unidades/ml de penicilina G, y 100 \mug/ml de sulfato de
estreptomicina). Al comienzo del ensayo, las células estaban un 30%
confluentes y estaban proliferando rápidamente. Las células se
despegaron con tripsina, se lavaron con PBS, y se sembraron en
placas de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo en medio
(McCoy-5A suplementado con 4 \mug/ml de
transferrina, 10 \mug/ml de insulina, 10 mM de ácido selénico, 4
nM de triyodotironina, y 0,03% BSA) con una concentración de suero
baja (0,05%). Las diluciones del péptido a ensayar se añadieron
inmediatamente en el día cero; el volumen total fue 100 \mul. Los
controles incluyeron sin tratamiento y diluciones seriadas de FBS.
Las placas de 96 pocillos se incubaron entonces durante tres días a
37ºC en una atmósfera con 5% CO_{2}. El medio se eliminó por
aspiración y se añadieron 30 \mul de cristal violeta 2% (Difco) en
metanol a las células durante quince minutos de tinción. El exceso
de colorante se eliminó con agua destilada. Se añadieron a cada
pocillo 100 \mul de HCl 0,04 N en isopropanol y el colorante se
volvió a solubilizar mezclando. La absorbancia se determinó a 595 nm
y los valores se representaron como veces de estimulación sobre la
línea basal (o sin tratamiento).
Se trataron las células LIM 1215 con los péptidos
mencionados anteriormente, y los resultados se muestran en la Figura
2. Como se muestra en la figura, EGF-\beta
estimuló la proliferación de las células LIM 1215, mientras que
EGF-\alpha no resultó un mitógeno tan potente.
Esto sugiere que un determinante importante de la actividad mitógena
reside en los últimos dieciséis aminoácidos de la porción
C-terminal de EGF-\beta que
corresponde a los aminoácidos 213-228 de la
NDF/heregulina extracelular de longitud completa a la que se hace
referencia más arriba. Los péptidos quiméricos ayudaron a concretar
este determinante de actividad en los siete restos que corresponden
a los aminoácidos 222-228 de la NDF/heregulina
extracelular de longitud completa. Específicamente,
EGF-\alpha/\beta consiste en los primeros
cuarenta y cinco restos de aminoácidos de la porción
N-terminal de EGF-\alpha y en los
últimos siete restos de aminoácidos de la porción
C-terminal de EGF-\beta (o
\alpha177-221/\beta222-228 que
corresponden a la numeración de aminoácidos de NDF/heregulina
extracelular de longitud completa). A la inversa,
EGF-\beta/\alpha consiste en los primeros
cuarenta y cinco restos de aminoácidos de la porción
N-terminal de EGF-\beta y en los
últimos siete restos de aminoácidos de la porción
C-terminal de EGF-\alpha (o
\beta177-221/\alpha222-228 que
corresponden a la numeración de aminoácidos de NDF/heregulina
extracelular de longitud completa). Mientras
EGF-\alpha/\beta presenta una actividad mitógena
significativa en las células de colon LIM1215,
EGF-\beta/\alpha no presentó ningún efecto
detectable en las mismas condiciones (véase la Figura 2). Estos
resultados demuestran muy claramente que la actividad mitógena de
los péptidos reside en el extremo C-terminal del
péptido. Más específicamente, el mayor grado de actividad es
atribuible a los últimos siete restos de aminoácidos del dominio
semejante a EGF de la forma \beta.
Las células LIM 1215 se crecieron en medio
RPMI-1640 suplementado con 5% FBS, 1 \mug/ml de
insulina bovina, 10 \muM de alfa tioglicerol, y 1X PSG. En el
momento del ensayo, las células estaban por encima del 30% de
confluencia y estaban proliferando rápidamente. Las células se
sembraron en placas de 24 pocillos a 25.000 células/pocillo en medio
sin suero (McCoy-5A, suplementado con 4 \mu/ml de
transferrina, 10 \mug/ml de insulina, 10 mM de ácido selénico, 4
mM de triyodotironina, y 0,03% BSA). Los péptidos a ensayar se
añadieron a una concentración de 420 picomolar inmediatamente en el
día cero; el volumen total fue 1,0 ml. Los controles incluyeron sin
tratamiento y diluciones seriadas de FBS. Las placas de 24 pocillos
se incubaron entonces durante tres días a 37ºC y con 5% CO_{2},
después de lo cual se eliminó el medio por aspiración y las células
se lavaron con 1,0 ml de PBS con 0,5% de BSA. Todos los lavados
posteriores se llevaron a cabo con este tampón. Las células se
fijaron entonces en Orthopermeafix (Ortho Chemicals Co.) durante
treinta minutos a temperatura ambiente, y se lavaron dos veces. Se
añadieron entonces 200 \mul de una disolución 10 nM de marcador
fluorescente NBD faloidina en PBS y las células se incubaron en
oscuridad (envueltas en papel de aluminio) durante treinta minutos a
temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces, y se
observaron utilizando un microscopio confocal.
Después del tratamiento de las células LIM 1215
con el péptido EGF-\beta, resultó evidente que la
morfología de las células cambiaba dramáticamente. La Figura 3
muestra la tinción de los filamentos de actina de las células (véase
más arriba el procedimiento) después de no recibir tratamiento
(panel superior) y después del tratamiento con 5% FBS (panel
inferior). En ausencia de tratamiento, las células aparecían
pequeñas y redondeadas. En presencia de FBS, las células cambiaron
en apariencia, volviéndose sólo un poco más grandes pero
permaneciendo redondeadas. Por el contrario, en presencia de
EGF-\beta (Figura 4, panel inferior) las células
sufrieron un cambio importante en su morfología, volviéndose más
grandes y con una apariencia semejante a guijarros. Por otra parte,
EGF-\alpha (Figura 4, panel superior) no produjo
los mismos cambios morfogénicos. Al estar las células proliferando
rápidamente en medio que contenía 5% de suero (Figura 3), la
morfología causada por el péptido EGF-\beta no
podía deberse únicamente a su capacidad de estimular la
proliferación. Más aún, la diferencia en las actividades
morfogénicas entre EGF-\beta y
EGF-\alpha debía haberse originado en los últimos
dieciséis aminoácidos del extremo C-terminal, al
ser ésta la única diferencia en la secuencia de los dos
péptidos.
Se obtuvo una localización adicional de la
actividad morfogénica mediante la utilización de los péptidos
quiméricos, EGF-\alpha/\beta y
EGF-\beta/\alpha. Como se observa en la Figura
5, EGF-\alpha/\beta produjo cambios morfogénicos
aparentes en las células LIM 1215 (panel inferior), mientras
EGF-\beta/\alpha, no produjo ningún cambio
apreciable (panel superior). De nuevo, la única diferencia en la
secuencia de estos dos péptidos es los últimos siete aminoácidos de
la porción C-terminal.
Se obtuvo una confirmación adicional de la
importancia de esta secuencia de siete aminoácidos por puntuación de
diferentes proteínas marcadoras en las células LIM 1215. Se utilizó
un citómetro ACAS de imagen confocal para detectar un número de
marcadores en las células sin despegar las células de la placa de
cultivo, como se hace habitualmente en el análisis de separación de
células activada por fluorescencia (FACS). Los datos presentados en
la Tabla 1, más abajo, muestran que EGF-\beta
produjo una expresión incrementada (+) del antígeno
carcinoembrionario (CEA) y de integrina \beta4. Por el contrario,
la expresión de vilina se redujo (-) por
EGF-\beta. La expresión de otros marcadores no
cambió (0) por tratamiento con EGF-\beta. De
manera análoga a los resultados previos en la caracterización de
cambios morfológicos observables, ni EGF-\alpha ni
EGF-\beta/\alpha cambiaron los niveles de estas
proteínas marcadoras, mientras que
EGF-\alpha/\beta cambió la expresión de las
proteínas marcadoras de manera similar a la observada con
EGF-\beta.
Proteína marcadora | EGF-\alpha | EGF-\beta | EGF-\alpha/\beta | EGF-\beta/\alpha |
CEA | 0 | + | + | 0 |
Integrina \beta4 | 0 | + | + | 0 |
Vilina | 0 | - | - | 0 |
Los tratamientos para el cáncer implican terapia
química o de radiación que resulta en una destrucción grave de la
capa epitelial del colon. Los resultados precedentes indican que los
péptidos de la invención pueden promover la reepitelización del
colon y aliviar los efectos negativos causados por el daño al
epitelio intestinal.
También se evaluó la actividad neurobiológica de
los péptidos mediante el estudio de sus efectos en la supervivencia
y el crecimiento de células de Schwann, como se describe más
adelante.
Se utilizó el nervio ciático de ratas neonatales
para generar un cultivo primario de células de Schwann. Las células
se sembraron durante toda la noche en 10% de suero sin exposición a
ningún factor de crecimiento. Al día siguiente, se añadieron
EGF-\beta, EGF-\alpha/\beta y
EGF-\beta/\alpha a las concentraciones en
nanogramos por mililitro (ng/ml) mostradas en la Tabla 2, más
adelante. Veinticuatro horas después, se añadió BrdU a cada muestra
de ensayo durante seis horas. BrdU es un análogo de timidina que se
incorpora en el ADN de células en división y que puede detectarse
mediante procedimientos estándar de inmunoquímica. Este agente
proporciona, por lo tanto, un medio para determinar la expansión de
la cantidad total de ADN en una muestra de ensayo y es una medida de
si la proliferación celular se ha producido. Después de terminar el
periodo de ensayo, las células de Schwann se fijaron y se analizaron
por medios inmunohistoquímicos. Las células se tiñeron primero para
el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), que es un
marcador conocido de las células de Schwann en cultivo, seguido de
tinción con BrdU. El contaje celular se llevó a cabo como sigue: en
una campo de visión dado del microscopio, se contaron todas las
células de Schwann reconocibles, después se contó el número de
células que presentaban una tinción positiva con BrdU. Para cada
muestra de ensayo (o pocillo) se contaron dos o tres campos, lo que
supuso aproximadamente 200 a 300 células de Schwann en total. El
resultado se expresa en la Tabla 2 como el porcentaje de células de
Schwann que estaban proliferando.
Concentración del Péptido, | EGF-\beta | EGF-\alpha/\beta | EGF-\beta/\alpha |
ng/ml | |||
0 | 1 | 1 | 1 |
0,1 | 7,5 | 1 | 1 |
1 | 13 | 10 | 2 |
10 | 14 | 10 | 5 |
100 | 19 | 17 | 10 |
Como se puede deducir de estos resultados, tanto
EGF-\beta como
EGF-\alpha/\beta estimularon la proliferación de
las células de Schwann en una medida significativamente mayor que
EGF-\beta/\alpha.
Los resultados del ensayo presentados más arriba
respecto a EGF-\beta y
EGF-\alpha/\beta indican la utilidad de estos
péptidos como agentes para la supervivencia, crecimiento y
proliferación de células epiteliales de colon y de células de
Schwann. Como mínimo, estos péptidos serán útiles para crecer estas
células en cultivo para estudio e investigación, y además, para la
producción de tejido para ser utilizado en terapias de implantación
en pacientes que lo necesiten. Serán especialmente interesantes los
pacientes que sufran condiciones o enfermedades que implican
deficiencias en, o pérdidas de, estas células. En el caso particular
de las células epiteliales de colon, estas condiciones incluyen
úlceras y colitis, que implican déficits, o deterioro, de las
células epiteliales de colon. Los péptidos de esta invención son
prometedores como factores de crecimiento para el tratamiento
terapéutico de estas condiciones, bien empleados ex vivo para
el crecimiento de tejido para reemplazar o utilizados in vivo
para la producción in situ de estas células y tejidos.
En el sistema nervioso periférico, las células de
Schwann, que constituyen una clase de células gliales, son
responsables de la formación de la cubierta de mielina que rodea y
aisla los axones en los vertebrados. La importancia funcional de la
mielina se ha recalcado por los graves deterioros en la función
motora observados en las enfermedades llamadas desmielinizantes, que
incluyen esclerosis múltiple y esclerosis amiotrófica lateral, que
están asociadas a una degeneración extensa de la cubierta de mielina
en el sistema nervioso central. El daño traumático del sistema
nervioso periférico implica habitualmente la destrucción de la
mielina que debe ser reparada para una cicatrización apropiada. Como
demuestran los resultados mostrados, los péptidos de esta invención
resultan útiles para mantener la supervivencia, crecimiento y
proliferación de las células de Schwann en cultivo, suponiendo, por
lo tanto, una fuente de estas células para la implantación en sitios
desmielinizados que resultan de daño nervioso periférico. También es
posible que la administración in vivo de estos péptidos,
formulados apropiadamente, resulte en la regeneración y
proliferación de las células de Schwann utilizadas en el reemplazo,
dando lugar a remielinización y cicatrización de heridas.
La utilización de los péptidos de esta invención
de acuerdo con los métodos de aplicación mencionados anteriormente,
se encuentra dentro de la capacidad de un médico preparado. La
cantidad eficaz de péptido para el tratamiento de una enfermedad o
condición particular in vivo dependerá de la naturaleza
específica de la enfermedad o condición, y dichas cantidades pueden
ser determinadas por técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible,
es deseable determinar la curva de dosis-respuesta y
las composiciones farmacéuticas de la invención primero in
vitro, en sistemas de bioensayo conocidos, y después en sistemas
de animales útiles antes de ensayarse en seres humanos. Los métodos
de administración in vivo incluyen, pero no están
necesariamente limitados a, administración intravenosa,
intramuscular, intraperitoneal, oral o intradermal.
Aún más, puede ser deseable administrar las
composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área
que necesite el tratamiento. Esto puede conseguirse, por ejemplo,
mediante una infusión local durante una operación, inyección,
catéter, o implante, siendo el implante de un material poroso, no
poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, como membranas
sialásticas, o fibras.
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden péptidos administrados a través de
liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En varias realizaciones
de la invención, puede resultar útil utilizar dichas composiciones
para alcanzar una liberación constante. Los péptidos de la invención
pueden administrarse en cualquier vehículo estéril compatible
biológicamente, incluyendo, pero no limitándose a, disolución
salina, disolución salina tamponada, dextrosa y agua, como tales, o,
si se desea, junto con cualquier aditivo adecuado.
Aunque la producción de los péptidos se ha
ilustrado específicamente respecto a la síntesis química, los
métodos convencionales de producción recombinante proporcionan una
alternativa adecuada para su preparación. A modo de ilustración, una
secuencia de nucleótido que codifica el péptido puede insertarse en
un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contenga
los elementos necesarios para la transcripción y traslación de la
secuencia insertada que codifica el péptido. Se pueden utilizar
varios sistemas anfitrión-vector para expresar la
secuencia que codifica el péptido. Estos sistemas incluyen, pero no
están limitados a, sistemas celulares de mamífero infectados con
virus (por ejemplo, virus de la vacuna, adenovirus, etc.); sistemas
celulares de insecto infectados con virus (por ejemplo,
baculovirus); microorganismos como levaduras que contengan vectores
de levaduras, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN
de plásmido, o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de estos
vectores varían en cuanto a su fuerza y especificidad. Dependiendo
del sistema anfitrión-vector utilizado, puede
utilizarse uno cualquiera de un número de elementos de transcripción
y traslación adecuados.
Cualquiera de los métodos descritos previamente
para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede utilizarse
para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico
que consista en señales de control apropiadas y en secuencias que
codifiquen péptidos. Estos métodos pueden incluir técnicas
recombinantes de ADN in vitro y técnicas sintéticas y
recombinaciones in vivo (recombinación genética). La
expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido
puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de
manera que el péptido se exprese en un anfitrión transformado con la
molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión puede
controlarse por cualquier elemento promotor/amplificador conocido en
el campo.
Una vez que se ha establecido un sistema
anfitrión y unas condiciones de crecimiento apropiadas, los vectores
recombinantes de expresión pueden propagarse y prepararse en
cantidad. Como se ha explicado previamente, los vectores de
expresión que pueden utilizarse incluyen, pero no están limitados a,
los vectores siguientes o sus derivados: virus humanos o animales,
como virus de la vacuna o adenovirus; virus de insectos como
baculovirus; vectores de levadura; vectores bacteriófagos (por
ejemplo, lambda), y vectores de ADN de plásmidos y cósmidos, por
nombrar algunos.
El péptido expresado resultante puede aislarse y
purificarse por métodos estándar, incluyendo cromatografía (por
ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, o de
exclusión), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier
otra técnica estándar para la mencionada purificación.
Los métodos de producción recombinante descritos
en la solicitud PCT WO 94/28133 mencionada previamente resultan
particularmente apropiados para ser utilizados en la presente
memoria.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Amgen Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos NDF
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Amgen Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1840 Dehavilland Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 91320
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1,0, Versión #1,25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Mazza, Richard J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/FACTURA: A-310
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys
Thr Phe Cys Val Asn}
\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser
Asn Pro Ser Arg Tyr}
\sac{Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala
Arg Cys Gln Asn Tyr}
\sac{Val Met Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys
Thr Phe Cys Val Asn}
\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser
Asn Pro Ser Arg Tyr}
\sac{Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp
Arg Cys Gln Asn Tyr}
\sac{Val Met Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys
Thr Phe Cys Val Asn}
\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser
Asn Pro Ser Arg Tyr}
\sac{Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala
Arg Cys Thr Glu Asn}
\sac{Val Pro Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys
Thr Phe Cys Val Asn}
\sac{Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser
Asn Pro Ser Arg Tyr}
\sac{Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp
Arg Cys Thr Glu Asn}
\sac{Val Pro Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn
Gly Gly Glu Cys Phe}
\sac{Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr
Leu Cys Lys Cys Gln}
\sac{Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys }
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn
Gly Gly Glu Cys Phe}
\sac{Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr
Leu Cys Lys Cys Pro}
\sac{Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys}
Claims (35)
1. Un péptido que tiene la secuencia de
aminoácidos:
SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCQPGFTGARCQNYVMAS
(SEC ID NO:1), o
un péptido que consiste en la secuencia de
aminoácidos siguiente:
SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMAS
(SEC ID NO:2).
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
que es el producto de una síntesis química.
3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
que es el producto recombinante de la expresión eucariota o
procariota de una secuencia de ADN exógena.
4. Una molécula de ADN que codifica un péptido de
la reivindicación 1.
5. Una célula anfitriona procariota o eucariota
transformada o transfectada de manera estable con una molécula de
ADN de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Un plásmido circular o un vector de ADN viral
funcional desde un punto de vista biológico, que incluye una
secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 4.
7. Una célula anfitriona procariota o eucariota
transformada o transfectada de manera estable con un vector de ADN
de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula de E. coli transformada o
transfectada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó
7.
9. Un procedimiento para la producción de un
péptido, que comprende cultivar, bajo condiciones adecuadas de
nutrientes, una célula anfitriona procariota o eucariota
transformada o transfectada con una secuencia de ADN de acuerdo con
la reivindicación 4 o con un vector de ADN de acuerdo con la
reivindicación 6, de manera que se permita a la célula anfitriona
expresar el péptido, y, opcionalmente, aislar el péptido.
10. Una composición farmacéutica, que comprende
un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y un diluyente,
adyuvante o vehículo aceptable desde un punto de vista
farmacéutico.
11. Un método ex vivo para mantener la
supervivencia de células de Schwann, que comprende poner dichas
células en contacto con una cantidad eficaz de un péptido de acuerdo
con la reivindicación 1.
12. Un método ex vivo para producir la
proliferación de células de Schwann, que comprende poner dichas
células en contacto con una cantidad eficaz de un péptido de acuerdo
con la reivindicación 1.
13. Un método ex vivo para producir la
proliferación, crecimiento y diferenciación de células epiteliales
de colon, que comprende poner dichas células en contacto con una
cantidad eficaz de un péptido de acuerdo con la reivindicación
1.
14. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11, 12 ó 13, que se lleva a cabo en cultivo
celular.
15. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para utilizarse en terapia humana.
16. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para utilizarse en el mantenimiento de la supervivencia de
células de Schwann in vivo.
17. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para utilizarse para producir la proliferación de células de
Schwann in vivo.
18. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para utilizarse para producir la proliferación, crecimiento y
diferenciación de células epiteliales de colon in vivo.
19. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad o trastorno
del colon.
20. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
19, donde la enfermedad o trastorno es colitis.
21. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
19, donde la enfermedad o trastorno es una úlcera.
22. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para promover la reepitelización del colon.
23. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
1, para tratar una enfermedad o trastorno del sistema nervioso.
24. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
23, donde la enfermedad o trastorno implica deficiencias o
anormalidades en, o deterioro o pérdida de, células de Schwann.
25. Un péptido de acuerdo con la reivindicación
23, donde la enfermedad o trastorno comprende daño nervioso causado
por un trauma.
26. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para mantener
la supervivencia de células de Schwann in vivo.
27. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para producir
la proliferación de células de Schwann in vivo.
28. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para producir
la proliferación, crecimiento y diferenciación de células
epiteliales de colon in vivo.
29. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar
una enfermedad o trastorno del colon.
30. Una utilización de acuerdo con la
reivindicación 29, donde la enfermedad o trastorno es colitis.
31. Una utilización de acuerdo con la
reivindicación 29, donde la enfermedad o trastorno es una
úlcera.
32. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para promover
la reepitelización del colon.
33. Utilización de un péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar
una enfermedad o trastorno del sistema nervioso.
34. Una utilización de acuerdo con la
reivindicación 33, donde la enfermedad o trastorno implica
deficiencias o anormalidades en, o deterioro o pérdida de, células
de Schwann.
35. Una utilización de acuerdo con la
reivindicación 33, donde la enfermedad o trastorno comprende daño
nervioso causado por un trauma.
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