CN107531773A - 用于增强癌症治疗的效果的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明特征在于用于通过给予OX40激动剂(例如，抗‑OX40抗体)和/或抗CTLA4抗体(例如，CTLA4‑封闭抗体)、与癌症治疗组合来增强抗肿瘤反应的组合物和方法。

Description

用于增强癌症治疗的效果的组合物和方法
背景技术
据估计，胰腺癌所有阶段的1年存活率为约20％，而5年存活率仅为6％。造成这些低存活率的原因是，在诊断的时候，许多患者的肿瘤已经扩散到胰腺以外，并且转移到不可能进行手术切除的位置。
最近的研究已经报告，单独的减少的T细胞浸润或与增加的巨噬细胞浸润相结合，与各种癌症的降低的存活率有关，包括患有胰腺癌的患者。在这些回顾性研究中，患者已经用常规癌症疗法进行治疗，包括化学疗法、放射疗法和手术切除，这表明在肿瘤中T细胞和巨噬细胞的浸润会对响应于对常规疗法的结果产生影响。
在过去的若干年里，人们已经免疫疗法兴趣高涨，免疫疗法为附属于传统的细胞毒素肿瘤疗法的一种新颖疗法。随着检查点抑制剂(例如用于黑色素瘤中的易普利姆玛(Ipilimumab))的临床成功，人们对将免疫疗法应用于更大范围的恶性肿瘤有着更广泛的兴趣。随着临床适应症的增加，利用免疫疗法与放射疗法或化学疗法的结合的综合疗法更为常见。然而，尽管组合应用变得越来越普遍，但很少有研究设计为基于每种药剂的给予时序来优化治疗效果。(Dewan等人，Clinical cancer research:an official journal ofthe American Association for Cancer Research[临床癌症研究：美国癌症研究协会官方杂志]，2009.15(17):5379-88)。因此，急需用于通过改善对常规癌症治疗方法的反应来增加存活率的方法。
发明内容
正如下面所描述的，本发明特征在于用于通过给予OX40激动剂(例如，抗OX40抗体)和抗CTLA4抗体(例如，CTLA4封闭抗体)与化学治疗剂和/或治疗方案结合在一起来增强抗肿瘤反应的组合物和方法。这项发明至少部分是基于这样一种发现：这种药剂的组合对于治疗对传统治疗方案具有高度抗性肿瘤(如，胰腺肿瘤)特别有效。因此，本发明提供了一种免疫治疗组合物，该组合物包括OX40激动剂和抗CTLA4抗体，以及一种与用于治疗癌症(如，胰腺癌)的癌症疗法(化学疗法和/或放射疗法)结合，给予OX40激动剂和抗CTLA4的方法。
在一个方面，本披露提供了一种增强患有肿瘤的受试者的化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后向受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，该方法包括：(a)向受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；(b)获得指示受试者体内巨噬细胞分化减少的细胞的测量值；以及(c)向受试者给予化学疗法或放射疗法。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，该方法包括：(a)向受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；(b)获得指示受试者体内巨噬细胞分化减少的细胞的测量值；以及(c)向受试者给予抗IL4抗体和化学疗法或放射疗法。
在又另一个方面，本披露提供了一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，该方法包括：(a)向受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；获得指示受试者体内巨噬细胞分化减少的细胞的测量值；(b)向受试者给予化学疗法；(c)向受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；以及(d)向受试者给予化学疗法或放射疗法。
在又另一个方面，本披露提供了一种增强患有结肠直肠癌的受试者的化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后向受试者给予抗CTLA4抗体。
在又另一个方面，本披露提供了一种治疗患有结肠直肠肿瘤的受试者的方法，该方法包括：(a)向受试者给予抗CTLA4抗体：以及(b)向受试者给予放射疗法。
在又另一个方面，本披露提供了一种增强患有结肠直肠癌的受试者的化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法期间或之后向受试者给予OX40激动剂。
在又另一个方面，本披露提供了一种治疗患有结肠直肠癌的受试者的方法，该方法包括：(a)向受试者给予放射疗法；以及(b)向受试者给予OX40激动剂。
在本文所述任何方面的不同实施例中，该抗CTLA4抗体为9D9和曲美木单抗中的一种或多种。在本文所述任何方面的不同实施例中，在给予抗CTLA4抗体后的约1、2、3、4、5、6或7天给予化学疗法或放射疗法。在本文所述任何方面的不同实施例中，在给予抗CTLA4抗体前的约1、2、3或4天给予化学疗法或放射疗法。
在本文所述任何方面的不同实施例中，该OX40激动剂为抗OX40抗体。在不同实施例中，该抗OX40抗体为OX86、人源化抗OX40抗体和9B12中的一种或多种。在不同实施例中，该OX40激动剂为OX40融合蛋白。在本文所述任何方面的不同实施例中，在给予化学疗法或放射治疗后约1或2天给予该OX40激动剂。
在本文所述任何方面的不同实施例中，在该受试者中，该方法延迟或减少肿瘤生长，减小肿瘤大小，和/或提高存活率。在不同实施例中，该受试者患有结肠直肠肿瘤。
本发明的其他特征和优点将根据详细说明以及根据权利要求书变得明显。
定义
除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下面的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology[微生物学和分子生物学词典](第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology[剑桥科技词典](Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics[遗传学词汇]，第5版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag[施普林格出版社](1991)；以及Hale和Marham，TheHarper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典](1991)。除非另行指明，如在此使用的以下术语具有以下赋予它们的含义。
“OX40多肽”意指受体TNFR超家族中的在抗原活化的哺乳动物CD4+和CD8+T淋巴细胞的表面上表达的成员。参见例如，Paterson等人，Mol Immunol[分子免疫学]24,1281-1290(1987)；Mallett等人，EMBO J[欧洲分子生物学组织杂志]9,1063-1068(1990)；以及Calderhead等人，J Immunol[免疫学杂志]151,5261-5271(1993))。OX40还被称为CD134、ACT-4以及ACT35。OX40受体序列是本领域中已知的并且例如以Genbank登录号：AAB33944或CAE11757提供。
示例性的人类OX40序列提供如下：
“OX40激动剂”意指与OX40受体特异性地相互作用并且增加OX40受体的生物活性的OX40配体。令人希望的是，该生物活性增加至少约10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在某些方面，如在此所披露的OX40激动剂包括OX40结合多肽，诸如抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)、OX40配体、或这些分子的片段或衍生物。
“OX40抗体”意指特异性地结合OX40的抗体。OX40抗体包括对OX40具有特异性的单克隆抗体和多克隆抗体以及其抗原结合片段。在某些方面，如在此所述的抗OX40抗体是单克隆抗体(或其抗原结合片段)，例如鼠类、人源化或全人单克隆抗体。
“CTLA4多肽”意指与Genbank登录号AAL07473.1具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽或其具有T细胞抑制活性的片段。以下提供了AAL07473.1的序列：
gi|15778586|gb|AAL07473.1|AF414120_1 CTLA4[智人]
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN(SEQ IDNO：93)
“抗CTLA4抗体”意指选择性结合CTLA4多肽的抗体。示例性的抗CTLA4抗体包括9D9和曲关木单抗。
“IL4多肽”意指与NCBI登录号NP_000580具有至少85％氨基酸序列一致性的多肽或其具有免疫细胞(如，巨噬细胞、T细胞)分化活性的片段。以下提供了NP_000580的序列：
gi|4504669|ref|NP_000580.1|白介素-4同种型1前体[智人]
MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(SEQ ID NO：94)
“抗IL4抗体”意指选择性结合IL4多肽的抗体。11B11是示例性抗IL4抗体。
“抗体”意指识别且特异性地结合靶标的免疫球蛋白分子。如在此使用，术语“抗体”包括完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段)，单链式Fv(scFv)突变体，产生自至少两个完整抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原酶识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要这些抗体展现希望的生物活性。抗体可以是以下五大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM、或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2)，基于它们的重链恒定区的特性分别被称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类的免疫球蛋白具有不同的且众所周知的亚基结构以及三维构型。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”指的是抗体分子的一部分，其由氨基酸组成，负责抗体和抗原之间的特异性结合。在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可以仅结合到该抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一些抗原结合功能。
“改善”意指减少、阻遏、减弱、减轻、阻止或稳定疾病的发展或进展。
“抗原结合片段”意指完整抗体的结合抗原的部分。特别地，术语抗原结合片段指的是完整抗体的抗原性决定可变区。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段、线性抗体、单链抗体、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“癌症”意指特征在于过度增殖或细胞凋亡减少的疾病或病症。例如，本发明的组合物和方法对于胰腺癌的治疗是有用的。
在此披露中，“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等具有美国专利法赋予它们的含义并且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有美国专利法赋予的含义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。
“检测”是指鉴定待检测的分析物的存在、不存在或量。
所谓“提高”意指至少10％、25％、50％、75％或100％的正的改变。
术语“分离的(isolated)”、“纯化的(purified)”或“生物上纯的(biologicallypure)”是指在不同程度上不含如同在其天然状态中所发现的通常伴随它的组分。“分离”表示自初始来源或环境的分离程度。“纯化(purify)”表示高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物上纯的”蛋白质充分不含其他材料，这样使得任何杂质不实质上影响蛋白质的生物特性或导致其他不利后果。即，如果当本发明的核酸或肽通过重组DNA技术产生时，基本上不包含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当本发明的核酸或肽化学合成时，基本上不包含化学前体或其他化学物，那么它是纯化的。纯度和均质性典型地使用分析化学技术来确定，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可经受修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同修饰可以产生不同的分离蛋白质，这些蛋白质可以单独纯化。
“分离的多肽”意指已经从天然伴随它的组分中分离的本发明的多肽。典型地，当该多肽以重量计为至少60％时，将它分离，没有与它天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子。优选地，该制剂是以重量计至少75％，更优选是至少90％，并且最优选是至少99％的本发明的多肽。本发明的分离的多肽可以例如通过从天然源提取、通过表达编码这样一种多肽的重组核酸或通过化学合成该蛋白而获得。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析。
“减少(reduce)”意指至少10％、25％、50％、75％或100％的负的改变。
“参考(reference)”意指标准或对照状况。
“参比序列”是一个被用作序列比较的基础的、定义的序列。参考序列可以是指定序列的亚集或整体；例如，全长cDNA或基因组序列的区段，或完整的cDNA或基因组序列。对于多肽，参比多肽序列的长度一般将是至少约16个氨基酸，优选地至少约20个氨基酸，更优选地至少约25个氨基酸，并且甚至更优选地约35个氨基酸，约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参比核酸序列的长度一般将是至少约50个核苷酸，优选地至少约60个核苷酸，更优选地至少约75个核苷酸，并且甚至更优选地约100核苷酸或约300个核苷酸或在那附近或其间的任何整数。
“特异地结合”意指化合物或抗体，其识别并且结合本发明的多肽，但是基本上不识别和结合在样品(例如，生物样品，其天然地包括本发明的多肽)中的其他分子。
所谓“基本上一致的”意味着相对于参考氨基酸序列(例如，在此描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，在此描述的任一核酸序列)，一种多肽或核酸分子表现出至少50％的一致性。优选地，相对于用于比较的序列，这样的序列在氨基酸水平或核酸上为至少60％，更优选地80％或85％，并且更优选地90％、95％、或甚至99％一致性。
典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(麦迪逊大学道1710，威斯康星州53705(1710University Avenue，Madison，Wis.53705))遗传计算组的序列分析软件包，BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。此类软件通过对各种取代、缺失和/或其他修饰分配同源性程度来匹配相同或类似序列。保守取代一般包括在下述组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定一致性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e-3和e-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。
“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地抑或进行组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(又称为高变区)连接的四个构架区(FW)组成。每个链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，与来自另一个链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[具有免疫学目的蛋白质的序列]，(第5版，1991，国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda)马里兰州)；和(2)一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
在此提供的范围被理解成对范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如在此所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”指的是减少或改善失调和/或与其相关联的症状将被理解的是，尽管不能排除，治疗失调或病症并不要求完全地消除该失调、病症或与其相关联的症状。
除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。
除非确切规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。大约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语大约修饰。
在变量的任何定义中对化学基团清单的引用在本文中包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。对一个变量或方面的实施例的详述在本文中包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。
附图说明
图1A-1C示出肿瘤巨噬细胞的适应性免疫重建。患有Panc02肿瘤的免疫活性的C57BL/6小鼠不接受治疗(NT)或在第14天和第17天用100mg/kg的吉西他滨腹腔内给药(i.p.)进行治疗(GZ)，然后在第21天收获肿瘤。图1A描绘了示出F4/80+巨噬细胞(绿色)和DAPI(蓝色)的免疫组织学的两图。跨整个肿瘤的多个图像被合并，以生成整个肿瘤的边缘到边缘的概图。肿瘤边缘用白色箭头指示。图1B示出两个散点图。患有第14天Panc02肿瘤的免疫活性的C57BL/6小鼠不接受治疗或用250μg抗OX40、250μg抗CTLA4或组合进行治疗。肿瘤是在免疫疗法后第4天或第8天收获的，并且单细胞悬浮液被染色并按流式细胞术进行分选，图上的门控在小图(i)中，CD11b+细胞，以及在小图(ii)中的图，Gr1loIA+细胞在CD11b+群内。图1C提供了显示裂解的被分选的肿瘤巨噬细胞的免迹印迹的图像，以及精氨酸酶I和GAPdH的表达的免迹印迹图像。
图2A和2B示出制备型免疫疗法改善了化学疗法。图2A描绘了线性图(小图i)和散点图(小图ii)。患有Panc02肿瘤的免疫活性的C57BL/6小鼠不接受治疗或在第14天用250μg抗OX40、250μg抗CTLA4或组合进行治疗(红色虚线)。在第18天，小鼠被随机化，不接受进一步治疗，或每周两次持续3周进行吉西他滨(100mg/kg腹腔内给药)治疗。在图2A，小图(i)，图中示出每组6-7只小鼠的每组平均肿瘤面积。在图2A，小图(ii)，图中示出在第39天接收化学疗法的组的肿瘤面积。每个符号表示一只动物。图2B提供五幅图(小图i-v)，示出如图2A中治疗的小鼠的存活率曲线，为了清楚起见，一次比较两个组。图解：NS不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005；****p<0.001)。
图3示出三个散点图，描绘了制备型免疫疗法后肿瘤浸润免疫细胞。患有Panc02肿瘤的免疫活性的C57BL/6小鼠不接受治疗或在第14天用250μg抗OX40和250μg抗CTLA4进行治疗。治疗后第4天或第7天收获肿瘤并且通过流式细胞术分析浸润细胞群CD3+CD8+T细胞(小图(i))；CD3+CD4+T细胞(小图(ii))；或CD11b+(小图(iii))、髓样细胞。每个符号表示一个肿瘤。图解：NS不显著；*p<0.05。
图4A-4E示出了联合治疗驱动2型辅助T细胞(Th2)分化。图4A示出了患有Panc02肿瘤的免疫活性的C57BL/6小鼠不接受治疗或在第14天用250μg抗OX40、250μg抗CTLA4或组合进行治疗。7天后，收获淋巴结，并通过流式细胞术对细胞群进行分析。图4A描绘了四幅图，示出了CD4 T细胞(小图(i))；CD4+FoxP3+调节性T细胞(小图(ii))；CD4+FoxP3-T细胞(小图(iii))；以及CD8T细胞(小图(iv))的数目。图4B描述了四幅图，示出了来自未治疗的小鼠(小图(i))或用抗CTLA4治疗的小鼠(小图(ii))；用抗OX40治疗的小鼠(小图(iii))或用抗CTLA4和抗OX40治疗的小鼠(小图(iv))的FoxP3-CD4+T细胞中的转录因子Tbet和GATA3的细胞内染色的实例。图4C示出两幅图，提供如每个图4B的数据的总结，其示出是GATA3+Tbet-(小图(i))或GATA3-Tbet+(小图(ii))的FoxP3-CD4 T细胞的比例。每个符号表示一只小鼠。图4D描述了在分泌抑制剂的存在下，在体外用平板结合的抗CD3刺激4小时的如图4A中收获的淋巴结细胞。细胞被表面染色，然后细胞内的细胞因子被染色。图4D提供了两幅图，示出是IL-4+IFNγ-(小图(i))或IL-4-IFNγ+(小图(ii))的FoxP3-CD4 T细胞的百分比。图4E提供了两幅图，示出如图4A中收获的淋巴结CD8T细胞，细胞内转录因子脱中胚蛋白染色(小图(i))，并且如图4D所受刺激，并且IFNγ染色(小图(ii))。图解：NS不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005；****p<0.001)。
图5A和5B示出白介素-4(IL-4)封闭改善的肿瘤控制。图5A示出了两幅图，描述了患有Panc02肿瘤的免疫活性的C57BL/6小鼠不接受治疗或在第14天用250μg抗OX40和250μg抗CTLA4进行治疗。在第18天，小鼠被随机化，不接受进一步治疗，或每周两次持续3周进行吉西他滨(100mg/kg腹腔内给药)治疗，并且进一步随机化，不接受进一步治疗(小图(i))，或接受100μg抗IL-4腹腔内给药(i.p.)同时进行吉西他滨注射(小图(ii))。图显示每组6-7只小鼠的每组平均肿瘤面积。图5B显示了一幅图，描述了在第35天接受如图5A所示治疗组合的组的肿瘤面积。每个符号表示一只动物。图解：NS不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005；****p<0.001)。
图6A-6C示出使用重复周期的免疫化学疗法的改善的效果。图6A是在一个周期的化学免疫疗法之后周围血液免疫细胞的分析，示出六个图，描述了以下项的代表性门控：CD11b+髓样细胞(小图(i))；门控的CD11b+髓样细胞中的Gr1HI嗜中性细胞(小图(ii))；门控的CD11b+髓样细胞中的Gr1loMHCII+单核细胞(小图(iii))；门控的CD11b+髓样细胞中的Ly6C+Ly6G-(小图(iv))；CD8+和CD4+T细胞(小图(v))；以及CD4+CD25+T细胞(小图(vi))。图6B示出了六个散点图，其提供了在一个周期的化学免疫疗法之后在全部外围的血液中如图6A中门控的群的一个定量分析。每个符号表示一只小鼠。图6C示出了六幅图，描述了患有Panc02肿瘤的C57BL/6小鼠不接受治疗或在第14天用抗OX40(250μg)合抗CTLA4(250μg)进行治疗。在第18天，小鼠被随机化，不接受进一步治疗，或每周两次持续2周进行吉西他滨(100mg/kg腹腔内给药)治疗。最后一剂吉西他滨后三(3)天，选择接受另一剂量的抗OX40和抗CTLA4的或不接受治疗的组，随后是另一周期的每周两次吉西他滨(100mg/kg腹腔内给药)持续两周。图显示每组6-7只小鼠的个体小鼠的肿瘤面积。图解：NS不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005；****p<0.001)。
图7描述了三幅图，示出化学疗法的交替时序。患有Panc02肿瘤的C57BL/6小鼠不接受治疗或在第11天(第7天)或在第18天(第0天)用250μg抗OX40和250μg抗CTLA4进行治疗。小鼠被随机化，不接受进一步治疗，或从第18天开始每周两次持续3周进行吉西他滨(GZ100mg/kg腹腔内给药)治疗。图示出单独使用NT对比单独使用GZ(小图(i))；单独使用GZ对比抗OX40和抗CTLA4加第0天GZ(小图(ii))；以及单独使用GZ对比抗OX40和抗CTLA4加第7天GZ(小图(iii))的每组6-7只小鼠的小鼠的存活率曲线。
图8A和8B示出CT26结肠直肠肿瘤的放射治疗与抗CTLA4预处理的改善的效果。图8A提供了显示平均肿瘤大小(小图(i))和总体存活率(小图(ii))的图。当肿瘤直径大于12mm时或当小鼠显示体力衰退时，将小鼠安乐死。图8B提供了描绘了以下组中来自个体小鼠的肿瘤测量值的图：未经治疗的(小图(i))或用抗CTLA4 d7治疗的(小图(ii))；放射疗法(RT)20Gy d14治疗的(小图(iii))；抗CTLA4 d7+RT 20Gy d14治疗的(小图(iv))；抗CTLA4d15+RT 20Gy d14治疗的(小图(v))；抗anti-CTLA4 d19+RT 20Gy d14治疗的(小图(vi))。代表性实验用每组n＝6只小鼠显示。实验至少重复了两次。
图9是示出在4T1荷瘤小鼠中抗CTLA4预处理的效果的图。4T1肿瘤是第四阶段乳腺癌的动物模型。以下组中来自个体小鼠的肿瘤测量值：未经治疗的(小图(i))或用抗CTLA4d7治疗的(小图(ii))；放射疗法(RT)20Gy d14，15，和16治疗的(小图(iii))；抗CTLA4 d7+RT 20Gy d14，15和16治疗的(小图(iv))；抗CTLA4 d17+RT 20Gy d14，15和16治疗的(小图(v))。实验至少重复了两次。
图10是患有CT26结肠直肠肿瘤的小鼠的总体存活率的图，显示放射疗法后抗OX40免疫疗法的最佳时序。右腿患有CT26肿瘤的小鼠，不接受治疗，或用20Gy局灶放射进行治疗。小鼠被随机化，在第7天、第15天或第19天接受250μg抗OX40。当肿瘤直径大于12mm时或当它们显示体力衰退时，将小鼠安乐死。组合的来自3个实验的数据，每组总计n＝12-18只小鼠。
图11A-11C示出通过调节性T细胞的提前耗竭，改善了放射疗法的效果。右腿患有CT26肿瘤的小鼠被随机化，不接受治疗的、在第7天接受CD4消耗抗体或CD25消耗抗体。小鼠被进一步随机化，不接受治疗，或在第14天用20Gy局灶放射进行治疗。图11A描绘了门控的外周血淋巴细胞细胞的细胞分选，以示出对照组(小图(i))，以及CD4消耗小鼠(小图(ii))中的CD8和CD4 T细胞，以及门控的CD4 T细胞，以示出对照组(小图(iii))，以及CD25消耗小鼠(小图(iv))中的CD25+T细胞。图11B提供了描绘了以下给定组中来自个体小鼠的肿瘤测量值的图：未经治疗的(小图(i))或用抗CD4治疗的(小图(ii))；用抗CD25治疗的(小图(iii))；放射疗法(RT)治疗的(小图(iv))；用抗CD4+RT治疗的(小图(v))；用抗CD25+RT治疗的(小图(vi))。图11C是一个显示总体存活率的图。当肿瘤直径大于12mm时或当它们显示体力衰退时，将小鼠安乐死。代表性实验用每组n＝6只小鼠显示。
图12A和12B示出了不同抗CTLA4克隆体的比较。右腿患有CT26肿瘤的小鼠不接受治疗或在第7天用250μg抗CTLA4克隆9D9或250μg抗CTLA4克隆UC10治疗。小鼠被进一步随机化，不接受治疗，或在第14天用20Gy局灶放射进行治疗。图12A描绘了显示平均肿瘤大小(小图(i))和总体存活率(小图(ii))的图。当肿瘤直径>12mm时或当小鼠显示体力衰退时，将小鼠安乐死。图12B为描述了以下组中来自个体小鼠的肿瘤测量值的图：未经治疗的(小图(i))或用抗CTLA4(9D9)d7治疗的(小图(ii))；抗CTLA4(UC10)d7治疗的(小图(iii))；RT20Gy d14治疗的(小图(iv))；抗CTLA4(9D9)d7+RT 20Gy d14治疗的(小图(v))；抗CTLA4(UC10)d7+RT 20Gy d14治疗的(小图(vi))。代表性实验用每组n＝6只小鼠显示。
发明的详细说明
本披露呈现了对于增强癌症化学疗法的效果有用的方法。
本披露呈现了如下发现，激动性抗OX40抗体和抗CTLA4抗体的联合施用对患有确定的鼠胰腺腺癌肿瘤小鼠产生了一种短暂的表型变化，该变化与肿瘤中巨噬细胞的复极化相关。与化学疗法抑或单独的联合免疫治疗相比，吉西他滨的给予同时伴随巨噬细胞复极化，导致显著改善的肿瘤控制。这种免疫化学疗法的治疗窗口很短。抑制肿瘤环境的回归与在引流淋巴结中CD4 T细胞的Th2极化相关，增加了肿瘤的CD4细胞浸润和肿瘤巨噬细胞的反弹M2分化。IL-4封闭抗体的给予通过免疫化学疗法改善了肿瘤控制。重要的是，小鼠在化学疗法后保留了免疫功能，并且另外的免疫化学疗法周期可以改善肿瘤控制。这些数据表明，在一种对免疫疗法和化学疗法具有高度抗性的临床前肿瘤模型中，制备型免疫疗法可用于改善常规化学疗法的肿瘤控制。
此外，发现用抗CTLA4的免疫疗法后，递送的放射疗法导致在患有确定的结肠直肠癌肿瘤的小鼠中的100％的肿瘤治愈。在放射治疗后一天递送，抗OX40激动剂抗体的给予是最佳的(对比单独用RT50天，中位数存活期未达到，p<0.05)。抗CTLA4在放射治疗之前给予是高度有效的，部分是由调节性T细胞的耗竭介导的，而抗OX40激动剂抗体在放射治疗后立即递送是高度有效的，与抗原释放和增加的抗原呈递得的时序一致。这些数据表明，免疫疗法和放射疗法的组合可以改善治疗效果；并且放射疗法的理想给予时序取决于所利用的免疫疗法的类型。
在另外的实施例中，在此披露的免疫疗法可以用于治疗包括，但不限于乳腺癌、胰腺癌和肺癌。
肿瘤免疫环境
肿瘤的免疫环境预示着常规疗法后的结果。在胰腺癌的小鼠模型中，减少肿瘤相关的巨噬细胞浸润的疗法改善了对化学疗法的反应。在小鼠乳腺癌模型中也已经观察到了类似结果。
对于具有促进肿瘤生长的免疫环境的那些患者，建议有机会通过免疫疗法来改善肿瘤环境，以改善常规疗法的结果。靶向OX40或CTLA4的免疫疗法已经示出经由T细胞浸润的改变来重建肿瘤环境。使用针对OX40的激动性抗体的免疫疗法能够对肿瘤进行重建，导致增加的CD8浸润，并且因此减少了巨噬细胞浸润(Gough等人，Cancer Res[癌症研究]2008；68:5206-15)。类似地，已经示出，CTLA-4的封闭抗体导致在小鼠模型中(Curran等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]2010；107:4275-80)和在患者中(Huang等人，Clinical cancer research[临床癌症研究]2011；17:4101-9)的肿瘤的增加的T细胞浸润。然而，仅在患者中存在这些浸润并不一定与治疗成功相关(Huang等人，Clinical cancer research[临床癌症研究]2011；17:4101-9)。已经示出，在肿瘤免疫环境中的巨噬细胞可以迅速地将它们的表型从前适应性免疫M1分化改变为前伤口愈合M2分化，并解决T细胞疗法后的初始炎症(Gough等人，Immunology[免疫学]2012；136:437-47)。然而，在系统免疫疗法后的最初的T细胞浸润到肿瘤中可能足以短暂重建肿瘤环境，例如通过重构或使低效率的新生成血管的脉管系统正常化(Ganss等人，Cancer Res[癌症研究]2002；62:1462-70)，因为化学疗法的效果是受低效率的药物递送限制的。不被具体理论所束缚，假设通过免疫疗法的肿瘤重建有潜力使肿瘤在其他肿瘤免疫环境中更容易受到化学疗法的影响。
为了检验这一假设，使用了在免疫活性的小鼠中形成高度抗化学疗法和抗放射疗法的肿瘤的胰腺腺癌的Panc02小鼠模型，与更多的免疫原性肿瘤相比，它有广泛的基质参与和减弱的药物渗透。如在此所表明，系统免疫疗法如通过减少精氨酸酶表达确定的，短暂地改变肿瘤中巨噬细胞的极化。在改变的巨噬细胞极化的窗口期间吉西他滨化学疗法的递送导致显著改善的肿瘤控制和存活率。另外，表明这些荷瘤小鼠中T细胞分化对于这一免疫化学疗法而言并不是最佳的。这导致2型辅助T细胞(Th2)分化与通过激活的CD4 T细胞的白介素-4(IL-4)产生相关。体内抑制白介素-4(IL-4)显著改善免疫化学疗法的效果。最后，小鼠免疫细胞在化学疗法后示出保留功能性，这样使得另外周期的免疫化学疗法显著增加了肿瘤控制和存活率。这些数据表明，免疫疗法和化学疗法的顺序和时序会对肿瘤微环境和肿瘤反应有显著影响。制备型免疫疗法是一种新颖的治疗选择，它具有在免疫环境较差的情况下改善化学疗法的效果的潜能，并且可以用阴性免疫学增加癌症中的反应率。
放射疗法影响患者的免疫系统，并且免疫系统影响对放射疗法的反应(Gough等人，Immunotherapy[免疫疗法]，2012.4(2):125-8)。肿瘤的放射疗法会导致在MHC I类表达中的剂量反应性增加(Reits等人，The Journal of experimental medicine[实验医学杂志]，2006.203(5):1259-71)，并在高剂量放射治疗后的2天内呈现一个抗原呈递的短窗口(Zhang等人，The Journal of experimental medicine[实验医学杂志]，2007.204(1):49-55)。许多临床前和临床免疫疗法靶向T细胞，因此在放射治疗的剂量后立即应用共同刺激或免疫佐剂(Lee等人，Blood[血液]，2009.114(3):589-595；Gough等人，J Immunother[免疫疗法杂志]，2010.33(8):798-809；Demaria等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2005.11(2Pt 1):728-34；Deng等人，J Clin Invest[临床研究杂志]，2014.124(2):687-95；Seung等人，Sci Transl Med[科学转化医学]，2012.4(137):137ra74)。已经示出这些方法不同程度地增加的肿瘤抗原特异性免疫反应，改善对放射治疗和远距离未经治疗的肿瘤的清除，并且保护治愈的动物免受随后的肿瘤激发。然而，一系列有趣的轶事一样的研究已经表明，使用易普利姆玛(人抗CTLA4抗体)的免疫疗法，随后是放射治疗，会导致伴随增加的肿瘤抗原特异性反应发生黑色素瘤中广泛的肿瘤消退(Postow等人，The New Englandjournal of medicine[新英格兰医学杂志]，2012.366(10):925-31；Hiniker等人，Translational Oncology[转化肿瘤学]，2012.5(6):404-407)。在这些患者中，放射疗法以一种缓和的方式递送，以致在已经参与易普利姆玛研究的患者中进行个体损害。易普利姆玛疗法已经示出增加T细胞浸润至患者的肿瘤中，不管这些肿瘤是否对抗体疗法有反应(Huang等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2011.17(12):4101-9)。因此，那些用免疫疗法后递送的局灶姑息性放射治疗实现了局部和远程疾病控制的患者可能会接受至改善的肿瘤环境的治疗。在用易普利姆玛和放射进行治疗的患者的一篇综述中，Barker等人发现，在‘维持期’中接受放射疗法后用放射进行治疗的患者比在‘诱导期’中用放射进行治疗的那些患者示出显著的生存优势(Barker等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]，2013.1(2):92-8)。这些数据表明，通过优化时序，可以改善抗CTLA4和放射疗法的时序安排。
迄今为止，很少有研究能合理地优化免疫疗法与放射疗法的时序，这样使得免疫疗法首先递送。最近在放射疗法的临床前鼠模型中表明，用TGFβ抑制剂的前处理通过改善残余疾病的免疫控制，改善了对放射疗法的反应(Young等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]，2014)。不被具体理论所束缚，假设与放射疗法后治疗相比，在放射疗法前用抗CTLA4抗体进行预处理将改善肿瘤控制。在免疫活性的小鼠的结肠直肠癌的临床前模型中，用抗CTLA4抗体进行预处理提供了最佳肿瘤控制。然而，一种靶向新近激活的T细胞的使用抗OX40的替代免疫疗法，如果在放射疗法后立即递送，则是最佳的。不被具体理论所束缚，抗CTLA4预处理的效果可能在于其消除调节性T细胞的能力。在此描述的结果提供了重要的临床前证据，从而考虑当将最佳组合治疗转化为临床特别是免疫疗法时，作用的机制可能决定了最佳的放射治疗时序。
抗肿瘤治疗
在此提供的是用于治疗癌症的方法，该方法包括给予OX40激动剂或抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)和/或抗CTLA4抗体，结合其他癌症治疗。给予抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)和/或抗CTLA4抗体可导致肿瘤环境中的改变(例如，抑制巨噬细胞分化)，并且给予这种免疫疗法增加了化学疗法的抗肿瘤效果，例如，在疾病的进展中，改变肿瘤消退，收缩或停滞的水平。
本披露的一个方面提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向需要治疗的患者给予有效量的抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)和/或抗CTLA4抗体以及一种或多种化学治疗剂。适合的化学治疗剂和毒素描述于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿的医药科学]，第19版，(马克出版公司(Mack Publishing Co.)1995)，以及Goodman andGilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础]，第7版，(麦克米兰出版有限公司(MacMillan Publishing Co.)1985)中。其他适合的毒素和/或化学治疗剂是本领域技术人员已知的。
给予抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)和/或抗CTLA4抗体抑制肿瘤中的巨噬细胞分化，如通过在肿瘤相关的巨噬细胞中精氨酸酶表达的水平降低示出。肿瘤相关的巨噬细胞分化的抑制发生在一个窗口中，在这种情况下，在另外对常规疗法有抗性肿瘤中，观察到化学疗法的抗肿瘤效果。因此，在本发明的某些实施例中，化学治疗剂(例如，吉西他滨、5FU、多西他赛、紫杉醇或CPT11)在巨噬细胞分化减少时给予。抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)和抗CTLA4抗体的给予也与分泌IL4的T细胞的Th2分化相关，IL4促进了巨噬细胞分化。响应于通过Th2细胞的IL4分泌，与免疫疗法一起给予抗IL4抗体抑制巨噬细胞分化。因此，在某些实施例中，抗IL4抗体的使用包括在用抗OX40抗体(例如，OX40激动剂抗体)和抗CTLA4的抗肿瘤方案中。
令人希望的是，OX40激动剂和/或抗CTLA4抗体的给予导致肿瘤重塑、巨噬细胞分化的抑制和/或T细胞分化分化的抑制中的一个或多个。因此，OX40激动剂和/或抗CTLA4抗体的给予可以用于增强常规癌症疗法，包括例如化学疗法和放射疗法的抗肿瘤效果。OX40激动剂和/或抗CTLA4抗体可以在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后给予。待给予的OX40激动剂和/或抗CTLA4抗体的有效量可以由本领域技术人员通过熟知的方法确定。当癌症疗法的毒性可以被受试者忍受(例如，具有低的淋巴毒性)，可以使用根据本发明的方法所述的一个或多个周期的免疫化学疗法。
对给予OX40激动剂的临床应答可以使用临床医生已知的诊断技术来评估，这些诊断技术包括但不限于磁共振成像(MRI)扫描、x-射线照相成像、计算机断层照相(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活的细胞分选器(FACS)分析、组织学、宏观病理学、以及血液化学，包括但不限于可通过ELISA、RIA和色谱法检测到的变化。在一个实例中，OX40激动剂和抗CTLA4抗体减少巨噬细胞分化，这可以通过巨噬细胞中精氨酸酶表达的减少测量(例如，使用在此描述的方法)。
使用癌症疗法(包括OX40激动剂和/或抗CTLA4抗体)的有效治疗包括例如降低癌症的进展速率，阻滞或稳定化原发性肿瘤部位处或一个或多个转移中的肿瘤或转移生长、肿瘤收缩、和/或肿瘤消退。
如在此下文所报告的，给予OX40激动剂和IDO抑制剂出人意料地增强了包含肿瘤抗原的免疫原性组合物的效力。
OX40激动剂
在通过抗原引发过程中或在该引发后不久，OX40激动剂与CD4+T细胞上的OX40受体相互作用，从而导致CD4+T细胞对该抗原的应答增加。与对单独抗原的应答相比，OX40激动剂与抗原特异性CD4+T细胞上的OX40受体相互作用可以增加T细胞增殖。与OX40激动剂不存在的情况相比，对抗原的升高的应答可以维持实质上更长的时间段。因此，经由OX40激动剂的刺激通过加强抗原例如肿瘤细胞的T细胞识别来增强抗原特异性免疫应答。OX40激动剂例如在美国专利号6,312,700、7,504,101、7,622,444以及7,959,925中有所描述，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。在癌症治疗中使用这些激动剂的方法例如在WO/2013/119202中和在WO/2013/130102中有所描述，这些专利中的每一个通过引用以其全部内容结合在此。
OX40激动剂包括但不限于OX40结合分子，例如结合多肽，例如OX40配体(“OX40L”)或OX40结合片段、变体或其衍生物(诸如可溶性细胞外配体结构域和OX40L融合蛋白)以及抗OX40抗体(例如，单克隆抗体诸如人源化单克隆抗体)或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗OX40单克隆抗体的实例例如在美国专利号5,821,332和6,156,878中有所描述，这些专利的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。在某些实施例中，该抗OX40单克隆抗体是9B12或其抗原结合片段、变体或衍生物，如温伯格，A.D.等人，免疫学治疗杂志29,575-585(2006)中所描述，该文献通过引用以其全部内容结合在此。
在某些方面，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的氨基酸序列。
在某些方面，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32。
本披露进一步提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与以下各项一致或除了在这些VH-CDR中的一个或多个中的八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个单个氨基酸取代、缺失或插入外与以下各项一致的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列：VHCDR1氨基酸序列SEQ ID NO:8，VHCDR2氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，以及VHCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQID NO:26或SEQ ID NO:27。
本披露进一步提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含具有下式的氨基酸序列：
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，
其中HFW1是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，HCDR1是SEQ ID NO:8，HFW2是SEQ IDNO:9，HCDR2是SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16，HFW3是SEQ ID NO:17、HCDR3是SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27，并且HFW4是SEQ ID NO:28。在某些方面，HFW2的氨基酸序列是SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13。在某些方面，HFW3的氨基酸序列是SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:24。
此外，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、或SEQ ID NO:67至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％一致的氨基酸序列。
在一个方面，本披露提供一种包含抗体VH和抗体VL的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:59。
在某些方面，本披露提供一种包含抗体重链或其片段和抗体轻链或其片段的人源化抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中该重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71，并且该轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
在其他实施例中，特异性地结合OX40的抗体或其抗原结合片段与mAb 9B12结合相同OX40表位。
示例性的人源化OX40抗体描述于Morris等人，Mol Immunol.[分子免疫学]2007年5月；44(12):3112-3121，并且具有以下序列：
APLATDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ
VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGKELLGGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARI
KKLIGERGHGGGSNSQVSHRYPRFQSIKVQFTEYKKEKGFILTS
QKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDE
EPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNG
GELILIHQNPGEFCVL(SEQ ID NO:95)
9B12是鼠类IgG1，针对人OX40(CD134)的细胞外结构域的抗OX40 mAb(Weinberg,A.D.,等人J Immunother[免疫学治疗杂志]29,575-585(2006))。由于9B12引发对于OX40信号传导的激动剂应答的能力、稳定性以及其通过杂交瘤的高水平产生，所以从一系列抗OX40单克隆抗体中选择9B12。对于在临床应用中的使用，将9B12mAb用磷酸盐缓冲盐水(pH7.0)平衡，并且通过渗滤将它的浓度调节至5.0mg/ml。
“OX40配体”(“OX40L”)(也不同地称作肿瘤坏死因子配体超家族成员4、gp34、TAX转录活化糖蛋白-1以及CD252)在很大程度上被发现于抗原呈递细胞(APC)上，并且可以在活化的B细胞、树突细胞(DC)、朗格汉斯细胞、浆细胞样DC以及巨噬细胞上被诱导(Croft,M.,(2010)Ann Rev Immunol[免疫学年鉴]28:57-78)。其他细胞，包括活化的T细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞可以响应于炎性细胞因子(Id.)中表达OX40L。OX40L特异性结合到OX40受体。人类蛋白质被描述于PCT公开号WO 95/21915中。小鼠OX40L被描述于美国专利号5,457,035中。OX40L表达于细胞的表面上，并包括细胞内、跨膜和细胞外受体结合域。OX40L的功能活性可溶形式可以通过缺失细胞内结构域和跨膜结构域来产生，如例如在美国专利号5,457,035和6,312,700、以及WO 95/21915中所描述，其披露内容出于所有目的结合在此。OX40L的功能活性形式是保留特异性结合到OX40的能力的形式，即具有OX40“受体结合结构域”的形式。
在相关的实施例中，本披露提供已经丧失特异性结合OX40的能力的OX40L的突变体，例如SEQ ID NO：96的氨基酸51至183，其中人OX40L的受体结合域的位置180处的苯丙氨酸已被替换为丙氨酸(F180A)。
＞sp|P23510|TNFL4_人肿瘤坏死因子配体超家族成员4 OS＝智人GN＝TNFSF4 PE＝1 SV＝1
MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVLQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFIL TSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVT TDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL(SEQ ID NO：96)
确定OX40L分子或衍生物特异性结合到OX40的能力的方法在以下进行讨论。制造和使用OX40L及其衍生物(例如，包括OX40结合域的衍生物)的方法描述于WO 95/21915，其还描述了包含连接到其他肽的OX40L的可溶形式的蛋白，例如，人免疫球蛋白(“Ig”)Fc区，该蛋白可以被产生来促进OX40配体从培养的细胞中纯化，或被产生来提高该分子在体内给予至哺乳动物后的稳定性(也参见，美国专利号5,457,035和PCT披露号WP 2006/121810，这两个专利都通过引用以其全文结合在此)。
OX40激动剂包括融合蛋白，在该融合蛋白中，OX40L的一个或多个结构域共价地连接到一个或多个另外的蛋白结构域。可用作OX40激动剂的示例性OX40L融合蛋白在美国专利号6,312,700中有所描述，该专利的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。在一个实施例中，OX40激动剂包括自组装成多聚体(例如，三聚体或六聚体)OX40L融合蛋白的OX40L融合多肽。这些融合蛋白例如在美国专利号7,959,925中有所描述，该专利通过引用以其全部内容结合在此。
在某些实施例中，OX40L融合蛋白是OX40L-IgG4-Fc多肽亚基或多聚体融合蛋白。如上所述的OX40L融合多肽亚基可自组装成三聚体或六聚体OX40L融合蛋白。因此，本披露提供包括六个如上所述的多肽亚基的六聚体蛋白。一个示例性多肽亚基自组装成在此指定为“OX40L IgG4P融合蛋白”的六聚体蛋白。除非特别注明，在此所用的术语“OX40L IgG4P融合蛋白”是指人OX40L IgG4P融合蛋白。自组装成六聚体蛋白OX40IgG4P融合蛋白的多肽亚基的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:98中。尽管如此，本领域的普通技术人员将认识到，许多其他序列也满足在此阐述的关于六聚体OX40L融合蛋白的标准。
本披露进一步提供了包含编码OX40L融合多肽亚基、或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸。编码OX40L IgG4P融合蛋白的多肽亚基的示例性多核苷酸序列由SEQ ID NO:97所代表。在某些方面，编码IgG4Fc结构域、三聚结构域和OX40L受体结合域的核酸序列以5'至3'方向连接，例如，以5'至3’方向连续地连接起来。在其他方面，所提供的多核苷酸可进一步包括信号序列，该信号序列编码，例如，分泌信号肽或膜定位序列。本披露提供了编码任何和所有OX40L融合多肽亚基或多聚体(例如，包含该亚基的六聚体蛋白)的多核苷酸。
在某些方面，本披露提供了包含编码OX40L IgG4P融合蛋白的核酸的多核苷酸。在某些方面，核酸序列包含SEQ ID NO:97。在此提供的编码对照蛋白的多核苷酸，例如，本披露提供了包含编码HuIgG-4FcPTF2OX40L F180A的核酸的多核苷酸。在某些方面，该核酸包括SEQ ID NO:99，并且来自这个构建体的表达产物(在本此中也被称为huIgGFcPTF2OX40LF180A)包括SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
SEQ ID NO:97:huIgG4FcPTF2OX40L的DNA序列(5’至3’开放阅读框)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTG
SEQ ID NO:98:huIgG4FcPTF2OX40L的氨基酸序列(N至C末端)ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKDQ DKIEALSSKVQQLERSIGLKDLAMADLEQKVLEMEASTQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
huIgG4FcPTF2OX40L F180A的DNA序列(5’至3’开放阅读框)(SEQ ID NO:99)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGGCCTGCGTGCTG
huIgG4PFcTF2OX40L F180A的氨基酸序列(N至C末端)(SEQ ID NO:100)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKDQ DKIEALSSKVQQLERSIGLKDLAMADLEQKVLEMEASTQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGECVL
该多聚体OX40L融合蛋白在增强受试者(尤其是人受试者)的抗原特异性免疫应答方面表现出增加的效力，这是由于其自发地组装成高度稳定的三聚体和六聚体的能力。
在另一个实施例中，能够组装成多聚体形式的OX40激动剂包括在N末端至C末端方向上包含以下各项的融合多肽：免疫球蛋白结构域，其中该免疫球蛋白结构域包括Fc结构域、三聚化结构域，其中该三聚化结构域包括卷曲螺旋三聚化结构域；以及受体结合结构域，其中该受体结合结构域是OX40受体结合结构域，例如OX40L或OX40结合片段、其变体或衍生物，其中该融合多肽可以自组装成三聚体融合蛋白。在一个方面，能够组装成多聚体形式的OX40激动剂能够结合OX40受体并且刺激至少一种OX40介导的活性。在某些方面，OX40激动剂包含OX40配体的细胞外结构域。
能够组装成多聚体形式的OX40激动剂的三聚结构域用于促进单个OX40L融合多肽分子自组装成三聚体蛋白质。因此，具有三聚结构域的OX40L融合多肽自组装成三聚体OX40L融合蛋白。在一个方面，该三聚化结构域是异亮氨酸拉链结构域(zipper domain)或其他卷曲螺旋多肽结构。示例性卷曲螺旋三聚结构域包括：TRAF2(登录号Q12933，氨基酸299-348；血小板反应蛋白1(登录号PO7996，氨基酸291-314；母系蛋白-4(登录号O95460，氨基酸594-618；CMP(母系蛋白-1)(登录号NP-002370，氨基酸463-496；HSF1(登录号AAX42211，氨基酸165-191；和Cubilin(登录号NP-001072，氨基酸104-138。在某些特定方面，三聚化结构域包括TRAF2三聚化结构域、母系蛋白-4三聚化结构域或其组合。
在具体的实施例中，OX40激动剂被修饰以增加其血清半衰期。例如，OX40激动剂的血清半衰期可以通过与异源分子诸如血清白蛋白、抗体Fc区或PEG轭合而增加。在某些实施例中，OX40激动剂可以与其他治疗剂或毒素缀合以形成免疫缀合物和/或融合蛋白。
在某些方面，OX40激动剂可以进行配制以便有助于给予且促进活性剂的稳定性。在某些方面，根据本披露的药用组合物包含药学上可接受的、无毒性的、无菌的载体，诸如生理盐水、无毒性的缓冲液、防腐剂等。用于在此披露的治疗方法的适合配制品描述于，例如，在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿的医药科学]马克出版公司(MackPublishing Co.)第16版(1980)。
抗CTLA4抗体
特异性结合CTLA4并抑制CTLA4活性的抗体可用于增强抗肿瘤免疫应答。关于用于在此提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以见于US 6,682,736(其中它被称为11.2.1)，该专利的披露内容通过引用以其全文结合在此。曲美木单抗(也称为CP-675,206、CP-675、CP-675206、和替西木单抗)是一种人类IgG2单克隆抗体，该单克隆抗体对于CTLA4有高度选择性并阻断了CTLA4与CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的结合。它已被证明导致体外免疫激活，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已表现出肿瘤消退。
示例性的抗CTLA4抗体描述于例如美国专利号6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；和8,491,895中(其中，曲美木单抗是11.2.1)，这些专利通过引用结合在此。曲美木单抗是示例性抗CTLA4抗体。以下提供了曲美木单抗序列(参见美国专利号6,682,736。
曲美木单抗VH
GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH(SEQ ID NO:101)
曲美木单抗VL
PSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV(SEQ ID NO:102)
曲美木单抗VH CDR1
GFTFSSYGMH(SEQ ID NO:103)
曲美木单抗VH CDR2
VIWYDGSNKYYADSV(SEQ ID NO:104)
曲美木单抗VH CDR3
DPRGATLYYYYYGMDV(SEQ ID NO:105)
曲美木单抗VL CDR1
RASQSINSYLD(SEQ ID NO:106)
曲美木单抗VL CDR2
AASSLQS(SEQ ID NO:107)
曲美木单抗VL CDR3
QQYYSTPFT(SEQ ID NO:108)
用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗包括重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包括上文所示的氨基酸序列，该重链可变区包括上文所示的氨基酸序列。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包括上文所示的卡巴特(Kabat)定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中该轻链可变区包括上文所示的卡巴特定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的乔西亚(Chothia)定义的、Abm定义的或其他的CDR定义。在一个特定方面，用于在此提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括如在US 6,682,736中所披露的11.2.1抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，该专利通过引用以其全文结合在此。
其他抗CTLA4抗体描述于例如US 20070243184。在一个实施例中，该抗CTLA4抗体是易普利姆玛，也称为MDX-010；BMS-734016。
抗体
分别选择性结合OX40、CTLA4或IL4并且抑制OX40、CTLA4和IL4的结合或活性的抗体在本发明的方法中是有用的。经受涉及免疫疗法治疗的受试者可以给予本领域已知的几乎任何抗OX40、抗CTLA4或抗IL4抗体。适合的抗体包括，例如，已知的抗体、可商购的抗体或使用本领域熟知的方法开发的抗体。
本发明使用的抗体包括免疫球蛋白、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同表位结合片段形成的多特异抗体(例如，双特异抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫键结合的Fvs(dsFv)，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括(例如)针对本文披露的抗体的抗Id抗体)、细胞内抗体、以及任何以上的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如包含至少一个抗原结合位点的分子。
本发明的抗体涵盖单克隆人类的、人源化的或嵌合的抗体。在本发明的组合物和方法中使用的抗体可以是裸抗体、免疫偶联物或融合蛋白。在某些实施例中，抗体可以是具有IgG同种型、特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同种型或在人群体中发现的任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等位基因的人类的、人源化的或嵌合的抗体。人IgG类抗体具有多种有益的功能特征，例如在血清中的长半衰期和介导不同的效应子功能的能力(MonoclonalAntibodies:Principles and Applications[单克隆抗体：原理与应用]，Wiley-Liss,Inc.公司，第1章(1995))。人IgG类抗体被进一步分成以下4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该IgG1亚类在人类中具有高的ADCC活性和CDC活性(Chemical Immunology[化学免疫学]，65,88(1997))。在其他实施例中，该抗体是已知抗体的同种型转换变体。
药用组合物
给予用于治疗肿瘤或实体癌的化合物或化合物的组合可以通过任何适合的手段，这些手段导致治疗剂的浓度，该浓度与其他组分结合，具有抗肿瘤效果，或增强化学疗法的抗肿瘤效果(例如，在疾病的进展中，改变肿瘤消退，收缩或停滞的水平)。化合物都可以按任何适当的量被包含在任何适合的载体物质中。该组合物可以是以一种适合于肠胃外(如：腹腔内)给予途径的剂型来提供。这些药物组合物可以根据常规药物惯例进行配制(参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践](第20版)编辑A.R.Gennaro、Lippincott Williams&Wilkins、2000以及Encyclopedia ofPharmaceutical Technology[药物技术百科全书]，编辑J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，马塞尔·德克尔(Marcel Dekker)，纽约)。人类剂量最初可以通过从小鼠中使用的化合物的量进行推断来确定，正如本领域技术人员认识到的，与动物模型相比来修改对人类的剂量是本领域中的惯例。
用于肠胃外使用的组合物可以按单位剂型提供(例如，单次剂量安瓿)，或以包含若干剂量的小瓶形式提供，并且其中可以添加适合的防腐剂(参见下文)。除了一种或多种活性剂，该组合物可以包括适合的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。此外，该组合物可以包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂、和/或分散剂。
如上所指示，根据本发明所述的药用组合物可以处于适合无菌注射的形式。为制备这样的一种组合物，适合的一种或多种活性治疗剂溶解于或悬浮于肠胃外可接受的液体运载体中。可以采用的可接受的运载体和溶剂是水，通过添加适当量的盐酸、氢氧化钠或适合的缓冲液调节至适合的pH的水，1,3-丁二醇，林格氏溶液，和等渗氯化钠溶液以及右旋糖溶液。水性配制品还可以包含一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中一种化合物只少量或微量溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可能包括10％-60％w/w的丙二醇或类似物。
联合疗法
在某些实施例中，在此呈现的披露内容是增强患有结肠直肠癌的受试者中化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后向受试者给予抗CTLA4抗体和/或OX40激动剂。
免疫疗法和化学疗法之间的潜在相互作用正在被许多研究者所追寻(Chen和Emens，Cancer immunology,immunotherapy[癌症免疫学-免疫疗法]：CII 2013；62:203-16)。重要的是，一项先前的研究已经表明，在患有非小细胞肺癌的患者中的疫苗疗法后，对化学疗法的反应率出乎意料地高(Antonia等人，Clinical cancer research[临床癌症研究]2006；12:878-87)。在这项研究中，疫苗单独在产生抗原特异性T细胞反应中是有效的，但不会影响大多数患者中的疾病进展。然而，疫苗疗法并没有一致地与化学疗法药物协同作用，而改善结果。在患有转移性黑色素瘤的患者中，与单独使用达卡巴嗪相比，抗CTLA4与达卡巴嗪化学疗法的共同递送改善了反应(Robert等人，New England Journal ofMedicine[新英格兰医学杂志]2011；364:2517-26)，尽管反应率与先前治疗过的患者中单独使用抗CTLA4所看到的一致(Weber等人，Clinical cancer research[临床癌症研究]2009；15:5591-8；Hodi等人，New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]2010；363:711-23)。在患有非小细胞肺癌、给予六个周期的紫杉醇和卡铂的患者中，对比单独使用化学疗法，添加抗CTLA4同时伴随前四个剂量的化学疗法没有改善存活率，尽管添加抗CTLA4同时伴随最后四个剂量的化学疗法确实改善了无进展存活率，尽管没有同时的方案影响总体存活率(Lynch等人，Journal of clinical oncology[临床肿瘤病学杂志]；30:2046-54)。在广泛的疾病小细胞肺癌患者中也看到了类似结果，其中对比单独使用化学疗法，抗CTLA4和化学疗法的稍后剂量并用改善了无进展存活率，但并没有改善总体存活率(Reck等人，Annals of oncology[肿瘤学年鉴]2013；24:75-83)。到目前为止，还没有临床研究改变免疫疗法和化学疗法的时序，以利用目前临床前研究中观察到的治疗窗口。
研究人员已经表明，化学疗法和放射疗法都可以通过调节主要组织相容性复合体(MHC)和共刺激受体，使癌细胞更容易受到免疫破坏(Reits等人，The Journal ofexperimental medicine[实验医学杂志]2006；203:1259-71；Chakraborty等人，CancerRes[癌症研究]2004；64:4328-37；Ramakrishnan等人，The Journal of clinicalinvestigation[临床研究杂志]2010；120:1111-24)。此外，化学疗法引起的细胞死亡已被提议用于在治疗后驱动新的肿瘤抗原特异性免疫反应(Chen和Emens，Cancer immunology,immunotherapy[癌症免疫学-免疫疗法]：CII 2013；62:203-16；Zitvogel等人，Naturereviews Immunology[免疫学自然综述]2008；8:59-73)。免疫疗法也可能经由其他机制影响对化学疗法的反应。化学疗法的效果是由于药物渗透限制了至癌细胞的有效剂量而被限制。免疫疗法可以通过使新生成血管的脉管系统正常化来改善肿瘤的血管组织(Ganss等人，Cancer Res[癌症研究]2002；62:1462-70)，并且有趣的是，免疫疗法通过正常化的脉管系统，也更有效(Hamzah等人，Nature[自然]2008；453:410-4)。这些数据表明，肿瘤的免疫状况和对治疗的反应之间可能存在复杂的相互作用，以及经由免疫疗法，有机会操纵患者的肿瘤，以改善他们对化学疗法的敏感性。
不同的系统性化学疗法在它们对系统免疫细胞的影响上有很大差异。不断增加的证据表明，化学疗法的FOLFIRINOX混合物在患有转移性胰腺癌的患者中提供了结果的改善，但就像吉西他滨并不导致持久治愈一样(Conroy等人，The New England journal ofmedicine[新英格兰医学杂志]2011；364:1817-25)。然而，这种混合物比吉西他滨具有显著更大的淋巴毒性。如果人们可以使用一系列的迈向临床批准的免疫疗法来提高肿瘤的免疫环境，那么最佳的化学疗法伙伴可能需要用新的标准重新评估。因为已经在各种恶性肿瘤中示出，肿瘤中的免疫环境对常规疗法的结果有显著影响，所以我们可以合理地假设，经由免疫疗法改善肿瘤中的免疫环境，应该能改善一系列常规疗法的结果。这可能不会对具有优异免疫环境的患者造成很大的影响。例如，跨越多个阶段，具有良好的“免疫评分”的结肠直肠癌患者具有优异的预后(Galon等人，Science[科学]2006；313:1960-4)。然而，无论哪个阶段，对于具有促肿瘤的免疫环境的那些患者，预后很差(Galon等人，Science[科学]2006；313:1960-4)。这些患者可能从制备型免疫疗法中获益最多。这种方法可能在如胰腺腺癌的癌症类型中具有最大益处，其中肿瘤具有非常促肿瘤的免疫环境，该环境对常规疗法具有很高的抗性，并且患者预后也很差。
在此定义的抗肿瘤治疗可以被应用为单一疗法，或除了本发明的化合物，可以涉及常规手术、骨髓和外周干细胞移植、化学疗法和/或放射疗法。
试剂盒
本发明提供了用于治疗肿瘤和实体癌的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包括抗OX40抗体和抗CTLA4抗体。在另外的实施例中，该试剂盒包含化学治疗剂(例如，吉西他滨)。在另外的实施例中，该试剂盒包含抗IL4抗体。在一些实施例中，该试剂盒包括包含治疗性或预防性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或其他适合的本领域已知的容器形式。这些容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容纳药物的其他材料制成。如果需要，本发明的抗体(例如，抗OX40、抗CTLA4、抗IL4)与用于向患有实体肿瘤的受试者给予抗体的说明书一起提供。
在具体实施例中，这些说明书包括以下各项中的至少一种：治疗剂的描述；用于治疗SCLC或其症状的剂量日程表和给予；注意事项；警告信息；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器(当存在时)上，或作为标记应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夹。
除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中得到充分解释，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”[分子克隆：实验室手册]，第二版(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”[寡核苷酸合成](Gait,1984)；“Animal Cell Culture”[动物细胞培养](Freshney,1987)；“Methods inEnzymology”[酶学方法]“Handbook of Experimental Immunology”[实验免疫学手册](Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”[用于哺乳动物细胞的基因转移载体](Miller和Calos,1987)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”[当前分子生物学方案](Ausubel,1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”[PCR：聚合酶链式反应]，(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”[当前免疫学方案](Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何准备和使用测试、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的公开和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。
实例
实例1：免疫疗法改善了对化学疗法的反应。
为了研究免疫疗法是否能改善对化学疗法的反应，使用了胰腺腺癌的Panc02鼠模型。此模型，像患者中的胰腺腺癌，对细胞毒剂的敏感性和体外的其他细胞系在类似的水平上，但是对体内的化学疗法和放射疗法具有很高的抗性(Priebe等人，Cancer ChemotherPharmacol[癌症化学疗法与药理学]1992；29:485-9；Young等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]2014)。Panc02肿瘤已经被体内的巨噬细胞高度浸润了，并且已经表明了在Panc02肿瘤中巨噬细胞的分化是限制放射疗法的体内效果的一个显著因素(Crittenden等人，PloS one 2012；7:e39295)。
为了确定化学疗法对肿瘤中的巨噬细胞的影响，用吉西他滨化学疗法治疗的患有确定的Panc02肿瘤的小鼠，并且在一周的治疗后收获肿瘤。免疫荧光组织学表明，在整个未治疗的肿瘤中，有广泛的巨噬细胞浸润，特别聚焦于浸润性边缘，但也在整个肿瘤中弥散(图1A)。化学疗法后，与来自其他鼠胰腺癌细胞系(Mitchem等人，Cancer Res[癌症研究]2013；73:1128-4)以及鼠乳腺癌模型(DeNardo等人，Cancer discovery[癌症发现]2011；1:54-67)的数据匹配，在整个肿瘤中增加了巨噬细胞浸润(图1A)。为确定免疫疗法是否能调节在Panc02肿瘤中巨噬细胞的分化，将患有确定的Panc02肿瘤的小鼠用抗OX40、抗CTLA4或抗OX40和抗CTLA4的组合治疗。肿瘤巨噬细胞通过流式细胞术在免疫疗法后第4或第7天分离(图1B)，然后通过蛋白质印迹法分析作为抑制/修复分化的标记的精氨酸酶。抗体的组合降低了在肿瘤巨噬细胞中在第4天的精氨酸酶表达，尽管在第7天前就反弹到升高的精氨酸表达(图1C)。诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在任何治疗下通过蛋白质印迹法在肿瘤巨噬细胞中未检测出，表明没有完全转化为炎症状态。有趣的是，使用T细胞靶向免疫疗法的先前的结果示出，由肿瘤细巨噬胞引导的主动炎症消散抑制了T细胞浸润的短暂益处(Gough等人，Immunology[免疫学]2012；136:437-47)。不被具体理论所束缚，这表明肿瘤中免疫介导的重建的一个有限窗口。因此，抗OX40和抗CTLA的组合抑制巨噬细胞在Panc02肿瘤模型中的巨噬细胞分化。
实例2：用抗OX40和抗CTLA4的组合进行预处理，显著改善了用化学疗法的肿瘤控制。
基于巨噬细胞分化的这一时序，测试在免疫治疗后第4天开始递送的化学疗法的效果。在这种模式下，单独使用免疫疗法在肿瘤治疗中是无效的，而吉西他滨化学疗法则会给予短暂的肿瘤延迟。(图2A，小图(i))并且显著地延长了存活(图2B，小图(ii))。用抗OX40或抗CTLA4作为单一制剂预处理不改变对化学疗法的反应。然而，与化学疗法结合使用抗体的预处理显著改善了使用化学疗法的肿瘤控制(图2A，小图(ii))，并且与化学疗法或单独使用抗体组合相比，改善了存活率(图2B)。为了确定这一效果对时序有多敏感，测试在抗体免疫疗法的同一天开始的，或者在免疫疗法后的第7天开始的化学疗法的效果。在每种情况下，存活率与单独使用化学疗法并无不同(图7)，表明这一免疫疗法效果对时序敏感。
实例3：免疫治疗在不同时间点上对肿瘤环境的影响。
为了检查免疫疗法在这些时间点上对肿瘤环境的影响，收获肿瘤，并且对浸润细胞群进行了流式细胞术。治疗组合并没有改变髓细胞比例，并且令人惊讶的是，在治疗后，肿瘤中CD8T细胞的总体比例上没有统计学上显著的差异(图3)。CD8T细胞响应于免疫疗法的这一差的浸润，与在更多的免疫原性肿瘤类型中的对免疫疗法的反应不同(Gough等人，Cancer Res[癌症研究]2008；68:5206-15；Redmond等人，Cancer Immunology Research[癌症免疫学研究]2013；2:142-53)，潜在地解释了为何Panc02肿瘤对单独使用免疫疗法的反应很差。像CD8T细胞一样，CD11b+髓样细胞的比例不改变，这表明由免疫疗法引起的每个细胞群的变化不在比例上，而在分化上。联合治疗后7天，CD4 T细胞浸润具有显著增加(图3)，并且CD4 T细胞浸润已经被示出经由IL-4分泌，驱动巨噬细胞中的促肿瘤的和免疫抑制的表型。已经表明，在其他肿瘤模型中，抗OX40和抗CTLA4免疫疗法可以协同作用，以驱动CD4T细胞进入2型辅助T细胞(Th2)分化路径并且引导IL-4分泌(Redmond等人，CancerImmunology Research[癌症免疫学研究]2013；2:142-53；Linch等人，Oncoimmunology[肿瘤免疫学]2014；3:e28245)。这些数据可能会解释肿瘤巨噬细胞中的精氨酸酶反弹(图1C)，因为IL-4是巨噬细胞中精氨酸酶表达的主要驱动因素之一。
实例4：免疫疗法增加了Panc02鼠模型中的2型辅助T细胞(Th2)分化。
为了确定免疫疗法是否在此模型中驱动了2型辅助T细胞(Th2)的分化，从用抗OX40、抗CTLA4或组合治疗的患Panc02荷瘤小鼠中分离出淋巴结，并且分析了T细胞分化。联合治疗显著地增加了CD4和调节性T细胞在淋巴结中的数量，但仅少量地增加了CD8T细胞的数量(图4A)。非调节性(FoxP3-)CD4 T细胞的转录因子分析表明，抗OX40和抗CTLA4之间诱导Gata3表达的协同作用(图4B和4C)，其为2型辅助T细胞(Th2)分化的指示。1型辅助T细胞(Th1)相关转录因子Tbet也上调，虽然降低了水平而且看起来在组合中是相加的而不是协同的(图4C)。为了证实这些数据，用抗CD3在体外刺激了来自受治疗动物的淋巴结细胞T细胞，并且测量了细胞内细胞因子的产生。来自用抗OX40和抗CTLA4治疗的小鼠的非调节性CD4 T细胞表明，IL-4产生的协同诱导和干扰素γ(IFNγ，图4D)的相加诱导，与转录因子数据密切匹配。有趣的是，在CD8T细胞联合治疗中表明了脱中胚蛋白的显著上调(Redmond等人，Cancer Immunology Research[癌症免疫学研究]2013；2:142-53)，这表明联合治疗是在此时引导记忆T细胞而不是效应T细胞分化。
实例5：IL-4的2型辅助T细胞(Th2)生产限制了与抗OX40/抗CTLA4的治疗结合的化学疗法的效果。
为确定IL-4的此2型辅助T细胞(Th2)生产是否限制在此模型中化学疗法的效果，用抗OX40和抗CTLA4治疗小鼠并在4天后开始吉西他滨化学疗法。在化学疗法的每一给予中，配对组的小鼠接受IL-4封闭抗体。添加抗IL-4并没有单独影响肿瘤生长，但是增加了化学疗法和免疫疗法组合的影响(图5A)。在治疗期结束时，与所有其他组相比，给予抗OX40和抗CTLA4预处理，随后是与抗IL-4一起递送的化学疗法的组，展现了显著改善的肿瘤控制(图5B)。如以上所示，在肿瘤恢复快速生长前，在停止化学疗法和抗IL-4的治疗中，肿瘤控制持续了大约一周。
实例6：适应性免疫系统是充分功能性的，其通过联合治疗加上化学疗法，并且另外的联合治疗改善了存活率。
不同的化学疗法可以对造血细胞群有非常不同的影响。吉西他滨并不是更多的骨髓毒性的或淋巴毒性的化学疗法之一，但化学疗法可能会通过杀死效应子群来限制免疫疗法的效果。为了确定治疗对免疫细胞的影响，在免疫化学疗法后，对血液进行了定量流式细胞术分析。使用一系列表型标记来识别子群(图6A)，表明吉西他滨显著地减少外周血液中CD11b+Gr1hi嗜中性细胞，连同CD11b+Ly6C+Ly6Glo未成熟髓样细胞(图6B)。CD11b+Gr1-MHCII+单核细胞通过免疫疗法增加，并且在化学疗法后趋于减少，但变化并不是统计上显著的。在化学疗法后T细胞群未减少，与未经治疗的对照相比，CD8、CD4和调节性T细胞的数量在联合治疗加上化学疗法中都增加了(图6B)。这些数据表明，在使用吉西他滨化学疗法治疗的小鼠中，适应性免疫系统仍然保持完整。在这种情况下，测试了另外周期的免疫疗法是否可以有助于提高对化学疗法的反应。在这个实验中，用联合免疫疗法治疗的小鼠4天后接受了化学疗法，尽管持续了2周的更短的疗程。治疗过程被缩短，以确保所有的小鼠都能得到第二周期的治疗。小鼠被随机化，以接受第二次剂量的联合免疫疗法，4天后再进行第二次2周周期的化学疗法。接受第二次剂量的免疫疗法的小鼠与仅接受单独的免疫疗法、单独的化学疗法或仅一次的免疫疗法的小鼠相比，展现了显著改善的存活率(图6C)。这些数据表明，通过化学疗法，适应性免疫系统具有足够的功能性，以允许另外的刺激，从而再次增强正在进行的治疗的效果。
这些数据表明，制备型免疫疗法改善了对化学疗法的反应，而对化学疗法的改善的反应，与肿瘤相关的巨噬细胞的复极化相一致。机会的窗口非常狭窄，治疗窗口的关闭与2型辅助T细胞(Th2)的出现和肿瘤巨噬细胞中的精氨酸酶I的上调相关。阻断2型辅助T细胞(Th2)效应细胞因子IL-4改善了免疫化学疗法的效果，而且重要的是，免疫系统在化学疗法中仍保持足够的功能性，以允许至少一次另外周期的免疫化学疗法。
已知胰腺腺癌具有高度抑制的免疫环境，并且对患者中和动物模型中的化学疗法的反应也很差。这一失败的一些部分原因被认为是由于作为高度纤维化的肿瘤环境和低效率的新生成血管的脉管系统的结果，导致的对癌细胞的非常差的化学疗法递送。在某些肿瘤模型中，OX40的激动性抗体或CTLA4的封闭抗体能有效地重建肿瘤环境(Gough等人，Cancer Res[癌症研究]2008；68:5206-15)。然而，在这里测试的胰腺腺癌的模型中，只观察到伴随联合疗法的对化学疗法的影响。在其中单独使用抗CTLA4能够减缓肿瘤生长的更多免疫原性模型中，抗CTLA4足以改善对化学疗法的反应。(Lesterhuis等人，PloS one 2013；8:e61895；Jure-Kunkel等人，Cancer immunology,immunotherapy[癌症免疫学-免疫疗法]：CII 2013；62:1533-45)。在弱免疫原性Lewis肺癌(3LL)肿瘤模型中，重复给予与吉西他滨化学疗法一起的抗CTLA4能够产生一种生存优势，其中这两种药剂单独使用都是无效的。(Lesterhuis等人，PloS one 2013；8:e61895)。
虽然在免疫治疗后对不同的化学疗法时序进行了测试，但免疫疗法的改变的日程表并没有被测试。例如，在其他模型中，通过交错剂量的抗OX40和抗CTLA4免疫疗法，已经表明肿瘤控制(Redmond等人，Cancer Immunology Research[癌症免疫学研究]2013；2:142-53)。治疗计划的优化仍有很大的余地，其中增加治疗周期的数量，以及添加其他药剂，例如抗PD1、抗41BB或在发育中的其他共刺激分子。使用其他的药剂也可以被用来引导CD4 T细胞分化(远离2型辅助T细胞(Th2)模式)和IL-4生产，以将肿瘤控制最大化。
实例7：在放射疗法之前的抗CTLA4免疫疗法减小了肿瘤负荷并且增加了总体存活率。
越来越多的免疫疗法与放射疗法结合在一起，以增强反应。然而，关于联合治疗的理想时序的现存数据相对较少。轶事一样的报告表明，递送至经历抗CTLA4疗法的患者的姑息性放射治疗产生系统性的治疗反应。(Postow等人，The New England journal ofmedicine[新英格兰医学杂志]，2012.366(10):925-31；Hiniker等人，TranslationalOncology[转化肿瘤学]，2012.5(6):404-407)。鉴于这些报告与大多数的临床试验设计不一致，这些临床试验设计递送抗CTLA4疗法与放射治疗同时或在放射治疗，因此研究了抗CTLA4免疫疗法时序对放射治疗的影响。
CT26结肠直肠肿瘤是在同系的BALB/c小鼠的右后肢上建立，并且在第7天、第15天抑或第19天用抗CTLA4抗体治疗小鼠；仅在第14天，递送20Gy放射治疗至肿瘤。在第7天单独抗CTLA4治疗导致小的存活益处，其中，中位数存活期为32天，对比不经治疗(NT)对照组的28天(p＝0.03)(图8A和8B，小图(i)和(ii))。尽管单独使用放射治疗导致暂时的肿瘤控制，但是所有肿瘤再次生长导致继发于肿瘤负荷的安乐死，其中，中位数存活期为47天(p＝0.0014对比NT)(图8A和8B，小图(iii))。在放射治疗前，在第7天接受抗CTLA4的荷瘤小鼠清除了它们的肿瘤，具有不明确的中位数存活期(p＝0.002对比单独使用放射治疗)(图8A和8B，小图(iv))。在放射疗法的时候，用抗CTLA4预处理的小鼠对比对照组小鼠，平均肿瘤大小并没有显著不同。一半的在放射治疗后接受抗CTLA4的荷瘤小鼠清除了肿瘤，其中，中位数存活期为92天(第15天给予)(p＝0.002对比单独使用放射治疗)对比53天(第19天给予)(p＝0.07对比单独使用放射治疗)(图8A和8B，小图(v)和(vi))。重要的是，所有通过联合疗法治愈肿瘤的小鼠都抵抗用CT26肿瘤的重新激发，但仍然对不同的肿瘤易感，这表明了达到了长期的抗原特异性免疫(表1，如下)。
表1 CT26肿瘤的治愈的荷瘤小鼠，排斥用CT26重新激发，但屈服于免疫生物学明显的4T1肿瘤。
治愈CT26肿瘤的荷瘤小鼠在100天后用相对侧的CT26和4T1重新激发。得到的肿瘤生长表明，治愈CT26的所有小鼠排斥用CT26的重新激发，但屈服于于同系的，但免疫学上不同的4T1肿瘤。这些数据表明，按所有时序添加抗CTLA4至放射疗法可以改善存活率，但在放射治疗之前递送特别有效。
先前的报告表明，在4T1乳腺肿瘤模型中，在放射治疗之后是-CTLA4给予的情况下，改善了肿瘤生长的控制(Demaria等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2005.11(2Pt1):728-34；Dewan等人，Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research[临床癌症研究：美国癌症研究协会的官方杂志]，2009.15(17):5379-88)。为了确定这一模型中时序的影响是否类似，在4T1肿瘤模型中重复了抗CTLA4给予与放射治疗的时序。用4T1细胞激发BALB/c小鼠并在第7天或第17天给予抗CTLA4，伴随第14、15和16天递送的20Gy的放射治疗，其中4T1放射剂量和时序基于前述研究(Crittenden等人，PLoS One,2013.8(7):e69527)。尽管继发于肺部转移的身体状况恶化的所有组中的小鼠被安乐死，并且因此抗CTLA4疗法的存活益处是无法确定的，但是与单独使用放射疗法相比，在放射治疗前接受抗CTLA4的小鼠中观察到显著更小的原发性肿瘤(p<0.05，图9，小图(i)-(v))。与此模型中单独使用放射治疗相比，放射治疗后给予抗CTLA4并没有被检测到肿瘤大小的改善(图9，小图(iii)和(v))。这种放射后反应不如之前已经报告的那么有效(Demaria等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2005.11(2Pt 1):728-34；Dewan等人，Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research[临床癌症研究：美国癌症研究协会的官方杂志]，2009.15(17):5379-88)，虽然严格地测试时序的影响，但这项研究仅限单次给予抗CTLA4，而不是像之前测试的那样重复给予(Demaria等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2005.11(2Pt 1):728-34；Dewan等人，Clinical cancer research:an official journalof the American Association for Cancer Research[临床癌症研究：美国癌症研究协会的官方杂志]，2009.15(17):5379-88)。然而，其中报告了存活率，即使重复RT后给予，抗CTLA4在患有4T1肿瘤的野生型小鼠体内示出与单独使用放射治疗相比，未给出存活率优势。(Pilones等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2009.15(2):597-606)，与当前数据一致。
实例7：放射疗法后的OX40免疫疗法增加了总体存活率。
为了确定抗CTLA4免疫治疗的时序是否基于抗CTLA4的作用机理是独特的，对抗OX40免疫疗法与放射治疗的理想时序进行了评估。抗OX40是在抗原暴露后，立即在T细胞上诱导的(Evans等人，J Immunol[免疫学杂志]，2001.167(12):6804-11)，并且放射治疗后抗OX40的递送显著增加了3LL肺癌模型中的存活率(Gough等人，J Immunother[免疫学杂志]，2010.33(8):798-809；Yokouchi等人，Cancer Sci[癌症科学]，2008.99(2):361-7)。CT26结肠直肠肿瘤是在BALB/c小鼠的后肢上建立，并且在第7天、第15天或第19天递送抗OX40激动剂抗体；仅在第14天递送20Gy放射治疗至肿瘤。与用抗CTLA4疗法与放射治疗相结合观察到的相反，用抗OX40抗体的预处理与单独使用放治疗法相比没有提供任何治疗优势(中位数存活期55天对比48天，p＝0.23)(图10)。在第19天，大大延迟的抗OX40给予，与单独使用放射治疗相比也没提供益处(中位数存活期41天，p＝0.6)。然而，在放射疗法后的一天递送抗OX40产生了约50％的肿瘤清除率(116.5天，p＝0.0006对比单独使用放射治疗)(图10)。这一时序与先前的研究一致，表明抗OX40必须在抗原暴露后的关键期12-24小时期间存在，而与T细胞上的OX40上调一致(Evans等人，J Immunol[免疫学杂志]，2001.167(12):6804-11)，并且具有在放射疗法后的大约2天，肿瘤抗原呈递的证据(Zhang等人，The Journal ofexperimental medicine[实验医学杂志]，2007.204(1):49-55)，这表明放射疗法后的5天是在这一治疗窗口外的。重要的是，所有用最佳时序治愈肿瘤的小鼠都能抵抗用CT26肿瘤的重新激发，但仍然对同系的抗原不同的肿瘤易感，这表明了达到了长期的抗原特异性免疫(表1)。
实例7：在放射治疗前，抗CTLA4的改善的放射效果，部分是基于调节性T细胞的耗竭。
最近的报告表明，抗CTLA4抗体会引起肿瘤中调节性T细胞的Fc-依赖性耗竭(Simpson等人，J Exp Med[实验医学杂志]，2013.210(9):1695-710)，并且结果示出，在放射疗法同时或之后，调节性T细胞的耗竭导致增强的肿瘤控制(Bos等人，J Exp Med[实验医学杂志]，2013.210(11):2435-66；Sharabi等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫研究]，2014)。为了确定在放射治疗前，抗CTLA4的改善的放射效果是否可以通过调节性T细胞的耗竭来解释，CT26肿瘤在BALB/c小鼠的后肢上建立，并且在第7天用抗CD4治疗，以耗竭所有CD4 T细胞，或用抗CD25治疗，以耗尽调节性T细胞。如上在第14天，小鼠接受了放射治疗。抗体治疗有效地耗竭了小鼠中的CD4+和CD25+细胞(图11A)。单独地或或者与随后的放射疗法相结合，CD4的耗竭并没有影响肿瘤生长(图11B)。单独地，CD25的耗竭并没有影响肿瘤生长，但是当之后是放射治疗时，导致了有一半的小鼠的肿瘤治愈(图11C)。重要的是，CD25的耗竭并没有像在之前的抗CTLA4预处理的研究中表现得那么好(参见图8A和8B)，并且总的CD4耗竭，这将包括调节性T细胞的耗竭，都是无效的。不被具体理论所束缚，这表明抗CTLA4除了调节性T细胞的耗竭外，还会提供影响，并且表明非调节CD4细胞对于CD25耗竭的动物中的治愈是重要的。然而，此前已经表明，抗原反应性CD8+CD25+细胞的增加的比例使在放射治疗后肿瘤重新住入(Gough等人，J Immunother[免疫治疗杂志]，2010.33(8):798-809)，并且这些细胞也会被抗CD25治疗耗竭。不被具体理论所束缚，那么抗CTLA4治疗很有可能通过去除预先存在的调节性T细胞，和阻断CD4和CD8效应T细胞的CTLA4-介导的抑制的常规作用二者扮演双重角色，允许在放射疗法后的残余癌细胞的改善的清除。
由于不同的抗CTLA4克隆已经示出在调节性T细胞的耗竭方面有所不同，不同的克隆体结合放射疗法进行了测试：9D9克隆是高度耗竭的，而UC10克隆则更少耗竭(Simpson等人，J Exp Med[实验医学杂志]，2013.210(9):1695-710)。如前所述，CT26肿瘤是在免疫活性的Balb/c小鼠的后肢中建立的，并且在第7天给予了9D9克隆抑或UC10克隆，随后在第14天进行了放射治疗。尽管所有用9D9和放射治疗进行治疗的小鼠都清除了它们的肿瘤，但是用UC10克隆治疗的小鼠有67％清除了它们的肿瘤(图12)。综上所述，这些数据表明调节性T细胞的耗竭增强了肿瘤清除，但是并不完全对抗CTLA预处理与放射治疗之间看到的协同作用负责。
在本研究中，结合放射治疗的抗CTLA4阻断或抗OX40激动剂治疗的理想时序，根据其不同的作用机制而变化。发现，用抗CTLA4阻断的肿瘤预调节，随后是放射治疗，导致鼠结肠直肠肿瘤的清除。这些结果符合轶事一样的案例报告，其中接受易普利姆玛治疗的转移性黑色素瘤患者随后接受姑息性放射治疗，且具有系统性远位反应与长期无病存活率(Postow等人，The New England journal of medicine[新英格兰医学杂志]，2012.366(10):925-31；Hiniker等人，Translational Oncology[转化肿瘤学]，2012.5(6):404-407)。此外，对经历过姑息性放射治疗的接受易普利姆玛的患者进行回顾性复查，具有改善的总体存活率，如果在维持期间递送放射治疗，对比诱导易普利姆玛，进一步表明预调节改善了结果(Barker等人，Cancer Immunol Res[临床免疫学研究]，2013.1(2):92-8)。在鼠模型中，RT治疗同时和之后的抗CTLA4已被示出控制肿瘤生长(Demaria等人，Clin CancerRes[临床癌症研究]，2005.11(2Pt 1):728-34；Dewan等人，Clinical cancer research：anofficial journal of the American Association for Cancer Research[临床癌症研究：美国癌症研究协会的官方杂志]，2009.15(17):5379-88)，但对总体存活率的影响有限，用抗CTLA4和RT组合的总体存活率范围从0％(Pilones等人，Clin Cancer Res[临床癌症研究]，2009.15(2):597-606)至20％(Belcaid等人，PLoS One，2014.9(7):e101764)。抗CTLA4的作用机制已经与它在肿瘤中耗竭调节性T细胞的能力相关(Simpson、T.R.、F.Li、W.Montalvo-Ortiz、M.A.Sepulveda、K.Bergerhoff、F.Arce、C.Roddie、J.Y.Henry、H.Yagita、J.D.Wolchok、K.S.Peggs、J.V.Ravetch,J.P.Allison和S.A.Quezada，Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines theefficacy of anti-CTLA-4 therapy against melanoma[肿瘤浸润调节性T细胞的Fc-依赖性衰竭共同定义了抗CTLA-4治疗黑色素瘤的效果]，J Exp Med[实验医学杂志]，2013.210(9):1695-710)，并且已经示出了通过放射治疗，RT同时或之后的调节性T细胞的耗竭改善了肿瘤控制(Bos等人，J Exp Med[实验医学杂志]，2013.210(11):2435-66；Sharabi等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫研究]，2014)。在此所述的结果表明，放射治疗随后是抗CTLA4阻断，确实改善了放射治疗的效果，但是未达到与预处理相同的程度，并且调节性T细胞的预处理耗竭也能改善对放射治疗的反应。这些结果很重要，鉴于大多数的结合易普利姆玛和放射治疗的正在进行的临床试验，在放射治疗的同时和/或之后递送易普利姆玛，这可能导致改善的结果，但可能并不能充分最大化协同作用的潜力。
就像许多化学治疗剂经由独特的机制发挥作用一样，免疫治疗剂也有不同的作用机制。研究了不同类别的免疫治疗剂是否会导致不同的理想时序。发现，抗OX40激动剂抗体充当T细胞共刺激剂，在放射治疗后短时间内递送时，改善了放射治疗的效果。联合治疗的改善的效果与在大分割放射疗法后的抗原呈递的窗口是一致的(Zhang等人，The Journalof experimental medicine[实验医学杂志]，2007.204(1):49-55)。OX40分子在T细胞上迅速上调，并且在抗原衔接合后持续有限的时间，并且在有效T细胞刺激的窗口期间必须存在激动剂抗体(Evans等人，J Immunol[免疫学杂志]，2001.167(12):6804-11)。尽管OX40在调节性T细胞上表达，但是给予抗OX40至荷瘤小鼠并不会导致肿瘤调节性T细胞的耗竭(Gough等人，Cancer Res[癌症研究]，2008.68(13):5206-15)。抗OX40抗体已经最近在一期临床试验中示出了希望(Curti等人，Cancer Res[癌症研究]，2013.73(24):7189-98)，并且在一期试验中，结合使用最佳时序的放射治疗，目前正在进行评估。
综上所述，发现结合放射疗法的免疫疗法的时序影响结果。特异性免疫治疗剂的理想时序与它们的作用机制相一致，在将药剂组合并且转化成临床时，应考虑到关于机制的临床前数据。
使用下面的材料和方法进行了上文描述的结果。
动物和细胞系
Panc02鼠胰腺腺癌细胞系(Priebe等人，1992，Cancer Chemother Pharmacol[癌症化学疗法与药理学]；29:485-9.C57BL/6)，由Woo博士(西奈山医学院(Mount SinaiSchool of Medicine)，纽约州)慷慨提供。用于在这些实验中使用的6-8周大C57BL/6小鼠获得自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(威明顿市，马萨诸塞州)。所有动物实验方案均由EACRI IACUC(动物福利保证号A3913-01)批准。
CT26鼠结肠直肠癌(Brattain等人，Cancer Res[癌症研究]，1980.40(7):2142-6)和4T1乳腺癌细胞系(Aslakson.和Miller，Cancer Research[癌症研究]，1992.52(6):1399-405)获得自ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。细胞生长于RPMI-1640培养基，其补充有HEPES、非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺、10％FBS、青霉素和链霉素。所有细胞系测试为支原体阴性。BALB/c获得自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(巴尔港，缅因州)。所有动物实验方案均由Earle A.Chiles研究机构IACUC(动物福利保证号A3913-01)批准。
免疫化学疗法
患有10-14天大的肿瘤的小鼠用抗OX40(OX86，250μg，腹腔内给予，BioXcell，西黎巴嫩，新罕布什尔州)、抗CTLA4(9D9，250μg，腹腔内给予，BioXcell)或组合治疗。化学疗法由100mg/kg吉西他滨(Eli Lilly and Co.[礼来公司]，印第安纳波利斯，印第安纳州)腹腔内给予每周两次，持续2或3周。抗白介素-4(抗IL-4、11B11，100μg，腹腔内给予，BioXcell)每周两次腹腔内递送，持续3周。抗体和试剂
荧光偶联抗体CD11b-AF700、Gr1-PE-Cy7、IA(主要组织相容性复合物(MHC)II类)-e780、Ly6G-PE-Cy7、Ly6C-PerCP-Cy5.5、CD4-e450、CD4-PerCP Cy5.5、FoxP3-e450、CD25-APC和CD8-FITC获得自亿生物科技(eBioscience)(圣地亚哥，加利福尼亚州)。CD4-v500和Ly6G-FITC获得自BD生物科学公司(BD Biosciences)(圣何塞，加利福尼亚州)。CD8-PE-TxRD获得自英杰公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。大鼠抗F4/80获得自AbD赛洛特克[AbD Serotec](罗利，北卡罗莱纳州)。使用的蛋白质印迹法抗体包括精氨酸酶I(BD生物科学公司(BD Biosciences))、GAPdH、抗小鼠-辣根过氧化物酶(HRP)、以及抗兔-HRP(全部来自细胞信号技术公司(Cell Signaling Technology)，丹弗斯，马萨诸塞州)。
荧光偶联抗体CD4-e450、CD25-APC、CD4-PerCP获得自亿生物科技(eBioscience)(圣地亚哥,加利福尼亚州)。CD8-PE-TxRD获得自英杰公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。治疗性抗CTLA4(克隆9D9或UC10)、抗OX40(克隆OX86)、抗CD4(克隆GK1.5)、和抗CD25(克隆PC.61.5.3)抗体获得自BioXcell(布兰福德，康乃狄克州)并且重新悬浮于无菌PBS至浓度为1mg/mL。
体内放射疗法模型
1x104CT26或5x1044T1细胞在100μL的PBS中的溶液被皮下注射至免疫活性的BALB/c小鼠的右后肢中。给予的抗体为250μg(抗OX40和抗CTLA4)或100μg(抗CD4和抗CD25)，腹腔内给予。在每个程序中表明的指定的时间点上给予抗体治疗。使用临床直线加速器(6MVphotons，Elekta协同直线加速器，亚特兰大，佐治亚州)递送放射治疗，用半束阻断以保护生命器官以及1.0cm大剂量以增加至肿瘤的剂量。对于CT26肿瘤，在第14天递送20Gy x1(Young等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫研究]，2014)；对于4T1肿瘤，在第14至16天递送20Gy x 3(Crittenden等人，PLoS One，2013.8(7):e69527)。对于治愈CT26肿瘤的小鼠，小鼠在相对侧用5x1044T1和1x104CT26肿瘤进行重新激发，以评估肿瘤特异性免疫。
免疫组织学
对于免疫组织学来说，肿瘤是在Z7锌基固定剂中固定过夜(Lykidis等人，2007，Nucleic acids research[核酸研究]；35:e85)。然后通过梯度醇至二甲苯对组织脱水，在熔融的石蜡中进行孵育，并且然后再在石蜡中包埋。切片(5μm)被切割和封片用于分析。如对于抗原修复而言适当的，组织切片在乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液中煮沸。一抗结合用AlexaFluor 488偶联二抗(分子探针公司(Molecular Probes)，尤金，俄勒冈州)可视化，并且用DAPI(英杰公司(Invitrogen))封片，以染色核材料。使用以下获取图像：尼康TE2000S落射荧光显微镜、尼康DsFi1数码相机和尼康NIS-Elements成像软件。在高分辨率下对整个肿瘤拍摄了多个图像，并对进行了数字化合并，以形成肿瘤的单一边缘到边缘概图。在手稿中显示的图像代表了整个肿瘤和它们各自的实验族群。
肿瘤巨噬细胞的蛋白质印迹法
用前文描述的对CD11b、IA(主要组织相容性复合物(MHC)II类)和Gr1特异性的抗体染色肿瘤细胞悬浮液(Gough等人，2008，CancerRes[癌症研究]；68:5206-15；Crittenden等人，2012，PloS one；7:e39295)，并且CD11b+Gr1loIA+肿瘤巨噬细胞使用BD荧光激活细胞分选术(FACS)，Aria细胞分选仪分选至纯度高于98％。细胞在放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液中被裂解，在包含β2-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠(SDS)的上样缓冲液中变性，在10％的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并转移到硝化纤维。在4℃时，用一抗探测封闭的印迹过夜，随后用辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗。使用Pierce SuperSignal Pico化学发光底物(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，罗克福德，伊利诺伊州)检测结合并且暴露至膜。
肿瘤、血液和淋巴结的流式细胞术
为了分析肿瘤浸润细胞，肿瘤被分解为大约2mm碎片，随后在1mg/mL胶原酶(英杰公司(Invitrogen))、100μg/mL透明质酸酶(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)和20mg/mLDNA酶(Sigma公司)在PBS中的溶液中在室温下搅拌1小时。该消化液经过100μm的尼龙网过滤，以去除肉眼可见的碎片。对于浸润细胞的流式细胞学分析，细胞悬液被洗涤并直接用偶联荧光抗体染色。对于淋巴结的分析，淋巴结被粉碎、清洗和表面染色，然后使用调节性T细胞染色试剂盒(亿生物科技(EBioscience))清洗和固定细胞，并且染色转录因子。为了测量细胞因子反应，在Golgiplug(BD生物科学公司(BD biosciences))的存在下，将淋巴结细胞平铺在预包被1μg/ml抗CD3的孔内4小时。然后使用调节性T细胞染色试剂盒(亿生物科技(EBioscience))在细胞内细胞因子染色之前将细胞表面染色、洗涤并且固定。为了分析血液中的细胞数量，经由隐静脉从活小鼠收获全血到乙二胺四乙酸(EDTA)管中，，并且5-25μl新鲜血液直接用荧光抗体混合物染色(参见，Crittenden等人，PLoS One,2013.8(7):e69527)。向每个样品添加了已知数量的AccuCheck荧光珠(英杰公司(Invitrogen))，然后用Cal-Lyse全血裂解溶液(英杰公司(Invitrogen))裂解红细胞，并且在BD LSRII流式细胞仪上分析样品。样品中细胞的绝对数量是基于将细胞事件与珠事件(细胞/μl)进行比较而确定的。
统计学
使用Prism(GraphPad软件，拉荷亚(La Jolla)，加利福尼亚州)分析和绘制数据。使用学生T检验比较个人数据集。使用ANOVA进行跨越多个组的分析，其中使用Tukey’s比较评估了单个组。Kaplan Meier生存曲线是使用秩检验进行比较的。
其他实施例
从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。这样的实施例也在下述权利要求的范围内。
在变量的任何定义中对要素清单的叙述在本文中包括将该变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。在此的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用方式以相同的程度结合在此，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用的方式结合。
序列表
<110>普罗维登斯卫生服务中心(PROVIDENCE HEALTH & SERVICES-OREGON)-俄勒冈州
<120>用于增强癌症治疗的效果的组合物和方法
<130> OX40-301WO1
<140>
<141>
<150> 62/131,562
<151> 2015-03-11
<160> 108
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 107
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<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Pro或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Tyr或Phe
<400> 17
Arg Ile Thr Ile Asn Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 18
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 19
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 20
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 21
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 22
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 22
Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 23
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 24
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 25
Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 26
Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Ala Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 27
Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 31
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaagc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctccgccc tgccctggac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 34
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggcagcac 120
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 36
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 37
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 38
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catgggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 40
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 42
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 43
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 44
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 45
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 46
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 47
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 48
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 49
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 50
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 52
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 53
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 54
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Ala Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 363
<212> DNA
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<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 56
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg ccggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 57
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 58
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 59
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 60
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 61
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 62
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
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tct 363
<210> 63
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
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65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 64
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca gcggcatcac ctaccacaac 180
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gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 65
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 65
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 66
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cccagcctga agtcccggat cagcatcacc cgggacacca gcaagaacca ctactacctg 240
cagctgaaca gcgtgaccac cgaggacacc gccacctact tttgcgcccg gtacagatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tct 363
<210> 67
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 68
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
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tct 363
<210> 69
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 70
<211> 990
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
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tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa 990
<210> 71
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 72
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 72
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tctgcgtcga ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
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tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
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cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcttaagcct gtctccgggt aaa 1353
<210> 73
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 74
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 74
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tctgcgtcga ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc cttgcagcag aagcaccagc 420
gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggcgctct gaccagcggc gtgcatacct tccccgccgt gctccagagc 540
agcggactgt actccctgag cagcgtggtg accgtgcctt ccagcagcct gggcaccaag 600
acctacacct gcaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660
agcaagtacg gccctccctg ccccccttgc cctgcccccg agttcctggg cggacctagc 720
gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 780
acctgcgtgg tggtggacgt gtcccaggag gaccccgagg tccagtttaa ttggtacgtg 840
gacggcgtgg aagtgcataa cgccaagacc aagcccagag aggagcagtt caacagcacc 900
tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggaatac 960
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ggcaacgtct tcagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320
tccctgagcc tgagcctggg caag 1344
<210> 75
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
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435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 76
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 76
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080
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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 77
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 77
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 78
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
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gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
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<210> 79
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 80
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 80
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
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aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 81
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 81
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
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35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 82
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 82
caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120
cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180
cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240
cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300
gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tctgcgaaga cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 420
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 540
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660
agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt accgtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 720
ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 780
gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 840
gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 900
gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 960
gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1020
ccgaaggctc cacaggtgta taccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1080
gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1140
tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1200
tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1260
ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1320
cactctcctg gtaaa 1335
<210> 83
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 84
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 84
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaagc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctccgccc tgccctggac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgggctgat gcggcgccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642
<210> 85
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 85
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Met Arg Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Gly Arg Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 86
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Met Arg Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Gly Arg Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 87
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 87
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggt ctggtgcagc cctcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctgggtt ctcactaacc ggttacaatt tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gatgggaaga atgaggtatg atggagacac atattataat 180
tcagttctca aatcccgact gagcatcagc agggacacct ccaagaacca agttttcttg 240
aaaatgaaca gtctgcaaac ggatgacaca gccatttact attgtaccag agacgggcgt 300
ggtgactcct ttgattactg gggccaagga gtcatggtca cagtctcctc cgcgtcgacg 360
acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 420
accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 480
ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 540
ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 600
gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 660
tgtaagcctt gcatatgtac cgtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 720
cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 780
agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 840
gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 900
cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 960
gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1020
caggtgtata ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1080
tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1140
ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1200
tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1260
gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1320
aaa 1323
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 88
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Arg Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 89
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Arg Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 90
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 90
gatattgtga tgacccaggg tgcactcccc aatcctgtcc cttctggaga gtcagcttcc 60
atcacctgca ggtctagtca gagtctggta tacaaagacg gccagacata cttgaattgg 120
tttctgcaga ggccaggaca gtctcctcag cttctgacct attggatgtc tacccgtgca 180
tcaggagtct cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa catatttcac actgaaaatc 240
agtagagtga gggctgagga tgcgggtgtg tattactgtc agcaagttcg agagtatcct 300
ttcactttcg gctcagggac gaagttggaa ataaaacggg ctgatgcggc gccaactgta 360
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420
ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480
caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600
gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgt 657
<210> 91
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 92
<211> 272
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 92
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 93
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 94
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
20 25 30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys
35 40 45
Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr
50 55 60
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
85 90 95
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
100 105 110
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
115 120 125
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
130 135 140
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
145 150
<210> 95
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 95
Ala Pro Leu Ala Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Leu Leu Gly Gly Gly Ser Ile
225 230 235 240
Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His
245 250 255
Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly
260 265 270
His Gly Gly Gly Ser Asn Ser Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Phe
275 280 285
Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe
290 295 300
Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn
305 310 315 320
Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly
325 330 335
Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu
340 345 350
Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met
355 360 365
Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr
370 375 380
Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile
385 390 395 400
Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
405 410
<210> 96
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 97
<211> 1206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 97
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggacct 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac 180
gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc 240
acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag 360
gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tacaccctgc cacctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc agactgaccg tggacaagtc cagatggcag 600
gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagtccctga gcctgagcct gggcaaggac caggataaga tcgaggctct gtcctccaag 720
gtgcagcagc tggaacggtc catcggcctg aaggacctgg ccatggctga cctggaacag 780
aaagtgctgg aaatggaagc ctccacacag gtgtcacaca gatacccccg gatccagtcc 840
attaaggtgc agttcaccga gtacaagaaa gagaagggct ttatcctgac ctcccagaaa 900
gaggacgaga tcatgaaggt gcagaacaac tccgtgatca tcaactgcga cgggttctac 960
ctgatctccc tgaagggcta cttcagccag gaagtgaaca tctccctgca ctaccagaag 1020
gacgaggaac ccctgttcca gctgaagaaa gtgcggagcg tgaactccct gatggtggcc 1080
tctctgacct acaaggacaa ggtgtacctg aacgtgacca ccgacaacac ctccctggac 1140
gacttccacg tgaacggcgg cgagctgatc ctgatccacc agaaccctgg cgagttctgc 1200
gtgctg 1206
<210> 98
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 98
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys
225 230 235 240
Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala
245 250 255
Asp Leu Glu Gln Lys Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Gln Val Ser
260 265 270
His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr
275 280 285
Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile
290 295 300
Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr
305 310 315 320
Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu
325 330 335
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg
340 345 350
Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val
355 360 365
Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val
370 375 380
Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys
385 390 395 400
Val Leu
<210> 99
<211> 1206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 99
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggacct 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac 180
gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc 240
acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag 360
gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tacaccctgc cacctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc agactgaccg tggacaagtc cagatggcag 600
gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagtccctga gcctgagcct gggcaaggac caggataaga tcgaggctct gtcctccaag 720
gtgcagcagc tggaacggtc catcggcctg aaggacctgg ccatggctga cctggaacag 780
aaagtgctgg aaatggaagc ctccacacag gtgtcacaca gatacccccg gatccagtcc 840
attaaggtgc agttcaccga gtacaagaaa gagaagggct ttatcctgac ctcccagaaa 900
gaggacgaga tcatgaaggt gcagaacaac tccgtgatca tcaactgcga cgggttctac 960
ctgatctccc tgaagggcta cttcagccag gaagtgaaca tctccctgca ctaccagaag 1020
gacgaggaac ccctgttcca gctgaagaaa gtgcggagcg tgaactccct gatggtggcc 1080
tctctgacct acaaggacaa ggtgtacctg aacgtgacca ccgacaacac ctccctggac 1140
gacttccacg tgaacggcgg cgagctgatc ctgatccacc agaaccctgg cgaggcctgc 1200
gtgctg 1206
<210> 100
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 100
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys
225 230 235 240
Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala
245 250 255
Asp Leu Glu Gln Lys Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Gln Val Ser
260 265 270
His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr
275 280 285
Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile
290 295 300
Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr
305 310 315 320
Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu
325 330 335
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg
340 345 350
Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val
355 360 365
Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val
370 375 380
Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Ala Cys
385 390 395 400
Val Leu
<210> 101
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 101
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn
35 40 45
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
50 55 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165
<210> 102
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400> 102
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
1 5 10 15
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
85 90 95
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
100 105 110
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
115 120 125
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 103
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 104
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
<210> 105
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 105
Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 106
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 107
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400> 108
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5

Claims (39)

1.一种增强患有肿瘤的受试者的化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后向受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体。
2.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；
(b)获得细胞的一个测量值，该测量值表明该受试者中的巨噬细胞分化的减少；以及
(c)向该受试者给予化学疗法或放射疗法。
3.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；
(b)获得细胞的一个测量值，该测量值表明该受试者中的巨噬细胞分化的减少；以及
(c)向该受试者给予抗IL4抗体和化学疗法或放射疗法。
4.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；
(b)获得细胞的一个测量值，该测量值表明该受试者中的巨噬细胞分化的减少；
(c)向该受试者给予化学疗法；
(d)向该受试者给予OX40激动剂和抗CTLA4抗体；以及
(e)向该受试者给予化学疗法或放射疗法。
5.如权利要求4所述的方法，其中步骤(b)和(d)另外地包括抗IL-4抗体的共给予。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该受试者被鉴定为患有化学疗法抗性或放射疗法抗性肿瘤。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在该受试者中，该方法延迟或减少肿瘤生长、减小肿瘤大小、和/或提高存活率。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该肿瘤是化学疗法抗性或放射疗法抗性的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该肿瘤是非免疫原性或差免疫原性的。
10.如权利要求9所述的方法，其中该肿瘤具有CD8T细胞的差的浸润。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该受试者患有胰腺癌或胰腺腺癌。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该肿瘤是胰腺癌或胰腺腺癌。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该化学疗法包括给予吉西他滨。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该OX40激动剂是抗OX40抗体。
15.如权利要求14所述的方法，其中该抗OX40抗体是OX86、人源化抗OX40抗体、和9B12中的一种或多种。
16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中该OX40激动剂是OX40融合蛋白。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该抗CTLA4抗体是9D9和曲美木单抗中的一种或多种。
18.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中当在肿瘤环境中免疫细胞分化减少时给予所述治疗。
19.如权利要求18所述的方法，其中该免疫细胞是巨噬细胞或T细胞中的一种或多种。
20.如权利要求19所述的方法，其中巨噬细胞分化的减少是通过巨噬细胞中精氨酸酶表达的减少来确定。
21.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该化学疗法或放射疗法在给予该OX40激动剂和该抗CTLA4抗体后1、2、3、4、5或6天给予。
22.如权利要求3或5中任一项所述的方法，其中该抗IL4抗体减少了在肿瘤环境中的CD4T细胞分化。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，该方法包括向该受试者两次或更多次给予该OX40激动剂、该抗CTLA4抗体、和所述治疗。
24.如权利要求1所述的方法，该方法包括在化学疗法之前给予该OX40激动剂和抗CTLA4抗体。
25.如权利要求1所述的方法，该方法包括在放射疗法之前给予该OX40激动剂和抗CTLA4抗体。
26.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该受试者患有结肠直肠癌。
27.一种增强患有结肠直肠癌的受试者的化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后向该受试者给予抗CTLA4抗体。
28.一种治疗患有结肠直肠癌的受试者的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予抗CTLA4抗体；以及
(b)向受试者给予给予放射疗法。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中该抗CTLA4抗体是9D9和曲美木单抗中的一种或多种。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中该化学疗法或放射疗法在给予抗CTLA4抗体后1、2、3、4、5、6或7天给予。
31.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中该化学疗法或放射疗法在给予抗CTLA4抗体前1、2、3或4天给予。
32.一种增强患有结肠直肠癌的受试者的化学疗法或放射疗法的效果的方法，该方法包括在化学疗法或放射疗法之前、期间或之后向受试者给予OX40激动剂。
33.一种治疗患有结肠直肠癌的受试者的方法，该方法包括：
(a)向该受试者给予放射疗法；以及
(b)向该受试者给予OX40激动剂。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中该OX40激动剂是抗OX40抗体。
35.如权利要求34所述的方法，其中该抗OX40抗体是OX86、人源化抗OX40抗体、和9B12中的一种或多种。
36.如权利要求32或33所述的方法，其中该OX40激动剂是Ox40融合蛋白。
37.如权利要求32-36中任一项所述的方法，在给予化学疗法或放射疗法后1或2天给予该OX40激动剂。
38.如权利要求27-37中任一项所述的方法，其中该受试者患有结肠直肠肿瘤。
39.如权利要求27-37中任一项所述的方法，其中在该受试者中，该方法延迟或减少肿瘤生长、减小肿瘤大小、和/或提高存活率。
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