MX2008011389A - Moleculas modificadas las cuales promueven hematopoyesis. - Google Patents

Moleculas modificadas las cuales promueven hematopoyesis.

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MX2008011389A
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Abstract

La invención se relaciona con péptidos miméticos de EPO modificados que tienen propiedades específicas.

Description

MOLECULAS MODIFICADAS LAS CUALES PROMUEVEN HEMATOPOYESIS DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con péptidos como moléculas de unión para el receptor de eritropoyetina, métodos para la preparación del mismo, medicamentos que contienen dichos péptidos y su uso en indicaciones seleccionadas, preferiblemente para el tratamiento de diversas formas de anemia y apoplejía. La hormona eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína constituida por 165 aminoácidos y que tiene cuatro sitios de glucosilación . Las cuatro cadenas laterales de carbohidratos complejos comprenden 40 por ciento de la totalidad del peso molecular de aproximadamente 35 kD. Se forma EPO en los ríñones desde este lugar se desplaza al bazo y médula ósea en donde estimula la producción de eritrocitos. En renopatías crónicas la producción reducida de EPO resulta en anemia eritropénica . EPO recombinante , preparada por ingeniería genética se pueden tratar eficazmente las anemias. La EPO mejora la calidad de vida de los pacientes sometidos a diálisis. No solo la anemia renal sino también la anemia en recién nacidos prematuros, las anemias por inflamación y asociadas a tumor pueden mejorar con EPO recombinante. Por medio de EPO, se puede llevar a cabo una quimioterapia de alta dosificación con mayor éxito en pacientes con tumores. Igualmente, EPO mejora la recuperación de pacientes con cáncer si se administra junto con el ámbito de radioterapia. En el tratamiento con EPO existe el problema de que los regímenes de dosificación requeridos se basan en aplicaciones frecuentes o continuas intravenosas o subcutáneas debido a que la proteína se descompone relativamente rápido en el cuerpo. Por lo tanto, la evolución de moléculas derivadas a EPO recombinante avanza a una modificación selectiva de la glucoproteína, por ejemplo por glucosilación o pegilación adicionales con el fin de incrementar la estabilidad y por lo tanto el tiempo de semivida biológica. Otro tema importante relacionado con el tratamiento con EPO recombinante es el peligro de que los pacientes desarrollen anticuerpos a EPO recombinante durante el tratamiento. Esto se debe al hecho de que la EPO recombinante no es completamente idéntica a la EPO endógena. Una vez que se induce la formación de anticuerpos este puede generar anticuerpos que deterioran la actividad de eritropoyetina endógena también. Con frecuencia se producen incrementos en la dosificación de EPO recombinantes necesarios para el tratamiento. Especialmente si dichos anticuerpos deterioran la actividad de EPO endógeno, este efecto se puede interpretar como una enfermedad autoinmune inducida por tratamiento. Esto es especialmente indeseable, por ejemplo, en caso de pacientes con diálisis que experimentan transplante renal después de muchos años de tratamiento con EPO. Estos anticuerpos después pueden deteriorar la actividad de EPO endógena producida por el transplante y por lo tanto deterioran la actividad eritropoyética del órgano transplantado. Actualmente está sin respuesta la pregunta de si las modificaciones introducidas por EPO recombinante, con el fin de incrementar el tiempo de semivida biológico, agravarán o mejorarán este problema. De manera general, se esperará que modificaciones extensas y un tiempo de semivida más prolongado agraven esta propiedad probelmática . Una estrategia alternativa es la preparación de péptidos sintéticos a partir de aminoácidos que no compartan homología de secuencia o relación estructural con eritropoyetina . Se ha demostrado que los péptidos, no relacionados con la secuencia de EPO los cuales son significativamente más pequeños que la eritropoyetina, pueden actuar como agonistas ( righton et al., 1996). Los mismos autores han mostrado que dichos péptidos se pueden cortar y aún así se obtienen péptidos mínimos activos con longitudes de 10 aminoácidos. Los péptidos sintéticos que imitan la actividad de EPO se han sometido a su exposición por el documento abierto internacional WO 96/40749. Se describen péptidos miméticos de 10 a 40 aminoácidos de un consenso distinto que preferiblemente contiene dos prolinas en la posición denominada comúnmente como la posición 10 y 17, una de las cuales se considera esencial. El documento WO 01/38342 describe que estas prolinas se pueden combinar con naftilalanina . Hasta ahora, todos los agonistas basados en péptidos pequeños del receptor EPO han tenido una estructura que contiene por lo menos una prolina, con frecuencia dos residuos prolina en posiciones definidas, habitualmente numeradas en la posición 10 y 17, con referencia a su posición en el peptidomimético de eritropoyetina muy activo EMP1 (documento abierto al público internacional WO96/40749; Wrighton et al., 1996, Johnson et al, 1997 y 1998): GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG Estas prolinas se consideran indispensables para la eficacia de los péptidos. Para la prolina en la posición 17, se ha sostenido por interacciones con el receptor mientras que la prolina en la posición 10 se considera que es necesaria para el plegado correcto de la molécula (véase también Wrighton et al., 1996, 1997). El plegado correcto, soportado por las propiedades estereoquímicas específicas de prolina, habitualmente es una condición previa necesaria de actividad biológica. Generalmente, la prolina es un aminoácido formador de estructura el cual cumple si está involucrado - como en este caso - en la formación de estructuras de horquilla y giros beta. Debido a esta propiedad, por ejemplo, es un punto frecuente de ataque para endopeptidasa específica posprolina la cuales destruyen péptidos/proteínas que contienen prolina. Muchas hormonas peptídica endógenas (angiotensina I y II, urotensinas, tireoliberina, otras liberinas, etc.), son inactivadas por dicha separación posprolina "de un solo golpe". El tiempo de semivida de los péptidos miméticos de EPO que contienen prolina de esta manera se acorta por la actividad de estas enzimas, frecuentes y activas. Dichos péptidos cortos se pueden elaborar químicamente y no necesitan producción recombinante, la cual es mucho más difícil de controlar y obtención de productos con calidad e identidad definida. La producción química de péptidos de dicho tamaño pequeño también puede ser competitivo en términos de costos de producción. Además, la producción química también define la introducción de variaciones moleculares tales como glucosilación, pegilación y cualquier otra modificación definida, la cual puede tener una potencia conocida para incrementar la semivida biológica. No obstante, hasta ahora no ha habido aprobación de tratamiento alguno con los peptidomiméticos de EPO existentes. Además, existe la necesidad de incrementar la eficacia mimética de EPO de los peptidomiméticos de EPO con el fin de proporcionar moléculas suficientemente potentes para tratamiento. Los peptidomiméticos de EPO descritos en el estado de la técnica se pueden considerar como dominios de unión monoméricos que reconocen el sitio de unión de receptor eritropoyetina . No obstante, se ha resaltado por righton et al. ( righton 1997), que dos de estos dominios de unión generalmente son necesarios con el fin de homodimerizar el receptor EPO e inducir transducción de señal. De esta manera, una combinación de dos de estos peptidomiméticos EPO y por lo tanto los dominios de unión del receptor EPO en una molécula dimérica única incrementan considerablemente la actividad. Esto genera el resultado de que los péptidos con un solo dominio de unión muestran el mismo patrón cualitativo de actividad mientras que dos de los dominios de unión uniéndose muestran una DE50 (dosis de efectos 50%, una medida de actividad) mucho menor. La potencia de los peptidomiméticos de EPO monoméricos se pueden mejorar hasta 1000 veces por dimerización . Incluso algunos péptidos monoméricos inactivos se pueden convertir en agonistas por dimerización. Los péptidos que albergan dos dominios de unión se especifican como divalentes de péptidos miméticos. Se conocen diversas técnicas para dimerizar los monómeros. Los monómeros se pueden dimerizar, por ejemplo, por unión covalente a un enlazante. Un enlazante es una molécula de unión que genera una unión covalente entre las unidades polipeptidicas de la presente invención. Las unidades polipeptidicas se pueden combinar vía un enlazante de modo tal que mejora la unión al receptor EPO (Johnson et al. 1997; Wrighton et al). Se considera además que la multimerización de péptidos biotinilados monoméricos por interacción o covalente con una molécula portadora de proteina descrita por Wrighton et al., (Wrighton, 1997). También es posible utilizar un sistema biotina/estreptavidina, es decir, biotinando la aprte C terminal de los péptidos e incubación subsecuente de los péptidos biotinados con estreptavidina . De manera alternativa, se conoce la obtención de dimerización al formar una estructura dicetopiperazina . Este método conocido por las personas expertas en la técnica se describe detalladamente, por ejemplo, en Cavelier et al., (en: Peptides: The wave of the Futura, Michal Lebl and Richard A. Houghten (eds) ; American Peptide Society, 2001) . Otra manera alternativa de obtener dímeros peptídicos conocida de la técnica anterior es utilizar derivados de ácido dicarboxilico activados bifuncionales como precursores reactivos y en las porciones enlazantes siguientes, el cual reacciona con grupos amino en la parte N terminal y de esta manera forma el péptido dimérico final (Johnson et al, 1997). Los monómeros también se pueden dimerizar por unión covalente a un enlazante. Preferiblemente, el enlazante comprende NH-R-NH, en donde R es un alquileno inferior sustituido con un grupo funcional tal como un grupo carboxilo o un grupo amino que permite la unión a otra porción de molécula. En enlazante puede contener un residuo lisi.na o una amida lisina. Además, se puede utilizar como enlazante PEG. El enlazante puede ser una molécula que contenga dos ácidos carboxilicos y opcionalmente está sustituida en uno o más átomos con el grupo funcional tal como una amina capaz de unirse a una o más moléculas PEG. Una descripción detallada de las posibles etapas de oligomerización y dimerización de los péptidos como una porción enlazante también se proporciona en el documento WO 2004/101606. Se necesitan estrategias de dimerización alternativas para peptidomiméticos de EPO. Además, debe hacerse notar que EPO y los peptidomiméticos de EPO (monoméricos o diméricos) no solo son interesantes para propósitos terapéuticos humanos. Más allá de las aplicaciones humanas existe una necesidad grande de sustitutos EPO en el mercado del cuidado de la salud de los animales. A este respecto, es deseable proporcionar peptidomiméticos de EPO que muestren un patrón de actividad discriminador entre humanos y animales con el fin de evitar abuso. No obstante, esta es una tarea que constituye un reto dado que las secuencias de los receptores de EPO de diferentes animales (por ejemplo de ratón, rata, cerdo y perro) son muy similares al receptor EPO humano. Cuando se alinean los receptores EPO de las diferentes especies se vuelve evidente que las diferentes especies difieren solo en algunos aminoácidos. Esto implica una elevada homología estructural. Además, solo un porcentaje pequeño de estos residuos aminoácidos son relevantes para la unión de peptidomiméticos de EPO. Esto agrava el desarrollo de un peptidomimético de EPO que muestre niveles de actividad diferentes en los receptores de EPO tanto de humanos como de animales. Un objetivo de la presente invención es proporcionar péptidos sintéticos alternativos que muestren por lo menos partes esenciales de la actividad biológica de la EPO nativa y que de esta manera proporcionan un medio alternativo para estrategias terapéuticas eficaces. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar péptidos miméticos de EPO con una eficacia mejorada . Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar dimeros de péptidos miméticos de EPO por estrategia de dimerizacion alternativa. Además, un objetivo de la presente invención es proporcionar peptidomiméticos de EPO que muestren un patrón de actividad divergente en humanos y animales. Las soluciones de estos objetivos se delinean detalladamente en lo siguiente. De acuerdo con una primera modalidad de la invención se proporciona un péptido, especialmente uno capaz de unirse al receptor EPO, que comprende la siguiente secuencia de consenso de aminoácidos: X6X7X8X9X10 11X12 13 14 15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es un aminoácido como una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente, o A es ácido a-amino-Y-bromobutirico; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; Xio es un cambio no conservador de prolina; o X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único; X11 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; X13 , 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A. También comprendido por esta modalidad están péptidos seleccionados del grupo que consiste de fragmentos de funcionalidad equivalente, derivados o variantes de la frecuencia peptidica de consenso anterior, que tienen actividad mimética de EPO y que tienen un aminoácido en la posición Xio que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde X9 y Xi0 están sustituidos por un solo aminoácido . Las secuencias peptidicas de consenso descritas se pueden percibir como dominios de unión monoméricos para el receptor EPO. Como peptidomiméticos de EPO, son capaces de unión al receptor EPO. La longitud del péptido preferiblemente está entre diez a cuarenta o cincuenta o sesenta aminoácidos. En modalidades preferidas, el péptido de consenso muestra una longitud de por lo menos 10, 15, 18, 20 ó 25 aminoácidos. Por supuesto, el consenso se puede incrustar respectivamente para estar constituido por secuencias más largas. También se puede generar una longitud más larga al dimerizar dos unidades peptidicas monoméricas de la secuencia de consenso anterior (véase abajo) . Es muy sorprendente que los péptidos de acuerdo con la invención muestren actividades miméticas de EPO aunque una o, de acuerdo con algunas modalidades, incluso ambas prolinas de los peptidomiméticos de EPO conocidos de acuerdo con Wrighton y Johnson están sustituidos por otros aminoácidos naturales o no naturales. De hecho, los péptidos de acuerdo con la invención tienen una actividad comparable o incluso mejor que la de los péptidos que contienen prolina conocidos. No obstante, resulta notable que los aminoácidos que sustituyen a los residuos prolina no representan un cambio conservador, sino un cambio no conservador de prolina. Los ejemplos adecuados de dichos cambios no conservadores de prolina son aminoácidos en la posición 10 cargados positiva o negativamente. Preferiblemente se pueden utilizar para la sustitución aminoácidos cargados positivamente tales como aminoácidos básicos tales como, por ejemplo, aminoácidos proteinogénicos, K, R y H y especialmente K. El aminoácido no conservador utilizado para sustitución de la prolina en la posición 10 también puede ser un aminoácido no proteinogénico natural o no natural y preferiblemente es uno con una cadena lateral cargada positivamente. También están comprendidos los análogos respectivos de los aminoácidos mencionados. Los aminoácidos no proteinogénicos cargados positivamente que tienen una cadena lateral la cual está alargada en comparación con la lisina demostraron ser especialmente activos. Un ejemplo adecuado de dicho aminoácido alargado es homoarginina . De acuerdo con una modalidad, el péptido presenta un aminoácido cargado positivamente en la posición 10, excepto para el aminoácido natural arginina. De acuerdo con esta modalidad, la prolina 10 está sustituida por un aminoácido cargado positivamente que se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos proteinogénicos K o H y aminoácidos no proteinogénicos cargados positivamente, naturales o no naturales, con carga positiva tales como, por ejemplo, homoarginina. De acuerdo con la secuencia de consenso de la primera modalidad, X6 y 15 muestran aminoácidos con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente. Estos aminoácidos por lo tanto son capaces de formar una unidad de puente. De acuerdo con una modalidad, los aminoácidos en la posición ?ß y X15 se seleccionan de manera que son capaces de formar un puente intramolecular dentro del péptido al formar un enlace covalente entre si.
La formación de un puente intramolecular puede generar ciclización del péptido. Los ejemplos para unidades de puente adecuadas son el puente disulfuro y el puente diseleniuro. Los ejemplos adecuados de aminoácidos que muestran dichas funcionalidades formadoras de puente en sus cadenas laterales son, por ejemplo, cisteina y derivados de cisteina tales como homocisteina o selenocisteina pero también tiolisina. La formación de un puente diselenuro, por ejemplo entre dos residuos selenocisteina incluso tiene ventajas sobre un puente cisteina. Este, como un puente selenuro, es más estable es más estable en ambientes reductores. La conformación del péptido de esta manera se conserva incluso bajo condiciones difíciles. No obstante, resulta evidente que también los aminoácidos son adecuados en la posición X¾ y X15, mostrando una cadena lateral con una funcionalidad que permite la formación de enlaces covalentes diferentes tales como, por ejemplo, un enlace amida entre un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo los aminoácidos proteinogénicos K, H, R u ornitina, DAP o DAB) y un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo los aminoácidos proteinogénicos D o E) . Los ejemplos adicionales son puentes amida y tioéter .
Los péptidos que se encuentran bajo la secuencia de consenso de la primera modalidad de la presente invención se describen en la solicitud anterior y el solicitante PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959), la cual fue publicada después de las fechas de prioridad de la presente solicitud. En algunos países esta descripción en PCT/EP 2005/012075 puede constituir técnica anterior de acuerdo con la ley de patente respectiva. Únicamente en países en donde esto es aplicable y pueda cuestionar la patentabilidad, la secuencia de consenso descrita en lo anterior, por razones legales, no puede comprender secuencia que satisfagan la secuencia de consenso anterior que se muestran en PCT EP 2005 01 20 75. Esto también se puede aplicar a las siguientes secuencias de consenso o secuencias peptídicas: un péptido, especialmente uno que sea capaz de unión al receptor EPO que comprenda la siguiente secuencia de aminoácidos: X6 X8X9^10^11^12Xl3^14^15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es C, A, E, ácido a-amino-Y-bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; Xg es G o un cambio conservador de G; Xio es un cambio no conservador de prolina; o Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido único; Xn se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T o A; X13W, 1-nal, 2-nal, A o F; Xi4 es D, E, I, L o V; X15 es C, A, K, ácido -amino-Y-bromobutirico u homocisteina (hoc) ; con la condición de que cualquiera de X6 o Xi5 sea C o hoc; un péptido caracterizado por la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7X8 9X10 11X12X13 14 15 en donde cada aminoácido está indicado por la abreviatura de letra convencional o estándar, y X6 es C; X7 es R, H, L o W; X8 es M, F, I; Xg es G o un cambio conservador de G; Xio es un cambio no conservador de prolina; X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T; X13 es W; Xi4 es D, E, I, L o V; X15 es C; o en donde Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido . un péptido está caracterizado por siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7 8X9 10 11 12X13 14X15 en donde cada aminoácido está indicado por la abreviatura de letra estándar, y X6 es C; X7 es R, H, L o W; X8 es M, F, I o hsm (homoserinametiléter) ; Xg es G o un cambio conservador de G; Xio es un cambio no conservador de prolina; X11 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido; X12 es T; X13 es W; Xi4 es D, E, I, L o V, 1-nal ( 1-naftilalanina) o 2-nal (2-naftilalanina) X15 es C; - los péptidos descritos en el documento PCT/EP2005/012075 satisfacen el consenso anterior de la primera modalidad (véase la figura 21) . En donde la descripción publicada posteriormente mencionada antes de PCT/EP2005/012075 no resulta en un problema de patentabilidad, el consenso incluido en lo anterior y las secuencias peptidicas no necesitan ser excluidas del consenso amplio de la primera modalidad y por lo tanto están comprendidas por el consenso definido en lo anterior. Además, estos péptidos soportan la precisión del consenso mimético de EPO en general en la medida en que demuestran eficacia. De acuerdo con una segunda modalidad de la presente invención se proporciona un péptido el cual también muestra buenas propiedades miméticas de EPO. Este péptido comprende por lo menos 10 aminoácidos, es capaz de unión al receptor EPO y comprende un agonista y por lo tanto actividad mimética de EPO. El péptido comprende la siguiente secuencia de núcleo de aminoácidos: 9X10X11X12X13 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde Xg es G o un cambio conservador de G; Xio es un cambio no conservador de prolina; o X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único; X11 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; X13 es naftilalanina También comprendidos por esta modalidad están los péptidos que se seleccionan del grupo que consiste de fragmentos de funcionalidad equivalente, derivados y variantes de la secuencia de consenso peptidica anterior que tienen actividad mimética de EPO y que tiene un aminoácido en Xio que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único y los cuales muestran una naftilalanina en la posición Xi3. Los péptidos de esta segunda modalidad con la primera modalidad con la característica única de que Xio es un cambio no conservador de prolina o que Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido único. No obstante, una característica adicional de los peptidomiméticos de EPO de acuerdo con la segunda modalidad de la presente invención es la naftilalanina (ya sea 1-Nal o 2-Nal) en la posición 13. La combinación de naftilalanina en la posición 13 y el cambio de aminoácido no conservador de prolina en la posición Xio genera peptidomiméticos de EPO con propiedades de unión mejoradas. Los peptidomiméticos de EPO se unen en forma de un dimero al receptor EPO. Se supone que la incorporación de Nal en la posición 13 genera interacciones hidrofóbicas más fuertes entre los monómeros peptpidicos. Esto incrementa potencialmente la dimerización de las cadenas peptidicas monoméricas y posiblemente estabilizan la conformación del dimero peptidico. En combinación con un aminoácido el cual es no conservador para prolina, se generas una molécula mimética de EPO con propiedades miméticas de EPO mejoradas debido probablemente a una colocación favorable de los aminoácidos involucrados en la unión de receptor. Las secuencias que muestran naftilalanina en la posición 13 también se describen en la solicitud anterior de los solicitantes PCT/EP2005/012075. En los mismos países, esta descripción puede constituir técnica anterior, de acuerdo con la ley de patentes. En países en donde esto es aplicable y puede cuestionar la patentabilidad, la secuencia de consenso de la primera alternativa de la segunda modalidad por razones legales puede no comprender secuencias que satisfagan el consenso que se describe en PCT/EP 2005/012075. Esto se puede aplicar a la siguiente secuencia de consenso y secuencias peptidicas que se seleccionan del siguiente grupo que se describen en PCT/EP 2005/012075. un péptido, especialmente uno que sea capaz de unión al receptor EPO que comprenda la siguiente secuencia de aminoácidos: en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es C, A, E, ácido a-amino-Y-bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W, Y o R, H, L, , Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina ; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina; o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único ; Xii se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T o A; Xi3, 1-nal, 2-nal; Xi4 es D, E, I, L o V; Xi5 es C, A, K, ácido a-amino-Y-bromobutírico homocisteina (hoc) con la condición de que X6 o X15 sea C hoc; un péptido del siguiente grupo: GGTYSCHFGKITÜVCKKQGG GG YSCHFGKLT-Inal-VCKKQRG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT- Inal-VCKKQRG C-GGTYSCHFGKLT- lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT- Inal -VCKKQRG Ac-C-GGTYSCHFGKLT-Inal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Inal-VCKKQRG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Inal-VCKKQRG-Am GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT- Inal-VCKKQRG CGGTYSCHFQKLT- Inal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKL - Inal-VCKKQRG GGTYSCHMGKLTXVCKKQGG GGTYTCHFGKLTXVCKKLGG GGLYSCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCQKQGG GGTYSCHFGKLTXVCKKQRG GGTYTCHFGKLTUVCKKQGG GGTYSCHFGKLTÜVCKKLGG GGTYSCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKLGG GGLYACHFGKLTUVCKKQGG GGTYTCHFGKITUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCKKQGG GGLYACHFGKLTULCKKQGG GGTYTCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCKKQRG GGTYTCHFGKLTXVCKKQGG GGLYSCHFGKITUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCRKQGG GGTYACHFGKLTXVCKKLGG GGLYACHFGKLTXVCRKQGG GGTYACHFGKLTXVCKKQGG GGLYSCHMGKLTXVCRKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKQRG GGLYSCHMGKLTXVCKKQGG GGTYTCHMGKLTXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCRKQRG GGTYSCHFGKLTXVCKKQGG GGTYTCHFGKLTXVCKKQRG GGTYTCHFGKLTXVCKKQRG GGTYACHFGKLTUVCKKQGG GGLYACHFGKLTUVCRKQGG GGLYACHFGKLTXICKKQGG GGLYSCHFGKITXECKKQGG GGLYACHFGKLTXVCKKQGG GGTYSCHFGKLTXVCQKQGG GGLYSCHMGKLTXDCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCKKLGG GGLYSCHFGKLTUVCQKQGG GGLYSCHFGKLTUVCRKQRG GGTYTCHFGKLTUVCKKLGG GGTYSCHMGKLTUVCKKQGG GGLYACHMGKITXVCQKLRG GGTYSCHFGKLTXVCKKQRG GGLYSCHFGKLTUVCRKQGG GGTYSCHFGKLTXVCKKLGG GGLYSCHFGKITUICKKQGG GGTYTCHFGKLTXVCQKQGG GGLYACH GKITXVCQKLGG GGTYSCHFGKLTUVCKKQRG GGLYSCHFGKLTUVCRKLGG GGLYSCHFGKLTXVCRKLGG GGLYSCHFGKITUVCRKQGG GGLYSCHMGKLTUECKKQGG GGTYSCHFGKLTUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKQGG GGLYSCHFGKITXVCRKQGG GGTYTCHFGKLTUVCQKQGG GGTYSCHFGKLTUVCQKQGG GGTYTCHFGKLTUVCKKQRG en donde X es 1-naftilalanina y U es 2-naftilalanina .
En donde la descripción publicada posteriormente de PCT/EP2005/012075 no resulte en un problema de patentabilidad, la secuencias de consenso y peptidicas que se incluyen en lo anterior no necesitan ser excluidas del consenso amplio de la primera alternativa de la segunda modalidad y por lo tanto están comprendidas por el consenso amplio definido en lo anterior. Los aspectos benéficos adicionales de la primera y segunda modalidades de la presente invención se proporcionan en las reivindicaciones dependientes. Dado que la primera y segunda modalidades de esta invención comparten características idénticas respecto a la presencia de un cambio no conservador de prolina en la posición 10 o en donde Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido único, de hecho están unidos firmemente entre si. Las secuencias de consenso agrandadas de la primera y segunda modalidad, en donde los aminoácidos adecuados se definen para posiciones que rodean a las secuencias de núcleo anteriores se definen en la reivindicación independiente y también se describen en lo siguiente. Por favor, obsérvese que la numeración utilizada en la presente solicitud (X4X5X6.. etc . ) se proporciona únicamente con el fin de permitir la comparación entre los péptidos de la presente invención y los peptidomiméticos de EPO conocidos en la técnica (para la numeración basada en el péptido EMP1, véase, por ejemplo Johnson et al., 1997 y 1998). No obstante, esta numeración no se refiere a la longitud total del péptido y por lo tanto tampoco implicará que es siempre necesario que todas las posiciones estén ocupadas. Por ejemplo, no es necesario que la posición Xi este ocupada. Por ejemplo, un péptido que comienza con X6 también puede ser activo miméticamente a EPO en la medida en que se proporcione la longitud mínima de 10 aminoácidos. En consecuencia, la numeración de las posiciones de aminoácidos utilizados en esta solicitud únicamente permitirá la caracterización y comparación de los péptidos con la técnica anterior. La secuencia de consenso de la primera y segunda modalidades de la presente invención también pueden comprender la siguientes posiciones de aminoácidos adicionales .
X14X15X16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X14 se selecciona del grupo que consiste de D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A; Xi6 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; Xi7 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido cargado positiva o negativamente, natural, no natural o que se forme por derivados, en el caso de un aminoácido cargado positivamente preferiblemente es K, R, H, ornitina u homoarginina ; Xie se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; Xig se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado positiva o negativamente, en el caso de un aminoácido cargado positivamente puede ser, por ejemplo, K, R, H, ornitina y homoarginina o un aminoácido flexible pequeño tal como glicina o ß-alanina. De acuerdo con una modalidad adicional, la secuencia de consenso peptidica comprende las siguientes posiciones de aminoácidos adicionales: XgX7 8 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde; ?d es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A es un ácido a-amino-Y-bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es , F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina . De acuerdo con una mejora adicional de la primera y segunda modalidades de la invención, el péptido muestra un aminoácido cargado en la posición Xio, Xi y/o X19 si estas posiciones de aminoácidos están presentes en el péptido (que depende de la longitud del consenso peptidico) . Los aminoácidos en la posición X10, X17 y/o X19 están cargados positiva o negativamente y se seleccionan del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos derivatizados . Por favor nótese que los aminoácidos derivatizados se perciben como una modalidad especial de aminoácidos no naturales en el contexto de esta solicitud. El término aminoácido no natural de hecho es un término genérico. Los aminoácidos derivatizados actualmente se mencionan por separado dado que constituyen una modalidad especial de la presente invención, como se describirá con detalle en lo siguiente. En el caso en que los aminoácidos en Xi0, 17 y/o X19 sean aminoácidos cargados negativamente, dichos aminoácidos cargados negativamente se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente; aminoácidos originalmente cargados positivamente los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarlos con un grupo cargado negativamente. La cadena lateral cargada negativamente no natural puede mostrar una cadena lateral alargada. Los ejemplos de dichos aminoácidos son ácido a-amino adípico, (Aad) , 2-aminoheptanodiácido (ácido 2-aminopimélico) o ácido a-aminosubérico (Asu) . Una razón puede ser que los aminoácidos artificiales cargados negativamente sean capaces de obtener un mejor contacto con aminoácidos cargados positivamente del receptor EPO por lo que mejoran la capacidad de unión. Se ha encontrado que los péptidos respectivos los cuales también presentan una naftilalanina en posición 13 muestran propiedades de unión muy buenas. Como se ha mencionado, también es posible proporcionar un aminoácido cargado negativamente al convertir un aminoácido cargado positivamente en un aminoácido cargado negativamente. De esta manera, también es posible alargar la cadena lateral por lo que se incrementa potencialmente las propiedades de unión. De acuerdo con esta estrategia novedosa, la lisina (o aminoácidos homólogos más cortos como Dap, Dab u ornitina) generan derivados con un agente adecuado que proporciona grupos cargados negativamente. Un agente adecuado es, por ejemplo, un diácido tal como ácidos dicarboxilicos o ácidos disulfónicos . Se pueden mencionar como ejemplos el ácido glutárico, ácido adipico, ácido succinico, ácido pimélico y ácido subérico. De acuerdo con un aspecto adicional, el péptido de acuerdo con la invención presenta un aminoácido cargado positivamente en la posición Xio, Xi7 y/o X19. El aminoácido cargado positivamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina u ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente, aminoácidos originalmente cargados negativamente los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarlos con un grupo cargado positivamente. Se vuelve evidente que se pueden generar peptidomiméticos de EPO muy potentes cuando en la posición Xio y/o Xi7 del péptido está presente un aminoácido el cual muestra una cadena lateral alargada en comparación con lisina. Este aminoácido puede ser no proteinogénico . De acuerdo con una modalidad, la elongación del aminoácido cargado positivamente se proporciona al incorporar unidades de elongación en la cadena lateral del aminoácido que se van a alargar las cuales no necesariamente necesitan ser lisina. Además, se pueden utilizar aminoácidos más cortos como materiales iniciales los cuales después se alargan por reacciones químicas sistemáticas o rutinarias apropiadas. Habitualmente, las unidades de alargamiento son grupos alifáticos (por ejemplo unidades CH2) o aromáticos (por ejemplo unidades fenilo o naftilo) . Los ejemplos de aminoácidos alargados apropiados son, por ejemplo, homoarginina , aminofenilalanina y aminonaftilalanina . De acuerdo con una modalidad de esta primeras y segunda modalidades de la presente invención Xs es un D-aminoácido, preferiblemente D-fenilalanina . En el caso en que el consenso de la primera y segunda modalidades también comprende un aminoácido en la posición X5, se puede seleccionar Xs de cualquier aminoácido, no obstante, preferiblemente es A, H, K, L, S, T o I. En caso de que esté presente X4 en el péptido, se puede seleccionar de cualquier aminoácido, no obstante, preferiblemente es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que requiere electrones. El sustituyente que requiere electrones preferiblemente se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos. Los ejemplos 4-aminofenilalanina, 3-aminotirosina , 3-yodotirosina, 3-nitrotirosina, 3, 5-dibromotirosina, 3,5-dinitrotirosina y 3, 5-diyodotirosina . En el caso en el que X3 esté presente en el consenso, X3 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V. Además, especialmente en el caso de unidades monoméricas (dominio de unión) que forman un dímero, se prefiere que los aminoácidos en la región N terminal de los monómeros (por ejemplo la posición Xi y X2) y la región en la parte C terminal del monómero (por ejemplo Xi9 y X20) muestren un aminoácido flexible pequeño tal como glicina o ß-alanina con el fin de proporcionar una conformación flexible. De acuerdo con una tercera modalidad de la presente invención se proporciona un péptido estructura de manera diferente el cual también muestra buenas propiedades miméticas de EPO. Este péptido también comprende por lo menos 10 aminoácidos, es capaz de unión al receptor EPO y comprende una actividad agonista. Las características de este peptidomimético de EPO se describen por al menos una de las siguientes secuencias de consenso del núcleo de aminoácidos : X9X10X11X12X13 ; 9X10 11 12X13X14 15X16X17 o X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 Cada aminoácido de estas secuencias de consenso se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales. De acuerdo con la característica esencial del segundo aspecto de la presente invención, por lo menos una de las posiciones X10, X17 o X19 muestra un aminoácido cargado negativamente. También comprende péptidos que se seleccionan del grupo que consiste de fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia de consenso peptídica anterior que tengan actividad mimética de EPO y que tengan por lo menos en una de las posiciones X10 , X17 o X19 un aminoácido cargado negativamente. Resulta muy sorprendente que los aminoácidos cargados negativamente en estas posiciones muestren dichas propiedades miméticas de EPO excelentes. Las posiciones adicionales de aminoácidos (si están presentes en el consenso) se definen como sigue: X9 es G o un cambio conservador de G; X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es , 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido amino- -bromobutírico, X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q. Los péptidos de acuerdo con la tercera modalidad de la presente invención presentan un aminoácido cargado negativamente en por lo menos una de las posiciones X10, X17 y/o X19 (si están presentes) , son candidatos adecuados para un péptido que muestre propiedades miméticas de EPO diferenciadoras en el sistema humano y en el animal. Como se resalta en lo anterior, las secuencias proteínicas del receptor EPO de diferentes especies tienen únicamente algunas diferencias de especie a especie y por lo tanto los receptores EPO se clasifican como "altamente conservados con diferencias imperceptibles entre especies" . No obstante, se ha demostrado sorprendentemente que los peptidomiméticos de EPO con aminoácidos cargados negativamente en por lo menos una de las posiciones descritas puede ser capaz de diferenciar entre sitios que se unen a péptido del receptor EPO de humano o de animal. Los péptidos que tienen una mayor capacidad de unión al receptor animal se utilizan de manera preferible para usos veterinarios . El péptido que presenta un aminoácido cargado negativamente en por lo menos una de las posiciones X10, X17 y/o X19 puede comprender los siguientes aminoácidos adicionales en el consenso: en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde: X6 es un aminoácido con funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A, o ácido amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina . Además, el consenso agrandado también se puede describir por los siguientes aminoácidos: ?9?10?11?12?13?14?15?16?17?18?19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde X9 es G o un cambio conservador de G; en caso de que X10 no sea un aminoácido cargado negativamente, X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina, o X9 y X10 se sustituyen por un aminoácido único; X1X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X1S es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; en caso de que X17 no sea un aminoácido cargado negativamente, X17 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido cargado positivamente, natural o no natural o - que ha formado un derivado, preferiblemente K, R, H, ornitina u homoarginina; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; en caso en que X19 no sea un aminoácido cargado negativamente, X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado positivamente como K, R, H, ornitina u homoarginina o un aminoácido flexible pequeño tal como glicina o -alanina; con la condición de que por lo menos uno de X10, X17 o X19 sea un aminoácido cargado negativamente. Por supuesto, esta modalidad de la invención también comprende péptidos que se seleccionan del grupo que consiste de fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados y variantes de la secuencia de consenso peptídica anterior que tienen actividad mimética de EPO y que tienen por lo menos en una de las posiciones X10, X17 o X19 un aminoácido cargado negativamente. Se prefiere que los aminoácidos en las posiciones X6 Y xis tengan una funcionalidad de cadena lateral que permita la formación de un enlace covalente y por lo tanto la creación de un puente de enlace dentro del péptido que se seleccionan de manera que son capaces de formar un enlace covalente entre sí (por favor véase la descripción de la primera modalidad de la presente invención en lo anterior) . Los aminoácidos adecuados son por lo tanto aminoácidos que presentan grupos SH para formar enlaces disulfuro (por ejemplo cisteína y derivados de cisteína tales como homocisteína) o tiolisina por sólo mencionar algunos de los candidatos adecuados. Además, son adecuados aminoácidos formadores de puentes seleniuro tales como selenocisteína . Como se describe en lo anterior, además otros aminoácidos que permiten la formación de un enlace covalente, por ejemplo un enlace amida o un enlace tioéter son adecuados. Por lo tanto, una selección de los aminoácidos preferidos en la posición X6 y X1S comprende C, K, E, ácido -amino- -bromobutírico , homocisteína (hoc) y derivados de cisteína tales como selenocisteína o tiolisina. Esto es válido para todas las modalidades de la presente invención. Los aminoácidos cargados negativamente presentes en el péptido de acuerdo con la tercera modalidad de la presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente , aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado negativamente. La cadena lateral cargada negativamente no natural puede mostrar una cadena lateral alargada. Las cadenas laterales alargadas probablemente son capaces de poner en contacto más eficazmente los aminoácidos cargados positivamente del receptor EPO y por lo tanto incrementar la capacidad de unión. Los ejemplos para dichos aminoácidos son ácido -aminoadípico (Aad) , 2 -aminoheptanodiácido (ácido 2 -aminopimélico) o ácido -aminosubérico (Asu) . Como se ha indicado, también es posible proporcionar un aminoácido cargado negativamente al convertir un aminoácido cargado positivamente en un aminoácido cargado negativamente. Por lo tanto, también es posible alargar la cadena lateral. Esto puede mejorar las propiedades de uniónd el receptor EPO. De acuerdo con esta estrategia novedosa un aminoácido cargado positivamente tal como, por ejemplo lisina (o aminoácidos homólogos más cortos, por ejemplo Dap, Dab u ornitina) forman derivados con un agente adecuado que proporcione grupos cargados negativamente. Un agente adecuado es, por ejemplo, un diácido tal como por ejemplo, ácidos dicarboxílieos o ácidos disulfónicos . El ácido glutárico, ácido adípico, ácido succínico, ácido pinálico y ácido subérico se pueden mencionar como ejemplos. Un ejemplo adecuado de una lisina, alargada y cargada negativamente con ácido glutárico se proporciona en lo siguiente : Otra alternativa para una modificación de alargamiento es una combinación de lisina con ácido adípico : Esta estrategia de alargamiento es muy útil para mejorar las propiedades de unión de los peptidomiméticos de EPO de la presente invención que también se puede utilizar para mejorar las características de diferentes moléculas. Por lo tanto es una idea tecnológica completamente independiente. De esta manera, también se proporcionan aminoácidos modificados en donde un aminoácido cargado positivamente produce un derivado con grupos químicos adecuados con el fin de suministrarle a un aminoácido cargado positivamente un grupo cargado negativamente. De esta manera, el aminoácido originalmente cargado de manera positiva se convierte en un aminoácido cargado negativamente. Esto es especialmente útil si la modificación química también resulta en un alargamiento de la cadena lateral la cual con frecuencia mejora la capacidad de unión. Los agentes adecuados para modificación se describen en lo anterior. Como se indica en lo anterior, únicamente es necesario de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención que una de las posiciones de aminoácidos ???, i7 y/o X19 este ocupado por un aminoácido cargado negativamente aunque también dos o todas las porciones pueden mostrar un aminoácido respectivo. No obstante, en caso de que una o más de estas posiciones no estén ocupadas por un aminoácido cargado negativamente, se prefiere que este presente un aminoácido cargado positivamente en las otras posiciones Xio, Xi7 y/o X19. Este aminoácido cargado positivamente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina y ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente tales como, por ejemplo, homoarginina o ácido diaminobutírico; aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, producen derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente. Se vuelve evidente que los peptidomiméticos de EPO muy potentes se pueden generar cuando en la posición X10 y/o Xi7 está presente un aminoácido cargado positivamente el cual muestra una cadena lateral alargada en comparación con lisina. De acuerdo con una modalidad, el alargamiento del aminoácido cargado positivamente se proporciona al incorporar unidades de alargamiento en la cadena lateral del aminoácido las cuales no necesariamente necesitan ser lisina. Además el aminoácido más corto se puede utilizar como materiales iniciales los cuales después de alargan por reacciones químicas apropiadas sistemáticas o rutinarias. Habitualmente, las unidades de alargamiento son grupos alifáticos (por ejemplo unidades CH2) o aromáticos (por ejemplo unidades fenilo o naftilo) . Los ejemplos de aminoácidos apropiados son, por ejemplo, homoarginina, aminofenilalanina y aminonaftilalanina . Los aminoácidos no proteinogénicos se prefieren debido a su mayor variedad. Esta modalidad combinada con un aminoácido cargado negativamente en por lo menos una de otras posiciones de aminoácidos Xi0, 17 y/o X19 resulta en peptidomiméticos EPO potentes los cuales son candidatos adecuados para un patrón de actividad diferente en el modelo humano y animal. Para peptidomiméticos de EPO para usos veterinarios, se prefiere que un aminoácido cargado negativamente se localice en la posición 19. Se ha demostrado experimentalmente que los péptidos que tienen la característica respectiva con frecuencia muestran una capacidad de unión mejor a receptores EPO de animales. Para usos veterinarios, se prefiere especialmente que el aminoácido cargado negativamente en la posición 19 se seleccione de E, D o Aad. Es benéfico combinar esta característica con una naftilalanina (preferiblemente Nal-1) en la posición 13. Además, se prefiere que un aminoácido cargado positivamente esté en posición 17, preferiblemente K o Har. También se prefiere que un aminoácido cargado positivamente este presente en la posición 10, preferiblemente lisina. Los ejemplos especialmente preferidos de peptidomiméticos EPO de esta modalidad se muestran en la figura .7c. En particular, las secuencias péptido miméticas de EPO para usos veterinarios comprenden una secuencia de aminoácidos la cual se selecciona del grupo que consiste de: Ac-CGTYSCHFGKLT-Nal-VCK-Har-QDG-Am Ac-CGTYSCHFGKLT-Nal-VCK-Har-Q-Aad-G-Am GGGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQ-Aad-G-Am Esta tercera modalidad de la presente invención también se puede combinar con la característica en donde X8 es un D-aminoácido, preferiblemente D-fenilalanina .
Una secuencia de consenso agrandada de está modalidad comprende los siguientes aminoácidos adicionales: 4 puede ser F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que retira electrones. Como ya se ha descrito en lo anterior en relación con la segunda modalidad, el sustituyente que retira electrones preferiblemente se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, grupo nitro y halógenos. Los ejemplos adecuados son 4-amino-fenilalanina, 3-aminotorosina, 3-yodotirosina, 3-nitrotirosina , 3, 5-dibromotirosina, 3 , 5-dinitrotirosina o 3, 5-diyodotirosina . X5 se puede seleccionar de cualquier aminoácido, no obstante, preferiblemente es A, H, K, L, M, S, T o I. Además, X3 puede estar presente y puede seleccionarse independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, LN, S, T o V. Además, especialmente en caso de unidades monoméricas que están formando un dimero se prefiere que los aminoácidos en el inicio de los monómeros (por ejemplo la posición Xi y X2) y al final del monómero (por ejemplo Xi9 y X20) muestren aminoácidos flexibles pequeños tales como glicina o ß-alanina con el fin de proporcionar una conformación flexible. Como ya se ha descrito en relación con la segunda modalidad de la presente invención, resulta útil proporcionar una naftilalanina (nal-1 o nal-2) en la posición Xi3. La incorporación de Nal en la posición 13 genera y tiene interacciones hidrofóbicas más fuertes entre los monómeros peptidicos como se describe en lo anterior por lo que incrementan potencialmente la dimerización de las cadenas peptidicas monoméricas y posiblemente estabilizan la conformación del dimero peptidico por lo que mejoran la actividad mimética de EPO. Es muy favorable una combinación de ambas modalidades (segunda y tercera) . Los ejemplos de secuencias peptidicas adecuadas que comprenden naftilalanina se proporcionan en la figura 7a. De acuerdo con una cuarta modalidad de la presente invención se proporciona un péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud capaz de unirse al recetor EPO y que comprende una actividad agonista, que comprende la siguiente secuencia de núcleo de aminoácido: 8X9X10X11X12X13 14X15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde Xe es un D-aminoácido X9 es G o un cambio conservador de G; Xio es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina; o X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único; Xii se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina asparagina o glutamina; Xi4 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-y-bromobutírico . También se incluyen péptidos que se seleccionan del grupo que consiste de fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia peptidica de consenso de acuerdo con la cuarta modalidad que tienen actividad mimética de EPO y que tienen un D-aminoácido en la posición 8. La característica predominante de la cuarta modalidad de la presente invención es la presencia de un D-aminoácido en la posición X8. Se prefiere D-fenilalanina . Esta modalidad parece ser un buen candidato para diferenciar entre un receptor EPO animal y uno humano. La inversión del átomo C en la posición 8 genera una posición geométrica diferente del grupo fenilo lo cual se puede adecuar mejor con el receptor animal, especialmente EPOR canino. Este cuarto aspecto de la presente invención también se puede combinar con modalidades ventajosas adicionales como se describe subsecuentemente. El péptido de acuerdo con la cuarta modalidad de la invención también se puede describir por la siguiente secuencia del núcleo de aminoácidos agrandada: X6 7X8 9 10 11 12 13X14 15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde ?T es un aminoácido como una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente, o A o ácido a-amino-Y-bromobutirico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es D-M, D-F, D-I, D-Y, D-H, D-homoserinametiléter o D-norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; Xio es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina; o X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único; X11 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; Xi4 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o un ácido o¡-amino-Y-bromobutírico . Una modalidad adicional de la cuarta modalidad de la presente invención se puede describir por la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7Xs 9Xio i 1X12X13X1 X15X16X17X8X19 en donde X6-Xi5 tienen el significado anterior como se describe en relación con la cuarta modalidad de la invención y en donde: Xi6 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X17 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, por ejemplo A, G, P, Y o un aminoácido cargado natural, no natural o en forma derivada, preferiblemente K, R, H, ornitina u homoarginina en caso de un aminoácido cargado positivamente; Xi8 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido.
Además, en relación con la cuarta modalidad de la presente invención, se prefiere que esté presente un aminoácido cargado en la posición ???, X17 y/o X19 . Los experimentos muestran que se obtienen velocidades de actividad mimética EPO muy buena con aminoácidos cargados. No obstante, en general también los aminoácidos no cargados pero polares (tales como, por ejemplo, serina, treonina, asparagina o glutamina) en estas posiciones proporcionan buenos resultados, si se combinan con los aminoácidos correctos en las otras posiciones. El aminoácido cargado en la posición ??0? Xi7 y/o X19 está cargado positiva o negativamente y se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos que forman derivados . De acuerdo con un aspecto, X10 , X17 y/o X19 es un aminoácido cargado negativamente. El aminoácido cargado negativamente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente, aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados para proporcionarles un grupo cargado negativamente. La cadena lateral no natural cargada negativamente también puede mostrar una cadena lateral alargada. Los ejemplos de dichos aminoácidos son ácido o¡-aminoadipíco (Aad) , 2-aminoetanodiácido (ácido 2-aminopimélico) o ácido a-aminosubérico (véase antes) . Como se indica, también es posible proporcionar un aminoácido cargado negativamente al convertir un aminoácido cargado positivamente en un aminoácido cargado negativamente, por lo que también es posible alargar la cadena lateral y de esta manera incrementar las propiedades de unión. De acuerdo con esta estrategia novedosa (véase lo anterior para detalles), la lisina (o aminoácidos homólogos más cortos como Dap, Dab u ornitina) forman derivados con un agente adecuado que proporciona grupos cargados negativamente. Un agente adecuado es, por ejemplo, un diácido tal como por ejemplo ácidos dicarboxílieos o ácidos disulfónicos . También se pueden mencionar como ejemplos el ácido glutárico, ácido adípico, ácido succínico, ácido pimélico y ácido subérico. De acuerdo con un aspecto adicional, el péptido presenta un aminoácido cargado positivamente en la posición XiOf Xi7 y/o Xig. El aminoácido cargado positivamente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo, lisina, arginina, histidina u ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente, aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente. Se vuelve evidente que se pueden generar peptidomiméticos de EPO muy potentes cuando en la posición io y/o Xi7 está presente un aminoácido el cual muestra una cadena lateral alargada en comparación con lisina. De acuerdo con una modalidad, el alargamiento del aminoácido cargado positivamente se proporciona al incorporar unidades de alargamiento en la cadena lateral de un aminoácido las cuales no necesariamente necesitan ser lisina. Además se pueden utilizar aminoácidos más cortos como materiales iniciales los cuales después se alargan por reacciones químicas sistemáticas o rutinarias apropiadas (véase antes). Habitualmente, las unidades alargadas son grupos alifáticos (por ejemplo unidades CH2) o aromáticos (por ejemplo unidades fenilo o naftilo) . Los ejemplos de aminoácidos apropiados son, por ejemplo, homoarginina, aminofenilalanina y aminonaftilalanina . Se prefieren aminoácidos no proteinogénicos debido a su mayor variedad. Una manera alternativa es la formación de derivados de aminoácidos con grupos cargados positivamente los cuales no solo permiten una reversión de carga (a una carga positiva) sino que también proporcionan una manera fácil de alargamiento de la molécula. De acuerdo con un desarrollo adicional de esta modalidad el péptido se define por la siguiente secuencia de núcleo de aminoácido agrandada: X4X5X6X7X8X9X10 11X12 13X14X15 16X17 18 19 en donde e a X19 tienen el significado anterior como se describe en relación con el cuarto aspecto de la presente invención y en donde: X4 es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presentan por lo menos un sustituyente que atrae electrones; X5 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I. El sustituyente que recibe electrones preferiblemente se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, grupo nitro y halógeno. También se puede seleccionar X4 del grupo que consiste de 4-aminofenilalanina, 3-aminotirosina, 3-yodotirosina, 3- nitrotirosina, 3 , 5-dibromotirosina, 3 , 5-dinitrotirosina y 3, 5-diyodotirosina. Además X3 puede estar presente y se puede seleccionar independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V. Además, en el caso de que las unidades monoméricas formen un dimero se prefiere que las posiciones de aminoácidos al inicio de los monómeros (por ejemplo posición Xi y X2) y al final del monómero (por ejemplo Xi9 y X2o) muestren un aminoácido flexible pequeño tal como glicina o ß-alanina con el fin de proporcionar flexibilidad conformacional . Como ya se ha descrito en relación con la segunda modalidad de la presente invención, es ventajoso proporcionar una naftilalanina en la posición Xi3. La incorporación de Nal en la posición 13 genera interacciones hidrofóbicas más fuertes entre los monómeros peptidicos como se describe en lo anterior por lo que incrementan potencialmente la dimerización de las cadenas peptidicas monoméricas y posiblemente estabilicen la conformación del dimero peptidico por lo que mejoran la actividad mimética de EPO. De acuerdo con una quina modalidad de la presente invención se proporciona un péptido el cual también es un buen candidato para un peptidomimético de EPO que muestren una actividad diferenciadora entre especies. Este péptido comprende por lo menos 10 aminoácidos, es capaz de unirse al receptor EPO y comprende una actividad agonista. Este peptidomimético de EPO comprende la siguiente secuencia de núcleo de aminoácidos: X4X5X6X7X8 9 10X11X12 13X14X15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde: X4 es F o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presentan por lo menos un sustituyente que retira electrones; X5 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I. X es un aminoácido como una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente, o A o ácido a-amino-Y-bromobutirico; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina o Xg y X10 están sustituidos por un aminoácido único; X11 se selecciona de cualquier aminoácido; Xi2 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; Xi4 es D, E, I, L o V; Xi5 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido o¡-amino-Y-b.romobutírico . También están comprendidos péptidos que se seleccionan del grupo que consiste de fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados y variantes de la secuencia de consenso peptidica anterior que tienen actividad mimética de EPO y que tienen un aminoácido en la posición X4 la cual se selecciona de F o un derivado ya sea de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que retira electrones. El sustituyente que retira electrones se puede seleccionar del grupo que consiste del grupo amino, grupo nitro y halógeno. X4 preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de 4-aminofenilalanina, 3-aminotirosina , 3-yodotirosina, 3-nitrotirosina, 3, 5-dibromotirosina, 3,5-dinitrotirosina o 3 , 5-diyodotirosina . Las combinaciones ventajosas adicionales de la quina modalidad de la invención con modalidades adicionales se describen en las reivindicaciones dependientes. Para detalles acerca de las características respectivas por favor véase la referencia a la descripción anterior que explica las características junto con las modalidades respectivas de manera detallada. Las combinaciones de la mutación de X4 y la mutación de D-fenilalanina son especialmente adecuadas. De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención se proporcionan varios péptidos alternativos para proporcionar . peptidomiméticos de EPO mejorados. De acuerdo con esta sexta modalidad de la invención se proporciona un péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud el cual es capaz de unión al receptor EPO y que comprende una actividad agonista. La alternativa (a) de esta sexta modalidad comprende por lo menos una de las siguiente secuencias de núcleo de aminoácidos: X9X10 11 12X13 ; X9X10X11X12X13 1 15X16 l7 o X9X10X11X12X13X1 X15 16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: Xg es G o un cambio conservador de G; X11 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin cambio o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; Xi3 es W, naftilalanina, A o F; Xi4 es D, E, I, L o V; Xi5 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-Y-bromobutírico; en donde por lo menos una de las posiciones Xio, Xi6, Xi7 o Xi9 muestra un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina. También están incluidos péptidos que se seleccionan del grupo que consiste de fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de la secuencia de consenso peptídica anterior que tiene actividad mimética de EPO y que tienen un aminoácido en por lo menos una de las posiciones X10, X16, X17 o X19 que muestra un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina. Esta sexta modalidad de la invención describe una estrategia alternativa la cual también abre la opción a diferencial potencialmente entre el receptor humano y animal al alargar las cadenas laterales cargadas positivamente en los peptidomiméticos de EPO en por lo menos una de las posiciones X10, X16, X17 y/o X19. Esta modalidad proporciona candidatos adecuados para una diferenciación de péptidos dado que existen menos puntos de fijación cargados negativamente en el receptor EPO murino y canino y estos puntos de fijación son más inasequibles con cadenas laterales positivamente más cortas (por ejemplo lisina) . Por lo tanto, la incorporación de residuos cargados positivamente con una cadena lateral más larga tiene un alto potencial de incrementar la afinidad de péptidos a los receptores EPO. Las secuencias las cuales muestran una homoarginina en la posición X10 y/o X17 ya se han descrito en la solicitud anterior del solicitante PCT/EP 2005/012075. De acuerdo con la ley de patente de algunos países esta descripción puede constituir técnica anterior. Cuando esto es aplicable y se puede poner en duda la patentabilidad del consenso anterior, la secuencia de consenso de la primera alternativa de la sexta modalidad de la invención, por razones legales, puede no comprender secuencias descritas en PCT/EP 2005/01075. Esto se puede aplicar a las secuencias de consenso seleccionadas del siguiente grupo: - un péptido, especialmente uno que es capaz de unión al receptor EPO que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos.
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y X6 es C, A, E, ácido -amino- -bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es , F, I, homoserinametiléter o norisoleucina ; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es Har XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T o A; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es C, A, K, ácido -amino- -bromobutirico u homocisteína (hoc) con la condición de que ya sea X6 o X15 sea C u hoc , o - un péptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18 en donde X6 a X15 tiene el significado anterior y en donde X3 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V; X4 es Y; X5 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I ; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T; X17 es homoarginina ; X1B se selecciona independientemente de cualquier aminoácido; o GGTYSCSFGKLTWVCK-Har-QGG GGTYSCHFG-Har-LTWVCK-Har-QGG Estas secuencias ya han sido descritas en la solicitud PCT anterior del solicitante PCT EP_2005-01 20 75. En países en donde la descripción postpublicada de PCT/EP2005/012075 no constituyen problema de patentabilidad, la secuencia de consenso y peptídicas incluidas en la lista anterior no necesitan ser excluidas del consenso amplio de la primera alternativa de la sexta modalidad. De acuerdo con un desarrollo adicional de la sexta modalidad de la presente invención, el péptido comprende la siguiente secuencia de aminoácidos del núcleo agrandada : ^6^7^8X9^10^11X12^13^1 X15^16-^1 X18^19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde : X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de 6; en caso de que X10 no sea un aminoácido proteinogénicos cargado positivamente que tenga una cadena lateral la cual esté alargada en comparación con lisina, X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina, o X9 o X10 se sustituyen por un aminoácido único; X1:L se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es , 1-nal, 2 -nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X1S es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A ácido -amino- -bromobutírico; en caso de que X16 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T; en el caso en el que X17 es un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X17 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido natural, no natural o que forma derivados, cargado positivamente, preferiblemente K, R, H u ornitina; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; en caso de que X19 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado tal como un aminoácido cargado positivamente tal como K, R, H u ornitina o un aminoácido cargado negativamente tal como D, E o Aad; con la condición de que por lo menos uno de X10, X16, X17 o X19 sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina. De acuerdo con una modalidad adicional, por lo menos uno de X10/ X16, X17 o X19 es un aminoácido cargado positivamente y en donde el aminoácido cargado positivamente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina y ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente, - aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, pueden formar derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente; con la condición de que por lo menos uno de X10, X16, X17 o X19 sea un aminoácido no protenoigénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral que está alargada en comparación con lisina. Como se describe en lo anterior, el alargamiento del aminoácido cargado positivamente se puede proporcionar por unidades de alargamiento de la cadena lateral en donde las unidades de alargamiento son grupos alifáticos o aromáticos; el alargamiento puede proporcionarse, por ejemplo, por unidades CH2 en donde el número de unidades CH2 preferiblemente está entre 1 y 6. De manera alternativa, el alargamiento también se puede obtener por grupos aromáticos tales como por ejemplo unidades fenilo o naftilo . El aminoácido no proteinogénico cargado positivamente el cual está alargado en comparación con lisina, es preferiblemente un aminoácido no natural. Los aminoácidos no naturales ofrecen más posibilidades por lo que aumentan la probabilidad de encontrar un aminoácido alargado que acople perfectamente. Los ejemplos de aminoácidos alargados no naturales adecuados son, por ejemplo, homoarginina, aminofenilalanina y aminonaftilalanina . Una cadena lateral cargada positivamente, alargada en la posición X17 parece interactuar mejor con el receptor EPO murino/canino . Especialmente la homoarginina, la cual es una arginina homologa alargada artificial ha demostrado ser adecuada. Este aminoácido es externo a lisina y es capaz de interactuar con aminoácidos cargados negativamente más distantes en los receptores EPO murino/canino (Glu60 y Glu62 en los receptores EPO animales) . Una cadena lateral cargada positivamente y alargada en la posición X10 tiene un efecto similar a la mutación en la posición X17 descrita antes. También en este caso, los aminoácidos cargados negativamente más distantes pueden alcanzarse a través del alargamiento (Glu34 en el receptor EPO murino/canino) . Es deseable combinar mutaciones/características en las posiciones X10 y X17. La geometría del péptido que presenta un aminoácido cargado positivamente y alargado (por ejemplo homoarginina) en ambas posiciones indica una interacción fuerte con el receptor EPO. Como se ha descrito, el aminoácido preferiblemente es no proteinogénico . La fuerza de la interacción electrostática proporcionada .se intensifica incluso por enlaces de hidrógeno múltiples desde cada residuo homoarginina. De acuerdo con la sexta modalidad de la invención, por lo menos uno de X10, X16, X17 y/o Xlg muestra un aminoácido cargado positivamente alargado y no proteinogénico. Las otras posiciones de X10, X16, X17 y/o X19 también pueden mostrar un aminoácido cargado, el cual está cargado positiva o negativamente y se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos que forman derivados. De acuerdo con una alternativa, por lo menos no de X10, X17 y/o X19 es un aminoácido cargado negativamente. En caso de que X10, X17 y/o X19 sea un aminoácido cargado negativamente, dicho aminoácido cargado negativamente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente ; - aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado negativamente. La cadena lateral cargada negativamente no natural puede mostrar una cadena lateral alargada. Los ejemplos para dichos aminoácidos son ácido -aminoadípico (Aad) , 2 -aminoheptanodiácido (ácido 2 -aminopimélico) o ácido -aminosubérico . Como se indica en lo anterior, también es posible proporcionar un aminoácido cargado negativamente al convertir aminoácidos cargados positivamente en aminoácidos cargados negativamente. De esta manera, también es posible alargar la cadena lateral por lo que se incrementan las propiedades de unión. De acuerdo con esta estrategia novedosa se forman derivados de lisina (o aminoácidos más cortos homólogos como Dap, Dab u ornitina) con un agente adecuado que proporciona grupos cargados negativamente. Un agente adecuado es, por ejemplo, un diácido tal como, por ejemplo, los ácidos dicarboxílicos o ácidos disulfónicos . También se pueden mencionar como ejemplos ácido glutárico, ácido adípico, ácido succínico, ácido pimélico y ácido subérico. Véase por favor nuestra discusión anterior detallada de esta modalidad. Bajo la condición que por lo menos una de las posiciones X10, X17 y/o X19 muestra un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente y alargado, el péptido también puede presentar un aminoácido "normal" cargado positivamente en la posición X10, X16, X17 y/o X19. El aminoácido cargado positivamente se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina u ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente , - aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente. Un desarrollo adicional de la sexta modalidad de la presente invención proporciona en X8 un D-aminoácido, preferiblemente D-fenilalanina. De acuerdo con un desarrollo adicional de la sexta modalidad, el péptido comprende la siguiente secuencia del núcleo de aminoácidos agrandada: ?4?5?6?7?8?9?10?11?12?13?14?15?16?17?18?19 en donde X6 a X19 tienen el significado anterior y en donde : X4 es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que retira electrones; X5 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S , T o I . Como se describe en lo anterior, el sustituyente que retira electrones se puede seleccionar del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos. Los ejemplos son -amino-fenilalanina, 3 -amino-tirosina, 3-yodo-tirosina, 3 -nitro-tirosina, 3 , 5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina , 3 , 5 -diyodo- tirosina . Además, X3 puede estar presente y se puede seleccionar independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V. Además, en caso de que las unidades monoméricas formen un dímero vía un enlazante peptídico continuo, se prefiere que los aminoácidos en la región N- terminal de los monómeros (por ejemplo posición X1 y X2) en la región C terminal del monómero (por ejemplo X19 y X20) muestren un aminoácido flexible pequeño tal como glicina o -alanina con el fin de proporcionar una conformación flexible.
La solicitud describe, además de los peptidomiméticos de EPO, en general, medios y estrategias diferentes con el fin de mejorar la actividad mimética de EPO y/o con el fin de permitir una diferenciación entre EPO-R humano y animal. Como se ha descrito, las diferentes estrategias y aspectos de la invención se pueden combinar entre sí con el fin de obtener un peptidomimético de EPO "adaptado" que muestre la propiedades deseadas. De esta manera, es importante entender que las estrategias que se han descrito se pueden entender como unidades de diseño las cuales se pueden combinar independientemente entre sí con el fin de obtener un peptidomimético de EPO que tenga las propiedades deseadas. Por ejemplo, las características de la segunda modalidad (naftilalanina en la posición X13) se pueden combinar con las características de la tercera modalidad de que por lo menos uno de X10, X17 y X19 estén cargados negativamente. La longitud de los péptidos de acuerdo con las modalidades 1 a 6 descritas en lo anterior preferiblemente están entre diez a cuarenta o cincuenta o sesenta aminoácidos. En modalidades preferidas, el péptido de consenso muestra una longitud de por lo menos 10, 15, 18, 20 ó 25 aminoácidos. Por supuesto, las secuencias de consenso descritas se pueden incrustar respectivamente para estar comprendidas por secuencias más largas. Las secuencias de consenso peptídicas descritas se pueden considerar que forman dominios de unión para el receptor EPO. Como se describe en lo anterior y en lo siguiente, también es posible combinar las unidades peptídicas monoméricas (dominio de unión) a péptidos diméricos o incluso multiméricos . En caso de que se utilice un enlazante peptídico para crear una unidad dimérica o multimérica también se generan péptidos más largos debido en la dimerización y/o multimerización. Como pepetomiméticos de EPO, son capaces de unirse al receptor EPO. Las secuencias peptidomiméticas de EPO de acuerdo con la invención pueden tener acetilaciones y amidaciones en la parte N terminal y/o C terminal . Algunos aminoácidos también pueden estar fosforilados . Los péptidos de acuerdo con la invención pueden comprender, además de L-aminoácidos o los D-aminoácidos estereoisoméricos , aminoácidos no naturales/no convencionales tales como, por ejemplo, aminoácidos , disustituidos, N-alquilaminoácidos o ácido láctico, por ejemplo 1-naftilalanina, 2 -naftilalanina , homoserina-metiléter, -alanina, 3 -piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfoserina, N-metilglicina (sarcosina) , homoarginina, N-acetilserina, N-acetilglicina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, nor-lisina, ácido 5- aminolevulínico o ácido aminovalérico . Se prefiere particularmente el uso de N-metilglicina (MeG) y N-acetilglicina (AcG) , en particular en una posición terminal. También está dentro del alcance de la presente invención péptidos los cuales son péptidos retro, inverso y retro/inverso de los péptidos definidos y aquellos péptidos que consisten completamente de D-aminoácidos . La presente invención también se relaciona con los derivados de los péptidos, por ejemplo productos de oxidación de metionina o glutamina desamidada, arginina y la amida en la parte C terminal. De acuerdo con un desarrollo de las modalidades de la invención los péptidos tienen un aminoácido único que sustituye los residuos aminoácidos X9 y X10. En esta modalidad también ambos residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido no natural, por ejemplo ácido 5-aminolevulínico o ácido aminovalérico. De acuerdo con un desarrollo adicional, los péptidos descritos en la primera a sexta modalidades comprenden en Xe y/o X15 como un aminoácido con una funcionalidad C formadora de fuente un derivado cisteina tal como selenocisteina , E, K o hoc y/o X7 como R, H o Y o S y/o Xe como F o M y/o Xg como G o A, preferiblemente G y/o X10 como K o Har y/o X como V, L, I, M, E , A, T o norisoleucina y/o X12 como T y/o Xi3 como W o naftailalanina y/o Xi4 como D o V y/o Xi7 como P, Y o A o un aminoácido básico natural o no natural. No obstante, también se prefiere, como se describe en lo anterior que X17 sea K o un aminoácido no natural con una cadena lateral cargada positivamente tal como, por ejemplo, homoarginina . Los fragmentos, derivados y polipéptidos variantes de acuerdo con la presente invención prefieren sustancialmente la misma función o actividad biológica que los péptidos de acuerdo con las modalidades individuales descritas en la presente. Para diferenciarlos adecuadamente del estado de la técnica, el fragmento, los derivados o variantes tienen los mismos rasgos característicos que las modalidades respectivas: respecto a la modalidad 1, tienen un aminoácido en la posición Xi0 que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido único; respecto a la modalidad 2, tienen un aminoácido en la posición X10 que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido único y naftilalanina en la posición Xi3; respecto a la modalidad 3, por lo menos una de las posiciones Xio, X17 o Xi es un aminoácido cargado negativamente; respecto a la modalidad 4, presenta un D- aminoácido en posición Xe; respecto a la modalidad 5, tiene un aminoácido en la posición Xi0 que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde X9 y Xi0 están sustituidos por un aminoácido único y tienen en posición X4 F o un derivado de cualquiera de F o Y, en donde el derivado de F o Y tiene por lo menos un sustituyente que retira electrones; respecto a la modalidad 6, por lo menos una de las posiciones Xio, Xi6r n o X19 muestra un aminoácido no proteinico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina. "Un fragmento" es menos que un péptido de longitud completa (o polipéptido, el término péptido como se utiliza en la presente no comprende restricción de tamaño alguna) la cual retiene actividad funcional sustancialmente similar. El término "derivados" incluye péptidos que han sido modificados químicamente para proporcionar una estructura y/o función adicionales. Los derivados se pueden modificar ya sea por procesos naturales o por técnicas de modificación química, ambas bien conocidas en la técnica. Las modificaciones se pueden llevar a cabo en cualquier parte en un polipéptido que incluye la estructura principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y las partes terminales amino o carboxilo. Otras modificaciones químicas incluyen, por ejemplo, acetilaciones, acilación, amidación, unión covalente de diferentes porciones químicas, reticulado, ciclización, formación de (sitios) enlaces disulfuro u otras formaciones de los puentes, hidroxilación, metilación, oxidación, PEGilación o selenoilación . El término "variantes" de péptidos de acuerdo con la presente invención incluyen polipéptidos que tienen uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos con respecto a los aminoácidos definidos en la secuencia de consenso. Por supuesto, también puede contener aminoácidos diferentes de los aminoácidos naturales. Por ejemplo se pueden llevar a cabo una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo con esta invención con el fin de llegar a variantes funcionales de las diferentes modalidades de la invención como se describe en lo anterior. La sustitución se produce, por ejemplo, dentro de los aminoácidos que tienen cadena laterales no polares, los D o L-aminoácidos no cargados naturales o no naturales con cadenas laterales polares, aminoácidos con cadenas laterales aromáticas, los D o L-aminoácidos naturales o no naturales cargados positivamente, los D o L-aminoácidos naturales o no naturales cargados negativamente asi como dentro de cualquier aminoácido de tamaño y peso molecular similares en donde el peso molecular del aminoácido original no debe desviarse más de aproximadamente ± 25% del peso molecular del aminoácido original y que se mantenga la capacidad de unión del receptor de la hormona eritropoyetina con efecto agonista. Preferiblemente se sustituye un máximo de 1, 2 ó 3 aminoácidos. Se prefieren las variantes de secuencia donde no se introduce prolina en las posiciones 10 y 17. Las secuencias peptidicas descritas en la presente se pueden utilizar como unidades peptidicas monoméricas adecuadas las cuales constituyen dominios de unión para el receptor EPO. Se pueden utilizar en su forma monomérica dado que se unen al receptor EPO. Como se describe en la presente, se utilizan preferiblemente como dimeros dado que muestran que la capacidad para inducir dimerizacion del receptor EPO y por lo tanto su actividad biológica aumenta por dimerizacion de las unidades de unión monoméricas . Por lo tanto, es evidente que muchos péptidos diferentes están dentro del alcance de la presente invención. No obstante, se ha encontrado que la secuencia Ac-VLPLYRCRMGRETWECMRAAGVTK-NH2 tiene ciertas desventajas y por lo tanto no se prefiere, de acuerdo con la presente invención.
Al inicio (parte N terminal) y al final (parte C terminal) de las secuencias peptidicas individuales descritas se pueden retirar y/o agregar hasta cinco aminoácidos. Es evidente por si mismo que el tamaño no es de importancia en la medida en que se conserva en la función del péptido. Además, por favor obsérvese que las secuencias peptidicas individuales que pueden ser demasiado cortas para multiplicar su actividad como monoméros o habitualmente funcionan como agonistas por dimerización . Por lo tanto, dichos péptidos se utilizan preferiblemente en su forma dimérica. Las modalidades respectivas truncadas y/o alargadas por lo tanto están comprendidas también dentro del espíritu de la invención. En la presente invención, las abreviaturas para el código de una letra con mayúsculas así como la nomenclatura polipeptídica estándar se extiende por adición de aminoácidos no naturales .
Código aminoácido A L-alanina V L-valina L L-leucina I L-isoleucina M L-metionina F L-fenilalanina Y L-tirosina W L-triptofano H L-histidina S L-serina T L-treonina C L-cisteína N L-asparagina Q L-glutamina D ácido L-aspártico E ácido L-glutámico K L-lisina R L-arginina p L-prolina G glicina Ava, 5-Ava ácido 5 aminovalerico Ais, 5-Als ácido 5-aminolevulinico MeG N-metilglicina AcG N-acetilglicina Hsm homoserina metiléter Har homoarginina lnal 1-naftilalanina 2nal 2-naftilalanina PAla ¾ ß-alanina hoc/hcy homocisteina Ac acetilado Am amidado Dap ácido diamino propiónico Dab ácido diamino butírico Aad ácido a-amino adípico Asu ácido ot-aminosubérico Adi ácido adípico Glr ácido glutárico Sec selenocisteína Como se describe en lo anterior, la presente invención también incluye modificaciones de los péptidos y los consensos peptídicos definidos por cambios conservadores de un solo aminoácido. Dichos cambios alteran la estructura y función de una molécula de unión pero solo ligeramente en la mayor parte de los casos. En un cambio conservador, un aminoácido se sustituye por otro aminoácido dentro de un grupo con propiedades similares. Los ejemplos de grupos correspondientes son: aminoácidos con cadenas laterales no polares: A, G, V, L, I, P, F, W, M aminoácidos sin carga que tienen cadenas laterales polares: S, T, G, C, Y, N, Q aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas: F, Y, W . aminoácidos cargados positivamente: K, R, H aminoácidos cargados negativamente: D, E aminoácidos de tamaño o peso molecular similar, en donde el peso molecular de los aminoácidos de sustitución se desvia en un máximo de +/- 25% (o +/- 20%, +/- 15%, +/- 10%) del peso molecular del aminoácido original . Es evidente por si mismo que los grupos también incluyen aminoácidos no proteinogénicos naturales o no naturales con el perfil de cadena lateral respectiva tal como, por ejemplo, homoarginina en caso del grupo que muestra cadenas laterales cargadas positivamente. En caso de una prolina 10 como molécula de sustitución tal como, por ejemplo, un aminoácido natural no se puede asignar claramente a uno de los grupos anteriores caracterizado por sus propiedades de cadena lateral, habitualmente se percibe como una sustitución no conservadora de prolina, de acuerdo con esta invención. Para clasificar estos aminoácidos poco comunes, el auxiliar de clasificación de acuerdo con el peso molecular puede ser útil. De manera más especifica, Wrighton et al. (patente de E.U.A. 5,773,569 y patentes relacionadas) examinan en detalle, utilizando técnicas de presentación de fago, cuales aminoácidos se pueden sustituir, mientras se mantiene la actividad. También han investigado y publicado datos de posibles cortes, es decir, longitud mínima de un peptidomimético de EPO dado. No obstante, una prolina cerca de un residuo Gly central parece ser la única posibilidad para obtener péptidos activos. Preferiblemente, los péptidos descritos se modifican de manera que presenten AcG en la parte N terminal y MeG en la parte C terminal. Como se menciona en lo anterior, se prefiere que los péptidos comprendan dos secuencias de consenso miméticas de EPO y por lo tanto las unidades de unión monoméricas por lo que se forma un dimero (o un péptido divalente continuo en el caso de un enlace aminoácido que se utiliza para dimerisación) . Las unidades peptidomiméticas EPO monoméricas se pueden seleccionar de la totalidad de las modalidades descritas en lo anterior con el fin de formar el dimero. Una unidad de unión monomérica de acuerdo con la presente invención también se puede combinar con una unidad de unión monomérica de peptidomiméticos de EPO conocidos en el estado de la técnica . Un monómero o dimero peptidomimético de EPO de acuerdo con la presente invención puede comprender además por lo menos una porción separadora. Preferiblemente, dichos separadores conectan el enlazante de un monómero o dimero a una porción de polímero hidrosoluble o un grupo protector el cual puede ser, por ejemplo, PEG. El PEG tiene un peso molecular preferido de por lo menos 3 kD, preferiblemente entre 20 y 60 kD. El separador puede ser una porción de 1 a 12 átomos de carbono terminada con enlaces -NH o grupos COOH y opcionalmente sustituida en uno o más átomos de carbono disponibles con un sustituyente alquilo inferior. Un separador particularmente preferido se describe en el documento WO 2004/100997. Todos los documentos - WO 2004/100997 y WO 2004/101606 - se incorporan en la presente como referencia. La modificación de los péptidos con PEG se describe en el documento WO 2004/101600 el cual también se incorpora en la presente como referencia. Existen varias opciones posibles para diseñar un enlazante covalente entre dos cadenas peptidicas con el fin de obtener dimeros o múltimeros. Los péptidos se pueden enlazar por medio de cadenas laterales de aminoácidos o por medio de extensiones de estructura principal. Se indican cuatro estrategias de dimerización principal diferentes para conectar dos porciones pept idomimét icas EPO de manera covalente subsecuentemente como ejemplos para estrategias adecuadas . 1. Dimerización terminal de la parte C terminal a la parte C terminal puede obtener la dimerización por medio de una estructura dicetopiperazina en la parte C terminal de cada péptido. Se pueden obtener enlazantes dicetoperazina al activar los aminoácidos de la parte C terminal, preferiblemente glicinas. Las siguientes figuras muestran los ejemplos de acoplamiento.
Ejemplo a: I 1 GGTYSCHFGKLTWVC GGTYSCHFGKLTWVCKKQGGG-G - GGTYSCHFGKLTWVCKKQGGG-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQGGG I I Ejemplo b: I 1 I I GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-G I GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG I I I I Ejemplo c i— 1 i — I GGTYSCHFGKLTWVCKKQG-BAIa GGTYSCHFGKLTWVCKKQG-BAIa-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQG-BAIa-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQG-ttAla I I I I Ejemplo d: r i I 1 GGTYSCHFGKLTVWCKKQ-BAla-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQ-flAla-G-G GGTYSCHFG LTWVGK Q-BAIa-G-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQ-BAIa-G I I L I Por favor, nótese que de acuerdo con la segunda modalidad de la presente invención, puede existir una naftilalanina en la posición 13 en vez de triptofano. Las secuencias anteriores únicamente se utilizan para describir el principio/concepto de dimerización, el cual, no obstante, también es válido para otros péptidos descritos en la presente solicitud. 2. Dimerización terminal de la parte N terminal a la parte N terminal Los siguientes ejemplos representan péptidos diméricos en donde la parte N terminal de uno de los péptidos monoméricos está unido covalentemente a la parte N terminal del otro péptido, por lo que la unidad separadora preferiblemente contiene un bloque de construcción de ácido dicarboxílico .
Ejemplo a: Ejemplo de un dímero que contiene una unidad hexanodioilo (C6) como enlazante/separador: GGGTYSCHFGKLTWVCKKQGG I co- <c¾)4-co I GGGTYSCHFGKLTWVCKKQGG El puente enlazante en esta estructura dimérica se elabora según las necesidades por modelado molecular para evitar distorsiones de la conformación bioactiva.
Ejemplo b: Ejemplo de un dímero adecuado que contiene una unidad octanodioilo (C8) como enlazante/separador: GGGTYSCHFGKLTWVCKKQGQ I C0- (CH2>6-CO I GGGTYSCHFGKLTWVCKKQGG 3. Dimerizaclon por medio de cadenas laterales Además, la dimerización se puede llevar a cabo por medio de una unión covalente que se forme entre las cadenas laterales de péptidos monoméricos las cuales se supone que forman el dímero . existen varias opciones: De acuerdo con una modalidad las cadenas laterales del aminoácido en la posición X18 (por ejemplo Gln) , están adyacentes entre sí en el complejo péptido mimético de EPO-EPOR. Estas cadenas laterales Glnl8 se pueden sustituir por un puente covalente. Las siguientes fórmulas muestran ejemplos de dimeros peptídicos unidos vía cadenas laterales del aminoácido en la posición 18: I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG l I G —1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG I I La distancia correcta y la geometría necesitan considerarse en el diseño de los enlazantes adecuados. Cuando se optimiza la geometría del péptido con la siguiente fórmula, la estructura se contrae y se deforma en comparación con el dímero peptídico nativo: I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG I I En contraste con la estructura anterior, una ditnerización vía tiolisina en la posición 18 no distorsiona sustancialmente al dímero. I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG I I De acuerdo con una estrategia diferente, el puente covalente que une los monómeros peptídicos entre sí que de esta manera constituyen el dímero se forman entre las cadenas laterales del aminoácido de la parte C terminal de la primera unidad peptídica monomérica y el aminoácido en la parte N terminal del segundo monómero peptídico. Por lo tanto, se prefiere que de acuerdo con esta estrategia de ditnerización que los péptidos miméticos de EPO dimericen presentando un aminoácido con un puente que forma funcionalidad ya sea en la parte N o C terminal y por lo tanto se permite la formación de una unión covalente entre el último aminoácido del primer péptido y el primer aminoácido del segundo péptido. La unión que genera el dímero preferiblemente es covalente. Los ejemplos adecuados de puentes respectivos son, por ejemplo, el puente disulfuro y el puente diselenuro. No obstante, también, por ejemplo los enlaces amida entre aminoácidos cargados positiva y negativamente u otras uniones de enlace covalente tales como las uniones tioéter son adecuadas como porciones enlazantes (véase lo anterior respecto a la modalidad 1) . Los aminoácidos preferidos adecuados para formar puentes de conexión respectivos se delinean junto con la primera modalidad de la presente invención. En este caso se tienen, por ejemplo, cisteína, derivados de cisteína tales como homicisteína o selenocisteína o tiolisina. La forma ya sea de los puentes disulfuro o, en el caso de aminoácidos que contienen selenio, puentes diseleniuro. Los ejemplos adecuados para los dímeros creados respectivamente se proporcionan en lo siguiente: i 1 Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQR-Cya I s I 3 I C s-GTY8CH?GKLT-Nal-VCKKQRG-Am i i i 1 Ac-GOTYSCSFOKLT-Nal-VCX-Har-QG-Cye I s I 8 I Cyo-aTYSCSFGEKLT-Nal-VCK-Har-QGG-Aa i I r Ac-GOTYSCHFGKLT-Nml-VCXKQR-Sec (Sec = selenocisteina) I Se I Se I Sec-GTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am I I 1 Ac-GCTYSCSFCKLT-Nal-VCK-Har-QG-Sec Se I Se Sec-OTYSCSFGKLT-Nal-VCK-Har-QGG-Am I : I Ac-OOTYSCHFOKLT-Nal-VCKXQR-Hcy ^cy = homocisteina) 8 I s Hey-GTYSCHFC LT-Nal-VC KQRG-Am I I i 1 Ac-OGTTfSCSFGKLT-Mal-VCK-Bar-QC-Kcy S s I Hcy-GTYSCSFGXLT-Nal-VCK-Har-QGQ-Am I I I 1 Ac-GOTYSCSFCn LT-Nal-VCX-Har-QG-Cya-Am I s I ß I Ac-Cye-GTYSCSFGKLT-Nal-VCK-Har-QGG-Am I i De acuerdo con un desarrollo adicional, ya sea en la parte N o C terminal del dimero peptídico (y por lo tanto de las unidades peptídicas monoméricas respectivas que se localizan al principio o al final del dimero) que comprenden un aminoácido adicional lo que permite el acoplamiento del portador tal como HES. En consecuencia, el aminoácido introducido presenta una funcionalidad de acoplamiento respectiva tal como, por ejemplo, un grupo SH. Un ejemplo común de dicho aminoácido es cisteína. No obstante, son adecuados también otros aminoácidos con un grupo funcional que permite la formación de un enlace covalente (por ejemplo todos los aminoácidos cargados negativo y positivamente) . ( 1 AC-C(tsu) -eonrecsreiaiT-ii»i-vci-H*r-Qa-cy*-*m I s I i · s I · Ac-Cye-GTYSCSFCTIiT-Nal-VCK-Har-QGG-Am I . I Las barras sobre los monómeros peptídicos representan puentes intramoleculares covalentes; en este caso, puentes disulfuro. De acuerdo con un desarrollo adicional, el aminoácido en la parte terminal C y/o N involucrado en la formación del puente covalente para conectar las unidades monoméricas a un dimero muestra un grupo cargado tal como, por ejemplo, el grupo COO" o NH3+ . Esta característica genera una estabilización favorable de la estructura del puente intermolecular: Ac-C(tBu) -GQTYSCSrOKLT-Nal-VCK-Har-QG-C B-COO (-) I (?) H3N-Cya-<nnrsCSFaKLT-Nal-VCX-Har-Q8-Am I I Péptidos divalentes continuos El concepto fundamental de esta estrategia frena la síntesis de unidades peptídicas monoméricas en reacciones separadas antes de dimerización o multimerización pero sintetiza el péptido divalente o multivalente final en una etapa como un péptido continuo único; por ejemplo en una reacción en fase sólida única. De esta manera ya no es necesaria la etapa separada de dimerización o multimerización. Este aspecto proporciona una gran ventaja, es decir, el control completo e independiente sobre cada posición de secuencia en la unidad peptídica final. El método permite albergar fácilmente por lo menos dos dominios de unión diferentes, específicos de receptor en una unidad peptídica continua debido a control independiente en cada posición de secuencia. De acuerdo con esta modalidad, la secuencia del péptido final entre los dominios de unión (la cual es la "región enlazante") está constituida únicamente de aminoácidos, y por lo tanto genera un péptido mimético de EPO divalente o multivalente continuo único. En una modalidad preferida de la invención, el enlazante peptídico está constituido de aminoácidos naturales o no naturales los cuales permiten una alta flexibilidad conformacional . A este respecto puede ser ventajoso utilizar residuos glicina como aminoácidos enlazantes los cuales son conocidos por su alta flexibilidad en términos de torsión. No obstante, también se pueden utilizar otros aminoácidos tales como alanina o -alanina o una mezcla de los mismos, para crear el enlazante peptídico. El número y selección de aminoácidos utilizados depende de los datos estéricos respectivos. Esta modalidad de la invención permite el diseño al propósito de un enlazante adecuado por modelado molecular con el fin de evitar distorsiones de la conformación bioactiva. Se prefiere esencialmente un enlazante constituido de 3 a 5 aminoácidos. Resulta notable que el enlazante entre los dominios funcionales (o unidades monoméricas) de los péptidos divalentes o muítivalentes finales puede ser una parte distinta del péptido o puede estar constituida -totalmente o en partes- de aminoácidos los cuales son parte de los dominios funcionales monoméricos. Por ejemplo, los aminoácidos flexibles pequeños al inicio del monómero peptídico (por ejemplo, posiciones X1 y X2) y al final del monómero peptídico (por ejemplo posiciones X19 y X20) son las que se prefieren con el fin de formar un enlazante flexible y en el caso de un péptido divalente continuo. Los aminoácidos preferidos en estas posiciones, son, por ejemplo, residuos glicina o -alanina. Se proporcionan ejemplos con la secuencia 11 a 14. De esta manera, el término "enlazante" define más bien la funcionalidad de la estructura, dado que el aminoácido puede formar parte de la unidad enlazante así como de las subunidades monoméricas. Dado que -como se ha mencionado antes- durante la síntesis del péptido divalente/mul tivalente cada posición de secuencias dentro del péptido final está bajo el control y por lo tanto se puede determinar con precisión, es posible adecuar o ajusfar los péptidos o regiones específicas o dominios de los mismos, incluyendo el enlazante. Esta es una ventaja específica dado que permite evitar la distorsión de la conformación bioactiva del péptido _ divalente final debido a interacciones intramoleculares poco favorables. Se puede determinar el riesgo de distorsiones antes de la síntesis mediante elaboración de modelos moleculares. Esto en especial se aplica al diseño del enlaznate entre los dominios, monoméricos . Los péptidos divalentes/multivalentes continuos que tienen un enlazante peptídico para dimerización muestran una actividad mucho mayor en comparación con los péptidos monoméricos correspondientes y por lo tanto confirman la observación conocida a partir de otros péptidos diméricos de que existe un incremento en la eficacia asociado con conceptos peptídicos divalentes. Los péptidos divalentes/multivalentes continuos se pueden modificar, por ejemplo por acetilación o amidación o se puede alargar en las posiciones C terminal o N terminal . Las modificaciones de la técnica anterior para los péptidos monoméricos (monómeros) mencionados antes incluyen la unión de porciones solubles tales como PEG, almidón o dextranos también son aplicables a los péptidos multivalentes o divalentes, de acuerdo con la invención. Todas las posibles modificaciones también se aplican para modificar el enlazante. En particular, puede ser ventajoso unir porciones poliméricas solubles al enlazante tales como, por ejemplo, PEG, almidón o dextranos.
La síntesis de un péptido multivalente o divalente de acuerdo con la invención de manera favorable también puede incluir dos formaciones subsecuentes independientes de enlaces disulfuro u otros enlaces intramoleculares dentro de cada uno de los dominios de unión. De esta manera se pueden ciclar péptidos. Las estructuras divalentes de acuerdo con la invención se forman favorablemente en base en los monómeros peptídicos que se presentan en este documento. Las cadenas laterales reactivas de lós péptidos pueden servir como un nudo enlazante, por ejemplo para modificación adicionales. Los péptidos diméricos además comprenden opcionamente puentes intramoleculares entre el primero y el segundo y/o tercero y cuarto aminoácidos que tienen una funcionalidad de cadena lateral formadora de puente (X6 y X15) tales como, por ejemplo cisteínas. Se pueden modificar los péptidos, por ejemplo, para acetilación o amidación o se pueden alargar en las posiciones C terminal o N terminal . Las extensiones con uno o más aminoácidos en una o dos partes terminales (N o C) , por ejemplo para preparaciones de un sitio de unión para un polímero, con frecuencia tener una unidad peptídica divalente heterodimérica la cual se puede fabricar mejor como un péptido continuo. Se conocen en el estado de la técnica varios aminoácidos reactivos con el fin de acoplar portadores a proteínas y péptidos. Un aminoácido de acoplamiento preferido es cisteína la cual puede acoplarse a la parte N o C terminal. No obstante, la dirección de acoplamiento puede generar una diferencia considerable y por lo tanto debe seleccionarse cuidadosamente para cada péptido. Esto se demostrará en base en el siguiente ejemplo: Se utilizan los siguientes dos dimeros : AGE 400C6C4 1 2 3 4 1 0 0 0 0 1 Ac-5< rasáHFi^is^yá^vciaQiRG8 -NH» I I I I AGEM40C6C4 4 4 0 1 Ac-Cys(tBu) 1-Nal: 1-naftilalanina Cys (tBu) : L-cisteína protegida con S-terbutilo Las cadenas de 41 unidades AGEM400C6C4 y AGEM40C6C4 poseen la misma secuencia del núcleo. Los aminoácidos 1-40 de AGEM40C6C4 son iguales a los aminoácidos 2-41 de AGEM40C6C4. La única diferencia es la posición de la cisteína protegida con terbutilo. Este aminoácido no está involucrado en la interacción de receptor con medicamento, sino que se destina a que funciones como un grupo enlazante para un portador polimérico en el conjugado final. En el caso de AGEM400C6C4, la cisteína protegida con terbutilo se une a la parte C terminal, en el caso de AGEM40C6C4, se une a la parte N terminal . Las barras de conexión representan puentes cisteína. Existen dos ventajas de AGEM400C6C4 con respecto a AGEM40C6V4. La primera ventaja es la accesibilidad de síntesis. AGEM400C6C4 se puede aislar AGEM40C6C4 con rendimientos generales mayores en comparación con AGEM40C6C4. En el caso de la síntesis de la secuencia lineal de AGEM40C6C4 , se observa una cadena CIZ de 22 unidades (CIS-RGGGTYSCHFGKLT- 1 -Nal -VCKKQRG-NH2 , CIZ: grupo 2 -clorobenciloxicarbonilo) como un producto secundario. Durante la purificación de la secuencia lineal con cromatografía líquida de alta presión en fase inversa (RP-HLAP) que muestra un comportamiento cromatográfico similar que el precursor lineal de AGEM40C6C4 y por lo tanto dificulta que se separa lo que genera pérdidas en el rendimiento general del producto que se desea. En el caso de AGEM400C6C4, no se encuentran compuestos análogos. La segunda ventaja de AGE 400C6C4 con respecto a AGE 40C6C4 se encuentra en una implementación más fácil de un análisis del conjugado final del péptido desprotegido con un portador polimérico. Una estrategia para el análisis de un conjugado peptídico es la degradación selectiva del conjugado por separación con endoproteasas . Idealmente, todo el péptido se libera del portador polimérico durante la hidrólisis enzimática. Estos fragmentos peptídicos se pueden identificar y cuantificar por técnicas analíticas convencionales como por ejemplo CLAP con detección UV o EM, etcétera . En el caso de AGEM400C6C4, la separación se puede llevar a cabo con tripsina -una endoproteasa que se sabe separa enlaces peptídicos con alta selectividad que se encuentran en la parte C terminal de los aminoácidos cargados arginina y lisina (F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg.), "Bioanalytik" , Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín, 1998) . Aplicado a conjugados de AGEM400C6C4, esto generará fragmentos libres que abarcan 38 de 41 aminoácidos del enlace peptídico original a la molécula portadora. En el caso de los fragmentos de AGEM40C6C4 de únicamente 21 de los 41 aminoácidos se liberan por digestión tríptica: conjugado de AGEM400C6C4 ^e-GGTY3CHFGKLT-l-Nal-VCKXQRGGGTYSCHFGKLTrl Nal-VCKl¾¾G-Cys- polímero I I I 1 conjugado de AGEM40C6C4 polímero - t Ac) Cye -GGTYSCHFGKLT- 1 -Nal - VCKKQRjSGGTYSCHFQKLT - 1-Nal -VCKKQRG-NH'j Los fragmentos que se liberan se pueden detectar por análisis de seguimiento están marcados con un rectángulo gris. Dado que el análisis de un ingrediente farmacéutico activo es el tema clave durante su desarrollo, AGE 400C6C4 tiene una ventaja clara con respecto a AGEM40C6C4. Así, en caso de que un aminoácido cargado positivamente se localice en las posiciones respectivas, se prefiere en gran medida incorporar el aminoácido enlazante (en este caso cisteína) en la parte C terminal debido a que es posible generar un fragmento peptídico casi completo dado que el sitio de separación se debe a la arginina en la poisisión X19 del monómero muy a la derecha antes del polímero . Los compuestos de la presente invención ventajosamente se pueden utilizar para la preparación de composiciones farmacéuticas para humanos y/o veterinarias. De esta manera son adecuados para uso en tratamiento en humanos y tratamiento veterinario. Como diméticos de EPO, muestran básicamente el mismo patrón de actividad cualitativo que eritropoyetina . Por lo tanto, generalmente son adecuados para las mismas indicaciones que la eritropoyetina . La eritropoyetina es un miembro de la superfamilia de las citocinas. Además de los efectos estimulantes descritos en la introducción, también se ha encontrado que la eritropoyetina estimula los citoblastos. Los miméticos de EPO descritos en la presente por lo tanto son adecuados para todas las indicaciones causadas por efectos relacionados con los citoblastos. Los ejemplos no limitantes son prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema nervioso. Los ejemplos son daños, enfermedades o trastornos neurológicos tales como, por ejemplo, Parkinsonismo, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Tay-Sach, una neuropatía, daño a nervios periféricos, tumor en el cerebro, daño al cerebro, daño a la médula espinal o daño por apoplejía. Los peptidomiméticos de EPO, de acuerdo con la invención, también son adecuados para el tratamiento preventivo y/o curativo de pacientes que padecen o que se encuentran en riesgo de fallo cardíaco. Los ejemplos son infarto cardíaco, enfermedad de arteria coronaria, miocarditis, tratamiento por quimioterapia, alcoholismo, cardiomiopatía, hipertensión, enfermedades de válvula del corazón que incluyen insuficiencia mitral o estenosis aórtica y trastornos de la glándula tiroidea, síndrome coronario crónico y/o agudo. Además los miméticos de EPO se pueden utilizar para estimulación de la movilización, proliferación y diferenciación fisiológica de células precursoras endoteliales, para estimulación de vasculogénesis , para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una disfunción de células precursoras endoteliales y para la producción de composiciones farmacéutica para el tratamiento de dichas enfermedades y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos y otros agentes adecuados para estimulación de células precursoras endoteliales. Los ejemplos de dichas enfermedades son hipercolesterolemia , diabetes mellitus, enfermedades de inflamación crónica medida por endotelio, endoteliosis que incluye reticuloendoteliosis , ateroesclerosis , cardiopatía coronaria, isquemia miocárdica, angina de pecho, enfermedades cardiovasculares relacionadas con la edad, enfermedad de Raynaud, hipertonía inducida por embarazo, fallo renal crónico o agudo, sanado de heridas y enfermedades secundarias. Además, los péptidos de acuerdo con la invención son portadores adecuados para suministrar agentes de la barrera hematoencefálica y se pueden utilizar para los respectivos propósitos y/o para la producción de agentes de conjugación terapéuticos respectivos capaces de atravesar la barrera hematoencefálica . Los péptidos descritos en la presente son especialmente adecuados para el tratamiento de trastornos que están caracterizados por una deficiencia de heritropoyetina o una población defectuosa o baja de eritrocitos y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia o apoplejía. Los péptidos también son adecuados para aumentar y/o mantener el hematocrítico en un mamífero. Dichas composiciones farmacéuticas opcionalmente pueden comprender portadores farmacéuticos aceptables con el fin de adecuar la composición para el procedimiento de administración que se piensa inflar. Los métodos de suministro adecuados así como los portadores y aditivos se describen, por ejemplo en WO 2004/101611 y WO 2004/100997. Como se indica en lo anterior, la dimerización de los péptidos monoméricos a dímeros o incluso multímeros habitualmente mejora la actividad agonista de los miméticos de EPO en comparación con los péptidos monoméricos respectivos. No obstante, es deseable incrementar más la actividad. Por ejemplo, incluso los péptidomiméticos de EPO diméricos son menos potentes que EPO al considerar la activación de los mecanismos celulares. Se han realizado diversos enfoques en la técnica anterior con el fin de incrementar la actividad de los péptidos, por ejemplo mediante variación de las secuencias de aminoácidos con el fin de identificar los candidatos más potentes. No obstante, hasta ahora, aún es deseable incrementar adicionalmente la actividad de los péptidos, especialmente de peptidomiméticos de EPO con el fin de mejorar la actividad biológica. Una modalidad adicional de la presente invención proporciona una solución a dicho problema. En la presente se proporciona un compuesto que se une a moléculas objetivo y comprende: i) por lo menos dos unidades peptídicas en donde cada unidad peptídica comprende por lo menos dos dominios con capacidad de unión al objetivo; ii) por lo menos una unidad portadora polimérica; en donde las unidades peptídicas se unen a la unidad portadora polimérica. Sorprendentemente, se ha encontrado que la combinación de dos o más péptidos divalentes o multivalentes de acuerdo con la invención sobre un soporte polimérico incrementa en gran medida la eficacia de los péptidos divalentes (o incluso multivalente) a su receptor de unión no sólo de manera aditiva sino incluso superior a la aditiva. De esta manera se observa un efecto sinergístico . El término "divalente" , como se utiliza para el propósito de la presente invención se define como un péptico que comprende dos dominios con una capacidad de unión a un objetivo, aquí en particular el receptor EPO. Se utiliza de manera intercambiable con el término "dimérico" . En consecuencia, un péptido mimético de EPO "multivalente" o "multimérico" tiene varios dominios de unión respectivos para el receptor EPO. Es evidente por sí mismo que los términos "péptido" y "unidad peptídica" no incorporan restricción alguna respecto al tamaño e incorporan a oligopéptidos y polipéptidos así como a proteínas. Los compuestos que comprenden dos o más unidades peptídicas divalentes o multivalentes unidas a una unidad portadora polimérica se denominan "supravalente" en el contexto de esta modalidad. Estas moléculas supravalentes difieren en gran medida de las moléculas diméricas o multiméricas conocidas en el estado de la técnica. El estado de la técnica simplemente combina peptidomimético de EPO monoméricos con el fin de crear un dímero. En contraste, las moléculas supravalentes se generan al conectar de antemano (por lo menos) unidades peptídicas divalentes a una unidad portadora polimérica y de esta manera se genera una molécula supravalente (en las figuras se proporcionan ejemplos) . De esta manera, la actividad general y la eficacia de los péptidos aumenta en gran medida y por lo tanto disminuye la dosis CE50.
Hasta ahora las razones para la gran potencia de las moléculas supravalentes en comparación con las moléculas conocidas en el estado de la técnica no se entienden completamente. Puede deberse al hecho de que las moléculas diméricas conocidas en el estado de la técnica simplemente proporcionen un objetivo respectivamente para la unidad de unión de receptor por dimero . Por lo tanto, únicamente se genera un complejo receptor por unión del compuesto dimérico por lo que se induce únicamente un proceso de transduccion de señal. Por ejemplo, dos peptidomiméticos de EPO monoméricos se conectan, vía PEG para formar un dímero peptídico y de esta manera se facilita la dimerización de los monómeros receptores necesarios para transduccion de señal (Johnson et al . , 1997). En contraste, los compuestos supravalentes de acuerdo con la invención comprenden varias unidades de unión de receptor respectivas diméricas o multiméricas de antemano. Esto puede llevar a la generación de varios complejos receptores sobre la superficie celular por molécula de compuesto con lo que se inducen varias señales de transduccion y por lo tanto se potencia la actividad de las unidades peptídicas de manera supraaditiva. La unión de los compuestos supravalentes puede resultar en un agrupamiento de complejos receptores sobre la superficie de la célula.
Las unidades peptidomiméticas de EPO utilizadas en esta modalidad pueden ser homogénicas o heterogénicas , lo que significa que se utilizan unidades peptídicas idénticas o diferentes. Lo mismo es válido para los dominios de unión (péptidos monoméricos como se describe en lo anterior) de las unidades peptídicas las cuales también pueden ser homogénicas o heterogénicas. Las unidades peptídicas divalentes o multivalentes unidas a la unidad portadora se unen al mismo objetivo receptor. No obstante, por supuesto pueden aún diferir en la secuencia de aminoácidos . Los dominios de unión monoméricos de las unidades peptídicas divalentes o multivalentes pueden ser lineales o cíclicos. Se puede crear, por ejemplo, una molécula cíclica por la formación de puentes cisteínas intramoleculares (véase antes) . La unidad portadora polimérica comprende por lo menos un polímero natural o sintético ramificado, lineal o dendrítico. La unidad portadora polimérica preferiblemente es soluble en agua y fluidos corporales y preferiblemente es un polímero farmacéuticamente aceptable. Las porciones de polímero hidrosolubles incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a polialquilenglicol y derivados de los mismos que incluyen PEG, homopolímeros de PEG, mPEG, homopolímeros de polipropilenglicol , copolímeros de etilenglicol con propilenglicol , en donde los homopolímeros y copolímeros están no sustituidos o sustituidos en un extrémo, por ejemplo con un grupo acilo; poliglicerinas o ácido policiálico; celulosa y derivados de celulosa que incluyen metilcelulosa y carboximetilcelulosa; almidones (por ejemplo hidroxialquilalmidón (HAS) , especialmente hidroxietilalmidón (HES) y dextrinas, y derivados de los mismos; dextrano y derivados de dextrano, que incluyen sulfato de dextrano, dextrina reticulada y carboximetildextrina ; quitosana (un polisacárido lineal) , heparina y fragmentos de heparina; alcohol polivinílico y éteres de poliviniletilo ; polivinilpirrolidona ; - -poli [ (2 -hidroxietil ) -DL-aspartamida ; y polioles polioxietilados . Un ejemplo de una unidad portadora es un polímero homobifuncional como por ejemplo, de polietilenglicol (bis-maleimida , bis-carboxi, bis-amino, etcétera) . La unidad portadora polimérica la cual se acopla a por lo menos dos peptidomiméticos de EPO diméricos que comprenden secuencias monoméricas de consenso de acuerdo co la presente invención pueden tener una amplia gama de pesos moleculares debido a la diferente naturaleza de los diferentes polímeros que son adecuados junto con la presente invención. Por lo tanto, estas no son restricciones de tamaño. No obstante, se prefiere que el peso molecular sea de por lo menos 3 kD, preferiblemente de por lo menos lOkD y aproximadamente de alrededor de 20 a 500 kD y de manera más preferible alrededor de 30 a 150 o alrededor de 60 a 80 kD . El tamaño de la unidad portadora depende del polímero seleccionado y por lo tanto puede variar, por ejemplo, especialmente cuando se utilizan almidones tales como hidroxietilalmidón, el peso molecular puede ser considerablemente mayor. El promedio de peso molecular puede estar distribuido en aproximadamente 100 a 4000 kD o incluso puede ser mayor. No obstante, se prefiere que el peso molecular de la molécula de la HES se encuentre entre aproximadamente 50 y 500 kD o 100 a 300 kD y de preferencia aproximadamente a 200 kD. El tamaño de la unidad portadora preferiblemente se selecciona de manera que cada unidad peptídica esté distribuida de manera óptima para unión de sus moléculas receptoras respectivas. Con el fin de facilitar esto, una modalidad de la presente invención utiliza una unidad portadora que comprende una unidad ramificada. De acuerdo con esta modalidad, los polímeros, tales como por ejemplo PEG, se unen a una unidad de ramificación por lo que se tiene como resultado en una molécula portadora grande que permite la incorporación de numerosas unidades peptídicas. Los ejemplos de unidades de ramificación apropiadas con glicerol y poliglicerol . También se pueden utilizar unidades de ramificación dendrítica tales como por ejemplo las descritas por Haag 2000, incorporada en la presente como referencia. Además, el portador HES se puede utilizar en forma ramificada. Esto, por ejemplo, se obtiene con una proporción alta de amilopeptina . Preferiblemente, después de que se generan las unidades peptídicas por combinación de las unidades de unión monoméricas a unidades peptídicas (ya sea cabeza a cabeza, cabeza a cola o cola a cola) , la unidad portadora polimérica se conecta a las unidades peptídicas. La unidad portadora polimérica se conecta/acopla a las unidades peptídicas vía un enlace covalente o no covalente (por ejemplo una unión coordinada) . No obstante, se prefiere el uso de una unión covalente. La unión se puede llevar a cabo, por ejemplo, vía un aminoácido reactivo de las unidades peptídicas, por ejeplo lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina o el grupo N aminoterminal y el ácido carboxílico de la parte C terminal. En caso de que el péptido no presente un aminoácido respectivo, dicho aminoácido se puede introducir en la secuencia de aminoácidos. El acoplamiento se debe seleccionar de manera que la unión al objetivo esté impedida de manera nula o tan pequeño como se pueda. En base en la conformación de la unidad peptídica, el aminoácido reactivo se encuentra al inicia, al final o dentro de la secuencia peptídica.
En caso de que la unidad portadora poliraerica no posea un grupo de acoplamiento apropiado, se pueden utilizar varias sustancias/enlazantes de acoplamiento con el fin de modificar apropiadamente el polímero con el fin de que pueda reaccionar con por lo menos un grupo reactivo en la unidad peptídica para formar el compuesto supravalente . Los grupos químicos adecuados que se pueden utilizar para modificar el polímero son, por ejemplo, los siguientes : Grupos acilantes los cuales reaccionan con los grupos amino de la proteína, por ejemplo grupos de anhídrido de ácido, grupos N-acilimidazol , grupos azida, grupos N-carboxi anhídrido, grupos diceteno, grupos de pirocarbonato de dialquilo, grupos imidoéster y grupos carboxilo activados por carbodiimida . La totalidad de los grupos anteriores se sabe que reaccionan con grupos amino sobre proteínas/péptidos para formar enlaces covalentes que involucran enlaces acilo o similares; grupos alquilantes los cuales reaccionan con sulfridilo (mercapto) , tiometilo, imidazo o grupos amino sobre la unidad peptídica tales como grupos halocarboxilo , grupos maleimida, grupos vinil activados, grupos etilenimina, grupos haluro de arilo, grupos bromuro de 2-hidroxi-5-nitro-bencilo y grupos alifáticos aldehido y cetona junto con agentes reductores, que reaccionan con el grupo amino del péptido; grupos formadores de éster y amida los cuales reaccionan con un grupo carboxilo del péptido tal como grupos diazocarboxilato y grupos carbodiimida y amina juntos; grupos formadores de disulfuro los cuales reaccionan con los grupos sulfridilo en la proteína tales como grupos 5 , 5 ' -ditiobis (2 -nitrobenzoato) , disulfuros de orto-piridilo y grupos alquilmercaptano (los cuales reaccionan con los grupos sulfridilo de la proteína en presencia de agentes oxidantes tales como yodo) ; grupos dicarbonilo tales como grupos ciclohexanodiona y otros grupos 1 , 2 -dicetonas los cuales reaccionan con las porciones guanidina del péptido; grupos diazo, los cuales reaccionan como grupos fenolicos en el péptido; grupos reactivos de reacción de bromuro de cianógeno con el polisacárido, los cuales reaccionan con grupos amino en el péptido. En resumen, el compuesto de acuerdo con la invención se puede elaborar -opcionalmente- a modificar primero el portador polimérico químicamente para producir un portador polimérico que tenga por lo menos un grupo químico en el mismo el cual sea capaz de reaccionar con un grupo químico disponible o introducido sobre la unidad peptídica y después reaccionar junto con el polímero -opcionalmente- modificado y la unidad peptídica para formar un complejo unido covalentemente al mismo utilizando el grupo químico del polímero modificado -si es necesario-. En caso de que el acoplamiento se produzca vía un grupo SH libre, el péptido (por ejemplo de un grupo cisteína) , el uso de un grupo maleimida en el polímero se prefiere) . Con el fin de generar una molécula definida se prefiere utilizar un enfoque dirigido para unir las unidades peptídicas a la unidad portadora polimérica. En caso de que no estén presentes aminoácidos apropiados en el sitio de unión deseado, se pueden incorporar aminoácidos apropiados en la unidad peptidomimética de EPO dimérica. Para unión de polímero específica de sitio un grupo reactivo único, por ejemplo un aminoácido específico en el extremo de la unidad peptídica se prefiere con el fin de evitar reacciones de acoplamiento no controladas a través del péptido que generen una mezcla heterogénea que comprende una población de varias moléculas poliméricas · diferentes . En acoplamiento de las unidades peptídicas a la unidad portadora polimérica, por ejemplo PEG o HES se realiza utilizando reacciones conocidas principalmente por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, existen numerosos . métodos de unión de PEG y HES disponibles para aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, WO 2004/100997 que proporciona referencias adicionales, Roberts et al., 2002; US 4,064,118; EP 1 398 322; EP 1 398 327; EP 1 398 328; WO 2004/024761; la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Es importante comprender que el concepto de supravalencia descrito en la presente es diferente del concepto conocido de pegilacion o hesilación. En el estado de la técnica, por ejemplo pegilacion se utiliza únicamente con el fin de producir dímeros peptídicos o con el fin de mejorar los parámetros farmacocinéticos al unir una o más unidades PEG a un péptido. No obstante, como se indica en lo anterior, la unión de dos o más unidades peptídicas por lo menos divalentes, a, por ejemplo PEG o HES como una unidad portadora polimérica también incrementa en gran medida la eficacia (y por lo tanto disminuye la dosis CE50) . El concepto de esta invención por lo tanto tiene efectos fuertes sobre los parámetros farmacodinámicos y no sólo sobre los parámetros farmacocinéticos como en el caso con los conceptos de pegilacion o hesilación conocidos en el estado de la técnica. No obstante, por supuesto, la incorporación de, por ejemplo PEG o HES como unidad portadora polimérica también tiene las ventajas conocidas considerando la farmacocinética : La pegilacion habitualmente se lleva a cabo para mejorar las propiedades biofarmacéuticas de los péptidos. Las alteraciones más relevantes de la molécula proteínica después de la conjugación a PEG son aumento en el tamaño, superficie proteínica y enmascaramiento de la función de glucosilación, modificación de carga y protección de epítopos. En particular, el aumento en el tamaño frena la ultrafiltración renal y promueve la acumulación en tejidos permeables mediante incremento pasivo por los mecanismos de permeación y retención. La protección de la proteína reduce la proteólisis y el reconocimiento por el sistema inmunitario, los cuales son vías de eliminación importantes. El efecto específico de pegilación sobre las propiedades fisicoquímicas y biológicas de una proteína está determinado estrictamente por la proteína y las propiedades de polímero así como por la estrategia de pegilación que se lleve a cabo. No obstante, el uso de PEG u otros polímeros no biodegradables puede generar problemas nuevos. Durante las aplicaciones in vivo, los intervalos de dosificación en un ámbito clínico se activan por pérdida del efecto de medicamento. Las dosificaciones sistemáticas o de rutina y los intervalos de dosificación están adaptados de manera que el efecto no se pierde durante los intervalos de dosificación. Debido al hecho de que los péptidos unidos a una unidad polimérica grande y no biodegradable (por ejemplo una porción PEG) se pueden degradar más rápido que la molécula de soporte puede ser eliminada del cuerpo, puede surgir un riesgo de acumulación de la unidad portadora. Dicho riesgo de acumulación siempre se presenta como un efecto de tiempo de semivida del medicamento el cual es más corto que el tiempo de semivida de eliminación del medicamento mismo o uno de sus componentes/metabolitos . Por lo tanto, la acumulación de la molécula portadora debe evitarse especialmente en tratamientos a largo plazo debido a que los péptidos habitualmente se pegilan con porciones PEG muy grandes (~20-40kD) las cuales de esta manera muestran una eliminación renal lenta. La porción peptídica en sí misma experimenta degradación enzimática e incluso la separación parcial puede ser suficiente para desactivar el péptido. Con el fin de encontrar una solución a este problema potencial, una modalidad de la presente invención describe el uso de una unidad portadora polimérica que está constituida de por lo menos dos subunidades. Las subunidades poliméricas están conectadas por medio de estructuras enlazantes covalentes biodegradables . De acuerdo con esta modalidad, el peso molecular de la molécula portadora grande (por ejemplo 40 kD) se genera por varias subunidades de tamaño pequeño o intermedio (por ejemplo cada subunidad tiene un peso molecular de 5 a 10 kD) que se conectan vía enlazantes biodegradables . Los pesos moleculares de las subunidades modulares se suman por lo que se genera el peso molecular deseado de la molécula portadora. No obstante, las estructuras enlazantes biodegradables se pueden descomponer en el cuerpo por lo que se liberan subunidades portadoras más pequeñas (por ejemplo de 5 a 10 kD) . Las subunidades portadoras pequeñas muestran una mejor depuración renal en comparación con la molécula de polímero que tiene el peso molecular total (por ejemplo 40 kD) . En la figura 16 se proporciona un ejemplo ilustrativo . Las estructuras enlazantes se seleccionan de acuerdo con propiedades y escalas de tiempo de degradación conocidas para la degradación en fluidos corporales. Por ejemplo, las estructuras susceptibles de descomponerse contienen grupos capaces de sufrir descomposición o separación similares a derivados de ácido carboxílico tales como uniones amida/péptido o ésteres los cuales se pueden separar por hidrólisis (véase, por ejemplo, Roberts, 2002, incorporada en la presente como referencia) . Los ésteres de succinimidilo de PEG también pueden ser sintetizados con diversos enlaces éster en la estructura principal de PEG para controlar la velocidad de degradación a pH fisiológico (Zhao, 1997, incorporado en la presente como referencia). Otras estructuras susceptibles de ruptura como disulfuros o uretanos de bencilo se pueden separar bajo ambientes reductores ligeros tales como compartimientos endomómicos en una célula (Zalipsky, 1999) y por lo tanto también son adecuados. Otros criterios para selección de enlazantes apropiados son la selección de degradación rápida (con frecuencia enzimáticas) o degradación lenta (con frecuencia descomposición no enzimática) . La combinación de estos dos mecanismos en los fluidos corporales también es factible. Es evidente que este concepto altamente ventajoso no se limita a las unidades peptídicas específicas descritas o a las que sé hace referencia en la presente sino que también se aplica a otras moléculas farmacéuticas que se unen a unidades poliméricas grandes tales como moléculas de PEG en donde surgen los mismos problemas de acumulación. De acuerdo con una modalidad se utiliza hidroxialquilalmidón y preferiblemente HES como unidad portadora polimérica. HES tiene varias ventajas importantes. Primero que nada, HES es biodegradable . Además, esta capacidad de biodegradación de HES se puede controlar por medio de la proporción de grupos hidroxietilo y por lo tanto puede alterarse. Un grado molar de sustitución de 0.4-0.8 (en promedio 40-80% de las unidades glucosa contienen un grupo hidroxietilo) son muy adecuados para el propósito de la presente invención. Debido a la biodegradabilidad, los problemas de acumulación como se describen en lo anterior en relación con PEG habitualmente no se producen. Además, se ha utilizado HES durante un tiempo prolongado en tratamiento médico, por ejemplo en forma de un diluyente de plasma. Es inocuo y por lo tanto ha sido aprobado. Además, los derivados de productos de hidrólisis de HES son detectables por cromatografía de gases. Los conjugados HES-péptidos se pueden hidrolizar bajo condiciones bajo las cuales las unidades peptídicas aún son estables. Esto permite la cuantificación y supervisión de los productos de degradación y permite evaluciones y estandarización de los péptidos activos. De acuerdo con una modalidad adicional, un primer tipo de unidad portadora polimérica se utiliza y carga con las unidades peptídicas. Este primer portador preferiblemente es fácilmente degradable dado que es, por ejemplo, HES. No obstante, no todos los puntos de unión del primer portador son ocupados con unidades peptídicas sino únicamente, por ejemplo, a aproximadamente 20 a 50%. Dependiendo del tamaño del polímero utilizado varios cientos de unidades peptídicas generalmente se pueden acoplar a la molécula portadora. No obstante, habitualmente se utilizan menos unidades peptídicas tales como 2 a 50 ó 2 a 20. Se prefieren para peptidomimeticos de EPO 2 a 15, 2 a 10, 2 a 8 y 3 a 6 péptidos. El resto (o por lo menos parte) de los puntos de unión remanentes del primer portador se ocupan con un portador diferente, por ejemplo unidades PEG pequeñas que tienen un peso molecular menor que el primer portador. Esta modalidad tiene la ventaja de que se genera una composición supravalente debido a que el primer portador el cual, no obstante, es muy durable debido a la presencia del segundo portador, el cual está constituido preferiblemente por unidades PEG de 3 a 5 ó 10 kD. No obstante, la entidad completa es fácilmente degradable dado que el primer portador (por ejemplo HES) y las unidades peptídicas son biodegradables y el segundo portador, por ejemplo, PEG es suficientemente pequeño para ser depurado fácilmente del cuerpo. Los monómeros que constituyen los dominios de unión de las unidades peptídicas reconocen al receptor homodimérico de eritropoyetina . Esta última propiedad de ser un receptor homodimérico diferencia al receptor de EPO de muchos otros receptores de citocina. Las unidades peptídicas comprenden por lo menos dos dominios de unión monoméricos EPO miméticos como se describe en lo anterior que se unen al receptor EPO y preferiblemente son capaces de dimerizar respectivamente o multimerizar su objetivo, y/o estabilizarlos de manera concordante por lo que se genera un complejo de inducción de transducción de señal. La presente invención también comprende método de producción de compuesto respectivos en donde las unidades peptídicas se conectan a las unidades portadoras respectivas. La presente invención comprende además métodos de producción de compuestos respectivos en donde las unidades peptídicas se conectan a las unidades portadoras poliméricas respectivas. Los compuestos de la presente invención ventajosamente se pueden utilizar para la preparación de composiciones farmacéuticas para humanos y/o veterinarias. Pueden ser adecuadas especialmente para el tratamiento de trastornos que están caracterizados por una deficiencia de eritropoyetina o una población baja o defectuosa de eritrocitos y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia y apoplejía. También son utilizables para todas las indicaciones descritas en lo anterior. Dichas composiciones farmacéuticas opcionalmente pueden comprender portadores farmacéuticamente aceptables con el fin de adoptar la composición para el procedimiento de administración que se desee utilizar. Los métodos de suministro adecuados así como los portadores de aditivos se describen, por ejemplo, en WO 2004/100997 y WO 2004/101611, incorporados en la presente como referencia.
EJEMPLOS incepto de moléculas supravalent explicará por medio de ejemplos. La figura 1 muestra un ejemplo de una molécula supravalente sencilla, de acuerdo con la invención. Se conectan dos péptidos divalentes continuos por la parte N terminal por medio de una porción PEG bifuncional que presenta grupos maleimida. Se selecciona cisteína como el sitio de unión reactivo para la unidad portadora PEG. No obstante, las moléculas supravalentes pueden comprender más de dos unidades peptídicas continuas divalentes o multivalentes . La figura 2 proporciona un ejemplo que se basa en una unidad portadora con una unidad glicerol central como unidad de ramificación y que comprende tres péptidos divalentes continuos. Nuevamente, se utiliza cisteína para unión. La figura 3 muestra un ejemplo en donde se usa HES como unidad portadora polimérica. Se modifica HES de manera que presenta grupos maleimida que reaccionan con los grupos SH de las unidades peptídicas. De acuerdo con el ejemplo, todos los sitios de unión se unen a unidades peptídicas (en este caso, 4) . No obstante, también unidades PEG pequeñas (por ejemplo de 3 a 10 kD) pueden ocupar por lo menos parte de los sitios de unión . Como se ha explicado en lo anterior, el concepto supravalente también se puede ampliar a polímeros dendríticos polivalentes en donde la unidad portadora dendrítica y/o polimérica se conecta a una gran cantidad de péptidos divalentes continuos. Por ejemplo, la unidad de ramificación dendrítica se puede basar en poliglicerol (por favor, véase Haag 2000, incorporada en la presente como referencia) . Un ejemplo de una molécula supravalente basada en una unidad portadora con una unidad de ramificación dendrítica que contiene seis péptidos divalentes continuos se muestra en la figura 4. Otros ejemplos de moléculas supravalentes que comprenden unidades portadoras con almidones o dextranos los cuales se oxidan utilizando por ejemplo ácido peryódico para albergar una gran cantidad de funciones aldehido. En una segunda etapa, muchos péptidos divalentes se unen a la unidad portadora y juntos forman la molécula final. Por favor nótese que incluso varios cientos de unidades peptídicas (por ejemplo 50 a 1000, preferiblemente 150 a 800, de manera más preferible 250 a 700) se pueden acoplar a la molécula portadora la cual es, por ejemplo, HES . No obstante, también unidades peptídicas mucho menores también se pueden unir a la molécula HES, como se muestra en la figura, especialmente si se acoplan péptido miméticos EPO. El número promedio de unidades peptídicas que se van a acoplar se pueden seleccionar de aproximadamente 2 a 1000, 2 a 500, 2 a 100, 2 a 50, preferiblemente 2 a 20 y de manera más preferible 2 a 10, dependiendo del péptido y de uno o varios de los receptores que se van a unir. La figura 5 muestra el concepto de una molécula supravalente biodegradable sencilla. Se conectan dos péptidos divalentes continuos por la parte N terminal por dos porciones PEG bifuncionales que están conectadas vía un enlazante biodegradable que tiene una posición de separación intermedia. Los enlazantes permiten la ruptura de la unidad PEG grande en subunidades por lo que se facilita la depuración renal. Las ventajas relacionadas con el efecto de supravalencia resultan muy sorprendentes e inesperadas. Inicialmente se tenía la preocupación de que la conjugación a macromoléculas pudiera reducir la eficacia. Esta percepción se basa en las desventajas supuestas en la velocidad de unión debido a velocidades de difusión reducidas con moléculas más grandes. Otra preocupación era que, a partir de varios API peptídicos unidos a un portador no todos serían capaces de unirse al receptor potencialmente debido a problemas estéricos de unión simultánea o debido a que el número de receptores los cuales se pueden alcanzar por las extensiones del portador macromolecular es limitado y posiblemente por debajo del número de los API peptídicos. Por lo tanto no se esperaba un incremento en la potencia del API (ingrediente farmacéutico activo) peptídico, como se observa con el concepto de supravalencia de la presente invención. Por otra parte, debido a los cambios farmacocinéticos significativos que es capaz de introducir un portador macromolecular, se ha mejorado la potencia in vivo debido a un tiempo de vida media más prolongado del complejo péptido/portador completo. Este fenómeno también tiene el efecto de que el efecto de supravalencia es difícil de determinar in vivo dado que es una entidad farmacocinámica la cual debe ser determinada por separado. Los análisis in vitro por lo tanto no son suficientes pero pueden ser la única manera útil de demostrar claramente el efecto de supravalencia. El efecto de supravalencia, como se describe en esta invención, se puede demostrar por la comparación de las cantidades molares de péptido API (conjugado a un portador versus no conjugado) . Se llevó a cabo un experimento en un análisis de células TF-1 estándar como lo recomienda la European Pharmacopoe para la determinación de actividad similar a EPO in vitro (por favor véase lo siguiente) . Básicamente, se cultivan células TF-1 (su proliferación depende de la presencia de actividad similar a EPO) en presencia de diversas concentraciones de EPO o de sustancias miméticas a EPO. Los números resultantes de células se cuantifican utilizando un análisis MTT colorimétrico y mediciones fotométricas . En base en estos datos, es posible determinar relaciones normalizadas entre dosis y respuesta cada sustancia dada En este análisis, se utilizan EPO y el péptido AGEM40 (véase en lo siguiente) , éste último es un péptido divalente continuo con actividad mimética de EPO. Se utiliza AGEM40 como un péptido no conjugado y como péptido conjugado a un portador macromolecular (en este caso hidroxietilalmidón del peso molecular medio de 130 kD) . El tamaño de bloque de construcción de este conjugado es de aproximadamente 40 kD, lo que significa que la molécula HES promedio presenta aproximadamente 2-5, preferiblemente 2 a 4 porciones peptídicas. Además, se puede utilizar HES 200/0.5. Después de la modificación de 130 kD, se conjugan aproximadamente 4 péptidos de HES. Cuando se utiliza HES que tiene un peso molecular de 200 kD, esto constituye aproximadamente 5 unidades peptídicas conjugadas a HES. La comparación mostrada en la figura 6 se basa en la comparación molar de la concentración peptídica, ya sea que el péptido esté conjugado o no. En contraste con lo que se esperaba, se incrementa la potencia (disminuye la CE50) y la curva dosis-respuesta se encuentra hacia la izquierda en comparación con el péptido no conjugado) con lo que se demuestra una influencia farmacodinámica positiva de conjugación oligovalente a un portador macromolecular . De esta manera -independientemente de las mejoras farmacocinéticas esperadas- el concepto de conjugación de acuerdo con la invención incrementa claramente la potencia del ingrediente farmacéutico activo general. Este es un mecanismo nuevo el cual ciertamente se puede utilizar para péptidos dirigidos al receptor EPO pero potencialmente también para otros objetivos farmacológicos unidos a membrana, especialmente otros receptores de citocina tales como aquellos para trombopoyetina, G-CSF, interleucinas y otros.
I . Síntesis peptídica de monómeros Síntesis Manual La síntesis se lleva a cabo mediante el uso de sistema Discover microwave (CEM) utilizando PL-Rink-Amide-Resin (tasa de sustitución de 0.4 mmoles/g) o Wang-Resins precargadas en una escala de 0.4 mmoles. La separación del grupo Fmoc se obtiene por adición de 30 mi de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 100 durante 30 seg, 3 veces. El acoplamiento de aminoácidos se obtiene por adición de un exceso de 5 veces del aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50 W durante 30 seg, 5 veces. Entre los todos los ciclos de irradiación la solución se enfría manualmente con ayuda de un baño de hielo. Después de desprotección y acoplamiento, la resina se lava 6 veces con 30 mi de DMF. Después de la desprotección del último aminoácido algunos péptidos se acetilan por incubación con 1.268 mi de solución de remate (4.73 mi de anhídrido acético y 8.73 mi de DIEA en 100 mi de DMSO) durante 5 minutos. Antes de la separación la resina se lava después de 6 veces con 30 mi de DMF y 6 veces con 30 mi de DCM. La separación de los péptidos crudos se obtiene por tratamiento con 5 mi de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución se filtra en 40 mi de éter frío. El precipitado se disuelve en acetonitrilo/agua (l/l) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 µp?, 250 x 4.6 mm) . Síntesis Automatizada La síntesis se lleva a cabo mediante el uso de un sistema de microondas Odyssey (CEM) utilizando PL-Rink- Amide-Resins (tasa de sustitución 0.4 mmoles/g) o Wang-Resins precargadas en una escala de 0.25 mmoles. La separación de los grupos Fmoc se obtiene por adición de 10 mi de piperidina/D F (1:) e irradiación con 100 W durante 10 seg., 10 veces. El acoplamiento de los aminoácidos se obtiene por adición de un exceso de 5 veces de aminoácidos en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50 durante 30 seg., 5 veces. Entre todos los ciclos de irradiación la solución se enfría por burbujeo de nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Después de desprotección y acoplamiento la resina se lava 6 veces con 10 mi DMF. Después de desprotección del último aminoácido algunos péptidos se acetilan por incubación con 0.793 mi de solución de remate (4.73 mi de anhídrido acético y 8.73 mi de DIEA en 100 mi de DMSO) durante 5 minutos. Antes de la separación, la resina después se lava 6 veces con 10 mi de DMF y 6 veces con 10 mi de DCM. La separación de los péptidos crudos se obtiene por tratamiento con 5 mi de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución se filtra en 40 mi de éter frío, el precipitado se disuelve en acetonitrilo/agua (l/l) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 µt?, 250 x 4.6 mm) . Purificación Todos los péptidos se purifican utilizando un equipo Nebula-CLEM-system (Gilson) . El material crudo de todos los péptidos se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 µp?, 250 x 4.6 mm) . El caudal es de 20 ml/min y la proporción de división CLEM, 1/1000.
II . Formación de puente disulfuro intramoleculares Formación de ciclos K3 [ (FeCN6) Solución 1: 10 mg del péptido se disuelven en TFA 0.1%/acetonitrilo y se diluye con agua hasta que se alcanza una concentración de 0.5 mg/ml. Se agrega bicarbonato de amonio sólido para alcanzar un pH de aproximadamente 8. Solución 2 : en un segundo frasco se diluye 10 mi de TFA 0.1%/acetonitrilo con 10 mi de agua. Se agrega bicarbonato de amonio sólido hasta que se alcanza un pH de 8 y se agrega 1 gota de una solución K3 [ (FeCN6) ] 0.1 . La solución 1 y 2 se agregan a gotas durante un período de 3 horas a una mezcla de acetonitrilo/agua (1/1; pH = (8) . La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante la noche y la mezcla se concentra y purifica por CLE . Formación de ciclos con CLEAR-OXMR-resin A 100 mi de acetonitrilo/agua (l/l; 0.1% TFA), se agrega bicarbonato de amonio sólido hasta que se alcanza un H de 8. Esta solución se desgasifica por burbujeo de argón durante 30 minutos. Después se agregan 100 mg de CLEAR-OXMR-resin. Después de 10 minutos se agregan 10 mg del péptido como un sólido. Después de 2 h de incubación el sólido se filtra, concentra y purifica por CLEM. Purificación de péptidos cíclicos: Todos los péptidos se purifican utilizando un equipo Nebula-CLEM-system (Gilson) . El material crudo de todos los péptidos se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) o DMSO y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 o C8 10 µtt?, 250 x 4.6 mm) . El caudal es de 20 ml/min y la proporción de división CLEM es 1/1000. Otra tecnología muy adecuadas para formar puentes disulfuro intramoleculares se describen en PCT/EP2006/012526 , incorporada en la presente como referencia .
III. análisis in vitro con monómeros Análisis de proliferación con células TF-1 por incorporación de BrdU Células TF-1 en fase de crecimiento logarítmico (~ 2 x 105 - 1 x 106 células/ml; medio RPMI ; suero bovino fetal 20%; suplementado con penicilina, estreptomicina, L-glutamina; 0.5 ng/ml de interleucina 3) se lavan (5 minutos en centrifuga, 1500 rpm y se resuspenden en RPMI completo sin IL3 a 500,000 células/ml) y se precultivan antes de inicio del análisis durante 24 horas sin IL-3. Al día siguiente las células se siembran en placas de 24 ó 96 pozos, habitualmente usando por lo menos 6 concentraciones y 4 pozos por concentración que contiene por lo menos 10,000 células/pozo por agente que se va a probar. Cada experimento incluye controles que comprenden EPO recombinante como un agente de control positivo y pozos sin adición de citocina como agente de control negativo. Los péptidos y los controles de EPO se diluyen previamente en medio hasta las concentraciones deseadas y se agregan a los pozos, comenzando un período de cultivo de 3 días bajo condiciones de cultivo estándar o convencionales (37°C, dióxido de carbono 5% en la fase gaseosa, una atmósfera saturada con agua) . Las concentraciones siempre se refieren a la concentración final del agente en el pozo durante el período de cultivo de 3 días. Al final de este período de cultivo se agrega FdU a una concentración final de 8 ng/ml de medio de cultivo y el cultivo continúa durante 6 horas. Después se agregan BrdU (bromodeoxiuridina) y dCd (2-desoxicitidina) a sus concentraciones finales (10 ng/ml de BrdU; 8 ng/ml de dCD; concentraciones finales en medio de cultivo) y el cultivo continúa durante 2 horas adicionales. Al final de esta incubación y período de cultivo las células se lavan una vez en solución salina amortiguada con fosfato que contiene BSA 1.5% y se resuspenden en una cantidad mínima de líquido. A partir de esta suspensión las células se agregan a gotas en etanol 70% a -20°C. De aquí, las células se incuban durante 10 min en hielo y después se analizan directamente o se pueden almacenar a 4°C antes del análisis . Antes del análisis las células se sedimentan por centrifugación, el sobrenadante se desecha y las células se resuspenden en una cantidad mínima de fluido remanente. Las células después se suspenden e incuban durante 10 min en 0.5 mi de HCl 2M /Tritón X-100 0.5%. Después se sedimentan nuevamente y se resuspenden en una cantidad mínima de fluido remanente, el cual se diluye con 0.5 mi de Na2B407 0.1N, pH 8.5 antes resedimentación inmediata de las células. Finalmente, las células se resuspenden en 40 µ? de solución salina amortiguada con fosfato (BSA 1.5%) y se dividen en dos tubos de reacción que contienen 20 µ? de suspensión celular cada uno. Se agregan 2 µ? de anti-BrdU-FITC (DAKO, clone Bu20a) a un tubo y se agregan 2 µ? de mlgGl-FITC control (Sigma) al segundo tubo comenzando un período de incubación de 30 min a temperatura ambiente. Después se agregan 0.4 mi de solución salina amortiguada con fosfato y 10 µg/ml de yoduro de propidio (concentración final) . El análisis en el citómetro de flujo hace referencia a la fracción de células 4C o células con una ploidía superior y a la fracción de células positivas a BrdU y de esta manera se determina la fracción de células en las etapas pertinentes del ciclo celular. Análisis de Proliferación con células TF-1 por MTT Células TF-1 en fase de crecimiento logarítmico (~ 2 x 105 - 1 x 106 células/ml; medio RPMI ; suero bovino fetal 20%; suplementado con penicilina, estreptomicina, L-glutamina; 0.5 ng/ml de interleucina 3) se lavan (5 minutos en centrifuga, 1500 rpm y se resuspenden en RPMI completo sin IL3 a 500,000 células/ml) y se precultivan antes de inicio del análisis durante 24 horas sin IL-3. Al día siguiente las células se siembran en placas de 24 ó 96 pozos, habitualmente usando por lo menos 6 concentraciones y 4 pozos por concentración que contiene por lo menos 10,000 células/pozo por agente que se va a probar. Cada experimento incluye controles que comprenden EPO recombinante como un agente de control positivo y pozos sin adición de citocina como un agente de control negativo. Los péptidos y los controles de EPO se diluyen previamente en medio hasta las concentraciones deseadas y se agregan a las células, comenzando un período de cultivo de 3 días bajo condiciones de cultivo estándar (37°C, dióxido de carbono 5% en la fase gaseosa, una atmósfera saturada con agua) . Las concentraciones siempre se refieren a la concentración final del agente en el pozo durante el período de cultivo de 4 días. En el día 4, antes del inicio del análisis se prepara en varios de los pozos una serie en dilución de un número conocido de células TF-1 (0/2500/5000/10000/20000/50000 células/pozo en 100 µ? de medio) . Estos pozos se tratan de la misma manera que los pozos de prueba y posteriormente proporcionan una curva de calibración a partir de la cual se puede determinar el número de células. Habiendo establecido estos pozos de referencia, se recalientan MTS y PMS del equipo de proliferación MTT (Promega, CellTiter 96 Aqueous análisis de proliferación de células no radiactivo) en un baño maría a 37 °C y se agregan 100 µ? de solución PMS a 2 mi de solución MTS. Se agregan a cada pozo 20 µ? de esta mezcla de las placas de análisis y se incuban a 37°C durante 3-4 h. Se agregan a cada pozo 25 µ? de dodecilsulfato de sodio 10% en agua antes de la medición E492 en un equipo ELISA Reader .
IV. Síntesis de las unidades péptido miméticas de EPO divalentes La síntesis se lleva a cabo mediante el uso del sistema de microondas Liberty (CEM) utilizando Rink-Amide-Resin (tasa de sustitución 0.19 mmoles/g) en una escala de 0.25 mmoles. La separación de los grupos Fmoc se obtiene por tratamiento doble con 10 mi de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 50 W durante 10 seg.; 10 veces. El acoplamiento de los aminoácidos se obtiene por tratamiento doble con un exceso de 4 veces de aminoácidos en D F PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50 durante 30 seg. , 5 veces. Entre todos los ciclos de irradiación la solución se enfría por burbujeo de nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Después de desprotección y acoplamiento la resina se lava 6 veces con 10 mi DMF. Después del ciclo de acoplamiento doble todos los grupo amino que no han reaccionado se bloquean por tratamiento con un exceso de 10 veces de N-(2-clorobenciloxicarboniloxi ) succinimida (solución 0.2 M en DMF) e irradiación con 50 W durante 30 seg, 3 veces. Después de desprotección del último aminoácido el péptido se acetila por incubación con 0.793 mi de solución de remate (4.73 mi de anhídrido acético y 8.73 mi de DIEA en 100 mi de DMSO) durante 5 minutos. Antes de la separación, la resina después se lava 6 veces con 10 mi de DMF y 6 veces con 10 mi de DCM. La separación de los péptidos crudos se obtiene por tratamiento con 5 mi de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución se filtra en 40 mi de éter frío, el precipitado se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 µp?, 250 x 4.6 mm) . Reacción de formación de ciclos Se disuelven 30 mg del peptido lineal en 60 mi de solución A. Esta solución y 60 mi de DMSO se agregan a gotas a 60 mi de solución A (tiempo total de adición: 3 horas) . Después de 48 horas se separa el solvente por evaporación y el residuo remanente se disuelve en 30 mi de DMSO/agua (l/l) . Se agregan 30 mi de ácido acético y 17 mg de yodo (disuelto en DMSO/agua (l/l) ) y la solución se mezcla durante 90 minutos a temperatura ambiente Posteriormente se agregan 20 mg de ácido ascórbico y los solventes se separan por evaporación. La mezcla cruda se disuelve en acetonitrilo/agua (2/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 µta, 250 x 4.6 mm) . Solución A: acetonitrilo/agua (l/l) que contiene TFA 0.1%. El pH se ajusta a 8.0 por la adición de bicarbonato de amonio. Esquema de purificación: purificación del péptido cíclico, Kromasil 100 C18 10 µt?, 250 x 4.6 mm, gradiente de acetonitrilo 5% a 35% (TFA 0.1%) en 50 minutos.
V. Análisis de proliferación in vitro para determinar actividad de EPO Se cuentan células TF1 en fase de crecimiento logarítmico (2 x 10s - 1 x 106 células/ml que crecen en RPMI con suero bovino fetal (FCS) 20% y 0.5 ng/ml de IL-3)y se centrifugan los números de célula necesarios para realizar un análisis (5 minutos, 1500 rpm) y se resuspenden en RPMI con FCS 5% sin IL-3 a 300 000 células/ml. Las células se precultivan en este medio (en ayuno) sin IL-3 durante 48 horas. Antes de comenzar el análisis se cuentan nuevamente las células. Poco antes de iniciar el análisis se preparan soluciones concentradas de péptidos y EPO. Los péptidos se pesan y disuelven en RPMI con FCS 5% hasta una concentración de 1 mM, 467 µ? o 200 µ?. Las soluciones concentradas de EPO son de 10 nM o 20 nM. Se transfieren por pipeta 292 µ? de estas soluciones concentradas en un pozo de una placa de cultivo de 96 pozos - una placa se toma para cada sustancia que se va a probar - . Se transfieren por pipeta 200 µ? de RPMI con FCS 5% en diecisiete pozos adicionales en cada placa. Se transfiere por pipeta 92 µ? de solución concentrada en un pozo que contiene 200 µ? de medio. Los contenidos se mezclan y 92 µ? de este pozo se transfiere al siguiente, y así sucesivamente. De esta manera se prepara una serie de diluciones (18 diluciones) de cada sustancia de manera tal que en cada pozo consecutivo la concentración es l:Vl0 de la concentración del pozo antes de eso. A partir de cada pozo se transfieren 50 µ?, 3 veces a 3 pozos vacíos. De esta manera se mide por cuadruplicado cada concentración de sustancia. Nótese que la línea más superior y más inferior de cada placa queda vacía. Las células pre-tratadas (en ayuno) se centrifugan (5 min. 1500 rpm) y resuspenden en RPMI con FCS 5% a una concentración de 200 000 células por mi. Se agregan a cada pozo 50 µ? de suspensión de células (que contiene 10 000 células) . Nótese que debido a la adición de las células las concentraciones finales de las sustancias en los pozos es la mitad del intervalo de dilución original. Las placas se incuban durante 72 h a 37°C en C02 5%. Antes de comenzar la evaluación se prepara un intervalo de dilución de cantidades conocidas de células TF-1 en pozos: 0/2500/5000/10000/20000/50000 células/pozo se transfieren por pipeta (en 100 µ? de RPMI + FCS 5%) por cuadruplicado . Para medir el número de células vivas por pozo se recalienta en un baño maría a 37°C un reactivo MTT listo para ser usado (Promega, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay) . A cada pozo se le agregan 20 µ? de reactivo MTT y las placas se incuban a 37 °C y C02 5% durante otras 1-2 h. Se agregan 25 µ? de una solución SDS 10% y las placas se miden en un lector ELISA (Genios, Tecan) . Los datos se procesan en hojas de cálculos (Excel) y se grafican en el programa Graphpad.
VI. Análisis peptídicos extendidos En un análisis extendido se prueban varias secuencias peptídicas para determinar su actividad mimética de EPO. Los péptidos se sintetizan como amidas de péptidos en un sistema sintetizador LIPS-Vario. La síntesis se realiza en placas de síntesis MTP especiales, la escala es de 2 µt??? por péptido. La síntesis seguida por el protocolo Fmoc estándar utilizando HOBT como reactivo activador. Las etapas de acoplamiento se realizan como acoplamiento 4 veces. Cada etapa de acoplamiento requiere 25 min el exceso de aminoácido por etapa es de 2.8. La separación y desprotección de los péptidos se realiza con una solución de separación que contiene TFA 90%, TIPS 5%, H20 2.5% y DDT 2.5%. La placa de síntesis que contiene el péptido terminado unido a la resina se almacena en la parte superior de la placa con 96 pozos profundos. Se agrega a cada pozo 50 µ? de la solución de separación y la separación se realiza durante 10 min. Este procedimiento se repite tres veces. El péptido que se separa se eluye con 200 µ? de solución de separación por flujo por gravedad en una placa de pozos profundos. La desprotección de la función de la cadena lateral se realiza durante otras 2.5 h dentro de la placa de pozo profundo. Posteriormente, el péptido se precipita con éter/hexano enfriado con hielo y se centrifuga. Los péptidos se separan en una solución acuosa neutra y se incuba la ciclización durante la noche a 4°C. Se liofilizan los péptidos. La figura 7 proporciona una revisión general de algunos de los monómeros peptídicos sintetizados y probados . Se prueban los péptidos para determinar su actividad mimética de EPO en un análisis de proliferación in vitro. El análisis se realiza como se describe en V. En cada día de análisis, se preparan 40 placas de microtitulación para medir la actividad in vitro de 38 péptidos de prueba, un ejemplo de referencia y EPO, en paralelo. Las soluciones concentradas de EPO son 20 nM.
VII. Síntesis de conjugados de péptido con HES El esquema de reacción principal se muestra en la figura 8. Las estrategias alternativas para acoplamiento de péptidos diméricos en portador se describen en O 2006/136450, incorporado en la presente como referencia. El objetivo del método descrito es la producción de un derivado de un almidón, de acuerdo con este ejemplo HES el cual reacciona selectivamente con grupo tiol bajo condiciones de reacción acuosas y moderadas. Esta selectividad se obtiene con grupos maleimida. Primero se funcionaliza HES con grupo amino y posteriormente se convierten al derivado maleimida respectivo. Los lotes de reacción se liberan de reactivos de peso molecular bajo por medio de membranas de ultrafiltración . El producto, los productos intermedios así como los eductos son todos polidispersos .
Síntesis de amino-HES (AHES) Se obtiene hidroxietilalmidón (es decir, HES 130/0.4 o HES 200/0.5) vía dialfiltración y liofilizado subsecuente. El peso molar promedio es de aproximadamente 130 kD con un grado molar de sustitución de 0.4, respectivamente 200 kD, EM = 0.5. La síntesis se realiza de acuerdo con la síntesis descrita para aminodextrano en el documento de Jacob Piehler, "Modifizierung von Oberfláchen für die thermodynamische und kintische Charakterisierung biomolekularer Erkennung mit optischen Transducern" , 1997, incorporado en la presente como referencia. Se activa HES por oxidación selectiva parcial de los grupos hidroxilo diólicos a grupos aldehido con peryodato de sodio como se describe en Floor et al (1989) . Los grupos aldehido se convierten por medio de aminación reductiva con cianoborohidruro de sodio (Na [B (CN) H3] ) en presencia de amoniaco a grupos amino (Yalpani and Brooks, 1995) . Abertura del peryodato Por medio de oxidación ligera de los 1,2 -dioles en el sacárido por peryodato de sodio en agua se introducen grupos aldehido. Mediante la utilización de diferentes concentraciones molares del agente oxidante el número de grupos de ancla disponibles y así la cantidad de medicamento peptídico en el portador se puede controlar. Para optimizar el procedimiento, la oxidación se supervisa con el reactivo de Purpald que forma un aducto púrpura únicamente con aldehidos. Se puede reducir el tiempo de reacción a 8-18 h. La cantidad usada de peryodato representa 20% del número de bloques de construcción de glucosa (aplicando una masa de bloque de construcción de glucosa de 180 g/mol, DS = 0.4). El trabajado se realiza vía ultrafiltración y liofilizado. La purificación de cada producto polimérico se realiza por técnicas de ultrafiltración utilizando una membrana PES de límites de peso molecular diferentes seguido por liofilización . A partir de los derivados de HES optimizados únicamente se utiliza una masa molar con un intervalo mayor de 100 kD.
Análisis de Aldehido Cualitativo/semi -cuantitativo; reacción de Purpald de los grupos aldehido disponibles Aminación reductiva con cloruro de amonio En la siguiente etapa los grupos aldehido introducidos se convierten en aminas por una aminación reductiva en una solución saturada de cloruro de amonio a un valor de pH ligeramente ácido con cianoborohidruro de sodio . Para optimizar el protocolo, los grupos aldehido del material inicial son seguidos por el reactivo de Purpald y las aminas formadas con TNBS . Estos experimentos han demostrado que la formación del intermediario imina está en un equilibrio después de un período de inicio y el agente reductor agregado prefiere las iminas sobre el aldehido. De esta manera se puede encontrar que la reacción óptima se realiza por adición diversa del agente reductor con un tiempo de reacción total de 24 h. El tratamiento se realiza por medio de precipitación del producto y diafiltración o ultrafiltración.
Análisis de amina Cualitativo: reacción con ninidrina (prueba de Kaiser) Semi -cuantitativo : con ácido 2,4,6-trinitrobenzolsulfónico (TNBS) en comparación con un amino dextrano ..
El grado de sustitución que se obtiene es de aproximadamente 2.8%. Esto resulta en una masa molar de un bloque de construcción que presenta un grupo amino de aproximadamente 6400 g/mol.
Síntesis de maleimidopropionil-amino-hidroxietilamidón ("MalPA-HES") Después de introducción de grupo amino los grupos maleimida anclas se introducen con N-hidroxisuccinimidaésteres de ácido co-maleimidoalquilo (o arilo) . Síntesis La introducción final de los grupos maleimida en el HES se realiza con el éster N-hidroxisuccinimidico del ácido 3 -maleimidopropioníco (MalPA-OSu) . Cuando se utiliza un exceso (5 a 10 veces) en un amortiguador ligeramente ácido la conversión es cuantitativa (amortiguador fosfato 50 mM, pH 7, DMF 20%, durante la noche) . El producto ultrafiltrado y liofilizado se almacena a -18°C.
Análisis La reacción del grupo amino se verifica con ninidrina y TNBS . El número de grupos maleimida introducidos se demuestra por reacción de glutación (GSH) y la detección de grupos tiol excesivos con reactivos de Ellmans, ácido 6 , 6 ' -dinitro-3 , 3 ' -ditiodibenzoico (DTNB) y por medio de espectroscopia de RMN-1!! 700 MHz . El grado de sustitución que se obtiene es de aproximadamente 2% y corresponde a 8500 g/mol por bloque de construcción de maleimida (masa del bloque de construcción de glucosa de 180 g/mol, EM = 0.4) . La figura 9 muestra espectros de RMN-1!! (D20, 700 MHz) de HES modificado con maleimida. La proporción de protón maleimida (6.8 ppm) respecto a C-H anomérico (4.8-5.6 ppm) proporciona un tamaño de bloque de construcción de aproximadamente 6,900 g/mol (en comparación: la prueba GSH/DTNB proporciona 7,300 g/mol). El número de grupos maleimida y así el tamaño de bloque de construcción se puede medir por saturación con GSH y reacción con DTNB. El color amarillo que se forma es significativo y se puede cuantificar con facilidad. Estos valores proporcionan tamaños de bloque de construcción confiables entre 5,000 y 100,000 g/mol, en base en el material inicial utilizado, respectivamente la cantidad de peryodato en la etapa de oxidación. Este método ha sido validado por espectroscopia del producto por RMN-1!!. En el RMN, el contenido de grupos maleimida se puede cuantificar a partir de la proporción de todas las señales C-H anoméricas y los protones de anillo maleimida.
Se prefieren los siguientes intervalos: Tabla 1: Ejemplo del tamaño de bloque de construcción virtual asequible del grupo de ancla en la estructura principal HES vía la oxidación de peryodato.
Conjugado de péptido-hidroxietilalmidón (Pep-AHES) Síntesis Se utiliza un péptido que contiene cisteína el cual tiene una parte N terminal libre (Pep-IA) o biotinada (Pep-IB) . Una mezcla 4:1 de Pep-IA/B se convierte durante la noche en exceso (aproximadamente 6 equivalentes con MalPA-HES en amortiguador fosfato, 50 mM, pH 6.5/DMF 80:20; el tratamiento se lleva a cabo con ultrafiltración y liofilización) Análisis Se determina la absorción UV a 280 nm y se determina el contenido restante de grupos maleimida con GSH/DTNB . El rendimiento de péptido es casi cuantitativo. Casi no son detectables grupos maleimida libres. Para la conjugación del medicamento peptídico a un dominio peptídico Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am (BB68) se utiliza para crear una unidad peptídica al introducir un grupo tiol libre (por ejemplo al introducir un residuo cisteína en la parte N terminal) como en Ac-C (tBu) -GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am (AGEM40) se conjuga un exceso de 10-50% de péptido desprotegido en un amortiguador ligeramente ácido durante 1-2 horas. Las condiciones que se han optimizado para asegurar, por una parte, que la estructura principal HES, los grupos maleimida y los puentes disulfuro sean estables y, por la otra, observar una conversión cuantitativa. Mediante la utilización de diferentes compuestos HES con funcionalidad maleimida se sintetizan diversos peptidomiméticos de EPO supravalentes los cuales han demostrado in vi tro un efecto supravalente.
Tabla 2: Conjugados peptidomiméticos de EPO supravalentes de AGEM40 con diferente contenido peptídico Peptidomim tico Tamaños de Contenido Contenido de EPO los bloques peptídico peptídico supravalente en de teórico (%) experimental HES construcción (%) de grupos maleimida (g/mol) AGEM40-HES A2 7,300 39 37 AGEM40-HES A3 16, 000 23 22 AGEM40-HES A4 44, 000 10 10 Un análisis químico fácil de los conjugados peptidomiméticos de EPO supravalentes se lleva a cabo en dos etapas. En primer lugar se cuantifica el contenido de péptido por CLAP después de hidrólisis suave de la estructura principal HES y en segundo lugar de mide la cantidad de polisacárido por una prueba colorimétrica con fenol después de hidrólisis completa por ácido sulfúrico. La figura 10 muestra un cromatograma de CLAP (Shimadzu CLAP) de hidrólisis TFA/agua de los conjugados peptido miméticos de EPO supravalentes AGEM40-AHES A2. Después de cierto tiempo la absorbancia UV de todas las especies que contienen péptidos es constante a un valor máximo y por comparación con el péptido libre y un contenido de péptido de 37% se puede calcular (valor teórico: 39%) .
VIII. Experimentos in vi ro adicionales Muchos de los experimentos descritos en lo siguiente ya se han descrito en lo anterior. No obstante, los siguientes detalles proporcionan una generalidad de resumen con respecto a las pruebas y resultados descritos. De manera predominante se muestran los análisis de cultivo de células humanas y médula ósea. Por una parte, los análisis basados en líneas de células rápidas se utilizan para verificar la potencia de secuencias peptídicas optimizadas a través de las etapas tempranas de optimización. Estos análisis de cultivo celular aún son válidos como pruebas rápidas de eficacia de un péptido nuevo o un lote nuevo. Los dos criterios de valoración, los cuales se utilizan para la línea de células TF-1 (células humanas) son proliferación (aquí determinado habitualmente como el número de células vivas en puntos de tiempo definidos) y diferenciación como producción marcada de inmoglobina en células TF-1. Además, se utilizan células primarias (blastocitos de médula ósea humana) para los análisis de UFC, los cuales son muy cercanos a la citocina .in vivo.
Esto proporciona respuestas a la actividad eritropoyética en caso de uso de los peptidomiméticos de EPO como unidades peptídicas de una manera más similar a lo que se observa in vivo. No obstante, deben manejarse de manera más sofisticada y necesitan más tiempo por análisis en comparación con los análisis de cultivo celular.
Análisis utilizando células TF-1 humanas TF-1 es una línea de células de eritroleucemia humana que proliferan únicamente en respuesta a ciertas citocinas tales como IL3 o EPO. Además, las células TF-1 pueden diferenciarse hacia un fenotipo eritroide en respuesta a EPO. Las células TF-1 se obtienen de DSMZ (Braunschweig, Alemania) . Está disponible una hoja de producto en el sitio de la red de DSMZ, web site dsmz-de. TF-1 es la línea de células recomendada para determinación de actividad EPO por la European Pharmacopoe : Nuestro procedimiento de cultivo interno para mantenimiento del cultivo: Medio: RPMI+P/S+AmphoB+L-Glut . +20%FCS+h-IL-3 1. -500 mi RPMI + 5 mi P/S + 5 mi AmphoB 2. -200 mi RPMI + PS/AmphoB+ 2.5 mi L-Glutamina + 50 mi FCS = medio completo (1 mes, 4°C) 3. -45 mi de medio completó + 22.5 1 de h-IL-3 (1 semana, 4°C) Cultivo: Mantener entre 200,000 y 1,000,000 de células/ml durante 3 días 2 x 105/ml • Durante 2 días, 3 x 105/ml · Durante 1 día 5 x 105/ml Diseño de un análisis de proliferación TF-1 En un análisis de proliferación TF-1, se siembran y cultivan células TF-1 durante varios días en concentraciones variables de EPO o peptidomiméticos de EPO en una placa de pozos múltiples. Para resultados óptimos las células TF-1 se deben cultivar durante dos días en ausencia de citocina alguna (en ayuno) antes de iniciar el análisis. Tres días después de iniciar el análisis se mide la proliferación celular indirectamente al realizar un análisis respecto al número de células viables. Se agrega un reactivo de tetrazolio, denominado MTS, el cual se reduce a formazano coloreado. Esta reacción depende de NADH y NADPH, en otras palabras, depende de la actividad mitocondrial . Se mide espectrofotométricamente la cantidad de formazano. Utilizando un intervalo de número de células conocidas para calibración, es posible determinar el número absoluto de células viables presentes bajo cada condición. El diseño principal también se ilustra en la figura 11. La actividad de ciertos agentes en el análisis de determina por: 1. determinar si este agente provoca un incremento en el número de células viables a cierta concentración, y 2. a cual concentración este agente ejerce un efecto semimáximo (determinación de CES0) .
Resultados de los análisis de proliferación de TF-1 Como una marca general, debe mencionarse que todos los peptidomiméticos de EPO (EMP1 y los péptidos modificados descritos en lo anterior) se comportan en su forma monomérica en este análisis como agonistas parciales, es decir, la respuesta máxima es más débil que la respuesta que se observa con EPO. No obstante, el análisis se puede utilizar para determinar el desplazamiento a la derecha/izquierda en gráfica normalizadas y de esta manera determinar el resultado de las optimizaciones. Esto especialmente, dado que se conoce que la actividad agonista incrementa considerablemente por dimerización. La primera gráfica muestra este efecto en respuesta absoluta sin normalización. Todas las otras gráficas muestran gráficas normalizadas las cuales permiten determinación de los valores CE50 a partir de las curvas.
En los análisis se utilizan dos sustancias de referencia : 1) EMP1, una secuencia peptídica publicada con propiedades miméticas de EPO conocidas (Jhonson et al, 1997) . 2) Eritropoyetina Humana Recombinante (EPO), que se adquiere en la farmacia como producto Ortho Biotech Epoetin alfa (nombre comercial en Alemania: ErypoMR) Las gráficas de estas sustancias se proporcionan como líneas negras, continuas para EPO y con líneas discontinuas para EMP1. Los peptidomiméticos de EPO modificados con prolina se muestran en las siguientes figuras como líneas continuas de color. Estos péptidos modificados muestran la siguiente secuencia: 1) BB49 Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG muestra una eficacia y potencia en el mismo intervalo que EMP1 2) BB68 Ac-GGTYSCHFGKLT-Na1 -VCKKQRG-Am es incluso más efectiva que EMP1 y BB49 3 ) AGEM40 Ac-C (tBu) -GGTYSCHFGKLT- a1 -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT- Nal-VCKKQRG-Am la cual es un péptido continuo divalente el cual se diseña en base en la secuencia de BB68 que muestra características mejoradas 4) AGEM40_HES, el cual es un péptido avanzado, altamente eficaz y potente (AGEM40) HESilado de acuerdo con el principio de supravalencia de la presente invención. Estas secuencias se utilizan como ejemplos, por ejemplo, con el fin de ilustrar los beneficios del principio de supravalencia. La figura 12 muestra los resultados de peptidomiméticos de EPO monoméricos en comparación con EPO. La figura 12 incluye una gráfica de los datos reales de absorbancia que documentan la diferencia absoluta entre péptidos en general y en este análisis de EPO. La figura 13 proporciona los valores de CES0 calculados a partir de gráficas normalizadas ajustadas. La figura 14 muestra el efecto mejorado de BB68 en comparación con BB49. Utilizando BB68 optimizado como bloque de construcción para crear una unidad peptídica de acuerdo con la presente invención, el efecto mejora por dos ordenes de magnitud adicionales. Esto se documenta en la figura 14 y en la tabla correspondiente que se muestra en la figura 15. Las unidades peptidicas diméricas después se acoplan al portador macromolecular HES a una densidad optimizada. El AP resultante es por lo menos equipotente a EPO en una comparación molar y muy cercano a EPO en una comparación en masa (véase figura 16 y figura 17 abajo) . La figura 16 y las figuras y las tablas anteriores demuestran claramente la gran potencia del concepto de supravalencia . Manteniendo la precisión en mente, la cual se puede obtener con un análisis de cultivo celular, el API obtenido es por lo menos equipotente a EPO in vi tro. Por lo tanto es superior a cualquier API peptidomimético para EPO conocido que no utilice el concepto de supravalencia. Análisis de médula ósea La médula ósea contiene citoblastos hematopoyeticos con un potencial de autorrenovación y desarrollo en todos los tipos de células sanguíneas. Además, la médula ósea contiene células progenitoras comprometidas capaces de desarrollarse en una o en varias líneas de células sanguíneas. Entre estas células progenitoras algunas se desarrollan en eritrocitos (progenitores eritroides) . Las células progenitoras se pueden demostrar al sembrar células de médula ósea en placa en medio semi-sólido basado en metilcelulosa . En presencia de una combinación apropiada de citocina las células progenitoras proliferan y se diferencian para proporcionar una colonia de células de cierta línea. Los progenitores mieloides se desarrollan en colonias granulocíticas (derivadas de un UFC-G) , colonias monocíticas (a partir de UCF-M) o colonias granulocíticas-monocíticas mixtas (a partir de UFC-GM) . Los progenitores eritroides se desarrollan en una colonia de eritrocitos (células rojas) . Dependiendo del tamaño de la colonia eritroide, las células progenitoras se denominan BFU-E (que proporciona colonias de 200 células o mayores) o CFU-E (que proporciona colonias de menos de 200 células) . Las células progenitoras en una etapa anterior de involucramiento pueden desarrollarse en colonias mixtas granulocíticas-eritroides-monocíticas-megacariocíticas . Estos progenitores tempranos se denominan UFC-GEM . EPO estimula el desarrollo de colonias eritroides a partir de BFU-E o UFC-E si están presentes también ciertas citocinas diferentes. Sin EPO no se pueden desarrollar colonias eritroides. El crecimiento de colonias eritroides a partir de un lote homogéneo de células de médula ósea en metilcelulosa , por lo tanto es una medida de la actividad de EPO. Dado que los procedimientos mencionados antes son muy similares, sino idénticos al procedimiento que se lleva a cabo en médula ósea in vivo, son un excelente elemento de predicción de la actividad similar a EPO.
Diseño de análisis de médula ósea Se calientan de criofrascos células de médula ósea humana (disponibles comercialmente de Cryosystems, verificadas serológicamente) , se siembran en placa en medio de metilcelulosa con un fondo dado de citocinas (pero sin EPO) a una densidad celular fija. Se agrega EPO o peptidomimético de EPO a concentraciones variables. Se incuban los cultivos durante 12-14 días a 37°C, y después se determina la cantidad de colonias mieloides y eritroides por inspección microscópica. Criterios de valoración de los análisis de médula ósea: 1. Premisas: los cultivos sin EPO únicamente proporcionan colonias mieloides (blancas) pero no eritroides (rojas) . Los cultivos con EPO deben proporcionar un incremento, que depende de la concentración, en colonias de células rojas y un incremento, que depende de la concentración, en los tamaños de las colonias de células rojas . 2. Un péptido muestra actividad mimética de EPO si provoca un incremento, que depende de la concentración, en colonias de células rojas y un incremento, dependiente de la concentración, en los tamaños de las colonias de células rojas. No obstante, un péptido no debe interferir con el número de colonias mieloides que se obtengan.
Resultados de los análisis en médula ósea Los peptidomiméticos de EPO modificados con prolina descritos en lo anterior no estimulan la formación de colonias mieloides, pero muestran actividad significativa sobre la formación de colonias rojas. De manera cualitativa esto se muestra en la figura 18 en una fotografía de una placa de cultivo, mientras que la cuenta de colonias se documenta en la figura 19.
IX. Análisis de reactividad cruzada con anticuerpo Como se describe en la introducción de esta solicitud, los pacientes algunas veces desarrollan anticuerpos contra rhuEPO. Esto genera consecuencias graves descritas en la introducción. Con el fin de explorar adicionalmente las propiedades de los péptidos de acuerdo con la invención se analiza si los péptidos de hecho dan sección cruzada con anticuerpos an i-EPO. Se utilizan para las pruebas sueros de conejo y humanos que contienen anticuerpos anti-EPO. Estos sueros se tratan previamente ya sea con EPO o los siguientes peptidomiméticos de EPO: Ac-C-GGTYSCHFGKLT-1na1 -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT- 1na1 -VCKKQRG-Am (péptido de prueba 1) Ac-GGTYSCHFGKLT- 1na1 -VCKKQRG-Am (péptido de prueba 2) Ac = parte N terminal acetilada. Am = parte C terminal amidada lnal = 1-naftilalanina . En el análisis se utilizan concentraciones diferentes de eritropoyetina y peptidomiméticos de EPO. Después del tratamiento previo de los sueros con las sustancias de prueba con el fin de adsorber los anticuerpos anti-EPO presentes en los sueros, los sueros se tratan con eritropoyetina marcada radioactivamente. Los anticuerpos que permanecen en los sueros después de la etapa de adsorción previa se unen por la eri ropoyetina y nuevamente inmunoprecipitan . El procedimiento utilizado para esta prueba se describe en Tacey et al., 2003, incoporado en la presente como referencia. Los resultados de la adsorción previa realizada con el anticuerpo anti-EPO que contienen sueros utilizando ya sea EPO o peptidomiméticos de EPO de acuerdo con la invención se muestran en la figura 20. Cuando los sueros se tratan de antemano con peptidomiméticos de EPO, los sueros posteriormente dan prueba positiva cuando se ponen en contacto con eritropoyetina marcada radioactivamente. De esta manera, los anticuerpos anti-EPO se detectan en los sueros sin importar el tratamiento previo. Esto significa que los peptidomiméticos de EPO no son capaces de unirse a los anticuerpos anti-EPO durante el tratamiento previo. En ausencia de una actividad de unión, los anticuerpos anti-EPO no son eliminados de los sueros junto con los péptido miméticos de EPO y por lo tanto permanecen en los sueros. Los anticuerpos anti-EPO no son capaces de reconocer y por lo tanto de unirse a los peptidomiméticos de EPO. Se utiliza como control EPO humana recombinante (rhuEPO) . Cuando los sueros se tratan previamente con eritropoyetina, no son detectables muchos anticuerpos en el análisis subsecuente que incorpora eritropoyetina marcada radioactivamente dado que los anticuerpos ya se han unido y eliminado por el tratamiento previo con eritropoyetina. Los valores numéricos que se muestran en la figura 20 representan el porcentaje cpm de las cuentas totales utilizadas en el IP. Se determina un suero como positivo cuando el valor de porcentaje de cpm es > 0.9. 100% de cpm representa la cantidad de cuentas usadas totales (el trazador radioactivo) , actualmente la EPO marcada radioactivamente. El análisis demuestra que los peptidomiméticos de EPO de acuerdo con la invención ventajosamente no muestran reactividad a anticuerpos anti-EPO. Los peptidomiméticos de EPO descritos en la presente de esta manera deben mostrar un efecto terapéutico incluso en pacientes quienes desarrollaron anticuerpos contra rhuEPO. Además, se espera que los anticuerpos contra los peptidomiméticos de EPO no unan eritropoyetina . Los peptidomiméticos de EPO de acuerdo con esta invención por lo tanto preferiblemente también están caracterizados porque no muestran reactividad cruzada significativa con anticuerpos anti-EPO.
X. Eficacia en primates La eficacia de los peptidomiméticos de EPO de acuerdo con la presente invención también se probó en estudios en animales en donde se utilizaron para la prueba 7 monos que previamente habían sido expuestos (macaca fascicularis) . El péptido de prueba es AGEM 400 HES (véase antes) el cual se utilizó como un polvo liofilizado, disuelto en solución Ringer. Se probaron dosis entre 0.01 mg/kg y 50 mg/kg (administración intravenosa) . Los experimentos en animales mostraron que los peptidomiméticos de EPO muestran una buena eficacia mimética de EPO incluso a dosis bajas y presentan un efecto de duración prolongada. Además, no se observaron signos de toxicidad.
Referencias : Wrighton NC, Balasubramanian p. Barbone FP, Kashyap AK, Farrell FX, Jolliffe L, Barrett RW, Dower WJ (1997) Increased potency ot an erythropoietin peptide mimetic through covalent dimerization. Nature Biotechno.logy 15:1261-1265 righton NC, Farrell FX, Chang R, Kashyap AK. Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barrett R , Jolliffe LK, Dower WJ (1996) Small Peptides as Potent imetics of the Protein Hormone Erythropoietín. Science 273:458-463 Johnson, D. L, F. X. Farrell , et al . (1997). "Amino- terminal dimerization ot an erythropoietín mimetic peptide results in increased erythropoietic activity." Chemistry and Biology 4: 939-950. Johnson, D. L, F. X. Farrell, et al . (1998).
"Identification of a 13 Amino Acid Peptide Mimetic of Erythropoietín and Description of Amino Acids Critical for the Mimetic Activity of EMPl". Biochemistry 37,3699 - 3710. Haag R. Sunder A, Stumbé JF, J. Am. Chem. Soco (2000) , 122, 2954. Roberts, M. J. , M. D. Bentley, et al. (2002) . "Chemistry for peptide and protein PEGylation. " Advanced Drug Delivery Review 54(4): 459-476. Richard Tacey, Anthony Greway, Janice Smiell, David Power, Amo Kromminga, Mohamed Daha, Nicole Casadevall and Marian Kelley: The detection of antierythropoietin antibodies in human serum and plasma - Part 1. Validation ot the protocol tor a radioimmunoprecipitation assay; J Immunol Methods . 2003 Dec; 283 (1-2) : 317-29. Zalipsky S, Qazen. S, Walker II JA, Mullah N, Quinn YP, (1999) "New detachable poly (ethylene glycol) conjugates: Cysteine-cleavable lipopolymers regenerating natural phospholipid, diacyl phosphatidylethanolamine , Bioconjug. Chem. 10: 703-707. Zhao, X. et al (1997) , "Novel Degradable Poly (ethylene glycol) esters tor drug delivery." In "Poly (ethylene glycol) chemistry and biological applications ; Harris JM, Zalipsky, S. Eds . ; ACS Symposium Series 680; American Chemical Society: Washington DC, 1997; 458-472.

Claims (93)

REIVINDICACIONES
1. Péptido que es capaz de unirse al receptor EPO, que se selecciona del grupo que consiste de: -péptidos que comprenden la siguiente secuencia de consenso de aminoácidos: en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente, o A es ácido -amino- -bromobutírico ; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina; o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; Xlx se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; X13W, 1-nal, 2 -nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -broraobutírico y -fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos definidos por la secuencia de consenso anterior que muestran actividad mimética de EPO y que tengan un aminoácido en la posición X10 que constituya un cambio no conservador de prolina o en donde X9 y X10 estén sustituidos por un aminoácido único.
2. Péptido como se describe en la reivindicación 1, en donde los aminoácidos en la posición X6 y X15 se seleccionan de manera que son capaces de formar un puente intramolecular dentro del péptido al formar un enlace covalente entre sus cadenas laterales .
3. Péptido como se describe en la reivindicación 2, en donde el puente es un puente disulfuro o diselenurio.
4. Péptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el aminoácido en X6 y/o X15 se selecciona del grupo que comprende cisteína, derivados de cisteína tales como homocisteína y selenocisteína, tiolisina, K o E.
5. Péptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde X13 es naftilalanina .
6. Péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud, capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista que se selecciona de las siguientes dos alternativas: (a) un péptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de núcleo: ^9^10^11^12^13 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina o Xg y X10 están sustituidos por un solo aminoácido; X1X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; X13 es naftilalanina ; (b) un péptido, especialmente uno que es capaz de unión al receptor EPO que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es C, A, E, ácido -amino- -bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W, o Y o R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina ; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina; o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único ; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T o A; X13 es 1-nal, 2-nal; X14 es D, E, I, L o V; X1S es C, A, K, ácido -amino- -bromobutírico u homocisteína (hoc) ; con la condición de que cualquiera de X6 o X15 sea C u hoc; (c) fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos definidos por las secuencia de consenso anteriores que muestran una actividad mimética de EPO y que tienen un aminoácido en la posición X10 que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único y una naftilalanina en posición X13.
7. Péptido como se describe en la reivindicación 6, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de núcleo: en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde: X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina ; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es naftilalanina; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico.
8. Péptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque muestra un aminoácido cargado en la posición X10.
9. Péptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprenden las siguientes posiciones de aminoácidos adicionales: ^16^17^18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales , y X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X17 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, R, K, Y, Har; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido .
10. Péptido como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque X17 es un aminoácido cargado.
11. Péptido como se describe en la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque X19 es un aminoácido cargado.
12. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el aminoácido cargado en posición X10, X17 y/o Xg está cargado positiva o negativamente y se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos que forman derivados.
13. Péptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque X10, xi7 y/° xi9 es un aminoácido cargado negativamente.
14. Péptido como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente, los cuales preferiblemente muestran una cadena lateral tal como Aad, 2 -aminoheptanodiácido, Asu; aminoácidos originalmente cargados positivamente los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarlos con un grupo cargado negativamente.
15. Péptido como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque el grupo utilizado para convertir aminoácidos cargados positivamente en aminoácidos cargados negativamente se selecciona de diácidos tales como, por ejemplo, ácidos dicarboxílicos o ácidos disulfónicos .
16. Péptido como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el aminoácido cargado positivamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina u ornitina ; aminoácidos no naturales cargados positivamente los cuales muestran en la posición X10 y/o X17 preferiblemente una cadena lateral agrandada tal como en, por ejemplo, homoarginina; aminoácidos originalmente cargados negativamente los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarlos con un grupo cargado positivamente.
17. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde X8 es un D-aminoácido, preferiblemente D-fenilalanina .
18. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: X4X5X6 ' ^7^8^9^10^11^12X13^14^15X16X17^18^19 en donde X6 a X19 tienen el significado anterior, y en donde: X4 es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y tiene por lo menos un sustituyente que retira electrones en donde el sustituyente que retira electrones preferiblemente se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos y en donde X4 preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de 4 -aminofenilalanina, 3-aminotirosina, 3-yodotirosina, 3 -nitrotirosina, 3 , 5-dibromotirosina, 3,5-dinitrotirosina, 3 , 5-diyodotirosina; X5 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I.
19. Péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista que se selecciona del grupo que consiste de: péptidos que comprenden por lo menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de núcleo: X9X10X11X12X13 ; XgX10X11X12X13X14X15X16X17 o X9X10X11X12X13X14X1SX16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde por lo menos una de las posiciones X10, X17 o X19 es un aminoácido cargado negativamente, y en donde: X9 es G o un cambio conservador de G; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X1S es un aminoácido con funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido amino- -bromobutirico, X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q. fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos definidos por las secuencias de consenso anteriores que muestran una actividad mimética de EPO y en donde en por lo menos una de las posiciones X10, X17 o X19 es un aminoácido cargado negativamente .
20. Péptido como se describe en la reivindicación 19, que comprende la siguiente secuencia de consenso agrandada: X6 ' X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde X6 es un aminoácido con funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A, o ácido amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina ; X9 es G o un cambio conservador de G; en caso de que X10 no sea un aminoácido cargado negativamente, X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina, o X9 y X10 se sustituyen por un aminoácido único; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es , 1-nal, 2 -nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico ; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; en caso de que X17 no sea un aminoácido cargado negativamente, X17 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido cargado positivamente, natural o no natural o que ha formado un derivado, preferiblemente K, R, H, ornitina u homoarginina; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; en caso en que X19 no sea un aminoácido cargado negativamente, X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado positivamente como K, R, H, ornitina u homoarginina con la condición de que por lo menos uno de X10, X17 o X19 sea un aminoácido cargado negativamente, de manera preferible X19.
21. Péptido como se describe en la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente los cuales preferiblemente muestran una cadena lateral alargada tal como Aad, 2-aminoheptanodiácido, Asu, aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado negativamente.
22. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque en el caso de que esté presente un aminoácido cargado positivamente en por lo menos una de las posiciones X10, X17 y/o X19 se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina y orinitina ; aminoácidos no naturales cargados positivamente los cuales muestran en la posición X10 y/o X17 preferiblemente una cadena lateral alargada tal como en, por ejemplo, homoarginina ; aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente.
23. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 19 a 22, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X7X8 9 10 11 12 13 1 X15 16 17X18 19 en donde X6 a X19 tienen el significado anterior, y en donde : X4 es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que retira electrones; X5 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I.
24. Péptido como se describe en la reivindicación 23, en donde el sustituyente que retira electrones se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos y en donde X4 preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de 4-aminofenilalanina, 3 -aminotirosina, 3 -yodotirosina, 3-nitrotirosina, 3 , 5 -dibromotirosina , 3 , 5-dinitrotirosina, 3 , 5-diyodotirosina .
25. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque X13 es naftilalanina .
26. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 19 a 25, el cual se selecciona del grupo que consiste de: Ac-GGTYSCHFGKLT- a1 -VCKKQDG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal -VCKKQEG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Na1 -VCKKQ-Aad-G-Am Ac-GGTYSCHFGELT-Nal -VCKKQRG-Am Ac-GGTYSCHFGDLT-Na1 -VCKKQRG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Na1 -VCKEQRG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Na1 -VCKDQRG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Na1 -VCK-K (G1r) -QRG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal -VCK-K (Adi ) -QRG-Am Ac-GATYSCHFGKLT-Nal-VCKKQ-Aad-G-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCK-Har-QDG-Am Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCK-Har-Q-Aad-G-Am GGGTYSCHFGKLT-Nal -VCKKQEG-Am GGGTYSCHFGKLT-Na1-VCKKQ-Aad-G-Am
27. Péptido de una longitud de por lo menos 10 aminoácidos, capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista, que se selecciona del grupo que consiste de: péptidos definidos por la siguiente secuencia de aminoácidos de núcleo: X8X9X10X11X12X13X14X15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde : X8 es un D-aminoácido; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina; o X9 y X10 están sustituidos por un solo aminoácido ; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina ,- X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico, y fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos definidos por la secuencia de consenso anterior que muestran una actividad mimética de EPO y que tienen un D-aminoácido en la posición X8.
28. Péptido como se describe en la reivindicación 27, que comprende la siguiente secuencia de núcleo de aminoácidos : en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde: X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es D-M, D-F, D-I, D-Y, D-H, D-homoserinametiléter o D-norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina; o X9 y X10 están sustituidos por un solo aminoácido; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o un ácido -amino- -bromobutírico.
29. Péptido como se describe en la reivindicación 27 ó 28, caracterizado porque X8 es D-fenilalanina .
30. Péptido como se describe en la reivindicación 27 a 29, caracterizado porque muestra un aminoácido cargado en la posición X10.
31. Péptido como se describe en la reivindicación 27 a 30, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: en donde X6 - X15 tiene el significado anterior y en donde : X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X17 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente, A, G, P, Y o un aminoácido natural, no natural o que forma un derivado, cargado positivamente, preferiblemente, K, R, H, orinitina u homoarginina ; Xló se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido .
32. Péptido como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque X17 es un aminoácido cargado.
33. Péptido como se describe en la reivindicación 31 ó 32, caracterizado porque X19 es un aminoácido cargado.
34. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 30 a 33, en donde el aminoácido cargado en la posición X10, X17 y/o X19 está cargado positiva o negativamente y se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos que forman derivados.
35. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque X10, X17 y/o X19 es un aminoácido cargado negativamente.
36. Péptido como se describe en la reivindicación 35, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente los cuales preferiblemente muestran una cadena lateral alargada tal como en Aad, 2-aminoheptanodiácido, Asu; aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado negativamente.
37. Péptido como se describe en la reivindicación 36, caracterizado porque el grupo usado para convertir aminoácidos cargados positivamente en aminoácidos cargados negativamente se selecciona de diácidos tales como, por ejemplo, ácidos dicarboxílieos o ácidos disulfónicos .
38. Péptido como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el aminoácido cargado positivamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina y ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente los cuales muestran en la posición X10 y/o X17 preferiblemente una cadena lateral alargada tal como en, por ejemplo, homoarginina ; aminoácidos originalmente cargados de manera negativa en los cuales, no obstante, forman derivados con grupo químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente.
39. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 27 a 38, que comprende la secuencia de aminoácidos : X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X1BX19 en donde X6 a X19 tienen el significado anterior y en donde : X4 es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que retira electrones; Xs se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I.
40. Péptido como se describe en la reivindicación 39, en donde el sustituyente que retira electrones se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos.
41. Péptido como se describe en la reivindicación 39, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de 4-aminofenilalanina, 3 -aminotirosina, 3-yodotirosina, 3 -nitrotirosina, 3 , 5 -dibromotirosina , 3,5-dinitrotirosina y 3 , 5 -diyodotirosina .
42. Péptido de una longitud de por lo menos 10 aminoácidos capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista que se selecciona del grupo que consiste de: péptidos caracterizados por la siguiente secuencia de aminoácidos de núcleo: en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: X4 es F, o un derivado ya sea de F o Y, en donde el derivado de F o Y presentan por lo menos un sustituyente que retira electrones; Xs se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I ; X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente, o A o ácido -amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; X, es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; X1X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico; fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos definidos por la secuencia de consenso anterior que muestran una actividad mimética de EPO y que tienen un aminoácido en la posición X10 que constituye un cambio no conservador de prolina o en donde X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único y que tienen en posición X4 F o un derivado ya sea de F o Y, en donde el derivado de F o Y presenta por lo menos un sustituyente que retira electrones.
43. Péptido como se describe en la reivindicación 42, en donde el sustituyente que retira electrones se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos.
44. Péptido como se describe en la reivindicación 42, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de 4 -aminofenilalanina, 3 -aminotirosina, 3-yodotirosina, 3 -nitrotirosina, 3 , 5-dibromotirosina, 3,5-dinitrotirosina y 3 , 5-diyodotirosina .
45. Péptido como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 42 a 44, caracterizado porque muestra un aminoácido cargado en la posición X1Q .
46. Péptido como se describe en la reivindicación 42, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : X6X7X8X9X10X11X12X13X14X1SX16X17X18X19 en donde X6-X15 tienen el significado anterior, y en donde : X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X17 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, o Y; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido.
47. Péptido como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque X17 es un aminoácido cargado.
48. Péptido como se describe en la reivindicación 46 ó 47, caracterizado porque X19 es un aminoácido cargado.
49. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 45 a 48, en donde el aminoácido cargado en la posición X10, X17 y/o X19 está cargado positiva o negativamente y se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos que forman derivados .
50. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 45 a 49 precedentes, caracterizado porque xio Xi7 y/° xi9 es un aminoácido cargado negativamente.
51. Péptido como se describe en la reivindicación 50, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente, los cuales preferiblemente muestran una cadena lateral alargada tal como en Aad, 2-aminoheptanodiácido , Asu aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado negativamente.
52. Péptido como se describe en la reivindicación 51, caracterizado porque el grupo usado para convertir aminoácidos cargados positivamente en aminoácidos cargados negativamente se selecciona de diácidos tales como, por ejemplo, ácidos dicarboxílicos o ácidos disulfónicos .
53. Péptido como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el aminoácido cargado positivamente se selecciona del grupo que consiste de: aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina y ornitina; aminoácidos no naturales cargados positivamente los cuales muestran en la posición X10 y/o X17 preferiblemente una cadena lateral alargada tal como en, por ejemplo, homoarginina; aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, forman derivados con grupo químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente.
54. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 42 a 53, en donde X8 es un D-aminoácido , preferiblemente D-fenilalanina .
55. Péptido con una longitud de por lo menos 10 aminoácidos capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista que se selecciona del siguiente grupo de péptidos: (a) un péptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de núcleo: X9X10X11X12X13 ; X9X10X11X12X13X14X15X16X17 ?9?10?11?12?13?14?15?16?17??8??9 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: Xg es G o un cambio conservador de G; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, naftilalanina, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido amino- -bromobutirico ; así como fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos definidos por la secuencia de consenso anterior que muestran actividad mimética de EPO, en donde por lo menos una de las posiciones X10, X16, X17 o X19 muestra un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina; (b) un péptido, especialmente uno capaz de unirse al receptor EPO que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es C, A, E, ácido -amino- -bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W, Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es Har; X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T o A; X13 es W, 1-nal, 2 -nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es C, A, K, ácido -amino- -bromobutírico u homocisteína (hoc) ; con la condición de que cualquiera de X6 o X15 sea C u hoc; (c) un péptido, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18 en donde X6 a X15 tiene el significado anterior de la variante del inciso (b) y en donde: X3 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V; X4 es Y; Xs se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T; X17 es homoarginina; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido.
56. Péptido como se describe en la reivindicación 55, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de núcleo: ^6^7^8^9^10^11^12^13^1 ^1S^16^17^18^19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde: X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido -amino- -bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es , F, I, Y, H, hornoseriñametiléter o norisoleucina ; X9 es G o un cambio conservador de G; en caso de que X10 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; X1X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar no cargado o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X1S es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido amino- -bromobutírico; en caso de que X16 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T; en caso de que X17 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X17 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido natural, no natural o que forme un derivado, cargado positivamente, preferiblemente K, R, H u ornitina; Xia se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; en caso de que X19 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado positivamente tal como K, R, H u ornitina; con la condición de que por lo menos uno de X10, X16, X17 o X19 sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina.
57. Péptido como se describe en la reivindicación 56, en donde por lo menos uno de X10, X16, X17 o X19 es un aminoácido cargado positivamente y en donde el aminoácido cargado positivamente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados positivamente, por ejemplo lisina, arginina, histidina y ornitina; - aminoácidos no naturales cargados positivamente los cuales preferiblemente muestran una cadena lateral alargada en comparación con lisina; - aminoácidos originalmente cargados de manera negativa los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado positivamente; con la condición de que por lo menos uno de X10, X16, X17 o X19 sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina.
58. Péptido como se describe en la reivindicación 57, en donde el alargamiento del aminoácido cargado positivamente se proporciona por unidades de alargamiento de la cadena lateral en donde las unidades de alargamiento son grupos alifáticos o aromáticos.
59. Péptido como se describe en la reivindicación 58, en donde el alargamiento se proporciona por unidades CH2 en donde el número de unidades CH2 preferiblemente está entre 1 y 6.
60. Péptido como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 55 a 59, en donde el aminoácido no proteinogénico cargado positivamente el cual está alargado en comparación con lisina es un aminoácido no natural.
61. Péptido como se describe en la reivindicación 60, en donde el aminoácido no natural se selecciona del grupo que comprende homoarginina, aminofenilalanina y aminonaftilalanina .
62. Péptido como se describe en la reivindicación 56, caracterizado porque X10 o X17 es un aminoácido cargado.
63. Péptido como se describe en la reivindicación 56, caracterizado porque X19 es un aminoácido cargado.
64. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 55 a 63, en donde el aminoácido cargado en la posición X10, X17 y/o X19 está cargado positiva o negativamente y se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos que forman derivados.
65. Péptido como se describe en la reivindicación 64, caracterizado porque X10, X17 y/o X19 es un aminoácido cargado negativamente. .
66. Péptido como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque el aminoácido cargado negativamente se selecciona del grupo que consiste de: - aminoácidos naturales cargados negativamente, especialmente D o E; aminoácidos no naturales cargados negativamente, los cuales preferiblemente muestran una cadena lateral alargada tal como Aad, 2-aminoheptanodiácido, Asu - aminoácidos originalmente cargados de manera positiva los cuales, no obstante, forman derivados con grupos químicos adecuados con el fin de proporcionarles un grupo cargado negativamente.
67. Péptido como se describe en la reivindicación 66, caracterizado porque el grupo utilizado para convertir aminoácidos cargados positivamente en aminoácidos cargados negativamente se seleccionan de diácidos, tales como por ejemplo ácidos dicarboxílieos o ácidos disulfónicos .
68. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 55 a 67, en donde X8 es un D-aminoácido, preferiblemente D-fenilalanina .
69. Péptido como se describe en una de las reivindicaciones 55 a 68, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: en donde X6 a X19 tienen el significado indicado antes, y en donde: X4 es F, Y o un derivado de F o Y, en donde el derivado de F o Y tiene por lo menos un sustituyente que retira electrones; Xs se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I.
70. Péptido como se describe en la reivindicación 69, en donde el sustituyente que retira electrones se selecciona del grupo que consiste del grupo amino, el grupo nitro y halógenos.
71. Péptido como se describe en la reivindicación 70, en donde X4 se selecciona del grupo que consiste de 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-yodo-tirosina, 3 -nitro-tirosina , 3 , 5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina , 3 , 5 -diyodo-tirosina .
72. Peptidomimético de EPO, que comprende por lo menos dos secuencias de consenso peptidomiméticas de EPO monoméricas en donde por lo menos una de las secuencias de consenso peptídicas monoméricas es un péptido como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 71.
73. Péptido como se describe en la reivindicación 72, el cual es un dímero y comprende por lo menos una secuencia de consenso peptídica monomérica como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 71.
74. Compuesto que se une a moléculas objetivo, que comprende : (i) por lo menos dos unidades peptídicas en donde cada unidad peptídica comprende por lo menos dos dominios con una capacidad de unión a un objetivo; (ii) por lo menos una unidad portadora polimérica; en donde las unidades peptídicas se unen a la unidad portadora polimérica y en donde por lo menos un dominio de por lo menos una unidad peptídica es un péptido como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 71.
75. Compuesto como se describe en la reivindicación 74, en donde por lo menos una unidad peptídica comprende un dímero peptídico, como se describe en la reivindicación 73.
76. Compuesto como se describe en la reivindicación 74 ó 75, en donde la unidad portadora es o comprende por lo menos un polímero natural o sintético, ramificado, dendrítico o lineal y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de poliglicerinas , ácido polisiálico, dextranos, almidones o polietilenglicol o de otros polímeros hidrosolubles biológicamente inertes.
77. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 74 a 76 precedentes, en donde la unidad portadora polimérica comprende una unidad de ramificación.
78. Compuesto como se describe en la reivindicación 77, en donde la unidad de ramificación comprende glicerol o poliglicerol .
79. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 74 a 78, en donde la molécula portadora tiene un peso molecular de por lo menos 5 kD, preferiblemente de 20 a 200 ó 4000 kD y de 20 a 80 kD en caso de que se utilicen portadores más pequeños tales como polietilenglicol .
80. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 74 a 79, en donde la unidad portadora está constituida de por lo menos dos subunidades poliméricas en donde las subunidades poliméricas están conectadas por medio de por lo menos una estructura enlazante covalente biodegradable.
81. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes, que comprende una primera unidad portadora biodegradable en donde las unidades peptídicas y la segunda unidad portadora polimérica está unida a la primera unidad portadora polimérica .
82. Compuesto como se describe en la reivindicación 81, en donde la segunda unidad portadora tiene un peso molecular menor de la primera unidad portadora y en donde aproximadamente 20 a 50% de los sitios de la primera unidad portadora la cual preferiblemente es HES están ocupadas con las segundades unidades portadoras las cuales preferiblemente son PEG o un peso molecular de aproximadamente 3 a 10 Kd.
83. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde se utiliza una unidad portadora polimérica modificada.
84. Compuesto como se describe en la reivindicación 83, en donde la unidad peptídica se une vía un enlace covalente a la unidad portadora polimérica y la unión se produce vía un aminoácido reactivo, el grupo amino de la parte N terminal y/o el ácido carboxílico de la parte C terminal de las unidades peptídicas, en donde el aminoácido reactivo preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina, y en donde en caso de que la unidad portadora polimérica no presente un grupo de acoplamiento reactivo apropiado, se utiliza una unidad de acoplamiento para modificar la unidad portadora polimérica, en donde la unidad de acoplamiento preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de grupos acilantes los cuales reaccionan con los grupos amino en la unidad peptídica, grupos alquilantes los cuales reacionan con sulfhidrilo (mercapto) , tiometilo, grupos imidazo o amino sobre la unidad peptídica, de manera más preferible grupos maleimida, éster y grupos formadores de amida los cuales reaccionan con un grupo carboxilo de la proteína, grupos formadores disulfuro los cuales reacionan con los grupos sulfhidrilo de la unidad peptídica tales como grupos 5 , 51 -ditiobis (2 -nitrobenzoato) , disulfuros de orto-piridilo y grupos alquilmercaptano, grupos dicarbonilo tales como grupos ciclohexanodiona y otros grupos 1,2-dicetona los cuales reaccionan con las porciones guanidina de la unidad peptídica; grupos diazo los cuales reaccionan con grupos fenólicos sobre dicho péptido; grupos reactivos de reacción de bromuro de cianógeno con la unidad portadora polimérica la cual reacciona con grupos amino sobre la unidad peptídica.
85. Compuesto como se describe en la reivindicación 84, en donde el aminoácido reactivo es cisteína y en donde el grupo de acoplamiento es maleimida.
86. Ácido nucleico que codifica para un péptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 73.
87. Péptido, caracterizado porque es un péptido inverso y/o retro/inverso de los péptidos como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 73 de un péptido respectivo que consiste completamente de D-aminoácidos.
88. Método para dimerizar unidades peptídicas monoméricas para formar un dímero de peptidomimético de EPO, en donde el dímero se genera al formar un enlace covalente entre unidades peptídicas monoméricas en donde la unión se forma entre el aminoácido en la parte C terminal de la primera unidad peptídica monomérica y el aminoácido N-terminal de la segunda unidad peptídica monomérica.
89. Método como se describe en la reivindicación 88, en donde se utilizan unidades peptídicas monoméricas que presentan un aminoácido ya sea la parte C o N terminal con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente, en donde el enlace covalente se forma entre la cadena lateral del aminoácido de la parte C terminal de la primera unidad peptídica monomérica y la cadena lateral del aminoácido de la parte N terminal de la segunda unidad peptídica monomérica.
90. Método como se describe en la reivindicación 88 u 89, en donde el enlace de unión covalente de las dos unidades peptídicas monoméricas a un dímero es un puente disulfuro o uno diseleniuro .
91. Método como se describe en una de las reivindicaciones 88 a 90, en donde los aminoácidos forman un enlace intermolecular entre dos unidades peptidomiméticas EPO monoméricas que se seleccionan del grupo que consiste de cisteína, derivados de cisteína tales como homocisteína y selenocisteína, tiolisina, K o E.
92. Dimero peptidomimético de EPO, que comprende una secuencia peptidomimética de EPO como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 73.
93. Dimero peptidomimético de EPO producido por el método como se describe en las reivindicaciones 88 y 91 que preferiblemente comprende una secuencia peptídica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 73.
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