具体实施方式
以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明,不应理解为对本发明的限制
Raji(人B淋巴瘤细胞,ATCC,CCL-86)
pGEM-T载体,美国Promega公司产品
pcDNA3.1(+),美国Invitrogen公司产品
T4DNA连接酶,美国Invitrogen公司产品
pcDNA3.1/ZEO(+)载体,美国Invitrogen公司产品
COS-1细胞(ATCC CRL 1650)
CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)
pGEM-T easy载体,Promega公司产品
Human myeloma IgGl,κ,Sigma公司产品
HRP-羊抗人kappa,Southern Biotechnology Associates公司产品
Human IgG为抗人her2的人源化抗体trastuzumab,Roche公司产品
Rituximab,Roche公司产品
Daudi(人B淋巴瘤细胞,ATCC,CCL-213)
人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞,用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA,根据文献(Cell,1980,22:197-207)和文献(Nucleic Acids Research,1982,10:4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中,测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
实施例1抗人CD20单克隆抗体8E4的制备-细胞融合杂交瘤制备单克隆抗体
用高表达CD20的Raji细胞免疫BALB/c小鼠(购自购自上海实验动物中心),使其脾脏中的B淋巴细胞能产生抗人CD20的抗体,取免疫后小鼠的脾细胞与NS-1(BALB/c小鼠骨髓瘤细胞)融合,经HAT选择性培养,经过培养,筛选出抗人CD20阳性克隆,再经克隆化后筛选出亚克隆,以确保抗体是由单个克隆细胞产生,然后收集单个克隆细胞培养上清经Protein G柱纯化后,就得到抗人CD20的单克隆抗体8E4。
实施例2嵌合抗体c8E4的构建
抗人CD20单抗8E4可变区基因的克隆
按“Trizol Reagent”试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书提取2×106分泌抗人CD20单抗的杂交瘤细胞8E4的总RNA。选择抗体(IgG2a,κ)重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSP1、GSP2、GSP3,其中GSP1距离可变区基因最远,用于逆转录反应,GSP2用于首轮PCR扩增,GSP3用于巢式扩增。引物由上海生工生物工程公司合成,序列如下GSP1-H,5’-AGC TGG GAAGGT GTG CAC ACC ACT-3’;GSP2-H,5’-CAG AGT TCC AGG TCA AGGTCA-3’;GSP3-H,5’-CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT-3’.GSP1-L,5’-TTGCTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3’;GSP2-L,5’-TGT CGT TCA CTG CCATCA ATC TT-3’;GSP3-L,5’-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3’.按照5’RACE试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书以GSP1为引物将总RNA逆转录成cDNA,然后给第一链cDNA的3’末端加上poly(C)尾,加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增,将扩增产物稀释100倍再以AUAP和GSP3为引物进行巢式PCR扩增。两次PCR反应均采用热启动,反应条件:94℃5分钟;94℃45秒,60℃45秒,72℃1分10秒,30个循环;72℃7分钟。巢式PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到pGEM-T easy载体中,筛选阳性克隆测序,对测序结果进行分析。然后以测序正确的pGEM-T/VH为模板,设计引物正义AAGCTT GCC GCC ACC ATG GGA TGG AGT TGT ATC AT和H反义GCT AGCTGA GGA GAC GGT GAC,采用Onestep RT-PCR反应扩增VH链可变区基因并使其5′端含有限制酶位点HindIII,3′端含有限制酶位点Nhe I,反应条件为:50℃ 30分;95℃15分钟;94℃50秒,58℃50秒,72℃ 50秒,30个循环;72℃ 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆测序验证,结果证明该序列与5’RACE的序列完全一致。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VH。
以测序正确的pGEM-T/VL为模板,设计引物L正义AAG CTT GCC GCCACC ATG AGT GTG CTC ACT CA和L反义CCG CTT GAT TTC CAG TTTGGT采用Onestep RT-PCR反应扩增VL基因并使其5′端含有限制酶位点HindIII,3′端含有人抗体轻链恒定区5′端的互补序列,反应条件为:94℃5分钟;94℃50秒,58℃50秒,72℃1分钟,30个循环;72℃10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆测序验证,结果证明该序列与5’RACE的序列完全一致。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VL。
构建嵌合抗体c8E4
将上述Onestep RT-PCR测序正确的质粒pGEM-T/VH用HindIII和Nhe I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得约440bp的酶切片断,与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接,挑选正确克隆后以HindIII和EcoR I酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段,与同酶切的质粒pcDNA3.1(+)用T4DNA连接酶进行连接,构建成真核表达载体pcDNA3.1(+)(VHCH)。
采用Overlapping PCR将上述Onestep RT-PCR测序正确的克隆pGEM-T/VL直接与轻链恒定区的正确克隆pGEM-T/CL融合,反应条件为:50℃ 30分;95℃15分钟;94℃ 50秒,58℃50秒,72℃ 50秒,30个循环;72℃10分钟,得到PCR产物VLCL,其5′端含有限制酶位点HindIII,3′端含有限制酶位点EcoR I。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆测序。将测序正确的VLCL基因用HindIII和EcoR I双酶消化从pGEM-T载体中切下,克隆到pcDNA3.1/ZEO(+)载体中,构建成真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞,细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(VHCH)4μg,质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)6μg)和2μl Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中,CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基,置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2h,加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myelomaIgG1,κ),37℃温育2h,加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应,37℃温育1h,加入TMB于37℃作用5min,最后用H2SO4终止反应,测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养,用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化嵌合抗体c8E4。将纯化抗体用PBS进行透析,最后以紫外吸收法定量。
实施例3 8E4人源化抗体的构建
鼠源8E4单抗可变区(Fv)三维结构的同源模建
利用Accelrys公司的Insight II程序包来模拟8E4鼠源单抗可变区的三维结构。首先,用BLAST程序在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)中分别搜索8E4重链和轻链可变区蛋白的模板蛋白。选取同源性最高的抗体(PDBNO.2OSL)和(PDB NO.1WEJ)分别作为8E4重链和轻链的模建模板,同源性分别为84%和94%,利用Insight II程序模建出8E4的三维结构,如图1所示。
8E4人源化抗体的设计与构建
分别选择人免疫球蛋白重链III亚组(heavy chain subgroupIII(humIII))和Igκ链I亚组(light chain k subgroup I(humkI))分别作为8E4抗体轻重链的人源化模板.我们首先将8E4的重链和轻链CDR区分别直接移植到人源模板人免疫球蛋白重链III亚组和Igκ链I亚组上,构成CDR移植抗体,重链为hu8E4Ha,轻链为hu8E4La。hu8E4Ha和hu8E4La的可变区氨基酸序列如图2所示。全基因合成人源化抗体重、轻链可变区基因(hu8E4VHa和hu8E4VLa),然后以hu8E4VHa基因和pGEM-T/CH载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体重链基因,反应条件为:95℃ 15分钟;94℃ 50秒,58℃50秒,72℃ 50秒,30个循环;72℃ 10分钟。并使此人源化重链基因的5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列,3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列:
AAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGTTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTCCACTCC。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物,回收目的条带并克隆到pGEMT载体中,筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段hu8E4VHaCH,与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)进行连接,构建成人源化重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(hu8E4VHaCH)。
以hu8E4VLa基因和pGEM-T/CL载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体轻链基因,反应条件为:95℃ 15分钟;94℃ 50秒,58℃50秒,72℃ 50秒,30个循环;72℃ 10分钟,得到PCR产物hu8E4VLaCL,其5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列,,3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列见:
AAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGCGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGT。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段hu8E4VLaCL,与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)载体进行连接,构建成人源化轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(hu8E4VLaCL)。
于24孔组织培养板中接种0.8×105/孔的COS-1细胞,用10%FCS的RPMI1640/DMEM混合培养基(16/DM培养基)培养至90-95%融合度时进行转染:取质粒1μg(轻链表达载体0.6μg;重链表达载体0.4μg)和2μlLipofectamine2000 Reagent分别溶于50μl无血清16/DM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用0.5ml无血清的16/DM培养基替换24孔板中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到孔中,CO2孵箱培养4小时后补加0.5ml含20%FCS的16/DM培养基,置于CO2孵箱中继续培养,72小时后取培养上清进行分析,采用ELISA确定培养上清中抗体的含量:Goat anti-human IgG(Fc)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2小时,加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgG1,κ),37℃孵育2小时,加入HRP-goat anti-humankappa进行结合反应,37℃孵育1小时,加入TMB于37℃作用5分钟,最后用H2SO4终止反应,测OD450值。
将人Raji细胞用2%FCS-PBS重悬成1×106cells/ml,分别加入不同稀释度的转染人源化抗体的COS-1细胞培养上清,表达后置于4℃孵育60min,用2%FCS-PBS洗细胞2遍,再加入FITC-goat anti-human IgG(H+L)于4℃孵育60min,洗细胞后用FCM分析并计算细胞的荧光强度。结果发现与c8E4嵌合抗体相比,hu8E4Ha和hu8E4La组成的人源化抗体(hu8E4Ha/hu8E4La)的活性几乎完全丧失(图3)。因此,为了获得高亲和力的人源化抗体,我们还需对可能影响8E4抗体结合活性的FR区鼠源残基进行分析和回复突变。
通过分析模建的8E4单抗可变区的三维结构(图1),我们发现在CDR区周围5的空间范围内可能影响原抗体CDR构象而又与人源模板中相应位置不同的FR区残基有11个,分别为L48Val,L49His,H30Thr,H48Ile,H49Gly,H67Ala,H69Leu,H70Thr,H71Ala,H73Lys和H78Ala。将这些鼠源氨基酸残基保留在构建的CDR移植抗体中可得到人源化抗体(hu8E4Hb/hu8E4Lb)。hu8E4Hb和hu8E4Lb的可变区氨基酸序列如图2所示,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10分别显示了hu8E4Hb重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:11和SEQID NO:12分别显示了hu8E4Lb轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6分别显示了hu8E4Hb的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8分别显示了hu8E4Lb的核苷酸序列和氨基酸序列。hu8E4Hb的三个CDR区氨基酸序列分别为(可参见图2-1的HU8E4VHb):HCDR1:SYNMH、HCDR2:AIYPENGDTSYNQKFKD和HCDR3:WHYYGNGGALDY;hu8E4Lb的三个CDR区氨基酸序列分别为(可参见图2-2的HU8E4VLb):LCDR1:RASGNIHNYLA;LCDR2:NAKTLPD和LCDR3:QQFWSNPWT。采用重叠PCR的方法分别合成人源化抗体重、轻链可变区基因(hu8E4VHb/hu8E4VLb),并按与人源化抗体(hu8E4Ha/hu8E4La)相同的方法构建轻链表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(hu8E4VLbCL)和重链表达载体pcDNA3.1(+)(hu8E4VHbCH)。然后将轻、重表达载体共转染COS-1细胞,用流式细胞术测定抗体的抗原结合活性,发现其与Raji的结合活性与8E4嵌合抗体相似,将这个人源化抗体(hu8E4Hb/hu8E4Lb)命名为hu8E4。
实施例4人源化抗体的稳定表达与纯化
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞,细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(hu8E4VHbCH)4μg,质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(hu8E4VLbCL)6μg)和2μlLipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中,CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基,置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2h,加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1,κ),37℃温育2h,加入HRP-羊抗人kappa进行结合反应,37℃温育1h,加入TMB于37℃作用5min,最后用H2SO4终止反应,测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养,用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化人源化抗体hu8E4。将纯化抗体用PBS进行透析,最后以紫外吸收法定量。
实施例5竞争抑制实验
用透析标记法标记抗体:用0.025M pH9.5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体8E4稀释成1%浓度,装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液盛于小烧杯中,使透析袋浸没于FITC溶液中,在4℃避光搅拌24h。取出透析袋中标记液,用Sephadex G-50过柱,去除游离荧光素,收集荧光抗体FITC-8E4备用。将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体FITC-8E4和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞Raja(1×106/ml)中,4℃孵育60min,1%FCS-PBS洗细胞2遍,流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。Human IgG作为对照。竞争抗体的每个浓度设3个复管,计算半数抑制浓度IC50值,最大荧光强度表示在没有竞争抗体时获得的平均荧光强度。
实验结果见图4,结果表明抗体hu8E4能完全阻断荧光标记抗体FITC-8E4与Raja细胞的结合,它们的IC50值接近,表明人源化抗体具有与原鼠源抗体相似的特异性和亲和力(竞争抑制分析结果见表1)。
表1.竞争抑制分析结果
实施例6补体介导的细胞杀伤(CDC)实验
收集细胞后用无酚红RPMI 1640培养液洗两遍,重悬于无酚红RPMI 1640培养液,调整细胞密度至1×106/ml,按100μl/孔将细胞悬液加入96孔细胞培养板。用无酚红RPMI 1640培养液将rituximab和c8E4,hu8E4分别稀释至100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml和0.16μg/ml,1%Triton-X 100作为阳性对照,human IgG作为无关抗体对照,PBS作为阴性对照,空白培养液作为空白对照。然后将稀释好的抗体样品及对照加入上述96孔细胞培养板,20μl/孔,同时按50μl/ml细胞悬液的比例加入新鲜人血清,补充无酚红RPMI1640培养液至总体积200μl/孔。以上每组各设3个复孔,CO2培养箱作用4小时。4小时后将96孔细胞培养板200g离心5分钟,每孔吸取50μl上清至另一96孔板相应孔中。按照Promega公司CytoTox
非同位素法细胞杀伤检测试剂盒中的方法加入混合好的显色液50μl//孔至96孔板中,室温,避光作用30分钟。酶标仪读490nm的光吸收值。
实验结果见图5,试验结果表明:在CD20高表达的细胞株Daudi(ATCC)和Raji中,c8E4和hu8E4已具有很强的CDC活性,在10μg/ml的浓度时杀伤强度最强,c8E4和hu8E4的CDC作用均强于Rituximab;而对照抗体humanIgG不能诱导Dauli细胞的CDC作用。
实施例7抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
无菌采集静脉血,注入含有肝素20U/ml的离心管中,轻轻混匀。在生物安全柜中用无菌吸管加入等体积PBS溶液,使血液稀释以提高分离效果。取15ml离心管,每管加入6ml室温的淋巴细胞分离液,倾斜离心管,沿管壁缓慢加入稀释后的抗凝外周血6ml/管。动作轻柔,以防破坏界面。20℃,800g离心30min。将刹车关闭,自然降速。管内分为三层,从上至下依次为血浆层、细胞分离液、红细胞及粒细胞层。血浆层与细胞分离液交界处毛玻璃样的白色层即为淋巴细胞及单核细胞层。用吸管轻轻插入毛玻璃样层,缓慢吸出外周血单个核细胞,放入另一15ml离心管中。在吸出的细胞中加入PBS稀释后离心,200g,离心5min,共洗2遍。用无酚红RPMI-1640培养液调整细胞密度为6×106/ml,悬于15ml离心管中,加入160U/ml的IL-2预激活,置于37℃,5%CO2细胞培养箱备用。
靶细胞悬液的准备
对数生长期的细胞悬液吸至15ml离心管中,200g,离心5min,弃去上清,用PBS洗2遍,无酚红的RPMI-1640重悬细胞,计数,调整细胞密度为3×105/ml备用。
细胞与抗体的作用
设定培养基背景孔、效应细胞+靶细胞自发释放值孔、效应细胞+靶细胞最大释放值孔及实验孔,每种情况都设3个平行孔,用无酚红RPMI-1640培养基将c8E4,hu8E4稀释至浓度分别为100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml和0.16μg/ml,每管加入调整好细胞密度的靶细胞,4℃作用30min后,200g离心5min,PBS洗2遍,悬于300μl无酚红RPMI1640培养液,将上述与抗体作用后的细胞悬液加入96孔板中,100μl/孔,加入效应细胞100μl/孔,以40∶1的效、靶比加入96孔板中,37℃,5%CO2细胞培养箱12h~24h后显色。
显色、读数
将96孔板200g离心5min后,每孔吸取50μl上清至另一96孔板相应孔中,根据Promega公司CytoTox
非同位素法细胞杀伤检测试剂盒中的方法加入混合好的显色液50μl//孔至96孔板中,室温,避光作用30min,酶标仪读490nm的光吸收值。
实验结果见图6,试验结果表明,c8E4和hu8E4在低浓度时的作用时不明显,在10μg/ml的浓度时能引起明显的ADCC作用,c8E4和hu8E4的ADCC作用与Rituximab相比无明显差别.而对照抗体human IgG不能诱导Raji的ADCC作用。
实施例8细胞凋亡实验
在96孔培养板中加入数目相等的细胞,5×105/孔,将抗体分别以10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml和0.08μg/ml的终浓度加至相应细胞孔中,37C作用18~24h后,加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温,避光反应15min,PBS重悬后上机,流式细胞仪检测分析染色情况。阴性对照为PBS,无关抗体对照为HumanIgG。实验结果见图7,试验结果表明,c8E4和hu8E4在低浓度时的作用时不明显,在10μg/ml的浓度时能引起一定量的细胞凋亡,c8E4和hu8E4的凋亡作用与Rituximab相比无明显差别,而对照抗体human IgG不能诱导Dauli细胞凋亡。
实施例9生存率实验
用3.5×106Raji细胞尾静脉注射免疫8-10周龄雌性BALB/C小鼠,接种肿瘤细胞五天后,注射100μg相关抗体(c8E4、Rituximab、Human IgG和hu8E4)抗体,每天观察小鼠的存活状态。
实验结果见图8,试验结果表明:在同等剂量下,与注射Rituximab的小鼠相比,注射抗体c8E4和hu8E4组小鼠的生存时间得到了显著延长(P<0.05)。
序列表
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<160>12
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<210>1
<211>990
<212>DNA
<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列
<400>1
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990
<210>2
<211>330
<212>PRT
<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列
<400>2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>3
<211>318
<212>DNA
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列
<400>3
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgt 318
<210>4
<211>106
<212>PRT
<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列
<400>4
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>5
<211>1353
<212>DNA
<213>人源化抗体h8E4重链核苷酸序列
<400>5
gaggtccagc tggtcgagtc aggaggagga ctggtccagc ccggaggatc gctgaggctg 60
tcgtgtgctg ccagtggatt cactttcacc agttacaata tgcactgggt gaggcaggcc 120
cccggaaagg gactggagtg gattggggcc atttacccag agaacgggga caccagctac 180
aaccagaagt ttaaggatag ggccaccctc acagccgata aaagcaaaaa cacagcctac 240
ctccagatga acagcctccg tgccgaagat acagcagtgt actactgtgc acgttggcac 300
tactacggga acgggggggc actggattac tgggggcaag ggacgctggt gacggtgagc 360
agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga agagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctcccggt aaa 1353
<210>6
<211>451
<212>PRT
<213>人源化抗体h8E4重链氨基酸序列
<400>6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp His Tyr Tyr Gly Asn Gly Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210>7
<211>642
<212>DNA
<213>人源化抗体h8E4轻链核苷酸序列
<400>7
gacatccaaa tgacgcagag tccaagttct ctgtctgcat ctgtcgggga ccgggtcacg 60
atcacttgtc gggcgtctgg gaatatccac aactacctgg cgtggtacca gcagaagccg 120
gggaaggcgc cgaagctgct ggtccacaac gcgaagactc tgccggacgg cgtgccgtcc 180
cggttttccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctccagcct 240
gaagacttcg ctacctacta ctgccagcag ttctggagca acccttggac attcggtcag 300
ggtacaaagg tggaaattaa gcgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210>8
<211>214
<212>PRT
<213>人源化抗体h8E4轻链氨基酸序列
<400>8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
His Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>9
<211>363
<212>DNA
<213>人源化抗体h8E4重链可变区核苷酸序列
<400>9
gaggtccagc tggtcgagtc aggaggagga ctggtccagc ccggaggatc gctgaggctg 60
tcgtgtgctg ccagtggatt cactttcacc agttacaata tgcactgggt gaggcaggcc 120
cccggaaagg gactggagtg gattggggcc atttacccag agaacgggga caccagctac 180
aaccagaagt ttaaggatag ggccaccctc acagccgata aaagcaaaaa cacagcctac 240
ctccagatga acagcctccg tgccgaagat acagcagtgt actactgtgc acgttggcac 300
tactacggga acgggggggc actggattac tgggggcaag ggacgctggt gacggtgagc 360
agt 363
<210>10
<211>121
<212>PRT
<213>人源化抗体h8E4重链可变区氨基酸序列
<400>10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp His Tyr Tyr Gly Asn Gly Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>11
<211>324
<212>DNA
<213>人源化抗体h8E4轻链可变区核苷酸序列
<400>11
gacatccaaa tgacgcagag tccaagttct ctgtctgcat ctgtcgggga ccgggtcacg 60
atcacttgtc gggcgtctgg gaatatccac aactacctgg cgtggtacca gcagaagccg 120
gggaaggcgc cgaagctgct ggtccacaac gcgaagactc tgccggacgg cgtgccgtcc 180
cggttttccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctccagcct 240
gaagacttcg ctacctacta ctgccagcag ttctggagca acccttggac attcggtcag 300
ggtacaaagg tggaaattaa gcgt 324
<210>12
<211>108
<212>PRT
<213>人源化抗体h8E4轻链可变区氨基酸序列
<400>12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
His Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105