JP4472351B2 - インターナライジング抗ｃｄ７４抗体およびその使用方法 - Google Patents

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Description

発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４抗体もしくはそのフラグメント、または少なくとも一種のＣＤ７４抗体、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含んでなる抗体融合タンパク質、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントの治療および診断複合体、ならびにＢ細胞リンパ腫および白血病、細胞がＣＤ７４抗原に関して陽性であるリンパ腫および白血病以外の悪性腫瘍、および種々の自己免疫疾患および免疫不全症を、これらのヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントを用いて治療および診断する方法に関する。本発明は、抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントの少なくとも一方の腕と、病原性生物、癌細胞、寄生虫または感染性病原体などの有害なものに対して多重特異性のｍＡｂの少なくとも一方の腕とを含んでなる多価かつ／または多重特異性抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントに関する。本発明はさらに、抗原ペプチドに結合された抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントに関する。このヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂ、そのフラグメントおよびその複合体は単独で投与してもよいし、多様式治療計画の一部として投与してもよい。本発明はヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４抗体をコードするＤＮＡ配列、ならびに多価かつ／または多重特性抗ＣＤ７４ ｍＡｂおよびそのフラグメント、その治療用複合体、診断用複合体および抗原複合体、そのＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４抗体を作製する方法に関する。
２．背景
免疫療法の主要な目標の一つは腫瘍細胞または感染性生物に対して患者の免疫系を協調させることである。癌療法に関しては、患者の免疫系を腫瘍細胞へ向けることが対象となる。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、ならびに急性および慢性リンパ球性白血病は、なお癌の死亡率に大きく影響しているＢ細胞悪性腫瘍である。種々の形態の処置に対するこれら悪性腫瘍の応答は複合型である。
Ｔリンパ球応答の誘導は、宿主の免疫応答の重要な最初のステップである。Ｔ細胞が活性化されるとＴ細胞が増殖し、Ｔ細胞によりサイトカインが誘導され、Ｔ細胞媒介性のエフェクター機能が生じる。Ｔ細胞の活性化には抗原特異的シグナルが必要であり、これはしばしば初期活性化シグナルと呼ばれるものであり、Ｔ細胞の表面に存在するクローン的に分布したＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の刺激によって生じる。この抗原特異的シグナルは通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在するクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質かクラスII ＭＨＣタンパク質のいずれかと結合した抗原ペプチドの形態にある。ヒトのＭＨＣ分子はＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子と呼ばれている。
クラスII分子は限られた数の細胞腫、主としてＢ細胞、単球／マクロファージおよび樹状細胞にしか見られず、ほとんどの場合、細胞外環境から取り込まれたタンパク質に由来するペプチドを提示する。クラスII ＭＨＣは細胞外環境と連絡した細胞コンパートメントに保持されている。ヒトでは、ＭＨＣ−II分子は種々の遺伝子コードされている対立遺伝子に存在するＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ分子を含む。従って、例えば細胞外環境からの細菌抗原が取り込まれ、それらの細胞上の抗原提示細胞において細胞内プロセシングされた後に提示される。ＣＤ４＋Ｔ細胞はクラスII分子と会合しているペプチドを認識する。
放射性核種またはその他の細胞傷害剤に結合されたターゲッティングモノクローナル抗体を使用できれば、このような薬剤を腫瘍部位へ直接送達できることになり、それにより正常組織が有毒な薬剤に曝されることもなくなる(Goldenberg, Semin. Nucl. Med., 19: 332 (1989))。最近では、抗原に基づく療法および腫瘍関連抗原の限局化におけるその精度の潜在能力が実験および診療試験の双方で実証された（例えば、Thorpe, TIBTECH, 11: 42 (1993); Goldenberg, Scientific American, Science & Medicine, 1: 64 (1994); Baldwin et al., 米国特許第４，９２５，９２２号および同第４，９１６，２１３号； Young, 米国特許第号４９１８１６３号；米国特許第５，２０４，０９５号; Irie et al., 米国特許第５，１９６，３３７号; Hellstrom et al., 米国特許第５，１３４，０７５および同第５，１７１，６６５号参照）。一般に、治療よりも、腫瘍の限局化を目的に腫瘍関連マーカーに対する放射性標識抗体または抗体フラグメントを用いる場合において成功を収めているが、これは一つには腫瘍による抗体の取り込みが一般に低く、全注射量の０．０１％〜０．００１％の範囲でしかないためである(Vaughan et al., Brit. J. Radiol., 60: 567 (1987))。腫瘍に対する用量増加のために放射性標識濃度を高めると、通常、健康な組織への放射能暴露が高まるので、意図とは逆の結果を招くことになる。
マウスＬＬ１（ｍＬＬＩまたはマウス抗ＣＤ７４抗体）は、クラスII ＨＬＡ様抗原、すなわち、Ｂリンパ球、単球および組織球、ヒトＢリンパ腫細胞、黒色腫、Ｔ細胞リンパ腫、およびその他種々の腫瘍細胞種の表面上の不変鎖（Ｉｉ決定基）であるＣＤ７４と反応性のある特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である(Hansen et al., Biochem. J. 320: 293 (1996))。細胞表面結合ＬＬ１は、抗ＣＤ１９や抗ＣＤ２２などの他のｍＡｂよりもはやく、リソソームコンパートメントに迅速にインターナライズされ、すぐさま異化される（同上）。このＬＬ１固有の特性により、免疫療法に伴う上記のような困難な点はいくるか克服される。
マウスＬＬ１は、マウス骨髄腫細胞をＲａｊｉ Ｂリンパ腫細胞系統(Pawlak-Byczkowska et al., Can. Res., 49: 4568 (1989)ではＥＰＢ−１と呼ばれている）からの調製物で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞と融合させることにより開発された。その他のほとんどの有望なマウス抗体の場合とまさに同じで、ヒトではヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を生じることから、ｍＬＬ１の臨床使用は制限されている。ＨＡＭＡ応答は一般に、９９ｍＴｃにて標識されたｒｅ ａ ｍＬＬＩ Ｆａｂ’を用いた骨髄イメージング研究で示されるように、ｍＬＬＩ Ｆａｂ’を注射した後には見られない。Juweid et al., Nuc. Med Comm. 18: 142-148 (1997)を参照されたい。しかし、いくつかの治療および診断使用では、全長抗ＣＤ７４ ｍＡｂが好ましいようである。この全長抗ＣＤ７４ ｍＡｂの使用は、過敏感症の可能性の問題のためだけでなく、循環中の複合体の大部分が循環している抗マウス抗体と錯化し、封鎖されてしまうことから、このような抗体および抗体複合体の診断および治療の有用性は制限される。ｍＬＬ１の抗体フラグメントを用いれば免疫原性の問題は回避できるかもしれないが、全ＩｇＧのほうが望ましく、また、治療または抗体の生存時間を引き延ばすためには細胞免疫の誘導が意図されるという状況がある。一般に、ＨＡＭＡ応答はマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂの完全な診断および治療能を実現するには潜在的な障害がある。よって、治療および診断用のキメラ、ヒト化およびヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂおよびそのフラグメント、抗体融合タンパク質およびそのフラグメント、免疫複合体、多価かつ／または多重特異性ｍＡｂおよびそのフラグメント、ならびにそのワクチン複合体の開発は、ヒト抗マウス抗体の形成が少ない治療および診断に極めて有用である。
発明の概要
本発明は、細胞内に迅速にインターナライズ（internalize）されうる抗ＣＤ７４抗体およびそのフラグメントならびにその抗体融合タンパク質、特にキメラ、ヒト化またはヒト抗体を対象とする。
本発明はさらに、互いに融合され、かつ／または本発明のその他の抗体およびそのフラグメントと融合されている抗体またはそのフラグメントを含有する抗ＣＤ７４抗体融合タンパク質に関する。
本発明はさらに、診断薬または治療薬に結合されている本発明による抗ＣＤ７４抗体もしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含有する免疫複合体に関する。
本発明はまた、抗原ペプチドに結合されている本発明による抗ＣＤ７４抗体もしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含有する抗体複合体を含んでなるワクチンに関する。
本発明はさらに、癌マーカー物質、感染性病原生物の表面上のエピトープまたは血液もしくは他の体液中の有害物質に特異的な抗体または抗体フラグメントに結合されている本発明による抗ＣＤ７４抗体もしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含有する抗体を含んでなる二重特異性または多重特異性抗体に関する。
本発明はさらに、本発明のＣＤ７４抗体およびそのフラグメント、または抗体融合タンパク質およびその複合体を用いて疾病を治療および診断する方法に関する。
本発明はまた、ＣＤ７４抗体もしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメント、免疫複合体および抗体複合体、およびその多重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列、発現ベクター、および該ＤＮＡ配列を含有する宿主細胞、ならびに本発明によるこれらのＣＤ７４抗体を発現させる方法に関する。
発明の具体的説明
特に断りのない限り、「ａ」または「ａｎ」は「一またはそれ以上（one or more）」意味する。
１．概説
本発明は、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂ、そのフラグメント、および抗体融合タンパク質、ならびに単独で、または他の裸の抗体および多様式治療計画の一部としての抗体治療用複合体をはじめとする他の治療薬との複合体としての、またはそれらと組み合わせて投与される、哺乳類被験体、ヒトおよび家庭内動物の治療に有用なその治療用および診断用複合体を提供する。Ｂ細胞悪性腫瘍、その他のＣＤ７４陽性悪性腫瘍および自己免疫疾患の治療および診断方法が開示される。
２.定義
以下の説明において、多数の専門用語が使用されており、以下、本発明の理解を容易にするために定義を示す。
本明細書において「抗体」とは、全長（すなわち、天然に存在するまたは通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に有効な（すなわち、特異的に結合する）部分をいう。
「抗体フラグメント」とは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは無傷の抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ７４モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ７４のエピトープと結合する。「抗体フラグメント」とはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離されたフラグメント、Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子、および超過変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが挙げられる。
「裸の抗体」は一般的に治療薬と結合していない完全な抗体である。これは抗体分子のＦｃ部分が、細胞溶解を引き起こす作用をするようメカニズムを設定する補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）のようなエフェクター機能を提供するためである。しかし、治療機能のためにはこのＦｃ部分は必要なく、アポトーシスなどの他のメカニズム機能を果たす可能性がある。裸の抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方ならびにキメラ、ヒト化またはヒト抗体のようなある種の組換え抗体が含まれる。
「キメラ抗体」は、一つの種、好ましくは齧歯類の抗体由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常領域に由来する組換えタンパク質である。獣医学領域への適用のためには、このキメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種由来のものであってもよい。
「ヒト化抗体」は、一つの種、例えば齧歯類抗体由来の抗体のＣＤＲが齧歯類抗体のＨおよびＬ可変鎖からヒトＨおよびＬ可変ドメインに移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。
「ヒト抗体」は、抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するために「操作された」トランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座のエレメントが、内在性Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子座が標的破壊されている胚幹細胞株由来のマウス系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスをヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994),およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579(1994)に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレー技術により構築でき、これらはすべて当技術分野で公知である。例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのin vitroにおけるヒト抗体およびそのフラグメントの産生に関しては、McCafferty et al., Nature 348:552-553（1990）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子がフレーム内で糸状バクテリオファージの主要または微量コートタンパク質遺伝子へクローニングされ、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子表面上に提示される。この糸状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含み、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレーはさまざまな形式で行うことが可能であり、総説としては例えば、Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)を参照されたい。
ヒト抗体はまた、in vitro活性化Ｂ細胞により産生させることができる。引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい。
「治療薬」は、個別に、同時にまたは逐次に、抗体部分とともにまたは抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と結合させて投与される分子または原子であり、疾病の治療に有用である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬または色素および放射性同位元素が挙げられる。
「診断薬」は、抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と結合させて投与される分子または原子であり、その抗原を含む細胞を限局化することにより疾病の診断に有用である。有用な診断薬としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、色素（ビオチン−ストレプトアビジン複合体など）、造影剤、蛍光化合物または分子、および核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）などがある。米国特許第６，３３１，１７５号はＭＲＩ技術およびＭＲＩ増強剤に結合させた抗体の調製について記載しており、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。好ましくは、この診断薬は放射性同位元素、核磁気共鳴イメージングで使用する増強剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するためには、イオンを結合させるための多様なキレート基を付着させた長い尾部を有する試薬と反応させる必要があろう。このような尾部は、ポリリシン、多糖、または例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリミキシン、およびこの目的のために有用なことが公知の基といった、キレート基に結合できるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導体化可能な鎖でありうる。キレート剤は標準的な化学法を用いてペプチド抗原に結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失が最小で、凝集および／または内部架橋が最小となる分子との結合を形成しうる基により抗体に連結される。キレート剤を抗体に結合させるその他の、もっと特殊な方法および試薬は、１９８９年４月２５日出願の「Antibody Conjugates」と題されたHawthorneの米国特許第４，８２４，６５９号に開示されており、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とする。特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７６Ｂｒのような一般エネルギー範囲６０〜４００ｋｅＶの診断用同位元素とともに用いられる２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ、ラジオイメージングに用いられる。同じキレート剤がマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯化した場合は、本発明の抗体とともに使用するとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種とともに用いられる。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより極めて安定にすることができる。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであり、本発明に包含される。
「免疫複合体」は、抗体成分と治療薬または診断薬との複合体である。この診断薬は、放射性または非放射性標識、造影剤（核磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法または超音波診断法など）を含んでなり、この放射性標識はγ−、β−、α−、オージェ電子、または陽電子放射性同位元素でありうる。
「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現された遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのどちらかを含む任意の原核または真核細胞であってもよい。この語はまた、それらの原核、または細菌、酵母および哺乳類細胞などの真核細胞、ならびに宿主細胞または宿主細胞の細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物も含む。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ０細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株および抗体発現に有用な他の哺乳類宿主細胞が挙げられる。また、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用なものはＷＯ ００６３４０３ Ａ２に開示されているヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６であり、ＣＨＯ、ＣＯＳ、 Ｖｅｒｏ、 ＨｅＬａ、 ＢＨＫおよびＳＰ２などの従来の哺乳類細胞株に比べて２〜２００倍の組換えタンパク質を産生する。免疫系が改変された特別なトランスジェニック動物は完全なヒト抗体を作製するために特に有用である。
本明細書に記載のように、「抗体融合タンパク質」とは、同じまたは異なる特異性の２以上の同じまたは異なる単鎖抗体もしくは抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換え生産された抗原結合分子である。融合タンパク質の原子価は、この融合タンパク質が単一抗原またはエピトープに対する結合腕または結合部位をいくつ有しているかを示し、すなわち、一価、二価、三価または多価などである。抗体融合タンパク質が多価であるということは、抗原に対する結合において複数の相互作用を利用できることを意味し、従って、抗原に結合する結合力が高まる。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープに結合できるかを示し、すなわち、単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性などである。これらの定義により、例えばＩｇＧのような天然の抗体は、結合腕を２本持つために二価であるといえるが、この抗体は一つのエピトープに結合するために単一特異性である。単一特異性、多価融合タンパク質は、エピトープに対する１以上の結合部位を有するが、ただ一つのエピトープとしか結合せず、例えば二つの結合部位を持つダイアボディー（diabody）は同じ抗原と反応性がある。融合タンパク質は単一抗体成分、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組み合わせ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含んでもよい。この融合タンパク質はさらに抗体または抗体フラグメントおよび治療薬を含んでもよい。このような融合タンパク質に好適な治療薬の例としては、免疫調節剤（「抗体-免疫調節剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体-毒素融合タンパク質」）が挙げられる。好ましい一つの毒素としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）であり、好ましくは組換えＲＮアーゼである。
「多重特異性抗体」は、同時に構造の異なる少なくとも二つの標的、例えば二つの異なる抗原、同じ抗原上の二つの異なるエピトープ、またはハプテンおよび／または抗原、もしくはエピトープに結合できる抗体である。一つの特異性は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープであろう。もう一つの特異性は、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、およびＣＤ２２などの、同じ細胞種上の異なる抗原でありうる。多重特異性、多価抗体は一以上の結合部位を有する構築物であり、その結合部位は特異性が異なる。例えばダイアボディーでは、一つの結合部位が一つの抗原と反応し、もう一方は他の抗原と反応する。
「二重特異性抗体」は、同時に構造の異なる二つの標的に結合できる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも一つの腕、および治療薬または診断薬を担持する標的化可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他の腕を有する。分子工学技術を用いて種々の二重特異性融合タンパク質を作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対して一つの結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対して一つの結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、この二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば一つの抗原に対して一つの結合部位を有するＩｇＧおよび第二の抗原に対して二つの結合部位を有する二つのｓｃＦｖからなる。
「イヌ化またはネコ化抗体」は、モノクローナル抗体の齧歯類（または他の種）の相補性決定領域が、齧歯類（または他の種）免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖可変領域から、それぞれイヌまたはネコの免疫グロブリン可変ドメイン中に移されている組換えタンパク質である。
「家庭動物」は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、アルパカおよびブタのような大型動物、ならびにコンパニオン動物を含む。好ましい実施形態においては、過程動物はウマである。
「コンパニオン動物」は、ペットとして飼われる動物を含む。これらは主としてイヌおよびネコであるが、モルモット、ハムスター、ラットおよびフェレットのような小型齧歯類、またサルのような類人霊長類も含まれる。好ましい実施形態において、コンパニオン動物とはイヌまたはネコである。
３．キメラ、ヒト化およびヒト抗体をはじめとするモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、その抗体はただ一種の抗原結合部位を含んでなり、抗原決定基上のただ一つのエピトープに結合する。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495（1975), and Coligan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7（John Wiley & Sons 1991）[以下「Coligan」]を参照されたい。要するに、マウスに抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体産生を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、その抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによりモノクローナル抗体を得ることができる。
ＭＡｂは、ハイブリドーマ培養液から種々の十分確立された技術により単離、精製できる。このような単離技術としては、Ａタンパク質セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3.を参照されたい。また、Baines et al.,"Purification of Immunogloburin G (IgG),"in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104（The Humana Press, Inc. 1992）も参照されたい。
免疫原に対する最初の抗体生成の後に、その抗体の配列を決定し、次いで組換え技術により作製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、次いでフレームワーク領域中のヒト残基をマウスの対応物で置換することにより作製する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することによってマウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的な問題が防げられる。
マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般的な技術は、例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。キメラ抗体構築のための技術は当業者に周知である。例えば、Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)は、ＬＬ２モノクローナル抗体、抗ＣＤ２２抗体のＶＫおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列をそれぞれのヒトκおよびＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることでＬＬ２キメラをいかに作製したかが記載されている。この公報はまた、ＬＬ２のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のヌクレオチド配列、ＶＫおよびＶＨをそれぞれ提供する。ヒト化ＭＡｂを産生する技術は、例えばJones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992),およびSinger et al., J Immun. 150:2844 (1993)に記載されており、これらはそれぞれ引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
この目的で、本発明は、ＣＤ７４抗原と結合し、診断および治療法に使用できるキメラ、ヒト化およびヒト抗体ならびにそのフラグメントを記載する。ヒト化抗体および抗体フラグメントは、「Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods Of Use」と題された米国仮出願、弁理士管理番号１８７３３／１０７３、米国仮出願番号６０／３５６，１３２、米国仮出願番号６０／４１６，２３２および弁理士管理番号１８７３３／１１５５に記載されており、クラスIII抗癌胎児性抗原抗体（抗ＣＥＡ抗体）である、米国出願第５，８７４，５４０号に開示されているようなｈＭＮ−１４抗体；米国出願番号１０／１１６，１１６に開示されているようなＭｕ−９抗体；米国仮出願番号６０／３９９，７０７に記載されているようなＡＦＰ抗体；「Monoclonal Antibody cPAM4」と題された米国仮出願、弁理士管理番号１８７３３／１１０２に記載されているようなＰＡＭ４抗体；米国仮出願番号６０／３６０，２２９に記載されているようなＲＳ７抗体；および米国特許第５，７８９，５５４号および同第６，１８７，２８７号および米国出願番号０９／７４１，８４３および同０９／９８８，０１３に開示されているようなＣＤ２２抗体があり、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
キメラ抗体は、齧歯類抗体のような一種の動物由来のＣＤＲを含む可変ドメインを含む組換えタンパク質であり、抗体分子の残りの部分、すなわち定常ドメインはヒト抗体に由来する。従って、キメラモノクローナル抗体はまた、キメラｍＡｂの可変ドメイン中のマウスＦＲ配列を、一以上の異なるヒトＦＲと置換することによりヒト化することができる。具体的には、マウスＣＤＲをマウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖からヒト抗体の相当する可変ドメインに転移させる。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に転移させるだけでは、しばしば抗体親和性の低下または損失さえ起こるために、マウス抗体の元の親和性を回復させるためにはさらなる修飾が必要となる。これは、そのエピトープに対して良好な結合親和性を有する抗体を得るために、ＦＲ領域の一以上のいくつかのヒト残基をマウスの相当部分と置換することにより達成することができる。例えば、Tempest et al., Biotechnology 9:266（1991)およびVerhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)を参照。さらに、ヒト化、キメラおよびヒトＭＡｂの特定のエピトープに対する親和性は、ＣＤＲの突然変異誘発により高めることができ、その結果、より低用量の抗体が突然変異前の高用量の低親和性ＭＡｂと同等の有効性を示しうる。例えば、ＷＯ００２９５８４Ａ１を参照されたい。
本発明の抗体を作製するもう一つの方法は、トランスジェニック家畜の乳汁中での産生によるものがある。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63:141-147,1998; 米国特許第５，８２７，６９０号を参照されたい。なお、双方とも引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。対をなす免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む二つのＤＮＡ構築物体が調製される。このＤＮＡセグメントを、哺乳類上皮細胞中で優先的に発現されるプロモーター配列を含む発現ベクターへクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入されたフラグメントの３’側に哺乳類特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列が隣接する。これによりポリアデニル化部位および転写安定化配列が提供される。この発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に同時注入し、次いでレシピエント雌の子宮に着床させて妊娠させる。出産後、サザン分析により導入遺伝子の存在に関してその後代をスクリーニングする。抗体が存在するためには、Ｈ鎖およびＬ鎖双方の遺伝子が同時に同じ細胞で発現されなければならない。トランスジェニック雌動物から得た乳汁を当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法により、該抗体または抗体フラグメントの存在と機能に関して分析する。この抗体は当技術分野で公知の標準的方法により、乳汁から精製することができる。
ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４抗体との組み合わせ療法のための、本発明の完全なヒト抗体、すなわちヒト抗ＣＤ７４ ＭＡｂ、または抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２０、または抗ＣＤ２１ ＭＡｂなどの他のヒト抗体は、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とするMendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); 米国特許第５，６３３，４２５号を参照されたい。例えば、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。このマウス体液性免疫系は、内在する免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は極めて複雑で、多数の離散セグメントを含み、それはヒトゲノムのほぼ０．２％を占める。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを産生できることを保証するには、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座の大きな部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖系構造においてヒトＨ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成に始まる段階的なプロセスで達成される。それぞれの挿入配列はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築体は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。一つはＨ鎖遺伝子座、もう一つはＬ鎖遺伝子座を含む二つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚幹細胞の融合を通じてマウスに個々に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラ雄動物を、生殖細胞系を通じてＹＡＣを伝達する能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスと交配させる。一種はヒトＨ鎖遺伝子座を含み、もう一種はヒトＬ鎖遺伝子座を含む二種のトランスジェニック系統を繁殖させ、免疫感作に応答してヒト抗体を産生する作出する。
二重特異性ｍＡｂを産生するさらなる最新の方法は、付加的なシスチン残基を有し、より一般的な免疫グロブリンイソ型よりも強く架橋結合している人工的組換えｍＡｂを含む。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10（10):1221-1225, 1997を参照されたい。もう一つのアプローチは、二以上の異なる単鎖抗体または必要とされる二重特異性を有する抗体フラグメントセグメントを連結する組換え融合タンパク質を設計することである。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997を参照されたい。分子工学技術を用いて様々な二重特異性融合タンパク質を作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対する単一結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、一つの抗原に対する二つの結合部位を有するＩｇＧと、第二の抗原に対する二つの結合部位を有する二つのｓｃＦｖからなる。
二以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントを連結している二重特異性融合タンパク質も、同様の方法で作製する。種々の融合タンパク質を作製するためには組換え法を用いることができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ７４抗体由来のＦａｂフラグメントおよびマウス抗ｄｉＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含んでなる融合タンパク質を作製することができる。ＧＧＧＳのような柔軟なリンカーは、ｓｃＦｖを抗ＣＤ７４抗体のＨ鎖の定常領域に結合させる。あるいは、ｓｃＦｖは別のヒト化抗体のＬ鎖の定常領域に結合させることができる。Ｈ鎖ＦｄのｓｃＦｖとのフレーム内結合のために必要な適当なリンカー配列は、ＰＣＲ反応を介してＶλおよびＶκドメインに導入される。次いでｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントをＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むス足場ベクターに連結する。これにより得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物を切り出して、抗ＣＤ７４抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに連結する。得られたベクターは、二重特異性融合タンパク質の発現のための哺乳類細胞のような適当な宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
４．抗体フラグメントの生産
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製し得る。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。他の抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（ａｂ）'２フラグメント、およびＦ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作製できるＦａｂ'フラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速で容易な同定を可能にするＦａｂ’発現ライブラリーを構築することができる（Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281）。本発明は抗体および抗体フラグメントを包含する。
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含んでなる。このＶＬおよびＶＨドメインは組み合わさって標的結合部位を形成している。これらの二つのドメインはペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合されている。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＨ−Ｌ−ＶＬと表される。ｓｃＦｖ分子の作製方法、および好適なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，９４６，７７８号、R. Raag and M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80（1995）およびR. E. Bird and B. W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH, Vol 9:132-137(1991）を参照されたい。これらの参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
抗体フラグメントは、全長抗体のタンパク質加水分解、またはフラグメントをコードするＤＮＡの、大腸菌(E.coli)もしくは他の宿主中での発現により調製することができる。抗体フラグメントは、常法により全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例えば、抗体フラグメントは抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓフラグメントを与えることにより作製することができる。このフラグメントはチオール還元剤、および所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントが得られる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断により二つの一価Ｆａｂフラグメントと一つのＦｃフラグメントが直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されており、これらの特許は引用することによりその全開示内が本明細書の一部とされる。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230(1960); Porter, Biochem. J 73:119(1959)、Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422(Academic Press 1967)、および Coligan at pages 2.8. 1-2.8.10および2.10.-2. 10.4.も参照されたい。
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは抗体の可変領域のセグメントであり、抗体が結合するエピトープに対し相補的な構造であり、残りの可変領域よりもさらに変化に富んでいる。従って、ＣＤＲはしばしば超過変領域と呼ばれる。可変領域は三つのＣＤＲを含んでなる。ＣＤＲペプチドは、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。かかる遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される。例えば、Larrick et al., Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991); Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995);およびWard et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185（Wiley-Liss, Inc. 1995）を参照されたい。
Ｈ鎖を分離して一価のＬ−Ｈ鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような抗体を切断する他の方法、または他の酵素学的、化学的または遺伝学的技術も、それらのフラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り用いてよい。
５．抗ＣＤ７４抗体
本発明の抗ＣＤ７４ ｍＡｂはＣＤ７４抗原に対して特異性を有する特定のマウスＣＤＲを含む。本発明の抗ＣＤ７４ ｍＡｂはヒト化、キメラまたはヒトｍＡｂであり、それらはマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂであるマウスＬＬ１ｍＡｂのＣＤＲのアミノ酸を含む。ヒト化抗ＣＤ７４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメントは、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなる。さらに、このヒト化抗ＣＤ７４モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなる、ヒト化ｍＡｂのＨ鎖可変領域を含んでなる。さらに、このヒト化ｍＡｂはＣＤ７４に対する特異性を実質的に保持しており、すなわち、Ｂリンパ球、単球および組織球、ならびにＢ細胞リンパ腫および白血病、ならびに骨髄腫細胞などの細胞の表面上に存在するクラスII ＭＨＣ不変鎖ＩｉはこれらのｍＡｂ、そのフラグメントまたはｍＡｂ複合体の 迅速なインターナリゼーションと異化作用をもたらす。
一つの態様によれば、本発明によるＣＤ７４抗体は、マウス抗ＣＤ７４（ｍＬＬ１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のフレームワーク（ＦＲ）領域を含んでなるＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗ＣＤ７４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメントであり、このヒト化ｍＡｂのＬ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなり、かつ、このヒト化ｍＡｂのＨ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなる。Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のマウスＣＤＲはそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに示されている。ヒトＦＲのＬ鎖およびＨ鎖可変領域は、マウスｍＡｂの対応するＦＲから少なくとも一つのアミノ酸を置換することにより、ＣＤ７４に対する特異性を維持するように改変すればよい。より具体的には、特異性を維持するためにはヒト化抗ＣＤ７４のヒトＦＲにおいて、図３ＢのｃＬＬ１Ｖｋ配列のマウスＬ鎖可変領域のアミノ酸残基２、３、４、４６、８７および１００、ならびに図３ＡのｃＬＬ１ＶＨ配列のマウスＨ鎖可変領域アミノ酸残基５、３７、３８、４６、６８、９１および９３で示されるマウスｍＡｂ由来の一以上の特異的アミノ酸が維持されていればよい。
ある好ましい態様によれば、図４ＡのＨ鎖可変領域と図４ＢのＬ鎖可変領域を含むヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂ、ヒト化ＬＬ１（ｈＬＬ１）またはそのフラグメントが本発明に開示される方法で用いられる。より具体的には、このヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントはヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域またはその一部を含む。９．あるいは、本明細書に記載のヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントのいずれか一つのヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントはヒト化ＩｇＧ１でありうる。
ヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂが好ましいが、本発明ではキメラ抗ＣＤ７４（ｃＣＤ７４）ｍＡｂまたはそのフラグメントも意図される。ある態様によれば、キメラ抗ＣＤ７４（ｃＣＤ７４）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメントは、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域を含んでなる。さらなる態様によれば、キメラ抗ＣＤ７４モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域を含んでなる。またさらなる態様によれば、キメラ抗ＣＤ７４ ｍＡｂは、マウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）とマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含んでなるＬ鎖およびＨ鎖可変領域とヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域とを含んでなり、キメラｍＡｂのＬ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなり、かつ、キメラｍＡｂのＨ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなる。好ましいキメラ抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントは図２ＡのＨ鎖可変領域と図２ＢのＬ鎖可変領域を含んでなる。
また、本発明には、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなるヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなるヒト抗ＣＤ７４（ｈｕＣＤ７４）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメントも含まれる。さらに、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなるヒトｍＡｂのＨ鎖可変領域を含んでなるヒト抗ＣＤ７４（ｈｕＣＤ７４）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメントも含まれる。より好ましくは、本発明は、ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域ならびに定常領域を含んでなるヒト抗ＣＤ７４（ｈｕＣＤ７４）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメントを開示し、ここで、このヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域のｈｕＣＤ７４ ＣＤＲは、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなり、かつ、このヒトｍＡｂのＨ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなる。
本発明のヒト、キメラまたはヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂの各々は好ましくはＩｇＧ１であり、ここでその定常領域は好ましくはヒトＩｇＧ１であるが、このＩｇＧ１はそれぞれヒトＩｇＧ１、キメラＩｇＧ１またはヒト化ＩｇＧ１と呼ばれることがある。特に、ヒト化ＣＤ７４ ｍＡｂ、ｈＬＬＩはヒトＩｇＧ１由来の定常ドメインとヒンジ領域を有する。好ましくは、このキメラおよびヒトＬＬ１ ｍＡｂの双方は同一の定常ドメインとヒンジ領域を有する。しかし、ＩｇＧ１の定常領域がヒトＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト定常領域で置換されるように改変を行うことができる。
本発明はまた、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなるマウス抗ＣＤ７４モノクローナル抗体またはそのフラグメントも対象とする。さらに、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲを含んでなるマウス抗ＣＤ７４モノクローナル抗体またはそのフラグメントも対象とする。より好ましくは、マウス抗ＣＤ７４（ｍＬＬ１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とマウス抗ＣＤ７４抗体のフレームワーク（ＦＲ）領域とを含んでなるマウス抗ＣＤ７４モノクローナル抗体またはそのフラグメントも対象とし、ここで、該マウスｍＡｂのＬ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＶＳＮＲＦＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＱＳＳＨＶＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなり、かつ、マウスｍＡｂのＨ鎖可変領域は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＮを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹを含むＣＤＲ３を含んでなる。
本発明のヒト、キメラ、ヒト化またはマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントの各々は次のような特性の一以上を有する：抗原ＣＤ７４と特異的に結合し、それと反応性があり、そのＣＤ７４に対する結合はＣＤ７４に特異的であるか、またはＣＤ７４と反応性のある抗体またはそのフラグメントによってブロックされること；Ｒａｊｉリンパ腫培養細胞によってインターナライズされること；およびマウスＩｇＧ１ ｍＡｂのＦｃと反応性のあるヤギ抗血清と架橋した場合にＲａｊｉ培養細胞のアポトーシスを誘導すること。
ヒト、キメラまたはヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂのフラグメントはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖもしくはＦｖのＬ鎖およびＨ鎖の一部または全部を用いた融合構築物などのフラグメントであってよい。これらのフラグメントがＣＤ７４と結合することが重要である。
６．多重特異性抗体および多価抗体
組み合わせ療法で使用するための本明細書に記載の抗ＣＤ７４抗体、ならびに異なる特異性を有する他の抗体はまた、多重特異性抗体（ＣＤ７４エピトープまたは抗原に対して少なくとも一つの結合部位、およびＣＤ７４上の別のエピトープまたは別の抗原に対して少なくとも一つの結合部位を含んでなる）、ならびに多価抗体（同じエピトープまたは抗原に対して複数の結合部位を含んでなる）としても作製することができ、あるいは抗体は多価および多重特異性の双方とすることもできる。
本発明の好ましい抗体融合タンパク質は本明細書に記載のヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントの４以上のＦｖまたはＦａｂを含む。さらに、別の好ましい抗体融合タンパク質は、本明細書に記載のヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントのｍＡｂまたはそのフラグメントの一以上のＦｖまたはＦａｂ、ならびに例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のためのＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２などのＢ細胞系抗原から選択される腫瘍マーカーなどＣＤ７４発現細胞によって発現され、ならびに黒色腫などにおけるＳ１００のような他の種の悪性腫瘍を発症させる他のＣＤ７４陽性細胞によって発現される、ＣＤ７４抗原ではない腫瘍細胞マーカーに特異的な別の抗原に特異的な抗体に由来する一以上のＦｖまたはＦａｂを含む。さらに、この腫瘍細胞マーカーはＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＭＵＣ１およびＴＡＣからなる群から選択される非Ｂ細胞系抗原であってもよい。
本発明はまた、本発明による抗ＣＤ７４ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質が癌マーカー物質、感染性病原生物の表面上のエピトープまたは血液もしくは体液中の有害なものに特異的な抗体または抗体フラグメントに結合されている二重特異性または多重特異性抗体も提供する。本発明による二重特異性および多重特異性抗体は、その二重特異性抗体が病原性生物など有害なものに対する少なくとも一つの特異性と、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、「Therapeutic Using a Bispecific Antibody」と題された、１９９９年５月１９日出願の米国出願番号０９／３１４，１３５に詳細に記載されているようなＣＤ７４、クラスII ＨＬＡ不変鎖（Ｉｉ）に対する少なくとも一つの特異性を有する場合、種々の有害物質のクリアランスを誘導する方法に特に有用である。
本発明はさらに、標的細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも一つの結合領域、および標的化可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他の結合領域を有する、二重特異性抗体または抗体フラグメントを提供する。標的化可能な複合体は、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの結合領域により認識される少なくとも一つのエピトープを含んでなるか、または担持する、担体部分を含んでなる。
上記のような二重特異性抗体および抗体フラグメントを作製するためには、様々な組換え法を使用できる。
本発明では、抗ＣＤ７４多価抗体もまた意図される。この多価標的結合タンパク質は、第一および第二のポリペプチドの結合により構築される。第一のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリンＬ鎖可変領域ドメインである第一の免疫グロブリン様ドメインに共有結合された第一の単鎖Ｆｖ分子を含んでなる。第二のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリンＨ鎖可変領域ドメインである第二の免疫グロブリン様ドメインに共有結合された第二の単鎖Ｆｖ分子を含んでなる。第一および第二の単鎖Ｆｖ分子は各々、標的結合部位を形成し、第一および第二の免疫グロブリン様ドメインは結合して第三の標的結合部位を形成する。
ＶＬ−Ｌ−ＶＨ立体配置を有する単鎖Ｆｖ分子（ただしＬはリンカー）は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ立体配置を有する別の単鎖Ｆｖ分子と結合し、二価の二量体を形成しうる。この場合、第一のｓｃＦｖのＶＬドメインおよび第二のｓｃＦｖ分子のＶＨドメインは結合して一つの標的結合部位を形成し、一方、第一のｓｃＦｖのＶＨドメインおよび第二のｓｃＦｖのＶＬドメインは結合してもう一方の標的結合部位を形成する。
本発明の他の態様は、非共有結合して三つの結合部位を形成し、そのうちの二つが一つの標的に対して親和性を有し、第三の結合部位は作製可能で診断薬および／または治療薬のための担体に結合しているハプテンに親和性を有する、二つの異種ポリペプチド鎖を含んでなるＣＤ７４二重特異性、三価のターゲッティングタンパク質である。好ましくは、その結合タンパク質は二つのＣＤ２０結合部位および一つのＣＤ２２結合部位を有する。この二重特異性、三価のターゲッティング薬剤は二つの異なるｓｃＦｖを有し、第一のｓｃＦｖは短いリンカーによりもう一つの抗体のＶＬドメインに連結された一つの抗体由来の二つのＶＨドメインを含み、第二のｓｃＦｖは短いリンカーによりもう一つの抗体のＶＨドメインに連結された第一の抗体由来の二つのＶＬドメインを含む。ＶＨおよびＶＬドメインから多価、多重特異的薬剤を作製するこれらの方法によれば、一つのＶＨ鎖と一つのＶＬ鎖の非共有結合により多価および多重特異的ないずれの薬物でも作製できるという方法で、宿主生物中でＤＮＡプラスミドから合成された個々の鎖が完全なＶＨドメイン（ＶＨ鎖）または完全なＶＬドメイン（ＶＬ鎖）から構成されることになる。例えば、三価の三重特異性薬剤の形成では、ＶＨ鎖は三つのＶＨドメインのアミノ酸配列からなり、それぞれのドメインは異なる特異性の抗体に由来し、種々の長さのペプチドリンカーにより連結され、またＶＬ鎖は相補的ＶＬドメインからなり、ＶＨ鎖に使用されたものと類似のペプチドリンカーにより連結されている。抗体のＶＨおよびＶＬドメインは逆平行に結合しているため、本発明の好ましい方法では、ＶＬ鎖のＶＬドメインはＶＨ鎖のＶＨドメインとは逆の順序で配置されている。
６．ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディー
本発明による抗ＣＤ７４抗体はまた、ダイアボディーとも呼ばれる、機能性二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）の調製に使用でき、組換え法により哺乳類細胞中で作製できる。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025,1995を参照されたい。例えば、ｂｓｃＡｂは組換え法によりグリシン−セリンリンカーを介して二つの単鎖Ｆｖフラグメントを結合することで作製する。問題の二つの抗体のＶＬ鎖（ＶＬ）およびＶＨ鎖（ＶＨ）ドメインは、標準的ＰＣＲ法により単離される。次に、それぞれのハイブリドーマから得られたｃＤＮＡのＶＬおよびＶＨは二段階の融合ＰＣＲにおいて結合されて単鎖フラグメントを形成する。第一のＰＣＲステップでは（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーを導入し、第二のステップではＶＬおよびＶＨアンプリコンを結合させる。次いでそれぞれの単鎖分子を細菌発現ベクターへクローニングする。増幅後に単鎖分子の一つを切り出して問題の第二の単鎖分子を含む他のベクターへサブクローニングする。得られたｂｓｃＡｂフラグメントを真核細胞発現ベクターへサブクローニングする。機能性タンパク質の発現は、そのベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞へトランスフェクトすることにより得られる。二重特異性融合タンパク質も同様の方法で調製される。二重特異性単鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は本発明の範囲内に含まれる。
例えば、ヒト化、キメラ、またはヒト抗ＣＤ７４モノクローナル抗体を、抗原特異的ダイアボディー、トリアボディー（triabody）、およびテトラボディー（tetrabody）を作製するために使用することができる。この単一特異性ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーは選択的に標的抗原に結合し、分子上の結合部位数が増加すると標的細胞に対する親和性が高まり、所望の位置における滞留時間が長くなるのが観察される。ダイアボディーに関しては、５つのアミノ酸残基のリンカーによりヒト化ＣＤ７４ ｍＡｂのＶKポリペプチドに連結されたヒト化ＣＤ７４ ｍＡｂのＶＨポリペプチドを含んでなる二つの鎖が利用される。各々の鎖はヒト化ＣＤ７４ダイアボディーの１／２を形成する。トリアボディーの場合、ヒト化ＣＤ７４ ｍＡｂのＶＫポリペプチドにリンカーは介さずに連結されたヒト化ＣＤ７４ ｍＡｂのＶＨポリペプチドを含んでなる三つの鎖が利用される。各々の鎖はｈＣＤ７４トリアボディーの１／３を形成する。
本明細書に記載の二重特異性ダイアボディーは最終的に、その後の診断薬または治療薬の特異的送達のために、ＣＤ７４陽性腫瘍をプレターゲッティングするために使用する。これらのダイアボディーは標的抗原に選択的に結合し、親和性を高め、所望の位置における滞留時間を延長する。さらに、抗原と結合していないダイアボディーは体内から迅速に排泄され、正常組織の曝露は最小限に抑えられる。診断薬および治療薬としては、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、増殖因子、複合体、放射性核種および金属が挙げられる。例えば、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）にはガドリニウム金属が用いられる。放射性核種の例としては、２２５Ａｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒ、および２１１Ａｔが挙げられる。特に診断薬用としてはエネルギー範囲が６０〜４,０００ｋｅＶ、治療薬用としてはエネルギー範囲が６０〜７００ｋｅＶの他の放射性核種も診断薬および治療薬として利用可能である。
より最近では、二重特異性を有する四価タンデムダイアボディー（ｔａｎｄａｂと呼ばれる）も報告されている(Cochlovius et al., Cancer Researchm (2000) 60:4336-4341）。この二重特異性ｔａｎｄａｂは同一の二つのポリペプチドの二量体であり、それぞれが二つの異なる抗体の四つの可変ドメインを含み（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）、これは自己会合に際してそれぞれの二つの異なる特異性のための二つの可能性のある結合部位の形成を容易にする方向に連結されている。
７．結合多価および多重特異性抗ＣＤ７４抗体
本発明による他の態様は、結合多価抗ＣＤ７４抗体である。第一または第二のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに、さらなるアミノ酸残基を付加してもよい。このさらなるアミノ酸残基は、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（例えば、プロドラッグ活性化酵素）、ホルモン、シュードモナス外毒素のようなペプチド毒素、ペプチド薬、細胞傷害性タンパク質または他の機能性タンパク質を含んでよい。本明細書において機能性タンパク質とは、生物学的機能を有するタンパク質である。
ある一つの態様によれば、薬物、毒素、放射性化合物、酵素、ホルモン、細胞傷害性タンパク質、キレート剤、サイトカインおよび他の機能性薬剤を多価標的結合タンパク質に、好ましくはこの多価標的結合タンパク質のアミノ酸残基の側鎖、例えばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基に対する共有結合を介して結合させてもよい。
例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなど、種々の慣用されるリンカーをこの目的のために用いてよい。多価タンパク質への薬剤の結合は、該タンパク質のその標的に対する結合特異性または親和性に有意な影響しないことが好ましい。本明細書において機能性薬剤とは、生物学的機能を有する薬剤である。好ましい機能性薬剤は細胞傷害剤である。
さらに他の態様によれば、二重特異性抗体によって指示される治療薬またはプロドラッグポリマーのin vivo標的への送達は、放射性核種の二重特異性抗体送達と組み合わせることが可能なので、化学療法と免疫療法を組み合わせることができる。各々の治療法は標的化可能な複合体と結合させて同時に投与することができ、また、核種は第一の標的化可能な複合体の一部として投与し、薬物は後のステップで第二の標的化可能な複合体の一部として投与することができる。
もう一つの態様によれば、細胞傷害剤は高分子担体と結合させ、次いでその高分子担体を多価標的結合タンパク質を結合させればよい。この方法に関しては、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、Ryser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870, 1978, 米国特許第４，６９９，７８４号および同第４，０４６，７２２号を参照されたい。複合体化は多価結合タンパク質の結合特異性または親和性に有意な影響を及ぼさないことが好ましい。
８．ヒト化、キメラおよびヒト抗体の治療および診断への使用
本明細書に記載の本発明のヒト化、キメラおよびヒトモノクローナル抗体、すなわち抗ＣＤ７４ ｍＡｂおよび他のＭＡｂは、治療法および診断法での使用に好適である。従って本発明は、本発明によるヒト化、キメラおよびヒト抗体の裸の抗体としての単独投与、または多様式療法として、治療薬とは結合させないが、投与計画に従った一時的投与を意図する。免疫複合体は、診断薬または治療薬と結合された、ＣＤ７４と結合する本発明に記載のヒト化、キメラ、またはヒトＣＤ７４ ｍＡｂの少なくとも一つのｍＡｂもしくはそのフラグメント、またはその融合タンパク質を含んでなる抗体成分を含んでなる複合体である。
裸の抗ＣＤ７４ ｍＡｂの効力は、裸の抗体を一以上の他の裸の抗体、すなわちＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、テネイシン、ＨＭ１. ２４、またはＨＬＡ−ＤＲ、好ましくは成熟ＨＬＡ−ＤＲ二量体などの特定の抗原に対するｍＡｂによって、あるいは薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、酵素、治療用放射性核種などの治療薬と結合させた抗ＣＤ７４またはこれら挙げられた抗原に対する抗体の一以上の免疫複合体によって、あるいはｍＡｂと同時または逐次または指示された投与計画に従って投与される薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、酵素、治療用放射性核種などの一以上の治療薬によって補完することにより増強させることができる。好ましいＢ細胞結合抗原としては、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＣＤ５抗原と同等なものが挙げられる。好ましいＴ細胞抗原としては、ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５（ＩＬ−２受容体）抗原と同等なものが挙げられる。ＨＬＡ−ＤＲ抗原と同等なものは、Ｂ細胞およびＴ細胞性疾患の双方の治療に使用できる。特に好ましいＢ細胞抗原はヒトＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ抗原と同等なものである。特に好ましいＴ細胞抗原は、ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５抗原と同等なものである。ＣＤ４６は癌細胞表面上の抗原であり、補体依存性溶解（ＣＤＣ）を阻害する。
好ましい悪性黒色腫関連抗原はＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２およびｇｐ１００と同等なものである。さらに、好ましい多発性黒色腫関連抗原はＭＵＣ１およびＣＤ３８と同等なものである。
さらに、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫および他の疾病または疾患における診断および治療のための免疫複合体の投与も意図する。本明細書に記載のように、免疫複合体は抗体成分および診断薬もしくは治療薬を担持するペプチドをはじめとする、治療薬または診断薬を含んでなる分子である。免疫複合体は、抗体成分の免疫反応性を保持しており、すなわち抗体部分の複合体形成前と複合体形成後の同族抗原に対する結合能力はほぼ同等か、わずかに低下している。
多種多様な診断薬および治療薬が、本発明による抗体と有利にも結合できる。本明細書に列挙された治療薬は、上記のように裸の抗体とは別に投与しても有用である薬剤である。治療薬としては、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピトフィロトキシン、タキサン、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤、およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、およびこれらまたは他の種類の抗癌剤由来の他のものなどの化学療法薬が挙げられる。免疫複合体および抗体融合タンパク質の調製に有用な他の癌化学療法薬としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体、ホルモンなどが挙げられる。好適な化学療法薬は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995およびGOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬のような他の好適な化学療法薬も、当業者に公知である。
これに加えて、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡのようなキレート剤または好適なペプチドに、蛍光分子のような検出可能な標識または、重金属もしくは放射性核種のような細胞傷害剤を結合させることができる。例えば、治療上有用な免疫複合体は、光活性薬または色素を抗体混成物に結合させることにより得られる。蛍光色素のような蛍光組成物、および他の色素原、または可視光線に感受性のあるポルフィリンのような色素は好適な光線を病巣に当てることにより病巣の検出および治療に使用されてきた。治療においては、これは光照射、光療法または光線力学療法と呼ばれている（Jori et al. (eds.）, PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES（Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430（1986））。さらに、光療法を行うためにはモノクローナル抗体が光活性化色素と結合させられてきた。Mew et al., J.Immunol. 130:1473(1983);前掲, Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986);前掲, Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med.9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529（1991)。しかし、これらの初期の研究には、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントの使用を伴った内視鏡療法の適用は含まれていなかった。従って本発明は、光活性薬または色素を含んでなる免疫複合体の治療的使用を意図する。
放射性および非放射性薬剤の診断薬としての使用もまた、本発明により意図される。好適な非放射性診断薬は、核磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法または超音波診断法に好適な造影剤である。核磁気イメージング剤としては、本発明の抗体とともに用いる場合には、例えば、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属キレート剤と錯化したマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属が挙げられる。引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、２００１年１０月１０日出願の米国出願番号０９／９２１，２９０を参照されたい。
さらに、放射性標識抗体または免疫複合体は、診断イメージングに有用なγ線を放射する放射性同位元素または陽電子放射体を含んでよい。特にエネルギー範囲が６０〜４,０００ｋｅＶの好適な放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒなどが挙げられる。例えば、造影の目的で１８Ｆ、６８Ｇａおよび９４ｍＴｃなどのような陽電子放射体を開示する、「Labeling Targeting Agents with Gallium-68」と題された発明者G. L.Griffiths and W. J. McBrideの米国特許出願（米国仮出願番号６０／３４２，１０４）（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）を参照されたい。
シュードモナス外毒素のような毒素も複合化しうるし、あるいは本発明の抗ＣＤ７４抗体の抗体融合タンパク質の治療薬部分を形成することができる。このような複合体または他の融合タンパク質の調製に適切に使用される他の毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ Ｉ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が挙げられる。例えば、Pastan et al., Cell 47:641(1986)、およびGoldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994)を参照されたい。本発明で用いるのに好適なさらなる毒素は当業者に公知であり、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。
サイトカインのような免疫調節剤もまた結合させうるし、あるいは抗体融合タンパク質の治療薬部分を形成することができ、あるいは本発明のヒト化抗ＣＤ２０抗体とともに投与してもよい。本発明に好適なサイトカインとしては、限定されるものではないが、後述のようにインターフェロンおよびインターロイキンが挙げられる。
また、本発明によれば、クラスＩまたはクラスII ＭＨＣ抗原ペプチドと共有結合させて抗体複合体とした、ヒト化、キメラまたはヒトＣＤ７４ ｍＡａｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質を含んでなるワクチンも意図され、このワクチンは癌または感染症を有する患者を治療するために用いられる。抗体複合体がＣＤ７４マーカーを含む細胞によってインターナライズされると、樹状細胞のような抗原提示細胞により、ｍａｂまたはそのフラグメントと結合している大きなペプチドまたはタンパク質からのタンパク質分解消化されてクラスＩまたはクラスII抗原ペプチドが放出される。この抗体複合体は、ｍＡｂまたはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡと抗原ペプチドまたはタンパク質をコードするｃＤＮＡとを融合させ、細菌、酵母または哺乳類細胞でその融合タンパク質を発現させることにより生産される。本発明によるヒト化、キメラまたはヒトＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質を含む抗体複合体は、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、１９９５年１２月２２日出願の「Use of Immunoconjugates to Enhance the Efficacy of Multi-Stage Cascade Boosting Vaccines」と題された、係属中の米国出願番号０８／５７７，１０６に記載されている治療法で特に有用である。本発明のヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂは実施例５のマウスＬＬ１の代わりとして特に有用である。
９．免疫複合体の調製
本発明のいずれの抗体または抗体融合タンパク質も、一種以上の治療薬または診断薬と結合させることができる。一般に、一種の治療薬または診断薬を各々抗体または抗体フラグメントに結合させるが、二種以上の治療薬または診断薬を同じ抗体または抗体フラグメントに結合させることもできる。本発明による抗体融合タンパク質は二以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、この融合タンパク質を含んでなる抗体各々が治療薬または診断薬を含みうる。また、一以上の抗体融合タンパク質の抗体には、二種以上の治療薬または診断薬を結合させることができる。さらに、この治療薬は同じである必要はなく、異なる治療薬であってもよい。例えば、同じ融合タンパク質に薬物と放射性同位元素を結合させることができる。特に、ＩｇＧは１３１Ｉで放射性標識し、薬物に結合させることができる。この１３１Ｉは、ＩｇＧのチロシンに組み込むことができ、薬物はＩｇＧリジンのεアミノ酸に結合させることができる。治療薬および診断薬はいずれも、還元ＳＨ基および炭化水素側鎖に結合させることもできる。
本発明による二重特異性抗体はプレターゲッティング法において有用であり、二種の治療薬または二種の診断薬を被検体に送達する好ましい方法を提供する。米国出願番号０９／３８２，１８６は、二重特異性抗体を用いるプレターゲッティング法を開示しており、そこでは二重特異性抗体を１２５Ｉで標識して被検体に送達し、次に９９ｍＴｃで標識した二価のペプチドを送達する。送達の結果、１２５Ｉおよび９９ｍＴｃに関して腫瘍／正常組織比は良好となることから、二つの診断用放射性同位元素の有用性が示されている。抗体および抗体融合タンパク質を標識するには公知の治療薬または診断薬のいずれの組み合わせでも使用できる。ｍＡｂ複合体の抗体成分の結合特異性、治療薬または診断薬の有効性および抗体のＦｃ部分のエフェクター活性は、複合体の標準的な試験により判定することができる。
治療薬または診断薬は、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。あるいは、このようなペプチドはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体成分に結合させることができる。Yu et al., Int. J. Cancer 56 : 244(1994)を参照されたい。このような結合に関する一般的な技術は当技術分野で周知である。例えば、Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al.,"Modification of Antibody by Chemical Methods, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al.(eds), pages 187-230（Wiley-Liss, Inc. 1995）; Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 60-84（Cambridge University Press 1995）を参照されたい。あるいは、治療薬または診断薬は抗体のＦｃ領域の炭化水素部分を介して結合させることもできる。この炭化水素基は、チオール基に結合している同じペプチドの付加量を増大させるためにも使用できるし、あるいはこの炭化水素部分は異なるペプチドに結合するためにも使用できる。
抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にペプチドを結合させる方法は当業者に周知である。例えば、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990);およびShih et al., 米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。一般的な方法としては、炭水化物部分が酸化された抗体成分を、少なくとも一つの遊離アミン基を有し、かつ、複数のペプチドが付加された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは第二級アミンへの還元により安定化され最終の複合体を形成しうる。
免疫複合体の抗体成分として用いられる抗体が抗体フラグメントである場合には、Ｆｃ領域は存在しない。しかし、炭化水素部分を全長抗体または抗体フラグメントのＬ鎖可変領域へ導入することが可能である。例えば、Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., 米国特許第５，４４３，９５３号(1995), Leung et al., 米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたい（なお、これらは総て引用することにより本明細書の一部とする）。この操作された炭化水素部分は、治療薬または診断薬を結合させるために用いられる。
１０．医薬上許容される賦形剤
被検体に送達されるヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂは、ｍＡｂ単独、免疫複合体、融合タンパク質から構成されるか、または一以上の医薬上好適な賦形剤、一以上の付加的成分またはこれらのある組み合わせを含みうる。
本発明による免疫複合体または裸の抗体は、医薬上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調剤され、この免疫複合体または裸の抗体は混合物中で医薬上好適な賦形剤と結合する。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition （Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびそれらの改訂版を参照されたい。
本発明による免疫複合体または裸の抗体は、例えばボーラス注射または点滴による静脈内投与のために調剤できる。注射製剤は、例えばアンプルのような単位投与形、または保存剤を加えた複数回投与用容器で提供することができる。この組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、その活性成分は使用前に例えば滅菌パイロジェンフリー水のような好適なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。
治療用もしくは診断用複合体または裸の抗体の作用時間を制御するために、その他の製薬法を用いてもよい。徐放性製剤は、免疫複合体または裸の抗体と複合体形成するか、または免疫複合体または裸の抗体を吸着するポリマーの使用を通じて調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）マトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸の無水共重合体マトリックスが挙げられる。Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446(1992）を参照されたい。このようなマトリックスからの免疫複合体または抗体の放出速度は、免疫複合体または抗体の分子量、マトリックス内の免疫複合体、抗体の量、および分散している粒子の大きさによって異なる。Saltzman et al., Biophys. J. 55:163(1989); Sherwood et al.,前掲を参照されたい。他の固形投与形は、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition（Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびその改定版に記載されている。
また、免疫複合体、抗体融合タンパク質または裸の抗体は哺乳類に皮下投与または他の非経口経路でも投与できる。さらに、投与は点滴でも単回または複数回のボーラス注射によってもよい。一般に、ヒトにおいては投与される免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および以前の病歴といった因子によって異なる。通常、単回の静脈点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の免疫複合体、抗体融合タンパク質または裸の抗体をレシピエントに与えるのが好ましいが、状況によってはより低い、またはより高い用量を投与してもよい。この用量は必要に応じで繰り返してもよく、例えば、１週間に１回の投与を４〜１０週間、好ましくは１週間に１回の投与を８週間、そしてより好ましくは、１週間に１回の投与を４週間繰り返してもよい。また、１週間おきの投与を数ヶ月といったように低い頻度で投与してもよい。用量および日程を適宜調節して、種々の非経口経路により投与してよい。
治療目的では、治療上有効な量の免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体を哺乳類に投与する。ヒト以外の動物被検体もまた意図されるが、本発明の好適な被検体は通常ヒトである。抗体製剤は、投与される量が生理学上有意であれば、「治療上有効量」で投与されると言われる。薬物は、その存在が受容哺乳類の生理に検出可能な変化をもたらす場合に、生理学上有意である。特に、本発明の抗体製剤は、その存在が抗腫瘍応答を誘起するか、または自己免疫疾患の徴候および症候を緩和する場合に、生理学上有意である。また、生理学上有意な効果は、受容哺乳類における体液性および／または細胞性免疫応答を誘起することでありうる。
１１．治療方法
本発明はＣＤ７４発現悪性腫瘍の治療のための基本組成物としての本発明の裸の抗ＣＤ７４抗体の使用を意図し、これらの疾病または疾患は免疫調節障害症、自己免疫疾患、臓器移植拒絶症、および移植片対宿主病からなる群から選択される。ＣＤ７４発現悪性腫瘍は固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、その他のＢ細胞悪性腫瘍およびＴ細胞悪性腫瘍からなる群から選択される。固形腫瘍は黒色腫、癌腫および肉腫からなる群から選択され、癌腫は腎臓癌、肺癌、腸癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される。Ｂ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、および多発性骨髄腫、Ｂ細胞疾患、およびその他の疾患からなる群から選択される。特に本明細書に記載の組成物は、種々の自己免疫性ならびに無痛性Ｂ細胞リンパ腫、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療に特に有用である。例えば、ヒト化抗ＣＤ７４抗体成分および免疫複合体を用いて無痛性および急速進行性非ホジキンリンパ腫の双方を治療することができる。
より具体的には、本発明は、医薬上許容される担体と、本発明の少なくとも一種のヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質を含んでなる治療組成物を、Ｂ細胞関連悪性腫瘍を有する被験体に投与することを含んでなる、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療方法を意図し、ここで、Ｂ細胞悪性腫瘍はリンパ腫または白血病である。より具体的には、Ｂ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫、無痛型Ｂ細胞リンパ腫、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または急性リンパ性白血病である。ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントは２０〜２０００ｍｇの用量で静脈または筋肉内投与される。本方法はさらに、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するのに用いられる少なくとも一種の治療薬を投与する前、投与する際、または投与した後に抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントを投与することを含んでなる。この治療薬は裸の抗体、免疫調節剤、ホルモン、細胞傷害剤、酵素、少なくとも一種の免疫調節剤、放射性標識、ホルモン、酵素もしくは細胞傷害剤と結合させた抗体、またはそれらの組み合わせを含んでなる。免疫調節剤は好ましくはサイトカインであり、細胞傷害剤は薬物または毒素である。裸の抗体として組み合わせなしに、または補助的免疫調節剤として投与される抗体は医薬上許容されるビヒクル中に調剤され、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、テネイシン、およびＨＬＡ−ＤＲ、好ましくは成熟ＨＬＡ−ＤＲ二量体と反応性がある。
本発明はまた、リンパ腫または白血病以外のＣＤ７４抗原陽性悪性腫瘍を有する被験体に、医薬上許容される担体と本発明で開示される少なくとも一種の抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質を含んでなる治療組成物を投与することを含んでなる悪性腫瘍を治療することを意図する。抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質は２０〜２０００ｍｇの用量で静脈または筋肉内投与される。さらに、抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質は、悪性腫瘍の治療に用いられる少なくとも一種の治療薬を投与する前、投与する際、または投与した後に投与される。上記のような、また、本明細書を通じた治療薬は、抗体、免疫調節剤、ホルモン、細胞傷害剤、少なくとも一種の免疫調節剤、放射性標識、酵素、ホルモン、細胞傷害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせと結合させた抗体を含んでなり、この免疫調節剤はサイトカインであり、細胞傷害剤は薬物または毒素である。Ｂ細胞悪性腫瘍ではない悪性腫瘍を治療するために、医薬上許容されるビヒクル中に調剤して抗体を抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントと組み合わせて投与する場合、それは治療する悪性腫瘍を含む細胞によって発現されるＣＤ７４以外の腫瘍マーカーと反応性がなければならない。悪性黒色腫関連抗原に対して投与しうる抗体の例としては、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２およびｇａｐ１００と反応性のある抗体が挙げられる。さらに、多発性骨髄腫関連に対する好ましい抗体としては、ＭＵＣ１およびＣＤ３８に反応性があるものが挙げられる。
治療用組成物は少なくとも一種のヒト化、キメラまたはヒトモノクローナル抗ＣＤ７４抗体を単独で、あるいは他のヒト化、キメラ、もしくはヒト抗体などの他の抗体、または治療薬または免疫調節剤と組み合わせて含む。特に完全なヒト抗体との組み合わせ療法も意図され、これは上記に示される方法によって製造される。
また、裸の、あるいは同じもしくは異なるエピトープまたは抗原と結合させた抗体を本発明の一以上の抗体と組み合わせてもよい。例えば、ヒト化、キメラまたはヒト裸抗ＣＤ７４抗体を他の裸のヒト化、裸のキメラまたは裸のヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂと組みあわせてもよく、ヒト化、キメラまたはヒト裸抗ＣＤ７４抗体を抗ＣＤ７４免疫複合体と組みあわせてもよく、裸の抗ＣＤ７４抗体を抗ＣＤ２２放射性複合体と組みあわせてもよく、あるいは、抗ＣＤ２２裸抗体を同位元素、一以上の化学治療薬、サイトカイン、酵素、毒素またはそれらの組み合わせと結合させたヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４抗体と組みあわせてもよい。ヒト化、キメラまたはヒトＣＤ２０抗体と毒素もしくは免疫調節剤との融合タンパク質、あるいは少なくとも二つの異なるＢ細胞抗体（例えば、ＣＤ７４とＣＤ２２ ｍＡｂ、ＣＤ２０ ｍＡｂまたはＣＤ１９ ｍＡｂ）の融合タンパク質も本発明において使用できる。米国特許第６，３０６，３９３号の継続出願である、「Immunotherapy of B-Cell Malignancies Using Anti-CD-22 Antibodies」と題された、２００１年１０月１日出願の、係属中の米国出願番号０９／９６５，７９６を参照されたい（両者とも引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とし、他の裸の抗体と組み合わせた抗ＣＤ２２抗体により治療を開示している）。上記ですでに挙げたようなＢ細胞疾患に関連する少なくとも二つの異なる抗原を標的とする多くの異なる抗体の組み合わせが、裸の抗体として、または一部は裸で一部は治療薬もしくは免疫調節剤と結合したものとして、あるいは単に細胞傷害剤などの他の治療薬または放射線と組み合わせて構成することができる。
本明細書において「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、ならびにインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの造血因子、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｌ−２１、およびそれらの組み合わせ、ならびにインターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。あるいは、被検体に裸の抗ＣＤ７４抗体を投与してもよく、別にサイトカインを投与することもでき、これは裸の抗ＣＤ７４抗体を投与する前、投与する際または投与した後に投与することができる。上記に述べたように、抗ＣＤ７４抗体はまた、免疫調節剤と結合させてもよい。この免疫調節剤はまた、異なる抗原と結合する一以上の抗体からなるハイブリッド抗体と結合させてもよい。
本発明の多様式療法はさらに、裸の抗体、融合タンパク質の形態で、または免疫複合体として抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４６またはＨＬＡ−ＤＲ、好ましくは成熟ＨＬＡ−ＤＲ二量体抗体の投与を補った裸の抗ＣＤ７４抗体による免疫療法も含む。これらの抗体としては、これらの抗原決定基上の少なくとも一つのエピトープを認識するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体が挙げられる。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２抗体は当業者に公知である。例えば、引用することによりそれらの全開示内容を本明細書の一部とする、Ghetie et al., Cancer Res. 48:2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996)、ならびに米国特許第５，７９８，５５４号および同第６，１８７，２８７号を参照されたい。
多様式療法の別の形態では、被検体に裸の抗ＣＤ７４抗体および／または免疫複合体を、標準的な癌の化学療法と組み合わせて投与する。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２エトポシド、および１５０〜２００ｍｇ／ｍ２カルムスチン）は、非ホジキンリンパ腫の治療に用いられる投与計画である。Patti et al., Eur. J. Haematol. 51:18 (1993)を参照されたい。その他の好適な組み合わせ化学療法計画も当業者に周知である。例えば、Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas," CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3rd Edition, Holland et al. (eds. ), pages 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)を参照されたい。示したように、中悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療のための第一世代化学療法計画としては、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニソン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニソン）が挙げられる。有用な第二世代の化学療法計画としては、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）があり、好適な第三世代の計画としては、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）がある。さらなる有用な薬物としては、フェニルブチレートおよびブロスタチン−１がある。好ましい多様式療法では、化学療法薬とサイトカインの双方を本発明の抗体、免疫複合体または融合タンパク質と同時に投与する。サイトカイン、化学療法薬および抗体または免疫複合体はいずれの順序で投与してもよく、一緒に投与してもよい。
ある好ましい態様によれば、ＮＨＬは、連続４週間毎週または隔週２００〜４００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト化抗ＣＤ７４抗体の週１回を４回点滴し（２〜６時間かけて静脈投与）、必要があれば次の月／年にわたって繰り返す。また好ましくは、ＮＨＬは上記のように半月後と４回の点滴、同じ日に、抗ＣＤ７４モノクローナル抗体の点滴前、点滴中または点滴後に１時間にわたる静脈点滴として投与する３６０ｍｇ／ｍ２の用量のエプラツズムＡｂ（抗ＣＤ２２ヒト化抗体）と組み合わせて治療する。いっそう好ましくは、ＮＨＬはイットリウム−９０（Ｙ９０の用量は何週間または何ヶ月という期間で一回以上の注入として５〜３５ｍＣｉ／ｍ２の間である）などの治療用同位元素で放射性標識したＣＤ２２ ｍＡｂの二回以上の注入と組み合わせて、上記のような抗ＣＤ７４抗体の１週１回の４回で処置する。
さらに、本発明による治療組成物は異なる非ブロッキングＣＤ７４エピトープに向けられた裸のモノクローナル抗ＣＤ７４抗体の混合物またはハイブリッド分子を含みうる。よって、本発明は、少なくとも二つのＣＤ７４エピトープと結合するモノクローナル抗ＣＤ７４抗体の混合物を含んでなる治療組成物を意図する。さらに、本明細書に記載の治療組成物はＣＤＲ配列の異なる抗ＣＤ７４抗体の混合物を含みうる。
裸の抗ＣＤ７４抗体はＢ細胞リンパ腫および自己免疫疾患の治療のための基本治療組成物であるが、このような抗体療法の効力は、この裸の抗体に、ＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγをはじめとするインターフェロン；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびそれらの組み合わせを含むインターロイキン；ならびにＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦをはじめとするサイトカインのような免疫調節剤などの添加剤を補うことにより増強することができる。よって、ＣＤ７４抗体は、混合物として（個別に、または所定の投与計画で投与される）または抗ＣＤ７４抗体との複合体もしくは融合タンパク質として抗体およびサイトカインと組み合わせることができるだけでなく、薬物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせとしても投与することができる。例えば抗ＣＤ７４抗体は４薬化学療法計画としてのＣＨＯＰと組み合わせてもよい。さらに、裸の抗ＣＤ７４抗体は裸の抗ＣＤ２２抗体、およびＮＨＬ療法用の薬物組み合わせとしてのＣＨＯＰまたはフルダラビンと組み合わせてもよい。これらの補助的治療組成物は抗ＣＤ７４抗体の投与前、投与と同時または投与後に投与することができる。裸の抗ＣＤ７４ ｍＡｂはまた、アンチセンスｂｃｌオリゴヌクレオチドと組み合わせてもよい。
上記で述べたように、本発明の抗体はＢ細胞リンパ腫および白血病、ならびにその他のＢ細胞の疾病または疾患、ならびに罹患した、または関連する悪性細胞がＣＤ７４と反応性がある他の悪性腫瘍を治療するために使用できる。例えば、抗ＣＤ７４抗体は、免疫不全症、および急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫媒介性血小板減少症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、溶血性連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑らい、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、類肉腫症、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェジナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、および繊維性肺胞炎といった第III種自己免疫疾患をはじめとするＢ細胞関連免疫疾患の治療に使用できる。
特に、本発明のヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質はこれらの自己免疫疾患の一以上を有する被験体に投与される。本発明による抗ＣＤ７４抗体は、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、「Immunotherapy of Autoimmune Disorders using Antibodiess that Target B-Cells」と題された、２０００年６月９日出願の係属中の米国出願番号０９／５９０，２８４に開示されている自己免疫疾患の治療法に特に有用である。好ましくは、この抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質は２０〜２０００ｍｇの用量で静脈または筋肉内投与される。さらに、この抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質は、この疾患の治療に用いられる少なくとも一種の治療薬を投与する前、投与する際、または投与した後に投与される。上記のような、また、本明細書を通じた治療薬は、抗体、免疫調節剤、ホルモン、酵素、細胞傷害剤、少なくとも一種の免疫調節剤、放射性標識、ホルモン、酵素、細胞傷害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせと結合させた抗体を含んでなり、この免疫調節剤はサイトカインであり、細胞傷害剤は薬物または毒素である。裸の抗体として組み合わせなしに、または補助的免疫調節剤として投与される抗体は医薬上許容されるビヒクル中に調剤され、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、テネイシン、および成熟ＨＬＡ−ＤＲ、好ましくは成熟ＨＬＡ−ＤＲ二量体と反応性がある。
リンパ腫、白血病、骨髄腫、他のＣＤ７４発現悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患およびそれらの組み合わせからなる群から選択される疾病の治療のためのさらなる方法は、医薬上許容される担体と本発明の少なくとも一種の抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質を含んでなる治療組成物を投与することを含んでなり、ここで、少なくとも一種の治療薬が化学結合または遺伝子融合により、ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質のＦｖまたはＦａｂに結合されている。この治療薬は免疫調節剤、放射性標識、ホルモン、酵素、または細胞傷害剤であってよく、免疫調節剤はサイトカインであり、細胞傷害剤は薬物または毒素である。
抗ＣＤ７４抗体はまた、ＣＤ７４抗原を発現する細胞においてアポトーシスを誘導しうる。この誘導の証拠は本発明の実施例で支持されている。他の抗体でも、架橋したＣＤ２０ ＭＡｂのＩｇＧ１−Ｆｃと反応性のあるＦｃ受容体を有するリンパ系細胞を用いてアポトーシスが誘導できたことが実証されている。Shan et al., Cancer Immunol. Immunother. 48 (12):673-683 (2000)を参照されたい。さらに、キメラＣＤ２０ ＭＡｂの集合体、すなわちホモポリマーがアポトーシスを誘導したことも報告されている。Ghetie et al., Blood 97(5):1392-1398 (2000)およびGhetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94(14):7509-7514 (1997)を参照されたい。
Ｂ細胞のＣＤ７４表面抗原に特異的な抗体を哺乳類被験体に注射することができ、これは次に正常Ｂ細胞と悪性Ｂ細胞の両者のＣＤ７４細胞表面抗原と結合する。哺乳類被験体としてはヒトおよびイヌやネコなどのペットをはじめとする家庭内動物が挙げられる。本発明による抗ＣＤ７４ ｍＡｂ、すなわちヒト化、キメラ、ヒト、イヌ化およびネコ化、さらにはマウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂは、ＣＤ７４抗原に対して交差反応性のある種が存在する場合、非ヒト哺乳類被検体を治療するのに使用できる。ヒトにおいて免疫原性のあるマウスｍＡｂは通常、非ヒト哺乳類被検体では免疫原性が低い。ＣＤ７４表面抗原に結合している抗ＣＤ７４抗体は腫瘍性Ｂ細胞の破壊と枯渇をもたらす。
１２．診断方法
本発明ではまた、リンパ腫、白血病、骨髄腫、その他のＣＤ７４発現悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの疾病を有するかどうか診断される、または疑いのある被験体の疾病を診断する方法を提供し、その方法は医薬上許容される担体と少なくとも一種の抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントまたはその抗体融合タンパク質を含んでなる、診断上有効量の診断用複合体を該被験体に投与すること（ここで、診断薬は化学結合によりｍＡｂもしくはそのフラグメント、またはその抗体融合タンパク質のＦｖもしくはＦａｂと結合されている）、およびその診断薬を検出することを含んでなる。本発明に有用な診断薬は、放射性同位元素（この放射性同位元素の光量子はラジオシンチグラフィーまたはＰＥＴにより検出される）、またはＭＲＩにより検出できる金属、またはリポソームもしくはガス充填リポソームである（このリポソームは超音波走査装置により検出することができる）。
マウス抗ＣＤ７４ ｍＡｂ、キメラ抗ＣＤ７４ ｍＡｂおよびヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂの標的細胞へのインターナリゼーションは、本質的にPirker et al., J. Clin. Invest., 76: 1261 (1985)（引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）の手順に従って蛍光標識により追跡することができる。Ｒａｊｉ培養細胞を遠心分離し、細胞を新鮮培地に約５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに細胞懸濁液１００μＬを加える。総ての反応が同時に終わるような時間間隔で、反応ウェルに４０μｇ／ｍＬの抗体１００μＬ量を加える。このプレートをＣＯ２細胞培養インキュベーターにて３７℃でインキュベートする。インキュベーションが終わったところで、細胞を冷１％ＦＣＳ／ＰＢＳで３回洗浄することで結合しなかった抗体を除去する。次にこれらの細胞を４℃で１５分間、１ｍＬのＦｏｒｍａｉｄ−Ｆｒｅｓｈ［１０％ホルマリン溶液(Fisher, Fair Lawn, NJ)］で処理する。洗浄後、細胞表面か細胞内かのいずれかに存在する抗体を、それぞれアッセイされる抗体がマウスであるかキメラであるかヒト化であるかによってＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体(Tago, Burlingame, CA)、またはＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)で処理することにより検出する。蛍光分布をＢＨ−２蛍光顕微鏡(Olympus, Lake Success, NY)を用いて評価する。
これに関して、骨癌をスクリーニング／診断する方法がJuweid et al., 1999に記載されており、本発明の優れた抗ＣＤ７４ ｍＡｂから利益を得ることができるだろう。よって、９９ｍＴｃ標識ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４ ｍＡｂを含んでなる方法が意図される。
１３．発現ベクター
ＤＮＡ配列はヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂをコードしているものである。より具体的には、このＤＮＡ配列は、（ａ）本明細書に記載の抗ＣＤ７４ｍＡｂまたはそのフラグメント、（ｂ）本明細書に記載の抗ＣＤ７４ ｍＡｂまたはそのフラグメントのいずれか一つを含んでなる免疫複合体、（ｃ）本明細書に記載の少なくとも二種の抗ＣＤ７４ｍＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント、（ｄ）本明細書に記載の抗体融合タンパク質またはそのフラグメント、（ｅ）本明細書に記載のワクチン、および（ｆ）本明細書に記載の二重特異性または多重特異性抗体からなる群から選択されるｍＡｂまたはそのフラグメントをコードする核酸を含んでなる。本発明によるＤＮＡ配列はいずれも、核酸の複製をもたらす種々の既知の宿主ベクター中へ組換え操作することができる。これらのベクターは公知の方法を用い、核酸が送達される細胞内で核酸の転写、翻訳またはその双方を命令するために必要なエレメントを含むよう設計することができる。既知の方法論を用い、適当な転写／翻訳制御シグナルと作動可能なように連結されたタンパク質コード配列を有する発現構築物を作製することができる。これらの方法としてはin vitro組換えＤＮＡ技術および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (New York); Ausubel et al., 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (New York)を参照されたい。また、本発明では、ベクターと会合していないポリヌクレオチドの送達も提供する。
本発明における使用に好適なベクターはウイルス系であっても非ウイルス系であってもよい。ウイルスベクターの特定の例としては、アデノウイルス、ＡＡＶ、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。非ウイルス系ベクターの例としては、プラスミドがある。好ましい態様によれば、ベクターはプラスミドである。
本明細書に記載の発現ベクターは、宿主細胞で発現される遺伝子を含むポリヌクレオチドである。典型的には、遺伝子発現は構成的または誘導型プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーをはじめとする、ある特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子はそれら調節エレメントに「作動可能なように連結される」と言われる。好ましい発現ベクターはｐｄＨｌ２およびＧＳベクターである。
好ましくは本発明による発現ベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖可変および定常領域の双方を含むヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂをコードするＤＮＡ配列を含んでなる。しかし、一方がＨ鎖可変および定常領域を含み、他方がＬ鎖可変および定常領域を含むといったように二つの発現ベクターを用いてもよい。この発現ベクターはさらにプロモーターを含むと一層好ましい。任意の強力なプロモーターを使用できるので、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖定常領域をコードするゲノム配列、Ｉｇエンハンサーエレメント、および選択マーカーをコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含みうる。
本発明を用いる抗ＣＤ７４ ｍＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを発現させる方法は、（ａ）宿主細胞を、抗ＣＤ７４ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、またはその免疫複合体、融合タンパク質、または二重特異性もしくは多重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトすること；および（ｂ）抗ＣＤ７４ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを分泌する細胞を培養することを含んでなる。宿主細胞は細菌、酵母、または哺乳類細胞に由来するものである。より好ましくは哺乳類細胞由来のものであり、ある態様によれば、骨髄腫細胞などのリンパ系細胞である。
また、本明細書では、ヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂを発現させる方法を意図し、その方法は、（ｉ）ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ７４ ｍＡｂをコードするＤＮＡ配列を含んでなる少なくとも一つの発現ベクターをインターナライズすること、（ii）少なくとも一つの該インターナライズベクターで哺乳類細胞をトランスフェクトすること、（iii）マーカー遺伝子を発現するトランスフェクト細胞を選択すること、および（iv）それらのトラスフェクト細胞からヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂを分泌する細胞を同定することを含んでなる。
本発明者らは、マウス抗ＣＤ７４モノクローナル抗体（ｍＬＬ１ ｍＡｂ）のＶＬおよびＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを単離し、ヒト抗体のそれぞれκおよびＩｇＧ１定常領域をコードする遺伝子を含む哺乳類発現ベクターへそれらを組換え的にサブクローニングした。これら二つの組換えＤＮＡで哺乳類細胞を同時トランスフェクトしたところ、キメラ抗ＣＤ７４ ｍＡｂ（ｃＬＬ１）を発現し、それは親のｍＬＬ１ ｍＡｂ同様、Ｂリンパ腫細胞と強く結合し、Ｂリンパ腫細胞によって迅速にインターナライズされた。
上記のような哺乳類細胞でヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂ（ｈＬＬ１）が発現されるよう、ＶＫおよびＶＨ ＤＮＡのＣＤＲも同様に、それぞれヒトＶＫおよびＶＨ領域のフレームワーク（ＦＲ）配列に組換え的に結合させ、次にこれらをそれぞれヒトκおよびＩｇＧ１定常領域に結合させる。
Ｈ鎖を分離して一価のＬ−Ｈ鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような抗体を切断する他の方法、または他の酵素学的、化学的または遺伝学的技術も、それらのフラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り用いてよい。
本明細書に記載の抗体はモノクローナル（ｍＡｂ）である。モノクローナル抗体は特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、これらの抗体は核酸が特異的に結合するただ一つのタイプの抗原結合部位を含んでなる。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975),およびColigan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)［以下、"Coligan"］を参照されたい。要するに、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、血清サンプルを採取することで抗体生産の存在を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を得、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作出し、そのハイブリドーマをクローニングし、その抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、その抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、そのハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得ることができる。
ｍＡｂは十分確立された種々の技術によってハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離技術としては、Ａタンパク質セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3を参照されたい。また、Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)も参照されたい。
１４．作製方法
キメラまたはヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂのＶＫおよびＶＨ配列は、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とするOrlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833 (1989))が記載しているようなＰＣＲにより増幅することができる。ＶＫ配列はプライマーＣＫ３ＢＨおよびＶＫ５−３を用いて増幅することができ(引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とするLeung et al., BioTechniques, 15:286 (1993))、ＶＨ配列はマウスＩｇＧのＣＨ１領域へアニーリングするプライマーＣＨ１ＢおよびＶＨＩＢＡＣＫ（Orlandi et al., 1989, 前掲)を用いて増幅することができる。１０μｌの第一鎖ｃＤＮＡ産物、９μＬの１０Ｘ ＰＣＲバッファー［５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)を含有するＰＣＲ反応混合物に対して３０サイクルのＰＣＲを行うことができる。各ＰＣＲサイクルは好ましくは９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の重合からなる。増幅されたＶＫおよびＶＨフラグメントは２％アガロース(BioRad, Richmond, CA)上で精製することができる。ヒト化Ｖ遺伝子を構築する際に用いる自動Cyclone Plus DNAシンセサイザー(Milligan-Biosearch)でのオリゴＡ（１４９マー）およびオリゴＢ（１４０マー）の合成方法については実施例３を参照されたい。
ＶＫのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、およびＶＫ ＰＣＲ産物のフレーム内連結を容易にする便宜な制限部位を含む、ｐＢＲ３２７に基づく足場ベクターＶＫｐＢＲなどの足場ベクター中にサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくＶＨｐＢＳなどの同様の足場ベクター中へサブクローニングすることができる。各ＰＣＲ産物を含む個々のクローンは、例えば引用することにより本明細書の一部とするSanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463 (1977)の方法により配列決定すればよい。
本明細書に記載のＤＮＡ配列は、天然に存在するものであれ誘導されたものであれ、総てのその対立遺伝子、突然変異体および変異体を含むと考えられる。
この二つのプラスミドを適当な細胞、例えば骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４中に同時トランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性に関してコロニーを選択し、上清を、例えば下記のようにＥＬＩＳＡアッセイにより、キメラまたはヒト化抗ＣＤ７４ ｍＡｂの産生に関してモニタリングすることができる。
トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンのアッセイは次のようにして行うことができる。引用することにより本明細書の一部とするCo et al., J Immunol., 148:1149 (1992)に従うエレクトロポレーション(BioRad, Richmond, CA)による５×１０６個のＳＰ２／０骨髄腫細胞のトランスフェクションには、約１０μｇのｈＬＬ１ｐＫｈ（Ｌ鎖発現ベクター）および２０μｇのｈＬＬ１ｐＧ１ｇ（Ｈ鎖発現ベクター）を用いることができる。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、９６ウェルマイクロタイタープレートにて完全ＨＳＦＭ培地(GIBCO, Gaithersburg, MD)中で増殖させればよい。選択プロセスは２日後、ハイグロマイシン選択培地(Calbiochem, San Diego, CA)を最終濃度５００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで加えることにより開始することができる。コロニーは通常エレクトポレーション後２〜３週間で出現する。次に、これらの培養物をさらなる分析のために拡張することができる。
キメラまたはヒト化Ｈ鎖の分泌に関して陽性のトランスフェクトーマクローンはＥＬＩＳＡアッセイにより同定することができる。要するに、トランスフェクトーマ培養物からの上清サンプル（１００μＬ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)をプレコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３反復で添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することで結合していないタンパク質を除去する。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)をウェルに加える（抗体原液を１０４倍希釈したもの１００μＬ、非結合抗体を最終濃度１．０μｇ／ｍＬまで添加）。１時間インキュベートした後、プレートを通常３回洗浄する。反応溶液［ＰＢＳ中、１６７μｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）(Sigma, St. Louis, MO)、０．０２５％過酸化水素を含有する１００μＬ］をウェルに加える。暗所にて３０分間、発色させる。各ウェルに５０μＬの４Ｎ ＨＣｌ溶液を加えることで反応を停止させた後、自動ＥＬＩＳＡリーダー(Bio-Tek instruments, Winooski, VT)で４９０ｎｍにて吸光度を測定する。次に、無関係なキメラ抗体標品(Scotgen, Ltd., Edinburg, Scotlandから入手可能）に対して結合キメラ抗体を測定する。
抗体は細胞培養培地から次のようにして単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を血清フリー培地に適用する。キメラ抗体の生産のためには、ＨＳＦＭを用い細胞を回転瓶中５００ｍＬの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分子し、上清を０．２μメンブランで濾過する。濾過した培地をＡタンパク質カラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍＬ／分で通す。次にこの樹脂を約１０倍カラム量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５）を用いて、Ａタンパク質結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍＬ画分を、１０μＬの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）の入った試験管に回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求める。ピーク画分をプールし、ＰＢＳの対して透析し、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０(Amicon, Beverly, MA)を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度は上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍＬに調整する。保存のためにはサンプルにアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を加えると便宜である。
本明細書に挙げられた総ての刊行文献および特許ならびに特許出願は引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。以下、単に例として示される実施例により本発明をさらに説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に示される技術から明らかな総ての改変を含む。
実施例１ ＬＬ１ Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域の分子クローニングおよび配列の解明
それぞれLeung et al. 1993およびOrlandi et al. (PNAS 86:3833-3837 (1989))が記載しているようにＶＫ５’−４およびＶＫ１ＦＯＲプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによりｍＬＬ１のＶＫ遺伝子を得、ｐＣＲ２．１ ＡＴ−クローニングベクター(Invitrogen)中へクローニングした。ＰＣＲ反応から生じたエラーを排除するため、複数のクローンを配列決定した。大多数のクローン（６）は同じマウスＶＫ配列を含んでおり、これをＬＬ１ ＶＫと名づけ、その配列が図１Ｂに示されている。他のマウスＶｋ配列と比較したところ、ＬＬ１ＶｋはκＬ鎖サブクラスIIに属するものであることが明らかになった。
ＲＴ−ＰＣＲではマウスＶＨ遺伝子をコードする全長配列が得られなかったので、もう一つのクローニングアプローチとしてｃＤＮＡ ５’末端（５’−ＲＡＣＥ）の迅速増殖を用いた。ＬＬ１ハイブリドーマ細胞から調製したアダプターにより連結されたｃＤＮＡを、ユニバーサルアンカープライマー(Life Technologies)およびマウスＨ鎖のＣＨ１領域にアニーニングする遺伝子特異的プライマーＣＨ−１Ｂ(Leung et al. 1994)を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲから得られた〜６５０ｂｐの主要なＰＣＲ種をｐＣＲ２．１ ＡＴ−クローニングベクターへクローニングし、ＤＮＡシーケンシングにより複数のクローンの配列を決定した。このＰＣＲ産物は、非コード配列、５’末端分泌シグナルペプチドおよびγ１鎖のＣＨ１ドメインの部分コード配列によりフランキングされた全長ＶＨ配列（図１Ａ）を含んでいた。ＶＨをコードする配列内で欠失突然変異が見られ、これはＬＬ１ＶＨと名づけた。ｈＬＬ１ＶＨを他のマウスＶＨ配列と比較したところ、マウス重鎖のその他のサブグループに属することが明らかになった(Kabat et al., 1991)。ＫａｂａｔデータベースにてＬＬ１ＶＨおよびＶκのアミノ酸配列をマウスＡｂ Ｖ遺伝子と比較し、Ｋａｂａｔの定義を当てはめることにより、ｈＬＬ１ＶＨおよびＶｋのＣＤＲ領域はそれぞれ図１ＡおよびＢに示されるように同定された。ＫａｂａｔデータベースにてＬＬ１ＶＨおよびＶκのアミノ酸配列をマウスＡｂ Ｖ遺伝子と比較し、Ｋａｂａｔの定義を当てはめることにより、ｈＬＬ１ＶＨおよびＶｋのＣＤＲ領域はそれぞれ図１ＡおよびＢに示されるように同定された。
実施例２ キメラＬＬ１の発現ベクターの構築
クローニングされたＬＬ１のＦｖの忠実性を評価するため、キメラＬＬ１（ｃＬＬ１）を構築し、発現させた。ＬＬ１ Ｖｋのヌクレオチド残基７〜１２を、プライマーＬＬ１ＶＫ−ＰｖｕＩＩおよびＶＫ１ＦＯＲを用いたＰＣＲによりＰｖｕＩＩ制限部位ＣＡＧＣＴＧへと改変した。得られたＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩおよびＢｇＩＩＩで消化（Ｖｋの内部ＢｇＩＩＩ部位の存在により部分的）し、ｐＢＲ３２７に基づく足場ベクター（ＰｖｕＩＩおよびＢｃＩＩで消化）ＶＫｐＢＲ２へ強制的にクローニングしたところ、同じＩｇプロモーター、シグナルペプチド配列およびOrlandi et al., 1989およびLeung et al., 1994により用いられているようなＶＫ ＰＣＲ産物のフレーム内連結を容易にするのに便宜な制限部位を含んでいた。
LL1VK-PvuII 5'-GAT GTT CAG CTG ACC CAA ACT CCA CTC TCC-3'
同様に、ＬＬ１ＶＨの１０〜１５および３４５〜３５１番のヌクレオチド配列を、プライマーＬＬ１Ｂ−１およびＬＬ１Ｆ−１を用いたＰＣＲによりそれぞれＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩへと変換した。次に、ＶＨ ＰＣＲ産物をＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化したＶＨｐＢＳ２［ＶＨｐＢＳ(Leung, S.O., Shevitz, J., Pellegrini, M.C., Dion, A.S., Shih, L.B., Goldenberg, D.M.およびHansen, H.J. (1994))から改変したもので、シグナルペプチド配列と、ＶＨ ＰＣＲ産物のフレーム内連結を容易するのに便宜な制限部位を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく足場ベクター{Orlandi, Gussow, et al. 1989 741/同上}］に連結した。
LL1B-1 5'-CAG ATC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG-3'
LL1F-1 5'-GA GAC GGT GAC CAG AGT CCC TTG GCC CCA A-3'
ｃＬＬ１ＶＨおよびＶｋの両配列をＤＮＡシーケンシングにより確認し、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示している。
シグナルペプチド配列とともにｃＬＬ１のＶｋ配列を含むフラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩでの二重消化によりＬＬ１ＶＫｐＢＲ２から切り出した。次に、〜５５０ｂｐのＶｋフラグメントを哺乳類発現ベクターｐｄＨＬ２のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位へサブクローニングした。得られたベクターをｃＬＬ１ＶｋｐｄＨＬ２と名づけた。同様に、シグナルペプチド配列とともにＬＬ１ＶＨを含む約７５０ｂｐのフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ消化によりＬＬ１ＶＨｐＢＳ２から切り出し、アガロースゲルにて電気泳動により単離した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの双方の末端に相応するリンカーを用いてｃＬＬ１ＶｋｐｄＨＬ２のＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位へサブクローニングし、ｃＬＬ１ｐｄＨＬ２と呼ばれる最終の発現ベクターを得た。
実施例３ ｃＬＬ１のトランスフェクションおよび発現
約３０μｇのｃＬＬ１ｐｄＨＬ２をＳａｌで消化することにより線状化し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０−Ａｇｌ４細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を９６ウェルプレートで２日間平板培養した後、ＭＴＸ耐性に関して選択した。選択に生き残ったコロニーの上清をＥＬＩＳＡアッセイによりキメラ抗体分泌に関してモニタリングした。陽性細胞クローンを拡張し、細胞培養上清から、Ａタンパク質カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによりｃＬＬ１を精製した。
実施例４ 結合活性アッセイ
親ｍＬＬ１と比較してｃＬＬ１の免疫反応性を評価するため、競合細胞結合アッセイを行った。一定量の１２５Ｉ標識ｍＬＬ１（１００，０００ｃｐｍ）を４℃で１〜２時間、種々の濃度のｃＬＬ１またはｍＬＬ１の存在下でＲａｊｉ細胞とともにインキュベートした。洗浄後、細胞と結びついた放射活性を測定した。図５に示されているように、ｃＬＬ２抗体はｍＬＬ１に匹敵する結合活性を示し、クローニングされたＶ遺伝子の忠実性が確認された。
これらの結果をフローサイトメトリーに基づく第二の競合アッセイにより確認した。要するに、上記のようにＲａｊｉ細胞を用い、上記のように一方の抗体の濃度を他方に対して変化させ、結合したｃＬＬ１またはｍＬＬ１の量を、ＦＩＴＣ標識抗マウスＦｃまたは抗ヒトＦｃ抗体を用いて測定した後、フローサイトメトリーを用いて分析した。
親ｍＬＬ１と比較したｃＬＬ１の免疫反応性を評価するため、Ｒａｊｉ細胞膜をコーティングしたプレートでＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを行った。Ｒａｊｉ細胞膜画分は音波処理と遠心分離により調製した。粗膜抽出物を遠心分離により９６ウェル平底ＰＶＣプレートにコーティングし、０．１％グルタルアルデヒドで固定した。種々の濃度のｍＬＬ１またはｃＬＬ１と混合した一定量のビオチニル化ｍＬＬ１をこの膜コートウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。膜結合ビオチニル化ｍＬＬ１に結合したＨＲＰ結合ストレプトアビジンの量は、４ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸塩および０．０４％Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を加えた後、Ａ４９０ｎｍを読みとることによって明らかにした。図６の競合アッセイによって示されるように、ｈＲＳ７ ＩｇＧはｍＲＳ７およびｃＲＳ７のものに匹敵する結合活性を示し、ＲＳ７の結合親和性はヒト化しても保存されていることが確認された。
実施例５ ＬＬ１モノクローナル抗体のヒト化のためのヒトフレームワークおよび配列デザインの選択
ＫａｂａｔデータベースにてｃＬＬ１の可変（Ｖ）領域フレームワーク（ＦＲ）配列とヒト抗体のそれを比較することにより、ｃＬＬ１ＶＨおよびＶｋのＦＲがそれぞれヒト抗体ＲＦ−ＴＳ３ ＶＨおよびＨＦ−２１／２８ Ｖｋのそれと最も高い程度の配列ホモロジーを示すことが分かった。これらのアミノ酸配列は図３Ａおよび３Ｂに示されており、ｃＬＬ１ＶＨおよびＶｋ配列と比較させてある。よって、ＲＦ−ＴＳ３ ＶＨおよびＨＦ−２１／２８ ＶｋのＦＲおよびＦＲは、それぞれＬＬ１ ＶＨおよびＶｋのＣＤＲがグラフトされるヒトフレームワークとして選択された。しかし、ＲＦ−ＴＳ３のＦＲ配列ではなくＮＥＷＭのＦＲ配列を用いて、ＬＬ１Ｈ鎖のヒト化のためにＲＦ−ＴＳ３ ＦＲ４配列を置換した。図３Ａを参照されたい。ｈＬＬ１では、これまでに記載されている指針(Qu et al., Clin. Cancer Rec. 5:3095s-3100s (1990))に基づき、推定ＣＤＲに近接するＬＬ１ ＦＲの数個のアミノ酸残基を維持した。これらの残基はＶｋのＬ４６、Ｆ８７およびＱ１００（図３Ｂ）、ならびにＶＨのＩ３６、Ｋ３７、Ｑ４６、Ａ６８、Ｆ９１およびＳ９３（図３Ａ）である。図３Ａおよび３Ｂはヒト、キメラおよびヒト化ＶＨおよびＶｋアミノ酸配列を比較したものである。点線はヒトＶＨおよびＶｋ配列における対応する残基と同一であるｃＬＬ１およびｈＬＬ１の残基を示す。ｈＬＬ１ＶＨおよびＶｋのＤＮＡおよびアミノ酸配列はそれじれ図４Ａおよび４Ｂに示されている。
実施例６ ヒトＶ遺伝子のＰＣＲ／遺伝子合成
Leung et al. (Leung et al., 1994)が記載しているような改変戦略を用い、図５で示されているように、長いオリゴヌクレオチド合成とＰＣＲの組み合わせを用い、ｈＬＬ１のデザインされたＶｋおよびＶＨ遺伝子を構築した。ｈＬＬ１ＶＨドメインを構築する場合には、自動ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystem)で二つの長いオリゴヌクレオチドｈＬＬ１ＶＨＡ（１７６マー）およびｈＬＬ１ＶＨＢ（１６５マー）を合成した。ｈＬＬ１ＶＨＡ配列はｈＬＬ１ＶＨドメインのｎｔ２０〜１９５に相当する。
Figure 0004472351
 ｈＬＬ１ＶＨＢ配列はｎｔ１７３〜３３７に相補的なｈＬＬ１ＶＨドメインの負鎖に相当する。
Figure 0004472351
 ｈＬＬ１ＶＨＡおよびＢの３’末端配列（２２ｎｔ残基）は互いに相補的である。規定のＰＣＲ条件下では、ｈＬＬ１ＶＨＡおよびＢの３’末端はアニーリングして、長いオリゴヌクレオチドの残りの部分によりフランキングされる短い二本鎖ＤＮＡを形成する。各アニール末端は一本鎖ＤＮＡの転写のためのプライマーとして働き、その結果、ｈＬＬ１ＶＨのｎｔ２０〜３３７からなる二本鎖ＤＮＡが生じる。このＤＮＡを、二つの短いオリゴヌクレオチドｈＬＬ１ＶＨＢＡＣＫおよびｈＬＬ１ＶＨＦＯＲの存在下でさらに増幅し、全長ｈＬＬ１ＶＨを形成させた。
hLL1VHBACK 5'-GTG GTG CTG CAG CAA TCT GGG TCT GAG TTC AAG AAG CC-3'
HLL1VHFOR 5'-AAG TGG ATC CTA TAA TCA TTC CTA GGA TTA ATG-3'
最少量のｈＬＬ１ＶＨＡおよびＢ（実験的に決定）を１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣＬバッファー、ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｍｏｌのＬＬ１ＶＨＢＡＣＫおよびｈＬＬ１ＶＨＦＯＲ、ならびに２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct)の存在下で増幅した。この反応混合物に対して、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の重合からなる３サイクルのＰＣＲ反応、その後、９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の重合からなる２７サイクルのＰＣＲ反応を行った。ｈＬＬ１ＶＨの二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで制限消化し、Ｈ鎖足場ベクターＶＨｐＢＳ２の相補的ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位へクローニングした。
ヒト化Ｖｋ配列の全長ＤＮＡの構築に関しては、ｈＬＬ１ＶＫＡ（１５９マー）およびｈＬＬ１ＶＫＢ（１６９マー）を上記のように合成した。ｈＬＬ１ＶＫＡおよびＢは上記のように二種の短いオリゴヌクレオチドｈＬＬ１ＶＫＢＡＣＫおよびｈＬＬ１ＶＫＦＯＲによって増幅した。
ｈＬＬ１ＶＨＡ配列はｈＬＬ１ＶＨドメインのｎｔ１６〜１７４に相当する。
Figure 0004472351
 ｈＬＬ１ＶＨＢ配列はｎｔ１５３〜３２１に相補的なｈＬＬ１ＶＨドメインの負鎖に相当する。
Figure 0004472351
 hLL1VKBACK 5'-GAT GTT CAG CTG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG-3'
hLL1VKFOR 5'-G TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC AGC ACC GAA CG-3'
ｈＬＬ１Ｖｋのゲル精製したＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩＩで制限消化し、Ｌ鎖足場ベクターＶＫｐＢＲ２の相補的ＰｖｕＩ／ＢｃＩＩ部位へクローニングした。最終の発現ベクターｈＬＬ１ｐｄＨＬ２は、上記のように、それぞれｈＬＬ１ＶｋおよびＶＨのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐｄＨＬ２へ順次サブクローニングすることにより構築した。
実施例７ ｈＬＬ１のトランスフェクション、発現および結合活性アッセイ
ｈＬＬ１の発現および結合アッセイの方法はｃＬＬ１に関して記載したものと同じである。
ｈＬＬ１の免疫反応性を評価するため、Ｒａｊｉ細胞膜抽出物をコーティングしたプレートを用いるＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを開発した。Ｒａｊｉ細胞膜画分を音波処理と遠心分離により調製した。粗膜抽出物を遠心分離により９６ウェル平底ＰＶＣプレートにコーティングし、０．１％グルタルアルデヒドで固定した。種々の濃度のｍＬＬ１またはｃＬＬ１と混合した一定量のビオチニル化ｍＬＬ１をこの膜コートウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした。膜結合ビオチニル化ｍＬＬ１に結合したＨＲＰ結合ストレプトアビジンの量は、４ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸塩および０．０４％Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を加えた後、Ａ４９０ｎｍを読みとることによって明らかにした。図６の競合アッセイによって示されるように、ｍＬＬ１およびｃＬＬ１抗体は同等の結合活性を示した。同様に、図７の競合アッセイでは、ｈＬＬ１およびｃＬＬ１抗体は同等の結合活性を示した。
実施例８ ｈＬＬ１のインターナリゼーション
標準的な抗体プロセシングアッセイを用いて、Ｒａｊｉ細胞のインターナリゼーションおよび異化作用を評価した(Hansen et al., 1996)。細胞（１０７）を、１２５Ｉ標識ｈＬＬ１またはＬＬ１（１０７ｃｐｍ）を含む組織培養培地１ｍＬ中で、３７℃にて１時間インキュベートした。Ａｂ結合の特異性を評価するため、過剰量（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）の非標識Ａｂを含む、また含まない総ての実験で１／１０サンプルサイズ（細胞、放射活性および培地）の対照を設けた。結合インキュベーションの後、結合しなかった放射活性を洗浄により除去した。特異性対照を計数した。総ての実験で、細胞に対する放射活性の結合は非標識Ａｂのよって少なくとも９０％ブロックされた。次にこれらの細胞を３０ｍｌの新鮮培地に再懸濁させ、２４ウェルプレートに１．５ｍＬ／ウェルで分注した。サンプル１．５ｍＬを放射活性の測定のために用い、これを最初の結合ｃｐｍとした。プレートをＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。３、２４、４８および７２時間の時点で、細胞を次のように回収した。細胞を繰り返しピペットで吸い取って懸濁させ、コニカル試験管へ移した。ウェルおよびピペットを１ｍＬの新鮮培地ですすぎ、最初の細胞懸濁液回収物に加えた。この試験管を６００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清１ｍＬを注意深く採取し（全上清の４０％）、放射活性を計数した。担体タンパク質としてＢＳＡを最終濃度１％まで加え、このタンパク質を冷１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）５ｍｌで沈降させた。４℃で３０分間インキュベートし、５０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、上清を廃棄し、沈降したタンパク質の放射活性を計数した。ＴＣＡにより沈降しなかった放射性標識タンパク質は分解していたものとし、沈降した放射性タンパク質は完全であるとみなした。この細胞ペレットについて、洗浄した後、細胞に残留している放射活性を計数した。各画分の放射活性を最初に結合していたものに対する割合（％）として表した。図８Ａに示されているように、ｈＬＬ１は、Ｒａｊｉ細胞の表面に結合した後のマウスＬＬ１と同様の迅速なインターナリゼーションと異化作用を示し、すなわち、結合していた放射活性はほとんど総て３時間内に異化作用を受け、上清中に放出された。これは抗ＣＤ２２や抗ＣＤ１９などの他のインターナライジングＡｂの場合よりもはるかに速い(Hansen et al., 1996)。これらの試験の最初の時点では、ｈＬＬ１およびｍＬＬ１は同じプロセシングパターンが確認された。１時間内に最大異化作用に達した（図８Ｂ）。
実施例９ ｈＬＬ１の細胞傷害性
ｈＬＬ１の細胞傷害性をヒトリンパ腫細胞系統のＲａｊｉ細胞にて、ｍＬＬ１およびｃＬＬ１のものと比較した。ｈＬＬ１およびｃＬＬ１の架橋剤としてヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメント特異的Ａｂ（α−ｈＦｃ）を用い、ｍＬＬ１についてはヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的Ａｂ（α−ｍＦｃ）を用いた。０日目、５μｇ／ｍＬのＬＬ１ Ａｂおよび５０μｇ／ｍｌの適当な架橋剤を含む１ｍＬの培地に５×１０５のＲａｊｉ細胞を播種した。全細胞および生存細胞の数を３日間毎日計数した。図９に示されているように、通常のＲａｊｉ細胞の総数は３日間で４〜５倍増え、３日目の終わりには細胞生存率が８０％を超えるまでに留まっていた。架橋剤単独、ＬＬ１ Ａｂ単独、またはＬＬ１ Ａｂと同等でない架橋剤（例えば、ｈＬＬ１およびヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的Ａｂ）で処理した細胞は通常のＲａｊｉ細胞とは区別できなかった。しかし、ｈＬＬ１と抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的Ａｂの組み合わせは効果的に細胞死をもたらし、一日のうちに細胞生存率に４０％を超える減少と、３日目にほとんど全細胞の死滅をもたらした。ｈＬＬ１の有効性はｍＬＬ１およびｃＬＬ１に匹敵するものであった。Ｄａｕｄｉ細胞を用いた場合にも同様の結果が認められた（図１０）。別のインターナライジングＡｂ、ｈＬＬ２（ヒト化抗ＣＤ２２ Ａｂ）ではこのような結果は見られなかった。これらの結果から、リンパ腫細胞系統に対するｈＬＬ１の細胞傷害作用は細胞表面上のＡｂの架橋に特異的に依存することが証明された。
マウスＬＬ１Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１ＡはＲＴ−ＰＣＲにより得られたＬＬ１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１Ｂは５’−ＲＡＣＥにより得られたＬＬ１ＶｋのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に一文字コードで示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。ＫａｂａｔのＩｇ分子のナンバリングはアミノ酸残基の上にあるナンバリングで示されるようなアミノ酸残基に対して用いられる。特定のディジット（digit）の後は一文字でナンバリングされるアミノ酸残基はＫａｂａｔナンバリング法で定義された挿入残基を示す。一文字でナンバリングされた挿入残基はその前の残基と同じディジットを持つ。例えば、図１Ａの残基８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃは８２Ａ、ＢおよびＣとして示される。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたキメラＬＬ１（ｃＬＬ１）Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図２ＡはｃＬＬ１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図２ＢはｃＬＬ１Ｖｋの二本鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。ヌクレオチドおよびアミノ酸のナンバリングは図１の場合と同じである。ｃＬＬ１の構築に用いる制限部位は囲み線をつけ、表記している。 ヒト抗体ｃＬＬ１およびｈＬＬ１のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図３Ａはヒト抗体ＲＦ−ＴＳ３、ｃＬＬ１およびｈＬＬ１のＶＨアミノ酸配列のアライメントを示し、図３Ｂはヒト抗体ＨＦ−２１／２８、ｃＬＬ１およびｈＬＬ１のＶｋアミノ酸配列のアライメントを示す。点線はｃＬＬ１において、ヒト抗体で対応する残基と同一の残基を示す。囲み線の領域はＣＤＲ領域を表す。ｃＬＬ１のＮ末端残基もＣ末端残基も（下線）、使用する足場ベクターにより固定され、ヒト抗体とは比較されない。図１同様、ＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化ＬＬ１（ｈＬＬ１）Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図４ＡはｈＬＬ１ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、図４ＢはｈＬＬ１ＶｋのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。ヌクレオチドおよびアミノ酸のナンバリングは図１の場合と同じである。図１Ａおよび図１Ｂ同様、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 ｈＬＬ１ＶＨ遺伝子の構築の模式図を示す。鋳型およびプライマーとして用いるオリゴは矢印線で示されている。矢印の頭は３’末端を示す。センスＤＮＡ鎖（鋳型、プライマーおよびＰＣＲ産物）は実線で、アンチセンス鎖は点線で示されている。Ｖｋ遺伝子も同様に構築した。 競合的細胞表面結合アッセイの結果を、ｃＬＬ１とマウスＬＬ１との結合アッセイと比較して示す。種々の濃度のｃＬＬ１（黒三角）またはｍＬＬ１（黒ひし形）を一定量の１２５Ｉ標識ｍＬＬ１と混合し、Ｒａｊｉ細胞とともに４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞表面に結合した放射性標識ｍＬＬ１をカウントした。ｃＬＬ１とマウスＬＬ１はＲａｊｉ細胞に対する放射性標識ＬＬ１の結合に関して同等によく競合したが、このことからクローニングされたＶ遺伝子が忠実であることが確認される。 Ｒａｊｉ細胞膜をコートしたマイクロウェルにおける競合結合アッセイの結果を、ｈＬＬ１とｃＬＬ１との結合親和性を比較して示す。種々の濃度のｈＬＬ１（黒三角）またはｃＬＬ１（黒ひし形）を一定量のＨＲＰ結合ＬＬ１と混合し、Ｒａｊｉ細胞膜抽出物でコートした９６ウェルマイクロタイタープレートにて室温で１時間インキュベートした。膜に結合したＨＲＰ−ＬＬ１を測定した。ｈＬＬ１おｃＬＬ１はＨＲＰ−ＬＬ１の結合に関して同等によく競合したが、このことはヒト化ＬＬ１ではｍＡｂ ＬＬ１の結合特異性および親和性が保存されていることを示唆している。 Ｒａｊｉ細胞の表面に結合した１２５Ｉ標識ｈＬＬ１およびｍＬＬ１の運命を示す。放射性標識ｈＬＬ１（記号付きの実線）またはｍＬＬ１（記号付きの点線）をＲａｊｉ細胞とともにインキュベートし、結合しなかったＡｂを洗浄により除去した。次に、これらの細胞を対照として培養し、細胞と結合した放射性標識Ａｂ（黒ひし形の線）、培地中に分泌された放射性標識Ａｂ（黒三角の線）または分解された（黒丸の線）を示された時間に測定した。図８Ａは３日までにたどった結合Ａｂの運命を示す。図８Ｂは初期の時点（３日以内）で調べたｈＬＬ１プロセシングの結果を示す。データは２回の実験の平均とした。 Ｒａｊｉ細胞の架橋ＬＬＩＡｂの細胞傷害作用を示す。０日目、５×１０５のＲａｊｉ細胞を、パネルの上に示されているように５μｇ／ｍｌのｍＬＬ１、ｃＬＬ１またはｈＬＬＩを含有する、またはＡｂを含まない（Ｎｉｌ）、そしてパネルの右側に示されているように５０μｇ／ｍｌのα−ｍＦｃまたはα−ｈＦｃ Ａｂを含む、または架橋剤を含まない（Ｎｉｌ）、培地１ｍｌに播種した。全細胞および生存細胞の数をを３日間毎日計数した。生存細胞のパーセンテージ（黒四角）および０時における生存細胞に対する生存細胞の比率（黒ひし形）を算出し、培養時間に対してプロットした。 Ｄａｕｄｉ細胞に対する架橋ｈＬＬ１の細胞傷害作用を示す。０日目、５×１０５のＤａｕｄｉ細胞を、パネルの上に示されているように５μｇ／ｍｌのｈＬＬ１またはｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、インターナライジングＡｂ）、またはＡｂを含まない（Ｎｉｌ）、そしてパネルの右側に示されているように５０μｇ／ｍｌのα−ｈＦｃ Ａｂを含有する、または含まない（Ｎｉｌ）、培地１ｍｌに播種した。全細胞および生存細胞の数をを３日間毎日計数した。生存細胞のパーセンテージ（黒四角）および０時における生存細胞に対する生存細胞の比率（黒ひし形）を算出し、培養時間に対してプロットした。

Claims (36)

  1. ＣＤ７４と、マウス抗ＣＤ７４抗体ＬＬ１との結合をブロックする、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体、またはそのＣＤ７４抗原結合フラグメントであって、
    前記マウス抗ＣＤ７４抗体が、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ（ＣＤＲ１）、ＴＶＳＮＲＦＳ（ＣＤＲ２）およびＳＱＳＳＨＶＰＰＴ（ＣＤＲ３）を含んでなり、かつＨ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＮＹＧＶＮ（ＣＤＲ１）、ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ（ＣＤＲ２）およびＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ（ＣＤＲ３）を含んでなり、
    前記ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはそのＣＤ７４抗原結合フラグメントが、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ（ＣＤＲ１）、ＴＶＳＮＲＦＳ（ＣＤＲ２）およびＳＱＳＳＨＶＰＰＴ（ＣＤＲ３）を含んでなり、かつＨ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＮＹＧＶＮ（ＣＤＲ１）、ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ（ＣＤＲ２）およびＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ（ＣＤＲ３）を含んでなる、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  2. 非結合抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 少なくとも一つの診断薬または治療薬と結合している、請求項１に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗ＣＤ７４抗体またはＣＤ７４抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体であって、マウス抗ＣＤ７４抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体のフレームワーク（ＦＲ）とを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 前記ヒト化抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のＦＲが、これに対応する前記マウス抗体のＦＲから置換した少なくとも一つのアミノ酸を含んでなる、請求項４に記載のヒト化抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 前記マウス抗体由来のアミノ酸がｃＬＬ１Ｖｋ配列のマウスＬ鎖可変領域のアミノ酸残基２、３、４、４６、８７および１００、ならびにｃＬＬ１ＶＨ配列のマウスＨ鎖可変領域のアミノ酸残基５、３７、３８、４６、６８、９１および９３からなる群から選択され、
    ｃＬＬ１Ｖｋ配列が、アミノ酸配列：
    Figure 0004472351
     で表されるものであり、
    ｃＬＬ１ＶＨ配列が、アミノ酸配列：
    Figure 0004472351
     で表されるものである、請求項５に記載のヒト化抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を含んでなる、請求項４に記載のヒト化抗ＣＤ７４ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント。
  8. ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域またはその一部をさらに含んでなる、請求項４に記載のヒト化抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. ヒト化ＩｇＧ１である、請求項４に記載のヒト化抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. キメラ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. ヒトの定常領域の配列に結合した、マウスＬＬ１抗体の可変領域の配列を含んでなる、請求項１０に記載のキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. 少なくとも一つの診断薬または治療薬と結合している、請求項１０に記載のキメラ抗ＣＤ７４ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント。
  13. Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を含んでなる、請求項１２に記載のキメラ抗ＣＤ７４ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント。
  14. キメラＩｇＧ１である、請求項１２に記載のキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  15. 以下の少なくとも一つの特性を示す、請求項１に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント：
    （ａ）ＣＤ７４に対する前記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、ＣＤ７４に特異的な抗体またはそのフラグメントによってブロッキングされること、
    （ｂ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｒａｊｉリンパ腫培養細胞によってインターナライズされること、および
    （ｃ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウスＩｇＧ１ 抗体のＦｃと反応性を有するヤギ抗血清と架橋させた場合、Ｒａｊｉ培養細胞のアポトーシスを誘導すること。
  16. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖであるか、またはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖもしくはＦｖを含んでなる融合構築物である、請求項１に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  17. 前記融合構築物が、融合タンパク質であり、かつ多価であるかまたは多価かつ多重特異性である、請求項１６に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  18. ヒトＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒト定常領域で置換された、ＩｇＧ１の定常領域を含んでなる、請求項１に記載のヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  19. マウス抗ＣＤ７４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合フラグメントであって、（ａ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ（ＣＤＲ１）、ＴＶＳＮＲＦＳ（ＣＤＲ２）およびＳＱＳＳＨＶＰＰＴ（ＣＤＲ３）を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ｍＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲ、（ｂ）ＮＹＧＶＮ（ＣＤＲ１）、ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ（ＣＤＲ２）およびＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ（ＣＤＲ３）を含んでなるマウス抗ＣＤ７４ｍＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲ、および（ｃ）マウス抗ＣＤ７４抗体のフレームワーク（ＦＲ）領域を含んでなる、マウス抗ＣＤ７４ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント。
  20. 請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの４以上のＦｖまたはＦａｂを含んでなる、抗体融合タンパク質。
  21. 前記治療薬が、ドキソルビシンである、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  22. 前記治療薬が、ＲＮアーゼである、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  23. 前記治療薬が、放射性核種である、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  24. 前記治療薬が、免疫調節剤である、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  25. 前記治療薬が、インターフェロンである、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  26. 前記治療薬が、毒素である、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  27. 前記治療薬が、薬物である、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  28. 前記治療薬が、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピトフィロトキシン、タキサン、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体およびホルモンからなる群から選択される薬物である、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  29. 前記治療薬が、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ Ｉ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択される毒物である、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  30. 前記治療薬が、サイトカインである、請求項３に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  31. キメラである、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  32. ヒト化されている、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント。
  33. 患者におけるＣＤ７４陽性癌の治療用組成物であって、
    少なくとも一つのヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント、または、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる融合タンパク質を含んでなり、ここで、
    前記ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ（ＣＤＲ１）、ＴＶＳＮＲＦＳ（ＣＤＲ２）およびＳＱＳＳＨＶＰＰＴ（ＣＤＲ３）を含んでなり、かつＨ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＮＹＧＶＮ（ＣＤＲ１）、ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ（ＣＤＲ２）およびＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ（ＣＤＲ３）を含んでなる、治療用組成物。
  34. 非結合抗ＣＤ７４抗体を含んでなる、請求項３３に記載の治療用組成物。
  35. 前記非結合抗ＣＤ７４抗体が、ヒト化抗ＣＤ７４抗体である、請求項３４に記載の治療用組成物。
  36. Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ（ＣＤＲ１）、ＴＶＳＮＲＦＳ（ＣＤＲ２）およびＳＱＳＳＨＶＰＰＴ（ＣＤＲ３）を含んでなり、かつＨ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、ＮＹＧＶＮ（ＣＤＲ１）、ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ（ＣＤＲ２）およびＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ（ＣＤＲ３）を含んでなり、以下の少なくとも一つの特性を示す、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合フラグメント：
    （ａ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｒａｊｉリンパ腫培養細胞によってインターナライズされること、および
    （ｂ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウスＩｇＧ１ 抗体のＦｃと反応性を有するヤギ抗血清と架橋させた場合、Ｒａｊｉ培養細胞のアポトーシスを誘導すること。
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