CN101102793A - 治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用能有效消除患者中B细胞的较低剂量的抗CD20抗体治疗自身免疫性疾病的方法。

Description

治疗方法
本申请要求享有2005年1月13日提交的美国临时申请60/644,059的权益，其全文内容纳入本文参考。
技术领域
本发明涉及以特定抗体剂量治疗B细胞相关疾病。
背景技术
淋巴细胞是几种白细胞群之一种；它们特异识别并应答外来抗原。主要的3类淋巴细胞是B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和自然杀伤(NK)细胞。B淋巴细胞是产生抗体并带来体液免疫的细胞。B细胞在骨髓内成熟，在它们的细胞表面上表达出结合抗原的抗体离开骨髓。当初始B细胞(naive B cell)首次遇到与其膜结合的抗体特异的抗原时，细胞开始迅速分裂，使其后代细胞分化成记忆B细胞和称为“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞有较长的寿命并持续表达膜结合的抗体，该抗体具有与原始亲本细胞相同的特异性。浆细胞不产生膜结合的抗体，代之以产生分泌型的抗体。分泌型的抗体是体液免疫的主要效应分子。
CD20抗原(也称为人B-淋巴细胞限制性分化抗原，Bp35)是位于前B(pre-B)和成熟的B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白质，其分子量约为35kD(Valentine等.J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287(1989)；和Einfeld等.EMBO J.7(3)：711-717(1988))。该抗原也在超过90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等.Blood 63(6)：1424-1433(1984))，但在造血干细胞、原B细胞(pro-B cells)、正常血浆细胞或其它正常组织上未发现(Tedder等.J.Immunol.135(2)：973-979(1985))。CD20认为能调节细胞周期启动和分化的活化过程中的早期阶段(Tedder等，同前)，并可能起到钙离子通道(Tedder等.J.Cell.Biochem.14D：195(1990))的作用。
考虑到CD20在B细胞淋巴瘤中表达，该抗原已经是有用的治疗靶位以治疗该淋巴瘤。美国有超过300,000人患有B细胞NHL，并且每年诊断出超过56,000个新病例。CD20也是用于治疗自身免疫性疾病的靶抗原。
rituximab(RITUXAN)抗体用于治疗患有CD20阳性的复发性或顽固性低级或滤泡性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者，该抗体是抗人CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体(可从商业途径得自Genentech，Inc.，South San Francisco，California，美国)。Rituximab在颁布于1998年4月7日的美国专利第5,736,137号(Anderson等)和美国专利第5,776,456号中是称为“C2B8″的抗体。
在各种非恶性自身免疫病中也研究Rituximab，其中B细胞和自身抗体显示出在疾病病理生理中起作用。Edwards等，Biochem Soc.Trans.30：824-828(2002)。有报道，Rituximab潜在地减轻以下疾病的体征和症状：例如，类风湿性关节炎(RA)(Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61：883-888(2002)；Edwards等，Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)：S46(2002)；Stahl等，Ann.Rheum.Dis.，62(Suppl.1)：OP004(2003)；Emery等，Arthritis Rheum.48(9)：S439(2003))、狼疮(Eisenberg，Arthritis.Res.Ther.5：157-159(2003)；Leandro等，Arthritis Rheum.46：2673-2677(2002)；Gorman等，Lupus，13：312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D’Arena等，Leuk.Lymphoma 44：561-562(2003)；Stasi等，Blood，98：952-957(2001)；Saleh等，Semin.Oncol.，27(Supp 12)：99-103(2000)；Zaia等，Haematolgica，87：189-195(2002)；Ratanatharathorn等，Ann.Int.Med.，133：275-279(2000))、纯红细胞再生障碍(pure red cell aplasia)(Auner等，Br.J.Haematol.，116：725-728(2002))；自身免疫性贫血(Zaja等，Haematologica 87：189-195(2002)(错字勘误表在Haematologica 87：336(2002))、冷凝集素疾病(cold agglutinin disease)(Layios等，Leukemia，15：187-8(2001)；Berentsen等，Blood，103：2925-2928(2004)；Berentsen等，Br.J.Haematol.，115：79-83(2001)；Bauduer，Br.J.Haematol.，112：1083-1090(2001)；Damiani等，Br.J.Haematol.，114：229-234(2001))、严重胰岛素抗性的B型综合症(Cou等，N.Engl.J.Med.，350：310-311(2004)、混合性冷球蛋白血症(DeVita等，Arthritis Rheum.46 Suppl.9：S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja等，Neurology，55：1062-63(2000)；Wylam等，J.Pediatr.，143：674-677(2003))、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)(Specks等，Arthritis & Rheumatism 44：2836-2840(2001))、顽固性寻常性天疱疮(refractory pemphigus vulgaris)(Dupuy等，Arch Dermatol.，140：91-96(2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)：S1299(2002))，斯耶格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)(Somer等，Arthritis &Rheumatism，49：394-398(2003))，活跃性II型混合性冷球蛋白血症(Zaja等，Blood，101：3827-3834(2003))、寻常性天疱疮(Dupay等，Arch.Dermatol.，140：91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry74：485-489(2003))、肿瘤相关眼阵挛-肌阵挛综合症(paraneoplasticopsoclonus-myoclonus syndrome)(Pranzatelli等.Neurology 60(Suppl.1)PO5.128：A395(2003))、和复发-缓解性多发性硬化(relapsing-remittingmultiple sclerosis)(RRMS)。Cross等.(摘要)″Preliminary results from a phase IItrial of Rituximab in MS″，美国多发性硬化研究和治疗委员会的第八届年会，20-21(2003)。
在患有类风湿性关节炎(RA)的患者中进行的II期临床试验，提供了关于Rituximab安全性和功效的持续48周的数据。Emery等.Arthritis Rheum48(9)：S439(2003)；Szczepanski等.Arthritis Rheum 48(9)：S121(2003)。将患者均匀地随机分成4个治疗组：甲氨蝶呤、单独用rituximab、rituximab加甲氨蝶呤、和rituximab加环磷酰胺(CTX)。Rituximab的治疗方案是在第1和15天静脉内给药1克。
关于用rituximab治疗的公开文献包括：Perotta和Abuel，“Response ofchronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”摘要#3360 Blood10(1)(1-2部分)：p.88B(1998)；Perotta等，″Rituxan in the treatment ofchronicidiopathic thrombocytopaenic purpuRA(ITP)″，Blood，94：49(摘要)(1999)；Matthews，R.，“MedicalHeretics”New Scientist(2001年4月7日)；Leandro等，“Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated withBLymphocyte depletion”Ann Rheum Dis，同前；Leandro等，“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritis：early evidence for safety，efficacy and doseresponse″Arthritis and Rheumatism 44(9)：S370(2001)；Leandro等，“An openstudy of BLymphocyte depletion in systemicLupus erythematosus”，Arthritis andRheumatism，46：2673-2677(2002)，尽管使用了不同的方案，在2周内，每个患者接受2次500-mg的rituximab输注、2次750mg的环磷酰胺输注、和高剂量的口服皮质类固醇，但其中2个治疗的患者分别在第7和8个月复发并退出；″SuccessfulLong-term treatment of systemicLupus erythematosuswith rituximab maintenance therapy″Weide等，Lupus，12：779-782(2003)，其中一个患者用rituximab治疗(375mg/m2×4，每周间隔重复给药)，并且每隔5-6个月再递送rituximab，然后每隔3个月用rituximab 375mg/m2进行维持治疗，而且第二个患有顽固性SLE的患者成功地用rituximab进行了治疗，他每隔3个月接受维持治疗，两个患者都对rituximab治疗反应良好；Edwards和Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoid arthritisfollowing a protocol designed to deplete BLymphocyte s”Rheumatology 40：205-211(2001)；Cambridge等，″BLymphocyte depletion in patients withrheumatoid  arthritis：serial studies of immunological parameters″ArthritisRheum.，46(Suppl.9)：S1350(2002)；Edwards等，“B-Lymphocyte depletiontherapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders”同前；Edwards等，“Efficacy and safety of rituximab，a B cell targeted chimeric monoclonalantibody：A randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoidarthritis.Arthritis and Rheumatism 46(9)：S197(2002)；Levine和Pestronk，“IgMantibody-related polyneuropathies：B-cell depletion chemotherapy usingrituximab”Neurology 52：1701-1704(1999)；DeVita等，“Efficacy of selective Bcell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis”Arthritis & Rheum 46：2029-2033(2002)；Hidashida等.“Treatment of DMARD-refractory rheumatoidarthritis with rituximab.”美国风湿病学学院科学年会上提交；10月24-29日；New Orleans，LA 2002；Tuscano，J.“Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab”，美国风湿病学学院科学年会上提交；10月24-29日；New Orleans，LA 2002；″Pathogenic roles of B cells in人autoimmunity；insights from the clinic″ Martin和Chan，Immunity 20：517-527(2004)；Silverman和Weisman，″Rituximab Therapy and AutoimmuneDisorders，Prospects for Anti-B Cell Therapy″，Arthritis and Rheumatism，48：1484-1492(2003)；Kazkaz和Isenberg，″Anti B eell therapy(rituximab)in thetreatment of autoimmune diseases″，Current opinion in pharmacology，4：398-402(2004)；Virgolini和Vanda，″Rituximab in autoimmune diseases″，Biomedicine & pharmacotherapy，58：299-309(2004)；Klemmer等，″Treatmentof antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20monoclonalRituximab″，Arthritis and Rheumatism，48：(9)9，S(SEP)，页：S624-S624(2003)；Kneitz等，″Effective B cell depletion with rituximab in thetreatment of autoimmune diseases″，Immunobiology，206：519-527(2002)；Arzoo等，″Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with ananti-CD20monoclonal antibody(rituximab)″Annals of the Rheumatic Diseases，61(10)，p922-4(2002)Comment in Ann Rheum Dis.61：863-866(2002)；″FutureStrategies in Immunotherapy″，Lake和Dionne，见Burger′s MedicinalChemistry and Drug Discovery(2003，John Wiley & Sons，Inc出版)其文章网上发表日期：2003年1月15日(见第2章″Antibody-DirectedImmunotherapy″)；Liang和Tedder，Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine，Section：CD20as an Immunotherapy Target，文章网上发表日期：2002年1月15日，名称为″CD20″；名为″Monoclonal Antibodies toHuman Cell SurfaceAntigens″的附录4A，Stockinger等编：Coligan等，见Current Protocols inImmunology(2003 John Wiley & Sons，Inc)，网上发表日期：2003年5月；印刷版公开日：2003年2月；Penichet和Morrison，″CD Antibodies/molecules：Definition；Antibody Engineering″，见Wiley Encyclopedia of MolecularMedicine Section：Chimeric，Humanized andHuman Antibodies；网上发布于2002年1月15日；Specks等.“Response of Wegener’s granulomatosis toanti-CD20chimeric monoclonal antibody therapy”Arthritis & Rheumatism 44：2836-2840(2001)；网上提交了摘要并发布的Koegh等，″Rituximab forRemission Induction in Severe ANCA-Associated Vaculitis：Report of aProspective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients″，American College ofRheumatology，期号：28-100，期名：Vaculitis，期刊类型：ACR协作期刊，主要目录：28 Vaculitis，10/18/2004期( http: //www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp)；Eriksson，″Short-termoutcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated withrituximab″，Kidney and Blood Pressure Research，26：294(2003)；Jayne等，″B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis″Kidney and BloodPressure Research，26：294(2003)；Jayne，poster 88(第11届国际脉管炎和ANCA讨论会)，2003，美国肾脏学学会；Stone和Specks，″Rituximab Therapyfor the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis″，2002-2003免疫耐受网络的临床试验研究概要， http: //www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html。也可参见Leandro等，″B cell repopulation occurs mainly from
Figure A20068000228200101
B cells in patientwith rheumatoid arthritis and systemicLupus erythematosus″Arthritis Rheum.，48(增刊9)：S1160(2003)。
关于CD20抗体的专利和专利公开包括，美国专利5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734、以及美国专利申请US 2002/0197255A1、US2003/0021781A1、US2003/0082172A1、US2003/0095963A1、US2003/0147885 A1(Anderson等)；美国专利6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky等)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO01/10460(White和Grillo-Lopez)；US2001/0018041A1，US2003/0180292A1，WO01/34194(Hanna和Hariharan)；美国申请US2002/0006404和WO02/04021(Hanna和Hariharan)；美国申请US2002/0012665 A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美国申请US 2002/0058029A1(Hanna，N.)；美国申请US 2003/0103971 A1(Hariharan和Hanna)；美国申请US2002/0009444A1、和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美国申请第US2002/0128488A1号和WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky等)；WO2/096948(Braslawsky等)；WO02/079255(Reff和Davies)；美国专利6,171,586B1、和WO98/56418(Lam等)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美国专利6,194,551B1、美国专利6,242,195B1、美国专利6,528,624B1和美国专利6,538,124(Idusogie等)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd等)；WO01/03734(Grillo-Lopez等.)；美国申请US 2002/0004587A1和WO01/77342(Miller和Presta)；美国申请US2002/0197256(Grewal，I.)；关国申请US 2003/0157108 A1(Presta，L.)；  美国专利6,565,827B1、6,090,365B1、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等)；美国专利5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852B1(Robinson等)；美国专利6,410,391B1(Raubitschek等)；美国专利6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；美国申请US2003/0133930 A1和WO00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO00/76542(Golay等)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利6,368,596B1(Ghetie等)；美国专利6,306,393和美国申请US2002/0041847 A1(Goldenberg，D.)；美国申请US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)；美国专利申请2003/0068664(Albitar等.)；WO03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694、US2002/0009427A1、和US 2003/0185796 A1(Wolin等.)；WO03/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818 A1(Bohen等.)；US 2003/0219433 A1和WO03/068821(Hansen等)；US2002/0136719A1(Shenoy等)；WO2004/032828(Wahl等)；WO2004/035607(Teeling等)；US2004/0093621(ShitaR等)。也可参见美国专利5,849,898和EP申请330,191(Seed等)；美国专利4,861,579和EP332,865A2(Meyer和Weiss)；WO95/03770(Bhat等)、US 2001/0056066(Bugelski等)；WO 2004/035607(Teeling等)；WO2004/056312(Lowman等)；US 2004/0093621(ShitaRA等)；和WO 2004/103404(Watkins等)。关于CD20抗体的公开文献包括：Teeling，J.等“Characterisation of new人CD20monoclonal antibodies with potent cytolytic activity againstnon-Hodgkin′sLymphomas”Blood，2004年6月；10.1182。
在治疗疾病时，能以最低有效剂量给药药物是有益的。经过以下详细说明可以显而易见地看到，本发明满足了这样的用抗CD20抗体进行治疗的需求。
发明简述
本发明提供了消除患有自身免疫性疾病的患者中B细胞的方法，其包括向患者给药结合人CD20的抗体或其抗原结合片段，其以1mg至250mg范围的剂量进行。在一个具体实施方式中，相对于给药抗体前的基线，患者的B细胞消除了至少80％。
本发明也提供了减轻自身免疫性疾病的方法，其包括向患有自身免疫性疾病的患者以1mg至250mg范围的剂量给药结合人CD20的抗体。
在前述方法的不同具体实施方式中，结合CD20的抗体以1mg至100mg范围的剂量、或以200mg、100mg、50mg、25mg、10mg或5mg的平稳剂量(flatdoses)给药。典型地给药患者至少2剂抗体，在一些情况下，给药3、4或5剂。在一个具体实施方式中，所述2剂约隔2周给药。在最初的2剂之后，如需要，再次每隔3、6或9个月给药(additional doses)，用于维持治疗。更特别地，在减轻RA的方法中，2剂抗体在第1和15天给药。在消除B细胞和减轻自身免疫性疾病的方法中，在给药治疗剂量(therapeutic dose)前可给药初始耐受剂量(tolerating dose)，其中耐受剂量低于治疗剂量。
在前述消除B细胞或减轻自身免疫性疾病的方法之任意的特定具体实施方式中，结合CD20的抗体配制剂通过静脉内或皮下途径给药。
在前述B细胞消除和治疗方法之任意的特定具体实施方式中，自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎(juvenile rheumatoidarthritis)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、韦格纳氏病(Wegener’s disease)、炎性肠病(inflammatory bowel disease)、特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenic purpura，ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenic purpura，TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)、银屑病(psoriasis)、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、ANCA相关的脉管炎(ANCAassociated-vasculitis，AAV)、糖尿病，雷诺氏综合征(Reynaud’s syndrome)、斯耶格伦氏综合征(Sjgren’s syndrome)和肾小球肾炎。在更特定的具体实施方式中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
对于前述消除B细胞或减轻自身免疫性疾病的任意方法，在一个具体实施方式中，结合CD20的抗体是人源化抗体。在优选的具体实施方式中，人源化抗体是人源化2H7抗体，优选是如下表1所述的以下2H7变体型16、31、73、75、96、114、115、116、138、477、588、511和375之一。在不同实施方式中，人源化抗体包含以下这些VL和VH区对：L链可变区序列SEQ ID NO.1和H链可变区序列SEQ ID NO.2；L链可变区序列SEQ IDNO.15和H链可变区序列SEQ ID NO.12；或L链可变区序列SEQ ID NO.15和H链可变区序列SEQ ID NO.23。
人源化抗CD20抗体的其它具体实施方式是hA20(也称为IMMU-106、或90Y-hLL2；US 2003/0219433，Immunomedics)；和AME-133(US2005/0025764；Applied Molecular Evolution/EliLilly)。在不同的具体实施方式中，结合CD20的抗体是人抗体，优选是HUMAX-CD20TM(GenMab)。在另一个具体实施方式中，结合CD20的抗体是嵌合抗体，优选的具体实施方式是rituximab(Genentech，Inc.)和嵌合cA20抗体(US 2003/0219433中有描述，Immunomedics)。
在治疗RA的方法的一个具体实施方式中，利用选自非类固醇抗炎药物(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)、甲氨蝶呤、镇痛剂、糖皮质激素、环磷酰胺、阿达木单抗(adalimumab)、来氟米特(leflunomide)、英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、tocilizumab和COX-2抑制剂的药物，与结合CD20的抗体联合给药治疗。在一个具体实施方式中，用CD20抗体治疗RA的方法进一步包括向患者给药第二治疗剂。
附图简述
图1A是序列比对图，其比较了鼠2H7(SEQ ID NO.25)、人源化2H7.v16变体(SEQ ID NO.1)、和人kappa轻链亚型I(SEQ ID NO.26)之每一个的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下：CDR1(SEQ ID NO.27)、CDR2(SEQ ID NO.28)和CDR3(SEQ ID NO.29)。
图1B是序列比对图，其比较了鼠2H7(SEQ ID NO.30)、人源化2H7.v16变体(SEQ ID NO.2)、和重链亚型III的人共有序列(SEQ ID NO.31)的VH序列。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下：CDR1(SEQ ID NO.32)、CDR2(SEQID NO.33)和CDR3(SEQ ID NO.34)。
在图1A和图1B中，所示的每条链中的CDR1、CDR2和CDR3显示在括号内，其侧翼是框架区FR1-FR4。2H7指鼠2H7抗体。两排序列间的星号表示2个序列间不同的位置。残基编号是根据Kabat等(Sequences ofImmunological Interest.第5版.PublicHealth Service，National InstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991))所述进行的，其中插入如a、b、c、d、和e所示。
图2是如实施例2中所述的所有组(2H7研究组和Rituxan研究组的组合)中的平均绝对B细胞数[CD3-/CD40+]的概要图示。。
图3显示了实施例4中所述的类风湿性关节炎I/II期临床试验的剂量渐增方案(dose escalation scheme)。
图4显示了实施例4中所述的类风湿性关节炎I/II期临床试验的受试者的外周B细胞消除图，其基于平均绝对CD19计数。LLN表示正常组的低限。ULN指正常组的高限。NOM_TM_DAY＝距离治疗的天数。
图5显示了图4中的外周B细胞消除图，其基于平均绝对CD19计数，但其中Y轴延长了。
图6显示了安慰剂组的外周B细胞消除图，其基于平均绝对CD19计数。
优选的具体实施方式的详述
本文所用的“B细胞消除(B cell deletion)”指相对于治疗前的水平，药物或抗体治疗后动物或人中B细胞水平的降低。利用公知的测试，如通过得到全血计数、通过FACS分析染色已知的B细胞标记、和通过诸如实验示例中所述的方法，来测量B细胞水平。可部分或完全消除B细胞。在一个具体实施方式中，表达CD20的B细胞至少消除了25％。在接受B细胞消除药物的患者中，B细胞通常在这样的一段时间是消除的，所述一段时间指药物在患者体内循环的那段时间以及B细胞恢复所用的时间。
“自身免疫病”在本文中指由个体自身组织引起的并针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或由其产生的疾患。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎(Lyme-arthritis)、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎和幼年型类风湿关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、和强直性脊柱炎)、炎性过度增殖性皮肤病、银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疱性银屑病、和指甲银屑病、特应性病变包括特应性疾病诸如干草热(hay fever)和乔布氏综合征(Job’ssyndrome)、皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎、x连锁的高IgM综合征、荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹、多肌炎/皮肌炎、青少年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括系统性硬皮病)、硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼MS(spino-optical MS)、原发性进行性MS(PPMS)、和复发、缓解性MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调性硬化、炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏病、自身免疫介导的胃肠病、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、微观结肠炎(microscopic colitis)、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、和透壁性结肠炎、和自身免疫性炎性肠病)、坏疽性脓皮症、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、episcleritis、呼吸窘迫综合征，包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、整个或部分葡萄膜炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液学病症、类风湿性脊椎炎、突发性听觉丧失、IgE介导的疾病诸如过敏性和变应性和特应性鼻炎、脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen’s)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎、葡萄膜炎，诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎、具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)，包括I型和II型、和快速发展的GN、变应性状况和反应、变应性反应、湿疹包括变应性或特应性湿疹、哮喘诸如细支气管哮喘(asthma bronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)、和自身免疫性哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、针对外来抗原的免疫反应诸如针对妊娠过程中的胎儿A-B-O血型的免疫反应、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)诸如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发狼疮)、幼年期发作的(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性糖尿病性尿崩症(idiopathic diabetes insipidus)、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏感有关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病、粒细胞缺乏、血管炎病，包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu’s)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、微观(microscopic)多动脉炎、CNS血管炎、坏死性血管炎、皮肤性血管炎、超敏反应性血管炎、系统性坏死性血管炎、ANCA相关血管炎(AAV)，诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)和ANCA负性血管炎(ANCA-negative vasculitis)、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、库姆斯阳性贫血(Coombs positive anemia)、戴-布二氏(DiamondBlackfan)贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(anemia perniciosa)、阿狄森氏病、纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、白细胞渗出有关的疾病、CNS炎性病症、多器官损伤综合征诸如败血症、外伤或出血继发的、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、贝切特氏(
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)病/综合征、卡斯尔曼氏(Castleman’s)综合征、古德帕斯丘氏综合征、雷诺氏(Reynaud′s)综合征、斯耶格伦氏(Sjgren′s)综合征、史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征、类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)、和红斑性天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、莱特氏(Reiter′s)病或综合征、免疫复合物性肾炎、抗体介导的肾炎、视神经脊髓炎(NMO；也称为Devic’s syndrome)、多神经病、慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病、血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP、睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退、自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏病、多腺体综合征诸如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、瘤外综合征(paraneoplastic syndrome)，包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人(stiff-man)或僵体综合征、脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、和感觉神经病、多病灶运动神经病、席汉氏(Sheehan’s)综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴样间质性肺炎(LIP)、梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP、格-巴二氏综合征、贝格尔氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线性IgA皮肤病、原发性胆汁性肝硬化和肺硬变、自身免疫性肠病综合征、腹腔或腹部疾病、口炎性腹泻(麸质肠病)、难治的口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS；卢格里克氏(Lou Gehrig′s)病)、冠状动脉病、自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失、眼阵挛肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus syndrome，OMS)、多软骨炎诸如难治的或复发的或复发性多软骨炎、肺泡蛋白沉着症、淀粉样变、巩膜炎、非癌性淋巴细胞增多、原发性淋巴细胞增多，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)、周围神经病、瘤外综合征、通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、耳聋、盲、周期性瘫痪、和CNS的通道病、孤独症、炎性肌病、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝脏病学病症、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭(multiple endocrinefailure)、施密特氏(Schmidt’s)综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病、糖尿病性肾病、德雷斯勒氏(Dressler’s)综合征、斑秃、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍、指端硬化、和毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕不育、混合性结缔组织病、恰加斯氏(Chagas’)病、风湿热、习惯性流产、农民肺、多形红斑、心切开术后综合征、柯兴氏综合征、鸟爱好者肺、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞性血管炎、阿尔波特氏(Alport’s)综合征、肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风、疟疾、利什曼病、锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter氏综合征、卡普兰氏(Caplan’s)综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性肺间质纤维化、肺间质纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久隆起性红斑、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、舒尔曼氏(Shulman’s)综合征、费耳提氏(Felty’s)综合征、flariasis、睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)、或福克斯氏(Fuch’s)睫状体炎、亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾柯病毒感染(echovirus infection)、细小病毒感染、风疹病毒感染、种痘后综合征、先天性风疹感染、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎、埃文斯(Evan’s)综合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏(Sydenham’s)舞蹈病、链球菌后肾炎、闭塞性血栓脉管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞性多肌痛、慢性超敏性肺炎、干燥性角膜结膜炎、流行性角膜结膜炎、特发性肾炎综合征、微小病变肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、视网膜自身免疫、关节炎症、支气管炎、慢性阻塞性气道疾病、硅沉着病、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性病症、无精子形成(aspermiogenese)、自身免疫性溶血、伯克氏(Boeck’s)病、冷球蛋白血症、杜普伊特伦氏(Dupuytren’s)挛缩、晶体过敏性眼内炎(endophthalmiaphacoanaphylactica)、变应性小肠炎(enteritis allergica)、麻风结节性红斑、特发性面瘫、慢性疲乏综合征、风湿热(febris rheumatica)、哈-里二氏(Hamman-Rich’s)病、感觉神经性听觉缺失、阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺功能减退、局限性回肠炎、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎(traverse myelitis)、原发性特发性粘液水肿、肾病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、胰腺炎、急性多神经根炎、坏疽性脓皮症、奎尔万氏(Quervain’s)甲状腺炎、获得性脾萎缩(acquired spenic atrophy)、由于抗精子蛋白抗体(antispermatozoan antibody)导致的不育症、非恶性胸腺瘤、白癜风、SCID和EB病毒相关疾病(Epstein-Barr virus-associated disease)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病例如利什曼病(lesihmania)、中毒性休克综合征、食物中毒、T细胞浸润有关的病症、白细胞粘附缺陷、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答、白细胞渗出有关的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、变应性神经炎、自身免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原发性粘液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿病、混合性结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌衰竭(polyendocrine failure)、外周神经病、自身免疫性多腺综合征I型、成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)、全部脱发(alopecia totalis)、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita)(EBA)、血色素沉着、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦炎、额窦炎、上颌窦炎、或蝶窦炎、嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler’s)综合征、慢性嗜酸性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿、过敏反应、血清阴性脊椎关节炎病(spondyloarthritides)、多内分泌自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病、布鲁顿氏(Bruton’s)综合征、婴儿期一过性低丙种球蛋白血症、威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征、共济失调性毛细管扩张、与胶原病有关的自身免疫性病症、风湿病、神经病学疾病、淋巴结炎、缺血再灌注损伤、血压应答降低、血管功能障碍、血管扩张症(antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血、和伴随血管化的疾病、变应性超敏性病症、肾小球肾炎病(glomerulonephritides)、再灌注损伤、心肌或其它组织的再灌注损伤、具有急性炎性成分的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症、眼和眶炎性病症、粒细胞输血相关综合征、细胞因子诱发的毒性、急性重度炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病性肾病、糖尿病性大动脉疾病、动脉内增生、消化性溃疡、心瓣炎、和子宫内膜异位症。
如本文所使用的术语“非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’sLymphoma)”或“NHL”是指除何杰金氏淋巴瘤之外的淋巴系统的癌症。根据何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)细胞而非何杰金氏淋巴瘤中没有所述细胞通常可将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。如本文所使用的术语所涵盖的非何杰金氏淋巴瘤的实例包括本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学家)根据本领域已知的分类方案能够鉴定的任何淋巴瘤，所述分类方案诸如修订的欧洲美国淋巴瘤(REAL)方案，如Color Atlas ofClinicalHematology(3rd edition)，A.VictorHoffbrand and John E.Pettit(eds.)(Harcourt PublishersLtd.，2000)中所述。尤其参见图11.57、11.58和11.59中的列表。更具体的实例包括(但不限于)复发或难治的NHL，前线低级NHL(frontLineLow grade NHL)，III/IV阶段NHL，化疗耐受性NHL，前体B成淋巴细胞性白血病(precursor BLymphoblasticLeukemia)和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞性淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结节外边缘区MALT淋巴瘤，结节边缘区淋巴瘤，毛细胞性白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞性骨髓瘤，低级/滤泡淋巴瘤，中级/滤泡NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)，中级弥漫性NHL，弥漫性大B细胞淋巴瘤，攻击性(aggressive)NHL(包括攻击性前线NHL(aggressive front-lineNHL)和攻击性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或难治的NHL，原发纵隔大B细胞淋巴瘤，原发弥漫性淋巴瘤，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小无裂细胞(high grade small non-cleaved cell)NHL，贮积病(bulky disease)NHL，伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤，前体(外周)T细胞成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，成人T细胞淋巴瘤和/或白血病，T细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或幼淋巴细胞白血病，大颗粒状淋巴细胞性白血病，蕈样肉芽肿病和/或塞扎里综合征(Sezary syndrome)，淋巴结外(extranodal)天然杀伤细胞/T细胞(鼻型)淋巴瘤，肠病型T细胞淋巴瘤，肝脾T细胞淋巴瘤，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤，皮肤(表皮)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤，肠型T细胞淋巴瘤，外周T细胞(未有特殊说明)淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-cellLymphoma)。
“治疗”或“减轻”指治疗性处理和预防或防止性的措施，其中目的是防止或减缓(降低)靶病理状况或疾病。如果接受了根据本发明方法的治疗量的结合CD20的本发明抗体之后，受试者显示出具体疾病的一种或多种体征和症状的可观察或可测量的降低或缺少，则受试者自身免疫性疾病或CD20阳性B细胞恶性肿瘤得到了成功的“治疗”。例如，对于癌症是癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积减小；抑制(即，以某种程度减缓并优选停止)肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；增加症状缓解时长和/或某种程度地减轻与特定癌症相关的一种或多种症状；减少发病率和死亡率，并改善生活质量。疾病体征或症状的减轻也可凭患者的感觉。治疗可达到完全响应，其定义为所有癌症征候消失，或达到部分响应，其中肿瘤大小减小了，优选减小超过百分之50，更优选75％。如果患者经历着稳定的病情，这时也可认为患者得到了治疗。在优选的具体实施方式中，癌症患者在一年后，优选在15个月后，癌症无进展(progression-free)。这些评估治疗成功和改善疾病的参数可通过所属领域合适的医生所熟悉的常规过程来迅速地测量。
“治疗有效量”指抗体或药物的量，其能有效“治疗”受试者中的疾病或病症。在癌症病例中，治疗有效量的药物减少了癌细胞的数量；减小了肿瘤大小；抑制(即，以某种程度减缓并优选停止)癌细胞浸润外周器官；抑制(即，以某种程度减缓并优选停止)肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻与癌症相关的一种过多种症状。可参见前述“治疗”的定义。
“CD20”抗原是非糖基化的穿膜磷蛋白，其分子量约为35kD，其可在超过90％的外周血或淋巴器官的B细胞表面上发现。在早期前B细胞发育期间表达CD20，直到浆细胞分化；人干细胞、原祖淋巴细胞(lymphoidprogenitor cell)或正常浆细胞上没有发现它。CD20出现在正常B细胞以及恶性B细胞上。文献中CD20的其它名称包括“B-淋巴细胞限制性分化抗原”和“Bp35″。例如，CD20抗原在Clark和Ledbetter(Adv.Can.Res.52：81-149(1989))和Valentine等(J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287(1989))中有描述。
术语″抗体″以其最广意义使用，并具体涵盖了单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多特异性抗体(如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示出所希望的生物活性或功能即可。
本发明的CD20结合抗体的生物活性包括抗体与人CD20的结合，更优选是与人和其他灵长类(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩、狒狒)的CD20结合。抗体结合CD20的Kd值不高于1×10-8，优选Kd值不高于约1×10-9，并能杀死或清除体内的B细胞，优选其相对于不用该抗体处理的合适的阴性对照相比，清除至少20％。B细胞消除可以是ADCC、CDC、凋亡、或其它机制之一种或多种所造成的。在本文治疗疾病的一些具体实施方式中，特异性效应器功能或机制是所希望的，并且人源化2H7的某些变体或某些人CD20结合抗体优选实现那些生物功能，如ADCC。
“抗体片段”包含一部分全长抗体，一般是其抗原结合或可变的区域。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和抗体片段所形成的多特异性抗体。“Fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和结合位点。该片段由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域紧密地非共价连接成的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠得到了6个高变环(H和L链各3个)，其带有用于结合抗原的氨基酸残基并将抗原结合特异性赋予了抗体。即使单可变结构域(或Fv的一半，其仅包含3个特异针对抗原的CDR)仍具有识别和结合抗原的能力，但亲和力比完整结合位点低。
本文所用的术语“单克隆抗体”指来自实质均一的抗体群的抗体，即，包含在该群中的抗体个体是相同的和/或结合相同的表位，除了在生产单克隆抗体期间可能产生极少量的变体。该单克隆抗体典型地包括含能结合靶的多肽序列的抗体，其中靶结合多肽序列通过以下方法获得：其包括从多个多肽序列中选择出单靶位结合多肽序列。例如，选择过程可以从多个克隆中选择出独特的克隆，如从一组杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆中选择。例如，应当理解的是，可以进一步改变所选的靶结合序列，从而改善针对靶的亲和力，使靶结合序列人源化，改善其在细胞培养基中的产量，减少其体内免疫原性，创建多特异性抗体，等，而且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括抗不同决定簇(表位)的抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品中的每个单克隆抗体只针对抗原上单个决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体制品的优点还在于它们通常未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体得自实质均一的抗体群的特征，并不解释成需要以任何特定的方式产生的抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过各种技术制备，例如，杂交瘤技术(如，Kohler等，Nature，256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：ALaboratoryManual，(Cold SpringHarborLaboratory Press，第2版.1988)；Hammerling等，参见：Monoclonal Antibodies and T-cellHybridomas 563-681，(Elsevier，N.Y，1981))，重组DNA技术(参见如，美国专利4,816,567)，噬菌体展示技术(参见如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等.J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)，以及在具有人免疫球蛋白基因座位或编码人免疫球蛋白序列的基因的部分或全部的动物中生产人抗体或人样抗体的技术(参见如，WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国专利5,545,806；5,569,825；5,591,669(GenPharm)；5,545,807；WO1997/17852；美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016：Marks等， Bio/Technology， 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature， 368：856-859(1994)；Morrison， Nature， 368：812-813(1994)；Fishwild等， Nature Biotechnology， 14：845-851(1996)；Neuberger， Nature Biotechnology， 14：826(1996)；和Lonberg和Huszar， Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)。本发明的CD20结合抗体的“功能片段”是那些保持与CD20结合的片段，其亲和性与衍生它们的全长的完整分子的相同，并且，通过诸如本文所述的那些体外或体内测试所测，其能显示出包括消除B细胞的生物活性。
术语“可变”指可变结构域的某些片段可在抗体间的序列中存在大量差异的事实。V结构域介导抗原结合并限定了特定抗体针对其特定抗原的特异性。可是，可变性并不是在可变结构域的110个氨基酸的范围内平均分布的。事实上，V区由相对不变的15-30氨基酸个区段(称为框架区(FR))和分隔它的较短的分别为9-12个氨基酸长度的极度可变的区域(称为“高变区”)组成。天然重和轻链可变结构域分别包含4个FR，其大致采用β折叠构象，其由3个高变区相连，形成了环状连结，并在一些情况下形成了部分β折叠结构。每个链中的高变区通过FR紧密连结在一起，和其它链的高变区一起，用以形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.PublicHealth Service，NationalInstitutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出各种效应器功能，如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。
术语“高变区”在用于本文时，指起抗原结合作用的抗体氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”(如约在VL中残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和约在VH中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.PublicHealth Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))的氨基酸残基和/或来自“高变环”(如VL中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和VH中26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk  J. Mol.Biol.196：901-917(1987))的那些残基。
如本文所述的，“共有序列”或共有V结构域序列是人工序列，其源于对已知人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列的比较。根据这些比较，制备编码V结构域氨基酸的重组核酸序列，其是源于人κ和人H链亚型III V结构域的共有序列。共有V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和性。
本文中的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类型或亚类之抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分同源或相同于来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体的相应序列，以及这类抗体的片段，只要它们表现所需生物学活性(美国专利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供者抗体)，例如小鼠、大鼠、兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白Fv框架区(FR)的残基被相应的非人类残基代替。而且，人源化抗体可以包括在受者抗体或引入的CDR或框架序列中没有的残基。这些修饰用于进一步改进或最大化抗体性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常两个基本上全部的可变区，其中所有或基本上所有的超变环均对应于非人免疫球蛋白的超变环，而且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，尽管所述FR区可包括一个或多个能够提高结合亲和力的氨基酸取代。FR中的这些氨基酸取代的数目通常在H链中不多于6个，而在L链中，不多于3个。人源化抗体还任选至少包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
抗体“效应器功能”指那些归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性，并可随抗体同种型(isotype)而变化。抗体效应器功能的例子包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合性；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(如B细胞受体)和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指细胞毒性的形式，其中分泌的Ig结合在某些细胞毒性细胞(如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞)的Fc受体(FcR)上，其能使这些细胞毒性效应器细胞特异结合于含抗原的靶细胞上，随后用细胞毒性杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，而且为了有该杀伤作用而绝对需要这样。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet(Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991))的第464页的表3中有概述。如美国专利5,500,362或5,821,337号所述的，为了评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测试。用于该测试的效应器细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地，或另外，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内进行评估，如在动物模型中进行，如Clynes等．PNAS(USA)95：652-656(1998)所述的。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是具有天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体(gamma受体)的受体，并包含FcγRI、FcγRII、和FcγRIII亚型的受体，其包括等位基因变体并可选地包括这些受体的不同剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要区别在其细胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见综述M.in
Figure A20068000228200251
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述可见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其它FcR，包括将来鉴定出的那些，都涵盖在本文术语″FcR″内。该术语也包括新生受体(FcRn)，其负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol．24：249(1994))。
WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman等.)描述了具有改善的或减弱的与FcR结合的抗体变体。这些专利公开的内容明确纳入本文参考。也可参见，Shields等.J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”指在补体存在的条件下溶解靶细胞。补体系统的第一成分(Clq)与(合适亚型的)抗体的结合启动了经典补体途径的活化，所述抗体与它们识别的抗原结合。为了评估补体活化，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述，可进行CDC测试。
带有可变的Fc区氨基酸序列并具有增加或减少的Clq结合能力的多肽变体在美国专利6,194,551B1、WO99/51642中有描述。那些专利公开的内容明确纳入本文参考。也可参见，Idusogie等.J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
组合物
CD20抗体包括：“C2B8”，其现在称为“rituximab”(“RITUXAN”)(美国专利第5,736,137号)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，其命名为“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN)，其可通过商业渠道从IDECPharmaceuticals，Inc.获得(美国专利5,736,137；2B8在1993年6月22日以登录号HB11388保藏于ATCC)；鼠IgG2a“B1”，也称为“Tositumomab”，任选其可用131I标记以产生“131I-B1″或“碘I131 tositumomab”抗体(BEXXARTM)，其可通过商业渠道从Corixa获得(也可参见，美国专利5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press等.Blood 69(2)：584-591(1987)和其变体，包括“框架修补的(framework patched)”或人源化1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏号HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180)；人源化2H7(WO2004/056312Lowman等)和如下所述的)；HUMAX-CD20TM完整人抗体(Genmab，Denmark；参见如，Glennie和van deWinkel，Drug Discovery Today 8：503-510(2003)和Cragg等，Blood 101：1045-1052(2003))；WO2004/035607(Teeling等)提及的人单克隆抗体；US2004/0093621(ShitaRA等.)所述的具有复杂N-糖苷键的与糖链结合的Fc区的抗体；CD20结合分子，如AME系列的抗体，如，WO2004/103404提及的AME-133TM抗体(Watkins等，Applied Molecular Evolution)；A20抗体或其变体如嵌合或人源化A20抗体(分别为cA20、hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；和单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，其可得自国际白细胞分型研讨会(Valentine等，参见：Leukocyte TypingIII(McMichael，编，p.440，Oxford University Press(1987))。本文优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的、或人的CD20抗体，更优选是人源化2H7抗体、rituximab、嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)、和HUMAX-CD20TM人CD20抗体(Genmab)。
人源化抗体结合人CD20并优选还结合其它灵长类CD20，它包含H链，该H链具有非人物种抗人CD20抗体(供体抗体)H链的至少一个、优选2个或所有的CDR和人抗体(作为受体抗体)基本上所有的共有框架残基。供体抗体可以是各种非人物种，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、马、灵长类等的抗体，但最常见的是鼠抗体。上下文中的“基本所有”是指人源化抗体中的受体FR区可包含一个或多个最初不出现在人共有FR序列中的氨基酸。这些FR变化可包括未在受体或供体抗体中发现的残基。
在一个具体实施方式中，供体抗体是鼠2H7抗体，其如图1A和1B所示，V区包括H和L链之每一个的CDR和FR序列。在一个特定的具体实施方式中，用于人Fab框架的残基对应于人Vκ亚型I和VH亚型III的共有序列，这些共有序列分别如图1A和图1B所示。本发明的人源化2H7抗体具有鼠供体抗体H链中的至少一个CDR。在一个具体实施方式中，结合人CD20的人源化2H7抗体包含供体抗体H和L链的CDR。
在全长抗体中，本发明的结合CD20的人源化抗体包含连接于人免疫球蛋白C结构域上的人源化V结构域。在优选的具体实施方式中，H链C区来源于人IgG，优选来源于IgG1或IgG3。L链C结构域优选来源于人κ链。
为了本文中的目的，“人源化2H7”指完整的抗体或抗体片段，其包含可变轻链(VL)序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO：1)；
和
可变重链(VH)序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKF
KGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO：2)
其中人源化2H7抗体是完整的抗体，优选它包含v16轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：3)；
和
重链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKF
KGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGP
SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：4)
前述人源化2H7mAb的变体是2H7v.31，其具有与以上SEQ ID NO：3相同的L链序列，其带有H链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY
YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPLAATI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：5)
除了在下表1所示的氨基酸替换位置上，所有基于16型的其它变体的V区都具有v16的氨基酸序列。除非另外指明，2H7变体具有与v16相同的L链。人源化抗体2H7v.16也称为rhuMAb2H7或Ocrelizumab。
表1
2H7型 轻链(VL)变化 重链(VH)变化 Fc变化
16用于参考 -
31 - - S298A，E333A，K334A
73 M32L N100A
75 M32L N100A S298A，E333A，K334A
96 S92A D56A，N100A
114 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A
115 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A，E356D，M358L
116 M32L，S92A D56A，N100A S298A，K334A，K322A
138 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A，K326A
477 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A，K326A，N434W
375 - - K334L
588 - - S298A，E333A，K334A，K326A
511 M32L，S92A D56A，N100Y，S100aR S298A，E333A，K334A，K326A
表2
    2H7型     VLSEQ ID NO.     VHSEQ ID NO.   全长L链SEQ ID NO.   全长H链SEQ ID NO.
    16     1     2     3     4
    31     1     2     3     5
    73     6     7     8     9
    75     6     7     8     10
    96     11     12     13     14
    114     15     12     16     17
    115     15     12     16     18
    116     15     12     16     19
    138     15     12     16     20
    477     15     12     16     21
    375     1     2     3     22
    588     1     2     3     20
    511     15     23     16     24
残基编号是根据Kabat等(Sequences of Immunological Interest.第5版.PublicHealth Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991))的，其中的插入位显示为a、b、c、d、和e，而缺口在序列图中显示为破折号。例如，在纯化Ab期间或通过重组工程制备编码抗体多肽的核酸时，在包含Fc区的CD20结合抗体中，可去除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统是残基447)。因此，用于本发明的结合CD20的抗体组合物可包括带有K447、去除所有K447的抗体、或带有和不带有K447残基的抗体混合物。
IgG中的N-糖基化位点是在CH2结构域中的Asn297上。用于本发明治疗方法的CD20结合抗体包括具有Fc区的任意前述CD20抗体的组合物，其中组合物中的约80-100％(并优选约90-99％)的抗体包含成熟的核心碳水化合物结构，其缺少连于糖蛋白Fc区的海藻糖。本文证实该组合物显示了出人意料的对FcγRIIIA(F158)的改善的结合，其在与人IgG相互作用中不如FcγRIIIA(V158)有效。在正常、健康非洲裔美国人和高加索人中，FcγRIIIA(F158)比Fc(RIIIA(V158)更常见。可参见Lehrnbecher等.Blood 94：4220(1999)。
CD20结合抗体涵盖了双特异性的CD20结合抗体，其中抗体的一个臂具有能结合CD20的抗体的H和L链，如本发明人源化2H7抗体的H和L链，并且另一个臂具有针对第二抗原的V区结合特异性。在特定具体实施方式中，第二抗原选自：CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或其它NK活化配体。
治疗方法
Genentech和Biogen Idec的临床调查评估了利用从低至10mg直至1g的剂量范围的剂量的抗CD20抗体来治疗自身免疫性疾病的治疗效果(参见实施例4)。一般而言，在这些临床调查中给药抗体2剂，其间间隔约2周。临床调查研究的方案的例子包括，对于人源化CD20抗体2H7，以2×10mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为～10.1mg/m2)、2×50mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为55mg/m2)、2×200mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为220mg/m2)、2×500mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为～550mg/m2)和2×1000mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为～1100mg/m2)；而对于Rituxan，以2×500mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为～550mg/m2)、2×1000mg(对于70kg、67英寸高的患者，总剂量为～1100mg/m2)。在给药第一剂抗体后，观察到用了这些剂量之每一种，能实质(基本)消除(substantial deletion)循环的B-淋巴细胞。目前，用人源化2H7v16以单次或双次静脉内输注来研究10mg至2000mg的剂量范围。
本发明提供了通过向患者以稳定的0.1mg至1000mg剂量范围(at a flatdose in the range of 0.1mg to 1000mg)给药结合CD20的抗体来治疗自身免疫性疾病和消除患有自身免疫性疾病的患者中B细胞的方法。有益的是，能将剂量减少到最小治疗有效剂量。我们发现以少于300mg(甚至以10mg)的剂量，都能达到对B细胞的实质消除。所以，在本B细胞消除和治疗方法的优选的具体实施方式中，以0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200或250mg的剂量给药结合CD20的抗体。所希望的剂量取决于疾病和疾病的严重性、疾病的阶段、所希望调节的B细胞水平、和其它所述领域医师熟悉的因素。如果部分或短期B细胞消除是要达到的目的，则可用更低的剂量，如以20mg、10mg或更低。
50、75、100、125、150、200、或250mg的剂量也可用于针对B细胞恶性肿瘤的维持治疗中，如用于治疗NHL。
所希望消除的B细胞水平取决于疾病。为了治疗CD20阳性的癌症，期望最大化地消除B细胞，所述细胞是本发明抗CD20抗体的靶标。所以，为了治疗CD20阳性的B细胞瘤，期望B细胞消除到至少足以阻止疾病进展，这可由所属领域医师评估，如通过监测肿瘤生长(大小)、癌细胞类型的增殖、转移、特定癌的体征和症状。优选B细胞消除到足以防止疾病进展至少2个月，更优选3个月，更加优选4个月，更优选5个月，更加优选6或更多月。在更优选的具体实施方式中，B细胞消除到足以增加缓解的时间至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，更加优选5或更多年。在最优选的具体实施方式中，B细胞消除到足以治愈疾病。在优选的具体实施方式中，癌患者中的B细胞比治疗前的基线水平至少消除了约75％、并更优选80％、85％、90％、95％、99％，甚至达到100％。
为了治疗自身免疫性疾病，期望通过调节结合CD20的抗体的剂量来调节B细胞消除的程度，这取决于患者个体中的疾病和/或病况的严重性。所以，B细胞消除可以是完全的，也可以是不完全的。或者，期望在最初的治疗中完全消除B细胞，但在接下来的治疗中，调节剂量使之仅达到部分消除。在一个具体实施方式中，B细胞至少消除了20％，即相对于治疗前的基线水平，仍保留了80％或更少的CD20阳性的B细胞。在另外的具体实施方式中，B细胞消除了25％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。优选B细胞消除到足以阻断疾病进展，更优选在治疗下能减轻特定疾病的体征和症状，更加优选能治愈疾病。
给药频率可根据几个因素而变化。患者可接受1-5剂、优选至少2剂的结合CD20的抗体。例如，1个月内给药2剂，优选在第一剂后约2周内给药第2剂。根据疾病改善或复发水平，在疾病或疾病维持治疗的过程中可给药另外的剂量。
利用本发明的剂量方案可以治疗对一种或多种当前的治疗是无效的、耐受差的(pooly tolerated)、禁忌的(contraindicated)患有自身免疫性疾病或B细胞恶性肿瘤的患者。例如，本发明涉及针对RA患者的目前治疗方法，所述患者对肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂疗法或对缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)疗法没有足够的反应(inadequate response)。
在另一个具体实施方式中，本发明的低剂量治疗可用于维持治疗中。
评估治疗瘤的功效或成功程度的参数对有处理适当疾病经验的医师来说是已知的。一般来说，有经验的医师将寻找特定疾病体征和症状的减轻情况。参数可包括疾病进展的平均时间(median time to desease progression)、缓解的时间(time in remission)、稳定的病情(stable disease)。以下参考文献描述了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗和标准医疗过程，用于测量治疗功效。Canellos GP，Lister，TA，Sklar JL：TheLymphomas.W.B.Saunders公司，Philadelphia，1998；van Besien K和Cabanillas，F：Clinical Manifestations，Staging and Treatment of Non-Hodgkin′sLymphoma，第70章，pp 1293-1338，参见：Hematology，Basic Principles and Practice，第三版.Hoffman等(编辑).ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000；和Rai，K和Patel，D：ChronicLymphocyticLeukemia，第72章，pp 1350-1362，参见：Hematology，Basic Principles and Practice，第三版.Hoffman等(编辑).ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000。
评估治疗自身免疫或自身免疫相关疾病的功效或成功程度的参数对有处理适当疾病经验的医师来说是已知的。一般来说，有经验的医师将寻找特定疾病体征和症状的减轻情况。
在一个具体实施方式中，本发明的剂量和给药方案可用于治疗类风湿性关节炎(RA)。
RA是衰老性的自身免疫性疾病，其影响了2百万美国人，并干扰了受害者的日常活动。RA发生在自身免疫系统不适当地攻击关节组织并造成破坏健康组织和损伤关节的慢性炎症的时候。症状包括关节炎症、肿胀、僵硬、和疼痛。另外，由于RA是全身性疾病，所以它对其它组织(如肺、眼和骨髓)也有影响。还没有已知的治愈方法。治疗包括各种类固醇和非类固醇抗炎药物、免疫抑制剂、缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)和生物制剂。可是，许多患者一直对治疗无适当的反应。
抗体可在早期RA(即，未接触甲氨蝶呤(MTX))的患者中用作第一线的治疗剂，其可作为单独的治疗剂进行治疗或同诸如MTX或环磷酰胺联合治疗。或者，抗体可作为第二线治疗来用于治疗DMARD和/或MTX难治的患者，其可作为单独的治疗剂进行治疗或同诸如MTX联合治疗。人源化CD20结合抗体用于防止和控制关节损伤，延迟结构性损伤，减轻与RA中炎症有关的疼痛，并通常减轻中度至重度RA的体征和症状。在用其它用于治疗RA的药物治疗前、后或同时(参见以下组合治疗)，可用人源化CD20抗体治疗RA患者。在一个具体实施方式中，以前用缓解疾病的抗风湿药物治疗失败的和/或未对单独使用甲氨蝶呤作出适当反应的患者，用本发明的结合CD20的人源化抗体进行治疗。在本治疗的一个具体实施方式中，患者在17天治疗方案中单独接受结合CD20的人源化抗体(在第1和15天静脉输注1g)；结合CD20的抗体加环磷酰胺(在第3和17天静脉输注750mg)；或结合CD20的抗体加甲氨蝶呤。
评估对RA的治疗功效的一个方法是基于美国风湿病学学院(ACR)标准的，其除了其它事项，还测量了触痛和肿胀关节的改善百分比。对RA患者进行评分，例如，相对于不用抗体治疗的(如治疗前的基线)或用安慰剂治疗的有ACR20(百分之20改善)。评估抗体治疗功效的其它方式包括X射线评分，如Sharp X射线评分，将其用于为结构性损伤评分，如骨侵蚀和关节间隙变窄。在治疗期间或治疗后，也可根据健康评估问卷[HAQ]得分、AIMS得分、SF-36，对患者残疾的防止或改善程度进行评估。ACR20标准可包括在触痛(疼痛)关节计数和肿胀关节计数中有20％的改善，并在5个以下附加的测试中的至少三个中有20％改善：
1.通过可视类似测量(visual analog scale)(VAS)得到的患者的疼痛评估，
2.疾病活跃度的患者的全面评估(VAS)，
3.疾病活跃度的医师的全面评估(VAS)，
4.健康评估问卷测得的患者的自我评价的残疾程度，和
5.急性期反应物、CRP或ESR。
ACR50和70的定义相似。优选向患者给药有效量的本发明结合CD20的抗体，其能有效得到至少ACR20的分数，优选至少ACR30，更优选至少ACR50，更加优选至少ACR70，最优选至少ACR75并更高。
银屑病关节炎具有独特和不同的放射影像特征。对于银屑病关节炎，也可通过Sharp评分来评估关节侵蚀和关节间隙变窄。本发明的人源化CD20结合抗体可用于防止关节损伤并减轻病症的疾病体征和症状。
而本发明的另一方面是通过向患有SLE的患者给药治疗有效量的本发明结合CD20的人源化抗体来治疗狼疮或SLE的方法。SLE患者包括有肾外表现和狼疮肾炎的患者。SLEDAI评分提供了对疾病活跃度的数字化定量。SLEDAI是24个已知与疾病活跃度相关的临床和实验室参数的加权指数，其数值范围是0-103。可参见Bryan Gescuk & John Davis，“Noveltherapeutic agent for systemicLupus erythematosus”，Current Opinion inRheumatology 2002，14：515-521。认为双链DNA的抗体能造成肾潮红(renalflare)和其它狼疮表现。经受抗体治疗的患者可监测一段时间的肾潮红(将其定义为重要指标)、血清肌酸酐反复升高、尿中有尿蛋白或血。可选地或额外地，可监测患者抗核抗体和针对双链DNA的抗体水平。对SLE的治疗包括高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。
对于脉管炎，约75％的患有全身性脉管病的患者带有抗嗜中性粒细胞细胞质抗体，并可根据影响小/中脉管的情况确定为3种病症中的一种：韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosus，WG)、微小多脉管炎(microscopicpolyangiitis，MPA)和Churg Strauss综合症(CSS)，统称为ANCA相关的脉管炎(AAV)。
脊椎关节病是一组关节病症，  包括强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、银屑病关节炎和克罗恩病(Crohn’s disease)。通过有效的患者和医师全面评价测量工具可确定治疗的成功程度。
各种药物可用于治疗银屑病；治疗差异直接与疾病严重性有关。患有较轻形式银屑病的患者通常使用局部治疗，如局部使用类固醇、蒽啉、calcipotriene、clobetasol、和tazarotene，从而治疗疾病，而患有中度和严重银屑病的患者更可能使用全身性(甲氨蝶呤、类维生素A、环孢霉素、PUVA和UVB)疗法。也可用焦油(tars)。这些疗法治疗具有安全性问题、方案耗时、或过程不便问题。而且，一些需要昂贵的设备和专门的设施空间。全身性药物可产生严重的副作用，包括高血压、高脂血、骨髓抑制、肝病、肾病和肠胃紊乱。另外，使用光疗法可增加皮肤癌的几率。除了与使用局部治疗相关的不便性和不适性，光疗法和全身性治疗需要让患者循环接受和不接受治疗，并需要终生监测它们的副作用。
银屑病的治疗功效通过监测疾病的临床体征和症状的变化来评估，包括相对于基线状态进行医师的全面评价(PGA)变化和银屑病面积和严重指数(PASI)评分、银屑病症状评价(PSA)。通过用于在特定时间点显示出所经受的瘙痒程度的可视类似测定处理方式，可周期性地对患者进行测量。
患者接受首次输注治疗性抗体，可遭受输注反应或输注相关的症状。这些症状随严重性而变化，一般通过医疗干预而可逆。这些症状包括而不限于流感样发热、受寒/寒战、恶心、风疹、头疼、支气管痉挛、血管性水肿。预期本发明的疾病治疗方法可最小化输注反应。为了减轻或最小化该不利事件，患者可以接受初始适应剂量(conditioning dose)或耐受剂量的抗体，然后再以治疗有效剂量接受抗体。适应剂量低于治疗有效剂量，从而使患者适应以接受更高剂量。
给药途径
根据已知方法向人患者给药CD20结合抗体，如通过静脉内给药(如，在一段时间用推注(bolus)或通过持续输注)、通过皮下、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑液内、鞘内、或吸入途径进行，一般通过静脉内或皮下给药。
在一个具体实施方式中，通过静脉内输注给药人源化2H7抗体，其中0.9％氯化钠溶液作为输注载体。
联合疗法
在治疗上述B细胞瘤中，可用本发明的CD20结合抗体与一种或多种治疗剂以多药物方案来联合治疗患者，所述治疗剂如化学治疗剂。化学治疗剂可与结合CD20的抗体同时、顺序或交替地进行给药，或在其它疗法无反应后再给药。标准的治疗淋巴瘤的化学疗法可包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑和米托蒽醌加美法仑。CHOP是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的最常用化疗方案之一。以下是CHOP方案中所用的药物：环磷酰胺(商标名为cytoxan、neosar)；阿霉素(阿霉素/羟基阿霉素)；长春新碱(硫酸长春新碱)；和泼尼松龙(有时称为Deltasone或Orasone)。在特定的具体实施方式中，将结合CD20的抗体与一种或多种以下化学治疗剂联合给药给需要它的患者：阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙。在特定的具体实施方式中，遭受淋巴瘤(如非何杰金氏淋巴瘤)的患者用本发明的抗CD20抗体与CHOP治疗剂(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙)联合治疗。在另一个具体实施方式中，癌症患者用本发明结合CD20的人源化抗体与CVP治疗剂(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙)联合治疗。在特定的具体实施方式中，患CD20阳性NHL的患者用人源化2H7.v16与CVP联合治疗。在治疗CLL的特定具体实施方式中，结合CD20的抗体与氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺之一或二者联合给药。
″化疗剂″为可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括：烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTATM)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxideHydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Angew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、AD 32、alcarubicin、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、GPX-100、伊达比星(idarubicin)、KRN5500、美诺立尔(menogaril)、蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星，多柔比星脂质体(liposomal doxorubicin)和脱氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid)(leucovorin)；醋葡醛内酯(aceglatone)；抗叶酸抗瘤剂(anti-folateanti-neoplastic agents)，如ALIMTA、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氢叶酸还原酶抑制剂(如甲氨蝶呤(methotrexate))、抗代谢剂(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU))和其前药如UFT、S-1和卡培他滨(capecitabine))、和胸苷酸合成酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶抑制剂如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEXRM，TDX)；二氢嘧啶脱氢酶抑制剂，如恩尿嘧啶(eniluracil)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE，FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)和紫杉烷类(taxanes)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂；铂类似物或基于铂的类似物，诸如顺铂(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；长春花生物碱(vinca alkaloid)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(prednisolone)联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方案的缩写)。
该定义还包括：起调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药，诸如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
在治疗上述自身免疫性疾病或自身免疫相关病症中，可用一种或多种CD20结合抗体与第二治疗剂以多药物方案来联合治疗患者，所述第二治疗剂如免疫抑制剂。结合CD20的抗体可与免疫抑制剂同时、顺序或交替给药，或用其它疗法无反应后进行给药。免疫抑制剂可以与现有技术提及的相同或更低的剂量来给药。优选的辅助免疫抑制剂取决于许多因素，包括要治疗的病症类型以及患者病史。
本文所用的用于辅助治疗的“免疫抑制剂”指物质，其用以抑制或掩蔽患者的免疫系统。该制剂包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。该制剂的例子包括类固醇，如糖皮质激素，如强的松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、和地塞米松；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺，如果对硫唑嘌呤有副作用的话)；溴隐定；戊二醛(如美国专利4,120,649所述，其掩蔽MHC抗原)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β、或-α抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体；抗白细胞介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；可溶性肽，其包含LFA-3结合结构域(公开于7/26/90的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精液蛋白；雷帕霉素；T细胞受体(美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；和WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)，如T10B9。
为了治疗类风湿性关节炎，用结合CD20的抗体(如rituximab或ocrelizumab或其变体)和一种或多种以下药物联合治疗患者：DMARDS(缓解疾病的抗风湿药物(如，甲氨蝶呤)、NSAI或NSAID(非类固醇抗炎药物)、免疫抑制剂(如，硫唑嘌呤；麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)(CellCept；Roche))、镇痛剂、糖皮质激素、环磷酰胺、HUMIRATM(adalimumab；AbbottLaboratories)，ARAVA(来氟米特)、REMICADE(infliximab；Centocor Inc.，Malvern，Pa)、ENBREL(依那西普；Immunex，WA)、ACTEMRA(tocilizumab；Roche，瑞士)、COX-2抑制剂。RA中常用的DMARD是羟氯醌(hydroxycloroquine)、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、Gold(口服)、Gold(肌肉注射)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂。阿达木单抗(Adalimumab)是与TNFα结合的人单克隆抗体。英夫利昔单抗是与TNFα结合的嵌合单克隆抗体。依那西普是“免疫粘附素”的融合蛋白，其由与人IgG1 Fc部分相连的人75kD(p75)肿瘤坏死受体(TNFR)的胞外配体结合部分组成。ActemRA(tocilizumab)是人源化的抗人白细胞介素-6(IL-6)受体。对于传统的RA治疗，参见如，“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis”Arthritis & Rheumatism 46(2)：328-346(2002年2月)。在特定的具体实施方式中，用本发明的CD20抗体与甲氨蝶呤(MTX)联合治疗RA患者。MTX的示例性的剂量约为7.5-25mg/kg/周。MTX可口服和皮下给药。
为了治疗强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩病(crohn′s disease)，用本发明的结合CD20的抗体与诸如Remicade(infliximab；from CentocorInc.，of Malvern，Pa.)、ENBREL(依那西普；Immunex，WA)联合治疗患者。
SLE的疗法包括将CD20抗体与高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)组合。患SLE、AAV和NMO的患者可用本发明的结合CD20的抗体与以下之任何药物联合治疗：皮质类固醇、NSAID、镇痛剂、COX-2抑制剂、糖皮质类固醇、传统的DMARDS(如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、羟氯醌、来氟米特)、DMARD生物制剂，如抗Blys(如，belimumab)、抗IL6R，如tocilizumab；CTLA4-Ig(abatacept)、(抗CD22，如epratuzumab)、免疫抑制剂(如，硫唑嘌呤；麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)(CellCept；Roche))、和细胞毒剂(如，环磷酰胺)。
为了治疗银屑病，患者用结合CD20的抗体与局部治疗剂联合给药，所述局部治疗剂如局部用类固醇、蒽啉(anthralin)、calcipotriene、clobetasol、和tazarotene，或和甲氨蝶呤、类维生素A、环孢霉素、PUVA和UVB治疗剂给药。在一个具体实施方式中，用结合CD20的抗体与环孢霉素顺序或同时治疗银屑病患者。
为了最小化毒性，传统全身性治疗剂可与结合CD20的抗体组合物以当前剂量用轮流、顺序、组合、或间歇的治疗方案或以更低的剂量组合方案来进行给药。
药物配制剂
制备依照本发明使用的抗体的治疗用制剂，即将具有所需纯化程度的抗体与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，.Ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性抗CD20抗体制剂描述于WO 1998/56418，其明确地引入本文作为参考。另一制剂是液体多剂量(multidose)制剂，其中含有40mg/mL抗CD20抗体，25mM醋酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酯20，pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一种感兴趣的抗CD20制剂在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL二水合柠檬酸钠，0.7mg/mL聚山梨酯80，和注射用无菌水，pH 6.5中包含10mg/mL抗体。而另一种水性药用制剂包含约pH 4.8-约pH 5.5，优选pH5.5的10-30mM醋酸钠，量约为0.01-0.1％v/v的聚山梨酯20作为表面活性剂，量约为2-10％w/v的海藻糖以及苯甲醇作为防腐剂(U.S.6,171,586)。WO 97/04801中描述了适用于皮下给药的冻干制剂。这种冻干制剂可用合适的稀释液重建成高蛋白质浓度，且重建后的制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。
人源化2H7变体的一种制剂是在10mM组氨酸，6％蔗糖，0.02％聚山梨酯20，pH 5.8含12-14mg/mL的抗体。
在具体的实施方案中，2H7变体且尤其是2H7.v16的配制如下，在10mM组氨酸硫酸盐，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，以及注射用无菌水，pH5.8中含20mg/mL的抗体。
本文中的制剂还可包含治疗特定适应症所需的一种以上的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，在所述制剂中还可以进一步提供细胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的药剂，诸如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。此类其它试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾病或病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常以与上文所用相同的剂量和给药路径使用，或是迄今所用剂量的约1-99％。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.Ed.(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
实验示例
实施例1
制备人源化2H7抗体变体并测试生物功能，包括人CD20结合亲和力。效应器功能和B细胞消除如WO 04/056312所述，其全文纳入本文参考。鼠2H7抗体可变区序列和带有鼠V和人C的嵌合2H7已描述，如参见，美国专利5,846,818和6,204,023。
实施例2
在猕猴初步研究中的2H7变体的体内效应
瞬间转染CHO细胞制备的2H7变体在正常雄性猕猴(Macacafascicularis)中测试，以评估它们的体内活性。其它抗CD20抗体，如C2B8(Rituxan)，已经证明了能清除正常灵长类的B细胞(Reff等，Blood 83：435-445(1994))。
在一个研究中，比较人源化2H7变体。在平行的研究中，也在猕猴中测试Rituxan。5个剂量组中的每一组使用了4只猴子：(1)载体，(2)0.05mg/kgHu2H7.v16，(3)10mg/kg Hu2H7.v16，(4)0.05mg/kg Hu2H7.v31，和(5)10mg/kg Hu2H7.v31。以0、0.2、或20mg/mL的浓度静脉内给药抗体，总共给药2剂，研究第1天一剂，另一剂在第8天给予。给药的第一天定为第1天，而前一天定为第-1天；恢复的第一天(对于每组中的2只动物)定为第11天。在第-19、-12、1(给药前)天并在第一次给药后6h、24h、和72h，收集血样。其它样品在第8天(给药前)、第10天(宰杀2只动物/组前)、和第36和67天(对于恢复的动物)获取。
外周B细胞浓度用对CD3-/CD40+细胞计数的FACS法确定。猴样品中总淋巴细胞的CD3-CD40+B细胞百分比用以下门控策略来获得。淋巴细胞群标记在正向散射/侧散射散点图上从而定义出区域1(R1)。利用R1中的事件，显示出针对CD40和CD3标记物的荧光强度点图。荧光标记的同种型(isotype)对照用于分别确定CD40和CD3阳性的截止点(cutoff point)。
结果显示，2H7.v16和2H7.v31都能以10mg/kg的剂量产生完全外周B细胞消除，并以0.05mg/kg的剂量产生部分外周B细胞消除(图2)。对于这2种抗体，给药的第一个72h期间测量的B细胞消除的时间进程和程度是相似的。接下来对恢复的动物分析显示，相对于用2H7.v16给药的那些，用2H7.v31治疗的动物显示出延长的B细胞消除。特别是用10mg/kg2H7.v16治疗的恢复动物，B细胞在第10天和第36天取样之间的某个时间显示出了实质的B细胞恢复(substantial B-cell recovery)。可是，对于用10mg/kg2H7.v31治疗的恢复动物，直到第36天和第67天之间的某个时间，B细胞才显示出恢复(图2)。这提示了相对于2H7.v16，通过用2H7.v31可有长出约一个月的持续完全消除时间。
在猴子研究中以低或高剂量时没有观察到有毒性，而且宏观病理也正常。在其它研究中，隔2周向这些猴子静脉给药2剂后，v16能良好地耐受到所评估的最高剂量(100mg/kg×2＝1200mg/m2×2)。
比较用2H7.v16处理的猕猴(cynomolgus monkey)的数据和用Rituxan处理的猕猴的数据提示了，CDC活性降低5倍没有不利地影响效力。对第一次输注反应而言，具有强ADCC活性但CDC活性降低的抗体比具有较大CDC活性的抗体，具有更良好的安全性。
实施例3
体内抑制肿瘤生长
在Balb/c裸(无胸腺的)鼠中评估rhuMAb2H7.v16抑制Raji人B细胞-淋巴瘤细胞系(ATCC CCL 86)生长的能力。Raji细胞表达CD20，据报道其在裸鼠中生长，产生转移性疾病；Rituxan抑制肿瘤生长(Clynes等，NatureMedicine 6，443-446(2000))。56只8-10周大的Balb/c裸鼠分成7组(A-G)，每组由8只鼠组成。在第0天，每只鼠在胁腹接受皮下注射5×106个Raji B-淋巴瘤细胞。从第0天开始，每只鼠接受100μl阴性对照溶液(PBS；磷酸缓冲盐溶液)、Rituxan或2H7.v16。剂量取决于体重，而且由尾静脉静脉递送药物。组A的鼠接受PBS。组B-D分别以5.0mg/kg、0.5mg/kg、和0.05mg/kg接受Rituxan。组E-G的鼠分别以5.0mg/kg、0.5mg/kg、和0.05mg/kg接受2H7v.16。每周重复进行注射，进行6周。治疗期的每周间隔中，检查每只鼠在其注射位点上出现的可触及的肿瘤，如果存在肿瘤，测量并记录肿瘤体积。在第8周(不进行治疗的2周间隔期后)进行最后一次检查。
该研究结果显示在裸鼠中，rhuMAb2H7.v16和Rituxan都能有效地抑制皮下Raji细胞的肿瘤生长。从第4周开始，在PBS对照组中观察到肿瘤生长。可是，在用5mg/kg或0.5mg/kg Rituxan或2H7.v16治疗8周的研究的组中没有观察到肿瘤生长。在0.05mg/kg的低剂量治疗组中，在2H7组中的一只动物上和在Rituxan组中的一只动物上观察到了肿瘤。
实施例4
中度至重度类风湿性关节炎的rhuMAb2H7(2H7.v16)的I/II期研究
规程大纲
随机的、安慰剂对照的、多中心的、双盲的I/II期安全性研究，研究患有中度至重度类风湿性关节炎的受试者中逐步提高的PRO70769(rhuMAb2H7)剂量，其中受试者同时接受稳定剂量的甲氨蝶呤。
目的
本研究的主要目的是在患有中度至重度类风湿性关节炎(RA)的受试者中评估逐步提高的PRO70769(rhuMAb2H7)静脉内注射(IV)剂量的安全性和耐受性。
研究设计
这是随机的、安慰剂对照的、多中心的、对调查人员和受试者双盲的I/II期研究，其在患有中度至重度RA的受试者中研究剂量逐步提高的PRO70769与MTX组合治疗的安全性。该研究由剂量递增期和大量受试者参与的第二期组成。
患有中度至重度RA的受试者参与进来，所述受试者用一至五种缓解疾病的抗风湿药物或生物制剂治疗失败了，他们目前对用MTX治疗未达到满意的临床反应。
受试者需要每周接受10-25mg的MTX，在开始研究前至少进行12周，并在接受研究药物(PRO70769或安慰剂)的最初剂量之前以稳定的剂量进行至少4周。受试者也可接受稳定剂量的口服皮质类固醇(多至每天10mg或强的松等价物(equivalent))和稳定剂量的非类固醇抗炎药物(NSAID)。根据以下剂量递增计划，受试者在第1和15天以所示计量接受2次静脉输注PRO70769或安慰剂等价物(参见图3)。
剂量递增将根据具体标准进行，而且它在由内部安全性数据评判委员会评判安全性数据以及每组最后一个受试者进行第二次输注后72小时急性毒性评估之后进行。如果在剂量递增期证实了所述剂量水平是可耐受的，则剂量递增期之后，40个额外的受试者(32个用活性剂和8个用安慰剂)随机接受以下一种剂量水平：2×50mg、2×200mg、2×500mg和2×1000mg。约205个受试者参与本研究。
获得并记录B细胞数。在6个月的功效评估后48周的随访期内，用流式细胞仪评估B细胞数。B细胞消除不视作剂量限制性毒性(dose-limitingtoxicity)(DLC)，但视作PRO70769治疗的预期药效结果。
在可选的子课题研究中，在各种时间点上从受试者中获取用于血清和RNA分析的血样以及尿样。这些样品用于在患有中度至重度RA的受试者中鉴定生物标志物，所述标志物可预报PRO70769治疗的响应程度。
测定结果
用于本研究的主要测定结果(primary outcome measure)是患有中度至重度RA的受试者中PRO70769的安全性和耐受性。
治疗研究
根据以下递增计划，受试者组以所示剂量在第1和15天接受2次静脉输注PRO70769或安慰剂等价物：
-10mg PRO70769或安慰剂等价物：4个受试者接受活性药物，1个接受对照
-50mg PRO70769或安慰剂等价物：8个受试者接受活性药物，2个接受对照
-200mg PRO70769或安慰剂等价物：8个受试者接受活性药物，2个接受对照
-500mg PRO70769或安慰剂等价物：8个受试者接受活性药物，2个接受对照
-1000mg PRO70769或安慰剂等价物：8个受试者接受活性药物，2个接受对照
功效
通过ACR应答测定PRO70769功效。达到ACR20、ACR50和ACR70应答的受试者百分比按治疗组以95％置信区间来总结，由此为每组得出受试者中的百分比。这些应答的组分和它们相对于基线的改变按治疗组和参照组来总结。
结果
在研究中，受试者的外周B细胞数的初步结果如图4-6所示。结果显示，包括最低的10mg剂量的所有剂量都造成了实质的初始的B细胞消除。10mg×2的剂量诱导出了持续时间较短的B细胞消除，其趋势是在第28和84天期间缓慢的恢复，并持续下去。
实施例5
中度至重度类风湿性关节炎中rhuMab2H7的临床研究基本如实施例4中所述的来设计。根据以下递增计划，受试者组以所示剂量在第1和15天接受静脉输注PRO70769或安慰剂等价物：
-0.1mg PRO70769或安慰剂等价物：80个受试者接受活性药物，20个接受对照；对于以下剂量组也是一样的
-1mg PRO70769或安慰剂等价物：
-10mg PRO70769或安慰剂等价物：
-25mg PRO70769或安慰剂等价物：
-100mg PRO70769或安慰剂等价物：
功效如上述所评估的。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)
<120>治疗方法
<130>P2199R1 US
<141>2006-01-13
<150>US 60/644,059
<151>2005-01-13
<160>34
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
 1                5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>2
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser
<210>3
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                110                 115                 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
                125                 130                 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                140                 145                 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
                155                 160                 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
                170                 175                 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
                185                 190                 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
                200                 205                 210
Gly Glu Cys
<2l0>4
<211>452
<212>PRT
<2l3>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>5
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>6
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>7
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser
<210>8
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                110                 115                 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
                125                 130                 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                140                 145                 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
                155                 160                 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
                170                 175                 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
                185                 190                 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
                200                 205                 210
Gly Glu Cys
<210>9
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>10
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
   1              5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hi s Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>11
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>12
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser
<210>13
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                110                 115                 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
                125                 130                 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                140                 145                 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
                155                 160                 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
                170                 175                 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
                185                 190                 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
                200                 205                 210
Gly Glu Cys
<210>14
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>15
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                 85                  90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg
<210>16
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
                 95                 100                 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                110                 115                 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
                125                 130                 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                140                 145                 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
                155                 160                 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
                170                 175                 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
                185                 190                 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
                200                 205                 210
Gly Glu Cys
<210>17
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                 440                445                 450
Gly Lys
<210>18
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>19
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>20
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>21
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Ala Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>22
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val yal Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Leu Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Se r Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>23
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser
<210>24
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
                125                 130                 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
                140                 145                 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                155                 160                 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                170                 175                 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
                185                 190                 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
                200                 205                 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
                215                 220                 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
                275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
                290                 295                 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                305                 310                 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
                320                 325                 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
                335                 340                 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                350                 355                 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                365                 370                 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                380                 385                 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                395                 400                 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                410                 415                 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                425                 430                 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                440                 445                 450
Gly Lys
<210>25
<211>106
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>25
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
  1               5                  10                  15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
                 20                  25                  30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
                 35                  40                  45
Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
                 50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
                 65                  70                  75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
                 80                  85                  90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
                 95                 100                 105
Lys
<210>26
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
                 20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>27
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
                  5                  10
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠(Mus mulsculus)
<400>28
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser
                  5
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>29
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
                  5
<210>30
<211>121
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>30
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
                 65                  70                  75
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
                 80                  85                  90
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
                 95                 100                 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val
                110                 115                 120
Ser
<210>31
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
                 20                  25                  30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
                 95                 100                 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>32
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
                  5                  10
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>33
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
  1               5                  10                  15
Lys Gly
<210>34
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>34
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
                  5                  10

Claims (36)

1.消除患有自身免疫性疾病的患者中B细胞的方法，其包括向患者以1mg至250mg范围的剂量给药结合人CD20的抗体。
2.权利要求1的方法，其中以1mg至100mg范围的剂量给药所述抗体。
3.权利要求1的方法，其中以100mg的剂量给药抗体至少2剂。
4.权利要求1的方法，其中以50mg或25mg的剂量给药抗体至少2剂。
5.权利要求1的方法，其中以10mg的剂量给药抗体至少2剂。
6.权利要求5的方法，其中人源化抗体是hu2H7v.16，其具有分别为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4的轻和重链序列。
7.权利要求1的方法，其中所述患者的B细胞相对于给药抗体前的基线，消除了至少80％。
8.权利要求1的方法，其中自身免疫性疾病选自：类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、包括狼疮肾炎的系统性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、视神经脊髓炎、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、ANCA相关的脉管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征和肾小球肾炎。
9.前述权利要求之任一项权利要求的方法，其中自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
10.减轻自身免疫性疾病的方法，其包括向患有自身免疫性疾病的患者以1mg至250mg范围的剂量给药结合人CD20的抗体。
11.权利要求10的方法，其中以100mg的剂量给药所述抗体至少2剂。
12.权利要求10的方法，其中以50mg或25mg的剂量给药所述抗体至少2剂。
13.权利要求10的方法，其中以10mg的剂量给药所述抗体至少2剂。
14.权利要求10-13之任一项的方法，其中静脉内给药所述抗体。
15.权利要求10-13之任一项的方法，其中皮下给药所述抗体。
16.权利要求11-15之任一项的方法，其中在第一剂后约2周给药第二剂。
17.权利要求11-16之任一项的方法，其中第二剂后，需要时再每隔3、6或9个月向患者给药。
18.前述权利要求之任一项的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
19.权利要求18的方法，其中人源化抗体是人源化2H7抗体。
20.权利要求19的方法，其中人源化抗体包含L链可变区序列SEQ IDNO.1和H链可变区序列SEQ ID NO.2。
21.权利要求19的方法，其中人源化抗体包含L链可变区序列SEQ IDNO.15和H链可变区序列SEQ ID NO.12。
22.权利要求21的方法，其中人源化抗体包含全长的H链SEQ ID NO.17。
23.权利要求19的方法，其中人源化抗体包含L链可变区序列SEQ IDNO.15和H链可变区序列SEQ ID NO.23。
24.权利要求23的方法，其中人源化抗体包含全长H链SEQ ID NO.24。
25.权利要求19的方法，其中人源化2H7抗体选自：表1中2H7v16、v31、v73、v75、v96、v114、v115、v116、v138、v477、v588、v511和v375。
26.前述权利要求之任一项的方法，其中结合CD20的抗体是嵌合抗体。
27.权利要求26的方法，其中嵌合抗体是Rituximab。
28.前述权利要求之任一项的方法，其中结合CD20的抗体是人抗体。
29.权利要求28的方法，其中人抗体是HUMAX-CD20TM。
30.前述权利要求之任一项的方法，其中自身免疫性疾病选自：类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、包括狼疮肾炎的系统性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、视神经脊髓炎、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、ANCA相关的脉管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征和肾小球肾炎。
31.权利要求30的方法，其中自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
32.权利要求31的方法，其中利用选自非类固醇抗炎药物(NSAID)、镇痛剂、糖皮质激素、环磷酰胺、阿达木单抗、来氟米特、英夫利昔单抗、依那西普、tocilizumab和COX-2抑制剂的药物，与结合CD20的抗体联合给药治疗。
33.权利要求30的方法，其进一步包括向患者给药第二治疗剂。
34.权利要求33的方法，其中第二治疗剂是免疫抑制剂。
35.权利要求31的方法，其中患者另外用甲氨蝶呤治疗。
36.权利要求1或10的方法，其中给药治疗剂量前给药最初的耐受剂量，其中耐受剂量低于治疗剂量。
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