NO318783B1

NO318783B1 - Peptid som binder til erytropoietinreseptoren og anvendelse derav, samt farmasoytiske blandinger som inneholder peptidet.

Info

Publication number: NO318783B1
Application number: NO19975729A
Authority: NO
Inventors: Linda Jolliffe; William J Dower; Nicholas C Wrighton; Ray S Chang; Arun K Kashyap; Dana Johnson
Original assignee: Ortho Pharma Corp; Affymax Yechnologies Nv
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2005-05-09
Also published as: NO975729L; EP1510524A2; PL185040B1; AU712713B2; JP2007277264A; JP2009280616A; CA2223833A1; KR100459984B1; DE69630708T2; ATE254138T1; EP0886648B1; JPH11507367A; NO975729D0; EP0886648A4; WO1996040749A1; BR9609006A; CN1192748A; NZ310804A; AU6166796A; IL122417A0

Description

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptider som binder til erytropoietin-reseptoren (EPO-R), samt anvendelse derav, for fremstilling av farmasøytiske blandinger som inneholder peptidet og farmasøytiske blandinger. Oppfinnelsen har betydning på området biokjemi og medisinsk kjemi og tilveiebringer særlig EPO-agonister for anvendelse ved behandling av humane sykdommer.

Erytropoietin (EPO) er et glykoprotein-hormon med 165 aminosyrer, 4 glykosyleringssteder på aminosyreposisjonene 24, 38, 83 og 126, og med en molekylvekt på ca. 34.000. Initialt produseres det som et forløperprotein med et signalpeptid på 23 aminosyrer. EPO kan opptre i tre former: a, p og asialo. a- og p-formene adskiller litt i karbohydratkomponentene, men har samme styrke, biologiske virkning og molekylvekt. Asialo-formen er en a- eller p-form hvor det terminale karbohydrat (sialinsyre) er fjernet. De DNA-sekvenser som koder for EPO er tidligere beskrevet. Se Lin (1987), US-patent 4.703.008, som det herved refereres til.

EPO stimulerer mitotisk deling og differensieringen av erytrocytt-forløperceller og sikrer derved produksjonen av erytrocytter. Ved hypoksiske tilstander produseres det i nyrene. Under EPO-indusert differensiering av erytrocytt-forløperceller skjer en induksjon av globinsyntese og økninger av syntesen av hem-komplekset og ferritin-reseptorantallet. Dette gjør det mulig for cellen å ta opp mer jern og syntetisere funksjonelt hemoglobin. Hemoglobin i modne erytrocytter binder oksygen. Erytro-cyttene og det hemoglobin som disse inneholder, spiller således en nøkkelrolle for oksygentilførselen til kroppen. De komplekse prosessene som er beskrevet tidligere, initieres gjennom interaksjonen mellom EPO og en passende reseptor på celleoverflaten av erytrocytt-forløpercellene. Se f.eks. Graber & Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29:51-66.

EPO forekommer i meget lave konsentrasjoner i plasma når kroppen er frisk, hvor vevet oppnår tilstrekkelig oksygenering fra det eksisterende erytrocyttantall. Denne normale lave konsentrasjon er tilstrekkelig til å stimulere erstatning av røde blodlegemer som tapes under normal aldring.

Mengden av EPO i kretsløpet økes under hypoksibetingelser når oksygen-transporten i blodcellene i kretsløpet reduseres. Hypoksi kan være forårsaket av tap av store mengder blod gjennom blødning, destruksjon av røde blodlegemer ved overeksponering for bestråling, reduksjon i oksygeninntak i store høyder eller lengre bevisstløshet eller av forskjellige former av anemi. Som respons på vev som er gjenstand for hypoksisk stress, vil EPO øke produksjonen av røde blodlegemer ved å stimulere proliferasjon av erytroiode progenitorceller. Når antallet av røde blodlegemer i kretsløpet er høyere enn oksygenkravet til normalt vev, minskes EPO i kretsløpet.

Siden EPO er essensiell for dannelsesprosessen av røde blodlegemer, vil hormonet kunne ha anvendelser både ved diagnose og behandling av blod-forstyrrelser som kjennetegnes ved lav eller defekt produksjon av røde blodlegemer. Nylige undersøkelser har gitt grunnlag for å forvente effekt av EPO-terapi ved en rekke sykdomstilstander, forstyrrelser og tilstander med hematologisk uregelmessighet, inklusivt: beta-thalassemi (se Vedovato et al., (1984) Acta. Haematol. 71:211-213); cystisk fibrose (se Vichinsky et al., (1984) J. Pediatric 105:15-21; graviditet- og menstruasjons-forstyrrelser (se Cotes et al., (1993) Brit. J. Ostet. Qyneacol. 90:304-311; tidlig anemi ved prematuritet (se Haga et al., (1983) Acta Pediatr. Scand. 72:827-831); ryggmargsskade (se Claus-Walker era/., (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374); romreiser (se Dunn et al., (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182); akutt blodtap (se Miller et al., (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590; aldring (se Udupa et al., (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580 og 581-588 og Lipschitz et al. (1983) Blood 63:502-509; forskjellige neoplastiske sykdomstilstander ledsaget av abnorm erytropoiese (se Dainiak et al., (1983) Cancer 5:1101-1106 og Schwartz et al. (1983) Otolaryngol. 109:269-272); og renal insuffistens (se Eschbach et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78).

Renset, homogent EPO er allerede karakterisert. Se Hewick US-patent 4.677.195. En DNA-sekvens som koder for EPO ble renset, klonet og uttrykt for å produsere syntetiske polypeptider med de samme biokjemiske og immunologiske egenskapene. Et rekombinant EPO-molekyl med identiske oligosakkarider som de på det naturlige materialet, er også produsert. Se Sasaki et al., (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076.

På tross av at renset rekombinant EPO er tilgjengelig, er det lite som er kjent angående mekanismene av EPO-indusert erytroblast-proliferasjon og differensiering. Den spesifikke interaksjon mellom EPO og progenitorceller av umodne røde blodlegemer, blodplater og megakaryocytter står igjen å karakterisere. Dette skyldes i det minste delvis det lave antall av overflate-EPO-reseptormolekyler på normale erytroblaster og på erytroleukemicellelinjen. Se Krantz & Goldwasser (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:7574-7578; Branch et al. (1987) Blood 69:1782-1785; Mayeux et ai, (1987) FEBS Letters 211:229-233; Mufson & Gesner (1987) Blood 69:1485-1490; Sakaguchi et ai, (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:7-12; Sawyer et al., (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3690-3694; Sawyer et al., (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562; og Todokoro et al., (1988) Proe. Nati. Acåd. Sei. USA 84:4126-4130.

Kryssbundne komplekser mellom radioaktivt jodert EPO og celleoverflate-proteiner tyder på at celleoverflateproteinene omfatter to polypeptider som har tilnærmede molekylvekter på henholdsvis 85.000 dalton og 100.000 dalton. Mer nylig er de to kryssbundne kompleksene blitt underkastet V8-proteaseoppslutning og har vist seg å ha identiske peptidfragmenter, hvilket tyder på at de to EPO-bindende polypeptidene kan være produkter av de samme, eller svært like, gener. Se Sawyer et al., (1988) supra. De fleste overflate-bindingsstudier har imidlertid avdekket en enkelt klasse av bindingssteder som i gjennomsnitt utgjør 300 til 600 per celleover-flate, med en Kd på ca. 800 pM (pikomolar). Se Sawyer et al., (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3690-3694. EPO-responderende milt-erytroblaster, fremstilt fra mus injisert den anemiske stamme (FVA) av Friend leukemivirus, oppviser imidlertid et bindingssete med høy og et med lav affinitet med dissosiasjonskonstanter på henholdsvis 100 pM og 800 pM. Se Sawyer et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562 og Landschulz (1989) Blood 73:1476-1478. DNA-sekvensene og de kodede peptidsekvensene for munne og humane EPO-reseptorproteiner er beskrevet. Se D'Andrea et al., PCT patentpublikasjon nr. WO 90/08822 (publisert 1990).

Tilgjengeligheten av klonede gener for EPO-R letter søkningen etter agonister og antagonister for denne viktige reseptor. Tilgjengeligheten av det rékombinante reseptorprotein gjør det mulig å studere reseptor/ligand-interåksjon i en rekke randomiserte og semi-randomiserte systemer for peptid-diversitets generering. Disse systemene innbefatter det «peptider på plasmider» system som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 778.233, av 16. oktober 1991, det «peptider på fag» system som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 718.577, av 20. juni 1991 og i Cwiria et al., aug. 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6378-6382, det «kodede syntetiske bibliotek» (ESL) system som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 946.239, av 16. september, 1992, som er en CIP av serie nr. 762.522, av 18. september, 1991, og det «very large scale immobilized polymer synthesis» system som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 492.462, av 7. mars, 1990; PCT patentpublikasjon nr. 90/15070, av 13. desember, 1990; US-patentsøknad serie nr. 624.120, av 6. desember, 1990; Fodor et al., 15. febr. 1991, Science 251:767-773; Dower & Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180; og US-patentsøknad serie nr. 805.727, av 6. desember, 1991; hvor hver av ovennevnte patentsøknader og publikasjoner herved herved refereres til.

Det gjenstår imidlertid behov for forbindelser som binder til, eller på annen måte gir, interaksjon med EPO-R, både for studier av de viktige biologiske virkningene som medieres av denne reseptor, og for sykdomsbehandling. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike peptidforbindelser.

Ifølge én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen peptid med en lengde på 10 til 40 aminosyrerester som binder til erytropoietinreseptorer, kjennetegnet ved at det omfatter aminosyresekvensen X3X4X5GPX6TWX7X8, hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; X6 er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; Xs er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og X8 er C.

Fortrinnsvis vil peptidet omfatte en kjernesekvens YX2X3X4X5GPX6TWX7X8 hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X2 og X6 er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og Xa er C.

Mer foretrukket vil peptidet omfatte en kjernesekvens av aminosyrene X1YX2X3X4XsGPX6TWX7X 8X9X10X11 hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X1( X2, X6, X9, X10 og Xn er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og X8 er C.

I en mer foretrukket utførelsesform vil både Xs og Xe være C, og peptidet vil således omfatte en kjernesekvens av aminosyrene X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10-Xn. Mer foretrukket vil peptidet omfatte en kjernesekvens av aminosyrene X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11, hvor X4 kan være R eller H; X5 kan være F eller M; X6 kan være I, L, T, M, E eller V; X7 er D eller V; X9 kan være G, K, L, Q, R, S eller T; og X10 kan være A, G, P, R eller Y. I henhold til en mest foretrukket utførelsesform vil peptidet omfatte en kjernesekvens av aminosyrene X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9-X10X11, hvor X1 kan være D, E, L, N, S, T eller V; X2 kan være A, H, K, L, M, S eller T; X4 er R eller H; X9 kan være K, R, S eller T; og X10 er P. Særlig foretrukne peptider inkluderer, men er ikke begrenset til, de følgende:

I henhold til en annen foretrukket utførelsesform cykliseres eller dimeriseres peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på peptider som kan cykliseres som C-terminale amider, inkluderer, men er ikke begrenset til, de følgende:

Et eksempel på en dimer i henhold til foreliggende oppfinnelse følger:

I henhold til enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen kan to eller flere, fortrinnsvis mellom to og seks, aminosyre rester, uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene eller de stereoisomere D-aminosyrene, være koblet til den ene eller begge endene av de ovenfor beskrevne kjerne-sekvenser. For eksempel vil sekvens GG ofte bli tilføyd til den ene eller begge ender av kjemesekvensene for å gjøre peptidsyntesen lettere. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også konjugater av disse peptidene og derivater og peptid-mimetika av de peptidene som bibeholder evnen til EPO-R-binding.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelse av peptidet for fremstilling av en farmasøytisk blanding for behandling av en lidelse som kjennetegnes ved en erytropoietinsvikt eller lav eller defekt populasjon av røde blodlegemer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre farmasøytiske blandinger som omfatter én eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen og en fysiologisk akseptabel bærer.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 angir sekvensene av de mutagenese-oligomerer som benyttes for de fremgangsmåter som her er beskrevet. Figur 2 angir sekvensene av representative peptider ifølge oppfinnelsen. Figur 3 illustrerer et nytt phagemid mutagenese-bibliotek konstruert ved å benytte pVIII display-systemet. I dette bibliotek var tyrosin-, glycin-prolin- og treonin-tryptofan-restene (understreket), i likhet med de to cysteinene, faste. Andre posisjoner mellom cysteinrestene (vist i konturskrrft, forekommende i det opprinnelig AF11154 hit-peptid) ble mutert ved oligokonstruksjon slik at hver aminosyrerest kunne endres til en hvilken som helst annen med en hyppighet på 50%. «X» angir en tilfeldig aminosyreposisjon. Figur 4A-C illustrerer pill- og pVIII-phagemid mutagenese-bibliotek som nå er under konstruksjon og screening. Aminosyrerester satt med fete typer, er faste, de øvrige (angitt med NNK) er randomiserte. 4A (ON3007) og 4C (ON3017) er konstruert for å undersøke bidraget til ekstraflankerende regioner henholdvis N-terminaft og C-terminalt til kjemesekvensen (tyrosin til det andre cystein). 4B (ON3016) er basert på peptidet Y-CHFGPLTWVC, hvor tyrosinresten er plassert i direkte nabostilling til det første cystein. Dette bibliotek gir ytterligere tilfeldige rester på begge sider av kjemesekvensen. Figur 5 illustrerer et mutagenese-bibliotek, basert på

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, konstruert og underkastet screening ved å benytte en ny Lac-I display-vektor («Headpiece Dimer»). Aminosyrerester betegnet X er tilfeldige (NNK), de understrekede er lett muterte (91:3:3:3/91:3:3:3/K), mens de vist i konturskrift er sterkere mutert (70:10:10/70:10:10/K).

Figur 6 illustrerer et mutagenese-bibliotek, basert på

TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, konstruert og underkastet screening ved å benytte en ny Lac-I display-vektor («Headpiece Dimer»). Aminosyrerester betegnet X er tilfeldige (NNK), de vist i konturskrift var faste, og de to glutaminsyrerestene var svakt muterte (91:3:3:3/91:3:3:3/K).

Figur 7 er en grafisk fremstilling av resultatene av FDCP-1/hEPO-R biotesten for utvalgte peptider ifølge oppfinnelsen, hvor • angir resultatene for GGCRIGPITWVCGG;

0 angir resultatene for GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG;

■ angir resultatene for GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

▲ angir resultatene for GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG

T angir resultatene for VGNYMCHFGPITWVCRPGGG; 1 angir resultatene for GGVYACRMGPITWVCSPLGG;

+ angir resultatene for VGNYMAHMGPITWVCRPGG; og

<*> angir resultatene for EPO.

Figur 8 er en grafisk fremstilling av resultatene av TF-1 biotesten for EPO (▲ og ♦ angir resultatene for testen ved å benytte EPO og henholdsvis 10.000 eller 20.000 celler per brønn) og for peptidet VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEKV. ID. NR:) (■ og • angir resultatene for testen ved bruk av peptidet og henholdsvis 10.000 eller 20.000 celler per brønn). Figur 9A (kontroll), 9B (behandlet med 500 pM EPO) og 9C (behandlet med 25 mM GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG) er fotografier som fremstiller resultatene av en MTT-proliferasjonstest på representative populasjoner av miltceller fra fenylhydrazin-behandlede mus ved en forstørrelse på 200 X. Figur 10 er en grafisk fremstilling av resultatene av FDCP-1/hEPOR bioassay som viser forsterket virkning av det biotinylerte peptid (dvs.

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) ved oligomerisering med streptavidin. Peptidene GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG og

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) oppviser tilnærmet samme aktivitet, men når sistnevnte på forhånd komplekseres med streptavidin (dvs. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin)-streptavidinkompleks) er det vesentlig kraftigere. I denne test sees det liten aktivitetsreduksjon i den laveste konsentrasjon (5 nM av peptidet i komplekset). Streptavidin har alene marginal virkning i høye konsentrasjoner. Figur 11 er en grafisk fremstilling av resultatene av FDCP-1/hEPOR-bioassay som viser polyklonal geit-anti-biotin-mediert økning av styrken av peptid AF11505. Pre-kompleksering av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) med geit-anti-biotin-antistoffer (GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK + G anti-B) øker styrken av peptidet med en 10-er potens i forhold til det frie peptid. De rensede antistoffene (G anti-B) har alene ingen stimulerende effekt. Figur 12 viser synteseskjemaet for fremstillingen av den dimere peptidanalog

av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.

Figur 13 viser ICscrplottet av den dimere peptidanalog av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Affiniteten ble bestemt ved å benytte en kompetitiv radioligand-bindingstest mot «PIG-tailed» EPOR immobilisert på mAB179. Figur 14 illustrerer den biologiske aktivitet in vitro av den dimere peptidanalog av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG ved å benytte FDCP-1/hEPOR-celleproliferasjonstesten. Det dimere peptid har en ECso på ca. 20 mM, en 20 gangers økning av styrken i forhold til det parentale peptid.

Figur 15 illustrerer cellecyklus-utviklingen av FDC-P1/ER.

Figur 16 illustrerer likevekts-bindingsanalysen av den spesifikke assosiasjon av [<12s>l]EPO med EBP immobilisert på agarosekuler, og tyder ifølge en lineær transformasjon (Scatchard) av bindings-isotermen, på en Kd på 5 nM ± 2. Figur 17A, 17B og 17C illustrerer resultatene av den polycytemiske ekshypoksiske biotest på mus ved å benytte peptidene henholdsvis

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ og LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD.

Figur 18A og 18B illustrerer resultatene av den polycytemiske ekshypoksiske biotest på mus ved å benytte peptidene henholdsvis

TIAQYICYMGPETWECRPSPKA og en dimer peptidanalog av henholdsvis GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG som inneholder to disutfidbindinger (AF12080).

Figur 19A og 19B illustrerer resultatene av retikulocytt-bestemmelsen ved å benytte henholdsvis EPO og GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. For begge doserings-gruppene utgjør n=10 dyr. EPO: 0,4,4,0,40,0 enheter/mus, totaldose bærer-kontroll; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: 2,0, 20,0, 200,0 u.g/mus, totaldose bærer-

kontroll + DMSO (1-2%) 200 ug/mus = 10 mg/kg. Rasjonale; in vitro proliferasjons-testdata tyder på: 2 ug av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0,4 enheter EPO.

Figur 20A og 20B illustrerer resultatene av retikulocytt-bestemmelsen ved å benytte henholdsvis EPO og GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. For begge doserings-gruppene utgjør n=10 dyr. EPO: 0,4,4,0,40,0 enheter/mus, totaldose; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: øket dose til 1 mg/mus, totaldose=50 mg/kg og til

2 mg/mus, totaldose= mg/kg.

De etterfølgende betegnelser er ment å ha følgende generelle betydninger: Aminosyrerester i peptider er forkortet som følger: fenylalanin er Phe eller F;

Leucin er Leu eller L; Isoleucin er Ile eller I; Metionin er Met eller M; Valin er Val eller V; Serin er Ser eller S; Prolin er Pro eller P; Threonin er Thr eller T; Alanin er Ala eller A; Tyrosin er Tyr eller Y; Histidin er His eller H; Glutamin er Gin eller Q; Asparagin er Asn eller N; Lysin er Lys eller K; Asparaginsyre er Asp eller D; Glutaminsyre er Glu eller E; Cystein er Cys eller C; Tryptofan er Trp eller W; Arginin er Arg eller R; og Glycin er Gly eller G.

Stereoisomerer (f .eks. D-aminosyrer) av de tyve konvensjonelle aminosyrene, så som a,a-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre og andre ukonvensjonelle aminosyrer kan også være egnede komponenter for forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ukonvensjonelle aminosyrer er: 4-hydroksyprolin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin og andre lignende aminosyrer og iminosyrer (f .eks. 4-hydroksyprolin).

«Agonist» refererer seg til en biologisk aktiv ligand som binder seg til dens komplementære biologisk aktive reseptor og aktiverer sistnevnte enten til å frembringe en biologisk respons i reseptoren eller til å forsterke allerede eksisterende biologisk aktivitet av reseptoren.

«Vertscelle» refererer seg til en eukaryot eller prokaryot celle eller cellegruppe som kan bli, eller er blitt, transformert med en rekombinant DNA-vektor. I denne sammenheng foretrekkes prokaryote vertsceller.

«Peptid» eller «polypeptid» refererer seg til en polymer, hvor monomerene er alfa-aminosyrer som er sammenkoblet gjennom amidbindinger. Peptider har ofte en lengde på to eller flere aminosyre-monomerer.

«Farmasøytisk akseptable salter» refererer seg til ugiftige alkalimetall-, jordalkalimetall- og ammonium-salter som vanligvis benyttes innen den farmasøytiske industri, inklusivt natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, barium-, ammonium- og protamin-sink-salter, som fremstilles etter velkjente

fremgangsmåter. Betegnelsen innbefatter også ugiftige syreaddisjonssalter som generelt fremstilles ved å omsette forbindelsene ifølge oppfinnelsen med en egnet organisk eller uorganisk syre. Representative salter er bl.a. hydroklorid, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oksalat, valerat, oleat, laurat, borat, benzoat, laktåt, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, napsylat og lignende.

«Farmasøytisk eller terapeutisk effektiv dose eller mengde» refererer seg til et doseringsnivå som er tilstrekkelig til å indusere et ønsket biologisk resultat. Resultatet kan bestå i lindring av tegn, symptomer eller sykdomsårsaker eller enhver annen ønsket endring av et biologisk system. Fortrinnsvis vil dosen eller mengden være tilstrekkelig til å stimulere EPO-R og dermed lindre de symptomene som er assosiert med en EPO-svikt eller en defekt eller lav in vivo populasjon av røde blodlegemer.

«Rekombinant DNA-klonings- eller ekspresjons-vektor» refererer seg til et DNA- eller RNA-molekyl som koder for en anvendelig funksjon og som kan benyttes for å transformere en vertscelle. I foreliggende sammenheng tjener en kloningsvektor primært som et mellomprodukt ved konstruksjonen av en ekspresjonsvektor, hvor sistnevnte vektor benyttes til å transformere eller transfektere en vertscelle slik at den transformerte vertscellen produserer et protein eller annet produkt som kodes av vektoren. Slike vektorer er typisk «plasmider» som i denne sammenheng er vektorer som kan opprettholdes ekstrakromosomalt i en vertscelle, men kan også være vektorer som kan integreres i vertscellens genom. Fagmannen kan omtale «kloningsvektorer» som her definert, som «vektorer» og «ekspresjonsvektorer» som her definert, som «plasmider».

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som binder til og aktiverer, EPO-R eller som på annen måte oppfører seg som en EPO-agonist. Disse forbindelsene innbefatter «leder»-peptidforbindelser, som er oppdaget gjennom genereringssystemer for tilfeldig peptid-diversitet, og «derivat»-forbindelser som er konstruert slik at de har samme eller lignende molekylstruktur eller form som lederforbindelsene, men adskiller seg fra lederforbindelsene enten med hensyn til ømfintlighet overfor hydrolyse eller proteolyse og/eller med hensyn til andre biologiske egenskaper, så som øket affinitet for reseptoren, øket in vitro aktivitet eller in vivo aktivitet.

De genereringssystemer for tilfeldig peptid-diversitet som i første omgang ble benyttet, inkluderte det ovenfor omtalte «peptider på fag» systemet. De tilfeldige peptidene ble konstruert med 8 aminosyreresters lengde, flankert av Cys-rester i begge endene (dvs. en totallengde på 10 aminosyrerester). I disse første systemene forekom de tilfeldige peptidene som del av et fusjonsprotein omfattende pVIII-kappeproteinet av fag fd-derivat (peptider på fag). Fusjonsproteinene ble sammen med den DNA som koder for fusjonsproteinene, «panned» på immobilisert EPO-R. Panning-prosessen involverte flere runder inkubering av fusjonsproteinene med den immobiliserte reseptor, oppsamling av de fusjonsproteiner som bandt seg til reseptoren (sammen med det ledsagende DNA) og fremstilling av mer av de oppsamlede fusjonsproteiner.

Etter tre panning-runder ble fusjonsproteinene og ledsagende DNA i alminnelighet isolert og dyrket for å frembringe fusjonsproteinpreparater for en ELISA for å bestemme om fusjonsproteinet spesifikt bandt seg til reseptoren. Denne testen ble foretatt på lignende måte som panning, bortsett fra at brønnene etter fjerning av ubundne fusjonsproteiner, ble behandlet med kanin anti-fag antistoff (eller med anti-lac-antistoff for peptider-på-plasmider-systemet), hvoretter alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-kanin-antistoff og deretter mengden av alkalisk fosfatase i hver brønn ble bestemt ved hjelp av standardmetoder. Ved å sammenligne testbrønner med kontrollbrønner (ingen reseptor) kan man bestemme om fusjonsproteinene bandt seg spesifikt til reseptoren.

Den immobiliserte reseptor benyttet for panning og ELISA omfattet det ekstracellulære domenet av EPO-reseptoren og ble produsert i rekombinante vertsceller. Dette reseptormolekylet kan fremstilles i en rekke ulike former og i ulike vertsceller. En anvendelig form konstrueres med et signalpeptid for proteinsekresjon og for glykofosfolipidmembran-forankring (denne form av forankring kalles «PIG-tailing»; se Caras & Wedell, 3. mars, 1989, Science 243:1196-1198; og Lin et al., 10. august, 1990, Science 249:677-679, som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse). Dette system gjør det mulig ganske lett å spalte reseptoren fra overflaten av de celler som uttrykker reseptoren og samle opp den avspaltede reseptor. Fortrinnsvis skytes det inn et protease-spaltningssete, så som et trombin-spaltningssete, mellom HPAP-epitopen av den «PIG-tailed» reseptoren og selve reseptoren.

Det rekombinante reseptorprotein ble immobilisert ved å benytte følgende metodikk. Mikrotiterplater ble dekket med et anti-reseptor-antistoff og brønnene som skulle inneholde den immobiliserte reseptor, ble behandlet med bovint serumalbumin

(BSA) for å blokkere ikke-spesifikk binding. Den «PIG-tailed» reseptor som har et trombin-spaltningssete, ble tilsatt til de dekkede brønnene i mikrotiterplaten som deretter ble vasket for å fjerne ubundet reseptor.

Ved bruk av systemer for tilfeldig peptidgenerering som muliggjorde multivalent ligand-reseptor-interaksjon, må man være klar over at tettheten av den immobiliserte reseptor er en viktig faktor ved bestemmelse av affiniteten av de ligander som vil binde seg til den immobiliserte reseptor. Ved høyere reseptor-tettheter (dvs. hver anti-reseptor antistoff-dekkede brønn behandlet med 0,25 til 0,5 mg reseptor) er det mer sannsynlig at det vil inntre multivalent binding (om i det hele tatt) enn ved lavere reseptor-tettheter (dvs. hver anti-reseptor antistoff-dekkede brønn behandlet med 0,5 til 1 ng av reseptoren). Dersom det inntrer multivalent binding, vil man med større sannsynlighet isolere ligander med relativt lav affinitet. I alminnelighet kan man identifisere lederforbindelser ved å benytte en høy tetthet av immobilisert reseptor og deretter teste derivatene av lederforbindelsen ved lavere reseptor-tettheter for å isolere forbindelser med høyere affinitet for reseptoren enn for lederforbindelsen.

Ofte ble reseptoren bare tilsatt til annen hver mikrotiterplate-rad, mens de BSA-blokkerte brønnene i de «blanke» radene tjente som egnede negative kontroller for å bestemme hvorvidt en reseptor-spesifikk reaksjon var det som førte til de observerte resultatene. Brønnene ble deretter tilsatt fusjonsproteinpreparater og inkubert for å muliggjøre binding til reseptoren, hvoretter brønnene ble vasket for å fjerne ubundne fusjonsproteiner.

Med de ovenfor beskrevne systemer ble det oppdaget et peptid som bandt seg til EPO-R. Den DNA som koder for fusjonsproteiner som bandt seg til reseptoren ble sekvensert. Dette peptidet hadde sekvensen: GGCRIGPITWVCGG (SEKV. ID. NR:) (den N-terminale GG-rest muliggjør spaltning på fagen). Dette peptid oppviste ved ELISA konsekvent lave affiniteter overfor BSA og overfor anti-reseptor antistoffet og høye affiniteter overfor EPO-R. Phagemid-klonen ble dessuten utkonkurrert av fritt EPO og av tilhørende fritt peptid. Videre ble det frie peptid funnet å utkonkurrere EPO-phagemid, Lacl-EPO-fusjon og radioligand. Endelig viste det frie peptid seg ikke å konkurrere i IL-2Rot[}-bindingstester.

Det ble deretter foretatt en mutagenese-undersøkeise på dette foretrukne peptid. For å frembringe samlingen av de oligonukleotider som koder for de tilfeldige peptidene, ble mutagenese-oligomerene vist i Figur 1, hvor N var nukleotid A, C, G eller T (ekvimolar; avhengig av den anvendte metodikk, kan andre nukleotider benyttes) og K var G eller T (ekvimolar) i kodonmotivet (NNK), fremstilt. Fagmannen vil innse at NNK-motivet koder for alle aminosyrene, bare koder for ett stoppkodon og reduserer kodon-skjevhet. Det er 32 mulige kodoner som resultat av NNK-motivet: 1 for hver av 12 aminosyrer, 2 for hver av 5 aminosyrer, 3 for hver av 3 aminosyrer og bare ett av de tre stoppkodonene.

Mutagenese-fusjonsproteinene ble sammen med den DNA som koder for disse, igjen «panned» på immobilisert EPO-R. Fusjonsproteinene og ledsagende DNA ble deretter isolert og dyrket for å frembringe fusjonsprotein-preparater for en ELISA for å bestemme om fusjonsproteinet bandt seg spesifikt til reseptoren. Foretrukne peptider som resultat av denne undersøkelse er vist i Figur 2. Disse peptidene kjennetegnes ved motivet «Xs^XsGPXeTWXyXe (SEKV. ID. NR:), hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs-standardforkortelse; Xe er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene eller de stereoisomere D-aminosyrene; X3 kan være C, A, a-amino-y-bromsmørsyre eller Hoc, hvor Hoc er homocystein; X4 kan være R, H, L eller W; X5 kan være M, F eller I; X7 kan være D, E, I, L eller V; og X8 kan være C, A, a-amino-y-bromsmørsyre eller Hoc, hvor Hoc er homocystein, forutsatt at enten X3 eller X8 er C eller Hoc.

For å komme frem til en grov indikasjon av affiniteten av peptidene ble fag-bibliotek også underkastet screening ved å benytte affinttetsseleksjon hvor peptidene konkurrerte med EPO (100 nM). Denne prosess ble i alminnelighet gjentatt i to panning-runder. I påfølgende panning-runder kan konkurranse-temperaturen (4°C til romtemperatur) og tiden (15 til 30 minutter) så vel som temperaturen (4°C til romtemperatur) av vaskeløsningene, endres for ytterligere å selektere for peptider med høy affinitet. Ved å benytte denne affintetsseleksjons-prosess ble peptider som hadde det felles motiv «X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X1oX1l>> (SEKV. ID. NR:), hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs-standardforkortelse; hver Xi, X2, X6, X9, Xi0 og X-n uavhengig er valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene eller de stereoisomere D-aminosyrene; X4 kan være R, H, L eller W; Xs kan være M, F eller I; og X7 kan være D, E, I, L eller V, isolert. I henhold til en mer foretrukket utførelsesform vil peptidet omfatte aminosyre-sekvensen X1YX2CX4X5GPX6TWX7CXgXioX11 (SEKV. ID. NR:), hvorX4 kan være R eller H; X5 kan være F eller M; X6 kan være I, L, T, M eller V; X7 er D eller V; X9 kan være G, K, L, Q, R, S eller T og Xi0 kan være A, G, P, R eller Y. I en mest foretrukket utførelsesform vil kjernepeptidet omfatte aminosyresekvensen X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X1oX11 (SEKV. ID. NR:), hvorXi kan være D, E, L, N, S, T eller V; X2 kan være A, H, K, L, M, S eller T; X4 er R eller H; X9 kan være K, R, S eller T; og Xi0 er P.

Eksempler på representative peptider med dette motiv og som ble isolert under affinitetsseleksjonsprosessen, er vist i Tabellene nedenfor.

Et annet mutagenese-bibliotek som hadde seks tilfeldige aminosyrerester i nabostilling til en 8-mer flankert av to cystein rester, ble også underkastet screening mot immobilisert EPO-R. Mutagenese-fusjonsproteinene ble på nytt «panned» sammen med den DNA som koder for disse, på immobilisert EPO-R. Fusjonsproteinene og ledsagende DNA ble deretter isolert og dyrket for å produsere fusjonsproteinpreparater for en ELISA for å bestemme hvorvidt fusjonsproteinet bandt seg spesifikt til reseptoren. Det foretrukne peptid som skrev seg fra denne undersøkelsen, hadde sekvensen GGPHHVYACRMGPLTWIC og passer således inn i kjemesekvensen «YX2X3X4X5GPX6TWX7X8», hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X2 og Xe uavhengig av hverandre, er valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene eller de stereoisomere D-aminosyrene; X3 kan være C, A, a-amino-y-bromsmørsyre eller Hoc, hvor Hoc er homocystein; X4 kan være R, H, L eller W; X5 kan være M, F eller I; X7 kan være D, E, I, L eller V; og Xfi kan være C, A, a-amino-Y-bromsmørsyre eller Hoc, hvor Hoc er homocystein, forutsatt at enten X3 eller X8 er C eller Hoc, hvor kjemesekvensen er koblet ved aminoterminalen til en enhet på seks aminosyrer, hvor hver aminosyre uavhengig er valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene eller de stereoisomere D-aminosyrene.

ICso-verdier ble beregnet for flere av de peptidene som falt innenfor det ovenfor beskrevne generelle motiv. Disse verdiene ble bestemt ved å benytte det frie peptid og er vist i Tabell 5 nedenfor. (Hvert av disse peptidene ble syntetisert uavhengig av hverandre og er amidert C-terminalt, men kunne lett fremstilles som den frie karboksysyre eller som en ester eller et annet karboksyamid).

I tillegg til det foregående ble det foretatt andre mutagenese-undersøkelser av denne høyaffinitets EPO-agonistfamilie av peptider under betingelser tilrettelagt for å anrike peptider med høyere affinitet. For anrikning av peptider med høyere affinitet, underkastes bibliotek screening, som tidligere beskrevet, ved å benytte en affinitetsseleksjonsprosess hvor peptidene konkurrerer med EPO (100 nM). Denne prosessen gjentas i alminnelighet i to panning-runder. I senere panning-runder kan konkurransetemperåturen (4°C til romtemperatur) og tiden (15 til 30 minutter) så vel som vaskeløsningens temperatur (4°C til romtemperatur) endres for ytterligere å selektere for peptider med høy affinitet. Ved anvendelse av disse teknikker ble et mutagenese-bibliotek som hadde tre tilfeldige aminosyrerester på hver side av den flankerende sekvens YXCRIGPITWVC også underkastet screening mot immobilisert EPO-R (se Figur 3). Mutagenese-fusjonsproteinene ble sammen med den DNA som koder for disse, igjen «panned» på immobilisert EPO-R. Fusjonsproteinene og ledsagende DNA ble deretter isolert og dyrket for å produsere fusjonsprotein-preparater for en ELISA for å bestemme om fusjonsproteinet bandt seg spesifikt til reseptoren. Foretrukne peptider som er resultat av denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 6.

I en annen mutagenese-undersøkelse ble et mutagenese-bibliotek hvor de sterkt konserverte restene (dvs. Y, C, G, P, T og W) var faste, de øvrige restene randomisert og 10 ytterligere rester i N-enden før tyrosinet, også underkastet screening mot immobilisert EPO-R (se Figur 4A). Mutagenese-fusjonsproteinene ble sammen med den DNA som koder for disse, igjen «panned» på immobilisert EPO-R. Fusjonsproteinene og ledsagende DNA ble deretter isolert og dyrket for å produsere fusjonsprotein-preparater for en ELISA for å bestemme om fusjonsproteinet bandt seg spesifikt til reseptoren. Foretrukne peptider som er resultat av denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 7.

I nok en annen mutagenese-undersøkelse ble et mutagenese-bibliotek hvor de sterkt konserverte restene (dvs. Y, C, G, P, T og W) var faste, de øvrige restene randomisert og 10 ytterligere rester mellom det andre cystein og (Gly)4-Ser-linkeren også underkastet screening mot immobilisert EPO-R (se Figur 4B). I dette bibliotek ble det foran de konserverte tyrosinrestene lagt inn to glycinrester for å oppnå effektiv srgnalpeptid-spaltning. Mutagenese-fusjonsproteinene ble sammen med den DNA som koder for disse, igjen «panned» på immobilisert EPO-R. Fusjonsproteinene og ledsagende DNA ble deretter isolert og dyrket for å produsere fusjonsprotein-preparater for en ELISA for å bestemme om fusjonsproteinet bandt seg spesifikt til reseptoren. Foretrukne peptider som er resultat av denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 8.

I ytterligere en annen mutagenese-undersøkelse ble et mutagenese-bibliotek hvor de sterkt konserverte restene (dvs. Y, C, G, P, T og W) var faste, med tyrosinet anbragt umiddelbart etter det første cystein, og de øvrige aminosyrene randomisert, inklusivt 4 rester N-terminalt til tyrosinet og 5 mellom det andre cystein og linkeren, også underkastet screening mot immobilisert EPO-R (se Figur 4C). Foran de N-terminale tilfeldige aminosyrene ble igjen lagt inn to glycinrester for å muliggjøre effektiv prosessering. Mutagenese-fusjonsproteinene ble sammen med den DNA som koder for disse, igjen «panned» på immobilisert EPO-R. Fusjonsproteinene og ledsagende DNA ble deretter isolert og dyrket for å produsere fusjonsprotein-preparater for en ELISA for å bestemme om fusjonsproteinet bandt seg spesifikt til reseptoren. Foretrukne peptider som er resultat av denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 9.

1 tillegg til de foregående mutagenese-undersøkelsene ble det foretatt mutagenese av peptid GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG ved å benytte et modifisert C-terminalt Lac-I display-system, hvor display-valensiteten var redusert med det formål å identifisere høyere affinitets-treff («Headpiece Dimer»). Display-systemet for Lac-I HPD (Headpiece Dimer) er beskrevet mer detaljert i US-patent 5.338.665 som

herved refereres til i foreliggende beskrivelse. I det vesentlige ble rester som var

sterkt konservert i de tidligere mutagenese-undersøkelsene (dvs. Y, 0, G, P, T og W) svakt mutert, mens de mindre konserverte restene (dvs. H, F, L og V) ble underkastet et høyere mutasjonsnivå. Fire tilfeldige rester ble lagt inn foran tyrosinresten, og sistnevnte ble også etterfulgt av én tilfeldig rest. Mutagenese-skjemaets C-terminal endte med 6 tilfeldige aminosyrer etter cysteinet. Detaljer angående bibliotek-konstruksjonen fremgår av Figur 5.

Biblioteket ble underkastet screening gjennom fire runder på «PIG-tailed» EPO-R immobilisert på mAb179, ved å benytte EPO-eluering fra runde to for å anrike med henblikk på kloner av høyere affinitet. Det resulterende DNA-innskudd ble deretter klonet som en samling inn i en maltose-bindende protein- (MBP) vektor, hvilket muliggjorde deres ekspresjon som et C-terminaft fusjonsprotein. Rå cellelysater fra tilfeldig plukkede individuelle MBP-fusjonskloner ble deretter undersøkt med henblikk på EPO-R-binding ved hjelp av en ELISA. Foretrukne peptider som skriver seg fra denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 10.

Et av de mest slående trekk ved peptidene oppnådd under bruk av Lac-I Headpiece Dimer Display-systemet er akkumuleringen av flere positive ladninger i de regioner som flankerte de konserverte cysteinene, særlig i RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV, som haren C-terminal strekning på 5 slike rester. Aminosyrer som var svakt mutagenisert (dvs. Y, C, G, P, T og W) var absolutt konserverte, mens nye motiver ble frembragt i de posisjoner som var sterkere mutert. Av særlig interesse er forekomsten av en ytterligere tyrosinrest i en rekke av peptidene (se f.eks. LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR) og forekomsten av to glutaminsyrerester mellom cysteinene i TIAQYICYMGPETWECRPSPKA.

I tillegg til de foregående mutagenese-undersøkelsene, ble det foretatt mutagenese av peptidet TIAQYICYMGPETWECRPSPKA ved å benytte et lignende modifisert C-terminalt Lac-I display-system som det tidligere beskrevne system. De restene som var sterkt konservert i tidligere mutagenese-undersøkeiser (dvs. Y, C, G, P, T og W) var faste, mens de mindre konserverte restene (dvs. H, F, L og V) ble randomisert. I tillegg ble de to glutaminsyrerestene svakt mutert. Fire randomiserte rester fortsatte tyrosinresten, idet sistnevnte også ble etterfulgt av en tilfeldig rest. C-enden av mutagenese-skjemaet endte med 6 tilfeldige aminosyrer etter cysteinet. Detaljene angående bibliotek-konstruksjonen er angitt i Figur 6.

Biblioteket ble underkastet screening gjennom tre runder på «PIG-tailed» EPO-R immobilisert på mAb179, ved å benytte EPO-eluering fra runde 2 og utover for å anrike kloner av høyere affinitet. Det ble foretatt koloniavtrykk («cotony lifts») ved probe-undersøkelse med human Fcy-EBP-reagens, etterfulgt av geit anti-human FcY-konjugert til alkalisk fosfatase, sistnevnte tilgjengelig fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Deretter ble de identifiserte HPD-plasmidene sekvensert. Peptider som skriver seg fra denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 11.

Den foregående samling av peptidsekvenser ble deretter klonet inn i en maltose-bindende protein- (MBP) vektor som muliggjorde ekspresjon av disse som et C-terminalt fusjonsprotein. Rå cellelysater fra tilfeldig plukkede individuelle MBP-fusjonskloner ble deretter undersøkt med henblikk på EPO-R-binding i en ELISA. Foretrukne peptider som skrev seg fra denne undersøkelse, er angitt nedenfor i Tabell 12.

Representative peptider som viste seg å binde spesifikt til EPO-reseptoren ble også undersøkt i celle-baserte funksjonelle tester. En test gjorde bruk av FDCP-1, en vekstfaktor-avhengig murin multipotensiell primitiv hematopoietisk progenitorcellelinje (se f.eks. Dexter et al., (1980), J. Exp. Med. 152:1036-1047) som den parentale cellelinje. Denne cellelinje kan proliferere, men ikke differensiere, når den suppleres med WEHI3-kondisjonert medium (et medium som inneholder IL-3, ATCC nummer T1B68). Den parentale cellelinje transfekteres med det humane eller murine EPO-R slik som nedenfor beskrevet, for å fremstille henholdsvis FDCP-1-hEPO-R eller FDCP-1 -mEPO-R cellelinjen. Disse transfekterte cellelinjene kan proliferere, men ikke differensiere, i nærvær av human eller murin EPO.

I korte trekk, ble cellene dyrket til halv stasjonær tetthet i nærvær av de nødvendige vekstfaktorer. Cellene ble deretter vasket i PBS og sultet i 16-24 timer i helmedium uten vekstfaktorene. Etter bestemmelse av cellenes levedyktighet, ble stamløsninger (i helmedium uten vekstfaktorene) fremstilt for å gi ca. 10<5> celler per 50 u.L. Seriefotrynninger av forbindelsen (i alminnelighet det frie løsningsfase-peptid i stedet for et fag-bundet eller på annen måte bundet eller immobilisert peptid) som skulle testes, ble foretatt i 96 brønns vevskulturplater i et sluttvolum på 50 uL per brønn. Celler (50 uL) ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert i 24-48 timer, et tidspunkt hvor de negative kontrollene skulle være døde eller hvilende. Celleproliferasjon måles deretter ved hjelp av kjent teknikk, som f.eks. en MTT-test som korrelerer med <3>H-tymidin-inkorporering som indikasjon på celleproliferasjon (se Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55). Figur 7 illustrerer resultatene av denne test med henblikk på EPO og med henblikk på peptidene angitt ovenfor i Tabell 5. Peptider som binder seg til EPO-reseptoren og oppviser aktivitet i FDCP-1/hEPO-R celle-basert bioassay, er foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen.

En annen celle-basert test utnytter TF-1 cellelinjen. Se Kitamura etat., (1989) Blood 73:375-380, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Representative resultater er vist i Figur 8. Figur 8 fremstiller virkningene av EPO og det frie peptidet VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEKV. ID. NR:) på cellulær proliferasjon av cellelinjen TF-1.

En annen celle-basert test som ytterligere illustrerer forbindelsenes evne til å virke som EPO-agonister er basert på <3>H-tymidin-inkorporering i miltceller fra fenylhydrazin-behandlede mus. Resultatene av denne test er vist i Figurene 9A-9C.

Andre biologiske tester som kan benyttes for å demonstrere virkningen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i Greenberger et al.,

(1983) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:2931-2935 (EPO-avhengig hematopoietisk progenitor-cellelinje); Quelle & Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614 (protein-tyrosinfosforylering i B6SUt.EP-celler); Dusanter-Fourt et al., (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678 (tyrosinfosforylering av EPO-reseptor i humane EPO-responderende celler); Quelle et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060 (tyrosinfosforylering av et cytosol-protein (pp 100) i FDC-ER-celler); Worthington et al.

(1987) Exp. Hematol. 15:85-92 (kolorimetrisk hemoglobinbestemmelse); Kaiho & Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120 (påvisning av hemoglobin med 2,7-diaminofluoren); Patel et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302 (ekspresjon av c- myb; Witthuhn et al., (1993) Cell 74:227-236 (assosiasjon og tyrosinfosforylering av JAK2); Leonard et al., (1993) Blood 82:1071-1079 (ekspresjon av GATA-transkripsjonsfaktorer); Ando et al., (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:9571-9575 (regulering av Gi/3-transisjon ved cyklisering av D2 og D3); og kalsiumfluks, som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

Et instrument utviklet av Molecular Devices Corp., kjent som et mikro-fysiometer, har vært rapportert som velegnet for måling av effekten av agonister og antagonister på diverse reseptorer. Grunnlaget for apparatet er målingen av endringene i surgjøringshastighet av det ekstracellulære medium som respons på reseptoraktivering.

I henhold til en foretrukket utførelsesform dimeriseres eller oligomeriseres peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, hvorved affiniteten og/eller aktiviteten av de her beskrevne lederforbindelser økes. For å undersøke hvilken effekt peptid-dimerisering/oligomerisering har på EPO-mimetisk styrke i celleproliferasjonstester, ble det syntetisert en C-terminal biotinylert analog av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (dvs. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin)).

Dette peptid ble inkubert med streptavidin i PBS i molforholdet 4:1 ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble komplekset benyttet i «PIG-tailed» EPO-R-bindingstesten for ICso-bestemmelse. Peptid som ikke var blitt komplekser! til streptavidin ble også tatt med i det samme forsøk. Pre-kompleksert peptid ble funnet å ha en ICso-verdi på 20 nM sammenlignet med ICso-verdien på 350 nM for peptidet som ikke var blitt inkubert med streptavidin. Denne mer enn 10 gangers økning i tilsynelatende affinitet, skyldes antagelig peptid-streptavidinkompleksets multivalente tilstand. Siden denne sammenligningen ble foretatt ved å benytte de frie peptid-konsentrasjonene og ikke den effektive komplekskonsentrasjon (teoretisk 4 ganger lavere) vil effekten være enda høyere.

I tillegg ble dette peptidet preinkubert med streptavidin i serumfritt HEPES-buffret RPMI i et molforhold på 4:1, som ovenfor. Komplekset ble testet på stimulering av celleproliferasjon i en FDCP-1 /hEPO-R-biotest sammen med fritt GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) og det ikke-biotinylerte parentale peptid, dvs. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Figur 10 illustrerer resultatene av testen hvor EPO-ED50-verdien av de frie peptidene var omtrent den samme (ca. 1 uM), men hvor verdien av det på forhånd dannede streptavidinkompleks var mindre enn 10 nM, en to tierpotensers reduksjon i EPO-ED50. Streptavidin hadde alene en viss liten stimulerende effekt ved de høyeste konsentrasjonene, antagelig som følge av forurensning med bakterielt endotoksin.

I tillegg ble det funnet en økning i biologisk styrke når peptidet ble dimerisert med geit anti-biotin IgG. Figur 11 illustrerer at én tierpotens reduksjon i EPO-ED50 også kan oppnås ved preinkubering av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) med renset geit anti-biotin IgG i molforholdet 2:1. Denne økning i biologisk styrke skyldes antagelig dimeriseringen av peptidet med antistoffene. Anti-biotin antistoffene hadde alene ingen effekt på cellene. Dessuten ble det registrert en 100 gangers reduksjon i EPO-ED50 med GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) streptavidinkomplekset. Ved dimertsering eller oligomerisering av lederpeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan affiniteten og/eller aktiviteten av slike peptider økes.

I henhold til en annen utførelsesform ble en dimer peptidanalog av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG inneholdende to disulfidbindinger, fremstilt ved å benytte det generelle skjema som er vist i Figur 12. Den første peptidkjeden ble satt sammen på en Tentagel-harpiks. Fmoc-Lys(Alloc) ble koblet til Knorr-linkeren, idet Alloc-gruppen ble benyttet som en ortogonal beskyttelsesgruppe. For den første peptidkjeden ble Cys(Acm) benyttet. Etter at den første peptidkjeden var fullført ble Alloc-gruppen fjernet og den andre peptidkjeden bygget på sidekjede-aminene av lysinresten. I denne peptidkjede ble Cys(trt) benyttet. Etter at syntesen var fullført ble peptidet avspaltet fra harpiksen og renset. Peptidet ble deretter cyklisert til en forbindelse som inneholdt en enkelt disulfidbinding. Deretter ble den andre disulfidbindingen dannet ved jod-oksydasjon, hvorved den bicykliske dimer ble dannet. Figurene 13 og 14 viser in vitro EPOR-binding og biologiske virkninger av dimeren. Dimerens affinitet ble testet mot «PIG-tailed» EPOR immobilisert på mAbl 79 i stripp-brønner. Resultatet av den kompetitive bindingstest ved likevekt indikerte en affinitet på ca. 2 nM, hvilket er en 200 gangers økning i forhold til verdien for det parentale peptid, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (200 nM) og 5 ganger i forhold til GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) streptavidinkomplekset. In vitro bioaktiviteten, målt ved hjelp av FDCP-1/hEPOR-celleproliferasjon, øket ca. 20 ganger fra en EC50 på 400 nM (for det parentale peptid) til 20 nM. Ved dimerisering eller oligomerisering av lederpeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan affiniteten og/eller aktiviteten av slike peptider økes vesentlig.

Peptidene ifølge oppfinnelsen eller derivater derav, kan konjugeres til forbindelser som binder til EPO-R, for å konstruere forbindelser med en affinitet for reseptoren som er større enn hver av de forbindelser som konjugatet er sammensatt av. Oppdagelsen av disse peptidene letter også identifiseringen av peptider som binder seg til det samme setet på EPO-R, siden man kan forfordele biblioteket eller panning-prosessen for å eliminere peptider med det komplementære «ikke-blokkerende» motiv.

Det foretrukne sekvensmotiv gir også mulighet for å bestemme den minimale størrelse av en EPO-agonist ifølge oppfinnelsen. Ved å benytte det «encoded synthetic library» (ESL) system som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 946.239, av 16. september, 1992, som er en CIP av serie nr. 762.522 av 18. september, 1991, eller «very large scale immobilized polymer synthesis» systemet beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 492.462, av 7. mars, 1990; 624.120 av 6. desember, 1990 og 805.727 av 6. desember, 1991, bestemmer man ikke bare den minimale størrelse av et peptid med slik aktivitet, men man kan også fremstille alle de peptider som danner den peptidgruppe som adskiller seg fra det foretrukne motiv (eller minimumsstørrelsen av vedkommende motiv) med hensyn til én, to eller flere rester. Dette peptidutvalget kan deretter underkastes screening med henblikk på evnen til å binde seg til EPO-reseptorer. Dette immobiliserte polymersyntesesystem, eller andre pepttdsyntesemetoder, kan også benyttes for å syntetisere enhver trunkeringsanalog og enhver delesjonsanalog og enhver kombinasjon av trunkerings-og delesjons-analoger av samtlige av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved hjelp av kjente klassiske metoder, som for eksempel anvendelsen av standard fastfaseteknikker. Standardmetodene innbefatter eksklusiv fastfasesyntese, partielle fastfase-syntesemetoder, fragmentkondensasjon, klassisk løsningssyntese og endog rekombinant DNA-teknikk. Se f.eks. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse. På fastfase innledes syntesen i alminnelighet fra peptidets C-terminale ende ved å benytte en a-amino-beskyttet harpiks. Et passende utgangsmateriale kan for eksempel fremstilles ved å feste den nødvendige a-aminosyre til en klormetylert harpiks, en hydroksymetyl-harpiks eller en benzhydrylamin-harpiks. En slik klormetylert harpiks selges under handelsnavnet BIO-BEADS SX-1 av Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, og fremstillingen av hydroksymetyl-harpiks er beskrevet av Bodonsky et al., 1966, Chem. Ind., (London) 38:1597. Benzhydrylamin- (BHA) harpiks har vært beskrevet av Pietta & Marshall, 1970, Chem. Commn. 650, og er kommersielt tilgjengelig fra Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, i hydrokloirdformen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan således fremstilles ved å koble en a-amino-beskyttet aminosyre til den klormetylerte harpiks, for eksempel ved hjelp av cesiumbikarbonat-katalysator, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Gisin, 1973, Heiv. Chim. Acta 56:1467. Etter den innledende kobling fjernes den a-amino-beskyttende gruppe gjennom et utvalg av reagenser som innbefatter løsninger av trifluoreddiksyre (TFA) eller hydrogenklorid (HCI) i organiske løsningsmidler ved romtemperatur.

De a-amino-beskyttende grupper er slike som på dette området har vist seg egnet for trinnvis syntese av peptider. De innbefatter beskyttelsesgrupper av acyltype (f.eks. formyl, trifluoracetyl, acetyl), aromatiske uretan-type beskyttelsesgrupper (f.eks. benzyloksykarbonyl (Cbz) og substituert Cbz), alifatiske uretan-beskyttelsesgrupper (f.eks. t-butyloksykarbonyl (Boe), isopropyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og beskyttelsesgrupper av alkyl-type (f.eks. benzyl, trifenylmetyl). Fmoc er en foretrukket beskyttelsesgruppe. Den sidekjede-beskyttende gruppe (i alminnelighet etere, estere, trityl, PMC og lignende) forblir intakt under koblingen og spaltes ikke av under avbeskyttelsen av den amino-terminale beskyttelsesgruppe eller under kobling. Den sidekjede-beskyttende gruppe må kunne fjernes etter fullført syntese av det endelige peptid og under reaksjonsbetingelser som ikke vil endre det tilsiktede peptid.

De sidekjede-beskyttende grupper for Tyr omfatter tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, Cbz, Z-Br-Cbz og 2,5-diklorbenzyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Asp omfatter benzyl, 2,6-diklorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Thr og Ser omfatter acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz. De sidekjede-beskyttende grupper for The og Ser er benzyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Arg omfatter nvtro, tosyl (Tos), Cbz, adamentyloksykarbonyl, mesitoylsulfonyl (Mts) eller Boe. De sidekjede-beskyttende grupper for Lys omfatter Cbz, 2-klorbenzyloksykarbonyl (2-CI-Cbz), 2-brombenzyl-oksykarbonyl (2-BrCbz), Tos eller Boe.

Etter fjerning av den a-amino-beskyttende gruppe kobles de gjenværende beskyttede aminosyrer trinnvis i den ønskede rekkefølge. Hver beskyttet aminosyre omsettes i alminnelighet i ca. tre gangers overskudd ved å benytte en passende karboksytgruppe-aktivator, som f.eks. 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyl-uronium-heksafluorfosfat (HBTU) eller dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i løsning, for eksempel i blandinger av metylenklorid (CH2CI2), dimetylformamid (DMF).

Etter at den ønskede aminosyresekvens er fullført, frakobles det ønskede peptid fra harpiks-bæreren ved behandling med et reagens som f.eks. trifluoreddiksyre (TFA) eller hydrogenfluorid (HF), som ikke bare spalter peptidet fra harpiksen, men også spalter alle gjenværende sidekjede-beskyttende grupper. Når den klormetylerte harpiks benyttes, resulterer hydrogenfluorid-behandling i dannelse av de frie peptidsyrene. Når benzhydrylamin-harpiksen benyttes, resulterer hydrogenfluorid-behandling direkte i det frie peptidamid. Når alternativt den klormetylerte harpiks benyttes, kan det sidekjede-beskyttede peptid frakobles ved behandling av peptid-harpiksen med ammoniakk for å gi det ønskede sidekjede-beskyttede amid, eller med et alkylamin for å gi et sidekjede-beskyttet alkylamid eller dialkylamid. Sidekjede-beskyttelsen fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amider, alkylamider eller dialkylamider.

Ved fremstilling av esterne ifølge oppfinnelsen, anvendes de harpikser som er benyttet til å fremstille peptidsyrene, og det sidekjede-beskyttede peptid avspaltes med base og den passende alkohol, dvs. metanol. Sidekjede-beskyttende grupper fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å oppnå den ønskede ester. Disse fremgangsmåtene for fastfase-peptidsyntese er velkjent på området og ytterligere beskrevet i Stewart, Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman & Co., San Francisco, 1969).

Fremgangsmåtene kan også benyttes for å syntetisere peptider hvor andre aminosyrer enn de 20 naturlig forekommende, genetisk kodede aminosyrene, er erstattet i én, to eller flere posisjoner av en hvilken som helst av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan naftylamin benyttes i stedet for tryptofan, hvilket forenkler syntesen. Andre syntetiske aminosyrer som kan substitueres inn i peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er bl.a. L-hydroksypropyl, L-3,4-dihydroksyfenylalanyl, 5-aminosyrer som L-5-hydroksylysyl og D-5-metylalanyl, L-a-metylalanyl, B-aminosyrer og isokinolyl. D-aminosyrer og ikke-naturlig forekommende syntetiske aminosyrer kan også inkorporeres i peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Man kan erstatte de naturlig forekommende sidekjedene i de 20 genetisk kodede aminosyrene (eller D-aminosyrene) med andre sidekjeder, for eksempel med grupper som alkyl, lavere alkyl, cyklisk 4-, 5-, 6- til 7-leddet al kyl, amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy, karboksy og lavere ester-derivater derav, og med 4-, 5-, 6- til 7-leddede heterocykliske grupper. Spesielt kan det benyttes prolinanaloger hvor ringstørrelsen av prolinresten er endret fra 5 ledd til.

4, 6 eller 7 ledd. Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og om umettede, være aromatiske eller ikke-aromatiske.

Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og om umettede, være aromatiske eller ikke-aromatiske. Heterocykliske grupper inneholder fortrinnsvis ett eller flere nitrogen-, oksygen- og/eller svovel-heteroatomer. Eksempler på slike grupper er bl.a. furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, isotiazolyl, isoksazolyl, morfolinyl (f.eks. morfolino), oksazolyl, piperazinyl (f.eks. 1-piperazinyl), piperidyl (f.eks. 1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (f.eks. 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, tiadiazolyl, tiazolyl, tienyl, tiomorfolinyl (f.eks. tiomorfolino) og triazolyl. Disse heterocykliske gruppene kan være substituerte eller usubstituerte. Når en gruppe er substituert kan substituenten være alkyl, alkoksy, halogen, oksygen eller substituert eller usubstituert fenyl.

Man kan også lett modifisere peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse ved fosforylering, og andre fremgangsmåter for fremstilling av peptid-derivater av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i Hruby ef a/.<42>. Peptid-forbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener således også som basis for fremstilling av peptid-mimetika med lignende biologisk aktivitet.

Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, inklusivt peptid-mimetika, kan kovalent modifiseres til én eller flere av et utvalg ikke-proteinaktige polymerer, f.eks. polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkener, som beskrevet i US-patent 4.640.835; US-patent 4.496.689; US-patent 4.301.144; US-patent 4.670.417; US-patent 4.791.192; eller US-patent 4.179.337, som alle med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse.

Fagmannen vil kjenne til det utvalg av teknikker som er tilgjengelig for konstruksjon av peptid-mimetika med den samme eller en lignende ønsket biologisk virkning som den tilsvarende peptidforbindelse, men med gunstigere virkning enn peptidet med hensyn til løselighet, stabilitet og følsomhet for hydrolyse og proteolyse. Se for eksempel Morgan & Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989). I det følgende beskrives fremgangsmåter for fremstilling av peptid-mimetika modifisert ved den N-terminale aminogruppe, den C-terminale karboksylgruppe og/eller ved forandring av én eller flere av amidokoblingene i peptidet til en ikke-amidokobling. Det er underforstått at to eller flere slike modifikasjoner kan kobles i strukturen av ett peptid-mimetikum (f.eks. modifikasjon i den C-terminale karboksylgruppe og inklusjon av en CH2-karbarnatkobling mellom to aminosyrer i peptidet).

Peptidene syntetiseres i alminnelighet som den frie syre, men kan som nevnt ovenfor, lett fremstilles som amidet eller esteren. Man kan også modifisere amino-og/eller karboksy-enden av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen for å fremstille andre forbindelser ifølge oppfinnelsen. Modifikasjoner av aminoenden omfatter metylering (dvs. -NHCH3 eller -NH(CH3)2), acetylering, addisjon av en karbobenzoylgruppe eller blokkering av aminoenden med en hvilken som helst blokkerende gruppe som inneholder en karboksylatfunksjon definert ved RCOO-, hvor R er valgt fra gruppen bestående av naftyl, akridinyl, steroidyl og lignende grupper. Karboksyende-modifikasjoner innbefatter erstatning av den frie syre med en karboksamidgruppe eller dannelse av et cyklisk laktam ved karboksyenden for å innføre strukturelle spenninger.

Aminoende-modifikasjoner er nevnt ovenfor og innbefatter alkylering, acetylering, addisjon av en karbobenzoylgruppe, dannelse av en succinimidgruppe, etc. Nærmere bestemt kan den N-terminale aminogruppe deretter omsettes som følgen

(a) for å danne en amidgruppe med formel RC(0)NH-, hvor R er som definert ovenfor, ved omsetning med et syrehalogenid [f.eks. RC(0)CI] eller med syreanhydrid. Reaksjonen utføres i alminnelighet ved å bringe ekvimolare mengder eller et overskudd (f.eks. ca. 5 ekvivalenter) av et syrehalogenid i kontakt med

peptidet i et inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan) som fortrinnsvis inneholder et overskudd (f.eks. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisoprdpyletylamin, for å oppfange syren som utvikles under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter). Alkylering av den terminale

aminogruppe for å gi en lavere alkyl-N-substitusjon med påfølgende omsetning med et syrehalogenid som ovenfor beskrevet, vil gi N-alkylamidgruppen med formel RC(0)NR-;

(b) for å danne en succinimidgruppe ved omsetning med ravsyreanhydrid. Som tidligere kan en tilnærmet ekvimolar mengde eller et overskudd av ravsyreanhydrid (f.eks. ca. 5 ekvivalenter) benyttes, og aminogruppen omdannes til succinimidet etter velkjente metoder, herunder anvendelse av et overskudd (f.eks. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin, i et egnet inert løsningsmiddel (f.eks. diklormetan). Se for eksempel Wollenberg, et al., US-patent 4.612.132, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Det er underforstått at succingruppen kan erstattes med for eksempel C2-C6-alkyl-eller -SR-substituenter som fremstilles på konvensjonell måte, for å gi substituerte succinimider i peptidets N-ende. Slike alkyl-substituenter fremstilles ved omsetning av et lavere olefin (C2-C6) med maleinsyreanhydrid som beskrevet av Wollenberg et al., supra, og -SR-substituenter fremstilles ved omsetning av RSH med maleinsyreanhydrid, hvor R er som definert ovenfor; (c) for å danne en benzoyloksykarbonyl-NH- eller en substituert benzyloksykarbonyl-NH-gruppe ved omsetning med ca. en ekvivalent mengde eller et overskudd av CBZ-CI (dvs. benzoyloksykarbonylklorid) eller et substituert CBZ-CI i et passende inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), som fortrinnsvis inneholder et tertiært amin for å oppfange syren som utvikles under reaksjonen; (d) for å danne en sulfonamidgruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-S(0)2CI i et egnet inert fortynningsmiddel (diklormetan) for å omdanne det terminale amin til et sulfonamid, hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd av tertiært amin (f.eks. 10 ekvivalenter) som f.eks. diisopropyletylamin, for å oppfange syren som utvikles under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter); (e) for å danne en karbamatgruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-OC(0)CI eller R-OC(0)OC6H4-p-N02 i et egnet inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan) for å omdanne det terminale amin til et karbamat, hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin, for å oppfange syren som dannes under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter); og (f) for å danne en ureagruppe ved omsenting med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-N=C=0 i et egnet inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan) for å omdanne det terminale amin til en ureagruppe (dvs. RNHC(O)NH-) hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, som f.eks. diisopropyletylamin. Reaksjonsbetingelsene er ellers konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i ca. 30 minutter).

I tillegg, eller alternativt, kan C-enden modifiseres. Ved fremstilling av peptid-mimetika hvor den C-terminale karboksylgruppe er erstattet med en ester (dvs. -C(0)OR, hvor R er som definert ovenfor), anvendes de harpiksene som er benyttet til å fremstille peptidsyrene, og det sidekjede-beskyttede peptid avspaftes med base og den passende alkohol, f.eks. metanol. Sidekjede-beskyttende grupper fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å oppnå den ønskede ester. Ved fremstilling av peptid-mimetika hvor den C-terminale karboksylgruppe er erstattet med amidet -C(0)NR<3>R<4>, benyttes en benzylhydrylamin-harpiks som den faste bærer for peptid-syntesen. Etter fullført syntese resulterer hydrogenfluorid-behandling for å frigjøre peptidet fra bæreren, direkte i det frie peptidamid (dvs. C-enden er -C(0)NH2). Bruk av den klormetylerte harpiks under peptidsyntesen koblet med omsetning med ammoniakk for å avspalte det sidekjede-beskyttede peptid fra bæreren, fører til det frie peptidamid, og omsetning med et alkylamin eller et dialkylamin gir et sidekjede-beskyttet alkylamid eller dialkylamid (dvs. C-enden er -C(0)NRR\ hvor R og R<1> er som definert ovenfor). Sidekjede-beskyttelsen fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amidene, alkylamidene eller dialkylamidene.

I en annen alternativ utførelsesform kan den C-terminale karboksylgruppe eller en C-terminal ester, induseres til cyklisering gjennom intern fortrengning av -OH eller esteren (-OR) av henholdsvis karboksylgruppen eller esteren med den N-terminale aminogruppe for å danne et cyklisk peptid. Etter syntese og spaltning for å gi peptidsyren, omdannes for eksempel den frie syre til en aktivert ester ved hjelp av en passende karboksylgruppe-aktivator, så som dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i løsning, for eksempel i blandinger av metylenklorid (CH2CI2) og dimetylformamid (DMF). Det cykliske peptid dannes deretter ved intern fortrengning av den aktiverte ester med det N-terminale amin. Intern cyklisering kan i motsetning til polymerisering, forsterkes ved bruk av meget fortynnede løsninger. Slike fremgangsmåter er velkjente på området. Man kan også cyklisere peptidene ifølge oppfinnelsen, eller inkorporere en desamino- eller deskarboksy-rest i peptidets ender slik at det ikke er noen terminal amino- eller karboksyl-gruppe, for å minske følsomheten overfor proteaser eller for å begrense peptidets konformasjon. C-terminale funksjonelle grupper av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy og de lavere ester-derivater derav, samt farmasøytisk akseptable salter derav.

Andre fremgangsmåter for fremstilling av peptrd-derivater av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i Hruby et al., Biochem J. 268(2):249-262 (1990), som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse. Peptid-forbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener således også som strukturmodeller for ikke-peptidiske forbindelser med lignende biologisk virkning. Fagmannen vil innse at det forefinnes en rekke teknikker for konstruksjon av forbindelser med den samme eller tilsvarende ønsket biologisk virkning som lederpeptidforbindelsen, men med mer fordelaktig aktivitet enn lederforbindelsen med hensyn til løselighet, stabilitet og følsomhet for hydrolyse og proteolyse. Se Morgan & Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989), som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse. Disse teknikkene innbefatter erstatning av peptidskjelettet med et skjelett sammensatt av fosfonater, amidater, karbamater, sulfonamider, sekundære aminer og N-metylaminosyrer.

Peptid-mimetika hvor én eller flere av peptidylkoblingene [-C(0)NH-] er erstattet med slike koblinger som en -CH2-karbamatkobling, en fosfonatkobling, en

-CH2-sulfonamidkobling, en ureakobling, en sekundær amin-(-CH2NH-) kobling og en alkylert peptidylkobling [-C(0)NR<6->, hvor R6 er lavere alkyl] fremstilles ved konvensjonell peptidsyntese ved kun å substituere en passende beskyttet aminosyreanalog med aminosyre-reagenset på det passende tidspunkt under syntesen. Egnede reagenser innbefatter for eksempel aminosyreanaloger hvor aminosyrens karboksylgruppe er erstattet med en egnet del for dannelse av én av ovennevnte koblinger. Dersom man for eksempel ønsker å erstatte en -C(0)NR-kobling i peptidet med en -CH2-karbamatkobling (-CH2OC(0)NR-), reduseres først karboksylgruppen (-COOH) i en passende beskyttet aminosyre til -CH2OH-gruppen som så ved hjelp av konvensjonelle metoder, omdannes til en -OC(0)CI-funksjon eller en para-nitrokarbonat -OC(0)0-C6H4-p-N02-funksjon. Omsetning av en slik funksjonell gruppe med det frie amin eller med et alkylert amin på N-terminalen av det delvis fremstillede peptid som finnes på den faste bærer, fører til dannelsen av en -CH2OC(0)NR-kobling. Angående en mer detaljert beskrivelse av dannelsen av slike

-CH2-karbamatkoblinger, se Cho et al., Science, 261:1303-1305 (1993).

Tilsvarende kan erstatning av en amidokobling i peptidet med en fosfonatkobling, oppnås som beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/943.805, 08/081.577 og 08/119.700, som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse.

Erstatning av en amidokobling i peptidet med en -CH2-sulfonamidkobling kan oppnås ved å redusere karboksylgruppen (-COOH) i en passende beskyttet aminosyre, til -CH2OH-gruppen, idet hydroksylgruppen deretter omdannes til en passende utgående gruppe, så som en tosylgruppe, ved hjelp av konvensjonelle metoder. Omsetning av det tosylerte derivat, for eksempel med tioeddiksyre og påfølgende hydrolyse og oksydativ klorering, vil gi den -CH2-S(0)2CI-funksjonelle gruppe som erstatter karboksylgruppen av den forøvrig passende beskyttede aminosyre. Anvendelse av denne passende beskyttede aminosyreanalog ved peptidsyntese, bevirker innføring av en -CH2S(0)2NR-kobling som erstatter amidokoblingen i peptidet og således gir et peptid-mimetikum. Angående en mer fullstendig beskrivelse av omdannelsen av aminosyrens karboksylgruppe til en -CH2S(0)2CI-gruppe, se for eksempel Weinstein, Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, bd. 7. s. 267-357, Marcel Dekker, Inc., New York, (1983) som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse.

Erstatning av en amidokobling i peptidet med en ureakobling kan oppnås som beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/147.805.

Sekundære aminkoblinger hvor en -CH2NH-kobling erstatter amidokoblingen i peptidet, kan fremstilles ved for eksempel å benytte en passende beskyttet dipeptidanalog, hvor karbonylbindingen av amidokoblingen ved konvensjonelle metoder er redusert til en CH2-gruppe. Når det for eksempel gjelder diglycin vil reduksjon av amidet til aminet, etter avbeskyttelse, gi H2NCH2CH2NHCH2COOH som så benyttes i N-beskyttet form i den neste koblingsreaksjon. Fremstillingen av slike analoger ved reduksjon av karbonylgruppen i dipeptidets amidokobling er velkjent på området.

Den passende beskyttede aminosyreanalog anvendes innen konvensjonell peptidsyntese på samme måte som den tilsvarende aminosyre ville bli benyttet. For eksempel benyttes i alminnelighet ca. 3 ekvivalenter av den beskyttede aminosyreanalog for denne reaksjon. Det benyttes et inert organisk fortynningsmiddel, som f.eks. metylenklorid eller DMF, og når det som biprodukt av reaksjonen utvikles en syre, bør løsningsmidlet i alminnelighet inneholde et overskudd av et tertiært amin for å oppfange syren som utvikles under reaksjonen. Et særlig foretrukket tertiært amin er diisopropyletylamin som i alminnelighet benyttes i ca. 10 gangers overskudd. Reaksjonen resulterer i at det i peptid-mimetikumet inkorporeres en aminosyreanalog som har en ikke-peptidylkobling. En slik substitusjon kan gjentas slik at fra null til samtlige amidobindinger i peptidet er erstattet med ikke-amidobindinger.

Man kan også cyklisere peptidene ifølge oppfinnelsen eller inkorporere en desamino- eller deskarboksy-rest i peptidets ender slik at det ikke forekommer noen terminal amino- eller karboksyl-gruppe, for å minske følsomheten for proteaser eller begrense peptidkonformasjonen. C-terminale funksjonelle grupper av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy, og deres lavere ester-derivater, samt farmasøytisk akseptable salter derav.

I henhold til en annen foretrukket utførelsesform vil restene Xs og Xs uavhengig av hverandre, bli valgt fra gruppen av C og Hoc. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan derved eksistere i cykltsert form med en intramolekylær disulfidbinding. Alternativt kan det dannes en intermolekylær disutfidbinding for å gi en dimer forbindelse. Disse intramolekylære eller intermolekylære disulfid-derivatene kan gjengis skjematisk som:

hvor m og n uavhengig er 1 eller 2.

Andre utførelsesformer av denne oppfinnelse gir analoger av disse disulfid-derivatene hvor ett av svovelatomene er erstattet med en CH2-gruppe eller en annen isoster for svovel. Disse analogene kan fremstilles fra forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor den ene av X3 eller Xs er C eller Hoc og den andre er cc-amino-y-smørsyre, via en intramolekylær eller intermolekylær fortrengning, ved å benytte kjente fremgangsmåter som vist nedenfor:

hvor p er 1 eller 2. Fagmannen vil lett innse at denne fortrengning også kan skje ved bruk av andre homologer av a-amino-Y-smørsyre og homocystein.

I tillegg til de foran omtalte cykliserings-strategier, kan andre ikke-disulfidpeptid-cykliseringsstrategier benyttes. Slike alternative cykliseringsstrategier innbefatter for eksempel amid-cykliseringsstrategier så vel som cykliseringsstrategier hvor det inngår dannelse av tioeter-bindinger. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan således eksistere i en cyklisert form med enten en intramolekylær amidbinding eller med en intramolekylær tioeterbinding. For å illustrere muligheten av amid-cykliseringsstrategien ble det syntetisert et peptid basert på ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg, hvor det første cystein ble erstattet med lysin, det andre cystein ble erstattet med glutaminsyre, og en cyklisk monomer ble dannet gjennom en amidbinding mellom disse to restenes sidekjeder. I tillegg til å illustrere muligheten av tioeter-cykliseringsstrategien, ble det syntetisert et peptid basert på ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg, hvor det første cystein ble erstattet med lysin og hvor det ble dannet en cyklisk monomer gjennom en tioeterkobling mellom lysinrestens sidekjeder og det C-terminale cystein. I tillegg til disulfid-cykliseringsstrategier kan både amid-cykliseringsstrategier og tioeter-cykliseringsstrategier lett benyttes til å cyklisere forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Som et alternativ kan peptidets aminoende avsluttes med en alfa-substituert eddiksyre, hvor alfa-substituenten er en utgående gruppe, så som en a-halogen-eddiksyre, for eksempel a-kloreddiksyre, a-bromeddiksyre eller a-jodeddiksyre. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hvor X3 er C eller Hoc, kan cykliseres ved fortrengning av den utgående gruppe med X3-restens svovel. Se f.eks. Barker et al., (1992) J. Med. Chem., 35:2040-2048 og Or et al., (1991) J. Org. Chem., 56:3146-3149, som herved med hele sitt innhold refereres til i foreliggende beskrivelse.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan benyttes in vitro som unike hjelpemidler for forståelse av den biologiske rolle av EPO, inklusivt vurderingen av de mange faktorer som antas å påvirke, og bli påvirket av, produksjonen av EPO og bindingen av EPO til EPO-R (f.eks. mekanismen for EPO-signaloverføring/-reseptoraktivering). De foreliggende forbindelser er også anvendelige ved utvikling av andre forbindelser som binder seg til EPO-R ved at foreliggende forbindelser gir viktig SAR (structure-activity relationship) informasjon som letter denne utviklingen.

På grunnlag av deres evne til å binde seg til EPO-reseptorene kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse dessuten benyttes som reagenser for påvisning av EPO-reseptorer på levende celler, fikserte celler, i biologiske væsker, i vevs-homogenater, i rensede, naturlige biologiske materialer, etc. Ved for eksempel å merke slike peptider kan man identifisere celler som på deres overflater har EPO-R. På grunnlag av deres evne til å binde EPO-reseptoren kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse dessuten benyttes ved in situ farving, FACS (fluorescence-activated cell sorting), western blotting, ELISA (enzyme-linked immunoadsorptive assay), etc. Dessuten kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse ut fra deres evne til å binde seg til EPO-reseptorer, benyttes ved reseptor-rensing eller ved rensing av celler som uttrykker EPO-reseptorer på celleoverflaten (eller innenfor permeabiliserte celler).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også utnyttes som kommersielle forskningsreagenser for forskjellige medisinske forsknings- og diagnose-formål. Slike anvendelser kan innbefatte, men er ikke begrenset til: (1) anvendelse som en kalibreringsstandard for kvantifisering av aktiviteter av EPO-agonistkandidater i en rekke funksjonelle tester; (2) anvendelse som blokkeringsreagenser ved randomisert peptid-screening, dvs. ved leting etter nye familier av EPO-reseptor-peptidligander, kan peptidene benyttes til å blokkere gjenvinningen av EPO-peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse; (3) anvendelse ved ko-krystalliseringen med EPO-reseptor, dvs. peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse vil muliggjøre dannelse av krystaller bundet til EPO-reseptoren for anvendelse ved reseptor/peptid-struktur røntgenkrystallografi; (4) anvendelse for å måle erytrocytt-forløpercellers evne til å differensiere og derved stimulere induksjonen av globinsyntese og økning av syntesen av hem-komplekset og antallet av ferritin-reseptorer; (5) anvendelse for å opprettholde proliferasjon og vekst av EPO-avhengige cellelinjer, så som FDCP-1-mEPO-R- og TF-1-cellelinjene; og (6) andre forsknings- og diagnose-anvendelser, hvor EPO-reseptoren fortrinnsvis aktiveres eller hvor slik aktivering lettvint kalibreres mot en kjent mengde av en EPO-agonist, og lignende.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også administreres til varmblodige dyr, inklusivt mennesker, for å stimulere bindingen av EPO til EPO-R in vivo. Det beskrives fremgangsmåter for terapeutisk behandling av forstyrrelser assosiert med EPO-svikt, og som omfatter administrering av en forbindelse ifølge oppfinnelsen i tilstrekkelige mengder til å stimulere EPO-R og dermed lindre symptomer som er assosiert med in vivo EPO-svikt. For eksempel vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen kunne finne anvendelse for fremstilling av en farmasøytisk blanding ved behandlingen av slutt-trinnet i nyresvikt/dialyse; anemi assosiert med AIDS, anemi assosiert med kronisk inflammatorisk sykdom (f.eks. reumatoid artritt og kronisk tarminflammasjon), autoimmunsykdom og maligniteter; og for økning av antallet røde blodlegemer hos en pasient før kirurgiske inngrep.

Andre utførelsesformer består i administrering av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse til behandling av forstyrrelser som ikke kjennetegnes ved lavt eller nedsatt antall røde blodlegemer, for eksempel som en forbehandling før transfusjoner. Dessuten kan administrasjon av forbindelsene ifølge oppfinnelsen resultere i en nedgang i blødningstid og således finne anvendelse ved administrering til pasienter før kirurgiske inngrep eller for indikasjoner hvor det forventes blødning. Dessuten vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen finne anvendelse ved aktiveringen av megakaryocytter.

Siden det har vært vist at EPO har en mitogen og en kjemotaktisk effekt på vaskulære endotelceller, så vel som en effekt på sentrale kolinerge neuroner (se f.eks. Amagnostou et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:5978-5982 og Konishi et al., (1993) Brain Res. 609:29-35) vil forbindelsene ifølge oppfinnelsen også finne anvendelse ved behandling av en rekke vaskulære forstyrrelser, så som forbedring av sårtilheling, vekst av kollaterale koronare blodkar (som f.eks. de som måtte forekomme etter myokardinfarktasjon), traumer og post-vaskulær transplantasjons-behandling, samt en rekke neurologiske forstyrrelser, som i alminnelighet kjennetegnes ved lave absolutte nivåer av acetylcholin eller lave relative nivåer av acetylcholin sammenlignet med andre neuroaktive substanser, f.eks. neuro-transmittere.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter således farmasøytiske blandinger som som virkestoff, omfatter minst ett av peptidene eller andre forbindelser ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk bærer eller fortynner. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres ved peroral, parenteral (intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs (i.v.) eller subkutan injeksjon), transdermal (enten passiv eller ved å benytte iontoforese eller elektroporering), transmukosal (nasal, vaginal, rektal eller sublingval), administrering eller ved anvendelse av bionedbrytbare implantater og kan formuleres i doseringsformer egnet for de respektive administrasjonsmåter.

Faste doseringsformer for peroral administrering er bl.a. kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faste doseringsformer er virkestoffet blandet med minst én inert farmasøytisk akseptabel bærer, så som sukrose, laktose eller stivelse. Slike doseringsformer kan også omfatte, hvilket også er normal praksis, ytterligere substanser utenom inerte fortynningsmidler, f.eks. glattemidler, så som magnesium-stearat. Når det gjelder kapsler, tabletter og piller, kan doseringsformene også omfatte buffere. Tabletter og piller kan dessuten fremstilles med enteriske overtrekk.

Flytende doseringsformer for peroral administrering innbefatter farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper, samt miksturer som inneholder inerte fortynningsmidler som vanligvis benyttes på området, f.eks. vann. Foruten slike inerte fortynningsmidler kan blandingene også innbefatte hjelpestoffer, så som fuktemidler, emulgerings- og suspenderingsmidler, samt søtningsmidler, smaksforbedrende midler og parfymerende midler.

Preparater for parenteral administrering innbefatter sterile, vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige løsningsmidler eller bærere, er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, som olivenolje og maisolje, gelatin og injiserbare organiske estere som f.eks. etyloleat. Slike doseringsformer kan også inneholde hjelpestoffer som f.eks. konserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmidler. De kan steriliseres for eksempel ved filtrering gjennom et filter som holder igjen bakterier, ved inkorporering av steriliseringsmidler i blandingene, ved bestråling av blandingene eller ved oppvarming av blandingene. De kan også fremstilles ved å benytte sterilt vann, eller et annet sterilt injiserbart medium, umiddelbart før bruk.

Blandinger for rektal eller vaginal administrering er fortrinnsvis suppositorier som i tillegg til virkestoffet kan inneholde hjelpestoffer som kakaosmør eller supposrtorievoks. Blandinger for nasal eller sublingval administrering fremstilles også med vanlige velkjente hjelpestoffer.

Virkestoffdosen i blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan varieres. Det er imidlertid nødvendig at mengden av virkestoffet velges slik at det oppnås en passende doseringsform. Dosen som velges avhenger av den ønskede terapeutiske virkning, av administrasjonsmåte og av den varighet av behandlingen som ønskes.

I alminnelighet administreres døgndoser på mellom 0,001 og 10 mg/kg kroppsvekt til pattedyr.

Som det vil fremgå av beskrivelsen ovenfor, har foreliggende oppfinnelse et bredt anvendelsesområde. De etterfølgende eksempler er.derfor bare ment som illustrasjon.

EKSEMPEL 1

Fastfase-peptidsyntesse

Forskjellige peptider ifølge oppfinnelsen ble syntetisert ved å benytte Merrifield fastfase-teknikk (se Stewart, J.M., & Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utg. (Pierce Chemical, Rockford, IL, 1984)) på et Milligen/Biosearch 9600 automatisert instrument. Den anvendte harpiks var PAL (Milligen/Bioserach) som er et kryssbundet polystyren med 5-(4'-Fmoc-aminometyl-3,5'-dirnetoksyfenoksy)-valeriansyre som linker. Anvendelsen av PAL-harpiks resulterer i en karboksyl-terminal amid-funksjon etter at peptidet er spaltet fra harpiksen. Primær amin-beskyttelse på aminosyrer ble oppnådd med F-moc, og beskyttelsesgrupper for sidekjeder var t-butyl for serin og tyrosin-hydroksylgrupper, trityl for glutaminamider og Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkromansulfonat) for argininguanidinogruppen. Hver enkelt kobling ble foretatt enten i én eller to timer med BOP (benzotriazolyl-N-okstris-dimetylaminofosfonium-heksafluorfosfat) og HOBt (1 -hydroksybenztriazol).

Under syntesen av peptider med en amidert karboksyende ble det fullt sammensatte peptid avspaltet med en blanding av 90% trifluoreddiksyre, 5% etanditiol og 5% vann, til å begynne med ved 4°C og gradvis økende til romtemperatur i løpet av 1,5 timer. Det avbeskyttede produkt ble f raf i It re rt fra harpiksen og utfelt med dietyleter. Etter grundig tørking ble produktet renset ved omvendt-fase HPLC på C18 med en gradient av acetonitril/vann i 0,1% trrfluor-eddiksyre.

EKSEMPEL 2

Biotester

A. FDCP-1/mEPO-R

FDCP-1/mEPO-R-cellene (10<5>) ble dyrket til halv stasjonær tetthet i nærvær av vekstfaktorer (2,5 nM EPO). Cellene ble vasket to ganger i PBS og deretter sultet i 24 timer i helmedium minus vekstfaktorer.

Cellenes levedyktighet ble bestemt ved trypanblått-farving. Forråd i helmedium minus vekstfaktor ble fremstilt for å gi det ønskede celleantall per 50 uL. Testforbindelsen ble fortynnet to ganger i 96 brønns vevskulturplater (50 jiL sluttvolum per brønn).

Celler (50 ul per brønn) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 24-48 timer (idet de negative kontroller skulle dø). Celleproliferasjon ble bestemt ved en MTT-test.

B. TF-1

Fremgangsmåten beskrevet av Kitamura etat., (Blood 73:375-380 (1989), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) i forbindelse med cellelinjen TF-1, hvis vekst er EPO-avhengig, ble også foretatt for å demonstrere virkningene av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som EPO-agonister. Representative resultater er vist i Figur 8. Figur 8 viser virkningene av EPO og peptidet VGNYMCHFGPITWVCRPGGG på cellulær proliferasjon av cellelinjen TF-1.

C. Miltcelleproliferasjon

Fremgangsmåten beskrevet i Krystal (Exp. Hematol. 11:649-660 (1983), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) for en mikro-bestemmelse basert på <3>H-tymidin-inkorporering i miltceller, ble også benyttet for å fastslå at forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tjene som EPO-agonister. I korte trekk ble B6C3F1 -mus daglig i løpet av 2 dager, injisert fenylhydrazin (60 ng/kg). Den tredje dagen ble miltceller uttatt og deres evne til å proliferere i løpet av 24 timer ved bruk av en MTT-test fastslått. Fotografier som viser proliferasjonen av representative populasjoner av miltceller, er vist i Figur 9A (kontroll), 9B (behandlet med 500 pM EPO) og 9C (behandlet med 25 fiM GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG) ved en forstørrelse på 200X.

D. Cellulær proliferasjon: Peptid-avhengig vekst av den EPO-responderende cellelinje, FDC-P1/ER

1. Materialer og metodikk

a. Prøve-tilberedning: peptider ble resuspendert i DMSO som en 1 x 10"<2> M stamløsning og dekadisk seriefortynnet for å frembringe følgende 100X løsningen

2 uL av hver stamløsning ble tilsatt i et totalvolum på 200 uL til en cellebrønn som beskrevet nedenfor, for å frembringe følgende sluttkonsentrasjoner:

b. Celleproliferasjonstest:

i. cellekilde: FDC-P1/ER (Dexter et al., J. Exp. Med. (1980) 152:1036-1047, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) er en godt karakterisert ikke-transformert murin cellelinje avledet fra benmarg, hvor erytropoietin-reseptoren er blitt stabilt transfektert. Cellene oppviser EPO-avhengig proliferasjon. c. Forsøksprotokoll: celler holdt i RPM11640/10% føtalt bovint serum/antibiotika og 10 U/mL erytropoietin ble dyrket til stasjonær fase. Cellene ble høstet og resuspendert i ferskt medium uten vekstfaktor (erytropoietin) i 24 timer. Cellene ble tellet og resuspendert i en konsentrasjon på 800.000 celler/mL. Hver brønn ble tilsatt ca. 40.000 celler (50 uL) i en 96 brønns mikrotiterplate. Peptid ble tilsatt til hver av tre parallellbrønner. Det ble foretatt en standard dose/respons-bestemmelse med hver peptidserie. Etter inkubering i 42 timer (=2 dobling) ble hver brønn pulset med 1 ^Ci/brønn tymidin. Cellene ble inkubert i ytterligere 6 timer og cellene på dette tidspunkt høstet og tellet for å fastslå tymidin-inkorporering som en indikator på celleproliferasjon. d. Resultater: peptidene evalueres både for erytropoietin-reseptorcellelinjen og den parentale ikke-reseptorbærende cellelinje. I de fleste tilfellene er peptidet evaluert for en trunkert human erytropoietin-reseptorcellelinje. Resultatene er uttrykt som den peptidmengde som fordres for å gi halvparten av den maksimale aktivitet som oppnås med rekombinant erytropoietin. Representative resultater er gjengitt i tabellform sammen med de relative bindingsdata (se Tabell 17-21, nedenfor).

E. Tyrosinfosforylering: peptid-indusert tyrosinfosforylering av erytropoietinreseptor og intracellulære proteiner

1. Materialer og metodikk

a. Prøveforberedning: peptidet ble resuspendert i DMSO for å gi et konsentrat på 1 x 10'<2>M.

b. Forsøksprotokoll: FDC-P1/muER-celler holdt i RPM11640/10% føtalt bovint serum/antibiotika og 10 U/mL erytropoietin ble dyrket til stasjonær fase. Cellene ble høstet og resuspendert i ferskt medium uten vekstfaktor (erytropoietin) i 24 timer. Cellene ble tellet og resuspendert i en konsentrasjon på 500.000 celler/mL. 1 ml_ celler (500.000) ble anbragt i et Eppendorf-rør. 1 mikroliter av en 1 x 10'<3 >peptidløsning tilsettes til cellene (sluttkonsentrasjon 1 x 10 "<5> M) og inkuberes i 10 minutter ved 37°C. En erytropoietin-kontroll (sluttkonsentrasjon 10 U/mL) ble tatt med for hver test. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering ved 14.000 rpm. ved 4°C. Cellene ble resuspendert i 100 uL SDS lyseringsbuffer og underkastet SDS polyakrylamid-gelelektroforese. Gelen ble overført til nitrocellulose og probe-undersøkt med et anti-fosfotyrosin antistoff (Upstate Biotechnology Incorporated) fortynnet 1:1000, i 1 time. Membranen ble vasket med Tris-buffret saltvann og på nytt probe-undersøkt med et anti-mus peroksydase-merket antistoff. Reaktive proteiner ble visualisert ved å benytte ECL western blotting reagenser (Amersham).

c. Resultater: erytropoietin-binding til dens reseptor i en erytropoietin-responderende cellelinje induserer tyrosinfosforylering av både reseptoren og mange intracellulære proteiner, inklusivt Shc, vav og JAK2-kinase. Mange peptider, inklusivt GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, er blitt analysert for å vurdere deres evne til å etterligne den respons som sees med erytropoietin. Aktive peptider, vurdert utfra bindings- og proliferasjons-kriterier, utløser et fosforyleringsmønster som er identisk med det for erytropoietin i erytropoietin-responderende celler. Disse resultatene tyder på at aktive peptider utløser deres respons gjennom en erytropoietin-indusert signaloverføringsvei. Resultatene er angitt i tabellform sammen med bindings- og proliferasjonsdata (se Tabell 17-22, nedenfor.

F. Cellulær respons-kinetikk: peptid-indusert initiering av

cellecyklus målt ved hjelp av DNA-innhold

1. Forsøksprotokoll: FDCP-1 /muER-celler ble dyrket til stasjonær fase

- 3, 0 x 10<6> celler/mL Cellene ble oppsamlet og resuspendert i ferskt medium uten nærvær av faktor og fikk vokse i ytterligere 18 timer, hvorpå cellene på dette tidspunkt ble delt i tre kolber med lik celletetthet: -faktor, +EPO og +peptid. Cellene ble deretter stimulert med enten 10 U/mL EPO eller 10 u.M peptid. Tre millioner celler ble oppsamlet til følgende tidspunkter: 0, 6, 8,10 og 12 timer (se Figur 15). Cellene ble vasket to ganger i kald PBS og fiksert ved resuspendering av cellepelleten i 100 uL kald PBS og deretter i 900 ul kald 70% etanol. Cellene ble farvet med 50 ug/mL propidium-jod, og fluorescensen ble målt på FACS Sean Flow cytometer. Prosentandelen celler i hver fase ble målt ved å benytte SOBR-modellen av programvaren CellFIT fra Becton Dickinson.

Erytropoietin (10 U/mL) og GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (1 x 10"<5>M) er like effektive med hensyn til å føre celler gjennom cellecyklusen. 10 timer etter induksjon med erytropoietin eller med peptid, var ca. 45% av cellene i S-fase, sammenlignet med 15% i kontrollmediet. Dette resultat tyder på at peptidet er i stand til å utløse dets respons etter samme kinetikk som rekombinant erytropoietin.

G. Kolonibestemmelse: murin benmarg og human periferblod kolonibestemmelse i

1. Materialer og metodikk

En 10 mL prøve av perifert blod ble tatt med et standard sterilt heparin vacutainer-rør, fra et friskt individ. Murin benmarg ble tatt fra lårben fra ca. 10 mus per forsøk. Alle reagenser ble anskaffet fra Stem Cell Technologies Inc. (Vancouver, Canada).

a. Forsøksprotokoll: i korte trekk ble det foretatt en telling av nukleerte celler for å fastslå antallet og konsentrasjonen av nukleerte celler i den opprinnelige prøve. Når det gjaldt perifert blod, ble prøven sentrifugert gjennom en Ficoll-Hypaque (1,077 g per ml_) gradient ved 400 g i 30 minutter ved romtemperatur. Mononukleære celler i grenseflaten til Ficoll-Hypaque-løsningen ble forsiktig uttatt og fortynnet til et totalvolum på ca. 10 ml_. Cellene oppnådd fra murin benmarg eller humant periferblod, ble oppsamlet ved sentrifugering og supernatanten fradekantert. De pelleterte cellene ble resuspendert i ferskt medium og oppsamlet som beskrevet ovenfor. De vaskede cellene ble fortynnet i lscove's medium/2% føtalt bovint serum til følgende konsentrasjoner f or utplating:

Normal marg: 1 x 10<5> celler, light density

Normal blod: 4 x 10<5> celler, light density

Celler ble tilsatt til metylcellulose i henhold til produsentens anvisninger. Peptider ble bestemt ved følgende sluttkonsentrasjoner: 1 x 10"<6> og 1 x 10"<5>M i et «minus EPO» metylcellulosemedium. Like celleantall ble utplatet i «komplett» metylcellulosemedium for å fastslå maksimal kolonidannelse. En kontrollskål ble tatt med for hver test, minus EPO og peptid, for å bestemme bakgrunns-kolonidannelse. Kolonier ble vurdert etter inkubering i 10 dager og i 18 dager.

b. Resultater: som vist i Tabell 13-15, var

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG i stand til å fremme kolonidannelse om enn i betydelig lavere nivåer enn de oppnådd på «komplett» metylcellulosemedium (erytropoietin 3 U/mL) både i benmarg fra mus og humant periferblod.

H. Peptid-indusert proliferasjon: peptid-avhengig vekst av cellelinjer

som ikke gir respons på erytropoietin

a. Forsøksprotokoll: peptider ble testet som beskrevet i del D, ovenfor. En vekstkurve for hver cellelinje ble tatt opp ved å benytte den relevante mitogen/vekstfaktor for hver cellelinje for å fastslå potensialet for vekst.

b. Resultater: som vist i Tabell 16 var GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG ute av stand til å stimulere vekstrespons i ikke-erytropoietin responderende cellelinjer, inklusivt både hematopoietiske og ikke-hematopoietiske cellelinjer.

I. Immobilisert EBP-basert [<125>l]EPO kompetitiv bindingstest

Det ekstracellulære domenet av den humane erytropoietinreseptor (EPO-bindingsprotein, EBP) er blitt uttrykt og overprodusert i E. coli. Som mange andre rekombinante eukaryote proteiner benyttet i E. coli, fremkom proteinet ved fermenteringer i laboratorieskala som et uløselig produkt og som ble omfoldet og renset for å oppnå aktivt protein. EBP fremstilt etter denne metoden inneholder én fri sulfhydrylgruppe som kan modifiseres uten å påvirke ligandbindingen i løsningsfase. For å immobilisere EBP for likevektsbindinganalyse og som grunnlaget for en kompetitiv bindingstest, ble denne observasjon utvidet til kovalent tilknytning av EBP til agarosekuler. Den kjemi som gjelder jodacetylaktivering av Sulfolink-kuler (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) er spesifikk for frie tioler og sikrer at koblingen ikke er lett reverserbar. EBP Sulfolink-kuler ble fremstilt som følger: SulfoLink-gelsuspensjon (10 mL) ble blandet med koblingsbuffer (40 mL: 50 mM Tris, pH 8,3, 5 mM EDTA), hvorpå gelen fikk sedimentere. Supernatanten ble fjernet og det EBP (0,3-1 mg/mL i koblingsbuffer) som skulle bindes, ble tilsatt direkte til de vaskede kulene. Blandingen ble vugget forsiktig i 30 minutter ved romtemperatur, hvoretter kulene fikk sedimentere i 1 time ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet og beholdt, og kulene ble vasket 2 ganger med 20 mL koblingsbuffer. Vaskevæskene ble også gjenvunnet. Kulene ble deretter behandlet med 20 mL 0.05M cystein i 30 minutter ved romtemperatur for å blokkere ubundne steder. Tilslutt ble kulene vasket med 50 mL 1M NaCI og deretter med 30 mL PBS, resuspendert i 20 mL PBS og oppbevart ved 4°C for senere anvendelse. Den mengde EBP som kovalent var bundet til kulene, ble bestemt ved å sammenligne OD2so av den opprinnelige EBP-løsning med den totalt gjenvundne OD2so i reaksjonssupernatanten og de to 20 mL vaskeløsningene. I alminnelighet forblir 40-60% av det påførte EBP forbundet med kulene.

Bindingstestene ble innledet ved tilsetning av EBP-kuler (50 |iL) til individuelle reagensglass. Total binding ble målt i reagensglass inneholdende 0,3-30 nM <125>l-EPO (NEN Research Products, Boston, MA, 100 u.Ci/ug). For bestemmelse av uspesifikk binding ble umerket EPO tilsatt i et 100 gangers overskudd av den tilsvarende [<125>l]EPO-konsentrasjon. Reaksjonsvolumet ble i hvert tilfelle bragt til 500 uL med bindingsbuffer (PBS/0,2% BSA). Reagensglassene ble inkubert i 5 timer (et tidsrom som eksperimentelt var fastslått passende for likevektsinnstilling) ved romtemperatur under forsiktig vugging. Etter 5 timer ble hver av reaksjons-blandingene sendt gjennom åpningen av en 1 mL pipette plugget med glassull. Reagensglassene ble vasket med 1 mL vaskebuffer (PBS/5% BSA) og dette volum, så vel som to ytterligere 1 mL vaskinger, ble sendt gjennom pipetteutiøpet og oppsamlet for bestemmelse av den frie EPO-konsentrasjon. Likevektsbindings-analyse av den spesifikke assosiasjon av [<125>l]EPO med EBP immobilisert på disse agarosekulene indikerte en Kd på 5 nM ±2 ut fra en lineær transformasjon (Scatchard) av bindingsisotermen (se Figur 16).

Kompetitive bindingsanalysetester av peptidkandidater ble foretatt som skissert nedenfor. De enkelte peptidene ble løst i DMSO for å fremstille en stam-løsning på 1 mM. Alle reagensglassene (i paralleller) inneholdt 50 uL EBP-kuler,

0,5 nM [<125>l]EPO og 0-500 uM peptid i totalt 500 uL bindingsbuffer. Slutt-konsentrasjonen av DMSO ble justert til 2,5% i alle reagensglass, en verdi som var uten påvisbar effekt siden en undersøkelse av testens følsomhet overfor DMSO viste

at konsentrasjoner opptil 25% DMSO (volumdeler) ikke hadde noen uheldig effekt på bindingen. Uspesifikk binding ble målt for hver enkelt test ved å ta med rør som inneholdt et stort overskudd av umerket EPO (1000 nM). Initiale testpunkter uten tilsatt peptid ble inkludert for hver test for å bestemme total binding. Bindings-blandinger ble inkubert over natten ved romtemperatur under forsiktig vugging. Kulene ble deretter oppsamlet ved å benytte Micro-columns (Isolab, Akron, Ohio) som ble vasket med 3 mL vaskebuffer. Kolonnene som inneholdt de vaskede kulene, ble anbragt i 12 x 75 mm reagensglass og nivåene av bundet radioaktivitet ble

bestemt ved å benytte en gammateller. Mengden av bundet [<125>l]EPO ble uttrykt som prosentandelen av kontrollbinding (total=100%) og plottet mot peptidkonsentrasjonen etter korrigering for uspesifikk binding. IC50 ble definert som den peptidkonsentrasjon som reduserte bindingen av [<125>l]EPO til EBP-kuler med 50%. Alle data er angitt i

forhold til GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ61233) som oppviste en ICS0-verdi på 5 uM (se Tabell 17-22, nedenfor)

J. Polycytemisk biotest på ekshypoksiske mus

BDF1-hunnmus (18-20 g) ble underkastet en kondisjoneirngsrunde (i rom med undertrykk) i 18 timer ved 0,40+0,02 atm. og 6 timer ved normaltrykk i 14 dager.

Musene holdes under normaltrykk i 72 timer før administrering av r-HuEPO eller testprøver. Testprøver eller r-HuEPO standarder fortynnes for injeksjon i kondisjonerte mus. Bæreren består av: PBS inneholdende 0,1% BSA (vekt/vol.). Av hver fortynning administreres 0,5 mL subkutant i 10 mus. <59>Fe administreres 48 timer senere. Blodprøver tas 48 timer etter administrering av <S9>Fe. Hematokritt- og radioaktivitets-målinger foretas på hver prøve. Doseringsområde og resultater (to forskjellige bestemmelser) er angitt i Tabell 23 og Figur 17A-17C, nedenfor.

Ved å benytte ovennevnte polycytemiske biotest på ekshypoksiske mus, ble dessuten TIAQYICYMGPETWECRPSPKA og en dimer peptidanalog av GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG som inneholdt to disulfidbindinger (AF12080) testet. Resultatene av den polycytemiske biotest på ekshypoksiske mus fremgår av Figur 18A-18B. Dessuten viser Tabell 24 nedenfor den tilnærmede ekvivalens mellom EPO og forskjellige mimetiske peptider.

K. Retikulocytt-bestemmelse

Normale ubehandlede BDF1-hunnmus ble på tre påfølgende dager dosert (0,5 mL s.q.) EPO eller forsøksforbindelsen. Bæreren: PBS, 10% PEG 8000, 0,25% BSA med DMSO tilsettes. På Dag 3 gis musene også en dose (0,1 mL i.p.) jerndekstran (100 mg/mL). På Dag 5 anestetiseres musene med CO2 og blodprøver uttas ved hjertepunksjon. % retikulocytter bestemmes ved hjelp av tiazolorange-farving og strømningscytometrisk analyse (retic-count program). Hematokrittverdier bestemmes manuelt. Prosentandelen korrigerte retikulocytter bestemmes med følgende formel:

Resultatene oppnådd ved å benytte ovennevnte retikulocytt-bestemmelse fremgår av Figur 18A-18B og Figur 19A-19B.

L. Kolonibestemmelse: erytroid kolonidannelse

1. Materialer og metodikk:

Humane nukleerte benmargceller tatt fra normale donorer, ble utplatet i halvfast metylcellulose (0,9% metylcellulose, 30% føtalt bovint serum, 1% bovint serumalbumin, 10"<4> 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin). I korthet ble det uttatt celler, og røde blodlegemer lysert ved tilsetning av bufferholdig ammoniumklorid. Cellene ble resuspendert i medium inneholdende 2% føtalt kalveserum og utplatet i en tetthet på 2 x 105 celler per plate i to paralleller. E ryt ro id- og granulocytt-makrofag (G-M) kolonier, dannet etter dyrkning i 12 dager, ble vurdert med henblikk på farve og morfologi. Det ble i undersøkelsen inkludert en kontrollplate inneholdende de rekombinante humane vekstfaktorer IL-3, GM-CSF og CSF (3/GM/S) for å bedømme GM-kolonidannelse av prøven.

2. Resultater:

Ut fra dataene vist ovenfor er det tydelig at GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ 61233/AFFY11157) er i stand til å fremme erytroid kolonidannelse uten nærvær av ytterligere cytokiner. Peptidet oppviser dessuten en strikt spesifisitet for erytroidlinjen gjennom dens manglende evne til å fremme kolonidannelse av GM-linjen.

Det skal bemerkes at den ovenfor gitte beskrivelse er ment å være illustrerende. Fagmannen vil se muligheter for mange utførelsesformer ved å sette seg inn i beskrivelsen ovenfor. Rammen for oppfinnelsen defineres av de etterfølgende patentkrav. Innholdet i samtlige nevnte artikler og referanser, inklusivt patentpublikasjoner, refereres til med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse.

Claims

1. Peptid med en lengde på 10 til 40 aminosyrerester som binder til erytropoietinreseptorer, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen XaX^sGPXeTWXyXa, hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; X6 er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og X8 er C.

2. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen YX2X3X4X5GPX6TWX7X8, hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X2 og Xe er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og X8 er C.

3. Peptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen XiYX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9XioXii, hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X-i, X2, X6, Xg, X10 og Xn er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og X8 er C.

4. Peptid ifølge krav 3, karakterisert ved at X4 er R eller H; X5 er F eller M; Xe er I, L, T, M, E eller V; X7 er D eller V; X9 er G, K. L, Q, R, S eller T; og X10 er A, G, P, R eller Y.

5. Peptid ifølge krav 4, karakterisert ved a t Xi er D, E, L, N, S, T eller V; X2 er A, H, K, L, M, S eller T; X4 er R eller H; X9 er K, R, S eller T; og X10 er P.

6. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av:

7. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av:

8. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen er cyklisert.

9. Peptid ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av:

10. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen er dimerisert.

11. Peptid ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte peptid omfatter følgende aminosyresekvens:

12. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1 i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.

13. Anvendelse av et peptid ifølge krav 1, for fremstilling av en farmasøytisk blanding for behandling av en lidelse som kjennetegnes ved en erytropoietinsvikt eller lav eller defekt populasjon av røde blodlegemer.

14. Anvendelse av et peptid ifølge krav 13, hvor lidelsen er sluttstadiet av nyresvikt eller dialyse; anemi assosiert med AIDS, autoimmunsykdom; eller maligniteter; beta-thalassemi; cystisk fibrose; tidlig anemi ved prematuritet; anemi assosiert med kroniske inflammatoriske sykdommer; ryggmargsskade; akutt blodtap; aldring; og neoplastiske sykdomstilstander ledsaget av abnorm erytropoiese.

15. Anvendelse av et peptid ifølge krav 13, hvor peptidet omfatter aminosyre-sekvensen YX2X3X4X5GPX6TWX7X8, hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X2 og X6 uavhengig er valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D. E, I, L eller V; og Xa er C.

16. Anvendelse av et peptid ifølge krav 15, hvor peptidet omfatter aminosyre-sekvensen XiYX2X3X4X5GPX6TvVX7X8X9XioXii1 hvor hver aminosyre er angitt med énbokstavs standardforkortelse; hver X^ X2, Xe, Xg, X10 og Xn er uavhengig valgt fra en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene; X3 er C; X4 er R, H, L eller W; X5 er M, F eller I; X7 er D, E, I, L eller V; og XB er C.

17. Anvendelse av et peptid ifølge krav 16, hvor X4 er R eller H; X5 er F eller M; X6 er I, L, T, M eller V; X7 er D eller V; X9 er G, K, L, Q, R; S eller T; og Xi0 er A, G, P, R eller Y.

18. Anvendelse av et peptid ifølge krav 17, hvor X-i er D, E, L, N, S, T eller V; X2 er A, H, K, L, M. S eller T; X4 er R eller H; X9 er K, R, S eller T; og Xt0 er P.

19. Anvendelse av et peptid ifølge krav 13, hvor peptidet er valgt fra gruppen bestående av:

20. Anvendelse av et peptid ifølge krav 13, hvor peptidet er cyklisert.

21. Anvendelse av et peptid ifølge krav 13, hvor peptidet er dimerisert.