MX2007016451A - Compuestos supravalentes - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con compuestos peptídicos supravalentes que muestran una eficacia mejorada. Los compuestos supravalentes comprenden varias unidades peptídicas por lo menos bivalentes que se unen a un receptor objetivo y que están conectadas a una unidad portadora polimérica grande.

Description

COMPUESTOS SUPRAVALENTES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con compuestos peptídicos. Con el desarrollo de investigación en proteínas se ha encontrado una gran cantidad de péptidos que tienen diversas actividades biológicas y farmacéuticas. Varios de estos péptidos ejecutan sus acciones vía la unión a moléculas objetivo tales como por ejemplo moléculas receptoras (tales como receptores de citocina) . Los factores de crecimiento hematopoyéticos (HGF) han demostrado ser sustancias terapéuticas clínicamente exitosas; no obstante, su tamaño (15-17 kDa), inestabilidad conformacional, susceptibilidad a degradación proteolítica, poca penetración por membrana, antigenicidad, altos costos de producción y farmacocinética desfavorable los vuelven medicamentos candidato menos ideales. Además, la poca biodisponibilidad de las proteínas nativas requiere que se administren parenteralmente. Por lo tanto, es ventajoso desarrollar agonistas (y antagonistas) de moléculas pequeñas de receptores HGF que sean equipotentes con sus contrapartes polipeptídicas pero que carezcan de algunos de los inconvenientes inherentes de las proteínas grandes . La identificación y examen de péptidos más pequeños que se unen y que activan receptores de citocina también proporciona una mejor comprensión de las interacciones ligando-receptor. Esta información se utiliza para diseñar de manera razonada miméticos de citocina de moléculas pequeñas disponibles oralmente. La activación de receptores transmembranales por factor de crecimiento y citocinas se producen cuando un ligando se une a un dominio específico en el receptor, por lo que induce un cambio conformacional y activa la dimerización u oligomerización de cadenas receptoras. Ante la unión con ligando, varios miembros de los receptores de citocina clase I forman homodímeros que incluyen al receptor de eritropoyetina (EPOR) , receptor de trombopoyetina (TPOR) , receptor de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSFR) , receptor de hormona de crecimiento (GHR) y receptor de prolactina (PrR) . Se han reportado diversos estudios que se dirigen hacia el descubrimiento de detalles precisos de las interfases de dimerización y el grado con el cual los receptores no ligandos existen como dímeros. Los resultados de estos estudios han demostrado similitudes estructurales y funcionales entre los receptores de citocina clase I. Los estudios también han mostrado que la dimerización de receptor sola, aunque necesaria para señalización intracelular, no es suficiente para producir transducción de señal. Reportes recientes han demostrado que tanto las moléculas pequeñas como los péptidos se pueden unir y activar receptores de citocina homodiméricos al actuar como agonistas e imitar los efectos de las proteínas naturales (véase Laber, E. G. (2004). Small-Molecule and Peptide Agonists: A Literature Review. Hematopoietic Growth Factors in Oncology - Basic Science and Clinical Therapeutics. G. Morstyn, M. Foote and G. J. Lieschke: 65-80). No obstante, su actividad biológica con frecuencia es inferior a la de moléculas naturales. En consecuencia, se han realizado intentos por mejorar la actividad biológica de las moléculas miméticas. Los ejemplos exitosos de dichos péptidos incluyen péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina y que imitan la función de la eritropoyetina y péptidos que se unen al receptor de trombopoyetina y que imitan la función de trombopoyetina . La hormona eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína constituida por 165 aminoácidos y que tiene cuatro sitios de glucosilación. Estimula la división mitótica y la diferenciación de células precursoras de eritrocitos y por lo tanto aseguran la producción de eritrocitos. Dado que el uso de EPO o de EPO recombinante presenta varias desventajas que incluyen reacciones inmunogénicas, se utilizan péptidos sintéticos los cuales no comparten ninguna homología de secuencia o relación estructural con EPO pero que de cualquier manera se unen e interactúan con EPO-R (véase, por ejemplo Wrighton et al., 1996) . Los péptidos sintéticos que imitan la actividad de EPO ("péptidos miméticos de EPO") son mientras tanto bien conocidos en el estado de la técnica (véase, por ejemplo WO 96/40772; WO 96/40749; WO 01/38342; WO 01/091780; WO 2004/101611; WO 2004/100997; WO 2004/101600; WO 2004/101606) . Los EPO y los péptidos miméticos de EPO activan el receptor de EPO al unir los dominios extracelulares del receptor y probablemente dimerizan dos monómeros receptores a un complejo receptor por lo que inician la transducción de señal (Johnson et al., 1997). La estructura cristalina del receptor EPO o unido a EMP1 (un péptido mimético de EPO bien conocido) muestra la formación de un complejo receptor-péptido que consiste de dos péptidos unidos a dos monómeros receptores. De esta manera, realmente no es una sorpresa que la combinación de exactamente dos de estos dominios de unión en una sola molécula incrementen considerablemente la actividad, lo que lleva al resultado de que los péptidos con un solo dominio de unión muestran el mismo patrón cualitativo de actividad mientras que dos de los dominios de unión unidos muestran una DE50 mucho menor (dosis eficaz al 50%, una medida de actividad) . Los métodos de preparación para los dímeros peptídicos respectivos de, por ejemplo, EPO o péptidos miméticos de TPO también son bien conocidos en el estado de la técnica y varían, desde por ejemplo dimerización vía PEGilación, puentes disulfuro o cadenas laterales lisina (véase, por ejemplo WO 96/40772; WO 96/40749; WO 01/38342; WO 01/091780; WO 2004/101611; WO 2004/100997; WO 2004/101600; WO 2004/101606, Wrighton et al., 1997; Johnson et al., 1997 WO 98/25965). Todos estos métodos combinan péptidos monoméricos vía una estructura enlazante con el fin de obtener las moléculas diméricas o incluso multiméricas deseadas las cuales incrementan la formación del complejo receptor dimérico o incluso multimérico activo. Un concepto similar para combinar unidades monoméricas también se conoce para otras moléculas de unión (véase, por ejemplo WO 2004/014951) . Con el fin de generar una molécula que sea capaz de interactuar con el complejo receptor dimérico o multimérico respectivo, esta solicitud describe el uso de una estructura de soporte pequeña con el fin de conectar los dominios de unión de receptor monomérico en una relación espacial que permite la interacción con los complejos de receptor respectivos (y por ejemplo inducción de dimerización o trimerización del receptor) . No obstante, aunque la dimerización (o incluso la multimerización en caso de un receptor multimérico) de las unidades peptídicas monoméricas habitualmente mejora la actividad en comparación con los péptidos monoméricos respectivos, no es deseable incrementar adicionalmente la actividad. Por ejemplo, incluso los péptidos miméticos EPO diméricos aún son mucho menos potentes que la molécula EPO respecto a la activación de los mecanismos celulares. También se conoce en el estado de la técnica la acoplación de una o más unidades portadoras hidrofílicas (tales como, por ejemplo PEG) a un péptido. Se ha encontrado que cuando los péptidos forman derivados con un polímero hidrofílico, su solubilidad y vida media en circulación se incrementa y disminuye su inmunogenicidad (véase, por ejemplo, WO 98/25965) . No obstante, se ha reportado que la unión de dicho portador hidrofílico puede disminuir la actividad biológica. No se ha reportado un incremento de actividad biológica. Se han realizado diversas soluciones para incrementar la actividad de los péptidos, por ejemplo por variación de la secuencia de aminoácidos con el fin de identificar candidatos más potentes. No obstante, hasta ahora no se conoce en el estado de la técnica una solución apropiada para mejorar la actividad de péptidos, especialmente de péptidos miméticos EPO o TPO. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos peptídicos que se unan a un objetivo receptor y que tengan una actividad aumentada . El objetivo se resuelve por un compuesto que une moléculas objetivo y que comprende: i) por lo menos dos unidades peptídicas en donde cada unidad peptídica comprende por lo menos dos dominios con una capacidad de unión a un objetivo (y por lo tanto por lo menos dos unidades de unión monoméricas) ; ii) por lo menos una unidad portadora polimérica; en donde las unidades peptídicas se unen a la unidad portadora polimérica. Sorprendentemente, se ha encontrado que la combinación de dos o más péptidos bivalentes o multivalentes sobre un soporte polimérico incrementa en gran medida la eficacia de los péptidos bivalentes (o incluso multivalentes) para unirse al objetivo respectivo, el cual habitualmente es una molécula receptora no solo de manera aditiva sino incluso de manera supraaditiva. De esta manera se observa un efecto sinergístico sobre la eficacia de unión. El término "bivalente" como se utiliza con el propósito de la presente invención se define como un péptido que comprende dos dominios con una capacidad de unión a un objetivo, el cual habitualmente es un receptor (este término por lo tanto se utilizará en lo siguiente) . El término "bivalente" se utiliza de manera intercambiable con el término "dimérico" . En consecuencia, un péptido "multivalente" o "multimérico" tiene varios dominios de unión respectivos y por lo tanto unidades de unión monoméricas. Es evidente por si mismo que los términos "péptido" y "unidad peptídica" no incorporan restricción alguna, respecto al tamaño e incorporan a oligopéptidos y polipéptidos así como proteínas. No obstante, se prefiere que las unidades peptídicas acopladas a una unidad portadora tengan una longitud de aproximadamente 200 aminoácidos o menos, o de aproximadamente 150 aminoácidos o menos, de manera más preferible de 100 aminoácidos o incluso 50 aminoácidos o menos. Los compuestos que comprenden dos o más unidades peptídicas bivalentes o multivalentes unidas a una unidad portadora polimérica se denominan "supravalentes" en el contexto de la presente invención. Estas moléculas supravalentes difieren en gran medida de las moléculas diméricas o multiméricas conocidas en el estado de la técnica. El estado de la técnica combina varias unidades peptídicas simplemente monoméricas con el fin de crear un dímero o multímero. En contraste, las moléculas supravalentes se generan al conectar unidades peptídicas (por lo menos) bivalentes de antemano a una unidad portadora polimérica por lo que se genera una molécula supravalente que presenta varias unidades peptídicas diméricas o multiméricas (los ejemplos ilustrados de este concepto se proporcionan en las figuras 13 a 15) . Por lo que la actividad total y la eficacia de los péptidos diméricos o multiméricos se incrementa en gran medida y por lo tanto disminuye la dosis CE50. Hasta ahora las razones para la gran potencia de las moléculas supravalentes en comparación con moléculas biméricas o multiméricas conocidas en el estado de la técnica no se comprende completamente . Puede deberse al hecho de que las moléculas biméricas conocidas en el estado de la técnica (por ejemplo péptidos miméticos de EPO diméricos) proporcionan simplemente un objetivo respectivamente de una unidad de unión de receptor activo por molécula de compuesto. Por lo tanto un complejo receptor (dimérico) se genera por unión del compuesto dimérico por lo que incluye solo un procedimiento de transducción de señal de la célula. Por ejemplo, dos péptidos miméticos de EPO monoméricos se conectan vía PEG para formar un dímero peptídico por lo que se facilita la dimerización de los monómeros receptores necesarios para transducción de señal (Johnson et al., 1997) . En contraste, los compuestos supravalentes de acuerdo con la invención comprenden varias unidades de unión de receptor dimérico o multimérico de antemano. Los compuestos supravalentes de acuerdo con la presente invención pueden presentar varias unidades de unión del receptor (bivalentes o multivalentes) . Cada unidad peptídica dimérica o multimérica acoplada al portador representa una unidad de unión a receptor. Esto puede permitir la generación de varios complejos de receptor sobre la superficie celular por molécula de compuesto por lo que se inducen (o se bloquean, en el caso de un antagonista) varias transducciones de señal y por lo tanto se potencia la actividad de las unidades peptídicas supra aditivamente. La unión de compuestos supravalentes puede resultar en un agrupamiento de complejos receptores sobre la superficie de la célula. Las unidades peptídicas de acuerdo con la invención son homogénicas o heterogénicas lo que significa que unidades peptídicas idénticas o diferentes se acoplan al portador polimérico. Lo mismo se aplica a los dominios de unión de las unidades peptídicas las cuales también pueden ser homogénicas o heterogénicas. Se prefieren los dominios de unión homogénicos (monómeros) en caso de que el receptor objetivo esté unido de manera que esté constituido de subunidades de proteína idénticas (tales como, por ejemplo, un receptor EPO homodimérico) . No obstante, la secuencia de aminoácidos de los dominios de unión homogénicos puede aún variar aunque se unan al mismo objetivo receptor (y por lo tanto tengan funcionalidad homogénica) . Se prefieren los dominios de unión heterogénicos (monómeros) en caso de que el receptor objetivo se una de manera que este constituido de subunidades proteínicas diferentes (tales como, por ejemplo, receptores de interleucina heterodiméricos) . Preferiblemente, las unidades peptídicas bivalentes o multivalentes unidas a la unidad portadora se unen al mismo objetivo receptor. No obstante, por supuesto pueden aún diferir en su secuencia de aminoácidos. Las unidades de unión monoméricas de las unidades peptídicas bivalentes o multivalentes pueden ser lineales o cíclicas. Una molécula cíclica puede crearse, por ejemplo, por la formación de puentes cisteína intramoleculares. La unidad portadora polimérica comprende por lo menos un polímero natural o sintético, ramificado, lineal o dendrítico. La unidad portadora polimérica preferiblemente es soluble en agua y fluidos corporales y preferiblemente es un polímero farmacéuticamente aceptable. Las porciones de polímero hidrosolubles incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a polialquilenglicol y derivados de los mismos, que incluyen PEG, homopolímeros de PEG, mPEG, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol con propilenglicol, en donde los homopolímeros y copolímeros están no sustituidos o sustituidos en un extremo, por ejemplo con un grupo acilo; poliglicerinas o ácido policiálico; carbohidratos, polisacáridos, celulosa y derivados de celulosa que incluyen metilcelulosa y carboximetilcelulosa; almidones (por ejemplo hidroxialquilalmidón (HAS) , especialmente hidroxietilalmidón (HES) y dextrinas y derivados de los mismos; dextrano y derivados de dextrano que incluyen sulfato de dextrano, dextrina reticulada y carboximetildextrina; quitosana (un polisacárido lineal) , heparina y fragmentos de heparina; alcohol polivinílico y poliviniletiléteres; polivinilpirrolidona; a, ß-poli[(2-hidroxietil) -DL-aspartamida; y polioles polioxietilados. Un ejemplo de una unidad portadora es un polímero homobifuncional de, por ejemplo, polietilenglicol (bis-maleimida, bis-carboxi, bis-amino, etc.). Una unidad portadora polimérica la cual se acopla a las unidades peptídicas de acuerdo con la presente invención puede tener una gama amplia de pesos moleculares debido a la naturaleza diferente de los diferentes polímeros que son adecuados junto con la presente invención. Por lo tanto, no existen limitaciones en cuanto al tamaño. No obstante, se prefiere que el peso molecular sea de por lo menos e kD, preferiblemete de por lo menos 10 kD y aproximadamente de alrededor de 20 a 500 kD y de manera más preferible aproximadamente 30 a 150 o aproximadamente 60 a 80 kD. El tamaño de la unidad portadora depende del polímero seleccionado y por lo tanto puede variar. Por ejemplo, especialmente cuando se utilizan almidones tales como hidroxetilalmidón, el peso molecular puede ser considerablemente mayor. El peso molecular promedio el cual después se puede distribuir alrededor de 100 a 4000 kD e incluso puede ser mayor. No obstante, se prefiere que el peso molecular de la molécula de HES sea de aproximadamente 100 a 300 kD, preferiblemente de aproximadamente 200 kD. El tamaño de la unidad portadora preferiblemente se selecciona de manera que cada unidad peptídica respectivamente se puede distribuir de manera óptima para unión de sus moléculas receptoras respectivas. Con el fin de facilitar esto, una modalidad de la presente invención utiliza una unidad portadora que comprende una unidad ramificada. De acuerdo con esta modalidad los polímeros tales como por ejemplo PEG se unen a una unidad ramificada y por lo tanto resultan en una molécula portadora grande que permite la incorporación de unidades peptídicas numerosas. Los ejemplos de unidades de ramificación apropiadas son glicerol o poliglicerol. Además, las unidades de ramificación dendríticas se pueden utilizar tal como se describe, por ejemplo por Haag 2000, incorporada en la presente como referencia. También se pueden utilizar portadores de HES en forma ramificada. Esto, por ejemplo, si se obtiene con una proporción elevada a partir de amilopectina. Preferiblemente, después de que se generan las unidades peptídicas por combinación de las unidades de unión monoméricas (ya se cabeza a cabeza, cabeza a cola o cola a cola) a las unidades peptídicas la unidad portadora polimérica se conecta/acopla a las unidades peptídicas. La unidad portadora polimérica se conecta a las unidades peptídicas vía un enlace covalente o no covalente (por ejemplo coordinado) . No obstante, se prefiere el uso de un enlace covalente . La unión se puede producir, por ejemplo, vía aminoácido reactivo de las unidades peptídicas, por ejemplo lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina o el grupo amino de la parte N terminal y el ácido carboxílico de la parte C terminal . En caso de que los péptidos no presenten un aminoácido reactivo respectivo tal aminoácido se puede introducir en la secuencia de aminoácidos. El acoplamiento se puede seleccionar de manera que la unión al objetivo no sea por lo menos tan pequeña que este impedida posiblemente. Dependiendo de la conformación de la unidad peptídica el aminoácido reactivo se encuentra en el inicio, al final o dentro de la secuencia peptídica. En el caso de que la unidad portadora polimérica no posea un grupo de acoplamiento apropiado, se pueden utilizar varias sustancias acopladoras/enlazantes con el fin de modificar apropiadamente el polímero de manera que pueda reaccionar con por lo menos un grupo reactivo sobre la unidad peptídica para formar el compuesto supravalente . Los grupos químicos adecuados que se pueden utilizar para modificar el polímero son, por ejemplo, los siguientes: Grupos acilantes los cuales reaccionan con los grupos amino de la proteína, por ejemplo grupos de anhídrido de ácido, grupos de N-acilimidazol, grupos azida, grupos de N-carboxianhídrido, grupos diceteno, grupos de pirocarbonato de dialquilo, grupos imidoéster y grupos carboxilo activados por carbodiimida. La totalidad de los grupos anteriores se sabe que reaccionan con grupos amino en proteínas/péptidos para formar enlaces covalentes que involucran acilo o enlaces similares; los grupos alquilantes los cuales reaccionan con sulfhidrilo (mercapto) , tiometilo, imidazo o grupos amino sobre la unidad peptídica, tal como grupos halo-carboxilo, grupos maleimida, grupos vinilo activados, grupos etilenimina, grupos haluro de arilo, grupos bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo y grupos aldehido y cetona alifáticos junto con los agentes reductores, reaccionan con el grupo amino del péptido; grupos formadores de éster y amida los cuales reaccionan con un grupo carboxilo del péptido, tal como los grupos diazocarboxilato y los grupos carbodiimida y amina juntos; grupos formadores disulfuro los cuales reaccionan con los grupos sulfhidrilo en la proteína tales como grupos 5, 5 ' -ditiobis (2-nitrobenzoato) , orto-piridil disulfuros y grupos alquilmercaptanos (los cuales reaccionan con los grupos sulfhidrilo del péptido en presencia de agentes oxidantes tales como yodo) ; grupos dicarbonilo tales como grupos ciclohexanodiona y otros grupos 1,2-dicetona los cuales reaccionan con las porciones guanidina de proteína; grupos diazo los cuales reaccionan con grupos fenólicos en el péptido; grupos reactivos de la reacción de bromuro de cianógeno con el polisacárido, el cual reacciona con los grupos amino en la proteína. Por lo tanto, resumiendo, el compuesto de acuerdo con la invención puede elaborarse (opcionalmente) al modificar primero el portador polimérico químicamente para producir un portador polimérico que tiene por lo menos un grupo químico en el mismo el cual es capaz de reaccionar con el grupo químico disponible o introducido en la unidad peptídica y después hace reaccionar junto con el polímero (opcionalmente) modificado y la unidad peptídica para formar un complejo unido covalentemente del mismo utilizando el grupo químico del polímero modificado (si es necesario) . En caso de que el acoplamiento se produzca vía un grupo SH del péptido, se prefiere el uso de un grupo maleimida en el polímero. Con el fin de generar una molécula definida, se prefiere utilizar un enfoque dirigido para unir las unidades peptídicas a la unidad portadora polimérica. En caso de que no estén presentes aminoácidos apropiados en el sitio de unión deseado, los aminoácidos apropiados se deben incorporar en la unidad peptídica. Para la unión de un polímero específico de sitio se prefiere un grupo reactivo único, por ejemplo un aminoácido específico en el extremo de la unidad peptídica con el fin de evitar reacciones de acoplamiento no controladas a través del péptido que generen una mezcla heterogénea que comprenda una población de varias moléculas poliméricas diferentes. El acoplamiento de las unidades peptídicas a la unidad portadora polimérica, por ejemplo PEG o HES se realiza utilizando reacciones conocidas principalmente por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, existen muchos métodos de unión de PEG y HES disponibles para aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, WO 2004/100997 que proporciona referencias adicionales, Roberts et al., 2002; US 4,064,118; EP 1 398 322; EP 1 398 327; EP 1 398 328; WO 2004/024761; todas incorporadas en la presente como referencia) . Es importante comprender que el concepto de supravalencia descrito en la presente es diferente del concepto conocido de PEGilación o HESilación. En el estado de la técnica, por ejemplo la PEGilación se utiliza únicamente con el fin de producir ya sea dímeros peptídicos o con el fin de mejorar los parámetros farmacocinéticos al unir una o más unidades PEG a un péptido. No obstante, como se ha indicado en lo anterior, la unión de dos o más unidades peptídicas por lo menos bivalentes a, por ejemplo HES como una unidad portadora polimérica también incrementa en gran medida la eficacia (y por lo tanto disminuye la dosis CE50) . El concepto de esta invención por lo tanto tiene fuertes efectos sobre parámetros farmacodinánicos y no solo sobre parámetros farmacocinéticos como en el caso con los conceptos de PEGilación y HESilación conocidos en el estado de la técnica. No obstante, por supuesto, la incorporación de por ejemplo PEG o HES como una unidad portadora polimérica también tiene las ventajas conocidas respecto a la farmacocinética. La PEGilación habitualmente se lleva a cabo para mejorar las propiedades biofarmacéuticas de los péptidos. Las alteraciones más relevantes de la molécula de proteína después de conjugación con PEG son agrandamiento de tamaño, superficie de proteína y enmascaramiento de la función de glucosilación, modificación de carga y protección del epítopo. En particular, el agrandamiento de tamaño frena la ultrafiltración de riñon y promueve la acumulación en tejidos permeables por un mecanismo pasivo de mejoramiento de permeación y retención. La cubierta de proteína reduce la proteolísis y el reconocimiento por el sistema inmunológico, los cuales son rutas de eliminación importantes. El efecto específico de la PEGilación sobre las propiedades fisicoquímicas biológicas de la proteína está determinado estrictamente por las propiedades de la proteína y el polímero así como por la estrategia de PEGilación adoptada. No obstante, el uso de PEG u otros polímeros no biodegradables puede generar problemas nuevos . Durante aplicaciones in vivo, los intervalos de dosificación en un ambiente clínico se activan por pérdida del efecto del medicamento. Las dosificaciones de rutina y los intervalos de dosificación están adaptados de manera que el efecto no se pierda durante los intervalos de dosificación. Debido al hecho de que los péptidos están unidos a una unidad polimérica grande no biodegradable (por ejemplo una porción PEG) , pueden ser degradados más rápidos que la molécula de soporte puede ser eliminada del cuerpo, y puede surgir un riesgo de acumulación de la unidad portadora. Dicho riesgo de acumulación siempre genera un efecto de tiempo de semivida del medicamento el cual es más corto que el tiempo de semivida de eliminación del medicamento mismo o uno de sus componentes/metabolitos . Por lo tanto, la acumulación de la molécula portadora debe evitarse especialmente en tratamientos a largo plazo debido a que los péptidos habitualmente son pegilados con porciones PEG muy grandes (~20-~40 kD) las cuales por lo tanto muestran una eliminación renal lenta. La porción peptídica en si misma experimenta degradación enzimática e incluso separación parcial que puede ser suficiente para desactivar el péptido. Con el fin de encontrar una solución a este problema potencial, una modalidad de la presente invención describe el uso de una unidad portadora polimérica que está constituida de por lo menos dos subunidades. Las subunidades poliméricas están conectadas vía estructuras enlazantes covalentes biodegradables. De acuerdo con esta modalidad, el peso molecular de la molécula portadora grande (por ejemplo 40 kD) se genera por varias subunidades pequeñas o de tamaño intermedio (por ejemplo, cada subunidad tiene un peso molecular de 5 a 10 kD) que están conectadas vía enlazantes biodegradables . Los pesos moleculares de las subunidades modulares se suman por lo que se genera el peso molecular deseado de la molécula portadora. No obstante, las estructuras enlazantes biodegradables se pueden descomponer en el cuerpo por lo que se liberan subunidades portadoras más pequeñas (por ejemplo 5 a 10 kD) . Las subunidades portadoras pequeñas pueden mostrar una mejor depuración renal que una molécula polimérica que tiene un peso molecular total (por ejemplo 40 kD) . Un ejemplo ilustrativo se proporciona en la figura 16. Las estructuras enlazantes se seleccionan de acuerdo con propiedades de degradación conocidas e incrementos en tiempo de degradación en fluidos corporales. Las estructuras que se pueden romper pueden contener, por ejemplo, un grupo separable que contiene derivados de ácido carboxílico, como enlaces amida/péptido o esteres los cuales se pueden separar por hidrólisis (véase, por ejemplo Roberts 2002, incorporada en la presente como referencia). Los esteres de PEG succinimidilo también se pueden sintetizar con diversos enlaces éster en la estructura principal PEG para controlar la tasa de degradación a pH fisiológico (Zhao, 1997, incorporado en la presente como referencia) . Otras estructuras que se pueden romper como disulfuros o benciluretanos, se pueden separar bajo ambientes reductores moderados, tal como en los compartimientos endosómicos de una célula (Zalipsky, 1999) y por lo tanto también son adecuados . Otros criterios para selección de enlazantes apropiados son la selección para degradación rápida (frecuentemente enzimática) o degradación lenta (frecuentemente descomposición no enzimática) . La combinación de estos dos mecanismos en fluidos corporales también es factible. Es evidente que este concepto altamente ventajoso no se limita a las unidades peptídicas específicas descritas o a las que se hace referencia en la presente sino que también se aplica a otras moléculas farmacéuticas que están unidas a unidades poliméricas grandes tales como moléculas de PEG en donde surgen los mismos problemas de acumulación. De acuerdo con una modalidad de utiliza hidroxialquilalmidón y preferiblemente HES como la unidad portadora polimérica. HES tiene varias ventajas importantes. Primero que nada, HES es biodegradable. Además, la biodegradabilidad de HES no se puede controlar vía la relación de grupos hidroxietilo y por lo tanto se puede influir. Un grado molar de sustitución de 0.4-0.8 (en promedio 40-80% de las unidades de glucosa contienen un grupo hidroxietilo) es adecuado para el propósito de la presente invención. Debido a la biodegradabilidad no se producen problemas de acumulación como se describe en lo anterior en relación con PEG. Además, se ha utilizado HES durante un tiempo prolongado en tratamiento médico, por ejemplo en forma de un diluyente de plasma, y por lo tanto se ha aprobado su condición inocua. Además, los derivados de productos de hidrólisis de HES son detectables por cromatografía de gases. Los conjugados de HES-péptido se pueden hidrolizar bajo condiciones bajo las cuales las unidades peptídicas aún son estables. Esto permite la cuantificación y monitoreo de los productos de degradación y permite evaluaciones y estandarizaciones de los péptidos activos. De acuerdo con una modalidad adicional, un primer tipo de unidad portadora polimérica se utiliza y se carga con las unidades peptídicas. El primer portador preferiblemente es biodegradable con facilidad tal como, por ejemplo, HES. No obstante, no todos los puntos de unión del primer portador están ocupados con unidades peptídicas sino solo, por ejemplo, aproximadamente 20 a 50%. Dependiendo del tamaño del polímero utilizado, se pueden acoplar varios cientos de unidades peptídicas a la molécula portadora. No obstante, dependiendo del péptido utilizado se acoplan habitualmente menos unidades peptídicas (2 a 50, 2 a 20, 2 a 10 o 3 a 5) . El resto (o por lo menos parte) de los puntos de unión remanentes se ocupan con un portador diferente, por ejemplo unidades PEG pequeñas que tienen un peso molecular menor que el primer portador. Esta modalidad tiene la ventaja de que la composición supravalente se genera debido a un primer portador el cual, no obstante, es muy durable debido a la presencia del segundo portador, el cual está constituido preferiblemente por unidades PEG de 3 a 5 o hasta 10 kD. No obstante, la totalidad de la entidad es muy degradable, dado que el primer portador (por ejemplo HES) y las unidades peptídicas son biodegradables y el segundo portador, por ejemplo PEG es suficientemente pequeño para ser depurado fácilmente del cuerpo. Los monómeros que constituyen los dominios de unión de las unidades peptídicas reconocen un sitio de unión de un objetivo. El término dominio de unión se refiere a la parte de unión del péptido monomérico que está involucrada en la unión del objetivo. Dependiendo del péptido, el dominio de unión puede estar constituido de motivos estructurales diferentes del péptido (por ejemplo láminas ß, hélices a, giros ß) que definen el dominio de unión en la conformación tridimensional del péptido. De acuerdo con una modalidad, la unidad peptídica se une a un receptor transmembranal . La activación de receptores transmembranales por factores de crecimiento y citocinas generalmente se produce cuando un ligando se une a un dominio específico en el receptor, por lo que se induce un cambio conformacional o dimerización activadora u oligomerización de cadenas receptoras. Al unir el ligando, varios miembros de los receptores de citocina clase I forman homodímeros que incluyen al receptor de eritropoyetina (EPOR) , el receptor de trombopoyetina (TPOR) , receptor de factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSFR) , receptor de hormona del crecimiento (GHR) y receptor de prolactina (PrR) . Estos receptores de citocina clase I muestran las similitudes estructurales y funcionales entre otras. De acuerdo con una modalidad, las unidades peptídicas se selecciona de manera que se pueden unir a estos receptores de citocina clase I. Como se ha indicado, un receptor homodimérico es cualquier proteína objetivo biológica que esté constituida por dos subunidades proteínicas idénticas que no estén asociadas covalentemente. Dichos receptores habitualmente solo son funcionales si ambas funcionalidades están asociadas en la forma homodimérica . Esta última propiedad de que los receptores sean homodiméricos diferencia al receptor EPO y, por ejemplo, al receptor TPO relacionado de muchos otros receptores de citocina. En la mayor parte de los demás casos de receptores de citocina, el receptor es un heterodímero (muchos receptores de interleucina o incluso un heterotrímero (por ejemplo IL-2) . Las unidades peptídicas de acuerdo con la invención, que comprende por lo menos dos dominios de unión monoméricos que unen su objetivo y que preferiblemente son capaces de dimerizar respectivamente o multimerizar el objetivo o estabilizarlo de acuerdo con el mismo generando un complejo que induce transducción de señal. Las unidades peptídicas preferiblemente tienen una molécula objetivo homodimérica la cual preferiblemente es un receptor de citocina (véase antes) . Como se indica en lo anterior, las unidades peptídicas utilizadas para crear las moléculas supravalentes unen al receptor objetivo. De acuerdo con una modalidad, las unidades peptídicas actúan como agonistas de receptor. El término agonista se refiere a un péptido biológicamente activo el cual se une a su receptor (objetivo) biológicamente activo complementario y activa este último ya sea para provocar una respuesta biológica en el receptor o para mejorar la actividad biológica preexistente del receptor (objetivo) . De acuerdo con una modalidad diferente, la unidad peptídica actúa como un antagonista de receptor. Un antagonista también une su receptor (objetivo) biológicamente activo complementario. No obstante, un antagonista no induce o incrementa la actividad biológica del receptor (objetivo) . Se conocen en el estado de la técnica diferentes métodos para la dimerización o multimerización de unidades peptídicas monoméricas. Estos métodos de pueden utilizar para crear unidades peptídicas de acuerdo con la invención. Las soluciones prevalentes después del enfoque de dimerización se caracterizan por: (a) el hecho de que los dominios de unión se sintetizan primero por separado como péptidos monovalentes o monoméricos los cuales se pueden modificar, por ejemplo, por unión de grupos reactivos en la preparación para la etapa b) b) en una segunda etapa de reacción, los dos dominios de unión (en su mayor parte idénticos) se unen juntos en una reacción de dimerización separada, la cual también puede incluir moléculas enlazantes que habitualmente están interpuestas entre los dos dominios dimerizados . Dichos dímeros son ejemplos de péptidos bivalentes (diméricos) y presentan esencialmente las mismas funciones biológicas que los monómeros pero muestran actividad biológica mejorada debido a una mejor interacción con el receptor. Se conocen varias técnicas por una persona experta en la técnica para dimerizar u oligomerizar los monómeros los cuales también se pueden aplicar de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Los monómeros se pueden dimerizar por unión covalente a un enlazante. Un enlazante es una molécula de unión que genera una unión covalente entre las unidades polipeptídicas de la presente invención. Las unidades polipeptídicas se pueden combinar vía un enlazante de manera que mejora la unión al receptor EPO (Johnson et al., 1997; Wrighton et al., 1997). Se refiere además que la multimerización de los péptidos biotinados monoméricos por interacción no covalente con una molécula portadora de proteína descrita por Wrighton et al (Wrighton, 1997) . También es posible utilizar un sistema de biotina/estreptavidina, es decir, biotinar la parte C terminal de los péptidos y la incubación subsecuente de los péptidos biotinados con estreptavidina. De manera alternativa, se conoce obtener la dimerización al formar una estructura dicetopiperazina. Este método conocido por una persona experta en la técnica se describe con detalle, por ejemplo en Cavelier et al. (en: Peptides; The wave of the Future; Michal Lebl and Richard A. Houghten (eds) ; American Peptide Society, 2001) . La descripción de estos documentos respecto a la dimerización y multimerización no covalente se incorpora en la presente como referencia. Otra manera alternativa de obtener dímeros peptídicos conocidos de la técnica anterior es utilizar derivados bifuncionales de ácido dicarboxílico activados como precursores reactivos de las porciones enlazantes posteriores, el cual reacciona con los grupos amino en la parte N terminal , por lo que forma el péptido dimérico final (Johnson et al., 1997) . Los monómeros también se pueden dimerizar por unión covalente a un enlazante. Preferiblemente, el enlazante comprende NH-R-NH, en donde R es un alquileno inferior sustituido con un grupo funcional tal como un grupo carboxilo o un grupo amino que permite la unión a otra porción de la molécula. El enlazante puede contener un residuo lisina o lisina amida. Además se puede utilizar PEG como enlazante. El enlazante puede ser una molécula que contenga dos ácidos carboxílicos y que opcionalmente este sustituido en uno o más átomos con un grupo funcional tal como una amina capaz de unirse a una o más moléculas de PEG. Una descripción detallada de las etapas posibles para oligomerización y dimerización de péptidos con una porción enlazante también se proporciona en WO 2004/101606. Aunque es funcionalmente suficiente y por lo tanto utilizable de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, la técnica anterior se enfoca en sintetizar moléculas diméricas lo cual puede tener ciertas desventajas para algunos péptidos. Un inconveniente potencial se puede percibir por el hecho de que los monómeros que se van a conectar primero necesitan ser sintetizados por separado. Debido al pareamiento estocástico de péptidos monoméricos durante la reacción de dimerización, es particularmente difícil obtener (selectiva e intensionalmente) péptidos bivalentes heterodiméricos con este enfoque. Por lo menos esto puede generar grandes pérdidas en rendimiento de un heterodímero diseñado especial. Los péptidos bivalentes que albergan dos o más dominios de unión monoméricos ligeramente diferentes son muy deseables dado que, debido a su naturaleza heterodimérica las interacciones especiales entre los dos dominios, los cuales son capaces de estabilizar su interacción en el péptido bivalente final, se puede introducir mientras se mantiene o incluso se incrementa la unión al receptor homodimérico. No obstante, debido a la elevadas pérdidas en rendimiento relacionadas con las "reacciones de dimerización estocástica" de la técnica anterior, esto habitualmente no es un enfoque económicamente atractivo. La aplicación de los enfoques de la técnica anterior para dimerización -aunque técnicamente adecuado-tiene por lo tanto ciertas desventajas económicas al proporcionar a estos péptidos con dominios de unión heterogéneos, como se ha descrito. Por lo tanto, preferiblemente se utiliza una estrategia más eficaz para obtener unidades peptídicas bivalentes altamente activas las cuales incluso pueden contener dominios de unión heterogéneos . El concepto de núcleo de este método de dimerización es para frenar la síntesis de los péptidos monoméricos que forman parte del péptido bivalente en reacciones separadas antes de dimerización o multimerización, pero para sintetizar la unidad peptídica final que tiene por lo menos dos dominios de unión en una etapa como un péptido único, por ejemplo en una reacción única en fase sólida. Por lo tanto, ya no se necesita una etapa separada de dimerización o multimerización como se describe por el estado de la técnica. Este aspecto proporciona una gran ventaja, es decir, el control completo e independiente sobre cada posición de la secuencia en la unidad peptídica final. El método permite albergar con facilidad por lo menos dos dominios diferentes de unión específica a receptor en un péptido debido al control independiente sobre cada posición en la secuencia. De acuerdo con esta modalidad, la secuencia del péptido final entre los dominios de unión (el cual es la "región enlazante") está constituido de aminoácidos únicamente, y por lo tanto genera una unidad peptídica continua única. En una modalidad preferida de la invención, el enlazante está constituido de aminoácidos naturales o no naturales los cuales permiten una alta flexibilidad conformacional . A este respecto, puede ser ventajoso utilizar residuos lisina como aminoácidos enlazantes los cuales se conocen por su alta flexibilidad en términos de torsiones. No obstante también se pueden utilizar otros aminoácidos tales como alanina o ß -alanina o una mezcla de los mismos. El número y selección de aminoácidos utilizados depende de hechos estéricos respectivos. Esta modalidad permite un diseño adaptable de un enlazante adecuado por modelado molecular con el fin de evitar distorsiones de las conformaciones biactivas y por lo tanto permitir una coincidencia perfecta con las unidades receptoras. Se prefiere especialmente un enlazante constituido de 3 a 5 aminoácidos . Resulta notable que el enlazante entre los dominios de unión funcional (también denominados como unidades monoméricas) de las unidades peptídicas pueden ser una parte distinta del péptido o se pueden componer -completamente o en partes- de aminoácidos los cuales son partes de los dominios de unión monoméricos. Por lo tanto, el término "enlazantes" se define más bien de manera funcional que estructural dado que el aminoácido puede formar parte de la unidad enlazante así como de las unidades de unión monoméricas . Dado que - como se ha mencionado antes - durante la síntesis del péptido bivalente cada posición de secuencia dentro del péptido final está bajo el control y por lo tanto se puede determinar con precisión, es posible adaptar o realizar una adecuación de las unidades peptídicas o regiones específicas o dominios de las mismas, incluyendo al enlazante. Esto es una ventaja específica dado que permite la creación de sitios de unión específicos para el polímero y evitar la distorsión de la conformación bioactiva de unidades peptídicas debido a interacciones intermoleculares desfavorables. Se puede determinar el riesgo de distorsiones antes de la síntesis mediante modelado particular. Esto se aplica especialmente al diseño del enlazante entre los dominios monoméricos . Los péptidos continuos bivalentes/multivalentes de acuerdo con la invención muestran una actividad mucho mayor que los péptidos monoméricos correspondientes y por lo tanto confirman la observación conocida a partir de otros péptidos diméricos que el incremento en la eficacia se relaciona con conceptos peptídicos bivalentes . De acuerdo con una modalidad preferida, todas las unidades peptídicas (en donde cada unidad peptídica se considera como una unidad que se une a receptor) se unen al mismo receptor objetivo. No obstante, puede ser heterogéneo y por lo tanto diferir en su secuencia de aminoácidos. De acuerdo con una modalidad preferida, dichas unidades peptídicas unen el receptor EPO por lo que dimerizan el complejo receptor EPO. Preferiblemente, inducen una transducción de señal y por lo tanto son agonistas de receptor EPO. Las unidades peptídicas respectivamente de los dominios de unión monoméricos crean que las unidades peptídicas se pueden seleccionar a partir del grupo de péptidos miméticos de EPO. Los péptidos miméticos EPO apropiados son bien conocidos en el estado de la técnica y se pueden utilizar en relación con la presente invención (por favor véase, por ejemplo, WO 96/40772; WO 96/40749; WO 01/38342; WO 01/091780; WO 2004/101611; WO 2004/100997; WO 2004/101600; WO 2004/101606) . Las unidades de péptidos miméticos EPO adecuadas adicionales que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención comprenden dominios de unión de por lo menos 10 aminoácidos de longitud que se unen al receptor EPO. Preferiblemente no comprenden prolina en la posición denominada comúnmente como la posición 10 del péptido mimético de EPO (para la numeración véase Wrighton et al., 1996 y Johnson, 1998) , sino un aminoácido cargado positivamente. Este péptido mimético de EPO presenta un motivo aminoácido característico para una estructura con giro ß (Wrighton et al,), en donde el dominio de unión de la unidad peptídica de acuerdo con esta modalidad no comprende prolina en dicho motivo de giro ß en la posición 10 sino un aminoácido cargado positivamente, preferiblemente ya sea K o R. Además se pueden utilizar otros aminoácidos básicos, especialmente aminoácidos no naturales tales como homoarginina . Las posiciones 9 y 10 del dominio de unión mimético de EPO pueden estar ocupadas por ácidos 5-aminolevulínico (5-Ais) . El dominio peptídico también puede presentar un R en la posición 17. De acuerdo con una modalidad, por lo menos uno de los dominios de unión de receptor EPO de las unidades peptídicas comprenden la siguiente secuencia de aminoácidos : 6X7X8X9X10X11X1-X--X1-X15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y Xe es C, A E, ácido a-amino-?-bromobutírico y homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter (hsm) o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G' ; X10 es un cambio no conservador de prolina; o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; Xn se selecciona independientemente de cualquier aminoácido; Xx2 es T o A; X?3 es W, l-nal, 2-nal, A o F; Xi es D, E, I, L o V; Xi5 es C, A, K, ácido a-amino-?-bromobutírico u homocisteína (hoc) con la condición de que ya sea X6 o X?5 sea C o hoc . La longitud del dominio de unión de dicha unidad peptídica preferiblemente está entre 10 a 40 o 50 ó 60 aminoácidos. En modalidades preferidas, el consenso peptídico muestra una longitud de por lo menos 10, 15, 18 ó 20 aminoácidos. Por supuesto, se puede incrustar respectivamente para estar comprendido por secuencias más largas. Las secuencias peptídicas monoméricas descritas se pueden percibir como dominios de unión para el receptor EPO. Respecto a los péptidos miméticos de EPO, son capaces de unirse y activar el receptor EPO. Es muy sorprendente que estos péptidos muestren actividades miméticas de EPO aunque -de acuerdo con algunas modalidades- uno o incluso ambas prolinas se pueden sustituir por otros aminoácidos naturales o no naturales. De hecho, los péptidos de acuerdo con la invención tienen una actividad comparable con la de los péptidos que contienen prolina. No obstante, es notable que los residuos aminoácidos que sustituyen a prolina no presenten un intercambio conservador, pero en vez de esto muestran un cambio no conservador. Preferiblemente, un aminoácido cargado positivamente tal como aminoácidos básicos tales como K, R y H y especialmente K se utilizan para sustitución. El aminoácido no conservador utilizado para sustitución también puede ser un aminoácido no natural y preferiblemente es uno con una cadena lateral cargada positivamente. También se comprenden análogos respectivos de los aminoácidos mencionados. Un ejemplo adecuado de un aminoácido no natural es homoarginina . De acuerdo con una modalidad, el péptido presenta un aminoácido cargado positivamente en la posición 10, excepto para el aminoácido natural arginina. De acuerdo con esta modalidad, la prolina 10 de este modo está sustituida por un aminoácido que se selecciona de K, H o un aminoácido cargado positivamente no natural tal como, por ejemplo, homoarginina. Se prefiere que los péptidos presenten una lisina u homoarginina en la posición 10. Como se describe en lo anterior, también la prolina en posición 17 se puede sustituir por un aminoácido no conservador. A este respecto también se prefiere que dicho aminoácido no conservador sea uno con una cadena lateral cargada positivamente tal como K, R, H o un aminoácido no natural respectivo tal como, por ejemplo, homoarginina. De acuerdo con dicha submodalidad de esta modalidad, el péptido presenta un aminoácido cargado positivamente en la posición 17, excepto para el aminoácido natural arginina. De acuerdo con esta modalidad, la prolina 17 de esta manera está sustituida por un aminoácido que se selecciona de K, H o un aminoácido no natural cargado positivamente tal como homoarginina. Se prefiere que los péptidos muestren una lisina u homoarginina en la posición 17. El dominio de unión de EPO-R puede comprender además una secuencia de los siguientes aminoácidos: 6 7 8 9 i- 11 -._ -.3X1.-X15 en donde cada aminoácido se indica por la abreviatura de letra estándar, y X6 es C; X7 es R, H, L o W; X8 es M, F o I; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina; X1X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido; X13 es W; X14 es D, E, I, L o V; X15 es C. Además, X7 puede ser serina, X8 puede ser hsm o norisoleucina y Xi3 también puede ser 1-nal, 2 -nal, A o F. La longitud del péptido de consenso preferiblemente está entre 10 a 40, o 50 ó 60 aminoácidos. En modalidades preferidas, el péptido de consenso comprende por lo menos 10, 15, 18 ó 20 aminoácidos. Los péptidos miméticos de EPO adicionales que se pueden utilizar con el fin de crear unidades peptídicas de acuerdo con la presente invención se definen por las siguientes secuencias de péptidos de consenso: un péptido es capaz de unirse al receptor EPO, que se selecciona del grupo que consiste de: -péptidos que comprenden la siguiente secuencia de consenso de aminoácidos X6X X8X9Xl?XllXl2Xl3Xl Xl5 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-?-bromobutírico; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina (o de acuerdo con otra modalidad, prolina o un cambio conservador de prolina) ; Xg y Xio están sustituidos por un aminoácido único; Xn se selecciona de cualquier aminoácido; Xi2 es un aminoácido polar sin carga o A; Xi3 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; Xi4 es D, E, I, L o V; Xis es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar una unión covalente o A o ácido -amino-?-bromobutírico, y fragmentos de funcionalidad equivalente, derivados y variantes de los péptidos definidos por la secuencia de consenso anterior que muestran una actividad mimética de EPO y que tienen un aminoácido en la posición Xio que constituye un cambio no conservador de prolina (o de acuerdo con otra modalidad, prolina o un cambio conservador de prolina) , o en donde Xg y X?0 están sustituidos por un aminoácido único. De acuerdo con la secuencia de consenso de la primera modalidad, X6 y Xi5 muestran aminoácidos con funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente. Estos aminoácidos por lo tanto son capaces de formar una unidad de puente. De acuerdo con una modalidad, los aminoácidos en la posición X6 y X15 se seleccionan de manera que son capaces de formar un puente intramolecular dentro del péptido al formar una unión covalente entre si. La formación de un puente intramolecular puede generar la formación de un ciclo del péptido. Los ejemplos para unidades de puente adecuadas son el puente disulfuro y el puente diselinuro. Los ejemplos adecuados de aminoácidos que muestran dichas funcionalidades de formación de puente en sus cadenas laterales son, por ejemplo, cisteína y derivados de cisteína tales como homocisteína o selenocisteína, pero también tiolisina. La formación de un puente diselinuro, por ejemplo entre dos residuos selenocisteína incluso tiene ventajas sobre un puente cisteína. Este puente selenuro es más estable en ambientes reductores. La conformación del péptido de esta manera se conserva incluso bajo condiciones difíciles. No obstante, es evidente que también los aminoácidos son adecuados en la posición X6 y X?5, que muestren una cadena lateral con una funcionalidad que permita la formación de enlaces covalentes diferentes tales como, por ejemplo, un enlace amida entre un aminoácido que tenga una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo aminoácidos proteinogénicos K, H, R u ornitina, DAP o DAB) y un aminoácido que tenga una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo los aminoácidos proteinogénicos D o E) . Los ejemplos adicionales son amida y puentes tioéter.

Un péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud, capaz de unión al receptor EPO se selecciona de las siguientes alternativas: (a) un péptido que comprende la siguiente secuencia de núcleo de aminoácidos : en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: Xg es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina (o de acuerdo con otra modalidad prolina o un cambio conservador de prolina) ; o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; Xn se selecciona de cualquier aminoácido; Xi2 es un aminoácido polar sin carga o A; Xi3 es naftilalanina. (b) un péptido es capaz de unirse a un receptor EPO que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7 8X9Xl? llXl2 l3 l l5 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y X6 es C, A, E, ácido -amino-?-bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, homoserinometiléter o norisoleucina; Xg es G o un cambio conservador de G; Xio es un cambio no conservador de prolina; o X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único; Xn se selecciona de cualquier aminoácido; Xi2 es T o A; Xi3 es 1-nal, 2-nal Xi4 es D, E, I, L o V; X?5 es C, A, K, ácido a-amino-?-bromobutírico u homocisteína (hoc) con la condición de que cualquiera de X6 o X?5 sea C o hoc . (c) fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados y variantes de los péptidos definidos por las secuencias de consenso anteriores que muestren actividad mimética de EPO y que tengan un aminoácido en la posición Xio que constituya un cambio no conservador de prolina (o de acuerdo con otra modalidad prolina o un cambio conservador de prolina) o en donde X9 y X?0 estén sustituidos por un aminoácido único y una naftilalanina en la posición Xi3. Un péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud, capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista, que se selecciona del grupo que consiste de: -péptidos que comprenden por lo menos una de las siguientes secuencias de núcleo de aminoácidos: X9X_._X--X-._X13 X9Xl?Xll l_Xl3Xl -XlsXl6 l7 o X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde en por lo menos una de las posiciones X10, X17 o X19 es un aminoácido cargado negativamente y en donde: X9 es G o un cambio conservador de G; X1X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X1S es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-?-bromobutírico; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados y variantes de los péptidos definidos en las secuencias de consenso anteriores, que muestran una actividad mimética de EPO y en donde en por lo menos una de las posiciones X10, X17 o X19 se encuentra un aminoácido cargado negativamente. El péptido mimético de EPO tiene un aminoácido cargado negativamente en por lo menos una de las posiciones X10, X17 o X19 también se puede describir en la siguiente secuencia de consenso agrandada X6X7X8X9X10X12X13X1 X15X16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales y en donde: X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o un ácido a-amino-?-bromobutírico,• X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina,- X9 es G o un cambio conservador de G; en el caso en que X10 no sea un aminoácido cargado de manera negativa, X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina, o X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido único; X?l se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-?-bromobutírico ; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, Har o T; en caso en que X17 no sea un aminoácido cargado negativamente, X17 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido cargado positivamente natural, no natural o derivatizado, preferiblemente K, R, H, ornitina u homoarginina; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; en caso de que X19 no sea un aminoácido cargado negativamente, X19 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado positivamente tal como K, R, H, ornitina u homoarginina; con la condición de que por lo menos uno de X10, X17 o X19 sea un aminoácido negativamente. Un péptido de por lo menos 10 aminoácidos de longitud, capaz de unirse al receptor EPO y que comprende una actividad agonista, que se selecciona del siguiente grupo de péptidos: (a) un péptido que comprende la siguiente secuencia de núcleo de aminoácidos: X9X10X11X12X13 ; X9X10X11X12X13X14X15X16X17 o X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: X9 es G o un cambio conservador de G; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, naftilalanina, A o F; X14 es D, E, I, L O V; X1S es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A es ácido a-amino-?-bromobutírico, así como fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados y variantes de los péptidos definidos por la secuencia de consenso anterior, que muestren una actividad mimética de EPO, en donde por lo menos una de las posiciones X10, X16, X17 o X19 muestran un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina; (b) un péptido, especialmente uno capaz de unirse al receptor EPO que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y X6 se C, A, E ácido a-amino-?-bromobutírico u homocisteina (hoc) ; X7 es R, H, L, W o Y o S; X8 es M, F, I, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un intercambio conservador de G; X10 es Har,- X1X se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es T o A; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es C, A, K, ácido a-amino-?-bromobutírico u homocisteina (hoc) , con la condición de que cualquiera de X6 o X15 sea C o hoc; (c) un péptido, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18 en donde X6 a X15 tienen el significado anterior de la variante (b) y en donde: X3 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V; X4 es Y; X5 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, H, K, L, M, S, T o I; X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T; X17 es homoarginina; X18 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido. Estos péptidos también se describen en la siguiente secuencia de núcleo de aminoácidos: X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y en donde: X6 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-?-bromobutírico; X7 es R, H, L, W, o Y o S; X8 es M, F, I, Y, H, homoserinametiléter o norisoleucina; X9 es G o un intercambio conservador de G; en el caso en donde X10 no es un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X10 es prolina, un cambio conservador de prolina o un cambio no conservador de prolina, o X9 y X10 están sustituidos por un solo aminoácido; XX1 se selecciona de cualquier aminoácido; X12 es un aminoácido polar sin carga o A; preferiblemente treonina, serina, asparagina o glutamina; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 es un aminoácido con una funcionalidad de cadena lateral capaz de formar un enlace covalente o A o ácido a-amino-?-bromobutírico; en caso en que X16 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, X16 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, o T; en caso de que X17 no sea un aminoácido cargado no proteinogénico positivamente que tiene una cadena lateral - - la cual está alargada en comparación con lisina, X?7 se selecciona de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, Y o un aminoácido cargado positivamente, natural, no natural o derivatizado, preferiblemente K, R, H u ornitina; Xie se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente L o Q; en caso de que X19 no sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina, Xi9 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido cargado positivamente tal como K, R, H u ornitina; con la condición de que por lo menos uno de Xio, Xi6> X o X19 sea un aminoácido no proteinogénico cargado positivamente que tiene una cadena lateral la cual está alargada en comparación con lisina. Las unidades peptídicas miméticas de EPO monoméricas, por lo menos dos de las cuales constituyen una unidad peptídica comprenden un aminoácido único que sustituye a los residuos aminoácidos Xg y X?0. Preferiblemente, ambos residuos están sustituidos por un aminoácido no natural, por ejemplo ácido 5-aminolevulínico o ácido 5-aminovaleríco . En una modalidad adicional, los dominios de unión utilizados en las unidades peptídicas comprenden la siguiente secuencia: X.X5X6X7X8X9X10X11X12X1-X1 15 en donde ß a X15 tienen el significado mencionado antes, y en donde X4 es Y; X5 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido y preferiblemente es A, H, K, L, M, S, T o I. Los dominios de unión se pueden extender y pueden comprender la secuencia de consenso: X3X4X5X6X X8X9Xl?XllXl2Xl3Xl . l5Xl 6Xl7Xl8 en donde X4 a X15 tienen el significado anterior, y en donde: X3 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V; Xi6 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S, o T, de manera más preferida K, R, S o T; X17 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, R, K, Y o un aminoácido no natural con una cadena lateral cargada positivamente, de manera más preferida R, K o un aminoácido no natural tal como homoarginina; Xi8 se selecciona independientemente de cualquier aminoácido . En una modalidad adicional de la invención, se prefiere que los péptidos comprendan X6 como C, E, A o hoc, preferiblemente C o X7 como R, H o Y, o Xs como F o M, o X9 como G o A, preferiblemente G o X?o como K o Xn como V, L, I, M, E, A, T o norisoleucina, o X?2como T o Xi3 como W o X?4 como D o V, o X15 como C o hoc, preferiblemente C o X?7 como P, Y o A. No obstante, también se prefiere que X?7 sea K o un aminoácido no natural con una cadena lateral cargada positivamente tal como homoarginina. La figura 19 describe monoméros peptídicos novedosos y adecuados adicionales que muestran la actividad mimética de EPO. Junto con la presente invención se pueden utilizar como dominios de unión adecuados (monoméros) para crear unidades peptídicas de acuerdo con esta invención. Además, se pueden utilizar como péptido miméticos EPO monoméricos o multiméricos como se describe en lo anterior. Al inicio (parte N terminal) y al fin (parte C terminal) de los monómeros de unión, se pueden quitar o agregar hasta cinco aminoácidos. Dado que únicamente las características funcionales del péptido son decisivas -aquí la capacidad de unirse y, en el caso de un agonista receptor de EPO, de activar al receptor EPO. La secuencia precisa de aminoácidos de la unidad peptídica pueden variar. En lo anterior únicamente se proporcionan ejemplos adecuados de péptidos miméticos de EPO con el fin de soportar el concepto general. NO obstante, también se pueden utilizar otros péptidos miméticos de EPO con una secuencia de aminoácidos diferente junto con la presente invención. De acuerdo con otra modalidad, dichas unidades peptídicas unen al receptor TPO por lo que dimerizan al complejo receptor TPO. Preferiblemente, inducen una transducción de señal y por lo tanto son agonistas de receptor de TPO. Las unidades peptídicas respectivamente de los dominios de unión monoméricos que crean las unidades peptídicas se pueden seleccionar del grupo de péptidos miméticos de TPO. Los péptidos miméticos de TPO apropiados son bien conocidos en el estado de la técnica y se pueden utilizar en relación con la presente invención. Los ejemplos adecuados se describen, por ejemplo en WO 98/25965, US5932546, WO0024770, Cwirla, S. E., P. Balasubramanian, D. J. Duffin, C. R. Wagstrom, C. M. Gates, S. C. Singer, A. M. N. C. Wrighton, R. W. Barrett y W. J. Dower (1997) . "Peptide agonist of the thronbopoietin receptor as potent as the natural cytokine". Science 276(5319): 1696-1699, US6083913, US6465430, US5869451, US6121238, US6251864, Dower, W. J. , S. E. Cwirla, P. Balasubramanian, P. J. Schatz, D. P. Baccanari y R. W. Barrett (1998). "Peptide agonists of the thrombopoietin receptor". Stem Cell 16 Suppl 2: 21-29, WO05023834, WO0024770, la descripción de todos los documentos respecto a la estructura/secuencia de aminoácidos de los péptidos - miméticos de TPO se incorpora por completo como referencia. Las unidades peptídicas de acuerdo con la invención pueden comprender, además de los L-aminoácidos o los D-aminoácidos estereoisoméricos, aminoácidos no naturales/no convencionales tales como aminoácidos a,a-disustituidos, N-alquilaminoácidos o ácido láctico, por ejemplo 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, homoserina-metiléter, ß-alanina, 3-piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfoserina, N-metilglicina (sarcosina) , N-acetilserina, N-acetilglicina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, nor-lisina, ácidos 5-aminolevulínico o ácido 5-aminovalérico . Se prefiere especialmente N-metilglicina (MeG) y N-acetilglicina (AcG) , en particular en una posición terminal. También dentro del alcance de la presente invención están los péptidos los cuales son retro, inverso y péptidos retro/inverso de los péptidos definidos y aquellos péptidos que consisten por completo de D-aminoácidos . También se pueden utilizar derivados de los péptidos, por ejemplo productos de oxidación de metionina, o glutamina desamidada, arginina y la amida de la parte C terminal . En la presente, las abreviaturas para el código de una letra como letras mayúsculas y aquellas de la nomenclatura de polipéptidos estándar, extendida por la - - adición de los aminoácidos no naturales. Código aminoácido A L-alanina V L-valina L L-leucina I L-isoleucina M L-metionina F L-fenilalanina Y L-tirosina W L-triptofan H L-histidina S L-serina T L-treonina C L-cisteina N L-asparagina Q L-glutamina D ácido L-aspártico E ácido L-glutámico K L-lisina R L-arginina P L-prolina G glicina Ava, 5-ava ácido 5-aminovalérico Ais, 5-Als ácido 5-aminolevulínico MeG N-metilglicina - AcG N-acetilglicina Hsm homoserina metiléter Har homoarginina lnal 1-naftilalanina 2nal 2-naftilalanina ßAla beta-alanina hoc/hcy homocisteina Ac acetilado Am amidado Dap ácido diaminopropionico Dab ácido diaminobutírico Aad ácido a-aminoadípico Asu ácido a-aminosubérico Adi ácido adípico Glr ácido glutárico Sec selenocisteina Las unidades peptídicas se pueden modificar, por ejemplo, por cambios conservadores de un solo aminoácido. Dicho cambio altera la estructura y función de una molécula de unión pero ligeramente en la mayor parte de los casos. En un cambio conservador, un aminoácido es sustituido por otro aminoácido dentro de un grupo con propiedades similares . Los ejemplos de grupos correspondientes son: - aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares: A, G, V, L, I, P, F, W, M aminoácidos sin carga que tienen cadenas laterales polares: S, T, G, C, Y, N, Q aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas: F, Y, W aminoácidos cargados positivamente: K, R, H aminoácidos cargados negativamente: D, E aminoácidos de tamaño o peso molecular similares, en donde el peso molecular de los aminoácidos que sustituyen se desvía en un máximo de +/-25% (o +/-20%, +/-15%, +/-10%) del peso molecular del aminoácido original. De manera más específica, Wrighton et al. (Patente de E.U.A. 5,773,569 y patentes asociadas) examinan con detalle, utilizando técnicas de presentación de fago, cuales aminoácidos de un péptido mimético de EPO se puede sustituir mientras se mantiene la actividad. También investigaron y publicaron datos sobre el posible corte, es decir, la longitud mínima de un péptido monomérico dado. De acuerdo con una modalidad de la invención, se utilizan los monómeros que se seleccionan del grupo que consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2, 4-9 indicadas en lo siguiente, para la formación de por lo menos unidades peptídicas bivalentes. Una buena actividad muestra a un péptido con K en la posición 10 y K en la posición 17 como en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG SECUENCIA DE IDENTICACION NUMERO GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG Incorporación de ácido 5-aminolevulínico (Als¡ -Ais SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 7: GGTYSCHF -(Ais) - LTWVCKPQGG SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 8: GGTYSCHF -(Ais) - LTWVCKKQGG SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 9: GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG De acuerdo con una modalidad, las unidades peptídicas se forman en base en los monómeros de acuerdo con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2 y 4 a 9 como se indican en lo anterior o modificaciones de las mismas. Los péptidos se pueden modificar, por ejemplo, por un cambio conservador de aminoácidos solos, en donde, de manera preferible, se cambian un máximo de 1, 2 ó 3 aminoácidos. Preferiblemente, estos péptidos se modifican respecto a AcG en la parte N terminal y MeG en la parte C terminal. Algunos ejemplos de unidades peptídicas apropiadas para dimerización del receptor EPO se incluyen posteriormente. Las barras encima de los dominios de unión simbolizan puentes disulfuro intramoleculares opcionales pero preferidos. SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 10 (basada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2) : i 1 i 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG — GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG SECUENCIA DE I DENTI FICACIÓN NUMERO 11 I 1 - I : 1 AC-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG — GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-COK El enlazante en estas estructuras bivalentes se elabora por adecuación de modelado molecular para evitar distorsiones de la conformación bioactiva (figura 1) . SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 12 La secuencia enlazante se puede acortar por un residuo glicina. Esta secuencia también es un ejemplo de un enlazante constituido por un residuo glicina que forma al mismo tiempo parte del dominio de unión (véase la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2). i 1 i 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKQG— GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 14 i 1 i 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKKGG— GGTYSCHFGKLTWVCKKDGG Esta secuencia presenta una unidad peptídica bivalente continua que alberga dos dominios de unión ligeramente diferentes (heterogéneos) . Dichos péptidos bivalentes pueden no ser accesibles económicamente con un enfoque de dimerización de la técnica anterior (véase antes) . La ventaja de esta molécula heterodimérica se encuentra en que los aminoácidos desviados (actualmente K y D en la parte C terminal) interactúan entre sí por lo que estabilizan al dímero. Por lo tanto, es ventajoso incorporar modificaciones estabilizantes respectivas en la molécula mediante modelado molecular. Un ejemplo adicional es: GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFHKLT-lnal-VCKKQRG De acuerdo con una modalidad adicional, el péptido opcionalmente presenta un aminoácido adicional, preferiblemente uno con una cadena lateral reactiva tal como cisteina en la parte N terminal, tal como por ejemplo en las siguientes secuencias: - - C-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG C-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG La cadena lateral reactiva de cisteina puede servir como una cola en la sangre, por ejemplo, para unión de la unidad portadora polimérica. Opcionalmente los péptidos comprenden además puentes disulfuro intramoleculares entre la primera y segundo y/o tercera y cuarta cisteinas. Las unidades monoméricas como se ejemplifican por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 2, 4-9 y 12, 13 y 15, 15a se pueden combinar favorablemente a las unidades peptídicas. Los ejemplos para métodos de dimerización que se aplican a los monómeros de las unidades peptídicas incluyen (pero no se limitan a) : 1. La dimerización vía conexión desde la parte C terminal a C terminal, en donde C terminal de un péptido monomérico se une covalentemente a la parte C terminal de otro péptido. El enlazante/separador entre los monómeros puede contener una unidad de dicetopiperazina. Se puede obtener una escalera de dicetopiperazina Gly-Gly preferida por activación del monómero glicina C terminal. Este principio también puede ser utilizado para formar una dimerización en la parte C terminal.

Las siguientes fórmulas y ejemplos representan cuatro ejemplos adecuados, los cuales se optimizan por modelado molecular: (a) dímero en base en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2 (la conformación del dímero se muestra en la figura 2) : i 1 GGTYSCHFGK TWVCKKQGGG-G GGTYSCHFGK TWVCKKQGGG-G J 1 I (b) dímero en base en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2 con un enlazante acortado por una glicina; la conformación se muestra en la figura 3.

I 1 GGTYSCHFGKLTVWCKKQGG-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG I I (c) dímero en base en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2 con glicina sustituida por ß-alanina (figura 4) . El monómero (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 16) también es aplicable como un péptido mimético de EPO.

I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKQG-ttA!a-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQG-RAIa-G I I I I (aj aimero en case en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2 con una glicina alternativa sustituida por ß-alanina (figura 5) . El monómero (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 17) también se puede aplicar como un péptido mimético de EPO: i 1 r i GGTYSCHFGKLTWVCKKQ-BAIa-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQ-BAIa-G-G I GGTYSCHFGKLTWVCKKQ-BAIa-G-G XX I I GGTYSCHFGKLT VCKKQ-BAIa-G I I 2. La dimerización vía conexión desde la parte N terminal a la parte N terminal, en donde la parte N terminal de uno de los péptidos monoméricos se une covalentemente a la parte N terminal del otro péptido, por lo que la unidad separadora preferiblemente contiene un bloque de construcción de ácido dicarboxílico. (a) En una modalidad, los dímeros resultantes en la base de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2 se alargan en la parte N terminal por un residuo glicina (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 18) que contienen una unidad hexanodiolilo como enlazante/separador (figura 6) : GGOTYSCHFGKLTWVCKKQGG CO-(CH2)«-CO GGGTYSCHPGKLTWVCKKQGG (b) En una modalidad alternativa, la dimerización se puede obtener mediante la utilización de una unidad octanodioilo como enlazante/separador (figura 7) GGG VSCHFßK TWVCKKQGG CO-(CH_)5-CO GGGTYSCHFGKLTWVCKKQGG 3. La dimerización vía las cadenas laterales en donde la cadena lateral de aminoácido de uno de los péptidos monoméricos se une covalentemente a una cadena lateral de aminoácido del otro péptido con inclusión de una molécula separadora adecuada que conecta a los dos monómeros peptídicos .

Esto puede incluir: (a) la conexión vía un enlace amida: i 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG (b) o la conexión vía un puente disulfuro: I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG -(CH2)m S' i *.CH_)n GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG I I i 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG 1 I I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG I I La X simboliza el núcleo de la estructura principal del aminoácido respectivo que participa en la formación de unión peptídica respectiva. De acuerdo con una estrategia diferente, el puente covalente que une a los monómeros peptídicos entre sí por lo que forma la unidad peptídica se conforma entre las cadenas laterales del aminoácido de la parte C terminal de la primera unidad peptídica monomérica y el aminoácido N terminal del segundo monómero peptídico. Por lo tanto, se prefiere de acuerdo con esta estrategia de dimerización que los péptidos monoméricos que van a ser dimerizados presenten un aminoácido con una funcionalidad formadora de puente ya sea en la parte en la N o C terminal por lo que se permite la formación de un enlace covalente entre el último aminoácido del primer péptido y el primer aminoácido del segundo péptido. La unión que genera el dímero preferiblemente es covalente. Los ejemplos adecuados de puente respectivos son, por ejemplo, el puente disulfuro y el puente diselenuro. No obstante, también los enlaces amida, por ejemplo, entre aminoácidos cargados positiva y negativamente u otras uniones enlazantes convalentes tales como uniones tioéter son adecuadas como porciones enlazantes . Los aminoácidos preferidos adecuados para formar puentes de conexión respectivos entre las unidades de unión monoméricas para formar la unidad peptídica final son, por ejemplo, cisteina, derivados de cisteina tales como homocisteina o selenocisteina o tiolisina. Forman puentes disulfuro o, en el caso de aminoácidos que contienen selenio, puentes diselenuro. Los ejemplos adecuados para los dímeros de unidades peptídicas creadas respectivamente se proporcionan a continuación utilizando péptidos miméticos de EPO como ejemplos : Ac - GGT- SCHFGK T - Nal - VCKKQR- Cyß I 8 I s Cys -GTYSCHFGK T-Nal -VCKKQRG- Ara I I i 1 Ac-GGTYSCSFGKLT-Nal-VCK-Har-QG-Cyß I 8 s I Cy- -GTYSCSFCn--T-Nal-VCK-Ha. -Qss-Am I I -__ ( ?C-GOTYSCHFGK T-Nal-VCKKQR- Sec Se I Se Sec-aTYBCHFGK T-Nal-VCKKQRG-Am I I i 1 ?c-GGTYSCSFGK T-Mal-VCK-Har-QG-Sec (Sec = selenocistelna) I • ße I Se I Sec-GTYSCSFGKLT-Nal-VCK-Har-QGG-Ain I I I ' 1 Ac-GGTYSCHFGK T-Nal-VCKKQR-Hcy (Hcy = homocisteina) I S I s \ Be -GTYSCHFGK T-Na1-VCKKQRG-Am I I i 1 Ac-OGT- SCSFGK T-Nal-VCK-Har-QG-.Hcy ß S I Hcy-GTYSCSFGi t-Nal-VCK-Har-QGG-Am I 1 Ac-GGTYSCSFGKLT-Nal-VCK-Har-QG-Cys-Am I s Ac-Cys-GTYSCSFGXLT-Nal-VCK-Har-QGG-Am De acuerdo con un desarrollo adicional ya sea la parte N o C terminal del dímero peptídico (y por lo tanto de las unidades peptídicas monoméricas respectivas ya sea que estén localizadas al inicio o al final del dímero) comprenden un aminoácido adicional, lo que permite el acoplamiento del portador polimérico tal como HES con el fin de generar el compuesto supravalente . En consecuencia, el aminoácido introducido presenta una funcionalidad de acoplamiento respectiva tal como, por ejemplo, un grupo SH . Un ejemplo común de dicho aminoácido es cisteina. No obstante, también son adecuados otros aminoácidos con un grupo funcional que permite la formación de un enlace covalente (por ejemplo aminoácidos cargados por completo de manera negativa y positiva) . i 1 Ac-C (tBu) -GGTYBCSFGKLT-Nal-VCl -Har-Qß-Cyß-Ara Ac-Cyß-GTYSCSFGJC T-Nal-vac-Har-QGG-Am I I Las barras sobre los monómeros peptídicos representan puentes intramoleculares covalentes; en este caso puentes disulfuro. De acuerdo con un desarrollo adicional, el aminoácido en la parte C o N terminal involucrado en la formación del puente covalente para conectar las unidades monoméricas a un dímero muestra un grupo cargado tal como, por ejemplo, el grupo COO" o NH3+ . Esta característica genera una estabilización favorable de la estructura del puente intermolecular: i 1 Ac-C(tBu)-CCT?SCSFGJCLT-Nal-VCX-Har-_a-Cyß-COO (-) (+) H3N-Cyß-GTYSC6FGlCLT-Nal-VaC-Har-QsG-?m . La dimerización al formar péptidos bivalentes o multivalentes continuos ya se ha indicado en lo anterior.

El concepto central de esta estrategia se encuentra en el sintetizar péptidos monoméricos que formen parte del péptido multivalente o bivalente en reacciones separadas antes de la dimerización o multimerización, pero sintetizar el péptido bivalente o multivalente final en una etapa como un péptido único; por ejemplo en una reacción en fase sólida única. Por lo tanto ya no se necesita una etapa separada de dimerización o multimerización. Este aspecto proporciona una gran ventaja, es decir, el control completo e independiente en cada posición de la secuencia en la unidad peptídica final. El método permite albergar con facilidad por lo menos dos dominios de unión diferentes específicos de receptor en una unidad peptídica debido al control independiente en cada posición de secuencia. Respecto a los monómeros y péptidos diméricos o multiméricos, los péptidos continuos bivalentes/multivalentes se pueden modificar, por ejemplo, por acetilación o amidación o se pueden alargar en las posiciones C terminal o N terminal. Todas las modificaciones posibles también se aplican para modificar el enlazante. En particular, puede ser ventajoso unir porciones de polímeros solubles al enlazante tal como por ejemplo PEG, almidón o dextranos . La síntesis del péptido final multivalente o bivalente de acuerdo con la invención favorablemente también puede incluir dos formaciones subsecuentes e independientes de enlaces disulfuro u otros enlaces intramoleculares dentro de cada uno de los dominios de unión. De esta manera los péptidos también se pueden ciclar. Las cadenas laterales reactivas de los péptidos pueden servir como una unión enlazante, por ejemplo para modificaciones adicionales. Opcionalmente, las unidades peptídicas además comprenden puentes intramoleculares entre aminoácidos que tienen funcionalidad de cadena lateral formadora de puente tal como, por ejemplo, las cisteinas. Los péptidos se pueden modificar, por ejemplo, por acetilación o amidación o se pueden alargar en las posiciones C terminal o N terminal. La extensión con uno o más aminoácidos en uno de las dos partes terminales (N o C) por ejemplo para preparación de un sitio de unión para el portador polimérico con frecuencia genera una unidad peptídica bivalente heterodimérica la cual se puede - - fabricar mejor como un péptido continuo. Se conocen en el estado de la técnica varios aminoácidos reactivos con el fin de acoplar los portadores a la proteína y péptidos. Un aminoácido de acoplamiento preferido es cisteina el cual se puede acoplar a la parte N o C terminal o se puede introducir dentro de la secuencia peptídica. No obstante, la dirección de acoplamiento puede establecer una diferencia considerable y por lo tanto debe seleccionarse con cuidado para la unidad peptídica. esto se demostrará en base en el siguiente ejemplo de un péptido mimético de EPO: Se utilizan los siguientes dos dímeros: AGEM400C6C4 1 2 3 4 4 1 0 0 0 0 1 Ac - iSG_ .SCHFGK.T- --lfa 1 - VCKKQltiGGlYJ-CHfQX- T - 1 -Nal WCKKQW- C?s ( _Bu) -NH_ I I 1 I AGEM40C6C4 1 2 3 4 4 1 0 ° ° ° ..1 Ac-Cys (tBu) - ¡3g TTfS-HFQK-T -'3, -lfa 1 - VCKKQRSGfi tYSCHTOKtiT-.I - Nal L-yCKKQJ-S- NH, C ,? i i I-Nal: 1-naftilalanina Cis (tBu): L-cisteína protegido con S-terbutilo Las secuencias de 41 unidades AGEM400C6C4 y AGEM40C6C4 poseen la misma secuencia de núcleo. Los aminoácidos 1-40 de AGEM40C6C4 igual a los aminoácidos 2-41 de AGEM40C6C4. La única diferencia es la posición de la cisteína protegida con terbutilo. Este aminoácido no está involucrado en la interacción de receptor y medicamento, perso está destinado a funcionar como el grupo enlazante a un portador polimérico en el conjugado final. En el caso de AGEM400C6C4, la cisteína protegida con terbutilo se une a la parte C terminal, en el caso de AGEM40C6C4 está unida a la parte N terminal . Las barras de conexión representan puentes cisteína. Existen dos ventajas de AGEM400C6C4 sobre AGEM40C6C4. La primer ventaja es su accesibilidad sintética. AGEM400C6C4 se puede aislar con rendimientos generales altos en comparación con AGEM40C6C4. En el caso de la síntesis de la secuencia lineal de AGEM40C6C4, se observa una secuenci CIZ-22 unidades (CIZ-RGGGTYSCHFGKLT-1-Nal-VCKKQRG-NH2, CIZ: grupo 2-clorobenciloxicarbonilo) como un producto secundario. Durante la purificación de la secuencia lineal por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa (RP-CLAP) presenta un comportamiento cromatográfico similar que el precursor lineal de AGEM40C6C4 y por lo tanto se vuelve difícil que se separe lo que genera una pérdida en el rendimiento total del producto deseado. En el caso de AGEM400C6C4 no se encuentra un compuesto análogo. La segunda ventaja de AGEM400C6C4 sobre AGEM40C6C4 se encuentra en la implementación más fácil de un análisis del conjugado final del péptido desprotegido con un portador polimérico. Una estrategia para el análisis de un conjugado peptídico es la degradación selectiva del conjugado por separación con endoproteasas . Idealmente el péptido completo se libera del portador polimérico durante la hidrólisis enzimática. Estos fragmentos peptídicos se pueden identificar y cuantificar por técnicas analíticas estándar como, por ejemplo, CLAP con detección UV o MS, etc . En el caso de AGEM400C6C4, la separación se puede llevar a cabo con tripsina - una endoproteasa que se sabe separa enlaces peptídicos de manera altamente selectiva que se encuentran en la parte C terminal de los aminoácidos cargados arginina y lisina (F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg.), "Bioanalytik" , Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín, 1998) . Aplicado a los conjugados de AGEM400C6C4 esto generará fragmentos libres que cubren 38 de los 41 aminoácidos del péptido original unido a la molécula portadora. En el caso de AGEM40C6C4, se liberan por la digestión tríptica fragmentos de sólo 21 a 41 aminoácidos . conjugado de AGEM400C6C4 c-GGTY9CHFG-XT-l-N_l-VCKKQRGGG3rysCHE -KXT-l-Nal-VCK QBG-Cya - polimero I 1 I 1 conjugado de AGEM40C6C4 polímero- (Ac) Cya -GGTYSCHFGK T- 1 -Nal - VCKKQRpGGT-jSCHFOKL'P- 1 ^N»l -^_gKXQB!S-WH.

Los fragmentos se liberan y se pueden detectar por análisis de seguimiento se marcan con con fondo gris. Dado que el análisis de un ingrediente farmacéutico activo es el tema clave durante su desarrollo, AGEM400C6C4 tiene una ventaja clara sobre AGEM40C6C4. Por lo tanto, en caso de que un aminoácido cargado positivamente se localice en las posiciones respectivas, se prefiere en gran medida incorporar el aminoácido enlazante (aquí cisteína) en la parte C terminal debido a que es posible generar un fragmento peptídico casi completo dado que un sitio de separación se debe a la arginina en la posición X19 de monómero mucho antes que el polímero. Los métodos de ensamblado respectivos como se describen en lo anterior también se pueden utilizar para la preparación de multímeros como unidades peptídicas. Se resalta que la totalidad de los dominios de unión descritos en la presente, ya sea solos o como parte de un péptido bivalente también se pueden combinar con uno o más dominios peptídicos idénticos o diferentes con el fin de formar unidades peptídicas bivalentes o multivalentes homogéneas o heterogéneas respectivas . Las unidades peptídicas opcionalmente se modifican de manera que tengan AcG en la parte N terminal y MeG en la parte C terminal . Las unidades peptídicas se pueden modificar, por ejemplo, por acetilación o amidación o se pueden alargar en las posiciones C terminal o N terminal. La extensión con uno o más aminoácidos en sólo una de las dos partes terminales, especialmente para preparación de la unión de una unidad portadora posterior con frecuencia genera una unidad peptídica bivalente heterodimérica la cua puede fabricarse de mejor manera como un péptido continuo (véase antes) . La síntesis de un péptido final multivalente o bivalente de acuerdo con la invención favorablemente también puede incluir dos formulaciones subsecuentes e independientes de enlaces disulfuro u otros enlaces intramoculares dentro de cada uno de los dominios de unión. La presente invención comprende además métodos de producción de compuestos respectivos en donde las unidades peptídicas se conectan a las unidades portadoras respectivas . Los compuestos de la presente invención ventajosamente se pueden utilizar para la preparación de composiciones farmacéuticas para humanos o veterinarias.

Las indicaciones dependen de las unidades peptídicas unidas a la misma. En caso de acoplamiento de péptidos miméticos de EPO los compuestos de acuerdo con la presente invención son especialmente adecuados para las mismas indicaciones que eritropoyetina. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para tratar a un paciente que padece de un trastorno que es susceptible de tratamiento con un agonista de eritropoyetina que comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz o una cantidad de un compuesto de la presente invención que presenta una unidad peptídica que comprende una actividad agonista de eritropoyetina . La eritropoyetina es un miembro de la superfamilia de citocinas (véase antes) . Además de los efectos estimulantes descritos en la introducción, también se ha encontrado que la eritropoyetina estimula a las células pluripotenciales . Los mimétidos de EPO descritos en la presente por lo tanto son adecuados para todas las indicaciones causadas por efectos asociados con células pluripotenciales. Los ejemplos no limitantes son la prevención o tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema nervioso. Los ejemplos son daños neurológicos, enfermedades o trastornos tales como, por ejemplo, parkinsonismo, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Tay-Sachs, una neuropatía, daño a nervios periféricos, tumor cerebral, daño al cerebro, daño a la médula espinal o daño por apoplejía. Los péptidos miméticos de EPO de acuerdo con la invención también son utilizables para el tratamiento preventivo o curativo de pacientes que padecen de, o que están en riesgo de padecer un fallo cardíaco. Los ejemplos son infarto cardíaco, enfermedad de arteria coronaria, miocarditis, tratamiento por quimioterapia, alcoholismo, cardiomiopatía, hipertensión, enfermedades cardíacas valvulares que incluyen insuficiencia mitral y estenosis aórtica y trastornos de la glándula tiroides, síndrome coronario crónico o agudo. Además, los miméticos de EPO se pueden utilizar para estimulación de la movilización, proliferación y diferenciación fisiológica de células precursoras endoteliales, para estimulación de vasculogénesis, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una disfunción de células precursores endoteliales y para la producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de dichas enfermedades y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos y otros agentes adecuados para estimulación de células precursoras endoteliales. Los ejemplos de dichas enfermedades son hipercolesterolemia, diabetes mellitus, enfermedades de inflamación crónica mediada por endotelio, endoteliosis que incluye retículo endoteliosis, aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, isquemia miocárdica, angina de pecho, enfermedades cardiovasculares relacionadas con la edad, enfermedad de Raynaud, hipertonía inducida por embarazo, fallo renal crónico o agudo, fallo cardíaco, sanado de heridas y enfermedades secundarias. Los compuestos que presentan unidades peptídicas miméticas de EPO son especialmente útiles para el tratamiento de trastornos que están caracterizados por una deficiencia de eritropoyetina o una población de eritrocitos baja o defectuosa y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia y apoplejía. Dichas composiciones farmacéuticas opcionalmente pueden comprender portadores farmacéuticamente aceptables con el fin de adoptar la composición para el procedimiento de administración propuesto. Los métodos de suministro adecuados así como los portadores de aditivos se describen, por ejemplo, en WO 2004/101611, incorporado en la presente como referencia. En el caso de que los compuestos presenten unidades peptídicas miméticas de TPO (que tengan una actividad agonista) , los compuestos se pueden utilizar para todas las indicaciones como trombopoyetina. Por lo tanto, son útiles para la prevención y tratamiento de enfermedades mediadas por TPO, tales como, por ejemplo, trastornos hematológicos que incluyen trombocitopenia, granulocitopenia y anemia y el tratamiento de cánceres hematológicos. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para tratar a un paciente que padece de un trastorno que es susceptible de tratamiento con un agonista de trombopoyetina, que comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamnte eficaz o una cantidad de un compuesto de la presente invención que presente una unidad peptídica que comprende una actividad agonista de trombopoyetina .

EJEMPLOS A. Ilustración del concepto de compuestos supravalentes El concepto de moléculas supravalentes se explicará por medio de ejemplos. La figura 13 muestra un ejemplo de una molécula supravalente sencilla de acuerdo con la invención. Dos péptidos bivalentes continuos se conectan de la parte N terminal por una porción PEG bifuncional que presenta grupos maleimida. La cisteína se selecciona como sitio de unión reactivo para la unidad portadora PEG. No obstante, las moléculas supravalentes pueden comprender más de dos unidades peptídicas bivalentes o multivalentes continuas. La figura 14 proporciona un ejemplo que se basa en una unidad portadora con una unidad de glicerol central como unidad ramificada y que comprende tres péptidos bivalentes continuos. Nuevamente se utiliza cisteína para unión. La figura 20 muestra un ejemplo utilizando HES como unidad portadora polimérica. Se modifica HES de manera que presenta grupos maleimida que reaccionan con los grupos SH de las unidades peptídicas. De acuerdo con el ejemplo, todos los sitios de unión se une a las unidades peptídicas. No obstante, también unidades PEG pequeñas (pr ejemplo de 3 a 10 kD) pueden ocupar por lo menos parte de los sitios de unión. Como se explica en lo anterior, el concepto supravalente también se puede extender a polímeros dendríticos polivalentes en donde la unidad portadora dendrítica o polimérica se conecta a un número más grande de péptidos bivalentes continuos. Por ejemplo, la unidad ramificada dendrítica se puede basar en poliglicerol (por favor véase Haag 2000, incorporado en la presente como referencia) . Un ejemplo de una molécula supravalente basada en una unidad portadora con una unidad ramificada dendrítica que contiene seis péptidos bivalentes continuos se muestra en la figura 15. Otros ejemplos de moléculas supravalentes que comprenden unidades portadoras con almidones o dextranos, los cuales se oxidan utilizando por ejemplo ácido peryódico para albergar un número grande de funciones aldehido. En una segunda etapa, muchos péptidos bivalentes se unen a la unidad portadora y juntos forman la molécula final. Por favor nótese que incluso varios cientos de unidades peptídicas (por ejemplo 50 a 1000, preferiblemente 150 a 800, de manera más preferible 250 a 700) se pueden acoplar a la molécula portadora la cual es, por ejemplo, HES. No obstante, se pueden unir muchas menos unidades peptídicas a la molécula HES como se muestra en las figuras, especialmente si los péptidos miméticos de EPO están acoplados . El número promedio de unidades peptídicas que se van a acoplar se puede seleccionar de aproximadamente 2 a 1000, 2 a 500, 2 a 100, 2 a 50, preferiblemente 2 a 20 y de manera más preferible 2 a 10, dependiendo del péptido y uno o varios de los receptores que se van a unir. La figura 16 demuestra el concepto de una molécula supravalente biodegradable simple. Se conectan dos péptidos bivalentes continuos de la parte N terminal por dos porciones PEG bifuncionales que se conectan vía enlazante biodegradable que tiene una posición de separación intermedia. Los enlazantes permiten la ruptura de la unidad PEG grande en subunidades por lo que se facilita la depuración renal. Las ventajas conectadas al efecto de supravalencia son muy sorprendentes e inesperados. Inicialmente se tenía la preocupación de que la conjugación a una macromolécula pudiera reducir la eficacia. Esta suposición se basa en las desventajas supuestas en la velocidad de unión debido a velocidades de difusión reducidas con moléculas más grandes. Otra esperanza era que, a partir de varios API peptídicos unidos a un portador no todos podrían ser capaces de unirse al receptor debido potencialmente problemas estéricos de unión simultánea o debido al número de receptores, los cuales se pueden alcanzar por las extensiones del portador macromolecular que está limitado y posiblemente por debajo del número de los API peptídicos. Por lo tanto, no se esperaba un incremento en la potencia de API peptídico (ingrediente farmacéutico activo) como se observa con el concepto de supravalencia de la presente invención. Por otra parte, debido a los cambios farmacocinéticos significativos que es capaz de introducir un portador macromolecular, la potencia in vivo pudo haber mejorado debido a una vida media más prolongada de la totalidad del complejo péptido/portador . Este fenómeno también tiene el efecto de que el efecto de supravalencia es difícil de determinar in vivo, dado que es una entidad farmacodinámica la cual debe ser determinada por separado. Los análisis in vitro por lo tanto no son sólo suficientes sino que son la única manera útil de demostrar con claridad el efecto de supravalencia. El efecto de supravalencia, como se describe en esta invención, se puede demostrar por comparación de cantidades molares de API peptídico (conjugado a un portador versus no conjugado) . Se realiza un experimento en un análisis de células TF-1 estándar como lo recomienda la Farmacopea Europea para la determinación de actividad similar a EPO in vitro (por favor véase lo siguiente) . Básicamente se cultivan células TF-1 (su proliferación depende de la presencia de actividad similar a EPO) en presencia de concentraciones variables de sustancias EPO y miméticas de EPO. El número de células resultantes se cuantifica utilizando un análisis MMT colorimétrico y mediciones fotométricas . En base en estos datos, es posible determinar las relaciones normalizadas dosis-respuesta para cada sustancia dada. En este análisis se utiliza EPO y el péptido AGEM40 (véase abajo) , este último es un péptido bivalente continuo con actividad mimética EPO conocida. Se utiliza AGEM40 como péptido no conjugado y como péptido conjugado a un portador macromolecular (en este caso hidroxietilalmidón de un peso molecular medio de 130 kD; fuente comercial es pharmacay, Voluven como sustituto de plasma) . El tamaño de bloque de construcción de conjugado es de aproximadamente 40 kD, lo que significa que la molécula HES promedio presenta aproximadamente 2-5, preferiblemente 3 a 4 porciones peptídicas. También se puede utilizar HES 200/0.5. Después de la modificación de HES de 130 kD se conjugan aproximadamente 4 péptidos de AGEM 40 (peso molecular de la molécula conjugada: 150 kD) . Cuando se utiliza un HES que tiene un peso molecular de 200 kD, esto constituye aproximadamente 5 unidades peptídicas conjugadas a HES (peso molecular de la molécula conjugada: 220 kD) . La comparación que se muestra en la figura 33 se basa en la comparación molar de la concentración peptídica, ya sea que el péptido esté conjugado o no. Sorprendentemente, la potencia se incrementa (disminuye CE50 y la curva dosis-respuesta se sitúa a la izquierda del péptido no conjugado) por lo que se demuestra una influencia farmacodinámica positiva de conjugación oligovalente a un portador macromolecular. Así independientemente de las mejoras farmacocinéticas esperadas - el concepto de conjugación de acuerdo con la invención incrementa claramente la potencia del ingrediente farmacéutico activo (API) general y por lo tanto su eficacia. Este es un mecanismo nuevo el cual puede ser utilizado con certidumbre para péptidos que se dirigen al receptor EPO, pero potencialmente también para otros objetivos farmacológicos unidos a membrana, especialmente otros receptores de citocina tales como aquellos para trombopoyetina, G-CSF, interleucina y otros (véase antes) .

B. Conceptos para conjugar unidades peptídicas a hidroxietilalmidón Como se indica en lo anterior, de acuerdo con una modalidad, se utilizan polisacáridos tales como hidroxialquilalmidón y preferiblemente hidroxietilalmidón como un portador polimérico para las unidades peptídicas.

Con el fin de poder conjugar las unidades peptídicas al portador, es factible introducir grupos enlazantes apropiados en la molécula de almidón con el fin de facilitar el acoplamiento. De acuerdo con una modalidad, se introducen grupos amino en el almidón (a continuación descrito sobre el ejemplo de hidroxietilalmidón) en la estructura principal. Existen diferentes estrategias que se pueden seguir. Tres de ellas se explicarán con mayor detalle en lo siguiente, una generalidad de estos métodos se proporciona en la figura 34 : 1. Procedimiento en dos etapas: Se introducen grupos aldehido por oxidación seguido por aminación - - reductiva La oxidación de una molécula de HES se puede llevar a cabo por varios agentes oxidantes, es decir, peryodato de sodio (NaI04) y ácido 2-yodoxibenzoico (IBX) . La oxidación con NaI04 es prolongada y bien conocida y genera aldehidos por apertura de los anillos sacáridos.

IBX Se puede utilizar estequeométricamente para convertir grupos de alcohol primario a aldehidos sin abertura de los anillos de sacárido (véase figura 36, para revisión véase: V. V. Zhdankin, Current Organic Synthesis, 2005, 2 , 121-145 y documentos mencionados). Los derivaados que son más solubles en agua se describen en la literatura (Thottumkara, A. P.; Vinod. T. K. , Tetrahedron Lettl . , 2002, 43 (4 ) , 569) . De acuerdo con un enfoque diferente, el carbohidrato (preferiblemente una molécula de almidón tal como HAS) se oxida por contacto del material inicial que contiene el carbohidrato (preferiblemente una molécula de almidón tal como HAS) con un reactivo que produce un ion oxoamonio en presencia de un agente oxidante o al poner en contacto el material inicial directamente con la especie reactiva, el ion oxoamonio. El agente oxidante es, por ejemplo, un agente oxidante químico tal como un hipohaluro tal como por ejemplo hipoclorito e hipobromito de sodio o peróxido de hidrógeno. De manera alternativa se puede utilizar una enzima oxidante como el agente oxidante (véase, por ejemplo, el documento WO 99/23240, incorporado en la presente como referencia) . El reactivo productor de ion oxoamonio preferiblemente es un compuesto nitroxilo, de manera más preferible un compuesto di-ternitroxilo tal como 2,2,6,6-tetrametilpiperidino-1-oxilo (TEMPO) o un derivado respectivo del mismo. La oxidación ya sea con cantidades catalíticas de un TEMPO en presencia de cantidades estequiométricas de un reactivo cooxidante adecuado, es decir, hipoclorito de sodio (NaOCl) genera principalmente la oxidación de los grupos de alcohol primario a aldehidos (véase la figura 35, en el caso de HES ya sea en la posición 6 o el átomo C terminal del grupo hidroxietilo se convierte a un aldehido) sin que se abran los anillos de sacárido (literatura: P.L. Bragd, H. van Bekkum, A.C. Besemer, Topics in Catalysis, 2004, 27, 1-4; review: W. Adam, C. R. Saha-Moller, P. A. Ganeshpure, Chem. Rev. 2001, 101 , 3499-3548 y documentos mencionados, A. E. J. de Nooy, A. C. Besemer, H. v. Bekkum, Carbohydrate Resarch, 1995, 269, 89, EP 1 093 467, EP 1 173 409, WO 00/50621, EP 1 077 221, EP 1 149 846) . De manera alternativa, en vez de cantidades catalíticas de TEMPO, se pueden utilizar cantidades estequiométricas de las especies activas - el compuesto oxoamonio - (literatura: J. M. Bobbitt, N. Merbouh, Organic Syntheses , 2005, 82, 80) . Otros derivados de TEMPO (es decir, 4-acetamido-, 4 -hidroxi-TEMPO) también son adecuados especialmente respecto al pH de la reacción o la solubilidad en agua. Después de la oxidación, los grupos aldehido que se obtienen se convierten a amina por aminación reductiva. Como agentes reductores se pueden utilizar por ejemplo cianoborohidruro de sodio o un complejo de borano-dimetilamina (u otros compuestos de borano complejos) . Como el compuesto amina, se puede utilizar por ejemplo, cloruro de amonio o diaminas tal como 1, 3-diaminopropano, 1,3-diaminopropan-2-ol o lisina preferiblemente a valores de pH ligeramente ácido. El uso de diaminas incrementa la longitud del separador entre la estructura principal HES y el medicamento peptídico y el rendimiento de la aminación reductiva. Los grupos aldehido no convertidos con se reduce nuevamente de regreso al alcohol primario . La modificación de la oxidación IBX se puede realizar en DMSO en presencia de N-hidroxisuccinimida (figura 39) . En este caso, el éster activado correspondiente del ácido urónico es el que se forma directamente. Estas especies se pueden convertir directamente con, por ejemplo, diaminas, es decir, 1,3-diaminopropano a un HES aminado (literatura: R. Mazitschek, M. M. Ibaier, A., Giannis, Angew. Chem. 2002, 114 , 21, 4216-4218; A. Schulze, A. Giannis, Adv. Synth. Catal . 2004, 346, 252-256) . 2. Un procedimiento de dos etapas en donde HES es activado como un reactivo de "acoplamiento" y se hace reaccionar con un exceso de una amina bisfuncional . Se describen diversos métodos para la activación de polisacáridos, es decir, 1, 1 ' -carbonildiimidazol (CDI) (literatura: G. S. Bethell, J. S. Ayers, M. T. W. Hearn, W. S. Hancock, J. of Chromatography, 1981, 219 , 361-372), epibromohidrina (l-bromo-2 , 3-epoxipropano, de manera alternativa epiclorohidrina, respectivamente l-cloro-2,3-epoxipropano) (literatura: H. Dóbeli, E. Huchuli, Patente, 0253303 Bl) , cloruro de 2 , 2 , 2-trifluoroetanosulfonilo (cloruro de tresilo) (literatura: H. P. Jennissen, J. Mol . Recogn . , 1995, 8, 116-124), bromocianuro (BrCN) - - (literatura: G. S. Bethell, J. S. Ayers , M. T. W. Hearn, W. S. Hancock, J. of Chromatography, 1981, 219, 361-372; H. P. Jennissen, J". Mol . Recogn . , 1995, 8, 116-124, H. Dóbeli, E. Huchuli, Patente EP0253303 Bl) . Todos los reactivos tienen en común que introducen grupos funcionales los cuales son altamente reactivos y se pueden hace reaccionar en una segunda etapa con un exceso de aminas similares a nucleófilos bifuncionales, es decir, cloruro de amonio (no adecuado con todos los reactivos activantes) o diaminas, es decir, 1, 3-diaminopropano, 1, 3-diaminopropan-2-ol o lisina. 3. Procedimiento de una etapa en donde se activa HES por adición de un precursor de amina adecuado Los precursores de amina adecuados son, por ejemplo, halogenoalquilaminas (es decir, como sus sales, es decir bromuro de bromoetilamonio) o anillos azarreactivos, es decir, aziridinas, es decir L-aziridin-2-carboxilato de litio. La totalidad de las tres estrategias descritas tienen en común que, después de la introducción de los grupos amino al hidroxietilalmidón, estos grupos amino se convierten a maleimidas como un ejemplo adecuado de un enlazante apropiado. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al hacer reaccionar con, por ejemplo, ácidos maleimidocarboxílicos activados, es decir, éster N-hidroxisuccinimídicos del ácido 3- (maleimido) propiónico o éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-(maleimido) butírico. Las maleimidas resultantes representan los grupos funcionales activos finales para acoplamiento con péptidos que presentan un grupo tiol libre. 1. Un procedimiento de dos etapas: Se introducen grupos aldehido por oxidación seguido por aminación reductiva. 1.1 Oxidación de alcoholes primarios a aldehidos Mediante oxidación directa de los alcoholes primarios en hidroxietilalmidón, de manera más precisa los grupos C6-OH de la glucosa y los grupos hidroxietilo, se pueden formar grupos aldehido. Estos productos de oxidación se pueden formar con agentes oxidantes disponibles comercialmente como TEMPO o IBX (por ejemplo Sigma-Aldrich o Acros) . a) Oxidación con peryodato Este método se describe con mayor detalle en la sección experimental en el inciso C (véase abajo) b) Oxidación con TEMPO Mediante la utilizacióni de 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO) o sus derivados, por ejemplo 4 -acetamido-TEMPO o 4-hidroxi-TEMPO y cooxidantes tales como hipoclorito de sodio en una mezcla con bromuro de potasio (relación molar de TEMPO:NaOCl : KBr por ejemplo 1:40:20) los alcoholes primarios se pueden oxidar en tiempos de reacción cortos de aproximadamente 60 minutos en un amortiguador de fosfato en un intervalo de pH de 6-8, por lo que un pH mayor incrementa la velocidad de reacción. Con concentración molar diferente de la mezcla oxidante, especialmente el cooxidante, se puede controlar el número de aldehidos formados. En consecuencia, se puede controlar por esta primera etapa la cantidad de grupos de ancla y por lo tanto la cantidad de medicamento peptídico en el portador . La optimización se monitorea con reactivo de Purpald que forma una aducto púrpura únicamente con aldehidos y la titulación redox del hipoclorito remanente con un complejo yodo/almidón. El trabajado se realiza por técnicas de ultrafiltración utilizando una membrana PES con límites de peso molecular diferentes seguido por liofilización (literatura: P.L. Bragd, H. van Bekkum, A.C. Besemer, Topics in Catalysis, 2004, 27, 1-4; revisióin: W. Adam, C. R. Saha-Moller, P. A. Ganeshpure, Chem. Rev. 2001, 101 , 3499-3548 y documentos mencionados; A. E. J. de Nooy, A. C. Besemer, H. v, Bekkum, Carbohydrate Research, 1995, 269, 89) . La figura 35 ilustra una generalidad sobre el mecanismo de oxidación mediado por TEMPO de alcoholes primarios. La oxidación adicional a carboxilatos únicamente se produce mediante el uso de un exceso de agente oxidante. c) Oxidación con IBX Mediante la utilización del reactivo oxidante ácido 2-yodoxibenzoico (IBX) o sus derivados, se puede oxidar HES en DMSO como solvente. Después de un tiempo de reacción de 1-2 h, el IBX se puede separar al agregar agua (10 veces) y el IBX precipitado se separa por filtración. El trabajado se realiza por técnicas de ultrafiltración utilizando una membrana PES de límites de peso molecular diferentes seguido por liofilización. Con una concentración molar diferente de IBX, se puede controlar el número de aldehidos formados . Por dicha concentración también se puede controlar la cantidad de grupos de ancla y de esta manera la cantidad de medicamento peptídico en el portador. La optimización se monitorea con el reactivo Purpald que forma un aducto púrpura únicamente con aldehidos (para una revisión véase: V. V. Zhdankin, Current Organic Synthesis, 2005, 2, 121-145 y documentos mencionados) . La figura 36 proporciona una generalidad esquemática sobre la oxidación de alcoholes primarios con TEMPO o IBX seguido por aminación reductiva.

La figura 37 ilustra la introducción de grupos maleimida y la conjugación con un medicamento peptídico. 1.2 Aminación reductiva a) Aminación reductiva con cloruro de amonio Este método se describe con mayor detalle en la sección experimental del inciso C (véase abajo) . b) Aminación reductiva con enlazante diamina Con el fin de mejorar la longitud de separador entre la estructura principal de HES y el medicamento peptídico y el rendimiento de la aminación reductiva, la reacción se puede llevar a cabo con una diamina, 1,3-diaminopropano, 1, 3-diaminopropan-2-ol o lisina como fuente de amina y diferentes agentes reductores, es decir, cianoborohidruro de sodio o complejo de borano-dimetilamina .

Ejemplo : Aminación reductiva con 1 , 3 - diaminopropano La aminación reductiva de HES oxidado se realiza en amortiguador fosfato 1M, pH = 5 con un exceso de 10 veces de 1, 3-diaminopropano en comparación con el agente oxidante utilizado en la etapa anterior. Después de equilibrio durante aproximadamente 90 min se agrega en varias porciones un exceso de cianoborohidruro de sodio (Na[CN]BH3). El tratamiento se realiza por técnicas de ultrafiltración utilizando una membrana PES de límites de peso molecular diferentes seguido por liofilización. Los derivados de HES utilizados únicamente se utiliza intervalo de masa mayor de 100 kDa. La figura 38 proporciona una generalidad ilustrativa sobre la aminación reductiva con diaminas como 1, 3 -diaminopropano seguido por la introducción de grupos maleimida por el ejemplo de un HES oxidado con peryodato.

Oxidación de alcoholes primarios directamente a esteres activados Mediante oxidación directa de los alcoholes primarios en hidroxietilalmidón, de manera más precisa los grupos C6-OH de la glucosa y los grupos hidroxietilo. Para esta oxidación se utilizan agentes oxidantes disponibles comercialmente IBX (por ejemplo Sigma-Aldrich o Acros) en presencia de N-hidroxisuccinimida (HOSu) el alcohol es oxidado a OSu-éster, el cual se puede convertir directamente en una amina mediante la utilización de diaminas. Oxidación con IBX en presencia de HOSu conversión directa a la amina Mediante la utilización del reactivo oxidante ácido 2-yodobenzoico (IBX) o sus derivados en presencia de N-hidroxisuccinimida se puede oxidar HES en DMSO como solvente. Después de 1-2 horas la oxidación finaliza y al OSu-éster que se forma se le agrega un exceso grande (10 veces) de la diamina, por ejemplo 1, 3 -diaminopropano. El tratamiento se realiza por técnicas de ultrafiltración utilizando una membrana PES de límites de peso molecular diferente seguido por liofilización. A partir de los derivados de HES optimizados únicamente se utiliza un intervalo de masa molar mayor de 100 kDa (para literatura véase: R. Mazitschek, M. M. Ibaier, A. Giannis, Angew. Chem. 2002, 114 , 21, 4216-4218; A. Schulze, A. Giannis, Adv. Synth . Catal . 2004, 346, 252-256). La figura 39 ilustra la oxidación de alcoholes primarios a OSu-éster seguido por conversión directa con una diamina. 2. Procedimiento de dos etapas en donde se activa HES por un reactivo de "acoplamiento" y se hace reaccionar con un exceso de una amina bisfuncional Se pueden aplicar varias alternativas para introducir grupos amina en la estructura principal HES. Algunos ejemplos: a) Modificación con carbonildi imidazol (CDI) Se suspende HES seco en acetona seca durante 1 h.

Se agrega CDI y la mezcla se agita durante 1 hora. De manera alternativa se pueden agregar algunas sales, por ejemplo yoduro de potasio como activador/conucleófilos . El HES se precipita por centrifugación (2000 U/min, >10 min) . Después de decantar se agrega acetona nueva y el HES se precipita por centrifugación nuevamente. Después de 3 veces de lavado con acetona se capta HES en amortiguador carbonato 1M pH 10 y se agrega 1, 3 -diaminopropano (pH 11) y la mezcla se agita durante 1 hora. Se trabaja HES por ultracentrifugación (MWCO 100 kD) seguido por liofilización. La figura 40 ilustra la modificación con carbonildiimidazol seguido por una diamina para introducir un grupo amina. b) Modificación con epibromohidrina (Epi) Se disuelve HES en parte de DMF y se agrega epibromohidrina (alternativamente también se pueden agregar algunas sales, por ejemplo yoduro de potasio como activador/conucleófilos) y la mezcla se agita durante la noche. El HES se diluye con agua (10 veces) y se trabaja por ultracentrifugación (MWCO 50 o 100 kD) seguido por liofilización. El producto se disuelve en amortiguador de fosfato 1M, pH = 7 y se agrega 1, 3 -diaminopropano y la mezcla se agita durante 1 hora. El HES se trabaja por ultracentrifugación (MWCO 50 o 100 kD) seguido por liofilización. La figura 41 ilustra la modificación con epiclorohidrina seguido por una diamina para introducir un grupo amina. 3. Procedimientos de una etapa en donde se activa HES por adición de un precursor de amina adecuado. a) Modificación con bromhidrato de bromuro de 2-aminoetilo Se disuelve HES en DMSO y se agrega bromohidruro de 2-bromoetilamina (de manera alternativa también se pueden agregar algunas sales, por ejemplo yoduro de potasio como activador/conucleófilo) y se agita durante la noche (también se puede utilizar cierto calentamiento) . El HES se diluye con agua (10 veces) y se trabaja por ultracentrifugación (MWCO 50 o 100 kD) seguido por liofilización. La figura 42 ilustra la modificación con clorhidrato de bromuro de 2-aminoetilo para introducir un grupo amina . b) Modificación con L-aziridin-2-carboxilato de litio Se disuelve HES en DMSO o una solución acuosa amortiguada y se agrega L-aziridin-2-carboxilato de 2-litio (alternativamente también se pueden agregar algunas sales, por ejemplo yoduro de potasio como activador/conucleófilo) y se agita durante la noche. La mezcla se diluye con agua (10 veces) y se trata por ultracentrifugación (MWCO 50 o 100 kD) seguido por liofilización. La figura 43 ilustra la modificación con L-aziridin-2-carboxilato de litio para introducir un grupo amina .

C. Ejemplos detallados de modalidades de la presente invención I. Síntesis peptídica de monómeros Síntesis manual Se lleva a cabo la síntesis mediante el uso del sistema de microondas Discover (CEM) utilizando PL-Rink-Amide-Resin (tasa de sustitución de 0.4 mmoles/g) o Wang-Resins recargadas en una escala de 0.4 mmoles. La separación del grupo Fmoc se obtiene por adición de 30 ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 100W durante 3 x 30 seg. El acoplamiento de aminoácidos se obtiene por adición de un exceso de 5 veces de aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50W durante 5 x 30 seg. Entre todos los ciclos de irradiación la solución se enfría manualmente con la ayuda de un baño con hielo. Después de desprotección y acoplamiento la resina se lava 6 veces con 30 ml de DMF. Después de desprotección del último aminoácido algunos péptidos se acetilan por incubación con 1.268 ml de solución de remate (4.73 ml de anhídrido acético y 8.73 ml de DIEA en 100 mide DMSO) durante 5 minutos. Antes de la separación la resina se lava 6 veces con 30 ml de DMF y 6 veces con 30 ml de DCM. La separación de los péptidos crudos se obtiene por tratamiento con 5 ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución se filtra en 40 ml de éter frío. El precipitado se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 m, 250 x 4.6 mm) . Síntesis automatizada La síntesis se lleva a cabo mediante el uso de un sistema de microondas Odyssey (CEM) utilizando PL-Rink-Amide-Resins (tasa de sustitución de 0.4 mmoles/g) o Wang-Resins precargada en una escala de 0.25 mmoles. La separación de los grupos Fmoc se obtiene por adición en 10 ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 100W durante 10 x 10 segundos. El acoplamiento de los aminoácidos se obtiene por adición de un exceso de 5 veces de aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50W durante 5 x 30 seg. Entre todos los ciclos de irradiación la solución se enfría por burbujeo de nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Después de desprotección y acoplamiento la resina se lava 6 veces con 10 ml de DMF. Después de desprotección del último aminoácido algunos péptidos son acetilados por incubación con 0.793 ml de una solución de remate (4.73 ml de anhídrido acético y 8.73 ml de DIEA en 100 ml de DMSO) durante 5 minutos. Antes de separación de la resina después se lava 6 veces con 10 ml de DMF y 6 veces con 10 ml de DCM. La separación de los péptidos crudos se obtiene por tratamiento con 50 ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución se filtra en 40 ml de éter frío, el precipitado se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 m, 250 x 4.6 mm) . Purificación Todos los péptidos se purifican utilizando un sistema Nebula-CLEM (Gilson) . El material crudo de todos los péptidos se disuelven en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 m, 250 x 4.6 mm) . El caudal es de 20 ml/min y la relación de división CLEM 1/1000.

II. Formación de puentes disulfuro intramoleculares Formación de ciclos con K3[(FeCN6) Solución 1: Se disuelven 10 mg del péptido en 0.1% de TFA/acetonitrilo y se diluyen con agua hasta que se alcanza una concentración de 0.5 mg/ml. Se agrega bicarbonato de sodio sólido para alcanzar un pH de aproximadamente 8. Solución 2: En un segundo frasco se diluyen 10 ml de 0.1% de TFA/acetonitrilo con 10 ml de agua. Se agrega bicarbonato de amonio sólido hasta que se alcanza un pH de 8 y se agrega 1 gota de una solución 0.1M de K3[(FeCN6)] . Se agregan a gotas las soluciones 1 y 2 durante un período de 3 horas a una mezcla de acetonitrilo/agua (1/1; pH = 8) . La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante la noche y la mezcla se concentra y purifica por CLEM.

Formación de ciclos con resina CLEAR-OXMR A 100 ml de acetonitrilo/agua (1/1; 0.1% TFA), se agrega bicarbonato de amonio sólido hasta que se alcanza un pH de 8. Esta solución se desgasifica al burbujear argón durante 30 minutos. Después se agregan 100 mg de resina CLEAR-OXMR. Después de 10 minutos se agregan 10 mg del péptido, como un sólido. Después de 2 horas de incubación se filtra la solución, se concentra y purifica por CLEM.

Purificación de péptidos cíclicos: Todos los péptidos se purifican utilizando el sistema Nebula-CLEM (Gilson) . El material crudo de todos los péptidos se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) o DMSO y el péptido se purifica por RP-HPLC (Kromasil 100 C18 o C8 10 m, 250 x 4.6 mm) . El caudal es de 20 ml/min y la relación de división CLEM es 1/1000. III. Análisis in vitro con monómeros Análisis de proliferación con células TF-1 por incorporación de BrdU Se lavan células TF-1 en fase de crecimiento logarítmico (~2 x 105 - 1 x 106 células/ml; medio RPMl; suero bovino fetal 20%; suplementado con penicilina, estreptomicina, L-Glutamina; 0.5 ng/ml de interleucina 3) (se centrifuga durante 5 minutos a 1500 rpm y se suspende en RPMl completo sin IL-3 a 500,000 células/ml) y se precultiva antes del inicio del análisis durante 24 horas sin IL-3. Al día siguiente las células se siembran en placas de 24 ó 96 pozos, habitualmente utilizando por lo menos 6 concentraciones y 4 pozos por concentración que contienen por lo menos 10,000 células/pozo, por agente que se va a probar. Cada experimento incluye controles que comprenden EPO recombinante como un agente de control positivo y pozos sin adición de citocina somo agente de control negativo. Los péptidos y los controles de EPO se prediluyen en medio hasta las concentraciones deseadas y se agregan a las células, iniciando un período de cultivo de 3 días bajo condiciones de cultivo estándar (37°C, dióxido de carbono 5% en la fase gaseosa, atmósfera saturada con agua) . Las concentraciones siempre se refieren a la concentración final del agente en el pozo durante este período de cultivo de 3 días . Al final de este período de cultivo se agrega FdU hasta una concentración final de 8 mg/ml de medio de cultivo y el cultivo continúa durante 6 horas. Después se agregan BrdU (bromodesoxiuridina) y dCd (2-desoxicitidina) a sus concentraciones finales (10 ng/ml de BrdU; 8 ng/ml de dCD; concentraciones finales en medio de cultivo) y el cultivo continúa durante 2 horas adicionales. Al final de este período de incubación y cultivo se lavan las células una vez en solución salina amortiguada con fosfato que contiene BSA 1.5% y se resuspenden en un líquido en una cantidad mínima. A partir de esta suspensión, las células se agregan a gotas en etanol 70% a -20 °C. A partir de aquí, las células se incuban durante 10 min en hielo y después se analizan directamente o se pueden almacenar a 4°C antes del análisis. Previo al análisis las células se sedimentan por centrifugación, el sobrenadante se desecha y las células se resuspenden en una cantidad mínima de un fluido remanente. Las células después se suspenden e incuban durante 10 minutos en 0.5 ml de HCl 2M/Triton X-100 0.5%. Después se sedimentan nuevamente y se resuspenden en una cantidad mínima de fluido remanente, el cual se diluye con 0.5 ml de Na2B407, 0.1N, pH 8.5 antes de volver a sedimentar de inmediato las células. Finalmente, las células se resuspenden en 40 1 de solución salina amortiguada con fosfato (BSA 1.5%) y se divide en dos tubos de reacción que contiene 20 1 de suspensión celular cada uno. Se agregan a un tubo 2 1 de anti-BrdU-FITC (DAKO, clon Bu20a) y se agregan 2 1 de control mlGgl-FITC (Sigma) al segundo tubo comenzando un período de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 0.4 ml de solución salina amortiguada con fosfato y 10 g/ml de yoduro de propidio (concentración final) . El análisis en el citómetro de flujo se refiere a la fracción de células 4C o células con una mayor ploidía y con la fracción de células BrdU positivas y de esta manera se determina la fracción de las células en las etapas relevantes del ciclo celular. Análisis de proliferación con células TF-1 por MTT Las célula TF-1 en fase de crecimiento (~2 x 105 - 1 x 106 células/ml; medio RPMl; suero bovino fetal 20%; suplementado con penicilina, estreptomicina, L-Glutamina; 0.5 ng/ml de interleucina 3) se lavan (centrifugación durante 5 min, 1500 rpm y se resuspende en RPMl completo sin IL-3 a 500,000 células/ml) y se precultiva antes del inicio del análisis durante 24 horas sin IL-3. Al día siguiente las células se siembran en placas de 24 ó 96 pozos habitualmente utilizando por lo menos 6 concentraciones de 4 pozos por concentración que contiene por lo menos 10,000 células/pozo por agente que se va a probar. Cada experimento incluye controles que comprenden EPO recombinante como un agente de control positivo y pozos sin adición de citocina, un agente de control negativo. Los péptidos y los controles de EPO se prediluyen en medio a las concentraciones deseadas y se agregan a las células, comenzando un período de cultivo de 3 días después de condiciones de cultivo estándar (37 °C, dióxido de carbono 5% en fase gaseosa, atmósfera saturada con agua) . Las concentraciones siempre se refieren a la concentración final del agente en el pozo durante este período de cultivo de 4 días . En el día 4, antes del inicio del análisis se prepara una serie de dilución de un número conocido de células TF-1 en varios pozos (0/2500/5000/10000/20000/50000 células/pozo en 100 1 de medio) . Estos pozos se tratan de la misma manera que los pozos de prueba y posteriormente se proporciona una curva de calibración a partir de la cual se pueden determinar los números de células. Habiendo establecido estos pozos de referencia, se recalientan en un baño maría a 37 °C MTS y PMS del equipo de proliferación MTT (Promega, análisis de proliferación de células no radioactivo acuoso CellTiter 96) y se agregan 100 1 de solución PMS a 2 ml de solución MTS. 20 1 de esta mezcla se agrega cada pozo de las placas de análisis y se incuban a 37°C durante 3-4 horas. Se agregan a cada pozo 25 µl de dodeciisulfato de sodio 10% en agua antes de la medición de E492 en un lector ELISA. Utilizando evaluaciones gráficas como se muestran en las figuras 17 y 18 en base en los cálculos de la relación dosis-respuesta utilizando el programa GraphPad, se determinaron los siguientes valores CE50 en base en los datos de análisis MTT: La siguiente Tabla muestra los valores CE50 de algunos monómeros peptídicos ejemplares: SECUENCIA DE GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG 3284 nmol/l IDENTIFICACIÓN NÚMERO 2: SECUENCIA DE GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG 4657 nmol/1 IDENTIFICACIÓN NÚMERO 4 : SECUENCIA DE GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG 5158 nmol/l IDENTIFICACIÓN NÚMERO 5: SECUENCIA DE GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG 4969 nmol/1 IDENTIFICACIÓN NÚMERO 6: SECUENCIA DE GGTYSCHF - (Ais) - LTWVCKPQGG 5264 nmol/1 IDENTIFICACIÓN NÚMERO 7: SECUENCIA DE GGTYSCHF - (Ais) - LTWVCKKQGG 4996 nmol/1 IDENTIFICACIÓN NÚMERO 8: GGTYSCHFGPLTWVCKKQGG 2518 nmol/1 GGTYSCHFAKLTWVCKKQGG 5045 nmol/1 GGTYSCHFGGLTWVCKPQGG sin actividad detectable Las figuras 17 y 18 muestran curvas dosis-respuesta de péptidos miméticos de eritropoyetina determinadas a partir de datos sin tratar que se obtienen por análisis descritos en el ejemplo 3b y curvas ajustadas con programa GraphPad Prism versión 4.

IV. Síntesis de unidades peptídicas miméticas de EPO bivalente Síntesis automatizada de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11 lineal (AGEM11) La síntesis se lleva a cabo mediante el uso del sistema de microondas Liberty (CEM) utilizando resina de amida Rink (tasa de sustitución de 0.19 mmoles/g) en una escala de 0.25 mmoles. La separación de los grupos Fmoc se obtiene por tratamiento doble con 10 ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 50W durante 10 x 10 segundos. El acoplamiento de aminoácidos se obtiene por tratamiento doble con un exceso de 4 veces de aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivo de acoplamiento e irradiación con 50W durante 5 x 30 segundos. Entre todos los ciclos de irradiación la solución es enfriada al burbujear nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Después de desprotección y acoplamiento, se lava la solución a 6 veces con 10 ml de DMF. Después del ciclo de acoplamiento doble todos los grupos amino que no han reaccionado se bloquean por tratamiento con un exceso de 10 veces de N-(2-clorobenciloxicarboniloxi) succinimida (solución OAM en DMF) e irradiación con 50W de 3 x 30 segundos. Después de desprotección del último aminoácido el péptido se acetila por incubación con 0.793 ml de una solución de remate (4.73 ml de anhídrido acético y 8.73 ml de DIEA en 100 ml de DMSO) durante 5 minutos. Antes de la separación la resina después se lava con 6 veces con 10 ml de DMF y 6 veces con 10 ml de DCM. La separación de los péptidos crudos se obtiene por tratamiento con 5 ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución se filtra en 40 ml de éter frío, el precipitado se disuelve en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 10 µm, 250 x 4.6 mm) . El esquema de purificación de AGEM11 lineal, Kromasil 100 C18 10 µm, 250 x 4.6 mm y el gradiente utilizado por lo tanto se muestra en la figura 8 y 9 de 5% a 50% de acetonitrilo (TFA 0.1%) en 50 minutos. Formación de ciclos a partir de AGEMll lineal ? 1 i 1 AC - GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG — GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-CONH, mg del péptido lineal se disuelven en 60 ml de solución A . Esta solución y 60 ml de DMSO se agregan a gotas a 60 ml de solución A ( tiempo total para adición : 3 h) . Después de 48 horas los solventes se separan por evaporación y el residuo remanente disuelto en 30 ml de DMSO/agua (1/1) . Se agregan 30 ml de ácido acético y 17 mg de yodo (disuelto en DMSO/agua (1 / 1) y la solución se mezcla durante 90 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se agregan 20 mg de ácido ascórbico y los solventes se separan por evaporación. La mezcla sin tratar se disuelve en acetonitrilo/agua (2/1) y el péptido se purifica por RP-CLAP (Kromasil 100 C18, 10 µm, 250 x 4.6 mm) . Solución A: Acetonitrilo/agua (1/1) que contiene TFA 0.1%. Se ajusta el pH a 8.0 por la adición de bicarbonato de amonio. Los parámetros de purificación para AGEM11 cíclico se proporcionan en las figuras 10 y 11 (esquema: Purificación de AGEM11 cíclico, Kromasil 100 C18 10 µm 250 x 4.6 mm, gradiente de 5% a 35% de acetonitrilo (TFA 0.1%) en 50 minutos.

V. Análisis de proliferación in vitro para determinar actividad de EPO Se realiza un conteo de células TF1 en fase de crecimiento logarítmico (2 x. 105 - 1 x 106 células/ml que crecen en RPMl con suero bovino fetal (FCS) 20% y 0.5 ng/ml IL-3) y se centrifugan (5 min, 1500 rpm) el número de células necesarias para realizar un análisis y se resuspenden en RPMl con FCS 5% sin IL-3 a 300,000 células/ml. Las células se precultivan en este medio (con baja cantidad de nutrientes) sin IL-3 durante 48 horas. Antes de iniciar el análisis las células se cuentan de nuevo. Poco antes de comenzar el análisis se preparan soluciones concentradas de péptidos y EPO. Los péptidos se pesan y disuelven en RPMl con FCS 5% hasta una concentración de 1 mM, 467 µM o 200 µM. Las soluciones concentradas de EPO son de 10 nM o 20 nM. Se pipetean 292 µl de estas soluciones concentradas en un pozo de una placa de cultivo de 96 pozos - una placa se toma para cada sustancia que se va a probar. Se pipetean 200 µl de RPMl con FCS 5% en otros 17 pozos en cada placa. Se pipetean 92 µl de solución concentrada en un pozo que contiene 200 µl de medio. Los contenidos se mezclan y 92 µl de este pozo se transfiere al siguiente, y así sucesivamente. De esta manera se prepara una serie de diluciones (18 diluciones) de cada sustancia de manera tal que cada pozo consecutivo tiene la concentración de l:Vl0 de la concentración en el pozo anterior. A partir de cada pozo se transfieren 3 x 50 µl a tres pozos vacíos. De esta manera la concentración de sustancia se mide por cuadruplicado. Nótese que la línea más superior y más inferior de los pozos de cada placa permanece vacía. Las células pretratadas (en ayuno) se centrifugan (5 min, 1,500 rpm) y se resuspenden en RPMl con FCS 5% a una concentración de 200,000 células por ml . Se agregan a cada pozo 50 µl de suspensión celular (que contiene 10,000 células) nótese que debido a la adición de las células, las concentraciones finales de las sustancias en los pozos son las de la mitad del intervalo de dilución original. Las placas se incuban durante 72 horas a 37 °C en C02 5%. Antes de iniciar la evaluación se prepara un intervalo de dilución de cantidades conocidas de células TF-1: 0/2500/5000/10000/20000/50000 células/por pozo se pipetean por cuadruplicado (en 100 µm de RPMl + FCS 5%). Para medir el número de células vivas por pozo, se recalienta en un baño maría a 37 °C el reactivo MTT listo para usarse (Promega, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay) . Por cada pozo se agregan 20 µl de reactivo MTT y las placas se incuban a 37 °C en C02 5% durante otra 1-2 h. Se agregan 25 µl de una solución SDS 10% y se miden las placas en un lector ELISA (Genios, Tecan) . Los datos se procesan en una hoja de datos (Excel) y se grafican en Graphpad.

Los datos se resumen en la figura 12.

DE50 (nM) EPO 0.0158 BB49 (monómero, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2) 4113 AGEM11 (bivalente) 36.73 I Análisis de péptidos extendidos En un análisis extendido, se prueban aproximadamente 200 secuencias peptídicas para determinar su actividad mimética EPO. Los péptidos se sintetizan como péptidos de amidas en un sistema sintetizador LIPS-Vario. La síntesis se realiza en placas de síntesis MTP especiales, la escala es de 2 µmoles por péptido. La síntesis sigue el protocolo Fmoc-estándar utilizando HOBT como reactivo activador. Las etapas de acoplamiento se realizan como acoplamientos 4 veces. Cada etapa de acoplamiento requiere 25 minutos y exceso de aminoácidos por etapa es de 2.8. La separación y desprotección de los péptidos se realiza con una solución de separación que contiene TFA 90%, TIPS 5%, H20 2.5% y DDT 2.5%. La placa de síntesis que contiene el péptido terminado unido a resina se almacena en la parte superior de una placa de 96 pozos profundos. Se agregan a cada pozo 50 µl de la solución de separación y la separación se realiza durante 10 min, este procedimiento se repite tres veces. El péptido separado se evalúa con 200 µl de solución de separación flujo por gravedad en una placa de pozo profundo. La desprotección de la función de la cadena lateral se realiza durante otras 2.5 h dentro de la placa de pozo profundo. Posteriormente el péptido se precipita con éter/hexano enfriado con hielo y se centrifuga. Los péptidos se separan o resuelven en solución acuosa neutra y la formación de ciclos de incuba durante la noche a 4°C. Los péptidos se liofilizan. La figura 19 proporciona una vista general de los monómeros peptídicos sintetizados y probados. Los péptidos se prueban para determinar su actividad mimética de EPO en un análisis de proliferación in vitro. El análisis se realiza como se describe en el inciso V. En cada día de análisis se preparan placas de 40 microlitros al medir la actividad in vitro de 38 péptidos de prueba, un ejemplo de referencia y EPO en paralelo. Las soluciones concentradas de EPO son de 20 nM. Los resultados se proporcionan en la figura 19.

Como se puede ver de los resultados, los péptidos que se prueban no satisfacen el consenso de la presente invención y no muestran actividad miméti?a de EPO.

VII. Sintesis de conjugados de péptido y HES utilizando oxidación con peryodato En la figura 21 se muestra el esquema de reacción principal . El objetivo del método que se describe es la producción de un derivado de un almidón de acuerdo con este ejemplo HES, el cual reacciona selectivamente con grupos tiol bajo condiciones de reacción acuosas ligeras.

Esta selectividad se alcanza con grupos maleimida. HES se funcionaliza primero con grupos amino y posteriormente se convierte el derivado maleimida respectivo. Los lotes de reacción se libera de los reactivos moleculares bajos vía membranas de ultrafiltración. El producto, los productos intermedios así como los eductos son todos polidispersos .

Sintesis de HES modificado Se obtiene hidroxietilalmidón (VoluvenMR 130/0,4 o Serumwerk Bernburg 200/0.5) vía diafiltración y congelamiento subsecuente. El peso molar promedio es de aproximadamente 130 kDa con un grado molar de sustitución de 0.4, respectivamente 200 kD, EM = 0.5. La síntesis se realiza de acuerdo con la síntesis descrita para aminodextrano en la disertación de Jacob Piehler, "Modifizierung von Oberflachen für die thermodynamische und kinetische Charakterisierung biomolekularer Erkennung mit optischen Transducern", 1977, incorporado en la presente como referencia. Se activa HES por oxidación selectiva parcial de los grupos hidroxilodiólicos a grupos aldehido con peryodato de sodio como se describe en Floor et, al (1989) . Los grupos aldehido se convierten vía aminación reductiva con cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) en presencia de amoníaco a grupos amino (Yalpani and Brooks, 1995) . 1.1 Oxidación de alcoholes primarios a aldehidos a) Oxidación/apertura por peryodato Mediante una oxidación ligera de los 1,2-dioles en el sacárido por peryodato de sodio en agua se introducen grupos aldehido. Mediante la utilización de una concentración molar diferente del agente oxidante se puede controlar el número de grupos de ancla disponibles y de esta manera la cantidad de medicamento peptídico en el portador. Para optimizar el protocolo se monitorea la oxidación con un reactivo de Purpald que forma un aducto púrpura únicamente con aldehidos. El tiempo de reacción se puede reducir a 8-18 h. La cantidad utilizada de peryodato representa 20% del número de bloques de construcción glucosa (aplicando una masa de bloque de construcción de glucosa de 180 g/mol, DS = 0.4). El trabajado se realiza por ultrafiltración y liofilización. La purificación de cada producto polimérico se realiza por técnicas de ultrafiltración utilizando una membrana PES de límites de peso molecular diferentes seguido por liofilización. A partir de los derivados de HES optimizados únicamente se utiliza un intervalo de masa molar mayor de 100 kDa.

Análisis de Aldehido Cualitativo/seraicuantitativo: Reacción de Purpald de los grupos aldehido disponibles. 1.2 Aminación reductiva a) Aminación reductiva con cloruro de amonio En la siguiente etapa los grupos aldehido introducidos se convierten en aminas por una aminación reductiva en una solución saturada de cloruro de amonio a un valor de pH ligeramente ácido con cianoborohidruro de sodio. Para optimizar el protocolo los grupos aldehido del material inicial son seguidos por el reactivo de Purpald y las aminas formadas con TNBS. Estos experimentos han demostrado que la formación de la imina intermedia está en un .equilibrio después del período inicial y el agente reductor agregado prefiere las iminas con respecto al aldehido. De esta manera podemos encontrar que la reacción óptima se realiza por diversa adición del agente reductor con un tiempo de reacción total de 24 h. Trabajado vía precipitación del producto o ultrafiltración.

Análisis de Amina Cualitativa: reacción de ninhidrina (prueba de Kaiser) Cuantitativa: con ácido 2,4,6-trinitrobenzolsulfónico (TNBS) en comparación con un aminodextrano . El grado de sustitución que se obtiene es de aproximadamente 2.8%. Esto resulta en una masa molar de un bloque de construcción que presenta un grupo amino de aproximadamente 6,400 g/mol.

Sintesis de maleimidopropionila inohidroxietilalmidón ("MalPA-HES") Después de que se introducen los grupos amino (existen varias estrategias diferentes, para los ejemplos véase lo anterior) , el grupo maleimida ancla se introduce con esteres de N-hidroxisuccinimida de ácido ?-maleimidoalquilo (o arilo) .

Síntesis La introducción final de los grupos maleimida en el HES se realizan con el éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 3-maleimidopropiónico (MalPA-OSu) . Cuando se utiliza un exceso (5 a 10 veces) en un amortiguador ligeramente ácido la conversión es cuantitativa (amortiguador fosfato 50 mM, pH 6 ó 7, DMF 20% durante la noche) . El producto ultrafiltrado y liofilizado se almacena a -18°C. Análisis Se verifica la reacción del grupo amino con ninhidrina y TNBS. El número de grupos maleimida introducidos se demuestra por reacción de glutation (GSH) y la detección de grupos tiol excesivos con el reactivo de Ellmans (DNTB) y vía espectroscopia de RMN A a 700 MHz. El grado de sustitución que se obtiene es de aproximadamente 2% y corresponde a 8500 g/mol por bloque de construcción de maleimida (180 g/mol masa de bloque de construcción de glucosa, EM = 0.4). La figura 22 muestra los espectros de RMN A (D20, 700 MHz) de un HES modificado con maleimida. La relación del protón de maleimida (6.8 ppm) respecto a C-H anomérico (4.8-5.6 ppm) proporciona un tamaño de bloque de construcción de aproximadamente 6900 g/mol (en comparación, la prueba GSH/DNTB proporciona 7,300 g/mol). El número de grupos maleimida y de esta manera el tamaño de bloque de construcción se puede medir por saturación con GSH y reacción con DNTB. .El color amarillo que se forma es significativo y se puede cuantificar con facilidad. Estos valores proporcionan tamaños de bloque de construcción confiables de entre 5,000 y 100,000 g/mol, dependiendo del material inicial utilizado, respectivamente la cantidad de peryodato en la etapa de oxidación. Este método ha sido validado por espectroscopia RMN 1H del producto. En la RMN, el contenido de grupos maleimida se puede cuantificar a partir de la relación de todas las señales C-H anoméricas y los protones de anillo maleimida.

Tabla 1: Ejemplo del tamaño de bloque de construcción virtual asequible del grupo ancla en la estructura principal HES vía la oxidación de peryodato.

Cantidad de peryodato Tamaños de bloque de construcción (1 etapa) ( _q) de maleimida (g/mol) 0.01-0.03 > 55,000 0.02-0.04 ~ 35,000-50,000 0.04-0.1 ~ 15,000-35,000 0.1-0.3 ~ 6,000-7,000 Conjugado de péptido-hidroxietilalmidón (Pep-AHES) Síntesis Se utiliza un péptido que contiene cisteína el cual tiene una parte N terminal libre (Pep-IA) o biotinada (Pep-IB) . Una mezcla 4:1 de Pep-IA/B se convierte durante la noche en un exceso (aproximadamente 6 equivalentes con MalPA-HES en amortiguador fosfato, 50 mM, pH 6.5/DMF 80:20; el trabajado se produce con ultrafiltración y liofilización .

Análisis Se determina la absorción UV a 280 nm y se determina el contenido remanente de grupos maleimida con GSH/DNTB. El rendimiento de péptido es casi cuantitativo. Casi no son detectables grupos maleimida libres. Para la conjugación del medicamento peptídico se utiliza un dominio de péptido. Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am (BB68 ) se utiliza para crear una unidad peptídica al introducir un grupo tiol libre (por ejemplo al introducir un residuo cisteína en la parte N-terminal) como en Ac-C (tBu) -GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT- Nal-VCKKQRG-A (AGEM40) un exceso 10-50% del péptido desprotegido se conjuga . en un amortiguador ligeramente ácido durante 1-2 horas. Las condiciones se han optimizado para asegurar, por una parte, que la estructura principal de HES, los grupos maleimida y los puentes disulfuro resultantes sean estables y, por otra parte, que se observa una conversión cuantitativa. Mediante la utilización de compuestos HES funcionalizados con maleimida diferentes, AplaGen puede sintetizar numerosos péptidos miméticos de EPO supravalentes, los cuales han demostrado un efecto supravalente in vitro. Algunos ejemplos se proporcionan a continuación.

Tabla 2: Conjugados de péptidos miméticos de EPO supravalentes de AGEM40 con diferente contenido peptídico.

Un análisis químico sencillo de los conjugados de péptido mimético de EPO supravalentes se realiza en dos etapas. En primer lugar el contenido del péptido se cuantifica por CLAP después de hidrólisis suave de la estructura principal de HES y en segundo lugar se mide la. cantidad de polisacárido por una prueba colorimétrica con fenol después de hidrólisis completa por ácido sulfúrico.

La figura 23 muestra un cromatograma de CLAP (Shimadzu HPLC) de la hidrólisis den TFA-agua de los conjugados de péptido mimético de EPO supravalentes AGEM40-AHES A2. Después de cierto tiempo la absorbancia por UV de todas las especies que contienen el péptido es constante a un valor máximo y por comparación con un péptido libre se puede calcular el contenido de péptido de 37% (valor teórico: 39%) .

VIII. Experimentos in vitro adicionales En muchos de los experimentos descritos en lo siguiente ya han sido descritos en lo anterior. No obstante los siguientes detalles proporcionan una generalidad de resumen que describen las pruebas y los resultados. Se exponen de manera predominante los cultivos de células humanas y análisis para médula ósea. Por una parte, se utilizan análisis basados en línea celular rápida para verificar la potencia de las secuencias peptídicas optimizadas a través de las etapas tempranas de optimización. Estos análisis de cultivo celular aún son válidos como pruebas rápidas de eficacia de un péptido nuevo o un lote nuevo. Los dos criterios de valoración los cuales se utilizan para la línea de células TF-1 (células humanas) son proliferación (aquí determinado virtualmente como el número de células vivas en puntos de tiempo definidos) y la diferenciación como producción de hemoglobina marcada en células de TF-1. Además, se utilizan células primarias (células pluripotenciales de médula ósea humana) para los análisis de CFU, los cuales son muy cercanos a la situación in vivo . Estos proporcionan preguntas a la actividad eritropoyética en caso del uso de péptidos miméticos de EPO como unidades peptídicas de una manera mucho más similar a in vivo . No obstante, deben de manejarse de manera más sofisticada y necesitan más tiempo para análisis que los análisis de cultivo celular.

Análisis utilizando células TF-1 humanas TF-1 es una línea de células de eritroleucemia humana que proliferan únicamente en respuesta a ciertas citocinas tales como IL-3 o EPO. Además, las células TF-1 se pueden diferenciar hacia un fenotipo eritroide en respuesta a EPO. Las células TF-1 se obtienen de DSMZ (Braunschweig, Alemania) . Está disponible una hoja de producto en el sitio de la red de DSMZ dsmz.de. TF-1 es la línea de células recomendada para determinación de actividad de EPO por la European Pharmacopoea . Nuestro protocolo de cultivo interno para cultivo de mantenimiento: Medio: RPMI+p/S+AmphoB+L-Glut . +20%FCS+h-IL-3 1. -500 ml de RPMl + 5 ml de P/S + 5 ml de AmphoB 2. -200 ml de RPMl + PS/AmphoB + 2.5 ml de L-Glutamina + 50 ml de FCS = medio completo (1 mes, 4°C) 3. -45 ml de medio completo + 22.5 µl de h-IL-3 (1 semana, 4°C) Cultivo: Se mantienen entre 200.000 y 1.000.000 de células/ml para 3 días 2 x 105/ml • Para 2 días, 3 x 105/ml • Para 1 día, 5 x 105/ml Diseño de un análisis de proliferación de TF-1 En un análisis de proliferación de TF-1, se siembran células TF-1 y se cultivan durante varios días en concentraciones variables de EPO o péptidos miméticos de EPO en una placa de pozos múltiples. Para resultados óptimos las células TF-1 se deben cultivar durante 2 días en ausencia de citocina alguna (supresión de nutrientes) antes de iniciar el análisis. Tres días después de iniciar el análisis la proliferación celular se mide indirectamente al determinar el número de células viables. Se agrega el reactivo de tetrazolio, denominado MTS el cual se reduce a formazan coloreado. Esta reacción depende de NADH y NADPH, en otras palabras depende de la actividad mitocondrial. Se mide espectrofoto étricamente la cantidad de formazano utilizando un intervalo de número de células conocido para calibración, es posible determinar el número absoluto de células viables presentes bajo cada condición. El diseño principal también se ilustra en la figura 24. La actividad de cierto agente en este análisis se determina al: 1. Determinar si este agente provoca un incremento en el número de células viables a cierta concentración, y 2. A la concentración en la que este agente ejerce un efecto semimáximo (determinación de la CE50.

Resultados de los análisis de proliferación de TF-1 Como una marca general, necesita mencionarse que todos los péptidos miméticos de EPO (EMP1 y los péptidos modificados de prolina descritos en lo anterior) se comportan en este análisis como agonistas parciales, es decir, la respuesta máxima es más débil que la respuesta observada en EPO. No obstante,, el análisis se puede utilizar para determinar el desplazamiento de derecha/izquierda en gráficas normalizadas y por lo tanto determinar el resultado de las optimizaciones . La primera gráfica muestra este efecto en respuesta absoluta sin normalización. Todas las demás gráficas muestran diagramas normalizados, los cuales permiten la determinación de los valores de CE50 a partir de las curvas . En los análisis se utilizan dos sustancias de referencia : 1) EMP1 , una secuencia peptídica publicada con propiedades miméticas de EPO conocidas (Johnson et al, 1997) . 2) La eri tropoyetina humana recombinan te (EPO) , se coloca en la farmacia como un producto Ortho Biotech Epoetin alfa (nombre comercial en Alemania: ErypoMR) . Las gráficas de esta sustancia se proporcionan en líneas negras, continuas para EPO y discontinua para EMP1 . Los péptidos miméticos de EPO modificados con prolina se muestran en las siguientes figuras como líneas continuas de color. Estos péptidos modificados muestran la siguiente secuencia. 1) BB49 Ac-GGYSCHFGKLTWVCKKQGG muestra una eficacia y potencia del mismo intervalo que EMP1 2) BB68 Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am es incluso más eficaz que EMP1 y BB49 3) AGEM40, Ac-C (tBu) -GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am el cual es un péptido continuo bivalente, el cual se diseña en base en la secuencia de BB68 que muestra características mejoradas. 4) AGEM40_HES, el cual es un péptido avanzado, altamente eficaz y potente (AGEM40) HESilado de acuerdo con el principio de supravalencia de la presente invención. Estas secuencias se utilizan como ejemplos por ejemplo con el fin de ilustrar los beneficios de un principio de supravalencia. La figura 25 describe los resultados de los péptidos miméticos de EPO monoméricos en comparación con EPO. La figura 25 incluye una gráfica de los datos de absorbancia reales que documentan la diferencia absoluta entre los péptidos en general y EPO en este análisis. La figura 26 proporciona los valores CE50 calculados a partir de las gráficas normalizadas ajustadas. La figura 27 muestra el efecto mejorado de BB68 en comparación con BB49. Utilizando BB68 optimizado como un bloque de construcción para crear una unidad peptídica de acuerdo con la presente invención, el efecto se mejora por dos órdenes de magnitud adicionales. Esto se documenta en la figura 27 y la tabla correspondiente que se muestra en la figura 28. Las unidades peptídicas diméricas después se acoplan al portador macromolecular HES a una densidad optimizada. El API resultante es por lo menos equipotente a EPO en una comparación molar y muy cercano a EPO en una comparación en masa (véase la figura 29 y la figura 30 abajo) . La figura 30 y las figuras y tablas anteriores demuestran claramente la gran potencia del concepto de supravalencia. Al mantener la precisión en mente, la cual se puede obtener con un análisis de cultivo celular, el API que se obtiene es por lo menos equipotente a EPO in vi tro . Por lo tanto es superior a cualquier API de péptido mimético EPO conocido que no utilice el concepto de suprevalencia .

Análisis en médula ósea La médula ósea contiene células hematopoyéticas con un potencial para autorrenovarse y para desarrollarse en todo tipo de células sanguíneas. Además, la médula ósea contiene células progenitoras comprometidas capaces de desarrollarse en una o en varias líneas de células sanguíneas. Entre estas células progenitoras, algunas se desarrollan a eritrocitos (progenitores eritroide) . Se puede demostrar las células progenitoras al sembrar en placa células de médula ósea en medio semisólido basado en metilcelulosa. En presencia de una mezcla apropiada de citocina las células progenitoras proliferan y se diferencian para proporcionar una colonia de células de cierto linaje. Los progenitores mieloides se desarrollan en colonias granulocíticas (derivadas de una CFU-G) , colonias monocíticas (derivadas de un CFU-M) o colonias mixtas granulocíticas-monocíticas (de un CFU-GM) . Los progenitores eritroides se desarrollan en una colonia de eritrocitos (glóbulos rojos) dependiendo del tamaño de la colonia eritroide, las células progenitoras se denominan BFU-E (que proporciona colonias de 200 células o mayores) , CFU-E (que proporciona colonias de menos de 200 células) . Las células progenitoras en una etapa anterior de relación se pueden desarrollar en colonias mixtas de granulocito-eritroide-monocito-megacariocito. Estos progenitores iniciales se denominan CFU-GEMM. EPO estimula el desarrollo de colonias eritroides a partir de BFU-E o CFU-E, si ciertas citocinas diferentes están presentes también. Sin EPO no se pueden desarrollar colonias eritroides. El resultado de las colonias eritroides a partir de un lote homogéneo de células de médula ósea en metilcelulosa, por lo tanto, es una medida de la actividad de EPO. Dado que los procedimientos mencionados antes son muy similares si no idénticos al procedimiento el cual se presenta en la médula ósea in vivo, son un excelente medio de predicción de la actividad similar a EPO.

Diseño de Análisis de Médula Osea Se recalientan frascos criogénicos células de médula ósea humana (disponibles comercialmente de Cryosystems, verificadas serológicamente) y se siembran en placa en medio de metilcelulosa con un fondo dado de citocinas (pero sin EPO) a una densidad de célula fija. La EPO o el péptido mimético de EPO se agregan en concentraciones variables. Los cultivos se incuban durante 12-14 días a 37°C. Después los números de colonias mieloides y eritroides se enumeran por instrucción microscópica.

Criterios de Valoración para Análisis de Médula Osea: 1. Premisas: el cultivo sin EPO únicamente puede proporcionar colonias mieloides (blancas) pero no eritroides (rojas). Los cultivos con EPO deben proporcionar un incremento que depende de la concentración en las colonias de eritrocitos y un incremento, que depende de la concentración, en los tamaños de las colonias de eritrocitos. 2. Un péptido muestra actividad mimética de EPO sin provoca un incremento dependiente de la concentración en colonias de eritrocitos y un incremento dependiente de la concentración en los tamaños de colonias de eritrocitos. No obstante, un péptido no debe interferir con los números de colonias mieloides que se obtienen.

Resultados de los Análisis de Médula Osea Los péptidos miméticos de EPO modificados con prolina que se describen en lo anterior no estimulan la formación de colonias mieloides sino que muestran actividad significativa en la formación de colonias rojas. Cualitativamente, esto se muestra en la figura 31 en una fotografía de una placa de cultivo mientras se documenta en la figura 32 el conteo de colonias.

Referencias Wrighton NC, Balasubramanian P, Barbone FP, Kashyap AK, Farrel FX, Jolliffe L, Barret RW, Dower WJ (1997) Increased potency of an erythropoietin peptide mimetic through covalente dimerization. Nature Biotechnology 15:1261-1265 Wrighton NC, Farrel FX, Chang R, Kashyap SK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barret RW, Jolliffe LK, Dower WJ (1996) Small Peptides as Potent Mimetics of the Protein Hormone Erythropoietin. Science 273:458-463 Johnson, D. L., F. X. Farrell, et al. (1997). "Amino-terminal dimerization of an erythropoietin mimetic peptide results in increased erythropotietic activity." Chemistry and Biology 4: 939-950.

Haag R, Sunder A, Stumbé JF, J. Am. Chem. Soc. (2000), 122, 2954.

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Zalipsky S, Qazen, S, Walker II JA; Mullah N, Quinn YP, (1999) "New detachable poly (ethylene glycol) conjugates: Cysteine-cleavable lipopolymers regenerating natural phospholipid, diacyl phosphatidylethanolamine, Bioconjug. Chem. 10; 7Q3-707.

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Claims (32)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto que se une a una molécula objetivo, que comprende: (1) por lo menos dos unidades peptídicas en donde cada unidad peptídica comprende por lo menos dos dominios con una capacidad de unión a un objetivo; (ii) por lo menos una unidad portadora polimérica; en donde las unidades peptídicas están unidas a la unidad portadora polimérica.

2. Compuesto como se describe en la reivindicación 1, en donde la molécula objetivo es una molécula receptora, preferiblemente un receptor transmembranal .

3. Compuesto como se describe en la reivindicación 2, en donde las unidades peptídicas se unen al receptor y actúan ya sea como antagonistas del receptor o como agonistas del receptor.

4. Compuesto como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la unidad peptídica tiene una longitud de aproximadamente 200 aminoácidos o menos, de aproximadamente 150 aminoácidos o menos, de aproximadamente 100 aminoácidos o menos o de aproximadamente 50 aminoácidos o menos .

5. Compuesto como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la unidad portadora polimérica transporta aproximadamente 50 unidades peptídicas o menos, 25 unidades peptídias o menos, 15 unidades peptídicas o menos, 10 unidades peptídicas o menos y preferiblemente entre 2 y 6 unidades peptídicas.

6. Compuesto como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la unidad portadora es o comprende por lo menos un polímero natural o sintético, ramificado, dendrítico o lineal y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de poliglicerinas, ácido polisialínico, dextranos, polisacáridos, almidones o polietilenglicol a partir de otros polímeros hidrosolubles biológicamente inertes.

7. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 1 a 6, en donde dicha unidad portadora polimérica comprende una unidad de ramificación, la unidad de ramificación preferiblemente comprende glicerol o poliglicerol.

8. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 1 a 7, en donde la molécula portadora tiene un peso molecular de por lo menos 5 kD, preferiblemente de 20 a 200 o 4,000 kD y de 20 a 80 kD en caso de que se utilicen portadores más pequeños tales como polietilenglicol.

9. Compuesto como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 8, en donde la unidad portadora está constituida de por lo menos dos subunidades poliméricas, en donde las subunidades poliméricas se conectan vía al menos una estructura en enlazante covalente biodegradable .

10. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes, que comprende una primera unidad portadora biodegradable, en donde las unidades peptídicas y las segundas unidades portadoras poliméricas están unidas a la primera unidad portadora polimérica.

11. Compuesto como se describe en la reivindicación 10, en donde la segunda unidad portadora tiene un peso molecular menor que la primera unidad portadora y en donde aproximadamente 20 a 50% de los sitios de unión de la primera unidad portadora la cual preferiblemente es HES están ocupados con las segundas unidades portadoras las cuales preferiblemente son PEG de un peso molecular de aproximadamente 3 a 10 kD.

12. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde se utiliza una unidad portadora polimérica modificada.

13. Compuesto como se describe en la reivindicación 12, en donde la unidad peptídica está unida vía un enlace covalente a la unidad portadora polimérica y la unión se produce vía un aminoácido reactivo, un grupo amino N terminal o ácido carboxílico C terminal de las unidades peptídicas, en donde el aminoácido reactivo preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina, y en donde en caso de que una unidad portadora polimérica no posea un grupo de acoplamiento reactivo, se utiliza una unidad de acoplamiento para modificar la unidad portadora polimérica, en donde a unidad de acoplamiento preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de grupos acilantes los cuales reaccionan con los grupos amino de la unidad peptídica, grupos alquilantes los cuales reaccionan con los grupos sulfidrilo (mercapto) , tiometilo, imidazo o amino en la unidad peptídica, de manera más preferible grupos maleimida, éster y grupos formadores de amida los cuales reaccionan con un grupo carboxilo de la proteína, grupos formadores de disulfuro los cuales reaccionan con los grupos sulfidrilo sobre la unidad peptídica tal como grupos 5, 5' -ditiobis (2-nitrobenzoato) , disulfuros de orto-piridilo y grupos alquilmercaptano, grupos dicarbonilo tales como grupos ciclohexanodiona y otros grupos 1,2-dicetona los cuales reaccionan con las porciones de guanidina de la unidad peptídica; grupos diazo los cuales reaccionan con grupos fenólicos sobre el péptido; grupos reactivos de la reacción de bromuro de cianógeno con la unidad portadora polimérica la cual reacciona con grupos amino sobre la unidad peptídica.

14. Compuesto como se describe en la reivindicación 13, en donde el aminoácido reactivo es cisteína y en donde el grupo de acoplamiento es maleimida.

15. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 1 a 14, en donde por lo menos una de las unidades peptídicas se une a un receptor homomérico, dimérico o multimérico, preferiblemente a un miembro de los receptores de citocina clase I, que incluye al receptor de eritropoyetina (EPOR) , receptor de trombopoyetina (TPOR) , receptor de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSFR) , receptor de hormona del crecimiento (GHR) y receptor de prolactina (PrR) .

16. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 1 a 14, en donde por lo menos una de las unidades peptídicas se une a un receptor heteromérico, dimérico o multimérico tal como un receptor de interleucina.

17. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 1 a 14, en donde las unidades peptídicas se unen y activan al receptor EPO y se seleccionan del grupo que consiste de péptidos miméticos de EPO.

18. Compuesto como se describe en la reivindicación 17, en donde por lo menos uno de las unidades peptídicas comprende un dominio de unión caracterizado por la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7X8X9X10X11X12X13X1.X15 en donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales o no naturales, y Xß es C, A, E, ácido a-amino-?-bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W o Y o S; Xe es M, F, I, homoserinmetiléter o norisoleucina; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina; o Xg y X10 están sustituidos por un aminoácido único; Xu se selecciona de cualquier aminoácido; X?2 es T o A; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; Xi4 es D, E, I, L o V; Xi5 es C, A, K, ácido a-amino-?-bromobutírico u homocisteína (hoc) con la condición de que cualquiera de Xß o X15 sea C o hoc.

19. Compuesto como se describe en la reivindicación 17, en donde por lo menos una de las unidades peptídicas comprende un dominio de unión caracterizado por la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X-7X8X9X10X11X12X13X14X15 en donde cada aminoácido está indica por una abreviatura estándar de una sola letra, y X6 es C; X7 es R, H, L o W; X8 es M, F o I; X9 es G o un cambio conservador de G; X10 es un cambio no conservador de prolina; Xn se selecciona independientemente de cualquier aminoácido; X?2 es T; X?3 es W; Xi4 es D, E, I, L o V; X?5 es C; . o en donde X9 y Xio están sustituidos por un aminoácido único.

20. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 1 a 19, en donde los dominios de unión (unidades de unión monoméricas) de las unidades peptídicas están conectadas internamente vía una estructura enlazante, preferiblemente un enlazante peptídico contiguo.

21. Compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones precedentes 17 a 20, en donde por lo menos una de las unidades peptídicas comprende un dominio de unión que se selecciona de los siguientes grupos de péptidos: GGTYSCHMGKLTXVCKKQGG GGTYTCHFGKLTXVCKKLGG GGLYSCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHMGKLTWVCRKQGG GGLYSCHFGKLTXVCQKQGG GGTYSCHFGKLTWVCQKQRG GGTYSCHFGKLTXVCKKQRG GGLYACHFGKLTWDCQKQGG GGTYTCHFGKLTUVCKKQGG GGTYSCHFGKLTUVCKKLGG GGTYSCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKLGG GGLYACHFGKLTUVCKKQGG GGLYSCHMGKLTWLCKKLGG GGTYSCRFGKLTWVCKKQGG GGTYTCHFGKITUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCKKQGG GGLYACHFGKLTULCKKQGG GGLYSCHFGKLTWVCKKQRG GGTYTCHFGKITXVCKKQGG GGTYTCHMGKLTWVCKKQRG GGLYSCHFGKLTXVCKKQRG GGTYTCHFGKLTXVCKKQGG GGLYSCHFGKITUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCRKQGG GGTYACHFGKLTXVCKKLGG GGLYACHFGKLTXVCRKQGG GGTYACHFGKLTXVCKKQGG GGLYSCHMGKLTXVCRKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKQRG GGLYSCHMGGKLTXVCKKQGG GGTYTCHMGKLTXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCRKQRG GGTYSCHFGKLTXVCKKQGG GGTYSCHFGKLTWVCKKQRG GGTYACHFGKLTWVCKKQRG GGLYSCHFGKLTWVCQKQRG GGTYTCHFGKLTXVCKKQRG GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG GGTYSCHF- (Ais) -LTWVCKPQGG GGTYSCHF- (Ais) -LTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal- VCKKQRG en donde X es 1-naftilalanina y U es 2-naftalina y en donde el ácido 5-aminolevulínico (Ais) es: 5-Als

22. Uso de un compuesto como se describe por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 21 para la preparación de una composición farmacéutica.

23. Uso de un compuesto como se describe por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 21 que tiene una unidad peptídica que se une y que activa el receptor EPO para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de un trastorno que está caracterizado por una deficiencia de eritropoyetina o una población baja o defectuosa de eritrocitos y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia y apoplejía.

24. Uso de un compuesto como se describe por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 21 que presenta una unidad peptídica que se une y que activa el receptor TPO para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de un trastorno que está caracterizado por una deficiencia de trombopoyetina y especialmente para el tratamiento de trastornos hematológicos que incluyen trombocitopenia, granulocitopenia y anemia.

25. Composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 21 y opcionalmente un portador farmacéutico aceptable.

26. Método para producir un compuesto como se describe en por lo menos una de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende: (i) generar por lo menos dos unidades peptídicas en donde cada unidad peptídica comprende por lo menos dos dominios con una capacidad de unión a un receptor; (ii) genera por lo menos una unidad portadora polimérica; (iii) unir las unidades peptídicas a la unidad portadora polimérica.

27. Método como se describe en la reivindicación 26, en donde las unidades peptídicas son sintetizadas como una cadena peptídica continua.

28. Método como se describe en la reivindicación 26 ó 27, en donde la unidad portadora polimérica se utiliza la cual tiene por lo menos un grupo químico en el mismo el cual es capaz de reaccionar con un grupo químico disponible en la unidad peptídica y después reaccionar junto con la unidad portadora polimérica reactiva y la unidad peptídica para formar un complejo unido covalentemente unido del mismo utilizando el grupo químico de la unidad portadora polimérica .

29. Método como se describe en la reivindicación 26 ó 28, en donde el portador polimérico es una molécula de almidón modificada, la cual se ha oxidado y en donde se ha introducido un grupo amino en una estructura principal de almidón y en donde el grupo amino está modificado con la introducción de un grupo enlazante, preferiblemente un grupo maleimida.

30. Método como se describe en la reivindicación 29, en donde la oxidación se lleva a cabo al poner en contacto la molécula de almidón con un reactivo que produce un ion oxoamonio en presencia de un agente oxidante o al poner en contacto el material inicial directamente con la especie reactiva, el ion oxoamonio.

31. Método como se describe en la reivindicación 30, en donde el agente oxidante es un agente oxidante químico tal como un hipoaluro tal como, por ejemplo, hipoclorito e hipobromito de sodio o peróxido de hidrógeno o una enzima oxidante.

32. Método como se describe en la reivindicación 30 ó 31, en donde el reactivo que produce el ion oxoamonio preferiblemente es un compuesto nitroxilo, de manera más preferible un compuesto diternitroxilo tal como 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO) o un derivado del mismo .