CN1981868A - 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用 - Google Patents

抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了治疗血液恶性肿瘤(包括B细胞淋巴瘤和白血病或非血液实体瘤)的联合疗法，包括施用抗细胞因子抗体或拮抗剂，抑制在维持B细胞激活中起作用的细胞因子的活性。这些抗体和拮抗剂，特别是抗－IL10抗体和拮抗剂的施用，尤其可用于避免或降低血液恶性肿瘤细胞或实体瘤细胞对化疗剂和抗－CD20或抗－CD22抗体的抗性。本发明也提供对涉及B细胞的实体瘤的联合治疗，包括施用抗细胞因子抗体和B细胞消耗性抗体，如RITUSAN。

Description

抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗-CD20 在B细胞淋巴瘤治疗中的联合应用
发明领域
本发明涉及应用抗细胞因子剂(如抗体和拮抗剂)治疗血液恶性肿瘤(包括B细胞淋巴瘤和白血病)的方法，其中导向的细胞因子通过刺激血液恶性肿瘤细胞(包括B淋巴瘤和白血病细胞)在疾病过程中起增强作用。已经发现抗细胞因子剂治疗联合其它已知疗法(如化学治疗和施用治疗用抗体)具有协同作用。
本发明也涉及通过施用细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂，联合抗B细胞靶标(如CD20)抗体治疗，对非血液(非淋巴)实体瘤(如结肠直肠癌或肝癌)的治疗，这些肿瘤的特征在于涉及B细胞。
发明背景
脊椎动物(例如灵长类动物，包括人、猿、猴等)的免疫系统由大量器官和细胞型组成，它们已经进化为：精确、特异地识别侵入脊椎动物宿主的外源微生物(“抗原”)；特异结合这些外源微生物；消灭/破坏这些外源微生物。淋巴细胞以及其它细胞型对于免疫系统和消灭和破坏外源微生物十分关键。淋巴细胞在胸腺、脾和骨髓(成人)中产生，约占人体(成人)循环系统中存在的总白细胞的30％。淋巴细胞有两个主要亚群：T细胞和B细胞。T细胞负责细胞介导的免疫，而B细胞负责抗体产生(体液免疫)。然而，可以认为T细胞和B细胞是相互依赖的——在典型免疫应答中，当T细胞受体结合与抗原递呈细胞表面的主要组织相容性复合物(“MHC”)糖蛋白结合的抗原片段时，T细胞被激活；这种激活导致生物介质(“白介素”或“细胞因子”)释放，根本上刺激B细胞分化并产生抗该抗原的抗体(“免疫球蛋白”)。
宿主内的每个B细胞都在其表面表达不同的抗体——因而一个B细胞将表达对一种抗原特异的抗体，而另一个B细胞将表达对不同抗原特异的抗体。因此，B细胞高度多样性，这种多样性对于免疫系统至关重要。在人类，每个B细胞能产生大量抗体分子(即，约107-108个)。当外源抗原被中和时，这种抗体产生一般停止(或者大大降低)。然而有时候，特定B细胞的增殖将持续不减弱；这种增殖可导致称为“B细胞淋巴瘤”的癌症。
非何杰金氏淋巴瘤是一种特征在于B淋巴细胞恶性生长的淋巴瘤。根据美国癌症协会所说，估计诊断有54000例新病例，其中65％被分类为中度或重度淋巴瘤。被诊断为中度淋巴瘤的患者平均存活2-5年，被诊断为重度淋巴瘤的患者在诊断后平均存活6个月至2年。
常规治疗包括化学治疗和放射治疗，如果有合适的供体，并且骨髓在收获后含有太多的肿瘤细胞，也可能同时进行自体或异体骨髓或干细胞移植。患者通常对常规治疗起反应，但常常在几个月内复发。
治疗非何杰金氏淋巴瘤的一种相对较新的方法是用抗癌B细胞表面上蛋白质的单克隆抗体治疗患者。该抗体可以与毒素或放射性标记物偶联，从而在结合后导致细胞死亡。此外，也可以用人恒定区构建抗体，使得在抗体结合后产生人抗体效应机制，导致细胞凋亡或死亡。
Rituximab(IDEC Pharmaceuticals Corporation)是为治疗B细胞淋巴瘤，特别是非何杰金氏淋巴瘤发展的新一代单克隆抗体之一。Rituximab是一种遗传工程抗一CD20单克隆抗体，含有鼠轻链和重链可变区和人γI重链和к轻链恒定区。Rituximab在固定补体和介导ADCC方面比它的鼠亲代更加有效，它在人补体存在下介导CDC。该抗体抑制B细胞系FL-18、Ramos和Raji细胞生长，使化学抗性人淋巴瘤细胞系对白喉毒素、蓖麻毒素、CDDP、多柔比星和表鬼臼毒吡喃葡糖苷敏感，并且以剂量依赖的方式诱导DHL-4人B细胞淋巴瘤系的凋亡。
然而，许多患者难以用Rituximab治疗和化学治疗治愈或在之后复发。因此，为了增加缓解病情的机会，降低淋巴瘤患者的复发率，仍然需要可与Rituximab治疗或化学治疗联合的淋巴瘤治疗方法。
许多研究小组建议使用细胞因子治疗多种类型的癌症。例如，Wang等人建议，细胞因子“对肿瘤细胞有直接毒性”，证明白介素-1α(IL1α)增强了抗肿瘤药物在体外对几种人类肿瘤细胞的抗肿瘤作用(Int.J.Cancer(1996年11月27日)68(5)：583-587)。Bonvida等人公开了细胞因子能“提高化疗剂的效能”，证明重组肿瘤坏死因子和化疗剂顺铂对卵巢癌细胞有协同作用(Gynecol.Oncol.(1990年9月)38(3)：333-339)。美国专利号5,716,612描述了IL-4可用于增强化疗剂在癌症治疗中的作用。
然而，一些研究小组也认为，细胞因子在某些癌症的发展中也可能起有害作用。例如，已知白介素-6(IL6)在某些情况下有抑制白血病细胞凋亡的能力。(参见Yonish-Rouach等人，野生型p53诱导髓样白血病细胞凋亡，并被白介素-6抑制。Nature 352：345-347(1991))。最近表明，IL6可能在某些白血病细胞对抗癌化疗剂的抗性中起作用，在体外，抗-IL6抗体增强了顺铂-抗性K562细胞对顺铂诱导的凋亡的敏感性。(参见Dedoussis等人，内源白介素6赋予K562人白血病细胞系对顺-二氨二氯铂介导的凋亡的抗性)。
对于IL10也假定对B细胞有增强作用，曾经报道IL10的产生在来自B细胞淋巴瘤的一些细胞系中上调(参见Cortes等人，非何杰金氏淋巴瘤中的白介素-10。Leuk Lymphoma 26(3-4)：251-259(1997年7月))。然而，当检测NHL患者血清IL10水平与预后之间的相关性时，由位于EB病毒(EBV)基因组中的同源开放阅读框BCFR1产生的病毒IL10水平更加重要。实际上，另一个研究小组大约同时报道了IL10是EBV感染的淋巴瘤细胞的一种自分泌生长因子。(参见Beatty等人，IL10参与EBV转化的B细胞系的自发生长。J.Immunol.158(9)：4045-51(1997年5月1日))。此外，其他小组假定巨噬细胞产生IL6和IL10在淋巴细胞疾病发病中起关键作用。(参见美国专利号5,639,600)。
也曾经报道，IL10可以与IL6、IL2和TNF-α联合作用，增强非何杰金氏淋巴瘤细胞的增殖。(参见Voorzanger等人，非何杰金氏淋巴瘤细胞在体内产生白介素-(IL)10和IL6，作为协同生长因子。Cancer Res.56(23)：5499-505(1996年12月1日))。在NHL患者中也观察到统计学上显著高于对照组的水平的IL2、IL6、IL8、IL10、可溶性IL2受体、可溶性转铁蛋白受体和新蝶呤，尽管没有发现具有预后意义的单一参数。(参见Stasi等人，细胞因子和可溶性受体值在新诊断为非何杰金氏淋巴瘤的患者中的临床意义。Eur.J.Haemotol.54(1)：9-17(1995年1月))。
然而，有许多文献报道提示，细胞因子如IL10显示与疾病进展无关，这些细胞因子实际上可能有助于对抗淋巴瘤而不是促进该疾病。例如，当Nonnefoix等人检测10种细胞因子(IL2、IL3、IL4、IL6、IL10、IL13、G-CSF、GM-CSF、干扰素α和干扰素γ)调节不同组织亚型的B-非何杰金氏淋巴瘤细胞自发增殖反应的能力时，该研究小组发现，根据样品不同，每一种细胞因子可能是抑制性或刺激性的，不同组织亚型之间没有相关性。实际上，美国专利号5,770,190(在此引用作为参考)建议与化疗剂联合施用IL10作为对急性白血病的治疗。
如果能够设计增加抗细胞因子抗体的治疗方案，使这些抗体能用来提高B淋巴瘤细胞对其它类型治疗药物的敏感性，对淋巴瘤患者将是有利的。如果施用抗细胞因子抗体，可避免或克服淋巴瘤患者的B淋巴瘤细胞对化疗剂的抗性，并且增强治疗用抗体的凋亡活性，那将是特别有用的。这些联合治疗方案将增加对淋巴瘤患者可用的治疗方法方法，并且可能降低这些患者的复发率。
发明目的
本发明的一个目的在于提供一种避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞或非血液实体瘤细胞对至少一种化疗剂的抗性的方法，包括在施用至少一种化疗剂之前、同时或之后，对诊断患有血液恶性肿瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
本发明的一个更具体的目的在于提供一种避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞对治疗剂诱发的凋亡的抗性的方法，包括对诊断患有血液恶性肿瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗在化学治疗后复发的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗用化学疗法难以治愈的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗在治疗用抗体治疗后复发的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗用治疗用抗体难以治愈的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗B细胞淋巴瘤患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的抗-CD20抗体，同时或以任何顺序连续施用抗细胞因子抗体。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗其中B细胞引发促肿瘤(pro-tumor)反应的非血液(非淋巴)实体瘤的方法，包括施用抗细胞因子抗体，如抗-IL10抗体，和至少一种B细胞消耗性(depleting)抗体，如抗-CD20抗体。
本发明的一个更具体的目的在于提供一种治疗涉及消化系统的非淋巴实体瘤(特别是结肠直肠癌或肝癌)的方法，包括施用抗细胞因子抗体，优选抗-IL10抗体，和B细胞消耗性抗体，特别是消耗性抗-CD20抗体。
发明概述
第一方面，本发明涉及抗细胞因子抗体和细胞因子拮抗剂，特别是IL10抗体，与化疗药物和/或治疗用抗体的联合施用，以提高血液恶性肿瘤(如B细胞淋巴瘤和白血病)或非血液实体瘤(如乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌等)患者的反应速率和反应持续时间。因此，本发明涉及通过对血液恶性肿瘤(如B细胞淋巴瘤和白血病)患者施用抗B细胞受体抗体和干扰某些细胞因子作用的抗体或拮抗剂，治疗血液恶性肿瘤(如B细胞淋巴瘤或白血病)的方法。特别是，本发明涉及施用启动B淋巴瘤细胞凋亡的B细胞标志抗体，如抗-CD20、抗-CD22、抗-CD40、抗-CD23、抗-CD19、抗-CD37和下文所述其它抗体，和可干扰凋亡的细胞因子的抗体或拮抗剂，如抗-IL10。也涉及联合治疗方案，其包括也受益于抗细胞因子治疗的其它治疗，即化学治疗。这些方法将特别用于治疗血液恶性肿瘤(如B淋巴瘤或白血病)患者，其特征在于细胞变得对化疗剂和治疗用抗体有抗性。
第二方面，本发明提供治疗涉及B细胞(但非B细胞来源)的非血液(非淋巴)实体瘤，特别是其中B细胞引发促肿瘤反应的癌症的新方法，包括施用抗细胞因子抗体，如IL10，结合B细胞特异性抗体治疗，特别是B细胞消耗性抗体，优选CD20抗体治疗，任选地结合放射治疗或化学治疗。这些实体瘤的例子包括：结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、食道癌等。合适的化学治疗在下文讨论。这些癌症可包括癌前期、I期和II期癌和晚期癌，例如II期之后，包括已经转移的实体瘤。
发明详述
第一方面，本发明包括避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞(包括如B淋巴瘤和白血病细胞)对至少一种化疗剂的抗性的方法，包括对诊断患有B细胞淋巴瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
血液恶性肿瘤患者B细胞的这种抗性通常通过一种或多种细胞因子刺激致瘤B细胞介导，使这些细胞对凋亡信号没有反应。在这种情况下，本发明的方法可以描述为避免、降低或克服这些致瘤B细胞对凋亡抗性的方法，化疗剂是可以诱发凋亡的试剂的实例。也包括抗B细胞表面靶标的治疗用抗体，如抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD40、抗-CD28和下文所述的其它B细胞靶标。
因为通常只有患者在治疗剂第一次治疗后复发或难以治愈之后，B细胞抗性是明显的，本发明的方法常常包括治疗在化学治疗或治疗用抗体治疗后复发或难以治愈的血液恶性肿瘤(如B细胞淋巴瘤或白血病)患者。然而，本发明的抗细胞因子抗体和拮抗剂也可与其它治疗联合或在其它治疗之前用于新诊断为淋巴瘤的患者，以降低复发机会，并增加对治疗反应的长短和持续时间。
本发明的方法适于治疗多种血液恶性肿瘤，特别是B细胞淋巴瘤和白血病，包括但不限于：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、慢性白细胞白血病、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、髓性白血病和早幼粒细胞白血病。本领域技术人员应当明白，由于分类系统的改变，这些淋巴瘤通常有不同的名称，按不同名称分类的淋巴瘤和白血病患者也可受益于本发明的联合治疗方案。
例如，欧洲和美国病理学家最近提出的一种分类系统称为修订的欧美淋巴瘤(REAL)分类法。该分类系统能区别套细胞淋巴瘤和缘细胞淋巴瘤等外周B细胞瘤，并将一些分类根据细胞学分成不同等级，即，小细胞、混合小细胞和大细胞、大细胞。应当理解，所有这些分类的淋巴瘤可受益于本发明的联合治疗。
美国国家癌症研究所(NCI)将一些REAL类别分为在临床上更有用的“静止性”或“侵入性”淋巴瘤命名。静止性淋巴瘤包括滤泡型细胞淋巴瘤(分为不同的细胞学“等级”)，弥漫型小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(CLL)、淋巴浆细胞样/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、缘区淋巴瘤和多毛细胞白血病。侵入性淋巴瘤包括弥漫型混合和大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/弥漫型小无裂细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和AIDS-相关淋巴瘤。需要的只是，由于施用抗细胞因子抗体或拮抗剂，对治疗的反应程度增强或持续时间延长。但是这些方法最优选地是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者，在此，发明者惊奇地发现，施用抗细胞因子抗体和拮抗剂具有协同作用。由于细胞因子的作用和有害细胞因子的种类在不同患者和不同淋巴瘤类型中可能不同，不同细胞因子对B淋巴瘤细胞抗性的作用可能随不同化疗剂和免疫治疗剂而不同，所以建议在对患者施用抗细胞因子治疗之前检测个体患者中各种细胞因子的水平。
第二方面，本发明提供一种治疗其中B细胞引发蛋白质反应(促进肿瘤生长和/或转移)的非血液实体瘤的方法，包括施用抗细胞因子抗体，如抗-IL10抗体，和B细胞靶标抗体，优选具有B细胞消耗活性的抗-CD20抗体。然而，本发明也包括下文所述其它B细胞靶标的抗体的应用。该方面也包括化学治疗和/或放射治疗的其它应用。
已经有多种化疗剂用于不同癌症类型的治疗，本发明的方法将避免、降低或克服恶性(例如淋巴瘤)细胞对至少一种(但可能是几种)这类化疗剂的抗性。特别是，可能受益于补充抗细胞因子治疗的化学治疗包括但不限于：CHOP、ICE、米托蒽醌、阿糖胞苷、DVP、ATRA、伊达比星、hoelzer化疗方案、La La化疗方案、ABVD、CEOP、2-CdA、FLAG&IDA随后进行或不进行G-CSF治疗、VAD、M&P、C-Weekly、ABCM、MOPP、DHAP、甲氨蝶呤、多柔比星、柔红霉素、他莫昔芬、托瑞米芬和顺铂。其它化疗剂在下文优选实施方案部分描述。
可能有多种细胞因子单独地或与其它细胞因子一起在血液或非血液恶性肿瘤(包括白血病和淋巴瘤疾病)中起有害的刺激作用。因此，根据患者和疾病，一种以上的抗细胞因子抗体或拮抗剂可能作为补充治疗有益于特定患者。这些细胞因子包括但不限于IL2、IL6、IL10和TNF-α。其它合适的细胞因子在下文优选实施方案中描述。对于非何杰金氏淋巴瘤，优选的抗细胞因子治疗包括抗-IL10治疗。
本领域周知的几种抗-IL10抗体可用于本发明。美国专利号5,871,725描述了一种命名为19F1的大鼠抗人抗体。美国专利号5,837,293中描述了另一种抗-IL10抗体α-IL10。Tim R.Mosmann等人，“利用固相放射免疫吸附测定分离IL-4、IL-5、IL-6和新Th2-特异细胞因子(IL-10)、细胞因子合成抑制因子特异的单克隆抗体”The Journal of Immunology，145(9)：2938-2945，1990年11月1日也描述了抗-IL10抗体。拮抗剂可以是竞争受体结合的蛋白质形式，例如，缺乏激活受体的能力，但阻断IL-10结合，或IL-10结合分子，如抗体。术语抗体应理解为包括抗体片段以及整个抗体，即Fab、Fab2和Fv片段。可以用人IL-10免疫另一种动物分离抗体，然后可用本领域周知的方法人源化，以降低它们在对人类患者施用后的免疫原性。
抗细胞因子抗体的适宜剂量取决于针对的细胞因子，个体患者中初步血清分布的结果，所治疗的淋巴瘤类型和疾病阶段。对于新诊断的轻度非何杰金氏淋巴瘤治疗中使用的抗-IL10抗体，优选剂量可以是0.001-100mg/kg，优选地约0.1-100mg/kg，最优选地约0.4-20mg/kg体重，取决于抗体是与另一种治疗剂同时还是在它之前施用。优选地，与化疗剂或其它治疗同时或在它之前施用抗细胞因子抗体，一般在约1小时之前到大约1个月之前，优选地在施用化疗剂或其它药剂前1-7天内。
本发明也包括完成公开的方法的试剂盒。根据本发明的一种试剂盒包含至少一种抗细胞因子抗体或拮抗剂，它们可以容易地与药学可接受的载体混合或重悬浮，并方便地注射到淋巴瘤患者中。如果优选地在施用抗细胞因子抗体或拮抗剂之前检测淋巴瘤患者血清的细胞因子分布，该试剂盒可以还或者作为替代方式含有检测患者血清中多种细胞因子相对含量的试剂和材料。
本发明也包括治疗血液恶性肿瘤(如B细胞淋巴瘤和白血病)的联合治疗方法，包括对血液恶性肿瘤患者施用治疗有效量的治疗用抗体，同时或以任何顺序连续施用抗细胞因子抗体。治疗用抗体被定义为可与血液恶性肿瘤细胞(如致瘤B细胞)表面上的受体结合，并在结合后介导其破坏或消耗的抗体，即，抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22、抗-CD21、抗-CD23、抗-CD37和下文所述的其它B细胞靶标。本发明的抗细胞因子剂由于阻断细胞因子介导的致瘤B细胞增殖而单独具有一定的有益作用，但与抗细胞因子剂联合施用治疗用抗体将具有协同作用，因为反应持续时间和/或程度将好于独立使用的两种治疗的加和作用。
不希望束缚于下列理论，发明者认为，同时施用本发明的抗细胞因子剂所见到的协同作用与通常具有抑制凋亡作用的靶向细胞因子的抑制有关。因此，当本发明的抗细胞因子剂与通过诱发凋亡起作用的药剂(例如，抗-CD20、抗-CD22、抗-CD19、抗-CD21、抗-CD23或抗-CD40抗体)联合使用时，联合施用显示优于单独使用药剂的加和作用的协同作用。
然而，这不排除在与凋亡不促进其效能的其它抗体或治疗剂的联合治疗中使用本发明的抗细胞因子抗体和拮抗剂。例如，放射标记抗体通过与B细胞表面结合并发出致死剂量的辐射促进肿瘤细胞的破坏。这些抗体，以及与毒素偶联的抗体，也可以与本发明的抗细胞因子剂联合使用。优选的放射标记抗体用钇-[90](90Y)标记。一种特别优选的放射标记抗体是Zevelin(IDEC PharmaceuticalsCorporation)，它是与90Y偶联的抗-CD20抗体。
本发明的联合治疗方法还可包括至少一种化疗剂或方案的应用，这些化学治疗包括，例如：CHOP、ICE、米托蒽醌、阿糖胞苷、DVP、ATRA、伊达比星、hoelzer化疗方案、La La化疗方案、ABVD、CEOP、2-CdA、FLAG&IDA随后进行或不进行G-CSF治疗、VAD、M&P、C-Weekly、ABCM、MOPP、DHAP、多柔比星、顺铂、柔红霉素、他莫昔芬、托瑞米芬和甲氨蝶呤，以及下文所述的其它化疗剂。治疗非何杰金氏淋巴瘤患者的一种优选化疗方案是CHOP。抗细胞因子抗体或拮抗剂优选地在B细胞靶标抗体(例如抗-CD20、CD22、CD19或CD40)和/或化学治疗之前施用，使得在施用B细胞治疗剂之前抑制靶向细胞因子引起的B淋巴瘤细胞的增殖。如上所述，靶向细胞因子可以是IL2、IL6、IL10或TNF-α，取决于治疗前患者的细胞因子分布，但靶向细胞因子优选地是IL10。
如上所述，本发明的治疗用抗体可以是针对B细胞表面表达的分子的任何抗体，特别是具有B细胞消耗活性的抗体。下文列出了合适的B细胞靶标的清单。
根据患者和疾病程度，抗B细胞靶标结合抗体，例如Rituximab，可以以0.01-约100mg/kg、更优选地约0.1-50mg/kg、最优选地约0.4-20mg/kg体重的剂量施用。在包括抗细胞因子剂的联合治疗方案中有效剂量可以降低，因为B淋巴瘤细胞的增殖能力将降低。另外，有效剂量将取决于选择的抗细胞因子治疗，和患者血清中增强性细胞因子的相对水平。
本发明的联合疗法也适于治疗多种淋巴瘤，包括但不限于：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、慢性白细胞白血病、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、髓性白血病和早幼粒细胞白血病。优选的靶向疾病是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，特别是轻度滤泡型NHL。另外，在施用抗细胞因子抗体或拮抗剂之前检测淋巴瘤患者血清的细胞因子分布也是有用的。
如上所述，此处所述联合治疗，特别是抗细胞因子抗体(如抗-IL10)和抗B细胞靶抗体(如抗-CD20)的联合使用也可用于治疗非血液(非淋巴)实体瘤，包括，例如：结肠直肠癌、肝癌和其它消化系统癌症、乳腺癌、食道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和睾丸癌。这些癌症可处于早期、中期或晚期，例如已转移。
本发明也包括用于按照公开的方法施用治疗用抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂的试剂盒。试剂盒可含有一种以上的治疗用抗体和一种以上的抗细胞因子剂。试剂盒也可含有用于在施用治疗用抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂之前检测细胞因子分布的试剂和材料。
如上所述，本发明进一步包括非淋巴实体瘤的治疗，包括施用抗细胞因子抗体，如抗-IL10抗体，和B细胞特异性抗体，优选地具有基本B细胞消耗活性的抗体，如RITUXAN。曾经报道，一些实体瘤显然涉及B细胞。也就是说，B细胞以某种方式参与促进或保持致瘤状态，并且可以阻止身体免疫防御系统对抗这种肿瘤。对此，WO020864 A1(在此引用作为参考，确定Biocrystal Inc.为申请人)描述了利用靶向B细胞的抗体(包括Rituxan)对非淋巴实体瘤的治疗。其中报道，这种治疗导致明显的抗肿瘤反应，甚至在晚期结肠直肠癌、肺癌和肝癌患者中。
相反，本发明提供一种改进的联合疗法，其中利用一种抗细胞因子抗体(如抗-IL10抗体)和B细胞消耗性抗体(如抗-CD20抗体)治疗非淋巴实体瘤。
这种联合方案提供了一种治疗实体瘤(特别是涉及B细胞，但B细胞本身不是癌细胞的实体瘤)的增强方法。在该方案中，细胞因子拮抗剂，例如抗细胞因子抗体，和B细胞消耗性抗体，如Rituxan，将分开或一起按任何顺序施用。
另外，该方案可以包括应用放射治疗，例如外波(externalbeam)照射、全身照射、放射免疫治疗或化学治疗。下文描述了合适的化学治疗。放射免疫治疗可以包括用能结合实体瘤表达的靶标的放射标记抗体治疗。
一般在B细胞消耗抗体之前施用抗细胞因子抗体。预期这种联合治疗将适于治疗涉及B细胞的任何实体瘤。实体瘤的适当例子以前已经描述。一个重要实例是结肠直肠癌。
在本实施方案中，将施用B细胞消耗性抗体和细胞因子，使其向实体瘤部位输送。优选地，在肿瘤部位附近或直接在该部位注射抗体，例如在肿瘤附近的静脉处静脉内注射。
这种联合方案导致实体瘤(如肺癌或结肠直肠癌)缓解或收缩。
优选实施方案详述
为了进一步描述优选实施方案和本发明的全部范围，提供下列定义。
I.定义
“细胞因子拮抗剂”是可抑制或阻断细胞因子(例如白介素或干扰素或另一种细胞因子)表达和/或活性的化合物。
“B细胞表面标志”或“B细胞靶标”或“B细胞抗原”在此是指B细胞表面表达的一种抗原，它能用与之结合的拮抗剂靶向。代表性B细胞表面标志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志。特别重要的B细胞表面标志与哺乳动物的其它非B细胞组织相比在B细胞上优先表达，并且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一个实施方案中，该标志，如CD20或CD19，在谱系由干细胞阶段分化直到最终分化为浆细胞之前的整个过程中存在于B细胞上。此处优选的B细胞表面标志是CD19和CD20。
“CD20”抗原是在外周血或淋巴器官中90％以上的B细胞表面上发现的一种-35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在前B细胞发育早期表达，保持到浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制性抗原”和“Bp35”。例如在Clark等人，PNAS(USA)82：1766(1985)中描述了CD20抗原。“CD19”抗原是指一种-90kDa抗原，例如可被HD237-CD19或134抗体识别(Kiesel等人，Leukemia Research 11，12：1119(1987))。类似于CD20，CD19在谱系由干细胞阶段分化直到最终分化为浆细胞之前的整个过程中存在于细胞上。拮抗剂与CD19的结合可引起CD19抗原的内化。
“血液恶性肿瘤”包括与血流中的细胞有关的任何恶性肿瘤。其实例包括B和T细胞淋巴瘤、白血病，包括但不限于：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、buky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、慢性白细胞白血病、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、髓性白血病和早幼粒细胞白血病。本领域技术人员应当明白，由于分类系统不同(如前所述)，这些淋巴瘤通常有不同的名称，按不同名称分类的淋巴瘤和白血病患者也可受益于本发明的联合治疗方案。
非血液(非淋巴)实体瘤是指涉及B细胞，即B细胞参与“促肿瘤”反应的非血液恶性肿瘤。这些实体瘤的特征在于可触及的肿瘤，一般至少直径0.5mm，更典型地至少直径1.0mm。其实例包括：结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌等。这些癌症可处于早期(癌前期)、中期(I期和II期)或晚期，包括已经转移的实体瘤。这些实体瘤优选地是B细胞引发促肿瘤反应的癌症，即B细胞的存在参与肿瘤发展、保持或转移。
B细胞“拮抗剂”是指一种分子，它在与B细胞表面标志结合后，例如通过降低或防止B细胞引发的体液反应，破坏或消耗哺乳动物的B细胞，和/或干扰一种或多种B细胞功能。拮抗剂优选地能消耗用它治疗的哺乳动物的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种消耗可通过多种机制实现，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，B细胞增殖的抑制和/或B细胞死亡的诱导(例如通过凋亡)。本发明范围内包括的拮抗剂包括能与B细胞标志结合的抗体、合成或天然序列肽和小分子拮抗剂，任选地与细胞毒性剂偶联或融合。优选的拮抗剂包括抗体，更优选地是B细胞消耗性抗体。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞裂解。介导ADCC的主要细胞——NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页的表3中。为了估计目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337所述。可用于这种测定的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，也可在体内估测目的分子的ADCC活性，例如使用动物模型，如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)所公开的。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应细胞功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII，并行使ADCC效应细胞功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；PBMC和NK细胞是优选的。
术语“Fc受体”或“FCR”用于描述可与抗体Fc区结合的受体。
优选的FcR是一种天然序列人FcR。而且，一种优选的FcR可结合IgG抗体(一种γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和其它剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活受体”和)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有类似的氨基酸序列，区别主要在于胞质域。激活受体FcγRIIA在胞质域含有免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在胞质域中含有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Hass等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)综述了FcR。此处的术语“FCR”包括其它FcR，包括将来鉴定的。该术语也包括新生受体FcRn，它负责母亲IgG向胎儿的转移(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。
“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”是指一种分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体系统的第一种成分(Clq)结合与同源抗原复合的分子(例如抗体)，起始补体激活途径。为了估计补体激活，可以进行CDC测定，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)所述。
“生长抑制”拮抗剂可阻止或降低表达一种可与拮抗剂结合的抗原的细胞增殖。例如，拮抗剂可以阻止或降低B细胞的体外和/或体内增殖。
“诱导凋亡”的拮抗剂是可诱导例如B细胞的程序性死亡的那些拮抗剂，这可用标准凋亡试验测定，如膜联蛋白V的结合，DNA的破碎，细胞收缩，内质网膨胀，细胞破碎，和/或膜泡的形成(称为凋亡体)。
术语“抗体”在此最广义地使用，具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的生物活性。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；diabody；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是约150 000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间，二硫键数量不同。每条重链和轻链也含有一定间距的链内二硫键。每条重链在一端含有一个可变域(VH)，随后是许多恒定域。每条轻链在一端含有一个可变域(VL)，在另一端含有一个恒定域；轻链的恒定域与重链的恒定域对准，轻链的可变域与重链的可变域对准。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成一个界面。
术语“可变”是指抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同，用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变域中并非平等分布。它集中于轻链和重链可变域中被称为超变区的三个片段中。可变域的更加高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域每个含有4个FR，大多采用β-折叠构型，通过三个超变区连接，形成与β折叠结构连接的环，有时形成β折叠结构的一部分。每条链的超变区通过FR与另一个链的超变区紧密邻接在一起，有助于形成抗体的抗原结合部位(参见Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示不同的效应物功能，如抗体参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两条相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每条含有一个抗原结合部位)，和剩余的“Fc”片段，该名称反映它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，它具有两个抗原结合部位，仍能交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区域包含紧密非共价结合的一条重链和一条轻链可变域的二聚体。该构型中每个可变域的三个超变区相互作用，在VH-HL二聚体表面上确定了一个抗原结合部位。概括起来，六个超变区为抗体提供抗原结合特异性。然而，甚至一个可变域(或者只含抗原特异的三个超变区的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合部位。
Fab片段也含有轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CHI)。Fab’片段不同于Fab片段，在重链CHI域的羧基端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是此处对恒定区的半胱氨酸残基含有至少一个游离巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段对产生，在片段之间含有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也周知。
来自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据恒定域的氨基酸序列，能够归类为两种截然不同的类型之一，称为kappa(к)和lambda(λ)。
根据重链恒定域的氨基酸序列，抗体能被归为不同的类型。完整的抗体有5个主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分为亚型(同种型)，例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同抗体类型的重链恒定域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型众所周知。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段含有抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽在VH和VL域之间还含有一个多肽接头，它使scFv能形成抗原结合所希望的结构。scFv的综述参见Pluckthun的《单克隆抗体药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编写，Springer-Verlag，纽约，269-315(1994)。
术语“diabody”是指含有两个抗原结合部位的小抗体片段，该片段在同一多肽链(VH-VL)中含有一个与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。利用一个因太短而不能使同一条链上的两个域配对的接头，使该域与另一条链的互补域配对，产生两个抗原结合部位。例如在EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中详述了diabody。
术语“单克隆抗体”在此使用时是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即该群体的抗体除了可能较少出现的自然发生的突变之外相同。单克隆抗体高度特异，针对一个抗原部位。而且，与一般包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每种单克隆抗体只针对抗原上的一种决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优点还在于通过杂交瘤培养合成，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”是指抗体从基本上同质的抗体群体获得的特征，不应视为需要用任何特殊方法产生。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以利用Kohler等人，Nature 256：495(1975)第一次描述的杂交瘤法制备，或者可以利用重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以利用如Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离。
此处的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定种或属于特定抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一个种或属于另一抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们显示希望的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。此处的目的嵌合抗体包括“灵长类动物化”抗体，其含有来自非人类灵长类动物(例如旧世界猴，如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体超变区的残基被替换为来自非人类物种(如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的超变区的残基(供体抗体)，具有希望的特异性、亲和力和能力。有时，人类免疫球蛋白的构架区(FR)残基被替换为相应的非人类残基。此外，人源化抗体还可含有在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。为了进一步精修抗体的性能进行这些修饰。总之，人源化抗体含有至少一个，一般两个可变域的基本上全部，其中所有或基本上所有超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环，所有或基本上所有FR具有人类免疫球蛋白序列。人源化抗体任选地也至少含有免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，一般是人类免疫球蛋白的。进一步的详述参见Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
术语“超变区”在此使用时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区含有来自“补体决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重链可变域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“超变环”的残基(例如轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是不同于此处所述超变区残基的可变域残基。“可结合”目的抗原(如B细胞表面标志)的拮抗剂能够以足够的亲和力和/或亲合力结合该抗原，使得该拮抗剂可用作针对表达该抗原的细胞的治疗剂。
可结合CD20抗原的抗体的例子包括：“C2B8”，现在称为“rituximab”(“RITUXAN”)(美国专利号5,736,137，在此引用作为参考)；钇-[90]标记的2138鼠抗体，命名为“Y2B8”(美国专利号5,736,137，在此引用作为参考)；任选地用1311标记的鼠IgG2a“131”，产生“1311-B1”抗体(BEXXARTM)(美国专利号5,595,721，在此引用作为参考)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press等人，Blood 69(2)：584-591(1987))；“嵌合2H7”抗体(美国专利号5,677,180，在此引用作为参考)；可从国际白细胞分型会获得的单克隆抗体L27、G28-2、93-1133、B-C1或NU-B2(Valentine等人，《白细胞分型III》，McMichael编写，第440页，牛津大学出版社(1987))。可结合CD19抗原的抗体的例子包括Hekman等人，CancerImmunol.Immunother.32：364-372(1991)和Vlasveld等人，Cancer Immunol.Immunother.40：37-47(1995)中的抗-CD19抗体，和Kiesel等人，Leukemia Research 11，12：1119(1987)中的B4抗体。
术语“rituximab”或“RITUXAN”在此是指抗CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利号5,736,137中命名为“C2B8”，在此引用作为参考。该抗体是一种IgG，к免疫球蛋白，含有鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列。Rituximab对CD20抗原有大约8.0nM的结合亲和力。
“分离的”拮抗剂是指从其天然环境成分中鉴定、分离和/或回收的拮抗剂。天然环境的污染成分是干扰拮抗剂诊断或治疗用途的物质，可包括：酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，拮抗剂将被纯化为(1)大于95％重量的拮抗剂，最优选地大于99％重量，利用Lowry法测定，(2)利用转杯式测序仪足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE经考马斯蓝或者优选地银染显示均质。分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂，因为拮抗剂自然环境中的至少一种成分将不存在。然而，分离的拮抗剂通常通过至少一个纯化步骤制备。用于治疗的“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜、动物园动物、运动动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施。需要治疗的动物包括已经患有疾病的以及将要预防疾病的动物。因此，哺乳动物可能已诊断为患病或可能易患疾病。
表述“治疗有效量”是指可有效预防、改善或治疗所述自身免疫病的拮抗剂的量。术语“免疫抑制剂”在此用于辅助治疗时是指用于抑制或遮蔽所治疗的哺乳动物免疫系统的物质。包括可抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或遮蔽MHC抗原的物质。
这些试剂的实例包括：2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077，其内容在此引用作为参考)；硫唑嘌呤；环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(遮蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，如糖皮质类固醇，例如强的松、甲基强的松龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体，抗肿瘤坏死因子-α抗体，抗肿瘤坏死因子-β抗体，抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；全T抗体，优选地抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公开的WO 90/08187)；链激酶；TGF-O；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等人，美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等人，Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature，341：482(1989)；WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)，如TLOB9。
术语“细胞毒性剂”在此使用时是指可抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(如I131、Y90、Ar211、P32、Re188、Re186、Sm153、B212等)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，或其片段。
“化疗剂”是可用于癌症治疗的化学化合物。化疗剂的例子包括：烷化剂，如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；氮丙啶和甲基吐根胺(amelamine)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化双氯乙基甲胺、美法仑、新氮芥(novembiehin)、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、久莫霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、idambicin、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁多柔比星、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄氨、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡醛内酯；aldophosphamide糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；nitracrine；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；podophyllinic acid；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；鲕格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOLO，Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(TAXOTEW，Rh6ne-Pulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；navelbine；三羟基蒽醌；替尼泊甙；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；capecitabine；和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义也包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体产生的，作为细胞间介质作用于另一种细胞的蛋白质的通称。细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-o；mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-P；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-o；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导(osteoinductive)因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在此使用时，术语细胞因子包括自然来源或来自重组细胞培养的蛋白质，和天然序列细胞因子的生物活性相当物。
术语“前体药物”在本申请中使用时是指药学活性物质的前体或衍生形式，与亲本药物相比，它对肿瘤细胞的细胞毒性较低，并且能被酶促激活或者转化为更有活性的亲本形式。参见，例如，Wihnan，“癌症化学治疗中的前体药物”Biochemical Society Transactions，14，375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人，“前体药物：定向药物输送的一种化学方法”《定向药物输送》，Borchardt等人(编写)，247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于：含磷酸盐的前体药物、含硫代磷酸盐的前体药物、含硫酸盐的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺的前体药物、含任选地取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选地取代的苯基乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物，它们能转化为更有活性的细胞毒性游离药物。能衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述化疗剂。
“脂质体”是由多种类型的脂类、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，它可用于向哺乳动物输送药物(如此处公开的拮抗剂，和任选地化疗剂)。脂质体的成分通常以双层结构排列，类似于生物膜的脂类排列。术语“包装插页”用来指治疗产物商品包装中通常包含的说明书，包括关于适应证、用法、剂量、施用、禁忌症的信息和/或关于使用这些治疗性产物的警告。
II.拮抗剂的产生
本发明的生产方法和产品使用或加入可结合B细胞表面标志的拮抗剂和/或细胞因子。因此，此处将描述生产这些拮抗剂的方法。用于生产或筛选拮抗剂的B细胞表面标志或细胞因子可以是例如含有希望的表位的可溶性抗原或其部分。作为替代，或另外，在细胞表面表达B细胞表面标志的细胞能用来生产或筛选拮抗剂。本领域技术人员知道可用于生产拮抗剂的B细胞表面标志的其它形式。优选地，B细胞表面标志是CD19或CD20抗原。优选地，细胞因子是IL-10。
尽管优选的拮抗剂是抗体，但此处也涉及抗体之外的拮抗剂。例如，拮抗剂可包括任选地与细胞毒性剂(如此处所述)融合或偶联的小分子拮抗剂。为了鉴定可结合该抗原的小分子，可以针对目的B细胞表面标志筛查小分子文库。可以根据拮抗性质进一步筛选小分子，和/或与细胞毒性剂偶联。
拮抗剂也可以是通过合理设计或噬菌体展示产生的肽(参见，例如，1998年8月13日公开的WO98/35036)。在一个实施方案中，选择的分子可以是根据抗体的CDR设计的“CDR模拟物”或抗体类似物。虽然这些肽可被其本身拮抗，但任选地可将肽与细胞毒性剂融合，以添加或增强该肽的拮抗性质。
下面描述了用于生产根据本发明使用的抗体拮抗剂的典型技术。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选地通过对动物多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂产生。可以利用双功能剂或衍化剂，如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，偶联相关抗原与在所免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。动物用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫，方法是将例如100pg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂组合，在多个部位皮内注射该溶液。一个月后，通过在多个部位皮下注射初始量1/5-1/10的肽或偶联物与弗氏完全佐剂，加强动物。7-14天后，动物放血，测定血清的抗体效价。加强动物直到效价稳定。优选地，用与不同蛋白质偶联的同一抗原和/或通过不同交联剂的偶联物加强动物。偶联物也能作为融合蛋白在重组细胞培养中制备。聚集剂(如明矾)也适用于增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体从基本上同质的抗体群体中获得，即，该群体的各种抗体除可能少量存在的自然发生的突变之外相同。因此，修饰语“单克隆”是指抗体不是不同抗体混合物的性质。例如，单克隆抗体可以利用Kohler等人，Nature 256：495(1975)第一次描述的杂交瘤技术制备，或者可以通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，诱导产生或能产生可特异结合免疫用蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，也可以在体外免疫淋巴细胞。然后应用合适的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞[Goding，《单克隆抗体：原理与实践》，59-103页(Academic Press，1986)]。
这样制备的杂交瘤细胞接种于合适的培养基中生长，其中优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基一般含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合的，支持选择的抗体产生细胞稳定、高水平地产生抗体，并且对培养基(如HAT培养基)敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如可从Salk InstituteCell Distribution Center，San Diego，California USA获得的来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，和可从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也曾描述了人骨髓瘤和小鼠人杂骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体生产[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，《单克隆抗体生产技术和应用》，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
测定培养杂交瘤细胞的培养基中抗该抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力例如可通过Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)所述的Scatchard分析法测定。
在确定可产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法亚克隆这些克隆，并通过标准方法培养(Goding，《单克隆抗体：原理与实践》，59-103页(AcademicPress，1986))。适用于该目的的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞也可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。
这些亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中适当分离。
编码单克隆抗体的DNA利用常规方法(例如，利用能特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可容易地分离并测序。杂交瘤细胞用作该DNA的优选来源。分离后，DNA可置于表达载体中，然后转染宿主细胞，如不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)和Phickthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，能利用McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)所述的技术从抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了利用噬菌体文库对鼠和人抗体的分离。以后的文章描述了应用链改组(shuffling)以及联合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Ac ids Res.21：2265-2266(1993))，产生高亲和力(nM级)人抗体(Marks等人，BioTechnology，10：779-783(1992))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的有效备选技术。
DNA也可以修饰，例如，用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或者共价连接免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。一般用这些非免疫球蛋白多肽代替抗体的恒定域，或者代替抗体的一个抗原结合部位的可变域，产生一种嵌合双价抗体，其含有一个具有抗原特异性的抗原结合部位和另一个具有不同抗原特异性的抗原结合部位。
(iii)人源化抗体
人源化非人类抗体的方法在本领域中已经描述。优选地，人源化抗体中引入一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“引入(import)”残基，一般来自“引入”可变域。人源化基本上能按照Winter及其同事(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))的方法进行，是用超变区序列代替人类抗体的相应序列。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中大大少于完整人类可变域部分被替换为来自非人类物种的相应序列。实际上，人源化抗体一般是人类抗体，其中一些超变区残基，或许一些FR残基被替换为来自啮齿类动物抗体类似位点的残基。
用于生产人源化抗体的人类可变域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性极其重要。根据所谓的“最佳拟合(best-fit)”法，对已知人类可变域序列的完整文库筛查啮齿类动物抗体的可变域序列。然后用最接近啮齿类动物的人类序列作为人源化抗体的人类构架区(FR)(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用特定轻链或重链亚型的所有人类抗体的共有序列衍生的特定构架区。几种不同的人源化抗体可以使用相同的构架(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))。
人源化抗体保持高度的抗原亲和力和其它有利的生物学性质是十分重要的。为了达到这一目的，按照一种优选方法，利用亲代和人源化序列的三维模型，通过对亲代序列和不同概念人源化产物的分析方法，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般可以获得，为本领域技术人员所周知。可以获得图形显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。观察这些图示可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合抗原能力的残基。这样，能从受体引入序列中选择并结合FR残基，以获得希望的抗体特性，如提高的靶抗原亲和力。超变区残基通常直接并最充分地参与影响抗原结合。
(iv)人类抗体
作为人源化的备选，可以生产人类抗体。例如，现在能生产在免疫后能产生全套人类抗体而不产生内源免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失使内源抗体产生被完全抑制。这种种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因排列的转移导致在抗原攻击后产生人类抗体。参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。或者，也能用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))由未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全部成分(repertoire)在体外生产人类抗体和抗体片段。按照该技术，将抗体V域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，在噬菌体颗粒表面展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能性的选择也导致选择编码显示这些性质的抗体的基因。因此，该噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示能用多种方式进行；综述参见，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in StructuralBiology 3：564-571(1993)。V基因片段的几种来源能用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)从来自免疫小鼠脾脏的V基因小随机组合文库中分离了不同排列的抗唑酮抗体。能够构建来自未免疫的人类供体的V基因全部成分，并能基本上按照Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术，分离抗不同排列抗原(包括自身抗原)的抗体。参见，美国专利号5,565,332和5,573,905。人类抗体也可由体外激活的B细胞产生(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
(v)抗体片段
已经发展了多种技术生产抗体片段。传统上是通过蛋白水解消化完整抗体产生这些片段(参见，例如，Morimoto等人，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，现在能由重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，能从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，也能直接从大肠杆菌中回收Fab’-Sli片段，并化学偶联形成F(ab’)2片段[Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)]。按照另一种方法，能直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。生产抗体片段的其它技术为技术人员所知。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，如美国专利5,641,870所述。这些线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同的表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异性抗体可以结合B细胞表面标志的两种不同表位。其它抗体可以结合第一种B细胞标志，并进一步结合第二种B细胞表面标志。或者，抗B细胞标志结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子，如CD2或CD3，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRI I(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂结合，以将细胞防御机制集中于B细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于B细胞。这些抗体具有一个B细胞标志结合臂，和一个结合细胞毒性剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体能制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
生产双特异性抗体的方法在本领域周知。全长双特异性抗体的传统生产是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生一种可能含有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种抗体分子具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常利用亲和层析步骤进行，十分繁琐，产物产量较低。WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)公开了类似的方法。
按照不同的方法，具有希望的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合部位)与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选地与免疫球蛋白重链恒定域融合，它含有铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选地有第一个重链恒定区(CHI)，它含有轻链结合所必需的部位，存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA，必要时和编码免疫球蛋白轻链的DNA，插入分别的表达载体中，共转染合适的宿主生物。当在构建中使用的三种多肽链的不相等比例获得最佳产量时，提供了调节实施方案中三种多肽片段相互比例的较大灵活性。然而，当比例相等的至少两种多肽链的表达导致高产量时，或当比例不是特别重要时，能在一个表达载体中插入两种或全部三种多肽链的编码序列。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体含有在一条臂上具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和在另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链轻链对(具有第二种结合特异性)。发现这种不对称的结构有利于从不想要的免疫球蛋白链组合中分离希望的双特异性化合物，因为只有一半双特异性抗体中存在免疫球蛋白轻链提供了一种简单的分离方法。该方法在WO 94/04690中公开。关于生产双特异性抗体的进一步的细节，参见，例如，Suresh等人，Methods inEnzymology，121：210(1986)。
按照美国专利号5,731,168所述的另一种方法，能改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分数最大。优选的界面包含抗体恒定域的CH3域的至少一部分。在该方法中，来自第一种抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链被替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过将较大的氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，在第二种抗体分子的界面上产生与较大侧链相同或相似大小的补偿“腔”。这提供了提高异二聚体产量，高于其它不必要的终产物(如同型二聚体)的一种机制。
双特异性抗体包括交联的或“异偶联”抗体。例如，异偶联物中的一种抗体能与亲合素偶联，另一种与生物素偶联。例如，这些抗体已经提议用于将免疫系统细胞导向不希望的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于HIV感染的治疗(WO 91/00360，WO92/200373和EP 03089)。异偶联抗体可以利用任何适宜的交联法制备。合适的交联剂在本领域众所周知，在美国专利号4,676,980中公开，还有许多交联技术。
由抗体片段生产双特异性抗体的技术已经在文献中描述。例如，双特异性抗体可以利用化学连接制备。Brennan等人，Science，229：81(1985)描述了一种方法，其中蛋白水解切割完整的抗体，产生F(ab’)2片段。这些片段在二硫酚(dithiol)复合剂亚砷酸钠存在下还原，稳定连位二硫酚并防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通过巯乙胺还原将Fab’-TNB衍生物之一恢复为Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体能用作酶的选择性固定的试剂。
最新进展有利于从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，它们能够化学偶联，形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每条Fab’片段由大肠杆菌分别分泌，在体外直接化学偶联，形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常人类T细胞，并触发人类细胞毒性淋巴细胞对人类乳腺癌靶标的裂解活性。
也描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，曾经利用亮氨酸拉链生产了双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同型二聚体在铰链区处还原，形成单体，然后再次氧化，形成抗体异二聚体。该方法也能用于生产抗体同型二聚体。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“diabody”技术提供了一种生产双特异性抗体片段的备选机制。这些片段含有通过接头与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)，该接头因太短而不能使同一条链上的两个域配对。
因此，使一条片段的VH和VL域与另一条片段的互补VL和VH域配对，从而形成两个抗原结合部位。也曾经报道了利用单链Fv(sFv)二聚体生产双特异性抗体的另一个策略。参见，Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。预期了两价以上的抗体。例如，能制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
III.拮抗剂的偶联和其它修饰
此处所述方法中使用的或产品中所含的拮抗剂任选地与一种细胞毒性剂偶联。可用于生产这种拮抗剂-细胞毒性剂偶联物的化疗剂在上文中已经描述。
在此也涉及拮抗剂与一种或多种小分子毒素(如加利车霉素、美登素(美国专利号5,208,020)、trichothene和CC1065)的偶联物。在本发明的一个实施方案中，拮抗剂与一个或多个美登素分子偶联(例如，每个拮抗剂分子约1-10个美登素分子)。例如，美登素可以转化为May-SS-Me，它可还原为May-SH3，并与修饰的拮抗剂反应(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))，产生类美登素-拮抗剂偶联物。
或者，拮抗剂也可与一个或多个加利车霉素分子偶联。抗生素加利车霉素家族能在亚皮摩尔浓度引起双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于：’yJ1、a21、a31、N-乙酰-yl’、PSAG和011(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1993))。
能够使用的酶活性毒素及其片段包括：白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、非洲蒴莲毒蛋白(modeccin)A链、α-八叠球菌(Sarcin)、4leuritesfordii蛋白、dianthin蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、Momordica charantia抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、gelonin、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯(tricothecene)。参见，例如，1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明进一步涉及与具有核酸裂解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNase)偶联的拮抗剂。多种放射性同位素可用于生产放射偶联的拮抗剂。实例包括Ar211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。拮抗剂与细胞毒性剂的偶联物可以用多种双功能蛋白质偶联剂制备，如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶双硫醇)-丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己胺-1-羧酸酯、亚氨基thiolane(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如乙二酰亚胺二甲基酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(如双(重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素能如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于结合放射性核苷酸与拮抗剂的一种典型螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于从细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))。此外，含有拮抗剂和细胞毒性剂的融合蛋白也可以通过例如重组技术或肽合成法制备。
在另一个实施方案中，拮抗剂可以与一种“受体”(如链霉亲和素)偶联，用于肿瘤预导向，其中对患者施用拮抗剂-受体偶联物，随后利用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与细胞毒性剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲和素)。本发明的拮抗剂也可以与一种能将前体药物(如肽酰化疗剂，参见WO81/01145)转化为活性抗癌药物的前体药物激活性酶偶联。参见，例如，WO88/07378和美国专利号4,975,278。
这些偶联物的酶组分包括能作用于前体药物使其转化为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。本发明的方法中有用的酶包括但不限于：可用于将含磷酸前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸盐前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨基酶；可用于将含肽前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物裂解酶，如li-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；可用于将胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍化的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗体在本领域中也被称作“抗体酶”(abzyme)，能用来将本发明的前体药物转化为游离活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。拮抗剂-抗体酶偶联物能如此处所述制备，用于对肿瘤细胞群输送抗体酶。
能利用本领域众所周知的技术，如使用上述异双功能交联剂，将本发明的酶与拮抗剂共价结合。或者，也能用本领域众所周知的重组DNA技术构建融合蛋白，其至少含有本发明的拮抗剂的抗原结合区，至少与本发明的酶的功能活性部分连接[参见，例如，Neuberger等人，Nature，312：604-608(1984)]。
此处也涉及拮抗剂的其它修饰。例如，拮抗剂可以与多种非蛋白质聚合物之一连接，例如：聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。此处公开的拮抗剂也可以配制为脂质体。含有拮抗剂的脂质体通过本领域周知的方法制备，如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公布的WO97/38731所述。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体能用反相蒸发法产生，其中使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物。脂质体通过规定孔径的滤器喷出，产生具有希望的直径的脂质体。本发明的抗体的Fab’片段能通过二硫化物交换反应如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述与脂质体偶联。脂质体中任选地含有化疗剂。参见Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。涉及此处所述的蛋白质或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，希望改善拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学性质。
通过向拮抗剂核酸中引入适当核苷酸改变，或通过肽合成，制备拮抗剂的氨基酸序列变体。这些修饰包括，例如：拮抗剂氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。进行缺失、插入和置换的任何组合，以获得最终构建体，只要最终构建体具有希望的特性。氨基酸改变也可改变拮抗剂的翻译后加工，如改变糖基化位点的数量或位置。
一种方法可用于鉴定拮抗剂中是优选诱变位置的某些残基或区域，称作“丙氨酸扫描诱变法”，如Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)所述。在此确定了一个残基或一组靶残基(例如，带电残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并替换为中性或带负电的氨基酸(最优选的是丙氨酸或聚丙氨酸)，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在置换位点引入其它变异，精确确定证实对置换功能敏感的氨基酸位置。因此，预先确定用于引入氨基酸序列变异的位点，而不需预先确定突变本身的性质。例如，为了分析特定位点突变的表现，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并根据希望的活性筛选表达的拮抗剂变体。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，其长度从一个残基到含有一百个或以上残基的多肽，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括含有一个N端甲硫氨酰残基的拮抗剂，或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括酶或延长拮抗剂血清半衰期的多肽与拮抗剂N端或C端的融合体。
另一种变体是氨基酸置换变体。这些变体在拮抗剂分子中至少一个氨基酸残基被替换为不同的残基。最适于抗体拮抗剂置换诱变的位点包括超变区，但是也包括FR改变。
表1在“优选置换”标题下列出了保守置换。如果这些置换导致生物活性改变，则可引入更大改变，在表1中被命名为“代表性置换”，或者如以下关于氨基酸类别所进一步描述的，并且筛选产物。
表1
    原始残基     代表性置换     优选置换
    Ala(A)     val；leu；ile     val
    Arg(R)     lys；gin；asn     lys
    Asn(N)     gin；his；asp，lys；arg     gln
    Asp(D)     glu；asn     glu
    Cys(C)     ser；ala     ser
    Gin(Q)     asn；glu     asn
    Glu(E)     asp；gin     asp
    Gly(G)     ala     ala
    His (H)     asn；gin；lys；arg     arg
    Ile(I)     leu；val；met；ala；phe；norleucine     ICU
    Lea(L)     norleucine；ile；val；met；ala；phe     ile
    Lys(K)     arg；gln；asn     arg
    Met(M)     leu；phe；ile     leu
    Phe(F)     leu；val；ile；ala；tyr     tyr
    Pro(P)     ala     ala
    Ser(S)     thr     thr
    Thr(T)     ser     ser
    TIP(W)     tyr；phe     tyr
    Tyr(Y)     trp；phe；thr；ser     phe
    Val(V)     ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸     ICU
拮抗剂生物学性质的本质改变通过选择置换实现，这些置换在下列方面显著不同：影响保持(a)置换区域中多肽主链的结构，如片层或螺旋构象，(b)靶部位处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。自然存在的残基根据共同的侧链性质分为以下几类：
(1)疏水：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链方向的残基：gly，pro；和
(6)芳族：trp，tyr，phe。
非保守性置换需要将这些类别之一的成员换为另一类别。
不参与保持拮抗剂正确构象的任何半胱氨酸残基也可以置换，一般为丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。反之，也可以向拮抗剂中加入半胱氨酸键，以提高其稳定性(特别是在拮抗剂是抗体片段如Fv片段时)。
一种特别优选的置换变体包括置换亲本抗体的一个或多个超变区残基。为进一步研究选择的变体一般具有比亲本抗体改进的生物学性质。生产这些置换变体的一种适宜方法是利用噬菌体展示的亲和成熟法。简言之，突变几个超变区位点(例如6-7个位点)，产生每个位点的所有可能的氨基置换。这样产生的抗体变体由丝状噬菌体颗粒以单价方式展示，作为与包装于每个颗粒中的M13的基因III产物的融合体。然后根据此处公开筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了确定用于修饰的候选超变区位点，能进行丙氨酸扫描诱变，以确定明显有助于抗原结合的超变区残基。作为替代或者此外，为了确定抗体与抗原之间的接触点，分析抗原-抗体复合物的晶体结构也是有利的。这些接触残基和邻近残基是按照此处详述的技术置换的候选残基。产生这些变体后，如此处所述筛选全部变体，可以选择在一次或多次相关试验中具有优越性质的抗体进一步研究。
拮抗剂的另一种氨基酸变体改变了拮抗剂的原始糖基化模型。改变是指删除拮抗剂中的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加一个或多个拮抗剂中没有的糖基化位点。
多肽的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任一种产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)连接，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。方便地通过改变氨基酸序列使其含有一种或多种上述三肽序列向拮抗剂中添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。也可以通过向原始拮抗剂序列中添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行这种改变(用于O-连接的糖基化位点)。
编码拮抗剂的氨基酸序列变体的核酸分子用本领域周知的多种方法制备。这些方法包括但不限于：从天然来源分离(对于天然存在的氨基酸序列变体)，或通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒诱变以前制备的拮抗剂变体或非变体形式。
可能希望在效应物功能方面修饰本发明的拮抗剂，例如，提高拮抗剂的抗原依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体拮抗剂的Fc区中引入一个或多个氨基酸置换实现。作为替代，或此外，可以在Fc区中导入半胱氨酸残基，从而在该区中形成链间二硫键。这样产生的同型二聚抗体可能具有提高的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。抗肿瘤活性提高的同型二聚抗体也可以应用如Wolff等人，Cancer Research53：2560-2565(1993)所述的异双功能交联剂制备。此外，也能构建含有双Fc区从而具有增强的补体裂解和ADCC能力的抗体。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为了提高拮抗剂的血清半衰期，可以向拮抗剂(特别是抗体片段)中加入补救受体结合表位，如美国专利5,739,277所述。在此使用时，术语“补救受体结合表位”是指负责延长IgG分子体内血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或I gG4)Fc区的表位。
IV.药用制剂
通过将具有希望的纯度的拮抗剂与任选地药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington制药学》第16版，Osol，A.编写(1980))，制备按照本发明使用的拮抗剂的治疗制剂以备贮存，形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度时对受体无毒，包括：缓冲液，如磷酸、柠檬酸或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；氯化苯甲烃铵、苯索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲基或丙基；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖或其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
WO98/56418描述了代表性抗-CD20抗体制剂，在此引用作为参考。该公开文本描述了一种液体多剂量制剂，其含有40mg/mlrituximab、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨酸酯20，pH5.0，在2-8℃下最短贮存期限为2年。另一种目的抗-CD20制剂在9.0mg/ml氯化钠、7.35mg/ml二水合柠檬酸钠、0.7mg/ml聚山梨酸酯80和无菌注射用水中含有10mg/mlrituximab，pH6.5。WO97/04801描述了适于皮下施用的冻干制剂。这些冻干制剂可以用合适的稀释剂重建为高蛋白质浓度，重建的制剂可以对此处治疗的哺乳动物皮下施用。
此处所述制剂也可含有一种以上的活性化合物，它们是所治疗的特定适应证所需的，优选地具有不会彼此不利影响的补充活性。例如，希望进一步提供一种细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的，如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。这种试剂的有效量取决于制剂中所含的拮抗剂的量，所治疗的疾病类型，和上述其它因素。它们一般以上文使用的施用途径以相同剂量使用，或者约为此前使用剂量的1-99％。
活性成分也可以包封于通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基异丁烯酸)微胶囊，在胶体药物输送系统(例如脂质体、白蛋白小球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中。Osol，A.编写的《Remington制药学》第16版(1980)中公开了这些技术。
也可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为成形形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸))，或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射小球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
将用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤实现。
V.拮抗剂治疗
含有可与B细胞表面抗原结合的拮抗剂的组合物和含有细胞因子拮抗剂(例如抗体)的组合物，它们可以在同一种组合物中，将以符合良好医学实践的方式配制和施用。优选地，抗细胞因子含有抗-IL10抗体，B细胞拮抗剂含有B细胞消耗性抗体，优选地抗-CD20抗体，如Rituxan。这里考虑的因素包括治疗的特定疾病，治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，病因，药物施用部位，施用方法，施用程序和医务工作者所知的其它因素。将要施用的拮抗剂的治疗有效量取决于这些考虑。
一般建议，每次肠胃外施用的拮抗剂的治疗有效量一般为每天约0.1-20mg/kg患者体重，所使用的拮抗剂的初始范围一般为约2-10mg/kg。
优选的拮抗剂是不与细胞毒性剂偶联的抗体，如RITUXAN。未偶联的抗体的合适剂量为约20mg/m2-约1000mg/m2。在一个实施方案中，抗体剂量不同于当前对RITUXAN所推荐的。例如，可以对患者施用一次或多次大大低于375mg/m2的抗体，例如，剂量约为20mg/m2-约250mg/m2，例如约50mg/m2-约200mg/m2。
此外，也可以最初施用一次或多次抗体，随后施用一次或多次，其中后来的mg/m2抗体剂量高于最初的mg/m2抗体剂量。例如，最初剂量可以是约20mg/m2-约250mg/m2(例如约50mg/m2-约200mg/m2)，随后的剂量可以是约250mg/m2-约1000mg/m2。
然而如上所述，这种建议的拮抗剂含量需要经过大量治疗判断。如上所述，选择合适剂量和程序的关键因素是获得的结果。
例如，为了治疗发展中的和急性疾病，最初需要相对较高的剂量。为了获得最有效的结果，根据疾病，尽可能地靠近疾病的第一次症状、诊断、出现或发病，或在疾病缓解过程中施用拮抗剂。
拮抗剂通过任何合适的方法施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，在希望局部免疫抑制治疗时，伤口内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
另外，也可通过脉动输注适当地施用拮抗剂，例如拮抗剂剂量逐渐降低。优选地，通过注射进行施用，最优选地通过静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
可以与此处所述的拮抗剂一起施用其它化合物，如细胞毒性剂、化疗剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。联合施用包括共同施用，使用分开的制剂，或一种药用制剂，以及按任何顺序连续施用，其中两种(或所有)活性剂同时发挥生物活性优选地需要一段时间。
除了对患者施用蛋白质拮抗剂之外，本申请还涉及通过基因治疗施用拮抗剂。表述“施用治疗有效量的拮抗剂”中包括施用编码拮抗剂的核酸。参见，例如，1996年3月14日公布的WO96/07321，关于基因治疗产生胞内抗体的应用。
有两种主要方法使核酸(任选地包含于一种载体中)进入患者细胞：体内和离体(ex vivo)。对于体内输送，通常在需要拮抗剂的部位，直接对患者注射核酸。对于离体治疗，取出患者细胞，向这些分离的细胞中导入核酸，直接或者例如包封于植入患者体内的多孔膜内，对患者施用这样修饰的细胞(参见，例如，美国专利号4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于向活细胞中导入核酸。根据核酸是转移到体外培养的细胞中还是体内转移到目的宿主细胞中，这些技术不同。适用于在体外向哺乳动物细胞转移核酸的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。离体输送基因常用的一种载体是逆转录病毒。
当前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂类的系统(可用于基因的脂类介导转移的脂类例如有DOTMA、DOPE和DC-Chol)转染。有时，希望为核酸来源提供可导向靶细胞的试剂，如细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体，靶细胞上受体的配体等。当使用脂质体时，可结合与胞吞有关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于导向和/或促进摄取，例如倾向于特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段，在循环中经历内化的蛋白质的抗体，和针对胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。例如，Wu等人，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)描述了受体介导的胞吞技术。当前周知的基因标志和基因治疗方法的综述见Anderson等人，Scienoe 256：808-813(1992)。参见WO 93/25673和此处引用的参考文献。
VI.产品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有可用于治疗上述疾病的物质的产品。该产品包括容器和容器上或与容器相连的一个标签或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料构成。容器容纳或含有一种可有效治疗所选疾病的组合物，可能有一个无菌入口(例如，容器可能是一个静脉内溶液袋或一个小瓶，它有一个皮下注射针头可穿过的塞子)。组合物中至少有一种活性剂是可结合B细胞表面标志的拮抗剂。优选地是CD20，和抗细胞因子抗体，例如抗-IL10抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗患有或易患如此处所述的自身免疫病的患者。该产品还可包含第二个容器，其中含有药学可接受的稀释缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲液、林格液和葡萄糖溶液。还可含有商业和用户方面需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
本发明的进一步的细节通过下列非限制性实施例说明。所有引用内容在此引用作为参考。
实施例
实施例1
非何杰金氏淋巴瘤的治疗
非何杰金氏淋巴瘤患者每周静脉内施用剂量为50mg/m2IV的抗-IL10抗体，持续4周。之后，按照下列剂量程序对患者静脉内施用RITUXAN：
(A)第一天50mg/m2IV
第8、15、22天150mg/m2IV
(B)第1天150mg/m2IV
第8、15、22天375mg/m2IV
(C)第1、8、15、22天375mg/m2IV
同一患者按照美国专利5,736,137所述方案施以CHOP化学治疗。
治疗后，监测患者，评价对淋巴瘤状态(例如肿瘤数量和大小)的影响。
实施例2
晚期实体瘤的治疗
特征在于涉及B细胞的晚期结肠直肠癌患者同时用与实施例1相同剂量的抗-IL10抗体和RITUXAN治疗。
治疗后，例如根据肿瘤收缩、肿瘤抗原表达降低或评价疾病预后的其它手段，对患者进行评估，确定这种治疗是否引起抗肿瘤反应。
本发明还涉及以下段落中的内容：
1.避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞或非血液实体瘤细胞对至少一种化疗剂的抗性的方法，包括在施用至少一种化疗剂之前、同时或之后，对诊断患有血液恶性肿瘤或非血液实体瘤的患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
2.段落1的方法，其中所述血液细胞包含B细胞淋巴瘤或白血病细胞。
3.段落2的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
4.段落3的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
5.段落2的方法，其中所述白血病细胞选自：急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、髓性白血病和早幼粒细胞白血病。
6.段落1的方法，其中所述至少一种化疗剂选自：CHOP、ICE、米托蒽醌、阿糖胞苷、DVP、ATRA、伊达比星、hoelzer化疗方案、La La化疗方案、ABVD、CEOP、2-CdA、FLAG&IDA随后进行或不进行G-CSF治疗、VAD、M&P、C-Weekly、ABCM、MOPP、DHAP、多柔比星、柔红霉素、他莫昔芬、托瑞米芬、甲氨蝶呤和顺铂。
7.段落1的方法，其中所述细胞因子选自：IL2、IL6、IL10和TNF-α。
8.段落7的方法，其中所述细胞因子是IL10。
9.段落8的方法，其中所述抗-IL10抗体是人源化或人类单克隆抗体。
10.段落9的方法，其中以0.01-1000mg/kg体重的剂量施用所述抗-IL10抗体。
11.段落10的方法，其中抗体剂量为约0.1-50mg/kg体重。
12.段落1的方法，其中在所述化疗剂同时和/或之前施用所述抗细胞因子抗体。
13.段落12的方法，其中在施用化疗剂同时和/或约1小时到30天前施用所述抗细胞因子抗体。
14.段落1的方法，其中在施用抗细胞因子抗体或其片段或拮抗剂之前检测所述淋巴瘤患者血清的细胞因子分布。
15.试剂盒，用于按照段落1的方法施用抗体或拮抗剂。
16.试剂盒，用于按照段落14的方法检测细胞因子分布。
17.试剂盒，用于按照段落16的方法检测细胞因子分布并施用抗体或拮抗剂。
18.避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞对治疗剂的抗性的方法，包括对诊断患有血液恶性肿瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
19.避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞对治疗剂诱发的凋亡的抗性的方法，包括对诊断患有血液恶性肿瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
20.段落18的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
21.段落19的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
22.治疗在化学治疗后复发的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
23.治疗用化学治疗难以治愈的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
24.段落21的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
25.治疗在用治疗性抗体或片段治疗后复发的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
26.段落23的方法，其中所述治疗性抗体是抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22、抗-CD37、抗-CD40或抗-CD28抗体。
27.治疗用治疗性抗体难以治愈的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
28.段落25的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
29.治疗B细胞淋巴瘤患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的B细胞消耗性抗体，同时或以任一顺序连续施用抗细胞因子抗体或片段。
30.段落29的方法，其中这种B细胞消耗性抗体可结合选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDω78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86的B细胞抗原。
31.段落21的方法，其中所述B细胞消耗性抗体可结合CD20。
32.段落29的方法，其中所述B细胞消耗性抗体可结合CD22。
33.段落29的方法，其进一步包括施用至少一种化疗剂。
34.段落33的方法，其中所述至少一种化疗剂选自：CHOP、ICE、米托蒽醌、阿糖胞苷、DVP、ATRA、伊达比星、hoelzer化疗方案、La La化疗方案、ABVD、CEOP、2-CdA、FLAG&IDA随后进行或不进行G-CSF治疗、VAD、M&P、C-Weekly、ABCM、MOPP、DHAP、多柔比星、柔红霉素、他莫昔芬、托瑞米芬、甲氨蝶呤和顺铂。
35.段落33的方法，其中在所述抗-CD20抗体和所述至少一种化疗剂之前施用所述抗细胞因子抗体或拮抗剂。
36.段落29的方法，其中在所述抗-CD20抗体之前施用所述抗细胞因子抗体或拮抗剂。
37.段落29的方法，其中所述细胞因子选自IL2、IL6、IL10和TNF-α。
38.段落37的方法，其中所述细胞因子是IL10。
39.段落29的方法，其中抗-CD20抗体是嵌合、人源化或人类抗-CD20抗体。
40.段落39的方法，其中所述抗-CD20抗体是嵌合抗-CD20抗体。
41.段落40的方法，其中所述嵌合抗-CD20抗体是Rituximab。
42.段落41的方法，其中所述Rituximab以0.4-20mg/kg体重的剂量施用。
43.段落33的方法，其中所述至少一种化疗剂是CHOP化学治疗方案的一部分。
44.段落29的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
45.段落44的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
46.段落45的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是轻度/滤泡型NHL。
47.段落29的方法，其中在施用所述抗细胞因子抗体或拮抗剂之前检测所述淋巴瘤患者血清的细胞因子分布。
48.试剂盒，用于按照段落29的方法施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
49.试剂盒，用于按照段落42的方法检测细胞因子分布并施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
50.治疗涉及B细胞的肿瘤的方法，包括对需要这种治疗的患者施用有效量的细胞因子特异性抗体和可与B细胞表达的抗原结合的B细胞消耗性抗体。
51.试剂盒，用于按照段落50的方法施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
52.段落50的方法，其中所述抗细胞因子抗体可结合选自干扰素、白介素、肿瘤坏死因子和集落刺激因子的细胞因子。
53.段落51的方法，其中所述抗细胞因子抗体可结合选自干扰素、白介素、肿瘤坏死因子和集落刺激因子的细胞因子。
54.段落50的方法，其中所述抗细胞因子抗体可特异结合IL-10。
55.段落51的方法，其中所述抗细胞因子抗体可特异结合IL-10。
56.段落50的方法，其中B细胞抗原选自：CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDω78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86。
57.试剂盒，用于按照段落51的方法施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
58.段落56的方法，其中所述B细胞抗原是CD20。
59.段落58的方法，其中抗-CD20抗体是人类、人源化或嵌合抗-CD20抗体。
60.段落59的方法，其中所述抗体具有ADCC和/或CDC活性。
61.段落59的方法，其中所述抗-CD20诱导B细胞凋亡。
62.段落59的方法，其中所述抗-CD20抗体是Rituxan，ATCC69119产生的嵌合抗-CD20抗体。
63.段落51的方法，其中该患者具有与选自下列的癌症相关的非淋巴实体瘤：肝癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、肺癌、食道癌、气管癌、肾癌、膀胱癌和结肠直肠癌。
64.段落50的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
65.段落50的方法，其中所述抗体经静脉内、肌内、肿瘤内或腹膜内施用。
66.段落51的方法，其中所述抗体经静脉内、肌内、肿瘤内或腹膜内施用。
67.段落51的方法，其中所述实体瘤包括癌前期、早期(I期或II期实体癌)、晚期癌(II期癌之后)或转移癌。
68.段落51的方法，其中该患者患有结肠直肠癌或肺癌。
69.治疗涉及B细胞的结肠直肠癌或肺癌的方法，包括对需要这种治疗的患者施用有效量的IL-10特异性抗体和消耗性抗-CD20抗体。
70.段落69的方法，其中所述消耗性抗-CD20抗体是人类、人源化或嵌合抗体。
71.段落70的方法，其中所述抗体是ATCC 69119产生的Rituxan。
72.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该治疗包括施用抗-IL10抗体。
73.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用至少一种抗-IL10抗体。
74.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和至少一种B细胞消耗性抗体。
75.段落63的方法，其中所述B细胞消耗性抗体可与选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDω78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86的B细胞抗原结合。
76.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD20或抗-CD22抗体。
77.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD20抗体。
78.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗体。
79.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD20抗体。
80.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD22抗体。
81.段落77的方法，其中所述抗体是Rituxan。
82.段落79的方法，其中所述抗体是Rituxan。
83.治疗患者B细胞淋巴瘤的联合疗法，包括施用治疗有效量的抗-IL10抗体、B细胞消耗性抗-CD20抗体和化学疗法。
84.段落83的方法，其中所述抗CD20抗体是Rituxan。
85.段落83的方法，其中所述患者在先前用B细胞消耗性抗体治疗后出现疾病复发。
86.段落85的方法，其中所述抗体是Rituxan。

Claims (86)

1.避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞或非血液实体瘤细胞对至少一种化疗剂的抗性的方法，包括在施用至少一种化疗剂之前、同时或之后，对诊断患有血液恶性肿瘤或非血液实体瘤的患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述血液细胞包含B细胞淋巴瘤或白血病细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
4.权利要求3的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
5.权利要求2的方法，其中所述白血病细胞选自：急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、髓性白血病和早幼粒细胞白血病。
6.权利要求1的方法，其中所述至少一种化疗剂选自：CHOP、ICE、米托蒽醌、阿糖胞苷、DVP、ATRA、伊达比星、hoelzer化疗方案、La La化疗方案、ABVD、CEOP、2-CdA、FLAG&IDA随后进行或不进行G-CSF治疗、VAD、M&P、C-Weekly、ABCM、MOPP、DHAP、多柔比星、柔红霉素、他莫昔芬、托瑞米芬、甲氨蝶呤和顺铂。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞因子选自：IL2、IL6、IL10和TNF-α。
8.权利要求7的方法，其中所述细胞因子是IL10。
9.权利要求8的方法，其中所述抗-IL10抗体是人源化或人类单克隆抗体。
10.权利要求9的方法，其中以0.01-1000mg/kg体重的剂量施用所述抗-IL10抗体。
11.权利要求10的方法，其中抗体剂量为约0.1-50mg/kg体重。
12.权利要求1的方法，其中在所述化疗剂同时和/或之前施用所述抗细胞因子抗体。
13.权利要求12的方法，其中在施用化疗剂同时和/或约1小时到30天前施用所述抗细胞因子抗体。
14.权利要求1的方法，其中在施用抗细胞因子抗体或其片段或拮抗剂之前检测所述淋巴瘤患者血清的细胞因子分布。
15.试剂盒，用于按照权利要求1的方法施用抗体或拮抗剂。
16.试剂盒，用于按照权利要求14的方法检测细胞因子分布。
17.试剂盒，用于按照权利要求16的方法检测细胞因子分布并施用抗体或拮抗剂。
18.避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞对治疗剂的抗性的方法，包括对诊断患有血液恶性肿瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
19.避免、降低或克服血液恶性肿瘤细胞对治疗剂诱发的凋亡的抗性的方法，包括对诊断患有血液恶性肿瘤的患者施用抗细胞因子抗体或细胞因子拮抗剂。
20.权利要求18的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
21.权利要求19的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
22.治疗在化学治疗后复发的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
23.治疗用化学治疗难以治愈的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
24.权利要求21的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
25.治疗在用治疗性抗体或片段治疗后复发的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
26.权利要求23的方法，其中所述治疗性抗体是抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22、抗-CD37、抗-CD40或抗-CD28抗体。
27.治疗用治疗性抗体难以治愈的血液恶性肿瘤患者的方法，包括对该患者施用抗细胞因子抗体或其片段或细胞因子拮抗剂。
28.权利要求25的方法，其中所述恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
29.治疗B细胞淋巴瘤患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的B细胞消耗性抗体，同时或以任一顺序连续施用抗细胞因子抗体或片段。
30.权利要求29的方法，其中这种B细胞消耗性抗体可结合选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDω78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86的B细胞抗原。
31.权利要求21的方法，其中所述B细胞消耗性抗体可结合CD20
32.权利要求29的方法，其中所述B细胞消耗性抗体可结合CD22。
33.权利要求29的方法，其进一步包括施用至少一种化疗剂。
34.权利要求33的方法，其中所述至少一种化疗剂选自：CHOP、ICE、米托蒽醌、阿糖胞苷、DVP、ATRA、伊达比星、hoelzer化疗方案、La La化疗方案、ABVD、CEOP、2-CdA、FLAG&IDA随后进行或不进行G-CSF治疗、VAD、M&P、C-Weekly、ABCM、MOPP、DHAP、多柔比星、柔红霉素、他莫昔芬、托瑞米芬、甲氨蝶呤和顺铂。
35.权利要求33的方法，其中在所述抗-CD20抗体和所述至少一种化疗剂之前施用所述抗细胞因子抗体或拮抗剂。
36.权利要求29的方法，其中在所述抗-CD20抗体之前施用所述抗细胞因子抗体或拮抗剂。
37.权利要求29的方法，其中所述细胞因子选自IL2、IL6、IL10和TNF-α。
38.权利要求37的方法，其中所述细胞因子是IL10。
39.权利要求29的方法，其中抗-CD20抗体是嵌合、人源化或人类抗-CD20抗体。
40.权利要求39的方法，其中所述抗-CD20抗体是嵌合抗-CD20抗体。
41.权利要求40的方法，其中所述嵌合抗-CD20抗体是Rituximab。
42.权利要求41的方法，其中所述Rituximab以0.4-20mg/kg体重的剂量施用。
43.权利要求33的方法，其中所述至少一种化疗剂是CHOP化学治疗方案的一部分。
44.权利要求29的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
45.权利要求44的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
46.权利要求45的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是轻度/滤泡型NHL。
47.权利要求29的方法，其中在施用所述抗细胞因子抗体或拮抗剂之前检测所述淋巴瘤患者血清的细胞因子分布。
48.试剂盒，用于按照权利要求29的方法施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
49.试剂盒，用于按照权利要求42的方法检测细胞因子分布并施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
50.治疗涉及B细胞的肿瘤的方法，包括对需要这种治疗的患者施用有效量的细胞因子特异性抗体和可与B细胞表达的抗原结合的B细胞消耗性抗体。
51.试剂盒，用于按照权利要求50的方法施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
52.权利要求50的方法，其中所述抗细胞因子抗体可结合选自干扰素、白介素、肿瘤坏死因子和集落刺激因子的细胞因子。
53.权利要求51的方法，其中所述抗细胞因子抗体可结合选自干扰素、白介素、肿瘤坏死因子和集落刺激因子的细胞因子。
54.权利要求50的方法，其中所述抗细胞因子抗体可特异结合IL-10。
55.权利要求51的方法，其中所述抗细胞因子抗体可特异结合IL-10。
56.权利要求50的方法，其中B细胞抗原选自：CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDω78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86。
57.试剂盒，用于按照权利要求51的方法施用抗-CD20抗体和抗细胞因子抗体或拮抗剂。
58.权利要求56的方法，其中所述B细胞抗原是CD20。
59.权利要求58的方法，其中抗-CD20抗体是人类、人源化或嵌合抗-CD20抗体。
60.权利要求59的方法，其中所述抗体具有ADCC和/或CDC活性。
61.权利要求59的方法，其中所述抗-CD20诱导B细胞凋亡。
62.权利要求59的方法，其中所述抗-CD20抗体是Rituxan，ATCC 69119产生的嵌合抗-CD20抗体。
63.权利要求51的方法，其中该患者具有与选自下列的癌症相关的非淋巴实体瘤：肝癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、肺癌、食道癌、气管癌、肾癌、膀胱癌和结肠直肠癌。
64.权利要求50的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自：轻度/滤泡型非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥漫型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、bulky疾病NHL和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
65.权利要求50的方法，其中所述抗体经静脉内、肌内、肿瘤内或腹膜内施用。
66.权利要求51的方法，其中所述抗体经静脉内、肌内、肿瘤内或腹膜内施用。
67.权利要求51的方法，其中所述实体瘤包括癌前期、早期(I期或II期实体癌)、晚期癌(II期癌之后)或转移癌。
68.权利要求51的方法，其中该患者患有结肠直肠癌或肺癌。
69.治疗涉及B细胞的结肠直肠癌或肺癌的方法，包括对需要这种治疗的患者施用有效量的IL-10特异性抗体和消耗性抗-CD20抗体。
70.权利要求69的方法，其中所述消耗性抗-CD20抗体是人类人源化或嵌合抗体。
71.权利要求70的方法，其中所述抗体是ATCC 69119产生的Rituxan。
72.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该治疗包括施用抗-IL10抗体。
73.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用至少一种抗-IL10抗体。
74.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和至少一种B细胞消耗性抗体。
75.权利要求63的方法，其中所述B细胞消耗性抗体可与选自CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDω78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86的B细胞抗原结合。
76.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD20或抗-CD22抗体。
77.在需要治疗的患者中治疗B细胞淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD20抗体。
78.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗体。
79.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD20抗体。
80.在需要治疗的患者中治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，该方法包括施用抗-IL10抗体和B细胞消耗性抗-CD22抗体。
81.权利要求77的方法，其中所述抗体是Rituxan。
82.权利要求79的方法，其中所述抗体是Rituxan。
83.治疗患者B细胞淋巴瘤的联合疗法，包括施用治疗有效量的抗-IL10抗体、B细胞消耗性抗-CD20抗体和化学疗法。
84.权利要求83的方法，其中所述抗CD20抗体是Rituxan。
85.权利要求83的方法，其中所述患者在先前用B细胞消耗性抗体治疗后出现疾病复发。
86.权利要求85的方法，其中所述抗体是Rituxan。
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