ES2350477T5 - Internalización de anticuerpos anti-CD74 y métodos de uso - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Internalización de anticuerpos anti-CD74 y métodos de uso
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD74, murinos, humanizados, quiméricos y humanos, o sus fragmentos o sus proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden al menos uno de tales anticuerpos anti-CD74, en particular anticuerpos monoclonales (mAbs), conjugados terapéuticos y de diagnóstico de tales mAbs anti-CD74 o sus fragmentos, y su uso en métodos de tratamiento y de diagnóstico de linfomas y leucemias de células B, otras enfermedades malignas distintas de linfomas y leucemias en las que las células son positivas para el antígeno CD74 y diversos sistemas autoinmunitarios, La presente invención se refiere a mAbs anti-CD74 polivalentes y multiespecíficos o sus fragmentos que comprenden al menos un brazo de tal mAb anti-CD74 o su fragmento y al menos un brazo del mAb multiespecífico para una sustancia nociva, tal como un organismo patógeno, tal como una célula cancerosa, un parásito o un agente infeccioso. La presente invención se refiere, además, a tales mAbs anti-CD74 o sus fragmentos, conjugados a un péptido antigénico. Tales mAbs anti-CD74, sus fragmentos y sus conjugados, pueden ser administrados aislados o como parte de un régimen terapéutico multimodal. La presente invención se refiere a secuencias de DNA que codifican tales anticuerpos anti-CD74 y mAbs anti-CD74 polivalentes y/o multiespecíficos y sus fragmentos, y sus conjugados terapéuticos, de diagnóstico y antigénicos, vectores y células huésped que contiene las secuencias de DNA, métodos de expresión de tales anticuerpos anti-CD74, tales inmunoconjugados, proteínas de fusión de anticuerpos o sus fragmentos, una vacuna y un anticuerpo biespecífico y multiespecífico.
2. Fundamento
Uno de los principales objetivos de la inmunoterapia es utilizar el sistema inmunitario de un paciente contra células tumorales u organismos infecciosos. Con respecto a la terapia del cáncer, el objeto es dirigir el sistema inmunitario de un paciente contra las células tumorales. El linfoma no-Hodgkins (NHL), el mieloma múltiple y la leucemia linfocítica crónica y aguda, son enfermedades malignas de las células B que permanecen como contribuyentes importantes a la mortandad por cáncer. La respuesta de estas enfermedades malignas a diversas formas de tratamiento es mixta.
La inducción de la respuesta a linfocitos T es una etapa inicial, crítica, en la respuesta inmunitaria del hospedador. La activación de las células T da por resultado la proliferación de las células T, la producción de citoquinas por las células T y la generación de funciones efectoras mediadas por las células T. La activación de las células T requiere una señal específica de un antígeno, denominada frecuentemente una señal primaria de activación, que resulta de la estimulación de un receptor de células T (TcR) distribuido clonalmente, presente sobre la superficie de la célula T. Esta señal específica de antígeno está, habitualmente, en la forma de un péptido antigénico unido o bien a una proteína de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) o bien a una proteína de clase II del MHC presente sobre la superficie de una célula que presenta antígenos (APC). Las moléculas de MHC en los seres humanos son designadas como moléculas HLA (antígeno de leucocitos humanos).
Las moléculas de clase II se encuentran en un número limitado de tipos de células, principalmente células B, monocitos/macrófagos y células dendríticas, y, en la mayoría de los casos, presentan péptidos derivados de proteínas recogidas desde el medio ambiente extracelular. Las clases II de MHC están cargadas en compartimentos celulares que se comunican con el medio ambiente extracelular. En los seres humanos las moléculas MHC-II comprenden las moléculas HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP, que ocurren en diversos alelos codificados genéticamente. Así, por ejemplo, pueden recogerse antígenos bacterianos procedentes del medio ambiente extracelular y ser presentados después de procesamiento intracelular en las células que presentan antígenos sobre sus superficies celulares. Las células CD4+T reconocen péptidos asociados con las moléculas de clase II.
El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos, conjugados a radioisótopos u otros agentes citotóxicos, ofrece la posibilidad de distribuir directamente tales agentes hacia el sitio del tumor, limitando con ello la exposición de los tejidos normales a los agentes tóxicos (Goldenberg, Semin. Nucl. Med. 19:332 (1989)). En los últimos años, el potencial de la terapia a base de anticuerpos y su exactitud para la localización de antígenos asociados a tumores, se han demostrado tanto en el laboratorio como en estudios clínicos (véase, por ejemplo, Thorpe, TIBTECH, 11:42 (1993); Goldenberg, Scientific American, Science and Medicine, 1:64 (1994); Baldwin et al. documentos U.S.
4.925.922 y 4.916.213; Young, U.S. 4918163; U.S. 5.204.095; Irie et al., U.S. 5.196.337; Hellstrom et al., U.S.
5.134.075 y 5.171.665). En general, el uso de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos radiomarcados contra marcadores asociados a tumores, para localizar tumores, ha tenido más éxito que para el tratamiento terapéutico debido, en parte, a que la absorción del anticuerpo por el tumor es generalmente baja, variando desde solamente el 0,01% al 0,001% de la dosis total inyectada (Vaughan et al., Brit. J. Radiol., 60:567 (1987)). Al aumentar la concentración del radiomarcador para aumentar la dosis para el tumor es contraproducente, en general, ya que esto hace aumentar también la exposición a la radiactividad del tejido sano.
El LL1 murino (mLL1 o anticuerpo anti-CD74 murino) es un anticuerpo monoclonal (mAb) específico, reactivo con CD74, el antígeno semejante a la Clase II de HLA, es decir, la cadena invariable (determinante li) sobre la superficie de linfocitos B, monocitos e histiocitos, líneas celulares de linfoma B humano, melanomas, linfomas de células T y una diversidad de otros tipos de células tumorales (Hansen et al., Biochem. J. 320:293 (1996)). El LL1 unido a la superficie celular es internalizado rápidamente hacia el compartimento lisosomal y catabolizado con rapidez, con mucha mayor rapidez que otros mAbs tales como anti-CD19 y anti-CD22. Id. Esta propiedad intrínseca del LL1 supera algunas de las dificultades entes citadas encontradas con la inmunoterapia.
El LL1 murino fue desarrollado por fusión de células de mieloma del ratón con esplenocitos procedentes de ratones BALB/c inmunizados con preparaciones obtenidas partiendo de la línea celular de linfoma B, de Raji (denominada EPB-1 en la publicación de Pawlak-Byczkowska et al., Can. Res., 49:4568 (1989)). El uso clínico de mLL1, al igual que la mayor parte de otros anticuerpos murinos prometedores, ha estado limitado por el desarrollo en los seres humanos de una respuesta de un anticuerpo humano anti-ratón (HAMA) Una respuesta del anticuerpo HAMA no ha sido observada directamente después de la inyección de Fab' de mLL1, como se ha evidenciado en un estudio de formación de imágenes de médula ósea usando un Fab' de mLL1 marcado con 99mTc. Juweld et al., Nuc. Med. Comm. 18: 142-148 (1997). Sin embargo, en algunos usos terapéuticos y de diagnóstico, puede preferirse un mAb anti-CD74 completo. Este uso del mAb anti-CD74 completo, puede limitar la utilidad terapéutica y de diagnóstico de tales anticuerpos y conjugados de anticuerpos, no solo debido a un problema anafiláctico potencial sino también porque una parte importante del conjugado en circulación puede formar un complejo con los anticuerpos anti-ratón que circulan y ser secuestrado por ellos. Aun cuando el uso de fragmentos de anticuerpos de mLL1 puede evitar los problemas de inmunogenicidad, existen circunstancias en la que es más deseable la IgG total y la inducción de inmunidad celular está destinada a la terapia o a intensificar el tiempo de supervivencia del anticuerpo. En general, las respuestas a HAMA imponen un obstáculo potencial a la realización del potencial completo terapéutico y de diagnóstico de los mAbs anti-CD74 murinos. Por consiguiente, sería sumamente útil para el tratamiento terapéutico y de diagnóstico el desarrollo de mAbs anti-CD74, quiméricos, humanizados y humanos y sus fragmentos, proteínas de fusión de anticuerpos de los mismos y sus fragmentos, inmunoconjugados para tratamiento terapéutico y de diagnóstico, mAbs polivalentes y/o multiespecíficos y sus fragmentos, y conjugados de vacunas de los mismos, con producción reducida de anticuerpos humanos anti-ratón.
Sumario de la invención
El problema esencial expuesto en la presente invención, es resuelto mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes. Realizaciones preferidas pueden ser tomadas desde las reivindicaciones dependientes.
La presente invención está dirigida a anticuerpos anti-CD74 y sus fragmentos en los que el anticuerpo anti-CD74, humanizado, humano quimérico o murino o su fragmento comprende CDRs de una región variable de las cadenas ligeras de un mAb anti-CD74 murino o humano, que comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT; y comprende CDRs de una región variable de las cadenas pesadas de un mAb anti-CD74 murino o humano, que comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINp Nt GEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY y sus proteínas de fusión de anticuerpos, que puede ser internalizado rápidamente en una célula.
La presente invención está dirigida, además, a proteínas de fusión de anticuerpos anti-CD74 que contienen tales anticuerpos o sus fragmentos, que están fusionados unos a otros y/o a otros anticuerpos y sus fragmentos, de la presente invención.
La presente invención está dirigida, adicionalmente, a inmunoconjugados que contienen los anticuerpos anti-CD74 o sus fragmentos o las proteínas de fusión de anticuerpos o sus fragmentos, de la presente invención, ligados a un agente de diagnóstico o terapéutico.
La presente invención está dirigida también a una vacuna que comprende un conjugado de anticuerpos que contiene los anticuerpos anti-CD74 o sus fragmentos, o las proteínas de fusión de anticuerpos o sus fragmentos, de la presente invención, ligados a péptidos antigénicos.
La presente invención está dirigida, además, a un anticuerpo biespecífico o multiespecífico que comprende un conjugado de anticuerpos que contiene los anticuerpos anti-CD74 o sus fragmentos, o las proteínas de fusión de anticuerpos o sus fragmentos, de la presente invención, ligados a un anticuerpo o a un fragmento de anticuerpo específico de una sustancia marcadora de cáncer, un epítopo sobre la superficie de un organismo de una enfermedad infecciosa o una sustancia nociva existente en la sangre u otro fluido corporal.
La presente invención está dirigida, adicionalmente, a los anticuerpos y sus fragmentos, la proteína de fusión de anticuerpos y el inmunoconjugado, cada uno de la presente invención, para usar en métodos de tratamiento y de diagnóstico de enfermedades.
La presente invención está dirigida también a secuencias de DNA que codifican los anticuerpos anti-CD74 o sus fragmentos, o las proteínas de fusión de anticuerpos o sus fragmentos, inmunoconjugados y conjugados de anticuerpos y sus anticuerpos multiespecíficos, vectores de expresión y células huésped que contienen las secuencias de DNA, y a métodos de expresión de estos anticuerpos anti-CD74 de la presente invención.
Descripción breve de las figuras
La Figura 1 muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de LL1 murino.
La Figura 1 A muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos de LL1VH obtenidas por RT-PCR. La Figura 1B muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos de LLIVk obtenidas por 5'-RACE. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de DNA correspondientes, se indican como códigos de una letra debajo de la secuencia de nucleótidos. La numeración de la secuencia de nucleótidos está situada en el lado derecho. Los restos de aminoácidos de las regiones CDR se indican en negrita y subrayados. Se utiliza la numeración de las moléculas de Ig de Kabat para los restos de aminoácidos como indica la numeración situada encima de los restos de aminoácidos. Los restos enumerados por una letra que sigue a un dígito particular indica los restos de inserción definidos por el esquema de numeración de Kabat. Los restos de inserción indicados con una letra poseen el mismo dígito precedente. Por ejemplo, los restos 82A, 82B y 82C de la Figura 1A, están indicados como 82A, B y C.
La Figura 2 muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del LL1 quimérico (cLL1) expresadas en células Sp2/0. La Figura 2A muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos del cLLIVH. La Figura 2B muestra las secuencias de DNA bicatenario y de aminoácidos del cLLIVk. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de DNA correspondientes se proporcionan como códigos de una letra. Los restos de aminoácidos de las regiones CDR se indican en negrita y subrayado. La numeración de los nucleótidos y de los aminoácidos es igual a la de la Figura 1. Los sitios de restricción usados para construir el cLL1 están incluidos en una caja e indicados. La Figura 3 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo humano, cLL1 y hLL1. La Figura 3A muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de las VH del anticuerpo humano RF-TS3, cLL1 y hLL1, y la Figura 3B muestra a alineación de la secuencia de aminoácidos de las Vk del anticuerpo humano HF-21/28, cLL1 y hLL1. Los puntos indican los restos de cLL1 que son idénticos a los restos correspondientes de los anticuerpos humanos. Las regiones incluidas en cajas representan las regiones CDR. Ambos restos de los extremos N- y C-terminales (subrayados) de cLL1 están fijados por los vectores de armazón usados y no comparados con los anticuerpos humanos. El esquema de numeración de moléculas de Ig, de Kabat, se utiliza como en la Figura 1. La Figura 4 muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del LL1 humanizado (hLL1) expresado en células Sp2/0. La Figura 4A muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos de VH de hLL1 la Figura 4B muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos del Vk de hLL1 . Las secuencias de los aminoácidos codificados por las correspondientes secuencias de DNA se proporcionan como códigos de una letra. Los restos de aminoácidos de las regiones CDR se indican en negrita y subrayados. El esquema de numeración de las moléculas de Ig, de Kabat, se utiliza para los restos de aminoácidos como en la Fig. 1A y 1B.
La Figura 5 muestra un diagrama esquemático de construcción del gen de VH de hLL1. Los óligos usados como moldes y cebadores se indican como líneas de flechas. Las puntas de las flechas indican los extremos 3'. Las cadenas de DNA de dirección sentido (moldes, cebadores y productos de PCR) se indican en forma de líneas continuas y las cadenas de dirección antisentido como líneas de puntos. El gen de Vk fue construido de modo semejante.
La Figura 6 muestra el resultado de un ensayo de unión competitiva en la superficie celular para comparar la afinidad de unión del cLL1 con la del LL1 murino. Concentraciones variables de cLL1 (triángulos) o mLL1 (rombos) fueron mezcladas con una cantidad constante de mLL1 marcado con 125I e incubadas con células Raji a 4°C durante 1 hora. Se sometió a recuento el mLL1 radiomarcado unido a la superficie celular después de lavar. El cLL1 y el LL1 murino compitieron igualmente bien por la unión del LL1 radiomarcado a células Raji, confirmando que los genes V clonados son auténticos.
La Figura 7 muestra el resultado de un ensayo de unión competitiva en micropocillos revestidos con membranas de células Raji para comparar la afinidad de unión del hLL1 con la del cLL1. Concentraciones variables de hLL1 (triángulos) o de cLL1 (rombos) fueron mezcladas con una cantidad constante de LL1 conjugado a HRP e incubados en una placa de microtitulación de 96 pocillos revestida con extractos de membranas Raji, a temperatura ambiente, durante 1 hora. Se midió el conjugado HRP-LL1 unido a la membrana; el hLL1 y el cLL1 competían igualmente bien para la unión de HRP-LL1, lo que indica que la especificidad de unión y la afinidad del mAb LL1 están preservadas en el LL1 humanizado.
La Figura 8 muestra el desarrollo de hLL1 y mLL1 marcados con 125I unidos a la superficie de células Raji. El hLL1 radiomarcado (línea continua con símbolos) o el mLL1 (línea de puntos con símbolos) fue incubado con células Raji y los Abs sin unir fueron separados por lavado. Luego fueron cultivadas las células como es normal y los Abs radiomarcados asociados con células (líneas de rombos) secretados en el medio (líneas de triángulos) o degradados (líneas de círculos) fueron medidos en los puntos de tiempo indicados. La Figura 8A muestra el desarrollo del Ab unido, seguido hasta 3 días. La Figura 8B muestra el resultado del tratamiento de hLL1 estudiado en puntos de tiempo precoces (menos de 3 horas). Los resultados indicados fueron la media de dos experimentos.
La Figura 9 muestra el efecto de citotoxicidad de Abs LL1 entrecruzados sobre células Raji. 5 x 105 células Raji fueron sembradas el día 0 en 1 ml de medio de cultivo que contenía (como se indica en la parte superior de los paneles) 5 |ig/ml de mLL1, cLL1 ó hLL1, o ningún Ab (Nil), con 50 |ig/ml de Ab a-mFc o a-hFc, o sin engarce alguno (Nil), indicado en el lado de la derecha de los paneles. Los números de células totales y viables fueron contados diariamente durante 3 días. El porcentaje de células viables (cuadrados) y la relación de células viables con respecto a las células viables en el tiempo cero (rombos) fueron calculados y representados frente al tiempo de cultivo.
La Figura 10 muestra el efecto de citotoxicidad de hLL1 entrecruzado sobre células Daudi. 5 x 105 células Daudi fueron sembradas el día 0 en 1 ml de medio de cultivo que contenía (como se indica en la parte superior de los paneles) 5 |ig/ml de hLL1 ó hLL2 (un Ab de internalización anti-CD22), o ningún Ab (Nil), con 50 |ig/ml de Ab a-hFc, o sin (Nil), indicado en el lado derecho de los paneles. Los números de células totales y de células viables fueron determinados diariamente durante 3 días. El porcentaje de células viables (cuadrados) y la relación de células viables con respecto a las células viables en el tiempo cero (rombos) fueron calculados y representados gráficamente frente al tiempo de cultivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A menos que se especifique de otro modo, los términos “un” o “uno” significan “uno o más”.
1. Visión de conjunto
La presente invención proporciona un mAb anti-CD74, murino humanizado, quimérico y humano, sus fragmentos, una proteína de fusión de anticuerpos, y sus conjugados terapéuticos y de diagnóstico según se define en las reivindicaciones, y que son útiles para el tratamiento de mamíferos, seres humanos y animales domésticos, solos, como un conjugado o administrados en combinación con otros agentes terapéuticos, con inclusión de otros anticuerpos desnudos y conjugados de anticuerpos terapéuticos, como parte de un régimen terapéutico multimodal. Se describen métodos de tratamiento y de diagnóstico de enfermedades malignas de células B, otras enfermedades malignas CD74-positivas, y enfermedades autoinmunitarias.
2. Definiciones
En la descripción que sigue se emplean diversos términos y expresiones y se proporcionan las definiciones que siguen para facilitar la comprensión de la presente invención-Un anticuerpo, según se describe en esta memoria, se refiere a una molécula de inmunoglobulina completa (es decir, natural o formada mediante procesos recombinatorios de fragmentos génicos de inmunoglobulinas naturales) (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) o una parte inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, tal como un fragmento de un anticuerpo.
Un fragmento de un anticuerpo es una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv y semejantes. Con independencia de su estructura, un fragmento de un anticuerpo se une al mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de un anticuerpo monoclonal anti-CD74 se une a un epítopo de CD74. La expresión “fragmento de anticuerpo” incluye también cualquier proteína obtenida sintética o genéticamente que actúa de modo semejante al de un anticuerpo por unión a un antígeno específico formando un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten en las regiones variables, tal como los fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, moléculas recombinantes de polipéptidos de una única cadena en las que las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas están conectadas por un engarce peptídico (“proteínas scFv”), y unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan a la región hipervariable.
Un anticuerpo desnudo es, en general, un anticuerpo entero que no está conjugado a un agente terapéutico. Esto es así debido a que la parte Fc de la molécula del anticuerpo proporciona funciones efectoras, tales como fijación de complemento y ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) que establecen mecanismos de acción que pueden dar por resultado la lisis celular. Sin embargo, es posible que la parte Fc no sea necesaria para la función terapéutica, con otros mecanismos, tales como apoptosis, puestos en juego. Los anticuerpos desnudos incluyen tanto anticuerpos policlonales como monoclonales, y también ciertos anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos.
Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante que contiene los dominios variables de un anticuerpo, con inclusión de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), derivados desde una especie, preferiblemente un anticuerpo de roedor, mientras que los dominios constantes de la molécula de anticuerpo han sido derivados desde los de un anticuerpo humano. Para aplicaciones veterinarias, los dominios constantes del anticuerpo quimérico pueden derivarse desde los de otras especies, tales como un gato o un perro.
Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDRs de un anticuerpo que procede de una especie, por ejemplo, un anticuerpo de un roedor, ha sido transferida desde las cadenas variables, pesadas y ligeras, del anticuerpo de roedor a los dominios variables, pesados y ligeros, humanos. Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo han sido derivados desde los de un anticuerpo humano.
Un anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido desde ratones transgénicos que han sido “construidos” para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a un enfrentamiento antigénico. En esta técnica, elementos de los lugares de las cadenas pesadas y ligeras humanas son introducidos en razas de ratones derivadas de líneas de células pluripotentes embriónicas que contienen rompimientos considerados objetivos de los lugares endógenos de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden ser usados para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Métodos de obtención de anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos han sido descritos por Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) y Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Un anticuerpo totalmente humano puede ser construido también mediante métodos de transfección genética o cromosómica, así como por tecnología de exposición fágica, todos los cuales con conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y sus fragmentos, in vitro, partiendo de repertorios génicos de dominios variables de inmunoglobulinas procedentes de donantes sin inmunizar. En esta técnica, genes de dominios variables de anticuerpos son clonados en el marco de lectura, en un gen de una proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, y expuestos como fragmentos funcionales de anticuerpo sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa con tiene una copia de un DNA monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo dan por resultado, asimismo, la selección del gen que codifica el anticuerpo que pone de manifiesto esas propiedades. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exposición del fago puede llevarse a cabo en una diversidad de formas; para su revisión, véase, por ejemplo, la publicación de Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology, 3:5564-571 (1993).
También pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro. Véanse las patentes de EE.UU. Nos. 5.567.610 y 5.229.275.
Un agente terapéutico es una molécula o un átomo que es administrado por separado, al mismo tiempo, o sucesivamente con un resto de un anticuerpo, o conjugado a un resto de un anticuerpo, es decir, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, o un subfragmento, y es útil para el tratamiento de una enfermedad. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fármacos, toxinas, enzimas, nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, oligonucleótidos antisentido, agentes quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o colorantes y radioisótopos.
Un agente de diagnóstico es una molécula o un átomo que se administra conjugado a un resto de un anticuerpo, es decir, un anticuerpo o un fragmento o un subfragmento de un anticuerpo y que es útil para diagnosticar una enfermedad por localización de las células que contienen el antígeno. Los agentes de diagnóstico útiles incluyen, aun cuando no se limita a ellos, radioisótopos, colorantes (tales como con el complejo de biotina-estreptovidina), agentes de contraste, compuestos o moléculas fluorescentes y agentes de intensificación (por ejemplo, iones paramagnéticos) para formar imágenes de resonancia magnética (MRI). La patente de EE.UU. No. 6.331.175 describe la técnica MRI y la preparación de anticuerpos conjugados a un agente de intensificación de MRI, y está incorporada en su totalidad por referencia. Preferiblemente, los agentes de diagnóstico están seleccionados entre el grupo que consiste en radioisótopos, agentes de intensificación para usar en la formación de imágenes de resonancia magnética, y compuestos fluorescentes. Con objeto de cargar un componente de anticuerpo con metales radiactivos o iones paramagnéticos, puede ser necesario hacerle reaccionar con un reactivo que posee una cola larga a la que están fijados una multiplicidad de grupos quelantes para unir los iones. Tal cola puede ser un polímero por ejemplo una polilisina, un polisacárido u otra cadena derivatizada o derivatizable que posee grupos colgantes a los que pueden unirse grupos quelantes tales como, por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), porfirinas, poliaminas, éteres en corona, bis-tiosemicarbazonas, polioximas, y grupos semejantes que se sabe que son útiles para esta finalidad. Los quelatos son acoplados a los agentes peptídicos usando procedimientos químicos estándar. El quelato está enlazado normalmente al anticuerpo por un grupo que permite la formación de una unión a la molécula con una pérdida mínima de inmunorreactividad y una agregación y/o un entrecruzamiento interno, mínimos. Otros métodos y otros reactivos, más habituales, para conjugar quelatos a anticuerpos están descritos en la patente de EE.u U. No. 4.824.659 otorgada a Hawthorne, titulada “Conjugados de Anticuerpos”, expedida el 25 de Abril de 1989. Las combinaciones de quelatos metálicos especialmente útiles incluyen 2-bencil-DTPA y sus análogos monometílico y ciclohexílico, usados con isótopos de diagnóstico en el intervalo general de energía de 60 a 4.000 keV, tales como 125I, 131I, 123I, 124I, 62Cu, 64Cu, 18F, 111In, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 11C, 13N, 15 O, 76Br, para formación de imágenes radiactivas. Los mismos quelatos, cuando están complejados con metales no radiactivos tales como manganeso, hierro y gadolinio, son útiles para MRI, cuando se usan junto con los anticuerpos de la invención. Los quelatos macrocíclicos tales como NOTA, DOTA y TETA tienen uso con una diversidad de metales y metales radiactivos. y más especialmente con radioisótopos de galio, itrio y cobre, respectivamente. Tales complejos de quelato-metal pueden hacerse muy estables ajustando el tamaño del anillo al metal de interés. Otros quelatos de tipo cíclico tales como poliéteres macrocíclicos, que tienen interés para fijar de modo estable nucleidos, tales como 223Ra para RAIT, están incluidos por la invención.
Un inmunoconjugado es un conjugado de un anticuerpo componente con un agente terapéutico o de diagnóstico. El agente de diagnóstico puede comprender un marcador radiactivo o no radiactivo, un agente de contraste (tal como para la obtención de imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada o ultrasonidos) y el marcador radiactivo puede ser un isótopo que emite radiaciones gamma, rayos beta, alfa, electrones del efecto Auger o positrones.
Un vector de expresión es una molécula de DNA que comprende un gen que es expresado en una célula huésped. Típicamente, la expresión génica es colocada bajo el control de ciertos elementos reguladores, que incluyen promotores constitutivos o inducibles. elementos reguladores específicos de tejidos e intensificadores. Se dice que tal gen está “ligado operablemente a” los elementos reguladores.
Un hospedador recombinante puede ser una célula procariótica o eucariótica que contiene o bien un vector de clonación o bien un vector de expresión. Esta expresión incluye también aquellas células procarióticas o eucarióticas, tales como células de bacterias, de levaduras y de mamífero, así como un animal transgénico no humano, que han sido transformados genéticamente para contener el gen o genes clonados en el cromosoma o el genoma de la célula o células huésped. Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen células de mieloma, tales como células SP2/0 y células NS0, así como células de Ovario de Hámster Chino (CHO), líneas celulares de hibridomas y otras células huésped de mamífero útiles para expresar anticuerpos. También es particularmente útil para expresar mAbs y otras proteínas de fusión la línea celular humana, PER.C6 descrita en el documento WO 0063403 A2, que produce 2 a 200 veces más proteína recombinante en comparación con las líneas celulares de mamífero convencionales tales como las líneas celulares CHO, COS, Vero, Hela, BHK y SP2. Son particularmente útiles para obtener anticuerpos totalmente humanos animales transgénicos especiales con un sistema inmunitarios modificado.
Tal como se usa en esta memoria, la expresión proteína de fusión de anticuerpos es una molécula de unión a antígenos, producida recombinantemente, en la que están enlazados dos o más del mismo o diferente anticuerpo o segmentos de fragmentos de anticuerpos de una sola cadena, con la misma o diferentes especificidades. La valencia de la proteína de fusión indica cuantos brazos o sitios de unión posee la proteína para un único antígeno o epítopo; es decir, monovalente, bivalente, trivalente o polivalente. La polivalencia de la proteína de fusión de anticuerpos significa que puede tomar ventaja de múltiples interacciones en la unión a un antígeno, aumentando de este modo la avidez de unión al antígeno. La especificidad indica cuantos antígenos o epítopos es capaz de fijar una proteína de fusión de anticuerpos; es decir, es monoespecífica, biespecífica, triespecífica, o multiespecífica. Usando estas definiciones, un anticuerpo natural, por ejemplo una IgG, es bivalente debido a que posee dos brazos de unión pero es monoespecífico porque se fija a un solo epítopo. Las proteínas de fusión polivalentes, monoespecíficas, tienen más de un sitio de unión para un epítopo pero solamente se unen con un epítopo, por ejemplo, un diacuerpo con dos sitios de unión reactivos con el mismo antígeno. La proteína de fusión puede comprender un único componente de anticuerpo, una combinación polivalente o multiespecífica de diferentes componentes de anticuerpos o múltiples copias del mismo componente de anticuerpo. La proteína de fusión puede comprender, adicionalmente, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y un agente terapéutico. Los ejemplos de agentes terapéuticos adecuados para tales proteínas de fusión incluyen inmunomoduladores / (“proteína de fusión de anticuerpoinmunomodulador”). Una toxina preferida comprende una ribonucleasa (RNasa), preferiblemente una RNasa recombinante.
Un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a dos dianas, por lo menos, que posee estructuras diferentes, por ejemplo, dos antígenos diferentes, dos epítopos diferentes sobre el mismo antígeno o un hapteno y/o un antígeno o un epítopo. Una especificidad podría ser para una célula B, una célula T, o un antígeno o un epítopo de una célula mieloide, plasmática o una célula cebada. Otra especificidad podría ser para un antígeno diferente situado sobre el mismo tipo de célula, tal como CD20, CD19, CD21, CD23, Cd46, CD80, HlA-DR, CD74 y CD22, sobre células B. Los anticuerpos polivalentes, multiespecíficos, son construcciones que poseen más de un sitio de unión, y los sitios de unión tienen especificidades diferentes. Por ejemplo, un diacuerpo, en el que un sitio de unión reacciona con un antígeno y el otro con otro antígeno.
Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a dos dianas que tienen estructuras diferentes. Los anticuerpos biespecíficos (bsAb) y los fragmentos de anticuerpos biespecíficos (bsFab) poseen al menos un brazo que se une específicamente, por ejemplo, a una célula B, una célula T, a un antígeno o un epítopo de una célula mieloide, plasmática o cebada, y al menos otro brazo que se une específicamente a un conjugado que puede considerarse diana, que lleva un agente terapéutico o de diagnóstico. Puede producirse una variedad de proteínas de fusión biespecíficas usando ingeniería molecular. En una forma, la proteína de fusión biespecífica es monovalente, consistiendo, por ejemplo, en una scFv con un único sitio de unión para un antígeno y un fragmento Fab con un único sitio de unión para un segundo antígeno. En otra forma, la proteína de fusión biespecífica es divalente, consistiendo, por ejemplo, en una IgG con un sitio de unión para un antígeno y dos scFv con dos sitios de unión para un segundo antígeno.
Anticuerpos caninizados o felinizados son proteínas recombinantes en las que regiones de determinación de la complementariedad de un anticuerpo monoclonal de roedor (o de otras especies), han sido transferidas desde las cadenas variables, pesadas y ligeras, de una inmunoglobulina de roedor (o de otra especie), a un dominio variable de una inmunoglobulina de un perro o un gato, respectivamente.
Animales domésticos incluye animales grandes tales como caballos, ganado vacuno, ovejas, cabras, llamas, alpacas y cerdos, y también animales de compañía. En una realización preferida el animal doméstico es un caballo.
Animales de compañía incluye animales mantenidos como mascotas- Estos son, principalmente, perros y gatos, aun cuando están incluidos también pequeños roedores tales como cobayas, hámsters, ratas y hurones, así como primates subhumanos tales como monos. En una realización preferida el animal de compañía es un perro o un gato.
3. Preparación de anticuerpos monoclonales con inclusión de anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.
Los anticuerpos monoclonales (MAbs) constituyen una población homogénea de anticuerpos para un antígeno particular y el anticuerpo comprende solamente un tipo de sitio de unión antigénica y se une solamente a un epítopo sobre un determinante antigénico. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de roedor para antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975) y Coligan et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL.
1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley and Sons, 1991) [en lo sucesivo “Coligan”]. Brevemente, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando ratones con una composición que comprende un antígeno, verificando la presencia de producción de anticuerpos retirando una muestra de suero, separando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno, y aislando los anticuerpos desde los cultivos de hibridomas.
Los MAbs pueden aislares y purificarse partiendo de cultivos de hibridomas mediante una diversidad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína A-Sepharose, cromatografía de exclusión de tamaños, y cromatografía de intercambio iónico. Véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3. Asimismo, véase la publicación de Baines et al., “Purificación de inmunoglobulina G (IgG)” en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY. VOL 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
Después de la producción inicial de anticuerpos para el inmunógeno, los anticuerpos pueden ser secuenciados y preparados seguidamente mediante técnicas recombinantes. La humanización y quimerización de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos murinos, son bien conocidas de los expertos en la técnica. Por ejemplo, se producen anticuerpos monoclonales humanizados por transferencia de regiones de determinación de la complementariedad, del ratón, partiendo de las cadenas variables, pesadas y ligeras, de la inmunoglobulina de ratón, a un dominio variable humano y sustituyendo después restos humanos de las regiones de marco de lectura de sus equivalentes murinos. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de regiones constantes murinas.
Técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulinas murinas figuran descritas, por ejemplo, en la publicación de Orlandi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Técnicas para construir anticuerpos quiméricos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Como ejemplo, Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994), describen como produjeron una quimera de LL2 combinando secuencias de DNA que codifican los dominios V k y VH de un anticuerpo monoclonal LL2, un anticuerpo anti-CD22 con los respectivos dominios de las regiones constantes de IgG1 humana y k . Esta publicación proporciona también las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de LL2, V k y VH, respectivamente. Técnicas para producir MAbs humanizados han sido descritas, por ejemplo, por Jones et al., en Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992) y Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993).
A este fin, la presente invención describe anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos y sus fragmentos que se unen al antígeno CD74 y que pueden ser utilizados en métodos de diagnóstico y terapéuticos. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, humanizados, están descritos en la solicitud de patente provisional de EE.UU. titulada “Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods of Use”, Expediente No. 18733/1073, No. Provisional de EE.UU. 60/356.132, solicitud de patente provisional de EE.UU. No. 60/416.232 y Expediente No.
18733/1155; anticuerpos hMN-14, tales como los descritos en la solicitud de patente de EE.UU. No. 5.874.540, que es un anticuerpo antigénico anti-carcinoembriónico de Clase III (anticuerpo anti-CEA); anticuerpos Mu-9, tales como los descritos en la solicitud de Patente de EE.UU. No. 10/116.116; anticuerpos AFP tales como los descritos en la solicitud de patente provisional de EE.UU. No. 60/399.707; anticuerpos PAM4, tales como los descritos en la solicitud de patente provisional de EE.UU. titulada “monoclonal Abtibody cPAM4”, Expediente No. 18733/1102; anticuerpos RS7, tales como los descritos en la solicitud de patente provisional de EE.UU. No. 60/360.229; y anticuerpos CD22, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 5.789.554 y 6.187.287 y en las solicitudes de patentes de EE.UU. Nos. 09/741.843 y 09/988.013.
Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante que contiene los dominios variables que incluyen las CDRs, derivados desde una especie de un animal, tal como un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo, es decir, los dominios constantes, han sido derivados desde un anticuerpo humano. Por consiguiente, un anticuerpo monoclonal quimérico puede ser humanizado también reemplazando las secuencias del FR murino de los dominios variables del mAb quimérico, con uno o más FRs humanos diferentes. Específicamente, CDRs del ratón son transferidas desde las cadenas variables, pesadas y ligeras, de la inmunoglobulina del ratón, a los correspondientes dominios variables de un anticuerpo humano. Dado que la simple transferencia de CDRs del ratón a FRs humanos da por resultado, con frecuencia, una disminución o incluso pérdida de afinidad del anticuerpo, pudiera requerirse una modificación adicional con objeto de restablecer la afinidad original del anticuerpo murino. Esto puede realizarse mediante el reemplazo de uno o más de algunos restos humanos de las regiones Fr con sus equivalentes murinos para obtener un anticuerpo que posee buena afinidad de unión a su epítopo. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991) y de Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988). Adicionalmente, la afinidad MAbs humanizados, quiméricos y humanos para un epítopo específico, puede ser aumentada por mutagénesis de las CDRs, por lo cual una dosis más baja de anticuerpo puede ser tan eficaz como una dosis más alta de un MAb de afinidad inferior antes de la mutagénesis. Véase, por ejemplo, el documento WO 0029584A1.
Otro método para producir los anticuerpos de la presente invención es mediante la producción en la leche de animales transgénicos. Véase, por ejemplo, la publicación de Colmanm A., Biochem. Soc. Symp., 63:141-147, 1998 y la Patente de EE.UU. No. 5.827.690. Se preparan dos construcciones de DNA que contienen, respectivamente, segmentos de DNA que codifican cadenas pesadas y ligeras emparejadas de inmunoglobulinas- Los segmentos de DNA son clonados en vectores de expresión que contienen una secuencia de un promotor que es expresada, preferentemente, en células epiteliales de mamífero. Como ejemplos se incluyen, aun cuando no se limita a ellos, promotores procedentes de genes de caseína de conejo, vaca y oveja, el gen de a-lactoglobulina de la vaca, el gen de p-lactoglobulina de la oveja y el gen de la proteína ácida del suero del ratón. Preferiblemente, el fragmento insertado está flanqueado en su lado 3' por secuencia genómicas cognadas procedentes de un gen específico mamario. Esto proporciona un lugar de poliadenilación y secuencias de estabilización de transcritos. Las casetes de expresión son inyectadas conjuntamente en los pronúcleos de cigotos fertilizados de mamífero, que después son implantados en el útero de una hembra receptora y se deja gestar. Después del nacimiento, la progenie es examinada para detectar la presencia de ambos transgenos mediante análisis Southern. Con objeto de que el anticuerpo esté presente, ambos genes de las cadenas pesadas y ligeras deben ser expresados al mismo tiempo en la misma célula. La leche procedente de hembras transgénicas es analizada para determinar la presencia y funcionalidad del anticuerpo o fragmento del anticuerpo usando métodos inmunológicos estándar conocidos en la técnica. El anticuerpo puede ser purificado partiendo de la leche usando métodos estándar conocidos en la técnica.
Un anticuerpo totalmente humano de la presente invención, es decir, MAbs anti-CD74 humanos u otros anticuerpos humanos, tales como los MAbs anti-CD22, anti-CD19, anti-CD23, anti-CD20 ó anti-CD21 para terapia de combinación con anticuerpos anti-CD74 humanizados, quiméricos o humanos, pueden ser obtenidos a partir de un animal transgénico no humano. Véase, por ejemplo, la publicación de Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997) y la Patente de EE.UU. No. 5.633.425. Por ejemplo, un anticuerpo humano puede ser recuperado partiendo de un ratón transgénico que posee lugares de inmunoglobulinas humanas. El sistema inmunitario humoral del ratón es humanizado mediante inactivación de los genes endógenos de inmunoglobulina e introduciendo lugares de inmunoglobulinas humana. Los lugares de las inmunoglobulinas humanas son sumamente complejos y comprenden un gran número de segmentos discretos que ocupan juntos casi el 0,2% del genoma humano. Para asegurar que los ratones transgénicos son capaces de producir repertorios adecuados de anticuerpos, deben introducirse en el genoma del ratón porciones grandes de lugares de las cadenas pesadas y ligeras humanas. Esto se efectúa en un proceso por etapas que comienza con la formación de cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contienen lugares de la inmunoglobulina humana de las cadenas pesadas o de las cadenas ligeras en configuración de línea germinal. Dado que cada inserción tiene un tamaño de aproximadamente 1 Mb, la construcción YAC requiere recombinación homóloga de fragmentos de los lugares de inmunoglobulina que se solapan. Los dos Yacs, uno que contiene los lugares de las cadenas pesadas y el otro que contiene los lugares de las cadenas ligeras, son introducidos por separado en ratones mediante la fusión de esferoblastos de levadura que contienen YAC con células pluripotentes embriónicas de ratón. Después clones de las células pluripotentes embriónicas son microinyectados en blastocisto de ratón. Los machos quiméricos que resultan son seleccionados por su capacidad de transmitir el YAC por medio de su línea germinal y son criados con ratones deficientes en la producción de anticuerpos murinos. La cría de las dos razas transgénicas, una que contiene los lugares de las cadenas pesadas humanas y el otro que contiene los lugares de las cadenas ligeras humanas, crea una progenie que produce anticuerpos humanos en respuesta a la inmunización.
Otros métodos recientes para producir mAbs biespecíficos incluyen mAbs recombinantes producidos que poseen restos adicionales de cisteína por lo que se entrecruzan más fuertemente que los isótopos de inmunoglobulinas más comunes. Véase, por ejemplo, la publicación de FitzGerald et al., en Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997. Otro enfoque consiste en producir proteínas de fusión recombinantes enlazando dos o más anticuerpos o segmentos de fragmentos de anticuerpos, diferentes, de una sola cadena, con las especificidades dobles necesitadas. Véase, por ejemplo, la publicación de Coloma et al., en Nature Biotech. 15:159-163, 1997. Puede producirse una diversidad de proteínas de fusión biespecíficas usando técnicas de ingeniería molecular. En una forma, la proteína de fusión biespecífica es monovalente, consistiendo, por ejemplo, en una scFv con un único sitio de unión para un antígeno y un fragmento Fab con un único sitio de unión para un segundo antígeno. En otra forma, la proteína de fusión biespecífica es divalente, consistiendo, por ejemplo en una IgG con dos sitios de unión para un antígeno y dos scFv con dos sitios de unión para un segundo antígeno.
Proteínas de fusión biespecíficas que enlazan dos o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos diferentes, de una sola cadena, son producidos de modo semejante. Pueden emplearse métodos recombinantes para producir una diversidad de proteínas de fusión. Por ejemplo, puede producirse una proteína de fusión que comprende un fragmento Fab derivado desde un anticuerpo monoclonal anti-CD74 humanizado y una scFv derivada desde un antidiDTPA murino. Un engarce flexible tal como GGGS conecta la scFv con la región constante de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD74. Alternativamente, la scFv puede conectarse a la región constante de la cadena ligera de otro anticuerpo humanizado. Secuencias de engarce apropiadas, necesarias para la conexión en el marco de lectura del Fd de la cadena pesada a scFv, son introducidas en los dominios VXy Vk mediante reacciones PCR. El fragmento de DNA que codifica la molécula scFv es ligado después en un vector de armazón que contiene una secuencia de DNA que codifica el dominio CH1. la construcción scFv-CH1 que resulta es escindida y ligada en un vector que contiene una secuencia de DNA que codifica la región VH de un anticuerpo anti-CD74. El vector que resulta puede ser usado para transfectar una célula huésped apropiada, tal como una célula de mamífero, para la expresión de la proteína de fusión biespecífica.
4. Producción de fragmentos de anticuerpos
Pueden generarse mediante técnicas conocidas fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos. Los fragmentos de anticuerpos son partes de un anticuerpo que se unen a antígenos, tales como F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv y semejantes. Otros fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitar a ellos, los fragmentos F(ab)'2 que pueden ser producidos por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab', que pueden ser generados por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab)'2. Alternativamente, pueden construirse colecciones de expresión, de la expresión de Fab' (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281) para permitir una identificación fácil y rápida de fragmentos Fab' monoclonales con la especificidad deseada. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.
Una molécula Fv de una sola cadena (scFv) comprende un dominio VL y un dominio VH. Los dominios VL y VH se asocian formando un sitio de unión diana. Estos dos dominios están, además, enlazados covalentemente por un engarce peptídico (L). Una molécula scFv es denominada o bien como VL-L-VH si el dominio VL es la parte N-terminal de la molécula scFv, o bien como VH-L-VL si el dominio VH es la parte N-terminal de la molécula scFv. Métodos de preparación de moléculas scFv y de diseño de engarces peptídicos adecuados, están descritos en la patente de EE.Uu . No. 4.704.692; la patente de EE.UU. No. 4.946.778, R. Raag y M. Whillow, “Single Chain Fvs” FASEB Vol. 9:73-80 (1995) y R.E.Bird y B.W.Walker, “Single Chain Antibody Variable Regions”, TIBTECH, Vol. 9: 132-137 (1991).
Puede prepararse un fragmento de un anticuerpo mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo completo o por expresión en E. coli u otro hospedador del DNA que codifica el fragmento. Puede obtenerse un fragmento de un anticuerpo por digestión por métodos convencionales con pepsina o papaína de los anticuerpos completos. Por ejemplo, puede producirse un fragmento de un anticuerpo mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede ser escindido posteriormente usando un agente reductor de tioles y, opcionalmente, un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos han sido descritos, por ejemplo, por Goldenberg en las patentes de EE.UU. Nos. 4.036.945 y 4.331.647 y en las referencias bibliográficas contenidas en ellas. Asimismo, véanse las publicaciones de Nisonoff et al., Arch, Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119(1959); Edelman et al., en METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan, en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.
Otra forma de un fragmento de un anticuerpo es un péptido que codifica una única región de determinación de la complementariedad (CDR). Una CDR es un segmento de la región variable de un anticuerpo que es complementario en estructura con el epítopo al que se une el anticuerpo y es más variable que el resto de la región variable. Por consiguiente, se alude frecuentemente a una CDR como una región hipervariable. Una región variable comprende tres CDRs Pueden obtenerse péptidos de CDR mediante construcción de genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable que procede de RNA de células que producen anticuerpos. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies” en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 166-179 (Cambridge University Press, 1995); y Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, en MONOCLONAL ANTIBo DiES: PRINCIp LeS AND APPLICATIONS, Birch et al (eds.), páginas 137-185 (Wiley-Liss, Inc., 1995).
Pueden emplearse también otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadenas ligeras-pesadas, escisión adicional de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, en tanto en cuanto los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
5. Anticuerpos anti-CD74
Los mAbs anti-CD74 de la presente invención contienen CDRs murinas, específicas, que poseen especificidad para el antígeno CD74. Los mAbs anti-CD74 de la presente invención son mAbs humanizados, quiméricos o humanos y contienen los aminoácidos de las CDRs de un mAb anti-CD74 murino, el mAb LL1 murino El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 humanizado o su fragmento, comprenden las CDRs de la región variable de una cadena ligera de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la Cd R2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT. Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal anti-CD74 humanizado o su fragmento, comprende la región variable de las cadenas pesadas de dicho mAb humanizado, que comprende las CDRs de una región variable de las cadenas pesadas de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY. Además, el mAb humanizado retiene sustancialmente la especificidad para el CD74, es decir, la cadena invariable de MHC de clase II, li, presente sobre la superficie de células tales como linfocitos B, monocitos e histiocitos, así como de linfoma y leucemia de células B, y también células de mieloma que dan por resultado la internalización y catabolización rápidas de estos mAbs, de sus fragmentos o de conjugados de mAb.
En una realización un anticuerpo anti-CD74 de la presente invención es un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 humanizado o su fragmento, que comprende las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que comprenden las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) de un anti-CD74 murino (mLL1) y las regiones del marco de lectura (framework) (FR) de un anticuerpo humano, en el que la región variable de las cadenas ligeras del mAb humanizado comprende las CDRs de la región variable de una cadena ligera de un mAb anti-CD74 murino que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de las cadenas pesadas del mAb humanizado comprende las CDRs de la región variable de una cadena pesada de un mAb anti-CD74 murino. que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY. Las CDRs murinas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se muestran en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Los FRs humanos de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas pueden modificarse para mantener la especificidad para el CD74 por sustitución de al menos un aminoácido sustituido procedente de los correspondientes FRs del mAb murino. Más específicamente, uno o más aminoácidos específicos procedentes del mAb murino, identificados por los restos de aminoácidos 2, 3, 4, 46, 87 y 100 de la región variable de las cadenas ligeras murinas de la secuencia de Vk de cLL1 de la Fig. 3B, y los restos de aminoácidos 5, 37, 38, 46, 68, 91 y 93 de la región variable de las cadenas pesadas murinas de la secuencia de VH de cLL1 de la Fig. 3A, pueden mantenerse en los FRs humanos del anti-CD74 humanizado para mantener la especificidad.
En una realización preferida, el mAb anti-CD74 humanizado, el LL1 humanizado (hLL1) o su fragmento que contienen la región variable de una cadena pesada de la Fig. 4A y la región variable de una cadena ligera de la Fig. 4B, se usa en los métodos descritos en la presente invención. Más específicamente, el mAb anti-CD74 humanizado o su fragmento contiene la región constante de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano o una parte del mismo 9. Adicionalmente, el mAb anti-CD74 humanizado o su fragmento de uno cualquiera de los mAbs anti-CD74 humanizado o su fragmento, descritos en esta memoria, puede ser una IgG1 humanizada.
Aun cuando son preferidos mAbs anti-CD74 humanizados, también están incluidos por la presente invención mAbs anti-CD74 quiméricos (cCD74) o sus fragmentos. En una realización el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 (cCD74) quimérico o su fragmento comprende la región variable de una cadena ligera de un mAb anti-CD74 murino, que comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT. En una realización adicional, el anticuerpo monoclonal anti-CD74 quimérico, o su fragmento, comprende la región variable de una cadena pesada de un mAb anti-CD74 murino, que comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY. En otra realización el mAb anti-CD74 quimérico comprende las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que comprenden las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un mAb anti-CD74 murino, y las regiones del marco de lectura (FR) de un mAb anti-CD74 murino, y las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo humano, en el que la región variable de las cadenas ligeras del mAb quimérico comprenden las CDRs de la región variable de una cadena ligera de un mAb anti-CD74 murino que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de una cadena pesada de dicho mAb quimérico comprende las CDRs de la región variable de una cadena pesada de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3
que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY. El mAb anti-CD74 quimérico preferido o su fragmento, comprende la región variable de la cadena pesada de la Fig.2A y la región variable de la cadena ligera de la Fig. 2B.
También está incluido en la presente invención un anticuerpo monoclonal (mAb) humano anti-CD74 (huCD74) o uno de sus fragmentos que comprende la región variable de una cadena ligera del mAb anti-CD74 humano que comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT. Además, está incluido un anticuerpo monoclonal (mAb) humano anti-CD74 (huCD74) o un fragmento del mismo que comprende la región variable de una cadena pesada de dicho mAb humano, que comprende las CDRs de la región variable de una cadena pesada de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY. Más preferiblemente, la presente invención describe un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 humano o su fragmento que comprende las regiones variables y constantes de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo humano, en el que las CDRs del huCD74 de la región variable de una cadena ligera del mAb humano anti-CD74 comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de una cadena pesada del mAb humano comprende las CDRs de la región variable de una cadena pesada de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN , la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
Cada mAb anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, de la presente invención, es preferiblemente una IgG1 en el que las regiones constantes son, preferiblemente, una IgG1 humana, pero puede hacerse referencia a la IgG1 como una IgG1 humana, una IgG1 quimérica, o una IgG1 humanizada, respectivamente. En particular, el mAb anti-CD74 humanizado, hLL1, posee dominios constantes y la región de la rótula procedente de una IgG1 humana. Preferiblemente, ambos mAbs LL1, quimérico y humano, poseen el mismo dominio constante y la misma región de la rótula. No obstante, pueden realizarse modificaciones para que las regiones constantes de la IgG1 estén reemplazadas con regiones constantes humanas de IgG2a, IgG3 ó IgG4 humanas.
La presente invención está dirigida también a un anticuerpo monoclonal anti-CD74 murino o uno de sus fragmentos, que comprende las CDRs de la región variable de una cadena ligera de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT. Además, el anticuerpo monoclonal anti-CD74 murino o su fragmento, comprende las CDRs de la región variable de una cadena pesada de un mAb anti-CD74 murino, que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY. Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal anti-CD74 murino o uno de sus fragmentos, comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo murino anti-CD74 (mLL1) y las regiones del marco de lectura (FR) de un anticuerpo murino anti-CD74, en el que la región variable de una cadena ligera de dicho mAb murino comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de una cadena pesada de dicho mAb murino comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
Cada uno de los mAbs anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, o uno de sus fragmentos, de la presente invención, posee al menos una de las siguientes propiedades: se une específicamente y son reactivos con el antígeno, CD74; su unión a CD-74 está bloqueada por un anticuerpo o uno de sus fragmentos específico para CD74 o reactivo con éste; es internalizado por células Raji de linfoma en cultivos; e induce la apoptosis de células Raji en cultivos celulares cuando se entrecruza con antisueros de cabra reactivos con el Fc de un mAb IgG1 murino.
Los fragmentos del mAb anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, pueden ser un fragmento tal como F(ab')2, Fab, scFv, Fv, o una construcción de fusión que utiliza parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas del F(ab')2, Fab, scFv o Fv. Es importante que el fragmento se una a CD74.
6. Anticuerpos multiespecíficos y polivalentes
Los anticuerpos anti-CD74, así como otros anticuerpos con especificidades diferentes para usar en terapia de combinación, descritos en esta memoria, pueden prepararse también como anticuerpos multiespecíficos (que comprenden por lo menos un sitio de unión para un epítopo o antígeno CD74 y al menos un sitio de unión para otro epítopo sobre CD74 u otro antígeno) y como anticuerpos polivalentes (que comprenden varios sitios de unión para el mismo epítopo o antígeno), o los anticuerpos pueden ser tanto polivalentes como multiespecíficos.
Una proteína de fusión de anticuerpos preferida, de la presente invención, contiene cuatro o más Fvs o Fab's de los mAbs anti-CD74 humanizados, quiméricos, humanos o murinos, o sus fragmentos, descritos en esta memoria. Adicionalmente, otra proteína de fusión de anticuerpos preferida contiene uno o más Fvs o Fab's de los mAbs o sus fragmentos, de los mAbs anti-CD74 humanizados, quiméricos, humanos o murinos, o sus fragmentos, descritos en esta memoria, y uno o más Fvs o Fab's procedentes de anticuerpos específicos para otro antígeno, específico para un marcador de una célula tumoral, que no es el antígeno CD74, que es expresado por las células que expresan CD74, tal como, por ejemplo, un marcador tumoral seleccionado entre un antígeno de un linaje de células B, tal como CD19, CD20 ó CD22, para el tratamiento de enfermedades malignas de las células B, así como otras células CD74-positivas que causan otros tipos de enfermedades malignas, tales como las S 100 del melanoma, etc. Adicionalmente, el marcador de células tumorales puede ser un antígeno de un linaje de células no B seleccionado entre el grupo que consiste en HLA-DR, CD30, C d 3 3 , CD52, MUC1 y TAC.
La presente invención proporciona también un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, en el que los mAbs anti-CD74 o sus fragmentos, o sus proteínas de fusión de anticuerpos, de la presente invención, están ligados a un anticuerpo o a un fragmento de anticuerpo específico de una sustancia marcadora de cáncer, un epítopo sobre la superficie de un organismo productor de una enfermedad infecciosa, o una sustancia nociva existente en la sangre u otros fluidos corporales. Los anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos de la presente invención son especialmente útiles en el método de inducción de aclaramiento de una diversidad de sustancias nocivas, en que el anticuerpo biespecífico posee al menos una especificidad para una sustancia nociva tal como un organismo patógeno, y al menos una especificidad para el CD74, la cadena invariable (li) de HLA de clase II, según se describe con detalle en el documento de EE.UU. Serie No.09/314.135, presentada el 19 de Mayo de 1999, titulado “Therapeutic Using a Bispecific Antibody”.
La presente invención proporciona, además, un anticuerpo biespecífico o su fragmento que tiene al menos una región de unión que se une específicamente a un marcador celular considerado diana y al menos otra región de unión que se une específicamente a un conjugado que puede considerarse diana. El conjugado que puede considerarse diana comprende una parte transportadora que comprende o lleva al menos un epítopo reconocido por al menos una región de unión del anticuerpo biespecífico o su fragmento. Diversos métodos recombinantes pueden ser utilizados para producir anticuerpos biespecíficos y sus fragmentos, según se ha descrito antes.
También es contemplado en la presente invención, un anticuerpo polivalente anti-CD74. Esta proteína polivalente, diana, de unión se construye por asociación de un primer y un segundo polipéptido. El primer polipéptido comprende una primera molécula de Fv de una sola cadena ligada a un primer dominio, tal como el de una inmunoglobulina, que es, preferiblemente, un dominio de la región variable de una cadena ligera de la inmunoglobulina. El segundo polipéptido comprende una segunda molécula de Fv de una sola cadena enlazada covalentemente a un segundo dominio, tal como el de una inmunoglobulina, que es, preferiblemente, un dominio de la región variable de una cadena pesada de la inmunoglobulina. Cada una de la primera y segunda moléculas de Fv de una sola cadena forma un sitio diana de unión, y el primero y segundo dominios tales como los de una inmunoglobulina, se asocian formando un tercer sitio diana de unión
Una molécula de Fv de una sola cadena con la configuración VL-L-VH, en la que L es un engarce, puede asociase con otra molécula Fv de una sola cadena con la configuración VH-L-VL y formar un dímero bivalente. En este caso, el dominio VL de la primera scFv y el dominio VH de la segunda molécula scFv se asocian formando un sitio diana de unión, mientras que el dominio VH de la primera scFv y el dominio VL de la segunda scFv, se asocian formando el otro sitio diana de unión.
Otra realización de la presente invención es una proteína dirigida trivalente, biespecífica, de CD74, que comprende dos cadenas polipeptídicas heterólogas asociadas no covalentemente formando tres sitios de unión, dos de los cuales poseen afinidad para una diana y un tercero que posee afinidad para un hapteno que puede hacerse y fijarse a un transportador de un agente de diagnóstico y/o terapéutico. Preferiblemente, la proteína de unión posee dos sitios de unión de CD20 y un sitio de unión de CD22. Los agentes dirigidos, trivalentes, biespecíficos, poseen dos scFvs diferentes; una scFV contiene dos dominios VH que proceden de un anticuerpo, conectados por un engarce corto al dominio VL de otro anticuerpo. y la segunda scFv contiene dos dominios VL procedentes del primer anticuerpo, conectados por un engarce corto al dominio VL del otro anticuerpo. Los métodos de generación de agentes polivalentes, multiespecíficos, partiendo de dominios VH y VL proporcionan el que las cadenas individuales sintetizadas desde un plásmido de DNA en un organismo hospedador, estén compuestas totalmente por dominios VH (la cadena VH) o totalmente por dominios VL (la cadena VL) de modo que cualquier agente de polivalencia y multiespecificidad puede ser producido por asociación no covalente de una cadena VH con una cadena VL.. Por ejemplo, formando un agente trivalente, triespecífico, la cadena VL consistirá en las secuencias de aminoácidos de tres dominios VH, cada uno de los cuales procede de un anticuerpo de diferente especificidad, unidos por engarces peptídicos de longitudes variables, y la cadena VL consistirá en dominios VL complementarios, unidos por engarces peptídicos similares a los utilizados para la cadena VH. Puesto que los dominios V h y VL de anticuerpos se asocian de modo antiparalelo, el método preferido en esta invención posee los dominios VL de la cadena VL dispuestos en orden inverso respecto a los dominios VH de la cadena VH.
6. Diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos
Los anticuerpos anti-CD74 de la presente invención pueden ser usados, asimismo, para preparar anticuerpos funcionales, biespecíficos, de una sola cadena (bscAb), denominados también diacuerpos, y pueden ser producidos en células de mamífero usando métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, la publicación de Mack et al., en Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025, 1995, incorporada. Por ejemplo, se producen bscAbs uniendo dos fragmentos Fv de una sola cadena por medio de un engarce de glicocola-serina, usando métodos recombinantes. Los dominios de la cadena ligera V (VL) y de la cadena pesada V (VH) de dos anticuerpos de interés, son aislados usando métodos estándar de PCR. Los cDNAs de la VL y de la VH obtenidos desde cada hibridoma se unen después formando un fragmento de una sola cadena en un proceso PCR de unión de dos etapas. La primera etapa de la PCR introduce el engarce (Gly4-Ser1)3, y la segunda etapa une los amplicones de Vl y VH. Cada molécula monocatenaria es clonada luego en un vector de expresión bacteriano. Después de amplificar, una de las moléculas monocatenaria es escindida y subclonada en el otro vector, que contiene la segunda molécula monocatenaria de interés. El fragmento bscAb que resulta es subclonado en un vector de expresión eucariótico. Puede obtenerse la expresión de la proteína funcional transfectando el vector en células de Ovario de Hámster Chino. Se preparan proteínas de fusión biespecíficas de un modo similar. Los anticuerpos de una sola cadena biespecíficos y las proteínas de fusión biespecíficas se incluyen dentro del alcance de la presente invención
Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo monoclonal anti-CD74, humanizado, quimérico o humano, para producir diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos específicos de antígenos. Los diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos monoespecíficos se unen selectivamente a antígenos considerados diana y a medida que aumentan los sitios de unión existentes sobre la molécula, aumenta la afinidad para la célula diana y se observa un mayor tiempo de permanencia en la posición deseada. Para los diacuerpos, se utilizan las dos cadenas que comprenden el polipéptido de VH del mAb CD74 humanizado, conectadas al polipéptido de V k del mAb CD74 humanizado, mediante un engarce de cinco restos de aminoácidos. Cada cadena forma la mitad del diacuerpo de CD74 humanizado. En el caso de triacuerpos, las tres cadenas comprenden el polipéptido de VH del mAb CD74 humanizado conectadas al polipéptido de V k del mAb de CD74 humanizado sin engarce. Cada cadena forma una tercera parte del triacuerpo hCD74
El uso final de los diacuerpos biespecíficos descritos en esta memoria es para pre-hacer diana en tumores CD74-positivos para la distribución específica subsiguiente de agentes de diagnóstico o terapéuticos. Estos diacuerpos se unen selectivamente a antígenos considerados dianas permitiendo una afinidad aumentada y un mayor tiempo de permanencia en el lugar deseado. Además, los diacuerpos no unidos a antígeno se eliminan rápidamente desde el cuerpo y se reduce al mínimo la exposición de tejidos normales. Los agentes de diagnóstico y terapéuticos pueden incluir isótopos, fármacos, toxinas, citoquinas, hormonas, enzimas, oligonucleótidos, factores de crecimiento, conjugados, radioisótopos, y metales. Por ejemplo, se usa el metal gadolinio para la formación de imágenes de resonancia magnética (MRI). Son ejemplos de radioisótopos: 225Ac, 18F, 68Ga, 67Ga, 90Y, 86Y, 111In, 131I, 125I, 125I, 123I, 99mTc, 94mTc, 186Re, 188Re, 177Lu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 32P, 11C, 13N, 15O, 76Br, y 211At. Otros radioisótopos se encuentran disponibles también como agentes de diagnóstico y terapéuticos, en especial los situados en el intervalo de energía de 60 a 4.000 keV para los agentes de diagnóstico y en el intervalo de energía de 60-700 para los agentes terapéuticos.
Más recientemente, un diacuerpo tetravalente en tándem (denominado tandab) con doble especificidad, ha sido indicado también (Cochlovius et al., Cancer Research (2000) 60:4336-4341). El tandab biespecífico es un dímero de dos polipéptidos idénticos, cada uno de los cuales contiene cuatro dominios variables de dos anticuerpos diferentes (VH1, VL1, VH2, VL2) ligados en una orientación que facilita la formación de dos sitios de unión potenciales para cada una de las dos especificidades diferentes, por autoasociación.
7. Anticuerpos anti-CD74 polivalentes y multiespecíficos conjugados
En otra realización de la presente invención hay un anticuerpo anti-CD74 polivalente, conjugado. Pueden añadirse restos adicionales de aminoácidos o bien al extremo N-terminal o bien al C-terminal del primero o el segundo polipéptido. Los restos adicionales de aminoácidos pueden comprender una marca de un péptido, un péptido señal, una citoquina, una enzima (por ejemplo, una enzima que activa un profármaco), una hormona, una toxina peptídica, tal como una exotoxina de Pseudomonas, un fármaco peptídico, una proteína citotóxica u otras proteínas funcionales. Tal como se usa en esta memoria, una proteína funcional es una proteína que posee una función biológica.
En una realización, pueden conjugarse fármacos, toxinas, compuestos radiactivos, enzimas, hormonas, proteínas citotóxicas, quelatos, citoquinas y otros agentes funcionales a la proteína de unión, diana, polivalente, preferiblemente a través de enlaces covalentes con las cadenas laterales de los restos de aminoácidos de la proteína de unión, diana, polivalente, por ejemplo, grupos amino, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo. Para este fin pueden utilizarse diversos engarces convencionales, por ejemplo, diisocianatos, diisotiocianatos, ésteres de bis(hidroxisuccinimida), carbodiimidas, ésteres de maleimido-hidroxisuccinimida, glutaraldehído, y semejantes. La conjugación de los agentes con la proteína polivalente no afecta significativamente, de preferencia, a la especificidad o afinidad de unión de la proteína a su diana. Tal como se usa en esta memoria, un agente funcional es un agente que posee una función biológica. Un agente funcional preferido es un agente citotóxico.
Todavía en otra realización, la distribución de polímeros terapéuticos o de profármacos, dirigida por anticuerpos biespecíficos a dianas, in vivo, puede combinarse con la distribución de radioisótopos de anticuerpos biespecíficos, de modo que se consigue una combinación de quimioterapia y de radioinmunoterapia. Cada tratamiento terapéutico puede conjugarse con el conjugado dirigible y administrarse simultáneamente, o el nucleido puede administrarse como parte de un primer conjugado dirigible y administrarse el fármaco en una etapa posterior como parte de un segundo conjugado dirigible.
En otra realización, pueden conjugarse agentes citotóxicos con un transportador polimérico, y seguidamente, el portador polimérico puede conjugarse con la proteína de unión, diana, polivalente. Para este método véase la publicación de Ryser et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870; 1978, la patente de EE.UU. No. 4.699.784 y la patente de EE.UU. No. 4.046.722. La conjugación, de preferencia, no afecta significativamente a la especificidad o afinidad de unión de la proteína de unión polivalente.
8. Uso de anticuerpos humanizados, quiméricos y humanos para tratamiento y diagnóstico
Los anticuerpos monoclonales humanizados, quiméricos y humanos, es decir, los mAbs anti-CD74 y otros mAbs descritos en esta memoria, según esta invención, son adecuados para usar en métodos terapéuticos y en métodos de diagnóstico. Por consiguiente, la presente invención contempla la administración de los anticuerpos humanizados, quiméricos y humanos, de la presente invención aislados, como anticuerpos desnudos, o administrados como un tratamiento terapéutico multimodal, temporalmente, según un régimen de dosificación, pero sin conjugar a un agente terapéutico. Un inmunoconjugado es un conjugado que comprende un componente de anticuerpo que comprende al menos un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, de los mAbs humanizados, quiméricos o humanos CD74 descritos en la presente invención, que se unen a CD74, que está ligado a un agente de diagnóstico o terapéutico.
La eficacia de los mAbs anti-CD74 desnudos puede ser intensificada suplementando los anticuerpos desnudos con uno o más de otros anticuerpos desnudos, es decir, mAbs para antígenos específicos, tales como CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, Ia, tenascina, HM1.24 ó HLA-DR, preferentemente el dímero HLA-DR maduro, con uno o más inmunoconjugados de anti-CD74, o de anticuerpos para estos antígenos citados, conjugado con agentes terapéuticos, que incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, hormonas, enzimas, radioisótopos terapéuticos, etc., con uno o más agentes terapéuticos, que incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, hormonas, enzimas, radioisótopos terapéuticos, etc., administrados simultánea o sucesivamente, o según un régimen de dosificación establecido previamente, con los mAbs. Los antígenos asociados a células B preferidos incluyen los equivalentes a los antígenos humanos CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD46, CD52, CD74, CD80 y CD5. Los antígenos de células T preferidos incluyen los equivalentes a los antígenos humanos CD4, CD8 y CD25 (el receptor de IL-2). Un equivalente al antígeno HLA-DR puede ser usado en el tratamiento de trastornos tanto de células B como de células T. Los antígenos de células B particularmente preferidos son los equivalentes a los antígenos humanos CD19, CD22, CD21, CD23, CD74, c D80 y HLA-DR. Los antígenos de células T particularmente preferidos son los equivalentes a los antígenos humanos CD4, CD8 y CD25. El antígeno CD46 es un antígeno situado sobre la superficie de células cancerosas que bloquean la lisis dependiente del complemento (CDC). Son antígenos preferidos asociados a melanomas malignos, los equivalentes a MART-1, TRP-1, TRP-2 y gp100. Otros antígenos preferidos asociados a mielomas múltiples son los equivalentes a MUC1 y CD38.
Adicionalmente, la presente invención contempla la administración de un inmunoconjugado para usos de diagnóstico y terapéuticos en linfomas de células B y otras enfermedades u otros trastornos. Un inmunoconjugado, según se describe aquí, es una molécula que comprende un componente de anticuerpo y un agente terapéutico o de diagnóstico, con inclusión de un péptido que puede llevar el agente de diagnóstico o terapéutico. Un inmunoconjugado retiene la inmunorreactividad del componente de anticuerpo, es decir, el resto del anticuerpo tiene aproximadamente la misma capacidad de unión o ligeramente reducida, al antígeno cognato tanto después de la conjugación como antes de la conjugación.
Una amplia variedad de reactivos de diagnóstico y terapéuticos pueden conjugarse ventajosamente a los anticuerpos de la invención. Los agentes terapéuticos citados en esta memoria, son aquellos agentes que también son útiles para administrar por separado con el anticuerpo desnudo, según se ha descrito antes. Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, fármacos quimioterápicos tales como alcaloides de la Vinca, antraciclinas, epidofillotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes de alquilación, antibióticos, inhibidores de Cox-2, antimitóticos, agentes antiangiogénicos y apoptóticos, en particular doxorubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos y otros de estas y otras clases de agentes anticancerosos, y semejantes. Otros fármacos quimioterápicos para el cáncer, para preparar inmunoconjugados y proteínas de fusión de anticuerpos, incluyen mostazas nitrogenadas, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, triazenos, análogos del ácido fólico. inhibidores de COX-2, análogos de la pirimidina, análogos de purinas, complejos de coordinación de platino, hormonas, y semejantes. Agentes quimioterápicos adecuados están descritos en las publicaciones REMINGTON'S PHARMACEUTiCa L SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Co. 1995) y GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7a Edición (MacMillan Publishing Co. 1985), así como en ediciones revisadas de estas publicaciones. Otros agentes quimioterápicos adecuados, tales como fármacos experimentales, son conocidos por los expertos en la técnica.
Adicionalmente, puede usarse un agente quelante tal como DTPA, DOTA, TETA o NOTA o un péptido adecuado, al que puede conjugarse un marcador detectable tal como una molécula fluorescente o un agente citotóxico, tal como un metal pesado o un radioisótopo. Por ejemplo, puede obtenerse un inmunoconjugado, útil desde el punto de vista terapéutico, conjugando un agente o un colorante fotoactivo a un compuesto de anticuerpo. Composiciones fluorescentes tales como fluorocromo, y otros cromógenos o colorantes, tales como porfirinas sensibles a la luz visible, han sido utilizados para detectar y tratar lesiones dirigiendo hacia la lesión la luz adecuada. En terapia esto ha sido denominado fotorradiación, fototerapia o terapia fotodinámica (Jori et al., (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Librería Progetto, 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986)). Además, anticuerpos monoclonales han sido acoplados a colorantes fotoactivados para conseguir fototerapia. Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983), idem., Cancer Res.45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8744 (1986); idem., Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Orig. Clin. Biol. Res.
288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991). Sin embargo, estos estudios anteriores no incluían el uso de aplicaciones terapéuticas endoscópicas, en especial con el uso de fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. Por tanto, la presente invención contempla el uso terapéutico de inmunoconjugados que comprenden agentes o colorantes fotoactivos.
Asimismo la presente invención contempla el uso de agentes radiactivos y no radiactivos como agentes de diagnóstico. Un agente de diagnóstico no radiactivo es un agente de contraste adecuado para obtener imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada o ultrasonidos. Los agentes de obtención de imágenes magnéticas incluyen, por ejemplo, metales no radiactivos tales como manganeso, hierro y gadolinio, complejados con combinaciones de quelatos-metal que incluyen 2-bencil-DTPA y sus análogos monometílico y ciclohexílico, cuando se usan junto con los anticuerpos de la invención. Véase el documento de EE.UU Serie No. 09/921.290 presentada el 10 de Octubre de 2001.
Además, un anticuerpo o un inmunoconjugado radiomarcado pueden comprender un radioisótopo que emite radiaciones y o un emisor de positrones, útil para obtener imágenes con fines diagnósticos. Los radioisótopos adecuados, en particular en el intervalo de energía de 60 a 4.000 keV, incluyen 131I, 123I, 124I, 86Y, 62Cu, 64Cu, 111In, 67Ga, 68Ga, 99mTc,94mTc, 18F, 11C, 13N, 15O, 75Br, y los semejantes. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. titulada “Labeling Targeting Agents with Gallium-68” - Inventores G.L. Griffiths y W.J. McBride, (Solicitud de patente provisional de EE.UU. No. 60/342.104), que describe emisores de positrones tales como 18F, 68Ga, 94mTc, y semejantes, con la finalidad de obtener imágenes.
Una toxina, tal como una exotoxina de Pseudomonas, puede complejarse también con la parte del agente terapéutico o formar dicha parte, de una proteína de fusión de anticuerpos de un anticuerpo anti-CD74 de la presente invención. Otras toxinas empleadas adecuadamente para preparar tales complejos u otras proteínas de fusión, incluyen ricina, abrina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina-A de Staphylococci, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, una exotoxina de Pseudomonas, y una endotoxina de Pseudomonas. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Pastan et al, Cell 47:641 (1986), y de Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians 44: 43 (1994). Toxinas adicionales adecuadas para usar en la presente invención, son conocidas por los expertos en la técnica y están descritas en la patente de EE.UU. No. 6.077.499.
Un inmunomodulador, tal como una citoquina, puede conjugarse también con la parte de agente terapéutico de una proteína de fusión de anticuerpos o formar dicha parte, o administrarse con los anticuerpos humanizados anti-CD20 de la presente invención. Las citoquinas adecuadas para la presente invención incluyen, aun cuando no se limita a ellas, interferones e interleuquinas, según se describe más adelante.
También se es contempla por la presente invención una vacuna que comprende los mAbs CD74, humanizados, quiméricos o humanos, o sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, enlazados covalentemente a péptidos antigénicos de MHC de Clase I ó de Clase II, formando un conjugado de anticuerpos, en el que la vacuna se usa para tratar pacientes aquejados de cáncer o de una enfermedad infecciosa. Cuando el conjugado de anticuerpos es internalizado mediante la célula que contiene el marcador CD74, los péptidos antigénicos de Clase I o Clase II son liberados por digestión proteolítica desde un péptido o proteína mayor, ligados al mAb o su fragmento, por una célula que presenta antígeno, tal como una célula dendrítica. Este conjugado de anticuerpos se prepara fusionando cDNA que codifica el mAb o su fragmento, con cDNA que codifica el péptido o proteína antigénicos, y expresando la proteína de fusión en una célula bacteriana, de levadura o de mamífero. Los conjugados de anticuerpos que contienen los mAbs CD74, humanizados, quiméricos o humanos, o sus fragmentos, o las proteínas de fusión de anticuerpos, de la presente invención, son particularmente útiles en un método de tratamiento descrito en el documento de EE.UU. Serie No.08/577.106, pendiente, presentado el 22 de Diciembre de 1995, titulado “Use of immunoconjugates to Enhance the Efficacy of Multi-Stage Cascade Boosting Vaccines”. el mAb anti-CD74 humanizado, de la presente invención, es particularmente útil en lugar del LL1 murino del Ejemplo 5.
9. Preparación de inmunoconjugados
Cualquiera de los anticuerpos o proteínas de fusión de anticuerpos de la presente invención, puede conjugarse con uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico. En general, está unido a cada anticuerpo o a cada fragmento de anticuerpo un agente terapéutico o de diagnóstico, pero puede unirse al mismo anticuerpo o fragmento de anticuerpo más de un agente terapéutico o de un agente de diagnóstico. Las proteínas de fusión de anticuerpos de la presente invención comprenden dos o más anticuerpos o sus fragmentos y cada uno de los anticuerpos que comprende esta proteína de fusión puede contener un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. Adicionalmente, uno o más de los anticuerpos de la proteína de fusión de anticuerpos puede tener unido más de un agente terapéutico o de diagnóstico. Además, no es necesario que los agentes terapéuticos sean los mismos, sino que pueden ser agentes terapéuticos diferentes. Por ejemplo, uno puede unir un fármaco y un radioisótopo a la misma proteína de fusión. Particularmente, una IgG puede estar radiomarcada con 131I y unida a un fármaco. El 1311 puede estar incorporado en la tirosina de la IgG y el fármaco estar unido al grupo amino en posición épsilon de las lisinas de la IgG. Ambos agentes, terapéuticos y de diagnóstico, pueden estar unidos también a grupos SH reducidos y a las cadenas laterales de hidratos de carbono.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención son útiles en métodos de preseñalización de dianas y proporcionan un medio preferido para distribuir a un sujeto dos agentes terapéuticos o dos agentes de diagnóstico. El documento de EE.UU. Serie No: 09/382.186 describe un método de señalización de dianas usando un anticuerpo biespecífico, en el que el anticuerpo biespecífico está marcado con 125I y se administra a un sujeto, seguido de un péptido divalente marcado con 99mTc. La administración da por resultado relaciones excelentes en tejidos tumoral/normal del 125I y el 99mTc., poniendo de manifiesto así la utilidad de dos radioisótopos de diagnóstico. Puede usarse cualquier combinación de agentes terapéuticos o agentes de diagnóstico conocidos para marcar los anticuerpos y las proteínas de fusión. La especificidad de unión del componente de anticuerpo del conjugado de mAb, la eficacia del agente terapéutico o del agente de diagnóstico y la actividad efectora de la porción Fc del anticuerpo, pueden determinarse mediante ensayos estándar de los conjugados.
Un agente terapéutico o de diagnóstico puede unirse en la región de la rótula de un componente de anticuerpo reducido mediante la formación de uniones disulfuro. Como alternativa, tales péptidos pueden fijarse al componente de anticuerpo usando un engarce de cruzamiento heterobifuncional, tal como el 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinilo (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Técnicas generales para tal conjugación son bien conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Wong en CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press, 1991); Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods”, en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), páginas 187­ 230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies” en MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION , Ritter et al., (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press, 1995). Alternativamente, el agente terapéutico o de diagnóstico puede ser conjugado por medio de un resto de un hidrato de carbono de la región Fc del anticuerpo. El grupo del hidrato de carbono puede utilizarse para aumentar la carga del mismo péptido que está unido a un grupo tiol, o el resto de hidrato de carbono puede usarse para unir a un péptido diferente.
Son bien conocidos por los expertos en la técnica métodos para conjugar péptidos a componentes de anticuerpos mediante un resto de un hidrato de carbono de un anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Shih et al., en Int. J. Cancer 41:832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101 (1990) y de Shih et al., Patente de EE.UU. No.
5.057.313. El método general implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que posee una parte de hidratos de carbono oxidada, con un polímero transportador que tiene, por lo menos, una función amina libre y que está cargado con una pluralidad de péptidos. Esta reacción da por resultado un enlace inicial de base de Schiff (imina), que puede ser estabilizada por reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.
La región Fc está ausente si el anticuerpo utilizado como el componente de anticuerpo del inmunoconjugado, es un fragmento de un anticuerpo. No obstante, es posible introducir un resto de un hidrato de carbono en la región variable de las cadenas ligeras de un anticuerpo completo o de un fragmento de anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Leung et al., en J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., patente de EE.UU. No. 5.443.953 (1995); Leung et al., patente de EE.UU. No. 6.254.868. El resto de hidratos de carbono obtenido se usa para fijar el agente terapéutico o de diagnóstico.
10. Excipientes farmacéuticamente aceptables
Los mAbs anti-CD74, humanizados, quiméricos y humanos, a administrar a un sujeto, pueden consistir en un mAb solo, un inmunoconjugado, una proteína de fusión solos, o pueden comprender uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados, uno o más ingredientes adicionales o alguna combinación de estos.
El inmunoconjugado o anticuerpo desnudo de la presente invención pueden formularse según métodos conocidos de preparación de composiciones útiles desde el punto de vista farmacéutico, por lo que el inmunoconjugado o el anticuerpo desnudo están combinados en una mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable. La solución salina tamponada con fosfato, estéril, es un ejemplo de un excipiente farmacéuticamente aceptable. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea and Febiger, 1990), y la de Gennar (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición, (Mack Publishing Company, 1990), y sus ediciones revisadas.
El inmunoconjugado o el anticuerpo desnudo de la presente invención pueden ser formulados para administrar por vía intravenosa, por ejemplo, mediante inyección de bolo o por infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas, o en viales multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones, en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, de estabilización y/o agentes dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituir antes del uso con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril apirógena.
Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para regular la duración de ación del conjugado o del anticuerpo desnudo, terapéutico o de diagnóstico. Pueden obtenerse preparados de cesión regulada mediante el uso de polímeros para complejar o absorber el inmunoconjugado o el anticuerpo desnudo. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de copolímeros de poli(etileno-acetato de vinilo) y matrices de un copolímero de tipo polianhídrido, de un dímero de ácido esteárico y ácido sebácico. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992). La velocidad de cesión desde una matriz de un inmunoconjugado o de un anticuerpo, depende del peso molecular del inmunoconjugado o el anticuerpo, de la cantidad de inmunoconjugado o de anticuerpo dentro de la matriz y del tamaño de las partículas dispersadas. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989); Sherwood et al., supra. Otras formas farmacéuticas sólidas figuran descritas por Ansel et al., en PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea and Febiger, 1990) y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edición (Mack Publishing Company, 1990), y sus ediciones revisadas.
El inmunoconjugado, las proteínas de fusión de anticuerpos o el anticuerpo desnudo pueden administrarse también a un mamífero por vía subcutánea o incluso por otras vías parenterales. Además, la administración puede ser por infusión continua o mediante bolos unitarios o múltiples. En general, la dosificación del inmunoconjugado, proteína de fusión o anticuerpo desnudo administrada a los seres humanos, puede variar dependiendo de factores tales como la edad del paciente, el peso, la estatura, el sexo, el estado médico general y la historia médica anterior. Típicamente, es deseable proporcionar al receptor una dosis de inmunoconjugado, proteína de fusión de anticuerpos o anticuerpo desnudo que esté situada en el intervalo de desde aproximadamente 1 mg/kg a 20 mg/kg, en forma de una sola infusión intravenosa, aun cuando puede administrarse asimismo una dosis menor o mayor según dicten las circunstancias. Esta dosis puede repetirse según se necesite, por ejemplo, una vez por semana durante 4-10 semanas, de preferencia una vez por semana durante 8 semanas, y más preferiblemente, una vez por semana durante 4 semanas. También puede administrarse con menor frecuencia, por ejemplo, una semana sí y otra no durante varios meses. La dosis puede administrarse mediante varias vías parenterales, con un ajuste apropiado de la dosis y del plan de administración.
Con fines terapéuticos, el inmunoconjugado, la proteína de fusión o el anticuerpo desnudo se administra a un mamífero en una cantidad terapéuticamente eficaz. Un sujeto adecuado para la presente invención es, habitualmente, un ser humano, aun cuando también se contempla un sujeto animal no humano. Se dice que una preparación de anticuerpo ha de ser administrada en una “cantidad terapéuticamente eficaz” si la cantidad administrada es relevante desde el punto de vista fisiológico. Un agente es relevante desde el punto de vista fisiológico si su presencia da por resultado un cambio detectable de la fisiología del mamífero receptor. En particular, una preparación de anticuerpo de la presente invención es relevante desde el punto de vista fisiológico, si su presencia invoca una repuesta antitumoral o mitiga los signos y síntomas del de una enfermedad autoinmunitaria. Un efecto relevante desde el punto de vista fisiológico, podría ser también la provocación en el mamífero receptor de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular.
11. Métodos de tratamiento
La presente invención contempla el uso de los anticuerpos desnudos anti-CD74 de la presente invención, como la composición principal para el tratamiento de una enfermedad maligna que expresa CD74, en la que la enfermedad o el trastorno está seleccionado entre el grupo que consiste en una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, el rechazo de injertos de órganos, y de enfermedad de injerto contra huésped. La enfermedad maligna que expresa CD74 está seleccionada entre el grupo que consiste en un tumor sólido, un linfoma no de Hodgkin, un linfoma de Hodgkin un mieloma múltiple, otra enfermedad maligna de células B y una enfermedad maligna de células T. El tumor sólido está seleccionado entre el grupo que consiste en un melanoma, un carcinoma y un sarcoma, y el carcinoma está seleccionado entre el grupo que consiste en un carcinoma renal, un carcinoma pulmonar, un carcinoma intestinal, un carcinoma estomacal y un melanoma. La enfermedad maligna de células B está seleccionada entre el grupo que consiste en un linfoma no de Hodgkin, un linfoma de Hodgkin, formas indolentes de linfomas de células B, formas agresivas de linfomas de células B, leucemias linfáticas crónicas, leucemias linfáticas agudas, y mieloma múltiple, trastornos de células B y otras enfermedades. En particular, las composiciones descritas en esta memoria son particularmente útiles para el tratamiento de diversas formas autoinmunitarias así como también formas indolentes, de linfomas de células B, formas agresivas de linfomas de células B, leucemias linfáticas crónicas, leucemias linfáticas agudas, mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenstrom. Por ejemplo, los componentes de anticuerpos anti-CD74 humanizados e inmunoconjugados, pueden ser usados para tratar tanto formas indolentes como formas agresivas de linfomas no de Hodgkin.
Más específicamente, la invención contempla un método de tratamiento de enfermedades malignas de células B que comprende administrar a un sujeto aquejado de una enfermedad maligna relacionada con células B, una composición terapéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos un mAb anti-CD74, humanizado, quimérico o humano, o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, de la presente invención, en la que la enfermedad maligna de células B es un linfoma o una leucemia. Más específicamente, la enfermedad maligna de células B es un linfoma no de Hodgkin, formas indolentes de linfomas de células B, formas agresivas de linfomas de células B, mieloma múltiple, leucemias linfáticas crónicas, o leucemias linfáticas agudas. El mAb CD74 o su fragmento se administra por vía intravenosa o intramuscular, en una dosis de 20-2000 mg. El presente método comprende, además, la administración del mAb anti-CD74 o su fragmento antes, durante o después de administrar al menos un agente terapéutico utilizado para tratar la enfermedad maligna de células B. El agente terapéutico comprende un anticuerpo desnudo, un inmunomodulador, una hormona, un agente citotóxico, una enzima, un anticuerpo conjugado a, por lo menos, un inmunomodulador, un marcador radiactivo, una hormona, una enzima o un agente citotóxico, o una de sus combinaciones. El inmunomodulador es, preferiblemente, una citoquina y dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina. El anticuerpo que se administra en combinación como un anticuerpo desnudo o como un inmunoconjugado suplementario, es reactivo con CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, Ia, HM1.24, tenascina, y HLA-DR, preferiblemente un dímero de HLA-DR maduro, formulado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención contempla también el tratamiento de una enfermedad maligna, que comprende administrar a un sujeto aquejado de una enfermedad maligna positiva respecto al antígeno CD74, distinta de linfoma o leucemia, una composición terapéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, según se describe en la presente invención. El mAb anti-CD74 o su fragmento o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, se administra por vía intravenosa o intramuscular en una dosis de 20-2000 mg. Adicionalmente, el mAb anti-CD74 o su fragmento o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, se administra antes, durante o después de administrar al menos un agente terapéutico utilizado para tratar la enfermedad maligna. El agente terapéutico, según se ha descrito ante y a lo largo de toda la memoria, comprende un anticuerpo, un inmunomodulador, una hormona, un agente citotóxico, un anticuerpo conjugado a, por lo menos, un inmunomodulador, un marcador radiactivo, una enzima, una hormona, un agente citotóxico, un oligonucleótido antisentido, o una de sus combinaciones, en el que el inmunomodulador es una citoquina y dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina. Cuando se administra un anticuerpo en combinación con el mAb anti-CD74 o su fragmento para tratar una enfermedad maligna que no es una enfermedad maligna de células B, debe ser reactivo con un marcador tumoral distinto del CD74, expresado por las células que comprenden la enfermedad maligna que se trata, formulado e un vehículo farmacéuticamente aceptable Son ejemplos de anticuerpos que pueden ser administrados para antígenos asociados a melanomas malignos, aquellos anticuerpos reactivos con MART-1, TRP-1, TRP-2 y gp100. Otros anticuerpos preferidos para antígenos asociados con mielomas múltiples son los reactivos con MUC1 y CD38.
Las composiciones de tratamiento contienen al menos un anticuerpo monoclonal anti-CD74, humanizado, quimérico o humano, solo o combinado con otros anticuerpos, tales como otros anticuerpos humanizados, quiméricos o humanos, agentes terapéuticos o inmunomoduladores. En particular, se contempla también la terapia de combinación con un anticuerpo totalmente humano, y es producida mediante los métodos antes establecidos.
Los anticuerpos desnudos o conjugados para el mismo o diferente epítopo o antígeno, pueden combinarse también con uno o más de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, puede combinarse un anticuerpo anti-CD74, humanizado, quimérico o humano, con otro mAb anti-CD74 humanizado desnudo, quimérico desnudo o humano desnudo, un anticuerpo anti-CD74 humanizado, quimérico o humano, desnudo, puede combinarse con un inmunoconjugado anti-CD74; un anticuerpo anti-CD74 desnudo puede combinarse con un radioconjugado anti-CD22, o un anticuerpo desnudo anti-CD22 puede combinarse con un anticuerpo anti-CD74 humanizado, quimérico o humano, conjugado a un isótopo, o uno o más agentes quimioterápicos, citoquinas, enzimas, toxinas o una de sus combinaciones. Una proteína de fusión de un anticuerpo CD20 humanizado, quimérico o humano, y una toxina o un inmunomodulador, o una proteína de fusión de al menos dos anticuerpos de células B diferentes (por ejemplo, un mAb CD74 y un mAb CD22, un mAb CD20 o un mAb CD19), puede usarse también en esta invención. Se hace referencia al documento de EE.UU. Serie No. 09/965.796., pendiente, presentada el 1 de Octubre de 2001, titulado “Immunotherapy of B-Cell Malignaancies Using Anti-CD22 Antibodies” que es una continuación de la patente de EE.UU. No. 6.306.393, que describe el tratamiento con anticuerpos anti-CD22 en combinación con otros anticuerpos desnudos. Muchas combinaciones diferentes de anticuerpos, que hacen diana en al menos dos antígenos diferentes asociados con trastornos de células B, según se ha indicado antes, pueden ser construidos, o bien como anticuerpos desnudos o bien como parcialmente desnudos o parcialmente conjugados con un agente terapéutico o inmunomodulador, o simplemente combinados con otros agentes terapéuticos tales como un fármaco citotóxico, o con radiaciones.
Tal como se usa en esta memoria, el término “inmunomodulador” incluye citoquinas, factores de crecimiento de células pluripotentes, linfotoxinas, tales como el factor de la necrosis tumoral (TNF) y factores hematopoyéticos, tales como interleuquinas por ejemplo, interleuquina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12. IL-18 e IL-21), factores estimulantes del colon (por ejemplo, el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferones (por ejemplo, los interferones a, p y y), el factor de crecimiento de las células pluripotentes denominado “factor S1), eritropoyetina, trombopoyetina, o una de sus combinaciones. Como ejemplos de restos de inmunomoduladores adecuados se incluyen IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, y una de sus combinaciones, y el interferón-y, y el TNF-a, y semejantes.
Alternativamente, los sujetos pueden recibir anticuerpos anti-CD74 desnudos y una citoquina administrada por separado, que puede administrarse antes, al mismo tiempo, o después de la administración de los anticuerpos anti-c D74 desnudos. Según se ha discutido anteriormente, el anticuerpo anti-CD74 puede conjugarse también al inmunomodulador. El inmunomodulador puede conjugarse también a un anticuerpo híbrido que consiste en uno o más anticuerpos que se unen a antígenos diferentes.
Las terapias multimodales de la presente invención incluyen. además, la inmunoterapia con anticuerpos anti-CD74 desnudos, suplementados con la administración de anti-CD22, anti-CD19, anti-CD21, anti-CD20, anti-CD80, anti-CD23, anti-CD46 ó HLA-DR, preferiblemente los anticuerpos de dímeros de HLA-DR maduros, en forma de anticuerpos desnudos, proteínas de fusión o como inmunoconjugados. Estos anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanos o humanizados, que reconocen al menos un epítopo situado en estos determinantes antigénicos. Los anticuerpos anti-CD19 y anti-CD22 son conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Ghelle et al., Cancer Res. 48:2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32: 364 (1991); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996) y las patentes de EE.UU. Nos.
5.798.554 y 6.187.287.
En otra forma de terapia multimodal, los sujetos reciben anticuerpos anti-CD74 desnudos, y/o inmunoconjugados, en asociación con tratamiento quimioterápico estándar del cáncer. Por ejemplo, “CVB” (ciclofosfamida, 1,5 g/m2, etoposido, 200-400 mg/m2, y carmustina, 150-200 mg/m2) es un régimen empleado para tratar linfomas no de Hodgkin. Patti et al., Eur. J. Harmatil, 51:18 (1993). Otras combinaciones adecuadas de regímenes quimioterápicos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de Freedman et al., “Non-Hodking's Lymphomas” en Ca Nc ER MEDICINE, VOLUME 2, 3a Edición, Holland et al., (eds.), páginas 2028-2068 (Lea and Febiger, 1993). Como ilustración, la primera generación de regímenes quimioterápicos para el tratamiento de linfomas no de Hodgkin (NHL) de grado intermedio, incluyen C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, procarbazina y prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona). Un régimen quimioterápico de segunda generación, útil, es el m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorin), mientras que un régimen de tercera generación, adecuado, es el MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorín). Fármacos adicionales, útiles, incluyen butirato de fenilo y brostatín-1. En un tratamiento terapéutico multimodal fármacos quimioterápicos y citoquinas, ambos, se administran conjuntamente con un anticuerpo, un inmunoconjugado o una proteína de fusión, según la presente invención, Las citoquinas, los fármacos quimioterápicos y el anticuerpo o el inmunoconjugado, pueden administrarse en cualquier orden, o juntos.
En una realización preferida, los NHL se tratan con 4 infusiones semanales del anticuerpo anti-CD74 humanizado, en una dosis de 200-400 mg/m2 por semana durante 4 semanas consecutivas o una semana sí y otra no (iv durante 2-8 horas), repetido según sea necesario a lo largo de los meses/años siguientes. También, de preferencia, se tratan los NHL con 4 infusiones semimensuales como antes, pero combinadas con epratuzumAb (anticuerpo humanizados anti-CD22), los mismos días, en una dosis de 360 mg/m2, administrado en forma de infusión intravenosa durante 1 hora, o bien antes, durante o después de la infusión de anticuerpo monoclonal anti-CD74. Todavía preferido, los NHL se tratan con 4 infusiones semanales del anticuerpo anti-CD74, como antes, combinado con una o más inyecciones de mAb CD22 radiomarcado con un isótopo terapéutico tal como el itrio-90 (en dosis del Y90 entre 5 y 35 mCi/metro cuadrado en forma de una o más inyecciones durante un período de semanas o de meses.
Además, una composición terapéutica de la presente invención puede contener una mezcla de moléculas híbridas de anticuerpos monoclonales anti-CD74 desnudos, dirigida hacia epítopos diferentes sin bloqueo de CD74. Por consiguiente, la presente invención contempla composiciones terapéuticas que comprenden una mezcla de anticuerpos monoclonales anti-CD74 que se unen al menos a dos epítopos de CD74. Adicionalmente, la composición terapéutica descrita en esta memoria puede contener una mezcla de anticuerpos anti-CD74 con secuencias variables de las CDRs.
Aun cuando los anticuerpos desnudos anti-CD74 son las composiciones terapéuticas principales para el tratamiento de linfomas de células B y enfermedades autoinmunitarias, la eficacia de tal terapia con anticuerpos puede ser intensificada suplementando los anticuerpos desnudos con agentes suplementarios, por ejemplo inmunomoduladores, tales como interferones, que incluyen los IFNa, IFNp e IFN, interleuquinas, que incluyen las IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, e IL-21 y una de sus combinaciones, y citoquinas. que incluyen las G-CSF y GM-CSF. Por tanto, los anticuerpos CD74 pueden combinarse no solo con anticuerpos y citoquinas, o bien como mezclas (dadas por separado o en algún régimen de dosificación predeterminado) o bien en forma de conjugados o proteínas de fusión para el anticuerpo anti-CD74, y también pueden administrarse como una combinación con fármacos o con oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD74 puede combinarse con CHOP como un régimen quimioterápico de 4 fármacos. Adicionalmente, un anticuerpo anti-CD74 desnudo puede combinarse con un anticuerpo anti-CD22 desnudo y CHOP o Fludarabina, como una combinación de fármacos para el tratamiento terapéutico de NHL. Las composiciones terapéuticas suplementarias pueden administrarse antes, al mismo tiempo o después de la administración de los anticuerpos anti-CD74. El mAb anti-CD74 desnudo puede combinarse también con un oligonucleótido bcl antisentido.
Como se ha discutido anteriormente, los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para tratar linfomas y leucemias de células B y otras enfermedades o trastornos de las células B, así como otras enfermedades malignas en las que las células malignas afectadas o asociadas son reactivas con CD74. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos anti-CD74 para tratar enfermedades de desarreglos inmunitarios y enfermedades autoinmunitarias afines, con inclusión de enfermedades autoinmunitarias de Clase III, tales como trombocitopenias inmunomediadas, por ejemplo la púrpura trombocitopénica idiopática aguda y la púrpura trombocitopénica idiopática crónica, las dermatomiositis, el síndrome de Sjogren, la esclerosis múltiple, la corea de Sydenham, la miastenia gravis, el lupus eritematoso sistémico la nefritis de lupus, las fiebres reumáticas, los síndromes poliglandulares, el penfigoide bulloso, las diabetes mellitus, la púrpura de Henoch-Schonlein, las nefritis post-estreptocócicas, el eritema nodoso, la arteritis de Takayasu, la enfermedad de Addison, la artritis reumatoide, la sarcoidosis, la colitis ulcerosa, el eritema multiforme, la nefropatía de IgA, la poliarteritis nodosa, la espondilitis anquilosante, el síndrome de Goodpasture, la tromboangitis obliterante, la cirrosis biliar primaria, la tiroiditis de Hashimoto, las tirotoxicosis, el escleroderma, la hepatitis activa crónica, las polimiositis/dermatomiositis, las policondritis, el pénfigo vulgar, la granulomatosis de Wegener, la nefropatía membranosa, la esclerosis lateral amiotrófica, las tabes dorsalis, las arteritis/polimialgias de células gigantes, la anemia perniciosa, la glomerulonefritis progresiva rápida, y la alveolitis fibrosante.
En particular, los mAbs anti-CD74, humanizados, quiméricos o humanos o sus fragmentos, o sus proteínas de fusión de anticuerpos, de la presente invención, son administrados a un sujeto aquejado de una o más de estas enfermedades autoinmunitarias. Los anticuerpos anti-CD74 de la presente invención, son particularmente útiles en el método de tratamiento de trastornos autoinmunitarios descritos en el documento de EE.UU., pendiente, Serie No.
09/590.284 presentado el 9 de Junio de 2000, titulado “Immunotherapy of Autoimmune Disorders using Antibodies that Target B-Cells”. Preferiblemente, el mAb anti-CD74 o su fragmento o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos se administra por vía intravenosa o intramuscular en una dosis de 20-2000 mg. Además, el mAb anti-CD74 o su fragmento o sus proteínas de fusión de anticuerpos se administra antes, durante o después de la administración de al menos un agente terapéutico usado para tratar el trastorno. El agente terapéutico, según se ha descrito antes y en toda la memoria descriptiva, comprende un anticuerpo, un inmunomodulador, una hormona, una enzima, un agente citotóxico, un anticuerpo conjugado a, por lo menos, un inmunomodulador, un marcador radiactivo, una hormona, una enzima o un agente citotóxico, un oligonucleótido antisentido, o una de sus combinaciones, en el que el inmunomodulador es una citoquina y dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina. El anticuerpo que es administrado en combinación en forma de un anticuerpo desnudo o como un inmunoconjugado suplementario, es reactivo con CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUC1, la, HM1.24, tenascina y HLA-DR maduro, preferiblemente un dímero de HLA-DR maduro, formulado en el seno de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro método de tratamiento de una de las enfermedades seleccionadas entre el grupo que consiste en linfoma, leucemia, mieloma, otras enfermedades malignas que expresan CD-74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, y una de sus combinaciones, que comprende administrar una composición terapéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos un mAb anti-CD74 o su fragmento o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, de la presente invención, en el que al menos un agente terapéutico ha sido ligado al mAb o su fragmento o a los Fvs o Fab's de la proteína de fusión de anticuerpos del mismo, por conjugación química o mediante fusión genética. El agente terapéutico puede ser un inmunomodulador, un marcador radiactivo, una hormona, una enzima o un agente citotóxico, y el inmunomodulador es una citoquina y dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina.
Los anticuerpos anti-CD74 también pueden inducir apoptosis en células que expresan el antígeno CD74. La evidencia de esta inducción está apoyada en los ejemplos de la presente invención. Otros anticuerpos han demostrado que podría inducirse apoptosis usando células linfoides que poseen receptores de Fc reactivos con el IgG1-Fc de mAbs CD20 que están entrecruzados. Véase la publicación de Shan et al., en Cancer Immunol. Immunother. 48(12):673-683 (2000). Además, se ha indicado que los agregados de un MAb quimérico CD20, es decir, homopolímeros, inducían apoptosis. Véanse las publicaciones de Shan et al, Blood 97(5):1392-1398 (2000) y de Ghtle et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(14):7509-7514 (1997).
Pueden inyectarse en un mamífero anticuerpos específicos para el antígeno de superficie CD74 de células B, que después se unen al antígeno de la superficie celular CD74 tanto de células B normales como malignas. Un mamífero incluye seres humanos y animales domésticos, con inclusión de animales de compañía tales como perros y gatos. Los mAbs anti-CD74 de la presente invención, es decir, mAbs anti-CD74, humanizados, quiméricos, humanos, caninizados y felinizados e incluso murinos, pueden ser utilizados para tratar los mamíferos no humanos cuando existe una especie de reactividad cruzada con el antígeno CD74. Los mAbs murinos, que son inmunógenos en los seres humanos son, habitualmente, menos inmunógenos en mamíferos no humanos. El anticuerpo anti-CD74 unido al antígeno de superficie CD74 conduce a la destrucción y agotamiento de células B neoplásicas.
12. Método de diagnóstico
También se proporciona en la presente invención un método de diagnóstico de una enfermedad en un sujeto al que se ha diagnosticado o del que se sospecha que está aquejado de al menos una de las enfermedades seleccionadas entre los grupos que consisten en linfomas, leucemias, mielomas, otras enfermedades malignas que expresan CD-74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, y una de sus combinaciones, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz desde el punto de vista del diagnóstico, de un conjugado de diagnóstico, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y al menos un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, en el que el agente de diagnóstico es ligado al mAb o su fragmento o a los Fvs o Fabs de la proteína de fusión de anticuerpos del mismo, mediante conjugación química y detección del agente de diagnóstico. Son agentes de diagnóstico útiles en la presente invención, un radioisótopo, en el que los fotones del radioisótopo son detectados mediante escintilación radiográfica o PET, o un metal, que puede ser detectado por MRI, o un liposoma o un liposoma lleno de gas, y en el que el liposoma puede ser detectado mediante un dispositivo de exploración de ultrasonidos.
La internalización en células diana de mAbs anti-CD74 murinos, mAbs anti-CD74 quiméricos y mAbs anti-CD74 humanizados, puede ir seguida de marcado por fluorescencia, según, esencialmente, el procedimiento operatorio de Parker et al., J. Clin. Invest., 76:1261 (1985). Células Raji cultivadas se centrifugan y las células se vuelven a suspender en medio de nueva aportación hasta una concentración de 5 x 106 células/ml, aproximadamente. A cada uno de los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos se añade 100 |il de la suspensión de células. Se añaden a los pocillos de reacción los anticuerpos, 40 |ig/ml, en un volumen de 100 |il, a intervalos de tiempo programados para que todas las reacciones terminen simultáneamente. Se incuba la placa a 37°C en un incubador de cultivos celulares con CO2. Los anticuerpos sin unir se retiran lavando tres veces las células con FCS al 1%/PBS al término de la incubación. Después se tratan las células con 1 ml de Formaid-Fresh [solución de formalina al 10% (Fisher, Fair Lawn, NJ)] durante 15 minutos a 4°C. Después de lavar, son detectados los anticuerpos presentes o bien sobre la superficie de las células o en el interior de las células, por tratamiento con anticuerpo de cabra anti­ ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Tago Burlingame, CA), o anticuerpo de cabra anti-humano marcado con FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), dependiendo de sí el anticuerpo sometido a ensayo es murino, quimérico o humanizado, respectivamente. Las distribuciones de las fluorescencias son evaluadas usando un microscopio de fluorescencia BH-2 (Olympus, Lake Success, NY).
En un aspecto relacionado, un método de selección/diagnóstico de cánceres óseos, descrito por Juweid et al., 1999, podría beneficiarse de los mAbs anti-CD74 superiores de la presente invención. Por consiguiente, se contempla un método que comprende un mAb anti-CD74. humanizado o quimérico, marcado con 99mTc.
13. Vectores de expresión
La secuencia de DNA que codifica un mAb anti-CD74, humanizado, quimérico o humano. Más específicamente, la secuencia de DNA comprende un ácido nucleico que codifica un mAb o uno de sus fragmentos, seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos descritos en esta memoria; (b) un inmunoconjugado que comprende uno cualquiera de los mAbs anti-CD74 o uno de sus fragmentos descritos en esta memoria; (c) una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos que comprenden al menos dos de dichos mAbs anti-CD74 o sus fragmentos descritos en esta memoria; (d) una proteína de fusión de anticuerpos o su fragmento descritos en esta memoria; (e) una vacuna según aquí se describe; y un anticuerpo biespecífico o multiespecífico descrito en esta memoria. Cualquiera de las secuencias de DNA de la presente invención puede ser obtenida recombinantemente en una diversidad de vectores hospedadores conocidos que proporcionan replicación del ácido nucleico. Estos vectores pueden ser diseñados usando métodos conocidos, para que contengan los elementos necesarios para dirigir la transcripción, la traducción o ambas, del ácido nucleico, en una célula a la que es distribuido. Puede usarse metodología conocida para generar construcciones de expresión que poseen una secuencia que codifica una proteína, ligada operablemente con señales apropiadas de control s de la transcripción/traducción. Estos métodos incluyen técnicas de DNA recombinante in vitro y técnicas de síntesis. Por ejemplo, véase la publicación de Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LAbOrATORY MANUAL., Cold Spring Harbor Laboratory (Nueva York), Ausubel et al., 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (Nueva York). También se proporciona por esta invención la administración de un polinucleótido no asociado con un vector.
Los vectores adecuados para usar en la presente invención pueden ser virales o no virales. Como ejemplos particulares de vectores virales se incluyen adenovirus, AAV, virus herpes simplex, lentivirus y retrovirus. Un ejemplo de un vector no viral es un plásmido. En una realización preferida, el vector es un plásmido.
Un vector de expresión, tal como aquí se describe, es un polinucleótido que comprende un gen que es expresado en una célula huésped. Típicamente, la expresión génica se coloca bajo el control de ciertos elementos reguladores, que incluyen promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores específicos de tejidos e intensificadores. Se dice de tal gen que está “ligado operablemente a” los elementos reguladores. Los vectores de expresión preferidos son el vector pdH12 y el GS.
Preferiblemente, el vector de expresión de la presente invención comprende la secuencia de DNA que codifica un mAb anti-CD74, humanizado, quimérico o humano, que incluye las regiones variables y constantes, ambas, de las cadenas pesadas y ligeras. Sin embargo, pueden usarse dos vectores de expresión uno de los cuales comprende las regiones variables y constantes de las cadenas pesadas, y el otro comprende las regiones variables y constantes de las cadenas ligeras. Se prefiere, todavía, que el vector de expresión comprenda además un promotor. Debido a ello puede usarse cualquier promotor fuerte, una secuencia de DNA que codifique un péptido señal de secreción, una secuencia genómica que codifique la región constante de las cadenas pesadas de una IgG1 humana, un elemento intensificador de Ig y, al menos, una secuencia de DNA que codifique un marcador de selección.
El método para la expresión de un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos o de una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, empleando la presente invención, comprende: (a) transfectar una célula huésped con una secuencia de DNA que codifica un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, una proteína de fusión o uno de sus anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos; y (b) cultivar la célula que secreta el mAb anti-CD74 o su fragmento, o la proteína de fusión de anticuerpos o su fragmento. La célula huésped es derivada de células bacterianas, de levaduras o de mamífero. Más preferiblemente procede de una célula de mamífero que, en una realización, es una célula linfocítica, tal como una célula de mieloma.
También se contempla en esta invención un método para expresar un mAb anti-CD74 humanizado, que comprende: (i) linearizar al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica un mAb anti-CD74, humanizado, quimérico o humano; (ii) transfectar células de mamífero con al menos uno de dichos vectores linearizados; (iii) seleccionar células transfectadas que expresen un gen marcador, y; (iv) identificar las células que secretan el mAb anti-CD74 humanizado desde las células transfectadas.
Los inventores han aislado CDNAs que codifican las regiones VL y VH del anticuerpo monoclonal murino anti-CD74 (mAb mLL1) y le han subclonado en vectores de expresión de mamífero que contienen los genes que codifican las regiones constantes kappa e IgG1, respectivamente, de anticuerpos humanos. La transfección conjunta de células de mamífero con estos dos DNAs recombinantes expresó un mAb anti-CD74 quimérico (cLL1) que al igual que el mAb mLL1 parental, se unía con avidez a las células de linfoma B y era internalizado rápidamente por ellas.
Las CDRs de los DNAs de VK y VH han sido ligadas recombinantemente, de modo semejante, a las secuencias del marco de lectura (FR) de las regiones VK y VH humanas, respectivamente, que después han sido ligadas, respectivamente, a las regiones constantes kappa e IgG1, expresando así en células de mamífero, como se ha descrito antes, un mAb anti-CD74 humanizado (hLL1).
Otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadenas ligeras-pesadas, escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, pueden ser empleadas también, en tanto que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
El anticuerpo aquí descrito es un anticuerpo monoclonal (mAb). Los anticuerpos monoclonales constituyen una población homogénea de anticuerpos para un antígeno particular, y el anticuerpo comprende solamente un tipo de sitio de unión antigénica al que se une específicamente el ácido nucleico. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de roedores para antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de Kohler y Milstein, Nature 256:495(1975), y de Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley and Sons, 1991) [en lo sucesivo “Coligan””]. Brevemente, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando ratones con una composición que comprende un antígeno, verificando la presencia de la producción de anticuerpos retirando una muestra de suero, separando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno, y aislando los anticuerpos desde los cultivos de los hibridomas.
Los mAbs pueden aislarse y purificarse partiendo de cultivos de hibridomas mediante una diversidad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose, cromatografía de exclusión de tamaños, y cromatografía de intercambio iónico. Véase, por ejemplo, Coligan, en las páginas 2.7.1-2.7.12 y en las páginas 2.9.1-2.9.3. Véase también la publicación de Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
14. Método de apareamiento
Las secuencias de VK y VH de mAb anti-CD74 quimérico o humanizado, pueden amplificarse por PCR según ha sido descrito por Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989)) que se incorpora como referencia. Las secuencias de VK pueden amplificarse usando los cebadores CK3BH y VK-3 (Leung et al., BioTechniques, 15: 286 (1993)), mientras que las secuencias de VH pueden ser amplificadas usando el cebador CH1B que se hibrida por extremos complementarios con la región CH1 de IgG murina, y VHIBACK (Orlandi et al., 1989, referencia anterior). Las mezclas de la reacción PCR que contienen 10 |il del producto de cDNA de la primera cadena, 9 |il de solución tampón (10X) de la PCR [KCl 500 mM, Tris.HCl 100 mM (pH 8,3), MgCl2 15 mM, y 0,01% (p/v) de gelatina] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), pueden someterse a 30 ciclos de PCR, Cada ciclo de PCR consiste, preferiblemente, en desnaturalización a 940°C durante 1 minuto, hibridación de ácidos nucleicos a 500°C durante 1,5 minutos y polimerización a 720°C durante 1,5 minutos. Los fragmentos VK y VH amplificados pueden ser purificados sobre agarosa al 2% (BioRad, Richmond, CA). Véase el Ejemplo 3 de un método para la síntesis de un oligo A (149-mero) y un oligo B (140-mero) en el sintetizador automático de DNA, Cyclone Plus (MiNigan-Biosearch) para utilizar en la construcción de genes V humanizados.
Los productos de la PCR para VK pueden ser subclonados en un vector de armazón. tal como el vector de armazón VKpBr basado en el pBR327, que contiene un promotor de Ig, una secuencia de un péptido señal y sitios de restricción convenientes para facilitar la ligación en el marco de lectura de los productos de VK obtenidos por PCR. Los productos de PCR para VH pueden ser subclonados en un vector de armazón similar, tal como el VHpBS basado en el pBluescript. Los clones individuales que contienen los respectivos productos obtenidos por PCR pueden ser secuenciados, por ejemplo, mediante el método de Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463 (1977).
Ha de tomarse en consideración que las secuencias de DNA descritas en esta memoria incluyen todos los alelos, mutantes y sus variantes, tanto si son naturales como si han sido inducidos.
Los dos plásmidos pueden ser transfectados conjuntamente en una célula apropiada, por ejemplo, la célula Sp2/0-Ag14 de mieloma, seleccionarse colonias por su resistencia a la higromicina, y monitorizarse los fluidos sobrenadantes para determinar la producción de mAbs, anti-CD74 quiméricos o humanizados, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA según se describe más adelante.
La transfección y el ensayo para determinar clones que secretan el anticuerpo mediante el ensayo ELISA, pueden llevarse a cabo del modo siguiente. Pueden emplearse, aproximadamente, 10 |ig de pKh de hLL1 (vector de expresión de cadenas ligeras) y 20 |ig de pG1g de hLL1 (vector de expresión de cadenas pesadas), para transfectar por electroporación 5 x 106 células SP2/0 de mieloma (BioRad, Richmond, CA) según la publicación de Co et al., en J. Immunol, 148:1149 (1992). Después de la transfección las células pueden ser cultivadas en placas de microtitulación de 96 pocillos, en medio HSFM completo (GIBCO, Gaithersburg, MD) a 370C y 5% de CO2. El proceso de selección puede ser iniciado después de dos días mediante la adición de un medio de selección de higromicina (Calbiochem, San Diego, CA), en una concentración final de 500 |ig/ml de higromicina. Las colonias emergen, típicamente, 2-3 semanas después de la electroporación. Luego pueden expandirse los cultivos para su análisis posterior.
Los clones de los transfectomas que son positivos para la secreción de cadenas pesadas, quiméricas o humanizadas, pueden identificarse mediante el ensayo ELISA. Brevemente, muestras de sobrenadantes (100 |il ) procedentes de cultivos transfectados, se añaden por triplicado a placas de microtitulación para el ensayo ELISA, previamente revestidas con anticuerpo de cabra anti- IgG(GAH) humana, específico de los fragmentos F(ab)2 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas sin unir se separan lavando tres veces con solución tampón de lavado (PBS que contiene polisorbato 20 al 0,05%). Se añade a los pocillos anticuerpos específicos del fragmento Fc anti-IgG-GAH conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) (100 |il de solución reserva de anticuerpo diluidos x 104, suplementado con el anticuerpo sin conjugar, hasta una concentración final de 1.0 |ig/ml). Después de incubar durante 1 hora se lavan las placas, típicamente tres veces. Se añade a los pocillos una solución de reacción. [100 |il, que contienen 167 |ig de ortofenilenodiamina (OPD) (Sigma, St. Louis,MO) y peróxido de hidrógeno al 0,025% en el seno de PBS]. Se deja desarrollar el color en oscuridad, durante 30 minutos. La reacción se detiene mediante la adición a cada pocillo de 50 |il de solución 4N de HCl antes de medir la absorbancia a 490 nm en un lector automatizado de ensayos ELISA (Bio-Tek instruments, Winooski, VT). Después son determinados los anticuerpos quiméricos unidos con respecto a un patrón de anticuerpos quiméricos irrelevante (que puede obtenerse de Scolgen,Ltd., Edinburg, Escocia).
Los anticuerpos pueden ser aislados desde los medios de cultivo celulares del modo siguiente. Los cultivos de transfectomas son adaptados a medio libre de suero. Para producir anticuerpos quiméricos, las células se hacen crecer en forma de un cultivo de 500 ml en frascos giratorios, usando HSFM. Los cultivos son centrifugados y se filtra el sobrenadante a través de una membrana de 0,2 micrómetros. El medio filtrado se hace pasar a través de una columna de proteína A (1 x 3 cm) con un caudal de 1 ml/min. La resina se lava luego con PBS, aproximadamente 10 volúmenes de columna, y el anticuerpo unido a la proteína A es eluído desde la columna con solución tampón 0,1 M de glicocola (pH 3,5) conteniendo EDTA 10 mM. Se recogen fracciones de 1,0 ml en tubos que contienen 10 |il de Tris 3 M (pH 8,6) y se determinan las concentraciones de proteína a partir de la absorbancia a 280/260 nm. Se reúnen las fracciones pico, se dializan frente a PBS y se concentra el anticuerpo, por ejemplo, con el Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA). La concentración de anticuerpo se determina mediante el ensayo ELISA, como antes, y se ajusta su concentración a 1 mg/ml, aproximadamente, usando PBS. Azida de sodio al 0,01% (p/v) es añadida convenientemente a la muestra como agente conservante.
La invención se describe adicionalmente mediante referencia a los ejemplos que siguen, que se proporcionan solamente para ilustración.
Ejemplos
Ejemplo 1. Clonación molecular y aclaración de las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de LL1
El gen V k de mLL1 se obtuvo por RT-PCR usando los cebadores VK5'-4 y VK1FOR según ha sido descrito por Leung et al., 1993 y Orlandi et al. (PNAS 86:3833-3837 (1989), respectivamente, y fue clonado en el vector de clonación pCR2.1 a T (Invitrogen). Varios clones fueron secuenciados para eliminar posibles errores resultantes de la reacción PCR. La mayoría de los clones (6) contenían una secuencia V k murina, idéntica, que fue designada LL1V k ; la secuencia se muestra en la Figura 1B. La comparación con otras secuencias V k del ratón reveló que el LL1V k es un miembro de la subclase II de la cadena ligera kappa.
Dado que la RT-PCR falló en proporcionar una secuencia completa que codificara el gen de VH del ratón, se empleó el segundo enfoque de clonación, la amplificación rápida de los extremos 5' de cDNA (5'-RACE) El cDNA ligado al adaptador, preparado partiendo de células de hibridoma de LL1 fue amplificado por PCR usando un cebador universal de anclaje (Life Technologies) y un cebador génico específico, CH-1B (Leung et al., 1994), que se reasocia a la región CH1 de las cadenas pesadas murinas. La especie principal de la PCR de ~650 bp, que resulto de la operación de PCR fue clonada en el vector de clonación pCR2.1AT y varios clones fueron secuenciados por secuenciación de DNA. El producto de PCR contenía una secuencia completa de VH (Figura 1A) flanqueada por las secuencias del péptido señal no codificante y de secreción en el extremo 5' y la secuencia codificante parcial para el dominio CH1 de la cadena y1. No se encontró mutación defectuosa dentro de la secuencia que codifica la VH, que fue designada LL1VH. La comparación de hLL1 VH con otras secuencias VH del ratón, reveló que pertenecía a un subgrupo diverso de las cadenas pesadas del ratón (Kabat et al., 1991). Por comparación de las secuencias de aminoácidos de LL1VH con los genes V de Ab murino de la base de datos de Kabat y siguiendo la definición de Kabat, fueron identificadas las regiones CDR de hLL1VH y Vk, indicadas en las Figuras 1A y B, respectivamente. Por comparación de las secuencias de aminoácidos de LL1VH y V k con los genes V de Ab murino de la base de datos de Kabat y siguiendo la definición de Kabat, fueron identificadas las regiones CDR de hLL1VH y Vk, como muestran las Figuras 1A y B, respectivamente.
Ejemplo 2. Construcción del vector de expresión para LL1 quimérico
Para evaluar la autenticidad del Fv clonado para LL1, se construyó y expresó un LL1 quimérico (célula). Los restos de nucleótidos 7-12 de LL1 Vk fueron modificados a un sitio de restricción Pvull, CAGCTG, por PCR con los cebadores LLIVK-Pvull y VK1FOR. El producto de PCR resultante se sometió a digestión con Pvull y BgIII (parcialmente, debido a la presencia de un sitio BgIII interior en la Vk) y clonado en un vector de armazón basado en un pBR327 (sometido a digestión con PvuII y BcII), VKpBR2, que contenía el mismo promotor Ig, la misma secuencia peptídica señal y los mismos sitios de restricción convenientes, para facilitar la ligación en el marco de lectura del producto de PCR VK, como ha sido usado por Orlandi et al., 1989 y Leung et al., 1994.
LL1 VK-Pvul I 5’-GAT GTT CAGCTG ACC CAA ACT CCA CTC TCC-3'
De modo semejante, las secuencias de nucleótidos en las posiciones 10-15 y 345-351 de LL1 VH fueron convertidas a Pstl y BstEll, respectivamente, por PCR con los cebadores LL1B-1 y LL1F-1. El producto de PCR VH fue sometido después a digestión con Pstl y BstEll y ligado en VHpBS2 digerido con Pstl y BstEll, un vector de armazón basado en pbluescript que contenía una secuencia de péptido señal y sitios de restricción convenientes para facilitar la ligación en el marco de lectura del producto de PCR VH (Orlandi, Gussow, et al., 1989741/id) modificado partiendo de VHpBS (Leung, S.O., Shevitz, J., Pellegrini, M.C., Dion, A.S., Shih, L.B., Goldenberg, D.M., y Hansen, H.J. (1994)).
LL1B-1 5'-CAG ATC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG-3’
LL1F-1 5'-GA GAC G G TG A C C A G ACT CCC TTG GCC CCA A-3’
Las secuencias de cLL1VH y Vk fueron confirmadas mediante secuenciación de DNA y se indican en las Figuras 2A y 2B, respectivamente.
El fragmento que contenía las secuencias de Vk de cLL1, junto con las secuencias de péptidos señal, fueron escindidas desde LLlVKpBR2 por doble digestión de restricción con Xbal y BamHl. Los fragmentos de Vk de ~ 550 bp fueron subclonados después en el sitio Kbal/BamHl del vector de expresión de mamífero pdHL2. El vector resultante fue denominado cLL1VkpdHL2. De modo semejante los fragmentos de aproximadamente 750 bp que contenían el LL1VH, junto con las secuencias de péptido señal, fueron escindidos partiendo del LL1VHpBS2 por digestión con Xhol y BamHl y aislados por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento fue subclonado en el sitio Xhol y Hindlll del cLL1VkpdHL2 con ayuda de un engarce comparable a ambos extremos BamHl y Hindlll, dando como resultado los vectores de expresión finales, denominados cLL1pdHL2.
Ejemplo 3. Transfección y expresión de cLL1.
Aproximadamente 30 |ig de cLLl pdHL2 fueron linearizados por digestión con Sall y transfectados en células Sp2/0-Ag14 por electroporación. Las células transfectadas fueron depositadas en una placa de 96 pocillos durante 2 días y después fueron seleccionadas por su resistencia a MTX. Los sobrenadantes de las colonias que sobrevivieron a la selección fueron monitorizados mediante el ensayo ELISA para determinar la secreción de anticuerpo quimérico. Los clones celulares positivos fueron expandidos y el cLL1 fue purificado a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad en una columna de Proteína A.
Ejemplo 4. Ensayos de actividad de unión
Se llevó a cabo un ensayo competitivo de unión de células para determinar la inmunorreactividad de cLL1 con respecto al mLL1 parental. Una cantidad constante de mLL1 marcado con 125I (100.000 cpm) se incubó con células Raji en presencia de concentraciones variables de cLL1 o mLL1, a 4°C durante 1-2 horas. Se determinó la radiactividad asociada con las células después de lavar. Como muestra la Figura 5, el anticuerpo cLL2 puso de manifiesto una actividad de unión comparable a la del mLL1, lo que confirmó la autenticidad de los genes V clonados.
Los resultados fueron confirmados mediante un segundo ensayo competitivo basado en citometría de flujo. Brevemente, usando células Raji como antes y variando la concentración de un anticuerpo respecto del otro, como antes, se determinó la cantidad de mLL1 ó cLL1 unida, con anticuerpos anti-Fc del ratón o anti-Fc humano, marcados con FITC, por análisis usando citometría de flujo.
Se llevó a cabo un ensayo ELISA de unión competitiva utilizando placas revestidas con membranas de células Raji, para determinar la inmunorreactividad de cLL1 con respecto a la de mLL1 parental. La fracción de las membranas de las células Raji se preparó por sonicación y centrifugación, Los extractos de membrana crudos fueron depositados por centrifugación en forma de capas, sobre placas de PVC de fondo plano. de 96 pocillos, y se fijaron con glutaraldehído al 0,1%. Una cantidad constante de mLL1 biotinilado mezclada con concentraciones variables de mLL1 ó cLL1 se añadió a los pocillos recubiertos con la membrana y se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Después de lavar se añadió estreptavidina conjugada con HRP y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de estreptavidina conjugada a HRP unida al mLL1 biotinilado unido a la membrana, fue revelada por lectura de la absorbancia en 490 nm después de la adición de una solución de sustrato que contenía dihidrocloruro de ortofenilenodiamina 4 mM y H2O2 al 0,04%.
Ejemplo 5. Elección de marcos de lectura humanos y diseño de secuencias para la humanización del anticuerpo monoclonal LL1
Por comparación de las secuencias del marco de lectura (FR) de la región variable (V) de cLL1 con las de los anticuerpos humanos de la base de datos de Kabat, se encontró que los FRs de cLL1VH y Vk ponían de manifiesto el grado máximo de homología de secuencias con las de los anticuerpos humanos RF-TS3 VH y HF-21/28 Vk, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos se muestran en las Figuras 3A y 3B y están comparadas con las secuencias de cLL1VH y Vk. Por consiguiente, los FRs de RF-TS3 VH y HF-21/28 Vk, y se seleccionaron FRs como los marcos de lectura humanos sobre los que las CDRs de LL1 VH y Vk, respectivamente, habían sido injertados. Sin embargo se usó la secuencia de FR4 de NEWM, en vez de la de RF-TS3 para reemplazar la secuencia de FR4 del RF-TS3 para la humanización de la cadena pesada de LL1. Véase la Figura 3A. Algunos restos de aminoácidos de los Frs de LL1, próximos a las CDRs putativas, estaban mantenidos en el hLL1 basándose en la pauta anteriormente descrita (Qu et al., Clin. Cancer Rec. 5: 3095s-3100s (1990). Estos restos son L46, F87 y Q100 de Vk (Figura 3B) y 136, K37, Q46, A68, F91 y S93 de VH (Figura 3A). Las Figuras 3A y 3B comparan las secuencias de aminoácidos de VH y VK humanas, quiméricas y humanizadas. Los puntos indican los restos de cLL1 y hLL1 que son idénticos a los restos correspondientes de las secuencias de VH y Vk humanas. Las secuencias de DNA y de aminoácidos de hLLIVH y Vk se muestran en las Figuras 4A y 4B, respectivamente.
Ejemplo 6. Síntesis génica/PCR de los genes V humanizados
Se usó una estrategia modificada, según ha sido descrito por Laung et al. (Laung et al., 1994), para construir los genes Vk y VH de hLL1 designados, usando una combinación de síntesis de oligonucleótidos largos y PCR, según ilustra la Figura 5. Para la construcción del dominio VH de hLL1 fueron sintetizados dos oligonucleótidos largos, hLL1VHA (176-mero) y hLL1VHB (165-mero). en un sintetizador de DNA automatizado (Applied Biosystems). La secuencia de hLL1VHA representa los nt 20 a 195 del dominio de hLL1VH.
5’- GGTCTGAGTT GAAGAAGCCT GGGGCC TCAG TGAAGGTTTC
CTGCAAGGCT TCTGGATACA CCTTCACTAA CTATGGAGTG AACTGGATAA
AGCAGGCCCC TGGACAAGGG CTTCAGTGGA TGGGCTGGAT AAACCCCAAC
ACTGGAGAGC CAACATTTGA TGATGACTTC AAGGGA-3*
La secuencia de hLL1VHB representa la cadena menos del dominio de hLL1VH, complementaria con relación a los nt 173 a 337:
5’- TCCCTTGGCC CCAATAAGCA AACCAGGCTT CGTTTTTACC CCTCGATCTT GAACAGAAAT ACACGGCAGT GTCGTCAGCC TTTAGGCTGC TGATCTGGAG ATATGCCGTG CTGACAGAGG TGTCCAAGGA GAAGGCAAAT CGTCCCTTGA AGTCATCATC AAATG-3’
Las secuencias del extremo 3'-terminal (22 restos de nucleótidos) de hLLIVHA y B son complementarias una de otra. En las condiciones de PCR definidas, los extremos 3' de hLL1VHA y B se hibridan por los extremos complementarios formando un DNA bicatenario corto flanqueado por el resto de los oligonucleótidos largos. Cada extremo hibridado sirve como cebador para la transcripción del DNA monocatenario, dando por resultado un DNA bicatenario compuesto de los nt 20 a 337 de hLL1VH. Este DNA fue amplificado después en presencia de dos oligonucleótidos cortos, hLL1VHBACK y hLL1VHFOR para formar el hLL1VH completo.
hLLl VHBACK 5’-GTG GTG CTG CAG CAA TCT GGG TCT GAG TTC AAG AAG CC -3’
hLLl VHFOR 5’-AAG TGG ATC CTA TAA TCA TTC CTA GGA TTA ATG-3 ’
Una cantidad mínima de hLL1 VHA y B (determinada empíricamente) fue amplificada en presencia de 10 |il de solución tampón de PCR 10x (KCl 500 mM, tampón de Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, MgCl2 15 mM), 2 |imol de hLL1VHBACK y hLL1VHFOR, y 2,5 unidades de DNA polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct). Esta mezcla de reacción se sometió a 3 ciclos de PCR que consistían en desnaturalización a 94°C durante 1 minuto, hibridación de ácidos nucleicos (reasociación) a 45°C durante 1 minuto, y polimerización a 72°C durante 1,5 minutos, seguido de 27 ciclos de PCR que consistían en desnaturalización a 94°C durante 1 minuto, hibridación de ácidos nucleicos a 55°C durante 1 minuto, y polimerización a 72°C durante 1 minuto. el producto para hLL1VH amplificado por PCR, bicatenario, fue purificado en gel, sometido a digestión con las enzimas de restricción Pstl y BstEll y clonado en los sitios Pstl/BstEll complementarios del vector de armazón de la cadena pesada, VHpBS2.
Para construir el DNA completo de la secuencia de Vk humanizada, fueron sintetizados según se ha descrito antes, el hLL1VKA (159-mero) y el hLL1VKB (169-mero). Los hLL1VKA y B fueron amplificados por dos oligonucleótidos cortos, hLLWKBACK y hLL1VKFOR, según se ha descrito anteriormente.
La secuencia de hLL1VHA representa los nucleótidos 16 a 174 del dominio de hLL1VH.
5 ’-CAGTCTCCAC TCTCCCTGCC CGTCACCCTT GGACAGCCGG CCTCCATCTC CTGCAGATCA AGTCAGAGCC TTGTAC ACAG AAATGGAAAC ACCTATTTAC ATTGGTTTCA GCAGAGGCCA GGCCAATCTC CAAGGCTCCT GATCTACACA GTTTCCAAC-3 *
La secuencia de hLL1VHB representa la cadena menos del dominio de hLL1VH complementaria de los nucleótidos 153 a 321.
5 ’ -TGTCCC AGC A CCGAACGTGG GAGGAACATG TGAACTTTGA
GAGCAGAAAT AAACCCCAAC ATCCTCAGCC TCCACCCTGC TGATTTTCAG
TGTGAAATCA GTGCCTGACC CACTGCCGCT GAATCTGTCT GGGACCCCAG
AAAATCGGTT GGAAACTGTG TAGATCAGG-3*
hLLl VKBACK 5’- GAT GTT CAG CTG ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG-
3’
hLLl VKFOR 5’- G TTA G A TC TC CAG TCG TGT CCC AGC ACC GAA CG-
3’
Los productos de PCR purificados en gel para hLLIVK fueron sometidos a digestión con las enzimas de restricción Pvull y Bgllll y clonados en los sitios Pvull/bcl complementarios del vector de armazón de las cadenas ligeras, VKpBR2. El vector de expresión, final, hLL1 pdHL2 fue construido subclonando secuencialmente los fragmentos Xbal-BamHl y Xhol/BamHi de hLL1Vk y VH, respectivamente, en el pdHL2 como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 7. Ensayos de transfección, expresión y actividad de unión de hLL1.
Los métodos de ensayos de expresión y de actividad de unión de hLL1 fueron los mismos descritos para cLL1.
Se desarrolló un ensayo ELISA de unión competitiva usando una placa revestida con extractos de membranas de células Raji, para determinar la inmunorreactividad de hLL1. Se preparó por sonicación y centrifugación una fracción de membranas de células Raji. Los extractos de membrana crudos fueron depositados como revestimientos, por centrifugación, en placas de pVc de fondo plano, de 96 pocillos, y se fijaron con glutaraldehído al 0,1%. Se añadió a los pocillos revestidos con membrana una cantidad constante del mLL1 biotinilado. mezclada con concentraciones variables de mLL1 ó cLL1, y se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Después de lavar se añadió estreptavidina conjugada con HRP y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, La cantidad de estreptavidina conjugada con HRP unida al muII biotinilado unido a las membranas, se reveló mediante lectura de la absorbancia en 490 nm después de añadir una solución de sustrato que contenía dihidrocloruro de ortofenilenodiamina 4 mM y H2O2 al 0,04%. Como muestran los ensayos de competición de la Figura 6, los anticuerpos mLL1 y cLL1 pusieron de manifiesto actividades de unión similares. Asimismo, los ensayos de competición de la Figura 7 mostraron que los anticuerpos hLL1 y cLL1 exhibían actividades de unión similares.
Ejemplo 8. Internalización de hLL1
Se usó un ensayo estándar de tratamiento de anticuerpos para evaluar la internalización y el metabolismo de hLL1 en células Raji (Hansen et al., 1996). Se incubaron células (107) en 1 ml de medio de cultivo de tejidos que contenía hLL1 o LL1 marcado con 125I (107 cpm) durante 1 hora a 37°C. Para asegurar la especificidad de unión del Ab se establecieron en todos los experimentos testigos de 1/10 del tamaño de la muestra (células, radiactividad y medio), con y sin exceso de Ab sin marcar (una concentración final de 100 |ig/ml). Después de incubar las uniones, se separó por lavado la radiactividad que no se había unido. Los testigos de especificidad fueron sometidos a recuento. En todos los experimentos la fijación de radiactividad a las células había sido bloqueada por el Ab sin marcar por lo menos en un 90%. Las células fueron resuspendidas luego en 30 ml de medio de nueva aportación y dispensadas en una placa de 24 pocillos con 1,5 ml/pocillo. Se guardaron muestras de 1,5 ml para determinar la radiactividad, que era la cuenta inicial de cpm. La placa se incubó en un incubador con CO2. A 3, 24, 48 y 72 horas, las células fueron recolectadas del modo siguiente. Se volvió a suspender las células pipeteando repetidamente y se hizo pasar a tubos cónicos. Los pocillos y la pipeta se enjuagaron con 1 ml de medio de cultivo de nueva aportación, que se añadió a la suspensión inicial de células recogida. El tubo se centrifugó durante 10 minutos a 600 x g y se recogió cuidadosamente 1 ml de sobrenadante (40% del sobrenadante total) para el recuento de radiactividad. Se añadió BSA como proteína de transporte hasta una concentración final de 1% y se precipitó la proteína con 5 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 10% (p/v), frío. Después de incubar durante 30 minutos a 4°C y centrifugar durante 15 minutos a 5000 x g, se desechó el sobrenadante y la proteína precipitada se sometió a recuento de radiactividad. La proteína radiomarcada que no había sido precipitada por TCA se consideró degradada, y la proteína radiactiva que precipitó se consideró intacta. El glóbulo de células se sometió a recuento de la radiactividad que permanecía en las células después de haber sido lavadas. La radiactividad de cada fracción se expresó como el porcentaje de la radiactividad unida inicialmente. Como muestra la Figura 8A, el hLL1 mostró una internalización rápida y un modo catabólico similares a los de LL1 murino después de unirse a la superficie de las células Raji, es decir, casi toda la radiactividad fijada estaba catabolizada y liberada en el sobrenadante al cabo de 3 horas. Esto es mucho más rápido que lo que ocurre con otros Abs de internalización, tales como el anti-CD22 y el anti-CD19 (Hansen et al., 1996). Los estudios con puntos de tiempo próximos confirmaron los esquemas similares de tratamiento de hLL1 y mLL1. La mayor parte del catabolismo se consiguió al cabo de 1 hora (Figura 8B).
Ejemplo 9. Citotoxicidad de hLL1
El efecto citotóxico de hLL1 se comparó con el de mLL1 y cLL1 en células Raji, una línea de células humanas de linfoma. Se usó Ab específico, de cabra, anti-fragmento Fc de IgG humana, (a-hFc) como el agente de entrecruzamiento para hLL1 y cLL1, y se usó Ab específico, de cabra, anti-Fc de IgG del ratón (a-mFc) para mLL1. 5 x 105 células Raji fueron sembradas el día 0 en 1 ml de medio de cultivo que contenía 5 |ig/ml de Ab LL1 y 50 |ig/ml del agente de entrecruzamiento apropiado. Los números de células totales y viables se contaron diariamente durante 3 días. Como indica la Figura 9, el número total de células Raji normales había aumentado 4-5 veces en 3 días y la viabilidad de las células permanecía >80% al término del tercer día. Las células tratadas con agente de entrecruzamiento solo, un Ab LL1 solo, o un Ab LL1 con un agente de entrecruzamiento incomparable (por ejemplo, hLL1 y Ab específico, de cabra, anti-Fc de IgG del ratón), no podían distinguirse de las células Raji normales. Sin embargo, una combinación de hLL1 y Ab, específico de anti-Fc de IG humana., causó, efectivamente, muerte celular: >40% de disminución de la viabilidad celular en un día y casi la muerte celular total en 3 días. La efectividad del hLL1 era comparable con la del mLL1 y el cLL1. Resultados similares se observaron al usar células Daudi (Figura 10). No se observó tal efecto con otro Ab de internalización, el hLL2 (Ab anti-CD22, humanizado). Estos resultados demostraron que el efecto de citotoxicidad del hLL1 sobre líneas celulares de linfoma, depende específicamente del entrecruzamiento del Ab sobre la superficie celular.

Claims (98)

REIVINDICACIONES
1. - Un anticuerpo anti-CD74, humanizado, humano, quimérico o murino, o uno de sus fragmentos, que comprende las CDRs de la región variable de las cadenas ligeras de un mAb anti-CD74, murino o humano, que comprenden: la CDR1, que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3, que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT; y que comprende las CDRs de la región variable de las cadenas pesadas de un mAb anti-CD74, murino o humano, que comprenden: la CDR1, que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2, que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3, que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
2. - El anticuerpo anti-CD74, humanizado, humano, quimérico o murino, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo anti-CD74 o su fragmento se usa como un anticuerpo desnudo para el tratamiento de una enfermedad maligna que expresa CD74.
3. - El anticuerpo anti-CD74, humanizado, humano, quimérico o murino, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo anti-CD74 o su fragmento se usa como un anticuerpo desnudo para el tratamiento de una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de injertos de órganos o de enfermedad de injerto contra huésped.
4. - El anticuerpo según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 humanizado, o uno de sus fragmentos, que comprende las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que comprenden las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un mAb anti-CD74 murino (mLL1) y las regiones de marco de lectura (FR) de un anticuerpo humano, en el que la región variable de las cadenas ligeras de dicho mAb humanizado comprende las CDRs de la región variable de las cadenas ligeras de un mAb anti-CD74 murino que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de las cadenas pesadas de dicho mAb humanizado comprende las CDRs de la región variable de las cadenas pesadas de un mAb anti-CD74 murino que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
5. - El mAb anti-CD74 humanizado, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 4, en la que dichos FRs de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de dicho anticuerpo humanizado, comprenden al menos un aminoácido sustituido procedente de dichos FRs correspondientes de dicho mAb murino.
6. El mAb anti-CD74 humanizado, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 5, en la que dicho aminoácido procedente de dicho mAb murino está seleccionado entre el grupo que consiste en los restos de aminoácidos 2, 3, 4, 46, 87 y 100 de la región variable de las cadenas ligeras murinas de la secuencia de cLLIVk de la Fig. 3B, y en los restos de aminoácidos 5, 37, 38, 46, 68, 91 y 93 de la región variable de las cadenas pesadas murinas de la secuencia de cLLIVH de la Fig. 3A.
7. - El mAb anti-CD74 humanizado, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 4, en la que dicho mAb o su fragmento comprende la región variable de las cadenas pesadas de la Fig. 4A y la región variable de las cadenas ligeras de la Fig. 4B.
8. - El mAb anti-CD74 humanizado, o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho mAb o su fragmento comprende, además, la región constante de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo humano o una de sus partes.
9. - El mAb anti-CD74 humanizado, o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho mAb o su fragmento es una IgG1 humanizada.
10. - El anticuerpo según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 quimérico (cCD74), o uno de sus fragmentos, que comprende la región variable de las cadenas ligeras de un mAb anti-CD74 murino, que comprende las CDRs: CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS , y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y la región variable de las cadenas pesadas de un mAb anti-CD74 murino, que comprende las CDRS: CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
11. - El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 quimérico (cCD74), o su fragmento, según la reivindicación 1, que comprende las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que comprenden las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un mAb anti-CD74 murino y las regiones de marco de lectura (FR) de un mAb anti-CD74 murino y las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo humano.
12. - Un mAb anti-CD74 quimérico, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 11, que comprende la región variable de las cadenas pesadas de la Fig.2A y la región variable de las cadenas ligeras de la Fig. 2B.
13. - El mAb anti-CD74 quimérico, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 11, en la que dicho mAb o su fragmento es una IgG1 quimérica.
14. - El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD74 humano (huCD74), o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 1, que comprende las regiones variables y constantes de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo humano, en el que dichas CDRs del huCD74, de la región variable de las cadenas ligeras del mAb humano anti-CD74, comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de las cadenas pesadas de dicho mAb humano comprende las CDRs de la región variable de las cadenas pesadas de un mAb murino anti-CD74, que comprenden: la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
15. - El mAb anti-CD74 humano, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 14, en la que dicho mAb o su fragmento es una IgG1 humana.
16. - Un mAb anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende al menos una de las siguientes propiedades:
(a) la unión de dicho mAb o su fragmento a CD74 es bloqueada por un anticuerpo o su fragmento, específico de CD74;
(b) dicho mAb o su fragmento es internalizado por células Raji de linfoma en cultivo; y
(c) dicho mAb o su fragmento induce apoptosis de células Raji en cultivos celulares cuando se somete a reacción cruzada con antisuero de cabra reactivo con Fc de un mAb IgG1 murino.
17. - Un mAb anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el fragmento es F(ab')2, Fab, scFv, Fv o una construcción de fusión que utiliza parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas de F(ab')2, Fab, scFv, o Fv, y en el que dicho fragmento se une a CD74.
18. - El mAb anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, o uno de sus fragmentos, según la reivindicación 17, en el que dicha proteína de fusión es polivalente, o polivalente y multiespecífica.
19. - Un mAb anti-CD74, humano, quimérico o humanizado, o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que las regiones constantes de la IgG1 están reemplazadas con regiones constantes humanas de IgG2a, IgG3 o IgG4 humanas.
20. - El anticuerpo según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-CD74 murino, o uno de sus fragmentos, que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un mAb murino anti-CD74 (mLLI) y las regiones de marco de lectura (FR) de un anticuerpo anti-CD74 murino, en el que la región variable de las cadenas ligeras de dicho mAb murino comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSQSLVHRNGNTYLH, la CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos TVSNRFS, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SQSSHVPPT, y en el que la región variable de las cadenas pesadas de dicho mAb murino comprende la CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos NYGVN, la c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINPNTGEPTFDDDFKG, y la CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SRGKNEAWFAY.
21. - Una proteína de fusión de anticuerpos que comprende cuatro o más Fvs, o Fab's de los mAbs o sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20.
22. - Una proteína de fusión de anticuerpos que comprende uno o más Fvs, o Fab's de los mAbs o sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, y uno o más Fvs o Fab's procedentes de anticuerpos específicos para un marcador de células tumorales que no es el antígeno CD74.
23. - La proteína de fusión de anticuerpos según la reivindicación 22, en la que dicho marcador de células tumorales está seleccionado entre un antígeno del linaje de células B.
24. - La proteína de fusión de anticuerpos según la reivindicación 23, en la que dicho marcador de células tumorales es un antígeno seleccionado entre el grupo que consiste en CD19, CD20 y CD22.
25. - La proteína de fusión de anticuerpos según la reivindicación 22, en la que dicho marcador de células tumorales es un antígeno seleccionado entre el grupo que consiste en HLA-DR, CD30, CD33, CD52, MUC1 y TAC.
26. - Un conjugado inmunoconjugado, que comprende un componente de anticuerpo que comprende al menos un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, que se une a CD74, en el que dicho componente de anticuerpo está ligado a un agente terapéutico o de diagnóstico.
27. - El uso de al menos un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, o un inmunoconjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno.
28. - El uso según la reivindicación 27, en el que dicha enfermedad o dicho trastorno es una enfermedad maligna que expresa CD74.
29. - El uso según la reivindicación 27, en el que dicha enfermedad o dicho trastorno está seleccionado entre el grupo que consiste en una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de injerto de órganos y una enfermedad de injerto contra huésped.
30. - El uso de un anticuerpo desnudo anti-CD74, humanizado, humano o quimérico, o uno de sus fragmentos, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, en el que la enfermedad o el trastorno está seleccionado entre el grupo que comprende una enfermedad maligna que expresa CD74 y una enfermedad autoinmunitaria, y el anticuerpo anti-CD74 se usa solo.
31. - El uso según la reivindicación 28 ó 30, en el que dicha enfermedad maligna que expresa CD74 está seleccionada entre el grupo que consiste en un tumor sólido, un linfoma no de Hodgkin, un linfoma de Hodgkin, un mieloma múltiple, otra enfermedad maligna de células B y una enfermedad maligna de células T.
32. - El uso según la reivindicación 31, en el que dicho tumor sólido está seleccionado entre el grupo que consiste en melanoma, carcinoma y sarcoma.
33. - El uso según la reivindicación 32, en el que dicho carcinoma está seleccionado entre el grupo que consiste en un carcinoma renal, un carcinoma pulmonar, un carcinoma intestinal, un carcinoma estomacal y un melanoma.
34. - El uso según la reivindicación 31, en el que dicha enfermedad maligna de células B está seleccionada entre el grupo que consiste en linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, formas indolentes de linfomas de células B, formas agresivas de linfomas de células B, leucemias linfáticas crónicas, leucemias linfáticas agudas y mieloma múltiple.
35. - El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 27 - 34, en el que dicho mAb o su fragmento, o su proteína de fusión de anticuerpos, se administra por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular, en una dosis de 20-2000 mg.
36. - El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 35 en la extensión que se refiere a cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, que comprende, además, administrar al menos un agente terapéutico o de diagnóstico.
37. - El uso según la reivindicación 36, en el que dicho mAb o su fragmento, se administra antes, durante o después de administrar al menos un agente terapéutico.
38. - El uso según la reivindicación 37, en el que dicho agente terapéutico está seleccionado entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un inmunomodulador, una hormona, un agente citotóxico, una enzima y un anticuerpo conjugado a, por lo menos, un inmunomodulador, un radioisótopo, una enzima, una hormona, un agente citotóxico, un oligonucleótido antisentido, o una de sus combinaciones.
39. - El uso según la reivindicación 38, en el que dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina.
40. - El uso según la reivindicación 38, en el que dicho inmunomodulador está seleccionado entre el grupo que consiste en una citoquina, un factor de crecimiento de células pluripotentes, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias, un interferón, una eritropoyetina, una trombopoyetina, o una de sus combinaciones.
41. - El uso según la reivindicación 40, en el que dicho factor hematopoyético es una interleuquina seleccionada entre el grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 y una de sus combinaciones.
42. - El uso según la reivindicación 40, en el que dicha linfotoxina es un factor de la necrosis tumoral.
43. - El uso según la reivindicación 40, en el que dicho interferón está seleccionado entre el grupo que consiste en un alfa-interferón, un beta-interferón y un gamma-interferón.
44. - El uso según la reivindicación 40, en el que dicho factor estimulante de colonias es el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de las colonias de macrófagos (GM-CSF).
45. - El uso según la reivindicación 38, en el que dicho anticuerpo está seleccionado entre el grupo que consiste en un mAb o uno de sus fragmentos, reactivo con CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUCI, tenascina, Ia, HM1.24 y HLA-DR, formulado en el seno de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
46. - El uso de una composición terapéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para preparar un medicamento para tratar una enfermedad maligna positiva al antígeno CD74, distinta de linfoma o leucemia.
47. - El uso según la reivindicación 46, en el que dicho mAb o su fragmento, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, se administra por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular, en una dosis de 20-2000 mg.
48. - El uso según la reivindicación 46, en el que mAb o su fragmento, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, se administra antes, durante o después de administrar al menos un agente terapéutico utilizado para tratar la enfermedad maligna.
49. - El uso según la reivindicación 48, en el que el agente terapéutico comprende un anticuerpo, un inmunomodulador, una hormona, un agente citotóxico, una enzima, un radioisótopo y un anticuerpo conjugado a, por lo menos, un inmunomodulador, una enzima, un marcador radiactivo, una hormona, un oligonucleótido antisentido, o un agente citotóxico, o una de sus combinaciones.
50. - El uso según la reivindicación 49, en el que dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina.
51. - El uso según la reivindicación 49, en el que dicho inmunomodulador está seleccionado entre el grupo que consiste en una citoquina, un factor de crecimiento de células pluripotentes, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias, un interferón, una eritropoyetina, una trombopoyetina, o una de sus combinaciones.
52. - El uso según la reivindicación 51, en el que dicho factor hematopoyético es una interleuquina seleccionada entre el grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, y una de sus combinaciones.
53. - El uso según la reivindicación 51, en el que dicha linfotoxina es un factor de la necrosis tumoral.
54. - El uso según la reivindicación 51, en el que dicho interferón está seleccionada entre el grupo que consiste en un alfa-interferón, un beta-interferón y un gamma-interferón.
55. - El uso según la reivindicación 51, en el que dicho factor estimulante de colonias es el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de las colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF).
56. - El uso según la reivindicación 49, en el que dicho anticuerpo está seleccionado entre el grupo que consiste en un mAb o uno de sus fragmentos reactivo con un marcador tumoral distinto de CD74, expresado por las células que comprenden la enfermedad maligna que está siendo tratada, formulado en el seno de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
57. - El uso de una composición terapéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un mAb o su fragmento, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para preparar un medicamento para tratar a un sujeto aquejado de al menos una enfermedad diagnosticada como una enfermedad de desarreglo inmunitario y una enfermedad autoinmunitaria.
58. - El uso según la reivindicación 57, en el que dicho mAb o su fragmento, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, se administra por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular, en una dosis de 20-2000 mg.
59. - El uso según la reivindicación 57 ó 58, en el que el mAb o su fragmento, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, se administra antes, durante o después de administrar por lo menos un agente terapéutico utilizado para tratar la enfermedad.
60. - El uso según la reivindicación 59, en el que el agente terapéutico comprende un anticuerpo, una enzima, un inmunomodulador, una hormona, un agente citotóxico y un anticuerpo conjugado a, por lo menos, un inmunomodulador, un marcador radiactivo, una hormona, una enzima, un agente citotóxico, un oligonucleótido antisentido, o una de sus combinaciones.
61. - El uso según la reivindicación 60, en el que dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina.
62. - El uso según la reivindicación 60, en el que dicho inmunomodulador está seleccionado entre el grupo que consiste en una citoquina, un factor de crecimiento de células pluripotentes, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias, un interferón, una eritropoyetina, una trombopoyetina. o una de sus combinaciones,
63. - El uso según la reivindicación 62, en el que dicho factor hematopoyético es una interleuquina seleccionada entre el grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21 y una de sus combinaciones.
64. - El uso según la reivindicación 62, en el que dicha linfotoxina es un factor de la necrosis tumoral.
65. - El uso según la reivindicación 62, en el que dicho interferón está seleccionado entre el grupo que consiste en un alfa-interferón, un beta-interferón y un gamma-interferón.
66. - El uso según la reivindicación 62, en el que dicho factor estimulante de colonias es el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de las colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF).
67. - El uso según la reivindicación 60, en el que dicho anticuerpo está seleccionado entre el grupo que consiste en un mAb o uno de sus fragmentos, reactivo con CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, B7, MUCI, Ia, HM1.24, tenascina y un dímero maduro de HLA-DR, formulado en el seno de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
68. - El uso de una composición terapéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que al menos un agente terapéutico ha sido ligado a un mAb o su fragmento, o a los Fvs o Fab's de su proteína de fusión de anticuerpos, por conjugación química o por fusión genética, para preparar un medicamento para el tratamiento de una de las enfermedades seleccionada entre el grupo que consiste en linfomas, leucemias, otras enfermedades malignas que expresan CD-74, una enfermedad autoinmunitaria, y una de sus combinaciones.
69. - El uso según la reivindicación 68, en el que dicho agente terapéutico comprende un inmunomodulador, un marcador radiactivo, una hormona, una enzima o un agente citotóxico.
70. El uso según la reivindicación 69, en el que dicho agente citotóxico es un fármaco o una toxina.
71. - El uso según la reivindicación 69, en el que dicho inmunomodulador está seleccionado entre el grupo que consiste en una citoquina, un factor de crecimiento de células pluripotentes, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias, un interferón, una eritropoyetina, una trombopoyetina, o una de sus combinaciones.
72. - El uso según la reivindicación 71, en el que dicho factor hematopoyético es una interleuquina seleccionada entre el grupo de IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, y una de sus combinaciones.
73. - El uso según la reivindicación 71, en el que dicha linfotoxina es un factor de la necrosis tumoral.
74. - El uso según la reivindicación 71, en el que dicho interferón está seleccionado entre el grupo que consiste en un alfa-interferón, un beta-interferón y un gamma-interferón.
75. - El uso según la reivindicación 71, en el que dicho factor estimulante de colonias es el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de colonias de granulocitos- macrófagos (GM-CSF).
76. - El uso de al menos un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en el que un agente de diagnóstico ha sido ligado al mAb o su fragmento, de los Fvs o Fab's de su proteína de fusión de anticuerpos, por conjugación química, para fabricar una composición de diagnóstico que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y dicho al menos un mAb o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en el que un agente de diagnóstico ha sido ligado por conjugación química al mAb o uno de sus fragmentos, de los Fvs o Fab's de su proteína de fusión de anticuerpos, para diagnosticar una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en linfomas, leucemias, otras enfermedades malignas que expresan CD-74, una enfermedad autoinmunitaria, y una de sus combinaciones, la composición diagnóstica.
77. - El uso según la reivindicación 76, en el que dicho agente de diagnóstico es un radioisótopo en el que los fotones del radioisótopo son detectados por escintilación radiográfica, o PET.
78. - El uso según la reivindicación 76, en el que el agente de diagnóstico es un metal que puede ser detectado por MRI.
79. - El uso según la reivindicación 76, en el que el agente de diagnóstico es un liposoma o un liposoma lleno de gas, y en el que el liposoma puede ser detectado mediante un dispositivo de exploración con ultrasonidos.
80. - Una vacuna que comprende el enlace covalente de mAbs o sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, a péptidos antigénicos de clase I ó clase II de MHC, formando un conjugado de anticuerpos.
81. - Una vacuna según la reivindicación 80, en la que los péptidos antigénicos de clase I o clase II, son liberados por digestión proteolítica por una célula que presenta antígeno, de un péptido mayor o de una proteína ligada a dicho mAb o su fragmento.
82. - La vacuna según las reivindicaciones 80 u 81, en la que el conjugado de anticuerpo se prepara fusionando el cDNA que codifica el mAb o uno de sus fragmentos, con el cDNA que codifica el péptido antigénico o proteína antigénica, y expresando la proteína de fusión en una célula bacteriana, de levadura o de mamífero.
83. - Un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, en el que los mAbs o sus fragmentos, o sus proteínas de fusión de anticuerpos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, están ligados a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico de un marcador de una célula cancerosa o una célula inflamatoria, un epítopo sobre la superficie de un organismo productor de una enfermedad infecciosa, o una sustancia nociva existente en la sangre o en otro fluido corporal.
84. - Una secuencia de DNA que comprende un ácido nucleico que codifica un mAb o uno de sus fragmentos, seleccionado entre el grupo que consiste en:
(a) un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20;
(b) un inmunoconjugado según la reivindicación 26;
(c) una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, que comprende al menos dos de dichos mAbs anti-CD74 o sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20;
(d) una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 21-25.
(e) una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 80-82; y
(f) un anticuerpo biespecífico o multiespecífico según la reivindicación 83.
85. - Un vector de expresión que comprende la secuencia de DNA según la reivindicación 84.
86. - Un vector de expresión según la reivindicación 85, en la que el vector es pdHL2 o GS.
87. - Un vector de expresión según la reivindicación 86, en la que el vector pdHL2 o GS, cuando se usa para expresar una IgG quimérica, humanizada o humana, codifica las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras y la región de la rótula de IgG1.
88. - Una célula huésped que comprende la secuencia de DNA según la reivindicación 84.
89. - Una célula huésped según la reivindicación 88, en la que dicha célula es una célula bacteriana, de levadura o de mamífero.
90. - Una célula huésped según la reivindicación 89, en la que dicha célula de mamífero es una célula linfocítica.
91. - Una célula huésped según la reivindicación 90, en la que dicha célula linfocítica es una célula de mieloma.
92. - Un método para la expresión de un mAb anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una de sus proteínas de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, que comprende:
(a) transfectar una célula huésped con una secuencia de DNA según la reivindicación 84; y
(b) cultivar dicha célula que secreta dicho mAb anti-CD74, o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión o uno de sus fragmentos.
93. - El método según la reivindicación 92, en el que dicha célula huésped es derivada de células bacterianas, de levadura o de mamífero.
94. - Un anticuerpo anti-CD74 desnudo o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de antibióticos desnuda o uno de sus fragmentos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, para usar en el tratamiento de un trastorno o una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en una enfermedad maligna que expresa CD74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de un injerto de órganos, y una enfermedad de injerto contra huésped.
95. - Un conjugado terapéutico que comprende un anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que dicho anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, está unido a, por lo menos, un agente terapéutico para usar en el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad seleccionados entre el grupo que consiste en una enfermedad maligna que expresa CD74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de un injerto de órganos, y una enfermedad de injerto contra huésped.
96. - Un conjugado terapéutico que comprende un anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que dicho anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, está unido a, por lo menos, un agente terapéutico para usar en el diagnóstico de una enfermedad maligna que expresa CD74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de un injerto de órganos, una enfermedad de injerto contra huésped o una de sus combinaciones.
97. - Un conjugado terapéutico que comprende un anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que dicho anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, está unido a, por lo menos, un agente terapéutico para usar en el tratamiento de un trastorno o de una enfermedad seleccionados entre el grupo que consiste en una enfermedad maligna que expresa CD74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de un injerto de órganos, y una enfermedad de injerto contra huésped.
98.- Un conjugado de diagnóstico que comprende un anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, o un inmunoconjugado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que dicho anticuerpo anti-CD74 o uno de sus fragmentos, o una proteína de fusión de anticuerpos o uno de sus fragmentos, está unido a, por lo menos, un agente terapéutico para usar en el diagnóstico de una enfermedad maligna que expresa CD74, una enfermedad de desarreglo inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria, de rechazo de un injerto de órganos, una enfermedad de injerto contra huésped, o una de sus combinaciones.
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