DE69630708T2

DE69630708T2 - An den erythropoietin-rezeptor bindende zusammensetzungen und peptide

Info

Publication number: DE69630708T2
Application number: DE69630708T
Authority: DE
Inventors: C. Nicholas WRIGHTON; J. William DOWER; S. Ray CHANG; K. Arun KASHYAP; K. Linda JOLLIFFE; Dana Johnson; Linda Mulcahy
Original assignee: Affymax Inc; Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Affymax Inc; Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: EP0886648A4; EP1510524A3; NZ310804A; ES2210374T3; HUP9901069A2; CA2223833A1; NO318783B1; DE69630708D1; EP1510524A2; CN1192748A; JP2009280616A; JP2007277264A; JP4050314B2; BR9609006A; EP0886648B1; NO975729D0; TR199701557T2; KR100459984B1; WO1996040749A1; JPH11507367A

Description

Diese Anmeldung ist eine Teil-Fortführung von 08/484 635 und 08/484 631, eingereicht am 7. Juni 1995, welche Teil-Fortführungen der Serien-Nr. 08/155 940 sind, eingereicht am 19. November 1993, welche alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht unter anderem Peptide und Verbindungen vor, welche an den Erythropoietin-Rezeptor (EPO-R) binden und selbigen aktivieren oder anderweitig als ein EPO-Agonist wirken. Die Erfindung findet Anwendung auf den Gebieten der Biochemie und medizinischen Chemie und stellt insbesondere EPO-Agonisten zur Verwendung in der Behandlung von Krankheiten beim Menschen bereit.
Hintergrund der Erfindung
Erythropoietin (EPO) ist ein Glycoprotein-Hormon mit 165 Aminosäuren, 4 Glycosylierungsstellen an den Aminosäurepositionen 24, 38, 83 und 126 und einem Molekulargewicht von etwa 34000. Es wird anfänglich als ein Vorläuferprotein mit einem Signalpeptid von 23 Aminosäuren hergestellt. EPO kann in drei Formen vorkommen: α, β und Asialo. Die α- und β-Formen unterscheiden sich geringfügig hinsichtlich der Kohlehydrat-Komponenten, besitzen aber die (das) gleiche Wirksamkeit, biologische Aktivität und Molekulargewicht. Die Asialo-Form ist eine α- oder β-Form, bei der das endständige Kohlehydrat (Sialinsäure) entfernt ist. Die DNA-Sequenzen, welche für EPO codieren, sind berichtet worden; siehe Lin (1987), U.S.-Patent Nr. 4 703 008, welches hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
EPO stimuliert die mitotische Teilung und die Differenzierung von Erythrocyten-Vorläuferzellen und stellt somit die Produktion von Erythrocyten sicher. Es wird in der Niere hergestellt, wenn hypoxische Bedingungen vorherrschen. Während der EPO-induzierten Differenzierung von Erythrocyten-Vorläuferzellen kommt es zu einer Induktion der Globin-Synthese und Erhöhungen der Synthese des Häm-Komplexes und der Anzahl von Ferritin-Rezeptoren. Dies macht es für die Zelle möglich, mehr Eisen aufzunehmen und funktionelles Hämoglobin zu synthetisieren.
Hämoglobin in reifen Erythrozyten bindet Sauerstoff. Somit spielen die Erythrozyten und das in ihnen enthaltene Hämoglobin einen Schlüsselrolle bei der Versorgung des Körpers mit Sauerstoff. Die komplexen Verfahren, welche beschrieben worden sind, werden durch die Wechselwirkung von EPO mit einem passenden Rezeptor auf der Zelloberfläche der Erythrozyten-Vorläuferzellen initiiert; siehe z. B. Graber und Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29: 51–66.
EPO ist in sehr niedrigen Konzentrationen im Plasma vorhanden, wenn sich der Körper in einem gesunden Zustand befindet, worin die Gewebe eine ausreichende Oxygenierung aus der existierenden Zahl an Erythrozyten erhalten. Diese normale niedrige Konzentration ist ausreichend, um den Austausch von roten Blutkörperchen, welche normalerweise durch Alterung verlorengehen, zu stimulieren.
Die Menge an EPO im Kreislauf wird unter Bedingungen einer Hypoxie erhöht, wenn der Sauerstofftransport durch Blutzellen im Kreislauf verringert ist. Hypoxie kann durch Verlust von großen Mengen an Blut durch Blutung, Zerstörung von roten Blutkörperchen durch übermäßige Aussetzung an Strahlung, Verringerung der Sauerstoffaufnahme aufgrund großer Höhen oder längerer Bewußtlosigkeit oder verschiedene Formen von Anämie verursacht werden. In Antwort auf Gewebe, welche einem hypoxischen Streß unterliegen, wird EPO die Herstellung roter Blutkörperchen durch Stimulation der Proliferation von erythroiden Vorläuferzellen erhöhen. Wenn die Anzahl von roten Blutkörperchen im Kreislauf größer ist als für normale Gewebe-Sauerstoffanforderungen benötigt, wird EPO im Kreislauf gesenkt.
Weil EPO in dem Vorgang der Bildung roter Blutkörperchen essentiell ist, besitzt das Hormon potentiell nützliche Anwendungen sowohl in der Diagnose als auch der Behandlung von Blutkrankheiten, welche durch eine geringe oder mangelhafte Herstellung von roten Blutkörperchen gekennzeichnet sind. Kürzliche Untersuchungen haben eine Grundlage für die Projektion bzw. Vorhersage der Wirksamkeit einer EPO-Therapie in einer Vielzahl von Krankheitszuständen, Störungen und Zuständen einer hämatologischen Unregelmäßigkeit bereitgestellt, einschließlich:
beta-Thalassämie (siehe Vedovato et al. (1984) Acta. Haematol. 71: 211–213); cystische Fibrose (siehe Vichinsky et al. (1984) J. Pediatric 105: 15–21); Schwangerschaft und Menstruationsstörungen (siehe Cotes et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90: 304–311); frühe Schwangerschaftsanämie (siehe Haga et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72; 827–831); Rückenmarksverletzung (siehe Claus-Walker et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65: 370–374); Weltraumflug (sehe Dunn et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52: 178–182); akuter Blutverlust (siehe Miller et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52: 545–590); Altern (siehe Udupa et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103: 574–580 und 581–588, und Lipschitz et al. (1983) Blood 63: 502–509); verschiedene neoplastische Krankheitszustände, die mit abnormaler Erythropoiese einhergehen (siehe Dainiak et al. (1983) Cancer 5: 1101–1106, und Schwartz et al. (1983) Otolaryngol. 109: 269–272); und Nierenversagen (siehe Eschbach et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316: 73– 78).
Gereinigtes homogenes EPO ist charakterisiert worden; siehe Hewick, U.S.-Patent Nr. 4 677 195. Eine EPO-codierende DNA-Sequenz wurde gereinigt, kloniert und exprimiert, um synthetische Polypeptide mit den gleichen biochemischen und immunologischen Eigenschaften herzustellen. Ein rekombinantes EPO-Molekül mit identischen Oligosacchariden zu denjenigen auf dem natürlichen Material ist ebenfalls hergestellt worden; siehe Sasaki et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059–12076.
Trotz der Verfügbarkeit von gereinigtem rekombinanten EPO ist wenig in Hinsicht auf den Mechanismus der EPO-induzierten Erythroblasten-Proliferation und -Differenzierung bekannt. Diese spezifische Wechselwirkung von EPO mit Vorläufern von unreifen roten Blutkörperchen, Plättchen und Megakaryocyten bleibt zu charakterisieren. Dies beruht zumindestens teilweise auf der kleinen Anzahl von Oberflächen-EPO-Rezeptormolekülen auf normalen Erythroblasten und auf der Erythroleukämie-Zellinie; siehe Krantz und Goldwasser (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 841: 7574–7578; Branch et al. (1987) Blood 69: 1782–1785; Mayeux et al. (1987) FEBS Letters 211: 229–233; Mufson und Gesner (1987) Blood 69: 1485– 1490; Sakaguchi et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 7–12; Sawyer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3690–3694; Sawyer et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 5554–5562; und Todokoro et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4126–4130.
Vernetze Komplexe zwischen radioaktiv iodiertem EPO und Zelloberflächenproteinen legen nahe, daß die Zelloberflächen-Proteine zwei Polypeptide mit ungefähren Molekulargewichten von 85 000 Dalton bzw. 100 000 Dalton umfassen. Noch kürzlicher sind die zwei vernetzten Komplexe einem V8-Proteaseverdau unterzogen worden, und von ihnen wurde festgestellt, identische Peptidfragmente aufzuweisen, was nahelegt, daß die zwei EPO-bindenden Polypeptide Produkte der gleichen oder sehr ähnlicher Gene sein können; siehe Sawyer et al. (1988) siehe oben. Die meisten Zelloberflächen-Bindungsuntersuchungen haben jedoch eine einzelne Klasse von Bindestellen, durchschnittlich 300 bis 600 pro Zelloberfläche, mit einem Kd von ungefähr 800 pM (Picomolar) enthüllt; siehe Sawyer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3690–3694. Allerdings zeigen EPO-responsive Milz-Erythroblasten, hergestellt aus Mäusen, welche eine Injektion mit dem anämischen Stamm (FVA) des Friend-Leukämie-Virus erhielten, eine Hoch- und eine Niedrig-Affinitätsbindungsstelle mit Dissoziati onskonstanten von 100 pM bzw. 800 pM; siehe Sawyer et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 5554– 5562 und Landschulz (1989) Blood 73: 1476–1478. Die DNA-Sequenzen und codierten Peptidsequenzen für Maus- und Mensch-EPO-Rezeptorproteine sind beschrieben worden, siehe D'Andrea et al., PCT Patentveröffentlichung Nr. WO 90/08822 (veröffentlicht 1990).
Die Verfügbarkeit von klonierten Genen für den EPO-R erleichtert die Suche nach Agonisten und Antagonisten dieses wichtigen Rezeptors. Die Verfügbarkeit des rekombinanten Rezeptorproteins ermöglicht die Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung in einer Vielzahl von statistischen und halb-statistischen Peptiddiversitäts-Erzeugungssystemen. Diese Systeme schließen das "Peptide-auf-Plasmiden"-System, beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung Serien Nr. 778 233, eingereicht am 16. Oktober 1991, das "Peptide-auf-Phage"-System, beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 718 577, eingereicht am 20. Juni 1991, und in Cwirla et al., August 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378–6382, das "codierte synthetische Bibliothek" (ESL, encoded synthetic library)-System, beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 946 239, eingereicht am 16. September 1992, welche eine Teilfortführungsanmeldung von Serien Nr. 762 522, eingereicht am 18. September 1991, ist, und das "in sehr großem Maßstab erfolgende immobilisierte Polymer-Synthese"-System, beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung Serien Nr. 492 462, eingereicht am 7. März 1990; PCT-Patentveröffentlichung Nr. 90/15070, veröffentlicht am 13. Dezember 1990; U.S.-Patentanmeldung, Serien-Nr. 624 120, eingereicht am 6. Dezember 1990; Fodor et al, 15. Februar 1991, Science 251: 767–773; Dower und Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271– 180; und U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 805 727, eingereicht am 6. Dezember 1991; ein, wobei jede der vorstehenden Patentanmeldungen und Veröffentlichungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Es bleibt jedoch eine Notwendigkeit für Verbindungen bestehen, welche an/mit dem EPO-R binden oder anderweitig wechselwirken, sowohl für Untersuchungen der durch diesen Rezeptoren vermittelten, wichtigen biologischen Aktivitäten als auch für die Behandlung von Krankheiten. Die vorliegende Erfindung sieht derartige Verbindungen vor.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführungsform sieht die Erfindung Peptide vor, welche an den EPO-R binden und selbigen aktivieren oder sich anderweitig als EPO-Agonisten verhalten. Diese Peptide sind 10 bis 40 oder mehr Aminosäurerest lang, vorzugsweise 14 bis 20 Aminosäurerest lang, und umfassen eine Kernsequenz von Aminosäuren X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈ (SEQ ID NO:), wobei jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist; X₃ kann C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein; X₄ kann R, H, L oder W sein; X₅ kann M, F oder I sein; X6 wird unabhängig gewählt aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren oder der stereoisomeren D-Aminosäuren; X₇ kann D, E, I, L oder V sein; und X₈ kann C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, wobei Hoc Homocystein ist, sein, vorausgesetzt, daß entweder X₃ oder X₈ gleich C oder Hoc ist. Vorzugsweise wird das Peptid eine Kernsequenz von Aminosäuren YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈ (SEQ ID NO:) umfassen, wobei jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist; jedes X₂ und X₆ wird unabhängig gewählt aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren; X₃ gleich C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann; X₄ kann R, H, L oder W sein; X₅ kann M, F oder I sein; X₇ kann D, E, I, L oder V sein; und X₈ kann C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, wobei Hoc Homocystein ist, sein, vorausgesetzt, daß entweder X₃ oder X₈ gleich C oder Hoc ist Weiter bevorzugt wird das Peptid eine Kernsequenz von Aminosäureen X₁YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈X₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO:) umfassen, wobei jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist; jedes X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀ und X₁₁ unabhängig gewählt wird aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren; X₃ gleich C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann; X₄ gleich R, H, L oder W sein kann; X₅ gleich M, F oder I sein kann; X₇ gleich D, E, I, L oder V sein kann; und X₈ gleich C, A, α-Amino-γ-bromtuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann, vorausgesetzt, daß entweder X₃ oder X₈ gleich C oder Hoc ist.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden sowohl X₃ als auch X₈ gleich C sein und das Peptid wird somit eine Kernsequenz von Aminosäuren X₁YX₂CX₄XSGPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO:) umfassen. Weiter bevorzugt wird das Peptid eine Kernsequenz von Aminosäuren X₁YX₂CX₄XSGPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO:) umfassen, worin X₄ gleich R oder H sein kann; X₅ F oder M sein kann; X₆ gleich I, L, T, M oder V sein kann; X₇ gleich D oder V ist; X₈ gleich G, K, L, Q, R, S oder T sein kann, und X₁₀ gleich A, G, P R oder Y sein kann. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid eine Kernsequenz von Aminosäuren X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO:) umfassen, worin X₁ gleich D, E, L, N, S, T oder V sein kann; X₂ gleich A, H, K, L, M, S oder T sein kann; X₄ gleich R oder H ist; X₉ gleich K, R, S oder T sein kann; und X₁₀ gleich P ist. Besonders bevorzugte Peptide schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein:
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Peptide der vorliegenden Erfindung cyclisiert oder dimerisiert. Beispiele von Peptiden, welche als C-terminale Amide cyclisiert sein können, schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein:
Ein Beispiel eines Dimers gemäß der vorliegenden Erfindung folgt:
Gemäß einigen Ausführungsformen dieser Erfindung werden zwei oder mehr, und vorzugsweise zwischen zwei und sechs Aminosäurereste, unabhängig gewählt aus einer der 20 genetisch codieren L-Aminosäuren oder den stereoisomeren D-Aminosäuren, an eines oder beide Enden der obenstehend beschriebenen Kernsequenzen gekoppelt. Beispielsweise wird die Sequenz GG häufig an ein oder beide Enden der Kernsequenzen zur Leichtigkeit bei der Synthese der Peptide angehängt werden. Die vorliegende Erfindung sieht auch Konjugate dieser Peptide und Derivate und Peptidomimetika der Peptide vor, welche die Eigenschaft der EPO-R-Bindung beibehalten.
Die vorliegende Erfindung sieht auch Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, beinhaltend einen Mangel an EPO, unter Verwendung der neuen Verbindungen der Erfindung vor. Die vorliegende Erfindung sieht ferner pharmazeutische Zusammensetzungen vor, umfassend ein oder mehrere Verbindungen der Erfindung und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 stellt die Sequenzen der Mutagenese-Oligomere bereit, welche in den hierin beschriebenen Vorgehensweisen verwendet wurden.
Die 2 gibt die Sequenzen von repräsentativen Peptiden dieser Erfindung an.
Die 3 veranschaulicht eine neue Phagmid-Mutagenese-Bibliothek, welche unter Verwendung des pVIII-Display-Systems konstruiert wurde. In dieser Bibliothek wurden die Tyrosin-, Glycin-Prolin- und Threonin-Tryptophan-Reste (unterstrichen) fixiert, ebenso wie die zwei Cysteine. Andere Positionen zwischen den Cysteinresten (gezeigt in Umriß-Kursiv-Schriftschnitt, vorhanden in dem ursprünglichen AF11154-Treffer-Peptid) wurden durch Oligo-Konstruktion so mutiert, daß jeder Aminosäurerest bei einer Häufigkeit von 50% zu jedwedem anderen wechseln konnte. "X" steht für eine zufällige Aminosäure-Position.
Die 4A–C veranschaulichen pIII- und pVIII-Phamid-Mutagenese-Bibliotheken, welche derzeit unter Konstruktion und Screening stehen. Aminosäurereste in Fettdruck sind festgelegt, der Rest (angegeben durch NNK) ist zufällig. 4A (ON3007) und 4C (ON3017) sind entworfen, um den Beitrag von zusätzlichen flankierenden Regionen N-terminal bzw. C-terminal zu der Kernsequenz (Tyrosin bis zum zweiten Cystein) zu untersuchen. 4B (ON3016) basiert auf dem Peptid Y-CHFGPLTWVC, worin der Tyrosinrest direkt neben dem ersten Cystein plaziert ist. Diese Bibliothek fügt zusätzliche statistische Reste auf beiden Seiten der Kernsequenz hinzu.
Die 5 veranschaulicht eine Mutagenese-Bibliothek, basierend auf GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, konstruiert und gescreent unter Verwendung eines neuen Lac-I-Display-Vektors ("Headpiece Dimer"). Mit X angegebene Aminosäurereste sind statistisch (NNK), die unterstrichenen sind geringfügig mutiert (91 : 3 : 3 : 3/91 : 3 : 3 : 3/K), wohingegen diejenigen in Umrißdruck stärker mutiert sind (70 : 10 : 10/70 : 10 : 10/K).
Die 6 veranschaulicht eine Mutagenese-Bibliothek, basierend auf TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, konstruiert und gescreent unter Verwendung eines neuen Lac-I-Display-Vektors ("Headpiece Dimer"). Mit X angegebene Aminosäurereste sind statistisch (NNK), die in Umrißdruck waren festgelegt, und die zwei Glutaminsäurereste waren geringfügig mutiert (91 : 3 : 3 : 3/91 : 3 : 3 : 3/K).
Die 7 ist eine graphische Abbildung der Ergebnisse des FDCP-1/hEPO-R-Bioassays für ausgewählte Peptide der Erfindung, wobei:

• die Ergebnisse anzeigt für GGCRIGPITWVCGG;
O die Ergebnisse anzeigt für GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG;
∎ die Ergebnisse anzeigt für GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;
die Ergebnisse anzeigt für GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG;
die Ergebnisse anzeigt für VGNYMCHFGPITWVCRPGGG;
| die Ergebnisse anzeigt für GGVYACRMGPITWVCSPLGG;
+ die Ergebnisse anzeigt für VGNYMAHMGPITWVCRPGG; und
* die Ergebnisse anzeigt für EPO.

Die 8 ist eine graphische Abbildung der Ergebnisse des TF-1-Bioassays für EPO (
und ♦ geben die Ergebnisse für den Assay unter Verwendung von EPO und 10 000 bzw. 20 000 Zellen pro Vertiefung wieder); und für das Peptid VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:) (∎ und • geben die Ergebnisse für den Assay unter Verwendung des Peptides und 10 000 bzw. 20 000 Zellen pro Vertiefung wieder.)
Die 9A (Kontrolle), 9B (behandelt mit 500 pM EPO) und 9C (behandelt mit 25 mm GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG) sind Photographien, welche die Ergebnisse eines MTT-Proliferations-Assays auf repräsentative Populationen von Milzzellen von mit Phenylhydrazin behandelten Mäusen bei 200-facher Vergrößerung darstellen.
Die 10 ist eine graphische Abbildung der Ergebnisse des FDCP-1/hEPOR-Bioassays, welche die erhöhte Wirksamkeit des biotinylierten Peptids (d. h. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin)) durch Oligomerisierung mit Streptavidin zeigt. Die Peptide GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG und GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin) zeigen ungefähr die gleiche Aktivität, aber wenn das Letztere mit Streptavidin vorkomplexiert wird (d. h. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin)-Streptavidin-Komplex), ist es bei weitem wirksamer. In diesem Assay wird eine geringe Reduktion der Aktivität bei der niedrigsten Konzentration beobachtet (5 nM bezüglich des Peptids in dem Komplex). Streptavidin allein besitzt marginale Aktivität bei hohen Konzentrationen.
Die 11 ist eine graphische Abbildung der Ergebnisse des FDCP-1/hEPOR-Bioassays, welche die von polyklonalem Ziege-Anti-Biotin vermittelte Erhöhung der Wirksamkeit des Peptides AF11505 zeigt. Die Vor-Komplexierung von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-Biotin) mit Ziege-Anti-Biotin-Antikörpern (GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK + G anti-B) erhöht die Wirksamkeit des Peptides um eine logarithmische Einheit gegenüber dem freien Peptid. Die gereinigten Antikörper (G anti-B) besitzen allein keinen stimulatorischen Effekt.
Die 12 veranschaulicht das Syntheseschema für die Herstellung des dimeren Peptidanalogs von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
Die 13 veranschaulicht die IC₅₀-Auftragung des dimeren Peptidanalogs von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Die Affinität wurde unter Anwendung eines Radioliganden-Kompetitions-Bindungs-Assays gegen "PIG-tailed" bzw. „mit PIG-Schwanz versehenes" EPOR, welcher auf mAB 179 immobilisiert war, bestimmt.
Die 14 veranschaulicht die biologische Aktivität in vitro des dimeren Peptid-Analogs von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG unter Anwendung des FDCP-1/hEPOR-Zellproliferations-Assays. Das dimere Peptid besitzt einen EC₅₀ von ungefähr 20 nM, eine 20-fache Erhöhung der Wirksamkeit gegenüber dem Eltern-Peptid.
Die 15 veranschaulicht die Zellcyclus-Progression von FDC-P1/ER.
Die 16 veranschaulicht die Gleichgewichts-Bindungsanalyse der spezifischen Assoziation von [¹²⁵I]-EPO mit EBP, immobilisiert auf Agaroseperlen, und zeigt einen Kd von 5 nM ± 2, basierend auf einer linearen Transformation (Scatchard) der Bindungsisothermen.
Die 17A, 17B und 17C veranschaulichen die Ergebnisse des polyzythämischen exhypoxischen Maus-Bioassays unter Verwendung der Peptide GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ bzw. LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD.
Die 18A und 18B veranschaulichen die Ergebnisse des polyzythämischen exhypoxischen Maus-Bioassays unter Verwendung der Peptide TIAQYICYMGPETWECRPSPKA bzw. eines dimeren Peptid-Analogs von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, enthaltend zwei Disulfid-Brückenbindungen (AF 12080).
Die 19A und 19B veranschaulichen die Ergebnisse des Reticulocyten-Assays unter Verwendung von EPO bzw. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Für beide Dosisgruppen, n = 10 Tiere. EPO: 0,4, 4,0, 40,0 Units/Maus, Gesamtdosis Vehikel-Kontrolle; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: 2,0, 20,0, 200,0 μg/Maus, Gesamtdosis Vehikelkontrolle + DMSO (1–2%) 200 μg/Maus = 10 mg/kg. Überlegungsbasis: Daten aus einem in vitro-Proliferationsassay legen nahe: 2 μg von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0,4 Units EPO.
Die 20A und 20B veranschaulichen die Ergebnisse des Reticulocyten-Assays unter Verwendung von EPO bzw. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Für beide Dosisgruppen n = 10 Tiere. EPO: 0,4, 4,0, 40,0 Units/Maus, Gesamtdosis;
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: Erhöhen der Dosis auf 1 mg/Maus, Gesamtdosis = 50 mg/kg, und auf 2 mg/Maus, Gesamtdosis = mg/kg.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungsform
Die folgenden Begriffe besitzen beabsichtigtermaßen die folgenden allgemeinen Bedeutungen: Aminosäure-Reste in Peptiden werden wie folgend abgekürzt: Phenylalanin ist Phe oder F; Leucin ist Leu oder L; Isoleucin ist Ile oder I; Methionin ist Met oder M; Valin ist Val oder V; Serin ist Ser oder S; Prolin ist Pro oder P; Theronin ist Thr oder T; Alanin ist Ala oder A; Tyrosin ist Tyr oder Y; Histidin ist His oder H; Glutamin ist Gln oder Q; Asparagin ist Asn oder N; Lysin ist Lys oder K; Asparaginsäure ist Asp oder D; Glutaminsäure ist Glu oder E; Cystein ist Cys oder C; Tryptophan ist Trp oder W; Arginin ist Arg oder R; und Glycin ist Gly oder G.
Stereoisomere (z. B. D-Aminosäuren) der 20 herkömmlichen Aminosäuren, unnatürliche Aminosäuren, wie α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkylaminosäuren, Milchsäure und andere unkonventionelle Aminosäuren können ebenfalls geeignete Komponenten für Verbindungen der vorliegenden Erfindung sein. Beispiele von nicht-herkömmlichen Aminosäuren schließen ein: 4-Hydroxyprolin, O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin und andere ähnliche Aminosäuren und Iminosäuren (z. B. 4-Hydroxyprolin).
"Agonist" bezieht sich auf einen biologisch aktiven Liganden, welcher an seinen komplementären biologisch aktiven Rezeptor bindet und letzteren aktiviert, entweder um eine biologische Antwort in dem Rezeptor zu verursachen oder um eine vorher existierende biologische Aktivität des Rezeptors zu verstärken.
"Wirtszelle" bezieht sich auf eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle oder Gruppe von Zellen, welche mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert werden kann oder worden ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden prokaryotische Wirtszellen bevorzugt.
"Peptid" oder "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer, in welchem die Monomere alpha-Aminosäuren sind, welche durch Amidbindungen miteinander verbunden sind. Peptide sind zwei oder häufig mehrere Aminosäure-Monomere lang.
"Pharmazeutisch annehmbare Salze" bezieht sich auf die nicht-toxischen Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, welche üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, einschließlich den Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Barium-, Ammonium- und Protamin-Zink-Salzen, welche durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Der Begriff schließt auch nicht-toxische Säureadditionssalze ein, welche im allgemeinen durch Umsetzen der Verbindungen dieser Erfindung mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Salze schließen das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Furmarat, Succinat, Tartrat, Napsylat und dergleichen ein.
"Pharmazeutisch oder therapeutische wirksame Dosis oder Menge" bezieht sich auf einen Dosierungsspiegel, der ausreichend ist, um ein gewünschtes biologisches Ergebnis zu induzieren. Dieses Ergebnis kann die Linderung der Anzeichen, Symptome oder Ursachen einer Krankheit oder jedwede andere gewünschten Veränderung eines biologischen Systems sein. Vorzugsweise wird diese Dosis oder Menge ausreichend sein, um den EPO-R zu stimulieren und somit die Symptome zu lindern, welche mit einem Mangel an EPO oder einer mangelhaften oder geringen roten Blutkörperchen-Population in vivo assoziiert sind.
"Rekombinanter DNA-Klonierungs- oder Expressions-Vektor" bezieht sich auf ein DNA- oder RNA-Molekül, welches eine nützliche Funktion codiert und verwendet werden kann, um eine Wirtszelle zu transformieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung dient ein Klonierungsvektor typischerweise hauptsächlich als eine Zwischenstufe bei der Konstruktion ei nes Expressionsvektors; der letztgenannte Vektor wird verwendet, um eine Wirtszelle so zu transformieren oder zu transfizieren, daß die transformierte Wirtszelle ein Protein oder ein anderes Produkt, welches von dem Vektor codiert wird, erzeugt. Derartige Vektoren sind typischerweise "Plasmide", welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Vektoren sind, welche in einer Wirtszelle extrachromosomal aufrechterhalten werden können, können aber ebenfalls Vektoren sein, welche sich in das Genom einer Wirtszelle integrieren. Der Fachmann kann auf "Klonierungsvektoren", wie hierin definiert, als "Vektoren" und auf "Expressionsvektoren", wie hierin definiert, als "Plasmide" Bezug nehmen.
Die vorliegende Erfindung sieht Verbindungen vor, welche an den EPO-R binden und diesen aktivieren oder sich anderweitig als ein EPO-Agonist verhalten. Diese Verbindungen schließen "Führungs"- bzw. "Anfangs"-Peptid-Verbindungen, ermittelt mit statistischen Peptiddiversität-erzeugenden Systemen, und "Derivat"-Verbindungen ein, welche so konstruiert wurden, daß sie dieselbe oder ähnliche molekulare Struktur oder Gestalt wie die Anfangs-Verbindungen aufweisen, aber welche von den Anfangs-Verbindungen entweder in bezug auf die Anfälligkeit gegen Hydrolyse oder Proteolyse und/oder in Hinsicht auf andere biologische Eigenschaften abweichen, wie einer erhöhten Affinität für den Rezeptor, einer erhöhten in vitro-Aktivität oder in vivo-Aktivität.
Die statistische Peptiddiversität erzeugenden Systeme, welche anfangs verwendet wurden, schlossen die obenstehend erörterten "Peptide-auf-Phagen"-Systeme ein. Die statistischen Peptide wurden entworfen, um 8 Aminosäurereste Länge aufzuweisen, flankiert von Cys-Resten an beiden Enden (daher insgesamte Länge von 10 Aminosäure-Resten). In diesen anfänglichen Systemen wurden die statistischen Peptide als Teil eines Fusionsproteins, umfassend das pVIII-Hüllprotein eines Phage-fd-Derivates, präsentiert (Peptide-auf-Phagen). Die Fusionsproteine, zusammen mit der für die Fusionsproteine codierenden DNA, wurden auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Das "Panning"-Verfahren beinhaltete mehrere Runden der Inkubation der Fusionsproteine mit dem immobilisierten Rezeptor, Absammeln der Fusionsproteine, welche an den Rezeptor gebunden hatten (zusammen mit der begleitenden DNA), und vermehrtes Herstellen der abgesammelten Fusionsproteine.
Typischerweise wurden die Fusionsproteine und begleitende DNA, nach drei Panning-Runden, isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hatte. Dieser Assay wurde auf eine zum Panning ähnliche Weise durchgeführt mit der Ausnahme, daß nach Entfernung von nicht-gebundenen Fusionsproteinen die Vertiefungen mit Kaninchen-Anti-Phage-Antikörper (oder mit Anti-lac-Antikörper für das Peptide-auf-Plasmiden-System) und dann mit alkalische-Phosphatase-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper behandelt wurden, und danach die Menge an alkalischer Phosphatase in jeder Vertiefung durch Standardverfahren bestimmt wurde. Durch Vergleichen von Testvertiefungen mit Kontrollvertiefungen (keine Rezeptor) kann man bestimmen, ob die Fusionsproteine spezifisch an den Rezeptor gebunden hatten.
Der in den Panning- und ELISA-Verfahrensweisen verwendete immobilisierte Rezeptor umfaßte die extrazelluläre Domäne des EPO-Rezeptors und wurde in rekombinanten Wirtszellen hergestellt. Dieses Rezeptormolekül kann in einer Vielzahl von unterschiedlichen Formen und Wirtszellen hergestellt werden. Eine nützliche Form wird mit einem Signalpeptid für die Proteinsekretion und für die Glycophospholipid-Membrananker-Anheftung konstruiert (diese Form von Ankeranheftung wird als "PIG-Tailing" bezeichnet; siehe Caras und Weddell, 3. März 1989, Science 243: 1196–1198, und Lin et al., 10 August 1990, Science 249: 677–679, von denen jedes hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist). Dieses System gestattet die Spaltung des Rezeptors von der Oberfläche der Zellen, welche den Rezeptor exprimieren, und das Absammeln des abgespaltenen Rezeptors in einigermaßen einfacher Weise. Vorzugsweise wird eine Protease-Spaltungsstelle, wie eine Thrombin-Spaltungsstelle, zwischen das HPAP-Epitop des 'PIG-tailed'-Rezeptors und den Rezeptor selbst eingefügt.
Das rekombinante Rezeptorprotein wurde unter Anwendung der folgenden Methodik immobilisiert. Mikrotiterplatten wurden mit einem Anti-Rezeptor-Antikörper beschichtet, und die Vertiefungen, welche den immobilisierten Rezeptor enthalten sollen, wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) behandelt, um nicht-spezifische Bindung zu blockieren. Der "PIG-tailed"-Rezeptor mit einer Thrombin-Spaltungsstelle wurde in die beschichteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte zugesetzt, welche dann gewaschen wurden, um nicht-gebundenen Rezeptor zu entfernen.
Bei der Anwendung von Systemen zur statistischen Peptid-Erzeugung, welche eine mehrwertige Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung zulassen, muß man erkennen, daß die Dichte des immobilisierten Rezeptors ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Affinität der Liganden ist, welche an den immobilisierten Rezeptor binden werden. Bei höheren Rezeptordichten (d. h. jede mit Anti-Rezeptor-Antikörper beschichtete Vertiefung wurde mit 0,25 bis 0,5 mg Rezeptor behandelt) findet eine mehrwertige Bindung wahrscheinlicher (falls überhaupt) statt, als bei geringeren Rezeptordichten (d. h. jede Anti-Rezeptor-Antikörper-beschichtete Vertiefung wurde mit 0,5 bis 1 ng des Rezeptors behandelt). Wenn eine multivalente Bindung stattfindet, wird man mit größerer Wahrscheinlichkeit Liganden mit relativ geringer Affinität isolieren. Typischerweise kann man Führungs- bzw. Anfangs-Verbindungen unter Verwendung einer hohen Dichte von immobilisiertem Rezeptor identifizieren und dann die Derivate der Anfangs-Verbindung bei geringeren Rezeptordichten testen, um Verbindungen mit höherer Affinität für den Rezeptor als die Anfangs-Verbindung zu isolieren.
Häufig wurde der Rezeptor nur zu abwechselnden Reihen der Mikrotiterplatte zugegeben; die BSA-blockierten Vertiefungen in den "Leerwert"-Reihen dienten als Negativkontrollen, um zu bestimmen, ob eine rezeptorspezifische Reaktion die beobachteten Ergebnisse hervorrief. Dann wurden Fusionsprotein-Präparationen in die Vertiefungen gegeben und inkubiert, um das Stattfinden einer Binden an den Rezeptor zu gestatten; danach wurden die Vertiefungen gewaschen, um nicht-gebundene Fusionsproteine zu entfernen.
Mit den obenstehenden Systemen wurde ein Peptid gefunden, welches an den EPO-R gebunden hatte. Die für das Fusionsprotein, welches an den Rezeptor gebunden hatte, codierende DNA wurde sequenziert. Dieses Peptid besaß die Sequenz: GGCRIGPITWVCGG (SEQ ID NO:) (wobei der N-terminale GG-Rest die Spaltung auf dem Phagen gestattet). Dieses Peptid zeigte konsistent geringe Affinitäten für BSA und für den Anti-Rezeptor-Antikörper und eine hohe Affinität für EPO-R im ELISA. Darüber hinaus wurde der Phagmid-Klon von freiem EPO und von entsprechendem bzw. verwandtem freien Peptid kompetiert. Ferner wurde festgestellt, daß freies Peptid das EPO-Phagmid, die LacI-EPO-Fusion und Radioligand kompetiert. Schließlich kompetierte des freie Peptid nicht in IL-2Rαβ-Bindungsassays.
Eine Mutageneseuntersuchung an diesem bevorzugten Peptid wurde danach durchgeführt. Um die Sammlung von Oligonukleotiden, welche die statistischen Peptide codieren, zu erzeugen, wurden die in der 1 gezeigten Mutagenese-Oligomere hergestellt, worin, in dem Codon-Motiv (NNK), N gleich Nukleotid A, C, G oder T (äquimolar; abhängig von der angewandten Methodik können andere Nukleotide verwendet werden) war, und K gleich G oder T (äquimolar) war. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß das NNK-Motiv für alle Aminosäuren codiert, lediglich ein Stop-Codon codiert und das Codon-Ungleichgewicht verringert. Es gibt 32 mögliche Codons, welche aus dem NNK-Motiv resultieren: 1 für jede von 12 Aminosäuren, 2 für jede von 5 Aminosäuren, 3 für jede von 3 Aminosäuren und lediglich eines der drei Stopp-Codons.
Die Mutagenese-Fusionsproteine, zusammen mit der für sie codierenden DNA, wurden erneut auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Die Fusionsproteine und die begleitende DNA wurden dann isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hat. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultieren, sind in der 2 gezeigt.
Diese Peptide sind durch das Motiv "X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈" (SEQ ID NO:) gekennzeichnet, worin jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben wird; X₆ unabhängig aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren oder den stereoisomeren D-Aminosäuren ausgewählt ist; X₃ gleich C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann; X₄ gleich R, H, L oder W sein kann; X₅ gleich M, F oder I sein kann; X₇ gleich D, E, I, L oder V sein kann; und X₈ gleich C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann, vorausgesetzt, daß entweder X₃ oder X₈ gleich C oder Hoc ist.
Um einen groben Hinweis auf die Affinität der Peptide zu ermitteln, wurden die Phagen-Bibliotheken auch unter Verwendung eines Affinitäts-Selektions-Protokolls gescreent, worin die Peptide mit EPO (100 nM) kompetiert werden. Dieses Verfahren wird typischerweise während zwei Panning-Runden wiederholt. In anschließenden Panning-Runden können die Kompetitionstemperatur (4°C bis Umgebungstemperatur) und –zeit (15 bis 30 Minuten) sowie die Temperatur (4°C bis Umgebungstemperatur) der Waschlösungen geändert werden, um ferner hinsichtlich Peptiden mit hoher Affinität zu selektieren. Unter Anwendung dieses Affinitässelektions-Vorgehens wurden Peptide isoliert, welchen das gemeinsame Motiv "X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁" (SEQ ID NO:) gemeinsam war, worin jede Aminosäure durch Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angezeigt wird; jedes X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀ und X₁₁ unabhängig aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren oder den stereoisomeren D-Aminosäuren ausgewählt ist; X₄ gleich R, H, L oder W sein kann, X₅ gleich M, F oder I sein kann, und X₇ gleich D, E, I, L oder V sein kann. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid eine Sequenz von Aminosäuren X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO:) umfassen, worin X₄ gleich R oder H sein kann, X₅ gleich F oder M sein kann, X₆ gleich I, L, T, M oder V sein kann, X₇ gleich D oder V ist, X₉ gleich G, K, L, Q, R, S oder T sein kann, und X₁₀ gleich A, G, P, R oder Y sein kann. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Kernpeptid eine Sequenz von Aminosäuren X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁ (SEQ ID NO:) umfassen, worin X₁ gleich D, E, L, N, S, T oder V sein kann; X₂ gleich A, H, K, L, M, S oder T sein kann; X₄ gleich R oder H ist; X₉ gleich K, R, S oder T sein kann; und X₁₀ gleich P ist.
Beispiele von repräsentativen Peptiden, welche diesem Motivs folgen bzw. angehören und während des Affinitäts-Selektionsverfahrens isoliert wurden, sind in den nachstehenden Tabellen gezeigt.
Tabelle 1 Peptide aus Affninitäts-Selektions-Protokoll Kompetition mit 100 nM EPO, 15 min, 4°C
Keine Kompetition
Tabelle 2 Peptide aus Affninitäts-Selektions-Protokoll Zweite Kompetition mit 100 nM EPO, 15 min, 4°C
Keine Kompetition
Tabelle 3 Peptide aus Affninitäts-Selektions-Protokoll Kompetition mit 100 nM EPO, 15 min, Raumtemperatur
Keine Kompetition
Tabelle 4 Peptide aus Affninitäts-Selektions-Protokoll Kompetition mit 100 nM EPO, 30 min, Raumtemperatur
Keine Kompetition
Eine weitere Mutagenese-Bibliothek mit sechs statistischen Aminosäure-Resten, angrenzend an ein statistisches 8-mer, flankiert von zwei Cystein-Resten, wurde ebenfalls gegen immobilisierten EPO-R gescreent. Die Mutagenese-Fusionsproteine, zusammen mit der für sie codierenden DNA, wurden erneut auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Die Fusionsproteine und begleitende DNA wurden dann isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu ermitteln, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hatte. Das bevorzugte Peptid, welches aus dieser Untersuchung resultiert, besaß die Sequenz GGPHHVYACRMGPLTWIC (SEQ ID NO:) und wird somit von der Kernsequenz "YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈" (SEQ ID NO:) beinhaltet, worin jede Aminosäure durch Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist; jedes X₂ und X₆ unabhängig aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren oder den stereoisomeren D-Aminosäuren ausgewählt ist; X₃ gleich C, A, α-Amino-γ-brombutteräsure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann; X₈ gleich R, H, L oder W sein kann; X₅ gleich M, F oder I sein kann; X₇ gleich D, E, I, L oder V sein kann; und X₈ gleich C, A, α-Amino-γ-brombuttersäure oder Hoc, worin Hoc Homocystein ist, sein kann, vorausgesetzt, daß entweder X₃ oder X₈ gleich C oder Hoc ist, wobei die Kernsequenz an ihrem Amino-Terminus an eine Sechs-Aminosäure-Einheit gekoppelt ist, worin jede Aminosäure unabhängig aus einer der 20 genetisch codierten L-Aminosäuren oder den stereoisomeren D-Aminosäuren ausgewählt ist.
IC₅₀'s wurden für mehrere der Peptide berechnet, welche unter die obenstehend beschriebenen allgemeinen Motive fallen bzw. dazugehören. Diese Werte wurden unter Verwendung des freien Peptids bestimmt und sind in der nachstehenden Tabelle 5 gezeigt. (Jedes dieser Peptide wurde unabhängig synthetisiert und C-terminal amidiert, konnte aber leicht als die freie Carbonsäure oder als ein Ester oder ein anderes Carboxyamid hergestellt werden).
Tabelle 5
Zusätzlich zum Vorstehenden wurden andere Mutagenese-Untersuchungen an dieser Hochaffinitäts-EPO-Agonisten-Familie von Peptiden unter Bedingungen durchgeführt, welche entworfen waren, um eine Anreicherung hinsichtlich Peptiden mit höherer Affinität vorzunehmen. Wie vorausgehend beschrieben, werden, um eine Anreicherung hinsichtlich Peptiden mit höherer Affinität vorzunehmen, Bibliotheken unter Anwendung eines Affinitäts-Selektionsprotokolls gescreent, wobei die Peptide mit EPO (100 nM) kompetiert werden. Dieses Verfahren wird typischerweise während zwei Panning-Runden wiederholt. In anschließenden Panning-Runden können die Kompetitionstemperatur (4°C bis Umgebungstemperatur) und -zeit (15 bis 30 Minuten) sowie die Temperatur der Waschlösungen (4°C bis Umgebungstemperatur) geändert werden, um weiterhin hinsichtlich Peptiden mit hoher Affinität zu selektieren. Unter Anwendung dieser Techniken wurde eine Mutagenese-Bibliothek mit drei statistischen Aminosäure-Resten auf jeder Seite der flankierenden Sequenz YXCRIGPITWVC ebenfalls gegen immobilisierten EPO-R gescreent (siehe 3). Die Mutagenese-Fusionsproteine, zusammen mit der für sie codierenden DNA, wurden erneut auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Die Fusionsproteine und begleitende DNA wurden dann isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hatte. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultieren, sind in der Tabelle 6 nachstehend dargestellt.
Tabelle 6
In einer weiteren Mutageneseuntersuchung wurde eine Mutagenese-Bibliothek, bei welcher die stark konservierten Reste (d. h. Y, C, G, P, T und W) festgelegt waren, die anderen Reste randomisiert waren, und 10 zusätzliche Reste am N-Terminus vor dem Tyrosin vorlagen, ebenfalls gegen immobilisierten EPO-R gescreent (siehe 4A). Die Mutagenese-Fusionsproteine, zusammen mit der für sie codierenden DNA, wurden erneut auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Die Fusionsproteine und begleitende DNA wurden dann isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hatte. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultieren, sind in der nachstehenden Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
In noch einer weiteren Mutagenese-Untersuchung wurde eine Mutagenese-Bibliothek, bei der die stark konservierten Reste (d. h. Y, C, G, P, T und W) festgelegt waren, die anderen Reste randomisiert waren und 10 zusätzliche Reste zwischen dem zweiten Cystein und dem (Gly)4-Ser-Linker vorlagen, ebenfalls gegen immobilisierten EPO-R gescreent (siehe 4b). In dieser Bibliothek gingen dem konservierten Tyrosin-Rest zwei Glycin-Reste voraus, um eine effiziente Signalpeptid-Spaltung zu gestatten. Die Mutagenese-Fusionsproteine, zusammen mit der für sie codierenden DNA, wurden erneut auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Die Fusionsproteine und begleitende DNA wurden dann isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hatte. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultieren, sind in der Tabelle 8 nachstehend dargestellt.
Tabelle 8
In noch einer anderen Mutagenese-Untersuchung wurde eine Mutagenese-Bibliothek, bei der die stark konservierten Reste (d. h. Y, C, G, P, T und W) festgelegt waren, wobei das Tyrosin direkt neben dem ersten Cystein plaziert war, und die anderen Aminosäuren randomisiert waren, einschließlich 4 Resten N-terminal zu dem Tyrosin und 5 zwischen dem zweiten Cystein und dem Linker, ebenfalls gegen immobilisierten EPO-R gescreent (siehe 4c). Den N-terminalen statistischen Aminosäuren gingen wiederum zwei Glycin-Reste voraus, um eine effizientere Prozessierung zu ermöglichen. Die Mutagenese-Fusionsproteine, zusammen mit der für sie codierenden DNA, wurden erneut auf immobilisiertem EPO-R "gepanned". Die Fusionsproteine und begleitende DNA wurden dann isoliert und kultiviert, um Fusionsprotein-Präparationen für einen ELISA herzustellen, um zu bestimmen, ob das Fusionsprotein spezifisch an den Rezeptor gebunden hatte. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultieren, sind nachstehend in der Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9
Zusätzlich zu den vorangehenden Mutagenese-Untersuchungen wurde eine Mutagenese des Peptides GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG durchgeführt unter Verwendung eines modifizierten C-terminalen Lac-I-Display-Systems, in welchem die Display-Wertigkeit mit dem Ziel verringert war, Treffer von höherer Affinität zu identifizieren ("Headpiece Dimer"). Das Lac-I-Headpiece-Dimer (HPD)-Display-System wird in größerer Ausführlichkeit in U.S.-Patent Nr. 5 338 665 beschrieben, welches hierin für alle Zwecke durch den Bezug darauf einbezogen ist. Im wesentlichen wurden die Reste, welche in den früheren Mutagenese-Unter suchungen hoch konserviert waren (d. h. Y, C, G, P, T und W) geringfügig mutiert, wohingegen die weniger konservierten Reste (d. h. H, F, L und V) einem höheren Spiegel an Mutation unterzogen wurden. Vier statistische Reste gingen dem Tyrosin-Rest voraus, wobei dem letzteren ebenfalls ein statistischer Rest folgte. Der C-Terminus des Mutagenese-Schemas endete mit 6 zufälligen bzw. statistischen Aminosäuren, welche dem Cystein folgten. Die Details der Bibliothekkonstruktion sind in der 5 dargestellt.
Die Bibliothek wurde durch vier Runden auf 'PIG-getailtem' EPO-R, immunobilisiert auf mAb179, gescreent, wobei eine EPO-Elution von Runde zwei aufwärts angewandt wurde, um eine Anreicherung hinsichtlich Klonen höherer Affinität vorzunehmen. Die resultierenden DNA-Inserts wurden dann als ein Pool in einen Maltose-Bindungs-Protein (MBP)-Vektor kloniert, der ihre Expression als ein C-terminales Fusionsprotein gestattete. Rohzell-Lysate aus zufällig, statistisch gepickten einzelnen MBP-Fusionsklonen wurden dann hinsichtlich EPO-R-Bindung in einem ELISA-Format getestet. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultieren, sind in nachstehenden Tabelle 10 dargestellt.
Tabelle 10
Eines der bemerkenswertesten Merkmale der Peptide, erhalten unter Verwendung des Lac-I-Headpiece-Dimer-Display-Systems ist die Anhäufung von mehreren positiven Ladungen in den Regionen, welche die konservierten Cysteine flankieren, was insbesondere der Fall in RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV ist, welches einen C-terminalen Abschnitt von 5 derartigen Resten aufweist. Aminosäuren, welche geringfügig mutagenisiert waren (d. h. Y, C, G, P, T und W) waren absolut konserviert, wohingegen neue Motive an denjenigen Positionen erzeugt wurden, welche stärker mutiert wurden. Von besonderem Interesse ist das Vorhandensein eines zusätzlichen Tyrosin-Rests in einer Anzahl von Peptiden (siehe z. B. LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR), und das Vorhandensein von zwei Glutaminsäure-Resten zwischen den Cysteinen in TIAQYICYMGPETWECRPSPKA.
Zusätzlich zu den vorhergehenden Mutagenese-Untersuchungen wurde eine Mutagenese des Peptids TIAQYICYMGPETWECRPSPKA unter Verwendung eines modifizierten C-terminalen Lac-I-Display-Systems, welches zu dem zuvor beschriebenen System ähnlich war, durchgeführt. Im wesentlichen waren die Reste, welche in früheren Mutagenese-Untersuchungen stark konserviert waren (d. h. Y, C, G, P, T und W) festgelegt, wohingegen die weniger konservierten Rest (d. h. H, F. L und V) randomisiert wurden. Darüber hinaus wurden die zwei Glutaminsäure-Reste geringfügig mutiert. Vier statistische Reste gingen dem Tyrosin-Rest voraus, wobei dem letzteren ebenfalls von einem statistischen Rest gefolgt wurde.
Der C-Terminus des Mutagenese-Schemas endete mit 6 statistischen Aminosäuren, welche dem Cystein folgten. Die Details der Bibliothekkonstruktion sind in der 6 dargestellt.
Die Bibliothek wurde durch drei Runden auf PIG-getailtem EPO-R, immunobilisiert auf mAb 179, gescreent, wobei EPO-Elution von Runde zwei aufwärts angewandt wurde, um eine Anreicherung hinsichtlich Klonen höherer Affinität vorzunehmen. Kolonie-Abdrücke bzw. -Abhebungen wurden durchgeführt unter Sondierung mit dem humanen Fcγ-EBP-Reagens, gefolgt von Ziege-Anti-Mensch-Fcγ, konjugiert an alkalische Phosphatase, wobei letztere von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, erhältlich ist. Danach wurden die identifizierten HPD-Plasmide sequenziert. Aus dieser Untersuchung resultierende Peptide sind in der nachstehenden Tabelle 11 dargestellt.
Tabelle 11
Der vorstehende Pool von Peptidsequenzen wurde dann in einen Maltose-Bindungsprotein (MBP)-Vektor kloniert, was ihre Expression als C-terminales Fusionsprotein gestattete. Rohzell-Lysate aus zufällig abgepickten individuellen MBP-Fuskionsklonen wurden dann auf EPO-R-Bindung in einem ELISA-Format geassayed bzw. getestet. Bevorzugte Peptide, welche aus dieser Untersuchung resultierten, sind nachstehend in der Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12
Repräsentative Peptide, von denen festgestellt wurde, spezifisch an den EPO-Rezeptor zu binden, wurden auch in Zell-basierenden funktionellen Assays getestet. Ein Assay verwendete FDCP-1, eine Wachstumsfaktor-abhängige, marine, multi-potentielle primitive hämatopoietische Vorläuferzelline (siehe z. B. Dexter et al. (1980), J. Exp. Med. 152: 1036–1047) als die Elternzellinie. Diese Zellinie kann proliferieren aber nicht differenzieren, wenn sie mit WEHI3-konditioniertem Medium (ein Medium, welches IL-3 enthält, ATCC-Nr. T1B68) supplementiert wird. Die Elternzellinie wird mit dem humanen oder marinen EPO-R wie nachstehend beschrieben transfiziert, um die Zellinien FDCP-1-hEPO-R bzw. FDCP-1-mEPO-R herzustellen. Diese transfizierten Zellinien können, in Gegenwart von humanem oder marinem EPO, proliferieren, aber nicht differenzieren.
Kurz gesagt, werden die Zellen zu halbstationärer Dichte in Gegenwart der notwendigen Wachstumsfaktoren herangezogen. Die Zellen werden dann in PBS gewaschen und 16– 24 Stunden lang in Vollmedium ohne die Wachstumsfaktoren hungern gelassen. Nach Bestimmen der Lebensfähigkeit der Zellen werden Stammlösungen (in Vollmedium ohne die Wachstumsfaktoren) hergestellt, um etwa 105 Zellen pro 50 μl zu ergeben. Verdünnungsreihen der Verbindungen (typischerweise das freie Lösungsphasen-Peptid im Gegensatz zu einem Phagen-gebundenen oder, anderweitig gebundenen oder immobilisierten Peptid), welche getestet werden sollen, werden in 96-Vertiefungs-Gewebekulturplatten für ein Endvolumen von 50 μl pro Vertiefung angefertigt. Zellen (50 μl) werden in jede Vertiefung gegeben, und die Zellen werden 24–48 Stunden lang inkubiert, an welchem Punkt die Negativkontrollen sterben oder ruhiggestellt bzw. quieszent sein sollten. Die Zellproliferation wird dann durch im Fachgebiet bekannte Techniken gemessen, wie einen MTT-Assay, der mit dem 3H-Thymidin-Einbau als eine Anzeige der Zellproliferation korreliert (siehe Mosmann (1983), J. Immunol. Methods 65: 55). Die 7 veranschaulicht die Ergebnisse dieses Assays für EPO und für die in der obenstehenden Tabelle 5 aufgelisteten Peptide. Peptide, welche an den EPO-Rezeptor binden, und Aktivität in dem FDCP-1/hEPO-R-Zell-basierenden Bioassay aufzeigen, sind bevorzugte Verbindungen der Erfindung.
Ein zweiter zellbasierter Assay verwendete die TF-1-Zellinie; siehe Kitamura et al. (1989) Blood 73: 375–380, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Repräsentative Ergebnisse sind in der 8 gezeigt. Die 8 zeigt die Effekte von EPO und dem freiem Peptid VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:) auf die zelluläre Proliferation der Zellinie TF-1.
Ein anderer zellbasierender Assay, welcher das Vermögen der Verbindungen dieser Erfindung, als EPO-Agonisten zu wirken, weiter veranschaulicht, basiert auf dem 3H-Thymidin-Einbau in Milzzellen von Phenylhydrazin-behandelten Mäusen. Die Ergebnisse dieses Assays sind in den 9A–9C gezeigt.
Andere biologische Assays, welche verwendet werden können, um die Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, werden offenbart in Greenberger et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931–2935 (EPO-abhängige hämatopoietische Vorläuferzelline); Quelle und Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266: 609–614 (Protein-Tyrosinphosphorylierung in B6SUt.EP-Zellen); Dusanter-Fourt et al. (1992) J. Biol. Chem. 28: 10670– 10678 (Tyrosinphosphorylierung des EPO-Rezeptors in humanen EPO-responsiven Zellen); Quelle et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17055–17060 (Tyrosinphosphorylierung eines cytosolischen Proteins (pp100) in FDC-ER-Zellen); Worthington et al. (1987) Exp. Hematol. 15: 85– 92 (kolorimetrischer Assay für Hämoglobin); Kaiho und Miuno (1985) Anal. Biochem. 149: 117–120 (Nachweis von Hämoglobin mit 2,7-Diaminofluoren); Patel et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 21300–21302 (Expression von c-myb); Witthuhn et al. (1993) Cell 74: 227–236 (Assoziation und Tyrosinphosphorylierung von JAK2); Leonard et al. (1993) Blood 82: 1071– 1079 (Expression von GATA-Transkriptionsfaktoren); Ando et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9571–9575 (Regulierung des G1/3-Übergangs durch Cycling von D2 und D3); und Calcium-Strömung, von denen jedes hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Ein von Molecular Devices Corp. entworfenes Instrument, bekannt als ein Mikrophysiometer, ist berichtetermaßen erfolgreich für die Messung des Effekts von Agonisten und Antagonisten auf verschiedene Rezeptoren eingesetzt worden. Die Grundlage für diese Vorrichtung ist die Messung der Änderungen in der Ansäuerungs-Rate des extrazellulären Mediums in Antwort auf eine Rezeptoraktivierung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide der vorliegenden Erfindung dimerisiert oder oligomerisiert, wodurch die Affinität und/oder Aktivität der hierin offenbarten Anfangs-Verbindungen erhöht wird. Um den Effekt, welchen Peptid-Dimerisierung/Oligomerisierung auf die EPO-nachahmende Wirksamkeit in Zell-Proliferations-Assays aufweist, zu untersuchen, wurde ein C-terminal biotinyliertes Analog von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG synthetisiert (d. h. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-Biotin)).
Dieses Peptid wurde mit Streptavidin in PBS bei einem Molverhältnis von 4 : 1 eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß daran wurde der Komplex in den "PIG-tailed"-EPO-R-Bindungsassay für die IC₅₀-Bestimmung eingebracht. Peptid, welches nicht an Streptavidin komplexiert worden ist, wurde in dem gleichen Experiment ebenfalls laufen gelassen. Vorkomplexiertes Peptid besaß festgestelltermaßen einen IC₅₀ von 20 nM, verglichen. zu den 350 nM IC₅₀ des Peptids, welches nicht mit Streptavidin inkubiert worden war. Diese mehr als 10-fache Erhöhung der scheinbaren Affinität beruht vermutlich auf dem mehrwertigen Zustand des Peptid-Streptavidin-Komplexes. Da dieser Vergleich unter Verwendung der freien Peptid-Konzentrationen und nicht der effektiven Komplex-Konzentration (theoretisch 4-fach geringer) vorgenommen wurde, wird der Effekt sogar größer sein.
Darüber hinaus wurde dieses Peptid mit Streptavidin in serumfreiem HEPES-gepufferten RPMI bei einem Molverhältnis von 4 : 1, wie obenstehend, vorinkubiert. Der Komplex wurde hinsichtlich Stimulation der Zellproliferation in einem FDCP-1/hEPO-R-Bioassay neben freiem GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin) und dem nicht-biotinylierten Eltern-Peptid, d. h. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, getestet. Die 10 veranschaulicht die Ergebnisse des Assays, worin der EPO-ED₅₀ der freien Peptide ähnlich (ungefähr 1 μM) war, aber derjenige des vorgeformten Streptavidin-Komplexes geringer als 10 nM war, eine zweifache logarithmische Verringerung im EPO-ED₅₀. Streptavidin alleine hatte einen gewissen kleinen stimulatorischen Effekt bei den höchsten Konzentrationen, vermutlich aufgrund von Kontamination mit bakteriellem Endotoxin.
Darüber hinaus wurde eine Erhöhung der biologischen Wirksamkeit festgestellt, als das Peptid mit Ziege-Anti-Biotin-IgG dimerisiert wurde. Die 11 veranschaulicht, daß eine log- Verringerung im EPO-ED₅₀ ebenfalls durch Vorinkubation von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin) mit gereinigtem Ziege-Anti-Biotin-IgG bei einem Molverhältnis von 2 : 1 erzielt werden kann. Diese Erhöhung in der biologischen Wirksamkeit beruht vermutlich auf der Dimerisierung des Peptids durch die Antikörper. Die Anti-Biotin-Antikörper allein hatten keinen Effekt auf die Zellen. Weiterhin wurde eine 100-fache Verringerung der EPO-EDSp mit dem GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin)-Streptavidin-Komplex beobachtet. Somit kann, durch Dimerisieren oder Oligomerisieren der Anfangs-Peptide der vorliegenden Erfindung die Affinität und/oder Aktivität derartiger Peptide erhöht werden.
In einer anderen Ausführungsform wurde ein dimeres Peptid-Analog von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, enthaltend zwei Disulfidbrücken, unter Verwendung des in 12 dargestellten allgemeinen Schemas hergestellt. Kurz gesagt, wurde die erste Peptidkette auf einem Tentagel-Harz zusammengebaut. Das Fmoc-Lys(Alloc) wurde an den Knorr-Linker gekoppelt, wobei die Alloc-Gruppe als eine orthogonale Schutzgruppe verwendet wurde. Für die erste Peptidkette wurde Cys(Acm) verwendet. Nach der Vervollständigung der ersten Peptidkette wurde die Alloc-Gruppe entfernt, und die zweite Peptidkette wurde auf den Seitenketten-Aminen des Lysin-Restes aufgebaut. In dieser Peptidkette wurde Cys(trt) verwendet. Nachdem die Synthese abgeschlossen war, wurde das Peptid von dem Harz abgespalten und gereinigt. Das Peptid wurde dann zu einer Verbindung mit einer einzigen Disulbidbrücke cyclisiert. Danach wurde die zweite Disulfidbrücke durch Iod-Oxidation gebildet, was das bicyclische Dimer ergab.
Die 13 und 14 zeigen die in vitro EPOR-Bindung und die biologischen Aktivitäten des Dimers. Die Affinität des Dimers wurde gegen den "PIG-getailten" EPOR, immobilisiert auf mAb179 in Streifenvertiefungen, getestet. Das Ergebnis des Gleichgewichts-Kompetitions-Bindungsassays zeigte eine Affinität von ungefähr 2 nM, eine Erhöhung um das 200fache gegenüber dem Wert für das Elternpeptid GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (200 nM) und um das 5fache gegenüber dem GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-Biotin)-Streptavidin-Komplex. Die in vitro-Bioaktivität, wie gemessen durch FDCP-1/hEPOR-Zellproliferation, war ungefähr 20-fach von einem EC₅₀ von 400 nM (für das Elterpeptid) auf 20 nM erhöht. Daher kann, durch Dimerisieren oder Oligomerisieren der Anfangs-Peptide der vorliegenden Erfindung, die Affinität und/oder Aktivität derartiger Peptide signifikant erhöht werden.
Die Peptide dieser Erfindung oder Derivate davon können an Verbindungen konjugiert werden, welche an den EPO-R binden, um Verbindungen mit einer größeren Affinität für den Rezeptor als eine jede der Verbindungen, aus denen das Konjugat zusammengesetzt ist, zu konstruieren. Die Ermittlung dieser Peptide erleichtert auch die Identifizierung von Peptiden, welche an die gleiche Stelle auf dem EPO-R binden, weil man das Bibliotheks- oder Panning-Vorgehen vorbestimmen bzw. beeinflussen kann, um Peptide mit dem komplementären "nicht-blockierenden" Motiv zu eliminieren.
Die bevorzugte Motivsequenz sieht auch ein Mittel vor, um die Minimumgröße eines EPO-Agonisten der Erfindung zu bestimmen. Unter Verwendung des "Encoded Synthetic Libary" (ESL)-Systems, beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 946 239, eingereicht am 16. September 1992, welche eine Teilfortführungsanmeldung von Serien Nr. 762 522, eingereicht am 18. September 1991, ist, oder des "Very large scale immobilized polymer synthesis"-Systems, beschrieben in den U.S.-Patentanmeldungen, Serien-Nr. 492 462, eingereicht am 7. März 1990; 624 120, eingereicht am 6. Dezember 1990; und 805 727, eingereicht am 6. Dezember 1991; kann man nicht nur die Minimumgröße eines Peptids mit einer derartigen Aktivität bestimmen, sondern man kann auch alle der Peptide herstellen, welche die Gruppe von Peptiden bilden, welche sich von dem bevorzugten Motiv (oder der Minimumgröße dieses Motivs) in einem, zwei oder mehreren Resten unterscheiden. Diese Sammlung von Peptiden kann dann hinsichtlich der Fähigkeit, an den EPO-Rezeptor zu binden, gescreent werden. Dieses immobilisierte Polymer-Synthese-System oder andere Peptidsynthese-Verfahren können auch angewandt werden, um jedwedes Trunkierungsanalog und jedwedes Deletionsanalog und jedwede Kombination von Trukierungs- und Deletionsanalog von allen Peptidverbindungen der Erfindung zu synthetisieren.
Die Peptide der Erfindung können auch durch klassische, im Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von standardmäßigen Festphasentechniken. Die Standardverfahren schließen exklusive Festphasensynthese, partielle Festphasensynthese-Verfahren, Fragmentkondensierung, klassische Lösungssynthese und sogar rekombinante DNA-Technologie ein; siehe z. B. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Auf einer Festphase wird die Synthese typischerweise von dem C-terminalen Ende des Peptids unter Verwendung eines α-Amino-geschützten Harzes begonnen. Ein geeignetes Ausgangsmaterial kann beispielsweise hergestellt werden durch Anheften der erforderlichen α-Aminosäure an ein chlormethyliertes Harz, ein Hydroxymethylharz oder ein Benzhydrylaminharz. Ein derartiges chlormethyliertes Harz wird unter dem Handelsnamen BIO-BEADS SX-1 von Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, vertrieben, und die Herstellung des Hydroxymethylharzes wird von Bodonszky et al., 1966, Chem. Ind. (London) 38: 1597, beschrieben. Das Benzhydrylamin(BHA)-Harz ist beschrieben worden von Pietta und Marshall, 1970, Chem. Commm. 650, und ist kommerziell von Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, in der Hydrochlorid-Form erhältlich.
Somit können die Verbindungen der Erfindung durch Koppeln einer α-Amino-geschützten Aminosäure an das chlormethylierte Harz beispielsweise mit Hilfe von Cäsiumbicarbonat-Katalysator, gemäß des Verfahrens, beschrieben von Gisin, 1973, Helv. Chim. Acta 56: 1467, hergestellt werden. Nach der anfänglichen Kopplung wird die α-Amino-Schutzgruppe durch eine Auswahl von Reagenzien, einschließlich Trifluoressigsäure(TFA)- oder Chlorwasserstoffsäure(HCl)-Lösungen in organischen Lösungsmitteln, bei Raumtemperatur entfernt.
Die α-Amino-Schutzgruppen sind diejenigen, welche bekanntermaßen auf dem Fachgebiet der schrittweisen Synthese von Peptiden nützlich sind. Eingeschlossen sind Acyl-Typ-Schutzgruppen (z. B. Formyl, Trifluoracetyl, Acetyl), aromatische Urethan-Typ-Schutzgruppen (z. B. Benzyloxycarbonyl (Cbz) und substituiertes Cbz), aliphatische Urethan-Schutzgruppen (z. B. t-Butyloxycarbonyl (Boc), Isopropyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl) und Schutzgruppen vom Alkyl-Typ (z. B. Benzyl, Triphenylmethyl). Fmoc ist eine bevorzugte Schutzgruppe. Die Seitenketten-Schutzgruppen (typischerweise Ether, Ester, Trityl, PMC, und dergleichen) bleibt während der Kopplung intakt und wird während des Entschützens der Amino-Terminus-Schutzgruppe oder während der Kopplung nicht abgespalten. Die Seitenketten-Schutzgruppe muß nach Abschluß der Synthese des letztendlichen Peptids und unter Reaktionsbedingungen, welche das Zielpeptid nicht verändern werden, entfernbar sein.
Die Seitenketten-Schutzgruppen für Tyr schließen Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, Benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz und 2,5-Dichlorbenzyl ein. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Asp schließen Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl, Ethyl und Cyclohexyl ein. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Thr und Ser schließen Acetyl, Benzoyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Cbz ein. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Thr und Ser sind Benzyl. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Arg schließen Nitro, Tosyl (Tos), Cbz, Adamantyloxycarbonyl, Mesitoylsulfonyl (Mts) oder Boc ein. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Lys schließen Cbz, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-Cl-Cbz), 2-Brombenzyloxycarbonyl (2-BrCbz), Tos oder Boc ein.
Nach Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden restlichen geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt. Jede geschützte Aminosäure wird im allgemeinen in einem etwa 3-fachen Überschuß unter Verwendung eines passenden Carboxylgruppen-Aktivators, wie 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) oder Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), in Lösung, zum Beispiel in Methylenchlorid(CH₂Cl₂)-Dimethylformamid(DMF)-Mischungen, umgesetzt.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vervollständigt worden ist, wird das gewünschte Produkt von dem Harzträger durch Behandlung mit einem Reagenz, wie Trifluoressigsäure (TFA) oder Hydrogenfluorid (HF) entkoppelt, welches nicht nur das Peptid von dem Harz spaltet, sondern auch alle verbleibenden Seitenketten-Schutzgruppen abspaltet. Wenn das chlormethylierte Harz verwendet wird, führt die Hydrogenfluorid-Behandlung zur Bildung der freien Peptidsäuren. Wenn das Benzhydrylamin-Harz verwendet wird, führt die Hydrogenfluorid-Behandlung direkt zu dem freien Peptidamid. Wenn, alternativ dazu, das chlormethylierte Harz verwendet wird, kann das Seitenketten-geschützte Peptid durch Behandlung des Peptidharzes mit Ammoniak unter Erhalt des gewünschten Seitenketten-geschützten Amids oder mit einem Alkylamin unter Erhalt eines Seitenketten-geschützten Alkylamids oder Dialkylamids entkoppelt werden. Der Seitenkettenschutz wird dann auf die übliche Weise durch Behandlung mit Hydrogenfluorid entfernt, wodurch freie Amide, Alkylamide oder Dialkylamide erhalten werden.
Bei der Herstellung der Ester der Erfindung werden die zur Herstellung der Peptidsäuren verwendeten Harze eingesetzt, und das Seitenketten-geschützte Peptid wird mit Base und dem entsprechenden Alkohol, d. h. Methanol, abgespalten. Seitenketten-Schutzgruppen werden dann in der üblichen Weise durch Behandlung mit Hydrogenfluorid entfernt, um den gewünschten Ester zu erhalten. Diese Festphasen-Peptidsynthese-Verfahrensweisen sind im Fachgebiet gut bekannt und in Stewart, Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San Francisco, 1969), weiter beschrieben.
Diese Verfahrensweisen können auch angewandt werden, um Peptide zu synthetisieren, in denen von den 20 natürlich vorkommenden, genetisch codierten Aminosäuren verschiedene Aminosäuren an einer, zwei oder mehreren Positionen von jeder der Verbindungen der Erfindung substituiert sind. Zum Beispiel kann Naphthylalanin für Tryptophan substituiert werden, was die Synthese erleichtert. Andere synthetische Aminosäuren, welche in die Peptide der vorliegenden Erfindung substituiert werden können, schließen L-Hydroxypropyl, L-3,4-Dihydroxyphenylalanyl, δ-Aminosäuren wie L-δ-Hydroxylysyl und D-δ-Methylalanyl, L-α-Methylalanyl, β-Aminosäuren und Isochinolyl ein. D-Aminosäuren und nicht-natürlich vorkommende synthetische Aminosäuren können ebenfalls in die Peptide der vorliegenden Erfindung eingebaut werden.
Man kann die natürlich vorkommenden Seitenketten der 20 genetisch codierten Aminosäuren (oder D-Aminosäuren) durch andere Seitenketten ersetzen, beispielsweise mit Gruppen, wie Alkyl, Niederalkyl, cyclisches 4-, 5-, 6- bis 7-gliedriges Alkyl, Amid, Amidniederalkyl, Amiddi(niederalkyl), Niederalkoxy, Hydroxy, Carboxy und den Niederester-Derivaten hiervon, und mit einem 4-, 5-, 6- bis 7-gliedrigen Heterocyclus. Im besonderen können Prolin-Analoge, in welchen die Ringgröße des Prolin-Rests von 5 Gliedern auf 4, 6 oder 7 Glieder verändert wird, verwendet werden. Cyclische Gruppen können gesättigt oder ungesättigt sein, und, falls ungesättigt, aromatisch oder nicht-aromatisch sein.
Cyclische Gruppen können gesättigt oder ungesättigt sein, und können, falls ungesättigt, aromatisch oder nicht-aromatisch sein. Heterocyclische Gruppen enthalten vorzugsweise ein oder mehrere Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefelheteroatome. Beispiele solcher Gruppen schließen Furazanyl, Furyl, Imidazolidinyl, Imidazolyl, Imidazolinyl, Isothiazolyl, Isoxazolyl, Morpholinyl (z. B. Morpholino), Oxazolyl, Piperazinyl (z. B. 1-Piperazinyl), Piperidyl (z. B. 1-Piperidyl, Piperidino), Pyranyl, Pyrazinyl, Pyrazolidinyl, Pyrazolinyl, Pyrazolyl, Pyridazinyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrrolidinyl (z. B. 1-Pyrrolidinyl), Pyrrolinyl, Pyrrolyl, Thiadiazolyl, Thiazolyl, Thienyl, Thiomorpholinyl (z. B. Thiomorpholino) und Triazolyl ein. Diese heterocyclischen Gruppen können substituiert oder unsubstituiert sein. Falls eine Gruppe substituiert ist, kann der Substituent Alkyl, Alkoxy, Halogen, Sauerstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl sein.
Man kann die Peptide der vorliegenden Erfindung auch leicht durch Phosphorylierung modifizieren, und andere Verfahren zur Herstellung von Peptid-Derivaten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind beschrieben in Hruby et al.⁴². Somit dienen die Peptidverbindungen der Erfindung auch als eine Basis zur Herstellung von Peptid-Mimetika mit ähnlicher biologischer Aktivität.
Die Peptidverbindungen der Erfindung, einschließlich Peptidomimetika, können kovalent an eines oder mehrere einer Vielzahl von nicht-proteinartigen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkene, auf die Weise, dargestellt in U.S.-Patent Nr. 4 640 835; U.S.-Patent Nr. 4 496 689; U.S.-Patent Nr. 4 301 144; U.S.-Patent Nr. 4 670 417; U.S.-Patent Nr. 4 791 192 oder U.S.-Patent Nr. 4 179 337, welche alle in ihrer Gesamtheit hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, modifiziert werden.
Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, daß eine Vielzahl von Techniken zur Konstruktion von Peptidmimetika mit der gleichen oder einer ähnlichen gewünschten biologischen Aktivität wie die entsprechende Peptidverbindung, jedoch mit günstigerer Aktivität als das Peptid in Hinsicht auf Löslichkeit, Stabilität und Anfälligkeit gegenüber Hydrolyse und Proteolyse verfügbar sind; siehe zum Beispiel Morgan und Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243–252 (1989). Im folgenden werden Verfahren zur Herstellung von Peptid-Mimetika beschrieben, welche an der N-terminalen Aminogruppe, der C-terminalen Carboxylgruppe und/oder durch Änderung einer oder mehrerer der Amido-Bindungen in dem Peptid zu einer Nicht-Amido-Bindung modifiziert sind. Es versteht sich, daß zwei oder mehr derartige Modifikationen in einer Peptid-nachahmenden bzw. Peptid-Mimetikum-Struktur gekoppelt werden können (z. B. Modifikation an der C-terminalen Carboxylgruppe und Einschluß einer -CH₂-Carbamat-Bindung zwischen zwei Aminosäuren in dem Peptid).
Die Peptide werden typischerweise als die freie Säure synthetisiert, könnten aber, wie obenstehend angegeben, leicht als das Amid oder der Ester hergestellt werden. Man kann auch den Amino- und/oder Carboxy-Terminus der Peptid-Verbindungen der Erfindung modifizieren, um andere Verbindungen der Erfindung herzustellen. Amino-Terminus-Modifikationen schließen Methylierung (d. h. -NHCH₃ oder -NH(CH₃)₂), Acetylierung, Hinzufügung einer Carbobenzoylgruppe oder Blockierung des Amino-Terminus mit einer beliebigen Blockierungsgruppe, enthaltend eine Carboxylat-Funktionalität, definier durch RCOO-, worin R gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Naphthyl, Acridinyl, Steroidyl und ähnlichen Gruppen, ein. Carboxy-Terminus-Modifikationen schließen die Ersetzung der freien Säure mit einer Carboxamidgruppe oder die Bildung eines cyclischen Lactams am Carboxy-Terminus zur Einführung von strukturellen Beschränkungen ein.
Amino-Terminus-Modifikationen sind wie obenstehend angegeben beschaffen und schließen Alkylierung, Acetylierung, Hinzufügung einer Carbobenzoylgruppe, Bildung einer Succinimidgruppe, etc. ein. Spezifisch kann die N-terminale Aminogruppe dann wie folgend umgesetzt werden:

(a) zur Bildung einer Amidgruppe der Formel RC(O)NH-, worin R wie obenstehend definiert ist, durch Reaktion mit einem Säurehalogenid [z. B. RC(O)Cl] oder Säureanhydrid. Typischerweise kann die Reaktion durch Kontaktieren etwa äquimolarer oder überschüssiger Mengen (z. B. etwa 5 Äquivalenten) eines Säurehalogenids zu dem Peptid in einem inerten Verdünnungsmittel (z. B. Dichlormethan) durchgeführt werden, welches vorzugsweise einen Überschuß (z. B. etwa 10 Äquivalente) eines tertiären Amins, wie Diisopropylethylamin enthält, um die während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur während 30 Minuten). Die Alkylierung des terminalen Amino zur Vorsehung einer Niederalkyl-N-Substitution, gefolgt von Reaktion mit einem Säurehalogenid, wie obenstehend beschrieben, wird die N-Alkylamidgruppe der Formel RC(O)NR- bereitstellen;
(b) zur Bildung einer Succinimidgruppe durch Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid. Wie zuvor, kann eine ungefähr äquimolare Menge oder ein Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid (z. B. etwa 5 Äquivalente) verwendet werden, und die Aminogruppe wird in das Succinimid durch im Fachgebiet gutbekannte Verfahren umgewandelt, einschließlich der Verwendung eines Überschusses (z. B. zehn Äquivalente) eines tertiären Amins, wie Diisopropylethylamin in einem geeigneten inerten Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan); siehe z. B. Wollenberg et al., U.S.-Patent Nr. 4 612 132, welches in seiner Gesamtheit hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Es versteht sich, daß die Succinylgruppe mit beispielsweise C₂-C₆-Alkyl- oder -SR-Substituenten, welche in einer herkömmlichen Weise hergestellt werden, substituiert sein kann, um substituiertes Succinimid am N-Terminus des Peptids vorzusehen. Solche Alkyl-Substituenten werden durch Reaktion eines Niederolefins (C₂-C₆) mit Maleinsäureanhydrid in der Weise, beschrieben von Wollenberg et al., siehe oben, hergestellt, und -SR-Substituenten werden durch Reaktion von RSH mit Maleinsäureanhydrid hergestellt, worin R wie obenstehend definier ist;
(c) zur Bildung einer Benzyloxycarbonyl-NH- oder einer substituierten Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe durch Reaktion mit ungefähr einer äquivalenten Menge oder einem Überschuß von CBZ-Cl (d. h. Benzyloxycarbonylchlorid) oder einem substituierten CBZ-Cl in einem geeigneten ineren Verdünnungsmittel (z. B. Dichlormethan), welche vorzugsweise ein teriäres Amin zum Abfangen der während der Reaktion erzeugten Säure enthält;
(d) zur Bildung einer Sulfonamidgruppe durch Reaktion mit einer äquivalenten Menge oder einem Überschuß (z. B. 5 Äquivalente) von R-S(O)₂Cl in einem geeigneten ineren Verdünnungsmittel (Dichlormethan), um das terminale Amin in ein Sulfonamin umzuwandeln, worin R wie obenstehend definier ist. Vorzugsweise enthält das inere Verdünnungsmittel überschüssiges tertiäres Amin (z. B. zehn Äquivalente) wie Diisopropylethylamin, um die während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur während 30 Minuten);
(e) zur Bildung einer Carbamatgruppe durch Reaktion mit einer äquivalenten Menge oder einem Überschuß (z. B. 5 Äquivalenten) R-OC-(O)Cl oder R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂ in einem geeigneten ineren Verdünnungsmittel (z. B. Dichlormethan), um das terminale Amin in ein Carbamat umzuwandeln, worin R wie obenstehend definiert ist. Vorzugsweise enthält das inere Verdünnungsmittel einen Überschuß (z. B. etwa 10 Äquivalente) eines tertiären Amins, wie Diisopropylethylamin, um jedwede während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur während 30 Minuten); und
(f) zur Bildung einer Harnstoffgruppe durch Reaktion mit einer äquivalenten Menge oder einem Überschuß (z. B. 5 Äquivalenten) R-N=C=O in einem geeigneten inerten Verdünnungsmittel (z. B. Dichlormethan), um das terminale Amin in eine Harnstoffgruppe (d. h. RNHC(O)NH-) umzuwandeln, worin R wie obenstehend definiert ist. Vorzugsweise enthält das inerte Verdünnungsmittel einen Überschuß (z. B. etwa 10 Äquivalente) eines tertiären Amins, wie Diisopropylethylamin. Die Reaktionsbedingungen sind ansonsten herkömmlich (z. B. Raumtemperatur während etwa 30 Minuten).

Darüber hinaus, oder alternativ dazu, kann der C-Terminus modifiziert werden. Bei der Herstellung von Peptid-Mimetika, worin die C-terminale Carboxylgruppe durch einen Ester (d. h. -C(O)OR, worin R wie obenstehend definiert ist) ersetzt wird, werden die zur Herstellung der Peptidsäuren verwendeten Harze eingesetzt, und das Seitenketten-geschützte Peptid wird mit Base und dem passenden Alkohol, z. B. Methanol, abgespalten. Die Seitenketten-Schutzgruppen werden dann in der üblichen Weise durch Behandlung mit Hydrogenfluorid entfernt, um den gewünschten Ester zu erhalten.
Bei der Herstellung von Peptid-Mimetika, in welchen die C-terminale Carboxylgruppe durch das Amid -C(O)NR₃R₄ ersetzt ist, wird ein Benzhydrylamin-Harz als der feste Träger für die Peptidsynthese verwendet. Nach Vervollständigung der Synthese führt eine Hydrogenfluorid-Behandlung zur Freisetzung des Peptids von dem Träger direkt zu dem freien Peptidamid (d. h. der C-Terminus ist -C(O)NH₂). Alternativ dazu ergibt die Verwendung des chlormethylierten Harzes während der Peptidsynthese, gekoppelt mit Reaktion mit Ammoniak zur Abspaltung des Seitenketten-geschützten Peptids von dem Träger, das freie Peptidamid, und eine Reaktion mit einem Alkylamin oder einem Dialkylamin ergibt ein Seitenketten-geschütztes Alkylamid oder Dialkylamid (d. h. der C-Terminus ist -C(O)NRR₁, worin R und R¹ wie obenstehend definiert sind). Der Seitenketten-Schutz wird dann auf die übliche Weise durch Behandlung mit Hydrogenfluorid entfernt, wodurch man die freien Amide, Alkylamide oder Dialkylamide erhält.
In einer anderen alternativen Ausführungsform kann die C-terminale Carboxylgruppe oder ein C-terminaler Ester induziert werden, durch interne Verdrängung des -OH oder des Esters (-OR) der Carboxylgruppe bzw. des Esters mit der N-terminalen Aminogruppe unter Bildung eines cyclischen Peptids zu cyclisieren. Zum Beispiel wird, nach Synthese und Abspaltung unter Erhalt der Peptidsäure, die freie Säure durch einen passenden Carboxylgruppen-Aktivator wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Lösung, beispielsweise in Methylenchlorid(CH₂Cl₂)-Dimethylformamid(DMF)-Mischungen, in einen aktivierten Ester umgewandelt. Das cyclische Peptid wird dann durch interne Verdrängung des aktivierten Esters mit dem N- terminalen Amin gebildet. Die interne Cyclisierung im Gegensatz zur Polymerisierung kann durch Verwendung von sehr verdünnten Lösungen gefördert werden. Derartige Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt.
Man kann auch die Peptide der Erfindung cyclisieren oder einen Desamino- oder Descarboxy-Rest an den Enden des Peptids einbauen, so daß keine terminale Amino- oder Carboxylgruppe vorliegt, um die Anfälligkeit gegen Proteasen zu verringern oder die Konformation des Peptides zu beschränken. Die C-terminalen funktionellen Gruppen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung schließen Amid, Amidniederalkyl, Amid-di(niederalkyl), Niederalkoxy, Hydroxy und Carboxy und die Niederester-Derivate hiervon und die pharmazeutisch annehmbaren Salze hiervon ein.
Andere Verfahren zur Herstellung von Peptid-Derivaten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden beschrieben in Hruby et al., Biochem. J. 268(2): 249–262 (1990), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Somit dienen die Peptid-Verbindungen der Erfindung auch als strukturelle Modelle für Nicht-Peptid-Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, daß eine Vielzahl von Techniken zur Konstruktion von Verbindungen mit der gleichen oder einer ähnlichen gewünschten bio-logischen Aktivität wie die Anfangs-Peptid-Verbindung, jedoch mit günstigerer Aktivität als die Anfangsform hinsichtlich Löslichkeit, Stabilität und Anfälligkeit gegenüber Hydrolyse und Proteolyse, verfügbar sind; siehe Morgan und Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243–252 (1989), was hierin durch Bezug darauf einbezogen ist. Diese Techniken schließen das Ersetzen des Peptidgrundgerüsts mit einem Grundgerüst ein, welches aus Phosphonaten, Amidaten, Carbamaten, Sulfonamiden, sekundären Aminen und N-Methylaminosäuren aufgebaut ist.
Peptid-Mimetika, worin eine oder mehrere der Peptidyl-Bindungen [-C(O)NH-] durch solche Bindungen, wie eine -CH₂-Carbamat-Bindung, eine Phosphonat-Bindung, eine -CH₂-Sulfonamid-Bindung, eine Harnstoff-Bindung, eine sekundäre Amin(-CH₂NH-)-Bindung und eine alkylierte Peptidyl-Bindung [-C(O)NR⁶-, worin R⁶ Niederalkyl ist], ersetzt worden sind, werden während herkömmlicher Peptidsynthese hergestellt, indem lediglich ein geeignet geschütztes Aminosäure-Analog für das Aminosäure-Reagenz am passenden Punkt während der Synthese substituiert wird.
Geeignete Reagenzien schließen, zum Beispiel Aminosäure-Analoge ein, worin die Carboxylgruppe der Aminosäure mit einer Einheit ersetzt worden ist, welche zur Bildung einer der obenstehenden Bindungen geeignet ist. Wenn man beispielsweise wünscht, eine -C(O)NR-Bindung in dem Peptid durch eine -CH₂-Carbamat-Bindung (-CH₂OC(O)NR-) zu ersetzen, dann wird die Carboxyl(-COOH)-Gruppe einer geeignet geschützten Aminosäure zuerst zur -CH₂OH-Gruppe reduziert, welche dann durch herkömmliche Verfahren zu einer -OC(O)Cl-Funktionalität oder einer para-Nitrocarbonat -OC(O)O-C₆H₄-p-NO₂-Funktionalität umgewandelt wird. Die Reaktion von einer jeden von derartigen funktionellen Gruppen mit dem freien Amin oder einem alkylierten Amin auf dem N-Terminus des teilweise hergestellten Peptids, welches sich auf dem festen Träger findet, führt zur Bildung einer -CH₂OC(O)NR-Bindung. Für eine ausführlichere Beschreibung der Bildung derartiger -CH₂-Carbamat-Bindungen, siehe Cho et al., Science, 261: 1303–1305 (1993).
In ähnlicher Weise kann die Ersetzung einer Amido-Bindung in dem Peptid durch eine Phosphonat-Bindung auf die Weise erzielt werden, dargestellt in den U.S.-Patentanmeldungen Serien-Nr. 07/943 805, 08/081 577 und 08/119 700, wobei deren Beschreibungen hierin in ihrer Gesamtheit durch den Bezug darauf einbezogen sind.
Der Austausch bzw. die Ersetzung einer Amido-Bindung in dem Peptid durch eine -CH₂-Sulfonamid-Bindung kann erzielt werden durch Reduzieren der Carboxyl(-COOH)-Gruppe einer geeignet geschützten Aminosäure zur -CH₂OH-Gruppe, und die Hydroxylgruppe wird dann in eine geeignete Abgangsgruppe, wie eine Tosylgruppe, durch herkömmliche Verfahren umgewandelt. Die Reaktion des tosylierten Derivates beispielsweise mit Thioessigsäure, gefolgt von Hydrolyse und oxidativer Chlorierung, wird die funktionelle -CH₂-S(O)₂Cl-Gruppe vorsehen, welche die Carboxylgruppe der ansonsten geeignet geschützten Aminosäure ersetzt. Die Verwendung dieses geeignet geschützten Aminosäure-Analogs in der Peptidsynthese sieht den Einschluß einer -CH₂S(O)₂NR-Bindung vor, welche die Amidobindung in dem Peptid ersetzt, wodurch ein Peptid-Mimetikum vorgesehen wird. Für eine vollständigere Beschreibung der Umwandlung der Carboxylgruppe der Aminosäure in eine -CH₂S(O)₂Cl-Gruppe siehe beispielsweise Weinstein, Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Bd. 7, S. 267–357, Marcel Dekker, Inc., New York (1983), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Das Ersetzen einer Amido-Bindung in dem Peptid mit einer Harnstoffbindung kann auf die Weise erzielt werden, welche in der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/147 805 dargestellt wird, wobei diese Anmeldung hierin in ihrer Gesamtheit durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Sekundäre Amin-Bindungen, worin eine -CH₂NH-Bindung die Amido-Bindung in dem Peptid ersetzt, können hergestellt werden durch Anwendung beispielsweise eines geeignet geschützten Dipeptid-Analogs, worin die Carbonyl-Bindung der Amido-Verknüpfung durch herkömmliche Verfahren zu einer CH₂-Gruppe reduziert worden ist. Im Falle von Diglycin wird beispielsweise die Reduktion des Amins zu dem Amin nach dem Entschützen H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOH ergeben, welches dann in N-geschützter Form in der nächsten Kopplungsreaktion verwendet wird. Die Herstellung derartiger Analoge durch Reduktion der Carbonylgruppe der Amido-Verknüpfung in dem Dipeptid ist im Fachgebiet gut bekannt.
Das geeignet geschützte Aminosäure-Analog wird in der herkömmlichen Peptidsynthese auf die gleiche Weise verwendet, wie man die entsprechende Aminosäure verwenden würde. Beispielsweise werden typischerweise etwa 3 Äquivalente des geschützten Aminosäure-Analogs in dieser Reaktion verwendet. Ein inertes organisches Verdünnungsmittel, wie Methylenchlorid oder DMF, wird verwendet, und wenn eine Säure als ein Reaktionsnebenprodukt erzeugt wird, wird das Reaktionslösungsmittel typischerweise eine überschüssige Menge eines tertiären Amins enthalten, um die während der Reaktion erzeugte Säure abzufangen. Ein besonders bevorzugtes tertiäres Amin ist Diisopropylethylamin, welches typischerweise in einem etwa 10-fachen Überschuß verwendet wird. Die Reaktion führt zum Einbau eines Aminosäure-Analogs mit einer Nicht-Peptidyl-Bindung in das Peptid-Mimetikum. Eine solche Substitution kann nach Bedarf so wiederholt werden, daß von Null bis alle Amido-Bindungen in dem Peptid durch Nicht-Amido-Bindungen ersetzt worden sind.
Man kann die Peptide der Erfindung auch cyclisieren oder einen Desamino- oder Descarboxy-Rest an den Enden des Peptids einbauen, so daß es keine terminale Amino- oder Carboxylgruppe gibt, um die Anfälligkeit gegen Proteasen zu verringern oder die Konformation des Peptids einzugrenzen. C-terminale funktionelle Gruppen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung schließen Amid, Amidniederalkyl, Amiddi(niederalkyl), Niederalkoxy, Hydroxy und Carboxy und die Niederester-Derivate davon und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon ein.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Reste X₃ und X₈ unabhängig aus der Gruppe von C und Hoc gewählt. Somit können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer cyclisierten Form mit einer intramolekularen Disulfid-Bindung existieren. Alternativ dazu kann eine intermolekulare Disulfid-Bindung hergestellt werden, um eine dimere Verbindung zu ergeben. Diese intramolekularen oder intermolekularen Disulfid-Derivate können schematisch wie nachstehend gezeigt repräsentiert werden.
worin m und n unabhängig 1 oder 2 sind.
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung sehen Analoge dieser Disulfid-Derivate vor, in welchen einer der Schwefel durch eine CH₂-Gruppe oder ein anderes Isoster für Schwefel ersetzt worden ist. Diese Analoge können aus den Verbindungen der vorliegenden Erfindung, worin entweder X₃ oder X₈ gleich C oder Hoc ist, und das andere α-Amino-γ-buttersäure ist, durch eine intramolekulare oder intermolekulare Umlagerung unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie nachstehend gezeigt, hergestellt werden:
worin p gleich 1 oder 2 ist. Der Fachmann wird leicht einschätzen, daß diese Verdrängung bzw. Umlagerung auch unter Verwendung anderer Homologe von α-Amino-γ-buttersäure und Homocystein stattfinden kann.
Zusätzlich zu den vorstehenden Cyclisierungsstrategien, können andere Nicht-Disulfid-Peptid-Cyclisierungs-Strategien angewandt werden. Derartige alternativen Cyclisierungsstrategien schließen beispielsweise Amid-Cyclisierungs-Strategien sowie Cyclisierungs-Strategien, welche die Bildung von Thioether-Bindungen beinhalten, ein. Somit können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer cyclisierten Form mit entweder einer intramolekularen Amid-Bindung oder einer intramolekularen Thioether-Bindung existieren. Um die Durchführbarkeit der Amid-Cyclisierungs-Strategie zu veranschaulichen, wurde ein Peptid, basierend auf ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg, synthetisiert, worin das erste Cystein mit Lysin ersetzt wurde, das zweite Cystein mit Glutaminsäure ersetzt wurde, und ein cyclisches Monomer durch eine Amidbindung zwischen den Seitenketten dieser zwei Reste gebildet wurde. Um die Durchführbarkeit der Thioether-Cyclisierungsstrategie zu veranschaulichen wurde weiterhin ein Peptid, basierend auf ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg synthetisiert, worin das erste Cystein mit Lysin ersetzt war und ein cyclisches Monomer durch eine Thioetherbindung zwischen den Seitenketten des Lysin-Rests und des C-terminalen Cysteins gebildet wurde. Somit können, zusätzlich zu Disulfid-Cyclisierungsstrategien, Amid-Cyclisierungsstrategien und Thioether-Cyclisierungsstrategien beide leicht angewandt werden, um die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu cyclisieren.
Alternativ dazu kann der Amino-Terminus des Peptids mit einer alpha-substituierten Essigsäure verkappt werden, worin der alpha-Substituent eine Abgangsgruppe ist, wie einer α-Halogenessigsäure, z. B. α-Chloressigsäure, α-Bromessigsäure oder α-Iodessigsäure. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, worin X₃ gleich C oder Hoc ist, können durch Verdrängung der Abgangsgruppe durch den Schwefel des X₃-Restes cyclisiert werden; siehe z. B. Barker et al. (1992), J. Med. Chem. 35: 2040–2048, und or et al. (1991), J. Org. Chem. 56: 3146–3149, von denen jedes hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Die Verbindungen der Erfindung sind in vitro nützlich als einzigartige Werkzeuge zum Verstehen der biologischen Rolle von EPO, einschließlich der Auswertung der vielen Faktoren, welche angenommenermaßen die Herstellung von EPO sowie die Bindung von EPO an den EPO-R (z. B. den Mechanismus der EPO-Signaltransduktion/Rezeptoraktivierung) beeinflussen, und davon beeinflußt werden. Die vorliegenden Verbindungen sind ebenfalls nützlich in der Entwicklung anderer Verbindungen, welche an den EPO-R binden, weil die vorliegenden Verbindungen wichtige Struktur-Aktivität-Beziehung(SAR)-Informationen liefern, welche diese Entwicklung erleichtern.
Darüber hinaus können, basierend auf ihrer Fähigkeit, an den EPO-Rezeptor zu binden, die Peptide der vorliegenden Erfindung als Reagenzien zum Nachweis von EPO-Rezeptoren auf lebenden Zellen, fixierten Zellen, in biologischen Fluiden, in Gewebehomogenaten, in gereinigten, natürlichen biologischen Materialien etc. verwendet werden. Zum Beispiel kann man durch Markieren solcher Peptide Zellen, welche EPO-R auf ihren Oberflächen aufweisen, identifizieren. Basierend auf ihrer Fähigkeit, an den EPO-Rezeptor zu binden, können die Peptide der vorliegenden Erfindung darüber hinaus bei in situ-Färbung, FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung), Western-Blots, ELISA (Enzyme-Linked Immunoadsorptive Assay) etc. verwendet werden. Basierend auf ihrer Fähigkeit, an den EPO-Rezeptor zu binden, können die Peptide der vorliegenden Erfindung weiterhin bei der Rezeptor-Aufreinigung oder bei der Reinigung von Zellen, welche EPO-Rezeptoren auf der Zelloberfläche (oder innerhalb permeabilisierter Zellen) exprimieren, verwendet werden.
Die Verbindungen der Erfindung können auch als kommerzielle Forschungsreagenzien für verschiedene medizinische Forschungs- und Diagnose-Anwendungen verwendet werden. Derartige Anwendungen können, ohne darauf eingeschränkt zu sein, einschließen: (1) Verwendung als Kalibrationsstandard zur Quantifizierung der Aktivitäten von Kandidaten-EPO-Agonisten in einer Vielzahl von funktionellen Assays; (2) Verwendung als Blockierungsreagenzien bei der statistischen Peptid-Durchrasterung bzw. -Screening, d. h. bei der Suche nach neuen Familien von EPO-Rezeptor-Peptid-Liganden können die Peptide verwendet werden, um die Gewinnung der vorliegend beanspruchten EPO-Peptide zu blockieren; (3) Verwendung in der Co-Kristallisation mit EPO-Rezeptor, d. h. die Peptide der vorliegenden Erfindung werden die Bildung von Kristallen, gebunden an den EPO-Rezeptor, erlauben, was die Bestimmung der Rezeptor/Peptid-Struktur-Röntgenkristallographie ermöglicht; (4) Verwendung zur Messung der Kapazität von Erythrozyten-Vorläuferzellen, zu differenzieren und somit die Induktion von Globin-Synthese und Erhöhungen in der Synthese des Häm-Komplexes und in der Anzahl von Ferritin-Rezeptoren zu stimulieren; (5) Verwendung zur Aufrechterhaltung der Proliferation und des Wachstums von EPO-abhängigen Zellinien, wie den Zellinien FDCP-1-mEPO-R und TF-1; und (6) weitere Forschungs- und Diagnose-Anwendungen, worin der EPO-Rezeptor vorzugsweise aktiviert wird oder eine derartige Aktivierung zweckmäßigerweise gegen eine bekannte Menge eines EPO-Agonisten kalibriert wird, und dergleichen.
Die Verbindungen der Erfindung können auch an warmblütige Tiere, einschließlich Menschen, verabreicht werden, um die Bindung von EPO an den EPO-R in vivo zu simulieren. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung Verfahren zur therapeutischen Behandlung von mit einem Mangel an EPO assoziierten Störungen bzw. Krankheiten, welche das Verabreichen einer Verbindung der Erfindung in ausreichenden Mengen zur Stimulierung des EPO-R und somit zur Linderung der mit einem Mangel an EPO assoziierten Symptome in vivo umfassen. Beispielsweise werden die Verbindungen dieser Erfindung in der Behandlung von Nierenversagen/Dialyse im Endstadium; mit AIDS assoziierter Anämie, mit chronischen Entzündungskrankheiten (beispielsweise rheumatoider Arthritis und chronische Darmentzündung) assoziierter Anämie, Autoimmunkrankheit und bösartigen Erkrankungen; und zur Erhöhung der Anzahl roter Blutkörperchen eines Patienten vor einer Operation, Anwendung finden.
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung sehen die Verabreichung der Verbindungen der Erfindung für die Behandlung von Erkrankungen vor, welche nicht durch geringe oder mangelnde rote Blutkörperchen gekennzeichnet sind, zum Beispiel als eine Vorbehandlung vor Transfusionen. Weiterhin kann die Verabreichung der Verbindungen dieser Erfindung zu einer Verringerung der Blutungszeit führen und wird daher Anwendung in der Verabreichung an Patienten vor einer Operation oder für Befunde, bei welchen das Auftreten einer Blutung erwartet wird, finden. Darüber hinaus werden die Verbindungen dieser Erfindung Anwendung in der Aktivierung von Megakaryozyten finden.
Da EPO gezeigtermaßen einen mitogenen und chemotaktischen Effekt auf vaskuläre Endothelzellen sowie einen Effekt auf zentrale cholinerge Neuronen (siehe z. B. Amagnostou et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5978–5982, und Konishi et al. (1993) Brain Res. 609: 29–35) aufweist, werden die Verbindungen dieser Erfindung auch für die Behandlung einer Vielzahl von Gefäßerkrankungen, wie bei der Förderung der Wundheilung, dem Wachstum von kollateralen Koronarblutgefäßen (wie denjenigen, welche nach einem myokardialen Infarkt auftreten können), Trauma und einer Gefäßverpflanzungs-Nachbehandlung, und einer Vielzahl von neurologischen Störungen, welche allgemein durch niedrige absolute Spiegel von Acetylcholin oder niedrige relative Spiegel von Acetylcholin im Vergleich zu anderen neuroaktiven Substanzen, z. B. Neurotransmittern, gekennzeichnet sind, Anwendung finden.
Folglich schließt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen ein, umfassend als aktiven Bestandteil mindestens eines der Peptide oder anderen Verbindungen der Erfindung in Assoziation mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel. Die Verbindungen dieser Erfindung können durch orale, parenterale (intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse (iv) oder subkutane Injektion), transdermale (entweder passiv oder unter Verwendung von Iontophorese oder Elektroporation), transmukosale (nasale, vaginale, rektale oder sublinguale) Verabreichungswege oder unter Verwendung von biologisch erodierbaren Einpflanzungen bzw. Inserts verabreicht werden und können in Dosierungsformen formuliert werden, welche für jeden Verabreichungsweg angemessen sind.
Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate ein. In derartigen festen Dosierungsformen ist die aktive Verbindung mit mindestens einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Saccharose, Lactose oder Stärke, vermischt. Derartige Dosierungsformen können, wie es die normale Praxis ist, zusätzliche Substanzen umfassen, welche von inerten Verdünnungsmitteln verschieden sind, z. B. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Pufferungsmittel umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit enterischen Beschichtungen hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung schließen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups ein, wobei die Elixiere inerte Verdünnungsmittel, welche üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, wie Wasser, enthalten. Neben derartigen inerten Verdünnungsmitteln können Zusammensetzungen auch Zusatzstoffe, wie Benetzungsmittel, Emulgier- und Suspendiermittel und Süßstoffe, Geschmacks- und Duftstoffmittel, einschließen.
Präparationen gemäß dieser Erfindung für parenterale Verabreichung schließen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspension oder Emulsionen ein. Beispiele von nicht-wäßrigen Lösungsmittel oder Vehikeln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und Maisöl, Gelatine, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Derartige Dosierungsformen können auch Zusatzstoffe enthalten, wie Konservierungs-, Benetzungs-, Emulgier- und Dispergiermittel. Sie können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterienzurückhaltenden Filter, durch Einbringung von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzungen, durch Bestrahlung der Zusammensetzungen oder durch Erwärmung der Zusammensetzungen sterilisiert werden. Sie können auch unter Verwendung von sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium, unmittelbar vor der Anwendung, hergestellt werden.
Zusammensetzungen zur rektalen oder vaginalen Verabreichung sind vorzugsweise Suppositorien, welche zusätzlich zu der aktiven Substanz Exzipienten bzw. Trägerstoffe, wie Kakaobutter oder ein Suppositoriumswachs enthalten können. Zusammensetzungen zur nasalen oder sublingualen Verabreichung werden ebenfalls mit im Fachgebiet gut bekannten Standard-Exzipienten hergestellt.
Die Dosierung des aktiven Bestandteils in den Zusammensetzungen dieser Erfindung kann variiert werden; es ist jedoch notwendig, daß die Menge des aktiven Bestandteils derartig ist, daß eine geeignete Dosierungsform erhalten wird. Die gewählte Dosierung hängt von dem gewünschten therapeutischen Effekt, von dem Verabreichungsweg und von der gewünschten Dauer der Behandlung ab. Im allgemeinen werden Dosierungsspiegel von zwischen 0,001 bis 10 mg/kg Körpergewicht täglich an Säuger verabreicht.
Wie aus der obenstehenden Beschreibung abgeschätzt werden kann, besitzt die vorliegende Erfindung eine große Vielzahl von Anwendungen. Folglich werden die folgenden Beispiele zur Veranschaulichung und nicht auf dem Wege der Einschränkung angeboten.
Beispiel 1
Festphasen-Peptidsynthese
Verschiedene Peptide der Erfindung wurden unter Anwendung der Merrifield-Festphasen-Synthesetechniken (siehe Stewart, J. M., und Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage (Pierce Chemical, Rockford, IL, 1984)) auf einer automatischen Milligen/Biosearch 9600-Vorrichtung synthetisiert. Das verwendet Harz war PAL (Milligen/Biosearch), welches vernetztes Polystyrol mit 5-(4'-Fmoc-Aminomethyl-3,5'-dimethoxyphenoxy)valeriansäure als Linker ist. Die Verwendung von PAL-Harz führt zu einer Carboxy-terminalen Amid-Funktion nach Abspaltung des Peptids von dem Harz. Ein primärer Amin-Schutz auf Aminosäuren wurde mit F-moc erzielt, und die Seitenketten-Schutzgruppen waren t-Buty1 für Serin- und Tyrosin-Hydroxyle, Trityl für Glutamin-Amide und Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchromansulfonat) für die Arginin-Guanidinogruppe. Jede Kopplung wurde entweder eine oder zwei Stunden lang mit BOP (Benzotriazolyl-N-oxtrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat) und HOBt (1-Hydroxybenztriazol) durchgeführt.
In der Synthese von Peptiden mit einem amidierten Carboxy-Terminus wurde das vollständig zusammengebaute Peptid mit einer Mischung aus 90% Trifluoressigsäure, 5% Ethandithiol und 5% Wasser, anfänglich bei 4°C und schrittweise über 1,5 Stunden ansteigend auf Raumtemperatur, abgespalten. Das entschützte Produkt wurde aus dem Harz filtriert und mit Diethylether gefällt. Nach gründlichem Trocknen wurde das Produkt durch C18-Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einem Gradienten von Acetonitril/Wasser in 0,1% Trifluoressigsäure gereinigt.
Beispiel 2
Bioassays
A. FDCP-1/mEPO-R
Die FDCP-1/mEPO-R-Zellen (105) wurden in Gegenwart von Wachstumsfaktoren (2,5 nm EPO) zu halbstationärer Dichte herangezogen. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und dann 24 Stunden lang in Vollmedien ohne Wachstumsfaktoren ausgezehrt bzw. ausgehungert.
Die Zellebensfähigkeit wurde durch Typanblau-Färbung bestimmt. Stammlösungen in Vollmedium ohne Wachstumsfaktoren wurden angefertigt, um die gewünschte Zellanzahl pro 50 μl zu ergeben. Die zu testenden Verbindungen wurden 2-fach in einer 96-Vertiefungs-Gewebekulturplatte verdünnt (letztendlich 50 μl pro Vertiefung).
Zellen (50 μl pro Vertiefung) wurden in jede Vertiefung gegeben und 24–48 Stunden lang inkubiert (wenn die Negativkontrollen sterben sollten). Die Zellproliferation wurde durch einen MTT-Assay bestimmt.
B. TF-1
Das in Kitamura et al. (Blood 73: 375–380 (1989), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist) dargestellte Vorgehen, betreffend die Zellinie TF-1 mit einer Wachstumsabhängigkeit von EPO, wurde durchgeführt, um die Aktivitäten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung als EPO-Agonisten zu zeigen. Repräsentative Ergebnisse sind in der 8 gezeigt. Die 8 stellt die Effekte von EPO und des Peptids VGNYMCHFGPITWVCRPGGG auf die zelluläre Proliferation der Zellinie TF-1 stellt dar.
C. Milzzell-Proliferation
Das in Krystal (Exp. Hematol. 11: 649–660 (1983), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist) dargestellte Vorgehen für einen Mikroassay, basierend auf 3H-Thymidin-Einbau in Milzzellen, wurde gleichfalls angewandt, um die Fähigkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, als EPO-Agonisten zu dienen, zu bestimmen. Kurz gesagt, erhielten B6C3F₁-Mäuse zwei Tage lang täglich eine Injektion mit Phenylhydrazin (60 mg/kg). Am dritten Tag wurden Milzzellen entnommen, und ihre Fähigkeit, über 24 Stunden zu proliferieren, wurde unter Verwendung eines MTT-Assays ermittelt. Photographien, welche die Proliferation von repräsentativen Populationen von Milzzellen zeigen, sind in den 9A (Kontrolle), 9B (Behandlung mit 500 pM EPO) und 9C (Behandlung mit 25 μm GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG) bei 200-facher Vergrößerung gezeigt.
D. Zelluläre Proliferation: Peptid-abhängiges Wackstum der EPO-responsiven Zellinie FDC-P1/ER
1. Materialien und Methoden
a. Probenherstellung: Peptide wurden in DMSO als eine 1 × 10^–2 M Stammlösung resuspendiert, und es wurde eine Verdünnungsreihe in 10fach-Zuwächsen erstellt, um die folgenden 100X-Lösungen zu erzeugen:
1 × 10^–3 1 × 10^–4 1 × 10^–5 1 × 10^–6 1 × 10^–7 1 × 10^–8
2 μl jeder Stammverdünnung wurden zu einer Zellvertiefung, wie nachstehend beschrieben, in einem Gesamtvolumen von 200 μl zugesetzt, um Endkonzentrationen wie folgend herzustellen:
1 × 10^–5 l× 10^–6 1 × 10^–7 1 × 10^–8 1 × 10^–9 1 × 10^–10
b. Zellproliferations-Assay:
i. Zellquelle: FDC-P1/ER (Dexter et al., J. Exp. Med. (1980) 152; 1036–1047, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist) ist eine gut charakterisierte, nicht-transformierte Maus-Knochenmark-abgeleitete Zellinie, in welche der Erythropoietin-Rezeptor stabil transfiziert worden ist. Die Zellen zeigen eine EPO-abhängige Proliferation.
c. Experimentelles Protokoll: Zellen, welche in RPMI 1640/10% fötales Rinderserum/-Antibiotika und 10 U/ml Erythropoietin gehalten wurden, werden zur stationären Phase herangezogen. Die Zellen werden geerntet und in frischem Medium ohne Wachstumsfaktor (Erythropoietin) 24 h lang resuspendiert. Die Zellen werden gezählt und bei einer Konzentration von 800 000 Zellen/ml resuspendiert. Ungefähr 40 000 Zellen (50 u) werden in jede Vertiefung einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte gegeben. Peptid wird zu jeder Vertiefung in dreifache Ausfertigung zugesetzt. Eine Standard-Dosis-Antwort-Bestimmung wird mit jeder Reihe von Peptiden durchgeführt. Nach einer 42 Stunden langen Inkubation (≈ 2 Verdopplungen) wird jede Vertiefung mit 1 μCi/Vertiefung Thymidin gepulst. Die Zellen werden weitere sechs Stunden inkubiert, nach welcher Zeit die Zellen abgeerntet und gezählt werden, um den Thymidin-Einbau als Indikator der Zellproliferation zu ermitteln.
d. Ergebnisse: Peptide werden sowohl auf der Erythropoietin-Rezeptor-Zellinie als auch der parentalen Nicht-Rezeptor-tragenden Zellinie ausgewertet. In den meisten Fällen ist das Peptid auf einer Zellinie mit trunkiertem humanen Erythropoietin-Rezeptor ausgewertet worden. Die Ergebnisse werden als die zum Erhalten der Hälfte der mit rekombinantem Erythropoietin erhaltenen Maximalaktivität notwendige Menge an Peptid ausgedrückt. Repräsentative Ergebnisse sind in tabellarischer Form mit den relativen Bindungsdaten berichtet (siehe Tabellen 17–22, nachstehend).
E. Tyrosinphosporylierung: Peptid-induzierte Tyrosinphosphorylierung von Erythropoietin-Rezeptor und intrazellulären Proteinen.
1. Materialien und Methode
a. Probenherstellung: Peptide wurden in DMSO resuspendiert, um ein Konzentrat von 1 × 10^–2 M zu erhalten.
b. Experimentelles Protokoll: FDC-P1/muER-Zellen, welche in RPMI 1640/10% fötales Rinderserum/Antibiotika und 10 U/ml Erythropoietin gehalten wurden, werden zur stationären Phase herangezogen. Die Zellen werden abgeerntet und 24 Stunden lang in frischem Medium ohne Wachstumsfaktor (Erythropoietin) resuspendiert. Die Zellen werden gezählt und bei einer Konzentration von 500 000 Zellen/ml resuspendiert. Ein Milliliter Zellen (500 000) wird in ein Eppendorf-Röhrchen gebracht. 1 μl einer 1 × 10^–3 Peptid-Lösung wird zu den Zellen gegeben (Endkonzentration 1 × 10^–5 M) und 10 Minuten lang bei 37°C inkubieren gelassen. Eine Erythropoietin-Kontrolle (Endkonzentration 10 U/ml) wurde mit jedem Assay laufen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 14 000 U/min 4°C, gesammelt. Die Zellen werden in 100 μl SDS-Lysispuffer resuspendiert und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Das Gel wird auf Nitrocellulose überführt und mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Upstate Biuotechnology Incorporated), verdünnt 1 : 1000, 1 Stunde lang sondiert. Die Membran wird mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit einem Peroxidase-markierten Anti-Maus-Antikörper erneut sondiert. Reaktive Proteine werden unter Verwendung der ECL-Western-Blott-Reagenzien (Amersham) sichtbar gemacht.
c. Ergebnisse: Die Bindung von Erythropoietin an seinen Rezeptor in einer Erythropoietinresponsiven Zellinie induziert Typrosinphosphorylierung sowohl des Rezeptors als auch von zahlreichen intrazellulären Proteinen, einschließlich Shc-, vav- und JAK2-Kinase. Zahlreiche Peptide, einschließlich GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, sind analysiert worden, um ihre Fähigkeit, die mit Erythropoietin ersichtliche Antwort nachzuahmen, zu überprüfen. Aktive Peptide, wie beurteilt durch Bindungs- und Proliferationskriterien, rufen ein identisches Phosphorylierungsmuster, wie jenes von Eryhthropoietin, in Erythropoietin-responsiven Zellen hervor. Diese Ergebnisse implizieren, daß aktive Peptide ihre Antwort über einen Erythropoietin-induzierten Signaltransduktions-Weg hervorrufen. Die Ergebnisse sind tabellenartiger Form mit den Bindungs- und Proliferationsdaten berichtet (siehe Tabellen 17–22, nachstehend).
F. Zelluläre Antwortkinetiken: Peptid-induzierte Initiierung des Zellzyklus, gemessen durch DNA-Gehalt
1. Experimentelles Protokoll: FDCP-1/muER-Zellen wurden zur stationären Phase herangezogen ≈ 3,0 × 10⁶ Zellen/m. Die Zellen wurden abgesammelt und in frischem Medium in Abwesenheit von Faktor resuspendiert und weitere 18 h wachsen gelassen, an welchem Punkt die Zellen in drei Kolben von gleicher Zelldichte aufgeteilt wurden: –Faktor, +EPO und +Peptid. Die Zellen wurden dann entweder mit 10 U/ml EPO oder 10 μM Peptid stimuliert. 3 Millionen Zellen wurden an den folgenden Zeitpunkten abgesammelt: 0, 6, 8, 10 und 12 h (siehe 15). Die Zellen wurden zweimal in kaltem PBS gewaschen und durch Resuspendieren des Zellpellets in 100 μl kaltem PBS, gefolgt von 90 μl kaltem 70%igen Ethanol, fixiert. Die Zellen wurden mit 50 μg/ml Propidium-Iod gefärbt, und Fluoreszenz wurde auf einem FACS-'Scan Flow'-Zytometer gemessen. Der Prozentsatz an Zellen in jeder Phase wurde unter Anwendung des SOBR-Modell von CellFIT-Software von Becton Dickinson gemessen.
Erythropoietin (10 U/ml) und GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (1 × 10^–5 M) sind bei der Voranbringung von Zellen durch den Zellzyklus gleich effektiv. Zehn Stunden nach Induktion entweder durch Erythropoietin oder durch Peptid sind ungefähr 45% der Zellen in der S-Phase, im Vergleich zur Mediumkontrolle von 15%. Dieses Ergebnis legt nahe, daß das Peptid in der Lage ist, seine Antwort mit der gleichen Kinetik wie rekombinantes Erythropoietin hervorzurufen.
G. Kolonie Assay: Kolonieassay mit Maus-Knochenmark und humanem peripheren Blut
1. Materialien und Methoden
Eine 10 ml-Probe aus peripherem Blut wurde aus einem gesunden Individuum in einem standardmäßigen sterilen Heparin-"Vacutainer"-Röhrchen erhalten. Maus-Knochenmark wurde aus den Oberschenkelknochen von ungefähr 10 Mäusen pro Experiment erhalten. Alle Reagenzien wurden von Stem Cell Technologies Inc. (Vancouver, Kanada) erhalten.
a. Experimentelles Protokoll: Kurz gesagt, wurde eine Zählung von nukleierten bzw. kernhaltigen Zellen durchgeführt, um die Zahl und Konzentration von nukleierten Zellen in der Ursprungsprobe festzustellen. Im Falle von peripherem Blut wird die Probe einer Zentrifugation durch einen Ficoll-Hypaque (1,077 g pro ml)-Gradient bei 400 g während 30 Minuten bei Raumtemperatur unterzogen. Mononukleare Zellen an der Grenzfläche der Ficoll-Hypaque-Lösung werden vorsichtig entfernt und auf ein Gesamtvolumen von etwa 10 ml verdünnt. Die aus Maus-Knochenmark oder menschlichem peripheren Blut erhaltenen Zellen wurden durch Zentrifugation abgesammelt, und der Überstand wurde dekantiert. Die pelletierten Zellen wurden in frischem Medium resuspendiert und einer Absammlung wie obenstehend beschrieben unterzogen. Die gewaschenen Zellen wurden in Iscove's-Medium/2% fötalem Rinderserum auf die folgenden Konzentrationen für das Ausplattieren verdünnt:

Normales Mark: 1 × 10⁵ Lichtdichte an Zellen

Normales Blut: 4 × 10⁵ Lichtdichte an Zellen
Die Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers zu Methylcellulose zugesetzt. Peptide wurden bei den folgenden Endkonzentrationen getestet: 1 × 10^–6 und 1 × 10^–5 M in einem "Minus-EPO"-Methylcellulose-Medium. Äquivalente Zellzahlen wurden in "Komplett"-Methylcellulose-Medium ausplattiert, um die maximale Koloniebildung zu ermitteln. Eine Kontrollplatte wurde mit jedem Assay ohne EPO und Peptid ausgeführt, um die Hintergrund-Koloniebildung zu bestimmen. Die Kolonien wurden sowohl nach 10 Tagen als auch 18 Tagen Inkubation bewertet.
b. Ergebnisse: Wie in den Tabellen 13–15 gezeigt, war GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG in der Lage, die Koloniebildung, obwohl bei signifikant niedrigeren Spiegeln im Vergleich zu denjenigen, welche auf "Komplett"-Methylcellulose-Medium (Erythropoietin 3 U/ml) erhalten wurden, sowohl bei Maus-Knochenmark als auch humanem peripheren Blut zu fördern. Tabelle 13. Kolonie-Assay an einer humanen peripheren Blut-Probe (Spender: männlich) (Ansatz-Datum: 10.2.94)

CFU-E: Kolonie-bildende Einheit – Erythroid (1-2 Cluster)
MBFU-E: Reife Burst- bzw. Sternform-ausbildende Einheit – Erythroid (3-8 Cluster)
PBRU-E: Primitiven Burst-ausbildende Einheit – Erythroid (9 oder mehr)
CFU-GM: Kolonie-bildende Einheit, Granulocytisch/Monocyt/Makrophage

Tabelle 14. Koloniebildende Zellzahlen (Maus-Knochenmark)
Tabelle 15: Koloniebildende Zellzahlen (Maus-Knochenmark)
H. Peptid-induzierte Proliferation: Peptid-abhängiges Wachstum bei Zellinien, welche nicht gegenüber Erythropoietin responsiv sind
a. Experimentelles Protokoll: Peptide wurden getestet, wie beschrieben in Abschnitt D, siehe oben. Ein Wachstumskurve wurde an jeder Zellinie aufgestellt unter Verwendung des relevanten Mitogens/Wachstumsfaktors für jede Zellinie, um das Wachstumspotential zu bestimmen.
b. Ergebnisse: Wie in der Tabelle 16 gezeigt, war GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG nicht in der Lage, eine Wachstumsantwort bei Nicht-Erythropoietin-responsiven Zellinien, einschließlich sowohl hämatopoietischen als auch nicht-hämatopoietischen Zellinien, zu stimulieren.
Tabelle 16: Zellproliferations-Assays mit 61233
I. Auf immobilisiertem EBP basierender [¹²⁵I] EPO-Kompetitions-Bindungsassay
Die extrazelluläre Domäne des humanen Erythropoietin-Rezeptors (EPO-Bindungsprotein, EBP) ist in E. coli exprimiert und überproduziert worden. Wie bei vielen anderen rekombinanten eukaryotischen Proteinen, die E. coli verwendet werden, erschien das Protein als ein unlösliches Produkt in Fermentierungen im Laboratoriumsmaßstab und wurde umgefaltet und gereinigt, um aktives Protein zu erhalten. Durch dieses Verfahren hergestelltes EBP enthält eine freie Sulfhydrylgruppe, welche modifiziert werden kann, ohne die Lösungsphasen-Bindung von Ligand zu bewirken. Um das EBP für Gleichgewichts-Bindungsanalyse und als Basis für einen Kompetitions-Bindungs-Assay zu immobilisieren, wurde diese Beobachtung für die kovalente Anheftung von EBP an Agaroseperlen ausgeweitet. Die Iodacetyl-Aktivierungschemie von Sufolink-Perlen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ist spezifisch für freie Thiole und gewährt, daß die Bindung nicht ohne weiteres reversibel bzw. umkehrbar ist. EBP-Sulfolink-Perlen wurden wie folgt hergestellt: SulfoLink-Gel-Suspension (10 ml) wurde mit Kopplungspuffer (40 ml: 50 mM Tris, pH 8,3, 5 mM EDTA) gemischt, und das Gel wurde sich absetzen gelassen. Der Überstand wurde entfernt und das zu bindende EBP (0,3–1 mg/ml in Kopplungspuffer) wurde direkt zu den gewaschenen Perlen zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang sanft geschüttelt, und die Perlen wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Der Überstand wurde entfernt und zurückbehalten, und die Perlen wurden zweimal mit 20 ml Kopplungspuffer gewaschen. Die Waschungen wurden ebenfalls gewonnen. Die Perlen wurden dann mit 20 ml 0,05 M Cystein 30 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt, um nicht-gebundene Stellen zu blockieren. Schließlich wurden die Perlen mit 50 ml 1 M NaCl, dann mit 30 ml PBS gewaschen und in 20 ml PBS resuspendiert und bei 4°C zur späteren Verwendung aufbewahrt. Die Menge an EBP, welche kovalent an die Perlen gebunden war, wurde durch Vergleichen des OD₂₈₀ der ursprünglichen EBP-Lösung zu dem Gesamt-OD₂₈₀, welches in dem Reaktionsüberstand und den zwei 20 ml-Waschungen gewonnen wurde, bestimmt. Typischerweise bleiben 40–60% des eingesetzten EBP mit den Perlen assoziiert.
Bindungsassays wurden durch die Zugabe von EBP-Perlen (50 μl) zu einzelnen Reaktionsröhrchen iniziiert. Die Gesamtbindung wurde in Röhrchen, enthaltend 0,3–30 nM ¹²⁵I-EPO (NEN Research Products, Boston MA, 100 μCi/ug), gemessen. Zur Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung wurde nicht-markiertes EPO bei einem Spiegel in 1000-fachem Überschuß über die entsprechende [¹²⁵I]-EPO-Konzentration zugesetzt. Jedes Reaktionsvolumen wurde mit Bindungspuffer (PBS/0,2% BSA) auf 500 μl gebracht. Die Röhrchen wurden fünf Stunden lang (eine Zeitdauer, welche experimentell als angemessen für die Einrichtung eines Gleichgewichts bestimmt wurde) bei Raumtemperatur unter sanften Schütteln inkubiert. Nach fünf Stunden wurde jede Reaktionsmischung durch eine 1 ml-Pipettenspitze hindurchgeleitet, welche mit Glaswolle gestopft war. Die Röhrchen wurden mit 1 ml Waschpuffer (PBS/5% BSA) gewaschen, und dieses Volumen sowie zwei zusätzliche 1 ml-Waschungen wurden durch die Pipettenspitze geleitet und für eine Bestimmung der freien EPO-Konzentration aufgefangen. Die Gleichgewichts-Bindungsanalyse der spezifischen Assoziation von [¹²⁵I]-EPO mit auf diesen Agaroseperlen immobilisiertem EBP zeigt einen Kd von 5 nM ± 2, basierend auf einer linearen Transformation (Scatchard) der Bindungs-Isothermen (siehe 16).
Kompetitive Bindungsanalyse-Assays von Kandidaten-Peptiden wurden wie nachstehend skizziert durchgeführt. Einzelne Peptide wurden in DMSO gelöst, um eine Stammlösung von 1 mM herzustellen. Alle Reaktionsröhrchen (in zweifacher Ausfertigung) enthielten 50 μl EBP-Perlen, 0,5 nM [¹²⁵I]EPO und 0–500 μM Peptid in insgesamt 500 μl Bindungspuffer. Die Endkonzentration an DMSO wurde in allen Assay-Röhrchen auf 2,5% eingestellt, ein Wert ohne nachweisbaren Effekt, da eine Untersuchung der Empfindlichkeit des Assays gegenüber DMSO zeigte, daß Konzentrationen von bis zu 25% DMSO (V/V) keinen nachteiligen Effekt auf die Bindung hatten. Die nicht-spezifische Bindung wurde in jedem individuellem Assay durch Einschluß von Röhrchen, enthaltend einen großen Überschuß an nicht-markiertem EPO (1000 nM), gemessen. Anfängliche Assay-Punkte ohne zugesetztes Peptid wurden in jedem Assay eingeschlossen, um die Gesamtbindung zu bestimmen. Bindungsmischungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubiert. Die Perlen wurden dann unter Verwendung von Micro-Säulen (Isolab, Inc., Akron, Ohio) aufgefangen und mit 3 ml Waschpuffer gewaschen. Die Säulen, welche die gewaschenen Perlen enthielten, wurden in 12 × 75 mm-Glasröhrchen eingebracht, und die gebundenen Radioaktivitätsspiegel wurden unter Verwendung eines Gamma-Zählers bestimmt. Die Menge an gebundenem [¹²⁵I]EPO wurde als ein Prozentsatz der Kontrollbindung (insgesamt = 100%) ausgedrückt und gegen die Peptidkonzentration nach Korrektur hinsichtlich nicht-spezifischer Bindung aufgetragen. Der IC50 war als die Peptidkonzentration definiert, welche die Bindung von [¹²⁵I]-EPO an die EBP-Perlen um 50% verringerte. Alle Daten sind im Verhältnis zu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ61233) berichtet, welches einen IC₅₀ von 5 μM zeigte (siehe Tabellen 17–22, nachstehend).
Tabelle 17: GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Substitutions-Reihe
Tabelle 18: GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Trunkierungs-Reihe
Tabelle 19. Sequenz Analog-Peptide
Tabelle 20: Position #4-Substitutions-Reihe
Tabelle 21. Position #17-Substitutionsreihe
Tabelle 22: Differentielle Aktivitätsreihe auf Basis von GGTYSCHFGPLTWVCKPOGG
J. Polyzythämischer exhypoxischer Maus-Bioassay
Weibliche BDF1-Mäuse (18–20 g) werden (in hypobarischen Kammern) einem Konditionierungszyklus von 18 h bei 0,40 ± 0,02 atm. und 6 h bei Umgebungsdruck während einer Dauer von 14 Tagen unterzogen.
Die Mäuse werden 72 h lang bei Umgebungsdruck vor der Verabreichung von r-HuEPO oder Testproben gehalten. Testproben oder r-HuEPO-Standard werden zur Injektion in konditionierte Mäuse verdünnt. Das Vehikel besteht aus: PBS, enthaltend 0,1% BSA (w/v). Für jede Verdünnung werden 0,5 ml subkutan in jede von 10 Mäusen verabreicht. ⁵⁹Fe wird 48 Stunden später verabreicht. Blutproben werden 48 Stunden im Anschluß an die Verabreichung von ⁵⁹Fe entnommen. Hämatokrit- und Radioaktivitätsmessungen werden für jede Probe bestimmt. Dosisbereiche und Ergebnisse (zwei verschiedene Assays) sind in der Tabelle 23 und in den 17A–17C nachstehend dargestellt.
Tabelle 23.
Darüber hinaus wurden unter Anwendung des vorstehenden polyzythämischen exhypoxischen Maus-Bioassays TIAQYICYMGPETWECRPSPKA und ein dimeres Peptid-Analog von GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, enthaltend zwei Disulfid-Bindungen, (AF12080) getestet. Die Ergebnisse des polyzythämischen exhypoxischen Maus-Bioassays sind in den 18A–18B dargestellt. Darüber hinaus stellt die nachstehende Tabelle 24 die ungefähre Äquivalenz von EPO und verschiedenen mimetischen Peptiden dar.
Tabelle 24.
K. Reticulozyten Assay
Normale unbehandelte weibliche BDF1-Mäuse erhalten an drei aufeinanderfolgenden Tagen ein Dosis von entweder EPO oder einer experimentellen Verbindung (0,5 ml. S.Q.). Das Vehikel: PBS, 10% PEG 8000, 0,25% BSA, wobei DMSO zugesetzt wird. Am Tag drei erhalten die Mäuse ebenfalls eine Dosis (0,1 ml, I.P.) von Eisen-Dextran (100 mg/ml). Am Tag fünf werden die Mäuse mit CO₂ betäubt, und Blut wird durch Herzpunktur entnommen. Die % Reticulozyten werden durch Thiazol-Orange-Färbung und Flußzytometer-Analyse ("reticcount"-Programm) bestimmt. Hämatokrit wird manuell bestimmt. Der Prozentsatz an korrigierten Reticulozyten wird unter Verwendung der folgenden Formel bestimmt: % RETIC(KORRIGIERT) –% RETIC_(BEOBACHTET) × Hct._{(INDIVIDUELL)}/Hct._(NORMAL).
Die unter Anwendung des vorstehenden Reticulozyten-Assays erhaltenen Ergebnisse sind in den 18A–18B und den 19A–19B dargestellt.
L. Kolonie Assay: Erythroid-Koloniebildung
1. Materialien und Methoden:
Humane nukleierte Knochenmarkzellen, erhalten von normalen Spendern, wurden in halbfester Methylcellulose ausplattiert (0,9% Methylcellulose, 30% fötales Rinderserum, 1% Rinderserumalbumin, 10^–4 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin). Kurz gesagt, werden die Zellen aufgefangen, und rote Zellen werden durch die Zugabe von gepuffertem Ammoniumchlorid lysiert. Die Zellen wurden in Medium, enthaltend 2% fötales Kälberserum, resuspendiert und bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Platte in zweifacher Ausfertigung ausplattiert. Erythroide und Granulozyten-Makrophagen(G-M)-Kolonien, welche nach 12 Tagen in Kultur gebildet wurden, wurden hinsichtlich Farbe und Morphologie bewertet. Eine Kontrollplatte wurde in die Untersuchung eingeschlossen, enthaltend rekombinante humane Wachstumsfaktoren IL-3, GM-CSF und SCF (3/GM/S), um die GM-Koloniebildung der Probe zu untersuchen.
2. Ergebnisse:
Aus den obenstehend dargestellten Daten ist ersichtlich, dass GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ 61233/AFFY 11157) in der Lage ist, die Erythroid-Koloniebildung in Abwesenheit von zusätzlichen Cytokinen zu fördern. Darüber hinaus zeigt das Peptid strikte Spezifität für die Erythroid-Abstammungslinie durch sein Unvermögen, eine Koloniebildung der GM-Abstammungslinie zu fördern.
Es versteht sich, dass die obenstehende Beschreibung als veranschaulichend und nicht als einschränkend beabsichtigt ist. Dem Fachmann auf dem Gebiet werden viele Ausführungsformen bei der Durchsicht der obenstehenden Beschreibung offensichtlich sein. Der Umfang der Erfindung sollte deshalb nicht unter Bezugnahme auf die obenstehende Beschreibung festgelegt werden, sondern sollte anstattdessem unter Bezugnahme auf die beiliegenden Patentansprüche, zusammen mit dem vollen Umfang an Äquivalenten, auf welche solche Ansprüche erhoben werden, bestimmt werden. Die Offenbarungen aller Fachartikel und Bezugsstellen, einschließlich Patentveröffentlichungen, sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen.

Claims

Ein Peptid mit einer Länge von 10 bis 40 Aminosäureresten, das an den Erythropoietin-Rezeptor bindet und eine Aminosäuresequenz X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈, gegebenenfalls cyclisiert oder dimerisiert, umfasst, wobei jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist, X₆ unabhängig aus einer der 20 genetisch-codierten L-Aminosäuren ausgewählt ist, X₃ gleich C ist; X₄ gleich R, N, L oder W ist; X₅ gleich, F oder I ist; X₇ gleich D, E, I, L oder V ist und X₈ gleich C ist.
Ein Peptid gemäß Anspruch 1, umfassend entweder: (a) eine Aminosäuresequenz YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈, worin jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist, wobei X₂ und X₆ jeweils unabhängig aus einer der 20 genetisch-codierten L-Aminosäuren ausgewählt ist; X₃ gleich C ist; X₄ gleich R, H, L oder W ist; X₅ gleich M, F oder I ist; X₇ gleich D, E, I, L oder V ist und X₈ gleich C ist; oder (b) eine Aminosäuresequenz X₁X₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈X₉X₁₀X₁₁, worin jede Aminosäure durch die Standard-Einbuchstaben-Abkürzung angegeben ist, wobei X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀ und X₁₁ jeweils unabhängig aus einer der 20 genetisch-codierten L-Aminosäuren ausgewählt ist, X₃ gleich C ist; X₄ gleich R, N, L oder W ist; X₅ gleich M, F oder I ist; X, gleich D, E, I, L oder V ist und X₈ gleich C ist.
Ein Peptid gemäß Anspruch 2 (b), worin X₄ gleich R oder H ist; X₅ gleich F oder M ist; X₆ gleich I, L, T, M, E oder V ist; X₇ gleich D oder V ist; X₉ gleich G, K, L, Q, R, S oder T ist und X₁₀ gleich A, G, P, R oder Y ist, bevorzugt worin X₁ gleich D, E, L, N, S, T oder V ist; X₂ gleich A, H, K, L, M, S oder T ist; X₄ gleich R oder N ist; X₉ gleich K, R, S oder T ist und X₁₀ gleich P ist.
Ein Peptid gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Ein Peptid gemäß Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz cyclisiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Ein Peptid gemäß Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz dimerisiert ist, wobei das Peptid die folgende Aminosäuresequenz umfasst:
Eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als Arzneimittel.
Die Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten mit einer Störung, die durch einen Erythropoietin-Mangel oder eine niedrige oder fehlerhafte rote Blutzellen-Population gekennzeichnet ist.
Eine Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das Arzneimittel zur Behandlung eines Patienten ist, der eine Störung aufweist, die Nierenversagen im Endstadium oder Dialyse; mit AIDS assoziierte Anämie, Autoimmunerkrankung oder bösartige Erkrankungen; beta-Thalassämie; zystische Fibrose; frühe Schwangerschaftsanämie; mit chronischen Entzündungserkrankungen assoziierte Anämie; Rückenmarkverletzung; akuter Blutverlust; Altern; und neoplastischen Krankheitsstadien, die mit abnormaler Erythropoiese einhergehen, ist.