CN110914299A - 抗icos促效剂抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离的单克隆抗体(例如人源化和人类单克隆抗体)，其结合至人类可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)并显示治疗所需的功能性质，例如刺激人类ICOS活性的能力。还提供编码本发明抗体的核酸分子、用于表达本发明抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供包含本发明抗体的免疫结合物、双特异性分子和医药组合物。本发明的抗体可用作例如促效剂以刺激或增强个体的免疫反应，例如对抗肿瘤或病毒抗原的抗原特异性T细胞反应。本发明的抗体还可与其它抗体(例如PD‑1、PD‑L1和/或CTLA‑4抗体)组合使用以治疗例如癌症。因此，所述抗体可用于治疗应用中及用于检测ICOS蛋白的方法中。

Description

抗ICOS促效剂抗体和其用途
技术领域
本发明涉及抗可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)促效剂抗体和其医药组合物，和使用这些抗体的方法，例如，用于通过投与所述抗ICOS促效剂抗体和医药组合物治疗癌症。
相关申请
本申请主张美国临时申请第62/483,158(2017年4月7日提交)、62/514,151(2017年6月2日提交)、62/545,732(2017年8月15日提交)和62/581,412(2017年11月3日提交)号的优先权。前述申请中的内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，其已以ASCII格式经电子方式提交，并以全文引用的方式并入本文中。在2018年3月30日创建的所述ASCII副本命名为MXI-556PC_SL.txt，且大小为321,751字节。
背景技术
需要对抗癌症的全球流行。癌症是疾病的主要原因之一，也是全球第二大致死原因。2015年癌症死亡人数为880万人。全球范围内，近六分之一的死亡是由于癌症。2018年，美国估计有1,735,350个新癌症病例经确诊和609,640例癌症死亡。2012年，欧洲估计有350万新癌症病例和190万例癌症死亡。据世界卫生组织估计2018年癌症的新病例的数量预期在未来二十年内将增长约70％。
传统的癌症治疗尤其包括外科手术、放射疗法和化学疗法。近年来，免疫肿瘤学已成为治疗癌症的新选择。免疫肿瘤学是不同于传统的癌症治疗，其例如已试图直接靶向肿瘤或破坏肿瘤血液供应。相反，免疫肿瘤学是经设计以使用病患自身的免疫反应来治疗癌症。了解免疫系统如何影响癌症发展和其可如何用于治疗癌症已成为具有挑战性的复杂问题。例如，病患可能对某些免疫肿瘤学药物无反应，和有些发展耐药机制，例如T细胞耗尽，其指T细胞(白血球的特定类型)不再正确发挥作用。(邓克(Dempke)等人，欧洲癌症杂志(Eur.J.of Cancer),74 55-72(2017))。
免疫系统的重要作用是其区分正常细胞和“外来”细胞的能力。因此，免疫系统可攻击外来细胞并单独留下正常细胞。为此，免疫系统使用“检查点”，其是某些免疫细胞上需要经活化或不活化以开始免疫反应的分子。肿瘤细胞可有时使用这些检查点以避免受免疫系统攻击。一些免疫肿瘤学药物通过充当检查点抑制剂靶向这些检查点。程序性死亡蛋白1(PD-1)是检查点抑制剂，其通常用作制动器以防止T细胞攻击身体中的其它细胞。PD-1在其结合至程序性死亡配体1(PD-L1)(一些正常(和癌症)细胞上的蛋白质)时会这样做。当PD-1结合至PD-L1时，此相互作用告知T细胞不攻击其它细胞。一些癌细胞具有大量的PD-L1，其有助于癌细胞逃避免疫攻击。靶向此PD-1/PD-L1相互作用的治疗剂(例如单克隆抗体例如纳武单抗
Figure GDA0002365581830000021
)可阻断PD-1/PD-L1结合以增加身体对肿瘤细胞的免疫反应。
需要靶向不同作用机制的药物，其可单独发挥作用或与检查点抑制剂组合发挥作用于安全且有效地治疗癌症和其它疾病或病症。T细胞活化和功能是由先天免疫系统通过CD28超家族中的共刺激分子(例如分别促进或抑制T细胞受体信号活化的阳性和阴性共刺激分子)进行调节。也称为CD278的可诱导共刺激分子(ICOS)是免疫检查点蛋白，其是此CD28超家族的成员。ICOS是55-60kDa I型跨膜蛋白，其是在T细胞活化后表达于T细胞上和在结合其配体ICOS-L(B7H2)之后共刺激T细胞活化。ICOS是由CD4+细胞、CD8+细胞和调节T细胞(Treg)表达。还已显示ICOS是滤泡性辅助T细胞(Tfh)和体液免疫反应的功能中的关键参与者。
T细胞的免疫反应的量级和质量部分取决于对T细胞的共刺激信号与对T细胞的抑制信号之间的复杂平衡。为改善病患在免疫疗法后的反应率并克服耐药性，需要新颖免疫肿瘤学疗法。
发明内容
本发明提供分离的单克隆抗体(例如人源化和人类单克隆抗体)，其结合至人类ICOS(SEQ ID NO:1)(即，抗huICOS抗体)并显示治疗所需的功能性质。本发明的抗体可用作促效剂以刺激或增强个体的免疫反应，例如，以刺激人类ICOS活性和/或提供抗肿瘤或病毒抗原的抗原特异性T细胞反应。本发明的抗体还可与其它抗体(例如PD-1、PD-L1和/或CTLA-4抗体)组合使用于治疗各种病症，例如癌症。因此，本文公开的抗体(单独使用或与其它药剂组合使用)可用于治疗各种病症或疾病，包括癌症。在其它实施例中，本文公开的抗体可用于检测ICOS蛋白的方法中。
在一个方面中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用，和
(a)在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中以约0.01至约0.16nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生；和/或
(b)在CD25- CD4+ T细胞和B细胞共培养分析中在葡萄球菌肠毒素B中以约0.002nM至约0.4nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞产生IFN-γ。
在另一实施例中，所述抗体(或其抗原结合部分)显示下列特征中的一或多种：
(a)以约0.7nM的EC50结合至人类T细胞和以约0.3nM的EC50结合至食蟹猕猴T细胞；
(b)结合至活化的人类CD4+ T细胞；
(c)不结合至人类CD28或人类CTLA-4；
(d)活化至少一种原代T淋巴细胞，例如CD4+效应T(Teff)细胞、滤泡性辅助T(Tfh)细胞和调节T(Treg)细胞；
(e)在活体外原代T细胞信号传导分析中以约30nM的EC50诱导蛋白激酶B(pAkt)的磷酸化；
(f)在Tfh和初始B细胞共培养分析中诱导因应葡萄球菌肠毒素B而产生白介素-10(IL-10)；
(g)在活体外分析中，相较于CD45RA+ Treg和CD45RO+ Treg，诱导受提高增殖增加CD3刺激的Teff；
(h)减少Treg对Teff的抑制；
(i)在全血细胞分析中在10μg/mL下不增加细胞因子产生；
(j)活体外增强Tfh细胞分泌IL-10和IFN-g中的至少一种；
(k)刺激ICOS介导的信号传导；
(l)对CD32B和/或CD32A具有增加的亲和力；和/或
(m)对CD16具有减小的亲和力。
在另一实施例中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中以约0.083nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生。在另一实施例中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中以约0.01至约0.1nM的EC50诱导CD25- CD4+T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生。
在一个方面中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在CD25-CD4+ T细胞和B细胞共培养分析中在葡萄球菌肠毒素B中以约0.2nM的EC50于CD25- CD4+ T细胞中诱导IFN-γ产生。在另一方面中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在CD25- CD4+ T细胞和B细胞共培养分析中在葡萄球菌肠毒素B中以约0.01至0.1nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞的IFN-γ产生。
在另一实施例中，所述抗体(或其抗原结合部分)结合至人类、食蟹猕猴、小鼠和大鼠ICOS。
在另一方面中，分离的抗体结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)且包含：
(a)包含分别包含SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和包含分别包含SEQ ID NO:12、14和15的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(b)包含分别包含SEQ ID NO:18、19和20的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和包含分别包含SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(c)包含分别包含SEQ ID NO:26、27和28的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和包含分别包含SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(d)包含分别包含SEQ ID NO:34、35和36的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和分别包含SEQ ID NO:37、38和39的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(e)包含分别包含SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和包含分别包含SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(f)包含分别包含SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和包含分别包含SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；或
(g)包含分别包含SEQ ID NO:191、192和193的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，和包含分别包含SEQ ID NO:194、195和196的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域。
在另一方面中，分离的抗体结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)，且重链和轻链可变区包含：
(a)分别为SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列；
(b)分别为SEQ ID NO:16和176的氨基酸序列；
(c)分别为SEQ ID NO:24和25的氨基酸序列；
(d)分别为SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列；
(e)分别为SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列；
(f)分别为SEQ ID NO:40和48的氨基酸序列；或
(g)分别为SEQ ID NO:186和189的氨基酸序列。
在另一方面中，结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)的经分离的全长人源化单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:7中阐述的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:8中阐述的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，经分离的抗体与阻断人类ICOS和人类ICOS-L的相互作用的抗体竞争结合至ICOS或结合至与阻断人类ICOS和人类ICOS-L的相互作用的抗体相同的抗原决定基。在另一实施例中，经分离的抗体特异性结合至人类ICOS的SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)的一或多个残基。在另一实施例中，所述ICOS抗原决定基包含人类ICOS的氨基酸残基SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)。
在一个实施例中，本发明的抗体是例如IgG1、IgG2、IgG2a或IgG4同型的全长抗体。在另一实施例中，所述抗体是结合片段，例如Fab、Fab'或(Fab')2片段或单链抗体。
在一个方面中，抗ICOS抗体或其抗原结合部分结合至Fc受体，例如一或多种活化Fcγ受体(FcγRs)。在某些实施例中，相较于人类IgG1序列(SEQ ID NO:206)，所述抗体在Fc区中包含至少一个氨基酸取代，此增强所述抗体对FcγR(例如FcγRIIb)的亲和力，例如包含234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和/或332，根据EU索引，例如，234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和/或332E中的至少一个的位置处的一或多个氨基酸取代。在其它实施例中，相较于人类IgG1序列(SEQ ID NO:206)，所述Fc区包含235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和/或267E-328F中的至少两个取代。在又另一实施例中，相较于如SEQ ID NO:206中阐述的人类IgG1序列，Fc区中的所述氨基酸取代是S267E。
在另一方面中，本发明提供包含连接至治疗剂(例如细胞毒性剂或放射性同位素)的本发明的抗体或其抗原结合部分的免疫结合物，和包含本发明的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，所述抗体或其抗原结合部分连接至相较于所述抗体或其抗原结合部分具有不同结合特异性的第二功能部分。
还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫结合物或双特异性分子和医药上可接受的载剂的组合物(例如医药组合物)。在另一方面中，所述组合物进一步包含可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白。
还提供编码本发明的抗体(例如cDNA)或其抗原结合部分(例如可变区和/或CDR)的核酸分子，和包含这些核酸的表达载体和包含这些表达载体的宿主细胞。还提供用于产生抗ICOS抗体的方法，其为通过在这些宿主细胞中表达所述抗体并从所述宿主细胞分离所述抗体。
在一个方面中，相较于IgG1对照抗体，分离的抗体具有减小的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
在另一方面中，本发明提供使用本发明的抗ICOS抗体或其抗原结合部分刺激免疫反应的方法。在一个实施例中，所述方法包括通过使T细胞与本发明的抗体或其抗原结合部分接触，使得抗原特异性T细胞反应经受刺激，从而刺激抗原特异性T细胞反应。在另一实施例中，刺激抗原特异性T细胞产生白介素-2。在又另一实施例中，所述个体患有肿瘤，且抗所述肿瘤的免疫反应经受刺激。在另一实施例中，所述个体患有病毒，且抗所述病毒的免疫反应经受刺激。
在又另一方面中，本发明提供用于抑制个体的肿瘤细胞的生长的方法，其包括向所述个体投与本发明的抗体或其抗原结合部分，使得所述个体中的所述肿瘤的生长经受抑制。在另一方面中，本发明提供用于治疗个体的病毒感染的方法，其包括向所述个体投与本发明的抗体或其抗原结合部分，使得所述个体中的所述病毒感染经受治疗。这些方法包括投与本发明的抗体或其抗原结合部分、组合物、双特异性分子或免疫结合物。
在又另一方面中，本发明提供用于刺激个体的免疫反应的方法，其包括向所述个体投与本发明的抗体或其抗原结合部分例如与至少一种额外治疗剂(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)的组合，使得所述个体中的免疫反应经受刺激，例如以抑制肿瘤生长或以刺激抗病毒反应。在一个实施例中，所述额外免疫刺激抗体是抗PD-1抗体。在另一实施例中，所述额外免疫刺激剂是抗PD-L1抗体。在又另一实施例中，所述额外免疫刺激剂是抗CTLA-4抗体。在又另一实施例中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2、经修饰的IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如抗CD137和/或抗GITR抗体)一起投与。在一些实施例中，所述抗体是例如人类、嵌合或人源化抗体。
在一个实施例中，分离的抗体是与一或多种额外治疗剂一起投与人类个体。在另一实施例中，所述额外治疗剂是化学治疗剂。
本文还提供用于治疗个体(例如人类病患)的癌症的方法，其包括向所述病患投与抗ICOS抗体或抗ICOS抗体和至少一种额外抗体(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)的组合，其中所述抗ICOS抗体或抗体的组合是根据特定剂量方案(即，以特定剂量并根据特定给药时间表)投与。在一个方面中，所述方法包括至少一个投药周期，且就至少一个周期中的每一者而言，所述抗体的至少一次剂量是以约375mg的剂量投与。在另一方面中，所述抗体是以足以实现和/或维持小于约80％的受体占有率的量或频率投与。在另一实施例中，所述方法包括依以下的时间间隔进行投与：每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每十一周一次或每十二周一次。
本文公开的方法包括治疗癌症，例如结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌(PRC)、尿路上皮癌(UCC)、膀胱癌、乳癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤或病毒相关癌症。
在又另一实施例中，抗体是针对静脉内投与进行调配。在另一实施例中，抗体是针对皮下投与进行调配。在另一实施例中，抗体是同时投与(例如以单一调配物或作为单独调配物同时投与)。或者，在另一实施例中，抗体是依序投与(例如作为单独调配物)。
本文提供的治疗方法的功效可使用任何合适的方式进行评估。在一些实施例中，所述治疗减小肿瘤尺寸、减少随时间的转移病变数量、产生完全反应、产生局部结果和/或导致稳定疾病。
在另一方面中，本发明提供本发明的抗ICOS抗体或其抗原结合部分和组合物用于前述方法中或用于制造用于前述方法(例如用于各种病症的治疗)中的药剂。
还提供包括含有适用于本文描述的方法中的治疗有效量的抗ICOS抗体的医药组合物的试剂盒。在另一实施例中，所述试剂盒包括适用于本文描述的方法中的治疗有效量的抗ICOS抗体和另一抗体(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体)。
例如，所述试剂盒包含：
(a)一次剂量的抗ICOS抗体；
(b)一次剂量的抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体；和
(c)关于在本发明的方法中使用所述抗体的说明书。
在另一方面中，提供抗ICOS抗体以根据本文描述的方法投与(或与另一抗体，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体共投与)。
本发明的其它特征和优点自下列实施方式和实例将显而易见，但实施方式和实例不应视为限制性。本申请通篇中所引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和公开专利申请的内容是以引用的方式明确并入本文中。
附图说明
图1显示人类ICOS序列(SEQ ID NO:1)。使用氢/氘交换质谱术(HDX-MS)进行的ICOS.4抗原决定基结合分析的结果是以粗体并加下划线的ICOS.4抗原决定基显示。
图2显示可用于本文公开的Fc序列变体中的人类IgG1f恒定域的序列的一部分(SEQ ID NO:52，重新编号为118至446)。以粗体阐述的残基是变化的实例残基。改变的氨基酸是在特定残基下以粗体提供。D270E取代加下划线。C端赖氨酸(K)残基已从SEQ ID NO:52的序列省略，但在一些实施例中，是存在的。同样地，在一些实施例中，编码这些实施例的核酸包括在核酸的3'端的编码额外赖氨酸的核苷酸。
图3显示用于使亲代仓鼠抗体(C398.4)人源化的人类重链和轻链生殖系序列的序列比对。基于框架序列同源性，选择VH3-15作为重链和选择VKI O18作为轻链。基于序列同源性，还选择人类生殖系FW4(JK3)作为轻链。基于序列相似性，选择人类生殖系FW4(JH4)作为重链，且人类生殖系FW4(JH4)不含有可造成潜在责任风险的残基。星号和下划线指示生殖系序列与亲代仓鼠抗体序列(C398.4)之间不同的氨基酸残基。
图4显示抗ICOS抗体ICOS.33 IgG1f S267E的重链和轻链可变区序列。重链和轻链可变区的CDR1、2和3区加粗、加下划线并标记。
图5A和5B是显示在CD25- CD4+ T细胞和CHO-OKT3-CD32A细胞的共培养中，ICOS.33 IgG1f S267E所诱导的干扰素-γ(IFN-γ)产生和细胞增殖的图。
图6是阐述抗ICOS抗体在CD25- CD4+ T细胞和B细胞SEB共培养分析中的IFN-γ诱导的图。
图7A和7B是显示在经SEB刺激的Tfh和初始B细胞共培养分析中的IL-10和IFN-γ诱导的图。平均值：4.4倍诱导。
图8A和8B是显示由Treg以抗ICOS抗体共刺激消除Teff抑制的图。
图9A和9B是使用来自两个不同供体(供体9和12)的细胞比较ICOS.33 IgG1fS267E和ICOS.33 IgG1诱导ADCC的能力的图。
图10是来自比较ICOS.33 IgG1f S267E和ICOS.33 IgG1结合人类补体的C1q组分的能力的ELISA分析的结果的图。
图11A至C是显示ICOS Fc变体(ICOS IgG1 SE(“ICOS hg1 SE”)和ICOS IgG1(“ICOS hg1”)抗体)和IgG1同型对照抗体(“hIgG1”)在MC38肿瘤模型中的抗肿瘤活性的图。
图12A至E是显示治疗组的肿瘤生长曲线的图。小鼠在Sa1N细胞移植后的第7、10和14天用同型对照mG1、ICOS.1 mg1 D265A、ICOS.4 mg1、ICOS.4 hg1或ICOS.4 mg2a进行治疗。
图13A和13B是阐述治疗组的平均和中位肿瘤生长曲线的图。小鼠在Sa1N细胞移植后的第7、10和14天用同型对照mG1、ICOS.1 mg1 D265A、ICOS.4 mg1、ICOS.4 hg1或ICOS.4mg2a治疗。
图14A至D是显示第15天肿瘤中的Foxp3+ Treg细胞、CD4+ Teff细胞和CD8+ T细胞百分率的图。小鼠在Sa1N细胞移植后的第7、10和14天用同型对照mG1、ICOS.1 mg1 D265A、ICOS.4 mg1、ICOS.4 hg1或ICOS.4 mg2a治疗。
图15A至J是显示以下治疗组的个别小鼠的肿瘤生长曲线的图：同型对照mIgG1、抗PD-1 mIgG1 D265A(“PD-1”)和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS.4 mg1”)抗体。
图16A和16B是显示以下治疗组的平均和中位肿瘤生长曲线的图：同型对照mIgG1、抗PD-1 mg1和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS.4 mg1”)抗体。
图17A至D是显示肿瘤中的Foxp3+、CD8+、Ki-67和颗粒酶B的平均(SEM)百分率的图。小鼠用同型对照mIgG1、抗PD-1 mg1和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS.4 mg1”)抗体治疗。
图18A至I是显示以下治疗组的个别小鼠的肿瘤生长曲线的图：同型对照mIgG1、抗PD-1 mIgG1 D265A(“PD-1”)和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS”)抗体。
图19A和19B是显示以下治疗组的平均和中位肿瘤生长曲线的图：同型对照mIgG1、抗PD-1 mIgG1 D265A(“PD-1”)和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS”)抗体。
图20A至D是显示肿瘤中的Foxp3+ Treg细胞、CD4+ Teff细胞和CD8+ T细胞百分率的图。小鼠是用同型对照mIgG1、抗PD-1 mIgG1 D265A(“PD-1”)和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS”)抗体进行治疗。
图21A至C是显示肿瘤中的Ki-67平均百分率的图。小鼠用同型对照mIgG1、抗PD-1mIgG1 D265A(“PD-1”)和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS”)抗体治疗。
图22A至D是显示脾脏和PBMC中的B细胞上的ICOS-L表达的图。小鼠用同型对照mIgG1、抗PD-1 mIgG1 D265A(“PD-1”)和/或抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS”)抗体治疗。
图23A至F是显示以下治疗组的个别小鼠的肿瘤生长曲线的图：同型对照mIgG1、抗CTLA-4 mIgG2b(“CTLA-4 mg2b”)、抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS.4 mg1”)和/或抗ICOS.4 mIgG2a(“ICOS.4 mg2a”)抗体。
图24A和24B是显示以下治疗组的平均和中位肿瘤生长曲线的图：同型对照mIgG1、抗CTLA-4 mIgG2b(“CTLA-4 mg2b”)、抗ICOS.4 mIgG1(“ICOS.4 mg1”)和/或抗ICOS.4mIgG2a(“ICOS.4 mg2a”)抗体。
图25A和25B是显示如使用FACS测量，ICOS.33 IgG1f S267E与人类、食蟹猕猴、大鼠和小鼠T细胞结合的图。
图26A和26B是显示相较于两种竞争抗ICOS抗体，ICOS.33 IgG1f抗体对CD4+ T细胞具有更大的结合性(如由EC50值计算)的图。
图27是阐述使用抗ICOS抗体与抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体的组合的剂量递增临床试验研究的示意图。
图28是显示渐增剂量的抗ICOS抗体(ICOS.33 IgG1f S267E)与抗PD1抗体的组合的效应和在小鼠模型中对肿瘤生长抑制的效应的图。
具体实施方式
本发明提供分离的抗体(例如单克隆抗体，例如人源化或人类单克隆抗体)，其特异性结合至人类ICOS(“huICOS”)且具有促效剂活性以刺激免疫反应。在一些实施例中，本文描述的抗体包含特定结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。在其它实施例中，所述抗体与本发明的抗体竞争结合至人类ICOS蛋白或结合至与本发明的抗体相同的抗原决定基。
本文进一步提供制造这些抗体、免疫结合物和包含这些抗体或其抗原结合片段的双特异性分子和经调配以含有所述抗体或抗体片段的医药组合物的方法。本文还提供使用所述抗体(单独使用或与其它药剂(例如其它免疫刺激剂(例如抗体))组合使用)以增强免疫反应，以例如治疗癌症和/或感染的方法。因此，本文描述的抗huICOS抗体可用于治疗各种病症，包括例如抑制肿瘤生长。
定义
为使本说明可更容易地被了解，首先定义某些术语。其它定义在整个实施方式中阐述。本文提供的标题不限制本发明的各种方面，其可通过参考整个说明书来了解。因此，紧接在下文中定义的术语是通过参考整个说明书而被更充分地定义。
如本文使用，ICOS是指“可诱导T细胞共刺激分子”蛋白，其是在人类中由ICOS基因编码。ICOS也称为“可诱导共刺激分子”、“活化可诱导淋巴细胞免疫调节分子”、AILIM、CVID1和CD278。人类ICOS是在GENE ID NO:29851和MIM(人类中的门德尔遗传):604558下进一步描述。包括20种氨基酸信号序列的人类ICOS(NP_036224.1)的序列是作为SEQ ID NO:1提供并显示于图1中。
下文是两种人类ICOS同功型的氨基酸序列。
同功型1(Q9Y6W8)
MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK VTLTGGYLHIYESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL(SEQ ID NO:1)
同功型2(Q9Y6W8-2)
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKM(SEQ ID NO:205)
同功型1和2的信号序列对应于氨基酸1至20(上文加下划线)。因此，成熟同功型1和2由SEQ ID NO:1的氨基酸21至199和SEQ ID NO:205的氨基酸21至158组成。
ICOS与ICOS配体(ICOS-L)相互作用，ICOS配体也被称为ICOSL、ICOS-LG、LICOS、B7H2、B7-H2、B7RP1、B7RP-1、CD275和GL50。人类ICOS-L是在GENE ID NO:23308和MIM:605717下进一步描述。包括18种氨基酸信号序列的人类ICOS-L(NP_001269979.1)的序列是以SEQ ID NO:2提供。因此，ICOS-L的成熟形式由SEQ ID NO:2的氨基酸19至302组成。
本文中可交换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”是指包含由双硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。各重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区(本文缩写为CH)。在某些抗体(例如天然存在的IgG抗体)中，重链恒定区包含铰链和三个域(CH1、CH2和CH3)。在某些抗体(例如天然存在的IgG抗体)中，各轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个域(本文缩写为CL)。所述VH和VL区可进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间穿插更保守的区域(称为框架区(FR))。各VH和VL包含三个CDR和四个FR，其从胺基端至羧基端以下列顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。所述抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体细胞的第一组分(C1q))。重链可具有或不具有C端赖氨酸。除非本文另有规定，否则可变区中的氨基酸是使用卡巴特(Kabat)编号系统编号和恒定区中的氨基酸是使用EU系统编号。免疫球蛋白可来自已知同型中的任一种，包括IgA、分泌IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG同型在某些物种中分为子类：在人类中分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，和在小鼠中分为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在某些实施例中，本文描述的抗ICOS抗体是具有IgG1子类型。免疫球蛋白(例如IgG1)存在数种同种异型，其在最多几个氨基酸方面彼此不同。“抗体”包括(以实例说明)天然存在和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人类和非人类抗体和完全合成抗体。
如本文使用，“IgG抗体”具有天然存在的IgG抗体的结构，即，其具有与同子类的天然存在的IgG抗体相同数量的重链和轻链和双硫键。例如，抗ICOS IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成，其中所述两条重链和轻链是由相同数量和位置的双硫桥连接，双硫桥分别出现于天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中(除非所述抗体已经突变以修饰所述双硫键)。
“抗原”是触发免疫反应并结合抗体的分子或物质。抗体通常以高亲和力特异性结合至其同源抗原，高亲和力由10-7至10-11M或更小的解离常数(KD)反映。通常认为大于约10- 6M的任何KD指示非特异性结合。如本文使用，“特异性结合”至抗原的抗体是指以高亲和力结合至所述抗原和(在一些情况下)大体上相同抗原，但不以高亲和力结合至无关抗原的抗体，高亲和力意指具有10-7M或更小、10-8M或更小、5x 10-9M或更小或介于10-8M与10-10M或更小之间的KD)。若抗原显示与给定抗原具有高度序列一致性，例如，若其显示与给定抗原的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性，则所述抗原是与给定抗原“大体上相同”。以实例说明，特异性结合至人类ICOS的抗体在一些实施例中还与来自某些非人类灵长类物种(例如食蟹猕猴)的ICOS抗原交叉反应，但不与来自其它物种的ICOS或与除ICOS外的抗原交叉反应。
如本文使用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一或多个部分，其保留特异性结合至抗原(例如人类ICOS)的能力。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段或部分进行。涵盖于术语抗体(例如本文描述的抗ICOS抗体)的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括：
(1)由VL、VH、LC和CH1域组成的Fab片段(来自木瓜蛋白酶裂解的片段)或相似单价片段；
(2)包含在铰链区处由双硫桥连接的两个Fab片段的F(ab')2片段(来自胃蛋白酶裂解的片段)或相似二价片段；
(3)由VH和CH1域组成的Fd片段；
(4)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段；
(5)单域抗体(dAb)片段(沃德(Ward)等人，(1989)自然(Nature)341:544-46)，其由VH域组成；
(6)经分离的互补决定区(CDR)；和
(7)两个或更多个经分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成连接子连接。此外，尽管Fv片段的两个域(VL和VH)是针对个别基因编码，但其可使用重组方法，通过能使其成为单一蛋白质链的合成连接子连接，在单一蛋白质链中，VL和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如博德(Bird)等人(1988)科学(Science)242:423-426；和修士顿(Huston)等人(1988)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。这些单链抗体希望涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”的内。这些抗体片段是使用所述领域中的技术人员已知的常规技术获得，且所述片段是以与完整抗体相同的方式针对效用进行筛选。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶或化学裂解产生。
术语“受体人类框架”是指包含衍生自人类免疫球蛋白框架或人类共通框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人类免疫球蛋白框架或人类共通框架的受体人类框架可具有与天然存在的人类免疫球蛋白框架或人类共通框架相同的氨基酸序列，或相较于野生型天然存在的人类免疫球蛋白框架或人类共通框架，其可具有氨基酸序列变化。在一些实施例中，氨基酸变化的数量是10、9、8、7、6、5、4、3或2或1。在一些实施例中，VL受体人类框架的序列是与VL人类免疫球蛋白框架序列或人类共通框架序列相同。
“铰链”、“铰链域”或“铰链区”或“抗体铰链区”是指重链恒定区的域，其将CH1域连接至CH2域且包含上游、中游和下游。(劳克斯(Roux)等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)161:4083)。取决于铰链的氨基酸序列，所述铰链在抗体的抗原结合域与效应区之间提供可变程度的灵活性和还在两个重链恒定区之间为分子间双硫键结提供位点。如本文使用，就所有IgG同型而言，铰链在E216开始并在G237结束(通过EU编号)。Id(如前述引用数据)。野生型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4铰链的序列显示于表1中。
表1：铰链区序列
Figure GDA0002365581830000141
*CH1域的C端氨基酸序列。
术语“铰链”包括野生型铰链(例如表1中阐述的那些)和其变体(例如非天然存在的铰链或经修饰的铰链)。例如，术语“IgG2铰链”包括如表1中显示的野生型IgG2铰链和具有1或多个突变(例如取代、缺失和/或添加)(例如1、2、3、4、5、1至3、1至5、3至5和/或最多5、4、3、2或1个突变)的变体。例示性IgG2铰链变体包括其中1、2、3或所有4个半胱氨酸(C219、C220、C226和C229)变化为另一氨基酸(例如丝氨酸)的IgG2铰链。在一特定实施例中，所述IgG2铰链区具有C219S取代。在某些实施例中，所述铰链包含来自至少两个同型的序列。例如，所述铰链可包含来自一个同型的上游铰链、中游铰链或下游铰链，和所述铰链的剩余部分来自一或多个其它同型。例如，所述铰链可以是IgG2/IgG1铰链，且可包含例如IgG2的上游铰链和中游铰链和IgG1的下游铰链。铰链可具有效应功能或缺乏效应功能。例如，野生型IgG1的下游铰链提供效应功能。术语“CH1域”是指重链恒定域中将可变域与铰链连接的重链恒定区。如本文使用，CH1域在A118开始和在V215结束。术语“CH2域”是指重链恒定域中将铰链与CH3域连接的重链恒定区。如本文使用，CH2域在P238开始和在K340结束。术语“CH3域”是指重链恒定域中C端与CH2域连接的重链恒定区。如本文使用，CH3域在G341开始和在K447结束。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两种不同结合特异性(例如具有两个不同重链/轻链对，从而产生对不同抗原具有特异性的两种抗原结合位点)的人造杂交抗体。双特异性抗体可通过各种方法产生，所述方法包括融合瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如松丝韦雷(Songsivilai)和拉奇曼(Lachmann),临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)79:315-321(1990)；考斯腾(Kostelny)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)148,1547-1553(1992)。
如本文使用，术语“单克隆抗体”是指获自大体上均质抗体的群体的抗体，即，所述群体中的个别抗体是大体上相似且结合相同抗原决定基(例如所述抗体显示单一结合特异性和亲和力)，除在单克隆抗体的产生期间可出现的可能变体外，这些变体通常少量存在。“单克隆”指示作为已获自大体上均质抗体的群体的抗体的特性，且无需通过任何特定方法产生抗体。术语“人类单克隆抗体”是指大体上均质抗体的群体的抗体，其显示单一结合特异性且具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变和可选恒定区。在一个实施例中，人类单克隆抗体是通过使用融合瘤方法产生。使用所述融合瘤方法，使转基因非人类动物(例如转基因小鼠)暴露于抗原，且被称为B细胞的白血球产生结合至所述抗原的抗体，其从转基因非人类动物收获。分离的B细胞是与永生化细胞融合以产生被称为融合瘤的杂交细胞系。在一个实施例中，所述融合瘤具有包含融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因体。
这些免疫球蛋白的抗原结合片段(包括scFv)还涵盖于如本文使用的术语“单克隆抗体”内。单克隆抗体是高度特异性的，是指针对单一抗原位点。此外，与常规(多克隆)抗体制剂(其通常包括针对抗原上的不同抗原决定基的不同抗体)相反，各单克隆抗体是针对单一抗原决定基。单克隆抗体可使用任何本技术领域公认的技术和彼等本文描述者(例如，例如融合瘤方法、转基因动物、重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)或使用噬菌体抗体库使用例如美国专利第7,388,088号和PCT公开第WO 00/31246号中描述的技术)制备。单克隆抗体包括嵌合抗体、人类抗体和人源化抗体，且可天然存在或重组产生。
如本文使用，术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(1)从就人类免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的融合瘤分离的抗体，(2)从经转型以表达抗体的宿主细胞分离的所述抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(3)从重组、组合人类抗体库分离的抗体，和(4)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人类抗体包含可变区和恒定区，其使用由生殖系基因编码的特定人类生殖系免疫球蛋白序列，但包括例如在抗体成熟期间发生之后续重排和突变。如所属领域中(参见例如隆伯格(Lonberg)(2005)自然生物技术(Nature Biotech.)23(9):1117-1125)中已知，所述可变区含有抗原结合域，其是由重排以形成对外源抗原具特异性的抗体的各种基因编码。除重排外，可变区可通过多种单一氨基酸变化(被称为体细胞突变或超突变)进一步修饰以增加对外源抗原的抗体亲和力。所述恒定区将变化以进一步回应于抗原(即，同型转换)。因此，编码轻链和重链免疫球蛋白多肽以回应于抗原的经重排和体细胞突变的核酸分子无法与原始核酸分子具有序列一致性，而是大体上相同或相似(例如具有至少80％一致性)。
如本文使用，“人类抗体”是指具有其中框架和CDR区两者均衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，若所述抗体含有恒定区，则所述恒定区也是衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列。本文描述的抗huICOS抗体可包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如因为通过活体外随机或位点特异性诱变或通过活体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人类抗体”无意包括其中衍生自其它非人类哺乳动物物种(例如小鼠)的生殖系的CDR序列已经移植至人类框架序列上的抗体。如本文使用，术语“人类”和“完全人类”抗体可交换使用。
“人源化”抗体是指其中在非人类抗体的CDR域外的一些、大多数或所有氨基酸是经衍生自人类抗体的相应氨基酸置换的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施例中，在CDR域外的一些、大多数或所有氨基酸已经来自人类抗体的氨基酸置换，而一或多个CDR区内的一些、大多数或所有氨基酸是未变化。氨基酸的小添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要其不阻止抗体结合至特定抗原即可。“人源化”抗体保留与原始抗体的抗原特异性相似的抗原特异性。
“嵌合抗体”是指其中可变区是衍生自一个物种且恒定区是衍生自另一物种的抗体，例如其中可变区是衍生自小鼠抗体且恒定区是衍生自人类抗体的抗体。“杂交”抗体是指具有不同类型的重链和轻链的抗体，例如小鼠或仓鼠(亲代)重链和人源化轻链或反之亦然。嵌合或杂交抗体可例如通过基因改造，由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构筑。
如本文使用，“同型”是指由抗体的重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD和IgE抗体)。
“同种异型”是指属于特定同型组内的天然存在的变体。(参见例如Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。
术语“识别抗原的抗体”和“对抗原具特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合至抗原的抗体”交换使用。
如本文使用，“经分离的抗体”是指是大体上不含其它蛋白质和细胞材料的抗体。如本文使用，“效应功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或由其引起的生物化学事件。例示性“效应功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应功能，例如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调。这些效应功能通常需使Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是结合至免疫球蛋白的Fc区的受体。结合至IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括等位基因变体和这些受体的可变剪接形式。所述FcγR家族由三个活化受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人类中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一个抑制受体(FcγRIIb，或相同地，FcγRIIB)组成。人类FcγR的各种例示性性质是汇总于表2中。先天效应细胞类型中的大多数共表达一或多种活化FcγR和抑制FcγRIIb，而自然杀手(NK)细胞选择性表达一种活化Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人类中的FcγRIIIA)，但不表达小鼠和人类中的抑制FcγRIIb。人类IgG1结合至大多数人类Fc受体且针对人类IgG1所结合的活化Fc受体的类型而被认为等同于鼠科IgG2a。
表2：人类FcγR的例示性性质
Figure GDA0002365581830000171
如本文使用，“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc域”或“Fc”是指抗体的重链的C端区，其介导所述免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括结合至位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体或结合至经典补体细胞的第一组分(C1q)。因此，Fc区包含抗体的除第一恒定区免疫球蛋白域(例如CH1或CL)外的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同型中，所述抗体的两个重链的每一者中的Fc区包含CH2和CH3恒定域；各多肽链中的IgM和IgE Fc区包含三个重链恒定域(CH域2至4)。就IgG而言，Fc区包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3和在Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可改变，但人类IgG重链Fc区是通常定义为自于位置C226或P230(或在这些两个氨基酸之间的氨基酸)处的氨基酸残基延伸至重链的羧基端，其中编号是如在卡巴特中根据EU索引。(卡巴特(Kabat)等人(1991)免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),国家健康研究院(National Institutes of Health),贝瑟斯达(Bethesda),MD)。人类IgG Fc区的CH2域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3域位于Fc区中的CH2域的C端侧上，即，其从IgG(包括C端赖氨酸)的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文使用，所述Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体或变体Fc(例如非天然存在的Fc)。Fc区是指此区处于分离或处于包含Fc的蛋白多肽(例如“包含Fc区的结合蛋白”)(也被称为“Fc融合蛋白”(例如抗体或免疫粘附素))的情况。
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc域”或“Fc”是指抗体的重链的C端区，其介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括结合至位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体或结合至经典补体细胞的第一组分(C1q)。因此，Fc区包含抗体的除第一恒定区免疫球蛋白域(例如CH1或CL)外的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同型中，所述Fc区包含两个相同蛋白片段，其衍生自所述抗体的两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定域。在IgM和IgE抗体同型中，各多肽链中的所述Fc区包含三个重链恒定域(CH域2至4)。就IgG而言，所述Fc区包含免疫球蛋白域CH2和CH3和在CH1与CH2域之间的铰链。尽管对免疫球蛋白重链的Fc区的边界的定义可改变，但如本文定义，人类IgG重链Fc区是定义为就IgG1而言从氨基酸残基D221、就IgG2而言从V222、就IgG3而言从L221和就IgG4而言从P224延伸至重链的羧基端，其中编号如在卡巴特中根据EU索引(卡巴特等人，1991)。人类IgG Fc区的CH2域从氨基酸237延伸至氨基酸340，且CH3域位于Fc区中的CH2域的C端侧上，即，其从IgG的氨基酸341延伸至氨基酸447或446(若缺乏C端赖氨酸残基)或445(若缺乏C端甘氨酸和赖氨酸残基)。如本文使用，所述Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体或变体Fc(例如非天然存在的Fc)。Fc也可指此区处于分离或处于包含Fc的蛋白多肽(例如“包含Fc区的结合蛋白”)(也被称为“Fc融合蛋白”(例如抗体或免疫粘附素))的情况。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”具有与自然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(例如SEQ ID NO:206)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；和天然序列人类IgG4 Fc区和其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型。(参见例如杰弗瑞斯(Jefferis)等人(2009)mAbs1:1)。
术语“抗原决定基”或“抗原决定子”是指抗原(例如huICOS)上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。抗原决定基可由连续氨基酸(通常线性抗原决定基)或由蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸(通常构象性抗原决定基)两者形成。由连续氨基酸形成的抗原决定基通常(但非总是)在暴露于变性溶剂时得以保留，而由三级折叠形成的抗原决定基通常在用变性溶剂处理时有所损失。抗原决定基在独特的空间构象中通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸。
术语“抗原决定基定位”是指鉴别抗原上的涉及抗体-抗原识别的分子决定子的方法。用于判定给定抗体所结合的抗原决定基的类型的方法为所属领域中众所周知且包括例如免疫印渍术和免疫沉淀分析，其中测试重叠或连续肽(例如来自ICOS)与给定抗体(例如抗ICOS抗体)的反应性；x射线结晶学；抗原突变分析，二维核磁共振；酵母呈现；和氢/氘交换质谱术(HDX-MS)(参见例如分子生物学方法中的抗原决定基定位方案(Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology)，第66卷，G.E.莫里斯(G.E.Morris)编(1996))。
针对两种或多种抗体的术语“结合至相同抗原决定基”意指所述抗体结合至氨基酸残基的相同区段，如通过给定方法确定。用于判定抗体是否与本文描述的抗体结合至“ICOS上的相同抗原决定基”的技术包括例如抗原决定基定位方法，例如抗原抗体复合物的晶体的x射线分析(其提供抗原决定基的原子解析)和HDX-MS。其它方法监测抗体对抗原片段(例如蛋白水解片段)的结合或对所述抗原的突变变种的结合，其中因抗原序列内的氨基酸残基的修饰引起的结合损失通常被认为是对抗原决定基组分的指示，例如丙氨酸扫描诱变(昆宁汗和韦尔斯(Cunningham&Wells)(1985)科学(Science)244:1081)或突变体靶序列变体的酵母呈现(参见实例16)。另外，也可使用用于抗原决定基定位的计算组合方法。这些方法依赖于受关注的抗体亲和分离来自组合噬菌体呈现肽库的特异性短肽的能力。预期具有相同VH和VL或相同CDR1、2和3序列的抗体结合至相同抗原决定基。
“与另一抗体竞争结合至靶”的抗体是指抑制(部分或完全)所述另一抗体结合至所述靶的抗体。两种抗体是否彼此竞争结合至靶(即，一种抗体是否抑制所述另一抗体结合至靶和一种抗体抑制所述另一抗体结合至靶的程度)可使用已知的结合竞争实验进行判定(例如
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表面等离子体共振(SPR)分析)。在某些实施例中，抗体与另一抗体竞争和抑制所述另一抗体结合至靶达至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的程度可取决于哪种抗体为“阻断抗体”(即，所述抗体当与抗原组合时阻断与所述抗原的另一免疫反应)。竞争分析可如例如艾德哈楼(Ed Harlow)和戴维德雷恩(David Lane),冷泉港(Cold Spring Harb.)Protoc.2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或艾德哈楼和戴维德雷恩的“使用抗体”("Using Antibodies")第11章，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),NY,USA 1999中描述进行。竞争抗体结合至相同抗原决定基、重叠抗原决定基或结合至相邻抗原决定基(例如如由立体阻碍证实)。若抗体以两种方式彼此阻断至少50％(即，无论一种或另一种抗原在竞争实验中是否首先与抗原接触)，两种抗体“交叉竞争”。
用于判定两种抗体就结合而言是否竞争或交叉竞争的竞争结合分析包括竞争结合至表达ICOS的T细胞，例如，通过流动式细胞测量术。其它方法包括：表面等离子体共振(SPR)(例如
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)、固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见斯塔力(Stahli)等人，酶学方法(Methods in Enzymology)9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见克科兰(Kirkland)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)137:3614(1986))；固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析(参见哈楼(Harlow)和雷恩(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1988))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见莫瑞尔(Morel)等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(张(Cheung)等人，病毒学(Virology)176:546(1990))；和直接标记RIA。(莫尔登霍耳(Moldenhauer)等人，斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)32:77(1990))。
如本文使用，术语“特异性结合”、“选择性结合(selective binding)”、“选择性结合(selectively bind)”和“特异性结合(specifically bind)”是指抗体结合至预定抗原上的抗原决定基。通常，所述抗体：(1)当通过例如SPR技术在
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2000SPR仪器中使用预定抗原(例如重组人类ICOS作为分析物和抗体作为配体)或抗体对抗原阳性细胞的结合的斯卡乍得(Scatchard)分析测定时，以约小于10-7M，例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更小的平衡解离常数(KD)结合，和(2)以比结合至除预定抗原或密切相关抗原外的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)的亲和力大至少两倍的亲和力结合至预定抗原。因此，“特异性结合至人类ICOS”的抗体是指以10-7M或更小，例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更小的KD结合至可溶或细胞结合的人类ICOS的抗体。“与食蟹猕猴ICOS交叉反应”的抗体是指以10-7M或更小，例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更小的KD结合至食蟹猕猴ICOS的抗体。
如本文使用，术语“kassoc”或“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，而如本文使用，术语“kdis”或“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如本文使用，术语“KD”是指平衡解离常数，其是获自kd相对于ka(即，kd/ka)的比率且表示为莫耳浓度(M)。抗体的KD值可使用所属领域中业已建立的方法测定。用于测定抗体的KD的可获得方法是生物层干涉术(BLI)分析，例如使用ForteBio Octet RED器件，SPR，优选使用生物传感器系统(例如
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SPR系统)或流动式细胞测量术和斯卡乍得(Scatchard)分析。
术语“EC50”在使用抗体或其抗原结合片段的活体外或活体内分析的上下文中是指引起为最大反应的50％的反应(即，在最大反应与基线之间的一半)的抗体或其抗原结合片段的浓度。
术语“结合至固定化ICOS”是指本文描述的抗体结合至ICOS(例如表达于细胞的表面上或结合至固体支撑物)的能力。
如本文使用，术语“交叉反应”是指本文描述的抗体结合至来自不同物种的ICOS的能力。例如，结合人类ICOS的本文描述的抗体也可结合来自另一物种的ICOS(例如食蟹猕猴ICOS)。如本文使用，交叉反应性可通过在结合分析(例如SPR、ELISA)中检测与经纯化的抗原的特异性反应性或结合至生理学表达ICOS的细胞或与生理学表达ICOS的细胞以其它方式在功能上相互作用进行测量。用于测定交叉反应性的方法包括如本文描述的标准结合分析，例如，通过使用
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2000SPR仪器(Biacore AB,瑞典阿普萨拉(Uppsala,Sweden))的SPR分析、或流式细胞技术。
如本文使用，“受体占有率”或“受体的占有率”是指结合至免疫刺激性受体(例如人类ICOS)的促效性抗体(例如本文描述的抗ICOS抗体)的量。“受体占有率％”或“受体的占有率％”可使用下式进行计算：([测试的ΔMFI]/[总的ΔMFI])x 100。ΔMFI(平均荧光单位的变化)是通过自所结合的促效性抗体的MFI减去以同型对照抗体染色的背景的MFI进行计算。总受体浓度是通过添加饱和量的促效性抗体以测定最大表达并因此特定免疫刺激性受体的MFI进行测定。计算总受体表达的替代方式是使用针对相同免疫刺激性受体的抗体，其不与其中受体占有率欲被计算的促效性抗体竞争。
如本文使用，术语“天然存在”当应用至物质时是自然中存在且未经人类有意修饰的物质。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可自然来源分离且未经人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基且链长度无上限的链。蛋白质中的一或多个氨基酸残基含有修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或双硫键。“蛋白质”可包含一或多条多肽。
如本文使用，术语“核酸分子”希望包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，且可以是cDNA。
术语“cDNA”是指已自mRNA产生或衍生的非天然存在的核酸分子，即，非编码区已被去除。
术语“mRNA”或“信使RNA”是在翻译期间指定多肽的氨基酸序列的核酸中间物。
如本文使用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可通过所属领域中已知的标准技术(例如定点诱变和聚合酶链反应(PCR)介导的诱变)引入本发明的抗体内。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基是经具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在所属领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰氨酸、谷酰氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一或多个氨基酸残基可经来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换，且改变的抗体可使用本文描述的功能分析针对所保留的功能(即，本文阐述的功能)进行测试。在某些实施例中，抗ICOS抗体中预测非必要氨基酸残基是经来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换。识别不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法已为所属领域中众所周知(参见例如布鲁梅尔(Brummell)等人，生物化学(Biochem.)32:1180-1187(1993)；小林(Kobayashi)等人，蛋白质工程(Protein Eng.)12(10):879-884(1999)；和博克(Burks)等人，美国国家科学院院刊94:412-417(1997))。
就核酸而言，术语“大体上同源”指示两种核酸或其指定序列当经优化比对和比较时是一致的，且在至少约80％的核苷酸、至少约90％至95％或至少约98％至99.5％的核苷酸中具有适当核苷酸插入或缺失。或者，当区段在选择性杂交条件下将与核酸股的补体杂交时，存在大体上同源。
就多肽而言，术语“大体上同源”指示两种多肽或其指定序列当在优化比对和比较时是一致的，且在至少约80％的氨基酸、至少约90％至95％或至少约98％至99.5％的氨基酸中具有适当氨基酸插入或缺失。
两个序列之间的百分率一致性是当所述序列在优化比对时，所述序列共享的相同位置的数量的函数(即，同源％＝(相同位置的数量)/(位置的总数量)x 100)，需考虑为所述两个序列的优化比对而需引入的间隙的数量和各间隙的长度。如下文描述，序列的比较和两个序列之间的百分率一致性的测定可使用数学算法完成。
两个核苷酸序列之间的百分率一致性可例如使用GCG软件包中的GAP程序，使用nwsgapdna.cmp矩阵和40、50、60、70或80之间隙权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分率一致性也可使用E.梅耶(E.Meyers)和W.米勒(W.Miller)(CABIOS,4:11-17(1989))的算法(其已并入ALIGN程序(2.0版)内)，使用PAM120权重残基表、12之间隙长度罚分和4之间隙罚分测定。另外，两个氨基酸序列之间的百分率一致性可使用尼德曼(Needleman)和温奇(Wunsch)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(48):444-453(1970))算法(其已并入GCG软件包中的GAP程序内)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4之间隙权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定。
本文描述的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索，例如，以识别相关序列。这些搜索可使用奥苏尔(Altschul)等人，(1990)分子生物学杂志215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序、评分＝100、字长度＝12进行，以获得与本文描述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3进行以获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得有间隙的比对以供比较，可使用Gapped BLAST，如艾尔特施豪(Altschul)等人，(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402中描述使用。当利用BLAST和Gapped BLAST程序，可使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的预设参数。(参见例如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)，可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/出处获得)。
核酸可存在于全细胞(例如宿主细胞)、细胞裂解物中或以部分纯化形式或大体上纯形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl条带化、管柱色谱术、琼脂糖凝胶电泳和所属领域中众所周知的其它技术)，自其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸(例如染色体的其它部分)或蛋白质)纯化时，核酸是经“分离的”或“呈现大体上纯的”。(参见F.奥苏贝尔(F.Ausubel)等人编，分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology),Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987))。
如本文使用，术语“载体”意指一种核酸分子，其可传输已与其连接的另一核酸。载体的一种类型是“质体”，其是指其中可拼接额外DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中额外DNA区段可拼接至病毒基因体内。某些载体可在引入其的宿主细胞内自主复制(例如具有复制的细菌起源的细菌载体和染色体外哺乳动物载体)。其它载体(例如非染色体外哺乳动物载体)一经引入基因体宿主细胞内，即可整合至宿主细胞内，并借此与宿主基因体一起复制。此外，某些载体可引导可操作地连接其的基因的表达。这些载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。适用于重组DNA技术中的表达载体包括质体。如本文使用，“质体”和“载体”可交换使用，因为质体是载体的最常用形式。然而，还包括表达载体的其它形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥相同功能。
可交换使用的术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是指包含核酸的细胞(所述核酸非天然存在于所述细胞中)，且可以是其中已引入重组表达载体的细胞。应了解这些术语不仅是指特定主体细胞，也是指此细胞之后代。因为某些修饰可因突变或环境影响而在传代中发生，事实上，此后代可能与亲代细胞不相同，但仍包括于如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
“免疫反应”是生物体中抗外来药剂(例如抗原)的生物反应，其保护生物体免受这些药剂和由其引起的疾病。免疫反应是通过免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀手(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一种或肝产生的可溶性巨分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，所述作用导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或自生物体身体消除入侵病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其它异常细胞或(在自身免疫力或病理性炎症的情况下)正常细胞或组织(包括例如人类细胞或组织)。免疫反应包括例如T细胞(例如效应T细胞或T辅助(Th)细胞，例如CD4+或CD8+ T细胞)的活化或抑制或Treg细胞的抑制或耗尽。“效应T”(“Teff”)细胞是具有细胞溶解活性的T细胞(例如CD4+和CD8+ T细胞)。T辅助(Th)细胞分泌细胞因子并活化和引导其它免疫细胞，但不包括调节T细胞(Treg细胞)。T调节(“Treg”)细胞是调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和预防自身免疫疾病的T细胞的子群。记忆B细胞是B细胞子型，其是在初次感染后于生长中心内形成且对在再感染(也称为二次免疫反应)的情况下产生经加速且更强大的抗体介导的免疫反应而言是重要的。NK细胞是对先天免疫系统而言至关重要的一种细胞毒性淋巴细胞。NK细胞所发挥的作用是与细胞毒性T细胞在脊椎动物适应性免疫反应中发挥的作用相似。NK细胞为受病毒感染的细胞提供快速反应并对肿瘤形成作出反应。
如本文使用，术语“T细胞介导的反应”是指由T细胞(例如效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞))介导的反应。T细胞介导的反应包括例如T细胞细胞毒性和增殖。
如本文使用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应”是指由细胞毒性T细胞引起的免疫反应。CTL反应是由例如CD8+ T细胞介导。
“免疫调节剂(immunomodulator)”或“免疫调节剂(immunoregulator)”是指药剂，例如可涉及调节(modulating/regulating)或修饰免疫反应的信号传导通路的组分。“调节(modulating/regulating)”或“修饰”免疫反应是指免疫系统的细胞中或此细胞(例如效应T细胞，例如Th1细胞)的活性的任何改变。此调节包括免疫系统的刺激或抑制，其可体现在各种细胞类型的数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或减小和/或免疫系统内可发生的任何其它变化。抑制和刺激免疫调节剂两者已经识别，其中的一些于肿瘤微环境中可具有增强的功能。在一些实施例中，所述免疫调节剂位于T细胞的表面上。“免疫调节靶(immunomodulatory target)”或“免疫调节靶(immunoregulatory target)”是针对由物质、药剂、基团、化合物或分子结合且活性是由物质、药剂、基团、化合物或分子的结合而改变的免疫调节剂。免疫调节靶包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。
“免疫疗法”是指通过包括引起、增强、抑制或以其它方式修饰免疫反应的方法治疗患有或有感染或患有疾病复发的风险的个体。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指导致增加(引起或增强)个体的免疫反应以例如治疗癌症的疗法。
“增强内源性免疫反应”意指增加个体中现存免疫反应的效能或效力。效能和效力的此增加可例如通过克服抑制内源性宿主免疫反应的机制或通过刺激增强内源性宿主免疫反应的机制实现。
如本文使用，术语“连接”是指两个或多个分子的结合。所述连接可以是共价或非共价的。所述连接还可以是基因的(即，重组融合)。这些连接可使用此技术领域公认的各种技术(例如化学结合和重组蛋白产生)实现。
如本文使用，“投与”是指使用所述领域中的技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种向个体物理引入包含治疗剂(例如抗ICOS抗体)的组合物。“投与”包括例如由其它人(例如，一或多个医务人员)向人类病患投与和由人类病患自投与。用于本文描述的抗体的各种投与途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其它肠胃外投与途径，例如通过注射或输注。如本文使用的词组“肠胃外投与”意指除肠内或局部投与外的投与模式(例如通过注射)且包括(但不限于)静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病变内、囊内、眶内、心内、皮内、气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，和活体内电穿孔。或者，本文描述的抗体可经由非注射途径投与，例如局部、表皮或粘膜投与途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部投与。投与也可例如一次、多次和/或在一或多个延长的周期进行。
如本文使用，“辅助”或“组合”投与(共投与)包括所述化合物以相同或不同剂型同时投与或分开投与化合物(例如顺序投与)。因此，第一抗体(例如抗ICOS抗体)和第二、第三或更多抗体抗体可以单一调配物同时投与。或者，所述第一和第二(或更多)抗体可经调配用于分开投与且是同时或顺序投与。如本文使用，“组合”疗法意指两种或多种治疗剂以协调的方式投与，且包括(但不限于)同时给药。具体地说，组合疗法包含共投与(例如共调配物的投与或不同治疗组合物的同时投与)和连续或顺序投与两者，只要一种治疗剂的投与在某种程度上是与另一治疗剂的投与协调。例如，一种治疗剂可仅在已投与不同治疗剂之后投与且容许在规定的时间周期内发挥作用。(参见例如科特(Kohrt)等人(2011)血液(Blood)117:2423)。
例如，可首先投与抗ICOS抗体，接着(例如立即接着)投与第二抗体，或反之亦然。在一个实施例中，所述抗ICOS抗体是在投与第二抗体之前投与。在另一实施例中，所述抗ICOS抗体是例如于投与第二抗体的约30分钟内投与。此同时或顺序投与优选导致两种抗体同时存在于经治疗的病患中。
如本文使用，术语“抑制”或“阻断”可交换使用且包含如例如由本文描述的方法测定的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的部分和完全抑制/阻断两者。
如本文使用，“癌症”是指特征为异常细胞于身体内不受控生长的一大类疾病。调节异常的细胞生长或分裂可导致恶性肿瘤或细胞的形成，所述恶性肿瘤或细胞会侵袭邻近组织的细胞且可通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部位。
如本文使用，术语“治疗”是指在个体上进行任何类型的干预或过程或向所述个体投与活性剂，且目的在于逆转、缓解、减轻、抑制或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生物化学指针的进展、发展、严重性或复发。相反，“防止”或“预防”是指向未患疾病的个体投与以预防所述疾病发生。“治疗”不包含防止或预防。
术语“有效剂量(effective dose或effective dosage)”被定义为足以实现或至少部分实现所需效应的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物的(当单独使用或与另一治疗剂组合使用时)促进疾病恢复的任何量，疾病恢复是由疾病症状的严重性的减小、无疾病症状周期的频率和持续时间的增加或对因疾病折磨引起的损伤或残疾的预防证实。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是药物的(当向处于发展疾病或遭受疾病的复发的风险下的个体单独投与或与另一治疗剂组合投与时)预防所述疾病的发展或复发的量。治疗剂促进疾病恢复或预防剂预防疾病的发展或复发的能力可使用熟练的从业者已知的各种方法加以评估，例如在临床试验期间于人类个体中、在预测人类中的功效的动物模型系统中或通过在活体外分析中分析药剂的活性加以评估。
根据本文提供的任一种方法投与有效量的抗ICOS抗体单独或抗ICOS抗体与抗PD-1抗体组合、与抗PD-L1抗体组合或与抗CTLA-4抗体组合可导致至少一种治疗效应，包括例如减少的肿瘤生长或尺寸、减少的随时间出现的转移病变的数量、完全缓解、部分缓解或稳定疾病。例如，治疗方法产生可比临床收益率(CBR＝完全缓解(CR)+部分缓解(PR)+稳定疾病(SD)持续≥6个月)，其优于未投与抗ICOS抗体所实现的临床收益率，或优于投与组合抗体中的任一种所实现的临床收益率，例如，临床收益率的改善是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
以实例说明的，抗癌剂是减缓个体的癌症进展或促进癌症恢复的药物。在一些实施例中，治疗有效量的药物促进癌症恢复至消除癌症的程度。“促进癌症恢复”意指投与有效量的药物(单独或与抗肿瘤剂组合)引起肿瘤生长或尺寸减小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重性的减小、无疾病症状周期的频率和持续时间的增加、对因疾病折磨引起的损伤或残疾的预防，或病患的疾病症状的其它方式缓解。“药理学效能”、“效能”或“功效”是指药物促进病患的癌症恢复的能力。“生理学安全性”是指因投与药物而于细胞、器官和/或生物体层面(副作用)引起的可接受的低程度的毒性或其它不利生理学效应。
以实例说明，就肿瘤的治疗而言，相对于未经治疗的个体，治疗有效量或剂量的药物抑制肿瘤细胞生长至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少超过70％、至少约80％，或至少约90％。在一些实施例中，治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即，100％抑制细胞生长或肿瘤生长。化合物(包括抗体)抑制肿瘤生长的能力可使用本文描述的分析评估。或者，组合物的此性质可通过检查化合物抑制细胞生长的能力评估；此抑制可通过熟练的从业者已知的分析活体外测量。在一些实施例中，肿瘤生长的抑制可无需在治疗后立即进行，且可仅在一段时间后或在重复投与后进行。在本文描述的其它实施例中，可见肿瘤消退和继续至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约60天或更久。
如本文使用，术语“固定剂量”、“平稳剂量”和“平稳-固定剂量”可交换使用且是指不考虑病患的体重或体表面积而向所述病患投与的剂量。固定剂量或平稳剂量是因此非作为mg/kg剂量提供，而是作为治疗剂的绝对量提供。
如本文使用，术语“基于重量”的剂量或给药意指向病患投与的剂量是基于病患的体重计算。例如，当60kg病患需要3mg/kg抗ICOS抗体时，我们可计算并使用适用于投与的抗ICOS抗体的量(即，180mg)。
术语“病患”包括接受治疗性或预防性治疗的人类和其它哺乳动物个体。
术语“个体”包括任何人类或非人类动物。例如，本文公开的方法和组合物可用于治疗患有癌症的个体。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，包括非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施例中，所述个体是人类个体。
如本文使用，除非另有规定，否则术语“一”或“一个”实体是指一或多个所述实体；例如，“核苷酸序列”应了解表示一或多种核苷酸序列。因此，术语“一”或“一个”、“一或多个”和“至少一个”在本文中可交换使用。
如本文使用，“和/或”应视为两个规定特征或组分中的每一者与另一者或不与另一者的特定公开内容。因此，用于例如“A和/或B”的词组中的术语“和/或”包括“A和B”、“A或B”、仅有“A”和仅有“B”。同样地，如用于例如“A、B和/或C”的词组中的术语“和/或”包含下列中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；仅有A；仅有B；和仅有C。
应了解每当在本文中以语言“包含”描述方面时，还提供就“由…组成”和/或“基本上由…组成”而言描述的其它相似方面。
单位、前缀和符号是以其国际单位制(SI)所接受的形式指示。数值范围包括界定所述范围的数字。除非另有指示，否则核苷酸序列是从左至右以5'至3'的方向书写。氨基酸序列是从左至右以胺基至羧基的方向书写。
如本文使用，术语“约”意指近似、粗略、大约或接近。当术语“约”结合数值范围使用时，其通过扩大边界高于和低于所述数值修改所述范围。一般而言，术语“约”可修改数值高于和低于规定值达例如10％(向上或向下(更高或更低))的差异。
本文提供的标题不限制本发明的各种方面，且应通过参考整个说明书来解读。因此，下文紧接定义的术语是通过参考整个说明书而加以更充分地定义。本文描述的各种方面在下列分段中加以进一步详细描述。
I.抗ICOS抗体
在一些实施例中，本发明公开具有所需功能或性质的抗体，例如完全人类抗体。本文描述具有作为治疗剂用于治疗疾病(例如癌症)中的所需性质的促效性抗人类ICOS(抗huICOS)抗体。这些性质包括以下中的一或多种：以高亲和力结合至人类ICOS的能力、人类个体中可接受的低免疫原性、优先结合至FcγRIIb(IgG Fc受体的特定类型)的能力和减小抗体的化学稳定性的序列可靠性的缺乏。本发明的抗体亦适用例如于癌症和与ICOS表达和/或活性相关的其它失调症的诊断。
如实例中描述，本文通过氨基酸序列公开的抗ICOS抗体结合至人类ICOS上的特异性抗原决定基。
具有特定功能性质的抗huICOS抗体
本发明的抗体的特征在于特定功能特征或性质。例如，所述抗体以高亲和力特异性结合至人类ICOS。在一些实施例中，所述抗体特异性结合至ICOS上的与ICOS-L结合的位点。与人类ICOS的结合可使用所属领域中业已建立的一或多种技术评估。例如，在一些实施例中，抗体可通过流动式细胞测量术分析测试，在流动式细胞测量术中，所述抗体与表达人类ICOS的细胞系(例如CHO细胞，其已经转染以在其细胞表面上表达人类ICOS)反应。另外或替代地，抗体的结合(包括结合动力学(例如KD值))可在Biacore结合分析中测试。又其它合适的结合分析包括使用例如重组人类ICOS蛋白的ELISA分析。
在一个实施例中，本发明的抗体或其抗原结合部分以5x 10-8M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以2x 10-8M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以5x 10-9M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以4x 10-9M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以3x 10-9M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以2x 10-9M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以1x 10-9M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以5x 10-10M或更小的KD结合至ICOS蛋白，以1x 10-10M或更小的KD结合至ICOS蛋白。
在另一实施例中，抗体结合人类ICOS的SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)的一或多个残基。在另一实施例中，所述抗体结合至包含人类ICOS的氨基酸残基SIFDPPPFKVTL(SEQID NO:203)的抗原决定基。在另一实施例中，所述抗体的抗原结合部分结合至包含人类ICOS的氨基酸残基SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)的抗原决定基。
在另一实施例中，抗体结合至人类ICOS并刺激免疫反应，例如，抗原特异性T细胞反应。抗体刺激免疫反应的能力可通过测量肿瘤生长测试，例如在活体内肿瘤移植模型中(参见例如实例6、7、8和9)。
在另一实施例中，抗体或其抗原结合部分结合至人类ICOS并显示下列性质中的至少一种：
(a)结合至人类ICOS的SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)内的一或多个残基；
(b)结合至人类ICOS上与抗体ICOS.33、17C4、9D5、3E8、1D7或2644相同的抗原决定基；
(c)与抗体ICOS.33、17C4、9D5、3E8、1D7或2644竞争结合至人类ICOS；
(d)相较于IgG1对照抗体，减小ADCC活性；
(e)增加结合至FcγRIIb受体的特异性；
(f)阻断ICOS配体(ICOS-L)与人类ICOS的结合；
(g)阻断人类ICOS和人类ICOS-L的相互作用；
(h)结合至人类、食蟹猕猴、小鼠和大鼠ICOS；
(i)结合至经活化的人类和食蟹猕猴T细胞；
(j)以约0.7nM的EC50结合至人类T细胞和以约0.3nM的EC50结合至食蟹猕猴T细胞；
(k)不结合至人类CD28或人类CTLA-4；
(l)活化至少一种原代T淋巴细胞，例如CD4+ Teff细胞、Tfh细胞和Treg细胞；
(m)在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中以约0.01至约0.16nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生；
(n)在活体外原代T细胞信号传导分析中以约30nM的EC50诱导蛋白激酶B(pAkt)；
(o)在CD25- CD4+ T细胞和B细胞共培养分析中在葡萄球菌肠毒素B中以约0.002至约0.4nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞产生IFN-γ。
(p)在Tfh和初始B细胞共培养分析中诱导白介素10(IL-10)产生以回应于葡萄球菌肠毒素B；
(q)在活体外分析中，相较于CD45RA+ Treg和CD45RO+ Treg，诱导受提高增殖增加CD3刺激的Teff；
(r)相较于CD45RA+ Treg，增加Teff增殖(例如其中相较于CD45RO+ Treg，CD45RA+Treg的增殖增加更大)；
(s)减少Treg对Teff的抑制；
(t)其中在全血细胞分析中，约10μg/mL的抗体不增加细胞因子产生；
(u)活体外增强Tfh细胞分泌IL-10和IFN-g中的至少一种；和/或
(v)刺激ICOS介导的信号传导。
在另一实施例中，经分离的抗体是经分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中以约0.083nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生。在另一实施例中，经分离的抗体是经分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中以约0.01至约0.1nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生。
在一个方面中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在CD25-CD4+ T细胞和B细胞共培养分析中在葡萄球菌肠毒素B中以约0.2nM的EC50诱导CD25- CD4+T细胞产生IFN-γ。在另一方面中，分离的抗体是分离的人源化抗体(或其抗原结合部分)，其结合至人类ICOS并阻断ICOS配体(例如人类ICOS-L)与人类ICOS的结合和/或相互作用且在CD25- CD4+ T细胞和B细胞共培养分析中在葡萄球菌肠毒素B中以约0.01至0.1nM的EC50诱导CD25- CD4+ T细胞产生IFN-γ。
在一些实施例中，本发明的抗体包括人源化和完全人类单克隆抗体。在其它实施例中，所述抗体是例如嵌合单克隆抗体。
单克隆抗体ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644
在一些实施例中，本发明的抗体是人源化和人类单克隆抗体ICOS.33 IgG1fS267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644，其是如下列实例中描述般加以分离和结构表征。ICOS.33IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VH氨基酸序列和ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VL氨基酸序列是阐述于表35中。
鉴于这些抗体中的任一种皆可结合至人类ICOS，因此可“混合并匹配”VH和VL序列以产生本发明的其它抗huICOS结合分子。在一些实施例中，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列经结构相似的VH序列置换。同样地，在一些实施例中，来自特定VH/VL配对的VL序列经结构相似VL序列置换。
因此，在一个方面中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:5、16、24、32、40或186中阐述的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO:6、17、25、33、41、48或189中阐述的氨基酸序列的轻链可变区；
其中所述抗体特异性结合人类ICOS。
在一些实施例中，重链和轻链可变区组合包括：
(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区；或
(g)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面中，本发明提供包含ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644或其组合的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体。ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VH CDR1的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:9、18、26、34、42和191中。ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VH CDR2的氨基酸序列分别显示于SEQID NO:10、19、27、35、43和192中。ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VHCDR3的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:11、20、28、36、44和193中。ICOS.33 IgG1fS267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VL CDR1的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:12、21、29、37、49和194中。ICOS.33IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VL CDR2的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:14、22、30、38、50和195中。ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的VL CDR3的氨基酸序列是分别显示于SEQ ID NO:15、23、31、39、51和196中。所述CDR区使用卡巴特系统界定(卡巴特等人，1991)免疫学关注的蛋白质的序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国健康与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公告第91-3242号)。
鉴于这些抗体中的每一者可结合至人类ICOS且所述抗原结合特异性是主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供，因此可“混合并匹配”VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列(即，尽管各抗体必须含有VH CDR1、CDR2和CDR3和VL CDR1、CDR2和CDR3，但可混合并匹配来自不同抗体的CDR)以产生本发明的其它抗huICOS结合分子。这些经“混合并匹配”的抗体的ICOS结合可使用本文描述的结合分析(包括实例中描述的结合分析(例如ELISA，
Figure GDA0002365581830000331
分析))进行测试。在一些实施例中，当混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列是经结构相似CDR序列置换。同样地，在一些实施例中，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选经结构相似CDR序列置换。一般技术人员容易了解新颖VH和VL序列可通过以来自单克隆抗体ICOS.33 IgG1fS267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644的本文公开CDR序列的结构相似序列取代一或多个VH和/或VL CDR区序列产生。
因此，在另一方面中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:9、18、26、34、42或191中阐述的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:10、19、27、35、43或192中阐述的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:11、20、28、36、44或193中阐述的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:12、21、29、37、49或194中阐述的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:14、22、30、38、50或195中阐述的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:15、23、31、39、51或196中阐述的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体特异性结合人类ICOS。
在一个实施例中，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:9的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:10的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:11的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:12的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR3。
在另一实施例中，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:18的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:19的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:20的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:21的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:22的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:23的轻链可变区CDR3。
在另一实施例中，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:26的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:27的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:28的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:29的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:31的轻链可变区CDR3。
在另一实施例中，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:34的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:35的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:36的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:37的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:38的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:39的轻链可变区CDR3。
在另一实施例中，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:42的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:43的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:44的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:49的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR3。
在另一实施例中，所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:191的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:192的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:193的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:194的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO:195的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO:196的轻链可变区CDR3。
所属领域中众所周知CDR3域(独立于CDR1和/或CDR2域)可单独确定抗体对同源抗原的结合特异性，且所属领域中众所周知可预测地产生具有基于共同CDR3序列的相同结合特异性的多种抗体。(参见例如克林卡(Klimka)等人，英国癌症杂志(British J.ofCancer)83(2):252-260(2000)。因此，本发明提供包含来自衍生自人类或非人类动物的抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体可特异性结合至人类ICOS。在某些方面中，本发明提供包含来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体可特异性结合至人类ICOS。在一些实施例中，包含来自非人类抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域的这些本发明抗体(a)可与对应亲代非人类抗体竞争结合；(b)保留对应亲代非人类抗体的功能特性；(c)结合至与对应亲代非人类抗体相同的抗原决定基；和/或(d)具有与对应亲代非人类抗体相似的结合亲和力。
在其它方面中，本发明提供包含来自人类抗体(例如人类抗体，例如从非人类动物获得的人类抗体)的一或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述人类抗体可特异性结合至人类ICOS。在其它方面中，本发明提供包含来自第一人类抗体(例如人类抗体，例如从非人类动物获得的人类抗体)的一或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述第一人类抗体可特异性结合至人类ICOS，且其中来自所述第一人类抗体的CDR3域置换缺乏对ICOS的结合特异性的人类抗体中的CDR3域以产生可特异性结合至人类ICOS的第二人类抗体。在一些实施例中，包含来自第一人类抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域的这些本发明抗体(a)可与对应亲代非人类抗体竞争结合；(b)保留对应亲代非人类抗体的功能特性；(c)结合至与对应亲代非人类抗体相同的抗原决定基；和/或(d)具有与对应亲代非人类抗体相似的结合亲和力。
本发明还提供包含本文公开的新颖可变域序列和具有经修饰的Fc区的恒定域的抗huICOS抗体，相较于经修饰的Fc区对其它Fc受体的亲和力，所述经修饰的Fc区对FcγRIIb具有增强的亲和力。在一些实施例中，具有增强的FcγRIIb特异性的这些促效性抗huICOS抗体在治疗癌症中显示绝佳功效。在其它实施例中，具有增强的FcγRIIb特异性的这些促效性抗huICOS抗体在治疗各种失调症(例如癌症)中显示绝佳功效。不希望受机械理论的限制，这些FcγRIIb特异性促效性抗ICOS单克隆抗体可通过增加树突细胞的成熟，因此，促进细胞毒性CD8+ T细胞的扩增和活化(此导致增强的抗肿瘤反应)而显示增强的辅助效应。不希望受理论的限制，因增加的受体聚集或“交联”所致的本发明的促效剂ICOS抗体的FcR介导的信号增强可以是治疗功效的主要贡献者。通过所述抗体的Fc部分的FcR参与使ICOS促效剂抗体交联可增加信号强度并借此增强细胞活化。
抗体的活化(A)相比于抑制(I)Fc受体的相对结合亲和力可表示为“A/I”比率，且通常随IgG抗体的Fc区的结构而变化。参见WO 2012/087928。对结合至抑制受体FcγRIIb具有增强的特异性的抗体具有较低的A/I比率。在一些实施例中，本文描述的促效性抗huICOS抗体具有小于5、4、3、2、1、0.5、0.3、0.1、0.05、0.03或0.01的A/I比率。
包含突变以增强FcγRIIb特异性的人类IgG1恒定域的实例是描述于本文中且还提供于序列表中。序列变体是参考于SEQ ID NO:52处提供并显示于图2中的人类IgG1f恒定域序列定义。关于Fc区中的突变的位置的命名法(编号)是根据如于卡巴特等人，1991)免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共健康服务署(Public Health Service),国家健康研究院(National Institutes ofHealth),Bethesda,Md.)中的EU索引，其促进在具有不同可变域长度的抗体中的相同位置处比较Fc序列。也参见爱德曼(Edelman)等人(1969)美国科学院院刊(Proc.Nat'lAcad.Sci.(USA))63:78；WO 2012/130831(使用相同编号系统)。表3提供Fc序列变体的汇总，所述领域中的技术人员自所述Fc序列变体可容易知晓于本文公开的抗体序列中的相应位置。SE和SELF变体是描述于楚(Chu)等人(2008)分子免疫学(Mol.Immunol.)45:3926中。P238D、V4、V7、V8、V9、V11和V12变体是描述于三元(Mimoto)等人(2013)蛋白质工程设计与选择(Protein Engineering Design&Selection)26:589(例如在其中的表1处)中。
表3：Fc序列变体
Figure GDA0002365581830000361
Figure GDA0002365581830000371
对FcγRIIb具有增强的亲和力的额外Fc序列变体是公开于俞(Yu)等人(2013)美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)135:9723(和WO 2014/184545)中，包括V262E和V264E，例如用于与S267E和L328F组合使用。
具有保守修饰的抗体
在某些实施例中，本发明的抗体包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一或多种包含基于本文描述的抗体(例如ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644)的指定氨基酸序列或其保守修饰，且其中所述抗体保留本发明的抗huICOS抗体的所需功能性质。在所属领域中应了解可作出不去除抗原结合的某些保守序列修饰。(参见例如布鲁梅尔(Brummell)等人(1993)生物化学(Biochem)32:1180-8)。因此，本发明提供经分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)包括包含SEQ ID NO:11、20、28、36、44或193中阐述的氨基酸序列的CDR3序列的重链可变区或其保守修饰；
(b)包括包含SEQ ID NO:15、23、31、39、51或196中阐述的氨基酸序列的CDR3序列的轻链可变区或其保守修饰；和
(c)抗体或其抗原结合部分特异性结合人类ICOS。
另外或替代地，所述抗体可具有本文描述的功能性质中的一或多种，例如结合至人类ICOS的高亲和力和/或刺激抗原特异性T细胞反应的能力。
在一些实施例中，包含CDR2序列的重链可变区包含SEQ ID NO:10、19、27、35、43或192中阐述的氨基酸序列或其保守修饰；和包含CDR2序列的轻链可变区包含SEQ ID NO:14、22、30、38、50或195中阐述的氨基酸序列或其保守修饰。在另一实施例中，包含CDR1序列的重链可变区包含SEQ ID NO:9、18、26、34、42或191中阐述的氨基酸序列或其保守修饰；和包含CDR1序列的轻链可变区包含SEQ ID NO:12、21、29、37、49或194中阐述的氨基酸序列或其保守修饰。
在各种实施例中，所述抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
结合至与抗huICOS抗体相同的抗原决定基的抗体
在另一实施例中，本发明提供结合至人类ICOS上与本发明的抗huICOS单克隆抗体中的任一种相同的抗原决定基的抗体(即，具有与本发明的单克隆抗体中的任一种交叉竞争结合至人类ICOS的能力的抗体)。在一些实施例中，用于交叉竞争研究的参考抗体是单克隆抗体ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644。
这些交叉竞争抗体可基于其在标准人类ICOS结合分析中与ICOS.33 IgG1fS267E、17C4、9D5、3E8、1D7和/或2644交叉竞争的能力进行鉴别。例如，可使用标准ELISA分析，其中使重组人类ICOS蛋白固定于盘上，荧光标记所述抗体中的任一种，并评估未经标记的抗体竞争掉已经标记的抗体的结合的能力。另外或替代地，可使用Biacore分析以评估所述抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制例如ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和/或2644对人类ICOS的结合的能力证实所述测试抗体可与ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和/或2644竞争结合至人类ICOS且因此结合至人类ICOS上与ICOS.33 IgG1fS267E、17C4、9D5、3E8、1D7和/或2644相同的抗原决定基。在一个实施例中，结合至人类ICOS上与ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和/或2644相同的抗原决定基的抗体是人源化或人类单克隆抗体。
如于实例16中进一步讨论，ICOS.33 IgG1f S267E、3E8和9D5人类ICOS的结合已定位至ICOS(SEQ ID NO:1)的残基112至123或氨基酸序列SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)。因此，在一个实施例中，本发明提供结合至人类ICOS的SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)的一或多个残基的抗huICOS抗体，例如，如通过HDX-MS测定。在另一实施例中，所述抗huICOS抗体结合至包含氨基酸残基人类ICOS的SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)的抗原决定基。
这些人源化或人类单克隆抗体可如本文描述般制备和分离。例如，结合至与本文公开的抗体相同或相似的抗原决定基的抗huICOS抗体可使用免疫方案(例如本文所述的免疫方案)提高。所得抗体可针对结合至人类ICOS的高亲和力加以筛选。所选抗体然后可在例如酵母呈现分析(其中huICOS的序列变体是呈现于酵母细胞的表面上)或通过氢-氘交换实验加以研究，以测定由所述抗体结合的精确抗原决定基。
抗原决定基测定可通过所属领域中已知的任何方法进行。在一些实施例中，若抗huICOS抗体与于huICOS的至少一个区内的相同残基中的一或多个接触；若其与huICOS的至少一个区内的大部分残基接触；若其与huICOS的各区内的大部分残基接触；若其沿huICOS的整体长度与大部分触体接触；若其与人类ICOS的相同的不同区的所有内接触；若其与人类ICOS上任何一个区处的所有残基接触；或若其与在所有相同区处的所有相同残基接触，则认为抗huICOS抗体结合至与本文公开的抗huICOS mAb相同的抗原决定基。抗原决定基“区”是沿着初级序列但未必直接相邻的残基的团簇。
用于以本文描述的抗体测定结合至“huICOS上的相同抗原决定基”的抗体的技术包括抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供抗原决定基的原子分辨率。其它方法监测所述抗体与抗原片段或所述抗原的突变变型的结合，在所述抗原的突变变型中，因抗原序列内的氨基酸修饰引起的结合损失指示抗原决定基组分。方法也可依赖于受关注的抗体亲和分离来自组合的噬菌体呈现肽库或来自靶蛋白的蛋白酶消化的特异性短肽(以天然三维形式或以变性形式)的能力。然后将所述肽视为用于定义对应于用于筛选肽库的抗体的抗原决定基的领导者。就抗原决定基定位而言，亦已研究已显示定位构象性不连续抗原决定基的计算算法。
抗原决定基或包含抗原决定基的区域也可通过针对结合至一系列跨越ICOS的重叠肽筛选进行识别。或者，杰斯伯(Jespers)等人(1994)生物技术(Biotechnology)12:899的方法可用于引导对具有相同抗原决定基的抗体和因此与本文描述的抗ICOS抗体相似的性质的选择。使用噬菌体呈现，首先，使抗ICOS抗体的重链与(例如人类)轻链的库配对以选择ICOS结合抗体，且然后使新颖轻链与(例如人类)重链的库配对以选择具有与本文描述的抗huICOS抗体相同的抗原决定基或抗原决定基区的(例如人类)ICOS结合抗体。或者，本文描述的抗体的变体可通过编码抗体的重链和轻链的cDNA序列的诱变获得。
也可使用扫描诱变的丙氨酸(如由昆宁汗(Cunningham)和韦尔斯(Wells)(1989)科学(Science)244:1081描述)或ICOS中的氨基酸残基的点诱变的一些其它形式(例如实例16处提供的酵母呈现方法)以测定用于抗ICOS抗体的功能抗原决定基。
由特异性抗体结合的抗原决定基或抗原决定基区(“抗原决定基区”是包含抗原决定基或与抗原决定基重叠的区)也可通过评估抗体与包含ICOS片段的肽的结合来测定。可以合成一系列包含ICOS序列(例如人类ICOS)的重叠肽并且筛选结合，例如在直接ELISA、竞争ELISA(其中评估所述肽阻止抗体对结合至微量滴定盘的孔的ICOS结合的能力)中或在芯片上筛选结合。这些肽筛选方法可能无法检测一些非连续功能抗原决定基，即，涉及沿ICOS多肽链的初级序列是不连续的氨基酸残基的功能抗原决定基。
抗原决定基也可通过基于MS的蛋白质足迹分析，例如HDX-MS和蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)识别。HDX-MS可例如如韦(Wei)等人(2014)今日药物发现(Drug DiscoveryToday)19:95处进一步描述进行，所述文献的方法是以引用的方式明确并入本文中。FPOP可例如如杭博雷和格罗斯(Hambley&Gross)(2005)美国质谱学会杂志(J.American Soc.MassSpectrometry)16:2057中描述进行，所述文献的方法是以引用的方式明确并入本文中。
抗ICOS抗体所结合的抗原决定基也可通过结构方法测定，例如X射线晶体结构测定(例如WO2005/044853)、分子模型化和核磁共振(NMR)光谱，包括当游离时和当与受关注的抗体结合成复合物时，于ICOS中的不稳定酰胺氢的H-D交换速率的NMR测定(辛-佳斯廷(Zinn-Justin)等人(1992)生物化学(Biochemistry)31:11335；辛-佳斯廷等人(1993)生物化学32:6884)。
除非另有指示，且参考申请专利范围，否则抗体所结合的抗原决定基是如HDX-MS方法测定的抗原决定基。
衍生自仓鼠抗体的抗huICOS抗体
本文描述包含衍生自仓鼠序列的CDR和/或抗体重链和/或轻链可变区的嵌合和人源化抗体的实例。本文描述的嵌合或人源化抗体可基于通过所属领域中已知的各种方法制备的单克隆抗体(例如小鼠或仓鼠)的序列制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可获自受关注的融合瘤且使用标准分子生物学技术改造以含有人类免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，例如小鼠或仓鼠抗体的可变区可使用所属领域中已知的方法连接至人类恒定区(参见例如卡比莉(Cabilly)等人的美国专利第4,816,567号)。为产生人源化抗体，CDR区可使用所属领域中已知的方法插入人类框架内(参见例如温特(Winter)的美国专利第5,225,539号和昆恩(Queen)等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号和第6,180,370号)。
以高亲和力结合的抗ICOS抗体
在一些实施例中，本发明的抗huICOS抗体以高亲和力结合至huICOS，例如本文公开的抗huICOS抗体，使得其变为有效治疗剂。在各种实施例中，本发明的抗huICOS抗体以小于10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM的KD结合至huICOS。在其它实施例中，本发明的抗huICOS抗体以介于2nM至100pM的KD结合至huICOS。用于评估抗体对huICOS的结合能力的标准分析包括ELISA、RIA、蛋白质印迹转渍法、生物层干涉术(BLI)和
Figure GDA0002365581830000401
SPR分析(参见实例10)。
抗ICOS抗体序列变体
本文公开的抗ICOS抗体序列变体维持本文公开的所需功能性质。CDR区是使用卡巴特系统(卡巴特等人，1991)描述。在一些实施例中，本发明进一步提供包含与本文公开的抗体的CDR序列至少70％、75％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％或99％一致的CDR序列的人类或人源化抗huICOS抗体。本发明还提供包含与本文公开的抗体的重链和/或轻链可变域序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的重链和/或轻链可变域序列的抗huICOS抗体，和包含与本文公开的抗体的重链和/或轻链序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的全长重链和/或轻链序列的抗huICOS抗体。
II.经改造和修饰的抗体
VH和VL区
本发明还提供经改造和修饰的抗体，其可使用具有本文公开的VH和/或VL序列中的一或多种的抗体作为初始材料以改造经修饰的抗体来制备，所述经修饰的抗体可具有与初始抗体不同的性质。在一些实施例中，如本文描述的抗体是通过修饰一或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如在一或多个CDR区内和/或在一或多个框架区内)的一或多个残基加以改造。另外或替代地，如本文描述的抗体是通过修饰恒定区内的残基例如以改变所述抗体的效应功能加以改造。
在一个实施例中，可变区改造包括CDR移植。此移植特别用于使非人类抗ICOS抗体(例如抗huICOS抗体)人源化，所述抗huICOS抗体与本文公开的抗huICOS抗体竞争结合和/或结合至与本文公开的选择抗huICOS抗体一致的抗原决定基。抗体主要通过位于重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。所述CDR在序列中是高度可变和/或形成结构定义环(“高度可变环”)。表达载体可经构筑使得其包括来自特定参考(也称为“亲代”)抗体的移植至来自不同抗体的框架序列上的CDR序列(参见例如李奇曼L.(Riechmann,L.)等人(1998)自然(Nature)332:323-327；简P.(Jones,P.)等人(1986)自然321:522-525；昆恩C.(Queen,C.)等人(1989)美国国家科学院院刊86:10029-10033；温特的美国专利第5,225,539号和昆恩等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)。在一些实例中，所得重组抗体具有相似于亲代抗体的性质。经改造的抗体然后可以经进一步修饰以获取不同于亲代抗体的性质。在其它实例中，将亲代CDR序列移植至框架上取消亲代抗体的某些特性使得所述重组抗体不再具有这些特性。一种例示性特性是针对抗原的结合亲和力。在这些实例中，其可能有利于进一步修饰经改造的抗体以重新获得亲代抗体的所需特性。
这些框架序列可获自包括生殖系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开参考文献。例如，人类重链和轻链可变区基因的生殖系DNA序列可参见“VBase”人类生殖系序列数据库和卡巴特E.A.等人，1991)；汤姆林逊I.M.(Tomlinson,I.M.)等人(1992)“人类生殖系VH序列的系谱揭露约五十组VH区段具有不同高变环”("The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops")分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227:776-798；和考克斯J.P.(Cox,J.P.L.)等人(1994)“人类生殖系VH区段的说明揭露它们的利用率存在强烈的偏向”("ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage,")欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24:827-836，其中的每一者的内容是以引用的方式明确并入本文中。
在一些实施例中，用于本文描述的抗体中的框架序列是彼等结构与由本文描述的抗体使用的框架序列相似者。VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列可移植至具有与衍生框架序列的生殖系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列的框架区上，或CDR序列可移植至相较于生殖系序列，含有多达20个氨基酸取代(包括保守氨基酸取代)的框架区上。例如，已发现在某些实例中，使框架区内残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见例如昆恩等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)。
本文描述的经改造的抗体包括其中已对VH和/或VL内的框架残基作出修饰例如以改善所述抗体的那些性质(例如以减小所述抗体的免疫原性)者。例如，一种方法为使一或多个框架残基“回复突变”成相应生殖系序列。更具体地说，已经历体细胞突变的抗体可含有不同于其中衍生所述抗体的生殖系序列的框架残基。这些残基可通过将抗体框架序列与其中衍生所述抗体的生殖系序列比较而进行识别。为使框架区序列回复至其生殖系构形，体细胞突变可通过例如定点诱变或PCR介导的诱变“回复突变”成生殖系序列。这些“回复突变”的抗体也包含于本发明中。
框架修饰的另一类型涉及使框架区内或甚至一或多个CDR区内的一或多个残基突变，以去除T细胞抗原决定基，借此减小所述抗体的潜在免疫原性。此方法也被称为“去免疫”且进一步详细地描述于卡尔(Carr)等人的美国专利公开第20030153043号中。
可变区修饰的另一类型是使CDR区内的氨基酸残基突变以改善受关注的抗体的一或多种结合性质(例如亲和力)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入有关抗体结合或受关注的其它功能性质的突变或影响。优选地，引入保守修饰。所述突变可以是氨基酸添加、缺失或取代。在一些实施例中，改变不超过CDR区内的一、二、三、四或五个残基。
抗体的CDR中的甲硫氨酸残基可经氧化，从而导致抗体效力的潜在化学降解和后续还原。因此，本文还提供重链和/或轻链CDR中的一或多个甲硫氨酸残基已经未经历氧化降解的氨基酸残基置换的抗ICOS抗体。相似地，脱酰胺位点可以从抗ICOS抗体去除，特定地说，从CDR中去除。本文还提供其中抗原结合域内的潜在糖基化位点经消除以阻止可干扰抗原结合的糖基化抗体。参见例如美国专利第5,714,350号。
抗体掩蔽
在一些实施例中，本文公开的抗体是经修饰以限制其对特定细胞和/或组织的结合。在一个实施例中，这些抗体包含特异性结合至所述抗体的抗原结合表面并干扰抗原结合的阻断肽“屏蔽”。在一些实施例中，所述屏蔽是通过蛋白酶可裂解连接子连接至所述抗体的各结合臂。参见例如CytomX的美国专利第8,518,404号。具有蛋白酶可裂解连接子的抗体是适用于治疗癌症，其中蛋白酶浓度在肿瘤微环境中相较于非肿瘤组织有极大提高。可裂解连接子在肿瘤微环境中的选择性裂解容许掩蔽/阻断肽的解离，从而选择性地在肿瘤中实现抗原结合，而非在其中抗原结合可能引起非所需副作用的外周组织中实现抗原结合。
在另一实施例中，开发包含两个抗原结合域的二价结合化合物(“掩蔽配体”)，其结合至(二价)抗体的抗原结合表面并干扰抗原结合。在一个实施例中，所述两个结合域屏蔽是通过可裂解连接子(例如可由肽酶裂解)彼此连接(但非抗体)。(参见例如Tegopharm公司的WO 2010/077643)。掩蔽配体可包含或衍生自其中希望结合所述抗体或可独立产生的抗原(例如抗特应型结合片段)。这些掩蔽配体适用于治疗癌症，其中蛋白酶浓度于肿瘤微环境中相较于非肿瘤组织有极大地提高。可裂解连接子于肿瘤微环境中的选择性裂解容许两个结合域彼此解离，从而减小对抗体的抗原结合表面的结合性。掩蔽配体自抗体的所得解离使得选择性在肿瘤中实现抗原结合，而非在其中抗原结合可能引起非所需副作用的外周组织中实现抗原结合。
Fc和经修饰的Fc区
在一个实施例中，本文描述的抗体可包含基于抗体的生物活性选择的Fc区。赛尔弗德(Salfeld)(2007)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)25:1369。人类IgG例如可被分为四个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。这些子类中的每一者包含就结合至Fcγ受体(活化受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA、FcγRIIC(CD32a,c)；FcγRIIIA和FcγRIIIB(CD16a、b)和抑制受体FcγRIIB(CD32b))中的一或多种和就结合至补体的第一组分(C1q)而言具有独特概况的Fc区。人类IgG1和IgG3结合至所有Fcγ受体；IgG2结合至FcγRIIAH131且对FcγRIIAR131 FcγRIIIAV158具有较低亲和力；IgG4结合至FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIAV158；和抑制受体FcγRIIB对IgG1、IgG2和IgG3相较于所有其它Fcγ受体具有更低的亲和力。(布鲁恩(Bruhns)等人(2009)血液(Blood)113:3716)。研究已显示FcγRI不结合至IgG2，和FcγRIIIB不结合至IgG2或IgG4。Id(如前述引用数据)。一般而言，关于ADCC活性，人类IgG1≧IgG3>>IgG4≧IgG2。在一些实施例中，选择IgG1恒定域，而非IgG2或IgG4，例如，用于治疗组合物中，因为需要ADCC。在其它实施例中，选择IgG3，因为需要活化表达FcγRIIIA的NK细胞、单核细胞或巨噬细胞。在其它实施例中，选择IgG4，因为所述抗体是用于使过敏患者脱敏。亦选择IgG4使得所述抗体缺乏所有效应功能。
本文描述的抗huICOS抗体可变区可连接(例如共价连接或融合)至Fc，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可具有任何同种异型或同族同种异型，例如，就IgG1而言：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；就IgG2而言：G2m、G2m23(n)；就IgG3而言：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。(参见例如杰弗瑞斯(Jefferis)等人(2009)mAbs 1:1)。同种异型的选择可受潜在免疫原性问题影响，例如以最小化抗药物抗体的形成。
在一些实施例中，本发明的抗ICOS抗体具有结合至FcγRIIb或对FcγRIIb具有增强的结合的Fc区，其提供经增强的促效作用。参见例如WO 2012/087928；李(Li)和拉韦奇(Ravetch)(2011)科学333:1030；韦尔逊(Wilson)等人(2011)癌细胞(Cancer Cell)19:101；瓦特(White)等人(2011)免疫学杂志(J.Immunol.)187:1754。在一些实施例中，本文描述的可变区可连接至增强对抑制受体FcyRIIb的亲和力的Fc变体，例如，以增强细胞凋亡诱导或佐剂活性。李和拉韦奇(2012)美国国家科学院院刊109:10966；美国专利申请公开2014/0010812。这些变体提供具有与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性的抗体。在一个实施例中，相对于一或多个活化受体，Fc变体提供对FcγRIIb的选择性增强的亲和力。这些变体也可显示增强的FcR介导的交联，从而导致增强的治疗功效。用于改变对FcγRIIb的结合的修饰包括例如于位置234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328或332(根据EU索引)处的一或多个修饰。用于增强FcγRIIb亲和力的例示性取代包括(但不限于)234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。例示性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强对FcγRIIb的结合的其它Fc变体包括235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和267E-328F。具体地说，人类IgG1的S267E、G236D、S239D、L328F和I332E变体(包括S267E-L328F双重变体)是具体地说在增强对抑制FcγRIIb受体的亲和力中具有特别价值。楚(Chu)等人(2008)分子免疫学(Mol.Immunol.)45:3926；美国专利申请公开2006/024298；WO 2012/087928。对FcγRIIb(如区别于FcγRIIaR131)的增强的特异性可通过添加P238D取代和其它突变(三元(Mimoto)等人(2013)蛋白质工程设计与选择26:589；WO 2012/1152410)和V262E和V264E(俞(Yu)等人(2013)美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)135:9723和WO 2014/184545)获得。
具有IgG2铰链区的非IgG2重链恒定域
在一些实施例中，本文描述的抗ICOS抗体显示增加的促效剂活性，至少部分因增加对FcγRIIb的结合和/或对FcγRIIb的特异性的修饰。替代方法是改造Fc区以提供促效作用的与FcγR无关的增强。针对其它靶的具有提供此增强的促效作用的经修饰IgG2域的抗体的实例是描述于WO 2015/145360和瓦特等人(2015)癌细胞27:138中，所述文献的公开内容是以全文引用的方式并入本文中。具体地说，双硫键是经配置以将所述抗体“锁”至更致密的“h2B”构形内，从而导致增强的促效作用。所得增强的促效作用是与FcγR无关的。(参见瓦特等人(2015)癌细胞27:138)。此与FcγR无关的促效作用在治疗一些肿瘤中是有利的，例如几乎无表达FcγR-+的彼等细胞(例如几乎无NK细胞或巨噬细胞)者。在一个实施例中，提供包含连接至具有hIgG2铰链区或其变体(包括CH1域序列变体)的非hIgG2重链恒定区(例如IgG1)的本文公开的CDR或可变域序列的抗ICOS抗体。在一个实施例中，相较于具有完全IgG1重链恒定区的抗体，这些“IgG2铰链”抗体显示增强的促效作用，且所述增强的促效作用与Fcγ受体介导的交联无关。在一些实施例中，这些IgG2铰链抗ICOS抗体保持大体上未经变化的抗原结合亲和力。本文还提供增强非IgG2抗ICOS抗体的与FcγR无关的促效作用的方法，其包括用IgG2铰链置换非IgG2铰链。在某些实施例中，经修饰的重链恒定区包含IgG2同型的铰链(“IgG2铰链”)和CH1、CH2和CH3域，其中CH1、CH2和CH3域中的至少一种不具有IgG2同型。IgG2铰链可以是野生型人类IgG2铰链(例如ERKCCVECPPCPAPPVAG，阐述于SEQ ID NO:96中)或还赋予增强的促效剂活性的其变体。在某些实施例中，这些IgG2铰链变体具有与野生型IgG2铰链相似的硬度或坚硬。铰链的硬度可例如通过电脑模型化、电子显微镜术、光谱学(例如核磁共振(NMR))、X射线结晶学(B因素)或沉降速度分析超速离心以测量或比较包含铰链的抗体的旋转半径进行测定。在一些实施例中，人类IgG2铰链变体包含四个半胱氨酸残基(即，C219、C220、C226和C229)中的一或多个例如经丝氨酸的取代。在一个实施例中，IgG2铰链变体包含C219S突变(例如ERKSCVECPPCPAPPVAG，如SEQ ID NO:110中阐述)。其它IgG2铰链变体包含C220S、C226S或C229S突变，其中的每一者可与C219S突变组合。
IgG2铰链变体也可包含非IgG2铰链序列组件(“嵌合铰链”)。在一些实施例中，所述嵌合铰链的硬度是至少相似于野生型IgG2铰链的硬度。例如，在一个实施例中，IgG2铰链变体包含野生型IgG1下游铰链。参见表2。
下表4提供CH1、CH2和CH3域的同型起源不同的“IgG2铰链”人类重链恒定区序列的实例。如本文使用，“IgG2铰链抗体”不仅是指包含衍生自IgG2的铰链区，而且指衍生自IgG2CH1的CH1区的抗体。表4中的星号(*)指示域可以具有任何同型或可完全不存在。在某些实施例中，经修饰的重链恒定区包含变体CH1域，例如包括A114C和/或T173C突变。经修饰的重链恒定区也可包含变体CH2域，例如包括A330S和/或P331S突变。
表4：“IgG2铰链”人类重链恒定区构筑体
CH1 铰链 CH2 CH3
* IgG2 * *
IgG1 IgG2 * *
IgG2 IgG2 * *
* IgG2 IgG1 *
* IgG2 IgG2 *
* IgG2 * IgG1
* IgG2 * IgG2
IgG1 IgG2 IgG1 *
IgG1 IgG2 IgG2 *
IgG2 IgG2 IgG1 *
IgG2 IgG2 IgG2 *
IgG1 IgG2 * IgG1
IgG1 IgG2 * IgG2
IgG2 IgG2 * IgG1
IgG2 IgG2 * IgG2
* IgG2 IgG1 IgG1
* IgG2 IgG1 IgG2
* IgG2 IgG2 IgG1
* IgG2 IgG2 IgG2
IgG1 IgG2 IgG1 IgG1
IgG1 IgG2 IgG1 IgG2
IgG1 IgG2 IgG2 IgG1
IgG1 IgG2 IgG2 IgG2
IgG2 IgG2 IgG1 IgG1
IgG2 IgG2 IgG1 IgG2
IgG2 IgG2 IgG2 IgG1
IgG2 IgG2 IgG2 IgG2
包含IgG2 CH1和铰链序列与其它同型序列的组合的抗体恒定域的实例和选择氨基酸取代是由下表5提供。
表5：“IgG2铰链”人类重链恒定区的实例
Figure GDA0002365581830000461
Figure GDA0002365581830000471
包含IgG2 CH1和铰链序列与其它同型序列的组合的抗体恒定域的额外特定实例和选择氨基酸取代由下表6提供。
表6：“IgG2铰链”人类重链恒定区的额外实例
Figure GDA0002365581830000472
Figure GDA0002365581830000481
抗ICOS抗体(包括包含本文公开的CDR和/或可变域序列的抗体)可并入本文公开的“IgG2铰链”恒定域序列，例如以增强与FcγR无关的促效剂活性。这些IgG2铰链恒定域的实例包括表5(SEQ ID NO:104至108和110至119)和表6(SEQ ID NO:120至151)公开的那些域和还在SEQ ID NO:101至108处所公开的那些域。
半衰期延长
在一些实施例中，抗ICOS抗体经修饰以增加其生物半衰期，例如所述抗体于血清中的半衰期。各种方法在所属领域中已知。例如，抗体的半衰期可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力延长。在一个实施例中，所述抗体可于CH1或CL区内加以改变以含有取自IgG的Fc区的CH2域的两个环的补救受体结合抗原决定基，如普莱斯塔(Presta)等人的美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中描述。增加对FcRn的结合和/或改善药物动力学性质的其它例示性Fc变体包括位置259、308和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc结合至FcRn的其它变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(辛顿(Hinton)等人，2004,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279(8):6213-6216；辛顿等人2006免疫学杂志(Journal of Immunology)176:346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(希尔德(Shields)等人，生物化学杂志(Journal ofBiological Chemistry),2001,276(9):6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(达尔夸(Dall'Acqua)等人，免疫学杂志(Journal of Immunology),2002,169:5171-5180；达尔夸等人，2006,生物化学杂志281:23514-23524)。参见美国专利第8,367,805号。
某些保守残基于IgG Fc(I253、H310、Q311、H433、N434)中的修饰(例如N434A变体(杨(Yeung)等人(2009)免疫学杂志(J.Immunol.)182:7663))已建议作为增加FcRn亲和力的方法，因此增加抗体在循环中的半衰期。(参见例如WO 98/023289)。包含M428L和N434S的组合Fc变体已显示增强FcRn结合和增强血清半衰期高达五倍。(查尔斯基(Zalevsky)等人(2010)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)28:157)。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体还延长IgG1抗体的半衰期。(匹特考瓦(Petkova)等人(2006)国际免疫学(Int.Immunol.)18:1759)。另外，包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M和M428L-N434S变体的组合Fc变体还已显示延长半衰期。(WO 2009/086320)。
此外，包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体增加半衰期近四倍。(达尔夸(Dall'Acqua)等人(2006)生物化学杂志281:23514)。提供增加的FcRn亲和力但减小的pH依赖性的相关IgG1修饰(M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F)已用于产生IgG1构筑体(“MST-HNAbdeg”)，所述构筑体是用作竞争者以阻止其它抗体结合至FcRn，从而导致增加其它抗体(内源性IgG(例如在自身免疫环境中)或另一外源性(治疗)mAb)的廓清率。(瓦卡诺(Vaccaro)等人(2005)自然生物技术23:1283；WO 2006/130834)。
用于增加FcRn结合的其它修饰是描述于杨(Yeung)等人(2010)免疫学杂志182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中。
在某些实施例中，可使用杂交IgG同型以增加FcRn结合，并潜在增加半衰期。例如，IgG1/IgG3杂交变体可通过以来自IgG3的位于其中两种同型不同的位置处的氨基酸取代CH2和/或CH3区的IgG1位置来构筑。因此，可构筑包含一或多个取代(例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F)的杂交变体IgG抗体。在本文描述的其它实施例中，IgG1/IgG2杂交变体可通过以来自IgG1的位于于其中两种同型不同的位置处的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构筑。因此，可构筑包含一或多个取代例如下列氨基酸取代中的一或多种：233E、234L、235L、–236G(是指于位置236处插入甘氨酸)和327A的杂交变体IgG抗体。参见美国专利第8,629,113号。IgG1/IgG2/IgG4序列的杂交已经产生，其据称增加血清半衰期并改善表达。美国专利第7,867,491号(其中序列编号18)。
本文描述的抗体的血清半衰期也可通过聚乙二醇化增加。抗体可经聚乙二醇化例如以增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，使所述抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)试剂(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在其中一或多个PEG基团变得结合至所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化是经由与反应性PEG分子(或相似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。如本文使用，术语“聚乙二醇”希望包含已用于衍生其它蛋白质的PEG形式中的任一种，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的抗体是非糖基化抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是为所属领域中已知且可应用于本文描述的抗体。(参见例如西村(Nishimura)等人的EP 0154316和石川(Ishikawa)等人的EP 0401384。
在一些实例中，可能需要减小抗体的半衰期，而非增加其半衰期。在一些实施例中，本文描述的抗体包括修饰以减小其半衰期。于人类IgG1的Fc中的例如I253A(霍尼克(Hornick)等人(2000)核医学杂志(J.Nucl.Med.)41:355)和H435A/R、I253A或H310A(金(Kim)等人(2000)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)29:2819)的修饰可减少FcRn结合，因此减小半衰期(增加廓清率)以用于其中快速廓清是优选的情况中，例如用于医学成像。(也参见肯诺瓦(Kenanova)等人(2005)癌症研究(Cancer Res.)65:622)。增强廓清率的其它方式包括将本发明的抗原结合域格式化为缺乏结合FcRn的能力的抗体片段(例如Fab片段)。这些修饰可例如减小抗体自几周至几小时的循环半衰期。抗体片段的选择性聚乙二醇化可然后任选地用于增加抗体片段的半衰期。(查普曼(Chapman)等人(1999)自然生物技术17:780)。抗体片段也可融合至人类血清白蛋白，例如在融合蛋白构筑体中，以增加半衰期。(耶(Yeh)等人(1992)美国国家科学院院刊89:1904)。或者，双特异性抗体可用本发明的第一抗原结合域和结合至人类血清白蛋白(HSA)的第二抗原结合域构筑。(参见WO 2009/127691和其中引用的专利参考文献)。或者，专门的多肽序列可添加至抗体片段以增加半衰期，例如“XTEN”多肽序列。(舍尔伦伯格(Schellenberger)等人(2009)自然生物技术27:1186；国际专利申请公开WO 2010/091122)。
额外Fc变体
在一些实施例中，当使用IgG4恒定域时，包括取代S228P可以是有利的，所述取代模拟IgG1中的铰链序列并借此稳定IgG4分子，例如通过减小所治疗病患中的治疗抗体与内源性IgG4之间的Fab臂交换。(拉布力(Labrijn)等人(2009)自然生物技术27:767；莱迪(Reddy)等人(2000)免疫学杂志164:1925)。
IgG1构筑体的铰链中的潜在蛋白酶裂解位点可由D221G和K222S修饰消除，从而增加抗体的稳定性。(WO 2014/043344)。
Fc变体对其配体(Fc受体)的亲和力和结合性质可通过所属领域中已知的各种活体外分析方法(例如基于生物化学或免疫学的分析)测定，所述方法包括(但不限于)平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或动力学(例如
Figure GDA0002365581830000501
SPR分析)和例如间接结合分析、竞争抑制分析、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱术(例如凝胶过滤)的其它方法。这些和其它方法可于检查中的组分中的一或多种上使用标记和/或采用各种检测方法，其包括(但不限于)显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可参见鲍尔W.E.(Paul,W.E.)编，基本免疫学(FundamentalImmunology)，第4版，力平考特-拉文(Lippincott-Raven),费城(Philadelphia)(1999)，其关注抗体-免疫原相互作用。
在又其它实施例中，抗体的糖基化是经修饰以增加或减少效应功能。例如，可通过使位置297(例如N297A)的保守天冬酰氨酸残基突变，因此废除补体和FcγRI结合而制得缺乏所有效应功能的非糖基化抗体。(博尔特(Bolt)等人(1993)欧洲免疫学杂志23:403。也参见陶(Tao)和莫里逊(Morrison)(1989)免疫学杂志143:2595(使用IgG1中的N297Q以消除位置297处的糖基化))。
尽管非糖基化抗体通常缺乏效应功能，但可引入突变以恢复所述功能。非糖基化抗体(例如彼等自N297A/C/D/或H突变产生或于不不使蛋白质糖基化的系统(例如大肠杆菌)中产生者)可经进一步突变以恢复FcγR结合，例如S298G和/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)或E382V和M428I(君格(Jung)等人(2010)美国国家科学院院刊107:604)。
糖工程化也可用于通过改变结合于Fc区的Asn297的糖链的α2,6唾液酸含量修饰IgG构筑体的抗炎性质，其中α2,6唾液酸化形式的增加比例导致增强的抗炎效应。(参见尼莫佳(Nimmerjahn)等人(2008)免疫学评述年鉴(Ann.Rev.Immunol.)26:513)。相反，具有α2,6唾液酸化糖的抗体的比例的减小可适用于其中无需抗炎性质的情况中。修饰抗体的α2,6唾液酸化含量的方法(例如通过选择性纯化α2,6唾液酸化形式或通过酶修饰)是提供于美国专利申请公开第2008/0206246号中。在其它实施例中，Fc区的氨基酸序列可经修饰以模拟α2,6唾液酸化的效应，例如，通过包括F241A修饰。(WO 2013/095966)。
III.抗体物理性质
在某些实施例中，本文描述的抗体于轻链或重链可变区中含有一或多个糖基化位点。这些糖基化位点可导致抗体的免疫原性增强或因抗原结合改变而改变抗体药物动力学(马歇尔(Marshall)等人(1972)生物化学评述年鉴(Ann.Rev.Biochem.)41:673-702；嘎纳(Gala)和莫里逊(Morrison)(2004)免疫学年鉴(J.Immunol.)172:5489-94；瓦力克(Wallick)等人(1988)实验与医学杂志(J.Exp.Med.)168:1099-109；斯匹罗(Spiro)(2002)糖生物学(Glycobiology)12:43R-56R；帕莱克(Parekh)等人(1985)自然316:452-7；米姆拉(Mimura)等人(2000)分子免疫学(Mol Immunol)37:697-706)。糖基化已知发生于含有N-X-S/T序列的基序处。在一些实施例中，抗huICOS抗体不含有可变区糖基化。这些抗体可通过选择可变区中不含有糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变获得。
在某些实施例中，本文描述的抗体不含有天冬酰氨酸异构位点。天冬酰氨酸的脱酰胺可发生于N-G或D-G序列上且导致产生异天冬氨酸残基，其将扭结引入多肽链内并降低其稳定性(被称为异天冬氨酸效应)。
在一些实施例中，本文描述的抗体具有介于6至9.5的pH范围内的等电点(pI)。在一些实施例中，本文描述的抗体具有7至9.5或6至8的pH范围内的pI。具有pI位于所需pI范围内的抗体可通过选择具有pI位于来自一组候选者的pH范围内的抗体或通过使特定抗体的带电表面残基突变获得。
在一些实施例中，本文描述的抗体是经选择和/或改造以具有大于60℃、大于65℃或大于70℃的初始解折叠的温度(TM1)。抗体的熔点可使用示差扫描量热法(陈(Chen)等人(2003)医药学研究(Pharm Res)20:1952-60；吉兰朵(Ghirlando)等人(1999)免疫学快报(Immunol Lett.)68:47-52)或圆偏光二色性(姆瑞(Murray)等人(2002)色谱科学杂志(J.Chromatogr.Sci.)40:343-9)测量。
在一些实施例中，本文描述的抗体是经选择和/或改造以具有有利降解性质，例如，活体外和/或活体内缓慢降解。抗体降解可使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(亚历山大(Alexander AJ)和休吉斯(Hughes D E)(1995)分析化学(Anal Chem.)67:3626-32)测量。在一些实施例中，本文描述的抗体是经选择和/或改造以具有有利聚集性质，例如，显示活体外和/或活体内最小聚集的抗体，其可引起非所需免疫反应和/或经改变或不利的药物动力学性质。在一些实施例中，相较于亲代抗体的聚集，本文描述的抗体显示25％或更小、20％或更小、15％或更小、10％或更小或5％或更小的聚集。聚集可通过数种技术测量，包括尺寸排阻管柱(SEC)、高效液相色谱术(HPLC)和光散射。
IV.核酸分子和重组方法
本文描述的另一方面涉及编码本文描述的抗huICOS抗体的核酸分子。核酸可存在于全细胞(例如宿主细胞)、细胞裂解物中或以部分纯化形式或大体上纯形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl条带化、管柱色谱术、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和所属领域中已知的其它技术)纯化自其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸(例如其它染色体DNA，例如，在自然中连接至经分离的DNA的染色体DNA)或蛋白质)时，核酸是“经分离”或“呈现大体上纯”。(参见F.奥苏贝尔(F.Ausubel)等人编，(1987)分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology),Greene Publishing and WileyInterscience,纽约(New York))。本文描述的核酸可以是例如DNA或RNA且可含有或不含有内含子。在某些实施例中，所述核酸是cDNA分子。
本文描述的核酸可使用标准分子生物学技术获得。就由融合瘤(例如如下文进一步描述的自携载人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制得的融合瘤)表达的抗体而言，编码通过融合瘤制得的抗体的轻链和/或重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。就自免疫球蛋白基因库(例如使用噬菌体呈现技术)获得的抗体而言，编码所述抗体的核酸可回收自所述库。
倘若获得编码VH和VL区段的DNA片段，则这些DNA片段可通过标准重组DNA技术进一步操作，例如，以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质(例如抗体恒定区或灵活性连接子)的另一DNA片段。如此上下文中使用的术语“可操作地连接”意指两个DNA片段是经连接使得由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框(in-frame)。
编码VH区的经分离的DNA可通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子而转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是为所属领域中已知(参见例如卡巴特等人，1991)，且包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如，IgG1区。就Fab片段重链基因而言，可将编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
编码VL区的经分离的DNA可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转化为全长轻链基因(和Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是为所属领域中已知(参见例如卡巴特等人，1991)免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第五版，美国健康与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公告第91-3242号)，且包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编码灵活性连接子(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得所述VH和VL序列可表达为连续单链蛋白，且VL和VH区由灵活性连接子连接(参见例如博德(Bird)等人(1988)科学242:423-426；修士顿(Huston)等人(1988)美国国家科学院院刊85:5879-5883；麦卡弗替(McCafferty)等人，(1990)自然348:552-554)。
V.抗体产生
本发明的各种抗体(例如结合至与本文公开的所选抗人类ICOS抗体相同的抗原决定基的那些抗体)可使用各种已知技术(例如考勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，自然256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术)产生。也可采用用于产生单克隆抗体的其它技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转型、使用人类抗体基因库的噬菌体呈现技术。
用于制备融合瘤的例示性动物系统是鼠科系统。于小鼠中产生融合瘤是业已建立的程序。用于分离经免疫脾脏细胞以用于融合的免疫方案和技术是为所属领域中已知。融合搭配物(例如鼠科骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知。
本文描述的嵌合或人源化抗体可基于如上文描述制备的鼠科单克隆抗体的序列制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可获自受关注的鼠科融合瘤且使用标准分子生物学技术改造以含有非鼠科(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可使用所属领域中已知的方法将鼠科可变区连接至人类恒定区(参见例如卡必莉(Cabilly)等人的美国专利第4,816,567号)。为产生人源化抗体，可使用所属领域中已知的方法将鼠科CDR区插入于人类框架内(参见例如温特的美国专利第5,225,539号和昆恩等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)。
在一个实施例中，本文描述的抗体是人类单克隆抗体。针对人类ICOS的这些人类单克隆抗体可使用携载人类免疫系统而非小鼠系统的一部分的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中被分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠且在本文中统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb
Figure GDA0002365581830000541
(Medarex有限公司)含有编码未经重排的人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因微型基因座，和灭活内源性μ和κ链基因座的靶向突变(参见例如隆伯格(Lonberg)等人(1994)自然368(6474):856-859)。因此，所述小鼠显示小鼠IgM或κ的减少的表达，并回应于免疫，经引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人类IgGκ单克隆抗体(隆伯格N.(Lonberg,N.)等人(1994)，同上；隆伯格,N.(1994)实验与医药学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)113:49-101；隆伯格,N.和修斯扎尔(Huszar,D.)(1995)国际免疫学评述(Intern.Rev.Immunol.)13:65-93和哈丁(Harding,F.)和隆伯格,N.(1995)纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)764:536-546中回顾)。HuMab小鼠的制备和用途和由这些小鼠携载的基因体修饰是进一步描述于泰勒L.(Taylor,L.)等人(1992)核酸研究(Nucleic AcidsResearch)20:6287-6295；陈(Chen,J.)等人(1993)国际免疫学(InternationalImmunology)5:647-656；泰伦(Tuaillon)等人(1993)美国国家科学院院刊90:3720-3724；曹(Choi)等人(1993)自然遗传学(Nature Genetics)4:117-123；陈,J.等人(1993)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:821-830；泰伦等人(1994)免疫学杂志(J.Immunol.)152:2912-2920；泰勒L.等人(1994)国际免疫学(International Immunology)6:579-591；和弗谢韦德(Fishwild,D.)等人(1996)自然生物技术(Nature Biotechnology)14:845-851中，所述文献的内容以全文引用的方式明确并入本文中。(也参见，全部为隆伯格和卡伊(Kay)的美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号和第5,770,429号；苏拉尼(Surani)等人的美国专利第5,545,807号；全部为隆伯格和卡伊的PCT公开第WO 92/03918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO 97/13852号、第WO 98/24884号和第WO99/45962号；和考曼(Korman)等人的PCT公开第WO 01/14424号)。
在某些实施例中，本文描述的抗体是使用于转基因和转染色体上携载人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如携载人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠)产生。这些小鼠(在本文中被称为“KM小鼠”)是详细描述于石田(Ishida)等人的PCT公开WO 02/43478中。
更进一步，表达人类免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在所属领域中是可获得的且可用于产生本文描述的抗huICOS抗体。例如，可使用被称为Xenomouse(Abgenix有限公司)的替代转基因系统；这些小鼠是描述例如于库奇尔拉帕替(Kucherlapati)等人的美国专利第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号和第6,162,963号中。
此外，表达人类免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在所属领域中是可获得的且可用于产生本文描述的抗ICOS抗体。例如，可使用携载人类重链转染色体和人类轻链转染色体两者的小鼠，其被称为“TC小鼠”；这些小鼠是描述于富冢(Tomizuka)等人(2000)美国国家科学院院刊97:722-727中。此外，携载人类重链和轻链转染色体的牛已描述于所属领域中(库鲁瓦(Kuroiwa)等人(2002)自然生物技术20:889-894)且可用于产生本文描述的抗huICOS抗体。
所属领域中描述用于产生人类抗体(例如人类抗huICOS抗体)的额外小鼠系统包括
Figure GDA0002365581830000551
小鼠(Regeneron制药公司)，其中内源性小鼠重链和轻链可变区已经由同源重组而经人类重链和轻链可变区(可操作地连接至内源性小鼠恒定区)置换，使得所述小鼠中产生嵌合抗体(人类V/小鼠C)，且然后接着使用标准重组DNA技术转化为完全人类抗体；和
Figure GDA0002365581830000552
小鼠(Merus制药公司)，其中所述小鼠含有未经重排的人类重链可变区但经单一重排的人类共同轻链可变区。这些小鼠和其用于产生抗体的用途描述于例如WO2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861和US 2012/0073004中。
本文描述的人类单克隆抗体也可使用用于筛选人类免疫球蛋白基因库的噬菌体呈现方法制备。用于分离人类抗体的这些噬菌体呈现方法在所属领域中业已建立。(参见例如拉德勒(Ladner)等人的美国专利第5,223,409号；第5,403,484号和第5,571,698号；多沃(Dower)等人的美国专利第5,427,908号和第5,580,717号；卡弗替(McCafferty)等人的美国专利第5,969,108号和第6,172,197号；和格瑞夫思(Griffiths)等人的美国专利第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号和第6,593,081号)。
本文描述的人类单克隆抗体也可使用患有重症综合性免疫缺陷(SCID)的小鼠加以制备，人类免疫细胞已重新组合于所述小鼠中，使得一经免疫即可产生人类抗体反应。这些小鼠描述于例如韦尔逊(Wilson)等人的美国专利第5,476,996号和第5,698,767号中。
免疫
为产生针对人类ICOS的完全人类抗体，含有人类免疫球蛋白基因的小鼠或转基因或转染色体小鼠(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)可用ICOS抗原和/或表达ICOS的细胞的纯化或富集制剂免疫，如针对其它抗原例如由隆伯格等人(1994)自然368(6474):856-859；非谢韦尔德(Fishwild)等人(1996)自然生物技术14:845-851和WO 98/24884描述。或者，小鼠可用编码人类ICOS的DNA免疫。优选地，所述小鼠首次输注时将为6至16周龄。例如，可使用重组人类ICOS抗原的纯化或富集制剂(例如5μg至50μg)以使小鼠腹膜内免疫。若使用ICOS抗原的纯化或富集制剂的免疫不产生抗体，则小鼠也可用表达ICOS的细胞(例如细胞系)免疫以促进免疫反应。
HuMAb转基因小鼠最初可用含于Ribi佐剂中的抗原经腹膜内或皮下(SC)免疫，接着每隔一周用含于Ribi佐剂中的抗原IP/SC免疫(总计多达10)。免疫反应可在免疫方案的过程期间以通过眼窝后出血获得的血浆样本进行监测。所述血浆可通过ELISA和FACS(如下文描述)筛选，且具有足够滴定量的抗ICOS人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。小鼠可用抗原静脉内加强免疫三天，然后处死并去除脾脏和淋巴结。针对各免疫可进行二至三次融合。对于各抗原，可使6至24只小鼠免疫。在一些实施例中，使用HCo7、HCo12和KM菌株。另外，HCo7和HCo12转基因两者均可一起培育成具有两种不同人类重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。
产生融合瘤，从而产生针对ICOS的单克隆抗体
为产生产生本文描述的单克隆抗体的融合瘤，来自经免疫小鼠的脾脏细胞和/或淋巴结细胞可经分离并融合至适当永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。所得融合瘤可针对抗原特异性抗体的产生进行筛选。例如，可使来自经免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单一细胞悬浮液融合至具有50％PEG的Sp2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC、CRL 1581)。细胞是以约2x 105接种于平底微量滴定盘中，接着在含有10％胎儿无性繁殖系血清、18％“653”改良性培养基、5％Origen(IGEN)、4mm L-谷酰氨酸、1mm丙酮酸钠、5mm HEPES、0.055mm 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma)的选择性培养基中培养两周。在约两周后，细胞可培养于其中HAT是经HT置换的培养基中。个别孔可然后通过ELISA针对人类单克隆IgM和IgG抗体进行筛选。倘若发生大量融合瘤生长，则培养基可通常在10至14天后进行观察。分泌抗体的融合瘤可经重新接种，再次筛选，且若仍对人类IgG呈阳性，则所述单克隆抗体通过有限稀释次克隆(subcloned)至少两次。稳定的传代无性繁殖系(subclone)可活体外培养以在用于表征的组织培养基中产生少量抗体。
就纯化单克隆抗体而言，所选融合瘤可在用于单克隆抗体纯化的两升旋转瓶中生长。上清液可经过滤和浓缩，然后以蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,新泽西州批斯卡塔维(Piscataway,N.J.))进行亲和色谱术。经溶析的IgG可通过凝胶电泳和高效液相色谱术检查以确保纯度。缓冲溶液可与PBS交换，且浓度可通过OD280使用1.43消光系数进行测定。单克隆抗体可等分并储存于-80℃下。
VI.抗体制造
产生转染瘤，从而产生针对ICOS的单克隆抗体
本发明的抗体(包括提供序列的特异性抗体和其它相关抗ICOS抗体两者)可于宿主细胞转染瘤中使用例如所属领域中众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(莫里逊S.(Morrison,S.)(1985)科学229:1202)产生。
例如，为表达抗体或其抗体片段，编码部分或全长轻链和重链的DNA可通过标准分子生物学技术(例如使用表达受关注的抗体的融合瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得，且DNA可插入表达载体内，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”意指将抗体基因拼接至载体内，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列经选择以与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入不同载体内或两种基因插入相同表达载体内。抗体基因通过标准方法插入表达载体内(例如拼接抗体基因片段和载体上的互补限制位点或若不存在限制位点，则平端拼接)。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同型的全长抗体基因，方式是通过将本文描述的抗体的轻链和重链可变区插入已编码所需同型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段和VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外或替代地，重组表达载体可编码信号肽，其促进自宿主细胞分泌抗体链。抗体链基因可被克隆至载体内，使得信号肽是同框连接至抗体链基因的胺基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源性信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，重组表达载体可携载调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调节序列”包括启动子、强化子和控制抗体链基因的转录或翻译的其它表达控制组件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列是描述例如于Goeddel(基因表达技术(Gene Expression Technology.)酶学方法(Methods in Enzymology)185,学术出版社(Academic Press),加州圣地亚哥(San Diego,CA)(1990))中。所述领域中的技术人员将知晓表达载体的设计(包括调节序列的选择)可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达程度的因素等等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中引导高程度的蛋白质表达的病毒组件，例如衍生自细胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或强化子。或者，可使用非病毒调节序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。更进一步，由来自不同来源的序列组成的调节组件，例如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子和人类T细胞白血病1型病毒的长末端重复序列(塔科贝Y.(Takebe,Y.)等人(1988)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8:466-472)的序列。
除抗体链基因和调节序列外，重组表达载体可携载额外序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制(例如复制的起源)的序列和可选择标志基因。可选择标志基因促进选拔出已引入载体的宿主细胞(参见例如全部为阿克塞尔(Axel)等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。例如，通常，可选择标志基因对已引入载体的宿主细胞赋予耐药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤。例示性可选择标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于使用氨甲喋呤选拔/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选拔)。
为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体是通过标准技术转染至宿主细胞内。术语“转染”的各种形式包含常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞内的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-聚葡糖转染和类似技术。尽管理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本文描述的抗体，但抗体在真核细胞(且最优选哺乳动物宿主细胞)中的表达是最优选的，因为这些真核细胞且特定地哺乳动物细胞相较于原核细胞更可能组装并分泌经适当折叠且具免疫活性的抗体。已有报告指出抗体基因的原核表达无法有效产生高产率的活性抗体(博斯M.A.(Boss,M.A.)和伍德C.R.(Wood,C.R.)(1985)当今免疫学(Immunology Today)6:12-13)。本发明的抗体也可在经乙二醇改造的酵母菌株中产生。(毕赤酵母(Pichia pastoris).李(Li)等人(2006)自然生物技术24:210)。
用于表达本文描述的重组抗体的例示性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于乌尔劳布(Urlaub)和蔡辛(Chasin),(1980)美国国家科学院院刊77:4216-4220中，使用二氢叶酸还原酶(DHFR)可选择标志，例如，如描述于R.J.考夫曼(R.J.Kaufman)和P.A.夏普(P.A.Sharp)(1982)分子生物学(Mol.Biol.)159:601-621)中，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特定地说，为与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一例示性表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体是通过将宿主细胞培养足以容许抗体于宿主细胞中表达或(更优选地)抗体分泌至让宿主细胞生长的培养基内的时间周期产生。抗体可使用标准蛋白质纯化方法回收自培养基。
本发明的抗体多肽链的N端和C端可因常见翻译后修饰而不同于预期序列。例如，C端赖氨酸残基通常自抗体重链失踪。(迪克(Dick)等人(2008)生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)100:1132)。治疗抗体的轻链和重链两者上的N端谷酰氨酸残基和在较小程度上谷氨酸残基常转化为焦谷氨酸残基。(迪克等人(2007)生物技术与生物工程97:544；刘(Liu)等人(2011)JBC 28611211；刘(Liu)等人(2011)生物化学杂志286:11211)。
本发明的各种促效剂抗huICOS抗体的氨基酸序列提供于序列表中，其汇总于表35中。就上文讨论的原因而言，C端赖氨酸不包括于序列表中针对重链或重链恒定域的许多序列中。然而，在一个替代实施例中，本发明的抗huICOS抗体的各重链和/或编码这些抗体或其重链或轻链的基因构筑体在重链的C端包括此额外赖氨酸残基。
VII.分析
可通过例如标准ELISA测试本文描述的抗体与ICOS的结合。例如，用含于PBS中的1至2μg/ml纯化ICOS涂覆微量滴定盘，和然后用含于PBS中的5％牛血清白蛋白阻断。在37℃下将抗体的稀释物(例如经ICOS免疫的小鼠的血浆的稀释物)添加至各孔中并培养1至2小时。在37℃下，所述盘用PBS/Tween清洗和然后用结合至辣根过氧化物酶(HRP)的二级试剂(例如对于人类抗体或另外具有人类重链恒定区的抗体，为山羊抗人类IgG Fc特异性多克隆试剂)培养1小时。清洗后，所述盘是用ABTS底物(Moss有限公司，产品：ABTS-1000)显影并通过分光亮度计在OD 415-495下分析。经免疫小鼠的血清然后由流动式细胞测量术针对结合至表达人类ICOS的细胞系，但不结合至不表达ICOS的对照细胞系进一步筛选。简单地说，抗ICOS抗体的结合是通过用抗ICOS抗体以1:20稀释培养表达ICOS的CHO细胞进行评估。清洗所述细胞且用经PE标记的抗人类IgG Ab检测结合。流动式细胞分析是使用FACScan流动式细胞测量术(Becton Dickinson,加州圣荷西(San Jose,CA))进行。优选地，开发最高滴定量的小鼠用于融合。若欲检测小鼠抗huICOS抗体，则可使用抗小鼠检测抗体进行相似实验。
可使用ELISA(例如如上文描述)以筛选抗体，并因此筛选产生与ICOS免疫原显示阳性反应性的抗体的融合瘤。产生优选以高亲和力结合至ICOS的抗体的融合瘤然后可次克隆并进一步表征。然后可选择保留亲代细胞反应性的各融合瘤的一个无性繁殖系(通过ELISA)用于制造细胞库，并用于抗体纯化。
为纯化抗ICOS抗体，所选融合瘤可在两升旋转瓶中生长以用于单克隆抗体纯化。可以过滤和浓缩上清液，然后以蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))进行亲和色谱术。经溶析的IgG可通过凝胶电泳和高效液相色谱术检查以确保纯度。缓冲溶液可交换成PBS，且浓度可通过OD280使用1.43消光系数进行测定。单克隆抗体可等分并储存于-80℃下。
为确定所选抗ICOS单克隆抗体是否结合至唯一抗原决定基，各抗体可使用市售试剂(Pierce,伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))生物素化。生物素化MAb结合可用链霉亲和素标记的探针检测。使用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究可使用如上文描述的经ICOS涂覆的ELISA盘进行。
为确定经纯化的抗体的同型，同型ELISA可使用对特定同型的抗体具特异性的试剂进行。例如，为确定人类单克隆抗体的同型，微量滴定盘的孔可在4℃下用1μg/ml抗人类免疫球蛋白涂覆整夜。在用1％BSA阻断后，使所述盘与1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或纯化的同型对照，在周围温度下反应一至两个小时。所述孔然后可与结合人类IgG1或人类IgM特异性碱性磷酸酶的探针反应。如上文描述显影并分析所述盘。
为测试单克隆抗体对表达ICOS的活细胞的结合，可使用流动式细胞测量术。简单地说，使表达膜结合的ICOS的细胞系(在标准生长条件下生长)在4℃下与含有0.1％BSA的PBS中所含的各种浓度单克隆抗体混合一小时。清洗后，使所述细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体在与初级抗体染色相同的条件下反应。所述样本可通过FACScan仪器使用光和侧向散射性质分析以门控单一细胞并测定经标记的抗体的结合。除流动式细胞测量术分析以外，可使用利用荧光显微镜术的替代分析，或可使用利用荧光显微镜术的替代分析替代流动式细胞测量术分析。细胞可如上文描述精确染色并通过荧光显微镜术检查。此方法容许个别细胞的可视化，但取决于抗原的密度，可具有减弱的灵敏度。
可通过蛋白质印迹转渍法进一步测试抗huICOS抗体与ICOS抗原的反应性。简单地说，可以制备表达ICOS的细胞的细胞提取物并经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离出的抗原转移至消化纤维膜，用20％小鼠血清阻断，并用待测试的单克隆抗体探测。IgG结合可使用抗IgG碱性磷酸酶检测并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma化学公司,密西根州圣路易斯(St.Louis,MO))显影。
用于分析各种抗ICOS抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括所属领域中已知的标准分析，例如，生物层干涉术(BLI)分析和使用
Figure GDA0002365581830000611
2000SPR仪器(Biacore AB,瑞典阿普萨拉(Uppsala,Sweden))的
Figure GDA0002365581830000612
SPR分析。
在一个实施例中，抗huICOS抗体特异性结合至人类ICOS的细胞外区。在一个实施例中，抗体结合至ICOS的细胞外域内的特定域(例如功能域)。在一个实施例中，抗huICOS抗体特异性结合至人类ICOS的细胞外区和食蟹猕猴ICOS的细胞外区。在一个实施例中，抗huICOS抗体以高亲和力结合至人类ICOS。
VIII.多特异性分子
在某些实施例中，本文描述的抗体可以是多特异性(例如双特异性或三特异性)分子。多特异性抗原结合分子(例如多特异性抗体)包含两个或多个抗原结合位点，各对不同抗原决定基具特异性。不同抗原决定基可以是相同或不同抗原的一部分。在一个实施例中，一个抗原结合位点对人类ICOS具特异性且另一个对不同抗原具特异性。在一个实施例中，如本文描述的抗huICOS抗体或其抗原结合片段是连接至另一抗原结合分子(例如具有不同结合特异性的另一肽或蛋白质(例如另一抗体或抗体片段或用于受体的配体))，以产生结合至至少两种不同结合位点或靶分子的双特异性分子。在一个实施例中，本文描述的抗体是多特异性分子，其经衍生或连接至超过一种其它抗原结合分子以产生结合至超过两个不同结合位点和/或靶分子。因此，本文提供包含针对ICOS的至少一个第一结合特异性和针对第二靶抗原决定基的第二结合特异性的双特异性分子。在本文描述的其中双特异性分子为多特异性的一个实施例中，所述分子可进一步包括第三结合特异性。
在一个实施例中，本文描述的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。所述抗体也可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段，例如如拉德勒(Ladner)等人的美国专利第4,946,778号中描述的Fv或单链构筑体，所述文献的内容是以引用的方式明确并入本文中。
尽管人类单克隆抗体是优选的，但本文描述的双特异性分子中可采用的其它抗体是鼠科、嵌合和人源化单克隆抗体。
本文描述的双特异性分子可通过使用所属领域中已知的方法结合成分结合特异性制备。例如，双特异性分子的各结合特异性可分别产生且然后彼此结合。当结合特异性是蛋白质或肽时，各种偶合剂或交联剂可用于共价结合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫乙酸盐(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸盐(SPDP)和环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲酯)(磺基-SMCC)(参见例如卡普斯基(Karpovsky)等人(1984)实验与医学杂志160:1686；刘(Liu)、MA等人(1985)美国国家科学院院刊82:8648)。其它方法包括鲍乐斯(Paulus)(1985)贝宁研究所(Behring Ins.Mitt.)第78期,118-132；布莱南(Brennan)等人(1985)科学229:81-83)和格伦列(Glennie)等人(1987)免疫学杂志139:2367-2375)中所述的那些方法。优选的结合剂是SATA和磺基-SMCC，均可获自Pierce化学有限公司(伊利诺伊州罗克福德)。
当结合特异性是抗体时，其可经由两条重链的C端铰链区的巯基键结合。在一个特别优选的实施例中，铰链区是在结合前经修饰以含有奇数个(优选一个)巯基残基。
或者，两种结合特异性皆可编码于相同载体中并表达和组装于相同宿主细胞中。此方法是特别适用于其中双特异性分子具有结合特异性的组合，例如(mAb x mAb)、(mAb xFab)、(Fab x F(ab')2)或(配体x Fab)融合蛋白。本文描述的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定子的单链分子或包含两个结合决定子的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；和美国专利第5,482,858号中。
双特异性分子与其特异性靶的结合可使用此领域公认的方法证实，例如使用ELISA、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生长抑制)或蛋白质印迹转渍法分析。这些分析中的每一者通常通过采用对受关注的复合物具特异性的经标记试剂(例如抗体)检测特别受关注的蛋白质-抗体复合物的存在。
IX.组合物
本发明进一步提供组合物(例如医药组合物)，其含有如本文描述的与医药上可接受的载剂一起调配的一或多种抗ICOS抗体或其抗原结合片段。因此，本发明的组合物包括人类或人源化抗huICOS抗体(或其抗原结合片段)，其具有表35中阐述的CDR序列、重链和/或轻链可变区序列或全长重链和/或轻链序列。本发明的组合物还包括序列为表35中阐述的序列的变体的抗huICOS抗体。例如，这些抗体可包含与表35中阐述的CDR序列、重链和/或轻链可变区序列或全长重链和/或轻链序列至少70％、75％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
这些组合物也可包括一种或(例如两种或多种不同)的本文描述的抗体或免疫结合物或双特异性分子的组合。例如，本文描述的医药组合物可包含结合至靶抗原上的不同抗原决定基或具有互补活性的抗体(或免疫结合物或双特异性抗体)的组合。
本文描述的医药组合物也可作为组合疗法(即，抗ICOS抗体与其它药剂的组合)投与。例如，所述组合疗法可包括本文描述的抗ICOS抗体与至少一种其它抗癌和/或T细胞刺激(例如活化)剂的组合。可用于组合疗法中的治疗剂的实例在下文中更详细地描述于本文所述的抗体的用途的部分中。
在一些实施例中，本文公开的医药组合物可包括用于治疗癌症的其它化合物、药物和/或药剂。这些化合物、药物和/或药剂可包括例如刺激针对给定癌症的免疫反应的化学治疗药物、小分子药物或抗体。在一些实施例中，医药组合物包含对抗huICOS具特异性的第一抗体和第二抗体。
在一些实施例中，第一抗体和第二抗体是以固定剂量(即，固定比率)存在于组合物中。在其它实施例中，此固定剂量是介于至少约1:200至至少约200:1、至少约1:150至至少约150:1、至少约1:100至至少约100:1、至少约1:75至至少约75:1、至少约1:50至至少约50:1、至少约1:25至至少约25:1、至少约1:10至至少约10:1、至少约1:5至至少约5:1、至少约1:4至至少约4:1、至少约1:3至至少约3:1或至少约1:2至至少约2:1mg抗huICOS抗体:mg第二抗体之间。在一些实施例中，所述固定剂量是至少约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:15、约1:20、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90、约1:100、约1:120、约1:140、约1:160、约1:180或约1:200抗huICOS抗体:第二抗体。在一些实施例中，所述固定剂量是至少约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约15:1、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约120:1、约140:1、约160:1、约180:1或约200:1mg第一抗体:mg第二抗体。例如，在一个实施例中，抗huICOS抗体和第二抗体是如实例18中描述投与。
额外抗体包括例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体、抗LAG-3抗体、抗CD73抗体、抗CD137抗体、抗CD27抗体或抗CSF-1R抗体中的一或多种。
如本文使用，“医药上可接受的载剂”包括生理上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂和类似物。在一些实施例中，所述载剂是适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮投与(例如通过注射或输注)。在一些实施例中，所述载剂是适用于静脉内投与。在其它实施例中，所述载剂适用于皮下投与。在一些实施例中，包含抗ICOS抗体的组合物是使用Halozyme的
Figure GDA0002365581830000631
药物递送技术(其包括临时降解透明质酸的重组人类玻尿酸酶酶(rHuPH20))皮下递送。在一些实施例中，所述
Figure GDA0002365581830000632
药物递送技术容许组合物的皮下投与，其相较于静脉内投与更快速。在其它实施例中，取决于投与途径，活性化合物(即，抗体、免疫结合物或双特异性分子)可涂覆于材料中以保护化合物免受可灭活所述化合物的酸和其它自然条件的作用。
本文描述的医药化合物可包括一或多种医药上可接受的盐。“医药上可接受的盐”是指保留亲代化合物的所需生物活性且不赋予任何非所需毒理学效应的盐(参见例如博格(Berge,S.M.)等人(1977)医药科学杂志(J.Pharm.Sci.)66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自非毒性无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸和类似物)的那些盐和衍生自非毒性有机酸(例如脂族单羧酸和二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸和类似物)的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙和类似物)的盐和衍生自非毒性有机胺(例如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因和类似物)的那些盐。
本文描述的医药组合物也可包括医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和类似物；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚和类似物；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本文描述的医药组合物中可采用的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和类似物)和其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当的流动性可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)；通过在分散液的情况下维持所需粒度；和通过使用表面活性剂维持。
这些组合物也可含有例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂的佐剂。防止微生物存在可通过灭菌程序(同上)和通过内含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸和类似物)确保。也可能需要在所述组合物中包括等张剂，例如糖、氯化钠和类似物。另外，可注射医药形式的延迟吸收可通过内含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现。
医药上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液和用于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。本文的例示性医药上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEXTM,Baxter国际有限公司)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开第2005/0260186和2006/0104968号中。在一个方面中，sHASEGP是与一或多种额外糖胺聚糖酶(例如硫酸软骨素酶)组合。
这些介质和药剂用于医药活性物质的用途为所属领域中已知。除任何常规介质或药剂是与活性化合物不相容以外，还预期其于本文描述的医药组合物中的用途。补充活性化合物也可并入所述组合物内。
治疗组合物在制造和储存的条件下通常必须为无菌且稳定的。组合物可调配成适合高药物浓度的溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇和类似物)和其合适混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)；通过在分散液的情况下维持所需粒度；和通过使用表面活性剂维持。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)实现。
无菌可注射溶液可通过任选地将所需量活性化合物并入适当溶剂与上文枚举的成分的一种或组合中，接着无菌微滤制备。通常，分散液是通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所述的那些所需其它成分的无菌载体内来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其使活性成分加任何额外所需成分的粉末从所述粉末的预先无菌过滤的溶液产生。
可与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于治疗中的个体和特定投药模式变化。可与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效应的组合物的量。在百分之百中，此量可在约0.01％至约99％活性成分的范围内变化，例如约0.1％至约70％，例如约1％至约30％活性成分与医药上可接受的载剂组合。
在一些实施例中，组合物包括10mg/mL浓度的抗ICOS抗体，例如ICOS.33 IgG1fS267E抗体。所述组合物是静脉内投与的无菌、非热原、一次性、不含防腐剂、等张水溶液。所述组合物可在输注前未经稀释或经0.9％氯化钠注射液进一步稀释至所需蛋白质浓度而投与。在一些实施例中，抗ICOS抗体包括下列赋形剂：L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐单水合物、蔗糖、喷替酸(pentetic acid)(也称为二亚乙基三胺五乙酸)、聚山梨醇酯80和注射用水。
调整给药方案以提供优化的所需反应(例如治疗反应)。例如，可投与单次推注，可随时间投与若干分次剂量或如由治疗情况的紧急程度指示可适当减少或增加剂量。将肠胃外组合物调配成剂量单位形式以便于投与和剂量均匀性是尤为有利的。如本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的个体的物理离散单元；各单元含有经计算以产生与所需医药载剂相关的所需治疗效应的既定量的活性化合物。用于本文描述的剂量单位形式的说明书由以下决定且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效应，和(b)组合此活性化合物用于治疗个体的敏感的领域中的固有限制。
就抗体的投与而言，剂量可在约0.0001至100mg/kg，和更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内变化。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg的范围内。或者，抗体的投与是可在2mg至800mg的范围内变化的平稳剂量，例如25mg、80mg、200mg或400mg的剂量。例示性治疗方案需要投与每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次。在一些实施例中，所述治疗方案包括初始剂量，和然后间歇剂量间隔下的不同剂量的维持剂量。
在一些实施例中，具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体同时投与，在所述情况下所投与的各抗体的剂量落于本文指示的范围内。在一些实施例中，所述治疗抗体是在多种场合下投与。单次剂量之间的间隔可以是例如每周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每年一次。间隔也可以是无规律的，如通过测量病患中针对靶抗原的抗体的血液浓度指示。在一些实施例中，可调整剂量以实现约1至1000μg/ml和在一些方法中约25至300μg/ml的血浆抗体浓度。
在一些实施例中，抗体可作为缓释调配物投与。经由缓释调配物的投与可能更无需频繁投与。剂量和频率取决于抗体于病患中的半衰期而变化。投药剂量和频率可取决于治疗为预防性抑或治疗性而变化。在预防性施用中，相对较低剂量是在较长时间周期内以相对不频繁的时间间隔投与。一些病患在其余生中继续接受治疗。在一些实施例中，针对治疗性治疗以相对较短时间间隔投与相对较高剂量。在一些实施例中，投与相对较高剂量直至疾病的进展减小或终止，例如，直至病患显示疾病的症状的部分或完全改善。在一些实施例中，预防性治疗是在治疗性治疗后投与病患。
本文描述的医药组合物中的活性成分的实际剂量程度可变化以便于可有效使特定病患、组合物和投与模式实现所需治疗反应且对病患无毒的活性成分的量。所选剂量程度将取决于各种药物动力学因素，其包括本文描述采用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、投与途径、投与时间、所采用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、治疗中的病患的年龄、性别、体重、病症、健康情况和既往病史和医药领域中众所周知的类似因素。
本文描述的抗ICOS抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重性的降低、无疾病症状周期的频率和持续时间的增加或对因疾病折磨引起的损伤或残疾的预防。在癌症的上下文中，治疗有效剂量优选预防与癌症相关的身体症状的进一步恶化。癌症症状在所属领域中众所周知且包括例如不寻常的痣特征、痣外观的变化(包括不对称性、边界、颜色和/或直径)、新染色的皮肤区、异常痣、指甲下变暗区、乳房肿块、乳头变化、乳房囊肿、乳房疼痛、死亡、体重减轻、虚弱、过度疲劳、进食困难、食欲不振、慢性咳嗽、日益恶化的呼吸困难、咳血、尿血、便血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹部胀满、鼓胀、腹腔积液、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、呕吐血、大量出汗、发烧、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、畏寒、肌肉筋挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移和胰脏转移、吞咽困难等。治疗功效可在第一次投与本发明的促效性抗huICOS单克隆抗体后立即观测到，或治疗功效仅在一段时间周期和/或一系列剂量后可观测到。这些延迟的功效可仅在治疗数月(例如长达6、9或12个月)之后可观测到。
治疗有效剂量可预防或延迟癌症的发病，例如当疾病的早期或初步体征存在时可为理想的。因此，监测前述中的任一种的任何临床或生物化学分析可用于判定特定治疗是否为用于治疗癌症的治疗有效剂量。一般技术人员基于例如个体的体型、个体症状的严重性和所选的特定组合物或投与途径的因素将可确定这些量。
本文描述的组合物可经由一或多种投与途径使用所属领域中已知的各种方法中的一或多种进行投与。如本领域技术人员将知晓，投与途径和/或模式将取决于所需结果而变化。用于本文描述的抗体的例示性投与途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它肠胃外投与途径，例如通过注射或输注。
或者，本文描述的抗体可经由非注射途径投与，例如局部、表皮或粘膜投与途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部投与。
活性化合物可与将保护化合物免于快速释放的载剂一起制备，例如控释调配物，包括移植物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些调配物的许多方法是专利的或通常为所述领域中的技术人员已知的。参见例如持续与控制释放的药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems),J.R.罗宾逊(J.R.Robinson)编，Marcel Dekker有限公司,纽约(New York),1978。
治疗组合物可用所属领域中已知的医学器件投与。例如，在一优选实施例中，本文描述的治疗组合物可用无针皮下注射器件投与，例如美国专利第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号或第4,596,556号中公开的器件。用于与本文描述的抗huICOS抗体一起使用的众所周知的移植物和模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，其公开用于以受控速率分配药物的可移植微型输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开用于透过皮肤投与药物的治疗器件；美国专利第4,447,233号，其公开用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开用于持续递送药物的可变流量可移植输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开具有多室隔室的渗透性药物递送系统；和美国专利第4,475,196号，其公开渗透性药物递送系统。这些专利是以引用的方式并入本文中。许多其它这些移植物、递送系统和模块为所述领域中的技术人员已知。
在某些实施例中，本文描述的抗huICOS抗体可经调配以确保适当的活体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为确保本文描述的治疗化合物跨越BBB(视需要)，其可在例如脂质体中调配。就制造脂质体的方法而言，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一或多个部分，其选择性运输至特定细胞或器官内，因此增强靶向药物递送(参见例如拉纳德(V.V.Ranade)(1989)临床医药杂志(J.Clin.Pharmacol.)29:685)。例示性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见例如罗伊(Low)等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(乌米扎瓦(Umezawa)等人，(1988)生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)153:1038)；抗体(P.G.博罗曼(P.G.Bloeman)等人(1995)FEBS快报(FEBS Lett.)357:140；M.奥瓦斯(M.Owais)等人(1995)抗微生物剂与化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)39:180)；表面活性剂蛋白A受体(布里斯考(Briscoe)等人(1995)美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)1233:134)；p120(施瑞尔(Schreier)等人(1994)生物化学杂志269:9090)；也参见K.肯纳伦(K.Keinanen)；M.L.劳卡伦(M.L.Laukkanen)(1994)FEBS快报346:123；J.J.吉尔那恩(J.J.Killion)；I.J.非德勒(I.J.Fidler)(1994)免疫方法(Immunomethods)4:273。
包含本文描述的抗体组合物(例如人类抗体、双特异性或多特异性分子或免疫结合物)的试剂盒和使用说明书也在本文描述的范围内。所述试剂盒可进一步含有至少一种额外试剂或本文描述的一或多种额外人类抗体。试剂盒可包括指示所述试剂盒的内容物的预期用途的标签。术语标签包括提供于所述试剂盒上或与所述试剂盒一起提供的任何书写或记录材料，或以其它方式随附于所述试剂盒的任何书写或记录材料。
X.使用方法
本文描述的抗体、抗体组合物和方法具有许多活体外和活体内用途，其涉及例如通过刺激ICOS信号传导增强免疫反应。在一个实施例中，本文描述的抗体是单克隆人类或人源化抗体。在一个实施例中，本文描述的抗huICOS抗体(例如ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644)可以活体外或离体投与培养的细胞中，或投与人类个体以增强各种疾病的免疫力。在一个特定实施例中，抗huICOS抗体促效性抗体(即，促效剂抗huICOS抗体)。本文提供修饰个体的免疫反应的方法，其包括向所述个体投与本文描述的抗体或其抗原结合片段使得所述个体的免疫反应经受增强、刺激或上调。在一个实施例中，根据本文描述的方法投与抗huICOS抗体(即，促效剂抗huICOS抗体)增强T细胞反应的共刺激。在一个实施例中，根据本文描述的方法投与抗huICOS抗体会刺激、增强或上调对肿瘤的抗原特异性T细胞反应。肿瘤可以是实体瘤或液体肿瘤，例如血液恶性肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施例中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施例中，肿瘤是PD-L1阴性的。个体也可以是携载病毒的个体且针对病毒的免疫反应是经增强。在一个实施例中，根据本文描述的方法投与抗huICOS抗体会刺激、增强或上调CD4+和CD8+ T细胞反应。T细胞可以是Teff细胞，例如CD4+ Teff细胞、CD8+ Teff细胞、T辅助(Th)细胞和T细胞毒性(Tc)细胞。
在一个实施例中，所述方法引起人类个体的免疫反应的增强，其中此增强具有所需效应。在一个实施例中，所述人类个体是患有可通过增加免疫反应(例如T细胞介导的免疫反应)治疗的失调症的人类病患。在一个特定实施例中，所述人类病患患有癌症。在一个实施例中，本文描述的抗huICOS抗体可与受关注的抗原一起投与或所述抗原可已存在于待治疗的个体(例如携载肿瘤或携载病毒的个体)中。当针对ICOS的抗体与另一药剂一起投与时，两者可分开或同时投与。
进一步提供用于抑制个体的肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述个体投与本文描述的抗huICOS抗体，使得所述个体中的肿瘤细胞的生长被抑制。本发明还提供治疗个体的慢性病毒感染的方法，其包括向所述个体投与本文描述的抗huICOS抗体，使得所述个体的慢性病毒感染经受治疗。
在一些实施例中，抗huICOS促效剂抗体是作为辅助疗法、佐剂疗法或新佐剂疗法投与个体(例如人类病患)。在一些实施例中，相对于目前护理标准，用抗huICOS抗体治疗患有癌症的个体可引起长期持久的反应；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年的长期存活，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多年的无复发存活。在某些实施例中，用抗huICOS抗体治疗患有癌症的个体预防癌症复发或延迟癌症复发达例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多年。抗ICOS治疗可用作一线、二线或后续线治疗。
本文描述的这些和其它方法是于下文中进一步详细讨论。
癌症
本文提供用于治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体投与本文描述的抗huICOS抗体，使得所述个体经受治疗，例如使得癌性肿瘤的生长被抑制或减少和/或所述肿瘤恢复。抗huICOS抗体可单独用于抑制癌性肿瘤的生长。或者，如下文描述，抗huICOS抗体可结合其它药剂(例如其它免疫原性剂)、标准癌症疗法或其它抗体一起使用。本发明还提供与PD-1抑制剂(例如抗PD-1或抗PD-L1抗体)的组合。本发明还提供与CTLA-4抑制剂(例如抗CTLA-4抗体)的组合。本发明还提供与PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂的组合。
在一个方面中，本文提供治疗个体的癌症的方法，其包括向所述个体投与治疗有效量的本文所述抗huICOS抗体，例如仓鼠抗ICOS抗体或其抗原结合片段的人源化形式。在一个实施例中，抗huICOS抗体可以是嵌合抗体、人类抗体或人源化抗huICOS抗体，例如，本文描述的人源化抗huICOS抗体中的任一种。在一个实施例中，治疗本文描述的癌症的方法包括投与人源化抗huICOS抗体，其于人类ICOS蛋白的SEQ ID NO:203的一或多个氨基酸残基处接触人类ICOS。在另一实施例中，所述方法包括投与ICOS.33IgG1f S267E抗体。在另一实施例中，所述方法包括投与包含ICOS.33 IgG1f S267E抗体的组合物。
癌症的实例包括(但不限于)鳞状细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰脏癌、胶质母细胞瘤(胶质母细胞瘤多形性细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌和头颈癌症(或癌)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤，例如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状旁腺的癌症、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌(包括脑干神经胶质瘤)、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的癌症)、病毒相关的癌症(例如与人乳头瘤病毒(HPV)相关的肿瘤)和衍生自两种主要血细胞谱系(即，骨髓细胞系(其产生颗粒细胞、红血球、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))中的任一种的血液恶性肿瘤，例如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化的AML(M0)、成髓细胞性白血病(M1)、成髓细胞性白血病(M2；具有细胞成熟)、早幼粒细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核球性白血病(M4或具有嗜酸性粒细胞增多的M4变体[M4E])、单核球性白血病(M5)、红血球性白血病(M6)、巨核细胞性白血病(M7)、孤立性粒细胞肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、与粘膜相关的淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞瘤；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖性失调症、真性组织细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系的造血细胞肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样霉菌病或塞扎里症候群)和淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)伴瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、阴燃骨髓瘤(也称为无痛性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎瘤、中枢和外周神经的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤和其它肿瘤，包括黑色素瘤、色素性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤、淋巴谱系的造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括(但不限于)T细胞失调症，例如T幼淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑细胞类型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选T细胞类型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞性子类型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓性淋巴瘤和所述癌症的任何组合。在一个实施例中，本文描述的方法也可用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如先前免疫疗法难以治疗的癌症，例如用阻断CTLA-4和/或PD-1抗体)和复发性癌症。
在一个实施例中，抗huICOS抗体可作为单一疗法投与。在一个实施例中，抗huICOS促效剂抗体作为单独的免疫刺激剂投与。在一个实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体与另一药剂一起投与病患。在一个实施例中，抗huICOS抗体与免疫原性剂一起投与。在一个实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体结合癌症疫苗投与。在一些实施例中，所述癌症疫苗包含癌细胞、经纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(海伊(He)等人(2004)免疫学杂志173:4919-28)。在一些实施例中，所述癌症疫苗是肽癌症疫苗，其在一些实施例中是个性化肽疫苗。在一些实施例中，所述肽癌症疫苗是多价长肽、多重肽、肽混合物、杂交肽或经肽冲击的树突细胞疫苗(参见例如山田(Yamada)等人，癌症科学(Cancer Sci),104:14-21,2013)。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合佐剂投与。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，例如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。已发明用于抗肿瘤的疫苗接种的许多实验策略(参见罗森堡S.(Rosenberg,S.),2000,癌症疫苗的开发(Development of Cancer Vaccines),ASCO教学书(ASCOEducational Book)Spring:60-62；劳格赛替斯C.(Logothetis,C.),2000,ASCO教学书Spring:300-302；卡雅特D.(Khayat,D.)2000,ASCO教学书Spring:414-428；弗恩K.(Foon,K.)2000,ASCO教学书Spring:730-738；也参见莱斯替弗N.(Restifo,N.)和斯诺M.(Sznol,M.),癌症疫苗(Cancer Vaccines),第61章，第3023至3043页，戴维他(DeVita)等人(编),1997,癌症：肿瘤学原理与实践(Cancer:Principles and Practice of Oncology)，第五版)。在这些策略的任一种中，疫苗是使用自体同源或同种异体肿瘤细胞制备。这些细胞疫苗已显示当肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。GM-CSF已显示是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效活化剂。德拉诺夫(Dranoff)等人(1993)美国国家科学院院刊90:3539-43。
其它癌症疫苗可包括来自涉及人类癌症的病毒(例如人类乳头状瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV))的蛋白质。可结合ICOS抑制使用的肿瘤特异性抗原的另一形式是从肿瘤组织自身分离的纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质的片段且这些HSP在递送抗原呈递细胞以诱发肿瘤免疫力时是高度有效的(索特(Suot)和斯瑞瓦斯塔瓦(Srivastava)(1995)科学269:1585-1588；塔姆拉(Tamura)等人(1997)科学278:117-120)。
树突细胞是可用于引起抗原特异性反应的有效抗原呈递细胞。树突细胞可离体产生并装载各种蛋白质和肽抗原和肿瘤细胞提取物(莱索(Nestle)等人(1998)自然医学(Nature Medicine)4:328-332)。树突细胞也可通过基因方式转导还以表达这些肿瘤抗原。出于免疫的目的，DC还已经直接融合至肿瘤细胞(库哥勒(Kugler)等人(2000)自然医学6:332-336)。作为免疫的方法，树突细胞免疫可与ICOS促效作用有效组合以活化(释放)更有效的抗肿瘤反应。
在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体是结合护理标准(例如手术、放射和/或化学疗法)投与。在一些实施例中，抗ICOS抗体可结合化学治疗剂投与。在一些实施例中，抗ICOS抗体是结合卡铂、顺铂、紫杉醇、纳他紫杉醇(nab-paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)或FOLFOX中的一或多种投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合卡铂或纳他紫杉醇投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合卡铂和紫杉醇投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合顺铂和培美曲唑(pemetrexed)投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合顺铂和吉西他滨投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合FOLFOX投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合FOLFIRI投与。在一个实施例中，抗huICOS抗体与用于治疗黑色素瘤的达喀尔巴嗪(decarbazine)组合投与。在一些实施例中，顺铂是以100mg/ml剂量每四周一次静脉内投与。在一些实施例中，抗人类ICOS促效剂抗体可结合阿霉素(doxorubicin)(亚德里亚霉素(adriamycin))、顺铂博来霉素硫酸盐(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达喀尔巴嗪和/或环磷酰胺羟基脲投与。在一些实施例中，亚德里亚霉素是以60mg/ml至75mg/ml剂量每21天一次静脉内投与。在一个实施例中，抗huICOS抗体投与对至少一种药物治疗具有耐受性的人类病患，其中抗huICOS抗体的投与减小、减轻或消除对所述至少一种药物的耐受性。
上文指示的组合疗法包含组合投与(其中两种或多种治疗剂是包括于相同或单独调配物中)和分开投与，在所述情况下，本发明抗体的投与可在额外治疗剂和/或佐剂的投与之前、同时和/或之后发生。本发明的抗体也可与放射疗法组合使用。
此组合的另一实例是抗huICOS抗体与白介素-2(IL-2)的组合。在一些实施例中，抗huICOS抗体和IL-2的组合用于治疗各种癌症，包括用于治疗肾细胞癌和黑色素瘤。在一些实施例中，本文讨论的抗huICOS抗体与IL-2通路促效剂组合以治疗各种癌症。所述组合包括各种IL-2通路促效剂，例如WO 2012/065086(Nektar Therapeutics)和WO 2015/125159(Nektar Therapeutics)中所述的那些促效剂，其内容是以全文引用的方式并入本文中。WO 2006/138572(Nektar Therapeutics)提供具有可降解键联的结合物和适用于制备这些结合物的聚合试剂，和制造这些聚合试剂和结合物的方法且以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，将如本文描述的抗huICOS抗体(例如ICOS.33 IgG1 S267E)和IL-2通路促效剂(例如NKTR-214)组合投与病患以治疗癌症。如下文中更详细描述，NKTR-214是通过使具有下列结构的基于平均约六个FMOC(茀基甲氧基羰基氯)的聚乙二醇(PEG)试剂(mPEG2-C2-fomc-20K-N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物，20kDa，(“mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS”)：
Figure GDA0002365581830000741
与具有下列132-氨基酸序列的蛋白质结合而产生：
PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEE 60
ELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRW 120
ITFSQSIISTLT 132(SEQ ID NO:219)
WO 2012/065086提供IL-2部分和一或多种非肽、水溶性聚合物的(包括聚乙二醇或其衍生物)结合物。具体地说，WO 2012/065086的实例2(第202至204段)描述rIL-2与mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS的聚乙二醇化以产生上文阐述的mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS结构。WO2015/125159的实例1(第63至66段)描述以mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS使IL-2聚乙二醇化以产生RSLAIL-2(NKTR-214)的放大方法。NKTR-214是细胞因子，其经设计以靶向CD122(也称为白介素-2受体β亚单元，IL-2Rβ)(于某些免疫细胞(例如CD8+ T细胞和NK细胞)上发现的蛋白质)，以扩增这些细胞以促进其抗肿瘤效应。
在一些实施例中，抗huICOS抗体可与抗血管生成剂组合投与。
通过细胞死亡可导致与ICOS促效作用的协同作用的其它组合疗法是放射、手术和激素剥夺。
在一些实施例中，本文描述的抗huICOS抗体可结合双特异性抗体投与。双特异性抗体可用于靶向两种不同抗原。在一个实施例中，抗huICOS抗体是与使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利第5,922,845和5,837,243号)。例如，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体已用于将巨噬细胞靶向肿瘤的位点。在一个实施例中，这些反应的T细胞臂是通过抗huICOS抗体促效ICOS而增强。或者，抗原可通过使用结合至肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标志物的双特异性抗体直接递送至DC。在一些实施例中，抗huICOS抗体是与减少或灭活由肿瘤表达的免疫抑制蛋白的抗体(例如抗TGF-β抗体、抗IL-10抗体和抗Fas配体抗体)组合使用。
慢性病毒感染
在另一方面中，本文描述的本发明提供治疗个体的传染病的方法，其包括向所述个体投与抗huICOS抗体或其抗原结合片段，使得所述个体的传染病经受治疗。
与其施用于如上文讨论的肿瘤类似，抗体介导的ICOS促效作用可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用于增强对病原体、毒素和自身抗原的免疫反应。特别适用此治疗方法的病原体的实例包括其中当前无有效疫苗的病原体或其中常规疫苗不完全有效的病原体。这些包括(但不限于)HIV、肝炎(A、B和C)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫(Giardia)、疟疾(Malaria)、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。ICOS促效作用针对既定感染通过例如在感染过程中呈现经改变的抗原的人类免疫缺陷病毒(HIV)的药剂是特别有用的。这些新颖抗原决定基在抗人类ICOS抗体投与时被识别为外来物，因此刺激强烈的T细胞反应。
引起通过本文描述的方法可治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒(EpsteinBarr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒(flaviviruses)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、革登热病毒、乳头瘤病毒、软件动物病毒、小儿麻痹病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒。
引起通过本文描述的方法可治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分支桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、瘟疫(plague)、钩端螺旋体病(leptospirosis)和莱姆病细菌(Lyme disease bacteria)。
引起通过本文描述的方法可治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌属(白色念珠菌(albicans)、克鲁丝酵母(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉菌(niger)等)、毛霉菌目(毛霉菌(mucor)、犁头霉菌(absidia)、根霉菌(rhizopus))、孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起通过本文描述的方法可治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠杆菌(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴氏锥虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
本文描述的向个体投与抗huICOS抗体的方法可与例如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF,IL-2)或双特异性抗体疗法的免疫疗法的其它形式组合。
组合疗法
在一个方面中，本文提供组合疗法例如以用于治疗癌症的方法，其中抗huICOS抗体(例如促效剂抗huICOS抗体)结合可有效刺激免疫反应的一或多种额外药剂(例如抗体)投与，借此进一步增强、刺激或上调个体的免疫反应。本文提供用于治疗或延迟个体的癌症进展的方法，其包括向所述个体投与抗huICOS抗体(例如ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644)与另一抗癌剂或癌症疗法的结合。在一些实施例中，抗huICOS抗体可结合化学疗法或化学治疗剂或与放射疗法或放射治疗剂一起投与，如上文描述。在一些实施例中，抗huICOS抗体可结合投与。在一些实施例中，抗huICOS抗体可结合靶向疗法或靶向治疗剂投与。在一些实施例中，抗huICOS抗体可结合免疫疗法或免疫治疗剂(例如单克隆抗体)投与。
在一些实施例中，本文描述的抗huICOS抗体可与以下组合：(i)另一共刺激受体的促效剂和/或(ii)T细胞上的抑制信号的促效剂。在一些实施例中，包含抗huICOS抗体和促效剂和/或拮抗剂的组合疗法在个体中引起增强的抗原特异性T细胞反应。在一些实施例中，本文描述的抗ICOS抗体可结合靶向作为免疫球蛋白超家族(IgSF)成员的共刺激和共抑制分子以增强免疫反应的药剂投与。在一些实施例中，本文描述的抗ICOS抗体(例如ICOS.33 IgG1f S267E、17C4、9D5、3E8、1D7和2644)可结合靶向共刺激或共抑制分子的配体的药剂投与。结合至共刺激或共抑制受体的膜结合配体的家族是B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6。结合至共刺激或共抑制受体的膜结合配体的另一家族是结合至同源TNF受体家族成员的分子的TNF家族，其包括CD40、CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。
在另一方面中，抗huICOS抗体可与抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；其它“免疫抑制细胞因子”)或刺激T细胞活化的细胞因子(用于刺激免疫反应)的拮抗剂组合使用，例如用于治疗增殖性疾病(例如癌症)。
在一个方面中，T细胞反應是由本文描述的抗huICOS抗体和以下中的一或多种的组合刺激：(i)抑制T细胞活化的蛋白质(例如免疫检查点抑制剂)(例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4)的拮抗剂，和(ii)刺激T细胞活化的蛋白质(例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD40、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、DR3和CD28H)的促效剂。
调节上文的蛋白质中的任一种且可与促效剂抗huICOS抗体(例如本文描述的那些抗体)组合以用于治疗癌症的例示性药剂包括：
Figure GDA0002365581830000771
/伊匹单抗或替西木单抗(针对CTLA-4)、加利昔单抗(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、皮地珠单抗/CT-011(针对PD-1)、
Figure GDA0002365581830000772
/派姆单抗/MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、CP-870893或达西珠单抗/SGN-40(CD40-克科伍德(Kirkwood)等人(2012)临床医师癌症杂志(CA Cancer J.Clin.)62:309；凡德雷得(Vanderheide)和格伦列(Glennie)(2013)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)19:1035)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3-WO 11/109400)、IMP321(针对LAG-3)、乌瑞鲁单抗/BMS-663513和PF-05082566(针对CD137/4-1BB)、万利鲁单抗/CDX-1127(针对CD27)、MEDI-6383和MEDI-6469(针对OX40)、RG-7888(针对OX40L-WO 06/029879)、阿塞西普(针对TACI)、莫罗单抗-CD3(针对CD3)、易普利单抗(针对CTLA-4)。因此，在一个实施例中，抗huICOS抗体(例如ICOS.33 IgG1f S267E)是与抗PD-1抗体(例如纳武单抗)和/或抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)组合。
可与促效剂抗huICOS抗体组合以治疗癌症的其它分子包括NK细胞上的抑制受体的拮抗剂或NK细胞上的活化受体的促效剂。例如，促效剂抗huICOS抗体可与KIR的拮抗剂(例如利丽单抗)组合。
用于组合疗法的又其它药剂包括抑制或耗尽巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括(但不限于)CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，其包括RG7155(WO 11/70024、WO 11/107553、WO 11/131407、WO 13/87699、WO 13/119716、WO 13/132044)或FPA-008(WO 11/140249；WO 13/169264；WO 14/036357)。
在一些实施例中，本文描述的促效剂抗huICOS抗体是与以下中的一或多种一起使用：拼接结合阳性共刺激受体的促效剂、减弱透过抑制受体的信号传导的阻断剂、和全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的一或多种药剂、克服肿瘤微环境内的独特免疫抑制途径的药剂(例如阻断抑制受体参与(例如PD-L1/PD-1相互作用)、耗尽或抑制Treg(例如使用抗CD25单克隆抗体(例如达克珠单抗)或通过离体抗CD25珠耗尽)、抑制例如IDO的代谢酶或逆转/防止T细胞无效或耗尽)和于肿瘤位点触发先天免疫活化和/或发炎的药剂。
本文提供用于刺激个体的免疫反应的方法，其包括向所述个体投与ICOS促效剂(例如抗体)和一或多种额外免疫刺激性抗体(例如PD-1拮抗剂，例如，拮抗剂抗体；PD-L1拮抗剂，例如，拮抗剂抗体；CTLA-4拮抗剂，例如，拮抗剂抗体；和/或LAG3拮抗剂，例如，拮抗剂抗体；使得所述个体中的免疫反应经受刺激，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒反应。在一个实施例中，所述个体是经投与促效剂抗huICOS抗体和拮抗剂抗PD-1抗体。在一个实施例中，所述个体是经投与促效剂抗huICOS抗体和拮抗剂抗PD-L1抗体。在一个实施例中，所述个体是经投与促效剂抗huICOS抗体和拮抗剂抗CTLA-4抗体。在一个实施例中，至少一种额外免疫刺激抗体(例如拮抗剂抗PD-1、拮抗剂抗PD-L1、拮抗剂抗CTLA-4和/或拮抗剂抗LAG3抗体)是人类抗体。或者，至少一种额外免疫刺激抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(例如由小鼠或仓鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4和/或抗LAG3抗体制备)。
本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和拮抗剂PD-1抗体。在一些实施例中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)或结肠直肠癌(CRC)。在一些实施例中，所述癌症的特征是具有以下的肿瘤：(i)CD32A/CD32B(FcγRIIa/Fcγ)的高表达；和/或(ii-a)ICOS的高表达或(ii-b)ICOS-L的减少的表达，例如如通过流动式细胞测量术或免疫组织化学(IHC)检测。具有中度至高度ICOS RNA表达的肿瘤类型包括头颈癌、肺癌、子宫颈癌、肾癌、胰脏癌、乳癌和结肠直肠癌，表明这些癌症也可显示高ICOS蛋白表达。在某些实施例中，促效剂是以亚治疗剂量投与，抗PD-1抗体是以亚治疗剂量投与，或两者均以亚治疗剂量投与。本文还提供用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法。在一个实施例中，所述方法包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述个体是人类。在一些实施例中，抗PD-1抗体是人类单克隆抗体和促效剂抗huICOS抗体是人源化单克隆抗体，例如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。
所属领域中已知的抗PD-1抗体可用于本文描述的方法中。以高亲和力特异性结合至PD-1的各种人类单克隆抗体已公开于美国专利第8,008,449号中。美国专利第8,008,449号中公开的抗PD-1人类抗体已证实显示下列特性中的一或多种：(a)如通过表面等离子体共振使用Biacore生物传感器系统测定，以1x 10-7M或以下的KD结合至人类PD-1；(b)非大体上结合至人类CD28、CTLA-4或ICOS；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中，增加T细胞增殖；(d)在MLR分析中，增加干扰素-γ产生；(e)在MLR分析中，增加IL-2分泌；(f)结合至人类PD-1和食蟹猕猴PD-1；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性记忆反应；(i)刺激抗体反应；和(j)活体内抑制肿瘤细胞生长。可用于本发明中的抗PD-1抗体包括特异性结合至人类PD-1并显示前述特性中的至少一种(在一些实施例中，至少五种)的单克隆抗体。
其它抗PD-1单克隆抗体已描述例如于美国专利第6,808,710、7,488,802、8,168,757和8,354,509号、US公开第2016/0272708号和PCT公开第WO 2012/145493、WO 2008/156712、WO 2015/112900、WO 2012/145493、WO 2015/112800、WO 2014/206107、WO 2015/35606、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2017/020291、WO 2017/020858、WO 2016/197367、WO 2017/024515、WO 2017/025051、WO 2017/123557、WO 2016/106159、WO 2014/194302、WO 2017/040790、WO 2017/133540、WO 2017/132827、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/106061、WO 2017/19846、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540号中，其的每一者是以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(也称为
Figure GDA0002365581830000791
5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538)、派姆单抗(Merck；也称为
Figure GDA0002365581830000792
兰利珠单抗和MK-3475；参见WO2008/156712)、PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)、MEDI-0680(AstraZeneca；也称为AMP-514；参见WO 2012/145493)、希米普单抗(cemiplimab)(Regeneron；也称为REGN-2810；参见WO 2015/112800)、JS001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA；参见刘思杨(Si-Yang Liu)等人，血液肿瘤学杂志(J.Hematol.Oncol.)10:136(2017))、BGB-A317(背金(Beigene)；参见WO 2015/35606和US 2015/0079109)、INCSHR1210(Jiangsu Hengrui Medicine；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847；刘思杨等人，血液肿瘤学杂志10:136(2017))、TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见WO2014/179664)、GLS-010(Wuxi/HarbinGloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见刘思杨等人，血液肿瘤学杂志10:136(2017))、AM-0001(Armo)、STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)、AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)、MGA012(Macrogenics，参见WO 2017/19846)或IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)。
在一个实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗是完全人类IgG4(S228P)PD-1免疫检查点抑制剂抗体，其选择性阻止与PD-1配体(PD-L1和PD-L2)的相互作用，借此阻断抗肿瘤T细胞功能的下调(美国专利第8,008,449号；王(Wang)等人，2014癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)2(9):846-56)。
在另一实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗是针对人类细胞表面受体PD-1(程序性死亡-1或程序性细胞死亡-1)的人源化单克隆IgG4(S228P)抗体。派姆单抗是描述例如于美国专利第8,354,509和8,900,587号中。
可用于本文公开的方法中的抗PD-1抗体还包括经分离的抗体，其特异性结合至人类PD-1并与本文公开的任何抗PD-1抗体(例如纳武单抗(参见例如美国专利第8,008,449和8,779,105号；WO 2013/173223))交叉竞争结合至人类PD-1。在一些实施例中，抗PD-1抗体结合与本文描述的抗PD-1抗体中的任一种(例如纳武单抗)相同的抗原决定基。抗体交叉竞争结合至抗原的能力指示这些单克隆抗体结合至抗原的相同抗原决定基区并空间上阻碍其它交叉竞争抗体结合至特定抗原决定基区。预期这些交叉竞争抗体具有与参考抗体(例如纳武单抗)的功能性质非常相似的功能性质，因为其结合至PD-1的相同抗原决定基区。交叉竞争抗体可基于其在标准PD-1结合分析(例如Biacore分析、ELISA分析或流动式细胞测量术(参见例如WO 2013/173223))中与纳武单抗交叉竞争的能力而易于识别。
在某些实施例中，与人类PD-1抗体(纳武单抗)交叉竞争结合至人类PD-1或结合至人类PD-1抗体(纳武单抗)的相同抗原决定基区的抗体是单克隆抗体。就向人类个体投与而言，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、经改造的抗体或人源化或人类抗体。这些嵌合、经改造、人源化或人类单克隆抗体可通过所属领域中众所周知的方法制备和分离。
可用于本发明公开的方法中的抗PD-1抗体还包括上文的抗体的抗原结合部分。已充分证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段进行。
适用于本发明公开的方法或组合物中的抗PD-1抗体是以高特异性和亲和力结合至PD-1，阻断PD-L1和或PD-L2的结合并抑制PD-1信号传导通路的免疫抑制效应的抗体。在本文公开的组合物或方法的任一种中，抗PD-1“抗体”包括抗原结合部分或片段，其结合至PD-1受体并显示与全抗体于抑制配体结合和上调免疫系统中的功能性质相似的功能性质。在某些实施例中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分与纳武单抗交叉竞争结合至人类PD-1。
本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和拮抗剂PD-L1抗体。在某些实施例中，促效剂抗huICOS抗体是以亚治疗剂量投与，抗PD-L1抗体是以亚治疗剂量投与，或两者均以亚治疗剂量投与。本文提供用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施例中，所述个体是人类。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是人类序列单克隆抗体和促效剂抗huICOS抗体是人源化单克隆抗体，例如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。
所属领域中已知的抗PD-L1抗体可用于本发明的方法中。适用于本发明的方法中的抗PD-L1抗体的实例包括美国专利第9,580,507号中公开的抗体。美国专利第9,580,507号中公开的抗PD-L1人类单克隆抗体已证实显示下列特性中的一或多种：(a)如通过SPR使用Biacore生物传感器系统测定，以1x 10-7M或以下的KD结合至人类PD-L1；(b)在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中，增加T细胞增殖；(c)在MLR分析中，增加干扰素-γ产生；(d)在MLR分析中，增加IL-2分泌；(e)刺激抗体反应；和(f)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的效应。可用于本发明中的抗PD-L1抗体包括特异性结合至人类PD-L1并显示前述特性中的至少一种(在一些实施例中，至少五种)的单克隆抗体。
在某些实施例中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(也称为12A4、MDX-1105；参见例如美国专利第7,943,743号和WO 2013/173223)、阿特珠单抗(Roche；也称为
Figure GDA0002365581830000811
MPDL3280A、RG7446；参见US 8,217,149；也参见赫布斯特(Herbst)等人(2013)临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)31(增刊):3000)、度伐鲁单抗(AstraZeneca；也称为IMFINZITM、MEDI-4736；参见WO 2011/066389)、巴文西亚单抗(Pfizer；也称为
Figure GDA0002365581830000812
MSB-0010718C；参见WO 2013/079174)、STI-1014(Sorrento；参见WO2013/181634)、CX-072(Cytomx；参见WO2016/149201)、KN035(3D Med/Alphamab；参见张(Zhang)等人，细胞发现(Cell Discov.)7:3(2017年3月)、LY3300054(Eli Lilly公司；参见例如WO 2017/034916)或CK-301(Checkpoint Therapeutics；参见高莱力克(Gorelik)等人，AACR:摘要4606(Apr 2016))。
在某些实施例中，PD-L1抗体是阿特珠单抗
Figure GDA0002365581830000813
阿特珠单抗是完全人源化IgG1单克隆抗PD-L1抗体。
在某些实施例中，PD-L1抗体是度伐鲁单抗(IMFINZITM)。度伐鲁单抗是人类IgG1κ单克隆抗PD-L1抗体。
在某些实施例中，PD-L1抗体是巴文西亚单抗
Figure GDA0002365581830000821
巴文西亚单抗是人类IgG1λ单克隆抗PD-L1抗体。
在其它实施例中，抗PD-L1单克隆抗体是28-8、28-1、28-12、29-8、5H1或其任何组合。
可用于本发明公开的方法中的抗PD-L1抗体还包括分离的抗体，其特异性结合至人类PD-L1并与本文公开的任何抗PD-L1抗体(例如阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或巴文西亚单抗)交叉竞争结合至人类PD-L1。在一些实施例中，抗PD-L1抗体结合与本文描述的抗PD-L1抗体(例如阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或巴文西亚单抗)中的任一种相同的抗原决定基。抗体交叉竞争结合至抗原的能力指示这些抗体结合至抗原的相同抗原决定基区且空间上阻碍其它交叉竞争抗体结合至特定抗原决定基区。预期这些交叉竞争抗体具有与参考抗体(例如阿特珠单抗和/或巴文西亚单抗)的功能性质非常相似的功能性质，因为其结合至PD-L1的相同抗原决定基区。交叉竞争抗体可基于其在标准PD-L1结合分析(例如Biacore分析、ELISA分析或流动式细胞测量术(参见例如WO 2013/173223))中与阿特珠单抗和/或巴文西亚单抗交叉竞争的能力而易于识别。
在某些实施例中，与人类PD-L1抗体(例如阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或巴文西亚单抗)交叉竞争结合至人类PD-L1或结合至人类PD-L1抗体(例如阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或巴文西亚单抗)的相同抗原决定基区的抗体是单克隆抗体。就向人类个体的投与而言，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、经改造的抗体或人源化或人类抗体。这些嵌合、经改造、人源化或人类单克隆抗体可以所属领域中众所周知的方法加以制备和分离。
可用于本发明公开的方法中的抗PD-L1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。已充分证实抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。
适用于本发明公开的方法或组合物中的抗PD-L1抗体是以高特异性和亲和力结合至PD-L1，阻断PD-1的结合并抑制PD-1信号传导通路的免疫抑制效应的抗体。在本文公开的组合物或方法的任一种中，抗PD-L1“抗体”包括抗原结合部分或片段，其结合至PD-L1并显示与全抗体在抑制受体结合和上调免疫系统中的功能性质相似的功能性质。在某些实施例中，抗PD-L1抗体或其抗原结合部分与阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或巴文西亚单抗交叉竞争结合至人类PD-L1。
在一个实施例中，本发明的促效剂抗huICOS抗体与PD-1/PD-L1信号传导的拮抗剂(例如PD-1拮抗剂(例如纳武单抗，也称为MDX1106，如WO 06/121168中描述)或PD-L1拮抗剂组合，与第三免疫治疗剂(例如抗ICOS抗体，例如ICOS.33 IgG1f S267E，与纳武单抗和伊匹单抗组合)组合。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是CTLA-4拮抗剂抗体。在某些实施例中，抗CTLA-4抗体是
Figure GDA0002365581830000831
(伊匹单抗或抗体10D1，描述于PCT公开WO 01/14424中)或替西木单抗(原名为替西木单抗，CP-675,206)。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是GITR拮抗剂或OX-40拮抗剂，例如本文公开的抗GITR或抗OX40抗体。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是GITR促效剂，例如促效性GITR抗体。合适的GITR抗体包括例如BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO06/105021、WO09/009116)和MK-4166(WO11/028683)。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括例如INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、因多莫得(indoximod)或NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)。
本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向个体投与本文描述的促效剂抗huICOS抗体和CTLA-4拮抗剂抗体。在某些实施例中，促效剂抗huICOS抗体是以亚治疗剂量投与，抗CTLA-4抗体是以亚治疗剂量投与，或两者均以亚治疗剂量投与。本文提供用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施例中，所述个体是人类。
所属领域中已知的抗CTLA-4抗体可用于本发明的方法中。本发明的抗CTLA-4抗体结合至人类CTLA-4以便干扰CTLA-4与人类B7受体的相互作用。因为CTLA-4与B7的相互作用转导导致携载CTLA-4受体的T细胞的灭活的信号，所以破坏相互作用有效地诱导、增强或延长这些T细胞的活化，借此诱导、增强或延长免疫反应。
以高亲和力特异性结合至CTLA-4的人类单克隆抗体已公开于美国专利第6,984,720号中。其它抗CTLA-4单克隆抗体已描述例如于美国专利第5,977,318、6,051,227、6,682,736和7,034,121号和国际公开第WO 2012/122444、WO 2007/113648、WO 2016/196237和WO 2000/037504中，其每一者是以全文引用的方式并入本文中。美国专利第6,984,720号中公开的抗CTLA-4人类单克隆抗体已证实显示下列特性中的一或多种：(a)如通过Biacore分析测定，以至少约107M-1或约109M-1或约1010M-1至1011M-1或更高的平衡结合常数(Ka)反映的结合亲和力特异性结合至人类CTLA-4；(b)至少约103、约104或约105m-1s-1的动力学结合常数(ka)；(c)至少约103、约104或约105m-1s-1的动力学解离常数(kd)；和(d)抑制CTLA-4结合至B7-1(CD80)和B7-2(CD86)。适用于本发明的抗CTLA-4抗体包括特异性结合至人类CTLA-4并显示前述特性中的至少一种，至少两种或至少三种的单克隆抗体。
在某些实施例中，CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为
Figure GDA0002365581830000832
MDX-010、10D1；参见美国专利第6,984,720号)、MK-1308(Merck)、AGEN-1884(Agenus有限公司；参见WO 2016/196237)或替西木单抗(AstraZeneca；也称为替西木单抗，CP-675,206；参见WO 2000/037504和Ribas,更新癌症疗法(Update Cancer Ther.)2(3):133-39(2007))。在特定实施例中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗。
在特定的实施例中，CTLA-4抗体是用于本文公开的方法中的伊匹单抗。伊匹单抗是阻断CTLA-4结合至其B7配体，借此刺激T细胞活化并改善患有晚期黑色素瘤的病患的总存活期(OS)的完全人类IgG1单克隆抗体。
在特定实施例中，CTLA-4抗体是替西木单抗。
在特定实施例中，CTLA-4抗体是MK-1308。
在特定实施例中，CTLA-4抗体是AGEN-1884。
可用于本发明公开的方法中的抗CTLA-4抗体还包括特异性结合至人类CTLA-4并与本文公开的任何抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗和/或替西木单抗)交叉竞争结合至人类CTLA-4的经分离的抗体。在一些实施例中，抗CTLA-4抗体结合与本文描述的抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗和/或替西木单抗)中的任一种相同的抗原决定基。抗体交叉竞争结合至抗原的能力指示这些抗体结合至抗原的相同抗原决定基区且空间上阻碍其它交叉竞争抗体结合至特定抗原决定基区。预期这些交叉竞争抗体具有与参考抗体(例如伊匹单抗和/或替西木单抗)的功能性质非常相似的功能性质，因为其结合至CTLA-4的相同抗原决定基区。交叉竞争抗体可基于其在标准CTLA-4结合分析(例如Biacore分析、ELISA分析或流动式细胞测量术(参见例如WO 2013/173223))中与伊匹单抗和/或替西木单抗交叉竞争的能力而容易识别。
在某些实施例中，与人类CTLA-4抗体(例如伊匹单抗和/或替西木单抗)交叉竞争结合至人类CTLA-4或结合至人类CTLA-4抗体(例如伊匹单抗和/或替西木单抗)的相同抗原决定基区的抗体是单克隆抗体。就向人类个体投与而言，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、经改造的抗体或人源化或人类抗体。这些嵌合、经改造、人源化或人类单克隆抗体可通过所属领域中众所周知的方法加以制备并分离。
可用于本发明公开的方法中的抗CTLA-4抗体还包括上文的抗体的抗原结合部分。已充分证实抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。
适用于本发明公开的方法或组合物中的抗CTLA-4抗体是以高特异性和亲和力结合至CTLA-4，阻断CTLA-4的活性并破坏CTLA-4与人类B7受体的相互作用的抗体。在本文公开的组合物或方法的任一种中，抗CTLA-4“抗体”包括抗原结合部分或片段，其结合至CTLA-4并显示与全抗体于抑制CTLA-4与人类B7受体的相互作用和上调免疫系统中的功能性质相似的功能性质。在某些实施例中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分与伊匹单抗和/或替西木单抗交叉竞争结合至人类CTLA-4。
在一个实施例中，本发明的促效剂抗huICOS抗体是与抗CTLA-4抗体组合，与第三免疫治疗剂组合。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是GITR拮抗剂或OX-40拮抗剂，例如本文公开的抗GITR或抗OX40抗体。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是GITR促效剂，例如促效性GITR抗体。合适的GITR抗体包括例如BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO06/105021、WO09/009116)和MK-4166(WO11/028683)。在一个实施例中，第三免疫治疗剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括例如INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、因多莫得或NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)。
本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和抗LAG-3抗体。在其它实施例中，促效剂抗huICOS抗体是以亚治疗剂量投与，抗LAG-3抗体是以亚治疗剂量投与，或两者均以亚治疗剂量投与。本文提供用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向个体投与促效剂抗huICOS抗体和亚治疗剂量的抗LAG-3抗体。在某些实施例中，所述个体是人类。在某些实施例中，抗LAG-3抗体是人类序列单克隆抗体和促效剂抗huICOS抗体是人源化单克隆抗体，例如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。抗LAG3抗体的实例包括包含抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体，其描述于美国专利公开第US2011/0150892和WO2014/008218号中。在一个实施例中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可使用的其它抗LAG-3抗体包括US 2011/007023或IMP-321中描述的IMP731。与这些抗体中的任一种竞争和/或结合至与这些抗体中的任一种相同的抗原决定基的抗LAG-3抗体也可用于组合治疗中。
在某些实施例中，抗LAG-3抗体以5×10-8M或更小的KD结合至人类LAG-3，以1×10- 8M或更小的KD结合至人类LAG-3，以5×10-9M或更小的KD结合至人类LAG-3或以在1×10-8M与×10-10M或更小之间的KD结合至人类LAG-3。
向一或多个第二靶抗原(例如LAG-3和/或CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1)投与本文描述的促效剂抗huICOS抗体和拮抗剂(例如拮抗剂抗体)可在病患中增强对癌细胞的免疫反应。使用本发明的抗体可抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用本文描述的组合疗法治疗癌症的实例包括(但不限于)在对使用促效剂抗huICOS抗体的单一疗法的讨论中的上文描述者。
在某些实施例中，本文讨论的治疗抗体的组合可作为含于医药上可接受的载剂中的单一组合物同时投与，或作为各抗体含于医药上可接受的载剂中的不同组合物同时投与。在另一实施例中，治疗抗体的组合可依序投与。例如，抗CTLA-4抗体和促效剂抗huICOS抗体可依序投与，例如首先投与抗CTLA-4抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体或首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗CTLA-4抗体。另外或替代地，抗PD-1抗体和促效剂抗huICOS抗体可依序投与，例如首先投与抗PD-1抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体或首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗PD-1抗体。另外或替代地，抗PD-L1抗体和促效剂抗huICOS抗体可依序投与，例如首先投与抗PD-L1抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体或首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗PD-L1抗体。另外或替代地，抗LAG-3抗体和促效剂抗huICOS抗体可依序投与，例如首先投与抗LAG-3抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体或首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗LAG-3抗体。
此外，若依序投与超过一次剂量的组合疗法，则依序投与的顺序在投与的各时间点下可相反或保持相同顺序，依序投与可与同时投与或其任何组合组合。例如，抗CTLA-4抗体和促效剂抗huICOS抗体的首次组合投与可同时进行，第二次投与可以是首先投与抗CTLA-4抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体依序进行，且第三次投与可以是首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗CTLA-4抗体依序进行等。另外或替代地，抗PD-1抗体和促效剂抗huICOS抗体的首次组合投与可同时进行，第二次投与可以是首先投与抗PD-1抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体依序进行，且第三次投与可以是首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗PD-1抗体依序进行等。另外或替代地，抗PD-L1抗体和促效剂抗huICOS抗体的首次组合投与可同时进行，第二次投与可以是首先投与抗PD-L1抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体依序进行，且第三次投与可以是首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗PD-L1抗体依序进行等。另外或替代地，抗LAG-3抗体和促效剂抗huICOS抗体的首次组合投与可同时进行，第二次投与可以是首先投与抗LAG-3抗体和其次投与促效剂抗huICOS抗体依序进行，且第三次投与可以是首先投与促效剂抗huICOS抗体和其次投与抗LAG-3抗体依序进行等。另一典型给药方案可涉及以首先投与促效剂抗huICOS和其次投与抗CTLA-4抗体(和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)依序进行的首次投与，且后续投与可同时进行。
在一个实施例中，促效剂抗huICOS抗体(作为唯一免疫治疗剂)或促效剂抗huICOS抗体和一或多种额外免疫治疗抗体(例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)的组合可进一步与免疫原性剂(例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等人(2004)免疫学杂志173:4919-28))组合。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，例如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步讨论)。ICOS促效剂和一或多种额外抗体(例如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3封锁)也可进一步与标准癌症疗法组合。例如，ICOS促效剂和一或多种额外抗体(例如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3封锁)可与化学治疗方案组合。在一个实施例中，抗huICOS促效剂抗体连同抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体与治疗黑色素瘤的达喀尔巴嗪的组合一起投与病患。在一个实施例中，抗huICOS促效剂抗体与抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体和治疗癌症(包括黑色素瘤)的白介素-2(IL-2)的组合一起投与病患。不希望受理论的束缚，ICOS促效作用和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3拮抗作用与化学疗法的组合使用可协同发挥作用，因为大多数化学治疗化合物的细胞毒性作用可导致肿瘤抗原于抗原呈递途径中增加的水平。可能与组合ICOS促效作用(含或不含通过细胞毒性的CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3拮抗作用)产生协同作用的其它组合疗法包括放射、手术或激素剥夺。在另一实施例中，血管生成抑制剂可与抗huICOS抗体和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3拮抗作用组合。
在一个实施例中，抗huICOS抗体作为唯一免疫治疗剂或抗huICOS抗体和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断抗体的组合也可与表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合。参见例如美国专利第5,922,845号和第5,837,243号。双特异性抗体可用于靶向两种不同抗原。这些反应的T细胞臂将通过使用经组合的ICOS促效作用和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3封锁增强。
在一个实施例中，抗ICOS抗体作为唯一免疫治疗剂或抗ICOS抗体和额外免疫刺激剂(例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)的组合可结合抗肿瘤剂(诸如
Figure GDA0002365581830000871
(利妥昔单抗)、
Figure GDA0002365581830000872
(曲妥珠单抗)、
Figure GDA0002365581830000873
(托西莫单抗)、
Figure GDA0002365581830000874
(替伊莫单抗)、
Figure GDA0002365581830000875
(阿仑单抗)、
Figure GDA0002365581830000876
(依帕珠单抗)、
Figure GDA0002365581830000877
(贝伐单抗)和
Figure GDA0002365581830000878
(埃罗替尼))使用。以实例说明且不希望受理论束缚，使用抗癌抗体或结合至毒素的抗癌抗体的治疗可导致癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，其可加强由免疫刺激剂(例如抗ICOS抗体、抗TIGIT抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗LAG-3抗体)介导的免疫反应。在一个实施例中，过度增殖性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌剂(例如抗体)与促效剂抗huICOS抗体和任选存在的额外免疫刺激剂(例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)的组合(同时或顺序或其任何组合)，其可加强由宿主产生的抗肿瘤免疫反应。
本文提供用于减少、减轻或消除与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病(例如癌症)相关的不良事件的方法，其包括向个体投与含或不含抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的拮抗剂抗huICOS抗体。在一个实施例中，所述方法通过向病患投与不可吸收的类固醇减小由免疫刺激性治疗抗体引起的结肠炎或腹泻的发病率。如本文使用，“不可吸收的类固醇”是糖皮质激素，其显示大量首关代谢，使得(在肝中代谢之后)类固醇的生物利用度较低，即，小于约20％。在本文描述的一个实施例中，不可吸收的类固醇是布地奈德(budesonide)。布地奈德是局部作用的糖皮质类固醇，其在口服后大量代谢(主要由肝代谢)。
Figure GDA0002365581830000881
(Astra-Zeneca)是布地奈德的pH和时间依赖性口服调配物，所述调配物经研制以优化对回肠和整个结肠的药物递送。ENTOCORT
Figure GDA0002365581830000882
在美国被批准用于治疗轻度至中度涉及回肠和/或升结肠的克罗恩氏病。用于治疗克罗恩氏病的ENTOCORT
Figure GDA0002365581830000883
的通常口服剂量是6至9mg/天。ENTOCORT
Figure GDA0002365581830000884
是在肠中释放，然后在肠粘膜中被吸收并保留。其一旦通过肠粘膜靶组织，则ENTOCORT
Figure GDA0002365581830000885
是被肝中的细胞色素P450系统大量代谢为具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用度较低(约10％)。相较于具有不太大量首关代谢的其它糖皮质激素，布地奈德的低生物利用度使得治疗比率改善。相较于全身作用的皮质类固醇，布地奈德引起的副作用较少，包括较少的下丘脑-垂体抑制。然而，ENTOCORT
Figure GDA0002365581830000886
的慢性投与可导致全身性糖皮质激素效应，例如皮质醇增多和肾上腺抑制。参见PDR 58版，2004；608-610。
在一个实施例中，含或不含CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3拮抗剂(即，针对ICOS的免疫刺激性治疗抗体和任选存在的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)的抗ICOS抗体与不可吸收的类固醇的结合可与水杨酸盐进一步组合。水杨酸盐包括5-ASA药剂，例如，例如：柳氮磺胺吡啶(
Figure GDA0002365581830000887
Pharmacia&UpJohn)；奥色拉嗪(
Figure GDA0002365581830000888
Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(
Figure GDA0002365581830000889
Salix制药有限公司)；和美色拉嗪(
Figure GDA00023655818300008810
Procter&Gamble Pharmaceuticals；
Figure GDA00023655818300008811
美国夏尔(Shire US)；
Figure GDA00023655818300008812
Axcan Scandipharm有限公司；
Figure GDA00023655818300008813
索尔维(Solvay))。
根据本文描述的方法，出于减少由免疫刺激性抗体诱发的结肠炎的发病率的目的，与含或不含抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或LAG-3抗体和不可吸收的类固醇的抗huICOS抗体组合投与的水杨酸盐可包括水杨酸盐和不可吸收的类固醇的任何重叠或依序投与。因此，例如，用于减少由本文描述的免疫刺激性抗体诱发的结肠炎的发病率的方法包括同时或依序投与水杨酸盐和不可吸收的类固醇(例如在投与不可吸收的类固醇6小时后投与水杨酸盐)或其任何组合。此外，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可通过相同途径(例如两者均是口服)或通过不同途径投与(例如口服水杨酸盐和直肠投与不可吸收的类固醇)，其可不同于投与抗huICOS和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的途径。
本文描述的促效剂抗huICOS抗体和组合抗体疗法也可与选用于针对治疗中的适应症(例如癌症)特别有效的其它众所周知的疗法结合使用。本文描述的促效剂抗huICOS抗体的组合可与医药上可接受的已知药剂依序使用。
在一个实施例中，本文描述的促效剂抗huICOS抗体和组合抗体疗法可与例如以下额外疗法组合(例如同时或分别)使用：放射、化学疗法(例如使用喜树碱(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、阿霉素、伊立替康、紫杉醇、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(Taxol)、阿霉素、5-fu或喜树碱+apo2l/TRAIL(6X组合))、一或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或MG132)、一或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2'(bcl-xl抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴托克(obatoclax))或MCL-1(髓样白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白的抑制剂)拮抗剂(例如smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见福达(Fulda)等人，自然医学(Nat Med)2002；8:808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如
Figure GDA0002365581830000891
)、合成三萜类化合物(参见黑尔(Hyer)等人，癌症研究2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如PPARγ(过氧化物酶体增殖物活化的受体γ)的天然和合成配体，5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如索拉非尼)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、西罗莫司、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素和西罗莫司)、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂和/或遗传毒性药物。
本文描述的促效剂抗huICOS抗体和组合抗体疗法可进一步与一或多种抗增殖细胞毒性剂使用。可用作抗增殖细胞毒性剂的化合物的类别包括(但不限于)下列：
烷化剂(包括(但不限于)氮芥、乙烯亚胺衍生物、磺酸烷基酯、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥、氮芥、环磷酰胺(CYTOXANTM)、磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、三乙烯硫代磷酸胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、达喀尔巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢物(包括(但不限于)叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。
除所属领域中已知的其它微管蛋白稳定剂外，适用于与促效剂抗huICOS抗体组合的抗增殖剂不限于紫杉烷、紫杉醇(紫杉醇作为TAXOLTM市售)、多西他赛、圆皮海绵内酯(DDM)、迪克斯汀(dictyostatin(DCT))、派洛西德A(Peloruside A)、埃博霉素、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、呋喃埃博霉素D、脱氧埃博霉素Bl、[17]-脱氢脱氧埃博霉素B、[18]脱氢脱氧埃博霉素B、C12,13-环丙基-埃博霉素A、C6-C8桥接埃博霉素A、反式-9,10-脱氢埃博霉素D、顺式-9,10-脱氢埃博霉素D、16-去甲基埃博霉素B、埃博霉素B10、迪莫利德、帕妥匹隆(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(圆皮海绵内酯)、TZT-1027(索利多汀(soblidotin))、ILX-651(塔斯汀(tasidotin)盐酸盐)、软海绵素B、甲磺酸艾日布尔(E-7389)、哈米特林(HTI-286)、E-7974、克普特素(Cyrptohycins)、LY-355703、美登素免疫结合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊斯平斯)、SB-743921、MK-0731、STA-5312、软珊瑚醇、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-侧氧基-B-高雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、环链蛋白、异劳马立德(isolaulimalide)、劳马立德(laulimalide)、4-表-7-脱羟基-14,16-二脱甲基-(+)-圆皮海绵内酯和塞托斯隆1(cryptothilone 1)。
在一些实施例中，可能需要结合本文描述的促效剂抗huICOS抗体使异常增殖细胞静止或在使用本文描述的促效剂抗huICOS抗体治疗之前使异常增殖细胞静止，例如，通过向病患投与激素和类固醇(包括合成类似物)，例如17a-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸睾酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲基-睾酮、泼尼松龙、去炎松、三对甲氧苯氯乙烯、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他米特、托瑞米芬、ZOLADEXTM。当采用本文描述的方法或组合物时，任选地也可投与用于在临床环境中调节肿瘤生长或转移的其它药剂，例如抗模拟剂。
用于安全且有效投与化学治疗剂的方法为所述领域中的技术人员已知。另外，其投与描述于标准参考文献中。例如，许多化学治疗剂的投与描述于医师案头参考(Physicians'Desk Reference(PDR))，例如1996版，(医药经济公司(Medical EconomicsCompany),新泽西州蒙特威尔(Montvale,N.J.)07645-1742,USA)中；其公开内容是以引用的方式并入本文中。
化学治疗剂和/或放射疗法可根据所属领域中已知的治疗方案投与。所述领域中的技术人员将知晓化学治疗剂和/或放射疗法的投与可取决于治疗中的疾病和化学治疗剂和/或放射疗法对所述疾病的抑制效应而变化。同样，根据熟练的临床医生的知识，治疗方案(例如投与剂量和次数)可鉴于所投与的治疗剂对病患的可见效应和鉴于所述疾病对所投与的治疗剂的可见反应而变化。
结果
肿瘤反应是例如通过由NCI建立的经修改的实体肿瘤反应评估标准(RECIST)确定。
关于靶病变，对疗法的反应可包括：
Figure GDA0002365581830000911
关于非靶病变，对疗法的反应可包括：
Figure GDA0002365581830000912
Figure GDA0002365581830000921
根据本文公开的方法治疗的病患优选经历癌症的至少一种体征的改善。在一个实施例中，改善是通过可测量肿瘤病变的质量和/或大小的减小加以测量。在另一实施例中，病变可于胸部x射线或CT或MRI胶卷上测量。在另一实施例中，可使用细胞学或组织学以评估对疗法的反应性。
在一个实施例中，经治疗的病患显示完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)、免疫相关的完全疾病(irCR)、免疫相关的部分反应(irPR)或免疫相关的稳定疾病(irSD)。在另一实施例中，经治疗的病患经历肿瘤收缩和/或生长速率的减小，即，肿瘤生长的抑制。在另一实施例中，非所需的细胞增殖是减少或被抑制。在又另一实施例中，下列中的一或多种可发生：癌细胞的数量可减少；肿瘤尺寸可减小；癌细胞向外周器官的浸润可被抑制、减缓、减慢或停止；肿瘤转移可被减慢或抑制；肿瘤生长可被抑制；肿瘤的复发可被防止或延迟；与癌症相关的症状中的一或多种可在一定程度上得到缓解。
在其它实施例中，根据本文提供的任一种方法投与有效量的抗ICOS抗体(或抗ICOS抗体和至少一种额外抗体(例如抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)的组合)产生肿瘤大小的减小、随时间出现的转移病变的数量的减少、完全缓解、部分缓解或稳定疾病。在又其它实施例中，治疗方法产生优于由单独抗ICOS抗体(或组合抗体中的单独任一种)实现的临床收益率的可比较临床收益率(CBR＝CR+PR+SD≥6个月)。在其它实施例中，相较于单独抗ICOS抗体(或组合抗体中的单独任一种)，临床收益率的改善是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更大。
疫苗佐剂
本文描述的抗huICOS抗体可通过共投与抗huICOS抗体和受关注的抗原(例如疫苗)而用于增强抗原特异性免疫反应。因此，本文提供增强个体对抗原的免疫反应的方法，其包括向所述个体投与：(i)抗原；和(ii)抗huICOS抗体或其抗原结合片段，使得增强个体对所述抗原的免疫反应。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这些抗原的非限制性实例包括上文部分中讨论的实例，例如上文讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)或来自上文描述的病毒、细菌或其它病原体的抗原。
检测和诊断
在另一方面中，本文提供用于检测样本中人类ICOS抗原的存在或测量人类ICOS抗原的量的方法，其包括使所述样本和对照样本与抗ICOS抗体(例如特异性结合至人类ICOS的单克隆抗人类ICOS抗体或其抗原结合片段)在容许于所述抗体或其片段与人类ICOS之间形成复合物的条件下接触。随后检测复合物的形成，其中样本与对照样本之间所比较的差异复合物的形成是指示样本中存在人类ICOS抗原。此外，本文描述的抗ICOS抗体可用于经由免疫亲和纯化纯化人类ICOS。
本发明由下列实例进一步阐述，所述实例不应视为限制性。整个本申请中所引用的所有图式和所有参考文献、GenBank序列、专利和公开申请的内容是以引用的方式明确并入本文中。
实例
下文是本发明的抗体、组合物和方法的非限制性实例。应了解各种其它实施例可根据本文提供的一般描述实施。
实例1
完全人类抗huICOS抗体的产生
本文公开完全人类抗huICOS单克隆抗体和结合至完全人类抗ICOS抗体的相同抗原决定基和/或交叉阻断完全人类抗ICOS抗体结合的完全人类抗体。这些抗体可使用表达人类抗体基因的转基因小鼠产生，如下列实例中描述。
A.使用HuMab
Figure GDA0002365581830000931
和/或昆明(KM)
Figure GDA0002365581830000932
的融合瘤技术
产生抗ICOS抗体
人类抗ICOS单克隆抗体是通过用1)可溶性人类ICOS抗原和2)经表达人类ICOS的人类ICOS基因转染的Hek293T细胞系、表达ICOS的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和表达ICOS的300-19细胞系使
Figure GDA0002365581830000933
转基因小鼠的HC2/KCo7品系(
Figure GDA0002365581830000934
是Medarex有限公司，新泽西州普林斯顿(Princeton,New Jersey)的商标)和KM小鼠(KM
Figure GDA0002365581830000935
Figure GDA0002365581830000936
品系含有SC20转染色体，如WO 02/43478中描述)免疫来产生。HC2/KCo7HuMAb小鼠和KM小鼠如美国专利第5,770,429和5,545,806号中描述产生，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。
抗原和免疫
抗原是包含与抗体Fc域融合的ICOS细胞外域的可溶性融合蛋白(重组人类ICOS-小鼠Fc嵌合蛋白)、Hek293T细胞、CHO细胞或经转染以用于人类ICOS的表面表达的300-19细胞。将所述抗原与RIBI单磷酰基脂质A(MPL)加TDM佐剂系统(Sigma)混合以用于免疫。经含于PBS中的15至25μg可溶性重组ICOS抗原的可溶性ICOS蛋白或含于PBS中的1x 107CHO细胞、Hek293T细胞或经转染以用于人类ICOS的表面表达的300-19细胞免疫的上述小鼠与佐剂1:1混合。每二至十四天将200μl已制备的抗原注射至小鼠的腹腔或皮下或足垫内。在ICOS抗原免疫后，向小鼠注射100至200μl重组小鼠IL21。对开发出抗ICOS滴定量的小鼠在融合前的三至两天内给予静脉内注射和/或足垫注射10至20μg可溶性重组ICOS抗原或5x106个CHO细胞或经转染以用于人类ICOS的表面表达的300-19细胞或加腹膜内注射含于100μl PBS中的15μg重组小鼠IL21蛋白。获取小鼠淋巴结和或脾脏，且将分离的淋巴结细胞和/或脾脏细胞用于融合瘤制备。
产生抗ICOS抗体的HuMab
Figure GDA0002365581830000941
或KM
Figure GDA0002365581830000942
的选择
为选择产生ICOS结合抗体的HuMab
Figure GDA0002365581830000943
或KM
Figure GDA0002365581830000944
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试来自经免疫小鼠的血清。简单地说，用含于PBS中的1至2μg/ml纯化重组人类ICOS-小鼠Fc涂覆微量滴定盘；以50μl/孔在4℃下培养整夜，然后用含于PBS/Tween(0.05％)中的200μl/孔5％鸡血清阻断。将ICOS免疫的小鼠血浆的稀释物添加至各孔中并在周围温度下培养一小时。所述盘用PBS/Tween清洗和然后用山羊抗人类IgG Fc多克隆抗体结合辣根过氧化物酶(HRP)在室温下培养一小时。清洗后，所述盘用ABTS底物(Moss有限公司，产品：ABTS-1000)显影并通过分光亮度计在415至495光学密度(OD)下分析。然后通过流动式细胞测量术进一步筛选结合至表达人类ICOS的细胞系，但不结合至不表达ICOS的对照细胞系的来自经免疫小鼠的血清。简单地说，抗ICOS抗体的结合是通过用抗ICOS抗体以1:20稀释培养表达ICOS的CHO细胞或300-19细胞评估。清洗所述细胞并用经藻红蛋白(PE)标记的抗人类IgG抗体检测结合。流动式细胞分析是使用FACScanTM流式细胞仪(BectonDickinson,加州圣荷西(San Jose,CA))进行。开发出最高滴定量的抗ICOS抗体的小鼠用于融合。融合如下文所述进行。通过ELISA和荧光活化流动式细胞测量术(FACS)测试融合瘤上清液的抗ICOS活性。
融合瘤制备
使用基于电场的电融合使用Cyto Pulse大室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse科学有限公司,马里兰州格伦伯列(Glen Burnie,MD))使从HuMab
Figure GDA0002365581830000945
和/或KM
Figure GDA0002365581830000946
分离的小鼠脾脏细胞和/或淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。简单地说，使来自经免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单一细胞悬浮液融合至相同数量的Sp2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC、CRL1581细胞系)。将细胞以约2x 104/孔接种于平底微量滴定盘中，接着在含有10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC、CRL TIB-63)改良性培养基、含于DMEM(Mediatech,CRL 10013，具有高葡萄糖、L-谷酰氨酸和丙酮酸钠)中的3至5％Origen(IGEN)加5mm HEPES、0.055mm 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1x次黄嘌呤-胺喋呤-胸腺核苷(HAT)培养基(Sigma,CRL P-7185)的选择性培养基中培养约两周。一至两周后，将细胞在培养基中培养，其中HAT用次黄嘌呤和胸腺核苷(HT)培养基置换。细胞接种后约10至14天，首次筛选来自个别孔的上清液是否含有人类γ和κ抗体。然后接着通过ELISA和FACS针对人类抗ICOS单克隆IgG抗体筛选人类γ和κ抗体呈阳性评分的上清液。将分泌抗体的融合瘤转移至24孔盘，再次进行筛选，且若仍对人类抗ICOS单克隆抗体呈阳性，则通过有限稀释次克隆至少两次。然后活体外培养稳定次无性繁殖系以在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。产生的人类单克隆抗体然后通过蛋白A柱色谱术纯化。如下表7中描述，特别受关注的分离抗体命名为17C4、9D5、3E8、1D7-a和1D7-b。
表7：分离的抗体
Figure GDA0002365581830000951
B.
Figure GDA0002365581830000952
mRNA显示系统
将KM小鼠#333819和#333821用过度表达人类ICOS的CHO细胞进行免疫，且接着获取脾脏和淋巴结。从脾脏和淋巴结细胞提取总RNA并使用对抗体恒定区具特异性的引物逆转录。使用抗体cDNA产生表达于mRNA显示中的单链可变片段(scFv)库，其中各scFv蛋白是经由嘌呤霉素键联融合至其编码mRNA。所述库是针对10nM重组人类ICOS-Fc加以选择，且任何经结合的分子是使用蛋白G磁珠捕获回收并通过聚合酶链反应(PCR)扩增以进行下一轮。完成总计六轮，然后通过定量PCR(qPCR)观测到显著ICOS结合信号。对最终群体测序且将独特的可变区克隆至IgG表达载体内。使用Hek293T细胞瞬时转染表达IgG蛋白以产生用于结合和功能分析的材料。选择如下表8中描述的抗体IgG-2644。
表8：抗体IgG-2644
Figure GDA0002365581830000961
实例2
人源化抗ICOS抗体的产生
仓鼠ICOS抗体C398.4A的序列测定
本文中被称为“亲代仓鼠抗体”或抗体“C398.4A”的仓鼠抗大鼠ICOS单株抗体(C398.4A(抗H4/ICOS)单株抗体)获自
Figure GDA0002365581830000962
C398.4A抗体是使用质谱测序。具体地说，使C398.4A在5.3M胍HCl中变性，用二硫苏糖醇(40mm)还原，并用碘乙酰胺(80mm)烷化。在用6kDa MW截断Zeba脱盐柱脱盐后，抗体用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、Lys-C、AspN或GluC酶促消化并通过质谱分析。使用肽定位和MS/MS以识别所得肽并证实氨基酸序列。完整的重链和轻链质量通过用PNGaseF裂解开聚糖，用二硫苏糖醇还原抗体和用碘乙酸烷化产生。所得抗体链通过LC-MS分析。
将所得肽片段化数据与由GenBank中存在的灰仓鼠(Cricetulus migratorius)的三个轻链和重链抗体序列连同通过衍生自亚美尼亚仓鼠的单克隆抗体的RNA测序内部测定的抗体序列组成的定制蛋白质数据库进行比对。数据库搜索将GenBank序列基因基因座CMU17870(登录号U17870)识别为与C398.4A轻链类似。与CMU17870序列比较时，在C398.4A序列中在CDR3和框架区中观测到氨基酸取代。数据库搜索将GenBank库序列基因基因座CMU17166(登录号U17166)识别为与C398.4A重链可变区类似。J区匹配内部识别的仓鼠序列HA-VH-7。重链的恒定区匹配与抗体HL4E10(登录号HM369133)相同的同型。D区确定为新颖且是通过肽片段化数据的从头测序进行识别。与CMU17166和HA-VH-7重链序列比较时，在CDR1、CDR2、CDR3和可变框架区中观测到氨基酸取代。
基于抗体C398.4A的嵌合抗体ICOS.4的产生和评估
使C398.4A抗体蛋白质序列回译成cDNA序列。D区(CDRH3)中位置96的异亮氨酸/亮氨酸(I/L)残基在此位置以异亮氨酸或亮氨酸表达。可变区克隆至含有信号序列和人类IgG1f恒定区的表达载体内，并转染至CHO-S细胞内以用于嵌合人类抗体ICOS.4的表达。嵌合抗体是使用2L上清液各使用250mL蛋白A柱于AKTA Avant上纯化并在CHO-OKT3-CD32a/CD25-CD4+ T细胞分析中针对活性进行筛选。所述CHO-OKT3-CD32a/CD25-CD4+ T细胞分析是经低浓度的单链-CD3(无性繁殖系OKT3)和较高浓度的CD32A(以交联抗体)转染的经辐射(生长停滞)CHO细胞和耗尽CD25的CD4+ T细胞以1:4的CHO:T细胞比率的共培养物。所述CHO细胞系在摇瓶中生长并在分析开始当天经受辐射。T细胞是使用
Figure GDA0002365581830000971
CD4+ T细胞分离试剂盒(目录15062)选自新鲜肤色血球层(Stanford Blood Bank)，接着遵循用于
Figure GDA0002365581830000972
耗尽的试剂盒说明书，使用
Figure GDA0002365581830000973
CD25-磁珠(目录130-092-983)耗尽CD25+细胞。
ICOS抗体或同型对照是以5倍连续稀释度、从5μg/mL加以滴定，并且各条件三重复进行。将培养物放置于经TC处理的平底
Figure GDA0002365581830000974
96孔盘中，所述盘每孔具有含于200μL完全培养基(RPMI-1640(
Figure GDA0002365581830000975
目录10-040-CM)+10％胎牛血清(FBS)(
Figure GDA0002365581830000976
目录25140)+1x Pen Strep(Corning目录30-002-CL)+10mm HEPES(Corning目录25-000-CL)+1mm丙酮酸钠(Corning目录25-000Cl)+1xMEM(Corning目录25030-CL)中的5x104个T细胞和1.25x104个CHO细胞，并在37℃下和5％CO2下培养三天。
在第3天获取培养物上清液(50μL/孔)以便使用均相时间分辨荧光(HTRF)分析
Figure GDA0002365581830000977
分析干扰素-γ浓度，使用
Figure GDA0002365581830000978
微量盘读取，并使用Softmax
Figure GDA0002365581830000979
软件依据标准曲线计算所述浓度。在功能T细胞分析中使用CHO-OKT3-CD32和CD4+CD25-T细胞测试ICOS.4抗体且滴定所述抗体以比较剂量依赖性共刺激的相对程度，如通过干扰素-γ分泌测定。ICOS.4显示0.018μg/mL的EC50值。
同型选择
针对免疫肿瘤学治疗抗体且具体地说针对促效剂靶的同型选择是受结合至FcR下游的两种不同考虑因素影响。如拉维特克(Ravetch)和同事(李(Li)和拉维特克,科学2011；333:1030-4；奥腾(Otten)等人，免疫学杂志(J Immunol.)2008；181:6829-36)详细描述，抗体与活化受体的结合可引起表达靶的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。另一方面抗体优先结合至抑制FcR可介导受体的多价交联和促效剂信号传导。因为ICOS在肿瘤微环境中可高度表达于CD8+和CD4+Teff上，所以使用可介导ADCC或ADCP的同型被视为不太有吸引力的选择。抗ICOS抗体的活体外ADCC活性还表明抗ICOS抗体在介导ADCC方面具有高度能力且支持应避免ADCC诱导的同型的想法。增加人类IgG1对CD32B的亲和力的抗体相反被视为替代同型。如上表3中显示，考虑的同型是人类IgG1的IgG1 S267E突变、SELF突变和V12突变。这些突变全部增加对CD32B的亲和力并在不同程度上增加对CD32A的亲和力，同时减小对CD16的亲和力(如表9中显示)。此减小预计降低ADCC活性，因为此是FcR可能介导T细胞于肿瘤中的耗尽。
表9：人类IgG1的野生型和S267E变体的结合性质的比较(μM Kd)
蛋白质 IgG1f IgG1f-S267E
CD16-V 97 950
CD16-F 200 >5000
CD32A-H131 530 650
CD32A-R131 960 31
CD32B 3400 87
CD64 0.2 0.2
C1q + ++
在SEB分析中使用CD4+ T细胞和B细胞的活体外活性显示IgG1f S267E抗体相较于人类IgG1和其它同型具有绝佳活性，如上文描述。基于来自功能实验的数据，选择IgG1fS267E作为前导抗体。选择IgG1f S267E的一个并发症是此同型相较于人类IgG1以更高亲和力结合至补体C1q，此可能增加补体依赖性细胞溶解(CDC)的风险。出乎意料地，在活体外测试中，相较于人类IgG1，IgG1f S267E不具有更高CDC活性。因此，S267E突变不导致CDC风险增加。
抗体ICOS.4的人源化
抗体ICOS.4是通过将仓鼠CDR移植至人类生殖系基因上进行人源化(图3)，基于框架序列同源性，将VH3-15选为重链并将VKI O18选为轻链。基于序列同源性，人类生殖系FW4，JK3，还被选为轻链。基于序列相似性，人类生殖系FW4，JH4，被选为重链，且其不含有可造成潜在责任风险的残基。CHO-OKT3-CD32A/CD4+CD25-T细胞分析中评估一组26个抗体，且抗体范围始于0.2μg/mL并通过四倍稀释滴定，以识别保留与亲代仓鼠抗体类似的结合的人源化序列(C398.4A，即，具有分别阐述于SEQ ID NO:3和4中的重链和轻链区序列的亲代仓鼠抗体)。
一个氨基酸残基取代是经识别(T94A)以恢复人源化CDR移植抗体的结合，且其位于FR3和CDRH3的接点处。另外，还评估D56、G57序列处具有可疑突变的三种嵌合抗体以查看VL中的潜在异构化位点是否可经去除而不影响活性。选择残基取代D56E以消除轻链中的潜在异构化位点(D56,G57)且并入人源化序列内。人源化抗体是用IgG1f同型筛选，然而，ICOS.33 IgG1f S267E是使用IgG1f S267E同型重新表达。产生的抗体的描述提供于下表10中。
表10：产生的抗体的汇总
Figure GDA0002365581830000981
Figure GDA0002365581830000991
如下文于实例3中描述，相较于原始仓鼠嵌合抗体，基于C398.4A的一组四种人源化抗体是于CHO-OKT3-CD32a/CD4+CD25-T细胞功能分析中加以测试。选择ICOS.33 IgG1fS267E用于进一步表征和研发。ICOS.33 IgG1f S267E的重链和轻链可变区序列分别显示于SEQ ID NO:5和6和图4中。
实例3
抗体选择
CHO-scFv-CD3-CD32A/CD25-CD4+ T细胞分析
初始功能分析筛选是使用表达单链可变片段(scFv)抗CD3(OKT3)和人类CD32A的CHO细胞以刺激原代人类T细胞而进行。此分析是经低浓度的单链可变片段-CD3(无性繁殖系OKT3)和较高浓度的CD32A(以交联抗体)转染的经辐射(生长停滞)CHO细胞和耗尽CD25的CD4+ T细胞以1:4的CHO:T细胞比率的共培养物。CHO细胞系在摇瓶中生长并在分析开始当天经受辐射。T细胞是使用RosetteSep CD4+ T细胞分离试剂盒选自新鲜肤色血球层(Stanford Blood Bank)。遵循用于AutoMACS耗尽的试剂盒说明书，使用Miltenyi CD25-磁珠耗尽CD25+细胞。
ICOS抗体或同型对照(即，与ICOS抗体为相同同型但不结合任何天然存在的人类蛋白质的抗体，例如，针对钥孔血蓝蛋白(KLH)、白喉毒素等等的抗体)以五倍连续稀释度、从2μg/mL加以滴定，且各条件使用两个供体的T细胞三重复进行。将培养物放置于经TC处理的平底96孔盘(Costar)中，所述孔盘每孔具有含于200μL完全培养基中的5×104个T细胞和1.25×104个CHO细胞，并在37℃和5％CO2下培养三天。
第3天获取培养物上清液(50μL/孔)，以使用均相时间分辨荧光(HTRF)分析(Cisbio)分析干扰素-γ浓度。浓度是使用Rubystar微量盘读取仪测定并使用Softmax Pro软件依据标准曲线计算。所述盘然后用每孔0.5μCi氘化胸腺核苷冲击八小时并冷冻。将所述细胞收获于过滤盘(Perkin Elmer)上以便分析氘化胸腺核苷并入以评估增殖。
无论抗体Fc子类型，FcR CD32A皆允许抗体交联。此交联容许通过ICOS促效作用共刺激T细胞，从而使得增殖和细胞因子释放相较于经同型对照处理的细胞增强。此活性可发现于CD8+、CD4+和CD25- CD4+ T细胞上。因为耗尽的CD25- CD4+ T细胞分析中绝佳的信噪比，这些细胞被用于筛选融合瘤。选择性能最佳的抗体用于次克隆、纯化和进一步表征。抗体组分析中包括亲代仓鼠单克隆抗体。如上文描述，CHO-CD3-CD32分析中的活性用于选择抗体的主要组，其以人类IgG1抗体或人类IgG1的其它修饰形式重新表达。如图5所示，ICOS.33 IgG1f S267E在CHO-scFv-CD3-CD32A/CD25-CD4+ T细胞分析中显示IFN-γ分泌和增殖的剂量依赖性诱导。就增殖而言，此效应的平均EC50是0.083nM(±0.067,n＝6)，且就IFN-γ诱导而言，是0.083nM(±0.074,n＝6)。相较于对照，在相同实验中，在总计6个供体中测试的三种最高浓度下，增殖诱导在2至5倍的范围内变化，而IFN-γ诱导在2倍至9倍的范围内变化。使用CHO-scFv-CD3(无CD32A)的先前实验证实交联是经测试的所有ICOS抗体的促效性活性所需的。
CD25-CD4+ T细胞和B细胞-SEB分析
抗ICOS抗体功能活性的进一步表征是使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为T细胞受体(TCR)刺激物进行并添加抗ICOS抗体以测试共刺激。当人类外周血细胞(PBMC)用于分析中时，抗ICOS抗体不显示功能活性。然而，当CD4+ T细胞(耗尽CD25或总CD4+T细胞)与经纯化的B细胞一起使用时，相较于对照抗体，抗ICOS抗体显示增强的干扰素γ(IFN-γ)分泌。
此分析涉及自体同源CD25-CD4+ T细胞和B细胞的共培养。添加SEB直至85ng/mL的最终固定浓度以提供次最大刺激，并滴定ICOS抗体以显示剂量依赖性共刺激效应。在如IFN-γ诱导浓度证实的初级活化信号(SEB+B细胞)的上下文中，此分析的目的是测量ICOS抗体增强T细胞的活性的能力。诱导更高浓度的IFN-γ是有利的，因为其是反映显示ICOS受体的促效作用的不同抗体的效力的T细胞活化的量度，且IFN-γ是抗肿瘤免疫力的已知介导者。
通过阳性选择从两个新鲜肤色血球层分离出T细胞，接着分离珠以产生未触变的CD4+ T细胞(Invitrogen)。然后遵循关于使用AutoMACS进行耗尽的试剂盒说明书，使用CD25-磁珠(Miltenyi)，从CD4+ T细胞耗尽CD25+细胞。遵循关于使用AutoMACS进行阳性选择的试剂盒说明书，然后使用Miltenyi CD20珠将来自CD4分离的阴性溶离份用于分离自体同源B细胞。
以5×104个细胞/孔将T细胞接种于经TC处理的96孔平底培养盘中，且自体同源B细胞以3至5×104个细胞/孔(取决于来自各供体的产量)接种并包括SEB，以实现85ng/mL的最终浓度。ICOS抗体或同型对照是自5μg/mL以5倍连续稀释加以滴定，以获得总计七个点，各测试一式三份。在设定于具有200μL/孔最终体积的完全培养基中进行分析。所述盘在37℃和5％CO2下培养3天。
第3天获取培养物上清液(50μL/孔)以使用HTRF分析(Cisbio)分析IFN-γ浓度。浓度是使用Rubystar微量盘读取仪测定并使用Softmax Pro软件依据标准曲线计算。
SEB共培养实验针对抗ICOS抗体ICOS.33 IgG1f、ICOS.33 IgG1f S267E、9D5IgG1f、9D5 IgG1f S267E、2644 IgG1f S267E和对照抗体KLH对照Ig1f比较IFN-γ产生(图6)。相较于具有野生型Fc的相同抗体(ICOS.33 IgG1f)，具有S267E突变的人源化前导抗体ICOS.33(ICOS.33 IgG 1f S267E，如图6中完全向下三角形中绘示)诱导更高浓度的IFN-γ。相较于ICOS.33 IgG1f S267E，经测试的其它比较抗体(即95D IgG1f、9D5 IgG1f S267E和2644 IgG1)还显示更低活性。KLH对照Ig1f不显示任何活性。在次最佳剂量的SEB刺激的CD25-CD4+ T和B细胞共培养物中，相较于对照抗体，ICOS.33 IgG1f S267E抗体以剂量依赖性方式将IFN-γ产生增加高达2.3倍。使用此分析测试总计20个供体，全部显示ICOS.33IgG1f S267E的最大促效剂活性，且EC50为0.020nM(±0.018)。
ICOS抗体对T滤泡性辅助细胞(Tfh)的活性是以此方式测试。相较于对照抗体1D12，在添加抗ICOS抗体9D5和ICOS.4后观测到增强的IL-10分泌。在通过CD4选择(Invitrogen试剂盒)富集后通过针对CD4、CD14、CXCR5、CD45RA和CD123染色CD4富集细胞并针对Tfh细胞(CD4+CXCR5+CD45RA-CD123-CD14-)使用Aria II FACS分选从PBMC中分选出Tfh细胞。使用Miltenyi试剂盒从CD4阴性溶离份中分离出初始B细胞。当用ELISA(BD)测量IL-10和IFNγ并显示ICOS抗体增强时，将Tfh和初始B细胞各以5e4个细胞/孔共培养于96孔平底TC盘中并用SEB刺激2天。此增强的细胞因子分泌无需外源性交联剂且可通过将S267E突变包括于人类IgG1中来增强(图7A和7B)。
选择ICOS.33 IgG1f S267E进一步研发，因为其在CHO FcR分析中具有刺激IFN-γ产生并诱导细胞增殖的能力(图5)，且相较于经测试的其它抗ICOS抗体，其在SEB分析中具有更高功能活性(图6)。
实例4
通过ICOS.33 IgG1f S267E逆转调节T细胞抑制
此研究目的是确定ICOS.33 IgG1f S267E对效应T细胞(Teff)增殖和Treg介导的抑制的作用。
在37℃下用抗CD3(3μg/mL)与ICOS.33 IgG1f S267E(10μg/mL)或抗KLH(不结合含于PBS中的ICOS蛋白(10μg/mL)的同型对照)的组合涂覆U底盘三小时。使用RosetteSep CD4+ T富集混合物结合Ficoll-Paque分离，遵循RosetteSep制造商的使用说明书从全新鲜分离肤色血球层CD4+ T细胞。富集的CD4+ T细胞用针对CD4、CD25、CD127、CD45RA和CD45RO的结合荧光团的单克隆抗体在FACS分选缓冲液中加以染色。然后使用FACSAria II细胞分选仪将CD4+ T细胞分选成Teff(CD4+CD25loCD127hi)、RA+Treg(CD4+CD25hiCD127lo/CD45RA+/CD45RO-)和RO+Treg(CD4+CD25hiCD127lo/CD45RA-/CD45RO+)细胞群体。分选出的Treg用CellTraceTMViolet(CTV)增殖染料根据制造商的使用说明书以5μM的浓度标记。分选的Teff用CellTrace CFSETM增殖染料(CFSE)根据制造商的使用说明书标记，只是其以1.25μM的更高稀释度用于减小在先前实验中可见的细胞毒性效应。
将含于100μL完全培养基中的五万个经分选和经CFSE标记的Teff添加至经抗CD3和ICOS.33 IgG1f S267E或同型对照涂覆的96孔盘的各孔中。这些是在添加或不添加2μg/mL(至1μg/mL的最终浓度)的抗CD28的情况下制得。然后将含于100μL完全培养基中的滴定数量的经分选和经CTV标记的Treg添加至各孔中，以5x104个Treg(1:1Treg:Teff)开始并在后续孔中2倍递减(1:2、1:4等)。
当细胞用可固定活力染料Ghost Red-780染色以排除死细胞时，在37℃下将培养物培养六天。使用BD FACSCanto II流式细胞仪收集流动式细胞测量术数据。Teff增殖百分率使用FACSDiva流动式细胞测量术分析软件测定。Teff增殖百分率通过对在至少一轮分裂后已稀释Teff的CellTrace CFSE增殖染料的Teff进行门控来测定。
此实例显示ICOS.33 IgG1f S267E均逆转Treg介导的抑制和增强Teff增殖，如图8A和8B中显示。图8A和8B的图例中显示的值是Teff:Teg比率。因此，值为1意指1个Teff对1个Treg的比率，值为2意指2个Teff对1个Treg等等，基本向下滴定Treg。在1:1比率下，ICOS.33 IgG1f S267E显示增殖的约4倍增加和RA+Treg介导的抑制的明显逆转。还观测到增殖的7倍增加和RO+Treg介导的抑制的明显逆转，如通过在同型对照与ICOS抗体之间的分裂Teff的百分率的差值测量。随着Treg被滴定出，相对于同型对照，表观抑制成比例下降，且在无Treg的情况下，分裂的Teff的百分率增加约1.5倍。在Treg的存在下的效应可以是Teff对Treg抑制敏感性下降或Treg抑制能力下降的结果。ICOS.33 IgG1f S267E逆转Treg介导的抑制和增强Teff增殖是有利的，因为此显示ICOS.33 IgG1f S267E刺激免疫反应。
实例5
ICOS.33 IgG1f S267E的活体外Fc效应功能
此研究目的是评估ICOS.33 IgG1f S267E的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和补体C1q因子结合活性。
用钙黄绿素AM进行靶细胞标记
来自供体2的CD4+ T细胞(Stanford Blood ID W070516511239)经分离、活化和经钙黄绿素AM标记。简单地说，外周血单核细胞(PBMC)通过密度梯度离心从肝素化肤色血球层纯化并用2％FBS(HyClone)补充的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。通过负向选择、使用基于磁珠的分离试剂盒(StemCell Technologies)和自动化RoboSep细胞分离器(StemCellTechnologies)分离出CD4+ T细胞。自CD4+ T细胞分离后，使用基于磁珠的分离试剂盒(Miltenyi Biotec)耗尽CD25+ Treg。纯化的CD4+ T细胞以2.5x 106个细胞/mL再悬浮于R10培养基中并用T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi Biotec)以每两个细胞一个珠在37℃下活化三天。第3天，对细胞计数，粒化并以1x 106个细胞/mL再悬浮于15mL锥形管中的PBS中。钙黄绿素AM试剂是通过向含有50μg冻干试剂的试剂管中添加20μL超纯DMSO加以制备。针对每1mL体积，将2μL体积的复水钙黄绿素AM添加至悬浮细胞中。将细胞涡旋并在37℃培养器中放置30分钟。在培养周期后，经标记的靶细胞用ADCC分析培养基清洗三次，且在分析培养基中将其浓度调整至105个细胞/mL。
以活化的CD4+ T细胞作为靶的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)分析
从两个不同供体(BDC供体9和12)的新鲜PBMC纯化原代人类NK效应细胞并用IL-2刺激。简单地说，通过密度梯度离心、从肝素化全血样本纯化PBMC并用2％FBS(HyClone)补充的PBS清洗。通过负向选择、使用基于磁珠的分离试剂盒(Miltenyi Biotech)和autoMACs分离器(Miltenyi Biotech)从PBMC中分离出NK细胞。纯化的NK细胞是以1x106个细胞/mL再悬浮于以500IU/mL IL-2补充的MyeloCult培养基中并在37℃下培养整夜。
第二天，活化的NK效应细胞在分析培养基中清洗两次且其浓度在所述分析培养基中调整至4.33至5x105个细胞/mL。将标记的靶细胞(50μL/孔)添加至含有50μL/孔测试或对照抗体的U底96孔盘中。然后添加活化的NK效应细胞(100μL/孔)以产生10:1的最终效应细胞:靶细胞比率(E:T)和0.0002μg/mL至1μg/mL的范围内变化的最终抗体浓度。将所述盘在湿润的37℃培养器中放置两小时。将上清液(50μL/孔)转移至光学96孔黑色盘内，并在设定至485激发和535发射过滤器的EnVision盘读取仪上读取荧光强度。
在无抗体的情况下用效应细胞培养的靶细胞为与抗体无关的细胞溶解(自发细胞溶解)的背景提供对照，而用20μL或100μL/孔Delfia细胞溶解缓冲液溶解的靶细胞在分析中表示最大释放。
抗体依赖性细胞溶解百分率是基于平均荧光强度(MFI)以下式计算：
Figure GDA0002365581830001041
靶细胞溶解百分率是使用GraphPad Inc的Prism v5.01软件针对各抗体绘图。
结果
以活化的CD4+ T细胞作为靶的原代NK ADCC
测试抗ICOS抗体ICOS.33 IgG1f S267E诱导表达ICOS的靶CD4+ T细胞的ADCC的能力并比较ICOS.33 IgG1诱导的ADCC。两个实验用靶细胞和NK细胞供体对进行。在各情况下，相较于ICOS.33 IgG1，具有经修饰的IgG1同型的ICOS.33 IgG1f S267E诱导经活化的CD4+T细胞的较少ADCC。来自这些实验的数据是汇总于表11和图9A和9B中。
表11：由抗ICOS IgG1和经修饰的IgG1同型介导的ADCC的比较
Figure GDA0002365581830001051
C1q结合分析
ICOS.33 IgG1f S267E与人类C1q的结合是通过ELISA研究。所有抗体以含于PBS中的10μg/mL以50μL每孔涂覆于高结合免疫分析盘上。包括孔仅涂覆PBS的非特异性结合对照。所述盘在4℃下培养整夜。第二天，将所述盘和所有试剂平衡至室温；所有后续步骤是在周围室温下进行。未被占据的蛋白质结合位点是用
Figure GDA0002365581830001052
以200μL每孔阻断30分钟。所述盘用清洗溶液(PBS+0.05％Tween-20)以200μL/孔清洗3次。以50μL/孔添加分级剂量的含于ELISA分析缓冲液中的人类C1q(48.00至0.76μM)。将所述盘培养两小时并用清洗溶液清洗三次。人类C1q与固定化抗体的结合是通过将生物素化小鼠抗C1q mAb在ELISA分析缓冲液中以1:1000稀释并培养一小时加以检测。在将所述盘清洗三次后，以50μL/孔添加结合物缓冲液中1:5000稀释的链霉亲和素-聚HRP并培养30分钟。完成最终清洗步骤，且所述盘用TMB底物以50μL/孔显影5分钟。光学密度是在650nm下、在SpectraMax 340PC384微量盘读取仪(Molecular Device)上读取。数据使用Prism(5.01版)绘图。
结果
ICOS.33 IgG1f S267E结合人类补体的C1q组分
测试抗ICOS抗体ICOS.33 IgG1f S267E在ELISA分析中相较于ICOS.33 IgG1结合人类补体的C1q组分的能力。相较于ICOS.33 IgG1，发现ICOS.33 IgG1f S267E以更高亲和力结合人类C1q。数据汇总于图10和表12中。
表12：ICOS.33 IgG1f S267E结合人类C1q
Figure GDA0002365581830001061
结论
具有经修饰的IgG1的ICOS.33 IgG1f S267E诱导表达ICOS的CD4+ T细胞的更少ADCC介导的杀死，但相较于具有野生型IgG1的抗ICOS抗体，以更高亲和力结合至人类C1q。
实例6
活体内抗肿瘤活性
抗小鼠ICOS作为单一疗法或与其它药剂组合的抗肿瘤活性
对T细胞表面受体(共刺激和共抑制两者)具特异性的抗体的同型的变化可改变抗肿瘤活性。产生17G9和ICOS.4两者的小鼠Fc同型变体且以小鼠IgG2a同型表达。如下文描述，相较于小鼠IgG1变体，两者均显示绝佳的抗肿瘤活性。尽管不受任何理论的束缚，但此很可能由于肿瘤位点处的T调节细胞(Treg)耗尽和自ICOS的抗体介导的促效作用造成的效应T细胞(Teff)扩增。针对17G9 Ab的小鼠研究还显示下调脾脏和肿瘤两者中的T细胞群体上的ICOS受体。在经接合FcR的Ab同型(mIgG1和mIgG2a)治疗的小鼠中观测到更低的ICOS表达，而受体浓度在非FcγR结合Ab(mIgG1 D265A，也被称为“ICOS.1 D265A”)治疗的小鼠中无变化。对FcγR相互作用的依赖表明此下调需交联。重要地，即使下调受体仍可显示抗肿瘤活性。
17G9(ICOS.1)和亲代仓鼠抗体(ICOS.4)两者的小鼠IgG1变体因结合至FcRII(抑制受体)的能力而均预期具有促效剂活性。如表13中汇总，两种小鼠IgG1变体相较于IgG2a同型在可检测但较低的程度下均显示抗肿瘤活性，和肿瘤Treg的较小减少。相反，不结合FcR(17G9-IgG1-D265A)的抗ICOS抗体不显示抗肿瘤活性。尽管耗尽同型(例如小鼠IgG2a)相较于促效性mIgG1显示更高抗肿瘤活性，但当结合预期更选择性耗尽Treg的另一治疗(例如抗CTLA-4抗体治疗)考虑时，ICOS于Teff上的高表达使得此作用机制不太有利。与在具有S267E突变的同型中活体外发现更佳促效剂活性一致，这些同型在人类FcR转基因小鼠中还显示相较于人类IgG1略高或相等的抗肿瘤活性。
表13：使用抗小鼠ICOS作为单一疗法或与其它药物组合的效用研究的汇总
Figure GDA0002365581830001071
ICOS IgG1 Fc变体的抗肿瘤活性
为确定人类IgG1 S267E是否与小鼠IgG1抗体类似地表达，但关于针对CD32的FcR结合和促效性受体接合具有更高效力，进行额外肿瘤模型实验。具体地说，为评估人类Fc受体(FcR)-转基因小鼠中的抗人类ICOS同型变体，构筑下列抗体：
(a)抗ICOS hIgG1-针对小鼠ICOS的单克隆抗体、嵌合仓鼠/小鼠抗小鼠ICOS、同型IgG1(ICOS.4 hg1)；
(b)抗ICOS hIgG1 SE-针对小鼠ICOS的单克隆抗体、嵌合仓鼠/小鼠抗小鼠ICOS、同型IgG1 SE(ICOS.4 hg1 SE)，所述抗体具有容许其相较于未修饰的版本更好地结合至CD32R和CD32B的突变；和
(c)IgG1同型对照-完全人类IgG1同型对照(DT-1D12 hg1)。
将MC38鼠科结肠癌细胞皮下植入小鼠的右胁腹中。将小鼠分为三个治疗组并在移植后的第7、10和14天给药60μg的(1)抗ICOS IgG1或(2)抗ICOS IgG1 SE，或(3)IgG1同型对照抗体(即，与ICOS抗体为相同同型、但不结合任何天然存在的鼠科蛋白质的抗体，例如，针对KLH、白喉毒素等的抗体)。每周两次测量体重和肿瘤尺寸，直至第52天的研究结束。若肿瘤≥2000mm3或出现溃烂，则将动物安乐死。针对每只小鼠的60μg抗ICOS IgG1 SE mAb治疗观测到抗肿瘤活性的增强；如表14和图11A至C中显示，相较于无SE修饰的抗ICOS IgG1的63％，平均肿瘤生长抑制(TGI)是76％。未观测到与治疗相关的体重显著变化，还观测到临床毒性的任何明显体征。
结果
在人类FcR-转基因小鼠模型中，ICOS IgG1 SE和ICOS IgG1 mAb的投与分别导致76％和63％平均肿瘤生长抑制(TGI)(如表14中显示)。在测试的剂量程度(60μg/小鼠)下在各组中观测到五次完全消退(表14和图11A-C)。未见毒性或体重损失的身体体征。
表14：ICOS IgG1 Fc变体的抗肿瘤活性
Figure GDA0002365581830001081
a完全消退＝在研究的最后一天至少3次测量的肿瘤<20mm3的小鼠。
b具有人类IgG1的ICOS.4
c具有人类IgG1和S267E突变的ICOS.4
总结
在Ravetch同基因肿瘤模型研究(汇总于表15中)中，两种抗ICOS单一疗法均促进适度的抗肿瘤活性，且抗ICOS IgG1 SE在第30天显示略大的功效(76％相比于63％平均TGI)(表14)。未观测到与治疗相关的体重显著变化，也未观测到临床毒性的任何明显体征。总体而言，抗ICOS单一疗法促进抗肿瘤活性，且抗ICOS IgG1 SE在第30天显示略大的功效(76％相比于63％平均TGI)。两种治疗皆引起五只小鼠排斥其肿瘤。未观测到与治疗相关的体重显著变化，也未观测到临床毒性的任何明显体征。
Figure GDA0002365581830001091
表15：活体内药理学研究
实例7
Sa1N肿瘤模型
Sa1N纤维肉瘤小鼠模型用于评估嵌合抗ICOS单克隆抗体的抗肿瘤活性。ICOS.4mIgG1是ICOS.33 IgG1 S267E的良好替代物，因为此ICOS.4变体优先结合至小鼠抑制Fc受体。因为所述肿瘤模型是在表达小鼠Fc受体的小鼠中进行，此使得ICOS.4变体成为人类抗体的良好替代物。ICOS.4 mIgG2a变体是ICOS.33 IgG1抗体的良好替代物，因为此ICOS.4变体更类似于人类IgG1，因为其结合至小鼠活化Fc受体。此外，这些变体作为替代物是尤其相关的，因为其可变区中无需修饰，其可变区已与小鼠和人类ICOS蛋白两者交叉反应。相反，抗ICOS.1鼠科IgG1(mIgG1)D265A不结合FcR。不结合至ICOS蛋白的IgG1抗体用作同型对照。
为在Sa1N纤维肉瘤模型中在用嵌合抗ICOS替代单克隆抗体治疗后评估抗肿瘤活性，将Sa1N细胞皮下移植至小鼠的右胁腹中。在移植后的第7、10和14天，向五个治疗组中的小鼠给予mAb：
(1)嵌合抗ICOS.1鼠科IgG1(mIgG1)D265A，
(2)抗ICOS.4 mIgG1，
(3)抗ICOS.4 hIgG1，
(4)抗ICOS.4 mIgG2a或
(5)IgG1同型对照，
各为10mg/kg。
在第15天，从每组四只小鼠获取肿瘤和脾脏以用于免疫监测分析。在剩余小鼠中，每周两次地测量体重和肿瘤尺寸，直至第56天的研究结束。若肿瘤≥2000mm3或出现溃烂，则将动物安乐死。
在移植后的第23天(平均肿瘤生长抑制(TGI)可基于仍活着的60％的治疗组动物计算的最后一天)，当相较于同型对照治疗时，抗ICOS同型对Sa1N肿瘤的治疗功效是显而易见的。中位TGI值是21％(ICOS.1 mIgG1 D265A)、55％(ICOS.4 mIgG1)、69％(ICOS.4hIgG1)和84％(ICOS.4 mIgG2a)。在任何治疗组中如由平均和中位体重损失仍低于20％证实无明显毒性。
免疫监测数据指示所有抗ICOS同型中的变化程度的肿瘤内Treg耗尽。另外，在所有抗mICOS.4治疗中观测到高浓度的肿瘤内CD8+ T细胞。
肿瘤反应与第15天的Treg减少Day部分相关，此与这些mAb与Fc受体的相对结合一致。这些数据表明减少Treg的抗ICOS mAb相较于不减少Treg者更为有效。
抗肿瘤治疗
在移植后的第7天(2015年2月02日)，将70只小鼠根据肿瘤体积(L×W×H/2)随机分成五组，每组14只小鼠。各组的平均肿瘤体积是约134mm3。在第7、10和14天，投与同型对照或指定mAb。向小鼠腹膜内(IP)给药。
T细胞群体的免疫监测
为进一步研究细胞层面的抗肿瘤活性，进行免疫监测以观察肿瘤位点的免疫细胞子集合并判定抗体治疗与淋巴细胞群体变化之间是否存在关联。在第15天，由动物设施操作员获取各治疗组的四只小鼠的肿瘤和脾脏。将所述组织首先在温和的MACS OctoDissociatorTM(Miltenyi,加州圣地亚哥(San Diego,CA))上处理和然后针对不同T细胞标志物进行染色。样本是通过流动式细胞测量术在Fortessa细胞计数器(BD Biosciences,加州圣荷西(San Jose,CA))上进行分析。
治疗后监测
每周两次测量小鼠的肿瘤和体重，直至研究结束。肿瘤是以三维方式用电子数字卡尺测量，且数据是使用Studylog Systems(加州南旧金山(South San Francisco,CA))的StudyDirector软件以电子文件方式记录。每日检查小鼠的姿势、理毛行为(grooming)和呼吸变化和嗜睡。当肿瘤实现2000mm3端点或出现溃烂时，将小鼠安乐死。
结果
肿瘤反应
研究中的所有小鼠均活着的最后一天是在移植后的第14天(IP给药的最后一天)。因此，无法计算平均肿瘤生长抑制(TGI)。在移植后的第23天(可计算中位TGI的最后一天)，抗ICOS同型对Sa1N肿瘤的治疗功效当相较于同型对照治疗时是显而易见的。中位TGI值是21％(ICOS.1 mIgG1 D265A)、55％(ICOS.4 mIgG1)、69％(ICOS.4 hIgG1)和84％(ICOS.4mIgG2a)。
治疗组的肿瘤生长曲线显示于图12A至E中。治疗组的TGI汇总于表16中。治疗组的平均和中位肿瘤生长曲线呈现于图13A和13B中。
表16：治疗组的肿瘤生长
Figure GDA0002365581830001111
抗ICOS同型间的功效差异证实mIgG2a>hIgG1>mIgG1>mIgG1 D265A的层级。无法结合FcR的惰性mIgG1 D265A变体在第23天显示具有21％中位TGI的一些抗肿瘤活性。未修饰的mIgG1同型(其可接合抑制Fc受体FcγRIIB)可加强促效作用且在此研究中在第23天显示55％中位TGI。与其较高的TGI值一致，mIgG2a和hIgG1同型可结合活化受体的鼠科并介导表达ICOS的Treg的ADCC或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。另外，在小鼠肿瘤模型中，肿瘤内Treg浓度的减小会增加肿瘤消退。在任何治疗组中未见明显毒性，因为平均和中位体重变化低于20％。
T细胞群体的变化
如图14A至D中显示，在第15天在经抗ICOS.4 mAb的mIgG2a和hIgG1变体治疗的组中观测到Treg耗尽，因为相较于同型对照组，这些组中的Foxp3+细胞的百分率显著更低。非耗尽抗ICOS抗体(mIgG1)治疗组中也观测到相同趋势。另外，在所有治疗组中，CD4+效应T细胞(Teff)明显增加，且具有下列排序：mIgG1>hIgG1>mIgG2a。此观测表明一些CD4+ Teff(其很可能是ICOS+)可能已经被mIgG2a同型(其具有最高的耗尽潜能)耗尽。所有抗mICOS.4治疗中也观测到高浓度的肿瘤内CD8+ T细胞。
总结
如表17中所汇总，在阶段式Sa1N同基因肿瘤模型中，嵌合抗ICOS同型促进抗肿瘤活性的变化程度，其介于第23天的21％至84％中位TGI的范围内。同型变体在此研究中的抗肿瘤效力如下排序：mIgG2a>hIgG1>mIgG1>mIgG1 D265A。肿瘤反应在第15天与Treg耗尽部分相关，此与这些mAb与Fc受体的相对结合一致。
来自此研究的结果显示同型的选择是抗ICOS抗体治疗的重要决定因素。抗ICOSmIgG2a同型(其与人类IgG1同型等效地结合活化Fcγ受体)可耗尽肿瘤内Treg并在抑制肿瘤生长方面显示最大功效。嵌合抗ICOS同型变体促进抗肿瘤活性的变化程度。肿瘤反应在第15天与Treg耗尽部分相关，此与这些mAb与Fc受体的相对结合一致。结果表明mg2a促进最佳抗肿瘤活性。
表17：活体内药理学研究
Figure GDA0002365581830001121
实例8
抗ICOS抗体与抗PD-1抗体的组合
研究1
为在CT26结肠直肠癌模型中在用不同剂量的抗ICOS替代单克隆抗体ICOS.4(亲代仓鼠抗体的小鼠IgG1变体)和/或抗PD-1 mAb治疗后评估抗肿瘤活性，将CT26细胞皮下植入小鼠的右胁腹中。当肿瘤实现31mm3时，将小鼠随机分为九个治疗组，各组10至14只小鼠。各小鼠在移植后的第7、10和14天给予mAb或同型对照(即，相同同型，但不结合任何天然存在的小鼠蛋白质的抗体，例如，针对KLH、白喉毒素等等的抗体)。
每周两次称重小鼠且测量肿瘤，直至第35天的研究结束。若肿瘤≥2000mm3或出现溃烂，则将动物安乐死。在移植后的第15天，将四个治疗组中的四只小鼠安乐死以获取脾脏和肿瘤。将组织处理成单一细胞悬浮液，且使用流动式细胞测量术抗体对细胞进行染色以分析T细胞群体。
在移植后的第21天(可计算相对于同型对照抗体的平均肿瘤生长抑制(TGI)的最后一天)，抗ICOS单一疗法的TGI值在3mg/kg和10mg/kg下分别是37％和33％；抗PD-1单一疗法的TGI值是22％。当抗ICOS以10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg与抗PD-1 mAb组合时，观测到中位TGI值>54％。当抗ICOS以0.3、0.1或0.03mg/kg与抗PD-1 mAb组合时，观测到中位TGI值<40但>20％。在任何治疗组中均无明显毒性。
抗体治疗
在CT26细胞移植后的第7天，根据肿瘤体积将120只小鼠随机分为10组，各组10至14只小鼠。组具有约31mm3的平均肿瘤体积。在第7、10和14天向小鼠给药抗体。
治疗后监测
每日检查小鼠的姿势、理毛行为和呼吸变化和嗜睡。每周至少两次称重动物，且若体重损失≥20％，则将小鼠安乐死。每周至少两次检查各动物的胁腹的肿瘤的存在和尺寸，直至死亡、安乐死或研究周期结束。使用电子数字卡尺测量肿瘤三维(长度[L]、宽度[W]和高度[H])，并记录。使用如下公式计算肿瘤体积：体积＝(L×W×H×0.5)。以治疗反应作为肿瘤生长抑制(TGI)的测量函数，并计算：(参考组mm3-测试组对象mm3)/参考组mm3×100。当肿瘤达到大于约2000mm3的体积或出现溃烂时，将动物安乐死。
T细胞群体的免疫监测
为研究ICOS抗体对T细胞群体的作用，在移植后第15天分别从四个治疗组中各取四只小鼠的组织。脾脏和肿瘤在温和MACS Octo DissociatorTM(米尔滕伊(Miltenyi),圣地亚哥(San Diego),加利福尼亚州(CA))上均质化。单细胞悬浮液使用结合荧光染料的抗体，针对T细胞标志物进行染色。采用流动式细胞测量术，在Fortessa细胞计数器(BDBiosciences,圣荷西(San Jose),加利福尼亚州)上检测抗体荧光性，且使用FlowJo软件(FlowJo,LLC,阿什兰(Ashland),俄勒冈州(OR))分析结果。
统计分析
计算肿瘤尺寸的平均值、标准偏差(SD)和中位值，以及平均体重值。计算100％的研究动物仍然活着时的平均值；并计算至少60％的研究动物仍然活着时的中位值。使用单方差分析(ANOVA)判定治疗组之间的平均值是否具统计学显著差异性；p值≤0.05被认为显著差异。使用GraphPad
Figure GDA0002365581830001131
5.01版软件(GraphPad软件，加州拉乔拉(La Jolla,CA))绘制数据，并测定组间的统计学差异。治疗组的个别小鼠的肿瘤生长曲线可见于图15A至J中。治疗组的平均和中位肿瘤生长曲线呈现于图16A和16B中。
结果
肿瘤生长抑制
在肿瘤移植后的第21天(可计算中位TGI的最后一天)，经抗ICOS.4 mIgG1作为单一疗法以10mg/kg治疗的小鼠相对于经对照mIgG1抗体治疗的小鼠显示33％中位TGI。经抗ICOS.4 mIgG1单一疗法以3mg/kg治疗的小鼠显示37％TGI和单一药剂抗PD-1 4H2 mAb显示22％TGI。在研究周期结束时(第35天)，无肿瘤小鼠的比例在对照抗体组中是0/10，在抗PD-1组中是0/10，在10mg/kg的抗ICOS.4 mIgG1组中是1/10，且在3mg/kg的抗ICOS.4 mIgG1组中是0/10。抗小鼠PD-1与各种剂量(10、3或1mg/kg)的抗ICOS.4 mIgG1的组合显示优于单一疗法的抗肿瘤活性(TGI值分别54％、60％和66％)。在研究结束时，无肿瘤小鼠的数量在这些组中是相同的(1/10无肿瘤小鼠)，例外是具有4/10无肿瘤小鼠的3mg/kg剂量。另外，中位TGI是也经21天使用在对照组与治疗组之间的效应曲线下面积的相对差值进行计算(表18)。
表18：治疗组的肿瘤生长抑制(相对于同型对照)
Figure GDA0002365581830001141
a中位TGI％是在第21天计算
b中位TGI％(历时21天)是使用对照组与治疗组之间历时21天的效应曲线下面积相对差异来计算
免疫监测分析
免疫监测是在移植后的第15天在某些治疗组中进行(图17A至D)。在经单一药剂抗ICOS.4 mIgG1治疗的组(10mg/kg和3mg/kg)中观测到Foxp3+ Treg于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的耗尽(图17A)。经抗PD-1 mIgG1治疗的小鼠不显示TIL Treg的减少。抗PD1 mIgG1或3mg/kg抗ICOS.4治疗组也显示CD8+ T细胞子集合于TIL中的增加(图17B)。在10mg/kg下，相较于对照组，单一药剂抗ICOS.4治疗似乎具有与此子集合类似的程度。
在用3mg/kg的抗ICOS.4 mIgG1进行单一药剂治疗后，Ki-67(细胞增殖的标志物)的浓度在CD4+效应T细胞子集合中增加(图17C)。还发现3mg/kg抗ICOS mIgG1或单独抗PD-1治疗组中的颗粒酶B(CD8+ T细胞上的溶细胞活性的标志物)阳性细胞百分率更高(图17D)。
总结
在阶段式CT26同基因肿瘤模型中，当抗ICOS.4 mIgG1是以3mg/kg(在第21天，37％TGI，0/10无肿瘤小鼠)相比于10mg/kg(在第21天，33％TGI，0/10无肿瘤小鼠)给药时，抗ICOS.4 mIgG1作为单一疗法显示更有效的TGI。免疫监测数据显示ICOS mIgG1 3mg/kg治疗组比10mg/kg治疗组具有更高百分率的CD8+ T细胞、CD4+效应物中的更高Ki-67浓度和CD8+T细胞中的更高颗粒酶B浓度。这些数据表明就抗ICOS单一疗法而言，3mg/kg剂量比10mg/kg剂量具有更大抗肿瘤活性。
抗ICOS.4 mIgG1 mAb以10mg/kg、3mg/kg和1mg/kg与抗PD-1 mIgG1的组合疗法引起中位TGI值>54％，且这些治疗组具有1/10只无肿瘤小鼠，除3mg/kg的抗ICOS.4以外，其具有4/10只无肿瘤小鼠。这些结果表明在三种最高剂量下，抗ICOS mIgG1与抗PD-1 mIgG1治疗的组合的抗肿瘤活性具有类似程度。
研究2
此研究是经设计以于CT26结肠直肠癌模型中在用不同剂量的抗ICOS替代单克隆抗体ICOS.4(亲代仓鼠抗体的小鼠IgG1变体)和/或抗PD-1 mAb治疗后评估抗肿瘤活性。将CT26细胞皮下植入小鼠的右胁腹中。当肿瘤实现45mm3时，将小鼠随机分为九个治疗组，各组15至20只小鼠。各小鼠在移植后第9、12和15天给予mAb或无关同型对照。每周两次称重小鼠并测量肿瘤，直至第51天的研究结束。若肿瘤≥2000mm3或出现溃烂，则将动物安乐死。在各时间点(在移植肿瘤后的第9天、第15天和第16天)从小鼠获取全血样本用于分析。在移植肿瘤后的第16天，将八个治疗组中的五只小鼠安乐死以获取脾脏和肿瘤。将组织处理成单一细胞悬浮液，且细胞使用流动式细胞测量术抗体染色以分析T细胞群体。
在肿瘤移植后的第29天(可计算相对于同型对照抗体的平均肿瘤生长抑制(TGI)的最后一天)，抗ICOS单一疗法的TGI值在30mg/kg下是5％和在3mg/kg下是33％；抗PD-1单一疗法显示74％的TGI值。当抗ICOS是以30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg与抗PD-1 mAb组合时，观测到平均TGI值>74％。在任何治疗组中无明显毒性。
抗体治疗
在肿瘤移植后的第9天，根据肿瘤体积将200只小鼠随机分为九组，各组15至20只小鼠。组具有约45mm3的平均肿瘤体积。小鼠在第9、12和15天给予抗体。
治疗后监测
每日检查动物的姿势、理毛行为和呼吸变化和嗜睡。每周至少两次地称重动物，且若体重损失≥20％，则将其安乐死。每周至少两次检查各动物的胁腹的肿瘤的存在和尺寸，直至死亡、安乐死或研究周期结束。肿瘤是以三维(长度[L]、宽度[W]和高度[H])用电子数字卡尺进行测量并记录。肿瘤体积是使用下式计算：体积＝(L×W×H×0.5)。对治疗的反应是作为肿瘤生长抑制(TGI)的函数进行测量并如下计算：(参考mm3-测试对象mm3)/参考mm3×100。当肿瘤实现大于约2000mm3的体积或出现溃烂时，将动物安乐死。
T细胞群体的免疫监测
使用各种方法研究ICOS抗体对T和B细胞群体的作用。全血样本是在各种时间点(第9天、第15天和第16天)下取自小鼠和然后处理以用于分析。另外，在移植后的第16天从八个治疗组中的各五只小鼠获取组织。脾脏和肿瘤在温和MACS Octo DissociatorTM(Miltenyi,圣地亚哥,加利福尼亚州)上均质化。单细胞悬浮液是针对T细胞标志物使用结合荧光染料的抗体进行染色。抗体荧光性通过流动式细胞测量术于Fortessa细胞计数器(BD Biosciences,圣荷西,加利福尼亚州)上进行检测，且结果使用FlowJo软件(FlowJo,LLC,阿什兰(Ashland),俄勒冈州(OR))进行分析。
统计分析
计算肿瘤尺寸的平均值、标准偏差(SD)和中位值和平均体重值。计算平均值，同时100％的研究动物仍然活着；并计算中位值，同时至少60％的研究动物仍然活着。使用单因素方差分析(ANOVA)判定治疗组之间的平均值在统计学上是否有显著差异；p值≤0.05被认为是显著差异。使用GraphPad
Figure GDA0002365581830001161
7.02版软件(GraphPad软件，加州拉乔拉(La Jolla,CA))绘制数据并测定组间的统计学差异。治疗组的个别小鼠的肿瘤生长曲线可见于图18A至I中。治疗组的平均值和中位肿瘤生长曲线呈现于图19A和19B中。
结果
肿瘤生长抑制
在肿瘤移植后的第29天(可计算平均TGI的最后一天)，观测到抗ICOS mAb疗法作为单一疗法和与抗PD-1 mAb组合均对CT26肿瘤具有治疗功效(表19)。经抗ICOS.4 mIgG1单一疗法以3mg/kg治疗的小鼠显示33％TGI和经单一药剂抗PD-1 4H2 mAb治疗的小鼠显示74％TGI。在研究周期结束时(第51天)，无肿瘤小鼠的数量在对照抗体组中是0/10，在抗PD-1组中是8/15且在所有抗ICOS.4 mIgG1剂量(30mg/kg、10mg/kg或3mg/kg)中是1/15。抗PD-1与各种剂量(30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg和1mg/kg)的抗ICOS.4 mIgG1的组合显示优于或等于单一疗法的抗肿瘤活性(TGI值分别为74％、80％、87％和78％)。无肿瘤小鼠在研究结束时的数量在四个组合组中是在8至11/15的范围内变化。
表19：治疗组的肿瘤生长抑制(相对于同型对照)
Figure GDA0002365581830001162
Figure GDA0002365581830001171
免疫监测分析
免疫监测是在移植后的各个时间点在某些治疗组中进行(图20A至D)。在移植后的第16天，在经抗ICOS.4 mIgG1 mAb治疗的所有组中观测到FoxP3+ Treg于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的耗尽(图20A和20B)。经单独抗PD-1 mIgG1治疗的携载CT26肿瘤的小鼠不显示TIL Treg的减少。尽管更可变，但相较于对照组中的TIL，所有治疗组中的CD8+ T细胞增加(图20D)。
在用抗PD-1(适度增加)或抗ICOS.4 mIgG1(高度增加)的单一药剂治疗后，Ki-67蛋白(细胞增殖的标志物)的浓度在CD4+效应T细胞子集合中增加(图21A至C)。在抗PD-1和抗ICOS.4 mIgG1组合治疗组中观测到Ki-67浓度的进一步增加。
ICOS-L(ICOS的配体)在用抗ICOS.4抗体治疗后于B细胞上显示更高的平均荧光强度(MFI)水平。ICOS-L的MFI水平在肿瘤移植后的第9天、第15天和第16天所取的全血和在肿瘤移植后的第16天所取的脾脏中也升高。似乎出现其中抗ICOS.4 mIgG1的最高剂量针对ICOS-L具有最高MFI的趋势(图22A至D)。
观察ICOS浓度，CD4+ T细胞上的受体表达损失是在抗体治疗后观测到。此在肿瘤TILS中最为明显(表20)。抗ICOS.4 mIgG1的较高剂量与ICOS的较低浓度相关。抗体剂量(同型对照为30mg/kg和抗PD-1 mIgG1 D265A为5mg/kg；抗ICOS.4 mIgG1 mAb为1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平)是通过在CT26细胞移植后的第9、12和15天腹膜内注射。在各个时间点下(在移植后的第9天、第15天和第16天)收集全血，且在移植后的第16天，从某些治疗组中的五只小鼠获取肿瘤。经由流动式细胞测量术对经处理的样本进行免疫监测分析。
表20：ICOS于CD4+ T细胞上的表达
Figure GDA0002365581830001172
Figure GDA0002365581830001181
总结
如汇总于表21中，于阶段式CT26同基因肿瘤模型中，抗ICOS.4 mIgG1 mAb治疗作为单一药剂或当与抗PD-1 mAb组合时均显示抗肿瘤活性。作为单一疗法，当抗ICOS.4mIgG1以30mg/kg、10mg/kg或3mg/kg给药时，观测到类似程度的抗肿瘤活性，然而3mg/kg剂量在第29天具有最高平均TGI(33％)。在抗ICOS.4 mIgG1治疗组的所有剂量中，免疫监测数据显示FoxP3+ Treg(肿瘤)的耗尽增加、CD8+ T细胞(肿瘤)的更高百分率、CD4+效应物(肿瘤)中的更高Ki-67蛋白浓度、B细胞(全血和脾脏)中的更高ICOS-L浓度和CD4+ T细胞(全血和脾脏)中的ICOS表达损失。这些数据显示抗ICOS单一疗法在此肿瘤模型中具有良好功效。
抗PD-1 mIgG1疗法在此实验中具有非常强的活性。抗ICOS.4 mIgG1 mAb以30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg和1mg/kg与抗PD-1 mIgG1的组合疗法使得平均TGI值≥74％，且这些治疗组具有8-11/15无肿瘤小鼠。这些结果显示在所有剂量下，抗ICOS mIgG1与抗PD-1 mIgG1疗法组合的抗肿瘤活性具有类似程度。抗ICOS和抗PD-1 mAb组合时，在CT26模型中观测到改善的抗肿瘤功效。就与抗PD-1组合的四次剂量(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg)抗ICOS治疗组中的每一者而言，肿瘤生长抑制≥74％，且在这些组中的每一者中，具有至少8/15无肿瘤小鼠。当以3mg/kg给药时，抗ICOS mAb作为单一药剂的肿瘤生长抑制是33％和1/15无肿瘤小鼠。在抗ICOS单一疗法中，免疫监测也显示更低的FoxP3+ Treg、CD8+ T细胞的更高百分率、CD4+效应物中的更高Ki-67浓度、B细胞中的更高ICOS-L浓度和更低ICOS受体表达程度。
表21：活体内非临床药理学研究
Figure GDA0002365581830001182
实例9
抗ICOS抗体与抗CTLA-4的组合在CT26肿瘤模型中的抗肿瘤活性
概述
为于CT26结肠直肠癌模型中在用具有可变Fc的抗ICOS替代单克隆抗体ICOS.4(亲代仓鼠抗体的小鼠IgG1或IgG2变体)和/或抗CTLA-4 mAb治疗后评估抗肿瘤活性，将CT26细胞皮下植入小鼠的右胁腹中。当肿瘤实现96mm3时，将小鼠随机分为六个治疗组，各组10至15只小鼠。各小鼠是在移植后的第13、16和20天给药mAb或同型对照(即，相同同型，但不结合任何天然存在的小鼠蛋白的抗体，例如，针对KLH、白喉毒素等等的抗体)。每周两次称重小鼠并测量肿瘤，直至第66天的研究结束。若肿瘤≥2000mm3或出现溃烂，则将动物安乐死。
在移植后的第30天(可计算相对于同型对照抗体的中位肿瘤生长抑制(TGI)的最后一天)，抗ICOS单一疗法的TGI值对于mIgG1和mIgG2a变体(例如具有VH/VL序列SEQ ID NO:3和4+IgG1或IgG2的嵌合小鼠抗体)分别为15％和69％；抗CTLA-4单一疗法显示-7％的TGI值。当抗ICOS mAb与抗CTLA-4 mAb组合时，观测到40％(mIgG1)和79％(mIgG2a)的平均TGI值。在任何治疗组中无明显毒性。
实验过程
测试抗体和对照
构筑下列抗体：
(a)抗小鼠ICOS小鼠IgG1抗体-抗ICOS.4 mAb同型小鼠IgG1是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系表达；
(b)抗小鼠ICOS小鼠IgG2a抗体-抗ICOS.4 mAb同型小鼠IgG2a是由CHO细胞系表达；
(c)抗小鼠CTLA-4 9D9小鼠IgG2b抗体-针对小鼠CTLA-4无性繁殖系9D9的单克隆抗体同型小鼠IgG2b是由经转染的CHO细胞系表达并调配于PBS中；和
(d)小鼠IgG1同型对照-完全鼠科IgG1抗体，非结合至ICOS；以10mg/kg制备于PBS中。
肿瘤细胞的制备
CT26鼠科结肠癌细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC，目录CRL-2638)且活体外在杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)+10％热灭活胎牛血清(FBS)的无菌培养物中维持，以获得小于10次传代。经由小鼠抗体产生测试证实细胞无病毒。
肿瘤移植
将CT26细胞在RPMI-1640培养基(HyClone/GE Healthcare,Logan UT，目录10-040-CM,Lot 16915003)中培养，所述培养基用10％胎牛血清(FBS)(Gibco,生命技术(LifeTechnologies)，目录26140-079,Lot 1704315)补充。细胞每隔三至四天1:10分裂。使用1-cm注射器和26号半英寸针头在各小鼠的右胁腹皮下植入含于0.2mL PBS中的1×106个CT26细胞。
抗体治疗
在移植CT26细胞后的第13天，根据肿瘤体积将120只小鼠随机分为六组，各组10至15只小鼠。组具有约96mm3的平均肿瘤体积。小鼠在第13、16和20天给予抗体。
治疗后监测
每日检查动物的姿势、理毛行为和呼吸变化和嗜睡。每周至少两次称重动物，且若体重损失大于或等于20％，则将其安乐死。每周至少两次检查各动物的胁腹的肿瘤的存在和尺寸，直至死亡、安乐死或研究周期结束。肿瘤是以三维(长度[L]、宽度[W]和高度[H])用电子数字卡尺进行测量并记录。肿瘤体积使用下式计算：体积＝(L×W×H×0.5)。对治疗的反应是作为肿瘤生长抑制(TGI)的函数进行测量并如下计算：(参考mm3-测试对象mm3)/参考mm3×100。当肿瘤实现大于约2000mm3的体积或出现溃烂时，将动物安乐死。
结果
如表22中显示，在肿瘤移植后的第30天(计算中位TGI的最后一天)，观测到抗ICOSmAb疗法作为单一疗法和与抗CTLA-4 mAb组合均对CT26肿瘤具有治疗功效。经抗ICOS.4变体作为单一疗法治疗的小鼠显示15％中位TGI(mIgG1)和69％TGI(mIgG2a)。抗CTLA-4 mAb(-7％TGI)的组合引起更高的中位TGI，因为抗ICOS.4 mIgG1变体具有40％TGI，和抗ICOS.4mg2a变体具有79％TGI。在研究周期结束时(第66天)，就所有组而言，无肿瘤小鼠的数量是0。治疗组的个别小鼠的肿瘤生长曲线显示于图23A至F中。抗体剂量(同型对照为20mg/kg；抗CTLA-4 mIgG2b、抗ICOS.4 mIgG1和抗ICOS.4mIgG2a为10mg/kg)在CT26细胞移植后的第13、16和20天通过腹膜内注射。
治疗组的平均值和中位肿瘤生长曲线呈现于图24A和24B中。在任何治疗组中无明显毒性，因为平均和中位体重变化低于20％。
表22：治疗组的肿瘤生长抑制
Figure GDA0002365581830001201
Figure GDA0002365581830001211
总结
如表23中所汇总，在阶段式CT26同基因肿瘤模型中，抗ICOS Fc变体单一疗法(即，亲代仓鼠抗体的ICOS.4小鼠IgG1或IgG2变体)均促进适度的抗肿瘤活性，并且抗ICOS.4mIgG2a在第30天显示的功效大于抗ICOS.4 mIgG1(69％相比于15％中位TGI)。抗ICOS.4治疗和抗CTLA-4 mAb的组合增加功效和中位TGI增加至79％(mIgG2a)和40％(mIgG1)。未观测到与治疗相关的体重显著变化，也未观测到临床毒性的任何明显体征。抗ICOS单一疗法促进抗肿瘤活性，且抗ICOS.4 mIgG2a在第30天显示更大的抗肿瘤功效(69％相比于15％中位TGI)。与抗CTLA-4 mAb疗法组合时，抗肿瘤功效增加，和抗ICOS.4 mIgG2a组合组为79％TGI和抗ICOS.4 mIgG1为40％TGI。
表23：活体内药理学研究
Figure GDA0002365581830001212
实例10
亲和力、结合、生物物理性质、强制稳定性和免疫原性
结合性质的表征
人类CD4+ T细胞、食蟹猕猴PBMC和小鼠和大鼠脾脏细胞是以1至2x 106个细胞/mL通过以结合盘的物种特异性抗CD3(在37℃下在6孔盘中以2mL/孔的含于PBS中的4μg/mL溶液涂覆3小时并用1mL培养基清洗两次)+1μg/mL可溶性物种特异性抗CD28于新鲜培养基中培养3至4天加以活化。应注意，在CD3/CD28活化三至四天后，食蟹猕猴PBMC和小鼠和大鼠脾脏细胞主要变为T细胞。在室温下获取所述细胞、计数、离心并再悬浮于染色缓冲液+100μg/mL小鼠IgG中阻断15分钟。在4至8℃下在U底盘中，ICOS.33 IgG1f S267E用染色缓冲液以4倍连续稀释从2μg/mL滴定至0.002μg/mL并与活化的人类、食蟹猕猴、大鼠或小鼠细胞一起培养30分钟。所述细胞然后在150至200μL染色清洗缓冲液中清洗两次并再悬浮于50μLAPC-山羊抗人类IgG(Fc gamma)中，所述APC-山羊抗人类IgG在染色缓冲液中1:200稀释，轻轻涡旋并在4至8℃下在黑暗中培养30分钟。然后将所述细胞在200μL染色清洗缓冲液中清洗一次，再悬浮于染色缓冲液中并在FACS Canto流式细胞仪上进行分析。
如图25A和25B中阐述，ICOS.33 IgG1f S267E显示强烈结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和小鼠T细胞且EC50值在三个物种之间无显著差异。
另外，将ICOS.33 IgG1f S257E的结合活性与两种不同抗ICOS竞争抗体进行比较。简单地说，所述抗体与活化的CD4+ T细胞一起在冰上培养三十分钟。然后清洗所述细胞，且用抗人类-IgG-PE第二试剂检测所结合的抗体。通过流动式细胞测量术测量信号，并计算平均荧光强度。如图26A至B中显示，相较于两种竞争抗体，ICOS.33 IgG1f S267E对活化的CD4+ T细胞显示更大的结合亲和力，如通过EC50计算。如本文讨论，术语“EC50”在使用抗体或其抗原结合片段的活体外分析上下文中是指诱导最大反应的50％(即，最大反应与基线之间的一半)反应的抗体或其抗原结合片段浓度。在图26A中，ICOS.33 IgG1f S267E的EC50是约0.07μg/mL，而竞争抗体1的EC50是约1.4μg/mL，并且竞争抗体2的EC50是约0.4μg/mL。换而言之，ICOS.33 IgG1f S267E的EC50比竞争抗体1的EC50小约20倍，且比竞争抗体2的EC50小约6倍。在图26B中，ICOS.33 IgG1f S267E的EC50是约0.08μg/mL，而竞争抗体1的EC50是约2.4μg/mL并且竞争抗体2的EC50是约1.0μg/mL。换而言之，ICOS.33 IgG1f S267E的EC50比竞争抗体1的EC50小约30倍且比竞争抗体2的EC50小约12倍。
亲和力研究
由于单体人类ICOS不可用，因此测定ICOS.33 IgG1f S267E的真实亲和力的实验是使用ICOS.33 IgG1f S267E Fab片段(Lot PC-1804-04)和人类ICOS Fc(R&D系统，169-CS-050)抗原以BiacoreTM T200设备进行。结合实验是在37℃下进行以在活体内条件下获得(或模型化)抗体对抗原的亲和力。CM4芯片是用Biacore的抗hFc捕获试剂共价涂覆。用乙二胺阻断表面。接着，具有Fc标记物的人类ICOS被捕获于CM4芯片上且ICOS.33 IgG1f S267E的Fab片段以0.91、2.7、25、74、667和2000nM浓度于芯片上流动。
结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)通过时间和反应单位(RU)使用BIA评估软件3.2版进行绘制。将数据相对于1:1Langmuir模型拟合。koff/kon比率由抗体-抗原复合物的解离常数(KD)表示。所述Biacore芯片是用50mm氢氧化钠溶液以100μL/min的流动速率再生。如通过ICOS.33 IgG1f S267E的Fab片段测量的抗体对人类ICOS抗原的亲和力是52nM至65nM。
生物物理分析
ICOS.33 IgG1f S267E的同一性是通过液相色谱术/质谱(LC-MS)证实。就重链和轻链质量测量而言，样本是按照标准测试方法进行去糖基化、还原和烷化并使用WatersLCT Premier ESI-TOF仪器进行分析。基于衍生自DNA序列的氨基酸序列，ICOS.33 IgG1fS267E轻链和重链的质量分别等同于23,795Da和50,161Da的其预测质量分配。
抗体的同一性是通过Edman序列分析确定。抗体重链和轻链的N端氨基酸测序用ABI Procise自动化蛋白质序列分析器进行。ICOS.33 IgG1f S267E的观测N端氨基酸序列匹配轻链和重链的预测氨基酸序列。
使用Agilent 2100生物分析仪系统，测定ICOS.33 IgG1f S267E在非还原(NR)条件下迁移至约160kDa。在还原条件(R)下，重链迁移至约60kDa且轻链迁移至约25kDa。
ICOS.33 IgG1f S267E的纯度是通过毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)测定。样本是用Beckman Coulter Proteome Lab PA 800plus在非还原和还原条件下进行分析。ICOS.33 IgG1f S267E通过CE-SDS在非还原条件下包含93.45％完整IgG。所检测的抗体片段如下：轻链(1.85％)、重链-轻链(0.45％)、两条重链(0.88％)和两条重链和一条轻链(3.37％)。ICOS.33 IgG1f S267E的纯度通过CE-SDS在还原条件下是96.51％(62.22％重链+34.29％轻链)。
ICOS.33 IgG1f S267E是通过疏水性相互作用色谱术(HIC)表征以测定产物异质性的程度。ICOS.33 IgG1f S267E显示具有98.1％主峰、主峰前的0.4％峰和1.5％拖尾肩的低均质性，此指示低化学或构象性异质性。
使用毛细管等电聚焦(cIEF)表征ICOS.33 IgG1f S267E的电荷同功型。样本是使用iCE分析器型号iCE3进行分析。ICOS.33 IgG1f S267E显示7.30至7.72的范围内的等电点(pI)和7.72(45.19％)下的主峰。观测到的其它峰是在7.30(7.51％)、7.40(16.21％)和7.56(31.10％)。观测到的pI范围是在针对IgG1抗体样本预期的正常范围内。
进行与多角度光散射(MALS)耦合的尺寸排阻色谱术(SEC；凝胶过滤)以测定ICOS.33 IgG1f S267E的主要杂质的单体含量和MW分布。发现ICOS.33 IgG1f S267E包含大于99.8％单体。通过MALS的MW分配指示单体组分具有144,300Da的MW。极少量的聚集物具有626,800Da的视MW。
肽指纹分析和测序是通过LC-MS于具有耦合至LTQ-Orbitrap XL质谱仪的AcquityUPLC BEH C18 1.7μm(2.1x 150mm；Waters公司)的Waters Acquity UPLC上分析经消化的肽进行。使用包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的各种消化物的MS/MS数据，重链和轻链序列识别是100％。肽测序证实同种异型是人类IgG1并如由DNA序列预测般匹配预期氨基酸序列。单一N-糖基化位点经证实为重链上的N297。发现双硫键与人类IgG1单克隆抗体预期一致。为了增强CD32b受体结合而发生的S267E突变也于序列中被识别。
存在于ICOS.33 IgG1f S267E上的N连接型糖的寡糖分布是通过毛细管雷射诱导的荧光(cLIF)使用Beckman MDQ仪器测定。存在于ICOS.33 IgG1f S267E上的N连接型聚糖包含不含海藻糖的脱唾液酸双触糖混合物，其相对于半乳糖并入的浓度而变化。主要聚糖结构是G0F(30.64％)和G1F(43.65％)，且在较低程度上，G2F(19.07％)。
使用VP-毛细管差示扫描量热计测定抗体的热稳定性和可逆性。使用Origin 7软件程序分析数据。对于典型人类单克隆抗体来说，热稳定性位于可接受范围内。在热扫描实验中，许多抗体显示三个可解析的解链温度；第一个是由于CH2域的解折叠，第二个是由于Fab域的解折叠和第三个是由于CH3域的解折叠。ICOS.33 IgG1f S267E显示具有三个解折叠温度的热谱：65.2℃(Tm1)、83.2℃(Tm2)、86.3℃(Tm3)。热可逆性是蛋白质在扰动(在此情况下是加热)之后再折叠回到其天然构形的能力的标志。在83.2℃(第二解链温度)下的热可逆性实验显示55.2％可逆性，此表明抗体具有稳健的再折叠性质。
ICOS.33 IgG1f S267E的稳定性汇总于表24中。
表24：ICOS.33 IgG1f S267E的稳定性
Figure GDA0002365581830001241
实例11
依据表面等离子体共振的ICOS.33 IgG1f S267E对人类FcγR的结合亲和力
人类FcγRs对ICOS.33 IgG1f S267E的结合是通过表面等离子体共振(SPR)研究并与对照抗体抗ICOS IgG1f比较。抗体被捕获于蛋白A传感器表面上，且滴定系列的FcγR作为分析物注射。
就这些研究而言，使用标准乙基(二甲基胺基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学物质，在乙醇胺阻断下，在10mm HEPES pH 7.4、150mm NaCl、3mm EDTA、0.05％表面活性剂p20的操作缓冲液中使蛋白A于CM5传感器芯片的流动池1至4上固定至约3000RU的密度。ICOS.33 IgG1f S267E(3μg/mL)或hIgG1f对照抗体(3μg/mL)在蛋白A表面上捕获至约400至500RU的密度，且FcγR分析物的结合是在由10mm NaPO4、130mm NaCl、0.05％p20、缓冲液(PBS-T)pH 7.1组成的操作缓冲液中在25℃下使用120秒结合时间和180秒解离时间在30μL/min的流动速率下进行测试。为测定结合动力学和亲和力，测试1μM降至0.15nM(CD64蛋白)或10μM降至1.5nM(所有其它FcγR)的FcγR浓度系列(3:1稀释)。动力学数据是使用Biacore T200评估软件拟合至1:1朗格缪尔模型或拟合至稳态模型。
将显示具有稳态结合的非常快速结合和解离速率的感测图数据相对于1:1稳态亲和力模型拟合，而将显示较慢动力学的数据相对于1:1Langmuir模型拟合。比较抗ICOS对照抗体和ICOS.33 IgG1f S267E在单一分析物浓度(0.11μM的hCD64和1.1μMh的CD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158、hCD16a-F158、hCD16b-NA1和hCD16b-NA21)下的数据，且ICOS.33 IgG1f S267E针对FcγR中的数种显示较高的结合反应和较慢的解离速率，且hCD32a-R131和hCD32b具有结合和较慢的解离速率的最显著增加。
最合适的动力学和亲和力值显示于表25中。这些数据定量显示相较于hIgG1f对照抗体，S267E突变改变针对数种FcR的结合亲和力。例如，与hCD32a-R131的结合将KD从1500nM(hIgG1f对照)改善至34nM(ICOS.33 IgG1f S267E)，其是大于40倍的改善，并且与hCD32b的结合将KD从大于5000nM(hIgG1f对照)改善至170nM(ICOS.33 IgG1f S267E)，其是至少29倍的改善。与食蟹猕猴CD32a和CD32b的结合低于针对人类CD32a和CD32b所见的结合。
表25：ICOS.33 IgG1f S267E与人类FcγR的结合的动力学和亲和力数据
Figure GDA0002365581830001261
实例12
ICOS.33 IgG1f S267E的药物动力学(PK)
用ICOS.33 IgG1f S267E获自单一剂量PK/PD和耐受性研究的PK参数汇总于表26中。暴露和1mg/kg与10mg/kg之间的剂量成比例，并且半衰期为13至14天。抗药物抗体(ADA)是在1mg/kg剂量组的四只食蟹猕猴的三只中在给药后的七天进行检测并在给药后持续增加长达至42天。ADA信号的增加对应于抗体于这些猴中的快速廓清率，且受ADA影响的此部分数据不包括于PK数据分析中。
表26：ICOS.33 IgG1f S267E在静脉内(IV)投与食蟹猕猴后的药物动力学参数
Figure GDA0002365581830001262
小鼠替代抗体于小鼠中的药物动力学
评估抗小鼠ICOS替代mAb(ICOS.4，亲代仓鼠抗体的小鼠IgG1变体)在1mg/kg单次静脉内剂量和单次腹膜内投与(0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg)之后在不携载肿瘤的BALB/c小鼠(其是实验室繁殖的白化家鼠品系)中的药物动力学。如表27中所示，抗体在1mg/kg至10mg/kg剂量范围内随剂量成比例的暴露显示更大的增幅。半衰期范围是最低1mg/kg剂量下的0.53天至最高10mg/g剂量下的1.5天。小鼠中的非线性PK似乎至少部分归因于靶介导的药物配置。
表27：ICOS.4小鼠IgG1在腹膜内投与小鼠后的药物动力学参数
Figure GDA0002365581830001271
实例13
交叉反应性和组织染色
结合分析已证实ICOS.33 IgG1f S267E对经活化的CD4+ T细胞的亲和力(EC50)在小鼠、大鼠、食蟹猕猴和人类中是类似。
在组织交叉反应性分析中，将结合FITC的ICOS.33 IgG1f S267E施加至来自20种正常人类组织(各为一至四个供体)的冷冻切片(经丙酮或丙酮/福尔马林固定)。在淋巴(胸腺、扁桃体和脾脏)和富含淋巴的组织(胃和小肠)中的淋巴细胞子集合中观测到特异性染色，以及非常罕见的单核细胞(MNC)散布于数个组织(甲状腺、皮肤、肺、子宫和睾丸)中，此主要是与潜在炎症相关。在大脑、小脑、心脏、肝、肾、胰脏、外周神经、结肠、垂体和前列腺中未见阳性标记。在淋巴组织中，阳性淋巴细胞主要分布于胸腺的髓质和扁桃体的生发中心和滤泡间区的亮区中。这些结果是与亲代抗体ICOS.4的先前免疫组织化学(IHC)一致。
ICOS.33 IgG1f S267E-FITC染色是也通过免疫组织化学(IHC)于来自包括大脑、心脏、肝、肺、肾、脾脏、胸腺、扁桃体、皮肤和睾丸的10种正常食蟹猕猴组织的冷冻切片中进行评估。总体而言，染色图案是与在人类组织中类似。在淋巴组织(扁桃体、脾脏和胸腺)中的淋巴细胞子集合中观测到特异性染色。在经检查的组织中未见意外的染色。
实例14
细胞因子释放、补体活化和耐受性
经ICOS.33 IgG1f S267E治疗的人类全血中的细胞因子释放
此研究是经设计以在用ICOS.33 IgG1f S267E对新鲜全血样本治疗后评估人类外周血细胞中的细胞因子反应。
将新鲜正常钠肝素化全血(100μL)添加至96孔圆底盘中。将100μL稀释于AIM V无血清培养基中的ICOS.33 IgG1f S267E或ICOS.33、同型对照抗KLH-hIgG1-2F5 mAb或TGN(5.11A1)抗CD28 mAb添加至孔以获得每孔10μg/mL的最终抗体浓度和每孔200μL的最终体积。将稀释于AIM V培养基中的SEB(100μL)添加至孔，实现100ng/mL SEB的最终浓度以获得每孔200μL的最终体积。将稀释于AIM V培养基中的CD3-CD28(100μL)添加至孔，实现1μg/mLCD3-CD28的最终浓度和每孔200μL的最终体积。将稀释于AIM V培养基中的LPS(100μL)添加至孔，实现10μg/mL LPS的最终浓度和每孔200μL的最终体积。将盘在培养器中在5％至7％CO2气氛下在37℃下培养20小时。20小时后自各孔获取浆细胞培养物上清液并储存于-20℃下。将样本装在干冰容器中运输至BMS新泽西州劳伦斯维尔(Lawrenceville,NJ)(LVL)以用于分析性能。
为评估细胞因子分泌，将12μL预混合标准品、对照品和样本转移至分析盘。将磁珠(6μL)添加至各384孔盘，然后密封并在室温下在盘振荡器上培养两小时。培养两小时后，将磁珠清洗两次，并将6μL检测抗体添加至各孔内。将盘再次密封并在室温下在盘振荡器上培养。将链霉亲和素-藻红蛋白(6μL)添加至含有检测抗体的各孔，然后在室温下培养30分钟，并使用盘清洗器清洗两次。将护套流体(80μL)添加至各孔，并在盘振荡器上将珠再悬浮五分钟。盘样本是通过使用Bioplex 3D仪器数组系统读取。原始数据测量为平均荧光强度(MFI)。浓度(pg/mL)是由Xponent软件计算。
针对ICOS.33 IgG1f S267E介导的细胞因子释放，评估来自八个人类正常供体的血液中的一组75种细胞因子。相较于同型对照，向供体全血添加ICOS.33 IgG1f S267E不介导细胞因子分泌。这些数据显示ICOS.33 IgG1f S267E治疗在全血中不导致细胞因子释放症候群(CRS)。
猴的间歇性剂量静脉内毒性研究
当向猴每周一次或每三周一次历时一个月周期静脉内给药以评估任何可见变化的可逆性、测定对ICOS.33 IgG1f S267E的全身性暴露、评估免疫反应和提供数据以支持ICOS.33 IgG1f S267E于人类中的用途时，进行此研究以测定ICOS.33 IgG1f S267E的潜在毒性和生物活性。ICOS.33 IgG1f S267E是静脉内作为缓慢推注以0(媒剂，每周一次，在第1、8、15、22和29天)、1.5mg/kg(每3周一次，在第1和22天)、15mg/kg(每周一次)或75mg/kg(每周一次)的剂量向五只雌猴和五只雄猴的组投与。所有剂量是以2mL/kg在由20mm组氨酸、260mm蔗糖、50μM二亚乙基三胺五乙酸和0.05％(w/v)聚山梨醇酯80(pH 6.0)组成的媒剂/载剂中投与。作为至少部分潜在药物动力学测量，所有猴是用钥孔血蓝蛋白(KLH，用于刺激初级反应的免疫原)、病毒载体腺病毒-5(Ad5)-Gag和Ad5-Nef(用于刺激抗原特异性CD8 T细胞反应的免疫原)和破伤风类毒素(用于刺激二次反应的免疫原)在第1天加以免疫。例如，用破伤风类毒素免疫容许扩增对破伤风类毒素具特异性的T细胞的数量且容许抗原特异性群体的PK/PD评估。
用于评估的标准包括存活、毒物动力学、临床观测(包括摄食行为)、体重、身体(包括呼吸、心血管和神经系统)和眼科检查、临床病理学评估、(抗ICOS.33 IgG1f S267E抗体；ADA的)免疫原性评估、免疫毒理学和药理学评估(包括CD4辅助T细胞上的受体占有率和受体表达，对KLH或破伤风类毒素的T细胞依赖性抗体反应(TDAR)、外周血淋巴细胞表型分析、T细胞活化、抗原特异性T细胞表型分析和对KLH、Gag或Nef肽的离体回忆反应)器官重量和粗略和微观病理学分析。定期尸检是在1个月(三只/组/性别)和在8周恢复周期(两只/组/性别)后进行。
在重复给药后，平均ICOS.33 IgG1f S267E全身性暴露(AUC[0-T])自15mg/kg至75mg/kg(每周一次)大约按计量成比例增加而在所有剂量下未见实质性性别差异。在以1.5mg/kg(每三周一次)重复给药后，平均ICOS.33 IgG1f S267E全身性暴露(AUC[0-504h])低于(0.4x)在第1天给药后的那些，而在以15mg/kg和75mg/kg(QW)重复给药后的AUC(0-168h)值是略高(2.1倍至2.6倍)于第1天给药后的那些，此表明聚集。
在第8天或在第8天后于分别在1.5mg/kg(每三周一次)和15mg/kg(每周一次)下的10只猴/组中的8和2只中检测到治疗紧急ADA反应。在撤消阶段期间，仅在1.5mg/kg下的猴中检测到ADA。在重复给药后，具有ADA的猴中的血清ICOS.33 IgG1f S267E浓度是通常无法测量(即，<定量下限，LLOQ)或低于在1.5mg/kg和15mg/kg下的无ADA的猴中的血清ICOS.33IgG1f S267E浓度，且ADA的存在有助于降低在1.5mg/kg下的平均AUC值。
针对ICOS.33 IgG1f S267E的毒物动力学汇总是呈现于表28中。
表28：毒物动力学汇总-平均性别-组合值
Figure GDA0002365581830001301
a值是用来自在第8天或/和在第8天后(在首次给药168小时后)具有可检测治疗紧急ADA的动物的数据的包括/排除进行计算。
b平均全身性暴露值是平均自个别AUC(0至72h)和AUC(0至168h)值。
c平均全身性暴露值是平均自个别AUC(0至168h)、AUC(0至336h)和AUC(0至504h)值。
d平均全身性暴露值是平均自个别AUC(0至72h)、AUC(0至168h)、AUC(0至336h)和AUC(0至504h)值。
NA＝不适用
ICOS.33 IgG1f S267E在所有剂量下皆耐受良好，且没有针对以下的ICOS.33IgG1f S267E相关临床观测或影响：体重、身体(包括呼吸、心血管和神经)和眼科评估、血液学、凝血、血清化学、尿分析、器官重量和粗略或微观病理学。另外，在经测试的任何剂量下没有针对以下的ICOS.33 IgG1f S267E相关影响：对破伤风类毒素的TDAR、细胞毒性T细胞、B细胞和NK细胞、T细胞子类型(包括初始CD4 T细胞、效应记忆CD4 T细胞、经CD25+活化的CD4 T细胞、经HLA-DR+活化的CD4 T细胞、初始CD8 T细胞、效应记忆CD8 T细胞、经CD25+活化的CD8 T细胞和经HLA-DR+活化的CD8 T细胞)的绝对数量、CD8+ T细胞增殖和离体回忆反应。
在所有剂量下皆可注意到ICOS.33 IgG1f S267E介导的作用的证据。CD4辅助T细胞上的ICOS受体表达在在第1天给药后的四小时在所有剂量下是接近于0％，此表明ICOS受体的下调和/或内化，且通常在整个给药和恢复周期内在≥15mg/kg下保持较低。低ICOS受体表达排除ICOS受体占有率的有意义评估。在1.5mg/kg下每三周一次投与，在第8天后，CD4辅助T细胞上的ICOS受体表达开始恢复，在第22天给药之前增加至41％，在第22天给药后减少至4％并在第29天增加至42％。受体表达的完全恢复是在第43天(91％)观测到。受体占有率通常与受体表达相关(例如在第22天[给药前]和第29天，71％和85％RO)。一般而言，ICOS受体表达程度是与血清ICOS.33 IgG1f S267E浓度负相关。此是与ICOS.33 IgG1f S267E抗体已导致受体损失的结论一致。
相对于载体对照，存在钥孔血蓝蛋白(KLH)特异性IgM(在第8天高达52％)和IgG反应(在第29天高达78％)的剂量无关抑制。通过ICOS.33 IgG1f S267E抑制对KLH的T细胞依赖性抗体反应可表示替代作用模式，且已在食蟹猕猴的先前研究中观测到。尽管不受任何机制的束缚，通过ICOS共刺激途径的促效剂抑制TDAR可与因为ICOS表达的早期和持续下调所致的T辅助细胞受损的促效作用相关。
在给药和/或恢复周期期间，在所有或一些剂量程度下的其它ICOS.33 IgG1fS267E相关作用包括总T细胞和CD4辅助T细胞的平均绝对数量、百分率CD4 T调节细胞、百分率中央记忆CD4+ T细胞、百分率中央记忆CD8+ T细胞、百分率Ki67+CD4+ T细胞和百分率Gag+和Nef+CD8 T细胞的减少。
总而言之，猴对以≤75mg/kg静脉内剂量每周一次投与一个月的ICOS.33 IgG1fS267E具有临床耐受性。在所有剂量下皆可注意到ICOS.33 IgG1f S267E相关作用，如通过ICOS受体表达和受体占有率变化、对KLH的T细胞依赖性抗体反应的抑制、某些T细胞子集合的浓度降低、减少的CD4-T细胞活化和减小的抗原特异性CD8 T细胞百分率证实。这些变化中的许多在恢复周期结束时在≥15mg/kg QW下仍显而易见，与整个恢复周期持续的ICOS.33 IgG1f S267E暴露和ICOS受体表达在这些剂量下之后续持续下调一致。每三周一次投与的1.5mg/kg的较低剂量在首次给药后导致较低的血清ICOS.33 IgG1f S267E浓度并在第二次给药后容许细胞表面上的受体恢复。不存在不利的ICOS.33 IgG1f S267E相关发现。因此，认为无明显不良作用剂量(NOAEL)是75mg/kg(452,000μg·h/mL的平均AUC[0-168h])。另外，为潜在确定最大推荐人类起始剂量，也认为75mg/kg是最高非严重毒性剂量(HNSTD)。
在猴中的单一剂量静脉内药物动力学和受体占有率研究
ICOS.33 IgG1f S267E的药物动力学是于蛋白质天然猴中评估。所有猴是用2.5mg钥孔血蓝蛋白(KLH)进行肌内免疫。在免疫后，对猴以0、1mg/kg或10mg/kg(媒剂组和1mg/kg和10mg/kg组为N＝2只/性别)的剂量经由股静脉静脉内投与含于20mm组氨酸、250mm蔗糖缓冲液、50μM三胺五乙酸(DPTA)和0.05％聚山梨醇酯80中的ICOS.33 IgG1f S267E(pH 6.0)。在给药前和给药后6、24、72、168、240、336、408、504、672、840和1008小时收集连续血液样本(约0.5mL)。使血液样本凝结和然后在4℃(1500-2000x g)下离心以获得血清。将血清样本储存于-20℃下并经递送以用于在干冰上分析。将未在接受当天分析的样本冷冻储存于经设定以维持温度≤70℃的冷冻器中直至分析。
食蟹猕猴血清样本是使用合格的
Figure GDA0002365581830001311
免疫分析进行分析以用于检测ICOS.33IgG1f S267E。使用生物素化人类ICOS mg1(批次号22Oct2015-生物素)作为ICOS.33 IgG1fS267E的捕获分子。将样本、标准品和QC调整至10％食蟹猕猴血清的最终基质浓度并装载于Gyrolab内。使用具有Gyrolab Bioaffy 200CD的Wash 2V2 Wizard方法。在最终清洗步骤中，经捕获的ICOS.33 IgG1f S267E是使用经Alexa 647标记的小鼠抗Hu IgG Fc特异性单克隆抗体无性繁殖系10C7(批次号15C3483473-10C7A)作为检测分子进行检测。ICOS.33IgG1f S267E于食蟹猕猴血清样本中的浓度是使用产生自ICOS.33 IgG1f S267E校准器的4参数逻辑(4-PL)校准曲线自通过Gyrolab测量的荧光强度加以计算。
ICOS.33 IgG1f S267E校准曲线的范围在食蟹猕猴血清中是自3ng/mL至30,000ng/mL。定量的上限和下限分别是30,000ng/mL和3ng/mL(即，ULOQ 30000ng/mL、LLOQ3ng/mL)。质量对照样本是在20ng/mL、200ng/mL、2,000ng/mL和20,000ng/mL下于食蟹猕猴血清中制备并于各CD上分析以确保可接受的分析性能。校准品、QC和样本是于PTB中10倍稀释。分析性能是于可接受的范围内：标准品的％CV是低于25％，和QC恢复是于标称值的±30％内。
通过ABO/BAS(新泽西州劳伦斯维尔(Lawrenceville,New Jersey))，使用合格的电化学发光免疫分析于Meso Scale Discovery(MSD)平台上分析猴血清样本中抗ICOS.33IgG1f S267E ADA的存在。使用ICOS.33 IgG1f S267E小鼠抗特应型抗体细胞上清液以制备阳性对照(PC)。使用生物素化ICOS.33 IgG1f S267E作为捕获分子和使用经磺基标识物标记的ICOS.33 IgG1f S267E作为检测试剂。使生物素化ICOS.33 IgG1f S267E和经磺基标识物标记的ICOS.33 IgG1f S267E稀释于PTB中并组合以产生主要混合物，所述混合物具有最终浓度1,000ng/mL的经磺基标识物标记的ICOS.33 IgG1f S267E和1,000ng/mL的生物素化ICOS.33 IgG1f S267E。样本是以10％最小所需稀释度(MRD)稀释于主要混合物中并在22℃下培养2小时。然后以50μL/孔将主要混合物转移至经链霉亲和素涂覆的MSD盘内。在22℃下再培养一小时后，清洗所述盘并添加MSD读取缓冲液。然后在MSD Sector Imager 6000上立即对盘进行读取。猴血清样本中可检测抗ICOS.33 IgG1f S267E抗体的存在是使用样本信号相比于阴性样本信号的比率确定。
猴血清样本是通过BAR(新泽西州劳伦斯维尔)分析。使用直接胰蛋白酶消化反相液相色谱术串联质谱(LC/MS/MS)分析食蟹猕猴血清样本的“总”ICOS.33 IgG1f S267E。使用免疫亲和富集靶捕获LC/MS/MS也分析猴血清样本的位置N329的脱酰胺基和未经修饰的ICOS.33 IgG1f S267E。定义分析范围的标准曲线是于市售获得的食蟹猕猴血清中制备并用研究样本作为完整的分析组进行分析。“总”ICOS.33 IgG1f S267E的浓度是以μg/ml经由Excel电子表格记录以用于毒物动力学和药物动力学阐述。
PK参数值是使用非隔室分析方法(Phoenix WinNonlin 6.4,Certara,新泽西州普林斯顿(Princeton,New Jersey))计算。低于定量下限(LLOQ：ICOS.33 IgG1f S267E为<10ng/mL(0.07nM))的暴露值是不用于分析中。自时间0至最终取样时间的曲线下面积(AUC(0至T))是使用线性和对数梯形总和的组合进行计算。
向食蟹猕猴单一静脉内给药1mg/kg和10mg/kg后的ICOS.33 IgG1f S267E的PK参数是汇总于表29中。静脉内投与后，ICOS.33 IgG1f S267E的血浆浓度显示双指数下降。在第7天后，在1mg/kg组的四只猴的三只中观测到加速的廓清率。因此，仅直至第14天的浓度时间数据是用于1mg/kg剂量组下的所有动物以用于分析，并报道AUC(0至14天)以消除ADA的影响。血浆样本的免疫原性测试表明八只猴中的五只是经入选于研究ADA的研究中，且具有较高ADA浓度的猴在1mg/kg剂量下显示更快的廓清率。报道10mg/kg组的AUC(0至42天)。ICOS.33 IgG1f S267E在Cmax和AUC(0-T)和AUC(0-INF)中显示接近于剂量成比例增加。以在1:10的比率下的剂量增量，雄性和雌性猴中的Cmax分别以1:8和1:8的比率增加；和AUC(0-T)分别以1:16和1:11的比率增加，和AUC(0-INF)分别以比率1:11和1:11增加。
完整ICOS.33 IgG1f S267E和脱酰胺基产物在10mg/kg静脉内给药后的浓度是使用LCMS/MS定量。脱酰胺基产物的浓度在所有经测量的时间点下介于总ICOS.33 IgG1fS267E的0.5％至8％之间。脱酰胺基产物的AUC(0至42天)是总ICOS.33 IgG1f S267E的暴露的2.9％。
表29：药物动力学汇总
Figure GDA0002365581830001331
a在1mg/kg剂量组中在第14天经截断的AUC(0-T)
b针对10mg/kg剂量组的动物报道的AUC(0至42天)
c猴的数量＝2只/性别
dAUC的>20％是经外推
尽管是于活体外观测到增加的C1q结合，但在单一剂量研究中在猴中的明显临床体征的缺乏和心血管仪器化猴模型中的血液动力学效应的缺乏显示补体活化的低风险。当作为单一剂量以1mg/kg或10mg/kg向食蟹猕猴静脉内给药时，ICOS.33 IgG1f S267E是经良好耐受且暴露与剂量成比例增加。未观测到不利临床病理学发现。
实例15
抗ICOS抗体结合竞争
进行抗原决定基分组(Epitope binning)实验以确定哪些抗ICOS抗体与其它哪些抗体竞争结合至huICOS。抗原决定基分组是使用竞争性免疫分析以成对组合方式测试抗体的方法，并且竞争相同结合区(即抗原的相同或紧密相关的抗原决定基)的抗体一起归入同组。抗huICOS抗体间的成对竞争如下确定。参考抗体(即，ICOS.33、20H4、27B9、23B6、12D10、23A10、15B7、12F3、13B4、17H9、26E11、23H5、6D1、12A9、5C4、10B10、17C4、1D7、21E1、9F11、15H11、25B10、8A10、4D11、6D5、7C6、26E9、3E8、16H4、25E4或2644)结合至传感器芯片的表面，将测试抗体与huICOS多肽构筑体混合预培养，且使预培养的混合物流动通过传感器芯片以在芯片表面上测定测试抗体干扰huICOS多肽构筑体对参考抗体的结合的程度。竞争实验是使用
Figure GDA0002365581830001342
表面等离子体共振(SPR)仪器进行。具体地说，将参考抗huICOS抗体固定至传感器芯片CM5芯片(S系列，GE Healthcare目录号BR-1005-30)表面上，使用流动池2、流动池3和流动池4(5000个共振单位，RU)和流动池1作为阴性对照。测试抗体(即，ICOS.33、20H4、27B9、23B6、12D10、23A10、15B7、12F3、13B4、17H9、26E11、23H5、6D1、12A9、5C4、10B10、17C4、1D7、21E1、9F11、15H11、25B10、8A10、4D11、6D5、7C6、26E9、3E8、16H4、25E4或2644)在起始浓度下稀释至120μg/mL(2X)。通过用缓冲液按1:3浓度稀释抗体以获得七种不同浓度和对照样本(0μg/ml)来产生测试抗体的一系列稀释液。将每个系列的抗体浓度分为两半。在浓度系列的前半部分中，添加40nM(2X)人类ICOS抗原(例如huICOS/Fc)以在各孔中制得最终浓度系列(60μg/ml至0.0μg/ml)和20nM的最终抗原浓度。在浓度系列的后半部分中，替代抗原，添加缓冲液以将抗体稀释至相同浓度，且此半部分作为空白处理。将测试抗ICOS抗体和huICOS/Fc的复合物培养两小时。以30μL/min将40μL复合物注射于经参考抗体涂覆的表面上。使用
Figure GDA0002365581830001341
T200SPR仪器并且操作缓冲液是HBE-EP(GE Healthcare目录号BR-1001-88，经过滤、脱气)、0.01M HEPES pH 7.4、0.15NaCl、3mm EDTA、0.005％表面活性剂P20。所述表面用25mm NaOH(订购代码：BR-1003-58，GE Healthcare)以100μL/min再生五秒。使用Microsoft Excel分析数据，其中测试抗体的浓度针对相应的反应单位绘图以获得滴定曲线。
结合竞争实验确定抗体ICOS.33、20H4、27B9、23B6、12D10、23A10、15B7、12F3、13B4、17H9、26E11、23H5、6D1、12A9、5C4、10B10、17C4、1D7、21E1、9F11、15H11、25B10、8A10、4D11、6D5、7C6和26E9彼此交叉竞争，并阻断配体(B7-H2；ICOS-L)结合至huICOS。抗体3E8、16H4和25E4彼此交叉竞争但不阻断配体结合至huICOS。相反，尽管发现抗体2644与抗体3E8交叉竞争，但其也可阻断配体结合至ICOS。
实例16
抗ICOS抗体抗原决定基定位
通过酵母呈现进行的抗ICOS抗体抗原决定基定位
抗huICOS抗体3E8和ICOS.4的抗原决定基如下测定：以酵母细胞(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))呈现人类ICOS的细胞外域(NP_036224.1的残基21至134，作为SEQ ID NO:173提供)的随机诱变变体，并基于其结合或不结合至特定抗体来分选酵母细胞。所选酵母细胞是基于其结合至所测试抗ICOS抗体的能力而扩增并经受额外几轮选择。参见例如曹(Chao)等人(2004)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)342:539。针对所得酵母测定huICOS变体的序列且分析各残基对抗体结合的影响。本发明抗体的结合抗原决定基经测定为huICOS序列内的基因座，在所述基因座中，单一氨基酸突变会破坏与本发明的抗huICOS抗体的结合。
简单地说，使用易错PCR将编码人类ICOS的DNA(编码SEQ ID NO:1的残基21至134)克隆至构筑体内，从而使huICOS变体作为进一步包含c-myc标签序列和酵母细胞壁蛋白Aga1p的融合蛋白的胺基端部分表达。当表达于酵母(酿酒酵母)中时，这些构筑体使变体huICOS多肽在酵母细胞的表面上呈现，通过Aga1p多肽固定至细胞表面。c-myc标签是用作阳性对照以分选出呈现huICOS融合蛋白的酵母细胞。然后进一步分选这些酵母细胞以获得表达适当折叠的huICOS融合蛋白(如通过异藻蓝蛋白(APC)标记的山羊抗小鼠IgG二级抗体检测到的对照小鼠抗huICOS抗体的结合所测定)，但不结合至本发明抗体(如通过用藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人类IgG作为二级抗体检测所测定)的酵母细胞。将这些选出的酵母细胞汇集、扩增并用于下一轮选择中。利用选择后的剩余酵母，测定构筑体中的huICOS序列。
结合至ICOS.4和3E8的酵母群体显示不同突变模式，表明这两种抗体识别不同抗原决定基。用抗体9D5进行类似实验，9D5阻断ICOS-配体结合至ICOS且与ICOS.4竞争。就9D5实验而言，使用基于CTLA-4/B7-2复合物的晶体结构(例如斯丹普(Stamper)等人(2001)自然410:608)的ICOS三维结构的分子模型区分哪些氨基酸残基被埋藏和哪些发生表面暴露以确定哪些所选突变最有可能是抗体特异性接触残基(即，抗原决定基残基)，而不仅仅为结构破坏性突变。针对ICOS.4、3E8和9D5的酵母呈现推断的抗原决定基提供于表30中。表30中的抗原决定基是以SEQ ID NO:1的huICOS中的残基清单呈现，SEQ ID NO:1包括20个氨基酸的信号序列。因此，成熟huICOS(即，无信号序列的ICOS蛋白)的残基数量是表30中指示的残基减20(例如具有信号序列的V48或无信号序列的V28)。
表30：抗ICOS mAb抗原决定基
无性繁殖系 ICOS残基(SEQ ID NO:1)
ICOS.4 V48、Q50、G70、S71、G72、F114、D115、P116、P117、P118、L123
3E8 D64、K78、S79、L80、K81、F82、S85
9D5 P45、I47、P117、P118、K120
类似酵母呈现实验是用ICOS-L(B7-H2)替代抗ICOS mAb进行以测定ICOS上对ICOS/ICOS-L相互作用而言至关重要的残基，即ICOS上用于ICOS-L的结合位点。ICOS-L结合位点经测定为位于ICOS的残基Q50、K52、F114、P117、P118和F119处的残基，如SEQ ID NO:1提供。检查表30中的抗ICOS mAb的抗原决定基表明ICOS.4和9D5应阻断ICOS-L结合，而3E8则可以不，此与实验观测结果一致(如上文于实例15中讨论)。
通过HDX-MS进行的抗ICOS抗体抗原决定基定位
使用抗体ICOS.4和9D5的氘交换实验证实当ICOS结合至ICOS-L时，来自S112和L123的区域发生接触，此表明功能抗原决定基区为ICOS(SEQ ID NO:1)的残基112至123或SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)。此区域与通过酵母呈现测定的抗原决定基的C端部分重叠，且表示沿初级序列的最大残基团簇。
抗huICOS抗体ICOS.4和9D5的抗原决定基是通过氢/氘交换质谱(HDX-MS)测定，参见例如分子生物学方法中的抗原决定基定位方案(Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology)，第66卷，G.E.莫里斯(G.E.Morris)编(1996)，如本文描述。ICOS-Fc与mAb以1:1比率混合且HDX-MS双重复运行1分钟、10分钟、4小时。
结果显示ICOS.4和9D5结合至相同的不连续抗原决定基，其显示于下文(抗原决定基加下划线)和图1中。
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQ 60
ILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFK 120
VTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEY 180
MFMRAVNTAKKSRLTDVTL 199
(SEQ ID NO:1)
实例17
肺癌、肾癌和结肠癌病患的外周血液和肿瘤浸润淋巴细胞上的ICOS表达
了解在不同肿瘤类型和病患群体中于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的ICOS表达有助于识别相关疾病适应症和针对有效ICOS.33 IgG1f S267E疗法的病患群体，尤其与抗PD-1药剂(例如纳武单抗)组合。分析非小细胞肺癌、肾细胞癌和结肠直肠癌(CRC)样本中的外周血细胞和TIL(CD8+和CD4+ T细胞)上的ICOS和PD-1表达频率和量级。
新鲜肿瘤组织和匹配外周血液样本获自患有肺癌、肾癌或CRC的病患(ConversantBio,MT Group,Benaroya)并在4℃下分别于hypothermosol FRS(Biolife溶液)和ACD溶液A(BD Biosciences)中装运整夜。所有样本经处理并于外科手术的24小时内进行染色。将肿瘤组织称重并使用Miltenyi解离试剂盒(Miltenyi，目录130-095-929)解离，而外周血细胞是在使红血细胞(RBC)于RBC细胞溶解缓冲液(BioLegend，目录420301)中溶解后加以分离。细胞悬浮液(来自肿瘤组织或外周血)是于HBSS(无Ca，无Mg)中清洗两次，用NIR存活率染料(Life Technologies的分子探针，目录L34976)染色，用含于杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(dPBS)中的人类AB血清阻断，并添加至含有抗体混合物的孔中(表31)以便在冰上在黑暗中培养45分钟。所述细胞然后用dPBS/BSA/Na叠氮化物清洗两次，固定并使用FOXP3缓冲液试剂盒(BioLegend，目录421403)通透化。所有抗体制备荧光减一(FMO)对照并用于测定阳性细胞群体。在Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上取样且使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
如表31中显示，设计一个组以检查多种标志物的表达，并分析CD8+和CD4+ T细胞上的ICOS表达。
表31：用于针对T细胞子集合的免疫荧光染色的抗体
Figure GDA0002365581830001381
就Treg、Teff、B细胞和NK细胞染色而言，将来自头和颈、肺、CRC和子宫内膜癌的新鲜肿瘤放在搁置于冰上的6孔盘中，浸入1至2mL解离培养基中。将肿瘤切成小片，并将肿瘤溶液放置于杜恩斯均质器内以用于解离。使用额外解离培养基、通过70μm过滤器过滤肿瘤溶液并离心。将所得细胞再悬浮于染色缓冲液中。新鲜网膜转移肿瘤组织样本是使用Miltenyi解离试剂盒(Miltenyi，目录130-095-929)解离。将冷冻的肿瘤样本解冻并滴加DNA酶(2mL DNA酶溶液)。将解冻培养基(8mL，于37℃浴中升温)添加至肿瘤和DNA酶溶液中，并通过70μm过滤器过滤。将细胞离心并再悬浮于染色缓冲液中。
TIL上的ICOS表达是通过FACS分析评估。肿瘤源细胞悬浮液是用含有近红外死细胞染色剂的染色缓冲液阻断。表面细胞群体标志物是用抗体(如表32中显示)染色以测定阳性细胞群体，接着在固定和通透化后，细胞内染色FOXP3。流式细胞术数据是使用FortessaX-20流式细胞仪收集。在对FSC-SSC-活/死标志物参数进行门控以排除碎片和死细胞后，针对CD4+ Teff、Treg、CD8+ T细胞、B细胞和NK细胞子集合测定ICOS+细胞的频率。Cd4+流式细胞术分析是用FlowJo分析软件进行分析。
表32：用于B细胞、NK细胞和T细胞子集合的免疫荧光染色的抗体
Figure GDA0002365581830001391
使用抗ICOS C398.4a无性繁殖系评估16个健康供体和14个肺癌、22个RCC和14个CRC病患的全血样本中的ICOS表达。相较于健康供体，获自癌症病患的ICOS+CD4+ T细胞的频率更高(表33，相较于健康供体，所有癌症病患组的P<0.001，曼惠特尼检验)。相较于健康供体(表33，P<0.01，曼惠特尼)，RCC病患的ICOS+CD8+ T细胞的频率明显更高。在肺癌和CRC病患血液样本中，ICOS+CD8+ T细胞的百分率也比健康供体样本中更高，但未实现统计学显著(表33)。
因为观测到频率比参考文献中报道的频率更高且因为C398.4a无性繁殖系阳性染色的T细胞多于其它常用无性繁殖系ISA-3、6、7、8、9、10，所以也分析高水平表达ICOS(ICOShi)的细胞的频率。与参考文献一致，CD8+ T细胞表达最小量的ICOShi，堪比背景(表33)。然而，在CD4+ T细胞中，ICOShi细胞频率的平均范围为健康供体的3.0％至患有RCC的病患的4.9％的范围内(表33，RC C相比于健康：P<0.05，曼惠特尼)。
接着，评估11个肺癌、21个RCC和8个CRC病患的TIL中的ICOS表达。所有肿瘤类型中的ICOS+CD4+和ICOS+CD8+ TIL的频率类似(表34)。与外周血中一样，测量到CD4+和CD8+TIL T细胞高表达ICOS。平均而言，高水平表达ICOS的CD4+ T细胞的百分率大于CD8+ T细胞(表34)。还测量到ICOS和PD-1于TIL中的共表达。ICOShi CD4+ TIL表达高浓度的PD-1(PD-1hi)且病患间差异较大(表34)。ICOShi CD8+ T细胞高水平共表达的PD-1的比例高于ICOShi CD4+ TIL(表34)。
表33：健康供体和癌症病患的外周血液样本中的ICOS+和ICOShi CD4+和CD8+ T细胞的平均频率±SD
Figure GDA0002365581830001401
缩写：ICOShi：高水平表达ICOS的细胞；N：样本数量；SD：标准偏差；NSCLC：非小细胞肺癌；RCC：肾细胞癌；CRC：结肠直肠癌
表34：癌症病患的TIL中的ICOS+、ICOShi和PD-1hi ICOShi CD4+和CD8+ T细胞的平均频率±SD
Figure GDA0002365581830001402
缩写：SD：标准偏差；ICOShi：高水平表达ICOS的细胞；PD-1：高水平表达PD-1的细胞；TIL：肿瘤浸润淋巴细胞；NSCLC：非小细胞肺癌；RCC：肾细胞癌；CRC：结肠直肠癌；N：样本数量
将来自患有两种肺腺癌、一种子宫内膜腺癌、一种浆液性乳头状癌的网膜转移、一种结肠直肠腺癌的肝转移和一种头颈鳞状细胞癌的病患的人类肿瘤样本解离并染色以用于流式细胞术分析各种淋巴细胞群体上的ICOS表达。在描绘的五种不同淋巴细胞群体(CD4+ Teff、Treg、CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞)中，CD4+ Teff和Treg表达最高频率的ICOS。在表达ICOS的细胞群体(CD4 Teff、Treg、CD8 T细胞和NK细胞)上，相较于其它细胞类型，Treg在每个细胞基础上表达更多ICOS。
总而言之，于外周血和TIL上，ICOS是更高浓度地表达于CD4+ T细胞上而非CD8+ T细胞中。ICOS表达是在病患之间存在差异且就所测试三种肿瘤类型而言是相似的。平均而言，33％至48％的ICOShi CD4+ TIL和62％至71％的ICOShi CD8+ TIL高水平共表达PD-1。另外，在人类肿瘤微环境中，Treg表达ICOS的水平高于CD4+ Teff、CD8+ T细胞、NK细胞和B细胞。
实例18
剂量递增和组合分群(cohort)研究以评估ICOS.33 IgG1f S267E单独或与一或多种抗PD-1抗体、一或多种抗PD-L1抗体和/或一或多种抗CTLA-4抗体的组合于患有晚期实体肿瘤的病患中的安全性和耐受性、药物动力学和功效
作为单一疗法或与抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体(例如纳武单抗和/或伊匹单抗)组合投与的ICOS.33 IgG1f S267E的第1/2阶段开放标记研究是在患有晚期实体肿瘤的参与者中进行。所述研究包括下列部分：
1)剂量递增单一疗法(初步安全分群和A部分)；
2)使用纳武单抗(B部分)或伊匹单抗(C部分)的剂量递增组合疗法；和
3)使用纳武单抗(D部分)或伊匹单抗(E部分)的剂量扩增阶段。
目标
此研究的主要目标是表征在患有晚期实体瘤的参与者中单独投与或与纳武单抗或伊匹单抗组合投与的ICOS.33 IgG1f S267E的安全性和耐受性。
次要目标包括探索在患有晚期实体瘤的参与者中单独投与和与纳武单抗或伊匹单抗组合投与的ICOS.33 IgG1f S267E的初步功效；表征当在患有晚期实体瘤的参与者中单独投与和与纳武单抗或伊匹单抗组合投与ICOS.33 IgG1f S267E时，ICOS.33 IgG1fS267E的PK；表征当在患有晚期实体瘤的参与者中单独投与和与纳武单抗或伊匹单抗组合投与ICOS.33 IgG1f S267E时，ICOS.33 IgG1f S267E的免疫原性；和监测在患有晚期实体瘤的参与者中单独投与和与纳武单抗或伊匹单抗组合投与的ICOS.33 IgG1f S267E的靶接合。
另外，探索性目标包括在治疗之前和在单独投与ICOS.33 IgG1f S267E和投与ICOS.33 IgG1f S267E与纳武单抗或伊匹单抗的组合之后，检查肿瘤组织中和外周血中抗肿瘤活性与特异性生物标志物测量值之间的关联；表征在ICOS.33 IgG1f S267E PK单独和与纳武单抗PK或伊匹单抗PK组合之间的关系，和安全性、功效和/或临床生物标志物；评估经ICOS.33 IgG1f S267E单独和与纳武单抗或伊匹单抗组合治疗的参与者的整体存活率(OSR)；表征当与ICOS.33 IgG1f S267E组合投与时的纳武单抗和伊匹单抗的PK和免疫原性；表征当与ICOS.33 IgG1f S267E组合投与时的纳武单抗和伊匹单抗的免疫原性；评估ICOS.33 IgG1f S267E对经修正的QT间期(QTc)的潜在影响；和探索在选择外周血生物标志物与不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)的发生率之间的关联。
整体设计
研究设计的示意图显示于图27中。
单一疗法由如下的两种不同分群组成：
·初步安全性分群：ICOS.33 IgG1f S267E作为单一疗法以2mg和8mg每四周一次投与，持续24周。
·A部分：ICOS.33 IgG1f S267E以25mg、80mg、200mg、400mg和800mg每四周一次投与，持续24周。
B部分和C部分是由不同组合分群组成，所述组合分群包含以下：
·B1：ICOS.33 IgG1f S267E每12周投与一次+纳武单抗480mg每4周投与一次，ICOS.33 IgG1f S267E的初始剂量程度由贝氏逻辑回归模型(Bayesian LogisticRegression Model；BLRM)-Copula模型和可获自A部分的PK/PD数据建议。
·B2：ICOS.33 IgG1f S267E每4周一次+纳武单抗480mg每4周一次，ICOS.33IgG1f S267E的剂量程度由贝氏逻辑回归模型(BLRM)-Copula模型(BLRM-RD)和可获自A部分的PK/PD数据建议。
·C1：ICOS.33 IgG1f S267E每12周一次+伊匹单抗3mg/kg每4周一次，ICOS.33IgG1f S267E的初始剂量程度由贝氏逻辑回归模型(BLRM)-Copula模型和可获自A部分的PK/PD数据建议。
·C2：ICOS.33 IgG1f S267E每4周一次+伊匹单抗3mg/kg每4周一次，ICOS.33IgG1f S267E的剂量程度由贝氏逻辑回归模型(BLRM)-Copula模型和可获自A部分的PK/PD数据建议。
B1和C1部分是同时登记。B2和C2部分是仅在需额外安全性、PK或PD数据以优化剂量和/或方案选择的情况下登记。
用于B和C部分(与纳武单抗或伊匹单抗组合)的ICOS.33 IgG1f S267E剂量是使用所有可获得的安全性(临床和实验室)、PK和靶接合/药物动力学生物标志物数据和Bayesian分层模型化框架(即，BLRM-Copula模型)内的建议模型化，通过并入ICOS.33IgG1f S267E(初步安全分群和A部分)和纳武单抗或伊匹单抗两者的单一药剂毒性分布曲线图和来自B和C部分的任何可获得的组合毒性分布曲线图(在B和C部分中，ICOS.33 IgG1fS267E的后续剂量)(PK/PD模型化)来确定且不超过ICOS.33 IgG1f S267E单一疗法于初步安全分群和A部分中的最大投与剂量(MAD)。由BLRM-Copula模型(即，BLRM-RD)建议的ICOS.33 IgG1f S267E的剂量程度定义为通用概念使得用于任何分群的BLRM-RD始终基于所有可获得且最新的信息。
与纳武单抗或伊匹单抗(B和C部分)组合投与的ICOS.33 IgG1f S267E的剂量在任何时间点下皆不超过在单一疗法剂量递增臂(A部分)中证实为安全的ICOS.33 IgG1fS267E的量，在组合疗法期间在B和C部分中在任何时间点下，ICOS.33 IgG1f S267E剂量皆不超过在单一疗法剂量递增臂(A部分)中测定为耐受的最高剂量。另外，与纳武单抗或伊匹单抗(B和C部分)组合使用的ICOS.33 IgG1f S267E的初始剂量程度是比已清除DLT周期的单一疗法(A部分)剂量低一个剂量程度。
B1和C1部分是由PK/药物动力学子研究组成，所述研究旨在探索在多种剂量的纳武单抗每4周一次(B1部分)或伊匹单抗每4周一次(C1部分)的存在下投与ICOS.33 IgG1fS267E后的ICOS受体下调和再表达的动力学(和/或所选靶接合/药物动力学生物标志物的变化)。
在B1和C1部分中投与ICOS.33 IgG1f S267E的不同剂量：
·诱导或预测诱导不同程度的ICOS受体下调的剂量，包括诱导接近完全受体下调(和/或所选择的靶接合/药物动力学生物标志物的变化)的至少一种剂量，历时至少4周的持续时间。这些剂量程度容许表征接近完全下调后的ICOS受体再表达动力学，历时等于、小于和/或超过A部分中使用的给药间隔的时间周期。通过了解ICOS受体动力学，可有助于在后续研究中告知测试ICOS.33 IgG1f S267E给药间隔。
·BLRM-RD：剂量程度是基于所有可获得的安全性(临床和实验室)和PK数据和外周靶接合标志物自当前分群的先前和已完成部分的变化(例如于T细胞和ICOS+B细胞上的ICOS下调)来测定，和/或(每当适用时)由BLRM/BLRM-Copula模型指导。
在单一疗法治疗24周后，或在组合疗法治疗两年后，参与者可被入选接受再治疗。就A部分而言，扫描是集中收集且可在稍后的日期或研究期间的任何时间通过盲法独立性中央回顾(BICR)进行回顾。就B和C部分而言，扫描是集中收集以由BICR实时回顾。
身体检查、生命体征测量、12导联心电图(ECG)和临床实验室评估是在整个给药间隔间所选的时间下进行。
在整个研究期间，严密监测参与者的AE。在研究治疗投与之后的30、60和100天追踪中收集血液以用于PK分析。
如下文描述，参与者完成研究的四个阶段：筛选、治疗、安全性追踪和反应/存活追踪。参与者在所述研究中的总持续时间是约2年。
破伤风疫苗
A、B和C部分中的所有病患接受已批准的破伤风疫苗。投与例如破伤风类毒素的有效回忆抗原诱发免疫系统，诱导免疫反应并促进更免疫原性的状态。
ICOS.33 IgG1f S267E增强回忆反应的能力将通过监测在破伤风疫苗接种后，CD4+T细胞的抗破伤风抗体和增殖和细胞因子反应测定。约70％的一般群体具有抗破伤风保护性抗体。然而，细胞免疫反应是通常在外周血中在接种破伤风疫苗一个月后可检测。破伤风已在癌症病患中用作报道抗原，所述病患接受使用疫苗的免疫疗法并可容易被监测。因此，破伤风疫苗接种可以单独投与的ICOS.33 IgG1f S267E和与纳武单抗或伊匹单抗组合投与的ICOS.33 IgG1f S267E提供有效回忆反应。
筛选
筛选阶段持续长达28天并在研究治疗的首次投与之前发生。在筛选阶段期间，确定参与者的初始资格，并获得书面知情同意书。针对所有受试者收集肿瘤活组织检查，通过免疫组织化学集中评估ICOS表达，且在研究治疗的首次剂量的投与之前评估结果。参与者是使用交互式反应技术(IRT)登记。
治疗阶段
初步安全分群和A部分中的治疗阶段是由多达六个四周治疗周期(1个周期＝28天)组成。在初步安全分群和A部分中，各治疗周期是由ICOS.33 IgG1f S267E单一疗法组成，历时总计24周。
B和C部分的剂量程度是基于所有可获得的安全性(临床和实验室)和PK数据和外周靶接合标志物自当前分群的先前和已完成部分的变化(例如于T细胞和ICOS+B细胞上的ICOS下调)来测定，且(每当适用时)由BLRM/BLRM-Copula模型指导。
在B1和C1部分中，使用四周周期，使得ICOS.33 IgG1f S267E+纳武单抗或伊匹单抗是在第1周期在第1天开始投与。纳武单抗和伊匹单抗是在各周期的第1天投与。ICOS.33IgG1f S267E是每12周投与一次，或在每三个周期的第1天(第1周期第1天、第4周期第1天、第7周期第1天等)投与。B1和C1部分的参与者继续治疗长达总计2年。
B2和C2部分中的治疗阶段是由在各周期的第1天投与长达总计2年的ICOS.33IgG1f S267E+纳武单抗或伊匹单抗组成，且仅在需额外安全性、PK或PD数据以优化剂量和/或方案选择时进行登记。
在各治疗周期后，以研究治疗的额外周期治疗参与者的决定是基于每12周(每12周±1周进行一次)进行的肿瘤评定评估且在下一周期的首次剂量之前完成。肿瘤进展或反应端点是使用实体肿瘤反应评估标准(RECIST)v1.1或前列腺癌工作组3(PCGW3)指导方针中仅针对前列腺进行评估(Scher等人，2016.去势难治性前列腺癌的试验设计和目标：来自前列腺癌临床试验研究组3的最新建议(Trial Design and Objectives for Castration-Resistant Prostate Cancer:Updated Recommendations From the Prostate CancerClinical Trials Working Group 3.)临床肿瘤学(Clin Oncol.)34(12):1402-1418)。
采用额外研究治疗周期的进展后继续治疗(Treatment Beyond Progression)是在首席研究员与BMS医学监视员/研究主任之间讨论和协议认为利益/风险评估有利于研究治疗的继续投与(例如参与者继续经历如由研究员评估的临床益处，耐受治疗并符合其它特定标准)之后，允许在患有初始RECIST v1.1或PCGW3(仅前列腺)定义的PD的所选参与者中就A部分而言进行长达至多24周和就B、C、D和E部分而言进行长达至多两年。
在给定周期结束时具有未经证实的进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分反应(PR)或完全反应(CR)的反应的参与者持续至下一治疗周期。通常让参与者持续研究治疗，直至以下的首次出现：1)最大数量的周期的完成，2)证实PD，3)表明很有可能无法自治疗中获得进一步益处的临床恶化，4)对疗法不耐受或5)符合研究治疗的中止标准的参与者。在首席研究员与BMS医学监视员/研究主任之间在利益/风险证明研究治疗中止的情境下具体咨商和协议后，具有证实的CR的个别参与者可基于个案选择中止研究治疗。
安全性追踪
针对A部分的研究治疗的24周一经完成(若可适用，或长达至最多48周)或针对B、C、D和E部分长达两年(若可适用，或长达至最多四年)，决定中止参与者的研究治疗(例如在治疗结束时[EOT])且所有参与者进入安全性追踪期。
就完成所有预定治疗周期的参与者而言，EOT访问是与上次预定和已完成的治疗期访问和第1周安全追踪访问开始的时间相同。就未完成研究治疗的所有预定周期的参与者而言，EOT访问是最近的治疗期访问(具有所有可获得的安全性和反应数据)且被视为安全性追踪访问的开始。
在EOT访问之后，评估所有参与者的任何新颖AE，持续研究治疗的最后给药之后至少100天。在最后给药之后或在中止当天(±7天)的第30、60和100天进行追踪访问以监视AE。所有参与者无论其是否开始新颖抗癌治疗皆被要求完成3次临床安全性追踪访问，除撤回研究参与的同意书的那些参与者外。
存活追踪
在完成安全性追踪访问后，经单一疗法和组合疗法治疗的所有参与者进入存活追踪期。参与者是被追踪约每3个月(12周)，直至死亡、失去追踪、撤回同意书或研究结束，以先发生者为准。此阶段的持续时间是从研究治疗的首次投药长达两年，然而若功效信号明显，则在所选病例中考虑更长的追踪期。
反应追踪
在安全性追踪期完成后，在EOT访问下具有持续SD、PR或CR的参与者进入反应追踪期。此周期与针对上述参与者的存活追踪期同时进行。参与者约每3个月(12周)继续进行放射学和临床肿瘤评估，直至死亡、失去追踪、撤回同意书或研究结束，以先发生者为准。在参与者完成研究的存活阶段后，继续收集具有持续临床益处的参与者的放射学肿瘤评估。在研究治疗的初始过程后患有疾病进展的参与者在EOT访问外不接受反应评估，且视需要容许接受其它肿瘤指导疗法。若参与者因除PD外的任何原因中止治疗，则放射学追踪持续直至参与者接受额外治疗。
24周后的额外周期治疗
除非提早符合研究治疗的中止标准，否则所有参与者均接受24周的单一疗法或组合疗法。在经BMS医学监视员/研究主任仔细评估和讨论确定风险/利益比率是否支持另一研究治疗的投与之后，完成持续疾病控制(CR、PR或SD)或未经证实的PD的治疗的所有参与者基于个案被入选针对A部分进行额外24周的研究治疗或进行总计两年的组合疗法。倘若完成额外的研究治疗周期，则所有参与者进入安全性追踪期。
进展后继续治疗(Treatment Beyond Progression)
在BMS医学监视员/研究主任讨论和协议认为利益/风险评估有利于研究治疗的继续投与(例如参与者继续经历如由研究员评估的临床益处，耐受治疗并满足其它标准)之后，容许在患有初始RECIST v1.1或PCGW3(仅前列腺)定义的PD的选择参与者中进行进展后继续治疗。
参与者补充重新同意知情同意书(ICF)以继续进行进展后继续治疗。进展后继续治疗需要持续的肿瘤评估。
在反应追踪期间的再治疗
在反应追踪期期间，此研究容许在疾病进展的情况下进行再治疗。在BMS医学监视员/研究主任小心评估和讨论确定风险/利益比率是否支持另一研究治疗的投与和参与者继续符合研究治疗的治疗资格标准之后，针对A部分完成约24周的研究治疗(或若适用，则长达至最多48周)和针对B、C、D和E部分完成约两年的研究治疗(或若适用，则长达至最多4年)或在因CR中止的情况下较短的参与者(因具有持续疾病控制(CR、PR或SD)且无任何显著毒性而进入反应追踪期的病患)在研究治疗的最后剂量的12个月内随后被证实疾病进展时基于个案被入选接受再治疗。
符合再治疗标准的参与者是用最初分配的单一疗法或组合疗法方案(例如在第一个24周期间，投与相同剂量和给药方案)进行治疗，除非随后发现所述(等)剂量和方案超过最新BLRM-RD(在此种情况下，所述参与者用BLRM-RD治疗)。进入此阶段的参与者遵循程序方案。较低频率地收集(在各治疗周期的投药前)用于PK和药物动力学的样本。在再治疗期间，收集获自血液的药物动力学生物标志物样本。
参与者的类型和靶疾病特征
a)参与者必须为至少18岁且患有组织学或细胞学证实的具有依RECIST v1.1或PCGW3(仅前列腺)定义的可测量疾病的转移性和/或无法切除的结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺腺癌(PRC)和尿路上皮癌(UCC)且除靶病变外患有至少1个病变可供活检。
b)存在具有由用于实体瘤反应评估的RECIST v1.1或PCGW3(仅前列腺)定义的可测量疾病的至少1个病变。先前经照射视野中的病变为可测量疾病的唯一位点的参与者只有在所述(等)病变已证实明确进展且可被测量的情况下才允许被登记。
c)参与者在晚期或转移性情境中必须已接受至少1种标准治疗方案(若此疗法存在)，且然后经历进展或已无法耐受所述至少1种标准治疗方案，且在登记前已考虑所有其它潜在有效疗法。
d)先前暴露于使用特异性靶向检查点途径抑制的任何药剂(例如抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4)的疗法的参与者在自最后一次治疗大于4周的任何时间的清洗周期后被允许。
肿瘤类型
a)结肠直肠癌(CRC)
i)组织学上证实的CRC，其是具有疾病进展记录的转移或复发。
ii)如果已知，则记录微卫星不稳定性、错配修复、KRAS和BRAF状态。
iii)先前疗法要求：参与者必须已接受针对转移性和/或无法切除的疾病(或在佐剂疗法的6个月内已经进展)的至少1种(但不超过3种)先前全身性疗法。
iv)参与者必须患有无法治愈的转移性疾病(即，患有由外科手术切除术可能治愈的疾病的病患不符合治疗资格)。
b)头颈鳞状细胞癌(HNSCC)(口腔、咽、喉)
i)组织学上证实的无法治愈的局部晚期、复发或转移性HNSCC(口腔、咽、喉)，第III或IV阶段且不适合具有治愈意图的局部疗法(有或无化学疗法的外科手术或放射疗法)。
ii)必须已记录HPV状态和子类型，特定地说，HPV16和HPV18。
iii)参与者必须已接受用于治疗转移性或局部晚期无法切除的疾病的至少1种但不超过2种先前全身性疗法(例如基于铂的化学疗法)方案，且然后经历进展或已不耐受或抗拒所述先前全身性疗法(例如基于铂的化学疗法)方案。
iv)先前治疗性放射疗法必须已在研究治疗投与之前的至少4周内完成。先前局部姑息性放射疗法必须已在研究治疗投与之后的至少2周内完成。
c)非小细胞肺癌(NSCLC)
i)参与者必须患有组织学或细胞学证实的NSCLC(根据第七届国际肺癌研究协会[IASLC])且鳞状或非鳞状组织学为晚期(转移性和/或无法切除)。
(1)：参与者必须已接受针对NSCLC的至少1种(但不超过2种)先前全身性疗法。维持治疗、佐剂或新佐剂(化学疗法或放射化学)疗法不算作额外线治疗。
(2)：已向参与者提供针对NSCLC的基于铂的化学疗法。基于铂的化学疗法可已于佐剂、新佐剂或化学放射情境中。认为患有在完成此治疗的6个月内复发的复发性/转移性疾病的参与者符合研究治疗的资格。只要最后一次给药方案在登记前至少4周内发生，即允许先前佐剂或新佐剂化学疗法。
(3)：只要化学疗法或放射疗法的最后一次投与(以最后一次给予为准)在登记前至少4周内发生，即允许针对局部晚期疾病进行的先前明确化学放射。
(4)：具有已知EGFR突变或ALK重排的参与者必须已分别接受EGFR或ALK抑制剂。若已知，则必须记录EGFR、ALK、KRAS和ROS1突变状态。
d)前列腺腺癌(PRC)
i)组织学或细胞学证实之前列腺腺癌。
ii)参与者已通过睾丸切除术治疗或正接受释放黄体化激素的激素类似物，且具有≤50ng/dL的睾酮水平。
iii)通过下列模态中的任一种的转移性疾病：计算机化断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和骨扫描。
e)尿路上皮癌(UCC)
i)转移性或外科手术无法切除的尿路上皮(涉及膀胱、尿道、输尿管或肾盂)的移行细胞癌的组织学或细胞学证据。
ICOS.33 IgG1f S267E剂量限制性毒性(DLT)
出于指导剂量递增的目的，DLT是基于未识别明确替代原因的AE的发病率、强度和持续时间进行定义。DLT周期是35天(5周)。
在初步安全分群中，接受1次剂量的ICOS.33 IgG1f S267E并完成4周DLT周期或因DLT而在4周DLT周期中中止的参与者被视为用于ICOS.33 IgG1f S267E单一疗法的DLT可评估参与者。
在A部分中，接受2次剂量的ICOS.33 IgG1f S267E并完成5周DLT周期或因DLT而在5周DLT周期中中止的参与者被视为用于ICOS.33 IgG1f S267E单一疗法的DLT可评估的参与者。
在B、C、D和E部分中，接受1次剂量的ICOS.33 IgG1f S267E或2次剂量的纳武单抗或伊匹单抗的参与者或因DLT而在5周组合治疗DLT周期中中止的参与者被视为用于组合治疗的DLT可评估参与者。在DLT评估周期期间退出研究的参与者或于单一疗法(A部分)中除DLT以外的其它原因接受小于2次剂量或在组合疗法(B、C、D、E部分)中接受1次剂量的参与者不被视为DLT可评估参与者且在相同剂量程度下不改用新参与者。若A部分中在DLT评估周期期间出于除DLT以外的原因而延迟给药的参与者接受至少2次剂量的疗法，则所述参与者被视为DLT可评估参与者。
出于参与者管理的目的，符合DLT标准的任何AE(无论其发生的周期)均导致研究治疗的中止。在5周DLT评估周期期间出于除DLT以外的原因退出研究的参与者在相同剂量程度下改用新参与者。在5周DLT评估周期期间的DLT的发病率是用于剂量递增决定中和用于识别BLRM-RD。在DLT周期后发生的AE被视为是出于根据赞助者、医学监视员/研究主任和研究者之间的协议定义BLRM-RD的目的。
经历DLT的参与者进入研究的安全性追踪期。针对初步安全分群的4周DLT观察周期或针对A、B和C部分的5周期DLT观察周期后发生的DLT被纳入判定用于组合部分的最大投与剂量(MAD)中。
此研究将显示如投与的抗ICOS抗体在治疗癌症中是安全且有效的。
实例19
渐增剂量的抗ICOS抗体对肿瘤生长的组合效应
在小鼠模型中评估渐增剂量的促效性抗ICOS抗体(ICOS.33 IgG1f S267E)与抗PD-1抗体的组合于肿瘤生长抑制的效应。如图28中显示，所述组合在较高剂量下显示减小的功效，即，“钩效应”，其中相较于抗体在较低浓度(即，不导致饱和的浓度)下的功效，抗体的接近饱和或饱和浓度导致减弱的效应。
简单地说，患有确定CT26肿瘤的小鼠(平均重约20mg)是通过抗PD-1单一疗法或与ICOS.33 IgG1f S267E的组合治疗。抗ICOS剂量递增是起始自0.1mg/kg，和三倍增加至10mg/kg(或约200μg/小鼠平稳剂量的最大剂量)。抗PD-1抗体是以10mg/kg(或约200μg/小鼠平稳剂量的最大剂量)给药。在肿瘤移植后，抗ICOS和抗PD1抗体是以相同方案投与(即，起始自第7天，每4天)。
如图28中显示，抗ICOS和抗PD1组合疗法中的最大肿瘤生长抑制(TGI)是在比所测试最大剂量(10mg/kg)低的抗ICOS抗体剂量(3mg/kg)下观测到，此证实TGI在大于3mg/kg的剂量下减少，即，最大功效是在子饱和剂量下实现。
Figure GDA0002365581830001501
Figure GDA0002365581830001511
Figure GDA0002365581830001521
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Figure GDA0002365581830001541
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Figure GDA0002365581830001561
Figure GDA0002365581830001571
Figure GDA0002365581830001581
Figure GDA0002365581830001591
Figure GDA0002365581830001601
Figure GDA0002365581830001611
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Figure GDA0002365581830001631
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Figure GDA0002365581830001661
Figure GDA0002365581830001671
Figure GDA0002365581830001681
Figure GDA0002365581830001691
Figure GDA0002365581830001701
Figure GDA0002365581830001711
Figure GDA0002365581830001721
Figure GDA0002365581830001731
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Figure GDA0002365581830001751
Figure GDA0002365581830001761
Figure GDA0002365581830001771
Figure GDA0002365581830001781
Figure GDA0002365581830001791
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 抗ICOS促效剂抗体和其用途
<130> MXI-556PC
<140>
<141>
<150> 62/581,412
<151> 2017-11-03
<150> 62/545,732
<151> 2017-08-15
<150> 62/514,151
<151> 2017-06-02
<150> 62/483,158
<151> 2017-04-07
<160> 219
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 199
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro
165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
<210> 2
<211> 309
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu
1 5 10 15
Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp
20 25 30
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn
35 40 45
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr
50 55 60
Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe
85 90 95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His
100 105 110
Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val
115 120 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser
130 135 140
Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser
145 150 155 160
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp
165 170 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn
180 185 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr
195 200 205
Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln
210 215 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp
225 230 235 240
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
245 250 255
Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala
260 265 270
Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly
275 280 285
Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Glu Ser Trp Asn Leu
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Leu Leu Leu Leu Ser
305
<210> 3
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Gly Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Lys Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Ala Cys Asp Ser Thr Thr Ser Thr Thr Asn
130 135 140
Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ser Val Leu His Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala
195 200 205
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Gly Asp
210 215 220
Gly Ser Gly Cys Lys Pro Cys Thr Cys Pro Gly Pro Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Ser Leu
245 250 255
Ser Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Ile Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Val Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Met Val
290 295 300
Ser Val Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Asn Ser Pro Ala Phe Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Arg Arg Gly Gln Leu Gln Val Pro Gln Val Tyr Thr Met
340 345 350
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Leu Thr Gln Ser Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Met Ile Lys Gly Phe Tyr Pro Glu Asp Ile Asp Val Ala Trp Gln Lys
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Asn Gly Gln Pro Glu Gln Ser Phe Lys Asn Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Thr Asp Glu Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asp Val Lys Lys Asp
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Asp Trp Glu Lys Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Thr Leu Ser Gln Arg Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Lys Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Gly Thr Gly Ser
115 120 125
Ala Thr Leu Val Cys Phe Val Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Ser Glu Lys Arg Asp Gly Val Leu Gln
145 150 155 160
Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Arg His Asn Leu Tyr Thr
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Cys Glu Val Thr His Lys Thr Ser Thr Ala Ala Ile Val Lys Thr Leu
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
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肽"
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Asp Tyr Phe Met His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 10
Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp Leu
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Val Lys Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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肽"
<400> 11
Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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肽"
<400> 12
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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肽"
<400> 13
Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Asp
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 14
Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Glu
1 5
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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肽"
<400> 15
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
1 5
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<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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多肽"
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Met Asp Ile Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Val Pro Ser Trp
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Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
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Ser Thr Ser Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
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Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr
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Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
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Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
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Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Ser Thr Pro Thr Tyr Tyr Gly Leu Asp
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Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 17
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
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Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
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Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 18
Thr Ser Gly Met Cys Val Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 19
Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr
1 5 10 15
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 20
Met Ser Thr Pro Thr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 22
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 23
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 24
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 24
Met Asp Thr Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Gly Thr Ser Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Phe Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala His Arg Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 25
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 26
Thr Ser Gly Leu Gly Val Gly
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 27
Phe Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 28
Arg Arg Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 29
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 30
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 31
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 32
Met Glu Phe Gly Leu Thr Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Met Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Thr Tyr Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Thr Val Ile Trp His Asp Gly Ser His Lys Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gln Thr Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Phe
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 33
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 33
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 34
Thr Tyr Gly Met Gln
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 35
Val Ile Trp His Asp Gly Ser His Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 36
Asp Arg Gln Thr Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 38
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 39
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 40
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 40
Met Asp Thr Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Gly Ser Asn Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ser Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala His Arg Asn Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 41
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 41
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Phe Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 42
Ser Asn Gly Leu Gly Val Gly
1 5
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 43
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 44
Arg Asn Ser Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 45
Arg Ala Ser Gln Gly Phe Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 46
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 47
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 48
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 48
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 50
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 51
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 52
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 53
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 54
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 55
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 56
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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多肽"
<400> 86
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1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 87
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<213> 智人
<400> 87
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 88
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<211> 325
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<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 89
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Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<213> 人工序列
<220>
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多肽"
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Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<211> 325
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<213> 人工序列
<220>
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多肽"
<400> 91
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325
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<213> 人工序列
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<221> 来源
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325
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<213> 人工序列
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<400> 93
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325
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多肽"
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Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<220>
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<400> 95
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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肽"
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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肽"
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 152
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 152
Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 153
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 153
Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 154
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 155
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 155
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 156
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 156
Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 157
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<400> 157
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 158
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<400> 158
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 159
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly
115
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<400> 160
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 161
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<400> 161
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 162
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<400> 162
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 163
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<400> 163
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 164
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 164
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 165
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 165
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 166
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 166
Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 167
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸
<400> 167
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 168
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸
<400> 168
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 169
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Pro Val Ala Gly
1
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 171
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 171
Glu Leu Leu Gly
1
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
<210> 173
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile Phe His Asn Gly
1 5 10 15
Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln Phe Lys
20 25 30
Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr
35 40 45
Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu Lys Phe Cys His
50 55 60
Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
65 70 75 80
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser Ile Phe Asp Pro
85 90 95
Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile Tyr Glu
100 105 110
Ser Gln
<210> 174
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 174
atggagtttg ggctgacctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggatgtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtacc tatggcatgc agtgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt gacagttata tggcatgatg gaagtcataa agactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gatgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatcggcaa 360
actggggagg gctactttga cttctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 417
<210> 175
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 175
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 360
gggaccaagc tggagatcaa a 381
<210> 176
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 176
atggacatac tttgttccac gctcctgcta ctgactgtcc cgtcctgggt cttatcccag 60
gtcaccttga gggagtctgg tcctgcgctg gtgaaaccca cacagaccct cacactgacc 120
tgcaccttct ctgggttctc actcagcact agtggaatgt gtgtgagctg gatccgtcag 180
cccccaggga aggccctgga gtggcttgca ctcattgatt gggatgatga taaattctac 240
agcacatctc tgaagaccag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300
cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatgtca 360
acacctacct actacggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420
<210> 177
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 177
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctctcac tttcggcgga 360
gggaccaagg tggagatcaa a 381
<210> 178
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 178
atggacacac tttgctccac gctcctgctg ctgaccatcc cttcatgggt cttgtcccag 60
atcaccttga aggagtctgg tcctacgctg gtgaaaccca cacagaccct cacgctgacc 120
tgcaccttct ctgggttctc actcggctct aatggactgg gtgtgggctg gatccgtcag 180
cccccaggaa aggccctgga gtggcttgca ctcatttatt gggatgatga taagcgctac 240
agtccatctc tgaagagcag gctcaccatc accaaggact cctccaaaaa ccaggtggtc 300
cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acacaggaac 360
agtggctttg actactgggg ccagggaatc ctggtcaccg tctcctca 408
<210> 179
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 179
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgtc gggcgagtca gggttttagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccttacac ttttggccag 360
gggaccaagc tggagatcaa a 381
<210> 180
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 180
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctctcac tttcggcgga 360
gggaccaagg tggagatcaa a 381
<210> 181
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 181
atggacacac tttgctccac gctcctgctg ctgaccatcc cttcatgggt cttgtcccag 60
atcaccttga aggagtctgg tcctacgctg gtgaaaccca cacagaccct cacgctgacc 120
tgcaccttct ctgggttctc actcggcact agtggactgg gtgtgggctg gatccgtcag 180
cccccaggaa aggccctgga gtggcttgca ttcatttatt gggatgatga taagcgctac 240
agcccatctc tgaagagcag gctcaccatc accaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300
cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacat attactgtgc acacagacgg 360
ggcttttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 408
<210> 182
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 182
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgctcac tttcggcgga 360
gggaccaagg tggagatcaa a 381
<210> 183
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 183
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggccagtca ggacattagc aattatttaa gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctactat acaaatctat tggcagaagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tattataact atcggacgtt cggccctggg 300
accaaagtgg atatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642
<210> 184
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 184
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatttca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggcgtc atagacacta aaagttttaa ttatgcaacc 180
tattactctg atttggtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccgca 300
accatcgctg tcccatatta cttcgattac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg gagcacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtccccgggt tga 1353
<210> 185
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 185
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ile Phe Lys Tyr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys His Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Asp Phe Asp Trp Ile His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 186
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 186
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ile Phe Lys Tyr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys His Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Asp Phe Asp Trp Ile His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 187
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 187
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 188
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 188
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 189
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 189
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 190
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 190
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 191
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 191
Tyr Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 192
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 193
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 193
Asp Gly Asp Phe Asp Trp Ile His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 194
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 194
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 195
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 195
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 196
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr
1 5
<210> 197
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 197
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cctctggatt catctttaaa tactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagca cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gaaagatggg 300
gattttgact ggatccacta ttactatggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcgtcgac caagggccca tccgtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 840
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 960
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1020
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1260
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggt 1359
<210> 198
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 198
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cctctggatt catctttaaa tactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagca cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gaaagatggg 300
gattttgact ggatccacta ttactatggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 199
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 199
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc cccgggt 987
<210> 200
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 200
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcacac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 201
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 201
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcacac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 202
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多核苷酸"
<400> 202
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 203
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 203
Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu
1 5 10
<210> 204
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 204
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 205
<211> 168
<212> PRT
<213> 智人
<400> 205
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Met
165
<210> 206
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 206
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 207
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 207
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 208
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 209
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 209
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 210
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
肽"
<400> 210
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 211
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 211
Glu Val Asp Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Phe Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Val Ser Thr Asp Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asp Ala Glu Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Val Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
245 250 255
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
290 295 300
Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
340 345 350
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp
385 390 395 400
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser
405 410 415
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 212
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 212
Asp Val Gln Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Ala Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 213
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 213
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gln Gly Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Lys Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 214
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 214
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 215
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 215
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 216
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 216
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 217
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 217
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Asp Thr Lys Ser Phe Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Leu Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Thr Ile Ala Val Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 218
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 218
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Asn Leu Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 219
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的
多肽"
<400> 219
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
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Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130

Claims (48)

1.一种经分离的人源化抗体，其结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)，其中所述抗体阻断ICOS配体与人类ICOS的结合和/或相互作用且其中所述抗体
(a)在活体外CHO-OKT3-CD32A共培养分析中，以约0.01至约0.16nM的EC50诱导CD25-CD4+T细胞增殖和干扰素-γ(IFN-γ)的产生；和/或
(b)在CD25-CD4+T细胞和B细胞共培养分析中，在葡萄球菌肠毒素B中，以约0.002至约0.4nM的EC50诱导CD25-CD4+T细胞产生IFN-γ。
2.根据权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述抗体具有下列特征中的一或多种：
(a)以约0.7nM的EC50结合至人类T细胞和以约0.3nM的EC50结合至食蟹猕猴T细胞；
(b)结合至活化的人类CD4+T细胞；
(c)不结合至人类CD28或人类CTLA-4；
(d)活化至少一种原代T淋巴细胞，例如CD4+效应T(Teff)细胞、滤泡性辅助T(Tfh)细胞和调节T(Treg)细胞；
(e)在活体外原代T细胞信号传导分析中，以约30nM的EC50诱导蛋白激酶B(pAkt)的磷酸化；
(f)在Tfh和初始B细胞共培养分析中，回应于葡萄球菌肠毒素B而诱导白介素-10(IL-10)产生；
(g)在活体外分析中，诱导CD3刺激的Teff的增殖增幅大于CD45RA+Treg和CD45RO+Treg；
(h)减少Treg对Teff的抑制；
(i)其中10μg/mL的抗体在全血细胞分析中不增加细胞因子产生；
(j)活体外增强Tfh细胞分泌IL-10和IFN-g中的至少一种；
(k)刺激ICOS介导的信号传导；
(l)对CD32B和/或CD32A具有增加的亲和力；和/或
(m)对CD16具有减小的亲和力。
3.根据权利要求1或2所述的经分离的抗体，其中所述抗体阻断人类ICOS和人类ICOS-L的相互作用。
4.根据权利要求1或2所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合至人类、食蟹猕猴、小鼠和大鼠ICOS。
5.一种经分离的抗体，其结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:9、10和11的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，以及分别包含SEQ ID NO:12、14和15的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(b)分别包含SEQ ID NO:18、19和20的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，以及分别包含SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(c)分别包含SEQ ID NO:26、27和28的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，以及分别包含SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(d)分别包含SEQ ID NO:34、35和36的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，以及分别包含SEQ ID NO:37、38和39的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(e)分别包含SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3区，以及分别包含SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；
(f)分别包含SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，以及分别包含SEQ ID NO:49、50和51的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域；或
(g)分别包含SEQ ID NO:191、192和193的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的重链可变域，以及分别包含SEQ ID NO:194、195和196的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3区的轻链可变域。
6.一种经分离的抗体，其结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)，其中所述重链和轻链可变区包含：
(a)分别为SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列；
(b)分别为SEQ ID NO:16和176的氨基酸序列；
(c)分别为SEQ ID NO:24和25的氨基酸序列；
(d)分别为SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列；
(e)分别为SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列；
(f)分别为SEQ ID NO:40和48的氨基酸序列；或
(g)分别为SEQ ID NO:186和189的氨基酸序列。
7.一种经分离的抗体，其与根据权利要求6所述的抗体竞争结合至ICOS或与根据权利要求6所述的抗体结合至相同的抗原决定基。
8.一种经分离的抗ICOS抗体，其特异性结合至人类ICOS的SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)的一或多个残基。
9.根据权利要求8所述的经分离的抗体，其中所述ICOS抗原决定基包含人类ICOS的氨基酸残基SIFDPPPFKVTL(SEQ ID NO:203)。
10.根据权利要求1、2和5至9中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
11.根据权利要求1、2和5至9中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体是全长IgG1或IgG2a抗体。
12.根据权利要求1、2和5至9中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中相较于如SEQID NO:206中阐述的人类IgG1序列，所述抗体在Fc区中包含至少一个氨基酸取代。
13.根据权利要求12所述的经分离的抗体，其中所述一或多个氨基酸取代增强所述抗体对FcγRIIb的亲和力。
14.根据权利要求12所述的经分离的抗体，其中所述一或多个氨基酸取代根据EU索引处于位置234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328或332处，或处于位置234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和/或332E处，或其中所述Fc区在235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和/或267E-328F处包含至少两个取代。
15.根据权利要求12所述的经分离的抗体，其中相较于如SEQ ID NO:206中阐述的人类IgG1序列，Fc区中的所述氨基酸取代是S267E。
16.根据权利要求15所述的经分离的抗体，其中相较于IgG1对照抗体，所述抗体具有减小的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
17.根据权利要求1、2和5至9中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
18.根据权利要求17所述的经分离的抗体，其中所述抗体片段是Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或scFv片段。
19.根据权利要求1、2和5至9中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
20.根据权利要求5至9中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体是人类、人源化或嵌合抗体。
21.一种经分离的全长人源化单克隆抗体，其结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)，其中所述重链包含SEQ ID NO:7中阐述的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:8中阐述的氨基酸序列。
22.一种经分离的全长人源化单克隆抗体，其结合至人类可诱导共刺激分子(ICOS)，其中所述重链由SEQ ID NO:7中阐述的氨基酸序列组成，并且所述轻链由SEQ ID NO:8中阐述的氨基酸序列组成。
23.一种经分离的核酸分子，其编码根据权利要求5或6所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
24.根据权利要求23所述的经分离的核酸，其中所述核酸是cDNA。
25.一种载体，其包含根据权利要求23或24所述的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的载体。
27.一种产生抗体的方法，其包括培养根据权利要求26所述的宿主细胞，其中产生所述抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞中回收所述抗体。
29.一种双特异性分子，其包含连接至第二功能部分的根据权利要求1至22中任一权利要求所述的抗体。
30.一种组合物，其包含根据权利要求1至22中任一权利要求所述的抗体或根据权利要求29所述的双特异性分子和医药上可接受的载剂和/或可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白。
31.根据权利要求30所述的组合物，其进一步包含额外治疗剂。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述额外治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
33.根据权利要求1、2、5至9、21和22中任一权利要求所述的抗体，其用作药剂。
34.根据权利要求1、2、5至9、21和22中任一权利要求所述的抗体，其用于治疗癌症。
35.根据权利要求34所述的抗体，其中所述癌症是膀胱癌、乳癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、头颈癌症、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤或病毒相关癌症。
36.根据权利要求34所述的抗体，其中所述癌症是结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、黑色素瘤、腺癌型NSCLC(NSCLC-AD)、鳞状细胞型NSCLC(NSCLC-SQC)、前列腺腺癌(PRC)、肾细胞癌(RCC)，或尿路上皮癌(UCC)。
37.根据权利要求1、2、5至9、21和22中任一权利要求所述的抗体，其用于增强免疫反应。
38.一种根据权利要求1至22中任一权利要求所述的抗体或根据权利要求29所述的双特异性分子或根据权利要求30、31或32所述的组合物的用途，其用于制造供治疗或延迟人类个体的癌症进展的药剂。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述癌症是膀胱癌、乳癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰脏癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌症、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤或病毒相关癌症。
40.根据权利要求38所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、黑色素瘤、腺癌型NSCLC(NSCLC-AD)、鳞状细胞型NSCLC(NSCLC-SQC)、前列腺腺癌(PRC)、肾细胞癌(RCC)，或尿路上皮癌(UCC)。
41.根据权利要求38所述的用途，其中所述药剂与一或多种额外治疗剂组合投与人类个体。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述额外治疗剂是化学治疗剂。
43.根据权利要求41所述的用途，其中所述额外治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
44.根据权利要求38至43所述的用途，其中所述药剂投与至少一个投药周期，其中对于所述至少一个周期中的每一个周期来说，所述药剂的至少一个剂量是以约375mg的剂量投与所述抗体。
45.一种根据权利要求1至22中任一权利要求所述的抗体或根据权利要求30、31或32所述的组合物的用途，其用于制造供刺激人类个体的免疫反应的药剂。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述个体患有肿瘤且刺激对抗所述肿瘤的免疫反应。
47.根据权利要求45所述的用途，其中所述个体患有慢性病毒感染且刺激对抗所述病毒感染的免疫反应。
48.根据权利要求45所述的用途，其中所述药剂是以足以实现和/或维持小于约80％的受体占有率的量或频率投与所述抗体。
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