CN117836316A

CN117836316A - 能够抑制myc驱动的转录的共价蛋白质二聚体的合成

Info

Publication number: CN117836316A
Application number: CN202280050891.4A
Authority: CN
Inventors: 安德烈·洛阿斯; 布雷德利·L·彭泰卢特; 塞巴斯蒂安·蓬普隆; 穆罕默德·杰巴拉; 卡莉·凯瑟琳·席斯塞尔; 雅各布·乔舒亚·利·罗德里克斯; 史蒂芬·莱弗勒·布赫瓦尔德; 安·博亚; 艾萨克·克莱因; 苏珊娜·威尔逊·霍肯; 查尔斯·汉·李
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2024-04-05
Also published as: CA3223698A1; WO2022271536A1; EP4359427A1; AU2022298484A1

Abstract

本公开内容涉及MYC、MAX和Omomyc的共价蛋白质二聚体；包含所述共价蛋白质二聚体的药物组合物；制备所述共价蛋白质二聚体的方法；以及用所述共价蛋白质二聚体治疗与MYC失调相关的病症(例如，癌症)的方法。

Description

能够抑制MYC驱动的转录的共价蛋白质二聚体的合成

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年6月21日提交的美国临时专利申请序列No.63/213,024的优先权权益。该申请的全部内容在此通过引用并入。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在瑞典研究委员会(Swedish Research Council)授予的资助No.VR2017-00372、德国研究基金会(Deutsche Forschungsgemeinschaft)授予的资助No.PO2413/1-1、国家科学基金研究生奖学金(National Science Foundation GraduateResearch Fellowship)授予的资助No.1122374和国家科学基金研究生奖学金授予的资助No.174530下在政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。

背景技术

转录因子蛋白MYC与MAX形成异二聚体，以与E-盒DNA(E-Box DNA)序列(CACGTG)结合。MYC/MAX蛋白复合物是碱性-螺旋-环-螺旋/亮氨酸-拉链(basic-helix-loop-helix/leucine-zipper，bHLH/Lz)转录因子家族的一部分，并启动数种细胞过程，包括细胞增殖和存活。或者，MAX可同源二聚化，竞争E-盒DNA结合位点并抑制MYC/MAX驱动的转录。因此，MYC/MAX和MAX/MAX具有相反的活性，并且在>50％的人癌症中观察到MYC过表达。

抑制致癌性MYC活性的有前景的策略依赖于稳定天然MAX/MAX二聚体或递送具有类似作用机制的蛋白质类似物。用小分子靶向MYC在很大程度上仍然难以捉摸，主要是因为MYC的结构不提供小分子配体的结合口袋。最近克服MYC用药(drugging)挑战的尝试包括MAX/MAX复合物的小分子稳定剂，其抑制数种癌细胞系的增殖并在鼠癌症模型中降低肿瘤负荷。替代方法涉及人工小蛋白Omomyc，其是显性负形式的MYC，可竞争E-盒DNA结合并抑制MYC/MAX依赖性转录，最终在多种小鼠癌症模型中导致肿瘤生长抑制。

像MYC和MAX一样，Omomyc必须形成具有功能性和生物活性的二聚体复合物。MYC、MAX和Omomyc可以以不同的组合相互作用。在将单体递送到细胞之后，形成的主要复合物取决于其他蛋白质的细胞浓度，并且难以预测。除潜在的更高的结构稳定性之外，确定的和稳定的二聚体复合物的直接施用将提供对生物活性二聚体抑制剂的浓度和组成的更高程度的控制。

制备均质、稳定、明确限定的蛋白质-蛋白质缀合物可能是挑战。产生共价连接的多聚体蛋白质的化学合成方法主要集中于制备泛素化(ubiquitinylated)蛋白或类泛素化修饰的(sumoylated)蛋白。这些策略依赖于化学连接或化学酶法工作流(chemoenzymaticworkflow)，分别需要并入非天然氨基酸或经工程化的识别序列。另外，已经报道了基于连接的策略来制备共价连接的HIV蛋白酶异二聚体，目的是研究这种酶二聚体的不对称突变。先前MYC/MAX类似物的二聚化策略依赖于在转录因子类似物的亮氨酸拉链区的C端形成二硫键，或者在MYC与MAX之间或MAX与MAX之间形成肟和硫酯键。虽然这些确定的二聚体使得能够进行DNA结合研究，但报道的策略依赖于在生物环境中具有低化学稳定性的燕尾连接(dovetail)，这使它们不适合用于体内生物活性研究。因此，需要MYC、MAX和Omomyc的生物稳定二聚体。

发明内容

本公开内容尤其提供了共价蛋白质二聚体或其可药用盐，其包含：含有C端和N端的第一多肽，其中所述第一多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％的同一性程度；含有C端和N端的第二多肽，其中所述第二多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％的同一性程度；和接头，所述接头使所述第一多肽的C端与所述第二多肽的C端共价连接。

在另一个方面中，本公开内容提供了具有根据式(I)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

R¹是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

R²是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

W是C_1-10烷基、C_1-10杂烷基、C_6-10芳基、或5元至10元杂芳基；

L是不存在的或是接头；

R是H、氮保护基、生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分；并且

n是0或1。

在一个实施方案中，所述共价蛋白质二聚体具有根据式(Ib)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L是不存在的或是接头；

n是0或1。

在另一个方面中，本公开内容提供了具有根据式(II)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹独立地是-O-、-NH-或-S-；

Z²独立地是-O-、-NH-或-S-；

R¹独立地是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

A是C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L独立地是不存在的或是接头；

R独立地是H、氮保护基、生物素、荧光染料、核靶向部分、或细胞穿透部分；并且

n独立地是0或1。

在一些实施方案中，所述共价蛋白质二聚体具有根据式(IIb)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；并且

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽。

在另一个方面中，本公开内容提供了药物组合物，其包含本公开内容的共价蛋白质二聚体和可药用载体。在另一个方面中，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗特征在于MYC失调的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用本公开内容的共价蛋白质二聚体。在一个实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在另一个方面中，本公开内容提供了制备本公开内容的共价蛋白质二聚体的方法。

附图说明

图1是自动化流动蛋白合成仪的示意图。

图2是经纯化的同二聚体3和4以及异二聚体5和6的合成时间、产率和LC-MS表征的图。这些图示出了作为基础谱的总离子流色谱(total ion current chromatogram，TIC)、电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)质荷谱(左侧插图)和去卷积质谱(deconvoluted mass spectra)(右侧插图)。

图3是7、8和9连同具有m/z和去卷积质量的二聚体缀合物的TIC-LCMS色谱的一组反应示意图。

图4是一组流式细胞术直方图，其示出了在HeLa细胞与浓度为0.01μM至15μM的TAMRA标记的二聚体和Omomyc-TAMRA单体孵育15分钟之后，HeLa细胞荧光的剂量依赖性提高。

图5是来自共聚焦显微术的一组显微照片；Hoechst(DAPI)标记核，并在孵育15分钟之后，在细胞中观察到TAMRA蛋白(Cy3)，随后在新鲜培养基中孵育1小时。

图6是示出了合成蛋白质二聚体和单体的凝胶(约1μg/装载的蛋白质)。通过考马斯蓝染色来使条带显现。

图7是示出了圆二色性分析结果的图。对于溶解在折叠缓冲液中的蛋白质二聚体，平均残基椭圆率(Mean residual ellipticity，MRE)显示为波长的函数。

图8是示出了在折叠缓冲液中与E-盒DNA一起孵育的蛋白质单体和合成二聚体的凝胶。样品在TBE缓冲液中的10％聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用溴化乙啶可视化。

图9是示出了在与和不与E-盒DNA一起孵育的情况下蛋白质单体和共价二聚体之间的解聚温度差异的一组图。

图10是示出了在与和不与E-盒DNA一起孵育的情况下多种蛋白质单体和共价二聚体的解聚温度的表。

图11是示出了在用共价蛋白质二聚体处理72小时之后HeLa、A549和H441细胞的细胞增殖测定结果的一组图，所述结果通过定量。

图12是总结共价蛋白质的增殖抑制EC₅₀值的表。

图13是示出了在用4处理的A549细胞中基因上调或下调的程度的图。具有调整的p值<0.05和|log2FC|≥1的上调基因示出在图的上半部分，具有p值<0.05和|log2FC|≤1的下调基因示出在下半部分。参与KRas途径的下调基因被标记。

图14是MYC靶基因标签的富集图，其显示在暴露于4之后的负富集(q值<0.05)。

图15是产生10、11和12的工作流程的示意图。

图16是示出了10、11和12的Fmoc去保护的在线UV_310nm监测的一组图。

图17是粗类似物的一组LC-MS分析和去卷积质谱：C)Max 11；D)Myc 10；E)Omomyc12；经纯化的类似物的LC-MS分析：F)Max 11；G)Myc 10；和H)Omomyc 12。这些图示出了作为基础谱的总离子流色谱(TIC)、电喷雾电离(ESI)质荷谱(左侧插图)和去卷积质谱(右侧插图)。

图18是当单体在溶液中混合时，蛋白质MYC、MAX和Omomyc的所有可能组合的示意图。

图19是示出了二聚体类似物的电泳迁移率测定变动的凝胶。DNA条带的上移表明分子量较高(蛋白质-DNA复合物)。

图19是描述二聚体类似物的电泳迁移率测定变动的凝胶。DNA条带的上移表明分子量较高(蛋白质-DNA复合物)。

图20是使用双官能Pd氧化加成复合物(oxidative addition complexe，OAC)的同二聚体和异二聚体的合成的示意图。

图21是使用试剂Pd OAC(表示为4)的蛋白质-蛋白质交叉偶联反应的示意图。

图22分别是分离的共价蛋白质二聚体13、14、15、16、17和18的一系列去卷积质谱。这些图显示了作为基础谱的总离子流色谱(TIC)、电喷雾电离(ESI)质荷谱(左侧插图)和去卷积质谱(右侧插图)。

图23是单体蛋白质类似物和共价蛋白质二聚体的SDS-PAGE分析。

图24是示出了三种单体类似物(左)和六种二聚体类似物13、14、15、16、17和18(右)的圆二色性分析的一组图。二聚体类似物表现出α-螺旋模式，如在207nm和222nm处的深双最小值所示。

图25是示出了11、14、16、12、15和17的平均残基椭圆率(MRE)vs.温度的一组图。

图26是11、14、16、12、15和17的熔点的表。

图27是示出了二聚体类似物的电泳迁移率测定变动的凝胶。DNA条带的上移表明分子量较高(蛋白质-DNA复合物)。

图28是来自与E-盒DNA探针(K_D＝50±11nM)结合的Max-Max 14的生物层干涉法分析的传感图。

图29是Max-Max递送至Myc依赖性癌细胞系以抑制Myc的示意图。

图30是示出了在与19孵育15分钟之后HeLa细胞荧光的剂量依赖性提高的一组流式细胞术直方图。

图31是示出了用不同浓度的Max-Max 14处理72小时的癌细胞系中ATP浓度降低的一组曲线。示出了相对于未经处理细胞的ATP浓度，其通过Cell-Titer Glo确定。每个点表示平均值和标准偏差(n＝3)。还分别示出了HeLa、A549和H441细胞系中Max-Max 14的EC50值。

图32是显示在用14处理的A549细胞中基因上调或下调的程度的图。具有调整的p值<0.05和|log2FC|≥1的上调基因示出在图的上半部分，具有p值<0.05和|log2FC|≤1的下调基因示出在下半部分。参与KRas途径的下调基因被标记。

图33是MYC靶基因标签的一组富集图，其示出了在暴露于14之后的负富集。

具体实施方式

定义

下面列出了用于描述本文中公开的化合物和组合物的多种术语的定义。这些定义适用于在整个本说明书和权利要求书使用的术语，除非在特定情况下单独或作为更大组的一部分受到限定。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文中使用的术语和细胞培养、分子遗传学、有机化学和肽化学中的实验室程序是本领域公知且通常使用的那些。

本文中使用的冠词“一”及其变化形式是指冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“要素”意指着一个/种要素或多于一个/种的要素。此外，术语“包括”以及其他形式例如“包含”(include)、“包含(includes)和“含有”的使用不是限制性的。

本文中使用的术语“约”是本领域普通技术人员所理解的，并且将根据使用它们的上下文在一定程度上变化。如本文中所使用的，当提及可测量值(例如量、持续时间等)时，术语“约”意指涵盖特定值的±20％或±10％，包括±5％、±1％和±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所公开的方法。

本文中使用的术语“施用”等是指向对象提供治疗剂。本领域存在施用治疗剂的多种技术，包括但不限于静脉内、经口、气雾剂、肠胃外、经眼、经肺和表面施用。

术语“治疗”及其变化形式包括减弱或减轻与所治疗的状态、病症或疾病相关或由其引起的至少一种症状。在某些实施方案中，治疗包括使对象接触有效量的用于癌症相关病症的本公开内容的共价蛋白质二聚体。

本文中使用的术语“预防(prevent)”及其变化形式意指无病症或疾病发生(在尚未发生病症或疾病的情况下)或者无进一步的病症或疾病发生(在已发生病症或疾病的情况下)。还考虑了预防与病症或疾病相关的一些或所有症状的能力。

本文中使用的术语“患者”、“个体”或“对象”是指人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，例如绵羊、牛、猪、犬、猫和海洋哺乳动物。优选地，患者、对象或个体是人。

本文中使用的术语“有效量”、“药物有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足以提供期望的生物学结果的药剂的量。该结果可以是疾病的体征、症状或病因的减轻或缓解，或者生物系统的任何其他期望的改变。本领域普通技术人员可使用常规实验确定任何个体情况下合适的治疗量。

本文中使用的术语“可药用”是指不破坏化合物的生物活性或特性，并且相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，即该材料可施用于个体而不引起不期望的生物学作用或以有害的方式与包含其的组合物的任何组分相互作用。

本文中使用的术语“可药用盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式而被改性。可药用盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属盐或有机盐等。本公开内容的可药用盐包括例如由无毒性无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒性盐。本公开内容的可药用盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这样的盐可通过使这些化合物的游离酸或游离碱形式与化学计量量的合适碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在二者的混合物中反应来制备；通常来说，优选非水性介质例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。短语“可药用盐”不限于单盐或1:1盐。例如，“可药用盐”还包括双盐，例如双盐酸盐。合适的盐的列表可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418和Journal of PharmaceuticalScience,66,2(1977)中找到，其各自均通过引用整体并入本文。

本文中使用的术语“组合物”或“药物组合物”是指可用于本公开内容中的至少一种化合物与可药用载体的混合物。该药物组合物有助于将化合物施用于患者或对象。本领域存在施用化合物的多种技术，包括但不限于静脉内、经口、气雾剂、肠胃外、经眼、经肺和表面施用。

本文中使用的术语“可药用载体”意指可药用材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料，其参与在患者体内或向患者携带或运输可用于本公开内容中的化合物，以使其可执行其预期功能。通常，这样的构建体从身体的一个器官或部分被携带或运输到身体的另一器官或部分。每种载体就与制剂(包括可用于本公开内容中的化合物)的其他成分相容并且对患者无害而言必须是“可接受的”。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；藻酸；无热原水；等张盐水；林格氏溶液(Ringer’ssolution)；乙醇；磷酸盐缓冲液；和其他用于药物制剂的无毒相容物质。

本文中使用的“可药用载体”还包括任何和所有的包衣、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等，它们与可用于本公开内容中的化合物的活性相容，并且是患者生理上可接受的。还可将补充的活性化合物并入到组合物中。“可药用载体”还可包括本文中公开的化合物的可药用盐。可包含在药物组合物中的其他另外成分是本领域已知的，并在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA)中描述，其通过引用并入本文。

本文中使用的术语“MYC”是指由MYC基因编码的蛋白质MYC原癌基因，其是转录因子myc家族的成员，并具有以下序列：

本文中使用的术语“MAX”指转录因子myc相关因子X，其由MAX基因编码并具有以下序列：

本文中使用的术语“Omomyc”是指作为MYC的显性负形式发挥功能的人工小蛋白，并具有以下序列：

本文中使用的术语“蛋白质-蛋白质”(例如，MAX-MAX或MYC-MAX)表示共价二聚体，而术语“蛋白质/蛋白质”(例如，MAX/MAX或MYC/MAX)表示非共价二聚体。

除非另有说明，否则本文中使用的术语“烷基”(本身或作为另一取代基的一部分)意指具有指定碳原子数的直链或支链烃(即，C₁-C₆烷基意指具有一至六个碳原子的烷基)，并且包括直链和支链。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。C₁-C₆烷基的其他实例包括乙基、甲基、异丙基、异丁基、正戊基和正己基。

本文中使用的“杂烷基”是指其中一个或更多个碳原子被选自O、S或N的杂原子取代的烷基，其中烷基如本文中所定义。

本文中使用的术语“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文中所定义。举例说明，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。

在某些实施方案中，本文中使用的术语“烯基”是指衍生自包含具有至少一个碳-碳双键的二至六个或二至八个碳原子烃部分的单价基团。烯基可以是或可以不是另一个基团的连接点。术语“烯基”包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、庚烯基、辛烯基等。

除非另有说明，否则本文中使用的术语“卤代”或“卤素”(单独或作为另一取代基的一部分)意指氟、氯、溴或碘原子，优选氟、氯或溴，更优选氟或氯。

本文中使用的术语“环烷基”意指完全或部分饱和的具有1、2或3个环的非芳族碳环系统，其中这样的环可以稠合。术语“稠合的”意指第二个环通过与第一个环共有(即，共有)两个相邻原子而存在(即连接或形成)。环烷基还包括本质上可以是桥接的或螺环的双环结构，双环中的每个单独的环具有3至8个不同的原子。术语“环烷基”包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、双环[3.1.0]己基、螺[3.3]庚基和双环[1.1.1]戊基。

本文中使用的术语“杂环基”或“杂环烷基”意指包含1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子并具有1、2或3个环的非芳族碳环系统，其中这样的环可以稠合，其中稠合如上定义。杂环基还包括双环结构，该双环结构本质上可以是桥接的或螺环的，其中双环中的每个单个环具有3至8个不同的原子，并包含0、1或2个N、O或S原子。因此，术语“杂环基”包括环酯(即内酯)和环酰胺(即内酰胺)，并且还具体地包括但不限于环氧基(epoxidyl)、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基(即环氧乙烷基(oxanyl))、吡喃基、二氧六环基(dioxanyl)、吖丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、2,5-二氢-1H-吡咯基、唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、硫代吗啉基、1,3-/>嗪烷基、1,3-噻嗪烷基(thiazinanyl)、2-氮杂双环[2.1.1]己基、5-氮杂双环[2.1.1]己烷基、6-氮杂双环[3.1.1]庚烷基、2-氮杂双环[2.2.1]庚烷基、3-氮杂-双环[3.1.1]庚烷基、2-氮杂双环[3.1.1]庚烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、2-氮杂双环-[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、3-氧杂-7-氮杂双环[3.3.1]-壬烷基、3-氧杂-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷基、2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷基、6-氧杂-3-氮杂-双环[3.1.1]庚烷基、2-氮杂螺[3.3]庚烷基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷基、2-氧杂螺[3.3]-庚烷基、2-氧杂螺[3.5]壬烷基、3-氧杂螺[5.3]壬烷基、2-氮杂螺[3.3]庚烷、8-氧杂双环[3.2.1]辛烷基、2,8-双氮杂螺[4.5]癸烷-1-酮基和1,8-双氮杂螺[4.5]癸烷-2-酮基。

本文中使用的术语“芳族”是指具有一个或更多个多不饱和环并具有芳族特征的碳环或杂环，即具有(4n+2)个离域的π(pi)电子，其中n是整数。

本文中使用的术语“芳基”意指包含1、2或3个环的芳族碳环系统，其中这样的环可以稠合，其中稠合如上定义。如果环是稠合的，则环中的一个必须是完全不饱和的，并且经稠合的环可以是完全饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。术语“芳基”包括但不限于苯基、萘基、茚满基和1,2,3,4-四氢萘基。在一些实施方案中，芳基具有6个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有六至十个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有六至十六个碳原子。

本文中使用的术语“杂芳基”意指包含1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子并具有1、2或3个环的芳族碳环系统，其中这样的环可以稠合，其中稠合如上定义。术语“杂芳基”包括但不限于呋喃基、噻吩基、唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、异/>唑基、异噻唑基、/>二唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、5,6,7,8-四氢异喹啉基、5,6,7,8-四氢喹啉基、6,7-二氢-5H-环戊[b]吡啶基、6,7-二氢-5H-环-戊[c]吡啶基、1,4,5,6-四氢环戊[c]吡唑基、2,4,5,6-四氢环戊[c]-吡唑基、5,6-二氢-4H-吡咯[1,2-b]吡唑基、6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-b][1,2,4]三唑基、5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基、4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶基、4,5,6,7-四氢-1H-吲唑基和4,5,6,7-四氢-2H-吲唑基。

应理解，如果芳基、杂芳基、环烷基或杂环基部分可通过不同的环原子键合或以其他方式连接到指定的部分上(即，所示或所述没有指明具体的连接点)，则所有可能的点均是预期中的，无论是通过碳原子还是例如三价氮原子。例如，术语“吡啶基”意指2-、3-或4-吡啶基，术语“噻吩基”意指2-或3-噻吩基，等等。

本文中使用的短语“保护基”是指通过氧原子、氮原子或硫原子的化学修饰以在随后的化学反应中获得化学选择性而引入到分子中的官能团。羟基保护基的实例包括但不限于甲氧基甲基(methoxymethyl，MOM)、四氢吡喃基(tetrahydropyranyl，THP)、烯丙基、苄基(benzyl，Bn)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tert-butyldimethylsilyl，TBDMS)、新戊酰基(pivaloyl，Piv)和苯甲酰基(benzoyl，Bz)。氮保护基的实例包括但不限于烯丙基氧基羰基(allyloxycarbonyl，Alloc)、苯甲氧甲酰基(carbobenzyloxy，Cbz)、叔丁氧基羰基(tert-butyloxycarbonyl，Boc)、9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)、乙酰基(acetyl，Ac)、苯甲酰基(benzoyl，Bz)、甲苯磺酰基(tosyl，Ts)和苄基(Bn)。硫保护基的实例包括但不限于甲氧基甲基(MOM)、烯丙基、三苯甲基(trityl，Trt)、三氯乙酰基、新戊酰基(Piv)和苯甲酰基(Bz)。

本文中使用的术语“任选地经取代”意指所指的基团可以是经取代的或未经取代的。本文中使用的术语“经取代”意指一个原子或一组原子已经取代氢作为连接至另一个基团的取代基。

共价蛋白质二聚体

本文中提供了抑制MYC/MAX复合物活性的共价蛋白质二聚体，其可用于治疗MYC相关病症，包括癌症和其他增殖疾病。

在一个方面中，本文中提供了共价蛋白质二聚体或其可药用盐，其包含：

含有C端和N端的第一多肽，其中所述第一多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％的同一性程度；

含有C端和N端的第二多肽，其中所述第二多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％的同一性程度；和

接头，其使所述第一多肽的C端与所述第二多肽的C端共价连接。

在一些实施方案中，第一多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％的同一性程度。在一些实施方案中，第一多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少95％的同一性程度。在一些实施方案中，第一多肽包含由SEQ ID NO:1、2或3表示的序列。

在一些实施方案中，第二多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％的同一性程度。在一些实施方案中，第二多肽相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少95％的同一性程度。在一些实施方案中，第二多肽包含由SEQ ID NO:1、2或3表示的序列。

在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性；第一多肽与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；或者第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。

在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第一多肽包含由SEQ ID NO:2表示的序列，并且第二多肽包含由SEQ ID NO:2表示的序列。

在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第一多肽包含由SEQ ID NO:3表示的序列，并且第二多肽包含由SEQ ID NO:3表示的序列。

在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第一多肽包含由SEQ ID NO:1表示的序列，并且第二多肽包含由SEQ ID NO:2表示的序列。

在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性，并且第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，第一多肽包含由SEQ ID NO:3表示的序列，并且第二多肽包含由SEQ ID NO:2表示的序列。

通常，接头是包含共价键或原子链的化学部分，所述化学部分将第一多肽的C端与第二多肽的C端共价连接。示例性的接头可包含至少一个任选地经取代的、饱和或不饱和的、直链、支链或环状的烷基或者任选地经取代的芳基。接头也可以是多肽(例如，约1至约50个氨基酸或更多，或者约1至约5个氨基酸)。在一些实施方案中，接头是生物稳定的，并且在生理环境或条件下不是易于切割的。

在另一个方面中，本文中提供了具有根据式(I)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

R¹是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

R²是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

W是C_1-10烷基、C_1-10杂烷基、C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L是不存在的或是接头；

n是0或1。

在一些实施方案中，式(I)的共价蛋白质二聚体具有根据式(Ia)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

W是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

L是不存在的或是接头；

R是H、保护基、荧光染料、生物素、核靶向部分或细胞穿透部分；并且

n是0或1。

在一些实施方案中，式(I)的共价蛋白质二聚体具有根据式(Ib)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L是不存在的或是接头；

n是0或1。

在一些实施方案中，Y¹包含C端和N端，其中所述C端与Z¹或-NH-形成键。

在一些实施方案中，Y²包含C端和N端，其中所述C端与Z²或-NH-形成键。

在一些实施方案中，如果Y¹或Y²中的一者与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，则另一者与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1、2或3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ IDNO:1、2或3表示的序列。

在一些实施方案中，Y²与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y²与SEQ ID NO:1、2或3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y²包含由SEQ IDNO:1、2或3表示的序列。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性；Y¹与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；或者Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ ID NO:2表示的序列，并且Y²包含由SEQ ID NO:2表示的序列。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ ID NO:3表示的序列，并且Y²包含由SEQ ID NO:3表示的序列。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ ID NO:1表示的序列，并且Y²包含由SEQ ID NO:2表示的序列。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ ID NO:3表示的序列，并且Y²包含由SEQ ID NO:2表示的序列。

在一些实施方案中，Z¹是-NH-。在一些实施方案中，Z²是-NH-。

在一些实施方案中，R¹是不存在的或是C_1-10烷基。在一些实施方案中，R²是不存在的或是C_1-10烷基。

在一些实施方案中，W是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基。在一些实施方案中，W是C_1-5烷基或C_1-5杂烷基。

在一些实施方案中，L是不存在的。

在一些实施方案中，L是接头。示例性的接头可包含至少一个任选地经取代的、饱和或不饱和的、直链、支链或环状的烷基或者任选地经取代的芳基。在一些实施方案中，接头是多肽。在一些实施方案中，接头包含一至五十个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含一至二十五个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含一至十个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含一至五个氨基酸。在一些实施方案中，L是β-丙氨酸。

在一些实施方案中，R是H。

在一些实施方案中，R是不为9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的氮保护基。在一些实施方案中，R是选自烯丙基氧基羰基(Alloc)、苯甲氧甲酰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、甲苯磺酰基(Ts)和苄基(Bn)的氮保护基。在一些实施方案中，R是Alloc或Boc。

在一些实施方案中，R是荧光染料。适合用于共价蛋白质二聚体的荧光染料包括本领域已知的任何荧光染料，其可通过氮原子邻近可变R与二聚体共价连接。荧光染料的非限制性实例包括Alexa Fluor荧光染料、DyLight Fluor荧光染料、罗丹明染料、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，eGFP)、Cascade Blue^TM、Marina Blue^TM、Pacific Orange^TM、OregonGreen^TM、Cascade Yellow^TM、BODIPY、香豆素、甲基氧基香豆素、氨基甲基香豆素(aminomethylcoumarin，AMCA)、丹酰、5-TAMRA、荧光素、mBanana、mOrange、mHoneydew、mTangerine、mCherry和mPlum。在一些实施方案中，荧光染料是5-TAMRA。

在一些实施方案中，R是核靶向部分。在一些实施方案中，R是具有以下序列的Mach3：

QKKRKSKANKKNWPKGKLSIHAKDYKQGPKAKX_aaRKQRX_aaRG(SEQ ID NO：4)，其中X_aa是6-氨基己酸。

在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是1。

在另一个方面中，本文中提供了具有根据式(II)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹独立地是-O-、-NH-或-S-；

Z²独立地是-O-、-NH-或-S-；

R¹独立地是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

A是C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L独立地是不存在的或是接头；

R独立地是H、氮保护基、生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分；并且

n独立地是0或1。

在一些实施方案中，式(II)的共价蛋白质二聚体具有根据式(IIa)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1。

在一些实施方案中，式(II)的共价蛋白质二聚体具有根据式(IIb)的结构：

其中：

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽。

在一些实施方案中，Y¹包含C端和N端，其中C端与Z²或-NH-形成键。

在一些实施方案中，Y²包含C端和N端，其中C端与Z²或-NH-形成键。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性；Y¹与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性；Y¹与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；或者Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ ID NO:1表示的序列，并且Y²包含由SEQ ID NO:1表示的序列。

在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。在一些实施方案中，Y¹与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性。在一些实施方案中，Y¹包含由SEQ ID NO:3表示的序列，并且Y²包含由SEQ ID NO:1表示的序列。

在一些实施方案中，Z¹是-S-。在一些实施方案中，Z²是-NH-。

在一些实施方案中，R¹是C_1-10烷基。在一些实施方案中，R¹是C_1-5烷基或C_1-5杂烷基。

在一些实施方案中，A是C_6-10芳基。在一些实施方案中，A是5元至10元杂芳基。在一些实施方案中，A是苯基或5元至6元杂芳基。在一些实施方案中，A是苯基。

在一些实施方案中，L是不存在的。

在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是1。

本文中公开的共价蛋白质二聚体可作为互变异构体和旋光异构体(例如，对映体、非对映体、非对映体混合物、外消旋混合物等)而存在。

在一个方面中，本文中提供了包含本文中公开的共价蛋白质二聚体和可药用载体的药物组合物。

在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物包含治疗或预防有效量的本文中所述的化合物。所述药物组合物可用于在有此需要的对象中治疗增殖性疾病，在有此需要的对象中预防增殖性疾病，或者在对象、生物样品、组织或细胞中抑制MYC的活性。在一些实施方案中，增殖性疾病是癌症。

共价蛋白质二聚体的合成

本文中还提供了制备本文中公开的共价蛋白质二聚体的方法。因此，在一个方面中，本公开内容提供了制备具有根据式(I)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

R¹是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

R²是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

W是C_1-10烷基、C_1-10杂烷基、C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L是不存在的或是接头；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(III)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于Y²所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(IV)的结构与树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹和PG²是不同的保护基，并且其中PG¹和PG²均不是Fmoc；

(b)从树脂结合的侧链经保护的第二肽中去除PG²，以提供具有根据式(V)的结构的树脂结合的侧链经保护的第三肽：

(c)使树脂结合的侧链经保护的第三肽与对应于由Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VI)的结构的树脂结合的侧链经保护的第四肽：

以及

(d)从所述树脂上切割树脂结合的侧链经保护的第四肽，以提供共价蛋白质二聚体。

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

W是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

L是不存在的或是接头；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(IIIa)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于Y²所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(Iva)的结构与树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹和PG²是不同的保护基，并且其中PG¹和PG²均不是Fmoc；(b)从树脂结合的侧链经保护的第二肽中去除PG²，以提供具有根据式(Va)的结构的树脂结合的侧链经保护的第三肽：

(c)使树脂结合的侧链经保护的第三肽与对应于Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VIa)的结构的树脂结合的侧链经保护的第四肽：

以及

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L是不存在的或是接头；

R是H、氮保护基、生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(IIIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于Y²所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(IVb)的结构与树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹和PG²是不同的氮保护基，并且其中PG¹和PG²均不是Fmoc；

(b)从树脂结合的侧链经保护的第二肽中去除PG²，以提供具有根据式(Vb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第三肽：

(c)使树脂结合的侧链经保护的第三肽与对应于Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第四肽：

以及

在一些实施方案中，Y¹和Y²不相同。

在一些实施方案中，PG¹选自烯丙基氧基羰基(Alloc)、苯甲氧甲酰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、甲苯磺酰基(Ts)和苄基(Bn)。在一些实施方案中，PG¹是Boc。

在一些实施方案中，Z¹和Z²是-NH-，并且PG²是氮保护基。在一些实施方案中，Z¹是-NH-，并且PG²选自烯丙基氧基羰基(Alloc)、苯甲氧甲酰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、甲苯磺酰基(Ts)和苄基(Bn)。在一些实施方案中，Z¹是-NH-，并且PG²是Alloc。

在一些实施方案中，在步骤(d)之前，所述方法包括去除PG¹以在其中提供去保护的氮原子，以及使生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分与去保护的氮原子共价连接。

在一些实施方案中，步骤(a)和(c)中的一个或更多个氨基酸中的每一个均包含Fmoc保护的主链氨基，其中在每一个氨基酸与树脂结合的侧链经保护的肽连接之后，将相应的Fmoc基团去保护。

在一些实施方案中，步骤(a)和(c)中的每一者均在偶联剂的存在下进行。适合用于本文中公开的方法的偶联剂包括本领域已知的促进肽键形成的那些。示例性的非限制性偶联剂包括(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、六氟磷酸盐氮杂苯并三唑四甲基脲(HATU)、六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲(HBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)和羟基苯并三唑(HOBt)。

在一些实施方案中，步骤(a)和(c)中的每一者均包括添加N,N-二异丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine，DIEA)。

在另一个方面中，本公开内容提供了制备具有根据式(I)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

Y¹和Y²是相同的，并且各自表示相对于SEQ ID NO:1、2或3具有85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

R¹是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

R²是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

W是C_1-10烷基、C_1-10杂烷基、C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L是不存在的或是接头；

R是H、保护基、生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分；并且

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VII)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于由Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VI)的结构的树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹是非Fmoc的氮保护基；以及

(b)从所述树脂上切割树脂结合的侧链经保护的第二肽，以提供共价蛋白质二聚体。

其中：

Y¹和Y²是相同的，并且各自表示相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

W是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

L是不存在的或是接头；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIIa)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于由Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VIa)的结构的树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹是非Fmoc的氮保护基；以及

其中：

L是不存在的或是接头；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于由Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹是非Fmoc的氮保护基；以及

在一些实施方案中，PG¹选自烯丙基氧基羰基(Alloc)、苯甲氧甲酰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、甲苯磺酰基(Ts)和苄基(Bn)。在一些实施方案中，PG¹是Alloc。

在一些实施方案中，Z¹和Z²是-NH-。

在一些实施方案中，在步骤(b)之前，所述方法包括去除PG¹以在其中提供去保护的氮原子，以及使生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分与去保护的氮原子共价连接。

在一些实施方案中，步骤(a)的一个或更多个氨基酸中的每一个均包含Fmoc保护的主链氨基，并且其中在每一个氨基酸与树脂结合的侧链经保护的肽连接之后，将相应的Fmoc基团去保护。

在一些实施方案中，步骤(a)在偶联剂的存在下进行。示例性的非限制性偶联剂包括(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、六氟磷酸盐氮杂苯并三唑四甲基脲(HATU)、六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲(HBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)和羟基苯并三唑(HOBt)。

在一些实施方案中，步骤(a)包括添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

在另一个方面中，本公开内容提供了制备具有根据式(II)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹独立地是-O-、-NH-或-S-；

Z²独立地是-O-、-NH-或-S-；

R¹独立地是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

A是C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIII)的结构的多肽与式(IX)化合物反应以提供具有根据式(X)的结构的多肽：

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体；以及

(b)使式(X)的多肽与具有根据式(XI)的结构的多肽反应以提供共价蛋白质二聚体：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIIIa)的结构的多肽与式(IX)化合物反应以提供具有根据式(Xa)的结构的多肽：

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体；以及

(b)使式(Xa)的多肽与具有根据式(XIa)的结构的多肽反应以提供共价蛋白质二聚体：

其中：

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIIIb)的结构的多肽与式(IX)化合物反应，以提供具有根据式(Xb)的结构的多肽：

/>

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体；以及

(b)使式(Xb)的多肽与具有根据式(XIb)的结构的多肽反应以提供共价蛋白质二聚体：

在一些实施方案中，Y¹和Y²不相同。

在一些实施方案中，Z¹是-S-。在一些实施方案中，Z²是-NH-。

在一些实施方案中，相对于式(VIII)、(VIIIa)或(VIIIb)的多肽，式(IX)、(IXa)或(IXb)的化合物以摩尔过量提供。在一些实施方案中，式(IX)、(IXa)或(IXb)的化合物和式(VIII)、(VIIIa)或(VIIIb)的多肽以约10:1至约2:1的摩尔比提供。在一些实施方案中，式(IX)、(IXa)或(IXb)的化合物和式(VIII)、(VIIIa)或(VIIIb)的多肽以约5:1的摩尔比提供。

在一些实施方案中，X和X’是I。

Lig可以是本领域已知的可用于交叉偶联反应的任何膦配体。就非限制性实例而言，Lig可以是JohnPhos，DavePhos，XPhos，SPhos，MePhos，RuPhos，BrettPhos，PhDavePhos，tBuXPhos，tBuMePhos，tBuBrettPhos，tBuDavePhos或JackiiePhos。在一些实施方案中，Lig具有根据式(XII)的结构：

其中：

B和C各自独立地是C_6-10芳基或6元至10元杂芳基；

R^a和R^b各自独立地是C_5-10环烷基、C_1-6烷基或C_8-10芳基，任选地其中所述芳基被一个、两个或三个C_1-3卤代烷基取代；

R^c独立地是C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或N(C_1-4烷基)₂

R^d独立地是C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、N(C_1-4烷基)₂、SO₃H、SO₃M或C_3-10环烷基；

M是Li、Na或K；

m是0、1、2、3或4；并且

p是1、2、3或4。

在一些实施方案中，Lig是

在另一个方面中，本公开内容提供了制备具有根据式(II)的结构的共价蛋白质二聚体的方法：

其中：

Z¹独立地是-O-、-NH-或-S-；

Z²独立地是-O-、-NH-或-S-；

R¹独立地是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

A是C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1；

所述方法包括使具有根据式(VIII)的结构的多肽与式(IX)化合物反应，以提供共价蛋白质二聚体：

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体。

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1；

所述方法包括使具有根据式(VIIIa)的结构的多肽与式(IX)化合物反应以提供共价蛋白质二聚体：

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体。

其中：

所述方法包括使具有根据式(VIIIb)的结构的多肽与式(IX)化合物反应以提供共价蛋白质二聚体：

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体。

在一些实施方案中，Z¹是-S-。在一些实施方案中，Z²是-NH-。

在一些实施方案中，X和X’是I。

Lig可以是本领域已知的可用于交叉偶联反应的任何膦配体。就非限制性实例而言，Lig可以是JohnPhos，DavePhos，XPhos，SPhos，MePhos，RuPhos，BrettPhos，PhDavePhos，tBuXPhos，tBuMePhos，tBuBrettPhos，tBuDavePhos或JackiePhos。在一些实施方案中，Lig具有根据式(XII)的结构：

其中：

B和C各自独立地是C_6-10芳基或6元至10元杂芳基；

R^c独立地是C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或N(C_1-4烷基)₂

M是Li、Na或K；

m是0、1、2、3或4；并且

p是1、2、3或4。

在一些实施方案中，Lig是

治疗方法

在一个方面中，本文中提供了在有此需要的对象中治疗特征在于MYC失调的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用本公开内容的共价蛋白质二聚体。在一些实施方案中，特征在于MYC失调的疾病或病症是免疫病症，例如重症肌无力、银屑病、寻常性天疱疮和动脉粥样硬化。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，癌症选自胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肝癌、脑癌、神经母细胞瘤、结直肠癌和血液恶性病。

还描述了使细胞或生物样品与有效量的本公开内容的共价蛋白质二聚体接触的方法。

在另一个方面中，本文中提供了在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向对象施用本公开内容的共价蛋白质二聚体。

术语“癌症”是指由恶性赘生性细胞增殖引起的任何癌症，例如肿瘤、赘生物、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤等。例如，癌症包括但不限于间皮瘤、白血病和淋巴瘤例如皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)、非皮肤外周T细胞淋巴瘤、与人T细胞淋巴营养病毒(human T-cell lymphotrophic virus，HTLV)相关的淋巴瘤例如成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell leukemia/lymphoma，ATLL)、B细胞淋巴瘤、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphaticleukemia，ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphatic leukemia，CLL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、伯基特淋巴瘤、成人T细胞白血病淋巴瘤、急性髓性白血病(acute-myeloid leukemia，AML)、慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)或肝细胞癌。另外的实例包括骨髓增生异常综合征、儿童实体瘤例如脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、维姆瘤(Wilms'tumor)、骨肿瘤和软组织肉瘤、成人常见实体瘤例如头颈癌(例如口腔癌、喉癌、鼻咽癌和食管癌)、泌尿生殖系统癌(例如前列腺癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌)、肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤和其他皮肤癌、胃癌、脑肿瘤、与Gorlin综合征相关的肿瘤(例如髓母细胞瘤、脑膜瘤等)以及肝癌。可由主题化合物治疗的癌症的另外的示例性形式包括但不限于骨骼肌或平滑肌癌、胃癌、小肠癌、直肠癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、肾上腺癌、肛门癌、直肠癌、甲状旁腺癌和垂体癌。

本文中所述共价蛋白质二聚体可用于预防、治疗和研究的另外癌症是，例如结肠癌、家族性腺瘤性息肉病癌(familial adenomatous polyposis carcinoma)和遗传性非息肉性结直肠癌或黑素瘤。此外，癌症包括但不限于唇癌、喉癌、喉咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(甲状腺髓样癌和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿癌、黑素瘤、脑肿瘤例如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)和浆细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌(stomach cancer)、皮肤癌、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞肝癌、乳头状肾癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体瘤。在另外的实施方案中，疾病是肺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、鳞状细胞癌或前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或子宫癌。在一些实施方案中，癌症是血液恶性病。在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤或弥漫大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，本公开内容的共价蛋白质二聚体可用于治疗癌症，例如结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌和肺癌；以及骨髓增生性病症，例如真性红细胞增多症、血小板增多症、伴有骨髓纤维化的髓样化生、慢性髓细胞性白血病、慢性粒单核细胞白血病、高嗜酸性粒细胞增多综合征、幼年型粒单核细胞白血病和全身性肥大细胞疾病。在一些实施方案中，本公开内容的共价蛋白质二聚体可用于治疗造血病症急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性早幼粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病(ALL)。

在一个方面中，本公开内容提供了本公开内容的一种或更多种共价蛋白质二聚体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症包括但不限于本文中公开的多种类型的癌症。

制剂和剂量

本文中所述的共价蛋白质二聚体通常将作为药物组合物施用于对象。本文中使用的术语“患者”和“对象”包括人和非人动物。本文中所述的共价蛋白质二聚体可在医师的指导下用于治疗。

包含本公开内容的共价蛋白质二聚体的组合物可被方便地配制成用于与任何可药用载体一起施用。例如，共价蛋白质二聚体可与可接受介质例如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、油、洗涤剂、助悬剂，或其合适的混合物一起配制。共价蛋白质二聚体在所选介质中的浓度可变化，并且可基于药物组合物的期望施用途径来选择介质。除非任何常规介质或试剂与待施用的共价蛋白质二聚体不相容，否则考虑将其用于药物组合物中。

适于向特定对象施用的本文中公开的共价蛋白质二聚体的剂量和给药方案可由医师考虑对象的年龄、性别、体重、一般医学状况、和施用所述共价蛋白质二聚体所针对的特定病症及其严重程度来确定。医师也可考虑施用途径、药物载体和共价蛋白质二聚体的生物学活性。

合适药物组合物的选择也将取决于所选的施用方式。例如，本发明的共价蛋白质二聚体可通过直接注射到期望部位(例如肿瘤)来施用。在这种情况下，包含共价蛋白质二聚体的药物组合物分散在与注射部位相容的介质中。本公开内容的共价蛋白质二聚体可通过任何方法施用。例如，本公开内容的共价蛋白质二聚体可非限制性地经肠胃外、皮下、经口、表面、经肺、经直肠、经阴道、静脉内、腹膜内、鞘内、脑内(intracerbrally)、硬膜外、肌内、皮内或颈动脉内施用。

包含与可药用载体紧密混合的作为活性成分的本公共内容的共价蛋白质二聚体的药物组合物可根据常规药物复配(compounding)技术来制备。根据期望的用于施用(例如静脉内、经口、直接注射、颅内和玻璃体内)的制剂形式，载体可采用广泛多种形式。

为了便于施用和剂量的均一性，本公开内容的药物组合物可被配制成剂量单位形式。本文中使用的剂量单位形式是指适用于正在接受治疗的患者的药物制剂的物理离散单位。每个剂量均应包含一定量的经计算与所选药物载体缔合来产生期望作用的活性成分。用于确定合适剂量单位的方法是本领域技术人员公知的。

剂量单位可基于对象的体重成比例地提高或降低。如本领域已知的，用于减轻特定病理状况的合适浓度可通过剂量浓度曲线计算来确定。

根据本公开内容，用于施用共价蛋白质二聚体的合适剂量单位可通过在动物模型中评价对分子或细胞的毒性来确定。可向小鼠施用药物制剂中多种浓度的共价蛋白质二聚体，并且可基于作为治疗结果观察到的有益结果和副作用确定最小和最大剂量。也可通过评估与其他标准药物组合的共价蛋白质二聚体的效力来确定合适的剂量单位。共价蛋白质二聚体的剂量单位可根据检测到的作用单独确定或与每次治疗组合确定。

包含共价蛋白质二聚体的药物组合物可以以合适的间隔施用，例如，每天至少两次或更多次直至病理症状减轻或缓解，之后可将剂量降低至维持水平。在特定情况下的合适间隔通常将取决于对象的状况。

实施例

通过以下实施例进一步举例说明本公开内容，这些实施例不应被解释为将本公开内容的范围或精神限于本文中所述的具体过程。应理解，提供实施例以举例说明某些实施方案，并且不旨在由此限制本公开内容的范围。还应理解，在不脱离本公开内容的精神和/或所附权利要求书的范围的情况下，可采取多种其他实施方案、其修改方案和等同方案，所述多种其他实施方案、其修改方案和等同方案本身可能已经向本领域技术人员提示。

实施例1：赖氨酸连接的共价蛋白质二聚体的合成

肽基树脂1和2的手动制备

将Rink酰胺树脂的制剂(载量0.18mmol/g，典型规模：100mg，0.02mmol)加载到烧结注射器(6mL)中，在DMF(4mL)中溶胀5分钟，并随后排出。将每种Nα-Fmoc保护的氨基酸(0.2mmol，10当量)溶解在包含0.39M HATU的DMF(0.5mL)中。紧临偶联之前，向混合物添加DIEA(100μL，30当量)以活化氨基酸。在预活化15秒之后，将混合物添加至树脂并在伴随偶尔搅拌的情况下反应10分钟。在偶联步骤完成之后，将注射器排空，并将树脂用DMF(3×5mL)洗涤。通过向树脂添加哌啶(在DMF中20％，3mL)进行Fmoc去保护(1×1分钟+1×5分钟)，随后排出树脂并将其用DMF(5×5mL)洗涤。对于肽基树脂1，用Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-βAla-OH和Fmoc-Lys(Fmoc)-OH顺序进行偶联循环；对于肽基树脂2，用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-βAla-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH顺序进行偶联循环。

自动化流动肽合成(automated flow peptide synthesis，AFPS)

通过平行单次快速流动固相合成，从肽基树脂1制备共价MAX-MAX和Omomyc-Omomyc同二聚体。每个步骤均同时涉及两个氨基酸的平行偶联和随后的去保护。每种同二聚体的合成时间均为约3.5小时(MAX-MAX(3)，164个残基；Omomyc-Omomyc(4)，184个残基)。在切割和侧链去保护之后，LC-MS分析显示作为两种粗反应混合物的主要组分的期望产物。在制备型HPLC纯化之后，分别以6％和8％的产率获得纯的MAX-MAX(3)和Omomyc-Omomyc(4)。

通过连续单次快速流动固相合成制备共价MYC-MAX和Omomyc-MAX异二聚体。使用快速流动合成仪，从肽基树脂2的赖氨酸接头的α-胺组装MAX。对于最后的氨基酸，添加Boc-甘氨酸，并从赖氨酸接头的Nε中去除Alloc保护。在该胺上，将MYC或Omomyc组装以分别提供5和6。每种异二聚体的合成时间总计约8小时(MYC-MAX(5)，167个残基；Omomyc-MAX(6)，175个残基)。观察到作为从切割和侧链去保护获得的粗产物混合物的主要组分的两种异二聚体。在制备型HPLC纯化之后，分别以4％和5％的产率获得纯的MYC-MAX(5)和Omomyc-MAX(6)二聚体。

在图1中示出的两个自动化流动系统上并且如Mijalis,A.J.et al.Nat.Chem.Biol.13,464-466(2017)中所述合成所有的肽。所使用的合成条件根据Hartrampf,N.et al.Science368,980-987(2020)。流量＝40mL/分钟，温度＝90℃(环路1)，70℃(环路2；用于组氨酸)以及85至90℃(反应器)。50mL/分钟泵头泵送400μL液体/泵冲程(pump stroke)；5mL/分钟泵头泵送40μL液体/泵冲程。标准的合成循环涉及以40mL/分钟在升高的温度下预洗涤树脂60秒的第一步骤。在偶联步骤期间，使用三台HPLC泵：50mL/分钟泵头泵送活化剂，第二台50mL/分钟泵头泵送氨基酸，和5mL/分钟泵头泵送DIEA。为了在DIEA泵被激活之前引发偶联剂和氨基酸，将前两台泵激活8次泵送冲程(pumping stroke)。然后将三台泵一起启动7次泵送冲程的时间，然后将活化剂泵和氨基酸泵使用旋转阀来切换以选择DMF。将三台泵一起启动以进行最后8次泵送冲程，然后关闭DIEA泵并且另外的两个泵继续洗涤树脂另外的40次泵冲程。在去保护步骤期间，使用两台HPLC泵。使用旋转阀，一台HPLC泵选择去保护储备溶液和DMF。将泵激活13次泵冲程。将两种溶液以1:1的比例混合。接下来，旋转阀选择DMF用于两台HPLC泵，并且将树脂洗涤另外的40次泵冲程。对所有另外的单体重复偶联-去保护循环。

手动Boc-Gly-OH偶联

对于异二聚体5和6，在通过Alloc保护的赖氨酸进行位点选择性修饰之前，用Boc-Gly-OH封闭蛋白质N端：将肽基树脂(约10μmol理论载量)加载到烧结注射器(6mL)中，在DMF(4mL)中溶胀5分钟，并随后排出。将Boc-Gly-OH(18mg，100μmol)和HATU(54mg，90μmol)溶解在DMF(250μL)中，用DIEA(38mg，52μL，300μmol)活化，将其添加至肽基树脂中并孵育15分钟。在该时间之后，将树脂排出，用DMF(3×5mL)洗涤并用于下一步骤。

Alloc去保护

将肽基树脂(约10μmol理论载量)用二氯甲烷(3×5mL)洗涤，并随后在室温下在避光下用在二氯甲烷/哌啶(8:2，1mL)中的Pd(PPh₃)₄(11.0mg，10μmol，1当量)处理30分钟。然后将树脂排出并用二氯甲烷(3×5mL)洗涤。

Mach3和TAMRA缀合

从同二聚体3或4开始，根据以上方案进行N端Boc保护和C端赖氨酸的Alloc去保护。通过AFPS从所得游离胺并入(install)Mach3(SEQ ID NO:4)。对于TAMRA并入，将肽基树脂(约10μmol理论载量)加载到烧结注射器(6mL)中，在DMF(4mL)中溶胀5分钟，并随后将其排出。将5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA，22mg，50μmol，5当量)和HATU(17mg，45μmol，4.5当量)溶解在DMF(500μL)中，用DIEA(19mg，26μL，150μmol)活化，将其添加至肽基树脂中并在避光下孵育30分钟。在该时间之后，将树脂排出，用DMF(3×5ml)洗涤，并储存直至切割。

切割方案

在合成之后，将肽基树脂用二氯甲烷(3×5mL)洗涤并干燥。向烧结注射器内部的肽基树脂添加约8mL切割溶液(82.5％ TFA、5％水、5％苯酚、5％茴香硫醚、2.5％ EDT)。将切割在室温下保持4小时，伴随偶尔振动。在该时间之后，将切割混合物转移至falcon管(通过注射器玻璃料，使树脂保持在注射器中)，并将该树脂用另外的2mL切割溶液洗涤。将冰冷的乙醚(45mL)添加至切割混合物中，并通过离心收集沉淀，并用冷乙醚(45mL)再研磨两次。弃去上清液。使剩余的乙醚蒸发，并将肽溶解在具有0.1％ TFA的水中的50％乙腈中(将长肽溶解在具有0.1％ TFA的水中的70％乙腈中)。将肽溶液用尼龙0.22μm注射器过滤器过滤，并冷冻，并随后冻干直至干燥。

实施例2：赖氨酸连接的共价蛋白质二聚体的表征

生物物理表征确定了四种共价蛋白质二聚体3、4、5和6的折叠和DNA结合活性。首先通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)分析二聚体。所有二聚体构建体均在约20kDa的预期高度处具有条带，并且在约10kDa处观察到单体MYC、MAX和Omomyc(通过AFPS合成)。蛋白质二聚体的再折叠不需要特殊的操作。将冻干的二聚体溶解在折叠缓冲液(MES 10mM、KCl 150mM、MgCl₂ 1mM、TCEP 1mM、甘油10％，pH＝6.5)中，并且所有四种二聚体均显示出明确的α-螺旋特征，如通过圆二色性(circular dichroism，CD)确定的。接下来进行电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)来确定二聚体的DNA结合活性。在1μM的DNA浓度和2μM的蛋白质浓度下，所有的二聚体均与E-盒DNA形成复合物，如通过凝胶上的位移延迟观察到的。作为阴性对照测试的单体MYC(4μM)不与E-盒DNA结合。

共价连接的二聚体与其非共价类似物相比在水性缓冲液中具有稳定的结构。记录在4℃至89℃之间的在221nm处的CD信号以确定解聚温度(melting temperature，Tm)。使用该方法，将非共价MAX/MAX和Omomyc/Omomyc二聚体与四种合成的共价蛋白质二聚体(3、4、5和6)进行比较。还在存在等摩尔E-盒DNA的情况下进行了蛋白质解聚温度测量。总的来说，DNA稳定了蛋白质复合物的结构。共价键联显示出对MAX二聚体的显著稳定作用：非共价MAX结构的Tm被确定为29℃，而共价二聚体的Tm为38℃。总的来说，Omomyc复合物显示出比其他测试二聚体更高的结构稳定性。与共价Omomyc-Omomyc(4)相比，未观察到非共价Omomyc的显著Tm差异。该观察结果可通过Omomyc亮氨酸拉链的稳定性更大来解释。所有测试结构中的最稳定的复合物是在DNA存在下的共价Omomyc-Omomyc二聚体(4)，其Tm为67℃。最后，测试了二聚体4的蛋白质水解稳定性。在37℃下在人血清(在PBS中5％)中孵育1小时之后，发现了91％的完整蛋白质二聚体。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)

利用预染色的Invitrogen SeeBlue^TM Plus2分子量标准品，使用Bolt^TM 4至12％Bis-Tris Plus凝胶(10孔)在165V下进行SDS-PAGE分析，持续36分钟。将Bolt^TM LDS样品缓冲液(4×)添加至每个蛋白质样品(1μg)用于加载到凝胶上。通过考马斯蓝染色来使条带显现。

电泳迁移率变动测定(EMSA)

将E-盒DNA探针(结合缓冲液中的2μM)加热至95℃，持续5分钟，并随后在15分钟内使其冷却低至室温，以进行双链退火。将蛋白质二聚体(在结合缓冲液(MES10mM、KCl150mM、MgCl₂ 1mM、TCEP 1mM、甘油10％，pH＝6.5)中4μM)添加至DNA(最终浓度：2μM蛋白质和1μM DNA)，并将该混合物在室温下孵育1小时。在孵育期间，将10％聚丙烯酰胺凝胶在1×TBE缓冲液中预运行(1小时，4℃，100V)。在该时间之后，将DNA蛋白质混合物(20μL)与6×DNA负载染料(Loading Dye，4μL)混合，并加载到凝胶上，将该凝胶在4℃下在75V下运行90分钟。将凝胶用水洗涤20秒，并随后在室温下用在1×TBE缓冲液中的0.02％溴化乙啶染色15分钟。在Biorad凝胶成像仪上使条带显现。

圆二色性(CD)

将冻干的样品以0.1mg/mL的最终蛋白质浓度溶解在折叠缓冲液(MES10mM、KCl150mM、MgCl₂ 1mM、TCEP 1mM、甘油10％、pH＝6.5)中。使用具有1mm路径长度石英比色皿的AVIV 420圆二色性光谱仪来获得圆二色性(CD)谱。每次测量使用300μL样品。对于全波长扫描，在4℃下记录250至200nm的CD谱，每个波长下的平均时间为3秒。以摩尔椭圆率报告Y轴值。对于解聚温度确定，记录4至89℃之间的在221nm处的CD谱，其中步长为+5度并且每个温度下的平衡时间为60秒。对于DNA/蛋白质复合物的测量，将等摩尔的E-盒DNA添加至折叠缓冲液中的蛋白质；将混合物加热至95℃，持续5分钟，使其在15分钟内冷却低至室温，并随后进行分析。

实施例3：共价蛋白质二聚体的细胞穿透

使用共价二聚体7、8和9，通过显微术和流式细胞术评估细胞穿透。为了评价摄取，将HeLa细胞用荧光团标记的二聚体(7、8和9)处理，并通过流式细胞术测量荧光。在短暂(15分钟)孵育之后，所有三种类似物均以剂量依赖性方式被摄取到细胞中(图4)。添加(4’,6-二脒-2-苯基吲哚)DAPI作为不可透过膜的生存力染料，其显示出TAMRA荧光细胞门控群没有被染色，表明该构建体进入了细胞而没有破坏膜。这些发现通过荧光显微术确定。用共价二聚体对HeLa细胞处理15分钟，随后在新鲜培养基中孵育1小时以及通过共聚焦显微术的成像显示出强烈的点状荧光，这与先前针对单体Omomyc的观察结果一致(图5)。然而，用9处理产生在核中的点状荧光以及弥漫荧光，表明内体逃逸和核定位(图5)。这些实验表明，二聚体转录因子被快速摄取到细胞中，并且它们的核定位可使用添加非天然的靶向序列来改善。

细胞培养

在37℃和5％ CO₂下，将HeLa(ATCC CCL-2)、A549(ATCC CCL-185)和H441(ATCCHTB-174)癌细胞系维持在MEM、FK-12和RPMI-1640培养基中，每种培养基各自包含10％v/v胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1％v/v青霉素-链霉素。在80％汇合率下使用0.25％胰蛋白酶-EDTA对细胞进行传代。

流式细胞术

在实验的前一天晚上，将HeLa细胞以10,000个细胞/孔平板接种在96孔板中。在当天，将细胞用包含血清的培养基中的指定浓度的TAMRA-Omomyc、7、8或9处理15分钟，将其用PBS洗涤一次，并在37℃和5％ CO₂下用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理30分钟以消化膜结合的蛋白质。然后将细胞用PBS洗涤，在包含1×DAPI的PBS中孵育三分钟，并随后重悬于包含2％FBS的PBS中。然后立即在BD FACS LSR II上使用DAPI和PE通道对细胞进行分析。

显微术

在实验的前一天晚上，将HeLa细胞以10,000个细胞/孔平板接种在96孔30mm玻璃底板中。在当天，将细胞用完全培养基中的TAMRA-Omomyc、7、8或9(5μM)处理15分钟，将其用新鲜培养基洗涤两次，并在37℃和5％ CO₂下孵育1小时，然后成像。在W.M.Keck显微术设施中，在RPI旋转盘共聚焦显微镜上，在RFP设置(561nm100mW OPSL激发激光，605/70nm发射)和DAPI设置(405nm 100mW OPSL激发激光，450/50nm发射)下获得显微照片。

实施例4：在Omomyc-Omomyc处理后对癌细胞增殖的抑制和对MYC驱动的转录的抑制

共价蛋白质二聚体抑制癌细胞的增殖。已知MYC在大多数的人癌症中驱动细胞增殖。在具有一系列MYC表达水平的三种细胞系中测试了所有化合物的生物活性(关于细胞培养方案，参见实施例3)；HeLa包含高MYC水平，A549包含中等水平，并且H441具有低MYC表达。将细胞用共价蛋白质二聚体处理72小时，并用(CTG)测定测量增殖。根据MYC表达水平，细胞增殖抑制遵循预期趋势；在HeLa细胞中观察到最显著的抑制，并且在H441细胞中观察到最弱的抑制。所有合成的二聚体均表现出抑制活性，其中4具有最高活性，且EC₅₀为4μM。这一观察结果与结构稳定性数据一致。此外，9还降低了每种细胞系中的EC₅₀(在HeLa细胞中为2μM)，表明核靶向部分有助于转录因子到达其靶标并赋予增强的活性。

共价蛋白质二聚体干扰MYC驱动的基因表达，如通过RNA测序(RNA-seq)和基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)确定的。为了评价化合物的生物活性是否与抑制MYC驱动的表达相关，对用4处理的A549细胞进行RNA-seq。与对照细胞相比，观察到431个基因的下调和297个基因的上调，表明共价蛋白质二聚体对基因表达有作用(图13)。在下调的基因中，发现了数个参与KRas信号传导途径的基因，已知这些基因驱动A549非小细胞肺癌细胞中的癌症发生。这一发现与先前表明MYC是KRas突变阳性肺癌发病机制的主要效应物的报道一致。RNA-seq数据的GSEA表明在4-处理条件下MYC-靶基因集的负富集，进一步证实了共价蛋白质二聚体干扰MYC驱动的基因表达程序(图14)。

细胞增殖抑制测定

在实验前一天，将细胞以5,000个细胞/孔平板接种在96孔板中。在完全培养基中制备不同浓度的共价蛋白质二聚体，并将其转移至板。将细胞在37℃和5％ CO₂下孵育72小时，并使用通过发光定量的CellTiter-Glo测定来测量细胞增殖。

NA-seq和GSEA

在6孔板中，将125,000个A549细胞平板接种到每个孔中。在第二天，将细胞用补充有10％ FBS和1％pen/strep的F12K培养基中的4(12.5μM)处理，并孵育72小时。使用QiagenRNeasy Plus Mini试剂盒(74136)，随后是DNA酶处理(AM1906)分离RNA。制备KAPAHyperRiboErase文库并在Hi-seq 2500仪器上测序。使用HISAT2 htseq-count功能对来自测序的读取进行比对。使用R中的DESEQ2包对原始比对读数计数进行经处理细胞与对照细胞之间的差异基因表达分析。将差异表达的基因通过其log2FC和调整的p值进行排序。使用分子标签数据库(Molecular Signatures Database，MSigBD)中的基因集进行预排序基因集富集分析(GSEA)以鉴定MYC靶基因集。

实施例5.MAX、MYC和Omomyc类似物的合成

MAX、MYC和Omomyc类似物10、11和12的制备

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逐步自动化快速流动固相合成(如实施例1中所述)能够快速高保真合成Max(10)、Myc(11)和Omomyc(12)类似物(长度为83至91个残基；图15)。每种蛋白质的合成时间总计约3.5小时，并且在一个工作日内产生三种蛋白质。将C端半胱氨酸残基并入到三种类似物中，以允许随后通过钯介导的S-芳基化化学反应进行交叉偶联反应。在每个偶联循环之后的Fmoc去保护步骤的在线UV-vis检测表明所有单体的有效并入(图16)。在三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)切割和乙醚沉淀之后，通过粗产物的LC-MS分析确定了三种类似物的高质量合成(图17)。通过反相快速色谱纯化类似物10、11和12，分别以38％、44％和40％的分离产率获得每一种数十毫克的三种经纯化类似物。这些结果表明基于流动的合成能够产生Myc、Max和Omomyc蛋白的DNA结合结构域。

实施例6：MAX、MYC和Omomyc类似物的DNA结合活性

三种合成类似物10、11和12可形成非共价二聚体，并与靶E-盒DNA(5’-CCGGCTGACACGTGGTATTAAT-3’)结合。通过以所有可能的二元组合(Max+Max、Myc+Myc、Omomyc+Omomyc、Myc+Max、Omomyc+Max和Omomyc+Myc)对类似物进行组合来确定10、11和12对典型E盒序列的DNA结合活性(图18)。将所得六种溶液中的每一种单独地与22bp双链DNA E-盒序列孵育，并通过电泳迁移率变动测定(EMSA)检测DNA结合活性(图19)。除Myc 10之外，合成蛋白质与E-盒DNA探针复合，如显著上移所示。正如预期的那样，单独的Myc 10不与E-盒DNA探针结合，因为它不能同源二聚化。这种DNA结合测定表明，每种单体均能够如预期的那样二聚化，并与E-盒DNA形成功能性蛋白质复合物。然而，不能确定在包含两种不同单体的溶液中形成的二聚体种类。例如，在混合Max(11)和Omomyc(12)后，可形成三种不同的二聚体(Max/Max、Omomyc/Omomyc和Max/Omomyc)并且其可能与DNA结合(图18)。为了以可信的方式评估这些蛋白质复合物的活性，获得明确限定的共价蛋白质二聚体是至关重要的。

实施例7：二硫代苯连接的共价蛋白质二聚体的合成和表征

使用双官能钯OAC的TF单体的交叉偶联

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双官能钯氧化加成复合物(oxidative addition complexe，OAC)能够按需合成蛋白质10、11和12的同二聚体类似物和异二聚体类似物，以产生所有可能的共价二聚体组合。二聚化策略如图20中所示：双官能Pd OAC与蛋白质单体的反应和随后钯重新插入到芳基-碘化物键中产生了这样的蛋白质-OAC：其然后可与第二蛋白质单体的半胱氨酸反应，形成最终的二聚体。使用单次快速方案来形成同二聚体类似物。在室温下，使蛋白质10、11和12中的每一个独立地与Pd OAC在10％ DMF、20mM Tris、150mM NaCl缓冲液(pH 7.5)中反应60分钟(图21)，以获得蛋白质同二聚体，如通过SDS-PAGE确定的。然后将同二聚体通过RP-HPLC纯化并通过LC-MS分析表征，分别以37％、40％和38％的分离产率得到Myc-Myc(13)、Max-Max(14)和Omomyc-Omomyc(15)(图22)。

为了制备异二聚体类似物，使用两步操作分离中间体蛋白质-OAC。在室温下，使蛋白质10、11和12与五当量的Pd OAC反应60分钟(图20)，并将所得蛋白质-OAC中间体通过RP-HPLC分离。分别以45％、54％和43％的分离产率获得10-OAC、11-OAC和12-OAC。接下来，使每种中间体与期望类似物反应(10-OAC与12，11-OAC与10，12-OAC与11，图21)。最后，将异二聚体产物通过RP-HPLC纯化，分别以7％、16％和6％的分离产率提供Myc-Max(16)、Omomyc-Max(17)和Omomyc-Myc(18)类似物。通过LC-MS(图22)和SDS-PAGE分析(图23)确定了所有六种二聚体的身份和纯度。接下来，研究了S-芳基键的化学稳定性。在37℃下，将蛋白质二聚体14(25μM)在磷酸缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.5)中孵育。LC-MS分析表明在24小时之后没有发生降解。

与单体类似物相比，共价蛋白质二聚体表现出α-螺旋特征并表现出更高的热稳定性。二聚体类似物(13、14、15、16、17和18)的折叠和稳定性通过圆二色性(CD)光谱术来表征(关于方案，参见实施例2)。在207和222nm处的强双最小值表明了二聚体类似物的α-螺旋特征(图24)。对解聚温度(Tm)的分析表明二聚体形成了热力学更稳定的复合物，这通过与单体类似物相比Tm提高来表明(图25和图26)。有趣的是，与Max单体11(发现其Tm为30℃)相比，Omomyc-Max二聚体17显示出最高的Tm(63℃)，随后是Myc-Max 16(53℃)以及Max-Max14(40℃)。然而，在59℃时，Omomyc-Omomyc 15显示出与Omomyc单体12类似的Tm，这可能是由于Omomyc蛋白的高度同源二聚化倾向。总的来说，这些结果表明，与单体类似物相比，S-芳基键可导致二聚体蛋白质复合物的结构稳定。

Pd介导的同二聚体合成的一般策略

向1.5mL Eppendorf管添加作为溶液的在20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.5)、234μL20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.5)、30.5μL DMF中的蛋白质-Cys单体(300μL，10.0mg/mL，1.0当量)和作为溶液的在DMF(滴定超过一分钟)中的Pd OAC 4(28.5μL，10.0mg/mL，1.0当量)。主要反应组分的最终反应浓度如下：2(500μM)；4(500μM)。将Eppendorf管封闭，涡旋，并在室温下孵育60分钟。从反应混合物中取出小等分试样用于通过SDS-PAGE进行分析。最后，将该反应通过DTT(10μl，在H₂O中1M)猝灭，并在室温下保持5分钟，然后通过RP-HPLC进行纯化。

蛋白质-OAC合成的一般策略

向Falcon 15mL锥形离心管添加作为溶液的在20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.5)中的蛋白质单体(9.0mL，1.1mg/ml，1.0当量)和作为溶液的在DMF中的Pd OAC(1.0mL，4.8mg/mL，5.0当量)。主要反应组分的最终反应浓度如下：10(100μM)；Pd OAc(500μM)。将Falcon管封闭，涡旋并在室温下孵育30分钟。从反应混合物中取出小等分试样用于通过LC-MS进行分析。最后，通过RP-HPLC纯化反应物。

Pd介导的异二聚体合成的一般策略

向5.0mL Eppendorf管添加作为溶液的在20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.5)、260μl20mM Tris、150mM NaCl缓冲液(pH 7.5)、185μl DMF中的蛋白质-OAC(500μL，6.0mg/mL，1.0当量)和作为溶液的在20mM Tris、150mM NaCl缓冲液(pH 7.5)中的蛋白质-Cys单体(905μl，6.0mg/ml，2.0当量)。主要反应组分的最终反应浓度如下：蛋白质-OAC(150μM)；蛋白质-Cys(300μM)。将Eppendorf管封闭，涡旋并在室温下孵育60分钟。从反应混合物中取出小等分试样用于通过SDS-PAGE进行分析。最后，将该反应通过DTT(10μl，H₂O中1M)猝灭，并在室温下保持5分钟，然后通过RP-HPLC进行纯化。

实施例8：蛋白质二聚体的DNA结合活性和生物物理表征

S-芳基交联的蛋白质二聚体显示出与E-盒序列的DNA结合活性。通过EMSA，观察到Max-Max 14、Myc-Max 16和Omomyc-Max 17的DNA缔合(图27)。在阴性对照Myc-Myc 13下未检测到DNA结合。此外，Omomyc-myc 18未显示出与DNA的缔合，表明该二聚体的抑制活性可能与其将内源性Myc螯合(sequester)成非活性形式相关。最后，通过生物层干涉术(bio-layer interferometry，BLI)来测量Max-Max 14与E-盒DNA探针的解离常数(图28)。确定的K_D为50±11nM，这与先前的报道显示的E-盒Max/Max复合物的低纳摩尔K_D值非常一致。这些实验共同证明了二聚体蛋白质以与非共价类似物类似的效力与E-盒DNA形成复合物。特别地，Max-Max 14被确定为是天然Myc抑制剂Max/Max的最接近类似物，作为E-盒DNA的强效结合剂。

实施例9：共价蛋白质二聚体14的细胞穿透性和抗增殖活性

基于细胞的研究表明，Max-Max 14共价蛋白质二聚体本质上是细胞可穿透的。为了研究Max-Max 14的生物活性，扩大交叉偶联反应以产生约10mg纯物质用于细胞研究。为了评估细胞穿透性，制备了用单羧基四甲基罗丹明(TAMRA)荧光团标记的Max-Max类似物(TAMRA-Max-Max(19))。接下来，通过流式细胞术确定不同浓度的TAMRA-Max-Max 19的细胞摄取(关于方案，参见实施例3)。发现用二聚体19处理产生了荧光的剂量依赖性提高，表明二聚体被摄取到细胞中(图29)。包含DAPI作为生存力染色没有产生被染色的细胞群，表明用TAMRA-Max-Max 19处理的细胞没有遭受膜透化。通过共聚焦荧光显微术进行的对HeLa细胞中构建体的摄取的进一步研究表明在短时间孵育之后的强的内化荧光(关于方案，参见实施例3)(图30)。这些结果确定了合成的二聚体不需要进一步改造而被直接递送到细胞中。

除进入细胞之外，Max-Max 14还抑制Myc依赖性癌细胞系的增殖。在一些癌细胞系(例如HeLa)中，高水平的Myc驱动稳健的细胞增殖。在包含高水平Myc的HeLa细胞中测试共价二聚体14，并在72小时之后测量细胞增殖。发现共价二聚体14以剂量依赖性方式抑制HeLa细胞增殖，其中EC₅₀为6μM。Max-Max 14的EC₅₀与最近研究报道的用于稳定癌细胞系中内源性Max二聚体的小分子的一致。值得注意的是，除其细胞穿透性之外，Max-Max 14还具有与基于小分子的Myc抑制剂相当的活性。还发现Max-Max 14抑制肺腺癌细胞A549和H441的增殖，其中两者的EC₅₀为19μM。已知这两种肺癌细胞系与HeLa相比具有较低的Myc水平，这可能解释了在假设同等细胞穿透的情况下，Max-Max 14在这些细胞中的较低的抗增殖作用。总之，这些实验表明，Max-Max 14进入细胞，并且潜在地通过占据E-盒位点并阻断Myc依赖性基因转录来抑制癌细胞增殖。

实施例10：用Max-Max处理的癌细胞的RNA测序和基因集富集分析

RNA测序分析显示，Max-Max 14选择性地下调癌细胞中的Myc靶基因。已知Myc通过与E-盒DNA序列结合进而触发促增殖基因的表达来驱动细胞增殖。为了评估Max-Max 14通过调节Myc驱动的基因的抗增殖活性，将肺腺癌细胞A549用Max-Max 14处理72小时，并提取RNA用于RNA测序分析(关于方案，参见实施例4)。发现14通过下调160个基因和上调70个基因直接干扰基因转录(图32)。已确定的下调和上调基因与先前关于Myc抑制的报道一致。值得注意的是，发现Max-Max 14下调参与KRas信号传导途径的数个基因的表达(通常使癌症进展)。14对Myc相关基因的选择性通过具有数个Myc靶基因集的RNA测序数据的基因集富集分析(GSEA)进一步确定。总之，这些结果确定了合成的复合物14能够下调Myc驱动的基因特征。

根据前面的描述，除本文中描述的那些之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员来说将变得明显。这样的修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。本申请中引用的每篇参考文献(包括但不限于所有专利、专利申请和出版物)均通过引用整体并入本文。

参考文献

1.Dawson，P.E.，Muir，T.W.，Clark-Lewis，I.&Kent，S.B.H.Synthesis ofproteins by native chemical ligation.Science(80-.).266，776(1994).

2.Bode，J.W.，Fox，R.M.&Baucom，K.D.Chemoselective amide ligations bydecarboxylative condensations of N-alkylhydroxylamines and α-ketoacids.Angew.Chemie-Int.Ed.45，1248-1252(2006).

3.Premdjee，B.，Andersen,A.S.，Larance,M.，Conde-Frieboes，K.W.&Payne，R.J.Chemical Synthesis of Phosphorylated l nsulin-like Growth Factor BindingProtein 2.J.Am.Chem.Soc.143，5336-5342(2021).

4.Agouridas,V.et al.Native Chemical Ligation and Extended Methods：Mechanisms，Catalysis，Scope，and Limitations.Chem.Rev.119，(2019).

5.Conibear，A.C.，Watson，E.E.，Payne，R.J.&Becker，C.F.W.Native chemicalligation in protein synthesis and semi-synthesis.Chem.Soc.Rev.47，9046-9068(2018).

6.Bondalapati，S.，Jbara，M.&Brik，A.Expanding the chemical toolbox forthe synthesis of large and uniquely modified proteins.Nat.Chem.8，407-418(2016).

7.Bertolini，M.et al.Interactions between nascent proteins translatedby adjacent ribosomes drive homomer assembly.Science(80-.)，371，57-64(2021).

8.Shiber，A.et al.Cotranslational assembly of protein complexes ineukaryotes revealed by ribosome profiling.Nature 561，268-272(2018).

9.Meyer，N.&Penn，L.Z.Reflecting on 25 years with MYC.Nat.Rev.Cancer 8，976-990(2008).

10.Blackwell，T.，Kretzner，L.，Eisenman，R.，Weintraub，H.&Blackwood，E.Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein.Science(80-.)，250，1149-1151(2006).

11.Blackwood，E.M.&Eisenman，R.N.Max：A Helix-Loop-Helix Zipper ProteinThat Complex with Myc.Science(80-.).251，1211-1217(1991).

12.Ferré-D’Amaré，A.R.，Prendergast，G.C.，Ziff，E.B.&Burley，S.K.Recognition by Max of its cognate DNA through a dimeric b/HLH/Zdomain.Nature 363，38-45(1993).

13.Chen，H，Liu，H.&Qing，G.Targeting oncogenic Myc as a stFategy forcancer treatment.Signal Transduct.Target，Ther.3，1-7(2018).

14.Kalkat，M.et al.MYC deregulation in primary human cancers.Genes(Basel).8，2-30(2017).

15.Rahl，P.B.et al.Transcriptional Amplification in Tumor Cells withElevated c-Myc.(2012).doi：10.1016/j.call.2012.08.026

16.Lee，T.I.&Young，R.A.Transcriptional regulation and itsmisregulation in disease.Cell 152，1237-1251(2013).

17.Fletcher，S.&Prochownik，E.V.Small-molecule inhibitors of the Myc oncoprotein.Biochim.Biophys.Acta-Gene Regul.Mech.1849，525-543(2015).

18.Boike，L.et al.Discovery of a Functional Covalent Ligand Targetingan Intrinsically Disordered Cysteine within MYC.Cell Chem，Biol.1-10(2020).doi：10.1016/j.chembiol.2020.09.001

19.Han，H.et al.Small-Molecule MYC lnhibitors Suppress Tumor Growthand Enhance Immunotherapy.Cancer Cell 36，483-497.e15(2019).

20.Koehler，A.N.A complex task？Direct modulation of transcriptionfactors with small molecules.Curr.Opin.Chem.Biol.14，331-340(2010).

21.Ulasov，A.V.，Rosenkranz，A.A.&Sobolev，A.S.Transcription factors：Timeto delivar.J.Control.Release 269，24-35(2018).

22.Madden，S.K.，de Araujo，A.D.，Gerhardt，M.，Fairlie，D.P.&Mason，J.M.Taking the Myc out of cancer：toward therapeutic strategies to directlyinhibit c-Myc.Mol.Cancer 20，1-18(2021).

23.Struntz，N.B.et al.Stabilization of the Max Homodimer with a SmallMolecule Attenuates Myc-Driven Transcription.Cell Chem.Biol.26，711-723.e14(2019).

24.Soucek，L.et al.Design and properties of a Myc derivative thatefficiently homodimerizes.Oncogene 17，2463-2472(1998).

25.Massó-Vallés，D.&Soucek，L.Blocking Myc to Treat Cancer：Reflectingon Two Decades of Omomyc.Cells 9，883(2020).

26.Beaulieu，M.E.et al.lntrinsic cell-penetrating activity propelsomomyc from proof of concept to viable anti-myc therapy.Sci.Transl.Med.11，1-14(2019).

27.Demma，M.J.et al.Omomyc Reveals New Mechanisms To lnhibit the MYCOncogene.Mol.Cell.Biol.39，1-27(2019).

28.Lobba，M.J.et al.Site-Specific Bioconjugation through Enzyme-Catalyzed Tyrosine-Cysteine Bond Formation.ACS Cent.Sci.(2020).doi：10.1021/acscentsci.Oc00940

29.Dhanjee，H.H.et al.Protein-Protein Cross-Coupling via Palladium-Protein Oxidative Addition Complexes from CysteineResidues.J.Am.Chem.Soc.142，9124-9129(2020).

30.Kumar，K.S.A.，Spasser，L.，Erlich，L.A.，Bavikar，S.N.&Brik，A.Totalchemical synthesis of di-ubiquitin chains.Angew.Chemie-Int.Ed.49，9126-9131(2010).

31.Chatterjee，C.，McGinty，R.K.，Pellois，J.-P.&Muir，T.W.Auxiliary-Mediated Site-Specific Peptide Ubiquitylation.Angew.Chemie 119，2872-2876(2007).

32.Ajish Kumar，K.S.，Haj-Yahya，M.，Olschewski，D.，Lashuel，H.A.&Brik，A.Highly efficiant and chemoselective peptide ubiquitylation.Angew.Chemie-Int.Ed.48，8090-8094(2009).

33.Fottnar，M.et al.Site-specific ubiquitylation and SUMOylation usinggenetic-code expansion and sortase.Nat.Chem.Biol.15，276-284(2019).

34.Sui，X.et al.Development and application of ubiquitin-basedchemical probes.Chem.Sci.11，12633-12646(2020).

35.Geurink，P.P.，EI Oualid，F.，Jonker，A.，Hameed，D.S.&Ovaa，H.A GeneralChemical Ligation Approach Towards lsopeptide-Linked Ubiquitin and Ubiquitin-Like Assay Reagents.ChemBioChem 13，293-297(2012).

36.Kulkarni，S.S.，Sayers，J.，Premdjaa，B.&Payne，R.J.Rapid and efficientprotein synthesis through expansion of the native chemical ligationconcept.Nat.Rev.Chem.2，1-17(2020).

37.Pan，M.et al.Quasi-Racemic X-ray Structures of K27-Linked UbiquitinChains Prepared by Total Chemical Synthesis.J.Am.Chem.Soc.138，7429-7435(2016).

38.Torbeev，V.Y.et al.Protein conformationel dynamics in the machanismof HIV-1 protease catalysis.Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.108，20982-20987(2011).

39.Nair，S.K.&Burley，S.K.X-ray structures of Myc-Max and Mad-Maxrecognizing DNA：Molecular bases of regulation by proto-oncogenictranscription factors.Cell 112，193-205(2003).

40.Canne，L.E.，Ferré-D’Amaré，A.R.，Burley，S.K.&Kent，S.B.H.TotalChemical Synthesis of a Unique Transcription Factor-Related Protein：cMyc-Max.J.Am.Chem.Soc.117，2998-3007(1995).

41.Mijalis，A.J.et al.A fully automated fIow-basad approach foraccelerated peptide synthesis.Nat.Chem.Biol.13，464-466(2017).

42.Hartrampf，N.et al.Synthesis of proteins by automated flowchemistry.Science 368，980-987(2020).

43.Palmacci，E.R.，Plante，O.J.，Hewitt，M.C.&Seeberger，P.H.AutomatedSynthesis of Oligosaccharides.Science(80-.).291，1523(2001).

44.Schissel，C.et al.Intarpretable Deep Learning for De Novo Design ofCell-Panatrating Abiotic Polymers.(2020).doi：10.1101/2020.04.10.036566

45.Fadzen，C.M.et al.Chimeres of Cell-Penetrating Peptides DemonstrateSynergistic Improvamant in Antisense Efficacy.Biochemistry 58，3980-3989(2019).

46.Wang，E.et al.Tumor panetrating peptides inhibiting MYC as a potenttargeted therapeutic strategy for triple-negativa breast cancers.Oncogene 38，140-150(2019).47.Fukazawa，T.et al.1nhibition of myc effactively targets KRASmutation-positive lung cancer axpressing high lavels of Myc.AnticancerRes.30，4193-4200(2010).

48.Spiagel，J.，Cromm，P.M.，Zimmermann，G.，Grossmann，T.N.&Waldmann，H.Small-molecule modulation of Ras signaling.Nat.Chem.Biol.10，613-622(2014).

49.Johnson，C.D.et al.The let-7 microRNA represses cell proliferationpathways in human cells.Cancer Res.67，7713-7722(2007).

50.Blackwood，E.M&Eisenman，R.N.Max：A helix-loop-helix zipper proteinthat forms a sequance-specific DNA-binding complex with Myc.Science(80-.).251，1211-1217(1991).

51.Amati，B.et al.Transcriptional activation by the human c-Myconcoprotein in yaast requires interaction with Max.Nature 359，423-426(1992).

52.Hu，J.，Banerjee，A.&Goss，D.J.Assembly of b/HLH/z protains c-Myc，Max，and Mad1 with cognate DNA：Importance of protein-protein and protain-DNAinteractions.Biochemistry 44，11855-11863(2005).

53.Montagne，M.et al.The max b-HLH-LZ can transduce into cells andinhibit c-Myc transcriptional activities.PLoS One 7，2-10(2012).

54.Demma，M.J.et al.Inhibition of Myc transcriptional activity by amini-protein based upon Mxd1.FEBS Lett.594，1467-1476(2020).

Claims

1.共价蛋白质二聚体或其可药用盐，其包含：

2.权利要求1所述的共价蛋白质二聚体，其中：

所述第一多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且所述第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；

所述第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且所述第二多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性；

所述第一多肽与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且所述第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；或者

所述第一多肽与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且所述第二多肽与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。

3.具有根据式(I)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹是-O-、-NH-或-S-；

Z²是-O-、-NH-或-S-；

R¹是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

R²是不存在的、是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

W是C_1-10烷基、C_1-10杂烷基、C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L是不存在的或是接头；

n是0或1。

4.权利要求3所述的共价蛋白质二聚体，其具有根据式(Ib)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L是不存在的或是接头；

n是0或1。

5.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中如果Y¹或Y²中的一者与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，则另一者与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。

6.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中：

Y¹与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性；

Y¹与SEQ ID NO：3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO：3具有至少85％同一性；

Y¹与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性；或者

Y¹与SEQ ID NO：3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性。

7.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中L是包含一至五十个氨基酸的接头。

8.权利要求7所述的共价蛋白质二聚体，其中L是β-丙氨酸。

9.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中R是非Fmoc的氮保护基。

10.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中R是包含Alloc或Boc的氮保护基。

11.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中R是包含5-TAMRA的荧光染料。

12.权利要求4所述的共价蛋白质二聚体，其中R是包含Mach3的核靶向部分，所述Mach3包含SEQ ID NO：QKKRKSKANKKNWPKGKLSIHAKDYKQGPKAKX_aaRKQRX_aaRG(SEQ ID NO：4)，其中X_aa是6-氨基己酸。

13.药物组合物，其包含权利要求4所述的共价蛋白质二聚体和可药用载体。

14.在有此需要的对象中治疗特征在于MYC失调的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求4所述的共价蛋白质二聚体。

15.权利要求14所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

16.制备具有根据式(Ib)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L是不存在的或是接头；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(IIIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于Y²所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(IVb)的结构的与树脂结合的侧链经保护的第二肽：

(b)从所述树脂结合的侧链经保护的第二肽中去除PG²，以提供具有根据式(Vb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第三肽：

(c)使所述树脂结合的侧链经保护的第三肽与对应于Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第四肽：

以及

(d)从树脂上切割所述树脂结合的侧链经保护的第四肽，以提供所述共价蛋白质二聚体。

17.权利要求16所述的方法，其中在步骤(d)之前，所述方法包括去除PG¹以在其中提供去保护的氮原子，以及使生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分与所述去保护的氮原子共价连接。

18.权利要求16所述的方法，其中步骤(a)和(c)中的所述一个或更多个氨基酸中的每一个均包含Fmoc保护的主链氨基，并且其中在每一个氨基酸与树脂结合的侧链经保护的肽连接之后，将相应的Fmoc基团去保护。

19.权利要求16所述的方法，其中步骤(a)和(c)中的每一者均在偶联剂的存在下进行。

20.权利要求19所述的方法，其中所述偶联剂选自(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、六氟磷酸盐氮杂苯并三唑四甲基脲(HATU)、六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲(HBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)和羟基苯并三唑(HOBt)。

21.权利要求16所述的方法，其中步骤(a)和(c)中的每一者均包括添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

22.权利要求16所述的方法，其中PG¹是Boc并且PG²是Alloc。

23.制备具有根据式(Ib)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

L是不存在的或是接头；

n是0或1；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第一肽与对应于Y¹所示多肽中氨基酸的一种或更多种氨基酸反应，以提供具有根据式(VIb)的结构的树脂结合的侧链经保护的第二肽：

其中PG¹是非Fmoc的氮保护基；以及

(b)从树脂上切割所述树脂结合的侧链经保护的第二肽，以提供所述共价蛋白质二聚体。

24.权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)之前，所述方法包括去除PG¹以在其中提供去保护的氮原子，以及使生物素、荧光染料、核靶向部分或细胞穿透部分与所述去保护的氮原子共价连接。

25.权利要求23所述的方法，其中步骤(a)中的所述一个或更多个氨基酸中的每一个均包含Fmoc保护的主链氨基，并且其中在每一个氨基酸与树脂结合的侧链经保护的肽连接之后，将相应的Fmoc基团去保护。

26.权利要求23所述的方法，其中步骤(a)在偶联剂的存在下进行。

27.权利要求26所述的方法，其中所述偶联剂选自(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、六氟磷酸盐氮杂苯并三唑四甲基脲(HATU)、六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲(HBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)和羟基苯并三唑(HOBt)。

28.权利要求23所述的方法，其中步骤(a)包括添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

29.权利要求23所述的方法，其中PG¹是Alloc。

30.具有根据式(II)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Z¹独立地是-O-、-NH-或-S-；

Z²独立地是-O-、-NH-或-S-；

R¹独立地是C_1-10烷基或C_1-10杂烷基；

A是C_6-10芳基或5元至10元杂芳基；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1。

31.权利要求30所述的共价蛋白质二聚体，其具有根据式(IIa)的结构：

其中：

Y¹是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

L独立地是不存在的或是接头；

n独立地是0或1。

32.权利要求31所述的共价蛋白质二聚体，其具有根据式(IIb)的结构：

其中：

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽。

33.权利要求32所述的共价蛋白质二聚体，其中：

Y¹与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；

Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性；

Y¹与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性；或者

Y¹与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性，并且Y²与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性。

34.药物组合物，其包含权利要求32所述的共价蛋白质二聚体和可药用载体。

35.在有此需要的对象中治疗特征在于MYC失调的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求32所述的共价蛋白质二聚体。

36.权利要求35所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

37.制备具有根据式(VIIb)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

Y²是相对于SEQ ID NO:1、2或3具有至少85％同一性程度的多肽；

所述方法包括：

(a)使具有根据式(VIIIb)的结构的多肽与式(IX)化合物反应以提供具有根据式(Xb)的结构的多肽：

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体；以及

(b)使式(X)的多肽与具有根据式(XI)的结构的多肽反应以提供所述共价蛋白质二聚体：

38.权利要求37所述的方法，其中相对于式(VIII)的多肽，所述式(IX)化合物以摩尔过量提供。

39.权利要求37所述的方法，其中X和X’是I。

40.权利要求37所述的方法，其中Lig具有根据式(XII)的结构：

其中：

B和C各自独立地是C_6-10芳基或6元至10元杂芳基；

R^c独立地是C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或N(C_1-4烷基)₂

M是Li、Na或K；

m是0、1、2、3或4；并且

p是1、2、3或4。

41.权利要求40所述的方法，其中Lig是：

42.制备具有根据式(IIb)的结构的共价蛋白质二聚体或其可药用盐的方法：

其中：

所述方法包括使具有根据式(VIII)的结构的多肽与式(IX)化合物反应，以提供所述共价蛋白质二聚体；

其中：

X和X’各自独立地是F、Cl、Br、I或OTf；并且

Lig是膦配体。

43.权利要求42所述的方法，其中X和X’是I。

44.权利要求42所述的方法，其中Lig具有根据式(XII)的结构：

其中：

B和C各自独立地是C_6-10芳基或6元至10元杂芳基；

R^c独立地是C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或N(C_1-4烷基)₂

M是Li、Na或K；

m是0、1、2、3或4；并且

p是1、2、3或4。

45.权利要求44所述的方法，其中Lig是：

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