BRPI0709014A2 - moléculas modifcadas que promovem hematopoise - Google Patents

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BRPI0709014A2
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amino acid
peptide
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amino acids
amino
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BRPI0709014-5A
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Hans-Georg Frank
Udo Haberl
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Aplagen Gmbh
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Abstract

MOLéCULAS MODIFICADAS QUE PROMOVEM HEMATOPOIESE. A presente invenção refere-se aos peptídeos miméticos modificados de EPO que têm propriedades específicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULASMODIFICADAS QUE PROMOVEM HEMATOPOIESE".
A presente invenção refere-se aos peptídeos como moléculas deligação para o receptor de eritropoietina, métodos para a preparação destes,medicamentos que contêm estes peptídeos, e o seu uso em indicações se-lecionadas, preferivelmente para tratamento de várias formas de anemia eacidente vascular cerebral.
A eritropoietina de hormônio (EPO) é uma glicoproteína constitu-ída por meio de 165 aminoácidos e tendo quatro sítios de glicosilação. Asquatro cadeias laterais de carboidrato complexas compreendem 40 por cen-to do peso molecular total de cerca de 35 kD. EPO é formado nos rins e delá migra no baço e medula óssea, onde estimula a produção de eritrócitos.
Em doenças crônicas do rim, a produção de EPO reduzida resulta em ane-mia eritropênica. Com EPO recombinante, preparado por engenharia genéti-ca, as anemias podem ser tratadas efetivamente. EPO melhora a qualidadede vida de pacientes de diálise. Não somente anemia renal, porém tambémanemia em recém-nascidos prematuros, anemias associadas à inflamação etumor podem ser melhorados com EPO recombinante. Por meio de EPO,uma quimioterapia de dosagem elevada pode ser realizada mais prospera-mente em pacientes de tumor. Similarmente, EPO melhora a recuperação depacientes de câncer se administrado dentro do escopo da terapia de radiação.
No tratamento com EPO, um problema existe pelo fato de queos regimes de dosagem requeridos são com base em aplicações intraveno-sas ou subcutâneas freqüentes ou contínuas porque a proteína é decompos-ta relativamente rapidamente no corpo. Portanto, a evolução de moléculasderivadas de EPO recombinantes dirige-se seletivamente modificando a gli-coproteína, por exemplo, por glicosilação ou pegilação adicional para au-mentar a estabilidade e desse modo tempo de meia-vida biológico.
Outro assunto importante associado com o tratamento com EPOrecombinante é o perigo que os pacientes desenvolvam anticorpos paraEPO recombinante durante o tratamento. Isto é devido ao fato que o EPOrecombinante não é completamente idêntico ao EPO endógeno. Uma vezque a formação de anticorpo é induzida, pode induzir aos anticorpos quecomprometem a atividade de eritropoietina endógena também. Freqüente-mente aumenta a dosagem de EPO recombinante necessária para o trata-mento. Especialmente se tais anticorpos comprometem a atividade de EPOendógeno, este efeito pode ser interpretado como uma doença auto-imuneinduzida por tratamento. É especialmente indesejado, por exemplo, no casode pacientes de diálise que sofrem transplante renal após meses ou anos detratamento de EPO. Os anticorpos então podem comprometer a atividade deEPO endógeno produzido pelo transplante e desse modo comprometer aatividade eritropoiética do órgão transplantado. Atualmente, é uma questãoem aberto se as modificações introduzidas no EPO recombinante para au-mentar o tempo de meia-vida biológico, agravarão ou melhorarão este pro-blema. Geralmente, seria esperado que modificações extensas e tempo demeia-vida mais longo agravassem esta propriedade problemática.
Uma estratégia alternativa é a preparação de peptídeos sintéti-cos de aminoácidos que não compartilham homologia de seqüência ou rela-ção estrutural com eritropoietina. Foi mostrado que peptídeos, não relacio-nados com a seqüência de EPO, que são significantemente menores do quea eritropoietina podem agir como agonistas (Wrighton e outros, 1996). Osmesmos autores mostraram que tais peptídeos podem ser truncados paraainda ativar peptídeos mínimos com comprimento de 10 aminoácidos.
Os peptídeos sintéticos que imitam a atividade de EPO são oassunto de W096/40749 internacional depositada em aberto. Ela descrevepeptídeos miméticos de 10 a 40 aminoácidos de um consenso distinto prefe-rivelmente contendo duas prolinas na posição geralmente referida como 10 e17, uma das quais é considerada ser essencial. WO 01/38342 descreve queestas prolinas poderiam ser combinadas com naftilalanina.
Desse modo até hoje, todos os agonistas com base em peptídeopequeno do receptor de EPO tiveram uma estrutura que contém pelo menosuma prolina, freqüentemente dois resíduos de prolina em posições definidas,normalmente numerada como posição 10 e 17, com referência à sua posi-ção no peptídeo EMP1 mimético de eritropoietina muito ativo (W096/40749internacional depositada em aberto; Wrighton e outros, 1996, Johnson e ou-tros, 1997 e 1998):
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG
Estas prolinas são consideradas indispensáveis à efetividadedos peptídeos. Para o prolina na posição 17, isto foi substanciado através deinterações com o receptor, ao mesmo tempo em que a prolina na posição 10foi considerada ser necessária para a duplicação correta da molécula (videtambém Wrighton e outros 1996, 1997). A duplicação correta, suportada pe-Las propriedades estereoquímicas específicas da prolina, normalmente éuma pré-condição necessária da atividade biológica. Geralmente, prolina éum aminoácido de formação de estrutura que está freqüentemente envolvido- como neste caso - na formação de estruturas de grampo de cabelo e voltasbeta. Devido a esta propriedade, inter alia, é um ponto freqüente de ataquepara endopeptidases específicas de pós-prolina que destroem os peptí-deos/proteínas contendo prolina. Vários hormônios de peptídeo endógeno(angiotensinas I e II, urotensinas, tireoliberina, outras liberinas, etc.) são ina-tivados por tal clivagem pós-prolina de "golpe único". O tempo de meia-vidade peptídeos miméticos de EPO contendo prolina é desse modo encurtadopela atividade destas enzimas freqüentes e ativas.
Tais peptídeos curtos podem ser produzidos quimicamente enão precisam de produção recombinante, que é muito mais difícil de contro-lar e produzir produtos com qualidade e identidade definidas. A produçãoquímica de peptídeos de tal tamanho pequeno também pode ser competitivaem termos de custos de produção. Além disso, a produção química permiteintrodução definida de variações moleculares tal como glicosilação, pegila-ção ou qualquer outra modificação definida, que possa ter uma potência co-nhecida para aumentar a meia-vida biológica. Porém, até agora não houvenenhuma aprovação de qualquer terapia com peptídeos miméticos de EPOexistentes.
Além disso, há uma necessidade de realçar a eficácia miméticade EPO dos peptídeos miméticos de EPO para fornecer moléculas potentessuficientes para terapia.
Os peptídeos miméticos de EPO que descritos no estado datécnica podem ser considerados como domínios de ligação monoméricosque reconhecem o sítio de ligação do receptor de eritropoietina. Porém, co-mo foi mostrado por Wrighton e outros (Wrighton 1997), dois destes domí-nios de ligação geralmente são necessários para homodimerizar o receptorde EPO e induzir a transdução de sinal. Desse modo, uma combinação dedois destes peptídeos miméticos de EPO e conseqüentemente os domíniosde ligação de receptor de EPO em uma única molécula dimérica, realçarama atividade consideravelmente. Isto induz ao resultado que os peptídeos comum único domínio de ligação mostraram o mesmo padrão qualitativo de ati-vidade ao mesmo tempo em que dois dos domínios de ligação juntos mos-tram um ED50 muito mais baixo (Dose de Efeito 50%, uma medida de ativi-dade). A potência de peptídeos miméticos de EPO monomérico pode sermelhorada até 1000-vezes por dimerização. Até mesmo alguns peptídeosmonoméricos inativos podem ser convertidos em agonistas através de dime-rização. Os peptídeos que abrigam dois domínios de ligação são especifica-dos como sendo peptídeos bivalentes ou diméricos.
Várias técnicas são conhecidas para dimerizar os monômeros.Os monômeros podem ser dimerizados, por exemplo, através de ligaçãocovalente a um ligador. Um Iigador é uma molécula de união que cria umaligação covalente entre as unidades de polipeptídeo da presente invenção.
As unidades de polipeptídeo podem ser combinadas por um ligador de umtal modo que a ligação ao receptor de EPO seja melhorada (Johnson e ou-tros. 1997; Wrighton e outros 1997). Refere-se também a multimerização depeptídeos biotinilados monoméricos através de interação não-covalente comuma molécula portadora de proteína descrita por Wrighton e outros (Wrigh-ton, 1997). Também é possível usar um sistema de biotina/estreptavidina,isto é, biotinilação de terminal de C dos peptídeos e uma incubação subse-qüente dos peptídeos biotinilados estreptavidina. Alternativamente, é conhe-cido para obter dimerização formando uma estrutura de dicetopiperazina.
Este método conhecido pelo versado na técnica é descrito em detalhes, porexemplo, em Cavelier e outros (em: Peptides: The wave of the Future; Mi-chal Lebl and Richard A. Houghten (eds); American Peptide Society, 2001 ).Outro modo alternativo para obter dímeros de peptídeo conhecidos da técni-ca anterior é usar derivados de ácido dicarboxílico bifunctional ativado comoprecursores reativos das porções ligadoras posteriores, que reagem comgrupos aminos de terminal de N, desse modo formando o peptídeo dimérico(Johnson e outros, 1997). Os monômeros também podem ser dimerizadosatravés de ligação covalente a um ligador. Preferivelmente o ligador com-preende o NH-R-NH em que R é um alquileno inferior substituído com umgrupo funcional tal como o grupo carboxila ou grupo amino que permitem aligação à outra porção de molécula. O ligador poderia conter um resíduo delisina ou amida de lisina. Também PEG pode ser usado como um ligador. Oligador pode ser uma molécula contendo dois ácidos carboxílicos e opcio-nalmente substituídos em um ou mais átomos com um grupo funcional talcomo um amina capaz de ser ligada a uma ou mais moléculas de PEG. Umadescrição detalhada de possíveis etapas para oligomerização e dimerizaçãode peptídeos com uma porção de ligação também é determinada em WO2004/101606. Estratégias de dimerização alternativas para peptídeos mimé-ticos de EPO são apreciadas.
Além disso, deveria ser notado que EPO e peptídeos miméticosde EPO (monoméricos ou diméricos) não são somente interessantes parapropósitos terapêuticos humanos. Além de aplicações humanas há umagrande necessidade de substitutos de EPO no mercado de cuidado médicoanimal. Neste respeito é desejável fornecer peptídeos miméticos de EPOque mostram um padrão de atividade distintivo nos seres humanos e ani-mais para prevenir abuso. Isto é porém, uma tarefa desafiadora, uma vezque as seqüências de receptor de EPO animais diferentes (por exemplo ca-mundongo, rato, porco e cachorro) são bem parecida com o receptor deEPO humano. Quando alinhando os receptores de EPO de espécies diferen-tes fica claro que as espécies diferentes diferem em somente alguns amino-ácidos. Isto envolve uma homologia estrutural elevada. Além disso, somenteuma porcentagem pequena destes resíduos de aminoácido é relevante paraligação aos peptídeos miméticos de EPO. Isto agrava o desenvolvimento deum peptídeo mimético de EPO que descreve níveis diferentes de atividadenos receptores de EPO humanos e animais.
É um objetivo da presente invenção, fornecer peptídeos sintéti-cos alternativos que exibem pelo menos partes essenciais da atividade bio-lógica do EPO nativo e desse modo fornece meios alternativos para estraté-gias terapêuticas eficientes.
É um objetivo adicional da presente invenção, fornecer aos pep-tídeos miméticos de EPO uma eficácia melhorada.
É um objetivo adicional da presente invenção, fornecer dímerosde peptídeos miméticos de EPO através de estratégias de dimerização al-ternativas.
Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer peptí-deos miméticos de EPO que descrevem um padrão de atividade distinto noshumanos e animais.
As soluções para estes objetivos serão descritas em detalhesabaixo.
De acordo com uma primeira modalidade da invenção, é forne-cido um peptídeo, especialmente um sendo capaz de se ligar ao receptor deEPO, compreendendo a seguinte seqüência de consensos de aminoácidos:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e
Χβ é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido oc-amino-γ-bromobutírico;
X7 é R, H, L, W, Y ou S;
X8 é M, F, eu, homosserinametiléter ou norisoleucina;
Xg é G ou uma permuta conservadora de G;
X10 é um permuta não-conservadora de prolina;
ou X9 e X-I0 são substituídos por meio de um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;Xi2 é um aminoácido polar não-carregado ou A;
X13 é W, 1-nal, 2-nal, A ou F;
X14 é D, Ε, I1 Lou V;
X-I5 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A.
Também compreendido por esta modalidade são peptídeos se-lecionados do grupo que consiste em fragmentos funcionalmente equivalen-tes, derivados e variantes da seqüência de consenso de peptídeo acima,tendo atividade mimética de EPO e tendo um aminoácido na posição Xi0que constitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que X9 e Xi0são substituídos por um único aminoácido.
As seqüências de consenso de peptídeo descritas podem serpercebidas como domínios de ligação monoméricos para o receptor de EPO.Como os peptídeos miméticos de EPO eles são capazes de ligação ao re-ceptordeEPO.
O comprimento do peptídeo é preferivelmente entre dez a qua-renta ou cinqüenta ou sessenta aminoácidos. Em modalidades preferidas, oconsenso de peptídeo descreve um comprimento de pelo menos 10, 15, 18,20 ou 25 aminoácidos. De fato o consenso pode ser embutido e respectiva-mente ser compreendido por seqüências mais longas. Um comprimentomais longo também pode ser criado através de dimerização de duas unida-des de peptídeo monoméricas dos consensos anteriores (vide abaixo).
Foi muito surpreendente que os peptídeos de acordo com a in-venção exibissem atividades miméticas de EPO embora uma ou - de acordocom algumas modalidades - até mesmo ambas as prolinas dos peptídeosmiméticos de EPO conhecidos de acordo com Wrighton e Johnson sejamsubstituídas por outros aminoácidos naturais ou não-naturais. Na realidadeos peptídeos de acordo com a invenção têm uma atividade comparável ouaté melhor do que aquela dos peptídeos contendo prolina conhecidos. Po-rém, é notável que os aminoácidos que substituem resíduos de prolina nãorepresentam uma permuta conservadora, porém ao contrário uma permutanão-conservadora de prolina. Os exemplos adequados de tais permutasnão-conservadoras de prolina são aminoácidos positivamente ou negativa-mente carregados na posição 10.
Preferivelmente, um aminoácido positivamente carregado talcomo aminoácidos básicos tal como, por exemplo, os aminoácidos proteino-gênicos K, R e H e especialmente K, pode ser usado para substituição. Oaminoácido não-conservador usado para substituição da prolina na posição10 também pode ser um aminoácido não-proteinogênico natural ou um ami-noácido não-natural e é preferivelmente um com uma cadeia lateral positi-vamente carregada. Também compreendidos são os análogos respectivosdos aminoácidos mencionados. Os aminoácidos não proteinogênicos positi-vamente carregados que têm uma cadeia lateral que é alongada comparadaa lisina, provaram ser especialmente ativos. Um exemplo adequado de umtal aminoácido alongado é homoarginina. De acordo com uma modalidade opeptídeo carrega um aminoácido positivamente carregado na posição 10com exceção da arginina de aminoácido natural. De acordo com esta moda-lidade a prolina 10 é substituída por um aminoácido positivamente carregadoselecionado do grupo que consiste em aminoácidos de proteinogênicos K ouH e aminoácidos positivamente carregados não-proteinogênicos naturais oupositivamente carregados não-naturais tal como, por exemplo, homoarginina.
De acordo com a seqüência de consenso da primeira modalida-de, Χβ e X15 descrevem aminoácidos com uma funcionalidade de cadeia late-ral capaz de formar uma ligação covalente. Estes aminoácidos são, dessemodo, capazes de formar uma unidade de ponte. De acordo com uma moda-lidade, os aminoácidos na posição X6 e Xi5 são escolhidos tal que eles se-jam capazes de formar uma ponte intramolecular dentro do peptídeo for-mando uma ligação covalente entre um ao outro. A formação de uma ponteintramolecular pode levar a ciclização do peptídeo. Os exemplos para unida-des de ponte adequadas são a ponte de dissulfeto e a ponte de disseleneto.
Os exemplos adequados de aminoácidos que descrevem tais funcionalida-des de formação de ponte nas suas cadeias laterais são, por exemplo, ciste-ína e derivados de cisteína, tal como homocisteína ou selenocisteína, mastambém tiolisina. A formação de uma ponte de disseleneto, por exemplo,entre dois igualam resíduos de selenocisteína tem vantagens sobre umaponte de cisteína. Esta como uma ponte de seleneto é mais estável em am-bientes de redução. A conformação do peptídeo é desse modo, preservadamesmo sob condições difíceis.
Porém, é evidente que também os aminoácidos são adequadosna posição Xe e X15, descrevendo uma cadeia lateral com uma funcionalida-de que permite a formação de diferentes ligações covalentes tal como, porexemplo, uma ligação de amida entre um aminoácido que tem uma cadeialateral positivamente carregada (por exemplo, os aminoácidos proteinogêni-cos Κ, H, R ou ornitina, DAP ou DAB) e um aminoácido que tem uma cadeialateral negativamente carregada (por exemplo, os aminoácidos proteinogêni-cos D ou E). Outros exemplos são pontes de amida e tioéter.
Os peptídeos que se incluem na seqüência de consensos daprimeira modalidade da presente invenção são descritos no pedido anteriordo requerente PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959), que foi publicadoapós as datas de prioridade do presente pedido. Em alguns países esta des-crição no PCT/EP 2005/012075 poderia constituir a técnica anterior de acor-do com a lei de patentes respectiva.
Somente em países onde isto é aplicável e poderia questionarpatenteabilidade, a seqüência de consenso descrita acima por razões legaispode não compreender seqüências que atendem ao consenso acima, asquais são descritas em PCT EP 2005 01 20 75. Isto poderia se aplicar àsseguintes seqüências de consenso ou seqüências de peptídeo:
- um peptídeo, especialmente um sendo capaz de se ligar aoreceptor de EPO que compreende a seguinte seqüência de aminoácidos:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e
Χβ é C, A, E, ácido a-amino-7-bromobutírico ou homocisteína(hoc);
X7 é R, H, L1 W ou Y ou R, H, L, W, Y ou S;X8 é M1 F, I, homoserinametiléter ou norisoleucina;
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X10 é uma permuta não-conservadora de prolina;
ou X9 e X-io são substituídos por meio de um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é T ou A;
X-13 é 1-nal, 2-nal,
X14 é D1 E, eu, L ou V;
X15 é C, A, K, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteínacontanto que X6 ou X15 seja C ou hoc
- um peptídeo, caracterizado pela seguinte seqüência de amino-ácidos:
ΧβΧτΧβΧθΧ 1 oX 11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é indicado por abreviação de letra padrão eX6 éC;
X7 é R1 H1 L, ou W;
X8 éM, F1 I;
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X-io é um permuta não-conservadora de prolina;
X11 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é T;
X13 é W;
X14 é D;
X15 é C;
ou onde X9 e X10 são substituídos por um único aminoácido.
- um peptídeo é caracterizado pela seguinte seqüência de ami-noácido:
X6X7X8X9Xi 0X11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é indicado por abreviação de letra padrão eX6 éC;
X7 é R, H1 L1 ou W;X8 é Μ, F, I ou hsm (metiléter de homosserina);
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X10 é um permuta não-conservadora de prolina;
X11 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é T;
X13 é W;
Xm é D, Ε, I, L ou V, 1-nal (1-naftilalanina) ou 2-nal (2-naftilalanina);
X15 é C;
- os peptídeos descritos em PCT/EP2005/012075 que atendemao consenso acima da primeira modalidade (vide Figura 21).
Onde a descrição pós-publicada anteriormente dePCT/EP2005/012075 não resulta em um problema de patenteabilidade, asseqüências de peptídeo e consensos listadas acima não precisam ser nega-das do consenso amplo da primeira modalidade e são desse modo compre-endidas pelo consenso definido acima. Além disso, estes peptídeos supor-tam a exatidão do consenso mimético de EPO em geral uma vez que elesdemonstram a efetividade.
De acordo com uma segunda modalidade da presente invenção,um peptídeo é fornecido, que também descreve boas propriedades miméti-cas de EPO. Este peptídeo compreende pelo menos 10 aminoácidos, é ca-paz de se ligar ao receptor de EPO e compreende um agonista e desse mo-do atividade mimética de EPO. O referido peptídeo compreende a seguinteseqüência núcleo de aminoácidos:
X9X10X11X12X13
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais, e em que:
Xg é G ou uma permuta conservadora de G ;
X10 é uma permuta não-conservadora de prolina ou X9 e Xi0 sãosubstituídos por meio de um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A;X13 é naftilalanina.
Também compreendidos por esta modalidade são os peptídeosselecionados do grupo consistindo em fragmentos funcionalmente equivalen-tes, derivados e variantes da seqüência de consensos de peptídeo acimatendo atividade mimética de EPO e tendo um aminoácido em X10 que consti-tui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que X9 e 10 são substi-tuídos por um único aminoácido e que descrevem uma naftilalanina na posi-ção X13-
Os peptídeos desta segunda modalidade compartilham com aprimeira modalidade a característica única que X10 é uma permuta não-conservadora de prolina ou que X9 e X10 são substituídos por um único ami-noácido. Porém, uma característica adicional para os peptídeos miméticosde EPO de acordo com a segunda modalidade da presente invenção é anaftilalanina (por exemplo, ou 1-Nal ou 2-Nal) na posição 13.
A combinação de naftilalanina na posição 13 e a permuta de a-minoácido não-conservadora de prolina na posição X10 leva aos peptídeosmiméticos de EPO com propriedades de ligação melhoradas.
Os peptídeos miméticos de EPO se ligam na forma de um díme-ro ao receptor de EPO. Foi assumido que a incorporação de Nal na posição13 leva às interações hidrofóbicas mais fortes entre os monômeros de peptí-deo. Isto potencialmente realça a dimerização das cadeias de peptídeo mo-nomérico e possivelmente estabiliza a conformação do dímero de peptídeo.Em combinação com um aminoácido que é não-conservador para prolina,uma molécula mimética de EPO com propriedades miméticas de EPO me-lhoradas é criada, talvez devido a uma colocação favorável dos aminoácidosenvolvidos na ligação de receptor.
As seqüências que descrevem naftilalanina na posição 13 tam-bém foram descritas no pedido anterior do requerente PCT/EP 2005/012075.Em alguns países esta descrição poderia constituir a técnica anterior de a-cordo com a lei de patentes.
Em países onde isto é aplicável e poderia ser questionada a pa-tenteabilidade, a seqüência de consenso da primeira alternativa da segundamodalidade por razões legais pode não compreender seqüências que aten-dem o consenso, as quais são descritas em PCT/EP 2005/012075. Isto po-deria se aplicar à seguinte seqüência de consenso e seqüências de peptí-deo, selecionadas do seguinte grupo que é descrito em PCT/EP2005/012075:
- um peptídeo, especialmente um sendo capaz de se ligar aoreceptor de EPO que compreende a seguinte seqüência de aminoácidos:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e
Xe é C, A, E, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína(hoc);
X7 é R1 H, L1WouY ou R, H, L1 W, Y ou S;
Xe é M, F, I, homoserinametiléter ou norisoleucina;
Xg é G ou uma permuta conservadora de G;
X10 é uma permuta não-conservadora de prolina;
ou Xg e X10 são substituídos por meio de um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é T ou A;
X13 é 1-nal, 2-nal,
X14 é D, E, eu, L ou V;
X-I5 é C, A, K, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína (hoc)
contanto que Xe ou Xi5 seja C ou hoc
- um peptídeo do seguinte grupo
GGTYSCHFGKITUVCKKQGG
GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG
GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRGC-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRGAc-C-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-Am
Ac-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-AmGGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG
GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRGCGGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRGGGTYSCHMGKLTXVCKKQGGGGTYTCHFGKLTXVCKKLGGGGLYSCHFGKITXVCKKQGGGGLYSCH FG KLTXVCQKQGGGGTYSCHFGKLTXVCKKQRGGGTYTCHFGKLTUVCKKQGGGGTYSCHFGKLTUVCKKLGGGGTYSCHFGKITXVCKKQGGGGLYSCHFGKLTUVCKKLGGGGLYACHFGKLTUVCKKQGGGGTYTCHFGKITUVCKKQGGGGLYSCHFGKLTXVCKKQGGGGLYACHFGKLTULCKKQGGGGTYTCHFGKITXVCKKQGGGGLYSCHFGKLTXVCKKQRGGGTYTCHFGKLTXVCKKQGGGGLYSCHFGKITUVCKKQGGGGLYSCHFGKLTXVCRKQGGGGTYACHFGKLTXVCKKLGGGGLYACHFGKLTXVCRKQGGGGTYACHFGKLTXVCKKQGGGGLYSCHMGKLTXVCRKQGGGGLYSCHFGKLTUVCKKQRGGGLYSCHMGKLTXVCKKQGGGGTYTCHMGKLTXVCKKQGGGGLYSCHFGKLTXVCRKQRGGGTYSCHFGKLTXVCKKQGGGGTYTCHFGKLTXVCKKQRGGGTYTCHFGKLTXVCKKQRGGGTYACHFGKLTUVCKKQGGGGLYACHFGKLTUVCRKQGGGGLYACHFGKLTXICKKQGGGGLYSCHFGKITXECKKQGGGGLYACHFGKLTXVCKKQGGGGTYSCHFGKLTXVCQKQGGGG LYSCHMG KLTXDCKKQGGGGLYSCHFGKLTXVCKKLGGGGLYSCHFGKLTUVCQKQGGGGLYSCHFGKLTUVCRKQRGGGTYTCHFGKLTUVCKKLGGGGTYSCHMGKLTUVCKKQGGGGLYACHMGKITXVCQKLRGGGTYSCHFGKLTXVCKKQRGGGLYSCHFGKLTUVCRKQGGGGTYSCHFGKLTXVCKKLGGGGLYSCHFGKITUICKKQGGG GTYTC H FG KLTXVCQ KQG GGGLYACHMGKITXVCQKLGGGGTYSCHFGKLTUVCKKQRGGGLYSCHFGKLTUVCRKLGGGGLYSCHFGKLTXVCRKLGGGGLYSCHFGKITUVCRKQGGGGLYSCHMGKLTUECKKQGGGGTYSCHFGKLTUVCKKQGGGGLYSCHFGKLTUVCKKQGGGGLYSCHFGKITXVCRKQGGGGTYTCHFGKLTUVCQKQGGGGTYSCHFGKLTUVCQKQGGGGTYTCHFGKLTUVCKKQRG
em que X é 1-naftilalanina anos e U é 2-naftilalanina.
Onde a descrição pós-publicada de PCT/EP2005/012075 nãoresulta em um problema de patenteabilidade, as seqüências de peptídeo econsenso acima não precisam ser negadas do amplo consenso da primeiraalternativa da segunda modalidade e são desse modo compreendidas pelosamplos consensos definidos acima.
Outros aspectos benéficos da primeira e segunda modalidade dapresente invenção são fornecidos nas reivindicações dependentes. Como aprimeira e segunda modalidade desta invenção compartilham característicasidênticas relativo à presença de uma permuta não-conservadora de prolinana posição 10 ou pelo fato de que X9 e Xio são substituídos por um únicoaminoácido, eles na realidade são firmemente ligados um ao outro.
As seqüências de consenso aumentadas da primeira e segundamodalidade, em que aminoácidos adequados são definidos para posiçõesque cercam as seqüências núcleo anteriores são definidas nas reivindica-ções dependentes e também são descritas abaixo. Favor notar que a nume-ração usada no pedido presente (X4XsXe - Btc) é somente fornecida paraaliviar a comparação entre os peptídeos da presente invenção e o peptídeosmiméticos de EPO conhecido no estado da técnica (para numeração combase no peptídeo de EMP1 favor se referir a Johnson e outros, 1997 e1998). Porém, esta numeração não se refere ao comprimento global do pep-tídeo e, portanto também não deve indicar que sempre é necessário quetodas as posições estejam ocupadas. Não é, por exemplo, necessário que aposição Xi seja ocupada. Por exemplo um peptídeo que começa com X6também é EPO mimeticamente ativo contanto que o comprimento mínimo de10 aminoácidos seja fornecido. Por conseguinte, as numerações das posi-ções de aminoácido usadas neste pedido devem somente aliviar a caracteri-zação e comparação dos peptídeos com a técnica anterior.
A seqüência de consenso da primeira e segunda modalidade dapresente invenção também pode compreender as seguintes posições deaminoácido adicionais:
X14X15X16X17X18X19
em qüé cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais eXi4 é selecionado do grupo que consiste em D, Ε, I, L ou V;
X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A;
X16 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T;
X17 é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, G,Ρ, Y ou um aminoácido positivamente ou negativamente carregado natural,não-natural ou derivatizado, no caso de um aminoácido positivamente carre-gado preferivelmente K, R, H, ornitina ou homoarginina;
X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;
X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente um aminoácido positivamente ou negativamente carregado,no caso de um aminoácido positivamente carregado, por exemplo, K, R, H,ornitina ou homoarginina ou um aminoácido flexível pequeno tal como glicinaou beta-alanina.
De acordo com uma melhora adicional, o consenso de peptídeocompreende as seguintes posições de aminoácido adicionais:
XeXyXe
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral,capaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
X7 é R, H, L, W ou Y ou S;
X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina.
De acordo com uma outra melhora adicional da primeira e se-gunda modalidade da invenção, o peptídeo descreve um aminoácido carre-gado na posição Χίο, X17 e/ou X19 se estas posições de aminoácido estãopresentes no peptídeo (depende do comprimento do consenso de peptídeo).
Os aminoácidos na posição X10, X17 e/ou X19 são positivamente ou negati-vamente carregados e são selecionados do grupo que consiste em aminoá-cidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivatizados. Favornotar que os aminoácidos derivatizados são percebidos como uma modali-dade especial de aminoácidos não-naturais no contexto deste pedido. Otermo aminoácido não-natural é na realidade o termo genérico. Os aminoá-cidos derivatizados são atualmente separadamente mencionados, uma vezque eles constituem uma modalidade especial da presente invenção comoserá descrito em detalhes abaixo.
No caso dos aminoácidos em X10, X17 e/ou X19 serem aminoáci-dos negativamente carregados, os referidos aminoácidos negativamentecarregados são preferivelmente selecionados do grupo que consiste em
- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmen-te D ou E;
- aminoácidos negativamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo negativamente carregado.
A cadeia lateral negativamente carregada não-natural pode des-crever uma cadeia lateral alongada. Os exemplos para tais aminoácidos sãoácido alfa-amino adípico (Aad), 2-aminoeptanodiácido (ácido 2-aminopimélico) ou ácido alfa-aminosubérico (Asu).
Uma razão poderia ser que os aminoácidos artificiais negativa-mente carregados alongados são capazes de entrar em contato melhor comaminoácidos positivamente carregados do receptor de EPO desse modo me-lhorando a capacidade de ligação.
Descobriu-se que os respectivos peptídeos que também carre-gam uma naftilalanina na posição 13 descrevem propriedades de ligaçãomuito boas.
Como mencionado, também é possível fornecer um aminoácidonegativamente carregado convertendo-se um aminoácido positivamente car-regado em um aminoácido negativamente carregado. Desse modo tambémé possível prolongar a cadeia lateral desse modo potencialmente realçandoas propriedades de ligação. De acordo com esta nova estratégia, a Iisina (ouaminoácidos mais curtos homólogos como Dap, Dab ou ornitina) é derivati-zada com um agente adequado que fornece grupos negativamente carrega-dos. Um agente adequado é, por exemplo, um diácido tal como, por exem-plo, ácidos dicarboxílcos ou ácidos dissulfônicos. Ácido glutárico, ácido adí-pico, ácido succínico, ácido pimélico e ácido subérico podem ser menciona-dos como exemplos.
De acordo com um outro aspecto, o peptídeo de acordo com ainvenção carrega um aminoácido positivamente carregado na posição X10,X17 e/ou X19. O aminoácido positivamente carregado é selecionado do grupoque consiste em,
- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina ou ornitina;
- aminoácidos positivamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
É mostrado que peptídeos miméticos de EPO muito potentespodem ser criados quando na posição Xi0 e/ou Xi7 do peptídeo um aminoá-cido está presente o qual descreve uma cadeia lateral alongada comparadaà lisina. Este aminoácido pode ser não-proteinogênico. De acordo com umamodalidade o alongamento do aminoácido positivamente carregado é forne-cido incorporando-se unidades de alongamento na cadeia lateral do aminoá-cido a ser prolongada que não necessariamente necessita ser lisina. Tam-bém aminoácido mais curto pode ser usado como materiais de partida quesão então alongados através de reações químicas apropriadas de rotina.Normalmente, as unidades de alongamento são grupos ou alifáticos (porexemplo, unidades de CH2) ou aromáticos (por exemplo, unidades de fenilaou naftila). Os exemplos de aminoácidos alongados apropriados são, porexemplo, homoarginina, aminofenilalanina e aminonaftilalanina.
De acordo com uma modalidade adicional desta primeira e se-gunda modalidade da presente invenção, Xe é um D-aminoácido, preferivel-mente D-fenilalanina.No caso do consenso da primeira e segunda modalidade tam-bém compreender um aminoácido na posição X5, X5 pode ser selecionadode qualquer aminoácido, porém, é preferivelmente A, Η, K, L, M, S, T ou I.
No caso de X4 está presente no peptídeo, ele pode ser selecio-nado de qualquer aminoácido, porém, é preferivelmente F, Y ou um derivadode F ou Y, em que o derivado de F ou Y carrega pelo menos um substituinteretirado de elétron. O substituinte retirado de elétron é selecionado preferi-velmente do grupo que consiste no grupo amino, o grupo nitro e halogênios.Os exemplos são 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina,.
No caso de X3 está presente no consenso, X3 é selecionado in-dependentemente de qualquer aminoácido, preferivelmente D, E, L1 N, S, Tou V.
Além disso, especialmente no caso das unidades monoméricas(domínios de ligação) estarem formando um dímero, é preferido que os ami-noácidos na região de terminal de N dos monômeros (por exemplo, posiçõesXi e X2) e na região de terminal de C do monômero (por exemplo, Xi9 e X2o)descrevam um aminoácido flexível pequeno como glicina ou beta-alaninapara fornecer uma conformação flexível.
De acordo com uma terceira modalidade da presente invenção éfornecido também um peptídeo diferentemente estruturado que descreveboas propriedades miméticas de EPO. Este peptídeo também compreendepelo menos 10 aminoácidos, é capaz de ligação ao receptor de EPO e com-preende uma atividade agonista. As características deste peptídeo miméticode EPO são descritas por pelo menos uma das seguintes seqüências deconsenso núcleo de aminoácidos:
X9X10X11X12X13;
X9X10X11X12X13X14X15X16X17
ou
X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19
Cada aminoácido destas seqüências de consenso é selecionadode aminoácidos naturais ou não-naturais. De acordo com a característicaessencial do segundo aspecto da presente invenção, pelo menos uma dasposições X-io, X17 ou X19 descreve um aminoácido negativamente carregado.
Também compreendidos são peptídeos selecionados do grupo que consisteem fragmentos, derivados e variantes funcionalmente equivalentes da se-qüência de consensos de peptídeo acima, tendo atividade mimética de EPOe tendo pelo menos em uma das posições X10, X17 ou X19 um aminoácidonegativamente carregado.
Foi muito surpreendente que os aminoácidos negativamente car-regados nestas posições descrevessem tais excelentes propriedades mimé-ticas de EPO. As posições de aminoácido adicional (se presente no consen-so) são definidas como segue:
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;
X13 é W, 1 -nal, 2-nal, A ou F;
X14 é D, Ε, I, Lou V;
X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico,
X16 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K1 L, Q, R, S, Har ou T;
XI8 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q.
Os peptídeos de acordo com a terceira modalidade da presenteinvenção que carregam um aminoácido negativamente carregado em pelomenos uma das posições X10, X17 e/ou X19 (se presente), são candidatosadequados para um peptídeo que descreve propriedades miméticas de EPOdiscriminantes no sistema humano e animal. Como mostrado acima, as se-qüências de proteína do receptor de EPO de espécies diferentes têm so-mente algumas diferenças de espécies para espécies, e desse modo os re-ceptores de EPO são classificados como "altamente conservados com dife-renças de espécies desprezíveis". Porém, foi mostrado surpreendentementeque os peptídeos miméticos de EPO com um aminoácido negativamentecarregado em pelo menos um das posições descritas podem ser capazes dediscriminar entre os sítios de ligação de peptídeo de receptor de EPO huma-no e animal. Os peptídeos que têm uma capacidade de ligação mais elevadaao receptor animal são preferivelmente usados para usos veterinários.
O peptídeo que carrega um aminoácido negativamente carrega-do em pelo menos uma das posições Xi0, X17 e/ou X19 pode compreender osseguintes aminoácidos adicionais no consenso:
X6X7X8
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
Χβ é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
X7 é R, H1 L1WouY ou S;
X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina.
Além disso, o consenso aumentado também pode ser descritopelos seguintes aminoácidos:
X9X10X11 Xi 2X13X14X15X16Χ17 7X18Χ19
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
Xg é G ou uma permuta conservadora de G;
no caso de X10 não ser um aminoácido negativamente carregado, X10 é pro-lina, uma permuta conservadora de prolina ou uma permuta não-conservadora de prolina ou X9 e X10 são substituídos por um único aminoá-cido;
Xn é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;
X13 é W,1 -nal, 2-nal, A ou F;
X14 é D, Ε, I, Lou V;X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
X16 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T;
no caso de Xu não ser um aminoácido negativamente carrega-do, X17 é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, G, P1 Y ouum aminoácido positivamente carregado natural, não-natural ou derivatiza-do, preferivelmente K, R, H, ornitina ou homoarginina;
X18 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;
no caso de Xig não ser um aminoácido negativamente carrega-do, X19 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido, preferi-velmente um aminoácido positivamente carregado tal como K, R, H, ornitinaou homoarginina ou um aminoácido flexível pequeno tal como glicina ou be-ta-alanina;
contanto que pelo menos um dentre X10, X17 ou Xig seja um a-minoácido negativamente carregado.
Certamente, esta modalidade da invenção também compreendepeptídeos selecionados do grupo que consiste em fragmentos, derivados evariantes funcionalmente equivalentes da seqüência de consenso de peptí-deo acima, tendo atividade mimética de EPO e tendo pelo menos em umadas posições X1O, X17 ou Xig um aminoácido negativamente carregado.
É preferido que os aminoácidos nas posições X6 e X15 que têmuma funcionalidade de cadeia lateral que permite a formação de uma ligaçãocovalente e conseqüentemente a criação de uma ponte de ligação no peptí-deo, sejam escolhidos tal que eles possam formar uma ligação covalenteentre si (favor referir-se à descrição da primeira modalidade da presente in-venção acima). Os aminoácidos adequados são conseqüentemente aminoá-cidos que carregam SH-grupos para formar ligações de dissulfeto (por e-xemplo, cisteína e derivados de cisteína tal como homocisteína) ou tiolisinadesse modo somente mencionando alguns candidatos adequados. Tambémos aminoácidos de formação de ponte de seleneto tal como selenocisteína,são adequados. Porém, como descrito acima, também outros aminoácidosque permitem a formação de uma ligação covalente, por exemplo, uma liga-ção de amida ou uma ligação de tioéter, são adequados. Conseqüentementeuma seleção de aminoácidos preferidos na posição X6 e X15 compreende C,Κ, E, ácido a-amino-y-bromobutírico, homocisteína (hoc), e derivados de cis-terna tal como selenocisteína, tiolisina. Isto se aplica em todas as modalida-des da presente invenção.
Os aminoácidos negativamente carregados presentes no peptí-deo de acordo com a terceira modalidade da presente invenção podem serselecionados do grupo que consiste em
- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmente D ou E;
- aminoácidos negativamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo negativamente carregado.
A cadeia lateral negativamente carregada não-natural pode des-crever uma cadeia lateral alongada. As cadeias laterais alongadas são pro-vavelmente capazes de contatar mais eficazmente os aminoácidos positiva-mente carregados do receptor de EPO e desse modo realçam a capacidadede ligação. Os exemplos para tais aminoácidos são ácido alfa-amino adípico(Aad), 2-aminoeptanodiácido (ácido2-aminopimélico) ou ácido alfa-aminossubérico (Asu).
Como descrito, também é possível fornecer um aminoácido ne-gativamente carregado convertendo-se um aminoácido positivamente carre-gado em um aminoácido negativamente carregado. Desse modo também épossível alongar a cadeia lateral. Isto pode melhorar as propriedades de li-gação ao receptor de EPO. De acordo com esta nova estratégia, um amino-ácido positivamente carregado tal como, por exemplo, Iisina (ou aminoácidosmais curtos homólogos tal como Dap, Dab ou ornitina) é derivatizado comum agente adequado que fornece grupos negativamente carregados. Umagente adequado é, por exemplo, um diácido tal como, por exemplo, ácidosdicarboxílicos ou ácidos dissulfônicos. Ácido glutárico, ácido adípico, ácidosuccínico, ácido pimélico e ácido subérico, podem ser mencionados comoexemplos.
Um exemplo adequado de uma lisina, alongada e negativamentecarregada com ácido glutárico é fornecido abaixo:
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Outra alternativa para uma modificação de alongamento é umacombinação de lisina com ácido adípico:
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Esta estratégia de alongamento que é muito vantajosa para me-lhorar as propriedades de ligação dos peptídeos miméticos de EPO da pre-sente invenção também pode ser usada para melhorar as características demoléculas diferentes. É desse modo, uma idéia tecnológica completamenteindependente. Desse modo, também um aminoácido modificado é fornecido,em que um aminoácido positivamente carregado é derivatizado com gruposquímicos adequados para fornecer o aminoácido positivamente carregadocom um grupo negativamente carregado. Desse modo o aminoácido origi-nalmente positivamente carregado é convertido em um aminoácido negati-vamente carregado. Isto é especialmente vantajoso se a modificação quími-ca também resultar em um alongamento da cadeia lateral que freqüente-mente melhora a capacidade de ligação. Os agentes adequados para modi-ficação são descritos acima.
Como descrito acima, somente é necessário de acordo com osegundo aspecto da presente invenção que uma das posições de aminoáci-do X-io, X17 e/ou Xig seja ocupado por um aminoácido negativamente carre-gado, embora também duas ou todas as posições possam descrever umaminoácido respectivo. Porém, no caso de uma ou mais destas posiçõesnão serem ocupadas por um aminoácido negativamente carregado, é prefe-rido que um aminoácido positivamente carregado esteja presente nas outrasposições X-io, X17 e/ou X19.
Este aminoácido positivamente carregado é selecionado preferi-velmente do grupo que consiste em
- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina e ornitina;
- aminoácidos positivamente carregados não-naturais, tal como,por exemplo, homoarginina ou ácido diaminobutírico;
- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
Foi mostrado que peptídeos miméticos de EPO muito potentespodem ser criados quando na posição Xi0 e/ou X17 um aminoácido positiva-mente carregado está presente, o qual descreve uma cadeia lateral alonga-da comparada à lisina. De acordo com uma modalidade o alongamento doaminoácido positivamente carregado é fornecido incorporando unidades dealongamento na cadeia lateral de um aminoácido que necessariamente nãoprecisa ser lisina. Também aminoácido mais curto pode ser usado como ma-teriais de partida que são então alongados através de reações químicas a-propriadas de rotina. Normalmente, as unidades de alongamento são gruposou alifáticos (por exemplo, unidades de CH2) ou aromáticos (por exemplo,unidades de fenila ou naftila). Os exemplos de aminoácidos apropriados são,por exemplo, homoarginina, aminofenilalanina e aminonaftilalanina. Os ami-noácidos não-proteinogênicos são preferidos devido à sua maior variedade.
Esta modalidade combinada com um aminoácido negativamente carregadoem pelo menos uma das outras posições de aminoácido Xi0, X17 e/ou X19resulta em peptídeos miméticos potentes de EPO que são os candidatosadequados para um padrão de atividade de diferenciação no modelo huma-no e animal.
Para peptídeos miméticos de EPO para usos veterinários, é pre-ferido que um aminoácido negativamente carregado esteja localizado na po-sição 19. Para isto foi mostrado experimentalmente que os peptídeos quetêm a respectiva característica freqüentemente descrevem uma capacidadede ligação melhor aos receptores de EPO animais.
Para usos veterinários, é preferido especialmente, que o amino-ácido negativamente carregado na posição 19 seja selecionado de E, D ouAad. É benéfico combinar esta característica com uma naftilalanina (preferi-velmente Nal-1) na posição 13. Além disso, é preferido que um aminoácidopositivamente carregado esteja na posição 17, preferivelmente K ou Har.
Também é preferido que um aminoácido positivamente carregado estejapresente na posição 10, preferivelmente lisina. Os exemplos especialmentepreferidos de peptídeos miméticos de EPO desta modalidade são mostradosna Fig 7c. Em particular, uma seqüência de peptídeo mimético de EPO parausos veterinários compreende uma seqüência de aminoácido que é selecio-nada do grupo que consiste em:
Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCK-Har-QDG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCK-Har-Q-Aad-G-AmGGGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQ-Aad-G-Am
Esta terceira modalidade da presente invenção também podeser combinada com a característica em que Xe é um D-aminoácido, preferi-velmente D-fenilalanina.
Uma seqüência de consenso aumentada desta modalidadecompreende os seguintes aminoácidos adicionais:
X4 pode ser F, Y ou um derivado de F ou Y, em que o derivadode F ou Y carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron. Como jádescrito acima em conjunto com a segunda modalidade, o substituinte reti-rado de elétron é selecionado preferivelmente do grupo que consiste no gru-po amino, o grupo nitro e halogênios. Os exemplos adequados são 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.
X5 pode ser selecionado de qualquer aminoácido, porém, é pre-ferivelmente A/Η, K, L, M, S, T ou I.
Também X3 pode estar presente e pode ser selecionado inde-pendentemente de qualquer aminoácido, preferivelmente D, E, L, N1 S, T ou V.
Além disso, especialmente no caso das unidades monoméricasestarem formando um dímero, é preferido que os aminoácidos no princípiodos monômeros (por exemplo, posição X1 e X2) e no final do monômero (porexemplo, Xi9 e X2o) descrevam aminoácidos flexíveis pequenos tal comoglicina ou beta-alanina para fornecer uma conformação flexível.
Como já descrito junto com a segunda modalidade da presenteinvenção, é vantajoso fornecer uma naftilalanina (nal-1 ou nal-2) na posiçãoΧ13. A incorporação de Nal na posição 13 leva às interações hidrofóbicasmais fortes entre os monômeros de peptídeo como descrito acima dessemodo potencialmente realçando a dimerização das cadeias de peptídeo mo-nomérico e possivelmente estabilizando a conformação do dímero de peptí-deo desse modo melhorando a atividade mimética de EPO. Uma combina-ção de ambas as modalidades (segunda e terceira) é muito favorável.
Os exemplos de seqüências de peptídeo adequadas que com-preendem naftilalanina, são fornecidos na Figura 7a.
De acordo com uma quarta modalidade da presente invenção éfornecido um peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento, ca-paz de ligação ao receptor de EPO e compreendendo uma atividade agonis-ta, compreendendo a seguinte seqüência núcleo de aminoácidos:
XeXgXioXi 1X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
X8 é um D-aminoácido;
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X10 é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou umapermuta não-conservadora de prolina;
ou X9 e X10 são substituídos por um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X14 é D, Ε, I, L ou V;
X-15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico.
Também compreendidos são peptídeos selecionados do grupoque consiste em fragmentos, derivados e variantes funcionalmente equiva-lentes da seqüência de consenso de peptídeo de acordo com a quarta mo-dalidade, tendo atividade mimética de EPO e tendo um D-aminoácido naposição 8.
A característica proeminente da quarta modalidade da presenteinvenção é a presença de um D-aminoácido na posição X8. D-fenilalanina épreferida. Esta modalidade parece ser um bom candidato por diferenciaçãoentre o receptor de EPO animal e humano. A inversão do alfa-C-átomo naposição 8 leva a uma posição geométrica diferente do grupo de fenila, quepoderia se ajustar melhor com o receptor animal especialmente o EPOR ca-nino.
Este quarto aspecto da presente invenção também pode sercombinado com as modalidades vantajosas adicionais como é subseqüen-temente descrito.
O peptídeo de acordo com a quarta modalidade da invençãotambém pode ser descrito pela seguinte seqüência núcleo de aminoácidoaumentada.
Χ6Χ7Χ8Χ9Χ10Χ11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
X7 é R, H, L1Wou Y ou S;
X8 é D-M, D-F, D-I, D-Y, D-H, D-homosserinametiléter ou D-norisoleucina;
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;Xio é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou umapermuta não-conservadora de prolina;
ou X9 e X10 são substituídos por um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;
X14 é D1 Ε, I, Lou V;
X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico.
Uma modalidade adicional da quarta modalidade da presenteinvenção pode ser descrita pela seguinte seqüência de aminoácido:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19
em que X6-X15 têm o significado acima como descrito junto com a quartamodalidade da invenção e em que
X16 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T;
X17 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,por exemplo, A, G, Ρ, Y ou um aminoácido carregado natural, não-natural oude derivatizado, preferivelmente K, R, H, ornitina ou homoarginina no casode um aminoácido positivamente carregado;
X1S é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;
X19 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido.
Também junto com a quarta modalidade da presente invenção, épreferido que um aminoácido carregado esteja presente na posição X1O, X17e/ou X19. As experiências mostraram que taxas de atividade mimética deEPO muito boas são alcançadas com aminoácidos carregados. Porém, emgeral também aminoácidos não-carregados, porém polares (tal como, porexemplo, serina, treonina, asparagina ou glutamina) nestas posições forne-cem bons resultados, se combinou com os aminoácidos certos nas outrasposições.O aminoácido carregado na posição X10, X17 e/ou X19 é positi-vamente ou negativamente carregado e é selecionado do grupo que consisteem aminoácidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivati-zados.
De acordo com um aspecto, Xi0, X17 e/ou Xi9 é um aminoácidonegativamente carregado. O referido aminoácido negativamente carregado éselecionado preferivelmente do grupo que consiste em
- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmen-te D ou E;
- aminoácidos negativamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo negativamente carregado.
A cadeia lateral negativamente carregada não-natural pode des-crever uma cadeia lateral alongada. Os exemplos para tais aminoácidos sãoácido alfa-amino adípico (Aad), 2-aminoeptanodiácido (ácido 2-aminopimélico) ou ácido alfa-aminossubérico (vide acima).
Como descrito, também é possível fornecer um aminoácido ne-gativamente carregado convertendo-se um aminoácido positivamente carre-gado em um aminoácido negativamente carregado. Desse modo também épossível alongar a cadeia lateral desse modo realçando as propriedades deligação. De acordo com esta nova estratégia (vide acima para detalhes), aIisina (ou aminoácidos mais curtos homólogos tal como Dap, Dab ou orniti-na) é derivatizada com um agente adequado que fornece grupos negativa-mente carregados. Um agente adequado é, por exemplo, um diácido tal co-mo, por exemplo, ácidos dicarboxílicos ou ácidos dissulfônicos. Ácido glutá-rico, ácido adípico, ácido succínico, ácido pimélico e ácido subérico podemser mencionados como exemplos.
De acordo com um aspecto adicional, o peptídeo carrega umaminoácido positivamente carregado na posição X10, X17 e/ou X19. O amino-ácido positivamente carregado que é selecionado do grupo que consistem em,- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina ou ornitina;
- aminoácidos positivamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
Foi mostrado que peptídeos miméticos de EPO muito potentespodem ser criados quando na posição Xi0 e/ou X17 um aminoácido está pre-sente o qual descreve uma cadeia lateral alongada comparada à lisina. Deacordo com uma modalidade o alongamento do aminoácido positivamentecarregado é fornecido incorporando unidades de alongamento na cadeialateral de um aminoácido que necessariamente não precisa ser lisina. Tam-bém aminoácidos mais curtos podem ser usados como materiais de partidaque são então alongados através de reações químicas apropriadas de rotina(vide acima). Normalmente, as unidades de alongamento são grupos ou ali-fático (por exemplo, unidades de CH2) ou aromático (por exemplo, unidadesde fenila ou naftila). Os exemplos de aminoácidos apropriados são, por e-xemplo, homoarginina, aminofenilalanina e aminonaftilalanina. São preferi-dos aminoácidos não-proteinogênicos devido à maior variedade. Um modoalternativo é a derivação de aminoácidos com grupos positivamente carre-gados que não somente permitem uma reversão de carga (para uma cargapositiva), porém também fornece um modo fácil para alongamento da molé-cula.
De acordo com um desenvolvimento adicional desta modalidadeo peptídeo é definido pela seguinte seqüência núcleo de aminoácido aumentada:
X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19
em que Χβ a X19 têm o significado anterior como descrito junto com o quartoaspecto da presente invenção e em que
X4 = é F, Y ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de Fou Y carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron;
X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,H,K,U,M,S,T ou I.
O substituinte retirado de elétron é selecionado preferivelmentedo grupo que consiste no grupo amino, o grupo nitro e halogênios. X4 tam-bém pode ser selecionado do grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.
Também X3 pode estar presente e pode ser selecionado inde-pendentemente de qualquer aminoácido, preferivelmente D, E, L, N1 S1 T ouV.
Além disso, no caso das unidades monoméricas estarem for-mando um dímero é preferido que as posições de aminoácido no princípiodos monômeros (por exemplo, posição Xi e X2) e no final do monômero (porexemplo, Xi9 e X2o) descrevam um aminoácido flexível pequeno tal comoglicina ou beta-alanina para fornecer flexibilidade conformacional.
Como já descrito em conjunto com a segunda modalidade dapresente invenção, é vantajoso fornecer uma naftilalanina na posição X13. Aincorporação de Nal na posição 13 leva às interações hidrofóbicas mais for-tes entre os monômeros de peptídeo como descrito desse modo potencial-mente realçando a dimerização das cadeias de peptídeo monomérico e pos-sivelmente estabilizando a conformação do dímero de peptídeo desse modomelhorando a atividade mimética de EPO.
De acordo com uma quinta modalidade da presente invenção,um peptídeo é fornecido que também é um candidato bom para um peptídeomimético de EPO que descreve uma atividade de descriminação de espé-cies. Este peptídeo compreende pelo menos 10 aminoácidos, é capaz de seligar ao receptor de EPO e compreende uma atividade agonista. Este peptí-deo mimético de EPO compreende a seguinte seqüência núcleo de aminoá-cidos:
X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
X4 = é F, ou um derivado de F ou Y1 em que o derivado de F ouY carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron;
X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,Η, K, L, M1 S1 Tou I.
X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido cc-amino-γ-bromobutírico;
X7 é R, H, L1WouY ou S;
X8 é M, F1 I, Y, H1 homosserinametiléter ou norisoleucina;
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X10 é permuta não-conservadora de prolina ou Xg e Xio é substi-tuído por um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;
X14 é D, Ε, I, Lou V;
X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido oc-amino-γ-bromobutírico.
Também compreendidos são peptídeos selecionados do grupoque consiste em fragmentos, derivados e variantes funcionalmente equiva-lentes da seqüência de consensos de peptídeo acima, tendo atividade mimé-tica de EPO e tendo um aminoácido na posição X^ que é selecionado de F,ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de F ou Y carrega pelo menosum substituinte retirado de elétron.
O substituinte retirado de elétron pode ser selecionado do grupoque consiste no grupo amino, o grupo de nitro e halogênios. X4 é seleciona-do preferivelmente do grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.
Outras combinações vantajosas desta quinta modalidade da in-venção com outras modalidades são descritas nas reivindicações dependen-tes. Para detalhes a cerca dos aspectos respectivos, por favor também refi-ra-se à descrição acima, explicando as características em conjunto com asrespectivas modalidades em detalhes. As combinações da mutação de X4 ea mutação de D-fenilalanina são especialmente adequadas.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção,vários peptídeos alternativos são fornecidos para fornecer peptídeos miméti-cos de EPO melhorados. De acordo com esta sexta modalidade da invençãoum peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento é fornecido, oqual é capaz de ligação ao receptor de EPO e compreende uma atividadeagonista.
Alternativa (a) desta sexta modalidade compreende pelo menosuma das seguintes seqüências núcleo de aminoácidos:
X9X10X11X12X13;
X9X10X11X12X13X14X15X16X17
ou
X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais, e em que:
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;
X13 é W, naftilalanina, A ou F;
X14 é D, E, I1 Lou V;
X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
em que pelo menos um das posições X10, X16, X17 ou X19 descreve um ami-noácido não-proteinogênico positivamente carregado que tem uma cadeialateral que é alongada comparada à lisina.
Também compreendidos são peptídeos selecionados do grupoque consiste em fragmentos, derivados e variantes funcionalmente equiva-lentes da seqüência de consenso de peptídeo acima tendo atividade miméti-ca de EPO e tendo um aminoácido em pelo menos uma das posições X1O,X16, X17 ou X19, descreve um aminoácido não-proteinogênico positivamentecarregado que tem uma cadeia lateral que é alongada comparada à lisina.
Esta sexta modalidade da invenção descreve uma estratégiaalternativa que também abre a opção para potencialmente discriminar entreo receptor humano e animal alongando-se as cadeias laterais positivamentecarregadas nos peptídeos miméticos de EPO em pelo menos uma das posi-ções X10, X16. X17 e/ou X19. Esta modalidade fornece os candidatos adequa-dos para um peptídeo discriminante uma vez que há menos pontos de aco-plamento negativamente carregados no receptor de EPO de murino e cani-no, e estes pontos de acoplamento são mais difíceis de se alcançar com ca-deias laterais positivamente mais curtas (por exemplo lisina). Desse modo, aincorporação de resíduos positivamente carregados com uma cadeia lateralmais longa tem um potencial elevado para aumentar a afinidade dos peptí-deos com os receptores de EPO.
As seqüências que descrevem uma homoarginina na posiçãoX10 e/ou X17 já foram descritas no pedido anterior da requerente PCT/EP2005/012075. De acordo com a lei de patentes de alguns países esta descri-ção poderia constituir a técnica anterior.
Onde isto é aplicável e poderia se questionar a patenteabilidadedo consenso acima, a seqüência de consenso da primeira alternativa da sex-ta modalidade da invenção por razões legais pode não compreender as se-qüências descritas em PCT/EP 2005/012075. Isto poderia se aplicar às se-qüências de consenso selecionadas do seguinte grupo:
- um peptídeo, especialmente um sendo capaz de se ligar aoreceptor de EPO que compreende a seguinte seqüência de aminoácidos:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e
X6 é C, A, E, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína (hoc);
X7 é R, H, L1 W ou Y ou S;X8 é Μ, F, I, homosserinametiléter ou norisoleucina;Xg é G ou uma permuta conservadora de G;X10 é Har
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é T ou A;
X13 é W, 1 -nal, 2-nal, A ou F;X14 é D, E1 I, Lou V;
X15 é C, A, K, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína(hoc)
contanto que X6 ou Xi5 seja C ou hocou
- um peptídeo, compreendendo a seguinte seqüência de amino-ácido,
X3X4X5X6X7X8X9X10X11 Xi 2X13X14X15X1 βΧι 7X18
em que Xe a Xi5 têm o significado anterior e em que
X3 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente D, E, L, N, S, T ou V;
X4 é Y;
X5 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente A, Η, K, L, M, S, T ou I.
X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S ou T;
X17 é homoarginina;
X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido.ou
GGTYSCSFGKLTWVCK-Har-QGG
GGTYSCHFG-Har-LTWVCK-Har-QGG
Estas seqüências já foram descritas no pedido de PCT anteriorda requerente PCT EP_2005-01 20 75.
Em países onde a descrição publicada PCT/EP2005/012075 nãoconstitui um problema de patenteabilidade, as seqüências de peptídeo econsenso listadas acima não precisam ser negadas do amplo consenso daprimeira alternativa da sexta modalidade.
De acordo com um outro desenvolvimento da sexta modalidadeda presente invenção, o peptídeo compreende a seguinte seqüência núcleoaumentada de aminoácidos:
X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19
em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que
X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou a ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
X7 é R1 H, L1WouY ou S;
X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina;
X9 é G ou uma permuta conservadora de G;no caso de Xi0 não ser um aminoácido não-proteinogênico positivamentecarregado que tem uma cadeia lateral que é alongada comparada à lisina,
X10 é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou uma permuta não-conservadora de prolina ou X9 e X10 são substituídos por um único aminoácido;
X11 é selecionado de qualquer aminoácido;
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;
X13 é W, 1 -nal, 2-nal, A ou F;
X14 é D, Ε, I, Lou V;
X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;
no caso de X16 não ser um aminoácido não-proteinogênico posi-tivamente carregado que tem uma cadeia lateral que é alongada comparadaà lisina, X16 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido, pre-ferivelmente G, K, L, Q, R, S ou T;
no caso de X17 não ser um aminoácido não-proteinogênico posi-tivamente carregado que tem uma cadeia lateral que é alongada comparadaà lisina, X17 é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, G, P,Y ou um aminoácido positivamente carregado natural, não-natural ou deriva-tizado, preferivelmente K, R, H ou ornitina;
X18 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;
no caso de X19 não ser um aminoácido não-proteinogênico posi-tivamente carregado que tem uma cadeia lateral que é alongada comparadaà lisina, X19 é selecionado independentemente de qualquer aminoácido, pre-ferivelmente um aminoácido carregado tal como aminoácido positivamentecarregado tal como K, R, H ou ornitina ou aminoácido negativamente carre-gado tal como D, E ou Aad;
contanto que pelo menos um dentre Xi0, X16, X17 ou Xi9 seja umaminoácido não-proteinogênico positivamente carregado que tem uma ca-deia lateral que é alongada comparada à lisina.
De acordo com uma modalidade adicional, pelo menos um den-tre X10, X16, X17 ou X-ig é um aminoácido positivamente carregado e em queo aminoácido positivamente carregado é selecionado preferivelmente dogrupo que consiste em:
- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina e ornitina;
- aminoácidos positivamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado;
contanto que pelo menos um dentre Xi0, X16, X17 ou X19 seja umaminoácido não-proteinogênico positivamente carregado que tem uma ca-deia lateral que é alongada comparada à lisina.
Como descrito acima, o alongamento do aminoácido positiva-mente carregado pode ser fornecido por unidades de alongamento da cadeialateral, em que as unidades de alongamento são grupos alifáticos ou aromá-ticos. O alongamento pode ser, por exemplo, fornecido através de unidadesde CH2, em que o número de unidades de CH2 é preferivelmente entre 1 e 6.Alternativamente, o alongamento também pode ser obtido com grupos aro-máticos tal como, por exemplo, fenila ou unidades de naftila.
O aminoácido não-proteinogênico positivamente carregado queé alongado comparado à lisina, é preferivelmente um aminoácido não-natural. Os aminoácidos não-naturais oferecem mais escolhas desse modoaliviando a possibilidade de encontrar um aminoácido alongado perfeitamen-te ajustado. Os exemplos para aminoácidos alongados não-naturais ade-quados são, por exemplo, homoarginina, aminofenilalanina e aminonaftilala-nina.
Uma cadeia lateral positivamente carregada alongada na posi-ção X17 parece interagir melhor com o receptor de EPO de murino/canino.Especialmente, homoarginina, que é uma arginina homóloga alongada artifi-cial, provou ser adequada. Este aminoácido está esticando a lisina e é capazde interagir com aminoácidos negativamente carregados mais distantes nosreceptores de EPO de murino/canino (Glu60 e Glu62 nos receptores de EPOanimais).
Uma cadeia lateral positivamente carregada alongada na posi-ção X10 tem um efeito similar à mutação na posição X17 descrita acima.Também neste caso, aminoácidos negativamente carregados mais distantespoderiam ser alcançados pelo alongamento (Glu34 no receptor de EPO demurino/canino).
É desejável combinar as mutações/aspectos nas posições X10 eX17. A geometria de um peptídeo que carrega um aminoácido positivamentecarregado alongado (por exemplo, homoarginina) em ambas as posiçõesindica uma forte interação com o receptor de EPO. Como descrito, o amino-ácido é preferivelmente não-proteinogênico. A força da interação eletrostáti-ca fornecida é até mesmo intensificada pelas múltiplas ligações de hidrogê-nio de cada resíduo de homoarginina.
De acordo com a sexta modalidade da invenção pelo menos umdentre X10, Χ16, X17 e/ou X19 descreve um aminoácido positivamente carre-gado não-proteinogênico alongado. As outras posições de Χ10, Χ16, X17 e/ouXig também podem descrever um aminoácido carregado que é positivamen-te ou negativamente carregado e é selecionado do grupo que consiste emaminoácidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivatizados.
De acordo com uma alternativa, pelo menos um dentre X10, X17e/ou X19 é um aminoácido negativamente carregado.
No caso de X10, X17 e/ou X19 ser um aminoácido negativamentecarregado, o referido aminoácido negativamente carregado é selecionadopreferivelmente do grupo que consiste em
- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmente D ou E;
- aminoácidos negativamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo negativamente carregado.
A cadeia lateral negativamente carregada não-natural pode des-crever uma cadeia lateral alongada. Os exemplos para tais aminoácidos sãoácido alfa-amino adípico (Aad), 2-aminoeptanodiaediácido (2-aminopimélico)ou ácido alfa-aminosubérico.
Como descrito, também é possível fornecer um aminoácido ne-gativamente carregado convertendo-se um aminoácido positivamente carre-gado em um aminoácido negativamente carregado. Desse modo também épossível alongar a cadeia lateral desse modo realçando as propriedades deligação. De acordo com esta nova estratégia, a Iisina (ou aminoácidos maiscurtos homólogos tal como Dap, Dab ou ornitina) é derivatizada com um a-gente adequado que fornece grupos negativamente carregados. Um agenteadequado é, por exemplo, um diácido tal como, por exemplo, ácidos dicar-boxílicos ou ácidos dissulfônicos. Ácido glutárico, ácido adípico, ácido succí-nico, ácido pimélico e ácido de subérico podem ser mencionados como e-xemplos. Por favor, também refira-se a descrição acima detalhada destamodalidade.
Sob a condição que pelo menos uma das posições X10, X16, X17e/ou X19 descreve um aminoácido não-proteinogênico positivamente carre-gado alongado o peptídeo também pode carregar um aminoácido "normal"positivamente carregado na posição Χιο> X161 X17 e/ou X19. O aminoácidopositivamente carregado é selecionado do grupo que consistem em
- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina ou ornitina;
- aminoácidos positivamente carregados não-naturais,
- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
Um desenvolvimento adicional da sexta modalidade da presenteinvenção fornece em X8 um D-aminoácido, preferivelmente D-fenilalanina.
De acordo com um outro desenvolvimento da sexta modalidade,o peptídeo compreende a seguinte seqüência núcleo de aminoácido aumen-tada:
X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19
em que X6 a Xi9 têm o significado acima e em que
X4 = é F, Y ou um derivado de F ou Y1 em que o derivado de Fou Y carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron;
X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,Η, K, L, M, S1Tou I.
Como descrito acima, o substituinte retirado de elétron pode serselecionado do grupo que consiste no grupo amino, grupo nitro e halogênios.Os exemplos são 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.
Também X3 pode estar presente e pode ser selecionado inde-pendentemente de qualquer aminoácido, preferivelmente D, E, L, N, S1 T ouV.
Além disso, no caso das unidades monoméricas estarem for-mando um dímero por um Iigador de peptídeo contínuo, é preferido que osaminoácidos na região de terminal de N dos monômeros (por exemplo, posi-ção Xi e X2) e na região de terminal de C do monômero (por exemplo, X19 eX20) descrevam um aminoácido flexível pequeno tal como glicina ou beta-alanina para fornecer uma conformação flexível.
A aplicação descreve além de peptídeos miméticos de EPO emgeral meios e estratégias diferentes para melhorar a atividade mimética deEPO e/ou para permitir uma discriminação entre o EPO-R humano e animal.
Como descrito, as estratégias e aspectos diferentes da invenção podem sercombinados entre si para obter um peptídeo mimético EPO "adaptado" quedescreve as propriedades desejadas. É, desse modo, importante entenderque as estratégias descritas possam ser entendidas como unidades de de-sígnio, que podem ser combinadas independentemente entre si alcançar aum peptídeo mimético de EPO que tem as propriedades desejadas. Por e-xemplo, as características da segunda modalidade (naftilalanina na posiçãoX13) podem ser combinadas com as características da terceira modalidadeque pelo menos um dentre X10, X17 e X19 são carregados negativamente.
O comprimento dos peptídeos de acordo com as modalidadesuma a seis descritas acima é preferivelmente entre dez a quarenta ou cin-qüenta ou sessenta aminoácidos. Em modalidades preferidas, os consensosde peptídeo descrevem um comprimento de pelo menos 10, 15, 18, 20 ou 25aminoácidos. De fato, as seqüências de consenso descritas podem ser em-butidas e respectivamente podem ser compreendidas por seqüências maislongas. As seqüências de consenso de peptídeo descritas podem ser perce-bidas como formando domínios de ligação para o receptor de EPO. Comodescrito acima e abaixo, também é possível combinar as unidades de peptí-deo monomérico (domínios de ligação) com di- ou mesmo multímeros depeptídeo. No caso de um Iigador de peptídeo ser usado para criar o di - oumultímero também peptídeos mais longos são criados devido à dimerizaçãoe/ou multimerisação. Como peptídeos miméticos de EPO eles são capazesde se ligar ao receptor de EPO.
As seqüências de peptídeo mimético de EPO de acordo com ainvenção podem ter acetilações e amidações de terminal de N e/ou de ter-minai de C. Alguns aminoácidos também podem ser fosforilados.
Os peptídeos de acordo com a invenção podem compreender L-aminoácidos ou D-aminoácidos estereoisoméricos, aminoácidos não-naturais/não convencionais, tal como, por exemplo, aminoácidos alfa, alfa-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila ou ácido lático, por exemplo 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, homosserina-metiléter, β-alanina, 3-piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfosserina, N-metilglicina (sarcosina),homoarginina, N-acetilserina, N-acetilglicina, N-formilmetionina, 3-metilistidina, 5-hidroxilisina, nor-lisina, ácido 5-aminolevulínico ou ácido ami-novalérico. O uso de N-metilglicina (MeG) e N-acetilglicina (AcG) é especi-almente preferido, em particular em uma posição de terminal. Também noescopo da presente invenção, estão os peptídeos que são peptídeos retro,inverso e retro/inverso dos peptídeos definidos e aqueles peptídeos queconsistem completamente em D-aminoácidos.
A presente invenção também refere-se aos derivados dos peptí-deos, por exemplo, produtos de oxidação de metionina, ou glutamina desa-midada, arginina e amida de terminal de C.
De acordo com um desenvolvimento das modalidades da inven-ção os peptídeos têm um único aminoácido que substitui os resíduos de a-minoácido Xg e Xi0. Nesta modalidade também ambos os resíduos podemser substituídos através de um aminoácido não-natural, por exemplo, ácido5-aminolevulínico ou ácido aminovalérico.
De acordo com um outro desenvolvimento, os peptídeos descri-tos na primeira a sexta modalidade compreendem em X6 e/ou Xi5 como umaminoácido com uma funcionalidade C de formação de ponte, um derivadode cisteína tal como selenocisteína, Ε, K, ou hoc, e/ou X7 como R, H ou Y ouS e/ou Xe como F ou M e/ou Xg como G ou A, preferivelmente G e/ou Xi0como K ou Har e/ou Xn como V, L, I, Μ, Ε, A, T ou norisoleucina e/ou Xi2como T e/ou X13 como W ou naftilalanina e/ou Xi4 como D ou V e/ou X17 co-mo Ρ, Y ou A ou um aminoácido natural ou não-natural básico. Porém, tam-bém é preferido como descrito acima que X17 seja K ou um aminoácido não-natural com uma cadeia lateral positivamente carregada tal como, por exem-pio, homoarginina.
Os fragmentos, derivados e polipeptídeos variantes de acordocom a presente invenção retêm substancialmente a mesma função biológicaou atividade como os peptídeos de acordo com as modalidades individuaisdescritas aqui. Para discriminá-los corretamente do estado da técnica frag-mento, derivados ou variantes têm os mesmos aspectos característicos co-mo as modalidades respectivas:
- relativo à modalidade 1 têm um aminoácido na posição X10 queconstitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que X9 e Xi0 sãosubstituídos por um único aminoácido;
- relativo à modalidade 2 têm um aminoácido na posição X10 queconstitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que X9 e X10 sãosubstituídos por um único aminoácido e uma naftilalanina na posição X13;
- relativo à modalidade 3, pelo menos uma das posições X10, X17ou X19 é um aminoácido negativamente carregado;
- relativo à modalidade 4, carregam um D-aminoácido na posição X8;
- relativo à modalidade 5, têm um aminoácido na posição X10que constitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que X9 e X10são substituídos por um único aminoácido e têm na posição X4 F, ou um de-rivado de F ou Y, em que o derivado de F ou Y carrega pelo menos umsubstituinte retirado de elétron;
- relativo à modalidade 6, pelo menos uma das posições X10,X16, X17 ou X-|9 descreve um aminoácido não-proteinogênico positivamentecarregado que tem uma cadeia lateral que é alongada comparada à lisina.
"Um fragmento" é menos que um peptídeo de tamanho natural(ou polipeptídeo, o termo peptídeo como usado aqui não compreende ne-nhuma restrição de tamanho), que retém atividade funcional substancialmen-te similar.
"Derivados" incluem peptídeos que foram quimicamente modifi-cados para fornecer uma estrutura e/ou função adicional.
Os derivados podem ser modificados através de processos natu-rais ou por técnicas de modificação químicas, ambos dos quais são bem co-nhecidos na técnica. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar emum polipeptídeo, incluindo a cadeia principal de peptídeo, as cadeias lateraisde aminoácido, e o terminal de amino ou de carboxila.
Outras modificações químicas incluem, por exemplo, acetila-ções, acilações, amidação, ligação covalente de porções químicas diferen-tes, reticulação, ciclização, ligação de dissulfeto ou outras formações deponte, hidroxilação, metilação, oxidação, PEGilação, selenoilação.
"Variantes" de peptídeos de acordo com a presente invençãoincluem polipeptídeos que têm uma ou mais permutas de seqüência de ami-noácido com respeito aos aminoácidos definidos nos consensos. De fato, osvariantes podem conter aminoácidos exceto aminoácidos naturais.
Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido conser-vadoras podem ser realizadas dentro da seqüência de aminoácido dos poli-peptídeos de acordo com esta invenção para chegar a variantes funcionaisdas modalidades diferentes da invenção como descrito acima. A substituiçãoocorre, por exemplo, dentro de aminoácidos que têm cadeias laterais nãopolares, os D- ou L aminoácidos não-carregados naturais ou não-naturaiscom cadeias laterais polares, os aminoácidos com cadeias laterais aromáti-cas, os D- ou L- aminoácidos positivamente carregados naturais ou não-naturais, os D ou L-aminoácidos negativamente carregados naturais ou não-naturais como também em qualquer aminoácido de tamanho e peso molecu-lar similares, em que o peso molecular do aminoácido original não deveriadivergir mais que aproximadamente + / - 25% do peso molecular do aminoá-cido original e a capacidade de ligação ao receptor da eritropoietina de hor-mônio com efeito agonístico é mantida. Preferivelmente, não mais do que 1,2 ou 3 aminoácidos são substituídos. Os variantes de seqüência em que ne-nhuma prolina é introduzida nas posições 10 e 17, são preferidos.
As seqüências de peptídeo descritas aqui, podem ser usadascomo unidades de peptídeo monòméricas adequadas que constituem domí-nios de ligação para o receptor de EPO. Elas podem ser usadas em suaforma monomérica uma vez que elas se ligam ao receptor de EPO. Comodescrito aqui, elas são preferivelmente usadas como dímeros, uma vez quefoi mostrado que a capacidade para induzir dimerização do receptor de EPOe, desse modo, a atividade biológica, é aumentada por dimerização das uni-dades de ligação monoméricas.
Desse modo, está claro que muitos peptídeos diferentes estãodentro do escopo da presente invenção. Descobriu-se porém, que a seqüên-cia Ac-VLPLYRCRMGRETWECMRAAGVTK-NH2 tem certas desvantagense não é, desse modo, preferida de acordo com a presente invenção.
No princípio (terminal de N) e fim (terminal de C) das seqüênciasde peptídeo individuais descritas até cinco aminoácidos podem ser removi-dos e/ou adicionado. É auto-evidente que o tamanho não é de relevânciacontanto que a função de peptídeo seja preservada. Além disso, por favornotar que as seqüências de peptídeo individuais que poderiam ser muito cur-tas para envolver sua atividade como monômeros normalmente funcionamcomo agonistas em dimerização. Tais peptídeos são desse modo preferi-velmente usados na sua forma dimérica. As modalidades truncadas e oualongadas respectivas são desse modo também compreendidas pelo espíri-to da invenção.
Na presente invenção, as abreviações para o código de umaletra como letras maiúsculas são aquelas da nomenclatura de polipeptídeopadrão, pretendida pela adição de aminoácidos não-naturais.
<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>
Como descrito acima, a presente invenção também inclui modifi-cações dos peptídeos e consenso de peptídeo definido por permutas con-servadoras de aminoácidos únicos. Tais permutas alteram a estrutura e fun-ção de uma molécula de ligação, porém só ligeiramente na maioria dos ca-sos. Em uma permuta conservadora, um aminoácido é substituído por outroaminoácido dentro de um grupo com propriedades similares.Os exemplos de grupos correspondentes são:
- aminoácidos que têm cadeias laterais não polares: A, G, V, L, I,
P, F1 W1 M,
- aminoácidos não-carregados que têm cadeias laterais polares:S,T,G,C,Y,N,Q,
- aminoácidos que têm cadeias laterais aromáticas: F, Y, W1
- aminoácidos positivamente carregados: K1 R, H,
- aminoácidos negativamente carregados: D, E,- aminoácidos de tamanho ou peso molecular similar, em que opeso molecular dos aminoácidos substituinte diverge por um máximo de + I-25% (ou + / - 20%, + / - 15%, + / - 10%) do peso molecular do aminoácidooriginal.
É auto-evidente, que os grupos também incluem aminoácidosnão-proteinogênicos naturais ou não-naturais com o respectivo perfil de ca-deia lateral tal como, por exemplo, homoarginina no caso do grupo que des-creve positivamente as cadeias laterais carregadas. No caso de uma molé-cula de substituição de prolina 10 tal como, por exemplo, um aminoácidonão-natural não pode ser claramente designado para um dos grupos acimacaracterizado por suas propriedades de cadeia lateral, normalmente deveriaser percebido como uma substituição não-conservadora de prolina de acor-do com esta invenção. Para categorizar estes aminoácidos incomuns, a aju-da de classificação de acordo com o peso molecular poderia ser útil.
Mais especificamente, Wrighton e outros (Patente US 5.773.569,e patentes associadas) examinaram em detalhes, usando técnicas de exibi-ção de fago, que aminoácidos podem ser substituídos, ao mesmo tempo emque mantendo a atividade. Eles também investigaram e publicaram dadosem possível mutilação, isto é, comprimento mínimo de um determinado pep-tídeo mimético de EPO. Porém, uma prolina próxima do resíduo Gly centralsomente a possibilidade para obter peptídeos ativos.
Preferivelmente os peptídeos descritos são modificados comopara AcG no terminal de N e M e G no terminal de C.
Como mencionado acima, é preferido que os peptídeos compre-endam duas seqüências de consenso miméticas de EPO e desse modo uni-dades monoméricas de ligação desse modo formando um dímero (ou peptí-deo bivalente contínuo no caso de um ligador de aminoácido é usado paradimerização). As unidades de peptídeo mimético monomérico de EPO po-dem ser escolhidas de todas as modalidades descritas acima para formar odímero. Uma unidade de ligação monomérica de acordo com a presente in-venção também pode ser combinada com uma unidade de ligação monomé-rica de peptídeos miméticos de EPO conhecidos no estado da técnica.Um monômero de peptídeo mimético de EPO ou dímero de a-cordo com a presente invenção pode também compreender pelo menos umaporção espaçadora. Preferivelmente tal espaçador conecta o Iigador de ummonômero ou dímero a uma porção de polímero solúvel em água ou umgrupo de proteção, que pode ser, por exemplo, PEG. O PEG tem um pesomolecular preferido de pelo menos 3 kD, preferivelmente entre 20 e 60 kD. Oespaçador pode ser uma porção de C1-12 terminada com NH-ligações ougrupos COOH e opcionalmente substituído em um ou mais átomos de car-bono disponíveis com um substituinte de alquila inferior. Um espaçador par-ticularmente preferido é descrito em WO 2004/100997. Todos os documen-tos- WO 2004/100997 e WO 2004/101606-estão aqui incorporados por refe-rência. A modificação de PEG de peptídeos é descrita em WO 2004/101600que também está aqui incorporada por referência.
Há várias possíveis opções para designar um Iigador covalenteentre duas cadeias de peptídeo para chegar em di- ou multímeros. Os peptí-deos podem ser ligados por cadeias laterais de aminoácido ou por exten-sões de cadeia principal. Quatro estratégias de dimerização principais dife-rentes para conectar duas porções de peptídeo mimético de EPO covalen-temente são descritas subseqüentemente como exemplos para estratégiasadequadas.
1. Dimerização de terminal de terminal de C a terminal de C
<formula>formula see original document page 51</formula>
A dimerização pode ser alcançada por meio de uma estruturade dicetopiperazina no Terminal de C de cada peptídeo. Os Iigadores de di-cetoperazina podem ser obtidos ativando-se aminoácidos de terminal de C,preferivelmente glicinas. As seguintes figuras mostram os exemplos apropriados:
Exemplo a:<formula>formula see original document page 52</formula>
Por favor, note que de acordo com a segunda modalidade dapresente invenção haveria uma naftilalanina na posição 13 em vez de tripto-fano. As seqüências acima são somente usadas para descrever o princí-pio/conceito de dimerização que, porém, também trabalha para outros peptí-deos descritos no presente pedido.
2. Dimerização de terminal de terminal de N a terminal de N_
<formula>formula see original document page 52</formula>Os seguintes exemplos representam peptídeos diméricos emque o terminal de N de um dos referidos peptídeos monoméricos está cova-lentemente ligado ao terminal de N do outro peptídeo, por meio do qual aunidade espaçadora está preferivelmente contendo um bloco de construçãode ácido dicarboxílico.
Exemplo a:
O exemplo de um dímero que contém uma unidade de hexano-dioíla (C6) como ligador/espaçador:
<formula>formula see original document page 53</formula>
A ponte de ligação nesta estrutura dimérica é feita sob enco-menda através de modelagem molecular para evitar distorções da confor-mação bioativa.
Exemplo b:
O exemplo de um dímero adaptado que contém uma unidade deoctanodioíla (C8) como ligador/espaçador:
<formula>formula see original document page 53</formula>
3. Dimerizacão por cadeias laterais
Além disso, a dimerização pode ocorrer por uma ligação cova-lente formada entre as cadeias laterais dos peptídeos monoméricos que sãosupostos formarem o dímero.
<formula>formula see original document page 53</formula>
Existem várias opções:
De acordo com uma modalidade, as cadeias laterais do aminoá-cido na posição Xi8 (por exemplo, Gln) são adjacentes um ao outro no com-plexo de EPOR-peptídeo mimético de EPO. Estas cadeias laterais de Gln18podem ser substituídas por uma ponte covalente. As seguintes fórmulasmostram exemplos de dímeros de peptídeo ligados por cadeias laterais doaminoácido na posição 18:
<formula>formula see original document page 54</formula>
A distância e a geometria certas têm que ser consideradas nodesígnio de Iigadores adequados.
Quando a geometria do peptídeo com a seguinte fórmula é aper-feiçoada, a estrutura é contraída e deformada em comparação ao dímero depeptídeo nativo:
<formula>formula see original document page 54</formula>
Em contraste com a estrutura anterior, uma dimerização por tio-Iisina na posição 18 não distorce o dímero substancialmente.<formula>formula see original document page 55</formula>
De acordo com uma estratégia diferente, a ponte covalente queliga os monômeros de peptídeo um ao outro desse modo formando o dímeroé formada entre as cadeias laterais do aminoácido de terminal de C da pri-meira unidade de peptídeo monomérico e do aminoácido de terminal de Ndo segundo monômero de peptídeo. Conseqüentemente, é preferido de a-cordo com esta estratégia de dimerização que os peptídeos miméticos deEPO a serem dimerizados carreguem um aminoácido com uma ponte queforma funcionalidade no terminal de N ou C desse modo permitindo a forma-ção de uma ligação covalente entre o último aminoácido do primeiro peptí-deo e o primeiro aminoácido do segundo peptídeo. A Ligação que cria o dí-mero é preferivelmente covalente. Os exemplos adequados de pontes res-pectivas são, por exemplo, a ponte de dissulfeto e a ponte de disseleneto.Porém, também, por exemplo, as ligações de amida entre aminoácidos posi-tivamente e negativamente carregados ou outras ligações de união covalen-te tal como as ligações de tioéter são adequadas como porções de ligação(vide acima relativo a modalidade 1).
Os aminoácidos preferidos adequados para formar as respecti-vas pontes de conexão foram descritos em conjunto com a primeira modali-dade da presente invenção. Eles são, por exemplo, cisteína, derivados decisteína tal como homocisteína ou selenocisteína ou tiolisina. Eles formampontes de dissulfeto ou, no caso de aminoácidos que contêm selênio, pontesde disseleneto.
Os exemplos adequados para dímeros respectivamente criadossão determinados abaixo:<formula>formula see original document page 56</formula><formula>formula see original document page 57</formula>
De acordo com um outro desenvolvimento ou no terminal de Nou no terminal de C do dímero de peptídeo (e conseqüentemente das res-pectivas unidades de peptídeo monomérico estando localizadas ou no inícioou no final do dímero) compreenda um aminoácido extra, permitindo o aco-plamento de um portador tal como HES. Por conseguinte, o aminoácido in-troduzido carrega uma funcionalidade de acoplamento respectiva tal como,por exemplo, um grupo SH. Um exemplo comum para um tal aminoácido écisteína. Porém, também outros aminoácidos com um grupo funcional quepermite a formação de uma ligação covalente (por exemplo, todos os amino-ácidos negativamente e positivamente carregados) são adequados.
<formula>formula see original document page 57</formula>
As barras sobre os monômeros de peptídeo representam pontesintramoleculares covalentes; neste caso pontes de dissulfeto.
De acordo com um outro desenvolvimento adicional o aminoáci-do no terminal de C e/ou N envolvido na formação da ponte covalente paraconectar as unidades monoméricas a um dímero descreve um grupo carre-gado tal como, por exemplo, o grupo COO" ou o NH3+. Este aspecto leva auma estabilização favorável da estrutura da ponte intermolecular:
<formula>formula see original document page 57</formula>4. Peptídeos bivalentes contínuos
<formula>formula see original document page 58</formula>
O conceito de núcleo desta estratégia se abstém de sintetizar asunidades de peptídeo monoméricas em reações separadas antes de dimeri-zação ou multimerização, porém para sintetizar o peptídeo bi- ou multivalen-te final em uma etapa como um único peptídeo contínuo; por exemplo, emuma reação de fase sólida única. Desse modo, uma etapa de dimerizaçãoou multimerização separada é obsoleta. Este aspecto fornece uma grandevantagem, isto é, o controle completo e independente em cada posição deseqüência na unidade de peptídeo final. O método permite facilmente abrigarpelo menos dois domínios diferentes de ligação específicos de receptor emuma unidade de peptídeo contínua devido ao controle independente em ca-da posição de seqüência.
De acordo com esta modalidade a seqüência do peptídeo finalentre os domínios de ligação (que é a "região ligadora") é composta de ami-noácidos somente, desse modo levando a um peptídeo mimético de EPO bi-ou multivalente único, contínuo. Em uma modalidade preferida da invenção,o referido Iigador de peptídeo é composto de aminoácidos naturais ou não-naturais que permitem uma flexibilidade conformacional elevada. Neste res-peito pode ser vantajoso usar resíduos de glicina como aminoácidos de Iiga-ção, que são conhecidos pela sua flexibilidade elevada em termos de torção.Porém, também outros aminoácidos, tal como alanina ou beta-alanina, ouuma mistura destes, podem ser usados para criar o Iigador de peptídeo. Onúmero e escolha de aminoácidos usados dependem dos fatos estéricosrespectivos. Esta modalidade da invenção permite o desígnio feito sob en-comenda de um Iigador adequado por modelagem molecular para evitar dis-torções da conformação de bioativo. Um Iigador composto de 3 a 5 aminoá-cidos é especialmente preferido.É notável que o ligador entre os domínios funcionais (ou unida-des monoméricas) dos peptídeos bivalente ou multivalente finais podem serou uma parte distinta do peptídeo ou podem ser compostos - completamenteou em parte - de aminoácidos que são parte dos domínios funcionais mono-méricos. Por exemplo, os aminoácidos flexíveis pequenos no começo domonômero de peptídeo (por exemplo, posições Χ1 e X2) e no final do monô-mero de peptídeo (por exemplo, posições X19 e X20) são preferidos para for-mar um ligador flexível e no caso de um peptídeo bivalente contínuo. Os a-minoácidos preferidos nestas posições são, por exemplo, resíduos de beta-alanina ou glicina. Os exemplos são determinados com Seq. 11 a 14. Dessemodo o termo "ligador" é desse modo de preferência definido funcionalmentedo que estruturalmente, uma vez que um aminoácido poderia formar parteda unidade Iigadora como também das subunidades monoméricas.
Uma vez que - como mencionado acima- durante a síntese dopeptídeo bivalente/multivalente cada posição de seqüência no peptídeo finalestá sob controle e desse modo pode ser precisamente determinado é pos-sível a fazer sob encomenda ou de forma adaptada os peptídeos ou regiõesou domínios específicos destes, incluindo o ligador. Isto é de vantagem es-pecífica uma vez que permite a evitação de distorção da conformação bioati-va do peptídeo bivalente final devido às interações intramoleculares desfavo-ráveis. O risco de distorções pode ser avaliado antes de síntese modelagemmolecular. Isto se aplica especialmente ao desígnio do ligador entre os do-mínios monoméricos.
Os peptídeos bivalentes/multivalentes contínuos que têm umligador de peptídeo para dimerização mostram atividade muito mais elevadaentão os peptídeos monoméricos correspondentes e desse modo confirmama observação conhecida de outros peptídeos diméricos que um aumento deeficácia está associado com os conceitos de peptídeo bivalentes.
Os peptídeos bivalentes/multivalentes contínuos podem ser mo-dificados por, por exemplo, acetilação ou amidação ou ser alongados nasposições de terminal de C ou de terminal de N. As modificações da técnicaanterior para os peptídeos monoméricos (monômeros) mencionados acimaincluindo as ligações das porções solúveis, tal como PEG1 amidos ou dex-tranas também são aplicáveis para os peptídeos multi - ou bivalentes de a-cordo com a invenção.
Todas as possíveis modificações também se aplicam para modi-ficar o ligador. Em particular poderia ser vantajoso prender as porções depolímero solúvel ao ligador tal como, por exemplo, PEG, amido ou dextranas.
A síntese do peptídeo multi- ou bivalente final de acordo com ainvenção pode incluir favoravelmente também duas formações subseqüen-tes e independentes de ligações de dissulfeto ou outras ligações intramole-culares dentro de cada dos domínios de ligação. Desse modo os peptídeostambém podem ser ciclizados.
As estruturas bivalentes de acordo com a invenção são favora-velmente formadas na base dos monômeros de peptídeo reportados aqui.
As cadeias laterais reativas dos peptídeos podem servir comoum laço de ligação, por exemplo, para modificações adicionais. Os peptí-deos diméricos também opcionalmente compreendem pontes intramolecula-res entre o primeiro e segundo e/ou terceiro e quarto aminoácido que temuma ponte que forma funcionalidade de cadeia lateral (Xe e Xi5) tal como,por exemplo, as cisteínas.
Os peptídeos podem ser modificados por, por exemplo, acetila-ção ou amidação ou podem ser alongados nas posições de terminal de C oude terminal de Ν. A extensão com um ou mais aminoácidos em uma das du-as terminações (N ou C), por exemplo, para preparação de um sítio de Iiga-ção para um polímero freqüentemente leva a uma unidade de peptídeo biva-lente heterodimérica que pode ser fabricada melhor como um peptídeo contínuo.
Vários aminoácidos reativos são conhecidos no estado da técni-ca para acoplar os portadores à proteína e peptídeos. Um aminoácido deacoplamento preferido é cisteína que pode ser ou acoplada ao terminal de Nou terminal de C. Porém, a direção de acoplamento pode tornar uma dife-rença considerável e deveria desse modo ser escolhida cuidadosamentepara cada peptídeo. Isto deve ser demonstrado com base do seguinte exemplo:
Usados são os seguintes dois dímeros:
<formula>formula see original document page 61</formula>
1-Nal: 1-NaftiIaIanina
Cys(tBu): L-cisteína protegida por S-terc.-butila
O 41mers AGEM400C6C4 e AGEM40C6C4 possuem a mesmaseqüência núcleo. Os aminoácidos 1-40 de AGEM40C6C4 se igualam aosaminoácidos 2-41 de AGEM40C6C4. A única diferença é a posição da ciste-ína protegida por tBu. Este aminoácido não está envolvido na interação defármaco receptor, porém é destinado para funcionar como o grupo unindopara um portador polímero no conjugado final. No caso de AGEM400C6C4 acisteína protegida por tBu é presa ao terminal de C, no caso de A-GEM40C6C4 é presa ao terminal de N. As barras de conexão representampontes de cisteína.
Há duas vantagens de AGEM400C6C4 sobre AGEM40C6C4.A primeira vantagem é sua acessibilidade sintética. A-GEM400C6C4 pode ser isolado em produções totais mais elevadas do queAGEM40C6C4. No caso da síntese da seqüência linear de AGEM40C6C4um CIZ-22mer (CIZ-RGGGTYSCHFGKLT-1 NaI-VCKKQRG NH2, CIZ: grupo2-Clorobenziloxicarbonila) é observado como um subproduto. Durante a puri-ficação da seqüência linear com cromatografia líquida de fase revertida dealta pressão (RP-HPLC) exibe um comportamento cromatográfico similarcomo o precursor linear de AGEM40C6C4 e então torna difícil ser separadodele levando a uma perda na produção total do produto desejado. No casode AGEM400C6C4 nenhum composto análogo é encontrado.
A segunda vantagem de AGEM400C6C4 sobre AGEM40C6C4consiste na implementação mais fácil de uma análise do conjugado final dopeptídeo desprotegido com um portador polimérico. Uma estratégia para aanálise de um conjugado de peptídeo é a degradação seletiva do conjugadopor clivagem com endoproteases. Idealmente o peptídeo inteiro é liberadodo portador polimérico durante a hidrólise enzimática. Estes fragmentos depeptídeo podem ser identificados e podem ser quantificados através de téc-nicas analíticas padrões como isto é, HPLC com detecção UV ou MS, etc.
Fragmentos que são liberados e podem ser detectados por aná-lises freqüentes são marcados em cinza.
No caso de AGEM400C6C4 a clivagem pode ser afetada comtripsina-uma endoprotease que é conhecida por clivar altamente seletiva-mente as ligações de peptídeo que consistem em terminal de C da argininae lisina de aminoácidos carregados (F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg.), "Bioa-nalytik", Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg1 Berlin, 1998). Aplicadoaos conjugados de AGEM400C6C4 isto fixará fragmentos livres que cobrem38 de 41 aminoácidos do peptídeo original ligado à molécula portadora. Nocaso de fragmentos de AGEM40C6C4 de somente 21 de 41 aminoácidosserem liberados pela digestão tríptica:
<formula>formula see original document page 62</formula>
Como a análise de um Ingrediente Farmacêutico Ativo é um as-sunto fundamental durante seu desenvolvimento AGEM400C6C4 tem umavantagem clara sobre AGEM40C6C4.
Desse modo no caso de um aminoácido positivamente carrega-do estar localizado nas respectivas posições, é altamente preferido incorpo-rar o aminoácido de ligação (aqui cisteína) no terminal de C porque é possí-vel gerar um fragmento de peptídeo quase completo, uma vez que um sítiode clivagem é devido à arginina na posição Xi9 do monômero bastante pre-ciso antes do polímero.
Os compostos da presente invenção podem vantajosamente serusados para a preparação de composições farmacêuticas veterinárias e/ouhumanas. Eles são, desse modo, adequados para uso na terapia humana eveterinária. Como miméticos de EPO eles descrevem basicamente o mesmopadrão de atividade qualitativa como eritropoietina. Eles são desse modo,geralmente adequados para as mesmas indicações como eritropoietina.
A eritropoietina é um membro da superfamília de citocina. Alémdos efeitos estimulantes descritos na introdução, descobriu-se que a eritro-poietina estimula as células troncas. Os miméticos de EPO descritos aquisão, desse modo, adequados para todas as indicações causadas por efeitosassociados à célula tronca. Os exemplos não Iimitantes são o tratamentoe/ou prevenção de doenças associadas com o sistema nervoso. Os exem-plos são lesões, doenças ou distúrbios neurológicos, tal como, por exemplo,Parkinsonismo, a doença de Alzheimer, coréia de Huntington, esclerose múl-tipla, esclerose lateral amiotrófica, doença de Gaucher, doença de Tay-Sachs, uma neuropatia, lesão de nervo periférico, um tumor cerebral, umalesão da medula espinhal, ou uma lesão de acidente vascular cerebral. Ospeptídeos miméticos de EPO de acordo com a invenção também são utilizá-veis para o tratamento preventivo e/ou curativo de pacientes que sofrem, ouestão em risco de sofrer de insuficiência cardíaca. Os exemplos são infartocardíaco, doença de artéria coronária, miocardite, tratamento de quimiotera-pia, alcoolismo, cardiomiopatia, hipertensão, doenças cardíacas valvares,incluindo insuficiência mitral ou estenose aórtica, e distúrbios da glândulatiróide, síndrome coronária aguda e/ou crônica.
Além disso, os miméticos de EPO podem ser usados para esti-mulação da mobilização, proliferação e diferenciação fisiológica de célulasprecursoras endoteliais, para estimulação de vasculogênese, para o trata-mento de doenças relacionadas a uma disfunção de células precursoras en-doteliais e para a produção de composições farmacêuticas para o tratamentode tais doenças e composições farmacêuticas compreendendo os referidospeptídeos e outros agentes adequados para a estimulação de células pre-cursoras endoteliais. Os exemplos de tais doenças são hipercolesterolemia,diabete melito, doenças de inflamação crônica mediada por endotel, endote-Iiose incluindo retículo-endoteliose, aterosclerose, doença cardíaca coroná-ria, isquemia miocárdica, angina pectoris, doenças cardiovasculares relacio-nadas com a idade, doença de Raynaud, gravidez induzida por hipertonia,insuficiência renal crônica ou aguda, insuficiência cardíaca, cura de ferida edoenças secundárias.
Além disso, os peptídeos de acordo com a invenção são os por-tadores adequados por liberar os agentes através da barreira hematoencefá-Iica e podem ser usados para os respectivos propósitos e/ou para a produ-ção de agentes de conjugação terapêuticos respectivos capazes de passarpela barreira hematoencefálica.
Os peptídeos descritos aqui são especialmente adequados parao tratamento de distúrbios que são caracterizados por uma deficiência deeritropoietina ou uma baixa ou defeituosa população de hemácias e especi-almente para o tratamento de qualquer tipo de anemia ou acidente vascularcerebral. Os peptídeos também são adequados para aumentar e/ou mantero hematócrito em um mamífero. Tais composições farmacêuticas podemopcionalmente compreender os portadores farmaceuticamente aceitáveispara adotar a composição para o procedimento de administração pretendido.
Os métodos de liberação adequados como também os portadores e aditivossão descritos, por exemplo, em WO 2004/101611 e WO 2004/100997.
Como descrito acima, a dimerização dos peptídeos monoméri-cos para dímeros ou mesmo multímeros normalmente melhora a atividadeagonista mimética de EPO comparada aos respectivos peptídeos monoméri-cos. Porém, é desejável para adicionalmente realçar a atividade. Por exem-pio, mesmo os peptídeos miméticos de EPO diméricos são menos potentesdo que o EPO relativo à ativação dos mecanismos celulares.
Várias abordagens foram feitas na técnica anterior para aumen-tar a atividade dos peptídeos, por exemplo por variação da seqüência deaminoácido para identificar os candidatos mais potentes. Porém, até agora éainda também desejável realçar a atividade de peptídeos, especialmente depeptídeos miméticos de EPO para melhorar a atividade biológica.
Uma modalidade adicional da presente invenção fornece umasolução para este problema. Aqui um composto é fornecido o qual liga asmoléculas alvo e compreende
i) pelo menos duas unidades de peptídeo em que cada unidadede peptídeo compreende pelo menos dois domínios com uma capacidade deligação ao alvo;
ii) pelo menos uma unidade portadora polimérica;
em que as referidas unidades de peptídeo são ligadas a referida unidadeportadora polimérica.
Surpreendentemente, descobriu-se que a combinação de doisou mais peptídeos bi- ou multivalentes de acordo com a invenção em umsuporte polimérico está grandemente aumentando a eficácia dos peptídeosbivalentes (ou mesmo multivalentes) para o seu receptor de ligação não sóaditivamente, porém até mesmo além de aditivamente. Desse modo um efei-to sinérgico é observado.
O termo "bivalente" como usado para o propósito da presenteinvenção é definido como um peptídeo que compreende dois domínios comuma capacidade de ligação a um alvo, aqui em particular o receptor de EPO.É alternadamente usado com o termo "dimérico". Conseqüentemente, umpeptídeo mimético de EPO "multivalente" ou "multimérico" tem vários domí-nios de ligação respectivos para o receptor de EPO. É auto-evidente que ostermos "peptídeo" e "unidade de peptídeo" não incorporam nenhuma restri-ção relativa ao tamanho, e incorpora oligo - e polipeptídeos como tambémproteínas.
Os compostos que compreendem duas ou mais unidades depeptídeo bi - ou multivalente presos a uma unidade portadora polimérica sãonomeados "supravalentes" no contexto desta modalidade. Estas moléculassupravalentes grandemente diferem das moléculas diméricas ou multiméri-cas conhecidas no estado da técnica. O estado da técnica combina peptí-deos miméticos de EPO meramente monoméricos para criar um dímero. Emcontraste as moléculas supravalentes são geradas conectando-se unidadesde peptídeo já bivalentes (pelo menos) a uma unidade portadora poliméricadesse modo criando uma molécula supravalente (os exemplos são determi-nados em figuras). Desse modo eficácia e atividade global dos peptídeossão grandemente realçadas diminuindo-se a dose de EC50.
Até agora as razões para a grande potência das moléculas su-pravalentes comparadas às moléculas conhecidas no estado da técnica nãosão entendidas completamente. Poderia ser devido ao fato que as moléculasdiméricas conhecidas no estado da técnica fornecem meramente uma uni-dade alvo de ligação de receptor respectivamente por dímero. Desse modosomente um complexo de receptor é gerado ao ligar o composto diméricodesse modo induzindo somente um processo de transdução de sinal. Porexemplo, dois peptídeos miméticos de EPO monoméricos são conectadospor PEG para formar um dímero de peptídeo desse modo facilitando a dime-rização dos monômeros de receptor necessários para transdução de sinal(Johnson e outros, 1997). Em contraste, os compostos supravalentes, deacordo com a invenção compreendem várias unidades de ligação de recep-tor respectivas já di - ou multiméricas. Isto poderia permitir a geração de vá-rios complexos de receptor na superfície da célula por molécula do compos-to desse modo induzindo várias transduções notáveis, e desse modo poten-cializando a atividade das unidades de peptídeo superaditivamente. A liga-ção dos compostos supravalentes poderia resultar em um agrupamento decomplexos de receptor na superfície da célula.
As que unidades de peptídeo miméticas de EPO usadas nestamodalidade podem ser homo- ou heterogênicas, significando que as unida-des de peptídeo idênticas ou diferentes são usadas. O mesmo se aplica aosdomínios de ligação (peptídeos monoméricos como descrito acima) das uni-dades de peptídeo que também podem ser homo- ou heterogênicas. As uni-dades de peptídeo bi- ou multivalente ligadas à unidade portadora se ligamao mesmo alvo receptor. Porém, elas podem de fato ainda diferir em suaseqüência de aminoácido. Os domínios de ligação monoméricos das unida-des de peptídeo bi - ou multivalentes podem ser lineares ou cíclicas. Umamolécula cíclica pode ser criada, por exemplo, pela formação de pontes decisteína intramolecular (vide acima).
A unidade portadora polimérica compreende pelo menos um po-límero natural ou sintético ramificado, linear ou dendrítico. A unidade porta-dora polimérica é preferivelmente solúvel em água e fluidos corpóreos e épreferivelmente um polímero farmaceuticamente aceitável. As porções depolímero solúveis em água incluem, porém não estão limitadas a, por exem-pio, polialquileno glicol e derivados destes, incluindo PEG, homopolímerosde PEG, mPEG, homopolímeros de polipropilenoglicol, copolímeros de etile-no glicol com propileno glicol, em que os referidos homopolímeros e copolí-meros são não-substituídos ou substituídos em uma extremidade, por exem-plo, com um grupo acila; poliglicerinas ou ácido polisiálico; celulose e deriva-dos de celulose, incluindo metilcelulose e carboximetilcelulose; amido (porexemplo, amido de hidroxialquila (HAS), especialmente amido de hidroxietila(HES) e dextrinas, e derivados destes; dextrana e derivados de dextrana,incluindo dextransulfat, dextrina reticulada, e dextrina de carboximetila; qui-tosana (um polissacarídeo linear) heparina e fragmentos de heparina; álcoolde polivinila e éteres de etila de polivinila; polivinilpirrolidona; alfa,beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida; e polióis polioxietilados. Um exemplo deuma unidade portadora é um polímero homobifuncional de, por exemplo,polietileno glicol (bis-maleimida, bis-carbóxi, bis-amino etc.).
A unidade portadora polimérica que é acoplada a pelo menosdois peptídeos miméticos de EPO diméricos que compreende seqüências deconsenso monoméricas de acordo com a presente invenção pode ter umaampla faixa de peso molecular devido à natureza diferente dos polímerosdiferentes que são adequados juntos com a presente invenção. Não há des-se modo nenhuma restrição de tamanho. Porém, é preferido que o peso mo·Lecular seja pelo menos 3 kD, preferivelmente pelo menos 10kD e aproxima-damente ao redor 20 a 500 kD e mais preferivelmente ao redor 30 a 150 ouao redor 60 ou 80 kD. O tamanho da unidade portadora depende do políme-ro escolhido e pode desse modo variar. Por exemplo, especialmente quandoos amidos tal como hidroxietilamido são usados, o peso molecular poderiaser consideravelmente mais alto. O peso molecular médio poderia então es-tar disposto ao redor 100 a 4.000 kD ou até mesmo poderia ser mais alto.Porém, é preferido que o peso molecular da molécula de HES consista emredor de 50 a 500 kD, ou 100 a 300kD e preferivelmente ao redor 200kD. Otamanho da unidade portadora é preferivelmente escolhido tal que cada uni-dade de peptídeo fique idealmente disposta para ligar suas respectivas mo-léculas receptoras.
Para facilitar isto, uma modalidade da presente invenção usauma unidade portadora que compreende uma unidade de ramificação. Deacordo com esta modalidade, os polímeros, como ,por exemplo, PEG, sãopresos a uma unidade de ramificação que resulta desse modo em uma mo-lécula receptora grande que permite a incorporação de numerosas unidadesde peptídeo. Os exemplos para unidades de ramificação apropriadas sãoglicerol ou poliglicerol. Também as unidades de ramificação dendríticas po-dem ser usadas, por exemplo, como ensinado por Haag 2000, aqui incorpo-rado por referência. Também o portador de HES pode ser usado em umaforma ramificada. Isto, por exemplo, se for obtido para uma proporção eleva-da de amilopectina.
Preferivelmente, após as unidades de peptídeo serem criadascombinando-se as unidades de ligação monoméricas para unidades de pep-tídeo (ou cabeça a cabeça, cabeça a cauda, ou cauda a cauda) a unidadeportadora polimérica é conectada às unidades de peptídeo. A unidade porta-dora polimérica é conectada/acoplada às unidades de peptídeo por uma li-gação covalente ou não-covalente (por exemplo, uma coordenativa). Porémo uso de uma ligação covalente é preferido. A ligação pode ocorrer, por e-xemplo, por um aminoácido reativo das unidades de peptídeo, por exemplo,lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina,treonina, tirosina ou o grupo amino de terminal de N e o ácido carboxílico determinal de C. No caso do peptídeo não-carregar um aminoácido respectivo,um tal aminoácido pode ser introduzido na seqüência de aminoácido. O aco-plamento deveria ser escolhido tal que a ligação ao alvo não seja, ou pelomenos o menos possível impedida. Dependendo da conformação da unida-de de peptídeo, o aminoácido reativo está no princípio, no final ou dentro daseqüência de peptídeo.
No caso da unidade portadora polimérica não possuir um grupode acoplamento apropriado, vários substâncias/ligadores de acoplamentopodem ser usados para adequadamente modificar o polímero para que elepossa reagir com pelo menos um grupo reativo na unidade de peptídeo paraformar o composto supravalente. Os grupos químicos adequados que po-dem ser usados para modificar o polímero são por exemplo como segue:
Os grupos de acilação que reagem com os grupos aminos daproteína, por exemplo, grupos anidrido ácido, grupo N-acilimidazol, grupoazida, grupo anidrido de N-carbóxi, grupo diceteno, grupo pirocarbonato dedialquila, grupo imidoéter, e grupos carboxila ativados por carbodiimida. To-dos os grupos acima são conhecidos para reagir com grupos aminos emproteínas/peptídeos para formar ligações covalentes, envolvendo acila ouligações similares;
grupos de alquilação que reagem com grupos sulfidrila (mercap-to), tiometila, imidazo ou aminos na unidade de peptídeo, tal como gruposhalo-carboxila, grupo maleimida, grupos vinila ativados, grupos etilenimina,grupos haleto de arila, grupos brometo de 5-nitro-benzila de 2-hidróxi; e gru-pos cetonas e aldeído alifático junto com agentes de redução, reagindo como grupo amino do peptídeo;
grupos de formação de amida e éster que reagem com um grupocarboxila do peptídeo, tal como grupos diazocarboxilato, e grupos carbodii-mida e amina juntos;
grupos de formação de dissulfeto que reagem com òs grupos desulfidrila na proteína, tal como grupos 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoato), gruposdissulfeto de orto-piridila e alquilmercaptan (que reagem com os grupos sul-fidrila da proteína na presença de agentes oxidantes tal como iodo);
grupos dicarbonila, tal como grupos de cicloexandiona, e outrosgrupos 1,2-dicetona que reagem com as porções de guanidina do peptídeo;
grupos diazo que reagem com grupos fenólicos no peptídeo;
grupos reativos de reação de brometo cianogênios com o polissacarídeo,que reage com grupos aminos no peptídeo.
Desse modo em resumo, o composto de acordo com a invençãopode ser feito -opcionalmente- modificando-se quimicamente primeiro o por-tador polimérico para produzir um portador polimérico que tem pelo menosum grupo químico nele que é capaz de reagir com um grupo químico dispo-nível ou introduzido na unidade de peptídeo, e então reagindo junto o -opcionalmente- polímero modificado e a unidade de peptídeo para formar um complexo covalentemente ligado deste utilizando o grupo químico do -senecessário - polímero modificado.
No caso do acoplamento ocorrer por um grupo SH livre do pep-tídeo (por exemplo, de um grupo de cisteína), o uso de um grupo de malei-mida no polímero é preferido.
Para gerar uma molécula definida é preferido usar uma aborda-gem alvejada para prender as unidades de peptídeo à unidade portadorapolimérica. No caso de nenhum aminoácido apropriado está presente nosítio de ligação desejado, aminoácidos apropriados podem ser incorporadosna unidade de peptídeo mimética de EPO dimérica. Para ligação de políme-ro específica de sítio um grupo reativo único, por exemplo, um aminoácidoespecífico na terminação da unidade de peptídeo é preferido para evitar rea-ções de acoplamento descontroladas ao longo do peptídeo a uma misturaheterogênea que compreende uma população de várias moléculas poliméri-cas diferentes.
O acoplamento das unidades de peptídeo à unidade portadorapolimérica, por exemplo, PEG ou HES, é realizado usando reações princi-palmente conhecidas por aquelas pessoas versadas na técnica. Por exem-plo há vários métodos de ligação de PEG e HES disponíveis para aquelesversados na técnica (vide, por exemplo, WO 2004/100997 que dá referên-cias adicionais, Roberts e outros, 2002; US 4.064.118; EP 1 398 322; EP 1398 327; EP 1 398 328; WO 2004/024761; todos aqui incorporados por refe-rência).
É importante entender que o conceito de supravalência descritoaqui é diferente do conceito conhecido de PEGilação ou HESilação. No es-tado da técnica, por exemplo, PEGilação é somente usado para produzir oudímeros de peptídeo ou para melhorar os parâmetros farmacocinéticosprendendo-se uma ou mais unidades de PEG a um peptídeo. Porém, comodescrito acima, a ligação de duas ou mais unidades de peptídeo pelo menosbivalentes a, por exemplo, PEG ou HES como uma unidade portadora poli-mérica também grandemente realça a eficácia (desse modo diminuindo adose de EC50). O conceito desta invenção desse modo tem efeitos fortesem parâmetros farmacodinâmicos e não somente em parâmetros farmacoci-néticos como é o caso com os conceitos de PEGilação ou HESilação conhe-cidos no estado da técnica. Porém, de fato a incorporação de, por exemplo,PEG ou HES como unidade portadora polimérica tem também as vantagensconhecidas relativo a farmacocinética:
A PEGilação normalmente é entendida melhorar as proprieda-des biofarmacêuticas dos peptídeos. As alterações mais relevantes da molé-cula de proteína seguinte à conjugação de PEG são amplificação de tama-nho, mascaramento da função de glicosilação e superfície de proteína, modi-ficação de carga e proteção de epítopo. Em particular, a amplificação de ta-manho reduz a velocidade de ultrafiltração de rim e promove o acúmulo emtecidos permeáveis pelo mecanismo de permeação e retenção de realcepassivo. A proteção de proteína reduz proteólise e reconhecimento de sis-tema imune, que são rotinas importantes de eliminação. O efeito específicode PEGilação em fisicoquímica de proteína e propriedades biológicas sãoestritamente determinadas por propriedades de proteína e polímero comotambém pela estratégia de PEGilação adotada.
Porém, o uso de PEG ou outros polímeros não-biodegradáveispoderia levar a novos problemas.
Durante aplicações in vivo, intervalos de dosagem em um ajusteclínico são ativados por perda de efeito do fármaco. As dosagens rotineiras eintervalos de dosagem são adaptados tal que o efeito não seja perdido du-rante intervalos de dosagem. Devido ao fato que os peptídeos presos a umaunidade de polímero não-biodegradável, grande (por exemplo, uma porçãode PEG) podem ser degradados mais rapidamente do que a molécula desuporte poderia ser eliminada pelo corpo, um risco de acúmulo da unidadeportadora pode surgir. Um tal risco de acúmulo sempre ocorre como efeito-tempo de meia vida do fármaco é mais curto do que o tempo de meia vidade eliminação do fármaco propriamente ou um de seus componen-tes/metabólitos. Desse modo, o acúmulo da molécula receptora deveria serevitado especialmente em tratamentos a longo prazo porque os peptídeossão normalmente PEGiIados com porções de PEG muito grandes (-20-40kD) que desse modo mostram uma eliminação renal lenta. A própria por-ção de peptídeo passa por degradação enzimática e até mesmo clivagemparcial poderia bastar para desativar o peptídeo.
Para achar uma solução para este problema potencial uma mo-dalidade da presente invenção ensina o uso de uma unidade portadora poli-mérica que é composta de pelo menos duas subunidades. As subunidadespoliméricas são conectadas por estruturas Iigadoras covalentes biodegradá-veis. De acordo com esta modalidade o peso molecular da molécula porta-dora grande (por exemplo, 40 kD) é criado por várias subunidades de tama-nho pequeno ou intermediário (por exemplo, cada subunidade tendo um pe-so molecular de 5 a 10kD), que são conectadas por Iigadores biodegradá-veis. Os pesos moleculares das subunidades modulares combinam dessemodo gerando o peso molecular desejado da molécula receptora. Porém, asestruturas Iigadoras biodegradáveis podem ser separadas no corpo dessemodo liberando as subunidades de portador menor (por exemplo, 5 a 10kD).
As Subunidades portadoras pequenas mostram uma liberação renal melhordo que uma molécula de polímero que tem o peso molecular global (por e-xemplo, 40kD). Um exemplo de ilustração é dado na Figura 16.
As estruturas Iigadoras são selecionadas de acordo com propri-edades de degradação conhecidas e escalas de tempo de degradação emfluidos corpóreos. Por exemplo, as estruturas quebráveis podem conter gru-pos cliváveis como derivados de ácido carboxílico como ligações ou ésteresde amida/peptídeo que podem ser clivados através de hidrólise (vide, porexemplo, Roberts, 2002 aqui incorporado por referência). Os ésteres de su-cinimidila de PEG também podem ser sintetizados com várias ligações deéster na cadeia principal de PEG para controlar a taxa de degradação em pHfisiológico (Zhao, 1997, incorporado aqui por referência). Outras estruturasquebráveis como dissulfetos de uretanos de benzila podem ser clivadas emambientes de redução moderados, tal como em compartimentos endossômi-cos de uma célula (Zalipsky, 1999) e são desse modo também adequadas.Outros critérios para seleção de Iigadores apropriados é a seleção para de-gradação rápida (freqüentemente enzimática) ou degradação lenta (freqüen-temente decomposição não-enzimática). A combinação destes dois meca-nismos em fluidos corpóreos também é possível. Está claro que este concei-to altamente vantajoso não está limitado às unidades de peptídeo específi-cas descritas ou referidas aqui, porém, também se aplica às outras molécu-las farmacêuticas que são presas às unidades de polímero grandes tal comomoléculas de PEG em que os mesmos problemas de acúmulo surgem.
De acordo com uma modalidade, o hidroxialquilamido e preferi-velmente HES são usados como unidade portadora polimérica. HES temvárias vantagens importantes. Em primeiro lugar, HES é biodegradável. A-lém disso, a biodegradabilidade de HES pode ser controlada pela relação degrupos hidroxietila e pode desse modo ser influenciada. Um grau molar desubstituição de 0,4-0,8 (em média 40 -80% das unidades de glicose contêmum grupo hidroxietila) é bem adequado para os propósitos da presente in-venção. Devido a biodegradabilidade, os problemas de acúmulo como des-crito acima junto com PEG normalmente não ocorrem. Além disso, HES foiusado por muito tempo em tratamento médico, por exemplo, em forma deum dilatador de plasma. Sua inocuosidade é desse modo aprovada.
Além disso, os derivados de produtos de hidrólise de HES sãodetectáveis através de cromatografia de gás. Os conjugados de peptídeo deHES podem ser hidrolisados sob condições sob as quais as unidades depeptídeo ainda são estáveis. Isto permite a quantificação e monitoramentodos produtos de degradação e permite avaliações e padronizações dos pep-tídeos ativos.
De acordo com uma outra modalidade um primeiro tipo de uni-dade portadora polimérica é usado e carregado com unidades de peptídeo.Este primeiro portador é preferivelmente facilmente biodegradável como é,por exemplo, HES. Porém, nem todos os pontos de ligação do primeiro por-tador estão ocupados com unidades de peptídeo, porém somente, por e-xemplo, ao redor 20 a 50%. Dependendo do tamanho do polímero usado,várias centenas de unidades de peptídeo geralmente poderiam ser acopla-das à molécula receptora. Porém, normalmente menos unidades de peptí-deo são usadas, tal como 2 a 50 ou 2 a 20. 2 a 15, 2 a 10, 2 a 8 e 3 a 6 pep-tídeos são preferidos para peptídeos miméticos de EPO. O resto (ou pelomenos alguns) dos pontos de ligação restantes do primeiro portador estáocupado com um portador diferente, por exemplo, unidades de PEG peque-nas que têm um peso molecular mais baixo do que o primeiro portador. Estamodalidade tem a vantagem que uma composição supravalente é criadadevido ao primeiro portador que é, porém, muito durável devido à presençado segundo portador que é constituído preferivelmente por unidades de PEGde 3 a 5 ou 10kD. Porém, a entidade inteira é muito bem degradável, umavez que o primeiro portador (por exemplo, HES) e as unidades de peptídeosão biodegradáveis e o segundo portador, por exemplo, PEG é pequeno obastante para ser facilmente depurado do corpo.
Os monômeros que constituem os domínios de ligação das uni-dades de peptídeo reconhecem o receptor de eritropoietina homodimérico. Apropriedade posterior de ser um receptor homodimérico diferencia o receptorde EPO de muitos outros receptores de citocina. As unidades de peptídeocompreendendo pelo menos dois domínios de ligação monoméricos miméti-cos de EPO como descrito acima se ligam ao receptor de EPO e preferivel-mente são capazes de di - respectivamente multimerisar seu alvo e/ou esta-bilizá-lo conseqüentemente criando desse modo uma transdução de sinalque induz o complexo.
A presente invenção também compreende métodos de produçãode composto respectivos, em que as unidades de peptídeo são conectadasàs respectivas unidades portadoras. A presente invenção também compre-ende respectivos métodos de produção de composto, em que as unidadesde peptídeo são conectadas às respectivas unidades portadoras poliméricas.
Os compostos da presente invenção podem ser vantajosamente usados pa-ra a preparação de composições farmacêuticas veterinárias e/ou humanas.Eles podem ser especialmente adequados para o tratamento de distúrbiosque são caracterizados por uma deficiência de eritropoietina ou uma baixaou defeituosa população de hemácia e especialmente para o tratamento dequalquer tipo de anemia e acidente vascular cerebral. Eles também são utili-záveis para todas as indicações descritas acima. Tais composições farma-cêuticas podem opcionalmente compreender os portadores farmacêuticosaceitáveis para adotar a composição para o procedimento de administraçãopretendido. Os métodos de liberação adequados como também os portado-res e aditivos são descritos, por exemplo, em WO 2004/100997 eWO 2004/101611, aqui incorporados por referência.
EXEMPLOS
O conceito das moléculas supravalentes será explicado por meiode exemplos. Figura 1 mostra um exemplo de uma molécula supravalentesimples de acordo com a invenção. Dois peptídeos bivalentes contínuos sãoconectados terminalmente de N por uma porção de PEG bifuncional que car-rega grupos de maleimida. A cisteína foi escolhida como sítio de ligação rea-tivo para a unidade portadora de PEG.
Porém, as moléculas supravalentes podem compreender maisde duas unidades de peptídeo bi- ou multivalentes contínuas. Figura 2 de-termina um exemplo que é com base em uma unidade portadora com umaunidade de glicerol central como unidade de ramificação e compreendendotrês peptídeos bivalentes contínuos. Novamente a cisteína foi usada paraligação. Figura 3 mostra um exemplo que usa HES como unidade portadorapolimérica. HES foi modificado tal que carrega grupos maleimida reagindocom os grupos SH das unidades de peptídeo. De acordo com o exemplo,todos os sítios de ligação são ligados às unidades de peptídeo (aqui 4). Po-rém, também as unidades de PEG pequenas (por exemplo, 3 a 10 kD) pode-riam ocupar pelo menos alguns dos sítios de ligação.
Como explicado acima, o conceito de supravalente também po-de ser estendido aos polímeros dendríticos polivalentes em que uma unida-de portadora dendrítica e/ou polimérica é conectada a um número maior depeptídeos bivalentes contínuos. Por exemplo, a unidade de ramificação den-drítica pode ser com base em poliglicerol (por favor, referir-se a Haag 2000,aqui incorporado por referência).
Um exemplo para uma molécula supravalente com base em umaunidade portadora com uma unidade de ramificação dendrítica que contémseis peptídeos bivalentes contínuos é mostrado na Figura 4.
Outros exemplos de moléculas supravalentes compreendem u-nidades portadoras com amidos ou dextranas, que são oxidadas usando, porexemplo, ácido periódico para abrigar um grande número de funções de al-deído. Em uma segunda etapa, muitos peptídeos bivalentes são presos àunidade portadora e juntos formam a molécula final. Por favor notar que atémesmo várias centenas (por exemplo 50 a 1000, preferivelmente 150 a 800,mais preferivelmente 250 a 700) de unidades de peptídeo podem ser aco-pladas à molécula portadora que é, por exemplo, HES. Porém, também mui-to menos unidades de peptídeo podem ser ligadas à molécula de HES comoé mostrado nas Figuras, especialmente se os peptídeos miméticos de EPOsão acoplados. O número médio de unidades de peptídeo a serem acopla-das pode ser escolhido de cerca de 2 a 1000, 2 a 500, 2 a 100, 2 a 50, prefe-rivelmente 2 a 20 e preferivelmente 2 a 10, dependendo do peptídeo e doreceptor(s) a ser ligado.
Figura 5 demonstra o conceito de uma molécula supravalentebiodegradável simples. Dois peptídeos bivalentes contínuos são terminal-mente de N conectados através de duas porções de PEG bifuncionais queestão conectadas por um Iigador biodegradável que tem uma posição declivagem intermediária. Os Iigadores permitem a quebra da unidade de PEGgrande nas subunidades desse modo facilitando a depuração renal.
As vantagens ligadas ao efeito de supravalência foram muitosurpreendentes e inesperadas. Inicialmente foi temido, que a conjugaçãopara uma macromolécula poderia reduzir a eficácia. Esta expectativa foi combase nas desvantagens assumidas na taxa de ligação devido às taxas dedifusão reduzidas com moléculas maiores. Outra expectativa foi, que dosvários APIs peptídeo ligados a um portador nem todos seriam capazes de seligar potencialmente ao receptor devido a problemas estéricos de ligaçãosimultânea ou porque o número de receptores, que pode ser alcançado pe-Ias extensões do portador macromolecular, é limitado e possivelmente abai-xo do número de APIs de peptídeo. Desse modo, um aumento de potênciado API de peptídeo (Ingrediente Farmacêutico Ativo) como é visto com oconceito de supravalência da presente invenção não foi esperado.
Por outro lado, devido às mudanças farmacocinéticas significan-tes um portador macromolecular pode introduzir a potência in vivo que podeter sido melhorada devido ao tempo de meia vida mais longo do complexode Peptídeo/Portador. Este fenômeno também tem o efeito que um efeito desupravalência é difícil de determinar in vivo, uma vez que é uma entidadefarmacodinâmica, que tem que ser determinada separadamente. Os ensaiosin vitro somente desse modo não são suficientes, porém poderiam ser o úni-co modo útil de demonstrar o efeito de supravalência claramente.
O efeito de supravaleência como descrito nesta invenção podeser demonstrado por comparação de quantidades molares de API de peptí-deo (conjugado para um portador vs. não conjugado).
Uma experiência foi realizada em um ensaio de célula TF-1 pa-drão como recomendado pelo European Pharmacopoe para a determinaçãode atividade tipo EPO in vitro (por favor, também vide abaixo). Basicamente,as células de TF-1 (sua proliferação sendo dependente da presença de ati-vidade tipo EPO) são cultivadas na presença de várias concentrações deEPO ou substâncias miméticas de EPO. Os números de célula resultantessão quantificados usando ensaio de MTT colorimétrico e medições fotomé-tricas. Com base nestes dados, é possível determinar relações de dose-resposta normalizadas para cada determinada substância.
Neste ensaio EPO e o peptídeo AGEM40 (vide abaixo), o últimosendo um peptídeo bivalente contínuo com atividade mimética de EPO, fo-ram usados.
AGEM40 era usado como peptídeo não-conjugado e como pep-tídeo conjugado para portador macromolecular (neste caso hidroxietilamidodo peso molecular médio de 130kD). O Tamanho do Bloco de Construçãodeste conjugado é asperamente 40kD, que significa que a molécula de HESmédia carrega cerca de 2-5, preferivelmente 2 a 4 porções de peptídeo.Também um HES 200/0,5 pode ser usado. Após a modificação do HES de130kD aproximadamente 4 peptídeos foram conjugados. Quando um HESque tem um peso molecular de 200 kD foi usado, esta quantidade se apro-ximou de 5 unidades de peptídeo conjugados para o HES.
A comparação mostrada na Figura 6 é com base na comparaçãomolar de concentração de peptídeo, se ou não o peptídeo é conjugado. Emcontraste com as expectativas, a potência está aumentando (EC50 está di-minuindo e a curva de resposta de dose está situada à esquerda do peptí-deo não-conjugado) desse modo demonstrando uma influência farmacodi-nâmica positiva de conjugação oligovalente para um portador macromolecular.
Desse modo -independente das melhoras farmacocinéticas es-peradas o conceito de conjugação de acordo com a invenção claramenteaumenta a potência do ingrediente farmacêutico ativo global.
Este é um mecanismo novo que pode certamente ser usado pa-ra peptídeos dirigindo-se ao receptor de EPO, porém potencialmente tam-bém para outros alvos farmacológicos ligados a membrana, especialmenteoutros receptores de citocina tal como aqueles para trombopoietina, G-CSF,interleucinas, e outros.
I. Síntese de peptídeo de monômeros
Síntese manual
A síntese é realizada pelo uso de um sistema de microondaDescubridor (CEM) usando PL-Rink-Amida-Resina (taxa de substituição 0,4mmol/g) ou resinas Wang pré-carregadas em uma escala de 0,4 mmol. ARemoção de grupo Fmoc é obtida por adição de 30 ml de piperidina/DMF(1:3) e irradiação com 100W durante 3x30 sec. O acoplamento de aminoáci-dos é obtido por adição de 5 vezes de excesso de aminoácido em DMF Py-BOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamento e irradiação com 50Wdurante 5x30 sec. Entre todos os ciclos de irradiação a solução é esfriadamanualmente com ajuda de um banho de gelo. Após a desproteção e aco-plamento, a resina é lavada 6 vezes com 30 ml de DMF. A desproteção doúltimo aminoácido alguns peptídeos são acetilados por incubação com 1.268ml de solução de tamponamento (4,73 ml de anidrido acético e 8,73 ml deDIEA em 100 ml de DMSO) durante 5 minutos. Antes da clivagem, a resina éentão lavada 6 vezes com 30 ml de DMF e 6 vezes com 30 ml de DCM. Aclivagem dos peptídeos brutos é obtida por tratamento com 5 ml deTFA/TIS/EDT/HaO (94/1/2,5/2,5) durante 120 minutos sob atmosfera inerte.
Esta solução é filtrada em 40ml de éter frio. O precipitado é dissolvido emacetonitrila / água (1/1) e o peptídeo é purificado por RP-HPLC (Kromasil100 C18 10 μm, 250x4,6mm).
Síntese automatizada
A síntese é realizada pelo uso de um sistema de microondaOdyssey (CEM) usando PL-Rink-Amida-resinas (taxa de substituição 0,4mmol/g) ou por resinas de Wang pré-carregadas em uma escala de 0,25mmol. A remoção de grupos Fmoc é obtida por adição de 10 ml de piperidi-na/DMF (1:3) e irradiação com 100W durante 10x10 sec. O acoplamento deaminoácidos é obtido por adição de 5 vezes de excesso de aminoácido emDMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamento e irradiação com50W durante 5x30sec. Entre todos os ciclos de irradiação a solução é esfria-da através de borbulhamento de nitrogênio pela mistura de reação. Após adesproteção e acoplamento, a resina é lavada 6 vezes com 10ml de DMF.Após a desproteção do último aminoácido, alguns peptídeos são acetiladosatravés de incubação com 0,793ml de solução de capeamento (4,73ml deanidrido acético e 8,73ml de DIEA em 100ml de DMSO) durante 5 minutos.Antes da clivagem a resina é então lavada 6 vezes com 10ml de DMF e 6vezes com 10ml de DCM. A clivagem dos peptídeos brutos é obtida atravésde tratamento com 5ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2,5/2,5) durante 120 mi-nutos sob uma atmosfera inerte. Esta solução é filtrada em 40ml de éter frio,o precipitado dissolvido em acetonitrila/água (1/1) e a peptídeo é purificadopor RP-HPLC (Kromasil 100 C18 10pm, 250x4,6mm).
Purificação
Todos os peptídeos foram purificados usando um sistema Nebu-la-LCMS (Gilson). O material bruto de todos os peptídeos foi dissolvido emacetonitrila/água (1/1) e o peptídeo purificado por RP-HPLC (Kromasil 100C18 10μητ>, 250x4,6mm). A taxa de fluxo foi 20ml/min e a relação de divisãode LCMS 1/1000.
II. Formação de pontes de dissulfeto intramolecularesCiclizacão com K3f(FeCN6)
Solução 1: 10mg do peptídeo são dissolvidos em 0,1% deTFA/acetonitrila e diluídos com água até que uma concentração de 0,5mg/mlseja alcançada. O bicarbonato de amônio sólido é adicionado para alcançarum pH de aproximadamente 8.
Solução 2: em um segundo frasco 10ml de 0,1% deTFA/acetonitrila são diluídos com 10ml de água. O bicarbonato de amôniosólido é adicionado até que um pH de 8 seja alcançado e 1 gota de uma so-lução de 0,1 M de K3[(FeCN6)] seja adicionada.
Soluções 1 e 2 são adicionadas em gotas durante um período de3 horas a uma mistura de acetonitrila/água (1/1; pH = 8). A mistura é incuba-da durante a noite em temperatura ambiente e a mistura é concentrada epurificada por LCMS.
Ciclizacão com resina CLEAR-OX™
A 100ml de acetonitrila/água (1/1; 0,1% de TFA), bicarbonato deamônio sólido é adicionado até que um pH de 8 seja alcançado. Esta solu-ção é desgaseificada através de borbulhamento de Argônio durante 30 minu-tos. Agora 100mg de resina CLEAR-OX™ são adicionados. Após 10 minu-tos, são adicionados 10mg do peptídeo como um sólido. Após 2h de incuba-ção, a solução é filtrada, concentrada e purificada por LCMS.Purificação de peptídeos cíclicos:
Todos os peptídeos foram purificados usando um sistema Nebu-Ia-LCMS (Gilson). O material bruto de todos os peptídeos foi dissolvido emacetonitrila/água (1/1) ou DMSO e o peptídeo foi purificado por RP-HPLC(Kromasil 100 C18 ou C8 ΙΟμπι, 250x4,6mm). A taxa de fluxo foi 20ml/min ea relação de divisão de LCMS 1/1000.
Outras tecnologias muito adequadas para formar pontes de dis-sulfeto intramoleculares são descritas em PCT/EP2006/012526, aqui incor-porado por referência.III. Ensaios in vitro com monômeros
Ensaio de proliferação com células TF-1 através de incorporação de BrdU
As células TF-1 em fase de crescimento logarítmica (~2 χ 105-1 χ 106 células/ml; meio de RPMI; 20% de soro de bezerro fetal; suplemen-tada com Penicilina1 estreptomicina, L-glutamina; 0,5ng/ml de Interleucina 3)são lavadas (centrífuga 5 min. 1500 rpm e ressuspensas em RPMI completosem IL3 a 500.000 células/ml) e pré-cultivadas antes de começo do ensaiodurante 24 h sem IL-3. No dia seguinte as células são semeadas em placasde 24 - ou 96-cavidades normalmente usando pelo menos 6 concentraçõese 4 cavidades por concentração que contém pelo menos 10.000 célu-las/cavidade por agente a ser testado. Cada experiência inclui controles quecompreendem EPO recombinante como um agente de controle positivo ecavidades sem a adição de citocina como agente de controle de negativo.
Os peptídeos e controles de EPO são pré-diluídos em meios para as con-centrações desejadas e adicionados às células, começando um período decultura de 3 dias sob condições de cultura padrão (37°C, 5% de gás carbôni-co na fase de gás, atmosfera saturada com água). As concentrações semprese referem à concentração final de agente dentro da cavidade bem duranteeste período de cultura de 3 dias. Ao término deste período de cultura, FdUé adicionado a uma concentração final de 8 ng/ml de meio de cultura e acultura continuou durante 6 horas. Então, BrdU (bromodeoxiuridina) e dCd(2-deoxicitidina) são adicionados às suas concentrações finais (10 ng/ml deBrdU; 8 ng/ml de dCD; concentrações finais em meio de cultura) e a culturacontinuou durante 2 horas adicionais.
Ao término deste período de incubação e cultura, as células sãolavadas uma vez em salina tamponada de fosfato que contém 1,5% de BSAe novamente suspensas em um líquido de quantidade mínima. Desta sus-pensão, as células são adicionadas em gotas em 70% de etanol a -20°C.Daqui, as células são incubadas durante 10 minutos em gelo e então anali-sadas diretamente ou podem ser armazenadas a 4°C antes da análise.
Antes da análise, as células são pelotizadas através de centrifu-gação, o sobrenadante é descartado e as células novamente suspensas emuma quantidade mínima de fluido restante. As células são então suspensase incubadas durante IOminutos entre 0,5 ml de 2M de HCI / 0,5% de tritão X-100. Então, elas são novamente pelotadas e ressuspensas em uma quanti-dade mínima de fluido restante, que é diluído com 0,5ml de 0,1 N deNa2B4O7, pH 8,5 antes de repelência imediata das células. Finalmente, ascélulas são suspensas em 40μΙ de salina tamponada de fosfato (1,5% deBSA) e divididas em dois tubos de reação contendo 20μΙ de suspensão decélula cada. 2 μΙ de anti-BrdU-FITC (DAKO, clone Bu20a) são adicionados aum tubo e 2 μΙ de mlgG1 -FITC de controle (Sigma) são adicionados ao se-gundo tubo começando um período de incubação de 30 minutos em tempe-ratura ambiente. Então, 0,4ml de salina tamponada de fosfato e 10 μg/ml delodeto de Propídio (concentração final) são adicionados. A análise no citô-metro de fluxo refere-se à fração de células 4C ou células com ploidia maiselevada e à fração de células BrdU-positivas, desse modo determinando afração de células nos estágios relevantes do ciclo de célula.
Ensaio de proliferação com células de TF-1 por MTT
As células F-1 em fase de crescimento logarítmico (-2x105-1 χ 106 células/ml; meio de RPMI; 20% de soro de bezerro fetal; suplemen-tado com Penicilina, estreptomicina, L-glutamina; 0,5 ng/ml de Interleucina 3)são lavadas (centrífuga 5 min. 1500 rpm e ressuspensas em RPMI completosem IL3 a 500.000 de células/ml) e pré-cultivadas antes do começo do en-saio durante 24 h sem IL-3. No dia seguinte as células são semeadas emplacas de 24 - ou 96-cavidades normalmente usando pelo menos 6 concen-trações e 4 cavidades por concentração contendo pelo menos 10.000 célu-las/cavidade por agente ser testado. Cada experiência inclui controles quecompreendem EPO recombinante como um agente de controle positivo ecavidades sem adição de citocina como agente de controle de negativo. Ospeptídeos e controles de EPO são pré-diluídos em meios para as concentra-ções desejadas e adicionados às células, começando um período de culturade 3 dias sob condições de cultura padrão (37°C, 5% de gás carbônico nafase de gás, atmosfera saturada com água). As concentrações sempre refe-rem-se à concentração final de agente na cavidade durante este período decultura de 4 dias.
No dia 4, antes de começo da análise, uma série de diluição deum número conhecido de células de TF-1 é preparada em várias cavidades(0/2500/5000/10000/20000/50000 células/cavidade em 100 μΙ de meio). Es-tas cavidades são tratadas da mesma maneira como as cavidades de teste edepois fornecem uma curva de calibração da qual podem ser determinadosnúmeros de célula. Tendo configurado estas cavidades de referência, MTS ePMS do kit de proliferação MTT (Promega, ensaio de proliferação de célula
* não-radioativo aquoso CeIITiter 96) são descongelados em um banho de
* 10 água de 37QC e 100 μΙ de solução de PMS é adicionado a 2ml de solução deMTS. São adicionados 20μΙ desta mistura a cada cavidade das placas deensaio e incubados a 37°C durante 3-4 horas. 25 μΙ de 10% de sulfato dedodecila de sódio em água são adicionados a cada cavidade antes de medi-ção de E492 em um Leitor de ELISA.
IV. Síntese de unidades de peptídeo miméticas de EPO bivalentes
A síntese é realizada pelo uso de um sistema de microonda Li-berty (CEM) usando Resina Rink-Amida (taxa de substituição 0,19mmol/g)em uma escala de 0,25 mmol. A remoção de grupos Fmoc é obtida atravésde tratamento duplo com 10ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiação com50W durante 10x10sec. O acoplamento de aminoácidos é obtido através detratamento duplo com um excesso de 4 vezes de aminoácido em DMF Py-BOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamento e irradiação com 50Wdurante 5x30sec. Entre todos os ciclos de irradiação a solução é esfriadaatravés de borbulhamento de nitrogênio pela mistura de reação. Após a des-proteção e acoplamento, a resina é lavada 6 vezes com 10ml de DMF. Apóso ciclo de acoplamento duplo, todos os grupos amino não-reagidos são blo-queados através de tratamento com um excesso de 10 vezes de sucinimidade N-(2-Clorobenziloxicarbonilóxi) (solução de 0,2M em DMF) e irradiaçãocom 50W durante 3x30sec. Após desproteção do último aminoácido, o pep-tídeo é acetHado por incubação com 0,793ml de solução de tamponamento(4,73ml de anidrido acético e 8,73 ml de DIEA em 100 ml de DMSO) durante5 minutos. Antes da clivagem a resina é então lavada 6 vezes com 10 ml deDMF e 6 vezes com 10 ml de DCM. A clivagem dos peptídeos brutos é obti-da através de tratamento com 5ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2,5/2,5) du-rante 120 minutos sob uma atmosfera inerte. Esta solução é filtrada em 40mlde éter frio, o precipitado dissolvido em acetonitrila/água (1/1) e o peptídeo épurificado por RP-HPLC (Kromasil 100 C18 IOpm1 250x4,6mm).
Reação de Ciclizacão
30 mg do peptídeo linear são dissolvidos em 60 ml da solução A.Esta solução e 60 ml de DMSO são adicionados em gotas a 60 ml da solu-ção A (tempo total para adição: 3h). Após 48h os solventes são removidospor evaporação e o resíduo restante dissolvido em 30ml de DMSO / água(1/1). 30 ml de ácido acético e 17 mg de iodo (dissolvido em DMSO / água(1/1) são adicionados e a solução é misturada durante 90 minutos em tem-peratura ambiente. Depois, 20 mg de ácido ascórbico são adicionados e ossolventes removidos por evaporação. A mistura bruta é dissolvida em aceto-nitrila/água (2/1) e o peptídeo é purificado por RP-HPLC (Kromasil 100 C18ΙΟμιτι, 250x4,6mm).
Solução A: acetonitrila/água (1/1) contendo 0,1% de TFA. O pHé ajustado para 8,0 pela adição de bicarbonato de amônio.
O esquema de purificação: a purificação de peptídeo cíclico,Kromasil 100 C18 10μττι, 250x4,6mm, gradiente de 5% a 35% de acetonitrila(0,1% de TFA) em 50 minutos.
V. Ensaio de proliferação in vitro para determinar atividade de EPO
As células TF1 em fase de crescimento logarítmica (2x105-1 χ 106 células/ml crescidas em RPMI com 20% de soro de bezerro fetal(FCS) e 0,5 ng/ml de IL-3) foram contadas, e o número de células necessá-rio para realizar um ensaio foi centrifugado (5 min. 1500 rpm) e resuspensoem RPMI com 5% de FCS sem IL-3 a 300 000 de células/ml. As células fo-ram pré-cultivadas neste meio (fome) sem IL-3 durante 48 horas. Antes decomeçar o ensaio as células foram contadas novamente.
Logo antes de começar o ensaio, as soluções de matéria-primade peptídeos e EPO foram preparadas. Os peptídeos foram pesados e dis-solvidos em RPMI com 5% de FCS até uma concentração de 1 mM, 467 μΜou 200 μΜ. As soluções de matéria-prima de EPO foram IOnM ou 20 nM.292 μΙ destas soluções de matéria-prima foram medidos com pipeta em umacavidade de uma placa de cultura de 96 cavidades - uma placa foi tomadapara cada susbtância a ser testada. Duzentos μΙ de RPMI com 5% de FCSforam medidos com pipeta em dezessete outras cavidades em cada placa.
Noventa e dois μΙ de solução de matéria-prima foram medidas com pipetaem uma cavidade contendo 200 μΙ de meio. Os conteúdos foram misturados,e 92 μΙ desta cavidade foram transferidos para a seguinte, e assim sucessi-vamente. Deste modo uma série de diluição (18 diluições) de cada substân-cia foi preparada tal que em cada cavidade consecutiva a concentração fos-se 1 :V10 da concentração na cavidade antes desta. De cada cavidade 3 χ 50μΙ foi transferido para três cavidades vazias. Deste modo cada concentraçãode substância foi medida em quadruplicado. Observe que a linha superior einferior das cavidades de cada placa foi deixada vazia.
As células pré-tratadas (privadas de alimentação) foram centri-fugadas (5 min. 1500 rpm) e ressuspensas em RPMI com 5% de FCS emuma concentração de 200 000 células por ml. Cinqüenta μΙ de suspensão decélula (contendo 10 000 células) foram adicionados a cada cavidade. Notarque devido à adição das células as concentrações finais das substânciasnas cavidades foram a metade daquela faixa de diluição original. As placasforam incubadas durante 72 h a 37SC em 5% de CO2.
Antes de começar a avaliação, uma faixa de diluição de quanti-dades conhecidas de células TF-1 em cavidades foi preparada:0/2500/5000/10000/20000/50000 células/cavidade foram medidas com pipe-ta (em 100 μΙ de RPMI + 5% de FCS) em quadruplicata.
Para medir o número de células vivas por cavidade, o reagentede MTT pronto para uso (Promega, Ensaio de Proliferação de Célula deUma Solução Aquosa CeIITiter 96) foi descongelado em um banho de águaa 379C. Por cavidade, 20 μI de reagente de MTT foram adicionados, e asplacas foram incubadas a 379C em 5% de CO2 durante outras 1-2 h. Vinte ecinco μΙ de uma solução de SDS a 10% foram adicionados, e as placas fo-ram medidas em um leitor de ELISA (Gênios, Tecan). Os dados foram pro-cessados em planilhas eletrônicas (Excel) e plotados em Graphpad.
VI. Ensaios de peptídeo prolongados
Em um ensaio prolongado, várias seqüências de peptídeo foramtestadas quanto à sua atividade mimética de EPO.
Os peptídeos foram sintetizados como amidas de peptídeos emum sistema de sintetizador Lips-Vario. A síntese foi realizada em Placas desíntese de MTP especiais, a escala foi 2 pmol por peptídeo. A síntese seguiuo protocolo de Fmoc padrão que usa HOBT como reagente ativador. As eta-pas de acoplamento foram realizadas como acoplamento de 4 vezes. Cadaetapa de acoplamento levou 25 min e o excesso de aminoácido por etapa foi2,8. A clivagem e desproteção dos peptídeos foram feitas com uma soluçãode clivagem que contém 90% de TFA, 5% de TIPS, 2,5% de H2O e 2,5% deDDT. A placa de síntese contendo o peptídeo acabado preso à resina foiarmazenada no topo de uma placa de 96 cavidades profundas. 50 μΙ da so-lução de clivagem foram adicionados bem a cada cavidade e a clivagem foirealizada durante 10 minutos, este procedimento foi repetido três vezes. Opeptídeo clivado foi eluído com 200 μΙ de solução de clivagem através defluxo de gravidade na placa de cavidade profunda. A desproteção da funçãoda cadeia lateral foi realizada durante outras 2,5 h dentro da placa de cavi-dade profunda. Depois, o peptídeo foi precipitado com gelo éter frio/hexanoe foi centrifugado. Os peptídeos foram dissolvidos em solução aquosa neutrae a ciclização foi incubada durante noite a 4°C. Os peptídeos foram Iiofilizados.
A Figura 7 dá uma avaliação sobre alguns dos monômeros depeptídeos sintetizados e testados.
Os peptídeos foram testados quanto a sua atividade mimética deEPO em um em ensaio de proliferação in vitro. O ensaio foi realizo comodescrito em V. Em cada dia de ensaio, 40 placas de microtítulo foram prepa-radas para medir atividade in vitro de 38 peptídeos de teste, 1 exemplo dereferência, e EPO em paralelo. As soluções de matéria-prima de EPO foram 20 NM.
VII. Síntese de conjugados de HES de peptídeoO esquema de reação de princípio é descrito na Figura 8. Asestratégias alternativas por acoplar peptídeos diméricos ao portador sãodescritas em WO 2006/136450, aqui incorporado por referência.
O objetivo do método descrito é a produção de um derivado deum amido, de acordo com este exemplo HES1 que seletivamente reage comgrupos de tiol sob condições de reação moderadas, aquosas. Esta seletivi-dade é alcançada com grupos de maleimida.
HES é primeiro funcionalizado com grupos aminos e convertidodepois para o respectivo derivado de maleimida. As bateladas de reaçãoforam livrados de reagentes moleculares baixos por ultra membranas. Oproduto, os produtos intermediários como também os edutos são todos poli-dispersos.
Síntese de amino-HES (AHES)
Hidroxietilamido (isto é, HES 130/0,4 ou HES 200/0,5) foi obtidopor diafiltração e liofilização subseqüente. O peso de molar médio foi apro-ximadamente 130 kD com um grau molar de substituição de 0,4, respecti-vamente 200 kD, MS=O,5.
A síntese foi realizada de acordo com a síntese descrita paradextrana amino na dissertação de Jacob Piehler, ,,Modifizierung vonOberfláchen für die thermodynamische und kinetische Charakterisierung bi-omolekularer Erkennung mit optischen Transducern", 1997, 1997, aqui in-corporado por referência. HES foi ativado por oxidação parcial, seletiva dosgrupos hidroxila diólica para grupos de aldeído com periodato de sódio comodescrito em Floor e outros (1989). Os grupos aldeído foram convertidos poraminação redutiva com sódiocianoboroidreto (Na[B(CN)H3]) na presença deamônio para grupos aminos (Yalpani e Riachos, 1995).
Abertura de Periodato
Por uma oxidação moderada dos 1,2-dióis no sacarídeo atravésde periodato de sódio em água, os grupos aldeído são introduzidos. Usandoconcentração molar diferente do agente de oxidação, o número de gruposâncoras disponíveis e, desse modo, a quantidade de fármaco de peptídeo noportador, podem ser controlados. Para otimizar o protocolo a oxidação foimonitorada com o reagente Purpald que forma uma adução púrpura comaldeídos. O tempo de reação pode ser reduzido até 8-18h. A quantia usadade periodato representa 20% do número de bloco de formação de glicose(aplicando uma massa de bloco de formação de glicose de 180 g/mol, DS =0,4). A preparação foi realizada por ultra filtração e liofilização. A purificaçãode cada produto polimérico foi realizada por técnicas de ultrafiltração usandouma membrana de PES de cortes de peso molecular diferente seguido porliofilização. Dos derivados de HES otimizados somente a faixa de massamolar maior do que 10OkD foi usada.
Análise de aldeído
Qualitativo/Semiquantitativo: Reação Purpald dos grupos de aldeído dispo-níveis.
Animação redutiva com cloreto de amônio
Na seguinte etapa os grupos aldeído introduzidos foram conver-tidos em aminas por uma aminação redutiva em uma solução saturada decloreto de amônio em um valor de pH ligeiramente ácido com cianoboroidre-to de sódio.
Para otimizar o protocolo os grupos-de aldeído do material departida foram seguidos pelo reagente Purpald e as aminas formadas comTNBS. Estas experiências mostraram que a formação do intermediário deimina está em um equilíbrio após um período inicial e o agente de reduçãoadicionado prefere as iminas sobre o aldeído. Desse modo poderia ser cons-tatado que a reação ideal é realizada por várias adições do agente de redu-ção com um tempo de reação total de 24h.
A preparação através de precipitação do produto e dia- ou ultra-filtração.
Análise de Amina
Qualitativo: reação de Ninhidrina (teste Kaiser)Semiquantitativo: com ácido sulfônico de 2,4,6-trinitrobenzol(TNBS) comparado com um dextrano de amino.
O grau de substituição alcançado foi cerca de 2,8%. Isto resultaem uma massa molar de um bloco de formação que carrega um grupo ami-no de aproximadamente 6400g/mol.
Síntese de maleimidopropionil-amino-hidroxietilamido ("MalPA-HES")
Após a introdução de grupos aminos os grupos âncoras de ma-Ieimida são introduzidos com alquila de ácido-N-hidroxissucinimidésteres deω-maleimido (ou arila).
Síntese
A introdução final dos grupos maleimida no HES é realizada comácido-N-hidroxissucinimidéster de 3-maleimidopropiona (MaIPA-OSu). Aousar um excesso (5 a 10 vezes) em um tampão ligeiramente ácido a conver-são é quantitavamente (50 mM de tampão de fosfato de, pH 7, 20% de DMF,durante noite). O ultrafiltrado e produto Iiofilizado são armazenados a -18°C.
Análise
A reação do grupo amino foi verificada com ninhidrina e TNBS.O número de grupos maleimida introduzidos é demonstrado por reação deglutationa (GSH) e a detecção de grupos tiol excessivos com reagente Ell-mans, ácido 6,6'-dinitro-3,3'-ditiodibenzóico (DTNB) e por 700 MHz-1H-RMN-espectroscopia
O grau de substituição obtido foi cerca de 2% e corresponde a8500 g/mol por bloco de formação de maleimida (180 g/mol de massa debloco de formação de, MS = 0,4).
Figura 9 mostra espetáculos um espectro 1H-RMN (D2O,700MHz) de um HES modificado por maleimida. A relação do próton de ma-leimida (6,8ppm) para o C-H anomérico (4,8-5,6ppm) produz um tamanho debloco de formação de aproximadamente 6.900g/mol (em comparação: o tes-te de GSH/DTNB produziu 7.300g/mol).
O número de grupos maleimida e desse modo o tamanho dobloco de formação pode ser medido por saturação com GSH e reação comDTNB. A cor amarela formada é significante e pode ser quantificada facil-mente. Estes valores produzem tamanhos de bloco de formação segurosentre 5.000 e 100. 000 g/mol dependendo do material de partida usado, res-pectivamente a quantidade de periodato na etapa de oxidação. Este métodofoi validado por espectroscopia de 1H-RMN do produto. No RMN conteúdode grupos maleimide pode ser quantificado da relação de todos os sinais C-H anoméricos e os prótons de anel de maleimida.
As seguintes faixas são preferidas:
<table>table see original document page 90</column></row><table>
Tabela 1: os exemplos para o tamanho de bloco de formação virtual alcan-çável do grupo âncora na cadeia principal de HES pela oxidação de periodato.
Conjugado de peptídeo-hidroxietilamido (Pep-AHES)Síntese
Um peptídeo contendo cisteína foi usado que teve um terminalde N- (Pep-IA) livre ou um (Pep-IB) biotinilado. Uma mistura de 4:1 de Pep-IA/B foi convertida durante noite em excesso (aproximadamente 6 equivalen-tes com MaIPA-HES em tampão de fosfato, 50 mM, pH 6,5/DMF 80:20; pre-paração ocorrida com ultra filtração e liofilização.
Analise
A absorcao UV foi determinada em 280 nm e o conteudo restan-te de grupos maleimide foi determinado com GSH/DTNB.
A producao de peptidfeo foi quase quantitativa. Quase nemhumgrupo maleimida livre foi detectaverl.
Para a conjugacao do formaco de peptideo um dominio de peptideo
Ac-GGTYSCHFGKLT-Na1-VCKKQRG-Am (BB68)
é usado para criar uma unidade de peptídeo introduzindo-se um grupo tiollivre (por exemplo, introduzindo um resíduo de cisteína no terminal de N)como em
Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Na1-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Na1-VCKKQRG-Am (AGEM40)
um excesso de 10-50% do peptideo desprotegido e conjugado em um tam-pão ligeiramente ácido durante 1-2h. As condições foram otimizadas paragarantir por um lado que a cadeia principal de HES, os grupos maleimida eas pontes de dissulfeto sejam estáveis, e por outro lado observar uma con-versão quantitativa. Ao usar compostos de HES funcionalizados de maleimi-da diferentes vários Peptídeos Miméticos de EPO supravalentes foram sinte-tizados, que mostraram in vitro um efeito supravalente. Alguns exemplos sãodeterminados abaixo
<table>table see original document page 91</column></row><table>
Tabela 2: conjugados de peptídeo mimético de EPO supravalente de A-GEM40 com conteúdos de peptídeo diferentes.
Uma análise química fácil dos conjugados de peptídeo miméticode EPO supravalente foi percebida em duas etapas. O primeiro conteúdo depeptídeo foi quantificado por HPLC depois de uma hidrólise leve da cadeiaprincipal de HES e a segunda quantidade de polissacarídeo foi medida porum teste colorimétrico com fenol após uma hidrólise completa através deácido sulfúrico.
Figura 10 mostra um cromatograma de HPLC (Shimadzu HPLC)da hidrólise de TFA/água do conjugado de Peptídeo Mimético de EPO Su-pravalente AGEM40-AHES A2. Depois de um certo tempo a absorvência deUV de todo o peptídeo que contém espécies, fica constante em um valormáximo e por comparação com o peptídeo livre um conteúdo de peptídeo de37% pode ser calculado (valor teórico: 39%).VIII. Outras experiências in vitro
Muitas das experiências descritas abaixo já foram descritas aci-ma. Porém, os detalhes seguintes dão uma avaliação resumida sobre ostestes e resultados descritos. Predominantemente a cultura de célula huma-na e ensaios de medula óssea são descritos.Por um lado, os ensaios rápidos com base em linhagem de célu-la foram usados para verificar a potência de seqüências de peptídeo ideaisao longo dos estágios anteriores de otimização. Estes ensaios de cultura decélula ainda são válidos como testes rápidos de eficácia de um peptídeo no-vo ou uma batelada nova. As duas finalidades, que foram usadas para a li-nhagem de célula TF-1 (células humanas) é a proliferação (aqui normalmen-te determinado como número de células vivas em pontos de tempo defini-dos) e a diferenciação como produção de hemoglobina acentuada em célu-las TF-1.
Além disso, as células primárias (células tronco humanas demedula óssea) foram usadas para ensaios CFU, que estão muito perto dasituação in vivo. Elas dão respostas à atividade eritropoiética no caso do usode peptídeos miméticos de EPO como unidades de peptídeo de um modomuito mais in vivo. Porém, elas devem ser manipuladas mais sofisticada-mente e será necessário mais tempo por ensaio do que os ensaios de cultu-ra de célula.
Ensaios usando células TF-1 humanas
TF-1 é uma linhagem de célula de eritroleucemia humana quesomente prolifera em resposta a certas citocinas tal como IL3 ou EPO. Alémdisso, as células TF-1 podem se diferenciar com respeito a um fenótipo deeritróide em resposta ao EPO. As células de TF-1 foram obtidas de DSMZ(Braunschweig, Alemanha). Uma folha de produto está disponível no local deweb DSMZ dsmz.de. TF-1 é a linhagem de célula recomendada para avalia-ção de atividade de EPO por European Pharmacopoe.
O protocolo de cultura interno para cultura de manutenção:
Meio: RPMI+P/S+AmphoB+L-Glut.+ 20%FCS+h-IL-3
1. - 500 ml de RPMI + 5 ml de P/S + 5 ml de AmphoB
2. - 200 ml de RPMI + PS/AmphoB+ 2,5 ml de L-glutamina+ 50 ml de FCS = Meio completo (1 mês 4°C)
3. - 45 ml de Meio completo + 22,5 ul de h-IL-3 (1 semana 4°C)
Cultura: manter entre 200.000 e 1.000.000 de células/ml durante 3 dias 2χ 105/mldurante 2 dias 3 χ 105/mldurante 1 dia 5 χ 105/mlPlanejamento de um ensaio de proliferação de TF-1
Em um ensaio de proliferação TF-1, as células de TF-1 são se-meadas e cultivadas durante vários dias em concentrações variadas de EPOou peptídeos miméticos de EPO dentro uma placa de multicavidade.
Para resultados otimizados deveriam ser cultivadas células TF-1durante dois dias na ausência de qualquer citocina (privada de alimento) an-tes de começar o ensaio. Três dias depois de começar o ensaio, a prolifera-ção de célula é indiretamente medida ensaiando-se o número de células viá-veis.
Um reagente de tetrazólio, chamado MTS, é adicionado o qual éreduzido para formazan colorido. Esta reação depende de NADH e NADPH,em outras palavras depende da atividade mitocondrial. A quantidade de for-mazan é espectrofotometricamente medida. Ao usar uma gama de númerosconhecidos de célula para calibração, é possível determinar o número abso-luto de células viáveis presentes em cada condição. O desígnio principaltambém é ilustrado na Figura 11.
A atividade de um certo agente neste ensaio é determinada :
1. avaliando-se se este agente causa um aumento no número decélulas viáveis em uma certa concentração, e
2. em qual concentração este agente mostra um efeito meio-máximo (determinação do EC50).
Resultados de ensaios de proliferação de TF-1
Como uma observação geral, tem que ser mencionado que to-dos os peptídeos miméticos de EPO (EMP1 e os peptídeos modificadosdescritos acima) se comportam na sua forma monomérica neste ensaio co-mo agonistas parciais, isto é, a resposta de máxima é mais fraca do que aresposta observada com EPO. Não obstante, o ensaio pode ser usado paradeterminar a mudança da direita/esquerda em plotes normalizados e dessemodo determinar o resultado das otimizações. Isto especialmente, como éconhecido que a atividade agonista consideravelmente aumenta na dimeri-zação.
O primeiro gráfico descreve este efeito em resposta absolutasem normalização. Todos os outros gráficos mostram plotes normalizadosque permitem a determinação de valores de EC50 das curvas.
Duas substâncias de referência foram usadas nos ensaios:
1) EMP1, uma seqüência de peptídeo publicada com proprieda-des miméticas de EPO conhecidas (Johnson e outros, 1997).
2) Eritropoietina Humana Recombinante (EPO), foi compradana farmácia como o produto Ortho Biotech Epoetin alfa (Nome comercial emAlemão: ErypoR)
A plotagem destas substâncias é determinada em linhas pretas,contínuas para EPO e pontilhadas para EMP1
Os peptídeos miméticos de EPO modificados por prolina sãomostrados nas próximas Figuras como linhas contínuas coloridas. Estespeptídeos modificados descrevem a seguinte seqüência:
1) BB49
Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG
Mostra uma eficácia e potência na mesma faixa como EMP1
2) BB68
Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Amé até mesmo mais efetivo do que EMP1 e BB49
3) AGEM40,
Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Na1 -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaI -
VCKKQRG-Am
que é um peptídeo contínuo bivalente que foi projetado com base na se-qüência de BB68 que descreve características melhoradas.
4) AGEM40_HES, que é um peptídeo avançado, altamente efe-tivo e potente (AGEM40) HESiIado de acordo com o princípio de suprava-lência da presente invenção.
Estas seqüências foram usadas como exemplos inter alia parailustrar os benefícios do princípio de supravalência.
Figura 12 descreve os resultados de peptídeos miméticos deEPO monoméricos comparados com EPO. Figo. 12 incluem um plote de da-dos de absorvência atuais que documentam a diferença absoluta entre pep-tídeos em geral e EPO neste ensaio.
Figura 13 determina os valores de EC50 calculados dos plotesnormalizados ajustados.
Figura 14 mostra o efeito melhorado de BB68 comparado aBB49. Usando o BB68 ideal como bloco de construção para criar uma uni-dade de peptídeo de acordo com a presente invenção, o efeito foi melhoradopor duas ordens adicionais de magnitude. Isto é documentado na Figura 14e na Tabela correspondente mostrada na Figura 15.
As unidades de peptídeo dimérico foram então acopladas aoHES portador macromolecular em uma densidade aperfeiçoada. O API re-sultante é pelo menos equipotente a EPO em comparação molar e muitoperto de EPO em comparação de massa (vide Figura 16 e Figura 17 abaixo).
Figura 16 e as Figuras e Tabelas abaixo claramente antes de-monstram a grande potência do conceito de supravalência. Ao lembrar daprecisão, que pode ser obtida com um ensaio de cultura de célula, o API ob-tido é pelo menos equipotente a EPO in vitro. É desse modo superior a qual-quer API de Peptídeo Mimético de EPO conhecido que não emprega o con-ceito de supravaleência.
Ensaios de Medula Óssea
Medula óssea contém as células tronco hematopoiéticas comum potencial para se auto-renovar e se desenvolver em todos os tipos decélulas de sangue. Além disso, a medula óssea contém células progenitorascomprometidas capazes de se desenvolver em uma ou várias linhagens decélula de sangue. Entre essas células progenitoras, algumas se desenvol-vem em eritrócitos (os progenitores de eritróide).
As células progenitoras podem ser demonstradas revestindo-secélulas da medula óssea em meios semi-sólidos com base em metilcelulose.Na presença de um coquetel de citocina apropriado, as células progenitorasse proliferam e se diferenciam para produzir uma colônia de células de umacerta linhagem. Os progenitores de mielóide se desenvolvem em colôniasgranulocíticas (derivados de um CFU-G), colônias monocíticas (de um CFU-M), ou colônias granulocíticas-monocíticas misturadas (de um CFU-GM). Osprogenitores de eritróide se desenvolvem em uma colônia de eritrócitos (cé-lulas vermelhas). Dependendo do tamanho da colônia de eritróide, as célulasprogenitoras são chamadas BFU-E (produzindo colônias de 200 células oumais) de CFU-E (produzindo colônias de menos de 200 células). As célulasprogenitoras em um estágio precoce de compromisso podem se desenvolverem colônias misturadas granulocíticas-eritróide-monocíticas-megacariocítica.Estes progenitores precoces são chamados CFU-GEMM.
EPO estimula o desenvolvimento de colônias de eritróide deBFU-E ou CFU-E, se certas citocinas diferentes estiverem presentes tam-bém. Sem EPO nenhuma colônia de eritróide pode se desenvolver. A ex-crescência de colônias de eritróide de uma batelada homogênea de célulasda medula óssea em metilcelulose, então, é uma medida para atividade deEPO.
Uma vez que os processos acima mencionados são bem pareci-dos, senão idênticos aos processos que ocorrem na medula óssea in vivo,eles são um preditor excelente de atividade tipo EPO.
Desígnio de Ensaios de Medula óssea
As células humanas de medula óssea (comercialmente disponí-vel de Cryosystems, sorologicamente verificadas) são descongeladas decriofrascos, e banhadas em meios de metilcelulose com um determinadofundo de citocinas (porém sem EPO) em uma densidade de célula fixa. EPOou Peptídeo Mimético de EPO é adicionado em concentrações variantes. Asculturas são incubadas durante 12-14 dias a 37C. Então, os números de co-lônias de mielóide e eritróide são enumerados através de inspeção micros-cópica.
Finalidades dos Ensaios de Medula óssea:
1. Premissas: culturas sem EPO deveriam produzir somente co-lônias mielóide (branco) porém não eritróide (vermelho). As culturas comEPO deveriam produzir um aumento dependente da concentração em colô-nias de célula vermelha, e um aumento dependente da concentração nostamanhos das colônias de célula vermelha.
2. Um peptídeo mostra atividade mimética de EPO se causa umaumento dependente da concentração em colônias de célula vermelha, e umaumento dependente da concentração nos tamanhos das colônias de célulavermelha. Porém, um peptídeo não deveria interferir com os números decolônias de mielóide obtidos.Resultados dos Ensaios de Medula óssea
Os Peptídeos miméticos de EPO modificados por prolina descri-tos acima não estimularam a formação de colônias de mielóide, porém mos-traram atividade significante na formação de colônias vermelhas. Qualitati-vamente, isto é mostrado na Figura 18 em uma fotografia de uma placa decultura, ao mesmo tempo em que a contagem das colônias é documentadana Figura 19.
IX. Ensaio de reatividade cruzada de anticorpo
Como descrito na introdução deste pedido, os pacientes às ve-zes desenvolvem anticorpos contra rhuEPO. Isto leva à conseqüências gra-ves descritas na introdução.
Para também explorar as propriedades dos peptídeos de acordocom a invenção foi analisado se os peptídeos de fato reagem cruzado comanticorpos anti-EPO.
Os soros de coelho e ser humano que contêm anticorpos anti-EPO foram usados para testar. Estes soros foram pré-tratados ou com EPOou os seguintes peptídeos miméticos de EPO:
Ac-C-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-1 nal-VCKKQRG-Am(peptídeo de teste 1)
Ac-GGTYSCHFGKLT-InaI-VCKKQRG-Am (peptídeo de teste 2)
Ac = terminal de N acetilado
Am = Terminal de C amidado
1nal = 1-naftilalanina
As concentrações diferentes de eritropoietina e peptídeos mimé-ticos de EPO foram usadas na análise. Após o pré-tratamento dos soroscom as substâncias de teste para absorver os anticorpos anti-EPO presen-tes nos soros, os soros foram tratados com eritropoietina rotulada radioati-vamente. Os anticorpos que permanecem nos soros depois da etapa de pré-adsorção são ligados pela eritropoietina e novamente imunoprecipitados. Oprotocolo usado para este teste é descrito em Tacey e outros, 2003, aquiincorporados por referência.
Os resultados da pré-adsorção realizada com o anticorpo anti-EPO que contém soros que usam EPO ou Peptídeos miméticos de EPO deacordo com a invenção são descritos na Figura20.
Quando os soros foram pré-tratados com Peptídeos miméticosde EPO, os soros foram, por conseguinte testados positivos quando conta-tados com eritropoietina radioativamente rotulada. Desse modo foram descri-tos anticorpos anti-EPO nos soros apesar do pré-tratamento. Isto significaque os Peptídeos miméticos de EPO não puderam se ligar aos anticorposanti-EPO durante o pré-tratamento. Na ausência de uma atividade de Iiga-ção, os anticorpos anti-EPO não foram eliminados dos soros junto com osPeptídeos miméticos de EPO e desse modo permaneceram nos soros. Osanticorpos anti-EPO não foram capazes de reconhecer e desse modo seligar aos Peptídeos miméticos de EPO.
EPO humano recombinante (rhuEPO) foi usado como um con-trole. Quando os soros foram pré-tratados com eritropoietina, quase nenhumanticorpo foi detectável no ensaio subseqüente que incorpora eritropoietinarotulada radioativamente uma vez que os anticorpos já foram ligados e eli-minados pelo pré-tratamento com eritropoietina.
Os valores numéricos descritos na Figura 20 representam o %de cpm das contas totais usadas no IP. Um soro é avaliado como positivoquando o % do valor de cpm é > 0,9. 100% de cpm representa a quantidadedas contas usadas globais (o traçador radioativo), agora o EPO rotulado ra-dioativamente.
O ensaio demonstra que os Peptídeos miméticos de EPO deacordo com a invenção não descrevem nenhuma reatividade cruzada vanta-josamente com anticorpos anti-EPO. Os peptídeos miméticos de EPO des-critos aqui deveriam descrever desse modo um efeito terapêutico até mesmoem pacientes que desenvolveram anticorpos contra rhuEPO. Além disso, éesperado, que anticorpos contra Peptídeos miméticos de EPO não deveriamse ligar a eritropoietina. Os peptídeos miméticos de EPO de acordo com estainvenção são desse modo preferivelmente também caracterizados pelo fatode que eles não mostram nenhuma reatividade cruzada significante com an-ticorpos anti-EPO.
X. Eficácia em primatas
A eficácia dos peptídeos miméticos de EPO de acordo com apresente invenção também foi provada em estudos com animal, em que 7macacos não livres de fármacos (macaca fascicularis) foram usados paratestar. O peptídeo de teste foi AGEM 400 HES (vide acima) que foi usadocomo um pó liofilizado, dissolvido em Solução Ringer. As doses entre0,01 mg/kg e 50mg/kg foram testadas (administração intravenosa). As expe-riências animais mostraram que o peptídeo mimético EPO descreve umaboa eficácia mimética de EPO até mesmo em doses baixas e teve um efeitoduradouro. Também, nenhum sinal de toxicidade foi observado.Referências:
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<110><120><130><140><141><150><151><150><151><150><151><150><151><160><170><210><211><212><213><220><223><220><221><222><223>
AplaGen GmbH
Moléculas Modificadas que Promovem Hematopoiese47 951 K
PCT/EP2007/002068
2007-03-09
EPO6 004 833.7
2006-03-09
US 60/780,568
2006-03-09
EP 06 010 174.8
2006-05-17
US 60/747,515
2006-05-17
301
PatentIn Versão 3.3110PRT
artificial
Ie Fórmula geral de consenso mimético de EPO
MISC_ASPECTO(1) ·· (1)
é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral capazde formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> R, H, L, W, ou Y ou S
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (3)..(3)
<223> é Μ, F, I, homosserinametiléter ou norisoleucina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> G oU permuta conservadora de G<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4) . . (5)
<223> alternativamente, os aminoácidos X9 e XlO (nas posições 4 e 5)são substituídos por um único aminoácido
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5) . . (5)
<223> permuta não-conservadora de prolina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6)..(6)
<223> independentemente selecionado de qualquer aminoácido<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (7).. (7)
<223> é um aminoácido polar não-carregado ou A
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> W1 1-nal, 2-nal, A ou F<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (9).. (9)
<223> é D, Ε, I, L ou V<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralde
formar uma ligação covalente ou A
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> 2s fórmula geral de consenso de peptideo mimético de EPO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)
<223> é G ou uma permuta conservadora de G<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(2)
<223> X9 e XlO são substituídos por um único aminoácido<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> é uma permuta não-conservadora de prolina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3).. (3)
<223> é selecionado de qualquer aminoácido<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> β Uin aminoacido polar não—Ccixir ecoado ou A<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5).. (5)<223> é naftilalanina
<400> 2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO mostrado na Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 3
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 4
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20PRT
artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
tomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13)..(13)2-naftilalanina
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
6=PRT
artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222>
tomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13) .. (13)<223> 1-naftilalanina
<400> 6
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly
<210> 7
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 7
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Ile Cis Lys15 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 8<211> 20<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 8Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Glu Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20920PRT
artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
tomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13)..(13)1-naftilalanina
9
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15
Lys Gln Gly Gly20
1020PRT
artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
tomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13) . . (13)1-naftilalanina10
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15Lys Gln Gly Gly20
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
1120PRT
artificialtomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13) . . (13)2-naftilalanina11
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly201220PRT
artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
tomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13) . . (13)1-naftilalanina12
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
1320PRT
artificialtomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13)..(13)1-naftilalanina
13
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Asp Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
1420PRT
artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
tomado da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13)..(13)1-naftilalanina14
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> 15
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 15
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 16
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial<220><223> tomado da Fig. 7<220><221> MISC_ASPECTO<222> (13)..(13)<223> 1-naftilalanina<400> 17
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly
20
<210> 18<211> 20<212> PRT<213> artificial<220><223> tomado da Fig. 7<220><221> MISC_ASPECTO<222> (13) . . (13)<223> 2-naftilalanina<400> 18
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 19<211> 20<212> PRT<213> artificial<220><223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 19
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 20
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg15 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 21<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO112
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 21
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> 22<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 22
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 23
<211> 20<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina<400> 23
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 24
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Leu Arg Gly20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 25
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 26
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 27
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln <3ly Gly<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 28
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 29
<211> 20<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 29
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> " 30<211> 20
<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 30
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 31
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 31
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 32
<211> 20<212> PRT<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 32
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Leu Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 33
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Ile Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220><223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 34
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
20<210> 35
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 35
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
20
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<22 0>
<223> tomado da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 36
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> 37
10 <211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13). .(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 37
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)<223> 2-naftilalanina
<400> 38
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 39
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da figura 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 39
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 40
<211> 20<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 40Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly
20<210> 41<211> 20<212> PRT<213> artificial<220> <223> tomado da Fig.<220> <221> MISC_ASPECTO<222> (13)..(13)<223> 1-naftilalanina<400> 41
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly
20<210> 42<211> 20<212> PRT<213> artificial<220> <223> tomado da Fig.<220> <221> MISC_ASPECTO<222> (13)..(13)<223> 2-naftilalanina<400> 42
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15Lys Gln Gly Gly20
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 43
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 44
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftiIalanina
<400> 45
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly
20
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftiIalanina
<400> 46
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
30 20
<210> 47
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 47
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 48
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 49
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 49
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 50
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<22 0>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 50
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Glu Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
<210> 51
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7126
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 2-naftilalanina
5 <400> 51
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 52
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 52
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 53
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (13) .. (13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 53
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 54
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 54
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Arg
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial<22 0>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> 1-naftilalanina<400> 55
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Met Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
20
<210> 56
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 56
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly
20
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 57
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 58
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 59
<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 59
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 2-naftilalanina
<400> 60
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 61<211> 20<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO tomado da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> 1-naftilalanina
<400> 61
Gly Gly Thr Tyr Thr Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 62<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> Consenso para peptídeos miméticos de EPO<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (1) . . (1)
<223> X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral,capaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> X7 é R, H, L, W ou Y ou S<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3) . . (3)
<223> X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina
<400> 62Xaa Xaa Xaa1
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1) . . (1)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>
treonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5)..(5)
<223> Χ13 é W, 1-nal, 2-nal, A ou F
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6)..(6)
<223> se presente, Χ14 é D, Ε, I, L ou V
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (7)..(7)
<223> se presente, Χ15 é um aminoácido com uma funcionalidade de ca-
deia lateral
capaz de formar uma ligação covalente ou A ouácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<220>
<221> MISC_ASPECTO
X9 é G ou uma permuta conservadora de G
MISC_ASPECTO(2)..(2)
é opcionalmente um aminoácido negativamente carregado
MISC_ASPECTO
(3)..(3)
Xll é selecionado de qualquer aminoácido
MISC_ASPECTO
(4)..(4)
X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmente<222> (8)..(8)
<223> se presente Χ16 é independentemente selecionado de qualquer ami-
noácido,
preferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (9).. (9)
<223> se presente é opcionalmente um aminoácido negativamente carrega-
do<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (10)..(10)
<223> se presente, X18 é independentemente selecionado de qualquer
aminoácido,
preferivelmente L ou Q
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> se presente é opcionalmente a aminoácido negativamente carregado
<400> 63
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 64
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1) .. (1)
<223> X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral ca-paz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutíricoacid
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> X7 é R, H, L, W ou Y ou S
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3) .. (3)
<223> X8 is M, F, I, V, H, homosserinametiléter ou norisoleucina
<400> 64
Xaa Xaa Xaa1
<210> 65
<211> 11<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPO
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)
<223> X9 éG ou uma permuta conservadora de G
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> no caso de XlO não ser um aminoácido negativamente carregado,
XlO será
prolina, uma permuta conservadora de prolina ou uma permuta não-conservadora de prolina ouΧ9 e XlO são substituídos por um único aminoácido
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (11)
<223> pelo menos um dentre XlO, X17 ou X19 é um aminoácido negativa-
mente carregado<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3).. (3)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4) . . (4)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmente
treonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5).. (5)
<223> X13 é W, 1-nal, 2-nal, A ou F
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6)..(6)
<223> X14 é D, Ε, I, L ou V
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (7) . . (7)
<223> X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral
capaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutirico<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> Χ16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, pre-
ferivelmente G,
K, L, Q, R, S, Har ou T
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (9)..(9)
<223> no caso de X17 não ser um aminoácido negativamente carregado,
X17 será
selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, G, Ρ, Y ou umaminoácido positivamente carregado natural, não-natural ou derivati-
zado,
preferivelmente K, R, H, ornitina ou homoarginina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Xl8 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, pre-
ferivelmente Lou Q
<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (11) . . (11)
<223> no caso de X19 não ser um aminoácido negativamente carregado,
X19 será
independentemente selecioado de qualquer aminoácido, preferivelmente
ura
aminoácido positivamente carregado tal como K, R, H, ornitina ouhomoarginina ou um aminoácido pequeno flexível tal como glicina ou<400> 65
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)
<223> é um D-aminoácido<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2)..(2)
<223> X9 é G ou uma permuta conservadora de G<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3)..(3)
<223> XlO é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou umapermuta não-conservadora da prolina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4) .. (4)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5).. (5)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6) .. (6)<223> Χ14 é D, Ε, I, L ou V<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (7).. (7)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<400> 66
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPO<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (1) .. (1)
<223> X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral ca-paz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-Y-bromobutírico
<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (2) . . (2)
<223> X7 é R, H, L, W ou Y ou S<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3).. (3)
<223> Χ8 é D-M, D-F, D-I, D-Y, D-H, D-homosserinametiléter ouD-norisoleucina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> X9 i é G ou uma permuta conservadora de G<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5)..(5)
<223> XlO é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou umapermuta não-conservadora de prolina
<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (6) .. (6)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (7).. (7)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> misc_ASPECT0
<222> (8).. (8)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (9).. (9)
<223> X14 é D, Ε, I, L ou V<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Χ15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<400> 67
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)
<223> X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral ca-paz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2)..(2)
<223> X7 é R, H, L, W ou Y ou S<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3)..(3)<223> Χ8 é D-M, D-F, D-I, D-Y, D-H, D-homosserinametiléter ouD-norisoleucina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> X9 é G ou uma permuta conservadora de G<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5)..(5)
<223> XlO é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou umapermuta não-conservadora de prolina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6)..(6)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (7).. (7)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina,
serina, asparagina ou glutamina
<22 0>
<221> misc_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (9) .. (9)
<223> X14 is D, Ε, I, L ou V
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223> Χ15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral
capaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)
<223> X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, pre-
ferivelmente G,
K, L, Q, R, S, Har ou T
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (12)..(12)
<223> X17 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, por
exemplo, A, G, P,
Y ou um aminoácido carregado, natural, não-natural ou derivatizado,preferivelmente K, R, H, ornitina ou homoarginina no caso de umaminoácido positivamente carregado
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, pre-
ferivelmente Lou Q
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido
<400> 68
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptideo mimético de EPO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1) .. (1)
<223> X4 = é F, Y ou um derivado de F ou Y, onde o derivado de
F ou Y carrega pelo menos um substituinte de retitada de elétron
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,K, L, M,
S, T ou I
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3).. (16)
<223> X6 a X19 como definido na fórmula Geral 10 (1 a 14)
<400> 69
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
15 10 15
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptideo mimético de EPOs<22 0>
<221> MISC_ASPECT0<222> (1)..(1)
<223> Χ4 = é F, ou um derivado de F ou Y, onde o
derivado de F ou Y carrega pelo menos vim substituinte de retirada de
elétron<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, H,K, L, M,
S, T ou I.
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3)..(3)
<223> X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral ca-paz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4) . . (4)
<223> X7 é R, H, L, W ou Y ou S<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5)..(5)
<223> X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6)..(6)
<223> X9 é G ou uma permuta conservadora de G<220>
<221> MISC ASPECTO<222> (7).. (7)
<223> XlO é permuta não-conservadora de prolina ou X9 e XlO sãosubstituídos por um único aminoácido
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (9)..(9)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> X13 não é definido
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> X14 é D, Ε, I, L ou V<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> " (12)..(12)
<223> X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<400> 70
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10146
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1) .. (1)
<223> X9 é G ou uma permuta conservadora de G<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2) . . (2)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2)..(11)
<223> pelo menos uma das posições 2 (XlO), 8 (X16), 9 (X17) ou 11 (
X19) descreve um aminoácido positivamente carregado não-proteinogênico
tendo uma cadeia lateral que é alongada comparada à lisina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3) . . (3)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> X13 é W, naftilalanina, A ou F<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (5)..(5)
<223> Χ14 é D, Ε, I, L ou V
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6)..(6)
<223> Χ15 é iam aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutirico
<400> 71
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)
<223> X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral ca-
paz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido ácido a-amino-γ-bromobutírico<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (2) . . (2)
<223> X7 é R, H, L, W ou Y ou S
<220><221> HISC_ASPECTO
<222> (3)..(3)
<223> Χ8 é Μ, F, I, Υ, Η, homosserinametiléter ou norisoleucina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4) .. (4)
<223> Χ9 é G ou uma permuta conservadora de G
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (5)..(5)
<223> no caso de XlO não ser um aminácido positivamente carregado nãp
proteinogênico
tendo uma cadeia lateral que é alongada comparada à lisina,XlO é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou umapermuta não-conservadora de prolina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (6).. (6)
<223> Xll é selecionado de qualquer aminoácido
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (7) . . (7)
<223> X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmente
treonina,
serina, asparagina ou glutamina
<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (8).. (8)
<223> X13 é W, 1-nal, 2-nal, A ou F
<22 0>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (9)..(9)<223> Χ14 é D, Ε, I, L ou V
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de
formar uma ligação covalente ou A ou ácido alfa-amino-gama-bromobutírico
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> no caso de X16 não ser um aminoácido positivamente carregadonão-proteinogênico
tendo uma cadeia lateral que é alongada comparada á lisina,X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, preferi-velmente G,
K, L, Q, R, S ou T
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (12) .. (12)
<223> no caso de X17 não ser um aminoácido positivamente carregadonão-proteinogênico
tendo uma cadeia lateral que é alongada comparada á lisina,
X17 é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, G, Ρ, You um
aminoácido positivamente carregado natural, não-natural ou derivati-zado
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> no caso de X19 não ser um aminoácido positivamente carregadonão-proteinogenico
tendo uma cadeia lateral que é alongada comparada á lisina,X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido
<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural
<400> 72
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 73
<211> 16<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para Peptideo mimético de EPO
<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (1)..(1)
<223> X4 = é F1 Y ou um derivativo de F ou Y, onde o derivativo de
F ou Y carrega pelo menos substituinte de retirada de elétron
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2) . . (2)
<223> X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,
K, L, M1
S, T ou I.
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (3)..(16)
<223> 3 (Χ6) Α16 (Χ19) temo ο mesmo significado omo na fórmula geral
14
(1 a 14)<400> 73
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)<223> is Y
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (2)
<223> é independentemente selecionado de qualquer aminoácido e é pre-ferivelmente
A, Η, K, L, M, S, T ou I
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3).. (12)
<223> tem o significado como descrito nas fórmulas gerais anteriores.
<400> 74
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
<210> 75<211> 16<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso para peptídeo mimético de EPOs
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (1)..(1)
<223> é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, preferi
velmente D, E,
L, N, S, T ou V
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (2).. (13)
<223> tem o significado das fórmulas gerais mencionadas antes
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, preferi
velmente G, K,
L, Q, R, S ou T, mais preferido K, R, S ou T
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (15)..(15)
<223> é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, preferi
velmente A, G,
P, R, Κ, Y ou um aminoácido não-natural com uma cadeia lateral positivamente carregada,
mais preferido R, K ou um aminoácido não-natural tal como homoargini
na<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (16)..(16)
<223> é independentemente selecionado de qualquer aminoácido
<400> 75
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 76
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Ser Leu Thr Trp Val Cis Lys15 10 15
Pro Gln Gly Gly20
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 77
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Thr Leu Thr Trp Val Cis Lys
1 5 10 15
Pro Gln Gly Gly20
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 78
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Gln
1 5 10 15Lys Leu Gly Gly20
<210> 79
<211> 20
5 <212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
10 <221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
15 <222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)20 <223> AMIDAÇÃO
<4 00> 79
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Met Gly Arg Ile Thr Xaa Val Cis Gln15 10 15
Lys Leu Gly Gly
25 20
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
30 <22 0>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220><221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 80
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Leu Arg Gly20
<210> 81
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 81
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Met Gly Lys Ile Thr Trp Val Cis Gln1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly 20
<210> 82
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural
<400> 82
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Leu Gly Gly20
<210> 83
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 83
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 84
<211> 21<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1) .. (1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)<223> AMIDAÇÃO
<400> 84
Cis Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Met Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis
1 5 10 15
Gln Lys Leu Arg Gly20<210> 85
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> acetilisina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18)..(18)
<223> acetilisina
<220>
20 <221> M0D_RES
<222> (21).. (21)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 85
Cis Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cis
1 5 10 15
Lys Xaa Gln Gly Gly20
<210> 86
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220><223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> acetilisina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MODlRES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 86
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 87
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<22 0>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> omitiria
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17) .. (17)
<223> ornitina<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃ0
<400> 87
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cis Lys
1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 88
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1) .. (1)
<223> ACETILAÇÃO<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> naftilalanina 1<220><221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 88
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Arg Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 89
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_AS PECTO
<222> (IO)--(IO)
<223> ornitina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> ornitina
<220>
<221> MOD RES<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO<400> 89
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly 20
<210> 90
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> homoarginina
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 90
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly
20
<210> 91
<211> 20<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> homoarginina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 91
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cis1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220><221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> homoarginina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 92
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly
20
<210> 93
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (10).. (10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> homoarginina<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 93
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 94
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1) . . (1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)<223> D-fenilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÂO
<400> 94
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Xaa Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 95
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> D-fenilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 95
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Xaa Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
_ <222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> D-fenilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> homoarginina<220><221> MOD_RES
<222> (20) . . (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 96
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Xaa Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> D-fenilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> homoarginina<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 97
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Xaa Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4).. (4)
<223> 3-Iodo-tirosina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 98
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
15 10 15Lys Gln Arg Gly20
<210> 99
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1) .. (1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4) . . (4)
<223> 3-Nitro-tirosina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 99
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 100<211> 20<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> peptíâeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> 3,5-dibromo-tirosina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8)..(8)
<223> D-fenilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 100
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> 3,5-dibromo-tirosina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (8).. (8)
<223> D-fenilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 101
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Xaa Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 102
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220><223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> M0D_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 102
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Tyr Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 103
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10) .. (10)
<223> acetilisina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 103
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> acetilisina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 104Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly 20<210> 105<211> 20<212> PRT<213> Artificial<220><223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220><221> MOD_RES<222> (1) . . (1)<223> ACETILAÇÃO
<220><221> MISC_ASPECTO<222> (10)..(10)<223> homoarginina
<220><221> MISC_ASPECTO<222> (13)..(13)<223> naftilalanina 1
<220><221> MISC_ASPECTO<222> (17)..(17)<223> ornitina
<220><221> M0D_RES<222>(20)..(20)<223> AMIDAÇÃO<400> 105
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5
Xaa Gln Arg Gly20
10
15
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
10620PRT
Artificial
peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
M0D_RES(1) · . (1)AC ET ILAÇÃO
MI SC_ASPECTO(10)..(10)ornitina
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina 1
MISC_ASPECTO(17) . . (17)homoarginina
MOD_RES(20) . . (20)AMIDAÇÃO106
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15Xaa Gln Arg Gly
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
107PRT
Artificial
peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
M0D_RES(1) · - (1)ACETILAÇÃO
MISC_ASPECTO(13) . . (13)naftilalanina 1
MISC_ASPECTO(17) . . (17)homoarginina
M0D_RES(20) . . (20)AMIDAÇÃO107
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 108<211> 20<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_AS PECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 108
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly
20
<210> 109
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (10)..(10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 109
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 110
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (16).. (16)<223> homoarginina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 110
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly
20
<210> 111
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> homoarginina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO<400> 111
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly
20
<210> 112<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 112
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 113
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1). . (1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> homoarginina
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 113
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 114
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
ACETILAÇAO
MISC_ASPECTO(4)..(4)
3,5 dibromo-tirosina
MOD_RES(20) . . (20)AMIDAÇÃO
114
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
11520PRT
Artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>
peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
MOD_RES(1)..(1)ACETILAÇAO
MI SC_ASPECTO(4) . . (4)
3,5 dibromo-tirosina
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 115
Gly Gly Leu Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 116<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)<22 3 > AMIDAÇÃO
<400> 116
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Asp Gly20<210> 117
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 117
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 118
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19) .. (19)
<223> ácido alfa-amino adípico, C6<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 118
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 119
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 119
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 120<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 120
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20<210> 121
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 121
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Glu Gln Arg Gly20
<210> 122
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃ0
<400> 122
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Asp Gln Arg Gly20
<210> 123
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO<400> 123
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Ser Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 124
<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 124
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Gln Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 125
<211> 20<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 125
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Asn Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 126
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> lisina modificada com ácido glutárico<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (18)..(18)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 126
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Xaa Gln Arg Gly20
<210> 127
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<22 0>
<221> MISC_ASPECTO<222> (13) . . (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> lysine modified com umadipic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 127
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 128
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> . (13) . . (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 128Gly Gly Thr Tyr Ser Ala His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Ala Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly Cis20129PRT
Artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
MOD_RES(1) - · (1)ACETILAÇÃO
MISC_ASPECTO(10)..(10)homoarginina
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina 1
MOD_RES(20)..(20)AMIDAÇÃO129
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Asp Gly20
<210> 130<211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>< 2 2 2 ><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Gly Gly1
Lys Gln
<210><211>
20PRT
Artificial
peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
M0D_RES(1) . . (1)ACETILAÇÃO
MISC_ASPECTO(10)..(10)homoarginina
MISC_ASPECTO(10)..(10)homoarginina
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina 1
MOD_RES(20)..(20)AMIDAÇÃO
130
Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys5 10 15
Glu Gly20
13120<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> ácido alfa-amino adipico, C6<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 131
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 132
<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 132
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Asp Gln Asp Gly20
<210> 133
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 133
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Glu Gln Glu Gly
15 20
<210> 134
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)<223> ácido alfa-amino adípico, C6<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19) . . (19)
<223> ácido alfa-amino adípico, C6<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 134
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Xaa Gly20
<210> 135
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<22 3> AC ET ILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 135
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Asp Gln Asp Gly20
<210> 136
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 136Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Glu Gln Glu Gly20
<210> 137
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> homoarginina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> ácido alfa-amino adípico, C6<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> ácido alfa-amino adípico, C6<220>
<221> MOD_RES<222> (20).. (20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 137
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Xaa Gly20
<210> 138
<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 138
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 139
<211> 20<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MOD_RES
<222> (20) . . (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 139
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Glu Gln Gly Gly20
<210> 140
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 140
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 141
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptideo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> lisina modificada com ácido glutárico<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 141
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 142
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)<223> ACETILAÇÃO
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 1
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17) . . (17)
<223> lisina modificada com ácido glutárico
<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 142
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15Xaa Gln Glu Gly 20 <210> 143 <211> 6 <212> PRT <213> consenso de peptídeo mimético de EPO<220> <221> MISC_ASPECT0 <222> (1) .... (1) <223> X14 é selecionado do grupo consistindo em D, Ε, I, L ou V<220> <221> MISC_ASPECTO <222> (2)..(2) <223> X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateral
capaz de formar uma ligação covalente ou A<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (3) .. (3)
<223> X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, pre-
ferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4).. (4)
<223> X17 é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A, G,
Ρ, Y ou aminoácido positivamente ou negativamente carregado natural, não-natural ou derivatizado, no caso de um aminoácido positivamente carregado<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (5)..(5)
<223> X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_ASPECTO208
<222> (6)..(6)
<223> Χ19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido
<400> 143Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 144
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> homoarginina<220>
<221> M0D_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 144
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Asp Gly20
<210> 145<211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
20PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
peptídeo mimético de EPO
M0D_RES(1) . . (1)ACETILAÇÃO
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina
MISC_ASPECTO(17) . . (17)homoarginina
MISC_ASPECTO(19)..(19)aad
MOD_RES(20)..(20)AMIDAÇÃO145
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15
Xaa Gln Xaa Gly20
<210> 146
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> aad<220>
<221> M0D_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 146
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis
15 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 147
<211> 20
<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da página 74<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> M0D_RES
<222> (13).. (13)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 147
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly
20
<210> 148
<211> 41
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> peptídeo mimético de EPO mostrado na página 74<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MOD_RES<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Xaa Gly1
Lys Lys
Thr Xaa
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
(1)..(1)
C BLOQUEADO com tBu
MISC_ASPECTO(14)..(14)naftilalanina
MISC_ASPECTO(34)..(34)naftilalanina
MOD_RES(41).. (41)AMIDAÇÃO
148
Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis
5 10 15
Gln Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu
20 25 30
Val Cis Lys Lys Gln Arg Gly35 40
14920PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
peptídeo mimético de EPO mostrado na página 78
MOD_RES(1) .. (1)AC ETILAÇÃO149Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 150
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> peptídeo mimético de EPO da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Acl<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> acl<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 150
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 151
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> tomado da Fig. 7<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> ornitina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> ornitina<220>
<221> MOD_RES
<222> (20) . .(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 151
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly
20
<210> 152
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220>
<221> M0D_RES
<222> (20)..(20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> · 152
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Arg Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 153
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
MI SC_ASPECTO(10)..(10)ornitina
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina
MISC_ASPECTO(17)..(17)ornitina
M0D_RES(20) . . (20)AMIDAÇÃO
153
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15 Xaa Gln Arg Gly20
15420PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221>
da Fig. 7
MOD_RES(1) .. (1)ACETILAÇÃO
MISC ASPECTO<222> (17).. (17)
<223> Har
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20).. (20)
<223> AMIDAÇÃO
<400> 154
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 155
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<22 0>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETILAÇÃO<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> har<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)<223> AMIDAÇÃO
<400> 155
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 156
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> har
<400> 156
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 157
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223> har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> har
<400> 157
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 158
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4).. (4)
<223> It3
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 158
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 159
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (4)..(4)
<223> Nt3
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 159
Gly Gly Thr Xaa Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 160<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<400> 160
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Tyr Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly<210> 161
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> Acl<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 161
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly
20
<210> 162
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (17).. (17)
<223> acl
<400> 162
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 163
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)<223> Har
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> ornitina
<400> 163
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 164
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 164
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 165
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECT0
<222> (16)..(16)<223> har
<400> 165
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20<210> 166<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 166
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 167
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 167
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15
Lys Gln Asp Gly20
<210> 168<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 168
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 169
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MI SC_AS PECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 169
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 170
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 170
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Glu Gln Arg Gly20
<210> 171
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 171
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys15 10 15
Asp Gln Arg Gly20
<210> 172
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 172
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Ser Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 173
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<400> 173
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Gln Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 174
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 174
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Asn Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Arg Gly20
<210> 175
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17) . . (17)
<223> K(Glr)
<400> 175
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 176
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> K(Adi)
<400> 176
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 177
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223> har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 177
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Asp Gly20<210> 178
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 178
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 179
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<22 0>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 179
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20<210> 180<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 180
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly
20
<210> 181
<211> 20
<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 181
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 182<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)<223> ornitina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> har
<400> 182
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Arg Gly20
<210> 183<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 183
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Ser Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 184
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 184
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Asp Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 185
<211> 20<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 185
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Glu Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 186<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 186
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Asn Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 187
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220><223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 187
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Trp Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 188<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 188
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Met Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 189
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 189
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ile Thr Xaa Val Cis Lys 1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 190
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<400> 190
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Met Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 191
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)<223> naftilalanina
<400> 191
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Val Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 192
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<400> 192
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ala Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 193
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 193Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Thr Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 194
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 194
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Ser Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 195
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)<223> Nva
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . .(13)<223> naftilalanina
<400> 195
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Xaa Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 196
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)
<223> Abu
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 196
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Xaa Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly
20
<210> 197
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 197
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Glu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 198
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<400> 198
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Lys Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 199
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)<223> naftilalanina
<400> 199
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Phe Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 200<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 200
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Gln Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 201<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<22 0>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina 2
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 201
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 202<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<400> 202
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 203
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> Aad
<400> 203
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15Lys Gln Xaa Gly20
<210> 204
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 204
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 205
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> Aad
<400> 205
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 206<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) . . (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> Aad
<400> 206
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 207
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220><223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 207
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 208<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 208
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 209
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 209
Gly Gly Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 210<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<400> 210
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 211<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 211
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15Lys Gln Glu Gly20
<210> 212<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina 2
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> Aad
<400> 212
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 213
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<400> 213
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
214
20
PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
da Fig. 7
MISC_ASPECTO(19)..(19)Aad
214
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
21520PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina215
Gly Ala Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 216<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 216
Gly Ala Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 217
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 217
Gly Ala Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 218<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MI SC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina
MISC_ASPECT0(19)..(19)Aad218
Gly Ala Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly2021920PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MI SC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina
MISC_ASPECTO(19)..(19)Aad219
Gly Ala Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15Lys Gln Xaa Gly20
<210> 220<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> Aad
<400> 220
Gly Ala Leu Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 221<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<400> 221Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 222<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 222
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 223
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 223
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20<210> 224
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 224
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly
20
<210> 225
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 225
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 226<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<22 0>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftailalanina
<400> 226
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 227
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223><220><221><222><223><400>
Har
MI SC_ASPECTO(13) . . (13)naftilalanina
227
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Asp Gly20
22820PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MISC_ASPECTO(10)..(10)har
MISC_ASPECTO(13) .. (13)naftilalanina228
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 229
<211> 20<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 229
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 230
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo miméti co de EPO axtificíâ.1<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 230
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Asp Gly20
<210> 231<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 231
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15 Lys Gln Glu Gly20
<210> 232
<211> 20
<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17) .. (17)
<223> Har<400> 232
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Glu Gly20
<210> 233
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (16)..(16)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> Har
<400> 233
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 234
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (16).. (16)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>
<221> MI SC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 234
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 235
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> Har
<400> 235
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Glu Gly20
<210> 236
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<22 0>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> Har
<400> 236
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Glu Gly20
<210> 237
<211> 20<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Aad<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> Har
<400> 237
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Glu Gly
20
<210> 238
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Aad<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> Har
<400> 238
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Asp Gly20
<210> 239
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223> Aad
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19)..(19)
<223> Aad
<400> 239
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15Lys Gln Xaa Gly20
<210> 240
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 240
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 241
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 241Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Xaa Gly20
<210> 242
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina
<400> 242
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 243
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> naftilalanina
<400> 243
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Hi& Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 244
<211> 20<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> Har
<400> 244
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 245
<211> 20<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> homoarginina
<400> 245
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 246
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 246
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 247
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220><223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (IO)--(IO)
<223> homoarginina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 247
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 248
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 248
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 249
<211> 20<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> Nal
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (16).. (16)
<223> Har
<400> 249
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 250
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 250
Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 251
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 251
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 252
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> Nal<400> 252
Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 253
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<400> 253
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Ser Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 254
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13) .. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO<222> (16).. (16)<223> Har
<400> 254
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 255
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 255
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Ser Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 256
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_AS PECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 256
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly20
<210> 257
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (20).. (20)<223> Aad
<400> 257
Gly Gly Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 258
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 258
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 259
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 259
Gly Gly Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 260<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<400> 260
Gly Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 261<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<400> 261
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Trp Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Gly Gly20
<210> 262<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MI SC_AS PECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 262
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Ser Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 263
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<400> 263
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 264
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> Har
<400> 264
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Xaa Lys Gln Arg Gly20
<210> 265
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 265
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Arg Gly20
<210> 266<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 266
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Asp Gln Arg Gly20
<210> 267
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 267
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Asp Gly20
<210> 268<211> 21<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<400> 268
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis
1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 269
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (20).. (20)<223> Aad
<400> 269
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 270
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 270
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis15 10 15
Lys Lys Gln Arg Gly20
<210> 271
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14) . . (14)<223> naftilalanina
<400> 271
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Glu Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Gly Gly20
<210> 272
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<400> 272
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Asp Gly20
<210> 273
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14) . . (14)
<223> naftilalanina
<220><221> MISC_ASPECTO
<222> (18).. (18)<223> Har
<400> 273
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Xaa Gln Gly Gly20
<210> 274
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14) .. (14)
<223> naftilalanina
<400> 274
Gly Ala Gly Leu Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 275
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MISC_ASPECTO(14)..(14)naftilalanina
275
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
27621PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MISC_ASPECTO(14)..(14)naftilalanina
MISC_ASPECTO(20)..(20)Aad276
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 277
<211> 21<212> PRT<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (20)..(20)
<223> Aad
<400> 277
Gly Ala Gly Thr Tyr Ala Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 278
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 278
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Asp Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 279<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (H)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 279
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Asp Gly20
<210> 280
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11) . . (11)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina<400> 280
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 281<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (20)..(20)<223> Aad
<400> 281
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 282<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)<223> ornitina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18)..(18)<223> Har
<400> 282
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Trp Val Cis1 5 10 15
Lys Xaa Gln Arg Gly20
<210> 283
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<400> 283
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Lys Gln Glu Gly20
<210> 284
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (20)..(20)<223> Aad
<400> 284
Gly Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20
<210> 285
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<400> 285
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Arg Gly20<210> 286
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14) .. (14)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18).. (18)
<223> Har
<400> 286
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis
1 5 10 15
Lys Xaa Gln Gly Gly20
20 <210> 287
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11)..(11)
<223> ornitina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18) . . (18)<223> Har
<400> 287
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Xaa Gln Arg Gly20
<210> 288<211> 21<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7 .
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (11).. (11)<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina
<400> 288
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Arg Gly20
<210> 289
<211> 21<212> PRT<213> peptideo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18).. (18)
<223> Har
<400> 289
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis
1 5 10 15
Lys Xaa Gln Arg Gly20
<210> 290
<211> 21
<212> PRT
<213> peptideo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18)..(18)
<223> Har
<400> 290
Gly Gly Gly Leu Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Xaa Gln Arg Gly20
<210> 291
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MI SC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (18)..(18)
<223> Har
<400> 291
Gly Ala Gly Thr Tyr Ser Cis Ser Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis
1 5 10 15
Lys Xaa Gln Gly Gly20
<210> 292
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10)..(10)
<223> Aad<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> Har
<400> 292
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 293
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> Har
<400> 293
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Arg
1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20<210> 294
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (16).. (16)
<223> Har<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17).. (17)
<223> Har
<400> 294
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
<210> 295
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (10).. (10)<223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
Har
MISC_ASPECTO(13) . . (13)naftilalanina
MISC_ASPECTO(17)..(17)Har
295
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Xaa Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Gly Gly20
29620PRT
peptídeo mimético de EPO artificial
<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>
da Fig. 7
MISC_ASPECTO(13)..(13)naftilalanina
MI SC_ASPECTO(16)..(16)Har296
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Xaa1 5 10 15
Lys Gln Gly Gly<210> 297
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 297
Gly Ala Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15 Lys Gln Xaa Gly20
<210> 298
<211> 20<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial
<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13).. (13)
<223> naftilalanina
<220>
<221> MISC ASPECTO<222> (17)..(17)
<223> Har
<400> 298
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys
1 5 10 15
Xaa Gln Asp Gly20
<210> 299
<211> 20
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (13)..(13)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (17)..(17)
<223> Har
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad
<400> 299
Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis Lys1 5 10 15
Xaa Gln Xaa Gly
20
<210> 300
<211> 21<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7
<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14)..(14)
<223> naftilalanina
<400> 300
Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Glu Gly20
<210> 301
<211> 21
<212> PRT
<213> peptídeo mimético de EPO artificial<220>
<223> da Fig. 7<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (14).. (14)
<223> naftilalanina<220>
<221> MISC_ASPECTO
<222> (19).. (19)
<223> Aad<220>
<221> misc_ASPECTO
<222> (20)..(20)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural
<400> 301Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cis His Phe Gly Lys Leu Thr Xaa Val Cis1 5 10 15
Lys Lys Gln Xaa Gly20

Claims (95)

1. Peptídeo sendo capaz de ligar-se ao receptor de EPO, sele-cionado do grupo que consiste em- peptídeos que compreendem a seguinte seqüência de consen-so de aminoácidos:X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais eXe é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;X7 é R, H, L1 W, Y ou S;Xe é M, F, eu, homosserinametiléter ou norisoleucina;X9 é G ou uma permuta conservadora de G ;X10 é um permuta não-conservadora de prolina;ou Xg e X10 são substituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A ;X13 é W, 1-nal, 2-nal, A ou F;X14 é D, E, eu, Lou V ;X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico e- fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados e variantesdos peptídeos definidos pela seqüência de consenso anterior, que descreveuma atividade mimética de EPO e tem um aminoácido na posição X1O queconstitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que Xg e X1O sãosubstituídos por meio de um único aminoácido.
2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, em que os amino-ácidos na posição Xe e X1S são escolhidos tal que eles sejam capazes deformar uma ponte intramolecular dentro do peptídeo formando-se uma liga-ção covalente entre suas cadeias laterais.
3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2, em que a ponte éou uma ponte de dissulfeto ou uma ponte de disselenida.
4. Peptídeo, de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a 3, em que o aminoácido em X6 e ou Xi5 são selecionados do grupo que com-preende cisteína, derivado de cisteína, tal como homocisteína e selenociste-ína, tiolisina, K ou E.
5. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que X13 é naftilalanina.
6. Peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento,capaz de se ligar ao receptor de EPO e compreendendo uma atividade ago-nista, selecionada das seguintes duas alternativas,(a) um peptídeo que compreende a seguinte seqüência núcleode aminoácidos:X9X10X11X12X13em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais, e em que:X9 é G ou uma permuta conservadora de G ;X10 é uma permuta não-conservadora de prolina ou X9 e X10 sãosubstituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A;X13 é naftilalanina.(b) um peptídeo, especialmente um que seja capaz de ligar-seao receptor de EPO que compreende a seguinte seqüência de aminoácidos:X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais eXe é C, A, E, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína(hoc);X7 é R, H, L, W ou Y ou R, H, L1 W1 Y ou S;X8 é M, F, I, homoserinametiléter ou norisoleucina;X9 é G ou uma permuta conservadora de G;Χ10 é uma permuta não-conservadora de prolina;ou X9 e X1O são substituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é T ou A;X13 é 1-nal, 2-nal,X14 é D, E, eu, L ou V;X15 é C, A, K, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína (hoc)contanto que Xe ou X15 seja C ou hoc(c) fragmentos funcionalmente equivalentes, derivados e varian-tes dos peptídeos definidos pelas seqüências de consenso anteriores quedescrevem uma atividade mimética de EPO e têm um aminoácido na posi-ção X10 que constitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em queX9 e X1O são substituídos por meio de um único aminoácido e uma naftilala-nina na posição X13-
7. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 6, compreendendo aseguinte seqüência núcleo de aminoácidos:XeX 7X8X9X10X11X12X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais, e em que:X6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-y-bromobutírico;X7 é R, H, L, W ou Y ou S;X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina;X9 é G ou uma permuta conservadora de G;X1O é uma permuta não-conservadora de prolina ou X9 e X1O sãosubstituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X13 é naftilalanina;X14 é D1 Ε, I, Lou V;Xi5 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido oc-amino-γ-bromobutírico.
8. Peptideo1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, caracterizado pelo fato de que descreve um aminoácido carregado na po-sição X-io.
9. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-8, compreendendo as seguintes posições de aminoácido adicionais :X16X17X18X19em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais eX16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G1 K1 L1 Q1 R1 S1 Har ou T;X17 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente A1 G, P, R, Κ, Y, Har,;Xis é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q,;X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido.
10. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que X17 é um aminoácido carregado.
11. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9 ou 101 caracteri-zado pelo fato de que Xi9 é um aminoácido carregado.
12. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 8 a 11, emque o aminoácido carregado na posição Xi0, X17 e/ou Xi9 é positivamente ounegativamente carregado e é selecionado do grupo que consiste em amino-ácidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivados.
13. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que Χίο, X17 e/ou Xi9 é um aminoá-cido negativamente carregado.
14. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o referido aminoácido negativamente carregado é selecio-nado do grupo que consiste em- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmen-te D ou E;- aminoácidos negativamente carregados não-naturais que pre-ferivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada tal como Aad 2-aminoeptanodiácido, Asu;- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para fornecer umgrupo negativamente carregado.
15. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o grupo usado para converter aminoácidos positivamentecarregados em aminoácidos negativamente carregados é selecionado dediácidos, tal como por exemplo, ácidos dicarboxílicos ou ácidos dissulfônicos.
16. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o aminoácido positivamente carregado é selecionado dogrupo que consiste em- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina ou ornitina;- aminoácidos positivamente carregados não-naturais que des-crevem na posição Xio e/ou X17 preferivelmente uma cadeia lateral compridatal como em, por exemplo, homoarginina;- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
17. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, emque Xe é um ácido D-amino, preferivelmente D-fenilalanina.
18. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 1 a 17,compreendendo a seguinte seqüência de aminoácido:X4X5X6X7X8X9X10X11 Xi 2X13X14X15X1 βΧι 7X1 eXi 9em que X6 a X19 têm o significado acima e em queX4 = é F1 Y ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de Fou Y carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron em que o substi-tuinte retirado de elétron é selecionado preferivelmente do grupo que consis-te no grupo amino, o grupo nitro e halogênios e em que X4 é selecionadopreferivelmente do grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina;X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,H.K.L.M.S.Toul.
19. Peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento,capaz de ligação ao receptor de EPO e compreendendo uma atividade ago-nista, selecionado do grupo que consiste em,- peptídeos que compreendem pelo menos uma das seguintesseqüências núcleo de aminoácidos:X9X10X11X12X13;X9X10X11X12X13X14X15X16X17ouX9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em que em pelo menos uma das posições X10, X17 ou X19 é umaminoácido negativamente carregado e em queX9 é G ou uma permuta conservadora de G ;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X13 é W, 1 -nal, 2-nal, A ou F;XMé D, Ε, I, Lou V ;X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T ;X-I8 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,ou homoarginina;contanto que pelo menos um dos X-m, X17 ou X19 seja um amino-ácido negativamente carregado, preferivelmente X19.
20. Peptídeo, de acordo com reivindicação 7 ou 8, caracterizadopelo fato de que o referido aminoácido negativamente carregado é selecio-nado do grupo que consiste em,- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmente D ou E;- aminoácidos negativamente carregados não-naturais, que pre-ferivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada tal como Aad, 2-aminoeptanodiácido, Asu,- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para fornecê-los comum grupo negativamente carregado.
21. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7a 9, caracterizado pelo fato de que no caso de um aminoácido positivamentecarregado está presente em pelo menos um das posições X10, X17 e/ou X19ele é selecionado do grupo que consiste em- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina e ornitina;- aminoácidos positivamente carregados não-naturais, que des-crevem na posição X10 e/ou X-17 preferivelmente uma cadeia lateral alongadacomo em, por exemplo, homoarginina;- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
22. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7a 10, caracterizado pelo fato de que são selecionados do grupo que consisteemAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQDG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQEG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQ-Aad-G-Amum aminoácido positivamente carregado natural, não-natural ou derivado,preferivelmente K, R1 H, ornitina ou homoarginina;X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;no caso de Xi9 não ser um aminoácido negativamente carrega-do, X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido, preferi-velmente um aminoácido positivamente carregado tal como K, R, H, ornitinaou homoarginina;contanto que pelo menos um dos X10, X17 ou X19 seja um amino-ácido negativamente carregado, preferivelmente X19.
23. Peptídeo, de acordo com reivindicação 19 ou 20, caracteri-zado pelo fato de que o referido aminoácido negativamente carregado é se-lecionado do grupo que consiste em,- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmen-te D ou E;- aminoácidos negativamente carregados não-naturais, que pre-ferivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada tal como Aad, 2-aminoeptanodiácido, Asu,- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para fornecê-los comum grupo negativamente carregado.
24. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 19 a 21,caracterizado pelo fato de que no caso de um aminoácido positivamente car-regado está presente em pelo menos um das posições X10, X17 e/ou X19 eleé selecionado do grupo que consiste em- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina e ornitina;- aminoácidos positivamente carregados não-naturais, que des-crevem na posição X10 e/ou X17 preferivelmente uma cadeia lateral alongadacomo em, por exemplo, homoarginina;- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
25. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 19 a 22,compreendendo a seguinte seqüência de aminoácido:em que Xe a Xi9 têm o significado acima e em queX4 = é F, Y ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de Fou Y carrega pelo menos um substituinte retirado do elétron;Xe = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,Η, K, L, M, S1Tou I.
26. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 23, em que o subs-tituinte retirado de elétron é selecionado do grupo que consiste no grupo a-mino, o grupo nitro e halogênios e em que X4 é preferivelmente selecionadodo grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.X4X5X6X7X8X9X10X1 1X1 2X13X14X15X16X17X18X19
27. Peptídeo, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções 19 a 24, caracterizado pelo fato de que X13 é naftilalanina.
28. Peptídeo, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções 19 a 25 que são selecionados do grupo que consiste emAc-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQDG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQEG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQ-Aad-G-AmAc-GGTYSCHFGELT-NaI-VCKKQRG-AmAc-GGTYSCHFGDLT-NaI -VCKKQRG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKEQRG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKDQRG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCK-K(GIr)-QRG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCK-K(Adi)-QRG-AmAc-GATYSCHFGKLT-NaI-VCKKQ-Aad-G-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCK-Har-QDG-AmAc-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCK-Har-Q-Aad-G-AmGGGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQEG-AmGGGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQ-Aad-G-Am
29. Peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento,capaz de se ligar ao receptor de EPO e compreendendo uma atividade ago-nista, selecionado do grupo que consiste em :- peptídeos caracterizados pela seguinte seqüência núcleo deaminoácidos:XeXgXioXl 1X12X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em queX8 é um D-aminoácido;X9 é G ou uma permuta conservadora de G;X10 é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou um per-muta não-conservadora de prolina;ou Xg e X10 são substituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X14 é D, Ε, I, Lou V;X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido oc-amino-γ-bromobutírico e- fragmentos, derivados e variantes funcionalmente equivalentesdos peptídeos definidos pela seqüência de consenso anterior que descreveuma atividade mimética de EPO e tem um D-aminoácido na posição Xe.
30. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 27, compreenden-do a seguinte seqüência núcleo de aminoácidoXeXyXeXgXioXi 1X12X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em queX6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;X7 é R1 H1 L1WouY ou S;X8 é D-M1 D-F, D-I, D-Y, D-H, D-homosserinametiléter ou D-norisoleucina;X9 é G ou uma permuta conservadora de G;X10 é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou um per-muta não-conservadora de prolina;ou Xg e X-io são substituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X14 é D, Ε, I, Lou V;X-i5 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico.
31. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracteri-zado pelo fato de que Xe é D-fenilalanina.
32. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 27 a 29, caracteri-zado pelo fato de que descreve um aminoácido carregado na posição X1O-
33. Peptídeo, de acordo com as reivindicações 27 a 30, compre-endendo a seguinte seqüência de aminoácido:X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19em que X6-X15 têm o significado acima e em queX16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S, Har ou T ;X17 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente A, G, Ρ, Y ou um aminoácido positivamente carregado natu-ral, não-natural ou derivado, preferivelmente K, R, H, ornitina ou homoargini-na;Xis é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido.
34. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que X17 é um aminoácido carregado.
35. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracteri-zado pelo fato de que X19 é um aminoácido carregado.
36. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 30 a 33,em que o aminoácido carregado na posição X10, X17 e/ou X19 é positivamen-te ou negativamente carregado e é selecionado do grupo que consiste emaminoácidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivados.
37. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações preceden-tes, caracterizado pelo fato de que X10, X17 e/ou X19 é um aminoácido nega-tivamente carregado.
38. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o referido aminoácido negativamente carregado é selecio-nado do grupo que consiste em- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmente D ou E;- aminoácidos negativamente carregados não-naturais que pre-ferivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada tal como em Aad, 2-aminoeptanodiácido, Asu;- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivados com grupos químicos adequados para lhes fornecer umgrupo negativamente carregado.
39. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o grupo usado para converter aminoácidos positivamentecarregados em aminoácidos negativamente carregados é selecionado dediácidos, tal como, por exemplo, ácidos dicarboxílicos ou ácidos dissulfônicos.
40. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o aminoácido positivamente carregado é selecionado dogrupo que consiste em- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina e ornitina;- aminoácidos positivamente carregados não-naturais que des-crevem preferivelmente na posição X10 e/ou X17 uma cadeia lateral alongadatal como em, por exemplo, homoarginina;- aminoácidos originalmente negativamente carregou que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
41. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 27 a 38,compreendendo a seguinte seqüência de aminoácido:X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19em que X& a X19 têm o significado acima e em queX4 = é F, Y ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de Fou Y carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron;X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,Η, K, L, M, S1Tou I.
42. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, em que o subs-tituinte retirado de elétron é selecionado do grupo que consiste no grupo a-mino, grupo nitro e halogênios.
43. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 39, em que X4 éselecionado do grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.
44. Peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento,capaz de se ligar ao receptor de EPO e compreendendo uma atividade ago-nista, selecionado do grupo que consiste em:- peptídeos caracterizados pela seguinte seqüência núcleo deaminoácidos:X4X5X6X7X8X9X10X11 Xi 2X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em queX4 = é F, ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de F ouY carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron;X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,H, K1 L, M, S1Tou I.Xe é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;X7 é R, H, L1WouY ou S;X8 é M, F, I, Y1 H1 homosserinametiléter ou norisoleucina;X9 é G ou uma permuta conservadora de G;X-io é permuta não-conservadora de prolina ou X9 e X10 sãosubstituídos por meio de um único aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X14 é D, Ε, I, L ou V ;X-I5 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido oc-amino-γ-bromobutírico- fragmentos, derivados e variantes funcionalmente equivalentesdos peptídeos definidos pela seqüência de consenso anterior que descreveuma atividade mimética de EPO e tem um aminoácido na posição Xi0 queconstitui uma permuta não-conservadora de prolina ou em que X9 e Xi0 sãosubstituídos por meio de um único aminoácido e estão na posição X4 F, ouum derivado de F ou Y, em que o derivado de F ou Y carrega pelo menosum substituinte retirado de elétron.
45. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 42, em que o subs-tituinte retirado de elétron é selecionado do grupo que consiste no grupo a-mino, grupo nitro e halogênios.
46. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 42, em que X4 éselecionado do grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina.
47. Peptídeo, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que descreve um aminoácido carre-gado na posição Xio-
48. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 42, compreenden-do a seguinte seqüência de aminoácido :X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19em que X6 a X15 têm o significado acima e em queX16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S1 Har ou T;X17 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente A, G, P ou Y;X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;X19 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido.
49. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que X17 é um aminoácido carregado.
50. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracteri-zado pelo fato de que X19 é um aminoácido carregado.
51. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 45 a 48,em que o aminoácido carregado na posição X10, X17 e/ou X19 é positivamen-te ou negativamente carregado e é selecionado do grupo que consiste emaminoácidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivatizados.
52. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações preceden-tes 45 a 49, caracterizado pelo fato de que X10, X17 e/ou X19 é um aminoáci-do negativamente carregado.
53. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 50, caracterizadopelo fato de que o referido que aminoácido negativamente carregado é sele-cionado do grupo que consiste em- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmen-te D ou E;- aminoácidos negativamente carregados não-naturais que pre-ferivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada como em Aad, 2-aminoeptanodiácido, Asu;- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo negativamente carregado.
54. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que o grupo usou por converter aminoácidos positivamente car-regados em aminoácidos negativamente carregados é selecionado de diáci-dos, como por exemplo ácidos de dicarboxílico ou ácidos de dissulfônico.
55. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que o aminoácido positivamente carregado é selecionado dogrupo que consiste em- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplolisina, histidina de arginina e ornitina;- aminoácidos positivamente carregados não-naturais que des-crevem preferivelmente na posição Xio e/ou Xi7 uma cadeia lateral alongadacomo em, por exemplo, homoarginina;- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivatizados com grupos químicos adequados para lhes fornecerum grupo positivamente carregado.
56. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 42 a 53,em que X8 é um D-aminoácido, preferivelmente D-fenilalanina.
57. Peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos em comprimento,capaz de se ligar ao receptor de EPO e compreendendo uma atividade ago-nista, selecionado do seguinte grupo de peptídeos :(a) um peptídeo, compreendendo a seguinte seqüência núcleode aminoácidos:XgX 10X11 Xl 2X13;X9X10X11X12X13X14X15X16X17OUX9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais, e em que:X9 é G ou uma permuta conservadora de G;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;Χ12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X13 é W, naftilalanina, A ou F;X14é D1 Ε, I, Lou V;X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico,como também fragmentos, derivado e variantes funcionalmenteequivalentes dos peptídeos definidos pela seqüência de consenso anteriorque descreve uma atividade mimética de EPOem que pelo menos uma das posições X10, Xi6, X17 ou X19 des-creve um aminoácido não-proteinogênico positivamente carregado que temuma corrente lateral que é alongada em comparação à lisina;(b) um peptídeo, especialmente um que seja capaz de ligar-seao receptor de EPO que compreende a seguinte seqüência de aminoácidos:X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais eXe é C, A, E, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína(hoc);X7 é R1 H, LlWouY ou S;Xe é M, F, I, homosserinametiléter ou norisoleucina;Xg é G ou uma permuta conservadora de G;X10 é HarX11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é T ou A;X13 é W, 1 -nal, 2-nal, A ou F;X14 é D, Ε, I, Lou V;X15 é C, A, K, ácido a-amino-y-bromobutírico ou homocisteína(hoc)contanto que Χβ ou X15 seja C ou hoc;(c) um peptídeo, compreendendo a seguinte seqüência de ami-noácido,X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16Χ17X18em que Χβ a Xi5 têm o significado acima da variante (b) e em queX3 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente D, E, L, N, S, T ou V;X4 é Y;X5 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente A, Η, K, L, M, S, T ou I.X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S ou T;X17 é homoarginina;X18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido.
58. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 55, compreenden-do a seguinte seqüência núcleo de aminoácidos:X6X7X8X9X10X11X12X13X14X10X16X17X18X19em que cada aminoácido é selecionado de aminoácidos naturais ou não-naturais e em queX6 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido a-amino-γ-bromobutírico;X7 é R, H, L, W ou Y ou S;X8 é M, F, I, Υ, H, homosserinametiléter ou norisoleucina;X9 é G ou uma permuta conservadora de G;no caso de X10 não é um aminoácido não-proteinogênico positi-vãmente carregado que tem uma corrente lateral que é alongada em compa-ração à lisina,X10 é prolina, uma permuta conservadora de prolina ou um per-muta não-conservadora de prolina ou Xg e X10 é substituída por meio de umúnico aminoácido;X11 é selecionado de qualquer aminoácido;X12 é um aminoácido polar não-carregado ou A; preferivelmentetreonina, serina, asparagina ou glutamina;X13 é W, 1-nal, 2-nal, A ou F;X14 é D, Ε, I, Lou V;X15 é um aminoácido com uma funcionalidade de cadeia lateralcapaz de formar uma ligação covalente ou A ou ácido oc-amino-γ-bromobutírico;no caso de Xi6 não ser um aminoácido não-proteinogênico posi-tivamente carregado que tem uma corrente lateral que é alongada em com-paração à lisina,X16 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente G, K, L, Q, R, S ou T;no caso de Xi7 não ser um aminoácido positivamente carregadonão-proteinogânico que tem uma corrente lateral que é alongada em compa-ração à lisina, X17 é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,G, Ρ, Y ou um aminoácido positivamente carregado natural, não-natural ouderivado, preferivelmente K, R, H ou ornitina,;X-18 é independentemente selecionado de qualquer aminoácido,preferivelmente L ou Q;no caso de Xi9 não ser um aminoácido positivamente carregadonão-proteinogênico que tem uma corrente lateral que é alongada em compa-ração à lisina, Xi9 é independentemente selecionado de qualquer aminoáci-do, preferivelmente um aminoácido positivamente carregado tal como K, R,H ou ornitina;contanto que pelo menos um dentre X10, X16. X17 ou Xi9 seja umaminoácido não-proteinogênico positivamente carregado que tem uma cor-rente lateral que é alongada em comparação à lisina.
59. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 56, em que pelomenos um dentre Xi0, X16. X17 ou Xi9 é um aminoácido positivamente carre-gado e em que o aminoácido positivamente carregado é selecionado preferi-velmente do grupo que consiste em:- aminoácidos positivamente carregados naturais, por exemplo,lisina, arginina, histidina e ornitina;- aminoácidos positivamente carregados não-naturais que prefe-rivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada em comparação à lisina;- aminoácidos originalmente negativamente carregados que são,porém, derivados com grupos químicos adequados para lhes fornecer umgrupo positivamente carregado;contanto que pelo menos um dentre Xi0, X16, X17 ou X19 seja umaminoácido não-proteinogênico positivamente carregado que tem uma cor-rente lateral que é alongada em comparação à lisina.
60. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 57, em que o alon-gamento do aminoácido positivamente carregado é fornecido por unidadesde alongamento da corrente lateral, em que as unidades de alongamentosão grupos alifáticos ou aromáticos.
61. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 58, em que o alon-gamento é fornecido pela unidades de CH2, em que o número de unidadesde CH2 é preferivelmente entre 1 e 6.
62. Peptídeo, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções 55 a 59, em que o aminoácido não-proteinogênico positivamente carre-gado que é alongado em comparação à lisina, é um aminoácido não-natural.
63. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 60, em que o refe-rido aminoácido não-natural é selecionado do grupo que compreende homo-arginina, aminofenilalanina e aminonaftilalanina.
64. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que X10 ou X17 é um aminoácido carregado.
65. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que X19 é um aminoácido carregado.
66. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 55 a 63,em que o aminoácido carregado na posição X10, X17 e/ou X19 é positivamen-te ou negativamente carregado e é selecionado do grupo que consiste emaminoácidos naturais, aminoácidos não-naturais e aminoácidos derivados.
67. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 64, caracterizadopelo fato de que X10, X17 e/ou Xi9 é um aminoácido negativamente carrega-do.
68. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 65, caracterizadopelo fato de que o referido aminoácido negativamente carregado é selecio-nado do grupo que consiste em- aminoácidos negativamente carregados naturais, especialmen-te D ou E;- aminoácidos negativamente carregados não-naturais que pre-ferivelmente descrevem uma cadeia lateral alongada tal como Aad, 2-aminoeptanodiácido, Asu;- aminoácidos originalmente positivamente carregados que são,porém, derivados com grupos químicos adequados para lhes fornecer umgrupo negativamente carregado.
69. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 66, caracterizadopelo fato de que o grupo usado para converter aminoácidos positivamentecarregados em aminoácidos negativamente carregados é selecionado dediácidos, tal como, por exemplo, ácidos dicarboxílicos ou ácidos dissulfônicos.
70. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 55 a 67,em que Xe é um ácido D-amino, preferivelmente D-fenilalanina.
71. Peptídeo, de acordo com uma das reivindicações 55 a 68,compreendendo a seguinte seqüência de aminoácido,:X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19em que Xe a X19 têm o significado acima e em queX4 = é F, Y ou um derivado de F ou Y, em que o derivado de Fou Y carrega pelo menos um substituinte retirado de elétron;X5 = é selecionado de qualquer aminoácido, preferivelmente A,Η, K, L, M, S, Tou I.
72. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 69, em que o subs-tituinte retirado de elétron é selecionado do grupo que consiste no grupo a-mino, grupo nitro e halogênios.
73. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 70, em que X4 éselecionado do grupo que consiste em 4-amino-fenilalanina, 3-amino-tirosina, 3-iodo-tirosina, 3-nitro-tirosina, 3,5-dibromo-tirosina, 3,5-dinitro-tirosina, 3,5-diiodo-tirosina,.
74. Peptídeo mimético de EPO, compreendendo pelo menosduas seqüências de consensos de peptídeo mimético de EPO monoméricas,em que pelo menos uma das seqüências de consenso de peptídeo monomé-ricas é um peptídeo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 71.
75. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 72, que é um díme-ro e compreende pelo menos uma seqüência de consensos de peptídeomonomérica de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 71.
76. Composto se ligando às moléculas alvo, compreendendo,(i) pelo menos duas unidades de peptídeo em que cada unidadede peptídeo compreende pelo menos dois domínios com uma capacidade deligação a um alvo;(ii) pelo menos uma unidade de veículo polimérica;em que as referidas unidades de peptídeo estão presas à referida unidadede veículo polimérica e em que pelo menos um domínio de pelo menos umaunidade de peptídeo é um peptídeo como definido em pelo menos uma dasreivindicações de 1 a 71,.
77. Composto, de acordo com a reivindicação 74, em que pelomenos uma unidade de peptídeo compreende um dímero de peptídeo comodefinido na reivindicação 73.
78. Composto, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, em quea referida unidade de veículo é ou compreende pelo menos um polímeronatural ou sintético, ramificado, dendrítico ou linear e é selecionado preferi-velmente do grupo que consiste em poliglicerinas, ácido polisiálico, dextra-nas, gomas ou polietileno glicol ou de outros polímeros solúveis água biolo-gicamente inertes.
79. Composto, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções precedentes 74 a 76, em que a referida unidade de veículo poliméricacompreende uma unidade ramificação.
80. Composto, de acordo com a reivindicação 77, em que a refe-rida unidade de ramificação compreende glicerol ou poliglicerol.
81. Composto, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções precedentes 74 a 78, em que a referida molécula veículo tem um pesomolecular de pelo menos 5 kD, preferivelmente de 20 a 200 ou 4000 kD e de-20 a 80 kD no caso de veículos menores tal como polietileno glicol, é usado.
82. Composto, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções precedentes 74 a 79, em que a referida unidade de veículo é compostade pelo menos duas subunidades poliméricas, em que as referidas subuni-dades poliméricas são conectadas por meio de pelo menos uma estruturaIigadora covalente biodegradável.
83. Composto, como definido em pelo menos uma das reivindi-cações precedentes, compreendendo uma primeira unidade de veículo bio-degradável em que as unidades de peptídeo e segundas unidades veículopoliméricas ligadas à referida primeira unidade de veículo polimérica.
84. Composto, de acordo com a reivindicação 81, em que a refe-rida segunda unidade de veículo tem um peso molecular menor do que areferida primeira unidade de veículo e em que cerca de 20 a 50% dos sítiosde ligação da referida primeira unidade de veículo que é preferivelmenteHES são ocupados com as referidas segundas unidades veículo que sãopreferivelmente PEG de um peso molecular de cerca de 3 a 10 kD.
85. Composto, de acordo com pelo menos uma das reivindica-ções acima, em que uma unidade de veículo polimérica modificada é usada.
86. Composto, de acordo com a reivindicação 83, em que a refe-rida unidade de peptídeo é ligada por meio de uma ligação covalente à refe-rida unidade de veículo polimérica e a ligação ocorre por meio de um amino-ácido reativo, o grupo amino de terminal N e/ou o ácido carboxílico de termi-nal C das referidas unidades de peptídeo, em que o referido aminoácido rea-tivo é selecionado preferivelmente do grupo que consiste em lisina, cisteína,histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e tirosina eem que no caso da referida unidade de veículo polimérica nãopossui um grupo de acoplamento reativo apropriado, uma unidade de aco-plamento é usada para modificar a unidade de veículo polimérica,em que a referida unidade de acoplamento é preferivelmenteselecionada do grupo que consiste em grupos de acilação que reagem comos grupos aminos das referidas unidade de peptídeo, grupo de alquilaçãoque reage com grupos sulfidrila (mercapto), tiometila, imidazo ou aminos nareferida unidade de peptídeo, preferivelmente grupos maleimida, éster e a-mida formando grupos que reagem com um grupo carboxila da proteína, dis-sulfeto que forma grupos que reagem com os grupos de sulfidrila na referidaunidade de peptídeo, tal como grupos 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoato), dissul-fetos de orto-piridila e grupo alquilmercaptan, grupo dicarbonila, tal comogrupos cicloexandiona, e outros grupo 1,2-dicetona que reagem com as por-ções de guanidina da referida unidade de peptídeo; grupo diazo que reagecom grupos fenólicos no referido peptídeo; grupos reativos de reação debrometo de cianogênios com a referida unidade de veículo polimérica, quereage com grupos aminos na referida unidade de peptídeo.
87. Composto, de acordo com a reivindicação 84, em que o refe-rido aminoácido reativo é cisteína e em que o referido grupo de acoplamentoé maleimida.
88. Ácido nucléico que codifica um peptídeo, como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 73.
89. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é um peptídeo in-verso e/ou retro/inverso dos peptídeos como definido em pelo menos umadas reivindicações 1 a 73, ou um peptídeo respectivo que consiste comple-tamente em D-aminoácidos.
90. Método, para dimerisar unidades de peptídeo monoméricopara formar um dímero de peptídeo mimético de EPO1 em que o dímero écriado formando uma ligação covalente entre as unidades de peptídeo mo-nomérico, em que a referida ligação é formada entre o aminoácido de termi-nal C da primeira unidade de peptídeo monomérico e o aminoácido de ter-minal N da segunda unidade de peptídeo monomérico.
91. Método, de acordo com a reivindicação 88, em que as uni-dades de peptídeo monomérico são usadas, carregando um aminoácido naterminação C ou N com uma funcionalidade de corrente lateral capaz deformar uma ligação covalente, em que uma ligação covalente é formada en-tre a corrente lateral do aminoácido de terminal C da primeira unidade depeptídeo monomérico e a corrente lateral do aminoácido de terminal N dasegunda unidade de peptídeo monomérico.
92. Método, de acordo com a reivindicação 88 ou 89, em que aligação covalente ligando as duas unidades de peptídeo monomérico a umdímero é um dissulfeto ou uma ponte de disselenida.
93. Método, de acordo com uma das reivindicações 88 a 90, emque os aminoácidos que formam a ligação intermolecular entre as duas uni-dades de peptídeo mimético de EPO monoméricas são selecionadas dogrupo que compreende cisteína, derivado de cisteína, tal como homocisteínae selenocisteína, tiolisina, K ou E.
94. Dímero de peptídeo mimético de EPO, compreendendo umaseqüência de peptídeo mimético de EPO como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 73.
95. Dímero de peptídeo mimético de EPO produzido pelo méto-do, como definido nas reivindicações 88 a 91 e compreendendo uma se-qüência de peptídeo preferivelmente como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 73.
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