ES2210374T3 - Compuestos y peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina. - Google Patents
Compuestos y peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PEPTIDOS DE 10 A 40 O MAS AMINOACIDOS DE LONGITUD, Y DE SECUENCIA X 3 X 4 X 5 GPX 6 TWX 7 X 8 (SEQ IC NO:) DONDE CADA AMINOACIDO ESTA INDICADO MEDIANTE UNA ABREVIATURA ESTANDAR DE UNA LETRA: X3 ES C; X 4 ES R, H, L O W; X 5 ES M, F O I; X 6 SE SELECCIONA INDEPENDIENTEMENTE A PARTIR DE CUALQUIERA DE LOS 20 LAMINOACIDOS CODIFICADOS GENETICAMENTE; X 7 ES D, E, I, L O V; Y X 8 ES C. DICHOS PEPTIDOS SE UNEN AL RECEPTOR DE ERITROPOYETINA (EPO-R) Y LO ACTIVAN O, ALTERNATIVAMENTE, ACTUAN COMO UN AGONISTA DE EPO. SE DESCRIBEN ASIMISMO METODOS DE UTILIZACION DE LOS CITADOS PEPTIDOS.
Description
Compuestos y péptidos que se unen al receptor de
eritropoyetina.
Esta solicitud es una continuación en parte de
las solicitudes de patente 08/484.635 y 08/484.631, presentadas el
7 de junio de 1995, que son continuación en parte de la solicitud
nº de serie 08/155.940, presentada el 19 de noviembre de 1993,
todas las cuales se incorporan a la presente memoria como
referencia.
La presente invención proporciona, entre otros,
péptidos y compuestos que se unen y activan el receptor de
eritropoyetina (EPO-R) o, de otro modo, actúan como
agonistas de EPO. La invención tiene aplicación en los campos de la
bioquímica y de la química medicinal y particularmente proporciona
agonistas de EPO para su utilización en el tratamiento de
enfermedades humanas.
Eritropoyetina (EPO) es una hormona de
glucoproteína con 165 aminoácidos, 4 zonas de glucosilación en las
posiciones de los aminoácidos 24, 38, 83 y 126 y con un peso
molecular de aproximadamente 34.000. Se produce inicialmente como
una proteína precursora como un péptido con señal de 23 aminoácidos.
EPO puede tener lugar en tres formas: \alpha, \beta y asialo.
Las formas \alpha y \beta se diferencian ligeramente en los
componentes carbohidrato, pero tienen la misma potencia, actividad
biológica y peso molecular. La forma asialo es una forma \alpha o
\beta con el carbohidrato terminal (ácido siálico) eliminado. Se
han descrito las secuencias de ADN que codifican EPO. Véase, Lin
(1987) patente U.S. nº 4.703.008, que se incorpora a la presente
memoria como referencia.
EPO estimula la división mitótica y la
diferenciación de las células precursoras de eritrocitos y asegura
de este modo la producción de eritrocitos. Se produce en el riñón
cuando prevalecen las condiciones hipóxicas. Durante la
diferenciación de las células precursoras de eritrocitos provocada
por EPO, existe producción de síntesis de globina y aumenta la
síntesis de complejo hemo y en el número de receptores de
ferritina. Esto hace posible que la célula acepte más hierro y
sintetice hemoglogina funcional. La hemoglobina se une al oxígeno
en los eritrocitos maduros. De este modo, los eritrocitos y la
hemoglobina contenida en ellos representa una pieza clave en el
aporte de oxígeno al cuerpo. Los procesos complejos que se han
descrito se inician por interacción de EPO con un receptor
apropiado en la superficie de la célula de las células precursoras
de eritrocitos. Véase, p. ej.: Graber y Krantz (1978) Ann. Rev.
Med. 29:51-66.
EPO está presente en muy bajas concentraciones en
el plasma cuando el cuerpo está en estado sano en el que los
tejidos reciben suficiente oxigenación procedente del número
existente de eritrocitos. Esta baja concentración normal basta para
estimular el reemplazamiento de los glóbulos rojos que se pierden
normalmente por envejecimiento.
La cantidad de EPO en circulación aumenta en
condiciones de hipoxia cuando se reduce el transporte de oxígeno
por los glóbulos rojos en la circulación. La hipoxia se puede
producir por pérdida de grandes cantidades de sangre por
hemorragia, destrucción de glóbulos rojos por sobreexposición a la
radiación, reducción del aporte de oxígeno debido a grandes
altitudes o periodos de inconsciencia prolongados, o a varias
formas de anemia. En respuesta a la sobrecarga hipóxica que
experimentan los tejidos, EPO aumentará la producción de glóbulos
rojos mediante estimulación de la proliferación de células
progenitoras eritroides. Cuando el número de glóbulos rojos en
circulación es mayor que el necesario para los requisitos en
oxígeno del tejido normal, la EPO en circulación disminuye.
Debido a que la EPO es esencial en el proceso de
formación de glóbulos rojos, la hormona tiene aplicaciones
potencialmente útiles tanto en el diagnóstico como en el
tratamiento de trastornos sanguíneos caracterizados por la
producción baja o insuficiente de glóbulos rojos. Estudios
recientes han proporcionado una base para la proyección de la
eficacia de la terapia de EPO en diversos estados patológicos y
estados de irregularidad hematológica, incluyendo:
beta-talasemia (véase, Vedovato et al.
(1984) Acta. Haematol. 71:211-213);
fibrosis quística (véase, Vichinsky et al. (1984) J.
Pediatric 105: 15-21); trastornos del embarazo
y de la menstruación (véase, Cotes et al. (1993) Brit. J.
Ostet. Gyneacol. 90:304-311; anemia
precoz de la premadurez (véase, Haga et al. (1983) Acta
Pediatr. Scand. 72:827-831); lesión de la médula
espinal (véase, Claus-Walker et al. (1984)
Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374); miedo
al espacio (véase, Dunn et al. (1984) Eur. J. Appl.
Physiol. 52:178-182); hemorragias agudas (véase,
Miller et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:
545-590); envejecimento (véase Udupa et al.
(1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580
y 581-588 y Lipschitz et al. (1983) Blood
63:502-509; varios estados patológicos
neoplásicos acompañados de eritropoyesis anormal (véase, Dainiak
et al. (1983) Cancer 5:1101-1106 y
Schwartz et al. (1983) Otolaryngol.
109:269-272); e insuficiencia renal (véase,
Eschbach et al. (1987) N. Eng. J. Med.
316:73-78).
Se ha caracterizado EPO purificada,
homogénea. Véase, Hewick patente U.S. nº 4.677.195. Se purificó
una secuencia de ADN que codifica a EPO, se clonó y se expresó para
producir polipéptidos sintéticos con las mismas propiedades
bioquímicas e inmunológicas. También se ha producido una molécula de
EPO recombinante con oligosacáridos idénticos a los del material
natural. Véase, Sasaki et al. (1987) J. Biol. Chem.
262:12059-12076.
A pesar de la disponibilidad de EPO recombinante
purificada, se conoce poco referente al mecanismo de proliferación
e identificación de eritroblastos provocado por EPO. La interacción
específica de EPO con los progenitores de glóbulos rojos inmaduros,
plaquetas y megacariocitos queda por caracterizar. Esto se debe, al
menos en parte, a un pequeño número de moléculas del receptor EPO
de superficie en eritroblastos normales y en la línea celular de la
eritroleucemia. Véase, Krantz y Goldwasser (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:7574-7578; Branch et
al. (1987) Blood 69:1782-1785; Mayeux
et al. (1987) FEBS Letters
211:229-233; Mufson and Gesner (1987) Blood
69:1485-1490; Sakaguchi et al. (1987)
Biochem. Biophys. Commun. 146:7-12;
Sawyer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3690-3694; Sawyer et al. (1987) J.
Biol. Chem. 262:5554-5562, y Todokoro et
al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:4126-4130.
Los complejos reticulados entre EPO radioyodada y
proteínas de la superficie celular sugieren que las proteínas de la
superficie celular comprenden dos polipéptidos con pesos
moleculares aproximados de 85.000 daltons y 100.000 daltons,
respectivamente. Más recientemente, los dos complejos reticulados
han sido sometidos a la digestión de la V8 proteasa y se ha
observado que tienen fragmentos de péptido idénticos, lo que
sugiere que los dos polipéptidos que se unen a EPO pueden ser
productos del mismo o de genes muy similares. Véase, Sawyer et
al. (1988) supra. La mayoría de los estudios de unión a
la superficie celular, sin embargo, han puesto de manifiesto una
sola clase de zonas de unión, promediando 300 a 600 por
superficie celular, con una Kd de aproximadamente 800 pM
(picomolar). Véase, Sawyer et al. (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:3690-3694. Sin embargo,
eritrotroblastos esplénicos que responden a EPO, preparados a
partir de ratones inyectados con la cepa anémica (FVA) del virus de
leucemia de Friend, demuestra una gran y baja afinidad por la zona
de unión con constantes de disociación de 100 pM y 800 pM,
respectivamente. Véase, Sawyer et al. (1987) J. Biol.
Chem. USA 262:5554-5562 y Landschulz (1989)
Blood 73:1476-1478. Se han descrito las
secuencias de ADN y las secuencias codificadas de péptido para las
proteínas del receptor de la EPO murina y humana. Véase, D'Andrea
et al. publicación de patente PCT nº WO 90/08822 (publicado
en 1990).
La disponibilidad de los genes clonados para el
EPO-R facilita la búsqueda de agonistas y
antagonistas de este importante receptor. La disponibilidad de la
proteína del receptor recombinante permite el estudio de la
interacción ligando-receptor en una variedad de
sistemas de generación de diversidad de péptidos aleatorios y
semialeatorios. Estos sistemas incluyen el sistema "péptidos en
plásmidos" descrito en la solicitud de patente U.S. nº de serie
778.233, presentada el 16 de octubre de 1991, el sistema "péptidos
en fago" descrito en la solicitud de patente U.S. nº de serie
718.577, presentada el 20 de junio de 1991 y en Cwirla et
al., Agosto de 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:6378-6382, el sistema de "biblioteca
codificada de síntesis" (ESL) descrito en la solicitud de
patente U.S. nº de serie 946.239, presentada el 16 de septiembre de
1992, que es una continuación en parte de la solicitud de nº de
serie 762.522, presentada el 18 de septiembre de 1991, y el sistema
de "síntesis de polímero inmovilizado a muy gran escala"
descrito en la solicitud de patente U.S. nº de serie 492.462,
presentada el 7 de marzo de 1990; publicación de patente PCT nº
90/15070, publicada el 13 de diciembre de 1990; la solicitud de
patente U.S. nº 624.120, presentada el 6 de diciembre de 1990;
Fodor et al., 15 Feb. 1991, Science 251:
767-773; Dower y Fodor, 1991, Ann. Rep. Med.
Chem. 26:271-180; y la solicitud de patente U.S.
nº de serie 805.727, presentada el 6 de Diciembre de 1991; cada una
de las solicitudes y publicaciones de patente anteriores se
incorporan a la presente memoria como referencia.
Subsiste una necesidad, sin embargo, de
compuestos que se unan o, de otro modo, interactúen con el
EPO-R, tanto para los estudios de actividades
biológicas importantes mediadas por este receptor como para el
tratamiento de enfermedades. La presente invención proporciona
dichos compuestos.
En una forma de realización preferida, la
invención proporciona péptidos que se unen y activan el
EPO-R o por otra parte se comportan como agonistas
de EPO. Estos péptidos son de 10 a 40 restos de aminoácidos de
longitud, preferentemente de 14 a 20 restos de aminoácidos de
longitud y comprenden una secuencia central de aminoácidos
X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8} (SEC ID nº:), en la
que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica de una
letra; X_{3} puede ser C, A,
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico
u Hoc, en el que Hoc es homocisteína; X_{4} puede ser R, H, L o
W; X_{5} puede ser M, F o I; X_{6} se selecciona
independientemente de entre uno cualquiera de los 20
L-aminoácidos codificados genéticamente o de entre
los D-aminoácidos estereoisoméricos; X_{7} puede
ser D, E, I, L o V; y X_{8} puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en donde Hoc es homocisteína, con la condición de que
X_{3} o X_{8} sea C u Hoc. Preferentemente, el péptido
comprenderá una secuencia central
YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8} (SEC ID nº:),
en la que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica
de una letra; cada X_{2} y X_{6} se selecciona
independientemente de entre uno cualquiera de los 20
L-aminoácidos codificados genéticamente; X_{3}
puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en donde Hoc es homocisteína; X_{4} puede ser R, H, L o W;
X_{5} puede ser M, F o I; X_{7} puede ser D, E, I, L o V; y
X_{8} puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en donde Hoc es homocisteína, con la condición de que
X_{3} o X_{8} sea C u Hoc.
Más preferentemente, el péptido comprenderá una
secuencia central de aminoácidos
X_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8}
X_{9}C_{10}X_{11} (SEC ID nº:), en la que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica de una letra; cada X_{1}, X_{2}, X_{6}, X_{9}, X_{10} y X_{11} se selecciona independientemente de entre uno cualquiera de los 20 L-aminoácidos codificados genéticamente; X_{3} puede ser C, A, ácido \alpha-amino-\gamma-bromobutírico, u Hoc, en donde Hoc es homocisteína; X_{4} puede ser R, H, L o W; X_{5} puede ser M, F o I; X_{7} puede ser D, E, I, L o V; y X_{B} puede ser C, A, ácido \alpha-amino-\gamma-bromobutírico, u Hoc, en donde Hoc es homocisteína, con la condición de que X_{3} o X_{8} sea C u Hoc.
X_{9}C_{10}X_{11} (SEC ID nº:), en la que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica de una letra; cada X_{1}, X_{2}, X_{6}, X_{9}, X_{10} y X_{11} se selecciona independientemente de entre uno cualquiera de los 20 L-aminoácidos codificados genéticamente; X_{3} puede ser C, A, ácido \alpha-amino-\gamma-bromobutírico, u Hoc, en donde Hoc es homocisteína; X_{4} puede ser R, H, L o W; X_{5} puede ser M, F o I; X_{7} puede ser D, E, I, L o V; y X_{B} puede ser C, A, ácido \alpha-amino-\gamma-bromobutírico, u Hoc, en donde Hoc es homocisteína, con la condición de que X_{3} o X_{8} sea C u Hoc.
En una forma de realización más preferida, tanto
X_{3} como X_{8} serán C y, de este modo, el péptido
comprenderá una secuencia central de aminoácidos
X_{1}YX_{2}CX_{4}GPX_{5}GPX_{6}TWX_{7}CX_{9}X_{10}X_{11}
(SEC ID nº:). Más preferentemente, el péptido comprenderá una
secuencia central de aminoácidos
X_{1}YX_{2}CX_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}CX_{9}C_{10}X_{11}
(SEC ID nº:), en la que X_{4} puede ser R o H; X_{5} puede ser F
o M; X_{6} puede ser I, L, T, M o V; X_{7} es D o V; X_{9}
puede ser G, K, L, Q, R, S o T; y X_{10} puede ser A, G, P, R o
Y. En una forma de realización más preferida, el péptido
comprenderá una secuencia central de aminoácidos
X_{1}YX_{2}CX_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}CX_{9}C_{10}X_{11}
(SEC ID nº:), en la que X_{1} puede ser D, E, L, N, S, T o V;
X_{2} puede ser A, H, K, L, M, S o T; X_{4} es R o H; X_{9}
puede ser K, R, S o T; y X_{10} es P. Los péptidos
particularmente preferidos comprenden, pero no están limitados a,
los siguientes:
En otra forma de realización preferida, los
péptidos de la presente invención están ciclados o dimerizados.
Ejemplos de péptidos que se pueden ciclar como amidas
C-terminales incluyen, pero no se limitan a, los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de un dímero según la presente
invención es el siguiente:
Según algunas formas de realización de la
presente invención, dos o más, y preferentemente entre dos a seis
restos de aminoácidos, seleccionados independientemente de entre
uno cualquiera de los 20 aminoácidos codificados genéticamente o de
entre los D-aminoácidos estereoisoméricos, estarán
acoplados a cualquiera de los dos o a ambos extremos de las
secuencias centrales descritas anteriormente. Por ejemplo, la
secuencia GG estará adjunta con frecuencia a cualquiera de los dos
o a ambos terminales de las secuencias centrales para facilitar la
síntesis de los péptidos. La presente invención proporciona asimismo
conjugados de estos péptidos y derivados y peptidomiméticos de los
péptidos que conservan la propiedad de la unión al
EPO-R.
La presente invención proporciona asimismo
procedimientos para tratar enfermedades que impliquen una
insuficiencia de EPO utilizando los nuevos compuestos de la
invención. La presente invención proporciona además composiciones
farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de la invención y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La Figura 1 proporciona las secuencias de los
oligómeros de la mutagénesis empleados en los procedimientos
descritos en la presente memoria.
La Figura 2 proporciona las secuencias de los
péptidos representativos de la presente invención.
La Figura 3 ilustra una nueva biblioteca de la
mutagénesis del fagómido construida utilizando el sistema de
presentación pVIII. En esta biblioteca, están fijados los restos de
tirosina, glicina-prolina y
treonina-triptófano (subrayados), así como las dos
cisteínas. Otras posiciones entre los residuos de cisteína
(mostradas en letras cursivas subrayadas presentes en el péptido con
éxito AF11154 original) fueron mutadas por la oligoconstrucción de
modo que cada resto de construcción se podría cambiar por cualquier
otro con una frecuencia del 50%. "X" significa una posición
aleatoria del aminoácido.
Las Figuras 4A-C ilustran las
bibliotecas pIII y pVIII de la mutagénesis del fagómido actualmente
en fase de construcción y de cribado. Los restos de aminoácidos
están en letra negrita, los restantes (indicados por NNK) están al
azar. 4A (ON3007) y 4C (ON 3017) se designan para investigar la
contribución de las zonas extraflanqueantes
N-terminal y C-terminal,
respectivamente, en la secuencia central (tirosina hasta la segunda
cisteína). 4B (ON3016) está basado en el péptido
Y-CHFGPLTWVC, donde el resto de tirosina se coloca
directamente junto a la primera cisteína. Esta biblioteca añade
restos adicionales al azar a ambos lados de la secuencia
central.
La Figura 5 ilustra una biblioteca de mutagénesis
basada en GGTYSCHFGPTWVCKPQGG, construida y cribada utilizando un
nuevo vector de exposición a Lac-I ("Dímero de
cabeza"). Los residuos de aminoácidos denominados X son
aleatorios (NNK), los subrayados están mutados ligeramente
(91:3:3:3/91:3:3:3/K), mientras que los que tienen contorno están
muy mutados (70:10:10/70:10/10/K).
La Figura 6 ilustra una biblioteca de mutagénesis
basada en TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, construida y cribada utilizando un
nuevo vector de exposición a Lac-I ("Dímero de
cabeza"). Los residuos de aminoácidos denominados X son
aleatorios (NNK), los subrayados fueron fijados y los dos restos de
ácido glutámico estaban ligeramente
mutados(91:3:3:3/91:3:3:3/K).
La Figura 7 es una representación gráfica de los
resultados del bioensayo
FDCP-1/hEPO-R para los péptidos de
la invención con:
\bullet que designa los resultados para
GGCRIGPITWVDGG;
\bigcirc que designa los resultados para
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG;
\sqbullet que designa los resultados para
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;
\blacktriangle que designa los resultados para
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG;
\blacktriangledown que designa los resultados
para VGNYMCHFGPITWVCRPGGG
\rectque designa los resultados para GGVYACRMGPITWVCSPLGG;
+ que designa los resultados para
VGNYMAHMGPITWVCRPGG; y
* que designa los resultados para EPO.
La Figura 8 es una representación de los
resultados del bioensayo de TF-1 para EPO
(\blacktriangle y \blacklozenge designan los resultados del
ensayo utilizando EPO y 10.000 y 20.000 células por pocillo,
respectivamente); y para el péptido VGNYMCHFG
PITWVCRPGGG (SEC ID nº:) (\sqbullet y \bullet designan los resultados del ensayo utilizando EPO y 10.000 y 20.000 células por pocillo, respectivamente).
PITWVCRPGGG (SEC ID nº:) (\sqbullet y \bullet designan los resultados del ensayo utilizando EPO y 10.000 y 20.000 células por pocillo, respectivamente).
Las Figuras 9A (referencia), 9B (tratada con EPO
500 pM) y 9C (tratada con 25 mm GGDYHCRMGPLTWVCK
PLGG) son fotografías que representan los resultados de un ensayo de proliferación de MTT en poblaciones representativas de células de bazo de ratones tratados con fenilhidrazina con una ampliación de 200 \times.
PLGG) son fotografías que representan los resultados de un ensayo de proliferación de MTT en poblaciones representativas de células de bazo de ratones tratados con fenilhidrazina con una ampliación de 200 \times.
La Figura 10 es una representación de los
resultados del bioensayo de FDCP-1/hEPOR que
presenta el aumento de potencia del péptido biotinilado (es decir,
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotina)), por
oligomerización con estreptavidina. Los péptidos
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG y GGTYSCHFGPLTWVCK-PQGGSSK
(Ahx-biotina) presentan aproximadamente la misma
actividad, pero cuando el último está acomplejado previamente con
estreptavidina (es decir, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK
(Ahx-biotina)-complejo de
estreptavidina), es mucho más potente. En este ensayo, se observa
poca reducción de actividad a la concentración más baja (5 nM con
respecto al péptido en el complejo). La estreptavidina, sola,
presenta actividad incierta a altas concentraciones.
\newpage
La Figura 11 es una representación de los
resultados del bioensayo de FDCP-1/hEPOR que
presenta el aumento de potencia del péptido AF11505 mediado por
anti-biotina policlonal de cabra. El acomplejamiento
previo de GGTYSCHFGPLTWVCKPQ-GGSSK
(Ahx-biotina) con anticuerpos
anti-biotina CGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK de cabra + G
anti-B) aumenta la potencia del péptido uno log
sobre el péptido libre. Los anticuerpos purificados (G
anti-B) no presentan solos efecto estimulante.
La Figura 12 ilustra el esquema de la síntesis
para la preparación del péptido dimérico análogo de
GGTYSCHFG
PLTWVCKPQGG.
PLTWVCKPQGG.
La Figura 13 ilustra la representación IC_{50}
del péptido dimérico análogo de GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Se determinó
la afinidad utilizando un ensayo de unión por competición con el
radioligando frente al EPOR con terminal PIG inmovilizado en
mAB179.
La Figura 14 ilustra la actividad biológica in
vitro del péptido dimérico análogo de
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ
GG utilizando el ensayo de proliferación celular FDCP-1/hEPOR. El péptido dimérico presenta un EC_{50} de aproximadamente 20 nM, un aumento en la potencia de 20 veces sobre el péptido progenitor.
GG utilizando el ensayo de proliferación celular FDCP-1/hEPOR. El péptido dimérico presenta un EC_{50} de aproximadamente 20 nM, un aumento en la potencia de 20 veces sobre el péptido progenitor.
La Figura 15 ilustra la progresión del ciclo
celular de FDC-P1/ER.
La Figura 16 ilustra el análisis de la unión en
equilibrio de la asociación específica de [^{125}I]EPO con
EBP inmovilizada en lechos de agarosa e indica una Kd de 5 nM \pm
2 basada en una transformación lineal (Scatchard) de la isoterma de
unión.
Las Figuras 17A, 17B y 17C ilustran los
resultados del bioensayo del ratón exhipóxico policitémico
utilizando los péptidos GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ y
LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD, respectivamente.
Las Figuras 18A y 18B ilustran los resultados del
bioensayo del ratón exhipóxico policitémico utilizando los péptidos
TIAQYICIMGPETWECRPSPKA y un péptido oligomérico de
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG que contiene dos enlaces disulfuro (AF12080),
respectivamente.
Las Figuras 19A y 19B ilustran los resultados del
ensayo de reticulocitos utilizando EPO y
GGTYSCHFG
PLTWVCKPQGG, respectivamente. Para ambas grupos de dosis, n = 10 animales, EPO: 0,4, 4,0, 40,0 unidades/ratón, dosis total del vehículo de referencia; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: 2,0, 20,0, 200,0 \mug/ratón, dosis total del vehículo de referencia + DMSO (1 a 2%) 200,0 \mug/ratón = 10 mg/kg. Base teórica: los datos del ensayo de proliferación in vitro sugieren: 2 \mug de GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0,4 unidades de EPO.
PLTWVCKPQGG, respectivamente. Para ambas grupos de dosis, n = 10 animales, EPO: 0,4, 4,0, 40,0 unidades/ratón, dosis total del vehículo de referencia; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: 2,0, 20,0, 200,0 \mug/ratón, dosis total del vehículo de referencia + DMSO (1 a 2%) 200,0 \mug/ratón = 10 mg/kg. Base teórica: los datos del ensayo de proliferación in vitro sugieren: 2 \mug de GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0,4 unidades de EPO.
Las Figuras 20A y 20B ilustran los resultados del
ensayo de reticulocitos utilizando EPO y
GGTYSCHFG
PLTWVCKPQGG, respectivamente. Para ambas grupos de dosis, n = 10 animales. EPO: 0,4, 4,0, 40,0 unidades/ratón, dosis total; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: aumenta la dosis a 1 mg/ratón, dosis total = 50 mg/kg y a 2 mg/ratón, dosis total = mg/kg.
PLTWVCKPQGG, respectivamente. Para ambas grupos de dosis, n = 10 animales. EPO: 0,4, 4,0, 40,0 unidades/ratón, dosis total; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: aumenta la dosis a 1 mg/ratón, dosis total = 50 mg/kg y a 2 mg/ratón, dosis total = mg/kg.
Se propone que los siguientes términos tengan los
siguientes significados generales:
Los restos de aminoácidos en los péptidos se
abrevian de la forma siguiente: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es
Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val
o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T;
Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H;
Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K;
Ácido aspártico es Asp o D; Ácido glutámico es Glu o E; Cisteína es
Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arg es Arg o R; y Glicina es Gly o
G.
Los estereoisómeros (p. ej.:
D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos
convencionales, de los aminoácidos no naturales tales como los
aminoácidos a-disustituidos,
N-alquil aminoácidos, ácido láctico, y otros
aminoácidos no convencionales pueden ser asimismo componentes
adecuados para los compuestos de la presente invención. Ejemplos de
aminoácidos no convencionales comprenden:
4-hidroxiprolina,
O-fosfoserina, N-acetilserina,
N-formilmetionina, 3-metilhistidina,
5-hidroxilisina y otros aminoácidos e iminoácidos
similares (p. ej.: 4-hidroxiprolina).
"Agonista" se refiere a un ligando
biológicamente activo que se une a su receptor complementario
biológicamente activo y activa este último, ya sea para producir
una respuesta biológica en el receptor o para aumentar la actividad
biológica preexistente del receptor.
"Célula huésped" se refiere a una célula
eucariótica o procariótica o a un grupo de células que pueden ser o
han sido transformadas por un vector de ADN recombinante. Para los
fines de la presente invención, se prefieren las células huésped
procarióticas.
"Péptido" o "polipéptido" se refiere a
un polímero en el que los monómeros son alfa aminoácidos unidos
mediante enlaces amida. Los péptidos son dos o a menudo más
monómeros largos de aminoácido.
"Sales farmacéuticamente aceptables" se
refieren a las sales de metal alcalino, de metal alcalinotérreo y
de amonio no tóxicos utilizadas generalmente en la industria
farmacéutica incluyendo las sales de sodio, potasio, litio, calcio,
magnesio, bario, amonio y protamina cinc, que se preparan por
procedimientos bien conocidos en la técnica. El término sal incluye
las sales de adición ácido no tóxicas que se preparan generalmente
haciendo reaccionar los compuestos de esta invención con un ácido
orgánico u inorgánico. Las sales representativas incluyen cloruro,
bromuro, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato,
laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, toxilato, citrato,
maleato, fumarato, succinato, tartrato, napsilato y similares.
"Dosis o cantidad farmacéutica o
terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de dosis
suficiente para producir un resultado biológico deseado. Este
resultado puede ser el alivio de las señales, síntomas o causas de
una enfermedad o de cualquier otra alteración deseada de un sistema
biológico. Preferentemente, la dosis o cantidad será suficiente
para estimular a EPO-R y aliviar, de este modo, los
síntomas asociados a una insuficiencia de EPO o a una población de
glóbulos rojos insuficiente o baja in vivo.
"Vector de clonación o de expresión del ADN
recombinante" se refiere a una molécula de ADN o ARN que
codifica una función útil y se puede utilizar para transformar una
célula huésped. Para los fines de la presente invención, un vector
de clonación sirve en general principalmente como producto
intermedio en la construcción de un vector de expresión; este
último vector se utiliza para transformar o transfectar una célula
huésped de modo que la célula huésped transfectada produzca una
proteína u otro producto codificado por el vector. Dichos vectores
son típicamente los "plásmidos", que para los fines de la
presente invención, son vectores que se pueden mantener fuera de los
cromosomas en una célula huésped, pero pueden ser también vectores
que se integren en el genoma de una célula huésped. Los expertos en
la técnica pueden referirse a los "vectores de clonación",
definidos anteriormente, como "vectores" y a los "vectores
de expresión", definidos en la presente memoria, como
"plásmidos".
La presente invención proporciona compuestos que
se unen y activan el EPO-R o de otra forma se
comportan como un agonista de EPO. Estos compuestos incluyen los
compuestos del péptido "principal", descubiertos en sistemas
que generan diversidad de péptidos al azar y compuestos
"derivados" construidos con el fin de tener la misma o similar
estructura molecular o tamaño que los compuestos principales, pero
que se diferencian de los compuestos principales ya sea con
respecto a la susceptibilidad a la hidrólisis o a la proteolisis y/o
con respecto a otras propiedades biológicas, tales como el aumento
de afinidad para el receptor, el aumento de la actividad in
vitro o de la actividad in vivo.
La diversidad de péptidos aleatorios que generan
los sistemas empleados inicialmente incluía el sistema "péptidos
en el fago" expuestos anteriormente. Los péptidos aleatorios se
diseñaron para ser 8 restos de aminoácido de longitud, flanqueados
por restos de Cys en ambos extremos (así pues, 10 restos de
aminoácido de longitud total). En estos sistemas iniciales, los
péptidos aleatorios se presentaron como parte de una proteína de
fusión que comprende la proteína de la capa pVIII de un derivado de
fago fd (péptidos en el fago). Las proteínas de fusión, junto con el
ADN que codifica las proteínas de fusión, se "desnaturalizaron"
en EPO-R inmovilizado. El proceso de
desnaturalización implicó múltiples rondas de incubación de las
proteínas de fusión con el receptor inmovilizado, recogiendo las
proteínas de fusión que se unen al receptor (junto con el ADN
adjunto) y produciendo más proteínas de fusión recogidas.
Típicamente, después de tres rondas de
desnaturalización, las proteínas de fusión y el ADN adjunto se
aislaron y se cultivaron para producir preparaciones de proteína de
fusión por ELISA para determinar si la proteína de fusión se unía
específicamente al receptor. Este ensayo se realizó de forma similar
al de la desnaturalización, excepto que después de eliminar las
proteínas no unidas, se trataron los pocillos con anticuerpo
anti-fago de conejo (o con anticuerpo-lac
para los péptidos en el sistema de plásmidos), a continuación con
anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con
fosfatasa alcalina y a continuación se determinó la cantidad de
fosfatasa alcalina en cada pocillo por procedimientos estándar. Por
comparación de los pocillos de la prueba con los pocillos de
referencia (sin receptor), se puede determinar si las proteínas de
fusión se unen al receptor específicamente.
El receptor inmovilizado utilizado en la
desnaturalización y los procedimientos de ELISA comprendían el
dominio extracelular del receptor de EPO y se produjeron en células
huésped recombinantes. Esta molécula receptora se puede producir de
varias formas y en células huésped diferentes. Una forma útil se
construye con un péptido con señal para la secrección de proteínas y
para la unión del anclaje de la membrana (esta forma de unión del
anclaje se denomina "terminación en PIG"; véase Caras y
Weddell, 3 de marzo de 1989, Science
243:1196-1198; y Lin et al., 10 de agosto
de 1990, Science, 249:677-679, cada
una de las cuales se incorpora a la presente memoria como
referencia). Este sistema permite con mucha facilidad la escisión
del receptor de la superficie de las células que expresan el
receptor y la recogida del receptor escindido. Se inserta
preferentemente, una zona de escisión de la proteasa, como por
ejemplo una zona de escisión de trombina, entre el epítopo HPAP del
receptor con terminal PIG y del propio receptor.
La proteína del receptor recombinante se
inmovilizó utilizando la metodología siguiente. Se recubrieron las
placas del microfiltro con un anticuerpo del receptor and y los
pocillos que contenían el receptor inmovilizado se trataron con
albúmina de suero bovino (BSA) para bloquear las uniones no
específicas. El receptor con terminal PIG con una zona de escisión
de trombina se añadió a los pocillos recubiertos de la placa
microfiltro, que se lavaron a continuación para eliminar el
receptor no unido.
Al utilizar los sistemas aleatorios de generación
de péptidos que permiten la interación polivalente
ligando-receptor, se debe reconocer que la densidad
del receptor inmovilizado es un factor importante para determinar
la afinidad de los ligandos que se unirán al receptor inmovilizado.
A densidades de receptor mayores (es decir, cada anticuerpo del
anti-receptor bien recubierto tratado con 0,25 a
0,5 mg de receptor), es más probable que tenga lugar la unión
polivalente (si es en todos) que a densidades menores del receptor
(es decir, cada anticuerpo del anti-receptor bien
recubierto tratado con 0,5 a 1 ng de receptor). Si está teniendo
lugar la unión polivalente, entonces se aislarán más probablemente
los ligandos con afinidad relativamente baja. Normalmente, los
compuestos principales se pueden identificar utilizando una densidad
alta de receptor inmovilizado y a continuación se prueban los
derivados del compuesto principal a las densidades menores del
receptor para aislar los compuestos con mayor afinidad al receptor
que el compuesto principal.
Con frecuencia, el receptor se añadió únicamente
en filas alternas de la placa de microvaloración; los pocillos
bloqueados con BSA en las filas de "blanco" sirvieron como
referencias negativas útiles para determinar si una reacción
específica para el receptor estaba produciendo los resultados
observados. Se añadieron a continuación a los pocillos
preparaciones de proteína de fusión y se incubaron para permitir
que tuviera lugar la unión al receptor; se lavaron los pocillos para
eliminar las proteínas de fusión no unidas.
Con los sistemas anteriores, se descubrió un
péptido que se une al EPO-R. Se determinó la
secuencia del ADN que codifica la proteína de fusión que se une al
receptor. Este péptido tenía la secuencia: GGCRIGPITWVCGG (SEC ID
nº:) (permitiendo el resto GG N-terminal la
escisión en el fago). Este péptido presentó consecuentemente bajas
afinidades para BSA y para el anticuerpo del
anti-receptor y altas afinidades para
EPO-R por ELISA. Además, el clon del fagómido
presentó competencia por el EPO libre y por el péptido libre afín.
Además, se observó que el péptido libre hacía competencia con el
fagómido de EPO, con la fusión LacI-EPO y con el
radioligando. Por último, el péptido libre no hacía competencia en
los ensayos de unión a IL-2R\alpha\beta.
Se llevó a cabo a continuación un estudio de
mutagénesis en este péptido preferido. Para generar la recogida de
oligonucleótidos que codifican a péptidos aleatorios, se prepararon
los oligómeros de mutagénesis presentados en la Fig. 1, en los que
N era el nucleótido A, C, G o T (equimolar; dependiendo de la
metodología empleada, se pueden emplear otros nucleótidos) y K era G
o T (equimolar) en el motivo del codón (NNK). Los expertos en la
técnica podrán reconocer que el motivo de NNK codifica todos los
aminoácidos, codifica únicamente un codón de terminación y reduce el
sesgo del codón. Existen 32 posibles codones que proceden del
motivo NNK: 1 por cada 12 aminoácidos, 2 por cada 5 aminoácidos, 3
por cada 3 aminoácidos y solamente uno de los tres codones de
terminación.
Las proteínas de fusión de la mutagénesis, junto
con el ADN que las codifica, se "desnaturalizaron" otra vez en
EPO-R inmovilizado. Se aislaron y se cultivaron a
continuación las proteínas de fusión y el ADN adjunto para producir
las preparaciones de la proteína de fusión por ELISA para determinar
si la proteína de fusión se unía específicamente al receptor. En la
Figura 2 se presentan los péptidos preferidos resultantes de este
estudio. Estos péptidos están caracterizados por el motivo
"X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8}" (SEC ID nº:),
en el que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica
de una letra; X_{6} se selecciona independientemente de entre uno
cualquiera de los 20 L-aminoácidos codificados
genéticamente o de los D-aminoácidos
estereoisómericos; X_{3} puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en el que Hoc es homocisteína; X_{4} puede ser R, H, L o
W; X_{5} puede ser M, F o I; X_{7} puede ser D, E, I, L o V; y
X_{8} puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en donde Hoc es homocisteína, con la condición de que
X_{3} o X_{8} sea C u Hoc.
Para determinar una indicación aproximada de la
afinidad de los péptidos, se cribaron también las bibliotecas de
fagos utilizando el protocolo de selección por afinidad en al que
los péptidos están en competencia con EPO (100 nM). Este
procedimiento se repite típicamente durante dos rondas de
desnaturalización. En sucesivas rondas de desnaturalización, la
temperatura de competencia (de 4ºC hasta temperatura ambiente) y el
tiempo (de 15 a 30 minutos) así como la temperatura (de 4ºC hasta
temperatura ambiente) de las soluciones de lavado se pueden alterar
para seleccionar además péptidos con gran afinidad. Utilizando este
procedimiento de selección de afinidad, los péptidos que comparten
el péptido común
X_{1}YX_{2}CX_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}CX_{9}X_{10}X_{11}
(SEC ID nº:), en el que cada aminoácido está indicado por una
abreviatura típica de una letra; cada X_{1}, X_{2}, X_{6},
X_{9}, X_{10} y X_{11} se selecciona independientemente de
entre uno cualquiera de los 20 L-aminoácidos
codificados genéticamente o de entre los
D-aminoácidos estereoisoméricos; X_{4} puede ser
R, H, L o W; X_{5} puede ser M, F o I, y se aislaron. En una
forma de realización más preferida, el péptido comprenderá una
secuencia de aminoácidos
X_{1}YX_{2}CX_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}CX_{9}C_{10}X_{11}
(SEC ID nº:), en la que X_{4} puede ser R o H, X_{5} puede ser F
o M, X_{6} puede ser I, L, T, M o V, X_{7} es D o V, X_{9}
puede ser G, K, L, R, S o T y X_{10} puede ser A, G, P, R o Y. En
la forma de realización más preferida, el péptido central
comprenderá una secuencia de aminoácidos
X_{1}YX_{2}CX_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}CX_{9}X_{10}X_{11}
(SEC ID nº:), en la que X_{1} puede ser D, E, L, N, S, T o V;
X_{2} puede ser A, H, K, L, M, S o T; X_{4} es R o H, X_{9}
puede ser K, R, S o T y X_{10} es P.
Ejemplos de péptidos representativos comprendidos
dentro de este motivo y aislados durante el proceso de selección de
afinidad se presentan a continuación en las tablas.
\newpage
Competencia con EPO 100 nM, 15 min,
4ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Segunda competencia con EPO 100 nM, 15 min,
4ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Competencia con EPO 100 nM, 15 min,
temperatura
ambiente
\vskip1.000000\baselineskip
Competencia con EPO 100 nM, 30 min,
temperatura
ambiente
Otra biblioteca de mutagénesis con seis restos
aleatorios de aminoácidos adyacentes a un octámero aleatorio
mediante dos restos de cisteína se cribó también mediante
EPO-R inmovilizado. Las proteínas de fusión de la
mutagénesis, junto con el ADN que las codifica, se
"desnaturalizaron" otra vez en EPO-R
inmovilizado. Las proteínas de fusión y el ADN adjunto se aislaron y
se cultivaron a continuación para producir las preparaciones de la
proteína de fusión para determinar por ELISA si la proteína de
fusión se unía específicamente al receptor. El péptido preferido
resultante de este estudio presentó la secuencia GGPHHVYACRMGPLTWIC
(SEC ID nº:) y, de este modo, está abarcada por la secuencia
central
"YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8}" (SEC
ID nº:), en la que cada aminoácido está indicado por una
abreviatura típica de una letra; cada X_{2} y X_{6} se
selecciona independientemente de entre cualquiera de entre
cualquiera de los 20 L-aminoácidos codificados
genéticamente o de los D-aminoácidos
estereoisoméricos; X_{3} puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en donde Hoc es homocisteína; X_{4} puede ser R, H, L o W;
X_{5} puede ser M, F o I; X_{7} puede ser D, E, I, L o V; y
X_{8} puede ser C, A, ácido
\alpha-amino-\gamma-bromobutírico,
u Hoc, en donde Hoc es homocisteína, con la condición de que
X_{3} o X_{8} sea C u Hoc, en la que la secuencia central está
acoplada en su terminal amino a una unidad de seis aminoácidos en
la que cada aminoácido se selecciona independientemente de entre
cualquiera de los 20 L-aminoácidos codificados
genéticamente o de los D-aminoácidos
estereoisoméricos.
estereoisoméricos.
Se calcularon los IC_{50} para varios de los
péptidos comprendidos dentro de los motivos generales descritos
anteriormente. Se determinaron estos valores utilizando el péptido
libre y se presentan a continuación en la Tabla 5. (Cada uno de
estos péptidos se sintetizaron independientemente y están amidados
en el terminal C, pero se podrían preparar fácilmente en forma de
carboxiácido libre o en forma de éster o de otra carboxiamida).
\vskip1.000000\baselineskip
Además del anterior, se realizaron otros estudios
de mutagénesis en esta familia de péptidos del agonista EPO de gran
afinidad en condiciones diseñadas para enriquecer en péptidos de
mayor afinidad. Como se describió anteriormente, para enriquecerse
en péptidos de gran afinidad, se cribaron las bibliotecas
utilizando un protocolo de selección por afinidad en el que los
péptidos están en competencia con EPO (100 nM). Este proceso se
repite típicamente durante dos rondas de desnaturalización. En las
posteriores rondas de desnaturalización, se pueden alterar la
temperatura de competencia (de 4ºC a temperatura ambiente) y el
tiempo (de 15 a 30 minutos) así como la temperatura (de 4ºC hasta
temperatura ambiente) de las soluciones de lavado para seleccionar
además péptidos con gran afinidad. Utilizando estas técnicas, se
cribó asimismo una biblioteca de mutagénesis con tres restos de
aminoácidos aleatorios a ambos lados de la secuencia flanqueante
YXCRIGPITWVC frente al EPO-R inmovilizado (véase la
Figura 3). Las proteínas de fusión por mutagénesis, junto con el
ADN que las codifica, se "desnaturalizaron" de nuevo en
EPO-R inmovilizado. Las proteínas de fusión y el
ADN adjunto se aislaron y se cultivaron para producir preparaciones
de proteína de fusión para determinar por ELISA si la proteína de
fusión se unía específicamente al receptor. Los péptidos preferidos
resultantes de este estudio se indican en la Tabla 6,
infra.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro estudio de mutagénesis, se fijó una
biblioteca de mutagénesis con residuos muy conservados (es decir,
Y, C, G, P, T y W), los demás residuos se colocaron al azar y 10
restos adicionales en el terminal N antes de la tirosina se
cribaron también frente a EPO-R inmovilizado (véase
la Figura 4A). Las proteínas de fusión por mutagénesis, junto con
el ADN que las codifica, se "desnaturalizaron" de nuevo en
EPO-R inmovilizado. Las proteínas de fusión y el
ADN adjunto se aislaron y se cultivaron para producir preparaciones
de proteína de fusión para determinar por ELISA si la proteína de
fusión se unía específicamente al receptor. Los péptidos preferidos
resultantes de este estudio se indican en la Tabla 7,
infra.
\vskip1.000000\baselineskip
Todavía en otro estudio de mutagénesis, se fijó
una biblioteca de mutagénesis con residuos muy conservados (p. ej.:
Y, C, G, P, T y W), los demás residuos se colocaron al azar y se
cribaron también 10 restos adicionales entre la segunda cisteína y
el conectador (Gly)4-Ser frente a
EPO-R inmovilizado (véase la Figura 4B). En esta
biblioteca, el resto de tirosina conservado estaba precedido por
dos restos de glicina para permitir la escisión eficaz del péptido
con señal. Las proteínas de fusión por mutagénesis, junto con el
ADN que las codifica, se "desnaturalizaron" de nuevo en
EPO-R inmovilizado. Las proteínas de fusión y el ADN
adjunto se aislaron y se cultivaron a continuación para producir
preparaciones de proteína de fusión para determinar por ELISA si la
proteína de fusión se unía específicamente al receptor. Los
péptidos preferidos resultantes de este estudio se indican en la
Tabla 8, infra.
\vskip1.000000\baselineskip
Todavía en otro estudio de mutagénesis, se fijó
una biblioteca de mutagénesis con residuos muy conservados (p. ej.:
Y, C, G, P, T y W), con la tirosina situada directamente después de
la primera cisteína y de los demás aminoácidos al azar, incluyendo
4 restos N-terminales para la tirosina y 5 entre la
segunda cisteína y el conectador, se cribaron también frente a
EPO-R inmovilizado (véase la Figura 4C). Los
aminoácidos aleatorios N-terminales estaban
precedidos de nuevo por dos restos de glicina para permitir un
tratamiento eficaz. Las proteínas de fusión por mutagénesis, junto
con el ADN que las codifica, se "desnaturalizaron" de nuevo en
EPO-R inmovilizado. Las proteínas de fusión y el
ADN adjunto se aislaron y se cultivaron a continuación para producir
preparaciones de proteína de fusión para determinar por ELISA si la
proteína de fusión se unía específicamente al receptor. Los
péptidos preferidos resultantes de este estudio se indican en la
Tabla 9, infra.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Además de los estudios de mutagénesis anteriores,
se realizó la mutagénesis del péptido GGTYSCHFGPLTWVCK
PQGG utilizando un sistema de presentación Lac-I C-terminal modificado en el que la valencia de presentación se redujo con objeto de identificar los mayores éxitos de afinidad ("Dímero de cabeza"). El sistema de presentación del dímero de cabeza (HPD) Lac-I se describe con mayor detalle en la patente U.S. nº 5.338.665, que se incorpora de este modo con referencia para todos los fines. Esencialmente, los restos que se conservaron en gran medida en los estudios anteriores de mutagénesis (es decir, Y, C, G, P, T y W) se mutaron ligeramente, mientras que los restos menos conservados (es decir, H, F, L y V) se sometieron a un nivel mayor de mutación. Cuatro restos aleatorios continuaron el resto de tirosina, estando esta última seguida también por un residuo al azar. El terminal-C del esquema de la mutagénesis acababa en 6 aminoácidos aleatorios, después de la cisteína. Los detalles de la construcción de la biblioteca se indican en la Figura 5.
PQGG utilizando un sistema de presentación Lac-I C-terminal modificado en el que la valencia de presentación se redujo con objeto de identificar los mayores éxitos de afinidad ("Dímero de cabeza"). El sistema de presentación del dímero de cabeza (HPD) Lac-I se describe con mayor detalle en la patente U.S. nº 5.338.665, que se incorpora de este modo con referencia para todos los fines. Esencialmente, los restos que se conservaron en gran medida en los estudios anteriores de mutagénesis (es decir, Y, C, G, P, T y W) se mutaron ligeramente, mientras que los restos menos conservados (es decir, H, F, L y V) se sometieron a un nivel mayor de mutación. Cuatro restos aleatorios continuaron el resto de tirosina, estando esta última seguida también por un residuo al azar. El terminal-C del esquema de la mutagénesis acababa en 6 aminoácidos aleatorios, después de la cisteína. Los detalles de la construcción de la biblioteca se indican en la Figura 5.
La biblioteca se cribó mediante cuatro rondas en
EPO-R acabado en PIG inmovilizado en mAb179,
empleando elución con EPO de la ronda dos en adelante para
enriquecer los clones con mayor afinidad. Las inserciones del ADN
resultantes se clonaron a continuación como un grupo en un vector de
la proteína de unión a la maltosa (MBP) permitiendo su expresión
como proteína de fusión C- terminal. Se ensayó a continuación en
formato ELISA la unión de EPO-R en los lisados
celulares en bruto procedentes de clones de fusión de MBP
individuales seleccionados al azar. Los péptidos preferidos
resultantes de este estudio se indican en la Tabla 10,
infra.
Una de las propiedades más impresionantes de los
péptidos obtenidos utilizando el sistema de presentación del dímero
de cabeza Lac-I es la acumulación de cargas
positivas múltiples en las zonas que flanquean las cisteínas
conservadas, particularmente así en RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV, que
presenta un segmento C-terminal de dichos 5 restos.
Los aminoácidos que se sometieron ligeramente a mutagénesis (es
decir, Y, C, G, P, T y W) se conservaron absolutamente, mientras que
en aquellas posiciones en las que se mutaron en mayor medida se
generaron nuevos motivos. De particular interés es la presencia de
un resto de tirosina adicional en numerosos péptidos (véase, p.
ej.: (LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR) y la presencia de dos restos de ácido
glutámico entre las cisteínas en TIAQYICYMGPETWECRPSPKA.
Además de los estudios de mutagénesis anteriores,
se realizó la mutagénesis del péptido TIAQYICYMGPETWE
CRPSPKA utilizando un sistema de presentación Lac-I C-terminal modificado similar al sistema descrito anteriormente. Esencialmente, se fijaron ligeramente los restos que se conservaron en gran medida en los estudios anteriores de mutagénesis (es decir, Y, C, G, P, T y W), mientras que los restos menos conservados (es decir, H, F, L y V) se colocaron al azar. Además, los dos restos de ácido glutámico se mutaron ligeramente. Cuatro restos aleatorios continuaron el resto de tirosina, estando esta última seguida también por un residuo aleatorio. El terminal-C del esquema de la mutagénesis acababa en 6 aminoácidos al azar, después de la cisteína. Los detalles de la construcción de la biblioteca se indican en la Figura 6.
CRPSPKA utilizando un sistema de presentación Lac-I C-terminal modificado similar al sistema descrito anteriormente. Esencialmente, se fijaron ligeramente los restos que se conservaron en gran medida en los estudios anteriores de mutagénesis (es decir, Y, C, G, P, T y W), mientras que los restos menos conservados (es decir, H, F, L y V) se colocaron al azar. Además, los dos restos de ácido glutámico se mutaron ligeramente. Cuatro restos aleatorios continuaron el resto de tirosina, estando esta última seguida también por un residuo aleatorio. El terminal-C del esquema de la mutagénesis acababa en 6 aminoácidos al azar, después de la cisteína. Los detalles de la construcción de la biblioteca se indican en la Figura 6.
La biblioteca se cribó mediante tres rondas en
EPO-R acabado en PIG inmovilizado en mAb179,
empleando elución con EPO de la ronda dos en adelante para
enriquecer los clones con mayor afinidad. Los aumentos de la colonia
se llevaron a cabo probando con el reactivo
Fc\gamma-EBP humana, seguido de Fc\gamma
anti-humano de cabra conjugado con fosfatasa
alcalina, que está disponible en Sigma Chemical Co., St. Louis,
Missouri. Después de esto, se determinó la secuencia de los
plásmidos identificados de HPD. Los péptidos preferidos
resultantes de este estudio se indican en la Tabla 11,
infra.
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El anterior grupo de secuencias de péptidos se
clonaron a continuación en un vector de la proteína de unión a la
maltosa (MBP) que permite su expresión como proteína de fusión
C-terminal. Se ensayó a continuación en formato
ELISA la unión de EPO-R en los lisados celulares
en bruto procedentes de clones de fusión de MBP individuales
seleccionados al azar. Los péptidos preferidos resultantes de este
estudio se indican en la Tabla 12, infra.
Se probaron asimismo los péptidos representativos
que se observó que se unen específicamente al receptor de EPO en
análisis funcional basado en células. Un análisis utilizó
FDCP-1, un factor de crecimiento que depende de la
línea celular del progenitor hematopoyético primitivo
multipotencial murino (véase p. ej.: Dexter et al. (1980)
J. Exp. Med. 152:1036-1047), como línea
celular del progenitor. Esta línea celular puede proliferar, pero no
se diferencia, cuando se complementa con medio acondicionado con
WEHI3 (un medio que contiene IL-3, ATCC número
T1B68). La línea celular del progenitor está transfectada con el
EPO-R humano o murino descrito anteriormente para
producir la línea celular
FDCP-1-hEPO-R o
FDCP-1-mEPO-R,
respectivamente. Estas líneas celulares transfectadas pueden
proliferar, pero no se diferencian, en presencia de EPO humano o
murino.
En resumen, las células se cultivan a una
densidad estacionaria media en presencia de los factores de
crecimiento necesarios. Se lavan a continuación las células en PBS
y se dejan en inhanición durante 16 a 24 horas en medio completo
sin factores de crecimiento. Después de determinar la viabilidad de
las células, se preparan soluciones madre (en medio completo sin
factores de crecimiento) para dar aproximadamente 10^{5} células
por 50 microlitros. Se hicieron diluciones en serie de los
compuestos (típicamente el péptido libre en fase de solución en
oposición a un enlace de fago, a otro enlace o a un péptido
inmovilizado) que se habían de analizar en placas de cultivo de
tejido para un volumen final de 50 mililitros por pocillo. Se
añadieron las células (50 mililitros) a cada pocillo y se incubaron
las células 24 a 48 horas, en cuyo momento los controles negativos
deberían morir o quedar en estado latente. La proliferación celular
se midió a continuación por las técnicas conocidas en la materia,
tal como un ensayo con MTT que se correlaciona con incorporación de
^{3}H-timidina como indicación de proliferación
celular (véase, Mossmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55).
La Figura 7 ilustra los resultados de este análisis para EPO y para
los péptidos relacionados en la Tabla 5 anterior. Los péptidos que
se unen al receptor de EPO y presentan actividad en el bioensayo
basado en las células FDCP-1/hEPO-R
se prefieren como compuestos de la
invención.
invención.
Un segundo ensayo basado en células utilizó la
línea celular TF-1. Véase, Kitamura et al.
(1989) Blood 73:375-380, que está incorporada
a la presente memoria como referencia. En la Figura 8 se presentan
los resultados representativos. La Figura 8 representa los efectos
de EPO y del péptido libre VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEC ID nº:) en la
proliferación celular de la línea celular TF-1.
Otro ensayo basado en células que ilustra además
la capacidad de los compuestos de la presente invención para actuar
como agonistas de EPO está basado en la incorporación de
^{3}H-timidina en las células del bazo de ratones
tratados con fenilhidrazina. Los resultados de este ensayo se
presentan en la Figuras 9A a 9C.
Otros ensayos biológicos que se pueden utilizar
para demostrar la actividad de los compuestos de la presente
invención se dan a conocer en Greenberger et al. (1983)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935
(línea celular del progenitor hematopoyético dependiente de EPO);
Quelle y Wojchowski (19991) J. Biol. Chem.
266:609-614 (fosforilación de tirosina en
proteínas en células B6SUt.EP); Dusanter-Fourt
et al. (1992) J. Biol. Chem.
287:10670-10678 (fosforilación de tirosina del
receptor EPO en células EPO humanas de respuesta); Quelle et
al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060
(fosforilación de tirosina) de una proteína citoplásmica (pp100) en
células FDC-ER); Worthington et al. (1987)
Exp. Hematol. 15:85-92 (análisis
colorimétrico de hemoglobina); Kaiho y Miuno (1985) Anal.
Biochem. 149:117-120 (detección de hemoglobina
con 2,7-diaminofluoreno); Patel et al.
(1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302
(expresión de o-myb; Witthuhn et al.
(1993) Cell 74:227-236 (asociación y
fosforilación de tirosina de JAK2); Leonard et al. (1993)
Blood 82:1071-1079 (expresión de los
factores de transcripción de GATA); Ando et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575
(regulación de la transición G_{1}/3 por ciclación D2 y D3); y
flujo de calcio, cada una de las cuales está incorporada en la
presente memoria como referencia.
Se ha descrito un instrumento diseñado por
Molecular Devices Corp., conocido como microfisiómetro, utilizado
con éxito para la medida del efecto de agonistas y antagonistas en
varios receptores. Este aparato se basa en la medida de las
alteraciones en la cantidad de acidificación del medio extracelular
en respuesta a la activación del receptor.
Según una forma de realización preferida, los
péptidos de la presente invención están dimerizados u
oligomerizados, aumentando de este modo la afinidad y/o la
actividad de los compuestos principales descritos en la presente
memoria. Para investigar el efecto que la
dimerización/oligomerización del péptido presenta sobre la potencia
mimética de EPO en los ensayos de proliferación celular, se
sintetizó un análogo biotinilado en el terminal-C de
GGTYSCHFG
PLTWVCKPQGG (es decir, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotina)).
PLTWVCKPQGG (es decir, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotina)).
Este péptido se incubó con estreptavidina en PBS
en una relación molar 4:1 a temperatura ambiente durante 1 hora.
Después de esto, se introdujo el complejo en el ensayo de unión de
EPO-R acabado en PIG para la determinación del
IC_{50}. El péptido que no se había acomplejado con estreptavidina
se introdujo también en el mismo experimento. Se observó que el
péptido acomplejado previamente presenta un IC_{50} de 20 nM
comparado con el IC_{50} de 350 nM del péptido que no había sido
incubado con estreptavidina. Este aumento mayor de 10 veces en la
afinidad aparente es supuestamente debido al estado polivalente del
complejo péptido-estreptavidina. Ya que esta
comparación se hizo utilizando las concentraciones de péptido libre
y no la concentración eficaz del complejo (teóricamente 4 veces
menor), el efecto será aún mayor.
Además, se incubó este péptido con estreptavidina
en RPMI tamponado con HEPES exento de suero a una relación molar de
4:1, como anteriormente. Se probó la estimulación de la
proliferación en el complejo mediante un bioensayo con
FDCP-1/hEPO-R junto a
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK libre (Ahx-biotina) y el
péptido del progenitor no biotinilado, es decir
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. La Figura 10 ilustra los resultados de este
ensayo en el que EPO-ED_{50} de los péptidos
libres fueron similares (aproximadamente 1 \muM), pero el del
complejo de estreptavidina formado previamente fue menor de 10 nM,
una reducción dos log en EPO-ED_{50}.
Estreptavidina, sola, presenta algún efecto estimulante pequeño a
concentraciones mayores, debido supuestamente a la contaminación por
la endoxina bacteriana.
Además, se observó un aumento de potencia
biológica cuando el péptido presentaba dimerización con IgG con
anti-biotina de cabra. La Figura 11 ilustra que se
puede conseguir una reducción uno log en
EPO-ED_{50} mediante incubación previa de
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotina) con IgG con
anti- biotina de cabra purificada en una relación molar 2:1. Este
aumento en la potencia biológica se debe supuestamente a la
dimerización del péptido por los anticuerpos. Los anticuerpos
anti-biotina no ejercen efectos sobre las células.
Además, se observó una reducción de 100 veces en la
EPO-ED_{50} con el complejo
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK
(Ahx-biotina)-estreptavidina.
Igualmente, se puede aumentar la afinidad y/o la actividad de dichos
péptidos dimerizando u oligomerizando los péptidos principales de
la presente invención.
En otra forma de realización, se preparó un
péptido dimérico análogo de GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG que contiene dos
enlaces disulfuro utilizando el esquema general indicado en la
Figura 12. En resumen, se montó la primera cadena de péptido en una
resina Tentagel. Se acopló el Fmoc-Lys (Alloc) al
conectador Knorr, siendo utilizado el grupo Alloc como grupo
protector ortogonal. Para la primera cadena de péptido, se utilizó
Cys(Acm). Después de la terminación de la primera cadena de
péptido se eliminó el grupo Alloc y se construyó la segunda cadena
de péptido en las aminas con cadena lateral del resto de lisina. En
esta cadena de péptido se utilizó Cys(trt). Después de
terminar la síntesis, se escindió el péptido de la resina y se
purificó. Se cicló a continuación el péptido en un segundo
compuesto que contenía un solo enlace disulfuro. A continuación, se
formó el segundo enlace disulfuro por oxidación con yodo, dando el
dímero bicíclico.
Las Figuras 13 y 14 presentan la unión de EPOR
in vitro y las actividades biológicas del dímero. Se probó
la afinidad del dímero frente a EPO con terminal PIG inmovilizado
en mAb179 en pocillos con tiras. Los resultados del ensayo de unión
por competencia en equilibrio indicaron una afinidad de
aproximadamente 2 nM, un aumento de 200 veces sobre el valor del
péptido del progenitor, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, (200 nM), y 5 veces
sobre el complejo GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK
(Ahx-biotina)-estreptavidina. En la
bioactividad in vitro, medida por la proliferación de las
células FDCP-1/hEPOR, aumentó aproximadamente 20
veces desde una EC_{50} de 400 nM (para el péptido del
progenitor) a 20 nM. Igualmente, se puede aumentar
significativamente la afinidad y/o la actividad de dichos péptidos
dimerizando u oligomerizando los péptidos principales de la
presente invención.
Los péptidos de la presente invención o sus
derivados se pueden conjugar con compuestos que se unen al
EPO-R para construir compuestos con una afinidad
para el receptor mayor de la de ambos compuestos de los que se
compone el conjugado. El descubrimiento de estos péptidos facilita
además la identificación de los péptidos que se unen en el mismo
punto del EPO-R, porque se puede sesgar la
biblioteca o desnaturalizar el procedimiento para eliminar los
péptidos con motivo complementario "no bloqueante".
La secuencia con motivo preferido proporciona
también un medio para determinar el tamaño mínimo de un agonista de
EPO de la invención. Utilizando el sistema de biblioteca sintética
codificada (ESL) descrito en la solicitud de patente U.S. nº de
serie 946.239 presentada el 16 de septiembre de 1992 que es una
continuación en parte de la solicitud nº de serie 762.522,
presentada el 18 de septiembre de 1991, o el sistema de "síntesis
del polímero inmovilizado a muy gran escala" descrito en la
solicitud de patente U.S. nº de serie 492.462, presentada el 7 de
marzo de 1990; nº 624.120, presentada el 6 de diciembre de 1990; y
nº 805.727, presentada el 6 de diciembre de 1991; se puede
determinar no solamente el tamaño mínimo del péptido con dicha
actividad, se pueden asimismo preparar todos los péptidos que
forman el grupo de péptidos que se diferencian en el motivo
preferido (o en el tamaño mínimo de este motivo) en uno, dos o más
restos. Esta recogida de péptidos se puede cribar a continuación por
su capacidad para unirse al receptor de EPO. Este sistema de
síntesis del polímero inmovilizado u otros procedimientos de
síntesis de péptidos se pueden también utilizar para sintetizar
cada análogo de truncamiento y cada análogo de delección y cada
combinación de análogo de truncamiento y de delección de todos los
compuestos de los péptidos de la invención.
Los péptidos de la invención se pueden preparar
también por procedimientos clásicos conocidos en la técnica, por
ejemplo, utilizando técnicas estándar en fase sólida. Los
procedimientos estándar incluyen la síntesis exclusiva en fase
sólida, procedimientos de síntesis en fase sólida parcial, la
condensación de fragmentos, síntesis clásica en solución y aún
mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, p. ej.: Merrifield,
1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, incorporado en la presente
memoria como referencia. En fase sólida, la síntesis comienza
típicamente en el extremo C-terminal del péptido
utilizando una resina protegida por \alpha-amino.
Se puede preparar un material de partida adecuado, por ejemplo,
uniendo el \alpha-aminoácido requerido a una
resina clorometilada, a una resina de hidroximetilo o a una resina
de bencidrilamina. Dicha resina clorometilada es comercializada
bajo la marca registrada BIO-BEADS
SX-1 por Bio Rad Laboratories, Richmond, CA y la
preparación de la resina de hidroximetilo está descrita por
Bodonszky et al., 1966, Chem. Ind. (Londres)
38:1597. La resina de bencilhidrilamina (BHA) ha sido
descrita por Pietta y Marshall, 1970, Chem. Commn. 650 y está
disponible en el comercio en Beckman Instruments, Inc., Palo Alto,
CA, en forma de hidrocloruro.
Por lo tanto, los compuestos de la invención se
pueden preparar acoplando a la resina clorometilada un
\alpha-aminoácido protegido con la ayuda, por
ejemplo, de un catalizador de bicarbonato de cesio, según el
procedimiento descrito por Gisin, 1973, Helv. Chim. Acta
56:1467. Después del acoplamiento inicial, se elimina el grupo
protector \alpha-amino mediante una selección de
reactivos incluyendo soluciones de ácido trifluoroacético (TFA) o de
ácido clorhídrico (HCl) en disolventes orgánicos a temperatura
ambiente.
Los grupos protectores
\alpha-amino son aquellos conocidos por ser útiles
en la técnica de la síntesis paso a paso de los péptidos. Están
incluidos los grupos protectores de tipo acilo (p. ej.: formilo,
trifluoroacetilo, acetilo), grupos protectores de tipo uretano
aromático (p. ej.: benciloxicarboilo (Cbz), y Cbz sustituido),
grupos protectores de uretano alifático (p. ej.,
t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo,
ciclohexiloxicarbonilo), y los grupos protectores de tipo alquilo
(p. ej.: bencilo, trifenilmetilo). Fmoc es un grupo protector
preferido. El grupo protector con cadena lateral (típicamente
éteres, ésteres, tritilo, PMC y similares) permanece intacto durante
el acomplamiento y no se desdobla durante la desprotección del
grupo protector con terminal amino o durante el acoplamiento. El
grupo protector con cadena lateral debe ser eliminable en el
momento de la terminación de la síntesis del péptido final y en
condiciones de reacción que no alteren el péptido objetivo.
Los grupos protectores con cadena lateral de Tyr
incluyen tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo,
bencilo, Cbz, Z-Br-Cbz y
2,5-diclorobencilo. Los grupos protectores con
cadena lateral de Asp incluyen bencilo,
2,6-diclorobencilo, metilo, etilo y ciclohexilo.
Los grupos protectores con cadena lateral de Thr y Ser incluyen
acetilo, benzoilo, titrilo, tetrahidropiranilo, bencilo,
2,6-diclorobencilo y Cbz. Los grupos protectores con
cadena lateral de Thr y Ser son bencilo. Los grupos protectores con
cadena lateral de Arg incluyen nitro, tosilo (Tos), Cbz,
adamantiloxicarbonil mesitoilsulfonilo (Mts) o Boc. Los grupos
protectores con cadena lateral de Lys incluyen Cbz,
2-clorobenciloxicarbonilo
(2-Cl-Cbz),
2-bromobenciloxicarbonilo
(2-Br-Cbz), Tos o Boc.
Después de la eliminación de los grupos
protectores \alpha-amino, los aminoácidos
protegidos que quedan se acoplan paso a paso en el orden deseado.
Cada aminoácido protegido ha reaccionado generalmente
aproximadamente 3 veces en exceso utilizando un activador apropiado
del grupo carboxilo como por ejemplo hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU) o diciclohexilcarbociclimida (DCC) en solución, por ejemplo,
en mezclas de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}),
dimetilformamida (DMF).
Después de terminar la secuencia de aminoácidos
deseada, se desacopla el péptido deseado del soporte de resina
mediante tratamiento con un reactivo tal como ácido
trifluoroacético (TEA) o fluoruro de hidrógeno (HF), que no sólo
escinde el péptido de la resina, sino que también escinde todos los
grupos protectores con cadena lateral restantes. Cuando se utiliza
resina clorometilada, el tratamiento con cloruro de hidrógeno
produce la formación de los péptidos ácidos libres. Por otra parte,
cuando se emplea resina clometilada, los péptidos protegidos con
cadena lateral se pueden desacoplar por tratamiento de la resina
con péptidos con amoniaco para dar la amida protegida por cadena
lateral o con una alqilamina una alquilamida o dialquilamida
protegida por cadena lateral. La protección de la cadena lateral se
elimina a continuación de la forma habitual por tratamiento con
fluoruro de hidrógeno para dar amidas, alquilamidas o
dialquilamidas libres.
En la preparación de los ésteres de la invención,
se emplean las resinas utilizadas para preparar los péptido-ácidos
y el péptido protegido por la cadena lateral se escinde con la base
y el alcohol apropiado, es decir, metanol. Los grupos protectores
con cadena lateral se eliminan a continuación de la forma habitual
por tratamiento con fluoruro de hidrógeno para obtener el éster
deseado. Estos procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida
son bien conocidos en la técnica y se describen además en Stewart,
Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman y Co., San Francisco,
1969).
Estos procedimientos se pueden utilizar también
para sintetizar péptidos en los que otros aminoácidos aparte de los
20 aminoácidos naturales codificados genéticamente están
sustituidos en una, dos o más posiciones de cualquiera de los
compuestos de la invención. Por ejemplo, naftilanilina puede ser
sustituida por triptófano, facilitando la síntesis. Otros
aminoácidos sintéticos que pueden ser sustituidos en los péptidos
de la presente invención comprenden
L-hidroxipropilo,
L-3,4-dihidroxifenilalanilo, y
\delta-aminoácidos tales como
L-\delta-hidroxilisilo
D-\delta-metilalanilo,
L-\alpha-metilalanilo,
\beta-aminoácidos y
\alpha-isoquinolina. Los
D-aminoácidos y los aminoácidos no naturales se
pueden incorporar asimismo en los péptidos de la presente
invención.
Se pueden sustituir las cadenas laterales de los
20 aminoácidos codificados genéticamente (o D aminoácidos) por
otras cadenas laterales, por ejemplo con grupos tales como alquilo,
alquilo inferior, alquilo cíclico de 4-, 5-, 6 a 7 elementos,
amida, amida alquilo inferior, amida di(alquil inferior),
alcoxi inferior, hidroxi, carboxi y sus derivados del éster
inferior y con 4-, 5-, 6- a 7 elementos heterocíclicos. En
particular, se pueden emplear los análogos de prolina en los que el
tamaño el tamaño del anillo del resto de prolina cambia de 5
elementos a 4, 6 ó 7 elementos.
Los grupos cíclicos pueden ser saturados o
insaturados, y si son insaturados, pueden ser aromáticos o no
aromáticos. Los grupos heterocíclicos contienen preferentemente uno
o más heteroátomos de nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Ejemplos de
tales grupos incluyen el furazanilo, furilo, imidazolidinilo,
isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (p. ej.: morfolino),
ozazolilo, piperazinilo (p. ej.: 1-piperidilo,
piperidino), piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo,
pirazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirrolidinilo (p. ej.:
1-pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo,
tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (p. ej.:
tiomorfolino) y triazolilo. Estos grupos heterocíclicos pueden
estar sustituidos o insustituidos. Cuando se sustituye un grupo, el
sustituyente puede ser alquilo, alcoxi, halógeno, oxígeno o fenilo
sustituido o insustituido.
Se pueden asimismo modificar fácilmente los
péptidos de la presente invención por fosforilación y en Hruby
et al.^{42} se describen otros procedimientos para
preparar derivados de péptidos de los compuestos de la presente
invención. Por lo tanto, los compuestos del péptido de la invención
también sirven como base para preparar péptidomiméticos con
actividad biológica similar.
Los compuestos de los péptidos de la invención,
incluyendo los péptidomiméticos, se pueden modificar covalentemente
en una o más de una variedad de polímeros no proteínicos, p. ej.:
polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquenos, de la forma
indicada en la patente U.S. nº 4.640.835, nº 4.496.689, patente U.S.
nº 4.301.144, patente U.S. nº 4.670.417, patente U.S. nº 4.791.192;
o patente U.S. nº 4.179.337, todas las cuales se incorporan como
referencias a la presente memoria en su totalidad.
Los expertos en la materia reconocen que están
disponibles una variedad de técnicas para construir
péptidomiméticos con la misma o similar actividad biológica deseada
que el correspondiente compuesto de péptido pero con actividad más
favorable que la del péptido con respecto a la solubilidad,
estabilidad y susceptibilidad a la hidrólisis y a la proteolisis.
Véase, por ejemplo, Morgan y Gainor Ann. Rep. Med. Chem.
24:243-252 (1989). Lo que sigue describe
procedimientos para preparar péptidomiméticos modificados en el
grupo amino N-terminal, el grupo carboxilo
C-terminal y/o cambiando uno o más de los enlaces
amido en el péptido a un enlace no-amida. Se
comprende que dos o más de dichas modificaciones se pueden acoplar
en una estructura péptidomimética (p. ej.: modificación en el grupo
carboxilo C-terminal e inclusión de un enlace
-CH_{2} carbamato entre dos aminoácidos y el péptido).
Los péptidos se sintetizan típicamente en forma
de ácido débil pero, como se indicó anteriormente, se pueden
preparar fácilmente en forma amido o éster. Se puede modificar
asimismo el término amino y/o carboxi de los compuestos de péptidos
de la invención para producir otros compuestos de la invención. Las
modificaciones con terminal amino comprenden la metilación (es
decir, -NHCH_{3} o -NH(CH_{3})_{2}),
acetilación, añadiendo un grupo carbobenzoilo o bloqueando el
terminal amino con un grupo bloqueante que contiene un carboxilato
definido funcionalmente por RCOO-, en el que R se selecciona de
entre el grupo constituido por naftilo, acridinilo, esteroilo y
grupos similares. Las modificacones del términal carboxi incluyen la
sustitución del ácido libre por un grupo carboxamido o formador de
una lactama cíclica en el terminal carboxi para introducir
limitaciones estructurales.
Las modificaciones del terminal amino son las
citadas anteriormente e incluyen la alquilación, acetilación,
añadiendo un grupo carbobenzoilo, formando un grupo succinimida,
etc. Específicamente, el grupo amino N-terminal
puede entonces reaccionar de la forma siguiente:
- (a)
- para formar un grupo amida de fórmula R(CO)NH- en el que R es tal como se definió anteriormente por reacción con un haluro ácido [p. ej.: RC(O)Cl] o anhídrido ácido. Típicamente, la reacción se puede llevar a cabo poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (p. ej.: aproximadamente 5 equivalentes) de un haluro ácido con el péptido en un diluyente inerte (p. ej.: diclorometano) preferentemente que contiene un exceso (p. ej.: aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina, para secuestrar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son, por otra parte, convencionales (p. ej.: temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino terminal para proporcionar una N-sustitución del alquilo inferior seguida de reacción con un haluro ácido tal como se describió anteriormente proporcionará el grupo N-alquil amido de fórmula RC(O)NR-;
- (b)
- para formar un grupo succinimida por reacción con el anhídrido succínico. Como anteriormente, se puede emplear una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anhídrido succínico (p. ej.: aproximadamente 5 equivalentes) y el grupo amino se transforma en la succinimida por procedimientos bien conocidos en la técnica incluyendo la utilización de un exceso (p. ej.: diez equivalentes) de una amina terciaria como por ejemplo diisopropiletilamina en un disolvente inerte adecuado (p. ej.: diclorometano). Véase, por ejemplo, Wollenberg, et al., patente U.S. nº 4.612.132 que está incorporada en la presente memoria en su totalidad. Se comprende que el grupo succínico pueda estar sustituido, por ejemplo, por los sustituyentes alquilo C_{2}-C_{6} o -SR que se preparan de manera convencional para proporcionar la succinimida sustituida en el terminal-N del péptido. Dichos sustituyentes alquilo se preparan por reacción de una olefina inferior (C_{2}-C_{6}) con anhídrido maleico en la forma descrita por Wollenberg, et al., supra. y los sustituyentes -SR se preparan por reacción de RSH con anhídrido maleico, en el que R es tal como se definió anteriormente;
- (c)
- para formar un grupo benciloxicarbonil-NH- o benciloxicarbonil-NH- sustituido por reacción con aproximadamente una cantidad equivalente o un exceso de CBZ-Cl (es decir, cloruro de benciloxicarbonilo) o un CBZ-Cl sustituido en un diluyente inerte adecuado (p. ej.: diclorometano) conteniendo preferentemente una amina terciaria para secuestrar el ácido generado durante la reacción;
- (d)
- para formar un grupo sulfonamida por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej.: 5 equivalentes) de R-S(O)_{2}Cl en un diluyente inerte adecuado (diclorometano) para transformar el terminal amina en sulfonamida, en la que R es tal como se definió anteriormente. Preferentemente, el diluyente inerte contiene una amina terciaria en exceso (p. ej.: diez equivalentes) tal como diisopropiletilamina, para secuestrar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son por otra parte, convencionales (p. ej.: temperatura ambiente durante 30 minutos);
- (e)
- para formar un grupo carbamato por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej.: 5 equivalentes) de R-OC(O)Cl o R-OC(O)OC_{6}H_{4}p-NO_{2} en un diluyente inerte adecuado (p. ej.: diclorometano) para convertir la amina terminal en un carbamato en la que R es tal como se definió anteriormente. Preferentemente, el diluyente contiene un exceso (p. ej.: aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para secuestrar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son por otra parte, convencionales (p. ej.: temperatura ambiente durante 30 minutos); y
- (f)
- para formar un grupo urea por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej.: 5 equivalentes) de R-N=C=O en un diluyente inerte adecuado (p. ej.: diclorometano) para convertir la amina terminal en el grupo urea es decir, RNHC(O)NH- en la que R es tal como se definió anteriormente. Preferentemente, el diluyente contiene un exceso (p. ej.: aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Las condiciones de reacción son por otra parte, convencionales (p. ej.: temperatura ambiente durante 30 minutos).
Además, o alternativamente, se puede modificar el
C-terminal. En la preparación de péptidos miméticos
en los que el grupo carboxilo C-terminal se
sustituye por un éster (es decir, -C(O)OR en el que R
es tal como se definió anteriormente), se emplean resinas
utilizadas para preparar los péptidos ácidos y el péptido protegido
con cadena laeral se escinde con la base y el alcohol apropiado, p.
ej.: metanol. Los grupos protectores con cadena lateral se eliminan
a continuación del modo habitual por tratamiento con fluoruro de
hidrógeno para obtener el éster deseado.
En la preparación de los péptidomiméticos en los
que el grupo carboxilo C-terminal se sustituye por
la amida -C(O)NR^{3}R^{4}, se utiliza una resina
de bencilhidrilamina como soporte sólido para la síntesis del
péptido. En el momento de la terminación de la síntesis, el
tratamiento con fluoruro de hidrógeno para liberar el péptido del
soporte produce directamente la péptido amida libre (es decir, el
terminal-C es -C(O)NH_{2}).
Alternativamente, la utilización de la resina clorometilada durante
la síntesis del péptido acoplada con la reacción con amoniaco para
escindir el péptido protegido con la cadena lateral del soporte
produce el péptido amida libre y la reacción con una alquilamina o
dialquilamina produce una alquilamida o dialquilamida protegida con
la cadena lateral (es decir, el terminal-C es
-C(O)NRR^{1} en la que R y R^{1} son tal como se
definieron anteriormente). La protección con la cadena lateral se
elimina a continuación de la forma habitual por tratamiento con
fluoruro de hidrógeno para dar las amidas, alquilamidas o
dialquilamidas libres.
En otra forma de realización alternativa, se
puede producir el grupo carboxilo C-terminal o un
éster C-terminal al ciclarse por desplazamiento
interno del -OH del éster (-OR) del grupo carboxilo o del éster
respectivamente con el grupo amino N-terminal para
formar un péptido cíclico. Por ejemplo, después de la síntesis y de
la escisión para dar un péptido ácido, el ácido libre se transforma
en un éster activado mediante un activador del grupo carboxilo
apropiado como por ejemplo diciclohexilcarbodiimida (DCC) en
solución en mezclas, por ejemplo, de cloruro de metileno
(CH_{2}Cl_{2}), dimetilformamida (DMF). El péptido cíclico se
forma a continuación por desplazamiento interno del éster activado
con la amina N-terminal. La ciclación interna
opuesta a la polimerización se puede mejorar utilizando soluciones
muy diluidas. Dichos procedimientos son bien conocidos en la
técnica.
Se pueden también ciclar los péptidos de la
invención, o incorporar un resto desamino o descarboxi en el
terminal del péptido, de modo que no exista terminal amino o grupo
carboxilo, para disminuir la susceptibilidad a las proteasas o
restringir la conformación del péptido. Los grupos funcionales
C-terminales de los compuestos de la presente
invención incluyen amida, amida alquil inferior, amida
di(alquil inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi y sus
derivados del éster inferior y las sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos.
Otros procedimientos para producir
péptido-derivados de los compuestos de la presente
invención se describen en Hruby et al., Biochem. J.
268(2): 249-262 (1990), incorporado en
la presente memoria como referencia. De este modo, los compuestos
de los péptidos de la invención sirven también como modelos
estructurales para los compuestos no peptídicos con actividad
biológica similar. Los expertos en la materia reconocen que están
disponibles diversas técnicas para construir compuestos con la
misma o similar actividad biológica deseada que el compuesto del
péptido principal pero con una actividad más favorable que la del
principal con respecto a la solubilidad, estabilidad y
susceptibilidad a la hidrólisis y a la proteolisis. Véase, por
ejemplo, Morgan y Gainor Ann. Rep. Med. Chem.
24:243-252 (1989), incorporada a la presente
memoria como referencia. Estas técnicas incluyen la sustitución del
eje central del péptido por un eje central compuesto de fosfonatos,
amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundarias y
N-metilaminoácidos.
Los péptido-miméticos en los que
uno o más de los enlaces peptidilo [-C(O)NH-] ha sido
sustituido por dichos enlaces como un enlace
-CH_{2}-carbamato, un enlace fosfonato, un enlace
-CH_{2}-sulfonamida, un enlace urea, un enlace
amina secundaria (-CH_{2}NH-) y un enlace peptidil alquilado
[-C(O)NR^{6}- en el que R^{6} es alquilo inferior]
se preparan durante la síntesis convencional del péptido
sustituyendo meramente un aminoácido análogo protegido adecuado por
el reactivo aminoácido en el punto apropiado durante la
síntesis.
Los reactivos adecuados incluyen, por ejemplo,
aminoácidos análogos en los que el grupo carbonilo del aminoácido
ha sido sustituido por un grupo adecuado para formar uno de los
enlaces anteriores. Por ejemplo, si se desea sustituir un enlace
-C(O)NR- en el péptido por un enlace
-CH_{2}-carbamato
(-CH_{2}OC(O)NR-), entonces el grupo
carboxilo
(-COOH) de un aminoácido protegido adecuadamente se reduce en primer lugar a grupo -CH_{2}OH que se transforma a continuación por procedimientos convencionales en un grupo funcional -OC(O)Cl o en un grupo funcional para-nitrocarbonato -OC(O)O-C_{6}H_{4}-p-NO_{2}. La reacción de ambos grupos funcionales con la amina libre o con una amina alquilada en el terminal-N del péptido parcialmente preparado observada en el soporte sólido conduce a la formación de un enlace -CH_{2}OC(O)NR-. Para una descripción más detallada de la formación de dichos enlaces-CH_{2}-carbamato, véase, Cho, et al. Science, b (1993).
(-COOH) de un aminoácido protegido adecuadamente se reduce en primer lugar a grupo -CH_{2}OH que se transforma a continuación por procedimientos convencionales en un grupo funcional -OC(O)Cl o en un grupo funcional para-nitrocarbonato -OC(O)O-C_{6}H_{4}-p-NO_{2}. La reacción de ambos grupos funcionales con la amina libre o con una amina alquilada en el terminal-N del péptido parcialmente preparado observada en el soporte sólido conduce a la formación de un enlace -CH_{2}OC(O)NR-. Para una descripción más detallada de la formación de dichos enlaces-CH_{2}-carbamato, véase, Cho, et al. Science, b (1993).
Igualmente, la sustitución de un enlace amido en
el péptido por un enlace fosfonato se puede conseguir de la forma
indicada en la solicitud de patente U.S nº de serie 07/943.805, nº
08/081.577 y nº 08/119.700, cuyas descripciones están incorporadas
en la presente memoria como referencia en su totalidad.
La sustitución de un enlace amido en el péptido
por un enlace -CH_{2}- sulfonamida se puede conseguir por
reducción del grupo carboxilo (-COOH) de un aminoácido protegido
adecuadamente a grupo -CH_{2}OH y el grupo hidroxilo se
transforma a continuación en un grupo saliente adecuado, como por
ejemplo el grupo tosilo, por procedimientos convencionales. La
reacción del derivado tosilado con, por ejemplo, ácido tioacético
seguida de hidrólisis y cloración oxidativa proporcionará el grupo
funcional
-CH_{2}-S(O_{2})-Cl que
sustituye, por otra parte, al grupo carboxilo del aminoácido
protegido adecuadamente. La utilización de este aminoácido análogo
protegido adecuadamente en la síntesis del péptido proporciona la
inclusión de un enlace
-CH_{2}-S(O_{2})-NR- que
sustituye al enlace amido en el péptido proporcionando de este modo
un péptido-mimético. Para una descripción más
completa de la transformación del grupo carboxilo del aminoácido en
un grupo -CH_{2}S(O_{2})Cl, véase, por ejemplo,
Weinstein, Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids,
Peptides and Proteins, vol. 7, págs. 267-357,
Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1983) que está incorporada en la
presente memoria como referencia.
La sustitución de un enlace amido en el péptido
por un enlace urea se puede conseguir de la forma indicada en la
solicitud de patente US nº de serie 08/147.805 cuya solicitud se
incorpora en la presente memoria como referencia en su
totalidad.
Los enlaces de amina secundaria en los que el
enlace -CH_{2}NH- sustituye al enlace amido en el péptido se
pueden preparar empleando, por ejemplo, un dipéptido análogo
protegido adecuadamente en el que el enlace carbonilo del enlace
amido se ha reducido a grupo CH_{2} por procedimientos
convencionales. Por ejemplo, en el caso de la diglicina, la
reducción de la amida a la amina producirá después de la
desprotección H_{2}NCH_{2}CH_{2}NHCH_{2}COOH que se utiliza
a continuación en forma N-protegida en la siguiente
reacción de acoplamiento. La preparación de dichos análogos por
reducción del grupo carbonilo del enlace amido en el dipéptido es
bien conocida en la técnica.
El aminoácido análogo protegido adecuadamente se
emplea en la síntesis del péptido convencional de la misma manera
que el aminoácido correspondiente. Por ejemplo, en esta reacción se
emplean típicamente aproximadamente 3 equivalentes del análogo de
aminoácido. Se emplea un diluyente orgánico inerte tal como el
cloruro de metileno o DMF y cuando se genera un ácido como
subproducto de la reacción el disolvente de la reacción contendrá
típicamente una cantidad en exceso de amina terciaria para
secuestrar el ácido generado durante la reacción. Una amina
terciaria particularmente preferida es la diisopropiletilamina que
se emplea típicamente en un exceso de aproximadamente 10 veces. La
reacción da como resultado la incorporación en el péptido mimético
de un análogo de aminoácido con un enlace no peptidílico. Dicha
sustitución se puede repetir como se desee, de modo que desde cero a
todos los enlaces amido en el péptido se hayan sustituido por
enlaces no amido.
Los péptidos de la invención también se pueden
ciclar o incorporar un resto desamino o descarboxi en el terminal
del péptido, de modo que no exista ningún grupo amino terminal o
carboxilo, para disminuir la susceptibilidad a las proteasas o para
restringir la conformación del péptido. Los grupos funcionales
C-terminales de los compuestos de la presente
invención incluyen amida, amida alquil inferior, amida
di(alquil inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi y sus
derivados del éster inferior y las sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos.
Según otra forma de realización preferida, los
restos X_{3} y X_{8} se seleccionarán independientemente de
entre el grupo de C y Hoc. Por lo tanto, los compuestos de la
presente invención pueden existir en forma cíclica con un enlace
disulfuro intramolecular. Por otra parte, se puede producir un
enlace disulfuro intramolecular para dar un compuesto dimérico.
Estos derivados de disulfuro intramoleculares o intermoleculares se
pueden representar esquemáticamente como se muestra a
continuación:
en el que m y n son independientemente 1 ó
2.
Otras formas de realización de la presente
invención proporcionan análogos de estos derivados de disulfuro en
los que uno de los sulfuros se ha sustituido por un grupo CH_{2}
u otro isóstero por azufre. Estos análogos se pueden preparar a
partir de los compuestos de la presente invención en los que X_{3}
o X_{8} es C u Hoc y el otro es el ácido
\alpha-amino-\gamma-butírico,
mediante un desplazamiento intramolecular o intermolecular, que
utilizan procedimientos conocidos en la técnica como se muestra a
continuación:
en los que p es 1 ó 2. Un experto en la materia
reconocerá rápidamente que este desplazamiento puede tener lugar
asimismo utilizando otros homólogos del ácido
\alpha-amino-\gamma-butírico
y
homocisteína.
Además de las estrategias de ciclación
anteriores, se pueden emplear otras estrategias de ciclación de
péptidos sin disulfuro. Dichas estrategias alternativas de
ciclación incluyen, por ejemplo, estrategias de ciclación de
amidas, así como estrategias de ciclación que implican la formación
de enlaces tio-éter. Así pues, los compuestos de la presente
invención pueden existir en forma ciclada con un enlace amida
intramolecular o un enlace tio-éter intramolecular. Para ilustrar la
viabilidad de la estrategia de ciclación de amidas, se sintetizó un
péptido basado en ggTYSCHFG
PLTWVCKPQgg en el que la primera cisteína se sustituyó por lisina, la segunda cisteína se sustituyó por ácido glutámico y se formó un monómero cíclico mediante un enlace amida entre las cadenas laterales de estos dos restos. Además, para ilustrar la viabilidad de la estrategia de ciclación del tio-éter, se sintetizó un péptido basado en ggTYS
CHFGPLTWVCKPQgg en el que la primera cisteína se sustituyó por lisina y se formó un monómero cíclico mediante un enlace tio-éter entre las cadenas laterales del resto de lisina y la cisteína C-terminal. Igualmente, además de las estrategias de la ciclación de disulfuro, se pueden utilizar ambas estrategias de ciclación de amida y estrategias de ciclación de tio-éter fácilmente para ciclar los compuestos de la presente invención.
PLTWVCKPQgg en el que la primera cisteína se sustituyó por lisina, la segunda cisteína se sustituyó por ácido glutámico y se formó un monómero cíclico mediante un enlace amida entre las cadenas laterales de estos dos restos. Además, para ilustrar la viabilidad de la estrategia de ciclación del tio-éter, se sintetizó un péptido basado en ggTYS
CHFGPLTWVCKPQgg en el que la primera cisteína se sustituyó por lisina y se formó un monómero cíclico mediante un enlace tio-éter entre las cadenas laterales del resto de lisina y la cisteína C-terminal. Igualmente, además de las estrategias de la ciclación de disulfuro, se pueden utilizar ambas estrategias de ciclación de amida y estrategias de ciclación de tio-éter fácilmente para ciclar los compuestos de la presente invención.
Por otra parte, el terminal amino del péptido se
puede proteger con un ácido acético alfa-sustituido, en el
que el sustituyente en alfa es un grupo saliente, tal como un ácido
\alpha-haloacético, por ejemplo, ácido
\alpha-cloroacético, ácido
\alpha-bromoacético o ácido
\alpha-yodoacético. Los compuestos de la presente
invención en los X_{3} es C u Hoc se pueden ciclar por
desplazamiento del grupo saliente por el sulfuro del resto X_{3}.
Véase, p. ej.: Barker et al. (1992) J. Med. Chem.
35:2040-2048 y Or et al. (1991) J. Org.
Chem. 56:3146-3149, cada una de las cuales está
incorporada a la presente memoria como referencia.
Los compuestos de la invención son útiles in
vitro como herramientas únicas para comprender el papel
biológico de EPO, que incluye la evaluación de muchos factores
pensados para influir, y ser influidos por, la producción de EPO y
la unión de EPO al EPO-R (p. ej.: el mecanismo de
transducción de la señal de EPO/activación del receptor). Los
presentes compuestos sirven además para el desarrollo de otros
compuestos que se unen al EPO-R, debido a que los
presentes compuestos proporcionan una información importante de la
estructura-actividad (SAR) que facilita este
desarrollo.
Además, basándose en su capacidad para unirse al
receptor de EPO los péptidos de la presente invención se pueden
utilizar como reactivos para detectar los receptores de EPO en las
células vivas, en las células fijadas, en los fluidos biológicos,
en los homogeneizados de tejido, en los materiales biológicos
naturales, purificados, etc. Por ejemplo, marcando dichos péptidos,
se puede identificar las células con EPO-R en sus
superficies. Además, basándose en su capacidad para unirse al
receptor de EPO, los péptidos de la presente invención se pueden
utilizar en la coloración in situ, FACS (clasificación
celular activada por fluorescencia), transferencia de Western, ELISA
(ensayo inmunosorbente con enzima ligado), etc. Además, basándose
en su capacidad para unirse al receptor de EPO, los péptidos de la
presente invención se pueden utilizar en la purificación del
receptor o en la purificación de las células que expresan los
receptores de EPO en la superficie de las células (o en el interior
de las células permeabilizadas).
Los compuestos de la invención se pueden utilizar
también como reactivos comerciales para investigación en varias
utilizaciones medicas de investigación y de diagnóstico. Dichas
utilizaciones pueden incluir, pero no están limitadas a: (1)
utilización como patrón de calibración para cuantificar las
actividades de los agonistas experimentales de EPO en varios
análisis funcionales; (2) utilización como reactivos de bloqueo en
el cribado aleatorio del por ejemplo, es decir, buscando nuevas
familias de ligandos de péptidos receptores de EPO, los péptidos se
pueden utilizar para bloquear la recuperación de los péptidos de
EPO reivindicados actualmente; (3) utilización en la cristalización
conjunta con el receptor de EPO, es decir, los péptidos de la
presente invención permitirán la formación de cristales unidos al
receptor de EPO, permitiendo la determinación de la estructura
receptor/péptido por cristalografía de rayos X; (4) utilización
para medir la capacidad de las células precursoras de eritrocitos
para diferenciar y, de este modo, estimular la producción de la
síntesis de globina y el aumento de la síntesis del complejo hemo y
del número de receptores de ferritina; (5) utilización para
mantener la proliferación y el crecimiento de las líneas celulares
dependientes de EPO, tales como las líneas celulares
FDCP1-mEPO-R y TF-1;
y (6) otras aplicaciones de investigación y de diagnóstico en las
que el receptor de EPO está preferentemente activado o dicha
activación está convenientemente calibrada frente a una cantidad
conocida de un agonista EPO y similares.
Los compuestos de la invención se pueden
administrar a animales de sangre caliente, incluido el hombre, para
simular la unión de EPO al EPO-R in vivo.
Por lo tanto, la presente invención abarca procedimientos para el
tratamiento terapéutico de los trastornos asociados a una
insuficiencia de EPO que comprenda la administración de un
compuesto de la invención en cantidades suficientes para estimular
a EPO-R y de este modo, aliviar los síntomas
asociados a la insuficiencia de EPO in vivo. Por ejemplo,
los compuestos de la presente invención hallarán utilización en el
tratamiento de la insuficiencia renal/diálisis en la etapa final;
anemia asociada al SIDA, anemia asociada a enfermedades
inflamatorias crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide e
inflamación del intestino crónica), enfermedad autoinmunitaria y
tumores malignos; y para reforzar el número de glóbulos rojos de un
paciente antes de la intervención
quirúrgica.
quirúrgica.
Otras formas de realización de la presente
invención proporcionan la administración de los compuestos de
invención para el tratamiento de los trastornos que no están
caracterizados por glóbulos rojos bajos o insuficientes, por
ejemplo como el pretratamiento antes de las transfusiones. Además,
la administración de los compuestos de la presente invención
hallará utilización en la activación de megacariocitos.
Ya que se ha demostrado que EPO presenta un
efecto mitógeno y quimiotáctico sobre las células endoteliales
vasculares así como un efecto sobre las neuronas colinérgicas
centrales (véase, p. ej.: Amagnostou et al. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:5978-5982 y Konishi
et al. (1993) Brain Res. 609:29-35),
los compuestos de la presente invención hallarán utilización
asimismo en el tratamiento de varios trastornos vasculares, tales
como los que favorecen la cicatrización de la herida, el desarrollo
de los vasos sanguíneos coronarios colaterales (tales como los que
pueden aparecer después del infarto de miocardio), el traumatismo y
el tratamiento post-vascular del trasplante y una
variedad de trastornos neurológicos, caracterizados en general por
concentraciones absolutas bajas de acetilcolina o concentraciones
relativas bajas de acetilcolina en comparación con otras sustancias
neuroactivas, p. ej.: neurotransmisores.
Por consiguiente, la presente invención incluye
composiciones farmacéuticas que comprenden, como principio activo,
al menos uno de los péptidos o de otros compuestos de la invención
juntamente con un excipiente o diluyente farmacéutico. Los
compuestos de la presente invención se pueden administrar por las
vías de administración oral, parenteral (intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa (IV) mediante inyección subcutánea),
transdérmica (bien de forma pasiva o utilizando iontoforesis o
electroporación), a través de la mucosa (nasal, vaginal, rectal o
sublingual) o utilizando inserciones bioerosionables y se pueden
formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de
administración.
Las formas de dosificación sólidas para
administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras,
polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, los
principios activos se administran con al menos un excipiente inerte
farmacéuticamente aceptable tal como sacarosa, lactosa o almidón.
Dichas formas de dosificación pueden comprender además, como es
práctica normal, otras sustancias adicionales aparte de diluyentes
inertes, p. ej.: agentes lubricantes, tal como estearato de
magnesio. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las
formas de dosificación pueden comprender además agentes
tamponantes. Los comprimidos y las píldoras se pueden preparar
además con recubrimientos entéricos.
Las formas de dosificación líquidas para
administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones,
jarabes, con los elixires que contienen diluyentes inertes
utilizados generalmente en la técnica, tal como agua. Además de
dichos diluyentes inertes, las composiciones pueden incluir también
adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y
de suspensión y agentes edulcorantes, potenciadores de sabor y
perfumantes.
Las preparaciones según la presente invención
para administración parenteral soluciones, suspensiones o
emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes
o vehículos no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol,
aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz,
gelatina y ésteres orgánicos inyectables tal como el oleato de
etilo. Dichas formas de dosificación pueden también contener
adyuvantes, tales como agentes conservantes, humectantes,
emulsionantes y dispersantes. Se pueden esterilizar, por ejemplo,
por filtración mediante un filtro que retiene bacterias;
incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando
las composiciones o calentando las composiciones. Se pueden
preparar también utilizando agua esterilizada o algún otro medio
inyectable estéril, inmediatamente antes de su uso.
Las composiciones para administración rectal o
vaginal son preferentemente supositorios que pueden contener,
además del principio activo, excipientes tales como manteca de
cacao o cera para supositorios. Las composiciones para
administración nasal o sublingual se preparan también con
excipientes estándar bien conocidos en la técnica.
La dosificación del ingrediente activo en las
composiciones de la presente invención puede ser variada; sin
embargo, es necesario que la cantidad de ingrediente activo sea tal
que se obtenga la forma de dosificación adecuada. La dosis
seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de
administración y de la duración del tratamiento deseado.
Generalmente se administran a mamíferos concentraciones de
dosificación entre 0,001 y 10 mg/kg de peso corporal al día.
Como se puede apreciar de la exposición anterior,
la presente invención posee una amplia variedad de aplicaciones.
Por consiguiente, los ejemplos siguientes se ofrecen a título
ilustrativo, no a título de limitación.
Se sintetizaron varios péptidos de la invención
utilizando las técnicas de síntesis en fase sólida de Merrifield
(véase Stewart, J.M. y Young, J.D., Solid Phase Peptide
Synthesis, 2ª edición (Pierce Chemical, Rockford, IL, 1984)) en
un instrumento automático Milligen/Biosearch 9600. La resina
utilizada fue PAL (Milligen/Biosearch), que es poliestireno
reticulado con ácido
5-(4'-Fmoc-aminometil-3,5'-dimetoxifenoxi)
valérico como aglutinante. La utilización de la resina PAL produce
una funcion amida con terminal carboxilo en el momento de la
escisión del péptido de la resina. La protección con la amina
primaria en los aminoácidos se consiguió con F-moc y
los grupos de protección con cadena lateral fueron
t-butilo para serina e hidroxilos de tirosina,
tritilo para amidas de glutamina y Pmc (sulfonato de
2,2,5,7,8-pentametilcroman) para el grupo arginina
guanidino. Cada acoplamiento se realizó durante una o dos horas
con BOP (hexafluorofosfato de benzotriazolil
N-oxtrisdimetilamoniofosfonio) y HOBt
(1-hidroxi-benzotriazol).
En la síntesis de péptidos con terminal carboxi
amidado, se escindió el péptido totalmente montado con una mezcla
de 90% de ácido trifluoroacético, 5% de etanoditiol y 5% de agua,
inicialmente a 4ºC y aumentando gradualmente hasta la temperatura
ambiente durante 1,5 horas. Se filtró el producto desprotegido en
la resina y se precipitó con éter dietílico. Después de secar a
fondo el producto se purificó por cromatografía líquida de alto
rendimiento en fase inversa C18 con un gradiente de
acetonitrilo/agua en ácido trifluoroacético al 0,1%.
Se cultivaron células
FDCP-1/mEPO-R (10^{5}) hasta
densidad media estacionaria en presencia de factores de crecimiento
(2,5 mm de EPO). Se lavaron las células dos veces en PBS y a
continuación se dejaron en inhanición durante 24 horas en medio
completo menos los factores de crecimiento.
Se determinó la viabilidad de las células por
coloración con tripano azul. Se preparó solución madre en medio
completo menos los factores de crecimiento para dar el número
deseado de células por 50 \mul. Los compuestos que se han de
probar se diluyeron 2 veces en placas de cultivo de tejido de 96
pocillos (50 \mul por pocillo final).
Se añadieron células (50 \mul por pocillo) a
cada pocillo y se incubaron de 24 a 48 horas (cuando las
referencias sean negativas deberían morir). Se determinó la
proliferación celular por el ensayo MTT.
Se llevó a cabo asimismo el procedimiento
indicado en Kitamura et al. (Blood
73:375-380 (1989), que se incorpora a la
presente memoria como referencia) en relación con la línea celular
TF-1 con dependencia de crecimiento en EPO para
demostrar las actividades de los compuestos de la presente invención
como agonistas de EPO. Los resultados representativos se muestran
en la Figura 8. La Figura 8 representa los efectos de EPO y del
péptido VGNYMCHFG
PITWVCRPGGG en la proliferación celular de la línea celular TF-1.
PITWVCRPGGG en la proliferación celular de la línea celular TF-1.
El procedimiento indicado en Kristal (Exp.
Hematol. 11:649-660 (1983), que se incorpora en
la presente memoria como referencia) para un microanálisis basado
en la incorporación de ^{3}H-timidina en las
células del bazo se empleó además para determinar la capacidad de
los compuestos de la presente invención para servir como agonistas
de EPO. En resumen, se inyectó a ratones B6C3F_{1} a diario
durante dos días con fenilhidrazina (60 mg/kg). Al tercer día se
eliminaron las células de bazo y se determinó su capacidad para
multiplicarse durante 24 horas utilizando un ensayo con MTT. Las
fotografías que demuestran la multiplicación de las poblaciones
representativas de células de bazo se muestran en las Figuras 9A
(referencia), 9B (tratada con 500 pM de EPO) y 9C (tratada con 25
\mum de GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG) con una ampliación de 200
\times.
a. Preparación de la muestra: Se volvieron a
poner en suspensión los péptidos en DMSO como solución madre 1
\times 10^{-2} M y se diluyeron en serie en incrementos de 10
veces para generar las siguientes soluciones 100\times:
1 \times 10^{-3}
\;
\;1 \times 10^{-4}
\;
\;1 \times 10^{-5}
\;
\;1 \times 10^{-6}
\;
\;1 \times 10^{-7}
\;
\;1 \times 10^{-8}
Se añadieron dos \mul de cada solución madre a
un pocillo de células según se describe a continuación en un
volumen total de 200 \mul para generar la concentración final
siguiente:
1 \times 10^{-5}
\;
\;1 \times 10^{-6}
\;
\;1 \times 10^{-7}
\;
\;1 \times 10^{-8}
\;
\;1 \times 10^{-9}
\;
\;1 \times 10^{-10}
b. Ensayo de multiplicación
celular:
- i.
- Origen de las células: FDC-P1/ER, (Dexter, et al., J. Exp. Med. (1980) 152:1036-1047, que se incorpora en la presente memoria como referencia), es una línea celular derivada de la médula ósea murina no transformada, bien caracterizada en la que el receptor de eritropoyetina ha sido transfectado de forma estable. Las células presentan multiplicación dependiente de EPO.
c. Protocolo experimental: Se cultivan en fase
estacionaria células mantenidas en RPMI 1640/10% de suero bovino
fetal/antibióticos y 10 U/ml de eritropoyetina . Se recogen las
células y se vuelven a poner en suspensión en medio reciente sin
factor de crecimiento (eritropoyetina) durante 24 hr. Se hace el
recuento de células y se vuelven a poner en suspensión a una
concentración de 800.000 células/ml. Se añaden aproximadamente
cuarenta mil células (50 \mu) a cada pocillo de una placa de
microvaloración de 96 pocillos. Se añade por tripicado el péptido a
cada pocillo. Se realiza una determinación estándar de la respuesta
a la dosis en cada serie de péptidos. Después de cuarenta y dos h
de incubación (\approx 2 duplicados), se pulsa cada pocillo con 1
\muCi/pocillo de timidina. Se incuban las células unas seis h más
en cuyo tiempo se recogen y se cuentan las células para evaluar la
incorporación de timidina como indicador de proliferación
celular.
d. Resultados: Se evalúan los péptidos en ambas
líneas celulares de receptor de eritropoyetina y en la línea celular
que no lleva receptor del progenitor. En la mayoría de los casos, se
ha evaluado el péptido en una línea celular del receptor de
eritropoyetina humana truncada. Los resultados se expresan como
cantidad de péptido necesario para producir la mitad de la
actividad máxima obtenida con eritropoyetina recombinante. Los
resultados representativos se publican en forma tabular con los
datos relativos de unión (Véase Tablas 17 a 22, infra).
a. Preparación de la muestra: Se volvió a poner
en suspensión el péptido en DMSO para dar un concentrado 1 \times
10^{-2} M.
b. Protocolo experimental: Células
FDC-P1/muER mantenidas en RPMI 1640/10% de suero
bovino fetal/antibióti-cos y 10 U/ml de
eritropoyetina se cultivan en fase estacionaria. Se recogen las
células y se vuelven a poner en suspensión en medio reciente sin
factor de crecimiento (eritropoyetina) durante 24 h. Se hace el
recuento de las células y se vuelven a poner en suspensión a una
concentración de 500.000 células/ml. Se coloca un mililitro de
células (500.000) en un tubo eppendorf. Se añade un microlitro de
una solución de péptidos 1 \times 10^{-3} a las células
(concentración final 1 \times 10^{-5} M) y se deja incubar
durante 10 minutos a 37ºC. Se realiza un control con eritropoyetina
(concentración final 10 U/ml) en cada ensayo. Se recogen las células
por centrifugación a 14.000 rpm y 4ºC. Se vuelven a poner en
suspensión en 100 \mul de tampón de lisis SDS y se someten a
electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Se transfiere el gel a
la nitrocelulosa y se prueba con un anticuerpo
anti-fosfotirosina (Upstate Biotechnology
Incorporated) diluido 1:1000 durante 1 h. Se lava la membrana con
solución salina tamponada Tris y se volvió a probar con un
anticuerpo marcado con peroxidasa anti-ratón. Se
visualizan las proteínas reactivas utilizando reactivos ECL de la
transferencia de Western (Amersham).
c. Resultados: La unión de eritropoyetina a su
receptor en una línea celular que responde a la eritropoyetina
produce la fosforilación de la tirosina tanto del receptor como de
las numerosas proteínas intracelulares, incluyendo Shc, vav y JAK2
cinasa. Se han analizado numerosos péptidos, incluyendo
GGTYSCHFGPLTFWCKPQGG, para evaluar su capacidad para simular la
respuesta observada con eritropoyetina. Los péptidos activos, tal
como los considerados por criterios de unión y de multiplicación,
producen un modelo de fosforilación idéntico al de la eritropoyetina
en las células que responden a la eritropoyetina. Estos resultados
suponen que los péptidos activos producen su respuesta mediante un
paso de transducción de la señal producida por la eritropoyetina.
Los resultados se describen en forma tabular con los datos de unión
y de multiplicación (Véase, Tablas 17 a 22, infra).
1. Protocolo experimental: Se cultivaron células
FDCP-1/muER en fase estacionaria 3,0 \times
10^{6} células/ml. Se recogieron las células y se volvieron a
poner en suspensión en medio reciente en ausencia de factor de
crecimiento y se dejaron cultivar durante 18 h adicionales en cuyo
momento las células se dividieron en tres frascos de igual densidad
circular: -factor, +EPO y +péptido. Se estimularon a continuación
las células con 10 U/ml de EPO o 10 \muM de péptido. Se
recogieron tres millones de células en los siguientes puntos de
tiempo: 0, 6, 8, 10 y 12 h. (véase, Figura 15). Se lavaron las
células dos veces en PBS frío y se fijaron volviendo a poner en
suspensión el sedimento de células en 100 \mul de PBS frío
seguido de 900 \mul de etanol al 70% frío. Se tiñeron las células
con 50 \mug/ml y se midió la fluorescencia en el citómetro Scan
Flow de FACS. Se midió el porcentaje de células en cada fase
utilizando el modelo SOBR del programa informático CellFIT, de
Becton Dickinson.
Eritropoyetina (10 U/ml) y GGTYSCHFGPLTFWCKPQGG
(1 \times 10^{-5} M) son igualmente eficaces para la evolución
de las células a través del ciclo celular. Cada diez horas después
de la producción por eritropoyetina o por el péptido,
aproximadamente el 45% de las células están en fase S en comparación
con el 15% del medio de referencia. Este resultado sugiere que el
péptido es capaz de producir su respuesta con la misma cinética que
la eritropoyetina recombinante.
Se extrajo una muestra de diez mililitros de
sangre periférica de un individuo sano en un tubo al vacío con
heparina esterilizada estándar. Se extrajo médula ósea murina de
los fémures de aproximadamente 10 ratones por experimento. Todos
los reactivos se adquirieron en Stem Cell Technologies Inc.
(Vancouver, Canadá).
a. Protocolo experimental: En resumen, se realizó
un recuento de las células nucleadas para establecer el número y
concentración de células nucleadas en la muestra original. En el
caso de la sangre periférica, se sometió la muestra a centrifugación
a través de un gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g
por ml) en 400 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se
separaron con cuidado las células mononucleares de la interfase de
la solución Ficoll-Hypaque y se diluyeron hasta un
volumen total de aproximadamente 10 ml. Se recogieron por
centrifugación las células obtenidas de la médula de hueso murina y
de la sangre periférica humana y se decantó el sobrenadante. Las
células decantadas se volvieron a poner en suspensión en medio
reciente y se sometieron a recogida tal como se describió
anteriormente. Se diluyeron las células lavadas en medio de
Iscove/2% de suero bovino fetal a la siguiente concentración para su
colocación en placas:
| Médula normal | 1 \times 10^{5} células con poca densidad |
| Sangre normal | 4 \times 10^{5} células con poca densidad |
Se añadieron las células a metilcelulosa según
las instrucciones del fabricante. Se analizaron los péptidos en las
siguientes concentraciones finales: 1 \times 10^{-6} y 1
\times 10^{-5}M en medio de metilcelulosa "menos EPO". Se
colocaron en placas números de células equivalentes en medio de
metilcelulosa "Completo" para evaluar la formación máxima de
colonias. Se montó una placa de referencia en cada ensayo sin EPO ni
péptido para determinar la formación de colonias de fondo. Se
puntuaron las colonias tras 10 días y 18 días de incubación.
b. Resultados: Como se muestra en las Tablas 13 a
15, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG fue capaz de estimular la formación de
colonias, aunque a concentraciones significativamente menores en
comparación con las obtenidas en medio de metilcelulosa
"Completo" (Eritropoyetina 3 U/ml), en médula ósea murina y
sangre periférica humana.
a. Protocolo experimental: Se analizaron los
péptidos tal como se describe en el apartado D, supra. Se
realizó una curva de crecimiento en cada línea celular utilizando
el mitógeno/factor de crecimiento apropiado para cada línea celular
para evaluar el potencial de crecimiento.
b. Resultados: Según se muestra en la Tabla 16,
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG fue capaz de estimular una respuesta de
crecimiento a las líneas celulares que responden al tratamiento en
ausencia de eritropoyetina incluyendo tanto las líneas celulares
hematopoyéticas como las no hematopoyéticas.
El dominio extracelular del receptor de
eritropoyetina humano (proteína de unión a EPO, EBP) se ha
expresado y sobreproducido en E. coli. Tal como en muchas
otras proteínas eucarióticas recombinantes utilizadas en E.
coli, la proteína apareció como un producto insoluble en las
fermentaciones a escala de laboratorio y se replegó y purificó para
obtener la proteína activa. La EBP tal como se produjo por este
procedimiento contiene un grupo sulfhidrilo libre que se puede
modificar sin efectuar la unión en fase de solución del ligando.
Esta observación se extendió al enlace covalente de EBP en lechos
de agarosa para inmovilizar la EBP para el análisis de la unión en
equilibrio y como base para un ensayo de unión en competencia. La
química de activación con yodoacetilo de los lechos Sufolink
(Pierce Chemical Co., Rockford, IL) es específica de los tioles
libres y asegura que el enlace no es fácilmente reversible. Se
prepararon los lechos EBP-Sulfolink de la forma
siguiente: Una suspensión de gel SulfoLink (10 ml) se mezcló con
tampón de acoplamiento (40 ml; Tris 50 mM, pH 8,3, EDTA 5 mM) y se
dejó sedimentar el gel. Se eliminó el sobrenadante y la EBP (0,3 a
1 mg/ml en tampón de acoplamiento) que se ha de unir se añadió
directamente a los lechos lavados. Se agitó la mezcla suavemente
durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se dejaron sedimentar
los lechos durante 1 hora a temperatura ambiente. Se separó el
sobrenadante, se conservó y se lavaron los lechos dos veces con 20
ml de tampón de acoplamiento. También se recogieron los lavados. Se
trataron a continuación los lechos con 20 ml de cisteína 0,05 M
durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear las zonas no
unidas. Por último, se lavaron los lechos con 50 ml de NaCl 1 M, a
continuación con 30 ml de PBS y se volvieron a poner en suspensión
en 20 ml de PBS y se almacenaron a 4ºC para su utilización
posterior. Se determinó la cantidad de EPB que se unió
covalentemente a los lechos por comparación de la OD_{280} de la
solución de EBP original con la OD_{280} total recuperada en el
sobrenadante de la reacción y en los dos lavados de 20 ml.
Típicamente, del 40 al 60% de la EBP aplicada queda asociada a los
lechos.
Los ensayos de unión se iniciaron con la adición
de bolitas de EBP (50 ml) a tubos de reacción individuales. Se
midió la unión total en los tubos que contenían 0,3 a 30 nM de
^{125}I-EPO (NEN Research Products, Boston MA, 100
\muCi/\mug). Para la determinación del enlace no específico, se
añadió EPO sin marcar a una concentración de 1000 veces en exceso
de la concentración correspondiente de [^{125}I]EPO. Se
llevó cada volumen de reacción a 500 \mul con tampón de unión
(PBS/0,2% de BSA). Se incubaron los tubos durante cinco horas
(periodo de tiempo determinado experimentalmente como adecuada para
el establecimiento del equilibrio) a temperatura ambiente con
agitación suave. Después de cinco horas, cada mezcla de reacción se
pasó a través de una boquilla de pipeta de 1 ml con un tapón de
lana de vidrio. Se lavaron los tubos con 1 ml de tampón de lavado
(PBS/5% de BSA) y este volumen, así como 2 lavados adicionales de 1
ml, se pasaron a través de la boquilla de la pipeta y se recogieron
para la determinación de la concentración de EPO libre. El análisis
de unión en equilibrio de la asociación específica de
[^{125}I]EPO con EPB inmovilizada en estos lechos de
agarosa indica una Kd de 5 nM\pm 2 basada en una transformación
lineal (Scatchard) de la isoterma de unión (véase la Figura 16).
Los ensayos de análisis de unión competitiva de
los péptidos experimentales se realizaron como se bosqueja más
adelante. Se disolvieron los péptidos uno a uno en DMSO para
preparar una solución madre 1 mM. Todos los tubos de reacción (por
duplicado) contenían 50 \mul de bolitas de EBP, [^{125}I] EPO
0,5 nM y péptido 0 a 500 \muM en un total de 500 \muL de tampón
de unión. Se añadió la concentración final de DMSO al 2,5% en todos
los tubos de ensayo, valor sin efecto detectable ya que un examen
de la sensibilidad del ensayo a DMSO demostró que las
concentraciones mayores de DMSO al 25% (V/V) no ejercían efecto
perjudicial sobre el enlace. Se midió la unión no específica en cada
uno de los ensayos mediante la inclusión de tubos que contenían un
gran exceso de EPO sin marcar (1000 nM). Los puntos iniciales del
ensayo sin péptido añadido se incluyeron en cada ensayo para
determinar el enlace total. Las mezclas de unión se incubaron toda
la noche a temperatura ambiente con agitación suave. Se recogieron a
continuación las bolitas utilizando Micro-columnas
(Isolab, Inc., Akron, Ohio) y se lavaron con 3 ml de tampón de
lavado. Las columnas que contenían las bolitas lavadas se colocaron
en tubos de vidrio de 12 \times 75 mm y se determinaron los
niveles de radioactividad ligada utilizando un contador gamma. La
cantidad de [^{125}I] EPO unida se expresó como porcentaje de la
unión de la referencia (total = 100%) y se representó frente a la
concentración de péptido después de la corrección para la unión no
específica. Se definió IC_{50} como la concentración de péptido
que redujo la unión de [^{125}I] EPO al 50% en las bolitas de
EBP. Todos los datos se presentaron en comparación con
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ611233) que demostró un IC_{50} de 5
\muM (véase las Tablas 17 a 22, infra).
Ratones hembra BDF1 (18 a 20 g) se sometieron a
un ciclo de acondicionamiento (en cámaras hipobáricas) de 18 h a
0,40 \pm 0,02 atmósfera y 6 h a la presión ambiente durante un
periodo de 14 días.
Se mantuvieron los ratones a la presión ambiente
durante 72 h antes de la administración de r-HuEPO
o de muestras de la prueba. Las muestras de prueba o
r-HuEPO estándar se diluyeron por inyección dentro
del ratón acondicionado. El vehículo está compuesto por: PBS
conteniendo 0,1% de BSA (p/v). Para cada dilución, se administra
0,5 ml por vía subcutánea en cada uno de los 10 ratones. Se
administra ^{59}Fe 48 h después. Se extraen muestras de sangre 48
h después de la administración de ^{59}Fe. Se determinan los
hematocritos y las medidas de radioactividad en cada muestra. El
intervalo de dosis y los resultados (dos ensayos diferentes) se
indican en la Tabla 23 y en las Figuras 17A a 17C,
infra.
Además, utilizando el siguiente bioensayo en
ratón exhipóxico policitémico, se probaron
TIAQYICYMGPETWE
CRPSPKA y un péptido dimérico análogo de GGTYSCHFGPLTFWCKPQGG que contiene dos enlaces disulfuro (AF12080). Los resultados del bioensayo en ratón exhipóxico policitémico se indican en las Figuras 18A y 18B. Además, la Tabla 24, a continuación, indica la equivalencia aproximada de EPO y de varios péptidos miméticos.
CRPSPKA y un péptido dimérico análogo de GGTYSCHFGPLTFWCKPQGG que contiene dos enlaces disulfuro (AF12080). Los resultados del bioensayo en ratón exhipóxico policitémico se indican en las Figuras 18A y 18B. Además, la Tabla 24, a continuación, indica la equivalencia aproximada de EPO y de varios péptidos miméticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se administran dosis (0,5 ml, S.Q.) a ratones
normales BDF1 hembra sin tratar en tres días consecutivos con EPO o
el compuesto experimental. Vehículo: PBS, 10% de PEG 8000, 0,25% de
BSA, añadiéndose DMSO. Al tercer día, también se administran dosis
a los ratones (0,1 ml, I.P.) con hierro dextrano (100 mg/ml). Al
quinto día, se anestesian los ratones con CO_{2} y se extrae
sangre mediante punción cardíaca. Se determina el % de
reticulocitos por coloración con naranja de tiazol y análisis con
el citómetro de flujo (programa retic-count). Se
determinan manualmente los hematocritos. El porcentaje de
reticulocitos corregido se determina utilizando la siguiente
fórmula:
% RETIC_{(CORREGIDO)} = %
RETIC._{(OBSERVADO)} \times Hct._{(INDIVIDUAL)}
/Hct._{(NORMAL)}
Los resultados obtenidos utilizando el ensayo de
reticulocitos anterior se indican en las Figuras 18A y 18B y en las
Figuras 19A y 19B.
Células nucleadas de médula ósea humana extraidas
de donantes normales se colocaron en placas en metilcelulosa
semisólida (0,9% de metilcelulosa, 30% de suero bovino fetal, 1% de
albúmina de suero bovino, 2-mercaptoetanol
10^{-4}, L-glutamina 2 mM). En resumen, se
recogieron las células y se lisaron los glóbulos rojos por adición
de cloruro de amonio tamponado. Se volvieron a poner en suspensión
las células en un medio conteniendo 2% de suero de ternero fetal y
se colocaron en placas a una densidad de 2 \times 10^{5} células
por placa por duplicado. Las colonias eritroides y de
granulocito-macrófago (G-M) formadas
después de 12 días de cultivo se puntuaron por el color y la
morfología. Se incluyó en el estudio una placa de referencia
conteniendo factores de crecimiento humanos recombinantes
IL-3, GM-CSF y SCF (3/GMS) para
acceder a la formación de la colonia GM de la muestra.
A partir de los datos indicados anteriormente, es
evidente que GGTYSCHFGPLTFWCKPQGG (RWJ 61233/AFF
Y11157) es capaz de favorecer la formación de colonias eritroides en ausencia de citocinas adicionales. Además, el péptido presenta especificidad estricta para el linaje eritroide por su capacidad para estimular la formación de la colonia del linaje GM.
Y11157) es capaz de favorecer la formación de colonias eritroides en ausencia de citocinas adicionales. Además, el péptido presenta especificidad estricta para el linaje eritroide por su capacidad para estimular la formación de la colonia del linaje GM.
Debe entenderse que la descripción anterior
pretende ser ilustrativa y no restrictiva. Muchas formas de
realización se pondrán de manifiesto para los expertos en la
materia en el momento de examinar la descripción anterior. Sin
embargo, el alcance de la invención debería estar determinado no con
respecto a la descripción anterior, sino en su lugar estar
determinado con respecto a las reivindicaciones adjuntas, junto con
el alcance completo de los equivalentes derivados de dichas
reivindicaciones. Las descripciones de todos los artículos y
referencias, incluyendo las publicaciones de patentes, se incorporan
en la presente memoria como referencia.
Claims (10)
1. Péptido de 10 a 40 restos de aminoácidos de
longitud que se une al receptor de eritropoyetina y comprende una
secuencia de aminoácidos
X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8}, opcionalmente
ciclada o dierizada, en la que cada aminoácido está indicado por
una abreviatura típica de una letra; X_{6} se selecciona
independientemente de entre uno cualquiera de los 20
L-aminoácidos codificados genéticamente; X_{3} es
C; X_{4} es R, H, L o W; X_{5} es M, F ó I; X_{7} es D, E, I,
L o V; y X_{8} es C.
2. Péptido según la reivindicación 1, que
comprende bien
- (a) una secuencia de aminoácidos YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8}, en la que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica de una letra; cada X_{2} y X_{6} se selecciona independientemente de entre uno cualquiera de los 20 L-amino-ácidos codificados genéticamente; X_{3} es C; X_{4} es R, H, L o W; X_{5} es M, F o I; X_{7} es D, E, I, L o V; y X_{8} es C; o
- (b) una secuencia de aminoácidos X_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}GPX_{6}TWX_{7}X_{8}X_{9}C_{10}X_{ 11}, en la que cada aminoácido está indicado por una abreviatura típica de una letra; cada X_{1}, X_{2}, X_{6}, X_{9}, X_{10} y X_{11} se selecciona independientemente de entre uno cualquiera de los 20 L-aminoácidos codificados genéticamente; X_{3} es C; X_{4} es R, H, L o W; X_{5} es M, F o I; X_{7} es D, E, I, L o V; y X_{8} es C.
3. Péptido según la reivindicación 2 (b) en el
que X_{4} es R o H; X_{5} es F o M; X_{6} es I, L, T, M, E o
V; X_{7} es D o V; X_{9} es G, K, L, Q, R, S o T; y X_{10} es
A, G, P, R ó Y, preferentemente en el que X_{1} es D, E, L, N, S,
T O V; X_{2} es A, H, K, L, M, S o T; X_{4} es R o H; X_{9} es
K, R, S o T; y X_{10} es P.
4. Péptido según la reivindicación 1, que se
selecciona de entre el grupo constituido por:
5. Péptido según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de aminoácidos está ciclada, y se selecciona de
entre el grupo constituido por:
6. Péptido según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de aminoácidos está dimerizada, cuyo péptido
comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
7. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en
combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, para su utilización como producto
farmacéutico.
9. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de un paciente que padece un
trastorno caracterizado por una insuficiencia de
eritropoyetina o por una población de glóbulos rojos
insuficiente.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la
que el medicamento está destinado al tratamiento de un paciente con
un trastorno que consiste en insuficiencia renal o diálisis en la
etapa final; anemia asociada al SIDA, enfermedad autoinmunitaria o
tumores malignos; beta-talasemia; fibrosis
quística; anemia precoz de la premadurez; anemia asociada a
enfermedades inflamatorias crónicas; lesión de la médula espinal;
hemorragias agudas; envejecimento y estados patológicos neoplásicos
acompañados de eritropoyesis anormal.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US484635 | 1995-06-07 | ||
| US484631 | 1995-06-07 | ||
| US08/484,631 US5830851A (en) | 1993-11-19 | 1995-06-07 | Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US08/484,635 US5773569A (en) | 1993-11-19 | 1995-06-07 | Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2210374T3 true ES2210374T3 (es) | 2004-07-01 |
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ID=27048076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96919296T Expired - Lifetime ES2210374T3 (es) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Compuestos y peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina. |
Country Status (18)
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