CN113166203A - 抗促红细胞生成素受体肽 - Google Patents

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CN113166203A
CN113166203A CN201980074931.7A CN201980074931A CN113166203A CN 113166203 A CN113166203 A CN 113166203A CN 201980074931 A CN201980074931 A CN 201980074931A CN 113166203 A CN113166203 A CN 113166203A
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小路弘行
安田佳子
加藤明良
越智宏
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Epo Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明提供抗EpoR肽。提供具有式(I)：X1‑SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)‑X2[式中，X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧，A1为M、或被卤素原子或羟基取代非取代的F、苯基甘氨酸或苯乙基甘氨酸，A2为A、d‑丙氨酸或G，A3为P、高脯氨酸或A，A4为M、L、A或I，A5为T或A，A6为M、或被甲基或卤素原子取代非取代的W、F、Y、β‑高色氨酸、α‑萘基丙氨酸、β‑萘基丙氨酸或喹啉基丙氨酸，A7为C、高半胱氨酸或青霉胺，A8为K、R、或不存在]结构的肽。

Description

抗促红细胞生成素受体肽
技术领域
本发明涉及新颖的抗促红细胞生成素受体(以下，也称为“EpoR”)肽和包含该肽的组合物、其使用(应用)。
背景技术
促红细胞生成素参与红细胞的分化和增殖，与其他细胞因子不同，不在血细胞中产生，而是在肾脏或肝脏中产生并释放到血液中。认为促红细胞生成素作用于红细胞前体细胞中的红系爆式形成单位(BFU-E，burst-forming unit-erythroid)和红系集落形成单位(CFU-E，colony-forming unit-erythroid)，促进其分化和增殖，诱导红细胞的产生(Krantz S. B. Blood, 77卷, 419-434页(1991))。认为若促红细胞生成素与存在于前体细胞的细胞膜的促红细胞生成素受体结合，则信号传递至细胞核内，引起红细胞的分化，即球蛋白mRNA的细胞内聚集、血红蛋白的产生、红细胞的增殖(D'Andrea A. D.等人, Cell,57卷, 277-285页(1989))。但是，关于其机制的详情尚不明确，今后应该解决的方面较多。
作为促红细胞生成素在与成红血细胞(erythroblast)相关的部位以外的组织中表达其基因的部位，已知有刚刚着床后的胚体(Yasuda Y.等人, Develop. GrowthDiffer., 35卷, 711-722页(1993))、人、猴、和小鼠的脑(Marti H.等人, Eur. J.Neurosci., 8卷, 666-676页(1996))和小鼠子宫(Yasuda Y.等人, J. Biol. Chem., 273卷, 25381-25387页(1998))。
促红细胞生成素可与促红细胞生成素受体结合而起作用。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Krantz S. B. Blood, 77卷, 419-434页(1991)；
非专利文献2：D'Andrea A. D.等人, Cell, 57卷, 277-285页(1989)；
非专利文献3：Yasuda Y.等人, Develop. Growth Differ., 35卷, 711-722页(1993)；
非专利文献4：Marti H.等人, Eur. J. Neurosci., 8卷, 666-676页(1996)；
非专利文献5：Yasuda Y.等人, J. Biol. Chem., 273卷, 25381-25387页(1998)。
发明内容
用于解决课题的手段
本发明提供以下详细地记载的本发明的肽或其盐或溶剂合物、或其前药。在一个实施方式中，本发明提供包含它们的组合物、制剂或试剂盒，在其他的实施方式中，本发明提供本发明的肽或其盐或溶剂合物、或其前药的使用或用于使用的方法。在特定的实施方式中，本发明的肽或其盐或溶剂合物、或其前药具有强的EpoR抑制能、高的癌细胞杀伤能、低的正常细胞杀伤能、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效的改善、副作用的降低、对特定部位的特异性迁移能、改善的吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度的改善、和高的稳定性中的1个以上特性。在一个实施方式中，本发明的肽或其盐或溶剂合物、或其前药可用于治疗或预防增殖性疾病、子宫腺肌病或糖尿病视网膜病。
因此，本发明提供以下内容。
(项目1)
基于具有-[SCHFGPLTWVCK]-结构的肽的修饰肽或其前药或其盐，其具有至少1个较具有CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2结构的肽改善的特性(字母表示氨基酸的单字母记号)。
(项目2)
具有下述的式(I)结构或式(II)结构的修饰肽或其前药或其盐，
式(I)：X1-SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)-X2
[式中，
X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧，
A1为-NH-CH(RA1)-CO-，在此，RA1具有(键、或直链或支链亚烷基)-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的直链或支链甲氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基)的结构，
A2为Ala、D-丙氨酸或Gly，
A3为Pro、高脯氨酸或Ala，
A4为Met、Leu、Ala或Ile，
A5为Thr或Ala，
A6为-NH-CH(RA1)-CO-，在此，RA1具有(键、或直链或支链亚烷基)-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的直链或支链甲氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基)的结构，
A7为Cys、高半胱氨酸或青霉胺，
A8为Lys、Arg、或不存在，
肽中的2个硫原子可形成二硫键，
X1为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-C(＝O)R1，
X2为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-NR1 2，
各R1独立地选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，或者与同一原子键合的2个R1一起形成可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环，
各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3]；或
式(II)：X1-kcvwtl(B1)Gfhcs-X2
[式中，X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧，
B1为Gly或D-脯氨酸，k、c、v、w、t、l、G、f、h、c、和s分别表示氨基酸，大写字母表示L体或非光学异构体，小写字母表示D体，
肽中的2个硫原子可形成二硫键，
X1为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-C(＝O)R1，
X2为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-NR1 2，
各R1独立地选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，或者与同一原子键合的2个R1一起形成可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环，
各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3]。
(项目3)
项目2所述的修饰肽或其前药或其盐，其满足下述的至少1个条件：
A2为Gly，
A3为Phe，
A5为Thr，
A7为Cys，和
A8为Lys。
(项目4)
项目2或3所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A1为Tyr、对氟苯丙氨酸、或苯乙基甘氨酸。
(项目5)
项目2或3所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A1为Tyr。
(项目6)
项目2～5中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A4为Leu或Met。
(项目7)
项目2～5中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A4为Met。
(项目8)
项目2～7中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A6为Trp、Met、8-萘基丙氨酸、2-喹啉基丙氨酸、5-氯-Trp、或2-苯并噻唑基丙氨酸。
(项目9)
项目2～7中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A6为2-苯并噻唑基丙氨酸。
(项目10)
项目2～9中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，
A2为Gly，
A3为Phe，
A5为Thr，
A7为Cys，
A8为Lys。
(项目11)
项目2～10中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，X1为-COOH、苯甲酰基、丙酰基或对氟苯基乙酰基。
(项目12)
项目2～11中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，X2为NH2。
(项目13)
包含项目1～12中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐的组合物，其用于治疗或预防增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病。
(项目14)
项目13所述的组合物，其中，上述增殖性疾病为子宫腺肌病、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌、肛门癌)、食道癌(食管癌)、十二指肠癌、头颈部癌(舌癌、咽癌、喉癌)、脑肿瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、子宫癌(子宫体癌、子宫颈癌)、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、血管瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、骨肿瘤、血管纤维瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、小儿实体癌、卡波西肉瘤、AIDS所引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、子宫肌瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、癌性间皮瘤、或白血病。
(项目15)
项目13所述的组合物，其中，上述增殖性疾病为乳癌、胰腺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、或白血病。
(项目16)
项目1～12中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其用于治疗或预防增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病。
(项目17)
项目16所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，上述增殖性疾病为子宫腺肌病、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌、肛门癌)、食道癌、十二指肠癌、头颈部癌(舌癌、咽癌、喉癌)、脑肿瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、子宫癌(子宫体癌、子宫颈癌)、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、血管瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、骨肿瘤、血管纤维瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、小儿实体癌、卡波西肉瘤、AIDS所引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、子宫肌瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、癌性间皮瘤、或白血病。
(项目18)
项目16所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，上述增殖性疾病为乳癌、胰腺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、或白血病。
(项目19)
用于治疗或预防受试者的增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病的方法，该方法包括对该受试者给予有效量的项目1～12中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐的工序。
(项目20)
项目19所述的方法，其中，上述增殖性疾病为子宫腺肌病、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌、肛门癌)、食道癌、十二指肠癌、头颈部癌(舌癌、咽癌、喉癌)、脑肿瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、子宫癌(子宫体癌、子宫颈癌)、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、血管瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、骨肿瘤、血管纤维瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、小儿实体癌、卡波西肉瘤、AIDS所引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、子宫肌瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、癌性间皮瘤、或白血病。
(项目21)
项目19所述的方法，其中，上述增殖性疾病为乳癌、胰腺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、或白血病。
(项目22)
项目1～12中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐在制造用于治疗或预防增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病的药物中的使用。
(项目23)
项目22所述的使用，其中，上述增殖性疾病为子宫腺肌病、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌、肛门癌)、食道癌、十二指肠癌、头颈部癌(舌癌、咽癌、喉癌)、脑肿瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、子宫癌(子宫体癌、子宫颈癌)、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、血管瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、骨肿瘤、血管纤维瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、小儿实体癌、卡波西肉瘤、AIDS所引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、子宫肌瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、癌性间皮瘤、或白血病。
(项目24)
项目22所述的使用，其中，上述增殖性疾病为乳癌、胰腺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、或白血病。
在本发明中，上述的1个或多个特征旨在除了所明确的组合之外，还可组合提供。本领域技术人员在根据需要阅读并理解以下的详细说明时将认识到本发明的其他实施方式和优点。
发明效果
本发明的肽具有强的EpoR抑制能、高的癌细胞杀伤能、低的正常细胞杀伤能、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效的改善、副作用的降低、对特定部位的特异性迁移能、改善的吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度的改善、和高的稳定性中的1个以上的有利特性。通过提供具有这样的特性的肽，可治疗或预防例如增殖性疾病、子宫腺肌病或糖尿病视网膜病。
附图说明
[图1]表示合成肽：(苯甲酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2(GT-11255)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图2]表示合成肽：(对氟苯乙酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2(GT-11256)的质谱分析的结果。上段不是来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图3]表示合成肽：(丙酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2(GT-11257)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图4]表示合成肽：Ac-SCH(对氟-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11258)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图5]表示合成肽：Ac-SCH(对氯-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11259)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图6]表示合成肽：Ac-SCH(间氯-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11260)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图7]表示合成肽：Ac-SCHYGPLTWVCK-NH2(GT-11261)(SEQ ID NO: 10)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图8]表示合成肽：Ac-SCH(苯基甘氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11262)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图9]表示合成肽：Ac-SCH(苯乙基甘氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11263)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图10]表示合成肽：Ac-SCHFAPLTWVCK-NH2(GT-11264)(SEQ ID NO: 11)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图11]表示合成肽：Ac-SCHFaPLTWVCK-NH2(GT-11265)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图12]表示合成肽：Ac-SCHFGALTWVCK-NH2(GT-11266) (SEQ ID NO: 12)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图13]表示合成肽：Ac-SCHFG(高脯氨酸)LTWVCK-NH2(GT-11267)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图14]表示合成肽：Ac-SCHFGPATWVCK-NH2(GT-11268) (SEQ ID NO: 13)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图15]表示合成肽：Ac-SCHFGPMTWVCK-NH2(GT-11269) (SEQ ID NO: 14)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图16]表示合成肽：Ac-SCHFGPLTMVCK-NH2(GT-11270)(SEQ ID NO: 15)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图17]表示合成肽：Ac-SCHFGPLT(β-高色氨酸)VCK-NH2(GT-11271)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图18]表示合成肽：Ac-SCHFGPLT(α-萘基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11272)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图19]表示合成肽：Ac-SCHFGPLT(β-萘基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11273)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图20]表示合成肽：Ac-SCHFGPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11274)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图21]表示合成肽：Ac-SCHFGPLT(6-氯-Trp)VCK-NH2(GT-11275)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图22]表示合成肽：Ac-SCHFGPLT(5-氯-Trp)VCK-NH2(GT-11276)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图23]表示合成肽：Ac-SCHFGPLTWV(高半胱氨酸)K-NH2(GT-11277)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图24]表示合成肽：Ac-SCHFGPLTWV(青霉胺)K-NH2(GT-11278)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图25]表示合成肽：Ac-kcvwtlpGfhcs-NH2(GT-11279)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图26]表示合成肽：Ac-kcvwtlGGfhcs-NH2(GT-11280)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图27]表示合成肽：Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11303)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图28]表示合成肽：Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11304)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图29]表示合成肽：Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11305)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图30]表示合成肽：Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11306)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图31]表示合成肽：Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11307)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图32]表示合成肽：Ac-SCHYGPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11308)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图33]表示合成肽：Ac-SCHYGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-1309)的质谱分析的结果。上段表示来自ESI-MS测定值的去卷积值，下段表示ESI-MS测定值。
[图34]表示实施例2中的各肽在120μM浓度的来自人肝癌的HepG2细胞杀伤效果。横轴分别表示YS12、GT-11268、GT-11261、GT-11274、GT-11259、GT-11260、GT-11280、GT-11303、GT-11304、GT-11305、GT-11306、GT-11307、GT-11308、GT-11309、PBS(-)治疗和无治疗。纵轴表示1mm2的隔室中观察到的死细胞数的平均和标准偏差(n＝3的情形)。
[图35]表示实施例2中的各肽在60μM浓度的来自人肝癌的HepG2细胞杀伤效果。横轴分别表示YS12、GT-11268、GT-11261、GT-11274、GT-11259、GT-11260、GT-11280、GT-11303、GT-11304、GT-11305、GT-11306、GT-11307、GT-11308、GT-11309、PBS(-)治疗和无治疗。纵轴表示1mm2的隔室中观察到的死细胞数的平均和标准偏差(n＝3的情形)。
[图36]表示实施例2中的各肽在30μM浓度的来自人肝癌的HepG2细胞杀伤效果。横轴分别表示YS12、GT-11268、GT-11261、GT-11274、GT-11259、GT-11260、GT-11280、GT-11303、GT-11304、GT-11305、GT-11306、GT-11307、GT-11308、GT-11309、PBS(-)治疗和无治疗。纵轴表示1mm2的隔室中观察到的死细胞数的平均和标准偏差(n＝3的情形)。
[图37]表示实施例2中的各肽在15μM浓度的来自人肝癌的HepG2细胞杀伤效果。横轴分别表示YS12、GT-11268、GT-11261、GT-11274、GT-11259、GT-11260、GT-11280、GT-11303、GT-11304、GT-11305、GT-11306、GT-11307、GT-11308、GT-11309、PBS(-)治疗和无治疗。纵轴表示1mm2的隔室中观察到的死细胞数的平均和标准偏差(n＝3的情形)。
[图38]表示通过WST法评价各种合成肽对来自人胰腺癌的AsPC-1细胞增殖的影响的结果。纵轴表示相对于对照(不含测试化合物的孔)的各测试化合物的抑制率。横轴表示试验的药剂。结果以3各孔的平均±标准误差表示。
[图39]表示通过WST法评价各种合成肽对来自人白血病的ATL-2细胞增殖的影响的结果。纵轴表示相对于对照(不含测试化合物的孔)的各测试化合物的抑制率。横轴表示试验的药剂。结果以3个孔的平均±标准误差表示。
[图40]表示评价各种合成肽对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。各图中，纵轴表示以试验开始时的肿瘤体积为100％的情况下在各时间点的相对肿瘤体积，横轴表示自给予开始日起的经过天数。对照是给予生理盐水。结果以小鼠3～5只的平均±标准误差表示。
[图41]表示评价各化合物对CFU-E形成的影响的结果。纵轴表示所形成的CFU-E数，横轴分别表示(-)Epo：未添加Epo、对照：仅添加Epo、GT-11269：添加Epo＋GT-11269(100μM)、GT-11309：添加Epo＋GT-11309(100μM)。结果以通过2个孔(10个位置/孔)测量而制作的箱形图表示。
[图42]表示通过WST法评价GT-11309对Epo依赖性癌细胞增殖的影响的结果。左图表示在0～10U/mL的Epo存在下的来自人白血病的UT-7细胞的增殖性，纵轴表示450nm下的吸光度。右图表示在1U/mL的Epo存在下通过添加抗Epo抗体(克隆R6)、抗EpoR抗体(克隆713210)或GT-11309(各抗体为1～100μg/mL、GT-11309为10～100μM)对UT-7细胞增殖的抑制率。横轴表示试验的药剂。结果以3个孔的平均±标准偏差表示。
[图43]表示通过WST法评价GT-11269、GT-11309和GT-11350对来自人胰腺癌的AsPC-1细胞增殖的影响的结果。纵轴表示相对于对照(不含测试化合物的孔)的各测试化合物的抑制率。横轴表示试验的药剂及其浓度(μM)。结果以3个孔的平均±标准误差表示。
[图44]表示以ATP量为指标来评价GT-11350对人乳癌细胞增殖的影响的结果。各自的图表示HCC1395(左)和HCC1806(右)的结果。各图中，纵轴表示相对于对照(不含测试化合物的孔)的各浓度下的抑制率，横轴表示试验的浓度(μM)。结果以3个孔的平均±标准误差表示。
[图45]表示评价合成肽对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。上图中，纵轴表示以试验开始时的肿瘤体积为100％的情况下在各时间点的相对肿瘤体积，横轴表示自给予开始日起的经过天数。下图中，纵轴表示在各时间点的体重，横轴表示自给予开始日起的经过天数。对照是给予生理盐水。结果以4～5只小鼠的平均±标准误差表示。
[图46]表示评价合成肽对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。纵轴表示按细胞尺寸划分的每肿瘤组织体积的FVIII阳性细胞数，横轴分别表示φ(细胞直径)＞50μm(large)、50μm＞φ＞10μm(medium)、10μm＞φ(capillary)的细胞尺寸。结果以3～4只小鼠的平均±标准误差表示。
[图47]表示评价合成肽对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。纵轴表示血细胞比容值(上图)和血中血红蛋白浓度(下图)，横轴表示测试化合物。结果以3～5只小鼠的平均±标准误差表示。
[图48]表示评价GT-11350对CFU-E形成的影响的结果。纵轴表示所形成的CFU-E数，横轴表示测试化合物。结果以通过2个孔(10个位置/孔)测量而制作的箱形图表示。
[图49]表示评价各剂量(0.1mg、0.2mg和0.4mg/天)的GT-11350对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。上图中，纵轴表示以试验开始时的肿瘤体积为100％的情况下在各时间点的相对肿瘤体积，横轴表示自给予开始日起的经过天数。下图中，纵轴表示在各时间点的体重，横轴表示自给予开始日起的经过天数。对照是给予生理盐水。结果以6只小鼠的平均±标准误差表示。
[图50]表示评价GT-11350对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。纵轴表示血细胞比容值(上图)和血中血红蛋白浓度(下图)，横轴表示测试化合物。结果以6只小鼠的平均±标准误差表示。
[图51]表示评价1天3次和1天1次的GT-11350对来自人胰腺癌的AsPC-1荷瘤小鼠的影响的结果。上图中，纵轴表示以试验开始时的肿瘤体积为100％的情况下在各时间点的相对肿瘤体积，横轴表示自给予开始日起的经过天数。下图中，纵轴表示在各时间点的体重，横轴表示自给予开始日起的经过天数。对照是给予生理盐水。结果以6只小鼠的平均±标准误差表示。
具体实施方式
以下，边给出最佳方式边对本发明进行说明。在本说明书的整体中，除非另有说明，否则单数形式的表达还应理解为包括其复数形式的概念。因此，除非另有说明，否则单数形式的冠词(例如，英文的情形为“a”、“an”、“the”等)还应理解为包括其复数形式的概念。另外，除非另有说明，否则本说明书中所使用的术语还应理解为以该领域中通常使用的含义使用。因此，除非另外定义，否则在本说明书中使用的所有专业术语和科学技术术语均具有与本发明所属领域的本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。如果矛盾，则以本说明书(包含定义)为准。
(定义)
以下，对本说明书中特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容进行适当说明。
本说明书中，“肽”以该技术领域中的通常含义使用，并且是指多个氨基酸通过肽键连接而得的聚合物及其修饰体的化合物。本说明书中，在记载肽序列的情况下，除非另外说明，否则将N末端(氨基末端)配置在左侧、且将C末端(羧基末端)配置在右侧。例如，在以AGTCI(丙氨酸-甘氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸)的序列表示的肽中，丙氨酸的氨基是游离的状态，丙氨酸的羧基与甘氨酸的氨基形成肽键，异亮氨酸的氨基与半胱氨酸的羧基形成肽键，异亮氨酸的羧基是游离的状态。在肽序列的末端存在化学基团的情况下，表示肽序列的末端氨基酸的氨基或羧基与该化学基团形成键，例如，在CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2的结构中，N末端的丝氨酸的氨基与CH3-CO-基形成键，C末端的赖氨酸的羧基与-NH2基形成键。作为修饰，例如可举出：乙酰基化、烷基(例如，甲基)化、卤素(例如，氟、氯)取代烷基(例如，氟甲基)化、烷氧基(例如，甲氧基)化、羟基化、卤素化、苯并噻唑基化、双环(例如，萘基)化和杂环化(例如，喹啉基化)，但不限于这些。
本说明书中，“促红细胞生成素”以该技术领域中的通常含义使用，并且是指作用于红细胞系干细胞(前体细胞)以刺激分化诱导、且促进红细胞产生的分子量为34,000～46,000的糖蛋白激素。本说明书中，促红细胞生成素也可表示为EPO或Epo。
本说明书中，“促红细胞生成素受体”以该技术领域中的通常含义使用，并且是指促红细胞生成素结合的受体，除了红细胞之外，也在骨髓细胞、白细胞、末梢/中枢神经上表达，若EPO与红细胞上的促红细胞生成素受体结合，则将Janus激酶2(JAK2)活化。本说明书中，促红细胞生成素受体也可表示为EpoR。
本说明书中，单独或作为另一基团的一部分的“烷基”是指，具有碳原子的直链或支链饱和烃基。关于烷基，代表性的可具有1～10个碳原子，在一些实施方式中，可具有1～8个碳原子、1～6个碳原子、1～4个碳原子、或1～3个碳原子。作为C1～3烷基的例子，可举出：甲基、乙基、丙基、和异丙基。作为C1～4烷基的例子，可举出：前述的C1～3烷基、以及丁基、异丁基、仲丁基、和叔丁基。作为C1～6烷基的例子，可举出：前述的C1～4烷基、以及戊基、异戊基、新戊基、己基等。作为烷基的追加的例子，可举出：庚基、辛基等。
在本说明书中使用的情况下，“亚烷基”是通过从“烷基”进一步夺取1个氢而生成的二价基团。作为亚烷基的具体例，可举出：-CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3-、-CH2CH(CH3)-、-(CH2)4-、-CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH3)CH2-、-(CH2)5-、-CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH(CH3)CH2-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、和-(CH2)10-等，但不限于这些。
本说明书中，单独或作为另一基团的一部分的“烯基”是指，具有碳原子和1个以上的碳-碳双键的直链或支链烃基。关于烯基，代表性的可具有2～10个碳原子，在一些实施方式中，可具有2～8个碳原子、2～6个碳原子、或2～4个碳原子。1个以上的碳-碳双键可以是内部(例如，2-丁烯基中的双键)，也可以是末端(例如，1-丁烯基中的双键)。作为C2～4烯基的例子，可举出：乙烯基(vinyl)、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、丁二烯基等。作为C2～6烯基的例子，可举出：前述的C2～4烯基、以及戊烯基、戊二烯基、己烯基等。作为烯基的追加的例子，可举出：庚烯基、辛烯基、辛三烯基等。
在本说明书中使用的情况下，“亚烯基”是从“烯基”进一步夺取1个氢而生成的二价基团。作为亚烯基的具体例，可举出：-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-(CH2)2-、-CH2-CH＝CH-CH2-、-CH＝C(CH3)-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-(CH2)3-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-(CH2)4-、-CH＝CH-(CH2)5-、-CH＝CH-(CH2)6-、-CH＝CH-(CH2)7-、和-CH＝CH-(CH2)8-等，但不限于这些。
在本说明书中使用的情况下，“烷氧基”是-O-烷基的一价基团。作为烷氧基的优选例，可举出：C1～6烷氧基(即，C1～6烷基-O-)、C1～4烷氧基(即，C1～4烷基-O-)等。作为C1～4烷氧基的具体例，可举出：甲氧基(CH3O-)、乙氧基(CH3CH2O-)、正丙氧基(CH3(CH2)2O-)、异丙氧基((CH3)2CHO-)、正丁氧基(CH3(CH2)3O-)、异丁氧基((CH3)2CHCH2O-)、叔丁氧基((CH3)3CO-)、仲丁氧基(CH3CH2CH(CH3)O-)等。作为C1～6烷氧基的具体例，可举出：C1～4烷氧基、正戊氧基(CH3(CH2)4O-)、异戊氧基((CH3)2CHCH2CH2O-)、新戊氧基((CH3)3CCH2O-)、叔戊氧基(CH3CH2C(CH3)2O-)、1,2-二甲基丙氧基(CH3CH(CH3)CH(CH3)O-)等，但不限于这些。
在本说明书中使用的情况下，“脂肪族基”是指，烷基、烯基、和炔基，不包含环状烃基。
在本说明书中使用的情况下，“杂脂肪族基”是指，脂肪族基中的一部分取代成杂原子(例如，氮原子、氧原子、硫原子等)而得的基团。
在本说明书中使用的情况下，术语“芳基”是指，环的至少1个为芳香族、所有环原子为碳的、单一芳香环或缩合(稠合)多环系。例如，芳基可具有6～26个碳原子(6～26元)、6～20个碳原子(6～20元)、6～14个碳原子(6～14元)、或6～12个碳原子(6～12元)。芳基包含苯基。芳基也包含至少1个环为芳香族、其他环可以是芳香族也可以不是芳香族的、具有8～20个碳原子的缩合多环系(例如，包含2、3或4个环的环系)。这样的缩合多环系在缩合多环系的任意的碳环部分中可任选地被1个或多个(例如，1、2或3个)氧代基取代。在价数的要素允许的情况下，缩合多环系的环可经由缩合、螺环和交联键而彼此连接。作为典型的芳基，可举出：苯基、茚基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基、芘基等，但不限于这些。
在本说明书中使用的情况下，术语“杂芳基”是指，在环中具有至少1个杂原子的、单一芳香环或缩合多环系，该杂原子可选自氧、氮和硫。关于杂芳基，代表性的可以是5～26元，在一些实施方式中，可以是5～20元、5～14元、5～12元、或5～10元。杂芳基包含在环中具有约1～6个碳原子、以及选自氧、氮和硫的约1～4个杂原子的单一芳香环。作为这样的环，可举出：吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噁唑基、呋喃基等，但不限于这些。如果环为芳香族，则硫和氮原子也可以以氧化形式存在。杂芳基还包含可与预先定义的杂芳基为选自杂芳基(例如萘啶基、例如形成1,8-萘啶基)、杂环(例如1,2,3,4-四氢萘啶基、例如形成1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶基)、碳环(例如，形成5,6,7,8-四氢喹啉基)和芳基(例如形成吲唑基)的1个或多个环进行缩合而形成缩合多环系的缩合多环系(例如，包含2、3或4个环的环系)。在一些实施方式中，杂芳基(单一芳香环或缩合多环系)在杂芳基环中具有约1～20个碳原子和约1～6个杂原子。这样的缩合多环系在缩合环的碳环或杂环部分中可被1个或多个(例如，1、2、3或4个)氧代基取代。在价数的要素允许的情况下，缩合多环系的环可经由缩合、螺环和交联键而彼此键合。应该理解为：缩合多环系的各环彼此可以以任意的顺序进行键合。也应该理解为：上述缩合多环系的键合点可存在于包括缩合多环系的杂芳基、杂环、芳基或碳环部分在内的缩合多环系的任意位置、以及包括碳原子和杂原子(例如，氮)在内的缩合多环系的任意的适当原子。作为示例的杂芳基，可举出：喹啉基、苯并噻唑基、吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡唑基、噻吩基、吲哚基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噁二唑基、噻二唑基、异喹啉基、苯并噁唑基、吲唑基、喹喔啉基、喹唑啉基、5,6,7,8-四氢异喹啉基苯并呋喃基、苯并咪唑基、硫茚基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、喹唑啉-4(3H)-酮基、三唑基、4,5,6,7-四氢-1H-吲唑基和3b,4,4a,5-四氢-1H-环丙并[3,4]环戊并[1,2-c]吡唑基(3b,4,4a,5-tetrahydro-1H-cyclopropa[3,4]cyclopenta[1,2-c]pyrazole group)等，但不限于这些。
除非另有指定，否则在本说明书中使用的情况下，单独或作为另一基团的一部分的“卤(halo)”或“卤素(halogen)”是指，氟(fluoro)、氯(chloro)、溴(bromo)、或碘(iodo)。
除非另有指定，否则在本说明书中使用的情况下，单独或作为另一基团的一部分的“卤代烷基”是指，氢原子中的1个以上分别独立地被卤(halo)取代的烷基。作为卤代烷基的例子，可举出：-CCl3、-CFCl2、-CF2Cl、-CCl2CCl3、-CH2F、-CHF2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH(Cl)CH2Br、-CH2CH(F)CH2Cl等。“卤代烯基”、“卤代炔基”和“卤代脂肪族基”等也与前述的“卤代烷基”同样地进行定义。
在本说明书中使用的情况下，单独或作为另一基团的一部分的“碳环”或“碳环式基”是指，完全饱和或包含1个以上不饱和单元但不为芳香族的单环式、双环式、三环式或超过其的多环式的烃基。在一个实施方式中，碳环式基可以是单环式的C3～9烃基、双环式的C8～12烃基、或三环式的C10～16烃基。上述碳环式基中的任意的个别环可具有3～7个的环原子。作为碳环式基的例子，可举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基等环烷基；环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、环壬烯基等环烯基；和环丙炔基、环丁炔基、环戊炔基、环己炔基、环庚炔基、环辛炔基、环壬炔基等环炔基；以及金刚烷基等，但不限于这些。碳环式基中，在可能的情况下，任何的环原子均可与分子的其余部分键合。
在本说明书中使用的情况下，单独或作为另一基团的一部分的“杂环”、“杂环基”或“杂环式基”是指，其环系中的至少1个环包含相同或不同的1个以上杂原子、完全饱和或包含1个以上不饱和单元但不为芳香族的单环式、双环式、三环式或超过其的多环式的环系。在一些实施方式中，“杂环”或“杂环式基”具有3～14个的环原子，在此，1个以上的环原子为独立地选自氧、硫、氮或磷的杂原子，其环系中的各环包含3～8个的环原子。
作为杂环式基的例子，可举出：2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢苯硫基、3-四氢苯硫基、2-吗啉代基、3-吗啉代基、4-吗啉代基、2-硫代吗啉代基、3-硫代吗啉代基、4-硫代吗啉代基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-四氢哌嗪基、2-四氢哌嗪基、3-四氢哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、5-吡唑啉基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、2-噻唑烷基、3-噻唑烷基、4-噻唑烷基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、5-咪唑烷基等单环；以及3-1H-苯并咪唑-2-酮基、3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮基、吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并硫杂戊环基(benzothiolane group)、苯并二噻烷基(benzodithian group)和1,3-二氢-咪唑-2-酮基等双环，但不限于这些。杂环式基中，在可能的情况下，任何的环原子均可与分子的其余部分键合。
在本说明书中使用的情况下，术语“不饱和”是指某部分具有1个以上的不饱和单元。
在“杂脂肪族基”、“杂环”、“杂环式基”、“杂芳基”、和“亚芳基”被取代的情况下，如果可以取代，则可以在杂原子上具有取代基。
在某基团“被取代的”情况下，该基团的至少1个氢被氢以外的基团(取代基)取代，该取代基的数目，只要可以取代即可没有特别限制，可为1个或多个。另外，除特别指示的情况外，各基团的说明也适用于该基团为其他基团的一部分或取代基的情形。需要说明的是，例如，在C1～6烷基被某取代基取代的情况下，该取代基的碳数不包含在该烷基的碳数内。其他基团也同样。
在本说明书中，“氨基酸”以该技术领域中的通常含义使用，并且是指在1个分子内具有羧基和氨基的化合物。代表性的氨基酸为α氨基酸，但在本说明书中也可以是β氨基酸和γ氨基酸等羧基与氨基的距离更远的氨基酸。而且，在本说明书中，除非另有说明，否则氨基酸表示L体的光学异构体，在为D体的情况下，首先标注D(或、d)(例如，D-Ala(或、d-Ala))、或用小写字母的字母(例如，a)表示。以下给出氨基酸的代表性例子，但在本说明书中也考虑其他氨基酸。
[表1]
表1：代表性的氨基酸
Figure DEST_PATH_IMAGE002
作为除上述表1所记载的以外的示例的氨基酸，可举出：高脯氨酸、苯基甘氨酸、苯乙基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、β-萘基丙氨酸、β-高色氨酸、喹啉基丙氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、肌氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、羟基脯氨酸、以及上述天然型氨基酸的修饰体(修饰氨基酸)、和非天然型氨基酸的修饰体(修饰氨基酸)，但不限于这些。
[表2]
表2：除20种代表性的天然氨基酸以外的氨基酸的例
Figure DEST_PATH_IMAGE004
作为进一步的氨基酸，还可举出：以下的修饰氨基酸。
・NH2-CH(R’)-COOH[式中，R’具有(键、或直链或支链亚烷基或亚烯基(例如，C1～5))-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基(例如，C1～3)、可被卤素原子取代的直链或支链甲氧基(例如，C1～3)、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基(例如，5～18元环、和/或单环、双环或三环式))的结构]；
・NH2-CH(R’)-COOH[式中，R’为-(直链或支链烷基或烯基(例如，C1～5))]
[化学式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE006
[式中，R’为直链或支链亚烷基或亚烯基(例如，C3～8)]；
・NH2-CH(R’)-COOH[式中，R’为-(直链或支链烷基或烯基(例如，C1～8))，在此，上述烷基或烯基中的任意的1个碳原子可被硫原子取代，可进一步具有-SH]；
・NH2-CH(R’)-COOH[式中，R’为-(直链或支链烷基或烯基(例如，C1～10))，在此，任意的1、2或3个碳原子可被氮原子取代]。
本说明书中，“保守取代”是指，将肽中的氨基酸取代成其他的性质类似的氨基酸，可预测肽的性质在保守取代的前后是类似的。 在一个实施方式中，保守取代是将以下的氨基酸组中的氨基酸用相同组内的氨基酸进行取代。
・组1：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
・组2：丝氨酸和苏氨酸；
・组3：苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和高色氨酸、苯基甘氨酸、苯乙基甘氨酸、苯并噻唑基丙氨酸、α-萘基丙氨酸、β-萘基丙氨酸、喹啉基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、苯并吡唑基丙氨酸、及其芳香环上的1个或2个氢原子被甲基、甲氧基、羟基或卤素原子取代而得的氨基酸；
・组4：赖氨酸、精氨酸、组氨酸和鸟氨酸；
・组5：半胱氨酸、蛋氨酸、高半胱氨酸和青霉胺；
・组6：脯氨酸和高脯氨酸；
・组7：谷氨酸和天冬氨酸；
・组8：谷氨酰胺和天冬酰胺。
在一个实施方式中，保守取代是指被包含以下任一种修饰的氨基酸取代：去除原始氨基酸所含的任意1个-CH2-部分；在氨基酸的任意1个部分中添加-CH2-或-CH3部分；原始氨基酸的任意1个氢原子被烷基(例如，甲基)、烷氧基(例如，甲氧基)、羟基或卤素原子取代；或在原始氨基酸中的芳香环的任一位置上去除或添加1个碳原子而使环缩小或扩大。
包含保守取代的本发明的肽或其盐或溶剂合物、或其前药与原始肽同样地保持下述中的1个以上的特性：EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性。
本说明书中，针对肽的“二硫键”是指在1个肽分子内所形成的S-S键。典型的是，二硫键形成在分别存在于2个半胱氨酸残基上的硫原子彼此之间，但在本说明书中存在于肽分子内的任意的硫原子之间的键也称为二硫键。在一个实施方式中，肽分子内的二硫键形成在存在于肽的侧链的硫原子之间。
本说明书中，“药物成分”是指可构成药物的任意成分，例如可示例：有效成分(其自体显示出药效)、添加成分(其自体不期待药效，但作为药物包含的情况下，可期待发挥一定作用(例如，赋形剂、润滑剂、表面活性剂等)的成分)、佐剂(增强有效成分的药效)等。药物成分可以是单独的物质，也可以是多种物质或制剂的组合。也可包含有效成分与添加成分的组合、佐剂与有效成分的组合等任意的组合。
本说明书中，“有效成分”是指发挥预期药效的成分，可以是单独或多种的成分。
本说明书中，“添加成分”是指不期待药效但在作为药物包含的情况下发挥一定作用的任意成分，例如可举出：药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、缓冲剂、粘合剂、爆炸剂、稀释剂、香味料、润滑剂。
本说明书中所使用的药物成分可以是被纯化的成分。本说明书中所使用的术语“被纯化”是指，存在优选至少75重量％、更优选至少85重量％、更进一步优选至少95重量％、而且最优选至少98重量％的、同型的生物学的因子。
本说明书中，“受试者(subject)”是指，成为本发明的治疗等对象的对象。
本说明书中，“药剂”、“剂”或“因子”(英文均相当于agent)在广义上可互换使用，只要可实现预期目的即可，可以是任何物质或其他元素(例如，光、辐射能、热、电等能量)。作为这样的物质，例如可举出：蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如，包含诸如cDNA、基因组DNA的DNA、诸如mRNA的RNA)、多糖、寡糖、脂质、有机小分子(例如，激素、配体、信息传递物质、有机小分子、通过组合化学合成的分子、可用作医药品的小分子(例如，小分子配体等)等)、它们的复合分子，但不限于这些。
本说明书中，“治疗”是指，针对某种疾病或紊乱，在成为这样的状态的情况下，防止这样的疾病或紊乱恶化、优选维持现状、更优选减轻、进一步优选消失，且包括可发挥患者的疾病或伴随疾病的1个以上症状的、症状改善效果或预防效果。事先进行诊断且进行适当的治疗称为“伴侣疗法”，为此目的诊断剂称为“伴侣诊断剂”。
本说明书中，“治疗药(剂)”广义上是指可治疗目标状态的所有药剂。本发明的一实施方式中，“治疗药”可以是包含有效成分和1个或多个药理学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可通过例如将有效成分与上述载体混合、并利用制剂学的技术领域中已知的任意方法来制造。另外，治疗药只要是可用于治疗的物质即可，对其使用方式没有限定，可以是单独的有效成分，也可以是有效成分与任意成分的混合物。另外，对上述载体的形状没有特别限定，可以是例如固体或液体(例如，缓冲液)。
本说明书中，“预防”是指，针对某种疾病或紊乱，在成为这样的状态之前，使其不成为这样的状态。可使用本发明的药剂来进行诊断，并且可根据需要使用本发明的药剂来进行疾病或紊乱的预防、或采取用于预防的对策。
本说明书中，“预防药(剂)”广义上是指可预防目标状态的所有药剂。
本说明书中，“试剂盒”是指，通常分为2个以上隔室而提供应提供的部分(例如，检查药、诊断剂、治疗药、标识、说明书等)的单元。为了稳定性等，不应混合提供，而是在使用前立即混合使用，当以提供这样的优选组合物为目的时，该试剂盒的形式是优选的。这样的试剂盒优选具备记载有如何使用所提供的部分(例如，检查药、诊断剂、治疗药)或应如何处理试剂的指示书或说明书是有利的。
本说明书中，“指示书”是记载对医师或其他用户说明使用本发明方法的文书。该指示书记载了指示给予本发明的药物等的描述。另外，在指示书中可记载指示给予方式(例如，口服、注射等)的描述。该指示书按照实施本发明的国家的监管机构(例如，在日本为厚生劳动省、在美国为食品及药品管理局(FDA)等)规定的格式进行制作，并附有明确的说明，表明获得了该监管机构的批准。指示书是所谓的附属文书(package insert，药品说明书)，通常以纸媒介提供，但不限于此，例如还可以电子媒介(例如，在互联网上提供的网站、电子邮件)等方式提供。
本说明书中，“诊断”是指，鉴定与受试者的疾病、紊乱、状态等相关的各种参数，以判定这样的疾病、紊乱、状态的现状或未来。本说明书中，“诊断”狭义上是指诊断现状，但广义上包括“早期诊断”、“预测诊断”、“事前诊断”等。
本发明的作为药物等的配制程序是该领域中已知的，例如，记载于日本药典、美国药典、其他国家的药典等中。因此，本领域技术人员可根据本说明书的记载来确定应使用的量，而无需进行过度的实验。
(优选实施方式的说明)
以下，对本发明的优选实施方式进行说明。以下所提供的实施方式是为了更好地理解本发明而提供的，可理解为：本发明的范围不应限于以下的记载。因此，本领域技术人员可参考本说明书中的记载，在本发明的范围内进行适当改变。对于这些实施方式，本领域技术人员可适当地组合任意的实施方式。
＜抗EpoR肽的结构＞
在一个方面中，本发明提供抗EpoR肽。在特定的实施方式中，本发明的肽与CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)进行比较具有1个以上改善的特性。作为这样的特性，例如可举出：EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性等，但不限于这些。
本发明涉及基于CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)的修饰肽。修饰肽具有-[SCHFGPLTWVCK]-的基本结构，可以是基于具有该结构的肽的修饰肽或其前药或其盐。例如，该修饰肽或其前药或其盐在CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)的任意的部分(包含肽的氨基末端和羧基末端)包含至少1个修饰，优选包含2个修饰、或3个修饰或4个修饰或修饰的修饰。在优选的实施方式中，本发明的肽在CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ IDNO: 9)中的氨基末端、羧基末端、F和W所对应的部分中的1个、2个、3个或全部包含修饰。
在另一个方面中，本发明的抗EpoR肽具有由以下的式(I)表示的结构。
式(I)：
X1-SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)-X2(SEQ ID NO: 1)
[式中，X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧]。
在式(I)的一个实施方式中，A1为-NH-CH(RA1)-CO-，式中，RA1具有(键、或直链或支链亚烷基或亚烯基)-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的直链或支链甲氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基)的结构。在式(I)的一个实施方式中，A1为-NH-CH(RA1)-CO-，式中，RA1为-(键、或C1～5的直链或支链亚烷基或亚烯基)-(可被卤素原子取代的C1～3的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的C1～3的直链或支链烷氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的5～18元的单环、双环或三环式芳基或杂芳基)，在此，任意数目的上述取代基可在任意位置存在于芳基或杂芳基上。在式(I)的一个实施方式中，A1为-NH-CH(RA1)-CO-，式中，RA1为(键、或C1～3的直链或支链亚烷基)-(C1～3的直链或支链烷基(例如，甲基)、C1～3的直链或支链烷氧基(例如，甲氧基)、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的单环或双环式芳基或杂芳基(例如，苯、萘、吡啶、噻吩或苯并噻吩))。在式(I)的一个实施方式中，A1为Met、或可被甲基、甲氧基、卤素原子或羟基取代的Phe、Tyr、苯基甘氨酸或苯乙基甘氨酸，在此，任意位置且任意数目的甲基、甲氧基、卤素原子或羟基可存在于芳香环上。在式(I)的一个实施方式中，A1中的芳香环上的甲基、甲氧基、卤素原子或羟基可存在于间位(间)、对位(对)或它们的组合(3,4-)上。在式(I)的一个实施方式中，A1为Phe、Tyr、对氟-Phe、对氯-Phe、间氯-Phe、3,4-二氟-Phe、苯基甘氨酸或苯乙基甘氨酸。不希望受任何理论的束缚，认为当抗EpoR肽与EpoR结合时，A1的残基可能存在于相当于EpoR的脂溶性口袋(lipophilic pocket)的位置。抗EpoR肽中，在A1为对氟-Phe、Tyr、苯乙基甘氨酸或氯取代Phe的情况下，观察到较高的活性。认为还可在A1的残基与EpoR之间形成氢键。A1中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，A2为-NH-CH(RA2)-CO-，式中，RA2为-(H、或C1～5的直链或支链烷基或烯基)。在式(I)的一个实施方式中，A2为Ala、D-Ala或Gly。A2中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，A3为-NH-CH(RA3)-CO-，式中，RA3为-(H、或C1～5的直链或支链烷基或烯基)。在式(I)的一个实施方式中，A3为
[化学式2]
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，在此，RA3为C3～8的直链或支链亚烷基或亚烯基。在式(I)的一个实施方式中，A3为Pro、高脯氨酸或Ala。A3中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。优选式(I)的肽具有至少1个较具有CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ IDNO: 9)结构的肽改善的特性。
在式(I)的一个实施方式中，A4为-NH-CH(RA4)-CO-，式中，RA4为-(H、或C1～5的直链或支链烷基或烯基)，在此，在一个实施方式中，上述烷基或烯基中的任意1个碳原子可被硫原子取代。在式(I)的一个实施方式中，A4为Met、Leu、Ala或IleI。在式(I)的特定的实施方式中，A4为Met或Leu。A4中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，A5为-NH-CH(RA5)-CO-，式中，RA5为-(H、或C1～5的直链或支链烷基或烯基)，在此，在一个实施方式中，上述烷基或烯基中的任意1个氢原子可被羟基取代。在式(I)的一个实施方式中，A5为Thr或Ala。A5中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持强的EpoR抑制能、高的癌细胞杀伤能、低的正常细胞杀伤能、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效的改善、副作用的降低、对特定部位的特异性迁移能、改善的吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度的改善、和高的稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，A6为-NH-CH(RA6)-CO-，式中，RA1具有(键、或直链或支链亚烷基或亚烯基)-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的直链或支链烷氧基(例如，甲氧基)、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基)的结构。在式(I)的一个实施方式中，A6为-NH-CH(RA6)-CO-，式中，RA6为-(键、或C1～5的直链或支链亚烷基或亚烯基)-(可被卤素原子取代的C1～3的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的C1～3的直链或支链烷氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的5～18元的单环、双环或三环式芳基或杂芳基)，任意数目的上述取代基可在任意位置存在于芳基或杂芳基上。在式(I)的一个实施方式中，A6为-NH-CH(RA6)-CO-，式中，RA6为-(键、或C1～3的直链或支链亚烷基)-(C1～3的直链或支链烷基(例如，甲基)、C1～3的直链或支链烷氧基(例如，甲氧基)、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的5～18元的单环或双环式芳基或杂芳基(例如，苯、吲哚、萘、苯并噻唑和喹啉))。在式(I)的一个实施方式中，A6为Met、或可被甲基、甲氧基、羟基或卤素原子取代的Trp、Phe、Tyr、β-高色氨酸、苯并噻唑基丙氨酸、α-萘基丙氨酸、β-萘基丙氨酸或喹啉基丙氨酸，在此，任意位置且任意数目的甲基、甲氧基、羟基或卤素原子可存在于芳香环上，苯并噻唑基丙氨酸可以是2-苯并噻唑基丙氨酸、4-苯并噻唑基丙氨酸、5-苯并噻唑基丙氨酸、6-苯并噻唑基丙氨酸、或7-苯并噻唑基丙氨酸的任一种，喹啉基丙氨酸可以是2-喹啉基丙氨酸、3-喹啉基丙氨酸、4-喹啉基丙氨酸、5-喹啉基丙氨酸、6-喹啉基丙氨酸、7-喹啉基丙氨酸、或8-喹啉基丙氨酸的任一种。在式(I)的一个实施方式中，A6为Trp、Met、β-高色氨酸、2-苯并噻唑基丙氨酸、α-萘基丙氨酸、β-萘基丙氨酸、6-氯-Trp、5-氯-Trp、2-喹啉基丙氨酸或8-喹啉基丙氨酸。在式(I)的特定的实施方式中，A6为Trp、Met、8-萘基丙氨酸、2-喹啉基丙氨酸、5-氯-Trp、或2-苯并噻唑基丙氨酸，在更具体的实施方式，A6可为2-苯并噻唑基丙氨酸。A6中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，A7为-NH-CH(RA7)-CO-，式中，RA7为-(H、或C1～8的直链或支链烷基或烯基)，在此，在一个实施方式中，上述烷基或烯基中的任意1个碳原子可被硫原子取代，在一个实施方式中，具有-SH基。在式(I)的一个实施方式中，A7为Cys、高半胱氨酸或青霉胺。A7中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，A8为-NH-CH(RA8)-CO-，式中，RA8为-(C1～10的直链或支链烷基或烯基[式中，任意的1、2或3个碳原子可被氮原子取代])。在式(I)的一个实施方式中，A8为Lys、Arg或不存在。A8中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，X1为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-C(＝O)R1，在此，R1选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，在此，各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3。在一个实施方式中，X1为-COOH、丙酰基、或可被卤素取代的苯甲酰基或苯基乙酰基。在一个实施方式中，X1为Gly-Thr-Tyr、Thr-Tyr、Tyr、Phe、Ala、Trp或这些氨基末端被直链或支链C1～5酰基取代的部分。在一个实施方式中，X1为苯甲酰基或对氟苯基乙酰基。X1中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的一个实施方式中，X2为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-NR1 2，在此，各R1选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，或者与同一原子键合的2个R1一起形成可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环，各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3。在一个实施方式中，X2为Pro-Gln-Gly、Pro-Gln、Pro或这些羧基末端被酰胺取代的部分。在一个实施方式中，X2为NH2。X2中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(I)的实施方式中，肽中的任意2个硫原子可形成二硫键。在一个实施方式中，A8中的硫原子与另一硫原子(例如，从氨基末端起第2位Cys中的硫原子)形成二硫键。
在式(I)的实施方式中，考虑由A1～A8、X1和X2的任意组合表的化合物。
在一个实施方式中，式(I)中的SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6) V(A7)(A8)(SEQ IDNO: 1)的部分具有从SCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO: 2)的结构中仅取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氨基酸而得的结构，在更具体的实施方式，具有从SCHFGPLTWVCK(SEQ IDNO: 2)的结构中仅取代1个、2个或3个氨基酸而得的结构。在一个实施方式中，式(I)中的SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)的部分具有从SCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO: 2)的结构中仅取代A1、A6或它们的组合而得的结构。在一个实施方式中，式(I)中的SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)的部分不是SCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO: 2)。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽包含Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO:9)结构中的-Ac、-NH2、F和W中的1个、2个、3个或全部的修饰。在一个实施方式中，包含该F和/或W中的修饰的本发明的抗EpoR肽可具有较Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)肽改善的活性(例如，EpoR抑制能、癌细胞杀伤能)。在一个实施方式中，包含该-Ac和/或-NH2中的修饰的本发明的抗EpoR肽可保持不含该修饰的肽的活性(例如，EpoR抑制能、癌细胞杀伤能)。在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽包含在Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)结构中的除-Ac、-NH2、F和W以外的氨基酸处的修饰，独立于上述-Ac、-NH2、F和W的修饰，而且这些修饰可保持不含该修饰的肽的活性(例如，EpoR抑制能、癌细胞杀伤能)的状态，例如，若使SEQ ID NO: 9中的L变更为A进行修饰，则可提高肽的亲水性。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽是具有上述式(I)中的SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)(SEQ ID NO: 1)部分的各氨基酸全部被D-氨基酸取代、且氨基酸的顺序颠倒的结构、并且X1和X2与上述同义的肽。这样的肽例如在代谢中可显示不同的行为。
在一个具体的式(I)的实施方式中，A2可为Gly，A3可为Phe，A5可为Thr，A7可为Cys，且/或A8可为Lys。在一个具体的式(I)的实施方式中，A1可为Tyr、对氟苯丙氨酸、或苯乙基甘氨酸，在更具体的实施方式，可为Tyr。在一个具体的式(I)的实施方式中，A4可为Leu或Met，在更具体的实施方式，可为Met。在一个具体的式(I)的实施方式中，A6可为Trp、Met、8-萘基丙氨酸、2-喹啉基丙氨酸、5-氯-Trp、或2-苯并噻唑基丙氨酸。在一个更具体的式(I)的实施方式中，A6可为2-苯并噻唑基丙氨酸。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽具有由以下的式(II)表示的结构。
式(II)：
X1-kcvwtl(B1)Gfhcs-X2
[式中，X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧]。
在式(II)的一个实施方式中，B1为Gly或D-脯氨酸。B1中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(II)的一个实施方式中，X1为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-C(＝O)R1，在此，R1选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，在此，各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3。在一个实施方式中，X1为-COOH、丙酰基、或可被卤素取代的苯甲酰基或苯基乙酰基。在一个实施方式中，X1为Gly-Thr-Tyr、Thr-Tyr、Tyr、Phe、Ala、Trp或这些氨基末端被直链或支链C1～5酰基取代的部分。在一个实施方式中，X为苯甲酰基或对氟苯基乙酰基。X1中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在式(II)的一个实施方式中，X2为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-NR1 2，在此，各R1选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，或者与同一原子键合的2个R1一起形成可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环，各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3。在一个实施方式中，X2为Pro-Gln-Gly、Pro-Gln、Pro或这些羧基末端被酰胺取代的部分。在一个实施方式中，X2为NH2。X2中具有上述范围的结构的抗EpoR肽，可预测良好地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的至少1个特性。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽是具有上述特定结构的肽中的任意数目(例如，1、2、3、4、5或6个)的氨基酸从L体取代成D体而得的肽。在一个实施方式中，与Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)中的除F和W以外对应的氨基酸为D体。虽然不希望受任何理论的束缚，但是肽形成的片层结构也可通过将一部分氨基酸从L体取代成D体来改变，因此可导入D体氨基酸以保持该片层结构。这样的L体取代成D体而得的肽也可与原始肽同样地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、和稳定性中的1个以上特性。在一个实施方式中，与Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)中的F和W对应的氨基酸可为D体，在该实施方式中，可改变肽的活性。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽是具有上述特定结构的肽中的任意数目(例如，1、2、3、4、5或6个)的氨基酸被保守取代而得的肽。包含这样的保守取代的肽也可与原始肽同样地保持EpoR抑制能、癌细胞杀伤能、正常细胞杀伤能的降低、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效、副作用、对特定部位的迁移能、吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度和稳定性中的1个以上特性。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽是具有以下的任一种结构的化合物(式中，X1和X2与上述定义相同)。
X1-SCHFGPLTWVCK-X2[SEQ ID NO: 2]
X1-SCH(对氟-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(对氯-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(间氯-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCHYGPLTWVCK-X2[SEQ ID NO: 3]
X1-SCH(苯基甘氨酸)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(苯乙基甘氨酸)GPLTWVCK-X2
X1-SCHFAPLTWVCK-X2[SEQ ID NO: 4]
X1-SCHFaPLTWVCK-X2
X1-SCHFGALTWVCK-X2[SEQ ID NO: 5]
X1-SCHFG(高脯氨酸)LTWVCK-X2
X1-SCHFGPATWVCK-X2[SEQ ID NO: 6]
X1-SCHFGPMTWVCK-X2[SEQ ID NO: 7]
X1-SCHFGPLTMVCK-X2[SEQ ID NO: 8]
X1-SCHFGPLT(6-氯-Trp)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(5-氯-Trp)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(β-高色氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(α-萘基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(β-萘基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLTWV(高半胱氨酸)K-X2
X1-SCHFGPLTWV(青霉胺)K-X2
X1-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHYGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-X2X1
SCHYGPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCH(对氟-Phe)GPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-X2X1
SCHYGPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-X2
X1-kcvwtlpGfhcs-X2
X1-kcvwtlGGfhcs-X2
X1-SCH(4-吡啶基丙氨酸)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(3-吡啶基丙氨酸)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(对甲氧基-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(间甲氧基-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(间羟基-Phe)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(1-萘基丙氨酸)GPLTWVCK-X2
X1-SCH(2-萘基丙氨酸)GPLTWVCK-X2
X1-SCHFGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHFGPLT(3-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2
X1-SCHYGPMT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-X2。
在一个实施方式中，本发明的抗EpoR肽是具有以下的任一种结构的化合物(式中，Ac为乙酰基)。
Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2[SEQ ID NO: 9]
(苯甲酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2
(对氟苯乙酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2
(丙酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(对氯-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(间氯-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCHYGPLTWVCK-NH2[SEQ ID NO: 10]
Ac-SCH(苯基甘氨酸)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(苯乙基甘氨酸)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCHFAPLTWVCK-NH2[SEQ ID NO: 11]
Ac-SCHFaPLTWVCK-NH2
Ac-SCHFGALTWVCK-NH2[SEQ ID NO: 12]
Ac-SCHFG(高脯氨酸)LTWVCK-NH2
Ac-SCHFGPATWVCK-NH2[SEQ ID NO: 13]
Ac-SCHFGPMTWVCK-NH2[SEQ ID NO: 14]
Ac-SCHFGPLTMVCK-NH2[SEQ ID NO: 15]
Ac-SCHFGPLT(6-氯-Trp)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(5-氯-Trp)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(β-高色氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(α-萘基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(β-萘基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLTWV(高半胱氨酸)K-NH2
Ac-SCHFGPLTWV(青霉胺)K-NH2
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHYGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHYGPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHYGPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-kcvwtlpGfhcs-NH2
Ac-kcvwtlGGfhcs-NH2
Ac-SCH(4-吡啶基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(3-吡啶基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(对甲氧基-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(间甲氧基-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(间羟基-Phe)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(1-萘基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCH(2-萘基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHFGPLT(3-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2
Ac-SCHYGPMT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2。
在一个实施方式中，本发明的肽用保护基(例如，甲酰基、乙酰基等C1-6酰基等)保护，例如，在分子内的氨基酸的侧链上的OH、NH2、SH等上导入保护基。在一个实施方式中，糖链或PEG链可与本发明的肽结合。
本发明的肽能够以盐的形式提供。作为盐，可以是碱加成盐和酸加成盐的任一种，但优选为生理上可接受的酸加成盐。作为酸加成盐，例如可举出：与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐；与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等)的盐等。作为碱加成盐，例如可举出：与无机碱(例如，钠、钾、钙、镁、铝、铵等)的盐；与有机碱(例如，三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺、N,N’-二苄基乙二胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等)的盐。
本发明的肽可以是溶剂合物的形式。溶剂只要是药学上可接受的溶剂即可，没有特别限定，例如可举出：水、乙醇、甘油、乙酸等。
本发明的肽可进行前药化。作为前药，可使用在生物体内的生理条件下进行酶促反应(氧化、还原、水解等)、或与胃酸等发生反应而转化成本发明的肽的化合物等。在一个实施方式中，作为本发明的前药的例子，可举出：本发明的肽的氨基被酰基化、烷基化、磷酸化的化合物(例如，被二十烷酰基化(eicosanoylated)、丙氨酰基化、戊基氨基羰基化、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基羰基化、四氢呋喃基化、吡咯烷基甲基化、新戊酰基氧基甲基化、叔丁基化的化合物等)；和本发明的肽的羟基被酰基化、烷基化、磷酸化、硼酸化的化合物(例如，被乙酰基化、棕榈酰基化、丙酰基化、新戊酰基化、琥珀酰基化、富马酰基化、丙氨酰基化、二甲基氨基甲基羰基化的化合物等)等。这些化合物可根据已知的方法由本发明的肽进行制造。
本发明的肽可按照已知的肽的合成法进行制造。作为肽的合成法，例如可以是固相合成法或液相合成法。即，使可构成本发明的肽的部分肽或氨基酸与剩余部分缩合，在产物具有保护基的情况下，通过脱离保护基，可制造目标肽。作为已知的缩合方法或保护基的脱离，例如可举出：以下(1)～(3)所记载的方法。
(1) 泉屋信夫他、Fundamentals and experiments of peptide synthesis、丸善(株) (1985年)；
(2) 实验化学讲座第5版、Polymer chemistry、26卷、丸善(株) (2007年)；
(3) 野上靖纯著、Partner Pharmaceutical Technochemistry、第2版、南江堂(2012年)。
更具体而言，在本发明的肽的合成中可使用通常市售的肽合成用树脂。例如可使用以聚苯乙烯为基材的树脂。为了得到C末端被酰胺化的肽，作为起始原料的树脂，可使用Fmoc-NH-SAL树脂(Rink酰胺树脂)、MBHA树脂、Sieber酰胺树脂、PAL树脂、Ramage酰胺树脂以及在它们的氨基官能团与聚苯乙烯之间导入聚乙二醇等膨润剂或接头而得的树脂等。使用这样的树脂、和用适当的保护基(例如，Boc、Fmoc)保护了α-氨基和侧链官能团的氨基酸作为原料，根据目标肽的序列，按照已知的各种缩合方法，在树脂上进行缩合。反应结束时，从树脂上切出肽，同时去除各种保护基，根据需要进一步在高稀释溶液中实施分子内二硫键形成反应，获取目标肽。保护基的去除(脱离)或从树脂中分离肽可通过已知的方法(例如，基于三氟乙酸的酸处理)来进行。需要说明的是，N末端被酰基化的肽可通过与乙酸酐等反应来调制。从树脂中分离的粗肽可使用已知的各种纯化手段进行纯化。
用于肽合成的氨基酸
用于肽合成的氨基酸(天然氨基酸和非天然氨基酸)可从任意的适当的供给源(例如，Merck、渡边化学、Enamine Ltd.、Bienta、ChemSpace、Sundia MediTech Company,Ltd.、Combi-Blocks. Inc、AnalytiCon Discovery GmbH、PharmaBlock (Nanjing) R&DCo., Ltd、Chemexpress Co., Ltd.、J&W Pharmlab, LLC、SAI Life Sciences Ltd、AstaTech、UkrOrgSyntez、Selleck Chemicals、WuXi AppTec、Vitas-M Laboratory, LTD.、Bepharm、Life Chemicals Inc、Accela ChemBio Co., Ltd.、Apollo Scientific Ltd、NovoChemy Ltd、Key Organics Ltd (Bionet Research)、Matrix Scientific、TorontoReserch chemicals Inc.、MAYBRIDGE、Chem-Impex International, Inc.、Allychem、Pharmeks Ltd.、Biorelevant、AOBChem、ACRO Biosystems、Maison Chemical、AdvancedChemBlocks, Inc.、Bellen、Microsource Discovery Systems, Inc.、Taros ChemicalsGmbH&Co. KG、Senn Chemicals AG、Sinocompound Catalysts Co., Ltd.、SyngeneInternational Ltd.、BroadPharm、EDASA Scientific、Hi-tech chemistry corp.等)获取。另外，关于用于肽合成的氨基酸(天然氨基酸和非天然氨基酸)，本领域技术人员可使用任意的已知的合成法(例如，斯特雷克反应(Strecker, A. (1850年). Ueber diekunstliche Bildung der Milchsaure und einen neuen, dem Glycocoll homologenKorper”. Ann. 75: 27-45.、Strecker, A. (1854年). “Ueber einen neuen ausAldehyd-Ammoniak und Blausaure entstehenden Korper”. Ann. 91: 349-351.))容易地进行合成。另外，将保护基(例如，Boc或Fmoc)和/或标识(例如，放射性原子或生物素)导入至给定氨基酸以合成肽的方法也是已知的，本领域技术人员可容易地实施这样的氨基酸修饰。
＜抗EpoR肽的性能＞
本发明的肽的性质
在一个实施方式中，本发明的肽或其盐或溶剂合物、或其前药，与CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)进行比较，具有1个以上改善的特性。作为这样的特性，例如可举出：对人EpoR的较低的IC50、以较低浓度杀伤癌细胞(例如，HepG2等癌细胞株)的能力、对正常细胞的杀伤需要较高浓度的能力、以较低的给予频率杀伤癌细胞的能力、更多地迁移到特定部位(例如，癌组织)的能力、改善的吸收/分布/代谢/排泄动力学、保管时的更高的稳定性等。
关于用于确认上述性质的试验，通过参考本说明书的记载，本领域技术人员可容易地实施与培养细胞的接触试验、动物模型中的给予试验、血中动力学的试验、毒性评价等。另外，本领域技术人员通过制作具有上述结构的任意的肽，并对所制作的肽实施该试验，可特定具有如上述记载的特性的至少一个的本发明的抗EpoR肽。
在一个实施方式中，关于本发明的抗EpoR肽，在使1.0～1.5×103个的HepG2细胞在包含120μM、60μM、30μM或15μM的该肽的溶液400μL中反应24小时的情况下，1mm2的隔室内的TB(Trypan blue)染色阳性细胞数的平均(例如，10隔室的平均。根据需要、n＝2、3或更多的重复之间的平均)具有与CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)的肽中的结果同等或超过其的HepG2细胞杀伤能力。
在一个实施方式中，关于本发明的抗EpoR肽，在通过WST法进行评价的情况下，相比CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)的肽，可具有强大的抑制(例如，杀伤)至少1种人癌细胞株(例如，肝癌、胰腺癌、白血病的细胞株)的能力，例如，使其与人癌细胞株在150μM下接触72小时，在通过WST法进行评价的情况下，相比CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ IDNO: 9)的肽，显示出强大的抑制效果。
在一个实施方式中，关于本发明的抗EpoR肽，在以ATP量为指标来评价细胞增殖能的情况下，相比CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)的肽，可具有强大的抑制(例如，杀伤)至少1种人癌细胞株(例如，乳癌的细胞株)的能力，例如，使其与人癌细胞株在30或100μM下接触72小时，在以ATP量为指标来评价细胞增殖能的情况下，相比CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)的肽，显示出强大的抑制效果。
在一个实施方式中，关于本发明的抗EpoR肽，在使接种于板上的骨髓细胞(例如，小鼠)与终浓度为100μM的抗EpoR肽和重组人促红细胞生成素(1U/mL)接触72小时的情况下，与仅重组人促红细胞生成素(1U/mL)的对照的结果进行比较，可具有CFU-E(ErythroidColony Forming Unit)的数目没有显著差异的能力。
在一个实施方式中，关于本发明的抗EpoR肽，对于将约5×106细胞的来自人胰腺癌的AsPC-1细胞(ECACC、96020930)移植到右背部皮下的6周齢的雄性裸鼠(BALB/cSlc-nu/nu)，当达到肿瘤体积(V)＝肿瘤的长径(L)×肿瘤的短径(W)2/2＝约150～200mm3时，在将该抗EpoR肽进行腹腔内给予(以0.2mg/天以周2或3次的方案给予2或4周)的情况下，可具有实现下述中的至少1个的能力：
・与非治疗对照进行比较，相比给予CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)肽时，观察到肿瘤体积减小的时期早(例如，1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、或7天以上)；
・相比给予CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2(SEQ ID NO: 9)肽时，给予开始第21天的肿瘤体积小(例如，约10％以上、约20％以上、约30％以上、约40％以上、或约50％以上)；
・给予开始第21天的小鼠体重与非治疗对照进行比较没有差异(例如，与对照的差为小于10％、小于7％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％)；
・给予开始第21天的血细胞比容值与非治疗对照进行比较没有差异(例如，与对照的差为小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％)；
・给予开始第21天的血中血红蛋白浓度与非治疗对照进行比较没有差异(例如，与对照的差为小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％)。
如实施例中所具体记载的那样，本发明的肽确认到肿瘤细胞杀伤效果，并且还包含这些以外的见解在内进行考察的结果，可预测能够有效地用于各种疾病(例如，增殖性疾病、子宫腺肌病或糖尿病视网膜病)。
＜组合物＞
在一个方面中，本发明提供包含本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的组合物。在特定的实施方式中，本发明的组合物具有强的EpoR抑制能、高的癌细胞杀伤能、低的正常细胞杀伤能、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效的改善、副作用的降低、对特定部位的特异性迁移能、改善的吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度的改善、和高的稳定性中的1个以上特性。在一个实施方式中，本发明的组合物可用于治疗或预防增殖性疾病、子宫腺肌病或糖尿病视网膜病。
在包含本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的组合物中可包含任意的添加成分。作为添加成分的例子，例如可举出：载体、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、助溶剂、混悬剂、等渗剂、缓冲剂、止痛剂(无痛化剂)、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、香味料、吸附剂、湿润剂。
作为赋形剂，例如可举出：乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质无水硅酸等。作为润滑剂，例如可举出：硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶态二氧化硅等。作为粘合剂，例如可举出：结晶纤维素、白糖、D-甘露醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。作为崩解剂，例如可举出：淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、L-羟丙基纤维素等。
作为溶剂，例如可举出：注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、芝麻油、玉米油、橄榄油等。作为助溶剂，例如可举出：聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。作为混悬剂，例如可举出：硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等表面活性剂；例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素，羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等的亲水性高分子等。作为等渗剂，例如可举出：葡萄糖、D-山梨糖醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇等。作为缓冲剂，例如可举出：磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲液等。作为止痛剂，例如可举出：苄醇等。作为防腐剂，例如可举出：对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。作为抗氧化剂，例如可举出：亚硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚等。
所调制的注射液通常填充在适当的安瓿中。在给予时，可将注射用组合物溶解于常规的水性稀释剂中，并作为溶液使用。作为水性稀释剂，可举出：葡萄糖水溶液、生理盐水、林格氏液、营养补充剂溶液等。
当在注射剂中包含磷酸或其盐的情况下，该注射剂中的磷酸钠或磷酸钾的浓度可为约0.1mM～500mM、优选约1mM～100mM。作为可用于制备无菌制剂的方法，可举出：使整个制造工序为无菌的方法、用γ射线杀菌的方法、添加防腐剂的方法等，但不限于这些。
在一个实施方式中，本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药或包含其的组合物能够以试剂盒的形式提供。在一个具体的实施方式中，试剂盒具有：(a)容器，其以溶液形状或冻结干燥形状包含：本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药或包含其的组合物；和任选地(b)第2容器，其包含稀释剂或重构溶液的；和任选地(c)说明书。在一个实施方式中，试剂盒可包含(iii)缓冲剂、(iv)稀释剂、(v)过滤器、(vi)针、和(v)注射器中的1个或多个。
在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含用于使用本发明的试剂盒的说明书。作为适当的容器，例如可举出：瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射器(双室注射器等)、和试验管。该容器可由如玻璃或塑料这样的各种材料形成。在一个实施方式中，本发明的试剂盒可包含另一容器，其包含与本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药不同的构成要素。
＜用途＞
本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药、或包含其的组合物可用于任意的适当的用途。在一个实施方式中，该用途可用于预防或治疗增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)、风湿病、瘢痕瘤或糖尿病视网膜病。在一个实施方式中，增殖性疾病可以是子宫腺肌病、恶性肿瘤或良性肿瘤(例如，原发性、转移性或复发性、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌、肛门癌)、食道癌、十二指肠癌、头颈部癌(舌癌、咽癌、喉癌、甲状腺癌)、脑肿瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、子宫癌(子宫体癌、子宫颈癌)、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、血管瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、骨肿瘤、血管纤维瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、小儿实体癌、卡波西肉瘤、AIDS所引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、子宫肌瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、癌性间皮瘤、白血病等的肿瘤等)。在一个实施方式中，增殖性疾病可以是肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、大肠癌、黑色素瘤、脑肿瘤、胃癌、和乳癌。在一个具体的实施方式中，增殖性疾病可以是乳癌、胰腺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、或白血病(或者，由其任意的选择项组成的亚群体)。
本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药、或包含其的组合物可用于任意的对象，例如，可用于鸟类、哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、羊、猪、猴、人等)。
＜使用＞
在一个实施方式中，本发明提供本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药、或包含其的组合物或试剂盒的使用，或在任意的适当用途中的使用方法。在特定的实施方式中，本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药、或包含其的组合物或试剂盒，由于具有强的EpoR抑制能、高的癌细胞杀伤能、低的正常细胞杀伤能、低的给予频率下的癌细胞杀伤能等药效的改善、副作用的降低、对特定部位的特异性迁移能、改善的吸收/分布/代谢/排泄动力学、生物利用度的改善、和高的稳定性中的1个以上特性，因此可用于治疗或预防增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病。因此，在一个实施方式中，本发明提供用于治疗或预防受试者的增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病的方法，该方法包括对该受试者给予有效量的本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的工序。另外，在其他的实施方式中，本发明提供本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药在制造用于治疗或预防增殖性疾病(例如，子宫腺肌病)或糖尿病视网膜病的药物中的使用。
含量
在包含本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的组合物中，本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的含量可根据组合物的形态而不同，例如，相对于组合物整体，可以是约0.1～100重量％、约0.5～50重量％、约1～30重量％、约5～20重量％、约10～99.9重量％、约20～90重量％、约0.1重量％、约0.2重量％、约0.5重量％、约1重量％、约2重量％、约5重量％、约10重量％、约20重量％、约50重量％。在本发明的组合物中，除本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药以外的成分的含量可根据组合物的形态而不同，例如，相对于组合物整体，可以是约10～99.9重量％、或约20～90重量％。
给予方案
本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药、或包含其的组合物，例如，每天每公斤体重的本发明的肽可在约0.005～50mg、约0.05～10mg、或约0.2～4mg的剂量下以单次或多次进行给予。本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药、或包含其的组合物能够以任意的适当的给予频率进行给予，例如能够以1天3次、1天2次、1天1次、隔天、每3天1次、每4天1次、每5天1次、隔周、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每2个月1次、每3个月1次、每4个月1次、每5个月1次、每6个月1次、或每1年1次的频率进行给予。
给予途径
包含本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的组合物可通过任意的适当的给予途径进行给予，例如可通过静脉内、局部、肌肉内、皮下、皮内、经皮、直肠、经阴道、口服腔粘膜、经肺粘膜、经鼻、经眼或口服(经肠)等途径进行给予。
剂型
包含本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药的组合物可制剂化成任意的适当的剂型，例如可制成液剂、注射剂、贴剂、微针、栓剂、缓释剂、片剂(包含糖衣片、薄膜包衣片)、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包含软胶囊)等的剂型。
组合
本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药可与任意的适当的药剂组合使用。作为这样的药剂的例子，例如可举出：内分泌疗法药、化学疗法剂、免疫疗法剂(BRM)、细胞生长因子、抑制细胞生长因子的作用的药剂等。
作为内分泌疗法药，例如可举出：磷雌酚、己烯雌酚、氯烯雌酚、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、乙酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、美帕曲星、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗雌激素(例如，枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬等)、药丸制剂、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、LH-RH激动剂(例如，乙酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、炔雌醇磺酸盐、芳香化酶抑制药(例如，盐酸法曲唑、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏罗唑、福美坦等)、抗雄激素(例如，氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制药(例如，非那雄胺、依立雄胺等)、肾上腺皮质激素系药剂(例如，地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安奈德等)、雄激素合成抑制药(例如，阿比特龙等)、类视黄醇和减缓类视黄醇代谢的药剂(例如，利阿唑等)等。
作为化学疗法剂，例如可举出：烷基化剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生物质、来自植物的抗癌剂等。
作为烷基化剂，例如可举出：氮芥、氮芥-N-氧化物盐酸盐、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替派、卡波醌、甲磺丙胺(improsulfan tosilate)、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、美法仑、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、曲他胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、哌泊溴烷、依托格鲁、卡铂、顺铂、米铂、奈达铂、奥沙利铂、六甲蜜胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵盐酸盐、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、核莫司汀(ribomustine)、替莫唑胺、曲奥舒凡、曲磷胺、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲、比折来新等。
作为代谢拮抗剂，例如可举出：巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、依诺他滨、阿糖胞苷、八磷酸阿糖胞苷(cytarabineocphosphate)、盐酸安西他滨、5-FU系药剂(例如，氟尿嘧啶、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨、依米替氟等)、氨基蝶呤、亚叶酸钙、tabloid、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、噻唑呋林、氨莫司汀等。
作为抗癌性抗生物质，例如可举出：放线菌素D、放线菌素C、丝裂霉素C、色霉素A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿克拉霉素、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、新制癌菌素、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星等。
作为来自植物的抗癌剂，例如可举出：依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨等。
作为免疫疗法剂(BRM)，例如可举出：溶链菌制剂(picibanil)、云芝多醣(krestin)、西佐喃(sizofiran)、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、淋巴毒素、BCG疫苗、粉刺丙酸菌(corynebacterium parvum)、左旋咪唑、多糖K、丙考达唑等。
作为细胞生长因子，代表性的可举出：分子量为20,000以下的肽，其是通过与受体结合而在低浓度发挥作用的因子，例如可举出：(1) EGF或与其实质上具有相同活性的物质(例如，EGF(表皮生长因子)、heregulin(HER3和HER4配体)等)；(2)胰岛素或与其实质上具有相同活性的物质(例如，胰岛素、IGF(胰岛素样生长因子)-1、IGF-2等)；(3) FGF(成纤维细胞生长因子)或与其实质上具有相同活性的物质(例如，酸性FGF、碱性FGF、KGF(角质细胞生长因子)、FGF-10等)；(4)其他细胞生长因子(例如，CSF(集落刺激因子)、IL-2、NGF(神经生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、TGF-β(转化生长因子β)、HGF(肝细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)等)等。
作为抑制细胞生长因子的作用的药剂，可举出：赫赛汀(HER2受体抗体)等。
作为可与本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药组合使用的其他药剂的例子，例如可举出：L-天冬酰胺酶、乙酰葡醛酯、盐酸丙卡巴肼、原卟啉钴络合物盐、血卟啉汞钠、拓扑异构酶I抑制药(例如，伊立替康、托泊替康等)、拓扑异构酶II抑制药(例如，索布佐生等)、裂解酶抑制药、内皮素拮抗药(例如，ABT-627等)、分化诱导剂(例如，类视黄醇、维生素D类等)、血管生成抑制药、α-阻滞剂(例如，盐酸坦索罗辛等)、胰岛素抵抗性改善药(例如，盐酸吡格列酮、(马来酸)罗格列酮、GI-262570、JTT-501、MCC-555、YM-440、KRP-297、CS-011、FK-614、(E)-4-[4-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基甲氧基)苄氧基亚氨基]-4-苯基丁酸、血管紧张素II拮抗药(例如，氯沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、环庚塞、缬沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦、他索沙坦、奥美沙坦和它们的活性代谢物(坎地沙坦等)等)、癌抗原、DNA、凝集素、糖质、脂质等。
当将本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药与组合使用的药剂一起使用时，对它们的给予时期没有限定，可同时给予、也可间隔一定时间给予对象(受试者)。本发明的肽或其盐或前药的投药量可根据给予对象、给予途径、疾病、组合等进行适当选择。
对本发明的肽或其盐、其溶剂合物或其前药与组合使用的药剂的给予方式没有特别限定，例如可举出：通过共同配制得到的单一制剂的给予、通过分开配制得到的2种以上的制剂以相同或不同给予途径同时或间隔一定时间的给予等。
本说明书中，“或(または)”是在可采用文章中列举的事项的“至少1个以上”时所使用的。“或(もしくは)”也同样。在本说明书中明确记载“2个值”的“范围内”的情况下，该范围也包括2个值本身。
(一般技术)
本说明书中所用的分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、生物信息学均是该领域中已知的，并且可使用周知的或惯用的任意的手法。
本说明书中所引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献，其全部内容均以与各自具体记载的程度相同的程度作为参考援引到本说明书中。
以上，为了便于理解，通过示出优选的实施方式说明了本发明。以下，基于实施例来说明本发明，但上述的说明和以下的实施例仅是为了示例而提供，不是为了限定本发明而提供。因此，本发明的范围不限于本说明书中具体记载的实施方式或实施例，而仅由权利要求书限定。
实施例
以下记载实施例。具体而言，试剂类使用了实施例中所记载的制品，但也可用其他制造商(Sigma-Aldrich、富士胶片和光纯药、Nacalai、R ＆ D Systems、USCN LifeScience Inc.等)的同等品替代。
(实施例1：肽的合成)
合成了以下的肽(括弧内表示各化合物的名称)：
Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(YS12)[SEQ ID NO: 9]
(苯甲酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2(GT11255)
(对氟苯乙酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2(GT-11256)
(丙酰基)-SCHFGPLTWVCK-NH2(GT-11257)
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11258)
Ac-SCH(对氯-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11259)
Ac-SCH(间氯-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11260)
Ac-SCHYGPLTWVCK-NH2(GT11261)[SEQ ID NO: 10]
Ac-SCH(苯基甘氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11262)
Ac-SCH(苯乙基甘氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11263)
Ac-SCHFAPLTWVCK-NH2(GT-11264)[SEQ ID NO: 11]
Ac-SCHFaPLTWVCK-NH2(GT-11265)
Ac-SCHFGALTWVCK-NH2(GT-11266)[SEQ ID NO: 12]
Ac-SCHFG(高脯氨酸)LTWVCK-NH2(GT-11267)
Ac-SCHFGPATWVCK-NH2(GT-11268)[SEQ ID NO: 13]
Ac-SCHFGPMTWVCK-NH2(GT-11269)[SEQ ID NO: 14]
Ac-SCHFGPLTMVCK-NH2(GT-11270)[SEQ ID NO: 15]
Ac-SCHFGPLT(β-高色氨酸)VCK-NH2(GT-11271)
Ac-SCHFGPLT(α-萘基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11272)
Ac-SCHFGPLT(β-萘基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11273)
Ac-SCHFGPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11274)
Ac-SCHFGPLT(6-氯-Trp)VCK-NH2(GT-11275)
Ac-SCHFGPLT(5-氯-Trp)VCK-NH2(GT-11276)
Ac-SCHFGPLTWV(高半胱氨酸)K-NH2(GT-11277)
Ac-SCHFGPLTWV(青霉胺)K-NH2(GT-11278)
Ac-kcvwtlpGfhcs-NH2(GT-11279)
Ac-kcvwtlGGfhcs-NH2(GT-11280)
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(8-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11303)
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11304)
Ac-SCH(3,4-二氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11305)
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11306)
Ac-SCH(对氟-Phe)GPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11307)
Ac-SCHYGPLT(2-喹啉基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11308)
Ac-SCHYGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11309)。
上述肽的合成、纯化和确认依赖于糖链工学研究所(大阪)。天然氨基酸购自Merck(德国) (Novabiochem (注册商标))等，非天然氨基酸购自渡边化学等。用于合成上述肽的氨基酸(包含非天然氨基酸)及其保护氨基酸可从任意的适当的供给源获取。使用RinkAmide ChemMatrix(Biotage、瑞典)作为起始原料，通过肽自动合成仪(Prelude(GyrosProtein Technologies))根据程序，从该树脂根据上述序列通过缩合反应依次延长氨基酸，合成了目标的保护肽树脂。在树脂上完成肽的构建后，将保护肽树脂进行干燥。将所得的保护肽用三氟乙酸进行处理，以分离保护基和树脂载体。将从树脂载体分离而得到的粗肽通过HPLC体系；Prominence UFLC(岛津制作所、京都)或LaChrom Elite(日立High-Technologies、东京)进行纯化。此时，使用A/B梯度的溶剂条件，流动相A：0.1％TFA水溶液、流动相B：0.09％TFA/10％H2O/90％MeCN。纯化肽(还原型)通过碘处理转化成粗肽(氧化型)以形成二硫键。
针对合成的各肽进行质谱分析测定，确认到得到了所期望的结构(图1～33)。基于MS的质谱分析测定是使用Synapt HDMS (Waters、美国)通过输注进行实施的。
使上述合成的肽与人肝癌HepG2细胞接触，在显微镜观察下确认到颗粒泄漏时，在GT-11259和GT-11260中观察到比较低度的颗粒泄漏が，而在GT-11258、GT-11261和GT-11274中观察到较多的颗粒泄漏。由此可期待：GT-11258、GT-11261和GT-11274的肽具有相对强的活性。
(实施例2：人肝脏癌细胞中的体外性能评价)
通过以下的方法测定了合成肽的性能。
基于使用来自人肝癌的HepG2细胞的合成肽的致死效果
针对以下的测试化合物进行了试验；YS12、GT-11268、GT-11261、GT-11274、GT-11259、GT-11260、GT-11280、GT-11303、GT-11304、GT-11305、GT-11306、GT-11307、GT-11308和GT-11309。
将HepG2细胞(ATCC、HB-8065)接种在8孔CHAMBER SLIDE(Nunc))上，在测试化合物的4种浓度下研究了致死效果。
培养条件；使用包含10％胎牛血清的D-MEM培养基(富士胶片和光纯药、045-30285)，在37℃、5％CO2-95％空气条件下进行培养。
试验浓度；120μM、60μM、30μM和15μM的测试化合物，而且，使用PBS(-)作为对照。
细胞数；将1.0～1.5×103的细胞数接种在350μL/孔的培养基中。
在培养开始16～24小时后，添加各测试化合物(50μL/孔)，使其反应24小时。
通过计数用0.1％Trypan blue溶液(TB溶液)而显示出阳性染色的细胞数并转化成每单位面积的值，试验了致死效果。具体而言，通过如下的步骤1～7来进行。
1. 从孔中去除培养液；
2. 将100μL的TB溶液注入到孔内，使其反应3分钟；
3. 去除2的TB溶液；
4. 注入10μL的Bouin液(15mL的苦味酸饱和溶液、5mL的福尔马林原液、1mL的冰醋酸)，在混合器上，使其反应10分钟；
5. 用100μL的PBS(-)使4的反应减弱，去除Bouin液；
6. 在各孔中加入100μL的PBS(-)；
7. 用显微镜(倒置相差显微镜、Nikon)计数1隔室(1mm2)内的TB阳性细胞，求出10隔室的平均。
其结果，得到了如图34～37所示的结果。GT-11268、GT-11261、GT-11274、GT-11259、GT-11260、GT-11280、GT-11303、GT-11304、GT-11305、GT-11306、GT-11307、GT-11308和GT-11309的肽均显示出与YS12同等或超过其的HepG2细胞杀伤效果。特别是，GT-11261、GT-11259、GT-11303～GT-11308的肽的效果强大。由此可期待：这些肽可有利地用于例如增殖性疾病(例如，癌、子宫腺肌病)和糖尿病视网膜病的治疗用途中。
(实施例3：人胰腺癌细胞的体外性能评价)
通过以下的方法评价了合成肽对人胰腺癌细胞的体外性能。
将来自人胰腺癌的AsPC-1细胞(ECACC、96020930)，使用包含10％胎牛血清(biowest，S182H-500)和1mM丙酮酸钠(gibco，11360-070)的RPMI-1640培养基(Sigma，R8758-500ML)，在37℃、5％CO2-95％空气条件下进行传代培养(2次/周)。使用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液(Sigma，T4174-100ML)从培养皿中回收该AsPC-1细胞，悬浮在上述培养基中后，接种在96孔微孔板(3×103/0.05mL/孔)上。进行过夜培养后，添加包含测试化合物(共计43个化合物、终浓度150μM)的培养基(0.05mL/孔、3孔/测试化合物)。72小时后，通过WST法(同仁化学研究所、Cell Counting Kit-8)来测定各孔的细胞增殖能，算出相对于对照(不含测试化合物的孔)的各测试化合物的抑制率。
WST法是使用水溶性四唑盐WST-8作为显色试剂的活细胞数测定法，将由WST-8的还原而生成的水溶性甲臜作为活细胞数的指标。由细胞中的脱氢酶而产生的NADH将WST-8转化为水溶性甲臜。由于所生成的水溶性甲臜在约450nm处具有极大吸收，因此通过测定该波长区域的吸收可显示活细胞数。在WST法中，观察到450nm的吸收。
另外，在此，调制了通过与实施例1同样的方法合成的其他候选化合物GT-11332～GT-11340(以下，表示各自的结构)，还评价了这些化合物的活性。
Ac-SCH(4-吡啶基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11332)
Ac-SCH(3-吡啶基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11333)
Ac-SCH(对甲氧基-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11334)
Ac-SCH(间甲氧基-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11335)
Ac-SCH(间羟基-Phe)GPLTWVCK-NH2(GT-11336)
Ac-SCH(1-萘基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11337)
Ac-SCH(2-萘基丙氨酸)GPLTWVCK-NH2(GT-11338)
Ac-SCHFGPLT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11339)
Ac-SCHFGPLT(3-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT-11340)。
其结果，得到了如图38所示的结果。包含GT-11257的共计12个测试化合物对AsPC-1细胞均显示出强的增殖抑制作用。
(实施例4：人白血病细胞的体外性能评价)
通过以下的方法评价了合成肽对人白血病细胞的体外性能。
将来自人T细胞白血病的ATL-2细胞(由京都大学前田博士提供)，使用包含10％胎牛血清(biowest，S182H-500)的RPMI-1640培养基(Sigma，R8758-500mL)，在37℃、5％CO2-95％空气条件下进行传代培养(2次/周)。从培养瓶中回收该ATL-2细胞，悬浮在上述培养基中后，接种在96孔微孔板(3×103/0.05mL/孔)上。进行过夜培养后，添加包含测试化合物(共计32化合物、终浓度150μM)的培养基(0.05mL/孔、3孔/测试化合物)。72小时后，通过WST法(同仁化学研究所、Cell Counting Kit-8)来测定各孔的细胞增殖能，算出相对于对照(不含测试化合物的孔)的各测试化合物的抑制率。
其结果，得到了如图39所示的结果。特别是，GT-11269、GT-11308和GT-11309等对ATL-2细胞显示出强的增殖抑制作用。
(实施例5：体内的肽性能评价)
在荷瘤小鼠模型中评价了合成肽的体内性能。
将来自人胰腺癌的AsPC-1细胞(ECACC、96020930)与实施例3同样地进行培养和回收，使其悬浮在包含10％基质胶(BD Bioscience，354234)的上述RPMI-1640培养基中，并移植到6周齢的雄性裸鼠(SLC、BALB/cSlc-nu/nu)的右背部皮下(5×106/0.1mL/只)。使用数字卡尺来测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，在用V＝L×W2/2公式求出的肿瘤体积(V)达到150～200mm3左右时，进行分组，并给予测试化合物(包含GT-11263的共计8个化合物)。对照组给予生理盐水。进行腹腔内(0.1mL/只、3～5只/测试化合物)给予，1天3次(间隔1小时、共计0.2mg/天)、每周3次共给予2周。每周测量2次肿瘤直径和体重，来监测肿瘤生长的状态和测试化合物给予的影响。
其结果，得到了如图40所示的结果。包含GT-11263的共计3种测试化合物在荷瘤小鼠模型中均显示出强的抗肿瘤效果。另外，任一种测试化合物对体重均未产生影响。特别是，GT-11269和GT-11309的效果表达快且强大。
(实施例6：候选化合物对CFU-E形成的影响)
由于期待GT-11269、GT-11309特别有用，因此试验了这些化合物对CFU-E形成的影响。
从小鼠(SLC、BALB/cSlc-nu/nu)的股骨采取骨髓细胞，将其悬浮在包含1.2％甲基纤维素(Sigma，M0512)、30％胎牛血清(biowest，S182H-500)、1％牛血清白蛋白(富士胶片和光纯药、017-25771)、0.1mM 2-巯基乙醇(富士胶片和光纯药、131-14572)、L-谷氨酰胺(Sigma、G7513)、青霉素/链霉素(富士胶片和光纯药、168-23191)的α-MEM培养基(富士胶片和光纯药、130-18621)中后，接种在6孔微孔板(3.2×105/2mL/孔、2孔/测试化合物)上。添加测试化合物(GT-11269或GT-11309、终浓度100μM)和重组人促红细胞生成素(Epo、1U/mL)，并培育72小时。DAB(diaminobenzidine tetrahydrochrolide、同仁化学研究所、D006)染色后，在显微镜下以CFU-E(Erythroid Colony Forming Unit)的形式测量了血红蛋白阳性细胞。
结果见图41。重组人促红细胞生成素促进了CFU-E的形成。在该条件下，确认到测试化合物(GT-11269和GT-11309)对CFU-E的形成均不产生影响。
(实施例7：候选化合物对Epo依赖性癌细胞增殖的影响)
通过以下的方法评价了预测有效的GT-11309对Epo依赖性癌细胞增殖的影响。
将来自人白血病的UT-7细胞(由北海道大学藤田博士提供)，使用包含重组人促红细胞生成素(Epo、2U/mL)和10％胎牛血清(biowest，S182-H-500)的D-MEM培养基(Sigma，D5796-500ML)，在37℃、5％CO2-95％空气条件下进行传代培养(2次/周)，共计培养9周。将该Epo治疗UT-7细胞洗涤3次，接种在96孔微孔板(1×104/孔)上。添加Epo(0～10U/mL)或Epo(1U/mL)存在下的抗Epo单克隆抗体(克隆R6、由京都大学増田博士提供、1～100μg/mL)、抗EpoR单克隆抗体(克隆713210、R＆D Systems, MAB3073、1～100μg/mL)或GT-11309(1～100μM)。培养4天后，通过WST法(同仁化学研究所、Cell Counting Kit-8)以450nm的吸收测定了各孔的细胞增殖能。
结果见图42。GT-11309与抗Epo抗体和抗EpoR抗体同样地抑制了Epo依赖性癌细胞增殖。
根据以上的见解发现了：在式(I)：
X1-SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)-X2 的结构中，A1的突变(例如，Tyr)、A4的突变(例如，Met)、A6的突变(例如，2-苯并噻唑基丙氨酸)特别特有用。
(实施例8：其他候选化合物)
由于预测GT-11269和GT-11309特别有用，因此将这些突变进行组合，以与实施例1同样的手法，制作了具有以下结构的GT-11350。
Ac-SCHYGPMT(2-苯并噻唑基丙氨酸)VCK-NH2(GT11350)
(实施例8-1：各剂量下的肽的体外性能)
对于GT-11269、GT-11309和GT-11350，改变浓度试验了体外性能。
与施例3同样地将来自人胰腺癌的AsPC-1细胞(ECACC、96020930)进行培养和回收，并接种在96孔微孔板(3×103/0.05mL/孔)上。进行过夜培养后，添加包含测试化合物(10、30或100μM)的培养基(0.05mL/孔、3孔/测试化合物)。72小时后，通过WST法(同仁化学研究所、Cell Counting Kit-8)来测定各孔的细胞增殖能，算出相对于对照(不含测试化合物的孔)的各测试化合物的抑制率。
结果见图43。GT-11269、GT-11309和GT-11350对AsPC-1细胞显示出强的增殖抑制作用。
而且，还试验了GT-11350对乳癌细胞株的增殖抑制能。
对来自人乳癌的HCC1395细胞(ATCC，CRL-2327)和HCC1806(ATCC，CRL-2335)进行培养和回收，并接种在384孔微孔板(1×103和3×103/0.04mL/孔)上。进行过夜培养后，添加了包含GT-11350(0～100μM)的培养基(0.01mL/孔)。72小时后，通过CellTiter-Glo 2.0(Promega, G9242)来测定各孔的细胞增殖能，以所得的ATP量为指标，算出相对于对照(不含测试化合物的孔)的细胞增殖能。
结果见图44。GT-11350对乳癌细胞株也显示出增殖抑制能。
(实施例8-2：体内性能)
在荷瘤小鼠模型中评价了合成肽的体内性能。
与实施例5同样地将来自人胰腺癌的AsPC-1细胞移植到6周齢的雄性裸鼠(SLC、BALB/cSlc-nu/nu)的右背部皮下(5×106/0.1mL/只)。使用数字卡尺来测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，在用V＝L×W2/2公式求出的肿瘤体积(V)达到150～200mm3左右时，进行分组，并给予测试化合物(GT-11269、GT-11309和GT-11350)。对照组给予生理盐水。进行腹腔内(0.1mL/只、5只/测试化合物)给予，1天3次(间隔1小时、共计0.5mg/天)、每周2次共给予4周。每周测量2次肿瘤直径和体重，来监测测试化合物给予的影响(图45)。
关于以同样的方案给予GT-11309或GT-11350的AsPC-1荷瘤小鼠，在最终给予第6天摘出肿瘤组织，将其一部分用Zamboni液进行固定后，制作了冻结切片。通过使用抗第VIII因子(FVIII)相关抗原抗体的免疫组织化学法来测定阳性细胞数，研究了测试化合物对肿瘤组织内的血管形成的作用(图46)。
关于以同样的方案给予GT-11269、GT-11309或GT-11350的AsPC-1荷瘤小鼠，在最终给予第6天进行采血，通过使用高速离心机的毛细管法来测定血细胞比容值。另外，使用市售的测定试剂盒(BioAssay Systems、DIHB-250)来测定血中血红蛋白浓度(图47)。 而且，对于CFU-E的形成进行了评价。从将GT-11350以1天3次(间隔1小时、共计0.4mg/天)、每周2次共给予4周的AsPC-1荷瘤小鼠的股骨采取骨髓细胞。对照组给予生理盐水。与实施例6同样地使从小鼠采取的骨髓细胞悬浮，并接种在6孔微孔板(3.2×105/2mL/孔)上。在板中添加重组人促红细胞生成素(Epo、1U/mL)并培育2天。DAB(diaminobenzidinetetrahydrochrolide、同仁化学研究所、D006)染色后，在显微镜下以CFU-E(ErythroidColony Forming Unit)形式测量血红蛋白阳性细胞(图48)。
关于图45，任一种测试化合物在荷瘤小鼠模型中均显示出抗肿瘤效果，但对体重未产生影响。关于图46，与对照组的FVIII阳性细胞数进行比较，测试化合物给予组的FVIII阳性细胞数均减小，测试化合物均显示出血管形成抑制作用。关于图47，任一种测试化合物均未对血细胞比容值和血中血红蛋白浓度产生影响。关于图48，在给予GT-11350的小鼠中CFU-E形成未受到抑制。
(实施例9：用法/剂量研究)
研究了GT-11350的用法/剂量。
与实施例5同样地将来自人胰腺癌的AsPC-1细胞移植到6周齢的雄性裸鼠(SLC、BALB/cSlc-nu/nu)的右背部皮下，在肿瘤体积(V)达到150～200mm3左右时，进行分组，并给予测试化合物(GT-11350)。对照组给予生理盐水。进行腹腔内(0.1mL/只)给予，1天3次(间隔1小时、共计0.1mg、0.2mg、0.4mg/天)、每周2次共给予4周。每周测量2次肿瘤直径和体重，来监测测试化合物给予的剂量所带来的影响(图49)。
关于以同样的方案给予GT-11350的AsPC-1荷瘤小鼠，在最终给予4天后进行采血，通过使用高速离心机的毛细管法来测定血细胞比容值。另外，使用市售的测定试剂盒(BioAssay Systems、DIHB-250)来测定血中血红蛋白浓度(图50)。
关于图49，GT-11350显示出剂量依赖性的抗肿瘤效果，但对体重未产生影响。关于图50，在任何剂量下对血细胞比容值和血中血红蛋白浓度均没有影响。
与实施例5同样地将来自人胰腺癌的AsPC-1细胞移植到6周齢的雄性裸鼠(SLC、BALB/cSlc-nu/nu)的右背部皮下，在肿瘤体积(V)达到150～200mm3左右时，进行分组，并给予测试化合物(GT-11350)。对照组给予生理盐水。进行腹腔内(0.1mL/只)给予，1天3次(间隔1小时、共计0.2mg/天)或1天1次(0.2mg/天)、每周2次共给予4周。每周测量2次肿瘤直径和体重，来监测测试化合物给予的用法所带来的影响。
结果见图51。GT-11350在1天3次和1天1次的任一种给予法中显示出同样的抗肿瘤效果。
(实施例10：其他肽)
合成以下的肽。
Ac-SCH(A1)GPLT(A6)VCK-NH2
式中，A1和A6分别独立地选自以下的表3。
[表3]
Figure DEST_PATH_IMAGE010
上述修饰氨基酸例如可使用以醛作为起始材料的斯特雷克反应等已知的方法进行合成。
将合成的肽进行纯化来获取纯的光学异构体，并将其用于性能试验。
与实施例1同样地通过质谱分析测定来确认这些肽的合成/纯化。
(实施例11：其他试验)
针对合成的肽进行与实施例3同样的试验。
其结果，可期待表3所示的1个以上化合物显示AsPC-1细胞杀伤效果。可理解为：表3中的一些可发挥特别强有力的AsPC-1细胞杀伤效果。由此可期待：这些肽可有利地用于例如增殖性疾病(例如，癌)、子宫腺肌病和糖尿病视网膜病的治疗用途中。
(注解)
如上所述，使用本发明的优选实施方式来示例本发明，但上述的说明和实施例仅提供示例的目的，而不以限定本发明的目的来提供。因此，可理解为：本发明不限于本说明书中具体记载的实施方式或实施例，而应该仅由权利要求书来解释其范围。可理解为：本说明书中引用的专利、专利申请和文献，其内容作为对本说明书的参考而援引，如同其内容本身具体记载于本说明书中。本申请针对2018年9月14日在日本国专利局申请的特愿2018-172479来要求优先权，并将其全部内容作为参考而援引到本申请中。
产业上的可利用性
本发明的肽具有显著的抗癌活性，且具有作为医药品的用途，因此在属于制药业或其原药制造商的产业中具有实用性。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1：SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)
SEQ ID NO: 2：SCHFGPLTWVCK
SEQ ID NO: 3：X1-SCHYGPLTWVCK-X2
SEQ ID NO: 4：X1-SCHFAPLTWVCK-X2
SEQ ID NO: 5：X1-SCHFGALTWVCK-X2
SEQ ID NO: 6：X1-SCHFGPATWVCK-X2
SEQ ID NO: 7：X1-SCHFGPMTWVCK-X2
SEQ ID NO: 8：X1-SCHFGPLTMVCK-X2
SEQ ID NO: 9：Ac-SCHFGPLTWVCK-NH2(YS12)
SEQ ID NO: 10：Ac-SCHYGPLTWVCK-NH2(GT-11261)
SEQ ID NO: 11：Ac-SCHFAPLTWVCK-NH2(GT-11264)
SEQ ID NO: 12：Ac-SCHFGALTWVCK-NH2(GT-11266)
SEQ ID NO: 13：Ac-SCHFGPATWVCK-NH2(GT-11268)
SEQ ID NO: 14：Ac-SCHFGPMTWVCK-NH2(GT-11269)
SEQ ID NO: 15：Ac-SCHFGPLTMVCK-NH2(GT-11270)。
Figure IDA0003064356600000011
Figure IDA0003064356600000021
Figure IDA0003064356600000031
Figure IDA0003064356600000041
Figure IDA0003064356600000051
Figure IDA0003064356600000061
Figure IDA0003064356600000071

Claims (15)

1.基于具有-[SCHFGPLTWVCK]-结构的肽的修饰肽或其前药或其盐，其具有至少1个较具有CH3-CO-SCHFGPLTWVCK-NH2结构的肽改善的特性，其中，字母表示氨基酸的单字母记号。
2.具有下述的式(I)结构或式(II)结构的修饰肽或其前药或其盐，
式(I)：X1-SCH(A1)(A2)(A3)(A4)(A5)(A6)V(A7)(A8)-X2 [式中， X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧， A1为-NH-CH(RA1)-CO-，在此，RA1具有(键、或直链或支链亚烷基)-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的直链或支链甲氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基)的结构， A2为Ala、D-丙氨酸或Gly， A3为Pro、高脯氨酸或Ala， A4为Met、Leu、Ala或IleI， A5为Thr或Ala， A6为-NH-CH(RA1)-CO-，在此，RA1具有(键、或直链或支链亚烷基)-(可被卤素原子取代的直链或支链烷基、可被卤素原子取代的直链或支链甲氧基、可被选自卤素原子和羟基的取代基取代的芳基或杂芳基)的结构，A7为Cys、高半胱氨酸或青霉胺， A8为Lys、Arg、或不存在， 肽中的2个硫原子可形成二硫键，X1为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-C(＝O)R1， X2为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-NR1 2， 各R1独立地选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，或者与同一原子键合的2个R1一起形成可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环， 各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3]；或 式(II)：X1-kcvwtl(B1)Gfhcs-X2 [式中，X1为肽的氨基末端侧，X2为肽的羧基末端侧， B1为Gly或D-脯氨酸，k、c、v、w、t、l、G、f、h、c、和s分别表示氨基酸，大写字母表示L体或非光学异构体，小写字母表示D体， 肽中的2个硫原子可形成二硫键， X1为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-C(＝O)R1， X2为氢、由1～3个任意的氨基酸构成的肽或-NR1 2， 各R1独立地选自氢、羟基、可被R2取代的直链或支链C1～10烷基、可被R2取代的直链或支链C1～10烯基、可被R2取代的直链或支链C1～10炔基、可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环、-OR2和-NR2 2，或者与同一原子键合的2个R1一起形成可被R2取代的芳香族或非芳香族5～10元环， 各R2独立地选自氢、羟基、卤素、可被卤素或羟基取代的苄基、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、＝O、-COOH、-OCH3、和-OCH2CH3]。
3.权利要求2所述的修饰肽或其前药或其盐，其满足以下的至少1个条件：
A2为Gly， A3为Phe， A5为Thr， A7为Cys，和 A8为Lys。
4.权利要求2或3所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A1为Tyr、对氟苯丙氨酸、或苯乙基甘氨酸。
5.权利要求2或3所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A1为Tyr。
6.权利要求2～5中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A4为Leu或Met。
7.权利要求2～5中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A4为Met。
8.权利要求2～7中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A6为Trp、Met、8-萘基丙氨酸、2-喹啉基丙氨酸、5-氯-Trp、或2-苯并噻唑基丙氨酸。
9.权利要求2～7中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A6为2-苯并噻唑基丙氨酸。
10.权利要求2～9中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，A2为Gly，
A3为Phe，
A5为Thr，
A7为Cys，
A8为Lys。
11.权利要求2～10中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，X1为-COOH、苯甲酰基、丙酰基或对氟苯基乙酰基。
12.权利要求2～11中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐，其中，X2为NH2。
13.包含权利要求1～12中任一项所述的修饰肽或其前药或其盐的组合物，其用于治疗或预防增殖性疾病或糖尿病视网膜病。
14.权利要求13所述的组合物，其中，上述增殖性疾病为子宫腺肌病、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌、肛门癌)、食道癌、十二指肠癌、头颈部癌(舌癌、咽癌、喉癌)、脑肿瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、子宫癌(子宫体癌、子宫颈癌)、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、血管瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、骨肿瘤、血管纤维瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、小儿实体癌、卡波西肉瘤、AIDS所引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、子宫肌瘤、成骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、癌性间皮瘤、或白血病。
15.权利要求13所述的组合物，其中，上述增殖性疾病为乳癌、胰腺癌、肝癌、恶性淋巴瘤、或白血病。
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