BR112019013597A2 - Anticorpos agonistas anti-icos e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados (por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados e humanos) que se ligam ao coestimulador de célula T induzível humano (ICOS) e exibem propriedades funcionais terapeuticamente desejáveis, por exemplo, a capacidade de estimular a atividade de ICOS humano. As moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos da invenção, vetores de expressão, células hospedeiras, e métodos para expressar os anticorpos da invenção são também fornecidos. Os imunoconjugados, moléculas biespecíficas, e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos da invenção são também fornecidos. Os anticorpos da invenção podem ser usados, por exemplo, como um agonista para estimular ou realçar uma resposta imune em um indivíduo, por exemplo, respostas de célula T específica de antígeno contra um tumor ou antígeno viral. Os anticorpos da invenção podem também ser usados em combinação com outros anticorpos (por exemplo, anticorpos PD-1, PD-L1, e/ou CTLA-4) para tratar, por exemplo, câncer. Consequentemente, os anticorpos podem ser usados em métodos e aplicações terapêuticos para detectar a proteína ICOS.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS AGONISTAS ANTI-ICOS E USOS DOS MESMOS".

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos agonistas de coestimulador de célula T anti-induzíveis (ICOS) e composições farmacêuticas dos mesmos, e métodos para uso de tais anticorpos, por exemplo, para tratar câncer administrando os anticorpos agonistas anti- ICOS e composições farmacêuticas.

PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este Pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos Provisionais U.S. Nºs. 62/483.158 (depositado em 7 de abril de 2017), 62/514.151 (depositado em 2 junho de 2017), 62/545.732 (depositado em 15 de agosto de 2017) e 62/581.412 (depositado em 3 de novembro de 2017). O teor dos pedidos acima mencionados é pelo presente incorporados por referência em suas íntegras.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi eletronicamente depositada no formato ASCII e é pelo presente incorporado por referência em sua íntegra. A referida cópia ASCII, criada em 30 de março de 2018, é denominada MXI-556PC_SL.txt e é de 321.751 bytes de tamanho.

ANTECEDENTE

[004] Existe uma necessidade de combater a epidemia global de câncer. O câncer é uma das principais causas de doença e a segunda maior causa de morte no mundo. O câncer foi responsável por 8,8 milhões de mortes em 2015. De um modo geral, quase uma em cada seis mortes é devido ao câncer. Em 2018, haverá uma estimativa de

1.735.350 novos casos de câncer diagnosticados e 609.640 mortes por câncer nos Estados Unidos. Em 2012, havia cerca de 3,5 milhões de novos casos de câncer e 1,9 milhões de mortes por câncer na Europa. A Organização Mundial da Saúde estima em 2018 que o número de novos casos de câncer deve aumentar em cerca de 70% nas próximas duas décadas.

[005] Tratamentos tradicionais de câncer incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, entre outras terapias. Nos últimos anos, a imuno-oncologia surgiu como uma nova opção para o tratamento do câncer. A imuno-oncologia é diferente dos tratamentos tradicionais de câncer, que, por exemplo, tentaram atacar os tumores diretamente ou interromper o suprimento sanguíneo do tumor. Em vez disso, a imuno- oncologia é projetada para usar a resposta imunológica do paciente para tratar o câncer. Entender como o sistema imunológico afeta o desenvolvimento do câncer e como ele pode ser usado para tratar o câncer tem sido um problema desafiador e complicado. Por exemplo, os pacientes podem não responder a certas drogas imuno-oncológicas, e alguns desenvolvem mecanismos de resistência, como a exaustão de células T, que é quando uma célula T, um tipo específico de célula branca do sangue, não funciona mais adequadamente. (Dempke et al., Eur. J. of Cancer, 74 55-72 (2017)).

[006] Um importante papel do sistema imunológico é a sua capacidade de diferenciar entre células normais e células "estrangeiras". O sistema imunológico pode, assim, atacar as células estranhas e deixar as células normais sozinhas. Para fazer isso, o sistema imunológico usa "pontos de verificação", que são moléculas em certas células do sistema imunológico que precisam ser ativadas ou inativadas para iniciar uma resposta imune. Às vezes, as células tumorais podem usar esses pontos de verificação para evitar ser atacadas pelo sistema imunológico. Alguns fármacos imuno- oncológicos visam esses pontos de verificação agindo como inibidores de ponto de verificação. A proteína de morte programada 1 (PD-1) é um inibidor de ponto de verificação que tipicamente atua como um freio para evitar que as células T ataquem outras células do corpo. A PD-1 faz isso quando se liga ao ligante de morte programado 1 (PD-L1), uma proteína em algumas células normais (e cancerosas). Quando PD-1 se liga a PD- L1, essa interação diz para a célula T não atacar outras células. Algumas células cancerígenas têm grandes quantidades de PD-L1, o que as ajuda a fugir do ataque imunológico. Agentes terapêuticos, como os anticorpos monoclonais que têm como alvo essa interação PD-1/PD- L1, como nivolumabe (Opdivo®), podem bloquear a ligação de PD-1/PD- L1 para aumentar a resposta imune do organismo contra células tumorais.

[007] Existe a necessidade de drogas que visem diferentes mecanismos de ação que funcionam isoladamente ou em combinação com inibidores de checkpoint para tratar com segurança e eficácia o câncer e outras doenças ou condições. A ativação e função de células T s reguladas pelo sistema imunológico inato através de moléculas costimulatórias na superfamília CD28 (por exemplo, moléculas coestimulatórias positivas e negativas que promovem ou inibem a ativação do sinal do receptor de células T, respectivamente). A molécula indutível do coestimulador (ICOS), também conhecida como CD278, é uma proteína do ponto de verificação imunológico que é um membro dessa superfamília CD28. A ICOS é uma proteína de transmembrana do tipo I de 55-60 kDa que é expressa em células T após ativação de células T e coestimula a ativação de células T após a ligação do seu ligante, ICOS-L (B7H2). O ICOS é expresso por células CD4+, células CD8+ e células T reguladoras (Treg). O ICOS também tem demonstrado ser um fator fundamental na função das células T auxiliares foliculares (Tfhs) e na resposta imune humoral.

[008] A magnitude e qualidade da resposta imune de células T depende em parte do complicado equilíbrio entre os sinais coestimulatórios e inibitórios para as células T. Para melhorar as taxas de resposta dos pacientes após a imunoterapia e para superar a resistência aos medicamentos, existe a necessidade de novas terapias de imuno-oncologia.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos e humanizados) que se ligam a ICOS humano (SEQ ID Nº: 1), isto é, anticorpos anti-huICOS, e exibem propriedades funcionais desejáveis terapeuticamente. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados como um agonista para estimular ou intensificar uma resposta imune em um indivíduo, por exemplo, para estimular a atividade de ICOS humano e/ou para fornecer respostas de células T específicas de antígeno contra um antígeno viral ou tumoral. Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados em combinação com outros anticorpos (por exemplo, anticorpos PD-1, PD-L1, e/ou CTLA-4) para tratar várias condições, por exemplo, câncer. Consequentemente, os anticorpos aqui descritos, isoladamente ou em combinação com outros agentes, podem ser utilizados para tratar várias condições ou doenças, incluindo câncer. Em outras modalidades, os anticorpos aqui descritos podem ser utilizados em métodos para detectar ICOS

[0010] Em um aspecto, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou uma porção de ligação a antígeno deste) que se liga ao ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) ao ICOS humano e induz a proliferação e a produção de interferon-gama (IFN-γ) em células CD25- CD4+ T com uma EC50 de cerca de 0,01 a cerca de 0,16 nM em um ensaio de cocultura in vitro CHO-OKT3-CD32A; e/ou induz a produção de IFN-γ em células CD25- CD4+ T com uma EC50 de cerca de 0,002 nM a cerca de 0,4 nM em uma enterotoxina B estafilococal em um ensaio de cocultura de célula B e célula CD25- CD4+ T.

[0011] Em outra modalidade, o anticorpo (ou porção de ligação a antígeno deste) exibe uma ou mais das seguintes características: liga-se às células T humanas com uma EC50 de cerca de 0,7 nM e células T de cinomolgo com uma EC50 de cerca de 0,3 nM; liga-se às células CD4+ T ativadas humanas; não se liga ao CD28 humano ou CTLA-4 humano; ativa pelo menos um linfócito T primário, tais como uma célula T efetora (Teff) CD4+, uma célula T folicular auxiliar (Tfh), e uma célula T reguladora (Treg); induz a fosforilação de proteína cinase B (pAkt) em um ensaio de sinalização de célula T primária in vitro com uma EC50 de cerca de 30 nM; induz a produção de interleucina-10 (IL-10) em resposta à enterotoxina B estafilocócica em um Tfh e ensaio de cocultura de célula B infantil; induz um aumento da proliferação maior de Teffs estimuladas por CD3 comparado com CD45RA+ Tregs e CD45RO+ Tregs em um ensaio in vitro; reduz a supressão de Teff por Tregs; não aumenta a produção de citocina em um ensaio de célula de sangue inteira a 10 μg/mL; aumenta a secreção de pelo menos um de IL-10 e IFN-g por células Tfh in vitro; estimula a sinalização mediada por ICOS; possui afinidade aumentada para CD32B e/ou CD32A; e/ou possui afinidade diminuída para CD16.

[0012] Em outra modalidade, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação a antígeno deste) que se liga ao ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) ao ICOS humano e induz a proliferação e a produção de interferon-gama (IFN-γ) em células T CD25- CD4+ com uma EC50 de cerca de 0,083 nM em um ensaio de cocultura de CHO-OKT3-CD32A in vitro. Em outra modalidade, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação a antígeno deste) que se liga ao ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) ao ICOS humano e induz a proliferação e a produção de interferon-gama (IFN-γ) em células T CD25- CD4+ com uma EC50 de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 Nm em um ensaio de cocultura de CHO- OKT3-CD32A in vitro.

[0013] Em um aspecto, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação a antígeno deste) que se liga ao ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) ao ICOS humano e induz a produção de IFN-γ em células T CD25- CD4+ com uma EC50 de cerca de 0,2 nM em uma enterotoxina B estafilocócica em uma célula T CD25- CD4+ e ensaio de cocultura de célula B. Em outro aspecto, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação a antígeno deste) que se liga ao ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) ao ICOS humano e induz a produção de IFN-γ em células T CD25- CD4+ com uma EC50 de cerca de 0,01 – 0,1 nM em uma enterotoxina B estafilocócica em uma célula T CD25- CD4+ e ensaio de cocultura de célula B.

[0014] Em outra modalidade, o anticorpo (ou porção de ligação a antígeno deste) liga-se ao ICOS humano, cinomolgo, camundongo e rato.

[0015] Em outro aspecto, o anticorpo isolado liga-se à molécula de coestimulador induzível humano (ICOS) e compreende:

um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 9, 10 e 11, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 12, 14 e 15, respectivamente; um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 18, 19 e 20, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 21, 22 e 23, respectivamente; um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 26, 27 e 28, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 29, 30 e 31, respectivamente; um domínio variável de cadeia pesada compreendendo regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 34, 35 e 36, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 37, 38 e 39, respectivamente; um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 42, 43, e 44, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 45, 46, e 47, respectivamente;

um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 42, 43, e 44, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 49, 50, e 51, respectivamente; ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 191, 192, e 193, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 194, 195, e 196, respectivamente.

[0016] Em outro aspecto, o anticorpo isolado liga-se à molécula de coestimulador induzível humano (ICOS), e as regiões variáveis de cadeias pesada e leve compreendem: as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 5 e 6, respectivamente; as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 16 e 176, respectivamente; as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 24 e 25, respectivamente; as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 32 e 33, respectivamente; as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 40 e 41, respectivamente; as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 40 e 48, respectivamente; ou as sequências de aminoácido de SEQ ID Nºs: 186 e 189, respectivamente.

[0017] Em outro aspecto, o anticorpo monoclonal humanizado, de tamanho natural que se liga à molécula de coestimulador induzível humano (ICOS) compreende cadeias pesadas que compreendem a sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID Nº: 7 e as cadeias leves que compreendem a sequência de aminoácido na SEQ ID Nº: 8.

[0018] Em uma modalidade, o anticorpo isolado compete para ligação ao ICOS com ou liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo que bloqueia a interação de ICOS humano e ICOS-L humano. Em outra modalidade, o anticorpo isolado especificamente liga-se a um ou mais resíduos de SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano. Em outra modalidade, o epítopo de ICOS compreende resíduos de aminoácido SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano.

[0019] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos de tamanho natural, por exemplo, de um isótopo IgG1, IgG2, IgG2a ou IgG4. Em outra modalidade, os anticorpos são fragmentos de ligação, tais como fragmentos de Fab, Fab' ou (Fab')2, ou anticorpos de cadeia única.

[0020] Em um aspecto, os anticorpos anti-ICOS, ou porção de ligação a antígenos destes, ligam-se aos receptores de Fc, tais como um ou mais receptores gama de Fc de ativação (FcγRs). Em certas modalidades, o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc comparado com a sequência IgG1 humana (SEQ ID Nº: 206), que realça a afinidade do anticorpo a um FcγR, por exemplo, FcγRIIb, tais como uma ou mais substituição de aminoácido em uma posição compreendendo pelo menos um de 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, e/ou 332, de acordo com o índice EU, por exemplo, 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, e/ou 332E. Em outras modalidades, a região Fc compreende pelo menos duas substituições de 235Y-267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D,

267E-268E, e/ou 267E-328F comparado a uma sequência IgG1 humana (SEQ ID Nº: 206). Em ainda outra modalidade, a substituição de aminoácido na região Fc é S267E comparado à sequência IgG1 humana como mencionado na SEQ ID Nº: 206.

[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece imunoconjugados compreendendo um anticorpo da invenção, ou porção de ligação a antígeno deste, ligado a um agente terapêutico, por exemplo, um agente citotóxico ou um isótopo radioativo, bem como moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste, da invenção, ligado a uma segunda porção funcional tendo uma diferente especificidade de ligação do que o referido anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste.

[0022] As composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste, ou imunoconjugado ou molécula biespecífica da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável são também fornecidos. Em outro aspecto, a composição também compreende uma glicoproteína hialuronidase ativa neutra solúvel.

[0023] As moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos (por exemplo, cDNA), ou as porções de ligação a antígeno destes (por exemplo, regiões variáveis e/ou CDRs), da invenção são também fornecidas, bem como os vetores de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão. Os métodos para produzir os anticorpos anti-ICOS expressando o anticorpo em tais células hospedeiras e isolando o anticorpo da célula hospedeira são também fornecidos.

[0024] Em um aspecto, o anticorpo isolado reduziu a atividade da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) comparado a um anticorpo de controle de IgG1.

[0025] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de estimular as respostas imunes empregando-se anticorpos anti-ICOS, ou porções de ligação a antígeno destes, da invenção. Em uma modalidade, o método inclui estimular uma resposta de célula T específica de antígeno contatando-se as células T com um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno deste, da invenção, tal que uma resposta de célula T específica de antígeno seja estimulada. Em outra modalidade, a produção de interleucina-2 pela célula T específica de antígeno é estimulada. Em ainda outra modalidade, o indivíduo possui um(uns) tumor(es), e uma resposta imune contra o tumor é estimulada. Em outra modalidade, o indivíduo possui um vírus, e uma resposta imune contra o vírus é estimulada.

[0026] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para inibir o desenvolvimento de células de tumor em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste, da invenção, tal que o crescimento do tumor seja inibido no indivíduo. Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar infecção viral em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste, da invenção tal que a infecção viral seja tratada no indivíduo. Tais métodos compreendem administrar um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno deste, uma composição, biespecífica, ou imunoconjugado da invenção.

[0027] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para estimular uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste, da invenção, por exemplo, em combinação com pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1 e/ou um anticorpo anti-CTLA-4, tal que uma resposta imune seja estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir o crescimento do tumor ou estimular uma resposta antiviral. Em uma modalidade, o anticorpo imunoestimulador adicional é um anticorpo anti-PD-1. Em outra modalidade, o agente imunoestimulador adicional é um anticorpo anti-PD-L1. Em ainda outra modalidade, o agente imunoestimulador adicional é um anticorpo anti-CTLA-4. Em ainda outra modalidade, um anticorpo, ou porção de ligação a antígeno deste, da invenção é administrado com uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-2 modificado, e/ou IL-21), ou um anticorpo coestimulador (por exemplo, um anticorpo anti-CD137 e/ou anti-GITR). Em algumas modalidades, os anticorpos são, por exemplo, anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados.

[0028] Em uma modalidade, o anticorpo isolado é administrado com um ou mais agente(s) terapêutico(s) adicional(is) ao ser humano. Em outra modalidade, o agente terapêutico adicional é um agente quimioterápico.

[0029] São também fornecidos aqui métodos para o tratamento de câncer em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano), compreendendo administrar ao paciente um anticorpo anti-ICOS, ou uma combinação de um anticorpo anti-ICOS e pelo menos um anticorpo adicional (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD- L1, e/ou um anticorpo anti-CTLA-4), em que o anticorpo anti-ICOS, ou combinação de anticorpos, são administrados de acordo com um regime de dosagem particular (isto é, em uma quantidade de dose particular e de acordo com um planejamento de dosagem específico). Em um aspecto, o método compreende pelo menos um ciclo de administração e, para cada um de pelo menos um ciclo, pelo menos, uma dose do anticorpo é administrada em uma dose de cerca de 375 mg. Em outro aspecto, o anticorpo é administrado em uma quantidade ou frequência suficiente para obter e/ou manter uma ocupação receptora de menos do que cerca de 80%. Em outra modalidade, o método compreende a administração em um intervalo de uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quarto semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas, uma vez a cada onze semanas, ou uma vez a cada doze semanas.

[0030] Os métodos descritos aqui incluem o tratamento de cânceres, tais como câncer colorretal (CRC), carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), câncer de próstata (PRC), carcinoma urotelial (UCC), câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cervical, câncer de ovário, câncer de testículo, câncer esofágico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer de cólon, câncer de rim, câncer de estômago, câncer de célula germinativa, câncer de osso, câncer de fígado, câncer de tiroide, câncer de pele, neoplasma do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, ou câncer relacionado a vírus.

[0031] Em ainda outra modalidade, os anticorpos são formulados para administração intravenosa. Em outra modalidade, os anticorpos são formulados para administração subcutânea. Em outra modalidade, os anticorpos são administrados simultaneamente (por exemplo, em uma formulação única ou concorrentemente como formulações separadas). Alternativamente, em outra modalidade, os anticorpos são administrados sequencialmente (por exemplo, como formulações separadas).

[0032] A eficácia dos métodos de tratamento fornecidos aqui pode ser avaliada empregando-se quaisquer métodos adequados. Em algumas modalidades, o tratamento reduz o tamanho do tumor, reduz o número de lesões metastáticas ao longo do tempo, produz uma resposta completa, produz resultados parciais, e/ou resultados em doença estável.

[0033] Em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos anti-ICOS, ou porções de ligação a antígeno destes, e composições da invenção para o uso nos métodos antecedentes, ou para a fabricação de um medicamento para o uso nos métodos anteriores (por exemplo, para o tratamento de várias condições).

[0034] Também fornecidos são os kits que incluem uma composição farmacêutica contendo um anticorpo anti-ICOS em uma quantidade terapeuticamente eficaz adaptada para o uso nos métodos descritos aqui. Em outra modalidade, o kit inclui um anticorpo anti-ICOS e outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti- PD-L1, e/ou um anticorpo anti-CTLA-4) em quantidades terapeuticamente eficazes adaptadas para o uso nos métodos descritos aqui. Por exemplo, o kit compreende: uma dose de um anticorpo anti-ICOS; uma dose de um anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1, e/ou um anticorpo anti-CTLA-4; e instruções para empregar os anticorpos em um método da invenção.

[0035] Em outro aspecto, um anticorpo anti-ICOS é fornecido para administração (ou coadministração com outro anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1, e/ou um anticorpo anti- CTLA-4) de acordo com os métodos descritos aqui.

[0036] Outras características e vantagens da presente descrição serão evidentes a partir dos seguintes exemplos e descrição detalhados, os quais não devem ser interpretados como limitantes. Os conteúdos de todas as referências, registros GenBank, patentes e pedidos de patentes publicados citados em todo este pedido são expressamente incorporados aqui por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0037] A Figura 1 mostra a sequência de ICOS humano (SEQ ID Nº:

1). Os resultados da análise de ligação de epítopo para ICOS.4 empregando-se uma espectrometria de massa de permute de hidrogênio/deutério (HDX-MS) são mostrados como o epítopo ICOS.4 em negrito e sublinhado.

[0038] A Figura 2 mostra uma porção da sequência do domínio constante de IgG1f humano (SEQ ID Nº: 52, renumerado como resíduos 118 – 446) que podem ser usados nas variantes da sequência Fc descritas aqui. Os resíduos apresentados em negrito são exemplos de resíduos sujeitos a variação. O aminoácido alterado é fornecido em negrito abaixo do resíduo particular. A substituição de D270E está sublinhada. Um resíduo de lisina terminal-C A (K) foi omitido da sequência de SEQ ID Nº: 52, porém, em algumas modalidades, está presente. Também, em algumas modalidades, oa ácidos nucleicos codificando estas modalidades incluem nucleotídeos codificando a lisina extra na extremidade 3' do ácido nucleico.

[0039] A Figura 3 mostra a sequência de alinhamento das sequências de linha germinal de cadeia leve e pesada humana empregadas para humanizar o anticorpo de hamster parental (C398.4). VH3-15 foi selecionado para a cadeia pesada, e VKI O18 foi selecionado para a cadeia leve com base na homologia da sequência estrutural. A linha germinativa humana FW4, JK3, foi também selecionada para a cadeia leve com base na homologia de sequência. A linha germinativa humana FW4, JH4, foi selecionada para a cadeia pesada com base na similaridade de sequência, e não continha resíduos que pudessem representar um risco de perigo potencial. Os asteriscos e os sublinhados indicam que os resíduos de aminoácido diferem entre as sequências de linha germinal e a sequência de anticorpo de hamster parental (C398.4).

[0040] A Figura 4 mostra as sequências da região variável de cadeias leve e pesada do anticorpo anti-ICOS S267E de IgG1f de ICOS.33. As regiões CDR1, 2, e 3 das regiões variáveis de cadeias leve e pesada estão em negrito, sublinhadas e rotuladas.

[0041] As Figuras 5A e 5B são gráficos que mostram a produção de interferon-gama (IFN-γ) e a proliferação celular induzida por S267E de IgG1f de ICOS.33 em coculturas de células T CD25- CD4+ e células CHO-OKT3-CD32A.

[0042] A Figura 6 é um gráfico que ilustra a indução de IFN-γ por anticorpos anti-ICOS em uma célula T CD25- CD4+ e ensaio de cocultura de SEB de célula B.

[0043] As Figuras 7A e 7B são gráficos que mostram a indução de IL-10 e IFN-γ em um Tfh estimulado por SEB e ensaio de cocultura de célula B infantil. Média: indução de 4,4-vezes.

[0044] As Figuras 8A e 8B são gráficos que mostram a eliminação da supressão de Teff por Tregs com a coestimulação de anticorpo anti- ICOS.

[0045] As Figuras 9A e 9B são gráficos que comparam a capacidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 e ICOS.33 IgG1 induzir ADCC empregando-se células de dois doadores diferentes (Doadores 9 e 12).

[0046] A Figura 10 é um gráfico dos resultados de um ensaio ELISA comparando a capacidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 e ICOS.33 IgG1 para ligarem-se ao componente C1q de complemento humano.

[0047] As Figuras 11A-C são gráficos que mostram a atividade antitumoral de variantes Fc dos anticorpos ICOS, ICOS IgG1 SE ("ICOS hg1 SE") e ICOS IgG1 ("ICOS hg1"), e um anticorpo de controle de isótipo IgG1 ("hIgG1") em um modelo de tumor MC38.

[0048] As Figuras 12A-E são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor por grupo de tratamento. Os camundongos foram tratados com o controle de isótipo mG1, ICOS.1 mg1 D265A, ICOS.4 mg1, ICOS.4 hg1, ou ICOS.4 mg2a nos dias 7, 10, e 14 após o implante de célula Sa1N.

[0049] As Figuras 13A e 13B são gráficos que ilustram as curvas de crescimento de tumor mediano e médio por grupo de tratamento. Os camundongos foram tratados com o controle de isótipo mG1, ICOS.1 mg1 D265A, ICOS.4 mg1, ICOS.4 hg1, ou ICOS.4 mg2a nos dias 7, 10, e 14 após o implante de célula Sa1N.

[0050] As Figuras 14A-D são gráficos que mostram a porcentagem de células Foxp3+ Treg, células CD4+ Teff, e células CD8+ T em tumores no Dia 15. Os camundongos foram tratados com controle de isótipo mG1, ICOS.1 mg1 D265A, ICOS.4 mg1, ICOS.4 hg1, ou ICOS.4 mg2a nos dias 7, 10, e 14 após o implante de célula Sa1N.

[0051] As Figuras 15A-J são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor para os camundongos individuais por grupo de tratamento: anticorpos mIgG1, mIgG1 anti-PD-1 D265A ("PD-1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS.4 mg1") de controle de isótipo.

[0052] As Figuras 16A e 16B são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor medianas e médias por grupo de tratamento: anticorpos mIgG1, anti-PD-1 mg1, e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS.4 mg1") de controle de isótipo.

[0053] As Figuras 17A-D são gráficos que mostram as porcentagens médias (SEM) de Foxp3+, CD8+, Ki-67, e Granzima B em tumores. Os camundongos foram tratados com anticorpos mIgG1, anti-PD-1 mg1, e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS.4 mg1") de controle de isótipo.

[0054] As Figuras 18A-I são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor para os camundongos individuais por grupo de tratamento: anticorpos mIgG1, mIgG1 anti-PD-1 D265A ("PD-1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS") de controle de isótipo.

[0055] As Figuras 19A e 19B são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor médias e medianas por grupo de tratamento: anticorpos mIgG1, mIgG1 anti-PD-1 D265A ("PD-1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS") de controle de isótipo.

[0056] As Figuras 20A-D são gráficos que mostram a porcentagem de células Foxp3+ Treg, células CD4+ Teff, e células CD8+ T nos tumores. Os camundongos foram tratados com os anticorpos mIgG1, mIgG1 anti-PD-1 D265A ("PD-1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS") de controle de isótipo.

[0057] As Figuras 21A-C são gráficos que mostram as porcentagens médias de Ki-67 em tumores. Os camundongos foram tratados com os anticorpos mIgG1, mIgG1 anti-PD-1 D265A ("PD-1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS") de controle de isótipo.

[0058] As Figuras 22A-D são gráficos que mostram a expressão de ICOS-L em células B no baço e PBMC. Os camundongos foram tratados com os anticorpos mIgG1, mIgG1 anti-PD-1 D265A ("PD-1"), e/ou anti- ICOS.4 mIgG1 ("ICOS") de controle de isótipo.

[0059] As Figuras 23A-F são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor para os camundongos individuais por grupo de tratamento: anticorpos mIgG1, anti-CTLA-4 mIgG2b ("CTLA-4 mg2b"), anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS.4 mg1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG2a ("ICOS.4 mg2a") de controle de isótipo.

[0060] As Figuras 24A e 24B são gráficos que mostram as curvas de crescimento de tumor médias e medianas por grupo de tratamento: anticorpos mIgG1, anti-CTLA-4 mIgG2b ("CTLA-4 mg2b"), anti-ICOS.4 mIgG1 ("ICOS.4 mg1"), e/ou anti-ICOS.4 mIgG2a ("ICOS.4 mg2a") de controle de isótipo.

[0061] As Figuras 25A e 25B são gráficos que mostram a ligação de S267E de IgG1f de ICOS.33 às células T de humanos, macaco cinomolgo, rato e camundongo, como medido empregando-se FACS.

[0062] As Figuras 26A e 26B são gráficos que mostram que o anticorpo ICOS.33 IgG1f possui maior avidez de ligação às células CD4+ T como calculado pelos valores EC50 comparado a dois anticorpos anti-ICOS competidores.

[0063] A Figura 27 é uma ilustração esquemática de um estudo de um ensaio clínico de escalação de dose empregando-se o anticorpo anti-ICOS em combinação com o anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-CTLA-4.

[0064] A Figura 28 é um gráfico mostrando os efeitos de aumento de doses de anticorpo anti-ICOS, S267E de IgG1f de ICOS.33, em combinação com um anticorpo anti-PD1 e o efeito sobre a inibição de crescimento de tumor em um modelo de camundongo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0065] A presente invenção fornece anticorpos isolados, tais como anticorpos monoclonais, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados ou humanos, que especificamente ligam-se ao ICOS humano ("huICOS") e possuem atividade agonista para estimular uma resposta imune. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos aqui compreendem características estruturais particulares tais como regiões CDR compreendendo as sequências de aminoácido particular. Em outras modalidades, os anticorpos competem para ligação à proteína ICOS humano com, ou ligam-se ao mesmo epítopo como, os anticorpos da presente invenção.

[0066] São também fornecidos aqui métodos de preparação de tais anticorpos, imunoconjugados, e moléculas biespecíficas compreendendo tais anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, e composições farmacêuticas formuladas para conter os anticorpos ou fragmentos de anticorpo. São também fornecidos aqui métodos de empregar os anticorpos, sozinho ou em combinação com outros agentes, por exemplo, outros agentes imunoestimuladores (por exemplo, anticorpos), para realçar a resposta imune para, por exemplo, tratar câncer e/ou infecções. Consequentemente, os anticorpos anti- huICOS descritos aqui podem ser usados para tratar uma variedade de condições, incluindo, por exemplo, inibir o crescimento de tumor.

Definições

[0067] Para que a presente descrição possa ser mais facilmente entendida, certos termos são primeiro definidos. As definições adicionais são apresentadas por toda descrição detalhada. Os títulos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos da descrição, os quais podem ser entendidos por referência à especificação como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação em sua totalidade.

[0068] Como usado aqui, ICOS refere-se à proteína "co- estimulatória de célula T induzível" que em humanos é codificada pelo gene ICOS. ICOS é também conhecido como "co-estimulador induzível," "molécula imunomediadora de linfócito induzível por ativação," AILIM, CVID1, e CD278. ICOS humano é também descrito em GENE ID Nº: 29851 e MIM (Herança Mendeliana no Homem):

604558. A sequência de ICOS humano (NP_036224.1), incluindo uma sequência sinal de 20 aminoácidos, é fornecida como SEQ ID Nº: 1 e mostrada na Figura 1.

[0069] Abaixo estão as sequências de aminoácido das duas isoformas de ICOS humano.

[0070] Isoforma 1 (Q9Y6W8)

MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK

VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL (SEQ ID Nº: 1)

[0071] Isoforma 2 (Q9Y6W8-2)

MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKY PDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLS NNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYE

SQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKM (SEQ ID Nº: 205)

[0072] A sequência sinal das isoformas 1 e 2 corresponde aos aminoácidos 1-20 (acima sublinhados). Desse modo, as isoformas maduras 1 e 2 consistem nos aminoácidos 21-199 de SEQ ID Nº: 1 e aminoácidos 21-158 de SEQ ID Nº: 205.

[0073] ICOS interage com o ligante de ICOS (ICOS-L), o qual é também conhecido como ICOSL, ICOS-LG, LICOS, B7H2, B7-H2, B7RP1, B7RP-1, CD275 e GL50. ICOS-L humano é também descrito em GENE ID Nº: 23308 e MIM: 605717. A sequência de ICOS-L humano (NP_001269979.1), incluindo a sequência sinal de aminoácido 18, é fornecida em SEQ ID Nº: 2. Desse modo, a forma madura de ICOS-L consiste em aminoácidos 19-302 de SEQ ID Nº: 2.

[0074] O termo "anticorpo" ou "imunoglobulina," o qual é usado intermitentemente aqui, refere-se a uma proteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada (abreviada aqui como CH). Em certas modalidades, por exemplo, anticorpos lgG de ocorrência natural, a região constante de cadeia pesada é compreendida de uma articulação e três domínios, CH1, CH2 e CH3. Em certos anticorpos, por exemplo, anticorpos lgG de ocorrência natural, cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio (abreviado aqui como CL). As regiões VH e VL podem ser também subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR).

Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjada de terminação amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Uma cadeia pesada pode ter a lisina de terminação C ou não. A não ser que de outra forma especificada aqui, os aminoácidos nas regiões variáveis são numerados empregando-se o sistema de numeração Kabat e aqueles nas regiões constantes são numerados empregando-se o sistema EU. Uma imunoglobulina pode ser de qualquer dos isótipos conhecidos, incluindo IgA, IgA secretório, IgD, IgE, IgG e IgM. O isótipo IgG é dividido em subclasses em certas espécies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 em humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 em camundongos. Em certas modalidades, os anticorpos anti-ICOS descritos aqui são do subtipo IgG1. As imunoglobulinas, por exemplo, IgG1, existem em vários alotipos, os quais diferem um do outro em, no máximo, alguns aminoácidos. "Anticorpo" inclui, como forma de exemplo, igualmente anticorpos de ocorrência natural e de ocorrência não natural; anticorpos monoclonais e policlonais; anticorpos quiméricos e humanizados; anticorpos humanos e não humanos e anticorpos completamente sintéticos.

[0075] Como usado aqui, um "anticorpo IgG" possui a estrutura de um anticorpo IgG de ocorrência natural, isto é, ele possui o mesmo número de cadeias pesadas e leves e ligações de dissulfeto como um anticorpo IgG de ocorrência natural da mesma subclasse. Por exemplo, um anticorpo anti-ICOS IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 consistem em duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs), em que as duas cadeias pesadas e cadeias leves são ligadas pelo mesmo número e localização de pontes de dissulfeto que ocorrem em anticorpos de ocorrência natural IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, respectivamente (a não ser que o anticorpo tenha sido mutado para modificar as ligações de dissulfeto).

[0076] Um "antígeno" é uma molécula ou substância que ativa uma resposta imune e a qual um anticorpo liga-se. Os anticorpos tipicamente ligam-se especificamente a seu antígeno cognato com elevada afinidade, refletida por uma constante dissociação (KD) de 10-7 a 10-11 M ou menos. Qualquer KD maior do que cerca de 10-6 M é geralmente considerado indicar ligação não específica. Como usado aqui, um anticorpo que "especificamente liga-se" a um antígeno refere-se a um anticorpo que se liga ao antígeno e, em alguns casos, substancialmente antígenos idênticos, com elevada afinidade, os quais métodos tendo um KD de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos, ou entre 10-8 M e 10-10 M ou menos, porém não se liga com elevada afinidade aos antígenos não relacionados. Um antígeno é "substancialmente idêntico" a um antígeno fornecido se ele exibe um elevado grau de identidade de sequência ao antígeno fornecido, por exemplo, se ele exibe pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência à sequência do antígeno fornecido. Como forma de exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ao ICOS humano, em algumas modalidades, também reação cruzada com os antígenos ICOS de certas espécies de primata não humano (por exemplo, macaco cinomolgo), porém não tem reação cruzada com ICOS de outras espécies ou com um antígeno diferente de ICOS.

[0077] Como usado aqui, o termo "porção de ligação a antígeno" ou "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo refere-se a uma ou mais partes de um anticorpo que retém a capacidade de especificamente se ligar a um antígeno (por exemplo, ICOS humano). Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos ou porções de um anticorpo de tamanho natural.

Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antígeno" ou "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-ICOS descrito aqui, inclui: um fragmento Fab (fragmento de clivagem de papaína) ou um fragmento monovalente similar consistindo dos domínios VL, VH, LC e CH1; um fragmento F(ab')2 (fragmento de clivagem de pepsina) ou um fragmento bivalente similar compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto em uma região de articulação; um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward e outro(s), (1989) Nature 341:544-46), o qual consiste em um domínio VH; uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR); e uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas, que podem opcionalmente ser ligadas por um ligante sintético.

Além disso, apesar de os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, serem codificados por genes separados, eles podem ser ligados, empregando-se métodos recombinantes, por um ligante sintético que lhes permite ser feitos como uma cadeia de proteína única a qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia única Fv (scFv); ver, por exemplo, Bird e outro(s) (1988) Science 242:423-426; e Huston e outro(s) (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única são também pretendidos ser abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antígeno" ou "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos empregando-se técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos são avaliados pela utilidade da mesma maneira como são os anticorpos intactos. As porções de ligação a antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem química ou enzimática de imunoglobulinas intactas.

[0078] O termo "estrutura humana aceitadora" refere-se a uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácido de uma estrutura de domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura humana aceitadora "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode ter a mesma sequência de aminoácido como a estrutura de imunoglobulina humana de ocorrência natural ou estrutura de consenso humana, ou ela pode ter alterações de sequência de aminoácido comparada com a estrutura de imunoglobulina humana de ocorrência natural tipo selvagem ou estrutura de consenso humana. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácido são 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2, ou 1. Em algumas modalidades, a estrutura humana aceitadora VL é idêntida na sequência para a sequência estrutura de imunoglobulina humana VL ou a sequência da estrutura de consenso humana.

[0079] "Articulação," "domínio de articulação," ou "região de articulação," ou "região de articulação de anticorpo" refere-se ao domínio de uma região constante de cadeia pesada que liga o domínio CH1 ao domínio CH2 e compreende porções superiores, médias e inferiores. (Roux e outro(s) (1998) J. Imunol. 161:4083). Dependendo de sua sequência de aminoácido, uma articulação fornece níveis variados de flexibilidade entre o domínio de ligação a antígeno e a região efetora de um anticorpo e também fornece sítiois para a ligação de dissulfeto intermolecular entre as duas regiões constantes de cadeias pesadas. Como usado aqui, uma articulação inicia em E216 e termina em G237 para todos os isótipos de IgG (por numeração EU). Id. As sequências de articulações tipo selvagem IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 são mostradas na Tabela 1. Tabela 1 - Sequências de Região de Articulação Tipo Ig Terminação C CH1* Articulação superior Articulação média Articulação inferior IgG1 VDKRV EPKSCDKTHT CPPCP APELLGG (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:67) (SEQ ID Nº:68) (SEQ ID Nº:69) IgG2 VDKTV ERK CCVECPPCP APPVAG (SEQ ID Nº:70) (SEQ ID Nº:71) (SEQ ID Nº:72) IgG3 (17-15- VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG 15-15) (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:73) (EPKSCDTPPPCPRCP)3 (SEQ ID Nº:69) (SEQ ID Nº:74) IgG3 (17-15- VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG 15) (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:73) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 (SEQ ID Nº:69) (SEQ ID Nº:75) IgG3 (17-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:73) (EPKSCDTPPPCPRCP)1 (SEQ ID Nº:69) (SEQ ID Nº:76) IgG3 (15-15- VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG 15) (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:77) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 (SEQ ID Nº:69) (SEQ ID Nº:78) IgG3 (15) VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:77) (SEQ ID Nº:79) (SEQ ID Nº:69) IgG4 VDKRV ESKYGPP CPSCP APEFLGG (SEQ ID Nº:66) (SEQ ID Nº:80) (SEQ ID Nº:81) (SEQ ID Nº:82) sequências de aminoácido de terminação C dos domínios CH1.

[0080] O termo "articulação" inclui articulações tipo selvagem (tais como aquelas apresentadas na Tabela 1), bem como variantes destas (por exemplo, articulações de ocorrência não natural ou articulações modificadas). Por exemplo, o termo "articulação IgG2" inclui articulação IgG2 tipo selvagem, como mostrado na Tabela 1, e variantes tendo 1 ou mais mutações (por exemplo, substituições, deleções e/ou adições), por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1 a 3, 1 a 5, 3 a 5 e/ou no máximo 5, 4, 3, 2, ou 1 mutações. Variantes de articulação IgG2 exemplares incluem articulações IgG2 nas quais 1, 2, 3 ou todas as 4 cisteínas (C219, C220, C226 e C229) são mudadas para outro aminoácido, por exemplo, serina. Em uma modalidade específica, a região de articulação IgG2 possui uma substituição C219S. Em certas modalidades, a articulação compreende sequências de pelo menos dois isótipos. Por exemplo, a articulação pode compreender a articulação superior, média ou inferior de um isótipo, e o resíduo da articulação de um ou mais outros isótipos. Por exemplo, a articulação pode ser uma articulação IgG2/IgG1, e pode compreender, por exemplo, as articulações superior e média de IgG2 e a articulação inferior de IgG1. Uma articulação pode ter função efetora ou ser privada de função efetora. Por exemplo, a articulação inferior de IgG1 tipo selvagem fornece função efetora. O termo "domínio CH1" refere-se à região constante de cadeia pesada ligando o domínio variável à articulação em um domínio constante de cadeia pesada. Como usado aqui, um domínio CH1 inicia em A118 e termina em V215. O termo "domínio CH2" refere-se à região constante de cadeia pesada ligando a articulação ao domínio CH3 em um domínio constante de cadeia pesada. Como usado aqui, um domínio CH2 inicia em P238 e termina em K340. O termo "domínio CH3" refere-se à região constante de cadeia pesada que é terminal C para o domínio CH2 em um domínio constante de cadeia pesada. Como usado aqui, um domínio CH3 inicia em G341 e termina em K447.

[0081] Um "anticorpo bifuncional" ou "biespecífico" é um anticorpo híbrido artificial tendo duas especificidades de ligação diferentes, por exemplo, dois pares de cadeia pesada/leve diferentes, dando origem a dois sítios de ligação a antígeno com especificidade para antígenos diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos de Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Imunol. 79:315-321 (1990); Kostelny e outro(s), J. Imunol. 148, 1547-1553 (1992).

[0082] Como usado aqui, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais na população são substancialmente similares e ligam-se ao(s) mesmo(s) epítopo(s) (por exemplo, os anticorpos exibem uma afinidade e especificidade de ligação únicas), exceto para as possíveis variantes que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. "Monoclonal" indica a característica do anticorpo como tendo sido obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não requer a produção do anticorpo por qualquer método particular. O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos que exibem uma especificidade de ligação única e que possuem regiões constantes opcionais e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos empregando-se o método de hibridoma, um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, é exposto a um antígeno, e um glóbulo branco conhecido como uma célula B produz anticorpos que ligam-se ao antígeno, o qual é colhido do animal não humano transgênico. As células B isoladas são fundidas com uma célula imortalizada para produzir uma linhagem de célula híbrida chamada hidridoma. Em uma modalidade, a hibridoma possui um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

[0083] Os fragmentos de ligação a antígeno (incluindo scFvs) de tais imunoglobulinas são também abrangidos pelo termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui. Os anticorpos monoclonais sõa altamente específicos, sendo direcionados contra um sítio antigênico único. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo convencional (policlonal), que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes epítopos sobre o antígeno, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um epítopo único. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados empregando-se qualquer técnica reconhecida e aquelas descritas aqui tais como, por exemplo, um método de hibridoma, um animal transgênico, métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nº

4.816.567), ou empregando-se bibliotecas de anticorpo de fago empregando-se técnicas descritas em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nº 7.388.088 e Publicação PCT Nº WO 00/31246). Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, e anticorpos humanizados e podem ocorrer naturalmente ou serem produzidos de forma recombinante.

[0084] Como usado aqui, o termo "anticorpo humano recombinante" inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por métodos recombinantes, tais como (1) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para os genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparado destes, (2) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (3) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatório, recombinante, e (4) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros métodos que envolvam a junção de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes compreendem regiões constantes e variáveis que usam sequências de imunoglobulina de linha germinal humana particular são codificados pelos genes de linha germinal, porém incluem recombinações subsequentes e mutações que ocorrem, por exemplo, durante a maturação do anticorpo. Como conhecido na técnica (ver, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117- 1125), a região variável contém o domínio de ligação a antígeno, o qual é codificado por vários genes que reorganizam-se para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Além da reorganização, a região variável pode ser também modificada pelas múltiplas alterações de aminoácido único (referido como mutação somática ou hipermutação) para aumentar a afinidade do anticorpo ao antígeno estranho. A região constante variará em outra resposta a um antígeno (isto é, mudança de isótipo). Desse modo, as moléculas de ácido nucleico mutadas somaticamente e reorganizadas que codificam os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia pesada e cadeia leve em resposta a um antígeno não podem ter identidade de sequência com as moléculas de ácido nucleico originais, porém ao invés disso, serão substancialmente idênticas ou similares (por exemplo, ter pelo menos 80% de identidade).

[0085] Como usado aqui, um "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo tendo regiões variáveis em que igualmente a estrutura e as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos anti-huICOS descritos aqui podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha germinal humana (por exemplo, por causa das mutações introduzidas pela mutagênese específica de sítio ou aleatória in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo "anticorpo humano" não é pretendido incluir anticorpos em que as sequências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero não humano, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências de estrutura humana. Como usado aqui, os termos anticorpos "humanos" e "completamente humanos" são usados alternadamente.

[0086] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo em que alguns, a maioria, ou todos os aminoácidos fora dos domínios CDR de um anticorpo não humano são substituídos com os correspondentes aminoácidos derivados de anticorpos humanos. Em uma modalidade de uma forma humanizada de um anticorpo, alguns, a maioria, ou todos os aminoácidos fora dos domínios de CDR foram substituídos com os aminoácidos de anticorpos humanos, enquanto que alguns, a maioria, ou todos os aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de CDR são inalterados. Pequenas adições, deleções, inserções, substituições, ou modificações de aminoácidos são permissíveis enquanto elas não previnem o anticorpo de ligação a um antígeno particular. Um anticorpo "humanizado" retém uma especificidade antigênica similar àquela do anticorpo original.

[0087] Um "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as regiões constantes são derivadas de outras espécies, tal como um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de camundongo e as regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano. Um anticorpo "híbrido" refere-se a um anticorpo tendo cadeias pesadas e leves de diferentes tipos, tal como uma cadeia pesada de camundongo ou hamster (parental) e uma cadeia leve humanizada, ou vice versa. Os anticorpos quiméricos ou híbridos podem ser construídos, por exemplo, por engenharia genética, a partir de segmentos de gene de imunoglobulina pertencendo a espécies diferentes.

[0088] Como usado aqui, "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgG (incluindo anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM,

IgA (incluindo IgA1 e IgA2), IgD, e IgE) que é codificado pelos genes da região constante de cadeia pesada do anticorpo.

[0089] "Alotipo" refere-se às variantes de ocorrência natural dentro de um grupo de isótipo específico. (Ver, por exemplo, Jefferis e outro(s) (2009) mAbs 1:1).

[0090] Os termos "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usados alternadamente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[0091] Como usado aqui, um "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outras proteínas e materiais celulares. Como usado aqui, uma "função efetora" refere-se à interação de uma região Fc de anticorpo com um ligante ou receptor de Fc, ou um evento bioquímico que resulta desta. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de receptor de Fc, funções efetoras mediadas por FcγR tais como ADCC e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), e subregulação de um receptor de superfície de célula (por exemplo, o receptor de célula B; BCR). Tais funções efetoras geralmente requerem a região Fc ser combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo).

[0092] Um "receptor de Fc" ou "FcR" é um receptor que se liga à região de Fc de uma imunoglobulina. FcRs que se liga a um anticorpo de IgG compreende receptores da família FcγR, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas emendadas destes receptores. A família FcγR consiste em três receptores de ativação (FcγRI, FcγRIII, e FcγRIV em camundongos; FcγRIA, FcγRIIA, e FcγRIIIA em humanos) e um inibitório (FcγRIIb, ou equivalentemente FcγRIIB). Várias propriedades exemplares de FcγRs humanos são sumarizadas na Tabela 2. A maioria dos tipos de célula efetora co-expressam um ou mais FcγR de ativação e o FcγRIIb inibitório, enquanto que as células exterminadoras naturais (NK) seletivamente expressam um receptor Fc de ativação (FcγRIII em camundongos e FcγRIIIA em humanos), porém não o FcγRIIb inibitório em camundongos e humanos. O IgG1 humano liga-se a maioria dos receptores Fc humanos e é considerado equivalente ao IgG2a de murino com relação aos tipos de receptores Fc de ativação que ele liga-se. Tabela 2 Propriedades exemplares de FcγRs humanos Fcγ Variantes Afinidade para Preferência de Distribuição celular alélicas IgG humano isótipo FcγRI Nenhuma Alta (KD = cerca IgG1=3>4>>2 Monócitos, macrófagos, descrita de 10 nM) neutrófilos ativados, células dendríticas FcγRIIA H131 Baixa média IgG1>3>2>4 Neutrófilos, monócitos, macrófagos, eosinófilos, células dendríticas, R131 Baixa IgG1>3>4>2 plaquetas FcγRIIIA V158 Média IgG1=3>>4>2 Células exterminadoras naturais (NK), monócitos, F158 Baixa IgG1=3>>4>2 macrófagos, mastócitos, eosinófilos, células dendríticas FcγRIIb I232 Baixa IgG1=3=4>2 células B, monócitos, macrófagos, células T232 Baixa IgG1=3=4>2 dendríticas, mastócitos

[0093] Como usado aqui, uma "região Fc" (região cristalizável de fragmento) ou "domínio de Fc" ou "Fc" refere-se à região de terminação C da cadeia pesada de um anticorpo que media a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo a ligação aos receptores de Fc localizados sobre várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Desse modo, uma região de Fc compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina da região constante (por exemplo, CH1 ou CL). Nos isótipos de anticorpo IgG, IgA, e IgD, a região de Fc compreende os domínios constantes CH2 e CH3 em cada uma das duas cadeias pesadas de anticorpo; as regiões de Fc IgM e IgE compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (CH domínios 2-4) em cada cadeia de polipeptídeo. Para IgG, a região Fc compreende domínios de imunoglobulina Cγ2 e Cγ3 e a articulação entre Cγ1 e Cγ2. Apesar dos limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina poder variar, a região Fc de cadeia pesada IgG humano é normalmente definida para distender de um resíduo de aminoácido na posição C226 ou P230 (ou um aminoácido entre estes dois aminoácidos) ao terminal de carbóxi da cadeia pesada, em que o número é de acordo com o índice EU como em Kabat. (Kabat e outro(s) (1991) Sequences of Proteins of Imunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD). O domínio CH2 de uma região Fc de IgG humano extende de cerca do aminoácido 231 a cerca do aminoácido 340, enquanto que o domínio CH3 está posicionado ao lado do terminal C de um domínio CH2 em uma região Fc, isto é, ele extende de cerca do aminoácido 341 a cerca do aminoácido 447 de um IgG (incluindo uma lisina de terminação C). Como usado aqui, a região Fc pode ser uma Fc de sequência nativa, incluindo qualquer variante alotípica, ou uma variante de Fc (por exemplo, uma Fc de ocorrência não natural). A região Fc refere-se a esta região em isolamento ou no contexto de um polipeptídeo de proteína compreendendo Fc tal como uma "proteína de ligação compreendendo uma região Fc," também referido como uma "proteína de fusão de Fc" (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesina).

[0094] Uma "região Fc" (região cristalizável de fragmento) ou "domínio de Fc" ou "Fc" refere-se à região de terminação C da cadeia pesada de um anticorpo que media a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo a ligação aos receptores de Fc localizados em várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico.

Desse modo, uma região Fc compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante (por exemplo, CH1 ou CL). Em isótipos de anticorpos IgG, IgA e IgD, a região Fc compreende dois fragmentos de proteína idênticos, derivados dos segundo (CH2) e terceiro (CH3) domínios constantes das duas cadeias pesadas de anticorpo.

Nos isótopos dos anticorpos IgM e IgE, as regiões Fc compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (CH domínios 2-4) em cada cadeia de polipeptídeo.

Para IgG, a região Fc compreende os domínios de imunoglobulina CH2 e CH3 e a articulação entre os domínios CH1 e CH2. Apesar da definição dos limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina poder variar, como definido aqui, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é defiida para estender do resíduo de aminoácido residue D221 para IgG1, V222 para IgG2, L221 para IgG3 e P224 para IgG4 ao terminal de carbóxi da cadeia pesada, em que a numeração é de acordo com o índice de EU como em Kabat (Kabat, e outro(s), 1991). O domínio de CH2 de uma região Fc de IgG humano estende-se do aminoácido 237 ao aminoácido 340, e o domínio CH3 é posicionado na lateral do terminal C de um domínio CH2 em uma região Fc, isto é, ele estende do aminoácido 341 ao aminoácido 447 ou 446 (se o resíduo de lisina do terminal C for ausente) ou 445 (se a glicina de terminação C e os resíduos de lisina foram ausentes) de um IgG.

Como usado aqui, a região Fc pode ser uma sequência Fc nativa, incluindo qualquer variante alotípica, ou uma variante Fc (por exemplo, um Fc de ocorrência não natural). Fc pode também referir-se a esta região em isolamento ou no contexto de um polipeptídeo de proteína compreendendo Fc tal como uma "proteína de ligação compreendendo uma região Fc," também referido como uma "proteína de fusão de Fc" (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesina).

[0095] Uma "região Fc de sequência nativa" ou "Fc de sequência nativa" possui uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humano de sequência nativa inclui uma região Fc de lgG1 humano de sequência nativa (por exemplo, SEQ ID Nº: 206); a região Fc de lgG2 humano de sequência nativa; região Fc de lgG3 de sequência nativa; e região Fc de lgG4 humano de sequência nativa bem como as variantes de ocorrência natural destas. Fc de sequência nativa inclui os vários alótipos de Fcs. (Ver, por exemplo, Jefferis e outro(s) (2009) mAbs 1:1).

[0096] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio em um antígeno (por exemplo, huICOS) ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo especificamente liga-se. Os epítopos podem ser formados igualmente de aminoácidos contíguos (normalmente um epítopo linear) ou aminoácidos não contíguos justapostos por duplicação terciária da proteína (normalmente um epítopo conformacional). Os epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente, porém não sempre, retidos na exposição de solventes de desnaturação, enquanto que os epítopos formados por duplicação terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos em uma única conformação espacial.

[0097] O termo "mapeamento de epítopo" refere-se ao processo de identificar as determinantes moleculares no antígeno envolvido no reconhecimento de antígeno de anticorpo. Os métodos para determinar o que os epítopos são ligados por um anticorpo fornecido são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de imunomanchamento e imunoprecipitação, em que os peptídeos contíguos ou sobreposição de (por exemplo, de ICOS) são testados para reatividade com um anticorpo fornecido (por exemplo, anticorpo anti-ICOS); cristalografia de raio-x; análise mutacional de antígeno, ressonância magnética nuclear bi-dimensional; exposição de levedura; e permuta de hidrogênio/deutério-espectrometria de massa (HDX-MS) (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[0098] O termo "liga-se ao mesmo epítopo" com referência a dois ou mais anticorpos significa que os anticorpos ligam-se ao mesmo segment dos resíduos de aminoácido, como determinado por um método fornecido. As técnicas para determinar se os anticorpos ligam- se ao "mesmo epítopo em ICOS" com os anticorpos descritos aqui incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítopo, tais como análises de raio-x de cristais de complexos de antígeno:anticorpo, que fornecem resolução atômica do epítopo, e HDX-MS. Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo aos fragmentos de antígeno (por exemplo, fragmentos proteolíticos) ou às variações mutadas do antígeno onde perde ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é frequentemente considerado como indicação de um componente de epítopo, tal como mutagênese de escaneamento de alanina (Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081) ou exibição de levedura de variantes de sequência alvo mutante (ver Exemplo 16). Além disso, os métodos combinatórios computacionais para mapeamento de epítopo podem também ser usados. Estes métodos contam com a capacidade do anticorpo de interesse à afinidade dos peptídeos pequenos específicos isolados de bibliotecas de peptídeo de exibição de fago combinatório. Os anticorpos tendo as mesmas sequências VH e VL ou a mesma CDR1, 2 e 3 são esperados ligarem-se ao mesmo epítopo.

[0099] Os anticorpos que "compete com outro anticorpo para ligar-

se a um alvo" referem-se aos anticorpos que inibem (parcialmente ou completamente) a ligação do outro anticorpo ao alvo. Se dois anticorpos competem um como o outro para se ligarem a um alvo, isto é, se e em que medida um anticorpo inibe a ligação do outro anticorpo a um alvo, pode ser determinado empregando-se experimentos de competição de ligação conhecidos, por exemplo, análise de ressonância de plasmônio superficial BIACORE® (SPR). Em certas modalidades, um anticorpo compete com, e inibe a ligação de outro anticorpo a um alvo por pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. O nível de inibição ou competição pode ser diferente dependendo de qual anticorpo é o "anticorpo de bloqueio" (isto é, o anticorpo que quando combinado com um antígeno bloqueia outra reação imunológica com o antígeno). Os ensaios de competição podem ser conduzidos como descrito, por exemplo, em Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harb. Protoc. 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 ou no capítulo 11 de "Using Antibodies" por Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Os anticorpos competindo ligam-se ao mesmo epítopo, um epítopo de sobreposição, ou aos epítopos adjacentes (por exemplo, como evidenciado por obstáculo estérico). Dois anticorpos "competição cruzada" se os anticorpos bloqueiam um ao outro em ambos os sentidos por pelo menos 50%, isto é, independentemente se, ou o outro anticorpo é contatado primeiro com o antígeno no experimento de competição.

[00100] Os ensaios de ligação competitivos para determinar se dois anticorpos competem, ou competição cruzada para ligação, incluem competição para ligação às células T expressando ICOS, por exemplo, por citometria de fluxo. Outros métodos incluem: ressonância de plasmônio superficial (SPR) (por exemplo, BIACORE®), radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição de sanduíche (ver Stahli e outro(s), Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (ver Kirkland e outro(s), J. Imunol. 137:3614 (1986)); ensaio rotulado direto de fase sólida, ensaio sanduíche rotulado direto de fase sólida (ver Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcação direta de fase sólida empregando-se 1-125 marcações (ver Morel e outro(s), Mol. Imunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung e outro(s), Virology 176:546 (1990)); e RIA rotulado direto. (Moldenhauer e outro(s), Scand. J. Imunol. 32:77 (1990)).

[00101] Como usado aqui, os termos "ligação específica," "ligação seletiva," "seletivamente liga-se," e "especificamente liga-se," referem- se à ligação de anticorpo a um epítopo em um antígeno pré- determinado. Tipicamente, o anticorpo: (1) liga-se com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de aproximadamente menos do que 10-7 M, tal como aproximadamente menos do que 10 -8 M, 10-9 M ou 10- 10 M ou ainda inferior quando determinado por, por exemplo, tecnologia de SPR em um instrumento de SPR BIACORE® 2000 empregando-se o antígeno pré-determinado, por exemplo, ICOS humano recombinante como o analito e o anticorpo como o ligante, ou análise de Scatchard de ligação do anticorpo às células positivas de antígeno, e (2) liga-se ao antígeno pré-determinado com uma afinidade que seja pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno pré- determinado ou um antígeno intimamente relacionado. Consequentemente, um anticorpo que "especificamente liga-se ao ICOS humano" refere-se a um anticorpo que se liga ao ICOS humano ligado à célula ou solúvel com um KD de 10-7 M ou menos, tal como aproximadamente menos do que 10 -8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda inferior. Um anticorpo que "reage cruzado com ICOS cinomolgo" refere-

se a um anticorpo que se liga ao ICOS cinomolgo com um KD de 10-7 M ou menos, tal como aproximadamente menos do que 10 -8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda inferior.

[00102] O termo "kassoc" ou "ka", como usado aqui, refere-se a taxa de associação constante de uma interação particular de anticorpo- antígeno, enquanto que o termo "kdis" ou "kd," como usado aqui, refere- se a taxa de dissociação constante de uma interação particular de anticorpo-antígeno. O termo "KD", como usado aqui, refere-se à constante de dissociação de equilíbrio, a qual é obtida da relação de kd para ka (isto é, kd/ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD para os anticorpos podem ser determinados empregando-se os métodos bem estabelecidos na técnica. Os métodos disponíveis para determinar o KD de um anticorpo é análise de interferometria de biocamada (BLI), tal como se empregando um dispositivo ForteBio Octet RED, SPR, preferivelmente empregando-se um sistema de biosensor tal como um sistema SPR BIACORE®, ou análise de Scatchard e citometria de fluxo.

[00103] O termo "EC50", no contexto de um ensaio in vitro ou in vivo empregando-se um fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno deste, refere-se à concentração de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno deste que induz uma resposta que seja 50% da resposta máxima, isto é, meio caminho entre a resposta máxima e a linha de referência.

[00104] O termo "liga-se ao ICOS imobilizado" refere-se à capacidade de um anticorpo descrito aqui ligar-se ao ICOS, por exemplo, expresso na superfície de uma célula ou ligado a um suporte sólido.

[00105] O termo "reage cruzado," como usado aqui, refere-se a capacidade de um anticorpo descrito aqui ligar-se ao ICOS de uma espécie diferente. Por exemplo, um anticorpo descrito aqui que se liga ao ICOS humano pode também ligar-se ao ICOS de outra espécie (por exemplo, ICOS cinomolgo). Como usado aqui, reatividade cruzada pode ser medida detectando-se uma reatividade específica com antígeno purificado em ensaios de ligação (por exemplo, SPR, ELISA) ou ligação a, ou de outra forma a funcionalidade interagindo com, células fisiologicamente expressando ICOS. Os métodos para determinar a reatividade cruzada incluem ensaios de ligação padrões como descrito aqui, por exemplo, por análise de SPR empregando-se um instrumento SPR BIACORE® 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia), ou técnicas de citométricas de fluxo.

[00106] "Ocupação receptora" ou "ocupação do receptor", como usado aqui, refere-se à quantidade de anticorpo agonístico (por exemplo, os anticorpos anti-ICOS descritos aqui) que é ligada ao receptor imunoestimulador (por exemplo, ICOS humano). "% de ocupação de receptor" ou "% de ocupação do receptor" pode ser calculado empregando-sse a seguinte fórmula: ([ΔMFI de Teste]/[ΔMFI do Total]) x 100. ΔMFI (mudança em unidade de fluorescência média) é calculado subtraindo-se o MFI de manchamento de base com um anticorpo de controle de isótipo do MFI do anticorpo agonístico ligado. O nível de receptor total é determinado adicionando-se uma quantidade de saturação de anticorpo agonístico para determinar a expressão máxima e, portanto, MFI do receptor imunoestimulador particular. Método alternativo para calcular a expressão de receptor total é empregar um anticorpo contra o mesmo receptor imunoestimulador que não compete com o anticorpo agonístico para o qual a ocupação receptora está sendo calculada.

[00107] Como usado aqui, o termo "de ocorrência natural" como aplicado a uma substância que está presente na natureza que não foi intencionalmente modificada por pessoa. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo

(incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado por pessoa no laboratório é de ocorrência natural.

[00108] Um "polipeptídeo" refere-se a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivamente ligados, sem nenhum limite superior no comprimento da cadeia. Um ou mais resíduos de aminoácido na proteína pode conter uma modificação tal como, porém não limitado a, glicosilação, fosforilação ou uma ligação de dissulfeto. Uma "proteína" pode compreender um ou mais polipeptídeos.

[00109] O termo "molécula de ácido nucleico," como usado aqui, é pretendido incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou filamento duplo, e pode ser cDNA.

[00110] O termo "cDNA" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural que foi criada ou derivada de mRNA, isto é, as regiões de não codificação foram removidas.

[00111] O termo "mRNA" ou "RNA mensageiro" é um intermediário de ácido nucleico que especifica a sequência de aminoácido de um polipeptídeo durante a translação.

[00112] Como usado aqui, o termo "modificações de sequência conservadora" refere-se às modificações de aminoácido que não significantemente afetam ou alteram as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido. Tais modificações conservadoras incluem a substituição de aminoácidos, adições e deleções. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por reação de cadeia de polimerase (PCR). A substituição de aminoácidos conservadores são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofan), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Desse modo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado pela função retida (isto é, as funções apresentadas aqui) empregando-se os ensaios funcionais descritos aqui. Em certas modalidades, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um anticorpo anti-ICOS é substituído com outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Os métodos de identificar as substituições conservadoras de aminoácido e nucleotídeo que não eliminam a ligação a antígeno são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell e outro(s), Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi e outro(s) Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks e outro(s) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).

[00113] Para os ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos, ou sequências designadas destes, quando otimamente alinhados e comparados, são idênticos, com deleções ou inserções de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, pelo menos cerca de 90% a 95%, ou pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente,

a homologia substancial existe quando os segmentos hibridizarão sob condições de hibridização seletiva ao complemento do filamento de ácido nucleico.

[00114] Para os polipeptídeos, o termo "homologia substancial" indica que dois polipeptídeos, ou sequências designadas destes, quando otimamente alinhados e comparados, são idênticos, com as deleções ou inserções de aminoácido apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos aminoácidos, pelo menos cerca de 90% a 95%, ou pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos aminoácidos.

[00115] A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições compartilhadas pelas sequências quando as sequências são otimamente alinhadas (isto é, % homologia = (número de posições idênticas)/(número total de posições) x 100), levando em consideração o número de intervalos e o comprimento de cada intervado, que precisa ser introduzido para o ótimo alinhamento das duas sequências. A comparação das sequências e a determinação da porcentagem de identidade entre as duas sequências podem ser obtidas empregando-se um algoritmo matemático, como descrito abaixo.

[00116] A porcentagem de identidade entre as duas sequências de nucleotídeo pode ser determinada, por exemplo, empregando-se o programa GAP no pacote de software GCG, empregando-se uma matriz nwsgapdna.cmp e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. A porcentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácido ou nucleotídeo pode ser também determinada empregando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), empregando-se uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácido pode ser determinada empregando-se o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, empregando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de interval de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[00117] As sequências de ácido nucleico e proteína, descritas aqui, podem também ser empregadas como uma "sequência queri" para realizar uma pesquisa contra a base de dados pública, por exemplo, para identificar as sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas empregando-se os programas NBLAST e XBLAST (versão

2.0) de Altschul, e outro(s) (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, tamanho da unidade de informação básica = 12 para obter as sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas aqui. As pesquisas de proteína de BLAST podem ser realizadas como o programa XBLAST, escore = 50, tamanho da unidade de informação básica = 3 para obter as sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína descritas aqui. Para obter os alinhamentos intervalados com propósitos de comparação, BLAST intervalado pode ser usado como descrito em Altschul e outro(s), (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e BLAST intervalado, os parâmetros padrões dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. (Ver, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI), disponível em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[00118] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, por exemplo, uma célula hospedeira, em um lisado de célula, ou em uma forma substancialmente pura ou parcialmente purificada. Um ácido nucleico é "isolado" ou "substancialmente puro renderizado"

quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, as outras partes do cromossoma) ou proteínas, por técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandagem de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese de gel agarose e outros bem conhecidos na técnica. (Ver, F. Ausubel, e outro(s), ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova York (1987)).

[00119] O termo "vetor", como usado aqui, é pretendido referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," o qual refere-se a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira, e desse modo são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Os vetores de expressão úteis nas técnicas de DNA recombinante incluem os plasmídeos. Como usado aqui, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente, como o plasmídeo é a mais comumente empregada forma de vetor. Entretanto, também incluídas são as outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retroviroses defectivas de replicação, adenoviroses e viroses associadas ao adeno), que servem funções equivalentes.

[00120] O termo "célula hospedeira" ou "célula hospedeira recombinante", que são empregadas alternadamente, refere-se a uma célula que compreende um ácido nucleico que não está presente naturalmente na célula, e pode ser uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos referem-se não apenas à célula do indivíduo particular, porém à progênie de tal célula. Por causa de certas modificações que podem ocorrer em gerações que se sucedem devido a mutação ou influências ambientais, tal progênie pode, de fato, não ser idêntica à célula de origem, porém são ainda incluídas dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como usado aqui.

[00121] Uma "resposta imune" é uma resposta biológica em um organismo contra agentes estranhos, por exemplo, antígenos, que protegem o organismo contra estes agentes e doenças causadas por eles. Uma resposta immune é mediada pela ação de uma célula do sistema imune (por exemplo, um linfócito T, linfócito B, célula exterminadora natural (NK), macrófago, eosinófilo, mastócito, célula dendrítica ou neutrófilo) e macromoléculas solúveis produzidas por qualquer uma destas células ou fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resultam no alvejamento seletivo, ligação a, dano a, destruição de, e/ou eliminação do corpo do organismo de invadir patógenos, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas ou outras anormais, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, tecidos ou células normais, incluindo, por exemplo, tecidos ou células humanos. Uma reação immune inclui, por exemplo, a ativação ou inibição de uma célula T, por exemplo, uma célula T efetora ou uma célula T auxiliar (Th), tal como uma célula CD4+ ou CD8+ T, ou a inibição ou depleção de uma célula Treg. As células "Efetoras T" ("Teff") são células T (por exemplo, células CD4+ e CD8+ T) com atividades citolíticas. As células T auxiliares (Th) secretam citocinas e ativam e direcionam outras células imunes, porém não incluem células T reguladoras (células Treg). As células T reguladoras ("Treg") são uma subpopulação de células T que modulam o sistema immune, mantêm a tolerância de auto-antígenos, e previnem doença autoimune. As células B de memória são um subtipo de célula B que são formados dentro de centros germinais após a infecção primária e são importantes em gerar uma resposta imune mediada por anticorpo acelerada e mais robusta no caso de re-infecção (também conhecido como uma resposta imune secundária). As células NK são um tipo de linfócito citotóxico crítico ao sistema imune inato. As células NK desempenham um papel análogo àquele das células T citotóxicas na resposta imune adaptativa vertebrada. As células NK fornecem rápidas respostas às células infectadas por vírus e respondem à formação de tumor.

[00122] Como usado aqui, o termo "resposta mediada por célula T" refere-se à resposta mediada por células T, por exemplo, células T efetoras (por exemplo, células CD8+) e células T auxiliares (por exemplo, células CD4+). As respostas mediadas por célula T incluem, por exemplo, a proliferação e citotoxicidade de célula T.

[00123] Como usado aqui, o termo "resposta de linfócito T citotóxica (CTL)" refere-se a uma resposta imune induzida por células T citotóxicas. As respostas de CTL são mediadas por, por exemplo, células CD8+ T.

[00124] Um "imunomodulador" ou "imunorregulador" refere-se a um agente, por exemplo, um componente de uma trilha de sinalização que pode ser envolvido na modulação, regulação ou modificação de uma resposta imune. "Modulação," "regulação," ou "modificação" de uma resposta imune refere-se a qualquer alteração em uma célula do sistema imune ou na atividade de tal célula (por exemplo, uma célula T efetora, tal como uma célula Th1). Tal modulação inclui a estimulação ou supressão do sistema imunológico, que pode ser manifestado por um aumento ou diminuição no número de vários tipos de célula, um aumento ou diminuição na atividade destas células, e/ou quaisquer outras mudanças que possam ocorrer dentro do sistema imune. Ambos os imunomoduladores inibitórios e estimulantes foram identificados, alguns dos quais pode ter função realçada em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, o imunomodulador está localizado na superfície de uma célula T. Um "alvo imunomodulador" ou "alvo imunorregulador" é um imunomodulador que é alvejado para ligação por, e cuja atividade é alterada pela ligação de, uma substância, agente, porção, composto ou molécula. Os alvos imunomoduladores incluem, por exemplo, receptores sobre a superfície de uma célula ("receptores imunomoduladores") e ligantes receptores ("ligantes imunomoduladores").

[00125] "Imunoterapia" refere-se ao tratamento de um indivíduo afligido com ou em risco de contrair ou sofre uma recorrência de uma doença por um método compreendendo induzir, realçar, suprimir ou de outra forma modificar uma resposta imune.

[00126] "Terapia Imunoestimulante" ou "terapia imunoestimuladora" refere-se a uma terapia que resulta em aumentar (induzir ou realçar) uma resposta imune em um indivíduo para, por exemplo, tratar câncer.

[00127] "Potencializar uma resposta imunológica endógena" significa a eficácia ou potência de existir uma resposta imune em um indivíduo. Este aumento em eficácia e potência pode ser obtido, por exemplo, superando-se os mecanismos que suprimem a resposta imune de hospedeiro endógeno ou estimulando-se os mecanismos que realçam a resposta imune de hospedeiro endógeno.

[00128] Como usado aqui, o termo "ligado(a)" refere-se à associação de duas ou mais moléculas. A ligação pode ser covalente ou não covalente. A ligação também pode ser genética (isto é, recombinantemente fundida). Tais ligações podem ser obtidas empregando-se uma ampla variedade de técnicas reconhecidas na técnica, tais como conjugação química e produção de proteína recombinante.

[00129] Como usado aqui, "administrar" refere-se à introdução física de uma composição compreendendo um agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo anti-ICOS, a um indivíduo, empregando-se qualquer um dos vários métodos de sistema de liberação conhecidos por aqueles versados na técnica. "Administrar" inclui, por exemplo, a administração a um paciente humano por outro, tal como, por exemplo, um ou mais provedores de saúde, e autoadministração pelo paciente humano. Várias vias de administração para os anticorpos descritos aqui incluem intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parenteral" como empregada aqui significa métodos de administração diferentes de administração enteral e tópica, tal como por injeção e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal e infusão, bem como eletroporação in vivo. Alternativamente, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado por meio de uma via não parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucosal de administração, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente. A administração também pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes, e/ou durante um ou mais períodos estendidos.

[00130] Como usado aqui, administração "adjunta" ou "combinada" (coadministração) inclui administração simultânea dos compostos na mesma ou diferente forma de dosagem, ou administração separada dos compostos (por exemplo, administração sequencial). Desse modo, um primeiro anticorpo, por exemplo, o anticorpo anti-ICOS, e um segundo, terceiro, ou mais anticorpos podem ser simultaneamente administrados em uma única formulação. Alternativamente, o primeiro e segundo (ou mais) anticorpos podem ser formulados para administração separada e são administrados concorrentemente ou sequencialmente. Terapia de "combinação", como usado aqui, significa a administração de dois ou mais agentes terapêuticos em uma forma coordenada, e inclui, porém não é limitado a, dois ou mais agentes terapêuticos em uma dosagem coordenada, e inclui, porém não é limitado a, dosagem concorrente. Especificamente, a terapia de combinação abrange igualmente a coadministração (por exemplo, administração de uma coformulação ou administração simultânea de composições terapêuticas separadas) e a administração serial ou sequencial, contanto que a administração de um agente terapêutico seja condicionada de alguma forma na administração de outro agente terapêutico. Por exemplo, um agente terapêutico pode ser administrado apenas após um diferente agente terapêutico ter sido administrado e deixado agir durante um período de tempo prescrito. (Ver, por exemplo, Kohrt e outro(s) (2011) Blood 117:2423).

[00131] Por exemplo, o anticorpo anti-ICOS pode ser administrado primeiro, seguido pela (por exemplo, imediatamente seguido por) administração de um segundo anticorpo, ou vice versa. Em uma modalidade, o anticorpo anti-ICOS é administrado antes da administração do segundo anticorpo. Em outra modalidade, o anticorpo anti-ICOS é administrado, por exemplo, dentro de cerca de 30 minutos do segundo anticorpo. Tal administração concorrente ou sequencial resulta em ambos anticorpos sendo simultaneamente presentes em pacientes tratados.

[00132] Como usado aqui, os termos "inibe" ou "bloqueia" são usados alternadamente e abrangem igualmente inibição/bloqueio parcial e completo por pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%, como determinado, por exemplo, pelos métodos descritos aqui.

[00133] Como usado aqui, "câncer" refere-se a um amplo grupo de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais no corpo. A divisão ou crescimento de célula desregulado pode resultar na formação de tumores malignos ou células que invadem os tecidos vizinhos e podem metastatizar as partes distantes do corpo através do sistema linfático ou corrente sanguínea.

[00134] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", como usados aqui, referem-se a qualquer tipo de intervenção ou processo realizado no, ou administrando um agente ativo ao indivíduo, com o objetivo de reverter, aliviar, melhorar, inibir ou abrandar ou prevenir a progressão, desenvolvimento, severidade ou recorrência de um sintoma, complicação, condição ou indícios bioquímicos associados com uma doença. Ao contrário, "profilaxia" ou "prevenção" refere-se à administração a um indivíduo que não possui uma doença para prevenir a doença de ocorrer. "Tratar", "tratando" e "tratamento" não abrangem profilaxia ou prevenção.

[00135] O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para obter ou pelo menos parcialmente obter um efeito desejado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dosagem terapeuticamente eficaz" de um fármaco ou agente terapêutico é qualquer quantidade do fármaco que, quando usado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, promove a regressão da doença evidenciada por uma diminuição na severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livre de sintoma da doença, ou uma prevenção do comprometimento ou incapacidade devido à aflição da doença. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" ou uma "dosagem profilaticamente eficaz" de um fármaco é uma quantidade do fármaco que, quando administrado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença ou sofrendo uma recorrência da doença, previne o desenvolvimento ou recorrência da doença. A capacidade de um agente terapêutico promover a regressão da doença ou de um agente profilático prevenir o desenvolvimento ou recorrência da doença pode ser avaliada empregando-se uma variedade de métodos conhecidos pelo praticante versado, tal como em indivíduos humanos durante experimentos clínicos, em sistemas de modelo animal preditivos de eficácia em humanos, ou ensaiando-se a atividade do agente em ensaios in vitro.

[00136] A administração das quantidades eficazes do anticorpo anti- ICOS sozinho, ou anticorpo anti-ICOS combinado com anticorpo anti- PD-1, combinado com anticorpo anti-PD-L1, ou combinado com anticorpo anti-CTLA-4, de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos aqui, pode resultar em pelo menos um efeito terapêutico, incluindo, por exemplo, tamanho ou crescimento de tumor reduzido, número reduzido de lesões metastáticas aparecendo ao longo do tempo, remissão completa, remissão parcial, ou doença estável. Por exemplo, os métodos de tratamento produzem uma taxa de benefício clínico comparável (CBR = remissão completa (CR) + remissão parcial (PR) + doença estável (SD) persistente ≥ 6 meses) melhor do que aquela alcançada sem a administração do anticorpo anti-ICOS, ou do que aquela obtida com a administração de qualquer um dos anticorpos combinados, por exemplo, a melhora da taxa de benefício clínico é de cerca de 20% 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais.

[00137] Como forma de exemplo, um agente anticâncer é um fármaco que diminui a progressão do câncer ou promove a regressão do câncer em um indivíduo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco promove a regressão do câncer ao ponto de eliminar o câncer. "Promover a regressão do câncer" significa que a administração de uma quantidade eficaz do fármaco, sozinho ou em combinação com um agente antineoplásico, resulta em uma redução no tamanho ou desenvolvimento do tumor, necrose do tumor, uma diminuição na severidade de pelo menos um sintoma da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livre do sintoma da doença, uma prevenção do comprometimento ou incapacidade devido à aflição da doença, ou de outra forma a melhora dos sintomas da doença no paciente. "Eficácia farmacológica," "efetividade," ou "eficácia" refere-se a capacidade do fármaco em promover a regressão do câncer no paciente. "Segurança fisiológica" refere-se a um nível aceitavelmente baixo de toxicidade ou outros efeitos fisiológicos adversos no nível celular, órgão e/ou organismo (efeitos adversos) resultante da administração do fármaco.

[00138] Como forma de exemplo, para o tratamento de tumores, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dosagem do fármaco inibe o crescimento da célula de tumor por pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30% pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos acima de 70%, pelo menos cerca de 80% em relação aos indivíduos não tratados, ou por pelo menos cerca de 90%. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dosagem do fármaco que completamente inibe o crescimento da célula ou crescimento do tumor, isto é, inibe o crescimento da célula ou o crescimento do tumor em 100%. A capacidade de um composto, incluindo um anticorpo, inibir o crescimento do tumor pode ser avaliada empregando-se os ensaios descritos aqui. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade do composto inibir o crescimento da célula; tal inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos pelo praticante versado. Em algumas modalidades, a inibição do crescimento de tumor pode não ser imediata após o tratamento, e pode apenas ocorrer após um período de tempo ou após a administração repetida. Em outras modalidades descritas aqui, a regressão do tumor é observada e continua durante pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 40 dias, pelo menos cerca de 50 dias, ou pelo menos cerca de 60 dias, ou mais.

[00139] Como usado aqui, os termos "dose fixa", "dose plana" e "dose fixa plana" são usados alternadamente e referem-se a uma dose que é administrada a um paciente sem levar em conta o peso ou a área da superfície corporal do paciente. A dose plana ou fixa não é, portanto, fornecida como uma dose mg/kg, porém como uma quantidade absoluta do agente terapêutico.

[00140] Como usado aqui, o termo dose ou dosagem "com base no peso" significa que uma dose administrada a um paciente é calculada com base no peso do paciente. Por exemplo, quando um paciente de 60 kg requer 3 mg/kg de um anticorpo anti-ICOS, alguém pode calcular e usar a quantidade apropriada do anticorpo anti-ICOS (isto é, 180 mg) para administração.

[00141] O termo "paciente" inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento terapêutico ou profilático.

[00142] O termo "indivíduo" inclui qualquer humano ou animal não humano. Por exemplo, os métodos e composições descritos aqui podem ser usados para tratar um indivíduo tendo câncer. Um animal não humano inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, incluindo primatas não humanos, ovelhas, cachorros, vacas,

galinhas, anfíbios, répteis, etc. Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano.

[00143] Como usado aqui, o termo entidade "um" ou "uma" refere-se a uma ou mais daquelas entidades a não ser que de outra forma especificado; por exemplo, "uma sequência de nucleotídeo," é entendido representar uma ou mais sequências de nucleotídeo. Como tal, os termos "um" ou "uma", "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados alternadamente aqui.

[00144] Como usado aqui, "e/ou" deve ser tomado como descrição específica de cada um dos dois componentes ou características especificados com ou sem o outro. Desse modo, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A e/ou B" inclui "A e B," "A ou B," "A" apenas, e "B" apenas. Também, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A, B, e/ou C" abrange cada um a seguir: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A apenas; B apenas; e C apenas.

[00145] É entendido que onde quer que os aspectos são descritos aqui com a linguagem "compreendendo," outros aspectos análogos descritos em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente de" são também fornecidos.

[00146] Unidades, prefixos, e símbolos são denotados em sua forma aceitável no Sistema Internacional de Unidades (SI). As variações numéricas são inclusive dos números definindo a faixa. A não ser que de outra forma indicado, as sequências de nucleotídeo são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'. As sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi.

[00147] Como usado aqui, o termo "cerca de" significa aproximadamente, mais ou menos, por volta de, ou na região de. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunto com uma faixa numérica, ele modifica aquela faixa estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos apresentados. Em geral, o termo "cerca de" pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor estabelecido por uma variância de, por exemplo, 10 por cento, acima ou abaixo (maior ou menor).

[00148] Os títulos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos da descrição, devem ser lidos por referência à especificação como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação em sua totalidade. Vários aspectos descritos aqui são descritos em mais detalhes nas subseções a seguir. Anticorpos Anti-ICOS

[00149] A presente invenção descreve, em algumas modalidades, anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, com funções ou propriedades desejáveis. São aqui descritos os anticorpos ICOS agonísticos anti-humanos (anti-huICOS) com propriedades desejáveis para utilização como agentes terapêuticos no tratamento de doenças tais como cânceres. Estas propriedades incluem uma ou mais da capacidade de se ligar a ICOS humanos com alta afinidade, imunogenicidade aceitavelmente baixa em sujeitos humanos, a capacidade de se ligar preferencialmente a FcγRIIb (um tipo específico de receptor Fc de IgG) e a ausência de passivos de sequência que reduzem a estabilidade química do anticorpo. Os anticorpos da invenção são também úteis, por exemplo, para diagnóstico de câncer e outros distúrbios associados com expressão e/ou atividade de ICOS.

[00150] Os anticorpos anti-ICOS aqui descritos pela sequência de aminoácido ligam-se a epítopos específicos em ICOS humanos, como descrito nos Exemplos. Anticorpos Anti-huICOS com Propriedades Funcionais Específicas

[00151] Os anticorpos da invenção são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares. Por exemplo, os anticorpos se ligam especificamente a ICOS humano com alta afinidade. Em algumas modalidades, os anticorpos ligam-se especificamente ao local em ICOS ao qual ICOS-L se liga. A ligação a ICOS humano pode ser avaliada usando uma ou mais técnicas bem estabelecidas na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo pode ser testado por um ensaio de citometria de fluxo em que o anticorpo é reagido com uma linhagem celular que expressa ICOS humanos, tais como células CHO que foram transfectadas para expressar ICOS humano na sua superfície celular. Adicionalmente ou alternativamente, a ligação do anticorpo, incluindo os cinéticos de ligação (por exemplo, valor de KD) pode ser testada em ensaios de ligação Biacore. Ainda outros ensaios de ligação adequados incluem ensaios ELISA utilizando, por exemplo, uma proteína ICOS humano recombinante.

[00152] Em uma modalidade, o anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, da invenção se liga a uma proteína ICOS com uma K D de 5 x 10-8 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 2 x 10-8 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 5 x 10-9 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 4 x 10-9 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 3 x 10-9 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 2 x 10-9 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 1 x 10-9 M ou inferior, liga-se a uma proteína ICOS com um KD de 5 x 10-10 M ou inferior, ou liga-se a uma proteína ICOS com uma KD de 1 x 10-10 M ou inferior.

[00153] Em outra modalidade, o anticorpo liga um ou mais resíduos de SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano. Em outra modalidade, o anticorpo liga-se a um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano. Em outra modalidade, a porção de ligação ao antígeno do anticorpo liga-se a um epítopo que compreende os resíduos de aminoácido SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano.

[00154] Em outra modalidade, o anticorpo liga-se a ICOS humano e estimula uma resposta imune, por exemplo, uma resposta de célula T específica de antígeno. A capacidade do anticorpo para estimular uma resposta imune pode ser testada medindo o crescimento do tumor, tal como em um modelo de enxerto de tumor in vivo (ver, por exemplo, Exemplos 6, 7 8 e 9).

[00155] Em outra modalidade, o anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, liga-se a ICOS humano e exibe pelo menos uma das seguintes propriedades: ligação a um ou mais resíduos dentro de SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano; ligação ao mesmo epítopo em ICOS humano como o anticorpo ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 ou 2644; competir pela ligação a ICOS humano com o anticorpo ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 ou 2644; reduzir a atividade de ADCC em comparação com um anticorpo de controle de IgG1; aumentar a especificidade para ligação ao receptor FcγRIIb; bloquear a ligação de um ligante de ICOS (ICOS-L) a ICOS humano; bloquear a interação de ICOS humano e ICOS-L humano; ligação a ICOS humano, de cinomolgo, camundongo e rato; ligação a células T humanas e de cinomolgos ativadas; ligação a células T humanas com um EC50 de cerca de 0,7 nM e células T de cinomolgos com um EC50 de cerca de 0,3 nM; nenhuma ligação ao CD28 humano ou CTLA-4 humano; ativação de pelo menos um linfócito T primário, tal como uma célula Teff CD4+, uma célula Tfh e uma célula Treg;

induz a proliferação e produção de interferon-gama (IFN-y) em células T CD25-CD4+ com um EC50 de cerca de 0,01 a cerca de 0,16 nM em um ensaio de cocultura CHO-OKT3-CD32A in vitro; indução de proteína cinase B (pAkt) em um ensaio de sinalização de células T primárias in vitro com um EC50 de cerca de 30 nM; induz a produção de IFN-γ em células T CD25-CD4+ com um EC50 de cerca de 0,002 a cerca de 0,4 nM em uma enterotoxina B estafilocócica em um ensaio de cocultura de células T CD25 + CD4 + e células B. induzir a produção de interleucina 10 (IL-10) em resposta à enterotoxina B estafilocócica em um ensaio de cocultura de células B naïve e Tfh; induzir um maior aumento da proliferação de Teffs estimuladas por CD3 em comparação com Tregs CD45RA+ e Tregs CD45RO+ em um ensaio in vitro; aumento da proliferação em Teffs em comparação com Tregs CD45RA+ (por exemplo, em que o aumento da proliferação é maior em Tregs CD45RA+ em comparação com Tregs CD45RO+); reduzir a supressão de Teff por Tregs; em que cerca de 10 μg/mL do anticorpo não aumenta a produção de citocinas em um ensaio de células sanguíneas completas; aumento da secreção de pelo menos um de IL-10 e IFN-g por células Tfh in vitro; e/ou estimular a sinalização mediada por ICOS.

[00156] Em outra modalidade, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga a ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) a ICOS humano e induz proliferação e produção de interferon-gama (IFN-y) em células T CD25-

CD4+ com um EC50 de cerca de 0,083 nM em um ensaio de cocultura CHO-OKT3-CD32A in vitro. Em outra modalidade, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga a ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) a ICOS humano e induz proliferação e produção de interferon-gama (IFN-) em células T CD25-CD4 + com um EC50 de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 nM em um ensaio de cocultura de CHO-OKT3-CD32A in vitro.

[00157] Em um aspecto, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga a ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) a ICOS humano e induz produção de IFN- em células T CD25-CD4 + com um EC50 de cerca de 0,2 nM em uma enterotoxina B estafilocócica em um ensaio de cocultura de células T CD25-CD4+ e células B. Em outro aspecto, o anticorpo isolado é um anticorpo isolado humanizado (ou porção de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga a ICOS humano e bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS (por exemplo, ICOS-L humano) a ICOS humano e induz produção de IFN-γ em células T CD25-CD4 + com um EC50 de cerca de 0,01-0,1 nM em uma enterotoxina B estafilocócica em um ensaio de cocultura de células T CD25-CD4 + e células B.

[00158] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção incluem anticorpos monoclonais humanizados e totalmente humanos. Em outras modalidades, os anticorpos são, por exemplo, anticorpos monoclonais quiméricos. Anticorpos Monoclonais S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644

[00159] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são os anticorpos monoclonais humanizados e humanos S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644, que são isolados e estruturalmente caracterizados como descrito nos Exemplos seguintes. As sequências de aminoácido VH de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 e as sequências de aminoácido VL de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são apresentadas na Tabela 35

[00160] Dado que cada um destes anticorpos pode ligar-se a ICOS humano, as sequências VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti-huICOS da invenção. Em algumas modalidades, quando as cadeias VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência VH de um emparelhamento VH/VL particular é substituída por uma sequência VH estruturalmente semelhante. Do mesmo modo, em algumas modalidades, uma sequência VL de um emparelhamento VH/VL particular é substituída por uma sequência VL estruturalmente semelhante.

[00161] Por conseguinte, em um aspecto, esta invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID Nºs: 5, 16, 24, 32, 40 ou 186; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido em SEQ ID Nºs: 6, 17, 25, 33, 41, 48 ou 189; em que o anticorpo se liga especificamente a ICOS humano.

[00162] Em algumas modalidades, as combinações de região variável de cadeia leve e pesada incluem: uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 5 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 6; uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 16 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 17; uma região variável de cadeia pesada, que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 24 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 25; uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 32 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 33; uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 40 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 41; uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 40 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 48; ou uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº: 186 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID Nº:

189.

[00163] Em outro aspecto, esta invenção fornece anticorpos que compreendem as CDR1s, CDR2s e CDR3 de cadeia pesada e cadeia leve de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644, ou combinações das mesmas. As sequências de aminoácido das CDR1s de VH de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são mostradas nas SEQ ID Nºs: 9, 18, 26, 34, 42 e 191, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR2s de VH de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são mostradas nas SEQ ID Nºs:

10, 19, 27, 35, 43 e 192, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR3s de VH de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são mostradas nas SEQ ID Nºs: 11, 20, 28, 36, 44 e 193, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR1s de VL de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são mostradas nas SEQ ID Nºs: 12, 21, 29, 37, 49 e 194, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR2s de VL de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são mostradas nas SEQ ID Nºs: 14, 22, 30, 38, 50 e 195, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR3s de VL de S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644 são mostradas nas SEQ ID Nºs: 15, 23, 31, 39, 51 e 196, respectivamente. As regiões de CDR são delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat et al., 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No 91-3242).

[00164] Dado que cada um destes anticorpos pode ligar-se a ICOS humano e que a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida principalmente pelas regiões CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de VL podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de diferentes anticorpos podem ser misturados e combinados, embora cada anticorpo deva conter uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VL) para criar outras moléculas de ligação anti-huICOS da invenção. A ligação de ICOS de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação aqui descritos, incluindo nos Exemplos (por exemplo, ELISAs, análise Biacore®). Em algumas modalidades, quando as sequências CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VH particular é substituída por uma(s) sequência(s) de CDR estruturalmente semelhante. Do mesmo modo,

em algumas modalidades, quando as sequências CDR de VL são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VL particular é preferivelmente substituída por uma(s) sequência(s) CDR estruturalmente semelhante. Será prontamente evidente ao técnico versado que podem ser criadas novas sequências de VH e VL substituindo uma ou mais sequências da região CDR de V H e/ou VL por sequências estruturalmente semelhantes das sequências CDR aqui descritas aqui para os anticorpos monoclonais S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7 e 2644.

[00165] Por conseguinte, em outro aspecto, esta invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo: uma região variável da cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nºs: 9, 18, 26, 34, 42 ou 191; uma região variável da cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nºs: 10, 19, 27, 35, 43 ou 192; uma região variável da cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nºs: 11, 20, 28, 36, 44 ou 193; uma região variável da cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nºs: 12, 21, 29, 37, 49 ou 194; e) uma região variável da cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nºs: 14, 22, 30, 38, 50 ou 195; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nºs: 15, 23, 31, 39, 51 ou 196;

em que o anticorpo se liga especificamente a ICOS humano.

[00166] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 9; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID Nº: 10; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID Nº: 11; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 12; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID Nº: 14; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID Nº: 15.

[00167] Em outra modalidade, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID Nº: 18; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID Nº: 19; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID Nº: 20; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 21; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID Nº: 22; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID Nº: 23.

[00168] Em outra modalidade, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 26;

uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID Nº: 27; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID Nº: 28; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 29; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID Nº: 30; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID Nº: 31.

[00169] Em outra modalidade, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID Nº: 34; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID Nº: 35; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID Nº: 36; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 37; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID Nº: 38; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID Nº: 39.

[00170] Em outra modalidade, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID Nº: 42; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID Nº: 43; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID Nº: 44;

uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 49; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID Nº: 50; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID Nº: 51.

[00171] Em outra modalidade, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID Nº: 191; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID Nº: 192; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID Nº: 193; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo a SEQ ID Nº: 194; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo a SEQ ID Nº: 195; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo a SEQ ID Nº: 196.

[00172] É bem conhecido na técnica que o domínio CDR3, independentemente do(s) domínio(s) de CDR1 e/ou CDR2, sozinho pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que múltiplos anticorpos podem ser gerados previsivelmente tendo a mesma especificidade de ligação baseada em uma sequência comum de CDR3. (Ver, por exemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83 (2): 252-260 (2000). Por conseguinte, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo derivado de um animal humano ou não humano, em que o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente a ICOS humano. Em certos aspectos, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínio de CDR3 de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo não humano, tal como um anticorpo de camundongo ou rato, em que o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente a ICOS humano. Em algumas modalidades, tais anticorpos inventivos compreendendo um ou mais domínio CDR3 de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo não humano (a) são capazes de competir para ligação com; (b) reter as características funcionais; (c) ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação semelhante à do anticorpo não humano parental correspondente.

[00173] Em outros aspectos, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não humano, em que o anticorpo humano é capaz de especificamente ligar-se ao ICOS humano. Em outros aspectos, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia leve e/ou pesada de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não humano, em que o primeiro anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente a ICOS humano e em que o domínio CDR3 do primeiro anticorpo humano substitui um domínio CDR3 em um anticorpo humano que não tem especificidade de ligação para ICOS para gerar um segundo anticorpo humano que seja capaz de se ligar especificamente a ICOS humano. Em modalidades, tais anticorpos inventivos compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia leve e/ou pesada do primeiro anticorpo humano (a) são capazes de competir para ligação com; (b) reter as características funcionais; (c) ligar-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação semelhante à do anticorpo não humano parental correspondente.

[00174] A presente invenção também fornece anticorpos anti- huICOS compreendendo as novas sequências de domínio variável aqui descridas e domínios constantes com regiões Fc modificadas tendo afinidade aumentada para FcRIIb em comparação com a sua afinidade para outros receptores Fc. Em algumas modalidades, tais anticorpos anti-huICOS agonísticos com especificidade de FcRIIb aumentada exibem eficácia superior no tratamento de câncer. Em outras modalidades, tais anticorpos anti-huICOS agonísticos com especificidade de FcRIIb melhorada exibem eficácia superior no tratamento de vários distúrbios, por exemplo, câncer. Sem pretender ser limitado pela teoria mecanicista, tais anticorpos monoclonais anti-ICOS agonistas específicos de FcRIIb podem exibir efeitos adjuvantes realçados, aumentando a maturação de células dendríticas, promovendo assim a expansão e ativação de células T CD8+ citotóxicas, o que leva a uma maior resposta antitumoral. Sem pretender ser limitado pela teoria, o aumento do sinal mediado por FcR de anticorpos ICOS agonistas devido ao aumento do agrupamento de receptores, ou "reticulação" da presente invenção, pode ser um dos principais contribuintes para a eficácia terapêutica. A reticulação de anticorpos agonistas de ICOS pelo envolvimento de FcR pela porção Fc do anticorpo pode aumentar a intensidade do sinal e, desse modo, aumentar a ativação celular.

[00175] A afinidade de ligação relativa dos anticorpos para ativar os receptores Fc (A) versus (I) inibitórios pode ser expressa como a relação "A/I" e é tipicamente uma função da estrutura da região Fc de um anticorpo IgG. Veja WO 2012/087928. Anticorpos possuindo especificidade aumentada para ligação ao receptor inibitório FcγRIIb têm menores relações A/I. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- huICOS agonísticos aqui descritos têm relações A/I menores do que 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05, 0,03 ou 0,01.

[00176] Exemplos de domínios constantes de IgG1 humano compreendendo mutações para aumentar a especificidade de FcγRIIb são aqui descritos e são também fornecidos na Listagem de Sequência.

Variantes de sequência são definidas com referência à sequência de domínio constante de IgGlf humano fornecida na SEQ ID Nº: 52 e mostrada na Figura 2. A nomenclatura relativa a posições (numeração) de mutações na região Fc é de acordo com o índice EU como em Kabat et al., 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), que facilita a comparação de sequências Fc em posições equivalentes em anticorpos com diferentes comprimentos de domínios variáveis.

Veja também Edelman et al. (1969) Proc.

Nat'l Acad.

Sci. (EUA) 63:78; WO 2012/130831 (usando o mesmo sistema de numeração). A Tabela 3 fornece um sumário das variantes de sequência Fc a partir do qual alguém versado na técnica poderia facilmente reconhecer as posições correspondentes nas sequências de anticorpo aqui descritas.

As variantes SE e SELF são descritas em Chu et al. (2008) Mol.

Immunol. 45:3926. As variantes P238D, V4, V7, V8, V9, V11 e V12 são descritas em Mimoto et al. (2013) Protein Engineering Design & Selection 26:589 (por exemplo, na Tabela 1 aqui). Tabela 3 - Variantes de Sequência Fc Designação SEQ ID: Variantes de Sequência IgG1f 52 SE 53 S267E SELF 54 S267E L328F P238D 55 P238D V4 56 P238D P271G V4 - D270E 57 P238D P271G D270E V7 58 E233D P238D P271G A330R V8 59 G237D P238D H268D P271G V9 60 G237D P238D P271G A330R V9 - D270E 61 G237D P238D P271G A330R D270E V11 62 G237D P238D H268D P271G A330R V12 63 E233D G237D P238D H268D P271G A330R

[00177] Variantes de Sequência Fc Adicionais com maior afinidade para FcγRIIb são descritos em Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723 (e WO 2014/184545), incluindo V262E e V264E, por exemplo, para uso em combinação com S267E e L328F. Anticorpos com Modificações Conservadoras

[00178] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2, e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2, e CDR3, em que uma ou mais dessas sequências CDR compreendem Sequências de Aminoácidos baseadas nos anticorpos descritos aqui (por exemplo, S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e 2644), ou modificações conservativas das mesmas, e em que os anticorpos retém as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-huICOS da invenção. É entendido na técnica que podem ser feitas certas modificações de sequência conservadora que não removem ligação ao antígeno. (Ver, por exemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180- 8). Consequentemente, esta descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2, e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que: (a) A região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR3 compreendendo uma Sequência de Aminoácido mencionada na SEQ ID Nºs: 11, 20, 28, 36, 44 ou 193, ou modificações conservadoras dos mesmos; (b) a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência CDR3 compreendendo uma Sequência de Aminoácido mencionado na SEQ ID Nºs: 15, 23, 31, 39, 51, ou 196, ou modificações conservadoras dos mesmos; e

(c) o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente ao ICOS humano.

[00179] Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode possuir uma ou mais das propriedades funcionais aqui descritas, tais como alta afinidade de ligação a ICOS humana, e/ou a capacidade de estimular respostas de células T específicas para antígeno.

[00180] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR2 compreendendo uma Sequência de Aminoácido mencionada na SEQ ID Nºs: 10, 19, 27, 35, 43, ou 192, ou modificações conservadoras dos mesmos; e a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência CDR2 compreendendo uma Sequência de Aminoácido mencionado na SEQ ID Nºs: 14, 22, 30, 38, 50, ou 195, ou modificações conservadoras dos mesmos. Em outra modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 compreendendo uma Sequência de Aminoácido mencionado na SEQ ID Nºs: 9, 18, 26, 34, 42, ou 191, ou modificações conservadoras dos mesmos; e a região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência CDR1 compreendendo uma Sequência de Aminoácido mencionado na SEQ ID Nºs: 12, 21, 29, 37, 49, ou 194, ou modificações conservadoras dos mesmos.

[00181] Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos. Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os Anticorpos Anti-huICOS

[00182] Em outra modalidade, esta descrição fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em ICOS humano como qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-huICOS da invenção (isto é, anticorpos que possuem a capacidade de competir de modo cruzado pela ligação a ICOS humano com qualquer um dos anticorpos monoclonais da invenção). Em algumas modalidades, o anticorpo de referência para estudos de competição de modo cruzado são os anticorpos monoclonais S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e

2644.

[00183] Tais anticorpos de competição de modo cruzado podem ser identificados com base em sua capacidade de competir de modo cruzado com S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e/ou 2644 em ensaios de ligação de ICOS humano padrão. Por exemplo, ensaios de ELISA padrão podem ser utilizados nos quais uma proteína ICOS humana recombinante é imobilizada na placa, um dos anticorpos é fluorescentemente marcado, e a capacidade de anticorpos não marcados para competir com a ligação do anticorpo marcado é avaliada. Além disso, ou alternativamente, a análise Biacore pode ser usada para avaliar a capacidade dos anticorpos de competir de modo cruzado. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de, por exemplo, S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e/ou 2644, ao ICOS humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e/ou 2644 para ligar a ICOS humana e assim se ligar ao mesmo epítopo em ICOS humano como S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e/ou

2644. Em uma modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em ICOS humano como S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e/ou 2644 é um anticorpo monoclonal humanizado ou humano.

[00184] Como descrito adicionalmente no Exemplo 16, a ligação de ICOS humano 9D5, S267E de IgG1f de ICOS.33 e 3E8 foi mapeada para resíduos 112 – 123 de ICOS (SEQ ID Nº: 1), ou a Sequência de Aminoácido SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203). Consequentemente, em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-huICOS que se liga a um ou mais resíduos de SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano, por exemplo, conforme determinado por HDX-MS. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-huICOS se liga a um epítopo que compreende os resíduos de aminoácidos SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano.

[00185] Estes anticorpos monoclonais humanizados ou humanos podem ser preparados e isolados como aqui descrito. Por exemplo, os anticorpos anti-huICOS que se ligam aos epítopos iguais ou semelhantes aos anticorpos aqui descritos podem ser criados utilizando protocolos de imunização, por exemplo, aqueles aqui descritos. Os anticorpos resultantes podem ser rastreados quanto à ligação de alta afinidade ao ICOS humano. Os anticorpos selecionados podem então ser estudados, por exemplo, no ensaio de exibição de levedura em que Variantes de Sequência de huICOS são exibidas na superfície de células de levedura, ou por experiências de troca de hidrogênio-deutério, para determinar o epítopo preciso ligado pelo anticorpo.

[00186] Determinações de epítopo podem ser feitas por qualquer método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-huICOS são considerados para se ligar ao mesmo Epítopo como um mAb anti-huICOS aqui descrito se eles fazem contato com um ou mais dos mesmos resíduos dentro de pelo menos uma região de huICOS; se eles fazem contatos com a maioria dos resíduos dentro de pelo menos uma região de huICOS; se eles fazem contatos com a maioria dos resíduos dentro de cada região do huICOS; se eles fazem contato com a maioria dos contatos ao longo de todo o comprimento do huICOS; se eles fazem contatos dentro de todas as mesmas regiões distintas do ICOS humano; se eles fazem contato com todas os resíduos em qualquer região do ICOS humano; ou se eles fazem contato com todos os mesmos resíduos em todas as mesmas regiões. As "regiões" do Epítopo são aglomerados de resíduos ao longo, mas não necessariamente adjacentes, da sequência primária.

[00187] As técnicas para determinação de anticorpos que se ligam ao "mesmo Epítopo em huICOS" com os anticorpos aqui descritos incluem análises de raios X de cristais de antígeno: complexos de anticorpo, que fornecem uma resolução atômica do epítopo. Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno em que a perda de ligação devido a uma modificação de aminoácido dentro da sequência de antígeno indica o componente epítopo. Os métodos também podem basear-se na capacidade de um anticorpo de interesse para isolar por afinidade peptídeos curtos específicos (na forma tridimensional nativa ou na forma desnaturada) a partir de bibliotecas combinadas de peptídeos exibindo fagos ou de uma digestão de protease da proteína alvo. Os peptídeos são então considerados como condutores para a definição do Epítopo correspondente ao anticorpo usado para rastrear a biblioteca de peptídeos. Para o mapeamento de Epítopo, também foram desenvolvidos algoritmos computacionais que mapeiam epítopos descontínuos conformacionais.

[00188] O epítopo ou região compreendendo o Epítopo pode também ser identificado por rastreio da ligação a uma série de peptídeos sobrepostos abrangendo ICOS. Alternativamente, o método de Jespers et al. (1994) Biotechnology 12: 899 pode ser utilizado para guiar a seleção de anticorpos que possuem o mesmo Epítopo e, por conseguinte, propriedades semelhantes aos anticorpos anti-ICOS aqui descritos. Usando a exibição de fago, primeiro, a cadeia pesada do anticorpo anti-ICOS é emparelhada com um repertório de (por exemplo, humano) cadeias leves para selecionar um anticorpo de ligação a ICOS, e então a nova cadeias leves é emparelhada com um repertório de, (por exemplo, humana) cadeias pesadas para selecionar um anticorpo (por exemplo, humano) que se liga a ICOS possuindo o mesmo Epítopo ou região de Epítopo como um anticorpo anti-huICOS aqui descrito.

Alternativamente, as variantes de um anticorpo aqui descrito podem ser obtidas por mutagênese de sequências de cDNA que codificam o cadeias pesadas e leves do anticorpo.

[00189] A mutagênese por varredura de alanina, tal como descrita por Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1081, ou alguma outra forma de mutagênese pontual de resíduos de aminoácidos em ICOS (tal como o método de exibição de levedura fornecido no Exemplo 16) também pode ser utilizada para determinar o Epítopo funcional para um anticorpo anti-ICOS.

[00190] O Epítopo ou região de Epítopo (uma "região de Epítopo" é uma região que compreende o epítopo ou sobreposição com o epítopo) ligada por um anticorpo específico também pode ser determinada por avaliação de ligação do anticorpo a peptídeos compreendendo fragmentos de ICOS. Uma série de peptídeos sobrepostos abrangendo a sequência de ICOS (por exemplo, ICOS humana) pode ser sintetizada e rastreada para ligação, por exemplo, em um ELISA direto, um ELISA competitivo (em que o peptídeo é avaliado quanto à sua capacidade de impedir a ligação de um anticorpo a ICOS ligado a uma cavidade de uma placa de microtítulo) ou a um chip. Tais métodos de rastreio de peptídeos podem não ser capazes de detectar alguns epítopos funcionais descontínuos, isto é, epítopos funcionais que envolvem resíduos de aminoácidos que não são contínuos ao longo da sequência primária da cadeia polipeptídica de ICOS.

[00191] Um epítopo também pode ser identificado por meio de pegadas de proteínas baseadas em MS, como HDX-MS e oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). HDX-MS pode ser conduzido, por exemplo, como descrito em Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95, os métodos dos quais são especificamente incorporados por referência aqui. FPOP pode ser conduzido como descrito, por exemplo, em Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry

16:2057, os métodos dos quais são especificamente incorporados por referência aqui.

[00192] O epítopo ligado a anticorpos anti-ICOS também pode ser determinado por métodos estruturais, como a determinação de estrutura de cristal de raios X (por exemplo, WO 2005/044853), modelagem molecular e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NRM), incluindo a determinação de NRM das taxas de troca de H-D de hidrogênios de amida lábeis em ICOS quando livres e quando ligados em um complexo com um anticorpo (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884).

[00193] A menos que de outra forma indicado, e com referência às reivindicações, o epítopo ligado por um anticorpo é o epítopo conforme determinado pelos métodos HDX-MS. Anticorpos Anti-huICOS Derivados de Anticorpos de Hamster

[00194] São aqui descritos exemplos de anticorpos quiméricos e humanizados que compreendem CDRs e/ou anticorpos de regiões variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve que foram derivadas de sequências de hamster. Os anticorpos quiméricos ou humanizados aqui descritos podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal, por exemplo, camundongo ou hamster, preparado por vários métodos conhecidos na técnica. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir de um hibridoma de interesse e modificado para conter sequências de imunoglobulina humana utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo químico, as regiões variáveis de, por exemplo, um anticorpo de camundongo ou hamster pode ser ligado a regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº. 4816567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº.

5.225.539 de Winter, e Patentes U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.). Anticorpos anti-ICOS que se ligam com alta afinidade

[00195] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-huICOS da presente invenção ligam-se a huICOS com elevada afinidade, como os anticorpos anti-huICOS aqui descritos, tornando-os agentes terapêuticos eficazes. Em várias modalidades, os anticorpos anti- huICOS da presente invenção ligam-se a huICOS com um KD inferior a 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 300 pM ou 100 pM. Em outras modalidades, os anticorpos anti-huICOS da presente invenção ligam-se a huICOS com um KD entre 2 nM e 100 pM. Ensaios padrões para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos contra huICOS incluem ELISA, RIA, Western blot, interferometria de biocamada (BLI) e análise BIACORE® SPR (ver Exemplo 10). Variantes de Sequência de Anticorpo Anti-ICOS

[00196] Variantes de Sequência de anticorpo Anti-ICOS aqui descritos mantêm as propriedades funcionais desejáveis aqui descritas. As regiões CDR são delineadas usando o sistema Kabat (Kabat et al., 1991). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece ainda anticorpos anti-huICOS humanos ou humanizados compreendendo sequências CDR que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticos à sequências CDR dos anticorpos aqui descritos. A presente invenção também fornece anticorpos anti-huICOS compreendendo sequências de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, ou 99% idênticos à sequências de domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos aqui descritos, bem como anticorpos anti-huICOS compreendendo sequências de cadeia leve e/ou pesada de comprimento total que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos aqui descritos. II. Anticorpos Construídos e Modificados Regiões VH e VL

[00197] São também fornecidos anticorpos construídos e modificados que podem ser preparados usando um anticorpo possuindo uma ou mais das sequências VH e/ou VL aqui descritas como material de partida para manipular um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas desde o anticorpo de partida. Em algumas modalidades, um anticorpo como aqui descrito foi construído através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo como aqui descrito foi construído através da modificação de resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

[00198] Em uma modalidade, a engenharia da região variável inclui enxerto de CDR. Tal enxerto é de uso particular na humanização de anticorpos anti-ICOS não humanos, por exemplo, anticorpos anti- huICOS que competem pela ligação com os anticorpos anti-huICOS aqui descritos e/ou se ligam ao mesmo Epítopo que os anticorpos anti- huICOS selecionados descritos aqui. Os anticorpos interagem com os antígenos alvo predominantemente através dos resíduos de aminoácidos que estão localizados nas CDRs de cadeias pesadas e leves. As CDRs são hipervariáveis em sequência e/ou formam loops estruturalmente definidos ("loops hipervariáveis"). Os vetores de expressão podem ser construídos de modo que eles incluam sequências de CDR de um anticorpo de referência específico (também denominado "parental")

enxertado em sequências estruturais de um anticorpo diferente (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Ver U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. Nº. 5.225.539 de Winter e Patente U.S. Nºs. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.). Em alguns casos, o anticorpo recombinante resultante tem propriedades que são semelhantes ao anticorpo parental. O anticorpo construído pode então ser modificado para adquirir propriedades que são distintas do anticorpo parental. Em outros casos, enxertar as sequências de CDR parentais em uma estrutura anula certas características do anticorpo parental, de tal modo que o anticorpo recombinante já não tem estas características. Uma característica exemplificativa é a afinidade de ligação em relação a um antígeno. Em tais casos, pode ser vantajoso modificar ainda mais o anticorpo construído para recuperar as características desejadas do anticorpo parental.

[00199] Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos de linhagem germinativa. Por exemplo, as sequências de DNA da linhagem germinativa para genes de região variável de cadeia leve e pesada humanos podem ser encontradas no banco de dados de sequências de linhagem germinativa humana "VBase", bem como em Kabat, E. A., et al., 1991); Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage," Eur. J. Immunol. 24:827-836; o conteúdo de cada um deles é expressamente incorporado aqui por referência.

[00200] Em algumas modalidades, sequências estruturais para usar nos anticorpos aqui descritos são aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências estruturais utilizadas pelos anticorpos aqui descritos. As sequências de CDR1, 2 e 3 de VH e as sequências de CDR1, 2 e 3 de VL podem ser enxertadas em regiões estruturais que possuam a sequência idêntica à encontrada no gene da imunoglobulina da linhagem germinal a partir da qual deriva a sequência estrutural ou as sequências CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contêm até 20 substituições de aminoácidos, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos, em comparação com as sequências da linhagem germinativa. Por exemplo, verificou-se que em certos casos, é benéfico mutar os resíduos dentro das regiões estruturais para manter ou aumentar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo (ver, por exemplo, Patente U.S. Nºs. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 e

6.180.370 de Queen et al).

[00201] Os anticorpos construídos aqui descritos incluem aqueles em que foram feitas modificações aos resíduos estruturais dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo, tal como diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é para "reverter mutação" um ou mais resíduos de estrutura para a sequência da linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos estruturais que diferem da sequência da linhagem germinal a partir da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados por comparação das sequências estruturais do anticorpo com as sequências da linhagem germinal a partir das quais o anticorpo derivado. Para retornar às sequências da região estrutural para a sua configuração da linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "novamente mutadas" para a sequência da linhagem germinal, por exemplo, por mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR. Esses anticorpos "novamente mutados" também estão englobados nesta descrição.

[00202] Outro tipo de modificação de estrutura envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T para reduzir assim a imunogenicidade potencial do anticorpo. Este método é também referido como "desimunização" e é descrita em mais detalhe em Publicação de Patente U.S. Nº. 20030153043 por Carr et al.

[00203] Outro tipo de modificação da região variável é para mutar os resíduos de aminoácidos nas regiões CDR para melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. Mutagênese dirigida ao sítio ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse. De preferência, modificações conservativas são introduzidas. As mutações podem ser adições, deleções ou substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, não mais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.

[00204] Os resíduos de metionina em CDRs de anticorpos podem ser oxidados, resultando em degradação química potencial e consequente redução na potência do anticorpo. Em conformidade, também são aqui fornecidos anticorpos anti-ICOS que tem um ou mais resíduos de metionina nas CDRs de cadeia pesada e leve substituídas por resíduos de aminoácidos que não sofrem degradação oxidativa. Similarmente, os sítios de desamidação podem ser removidos dos anticorpos anti-ICOS, particularmente nas CDRs. Também são aqui fornecidos anticorpos nos quais os potenciais sítios de glicosilação dentro do domínio de ligação ao antígeno foram eliminados para prevenir a glicosilação que pode interferir com a ligação ao antígeno. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nº.

5.714.350. Mascaramento de anticorpos

[00205] Em algumas modalidades, os anticorpos aqui revelados são modificados para limitar a sua ligação a células específicas e/ou tecido. Em uma modalidade, tais anticorpos compreendem uma "máscara" de peptídeo de bloqueio que se liga especificamente à superfície de ligação ao antígeno do anticorpo e interfere com a ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a máscara está ligada a cada um dos braços de ligação do anticorpo por um ligante clivável por protease. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nº. 8.518.404 de CytomX. Anticorpos com ligantes cliváveis por protease são úteis para o tratamento de cânceres nos quais os níveis de protease são grandemente aumentados no microambiente do tumor em comparação com tecidos não tumorais. A clivagem seletiva do ligante clivável no microambiente tumoral permite a dissociação do peptídeo mascarador/bloqueador, permitindo a ligação do antígeno seletivamente ao tumor, ao invés de tecidos periféricos nos quais a ligação ao antígeno pode causar efeitos colaterais indesejados.

[00206] Em uma outra modalidade, um composto de ligação bivalente ("ligante de mascaramento") compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno é desenvolvido que se liga a ambas as superfícies de ligação ao antígeno do anticorpo (bivalente) e interfere na ligação do antígeno. Em uma modalidade, as duas máscaras de domínio de ligação estão ligadas umas às outras (mas não ao anticorpo) por um ligante clivável, por exemplo, clivável por uma peptidase. (Ver, por exemplo, WO 2010/077643 de Tegopharm Corp). Os ligantes de mascaramento podem compreender ou serem derivados do antígeno ao qual o anticorpo se destina a ligar, ou podem ser gerados independentemente (por exemplo, fragmentos de ligação anti- idiotípico). Tais ligantes de mascaramento são úteis para o tratamento de cânceres nos quais os níveis de protease são grandemente aumentados no microambiente do tumor em comparação com tecidos não tumorais. A clivagem seletiva do ligante clivável no microambiente do tumor permite a dissociação dos dois domínios de ligação um do outro, reduzindo a avidez para as superfícies de ligação ao antígeno do anticorpo. A dissociação resultante do ligante de mascaramento do anticorpo permite a ligação do antígeno seletivamente no tumor, em vez de nos tecidos periféricos em que a ligação ao antígeno pode causar efeitos colaterais indesejados. Fcs e regiões Fc modificadas

[00207] Em uma modalidade, os anticorpos aqui descritos podem compreender regiões Fc selecionadas com base nas atividades biológicas do anticorpo. Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369. Human IgGs, por exemplo, pode ser classificado em quatro subclasses, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada uma destas subclasses compreende uma região Fc que possui um perfil único de ligação a um ou mais receptores Fc (receptores de ativação FcγRI (CD64), FcγRIIA, FcγRIIC (CD32a,c); FcγRIIIA e FcγRIIIB (CD16a,b) e inibidor do receptor FcγRIIB (CD32b) e para o primeiro componente do complemento (C1q). IgG1 Humana e IgG3 ligam-se a todos os receptores Fcγ; IgG2 liga-se a FcγRIIAH131, e com menor afinidade para FcγRIIAR131 FcγRIIIAV158; IgG4 liga-se a FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, e FcγRIIIAV158; e o receptor inibitório FcγRIIB tem uma menor afinidade para IgG1, IgG2 e IgG3 do que todos os outros receptores Fcγ. (Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716). Estudos demonstraram que o FcγRI não se liga ao IgG2 e o FcγRIIIB não se liga ao IgG2 ou ao IgG4. Id. Em geral, no que diz respeito à atividade ADCC, IgG1 Humana ≧ IgG3 ≫ IgG4 ≧ IgG2. Em algumas modalidades, um domínio constante de IgG1, em vez de um IgG2 ou IgG4, é escolhido, por exemplo, para uso em uma composição terapêutica porque o ADCC é desejado. Em outras modalidades, IgG3 é escolhida porque é desejável a ativação de células NK, monócitos ou macrófagos que expressam FcγRIIIA. Em outras modalidades, a IgG4 é escolhida porque o anticorpo é usado para dessensibilizar os pacientes alérgicos. A IgG4 também é selecionada para que o anticorpo não tenha todas as funções efetoriais.

[00208] As regiões variáveis do anticorpo anti-huICOS aqui descritas podem estar ligadas (por exemplo, ligadas covalentemente ou fundidas) a um Fc, por exemplo, um IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc, que pode ser de qualquer alotipo ou isoalotipo, por exemplo, IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, G2m23 (n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16 (t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v). (Ver, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). A seleção do alotipo pode ser influenciada pelas preocupações potenciais de imunogenicidade, por exemplo, para minimizar a formação de anticorpos antifármacos.

[00209] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-ICOS da presente invenção possuem uma região Fc que se liga ou melhora a ligação a FcγRIIb, que fornecem um agonismo melhorado. Ver, por exemplo, WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 87:1754. Em algumas modalidades, as regiões variáveis aqui descritas podem ser ligadas a variantes Fc que aumentam a afinidade para o receptor inibidor FcyRIIb, por exemplo, para aumentar a atividade indutora ou adjuvante da apoptose. Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:10966; Publicação de Pedido de Patente U.S. 2014/0010812. Tais variantes fornecem um anticorpo com atividades imunomoduladoras relacionadas às células FcγRIIb +, incluindo, por exemplo, células B e monócitos. Em uma modalidade, as variantes Fc fornecem uma afinidade seletivamente aumentada para FcγRIIb relativamente a um ou mais receptores de ativação. Tais variantes podem também exibir reticulação mediada por FcR intensificada, resultando em eficácia terapêutica aumentada. As modificações para alterar a ligação a FcγRIIb incluem uma ou mais modificações, por exemplo, nas posições 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 ou 332, de acordo com o índice Europeu. Substituições exemplares para aumentar a afinidade de FcγRIIb incluem, mas não se limitam a 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, e 332E. Substituições exemplares incluem 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, e 328Y. Outras variantes de Fc para aumentar a ligação a FcγRIIb incluem 235Y- 267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D, 267E-268E, e 267E- 328F. Especificamente, as variantes S267E, G236D, S239D, L328F e I332E, incluindo a variante dupla S267E-L328F, de IgG1 Humana são de particular valor em aumentar especificamente a afinidade para o receptor FcγRIIb inibitório. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº. 2006/024298; WO 2012/087928. Especificidade aprimorada para FcγRIIb (como distinta de FcγRIIaR131) pode ser obtida adicionando a substituição P238D e outras mutações (Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589; WO 2012/1152410), bem como V262E e V264E (Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723, e WO 2014/184545. Domínios Constantes de Cadeia Pesada Não IgG2 com Regiões de Articulação IgG2

[00210] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-ICOS aqui descritos exibem atividade agonista aumentada, pelo menos em parte, devido a modificações que aumentaram a ligação a, e/ou especificidade para, FcγRIIb. Uma abordagem alternativa é projetar a região Fc para fornecer um realce independente de FcγR do agonismo. Exemplos de anticorpos para outros alvos com domínios de IgG2 modificados que fornecem tal agonismo melhorado são descritos em WO 2015/145360 e White et al. (2015) Cancer Cell 27: 138, cujas descrições são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Especificamente,

ligações de dissulfureto são dispostas para "travar" o anticorpo em uma conformação "h2B" mais compacta, resultando em agonismo aumentado.

O agonismo fortalecido resultante é independente de FcγR. (Ver White et al. (2015) Cancer Cell 27:138). Tal agonismo independente de FcγR é vantajoso no tratamento de alguns tumores, tais como aqueles que têm poucas células que expressam FcγR- + (por exemplo, poucas células NK ou macrófagos). Em uma modalidade, anticorpos anti-ICOS compreendendo as sequências de CDR ou domínios variáveis aqui descritos ligados a regiões constantes de cadeia pesada não hullG2 (por exemplo, IgG1) tendo regiões de articulação hIgG2 ou suas variantes, incluindo o domínio CH1 de variantes de sequência, são fornecidos.

Em uma modalidade, estes anticorpos de "articulação IgG2" exibem agonismo aumentado em comparação com anticorpos com uma região constante de cadeia pesada de IgG1 total, e o agonismo aumentado é independente da reticulação mediada pelo receptor de Fcγ.

Em algumas circunstâncias, estes anticorpos anti-ICOS de articulação IgG2 retêm a afinidade de ligação ao antígeno substancialmente inalterada.

São também aqui fornecidos métodos para aumentar o agonismo independente de FcγR de anticorpos anti-ICOS não IgG2, compreendendo a substituição da articulação não IgG2 por uma articulação IgG2. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma articulação do isótipo IgG2 (uma "articulação IgG2") e um domínio CH1, CH2 e CH3, em que pelo menos um dos domínios CH1, CH2 e CH3 não é do isótipo IgG2. A articulação IgG2 pode ser uma articulação IgG2 humana de tipo selvagem (por exemplo, ERKCCVECPPCPAPPVAG, mencionada na SEQ ID Nº: 96) ou uma variante da mesma que também confere atividade agonista aumentada.

Em certas modalidades, tais variantes de articulação IgG2 têm rigidez ou dureza semelhantes às da articulação IgG2 de tipo selvagem.

A rigidez de uma articulação pode ser determinada, por exemplo, por modelagem computacional, microscopia eletrônica, espectroscopia tal como ressonância magnética Nuclear (RMN), cristalografia de raios X (fatores B) ou ultracentrifugação analítica de velocidade de sedimentação para medir ou comparar raio de giro dos anticorpos que compõem a articulação. Em algumas modalidades, as variantes de articulação IgG2 humana compreendem a(s) substituição(ões) de um ou mais dos quatro resíduos de cisteína (isto é, C219, C220, C226 e C229), por exemplo, com serina. Em uma modalidade, a variante de articulação IgG2 compreende uma mutação C219S (por exemplo, ERKSCVECPPCPAPPVAG, como mencionado na SEQ ID Nº: 110). Outras variantes de articulação IgG2 compreendem a mutação C220S, C226S ou C229S, qualquer uma das quais pode ser combinada com uma mutação C219S.

[00211] Uma variante de articulação IgG2 também pode compreender elementos de sequência de articulação não IgG2 (uma "articulação quimérica"). Em algumas modalidades, a rigidez da articulação quimérica é pelo menos semelhante à de uma articulação IgG2 de tipo selvagem. Por exemplo, em uma modalidade, uma variante de articulação IgG2 compreende uma articulação inferior de IgG1 de tipo selvagem. Veja a Tabela 2.

[00212] A Tabela 4 abaixo fornece exemplos de sequências da região constante de cadeia pesada humana de "articulação IgG2" que diferem nas origens isotípicas dos domínios CH1, CH2 e CH3. Como aqui utilizado, "anticorpo de articulação IgG2" refere-se não apenas aos anticorpos compreendendo regiões de articulações derivadas de IgG2, mas também regiões CH1 derivadas de IgG2 CH1. O asterisco (*) na Tabela 4 indica que o domínio indicado pode ser de qualquer isótipo, ou pode estar completamente ausente. Em certas modalidades, uma região constante de Cadeia Pesada modificada compreende um domínio CH1 variante, por exemplo, incluindo mutações A114C e/ou

T173C.

Uma região constante de cadeia pesada modificada também pode compreender um domínio variante de CH2, por exemplo, incluindo as mutações A330S e/ou P331S.

Tabela 4 - Construções de Região Constante de cadeia pesada humana da "Articulação IgG2"

CH1 Hinge CH2 CH3 * IgG2 * * IgG1 IgG2 * * IgG2 IgG2 * * * IgG2 IgG1 * * IgG2 IgG2 * * IgG2 * IgG1 * IgG2 * IgG2 IgG1 IgG2 IgG1 * IgG1 IgG2 IgG2 * IgG2 IgG2 IgG1 * IgG2 IgG2 IgG2 * IgG1 IgG2 * IgG1 IgG1 IgG2 * IgG2 IgG2 IgG2 * IgG1 IgG2 IgG2 * IgG2 * IgG2 IgG1 IgG1 * IgG2 IgG1 IgG2 * IgG2 IgG2 IgG1 * IgG2 IgG2 IgG2 IgG1 IgG2 IgG1 IgG1 IgG1 IgG2 IgG1 IgG2 IgG1 IgG2 IgG2 IgG1 IgG1 IgG2 IgG2 IgG2 IgG2 IgG2 IgG1 IgG1 IgG2 IgG2 IgG1 IgG2 IgG2 IgG2 IgG2 IgG1 IgG2 IgG2 IgG2 IgG2

[00213] Exemplos de domínios constantes de anticorpos compreendendo combinações de IgG2 CH1 e sequências de articulação com outras sequências isotípicas, e seleção de substituições de aminoácidos, são fornecidos na Tabela 5 abaixo. Tabela 5 - Exemplos de Regiões Constantes de Cadeia Pesada humanas de "articulação IgG2 " Construção SEQ ID Nº: Descrição IgG1f 104 IgG1f tipo selvagem IgG1.1f 109 IgG1.1f inerte padrão IgG2.3 105 Forma A de IgG2 (C219S) IgG2.5 108 Forma B de IgG2 (C131S) 107 CH1, articulação superior e articulação inferior/superior CH2 de IgG2.3G1-KH IgG2.3, todos os outros IgG1f 116 CH1, articulação superior e articulação inferior/superior CH2 de IgG2.5G1-KH IgG2.5, todos os outros IgG1f IgG2.3G1-AY 106 CH1 e articulação superior de IgG2.3, todos os outros IgG1f IgG2.5G1-AY 115 CH1 e articulação superior de IgG2.5, todos os outros IgG1f 119 CH1 de IgG1, articulação superior e articulação inferior/superior IgG1-G2.3G1-KH CH2 de IgG2.3, todos os outros IgG1f 118 CH1 de IgG1, articulação superior de IgG2.3, todos os outros IgG1-G2.3G1-AY IgG1f 110 CH1, articulação superior e articulação inferior/superior CH2 de IgG2.3G1.1f-KH IgG2.3, todos os outros IgG1.1f 114 CH1, articulação superior e articulação inferior/superior CH2 de IgG2.5G1.1f-KH IgG2.5, todos os outros IgG1.1f IgG1-deltaTHT 111 IgG1 com sequência THT removida da articulação IgG2.3-plusTHT 112 IgG2.3 com sequência THT (de IgG1) adicionada à dobradiça IgG2.5-plusTHT 117 IgG2.5 com sequência THT (de IgG1) adicionada à dobradiça IgG2.3-plusGGG 113 IgG2.3 com sequência GGG flexível adicionada à articulação

[00214] Exemplos específicos adicionais de domínios constantes de anticorpos compreendendo combinações de IgG2 CH1 e sequências de articulação com outras sequências isotípicas, e seleção de substituições de aminoácidos, são fornecidos pela Tabela 6 abaixo.

Tabela 6 - Exemplos Adicionais de Regiões Constantes de Cadeia Pesada Humanas de "articulação IgG2" Construção SEQ ID Nº: Descrição G2-G1-G1-G1 120 Domínio CH1 de IgG2, com todos os outros IgG1. Também, Cys>Ser mutante para G2.5-G1-G1-G1 121 reduzir a heterogeneidade potencial de dissulfeto. G1-G2.3-G2-G2 122 Domínio CH1 de IgG1 com todos os outros IgG2.3 G1-KRGEGSSNLF 123 G1-KRGEGS 124 Troque as regiões CH1 em IgG1 com as de G1-SNLF 125 IgG2, separadamente ou em conjunto. IgG1-ITNDRTPR 126 G1-SNLFPR 127 G2-RKEGSGNSFL 128 G2-RKEGSG 129 Troque as regiões CH1 em IgG2 com as de G2-NSFL 130 IgG1, separadamente ou em conjunto. IgG2-TIDNTRRP 131 G2-NSFLRP 132 G1-G1-G2-G1-AY 133 IgG1 com resíduos do domínio CH2 de IgG2 G1-G1-G2-G1-KH 134 G2-G2.3-G1-G2-KH 135 IgG2 com resíduos do domínio CH2 de IgG1 G2.5-G2.3-G1-G2-KH 136 G2-G2.3-G1-G2-AY 137 G2.5-G2.3-G1-G2-AY 138 G1-G2.3-G1-G1-KH 139 G2-G1-G2-G2-AY 140 G2.5-G1-G2-G2-AY 141 Troque as regiões de articulação entre IgG1 e G1-G2-G1-G1-AY 142 IgG2.

G2-G1-G2-G2-KH 143 G2.5-G1-G2-G2-KH 144 IgG1-deltaHinge 145 IgG2-deltaHinge 146 Truncamentos de articulação IgG2.5-deltaHinge 147 IgG1-deltaG237 148 IgG2-plusG237 149 IgG2.4 150 Outros IgG2.3/4 151

[00215] Anticorpos anti-ICOS, incluindo anticorpos compreendendo a CDR e/ou sequências do domínio variável descritas aqui, podem incorporar as sequências de domínio constante de "articulação IgG2" aqui descritas, por exemplo, para aumentar a atividade agonista independente de FcγR. Exemplos de tais domínios constantes de articulação IgG2 incluem os descritos pela Tabela 5 (SEQ ID Nºs: 104- 108 e 110-119) e Tabela 6 (SEQ ID Nºs: 120-151), e também aqueles descritos nas SEQ ID Nºs: 101-108. Extensão de meia-vida

[00216] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-ICOS é modificado para aumentar sua meia-vida biológica, por exemplo, a meia-vida do anticorpo no soro. Várias abordagens são conhecidas na técnica. Por exemplo, a meia-vida de um anticorpo pode ser prolongada aumentando a afinidade de ligação da região Fc para FcRn. Em uma modalidade, o anticorpo é alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento, retirado de dois loops de um domínio CH2 de uma região Fc de um IgG, como descrito em Patentes U.S. Nºs. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al. Outros exemplos de variantes Fc que aumentam a ligação a FcRn e/ou melhoram as propriedades farmacocinéticas incluem substituições nas posições 259, 308 e 434, incluindo por exemplo 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, e 434M. Outras variantes que aumentam a ligação do Fc ao FcRn incluem: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall'Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-

23524). Ver Patente U.S. Nº. 8.367.805.

[00217] Modificação de certos resíduos conservados em IgG Fc (I253, H310, Q311, H433, N434), como a variante N434A (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663), têm sido proposta como forma de aumentar a afinidade pelo FcRn, aumentando assim a meia-vida do anticorpo em circulação. (Ver, por exemplo, WO 98/023289). Mostrou- se que a variante Fc de combinação compreendendo M428L e N434S aumenta a ligação de FcRn e aumenta a meia-vida no soro em até cinco vezes. (Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157). A variante Fc de combinação compreendendo modificações de T307A, E380A e N434A também prolonga a meia-vida dos anticorpos IgG1. (Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759). Além disso, a variante Fc de combinação, compreendendo variantes M252Y-M428L, M428L-N434H, M428L- N434F, M428L-N434Y, M428L-N434A, M428L-N434M, e M428L- N434S também foram mostrados para prolongar a meia-vida. (WO 2009/086320).

[00218] Além disso, uma variante Fc de combinação compreendendo M252Y, S254T e T256E, aumenta a meia-vida quase quatro vezes. (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 23514). Uma modificação de IgG1 relacionada fornecendo maior afinidade de FcRn mas reduzida dependência de pH (M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F) foi utilizada para criar uma construção de IgG1 ("MST-HN Abdeg") para utilização como competidor para impedir a ligação de outros anticorpos para FcRn, resultando no aumento da depuração desse outro anticorpo, tanto IgG endógeno (por exemplo, em um ambiente autoimune) ou outro exógeno (terapêutico) mAb. (Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283; WO 2006/130834).

[00219] Outras modificações para aumentar a ligação de FcRn são descritas em Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; 6.277.375;

6.821.505; WO 97/34631; WO 2002/060919.

[00220] Em certas modalidades, os isótipos de IgG híbridos podem ser usados para aumentar a ligação de FcRn e potencialmente aumentar a meia-vida. Por exemplo, uma variante híbrida de IgG1/IgG3 pode ser construída substituindo as posições de IgG1 na região CH2 e/ou CH3 pelos aminoácidos de IgG3 nas posições em que os dois isótipos diferem. Assim, pode ser construído um anticorpo IgG variante híbrido que compreende uma ou mais substituições, por exemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R e 436F. Em outras modalidades aqui descritas, pode ser construída uma variante híbrida IgG1/IgG2 substituindo as posições de IgG2 na região CH2 e/ou CH3 por aminoácidos de IgG1 nas posições em que os dois isótipos diferem. Assim, pode ser construído um anticorpo de IgG variante híbrido que compreende uma ou mais substituições, por exemplo, uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, -236G (referindo-se a uma inserção de uma glicina na posição 236) e 327A. Ver Patente U.S. Nº. 8.629.113. Foi gerado um híbrido de sequências IgG1/IgG2/IgG4 que supostamente aumenta a meia-vida no soro e melhora a expressão. Patente U.S. Nº. 7.867.491 (sequência número 18).

[00221] A meia-vida sérica dos anticorpos aqui descritos também pode ser aumentada por pegilação. Um anticorpo pode ser pegilado, por exemplo, para aumentar meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pegilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com um reagente polietilenoglicol (PEG), tal como um derivado de éter ou aldeído reativo de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG se ligam ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. De preferência, a pegilação é realizada através de uma reação de acilação ou de uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero reativo hidrossolúvel análogo). Como aqui utilizado, o termo "polietilenoglicol" pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que tenham sido utilizadas para derivar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi ou arilóxi-polietilenoglicol ou polietilenoglicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser pegilado é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para a pegilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos aqui descritos. (Ver, por exemplo, EP 0154316 de Nishimura et al. E EP 0401384 de Ishikawa et al.).

[00222] Em alguns casos, pode ser desejável diminuir a meia-vida de um anticorpo, em vez de aumentá-lo. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos incluem modificações para diminuir sua meia- vida. Modificações tais como I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41: 355) e H435A/R, I253A ou H310A (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29: 2819) em Fc de IgG1 Humana pode diminuir a ligação de FcRn, diminuindo assim a meia-vida (aumentando a depuração) para utilização em situações em que a depuração rápida é preferida, tal como para imageamento médico. (Ver também Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622). Outros métodos para realçar a depuração incluem formatar os domínios de ligação a antígeno da presente invenção como fragmentos de anticorpo que não têm a capacidade de se ligar a FcRn, tais como fragmentos Fab. Tal modificação pode, por exemplo, reduzir a meia-vida circulante de um anticorpo de 2 semanas a horas. PEGilação seletiva de fragmentos de anticorpo pode então ser usada para aumentar a meia-vida dos fragmentos de anticorpo quando desejado. (Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780). Os fragmentos de anticorpos podem também ser fundidos com albumina de soro humano, por exemplo, em uma construção de proteína de fusão, para aumentar a meia-vida. (Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904). Alternativamente, um anticorpo biespecífico pode ser construído com um primeiro domínio de ligação ao antígeno da presente invenção e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a albumina do soro humano (HSA). (Ver WO 2009/127691 e referências de patentes aqui citadas). Alternativamente, sequências polipeptídicas especializadas podem ser adicionadas a fragmentos de anticorpo para aumentar a meia-vida, por exemplo, sequências polipeptídicas "XTEN". (Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186; Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2010/091122). Variantes Fc Adicionais

[00223] Em algumas modalidades, quando se utiliza um domínio constante de IgG4, pode ser vantajoso incluir a substituição S228P, que imita a sequência de articulação em IgG1 e estabiliza assim as moléculas de IgG4, por exemplo, reduzindo a troca do braço de Fab entre o anticorpo terapêutico e o IgG4 endógeno no paciente que está sendo tratado. (Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925).

[00224] Um potencial sítio de clivagem por protease na articulação das construções de IgG1 pode ser eliminado pelas modificações de D221G e K222S, aumentando a estabilidade do anticorpo. (WO 2014/043344).

[00225] As afinidades e propriedades de ligação de uma variante Fc para seus ligantes (receptores Fc) podem ser determinadas por uma variedade de métodos de ensaio in vitro (por exemplo, ensaios bioquímicos ou imunológicos) conhecidos na arte, incluindo, mas não limitados a, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoenzimático (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)) ou cinética (por exemplo, análise BIACORE® SPR) e outros métodos, como ensaios de ligação indireta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar uma etiqueta em um ou mais dos componentes a serem examinados e/ou empregam vários métodos de detecção incluindo, mas não se limitando a marcações cromogênicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada das afinidades e cinéticas de ligação pode ser encontrada em Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que foca nas interações de anticorpo-imunógeno.

[00226] Em ainda outras modalidades, a glicosilação de um anticorpo é modificada para aumentar ou diminuir a função efetora. Por exemplo, pode ser produzido um anticorpo aglicolisado que não possua toda a função efetora por mutação do resíduo conservado de asparagina na posição 297 (por exemplo, N297A), abolindo assim o complemento e a ligação FcγRI. (Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. Ver também Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (usando N297Q em IgG1 para eliminar a glicosilação na posição 297)).

[00227] Embora os anticorpos aglicolisados geralmente não tenham função efetora, podem ser introduzidas mutações para restaurar essa função. Anticorpos aglicosilados, por exemplo, aqueles que resultam de mutações N297A/C/D/ou H ou produzidos em sistemas (por exemplo, E. coli) que não glicosilam proteínas, podem ainda ser mutados para restaurar a ligação FcγR, por exemplo, S298G e/ou T299A/G/ou H (WO 2009/079242), ou E382V e M428I (Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 107:604).

[00228] A glicoengenharia também pode ser usada para modificar as propriedades anti-inflamatórias de uma construção de IgG alterando o teor de sialila α2,6 das cadeias de carboidrato ligadas em Asn297 das regiões Fc, em que uma proporção aumentada de formas sialiladas α2,6 resulta em efeitos anti-inflamatórios aumentados. (Ver Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513). Inversamente, a redução na proporção de anticorpos com carboidratos sialilados α2,6 pode ser útil nos casos em que não são desejadas propriedades anti-inflamatórias. Métodos de modificação do teor de sialilação de α2,6 de anticorpos, por exemplo, por purificação seletiva de formas sialiladas α2,6 ou por modificação enzimática, são fornecidos na Bar. de Pedido de Patente U.S. Nº. 2008/0206246. Em outras modalidades, a Sequência de Aminoácido da região Fc pode ser modificada para imitar o efeito da sialilação α2,6, por exemplo, pela inclusão de uma modificação F241A. (WO 2013/095966). III. Propriedades Físicas do Anticorpo

[00229] Em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos contêm um ou mais sítios de glicosilação em qualquer das regiões de cadeia leve ou pesada. Tais sítios de glicosilação podem resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma farmacocinética de anticorpo alterada devido à ligação alterada de antígeno (Marshall et al (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Sabe-se que a glicosilação ocorre em motifs que contêm uma sequência N-X-S/T. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-huICOS não contém glicosilação da região variável. Tais anticorpos podem ser obtidos pela seleção de anticorpos que não contêm o motivo de glicosilação na região variável ou pela mutação de resíduos dentro da região de glicosilação.

[00230] Em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos não contêm sítios de isomerismo da asparagina. A desamidação da asparagina pode ocorrer nas sequências N-G ou D-G e resultar na criação de um resíduo de ácido isoaspártico que introduz uma torção na cadeia polipeptídica e diminui sua estabilidade (conhecido como o efeito do ácido isoaspártico).

[00231] Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos possuem um ponto isoelétrico (pI) no intervalo de pH entre 6 e 9,5. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos têm um pI na faixa de pH de 7-9,5 ou 6-8. Anticorpos com pI dentro de uma faixa pI desejada podem ser obtidos selecionando anticorpos com pI na faixa de pH de um grupo de candidatos ou por mutação de resíduos de superfície carregados de um anticorpo particular.

[00232] Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos são selecionados e/ou modificados com uma temperatura de desdobramento inicial (TM1) maior que 60°C, maior que 65°C ou maior que 70°C. O ponto de fusão de um o anticorpo pode ser medido utilizando calorimetria de varredura diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett. 68:47-52) ou dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9).

[00233] Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos são selecionados e/ou construídos para terem propriedades de degradação vantajosas, por exemplo, degradação lenta in vitro e/ou in vivo. A degradação do anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander A J e Hughes D E (1995) Anal Chem. 67:3626-32). Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos são selecionados e/ou construídos para terem propriedades de agregação favoráveis, por exemplo, anticorpos que mostram agregação mínima in vitro e/ou in vivo, que podem induzir uma resposta imunitária indesejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos mostram agregação de 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, ou 5% ou menos em comparação com a agregação do anticorpo parental. A agregação pode ser medida por várias técnicas, incluindo coluna de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e dispersão de luz. IV. Moléculas de Ácidos Nucleicos e Métodos Recombinantes

[00234] Outro aspecto aqui descrito refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-huICOS aqui descritos. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células completas, por exemplo, uma célula hospedeira, em um lisado celular ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, outro DNA cromossômico, por exemplo, o DNA cromossômico que está ligado ao DNA isolado na natureza) ou proteínas, por técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandeamento de CsCl, cromatografia em coluna, enzimas de restrição, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. (Ver, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque). Um ácido nucleico aqui descrito pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter íntrons. Em certas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[00235] Os ácidos nucleicos aqui descritos podem ser obtidos utilizando técnicas padrões de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos transportadores de genes de imunoglobulina humana como descrito mais adiante), os cDNAs que codificam as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, utilizando técnicas de exibição de fagos), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado da biblioteca.

[00236] Uma vez que fragmentos de DNA que codificam segmentos VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser construídos por técnicas padrão de DNA recombinante, por exemplo, para converter genes da região variável em genes de cadeia de anticorpos de comprimento total, genes de fragmentos Fab ou a um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH está operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operacionalmente ligado", como usado neste contexto, significa que os dois fragmentos de DNA são unidos de forma que a sequência de aminoácidos codificada pelos dois fragmentos de DNA permaneça dentro da estrutura.

[00237] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento completo ligando operativamente o DNA codificador de VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (articulação, CH1, CH2 e/ou CH3). As sequências de genes da região constante de cadeia pesada, humanas são conhecidas na especialidade (ver, por exemplo, Kabat, et al., 1991) e os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR convencional. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA, IgE, IgM ou IgD, por exemplo, uma região IgG1. Para um fragmento Fab de gene de cadeia pesada, o DNA que codifica VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante de cadeia pesada CH1.

[00238] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (assim como um gene Fab) ligando operativamente o DNA codificador de VL a outra molécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante de cadeia leve de humano são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, et al., 1991). Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 91-3242), e os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR convencional. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

[00239] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL estão operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, codificando a Sequência de Aminoácido (Gly4 -Ser)3, tal que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554). V. Geração de Anticorpos

[00240] Vários anticorpos da presente invenção, por exemplo, aqueles que se ligam ao mesmo Epítopo como anticorpos anti-ICOS humanos selecionados aqui descritos, podem ser produzidos utilizando uma variedade de técnicas conhecidas, tais como a técnica padrão de hibridização de células somáticas descrita por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem também ser empregues, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B, técnica de exibição em fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpos humanos.

[00241] Um sistema animal exemplar para a preparação de hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

[00242] Os anticorpos químicos ou humanizados aqui descritos podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado como descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia leve e pesada pode ser obtido a partir do hibridoma murino de interesse e modificado para conter sequências de imunoglobulina não murinas (por exemplo, humanas) utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinos podem ser ligadas a regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº. 4.866.567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura humana utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº. 5.225.539 a Winter e Patente U.S. Nºs. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 a Queen et al.).

[00243] Em uma modalidade, os anticorpos aqui descritos são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra o ICOS humano podem ser gerados utilizando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imune humano em vez do sistema do camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos aqui referidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são referidos coletivamente como "camundongos Ig humanos".

[00244] O HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contém minilocos do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulinas de cadeia leve κ e pedada (µ e γ) humanas não rearranjadas, juntamente com mutações direcionadas que inativam as sequências endógenas µ e κ loci de cadeia (ver, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Dessa forma, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongos, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia leve e pesada humanos introduzidos sofrem mutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGκ humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). A preparação e uso de camundongos HuMan, e as modificações do genoma transportados por tais camundongos, são descritas em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579- 591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, o conteúdo de todos os que são especificamente incorporados por referência na sua totalidade. (Ver, também, Patente U.S. Nºs. 5.545.806;

5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.779.650; 5.877.397; 5.661.016;

5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas de Lonberg e Kay; Patente U.S. Nº. 5.545.807 de Surani et al.; Publicações PCT Nºs. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas de Lonberg e Kay e Publicação PCT Nº. WO 01/14424 de Korman et al.).

[00245] Em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos são criados usando um camundongo que transporta sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossoma humano de cadeia leve. Tais camundongos, aqui referidos como "camundongos KM", são descritos em detalhe na publicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al..

[00246] Ainda mais, sistemas animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para criar anticorpos anti-huICOS aqui descritos. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tal como camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nºs.

5.939.598, 6.075.181, 6.114.598, 6.150.584 e 6.162.963 de Kucherlapati et al..

[00247] Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para criar anticorpos anti- ICOS aqui descritos. Por exemplo, camundongos carregando tanto um transcromossoma de cadeia pesada humano quanto um transcromossoma de cadeia leve humano, chamado de "camundongos TC" podem ser usados; esses camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Além disso, vacas transportando transcromossomas de cadeia leve e pesada humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para aumentar os anticorpos anti-huICOS aqui descritos.

[00248] Sistemas de camundongos adicionais descritos na técnica para elevar anticorpos humanos, por exemplo, anticorpos anti-huICOS humanos, incluem (i) o camundongo VELOCIMMUNE ® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), no qual as regiões variáveis de cadeia leve e pesadas de camundongo endógeno foram substituídas por meio de recombinação homóloga, com regiões variáveis de cadeia leve e pesadas humanas, operativamente ligadas às regiões constantes de camundongos endógenos, de tal forma que os anticorpos quiméricos (humano V/camundongo C) são elevados nos camundongos e subsequentemente convertidos em anticorpos completamente humanos utilizando técnicas de DNA recombinante; e (ii) o camundongo MeMo® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), no qual o camundongo contém uma região variável de cadeia pesada humana não rearranjada, mas uma única região variável de Cadeia Leve comum humana rearranjada. Tais camundongos, e utilização dos mesmos para criar anticorpos, são descritos, por exemplo, em WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 e US 2012/0073004.

[00249] Os anticorpos monoclonais humanos aqui descritos também podem ser preparados utilizando métodos de exibição de fagos para rastreio de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Estes métodos de exibição de fagos para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. (Ver, por exemplo, Patente U.S. Nºs.

5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Ladner et al.; Patente U.S. Nºs.

5.427.908 e 5.580.717 de Dower et al.; Patente U.S. Nºs. 5.969.108 e

6.172.197 de McCafferty et al.; e Patente U.S. Nºs. 5.885.793;

6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 de Griffiths et al.).

[00250] Os anticorpos monoclonais humanos aqui descritos também podem ser preparados utilizando camundongos com imunodeficiência combinada grave (SCID) em que as células imunitárias humanas foram reconstituídas de modo a que possa ser gerada uma resposta de anticorpo humano após imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, em Patente U.S. Nºs. 5.476.996 e 5.698.767 de Wilson et al. Imunizações

[00251] Para gerar anticorpos totalmente humanos para ICOS humanos, camundongos ou camundongos transgênicos ou transcromossômicos contendo genes de imunoglobulina humana (por exemplo, camundongos HCo12, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno ICOS e/ou células que expressam ICOS, tal como descrito para outros antígenos,

por exemplo, por Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856 859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e WO 98/24884. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica ICOS humano. De preferência, os camundongos terão 6 a 16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou enriquecida (por exemplo, 5 µg -50 µg) do antígeno ICOS humano recombinante pode ser utilizada para imunizar os camundongos intraperitonealmente. Se as imunizações usando uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno ICOS não resultar em anticorpos, camundongos também podem ser imunizados com células expressando ICOS, por exemplo, uma linhagem celular, para promover respostas imunes.

[00252] Os camundongos transgênicos HuMAb podem ser inicialmente imunizados intraperitonealmente ou subcutâneamente (SC) com antígeno no adjuvante de Ribi, seguido por imunizações IP/SC a cada outra semana (até um total de 10) com antígeno no adjuvante de Ribi. A resposta imune pode ser monitorada ao longo do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangramentos retro-orbitais. O plasma pode ser rastreado por ELISA e FACS (como descrito abaixo), e os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-ICOS podem ser utilizados para fusão. Os camundongos podem ser reforçados intravenosamente com antígeno três dias antes do sacrifício e remoção do baço e dos nódulos linfáticos. Duas a três fusões para cada imunização podem ser realizadas. Entre 6 e 24 camundongos podem ser imunizados para cada antígeno. Em algumas modalidades, cepas de HCo7, HCo12 e KM são usadas. Além disso, tanto o transgene HCo7 quanto o HCo12 podem ser criados juntos em um único camundongo que possui dois diferentes transgenes humanos de cadeia pesada (HCo7/HCo12).

Geração de Hibridomas Produzindo Anticorpos Monoclonais para

ICOS

[00253] Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais aqui descritos, os esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser analisados quanto à produção de anticorpos específicos para o antígeno. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas com células de mieloma de camundongo não secretoras Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) com 50% de PEG. As células são lavadas a aproximadamente 2 x 105 em placa de microtitulação de base plano, seguida de duas semanas de incubação em meio seletivo contendo 10% de soro fetal clone, 18% de meio condicionante "653", 5% de Origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 50 mg/mL de gentamicina e 1X de HAT (Sigma). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas no meio em que o HAT é substituído por HT. As cavidades individuais podem então ser analisados por ELISA para anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos. Uma vez que ocorre o crescimento extensivo do hibridoma, o meio pode ser observado geralmente após 10 a 14 dias. Os anticorpos que secreta hibridomas podem ser substituídos, analisados novamente, se ainda forem positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpos em meio de cultura de tecidos para caracterização.

[00254] Para purificar anticorpos monoclonais, os hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos giratórios de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocada em PBS e a concentração pode ser determinada por OD280 usando o coeficiente de extinção 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados em -80°C. VI. Fabricação de Anticorpos Geração de Transfectomas que produzem Anticorpos Monoclonais para ICOS

[00255] Anticorpos da presente invenção, incluindo ambos os anticorpos específicos para os quais as sequências são fornecidas e outros anticorpos anti-ICOS relacionados, podem ser produzidos em um transfectoma da célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênica bem conhecidos na arte (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[00256] Por exemplo, para expressar anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, DNAs codificando cadeias pesada e leves de comprimento total podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse), e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de tal modo que os genes estejam operativamente ligados a sequências de controle de transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado a um vetor tal que as sequências de controle de transcrição e tradução dentro do vetor sirvam a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no(s) vetor(es) de expressão por métodos padrões (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene e vetor do anticorpo, ou ligação de extremidade embotada se nenhum sítio de restrição estiver presente). A região variável de cadeias pesada e leve dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes de anticorpos inteiros de qualquer isótipo de anticorpo, inserindo-os em vetores de expressão que codificam regiões constantes de cadeia leve e constante de cadeia pesada do isótipo desejado, tal que o segmento VH está operacionalmente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VL está operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de tal modo que o peptídeo sinal está ligado na estrutura ao terminal amino do gene da cadeia do anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não imunoglobulina).

[00257] Além dos genes da cadeia do anticorpo, os vetores de expressão recombinante podem conter sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" inclui promotores, estimuladores e outros elementos de controle da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia do anticorpo. Tais sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado pelos peritos na técnica que a concepção do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, entre outros fatores. Sequências reguladoras preferidas para expressão de células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem níveis elevados de expressão de proteínas em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o adenovírus principal promotor tardio (AdMLP) e poliomavírus. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor da ubiquitina ou o promotor da globina. Ainda mais, elementos reguladores compostos de sequências de diferentes fontes, como o sistema promotor SRα, que contém sequências do promotor precoce SV40 e a repetição terminal longa do vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

[00258] Além dos genes da cadeia do anticorpo e sequências regulatórias, vetores de expressão recombinantes podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, Patente U.S. Nºs. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis exemplificativos incluem o gene da di-

hidrofolato-redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para selecção por G418).

[00259] Para expressão de cadeias pesadas e leves, o(s) vetor(es) de expressão que codifica as cadeias pesadas e leves é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padrões. As várias formas do termo "transfecção" englobam uma ampla variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos aqui descritos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferencialmente células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que as células procarióticas para montar e secretar um anticorpo devidamente dobrado e imunologicamente ativo. Foi relatado que a expressão procariótica de genes de anticorpos é ineficaz para a produção de altos rendimentos de anticorpos ativos (Boss, M. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos em cepas de levedura manipuladas com glicol. (Pichia pastoris. Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210).

[00260] As células hospedeiras de mamífero exemplificativas para expressar os anticorpos recombinantes aqui descritos incluem o Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 4216 - 4220, utilizado com um marcador selecionável de di-hidrofolato redutase (DHFR), por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células

COS e células SP2. Em particular, para utilização com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão exemplificativo é o sistema de expressão do gene GS descrito em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos padrões de purificação de proteínas.

[00261] Os terminais N e C das cadeias polipeptídicas de anticorpo da presente invenção podem diferir da sequência esperada devido a modificações pós-translacionais comumente observadas. Por exemplo, os resíduos de lisina de terminação C estão frequentemente ausentes do anticorpo de cadeia pesada. (Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100: 1132). Os resíduos de glutamina de terminação N e, em menor grau, os resíduos de glutamato, são frequentemente convertidos em resíduos de piroglutamato tanto de cadeias leves quanto de cadeias pesadas de anticorpos terapêuticos. (Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211).

[00262] Sequência de Aminoácidos para vários anticorpos agonistas anti-huICOS da presente invenção são fornecidos na Lista de Sequências, que é resumida na Tabela 35. Pelas razões discutidas acima, a lisina de terminação C não está incluída em muitas das sequências na Listagem de Sequências para cadeia pesadas ou domínio constante de cadeias pesadas. No entanto, em uma modalidade alternativa, cada cadeia pesada para os anticorpos anti-

huICOS da presente invenção, e/ou construção genética codificando tais anticorpos ou as cadeias leves ou pesadas dos mesmos, inclui este resíduo de lisina adicional no terminal C da(s) cadeia(s) pesada(s). VII. Ensaios

[00263] Anticorpos descritos aqui podem ser testados quanto à ligação a ICOS, por exemplo, por ELISA padrão. Por exemplo, placas de microtítulo são revestidas com ICOS purificado em 1-2 µg/ml em PBS, e em seguida bloqueada com 5% albumina de soro bovino em PBS. Diluições de anticorpo (por exemplo, diluições de plasma de camundongo imunizado com ICOS) são adicionadas a cada cavidade e incubadas durante uma a duas horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e então incubadas com reagente secundário (por exemplo, por anticorpos humanos, ou anticorpos de outro modo tendo uma região constante de cadeia pesada humana, um reagente policlonal específico de fc IgG anti-humano de cabra) conjugado a peroxidase de rábano picante (HRP) durante uma hora a 37°C. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato ABTS (Moss Inc, produto: ABTS-1000) e analisadas por um espectrofotômetro em OD 415-495. Soro de camundongo imunizado é então rastreado por citometria de fluxo para ligação a uma linhagem celular expressando ICOS humana, porém não a uma linhagem celular de controle que não expressa ICOS. Brevemente, a ligação de anticorpos anti-ICOS é avaliada incubando ICOS expressando células CHO com o anticorpo anti-ICOS em diluição de 1:20. As células são lavadas e ligação é detectada com um Ab de IgG anti-humano rotulado com PE. Análises citométricas de fluxo são realizadas usando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Preferivelmente, camundongos que desenvolvem os títulos mais elevados serão usados para fusões. Experimentos análogos podem ser realizados usando anticorpos de detecção anticamundongo se anticorpos anti-huICOS de camundongo devem ser detectados.

[00264] Um ELISA, por exemplo, como descrito acima pode ser usado para análise de anticorpos e, assim, hibridomas que produzem anticorpos que mostram reatividade positiva com o imunógeno ICOS. Hibridomas que produzem anticorpos que se ligam, preferivelmente com afinidade elevada, a ICOS podem então ser sub-clonados e em seguida caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células de origem (por ELISA), pode então ser escolhido para fazer um banco de células, e para purificação de anticorpo.

[00265] Para purificar anticorpos anti-ICOS, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos giratórios de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). IgG eluída pode ser checada por eletroforese de gel e cromatografia líquida e alto desempenho para garantir a pureza. A solução de tamponamento pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD 280 usando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

[00266] Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-ICOS se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). Ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda rotulada com estreptavidina. Estudos de competição usando anticorpos monoclonais não rotulados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados usando placas de ELISA revistas com ICOS como descrito acima.

[00267] Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, isótipo de ELISA pode ser realizado usando reagentes específicos para anticorpos de um isótipo particular. Por exemplo, para determinar o isótipo de um anticorpo monoclonal humano, cavidades de placas de microtítulo podem ser revestidas com 1 µg/ml de imunoglobulina anti- humana durante a noite a 4°C. Após bloqueio com 1% de BSA, as placas são reagidas com 1 µg /ml ou menos de anticorpos monoclonais testes ou controles de isótipo purificado, em temperatura ambiente durante uma a duas horas. As cavidades podem então ser reagidas com IgG1 Humana ou sondas conjugada a fosfatase alcalina específica de IgM humana. Placas são desenvolvidas e analisadas como descrito acima.

[00268] Para testar a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas expressando ICOS, citometria de fluxo pode ser usada. Brevemente, linhagens celulares expressando ICOS ligada a membrana (crescimento sob condições de crescimento padrão) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo 0,1% de BSA a 4°C durante uma hora. Após lavagem, as células são reagidas com Anticorpo anti-IgG rotulado com Ficoeritrina (PE) sob as mesmas condições que o manchamento de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por instrumento FACScan usando propriedades de luz e dispersão lateral para bloqueio em células individuais e ligação dos anticorpos rotulados é determinada. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado (em adição a ou ao invés de) o ensaio de citometria de fluxo. Células podem ser manchadas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência. Este método permite visualização de células individuais, porém pode diminuir sensibilidade dependendo da densidade do antígeno.

[00269] Anticorpos anti-huICOS podem também ser testados quanto à reatividade com o antígeno ICOS por Western blotting. Em síntese, extratos celulares de células expressando ICOS podem ser preparados e submetidos à eletroforese de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. Após eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 20% de soro de camundongo, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. Ligação a IgG pode ser detectada usando fosfatase alcalina anti-IgG e desenvolvida com comprimidos de substratos BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

[00270] Métodos para analisar afinidade de ligação, reatividade cruzada, e cinéticas de ligação de vários anticorpos anti-ICOS incluem ensaios padrões conhecidos na técnica, por exemplo, análise Biolayer Interferometry (BLI), e análise BIACORE® SPR usando um instrumento BIACORE® 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suécia).

[00271] Em uma modalidade, um anticorpo anti-huICOS especificamente se liga à região extracelular de ICOS humano. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a um domínio particular (por exemplo, um domínio funcional) dentro do domínio extracelular de ICOS. Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS especificamente se liga à região extracelular de ICOS humana e a região extracelular de ICOS de cinomolgos. Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS se liga a ICOS humana com alta afinidade. VIII. Moléculas Multiespecíficas

[00272] Em certas modalidades, anticorpos descritos aqui podem ser multiespecíficos, por exemplo, moléculas biespecíficas ou triespecíficas. Moléculas de ligação a antígeno multiespecífica, tal como anticorpos multiespecíficos, compreendem dois ou mais sítios de ligação a antígeno, cada um específico para um epítopo diferente. O epítopo diferente pode ser parte do mesmo ou de diferentes antígenos. Em uma modalidade, um sítio de ligação a antígeno é específico para ICOS de humano e os outros para um antígeno diferente. Em uma modalidade, um anticorpo anti-huICOS, ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, como descritos aqui é ligado a outra molécula de ligação a antígeno, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou um ligante para um receptor) tendo uma especificidade de ligação diferente para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. Em uma modalidade, o anticorpo descrito aqui é derivatizado ou ligado a mais de uma molécula de ligação a antígeno para gerar moléculas multiespecíficas que se liga a mais do que dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo. Portanto, fornecidas aqui são moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para ICOS e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em uma modalidade descrita aqui na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode também incluir uma terceira especificidade de ligação.

[00273] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas descritas aqui compreendem como uma especificidade de ligação em pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia simples. O anticorpo pode também ser um dímero de Cadeia Leve ou Cadeia Pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples como descrito em Ladner et al. Patente U.S. Nº. 4,946,778, os conteúdos do qual é expressamente incorporado por referência.

[00274] Enquanto anticorpos monoclonais humanos são preferidos, outros anticorpos que podem ser usados nas moléculas biespecíficas descritas aqui estão anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[00275] As moléculas biespecíficas descritas aqui podem ser preparadas conjugando as especificidades de ligação constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e conjugada a uma outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de reticulação pode ser usado para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodi-imida, N-sucinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'- ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-sucinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossucinimidil 4- (N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (veja, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. Nº. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis em Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[00276] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados por meio de ligação de sulfidrila das regiões de articulação de terminação C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, preferivelmente um, antes de conjugação.

[00277] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica tem uma combinação de especificidades de ligação tais como uma proteína de fusão (mAb x mAb), (mAb x Fab), (Fab x F(ab')2) ou (ligante x Fab). Uma molécula biespecífica descrita aqui pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, em Patente U.S. Número

5.260.203, Patente U.S. Número 5.455.030, Patente U.S. Número

4.881.175, Patente U.S. Número 5.132.405, Patente U.S. Número

5.091.513, Patente U.S. Número 5.476.786, Patente U.S. Número

5.013.653, Patente U.S. Número 5.258.498 e Patente U.S. Número

5.482.858.

[00278] Ligação das moléculas biespecíficas para seus alvos específicos pode ser confirmada usando métodos reconhecidos na técnica, tais como usando ELISA, radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio Western blot. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular empregando um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. IX. Composições

[00279] Também fornecidas são composições, por exemplo, composições farmacêuticas, contendo um ou mais anticorpos anti- ICOS, ou fragmento(s) de ligação a antígeno dos mesmos, como descrito aqui, formulados junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Portanto, as composições da presente invenção incluem os anticorpos anti-huICOS humanizados ou humanos (ou fragmentos de ligação a antígeno) dos mesmos tendo as sequências de CDR, as sequências região variável de cadeia leve e /ou pesada, ou as sequências de cadeia leve e/ou pesada de comprimento total em Tabela

35. Composições da presente invenção também incluem anticorpos anti-huICOS tendo sequências que são variantes das sequências estabelecidas em Tabela 35. Por exemplo, tais anticorpos podem compreender sequências que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de CDR, as sequências de região variável de cadeia leve e/ou pesada, ou sequências de cadeia leve e/ou pesada de comprimento total estabelecidas em Tabela 35.

[00280] Tais composições também incluem uma ou uma combinação de (por exemplo, duas ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas descritas aqui. Por exemplo, uma composição farmacêutica descrita aqui pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou anticorpos biespecíficos) que se ligam a diferente epítopos no antígeno alvo ou que têm atividades complementares.

[00281] Composições farmacêuticas descritas aqui também podem ser administradas como terapia de combinação, por exemplo, anticorpos anti-ICOS combinados com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-ICOS descrito aqui combinado com pelo menos outro agente anticâncer e/ou estimulante de célula T (por exemplo, de ativação). Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação são descritos em maiores detalhes abaixo na seção sobre usos dos anticorpos descritos aqui.

[00282] Em algumas modalidades, composições farmacêuticas divulgadas aqui podem incluir outros compostos, fármacos, e/ou agentes usados para o tratamento de câncer. Tais compostos, fármacos, e/ou agentes podem incluir, por exemplo, fármacos quimioterápicos, fármacos de molécula pequena ou anticorpos que estimulam a resposta imune a um determinado câncer. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um primeiro anticorpo específico para anti-huICOS e um segundo anticorpo.

[00283] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo estão presentes na composição em uma dose fixada (por exemplo, uma relação fixada). Em outras modalidades, esta dose fixada está entre pelo menos cerca de 1:200 a pelo menos cerca de 200:1, pelo menos cerca de 1:150 a pelo menos cerca de 150:1, pelo menos cerca de 1:100 a pelo menos cerca de 100:1, pelo menos cerca de 1:75 a pelo menos cerca de 75:1, pelo menos cerca de 1:50 a pelo menos cerca de 50:1, pelo menos cerca de 1:25 a pelo menos cerca de 25:1, pelo menos cerca de 1:10 a pelo menos cerca de 10:1, pelo menos cerca de 1:5 a pelo menos cerca de 5:1, pelo menos cerca de 1:4 a pelo menos cerca de 4:1, pelo menos cerca de 1:3 a pelo menos cerca de 3:1, ou pelo menos cerca de 1:2 a pelo menos cerca de 2:1 mg de anticorpo anti-huICOS para mg de segundo anticorpo. Em algumas modalidades, a dose fixada é pelo menos cerca de 1:1, cerca de 1:2, cerca de 1:3, cerca de 1:4, cerca de 1:5, cerca de 1:6, cerca de 1:7, cerca de 1:8, cerca de 1:9, cerca de 1:10, cerca de 1:15, cerca de 1:20, cerca de 1:30, cerca de 1:40, cerca de 1:50, cerca de 1:60, cerca de 1:70, cerca de 1:80, cerca de 1:90, cerca de 1:100, cerca de 1:120, cerca de 1:140, cerca de 1:160, cerca de 1:180, ou cerca de 1:200 anticorpo anti-huICOS para segundo anticorpo. Em algumas modalidades, a dose fixada é pelo menos cerca de 2:1, cerca de 3:1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6:1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1, cerca de 10:1, cerca de 15:1, cerca de 20:1, cerca de 30:1, cerca de 40:1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1, cerca de 100:1, cerca de 120:1, cerca de 140:1, cerca de 160:1, cerca de 180:1, ou cerca de 200:1 mg de primeiro anticorpo para mg de segundo anticorpo. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo anti- huICOS e o segundo anticorpo são administrados como descrito em Exemplo 18.

[00284] Os anticorpos adicionais incluem, por exemplo, um ou mais de um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-

PD-L1, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-OX40 (também conhecido como CD134, TNFRSF4, ACT35 e/ou TXGP1L), um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti- CD137, um anticorpo anti-CD27, ou um anticorpo anti-CSF-1R.

[00285] Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, e agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardamento de absorção, e similares que são fisicamente compatíveis. Em algumas modalidades, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Em algumas modalidades, o veículo é adequado para administração intravenosa. Em outras modalidades, o veículo é adequado para administração subcutânea. Em algumas modalidades, a composição compreendendo anticorpo anti-ICOS é liberada subcutaneamente usando tecnologia de liberação de fármaco Halozyme's ENHANZE®, que inclui uma enzima hialuronidase humana recombinante (rHuPH20) que temporariamente degrada hialuronano. Em algumas modalidades, a tecnologia de liberação de fármaco ENHANZE® permite administração subcutânea de composições que é mais rápida quando comparada a administração intravenosa. Em outras modalidades, dependendo da via de administração, o composto ativo, por exemplo, anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[00286] Os compostos farmacêuticos descritos aqui podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto origem e não transmite quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (veja, por exemplo, Berge, S.M., et al.

(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil- substituídos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, alifáticos e ácidos sulfônicos aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N- metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

[00287] Uma composição farmacêutica descrita aqui também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

[00288] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser usados nas composições farmacêuticas descritos aqui incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como etil oleato. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de surfactantes.

[00289] Estas composições podem também ser adjuvantes tais como preservativos, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção de presença de micro-organismos pode ser garantida por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão de agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico de fenol, e similares. Pode também ser desejável para incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[00290] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós-estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares aqui também incluem agentes de dispersão de fármaco intersticial tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX ™, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritas em Publicação de Patente U.S. Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais tais como condroitinases.

[00291] O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é compatível com o composto ativo, uso do mesmo nas composições farmacêuticas descritas aqui é contemplado. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

[00292] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida cerca de incluindo na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[00293] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por microfiltração de esterilização. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles descritos acima. No caso de pós-estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00294] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem irá variar dependendo do indivíduo sendo tratado, e o modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem irá geralmente ser aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Fora de cem por cento, esta quantidade pode variar de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, por exemplo, de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, por exemplo, de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00295] Em algumas modalidades, a composição inclui um anticorpo anti-ICOS, tal como o anticorpo S267E de IgG1f de ICOS.33, em uma concentração de 10 mg/mL. A composição é uma solução aquosa isotônica estéril, não pirogênica, de único uso, livre de preservativo para administração intravenosa. A composição pode ser administrada não diluída ou também diluída com 0,9% de injeção de cloreto de sódio para as concentrações de proteínas requeridas antes de infusão. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-ICOS inclui os seguintes excipientes: L-histina, monoidrato de cloridrato de L-histidina, sucarose, ácido pentacético (também conhecido como ácido dietilenotriaminapentaacético, polisorbato 80, e água para a injeção.

[00296] Regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas durante o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso para formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilitar administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como usado aqui se refere unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas de dosagem unitárias descritas aqui são ditadas por e diretamente dependente de (a) as características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[00297] Para administração do anticorpo, a dosagem pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. Alternativamente, administração do anticorpo é uma dose fixa que pode variar de 2 mg a 800 mg, por exemplo, uma dose de 25 mg, 80 mg, 200 mg, ou 400 mg. Um regime de tratamento exemplar implica administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses. Em algumas modalidades, o regime de tratamento inclui uma dose inicial, e então a dose de manutenção de uma quantidade de dose diferente em um intervalo de dose intermitente.

[00298] Em algumas modalidades, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, no caso a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro da faixa indicada. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico é administrado em múltiplas ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podem também ser irregulares como indicados por níveis sanguíneos de medição de anticorpo para o antígeno alvo no paciente. Em algumas modalidades, dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 a 1000 µg/ml e em alguns métodos cerca de 25 a 300 µg/ml.

[00299] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada. Administração por meio de formulações de liberação sustentada pode requerer administração menos frequente. Dosagem e frequência variam dependendo da meia vida do anticorpo no paciente. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento for profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em algumas modalidades, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é administrada para tratamento terapêutico. Em algumas modalidades, uma dosagem relativamente alta é administrada até progressão da doença ser reduzida ou terminada, por exemplo, até o paciente mostrar melhora parcial ou completa de sintomas da doença. Em algumas modalidades, um tratamento profilático é administrado ao paciente após um tratamento terapêutico.

[00300] Níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas descritas aqui podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica ao paciente. O nível de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares descritas aqui empregadas, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[00301] Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-ICOS descrito aqui preferivelmente resulta em uma diminuição na severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração de períodos livre de sintoma de doença, ou uma prevenção de deficiência ou incapacidade devido à aflição da doença. No contexto de câncer, uma dose terapeuticamente eficaz preferivelmente previne também deterioração de sintomas físicos associados com câncer. Sintomas de câncer são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aspectos de mole não usuais, uma alteração na aparência de um mole, incluindo assimetria, limites, cor e/ou diâmetro, uma área de pele recém-pigmentada, um mole anormal, área escurecida sob a unha, nódulos mamários, alterações nos mamilos, cistos mamários, dor no peito, morte, perda de peso, força, fadiga excessiva, dificuldade de comer, perda de apetite, tosse crônica, agravamento de falta de ar, tosse com sangue, sangue na urina, sangue nas fezes, náusea, vômito, metástases hepáticas, metástases pulmonares, metástases ósseas, plenitude abdominal, inchaço, fluido cavidade peritoneal, sangramento vaginal, constipação, distensão abdominal, perfuração de cólon, peritonites agudas (infecção, febre, dor), dor, vômito com sangue, transpiração intensa, febre, pressão sanguínea elevada, anemia, diarreia, icterícia, tontura, calafrios, espasmos musculares, metástases de cólon, metástases pulmonares, metástases da bexiga, metástases hepáticas, metástases ósseas, metástases renais, e metástases pancreáticas, dificuldade de deglutição, e similares. Eficácia terapêutica pode ser observável imediatamente após a primeira administração de um anticorpo monoclonal anti-huICOS agonístico da presente invenção, ou ela pode ser observada apenas após um período de tempo e/ou uma série de doses. Tal eficácia retardada pode apenas ser observada após muitos meses de tratamento, por exemplo, até 6, 9 ou 12 meses.

[00302] Uma dose terapeuticamente eficaz pode prevenir ou retardar início de câncer, tal como pode ser desejada quando sinais precoces ou preliminares da doença estão presentes. Portanto, qualquer ensaio clínico ou bioquímico que monitore qualquer um dos acima mencionados pode ser usado para determinar se um tratamento particular é uma dose terapeuticamente eficaz para tratamento de câncer. Aquele versado na técnica deve ser capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particular ou via de administração selecionada.

[00303] Uma composição descrita aqui pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração usando uma ou mais variedades de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo técnico versado, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Vias exemplares de administração para anticorpos descritos aqui incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão.

[00304] Alternativamente, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado por meio de uma via não parenteral tal como via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo,

intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.

[00305] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que irão proteger o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulada. Polímeros biocompatíveis, biodegradáveis podem ser usados, tal como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aquele versado na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York,

1978.

[00306] Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica descrita aqui pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal com os dispositivos divulgados em Patentes U.S. Nºs.

5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824, ou

4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos para uso com anticorpos anti-huICOS descritos aqui incluem: Patente U.S. Nº.

4.487.603, que descreve uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicação em uma taxa controlada; Patente U.S. Nº.

4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. Nº. 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicação para liberação de medicação em uma taxa de infusão precisa; U. S. Nº. 4.447.224, que descreve um aparato de infusão implantável de fluxo variável para liberação de fármaco contínua; Patente U.S. Nº. 4.439.196, que descreve um sistema de liberação de fármaco osmótica tendo compartimentos de múltiplas câmaras; e Patente U.S. Nº. 4.475.196, que descreve um sistema de liberação de fármaco osmótica. Estas patentes são incorporadas aqui por referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de liberação e módulos são bem conhecidos por aquele versado na técnica.

[00307] Em certas modalidades, os anticorpos anti-huICOS descritos aqui podem ser formulados para garantir distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos descritos aqui cruzam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, veja, por exemplo, Patentes U.S. 4.522.811;

5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, assim aumentam liberação de fármaco alvejada (veja, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porções de alvejamento exemplares incluem folato ou biotina (veja, por exemplo, Patente U.S. 5,416,016 para Low et al.); manosídeos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A surfactante (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

[00308] Também dentro do escopo descrito aqui estão kits compreendendo as composições de anticorpo descritas aqui (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode também conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos humanos adicionais descritos aqui. Kits podem incluir um rótulo indicando o uso destinado dos conteúdos do kit. O termo rótulo inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido no ou com o kit ou que, de outra forma, acompanha o kit. X. Métodos de Uso

[00309] Os anticorpos, composições de anticorpo e métodos descritos aqui têm números usos in vitro e in vivo envolvendo, por exemplo, aumento de resposta imune estimulando sinalização de ICOS. Em uma modalidade, os anticorpos descritos aqui são anticorpos humanos ou humanizados monoclonais. Em uma modalidade, anticorpos anti-huICOS descritos aqui (por exemplo, S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e 2644) podem ser administrados a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos para aumentar imunidade em uma variedade de doenças. Em uma modalidade particular, anticorpos agonísticos de anticorpos anti- huICOS, isto é, anti-huICOS agonista. Fornecidos aqui são métodos de modificação de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, descrito aqui de modo que a resposta imune no indivíduo é aumentada, estimulada ou regulada. Em uma modalidade, administração de um anticorpo anti-huICOS (por exemplo, o anticorpo anti-huICOS agonista) de acordo com os métodos descritos aqui aumentam coestimulação de respostas de célula T. Em uma modalidade, administração do anticorpo anti-huICOS de acordo com os métodos descritos aqui estimula, aumenta ou regula respostas de célula T específica de antígeno a um tumor. Um tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor líquido, por exemplo, uma malignidade hematológica. Em certas modalidades, um tumor é um tumor imunogênico. Em certas modalidades, um tumor é não imunogênico. Em certas modalidades, um tumor é PD-L1 positivo. Em certas modalidades um tumor é PD-L1 negativo. Um indivíduo pode também ser um indivíduo portador de vírus e uma resposta imune contra o vírus é aumentada. Em uma modalidade, administração do anticorpo anti- huICOS de acordo com os métodos descritos aqui estimula, aumenta ou regula respostas de célula T CD4+ e CD8+. As células T podem ser células Teff, por exemplo, células Teff CD4+, células Teff CD8+, células T helper (Th) e células T citotóxicas (Tc).

[00310] Em uma modalidade, os métodos resultam em um aumento de uma resposta imune em um ser humano onde tal aumento tem um efeito desejável. Em uma modalidade, o ser humano é um paciente humano tendo um distúrbio que pode ser tratado aumentando uma resposta imune, por exemplo, a resposta imune mediada por célula T. Em uma modalidade particular, o paciente humano tem um câncer. Em uma modalidade, anticorpos anti-huICOS descritos aqui podem ser administrados juntos com um antígeno de interesse ou o antígeno pode já estar presente no indivíduo a ser tratado, por exemplo, um indivíduo portando tumor ou portando vírus. Quando anticorpos para ICOS são administrados juntos com outro agente, os dois podem ser administrados separadamente ou simultaneamente.

[00311] Também fornecidos são métodos para inibição de crescimento de uma célula de tumor em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti-huICOS descrito aqui de modo que crescimento da célula de tumor é inibido no indivíduo. Também fornecidos são métodos de tratamento de infecção viral crônica em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti-huICOS descrito aqui de modo que a infecção viral crônica é tratada no indivíduo.

[00312] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS agonista é administrado a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, como uma terapia auxiliar, terapia adjuvante, ou terapia neo-

adjuvante. Em algumas modalidades, tratamentos de indivíduos tendo câncer com um anticorpo anti-huICOS pode levar a uma resposta duradoura a longo prazo em relação ao padrão atual de cuidado; sobrevivência a longo prazo de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos, sobrevivência livre de recorrência de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais anos. Em certas modalidades, tratamento de um indivíduo tendo câncer com um anticorpo anti-huICOS previne recorrência de câncer ou retarda recorrência de câncer por, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais anos. Um tratamento com anti-ICOS pode ser usado como uma primeira, segunda, ou subsequente linha de tratamento.

[00313] Estes e outros métodos descritos aqui são descritos em mais detalhes abaixo. Câncer

[00314] Fornecidos aqui são métodos para tratamento de um indivíduo tendo câncer, compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti-huICOS descrito aqui, de modo que o indivíduo seja tratado, por exemplo, de modo que crescimento de tumores cancerosos seja inibido ou reduzido e/ou que o tumor regresse. Um anticorpo anti- huICOS pode ser usado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerosos. Alternativamente, um anticorpo anti-huICOS pode ser usado em conjunto com outro agente, por exemplo, outros agentes imunogênicos, tratamentos de câncer padrões, ou outros anticorpos, como descrito abaixo. Combinação com um inibidor de PD-1, tal como um anticorpo anti-PD-1 ou um anti-PD-L1, é também fornecida. Combinação com um inibidor de CTLA-4, tal como um anticorpo anti- CTLA-4, é também fornecida. Combinação com um inibidor de PD-1 e um inibidor de CTLA-4 é também fornecida.

[00315] Em um aspecto, fornecidos aqui são métodos de tratamento de câncer em um indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti- huICOS descrito aqui, por exemplo, uma forma humanizada de um anticorpo anti-ICOS de hamster ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, ou um anticorpo anti- huICOS humanizado, por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti- huICOS humanizados descritas aqui. Em uma modalidade, os métodos de tratamento de um câncer descritos aqui compreendem administração de um anticorpo anti-huICOS humanizado que contata ICOS humana em um ou mais resíduos de aminoácido de SEQ ID Nº: 203 de proteína ICOS humana. Em outra modalidade, o método compreende administração de anticorpo S267E de IgG1f de ICOS.33. Em outra modalidade, o método compreende administração de uma composição compreendendo anticorpo S267E de IgG1f de ICOS.33.

[00316] Exemplos de câncer incluem, porém não estão limitados a, carcinoma de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena (SCLC), câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de pulmão de célula não pequena escamosa (NSCLC), não NSCLC, glioma, câncer gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carcinoma de célula clara), câncer de ovário, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de endométrio, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais), câncer da próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônio), câncer da tireoide, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), câncer cervical, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon, e câncer de cabeça e pescoço (ou carcinoma), câncer gástrico, tumor de célula germinativa, sarcoma pediátrico, exterminadora natural sinonasal, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático, tal como melanoma maligno cutâneo ou intraocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer de útero, câncer da região anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma de endométrio, carcinoma de cérvix, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, câncer de esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos de infância, câncer do ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), linfoma de CNS primário, angiogênese de tumor, tumor de eixo espinhal, câncer de cérebro incluindo glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cânceres induzidos ambientalmente incluindo aqueles induzidos por asbestos, cânceres relacionados a vírus (por exemplo, tumor relacionado a papiloma vírus humano (HPV)), e malignidades hematológicas derivadas ou das duas linhagens de células sanguíneas principais, por exemplo, a linhagem celular mieloide (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, macrófagos, e mastócitos) ou linhagem celular linfoide (que produz B, T, NK, e plasmócitos), tal como todos os tipos de leucemia, linfomas, e mielomas, por exemplo, leucemias agudas, crônicas, linfocíticas e/ou mielógenas, tais como leucemia aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), e leucemia mielógena crônica (CML), AML indiferenciada (M0), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou variante de M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 ou variante de M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico isolado, e cloroma; linfomas, tais como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma de não Hodgkin (NHL), linfomas de célula B, linfomas de célula T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de célula B monocitoide, linfoma de tecido linfoide associado a mucosa (MALT), linfoma de célula grande anaplásico (por exemplo, Ki 1+), linfoma/leucemia de célula T adulta, linfoma de célula do manto, linfoma de célula T angio imunoblástica, linfoma angiocêntrico, linfoma de célula T intestinal, linfoma de célula B mediastinal primária, linfoma linfoblástico T precursor, T linfoblástico; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de célula T periférica, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoprofilativo pós- transplante, linfoma histiocístico verdadeiro, linfoma de sistema nervoso central primário, linfoma de efusão primária, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma de célula grande imunoblástica, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de célula T cutânea (CTLC) (também denominada síndrome de micose fungoide ou Sezary), e linfoma linfoplasmacitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tais como mieloma de IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretório, mieloma latente (também denominado mieloma indolente), plasmocitoma solitário, e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula capilar; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores dos nervos central e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular de tireoide e teratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, por exemplo tumores de célula T e B, incluindo, porém não limitados a distúrbios de célula T tais como leucemia prolinfocítica T (T-PLL), incluindo da célula pequena e tipo celular cerebriforme; leucemia de linfócito granular grande (LGL) preferivelmente do tipo de célula T; a/d linfoma hepatoesplênico T-NHL;

linfoma de célula T periférica/pós-tímico (sub-tipos pleomórficos e imunoblástico); linfoma de célula T angiocêntrica (nasal); câncer da cabeça e ou pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como quaisquer combinações dos referidos cânceres. Em uma modalidade, os métodos descritos aqui podem também ser usados para tratamento de cânceres metastáticos, cânceres refratários (por exemplo, cânceres refratários a imunoterapia anterior, por exemplo, com bloqueio de anticorpo CTLA-4 e/ou PD-1), e cânceres recorrentes.

[00317] Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS pode ser administrado como uma monoterapia. Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS agonista é administrado como o único agente estimulante. Em uma modalidade, o anticorpo agonista ICOS anti-humano é administrado a um paciente com outro agente. Em uma modalidade, um anticorpo anti-huICOS é administrado com um agente imunogênico. Em uma modalidade, o anticorpo agonista ICOS anti-humano é administrado em conjunto com uma vacina de câncer. Em algumas modalidades, a vacina de câncer compreende células cancerosas, antígenos de tumor purificado (incluindo proteínas recombinantes, peptídeos, e moléculas de carboidrato), células, e células transfectadas com genes codificando citocinas de estimulação imune (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Em algumas modalidades, a vacina de câncer é uma vacina de câncer de peptídeo, que em algumas modalidades é uma vacina de peptídeo personalizada. Em algumas modalidades a vacina de câncer de peptídeo é um peptídeo longo multivalente, um multipeptídeo, um coquetel de peptídeo, um peptídeo híbrido, ou uma vacina de célula dendrítica pulsada com peptídeo (veja, por exemplo, Yamada et al., Cancer Sci, 104:14-21, 2013). Em algumas modalidades, um anticorpo agonista ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com um adjuvante. Exemplos não limitantes de vacinas de tumor que podem ser usadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tal como peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, ou células de tumor transfectadas para expressar a citocina GM-CSF. Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores têm sido concebidas (veja, Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; ver também Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition). Em uma destas estratégias, uma vacina é preparada usando células de tumor autólogas ou alogênicas. Estas vacinas celulares foram mostradas serem eficazes quando as células de tumor são transfectadas para expressar GM-CSF. GM-CSF mostrou ser um potente ativador de apresentação de antígeno para vacinação de tumor. Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43.

[00318] Outras vacinas de câncer podem incluir as proteínas de viroses implicadas em cânceres humanos tais como um Papiloma Vírus Humano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus do Sarcoma do Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma de antígeno específico de tumor que pode ser usado em conjunto com inibição de ICOS são proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do tecido de tumor em si. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células de tumor e estas HSPs são altamente eficientes em liberação de células apresentando antígeno para provocar imunidade de tumor (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).

[00319] Células dendríticas são potentes células apresentando antígeno que podem ser usadas para gerar respostas específicas de antígeno. Células dendríticas podem ser produzidas ex vivo e carregadas com várias proteínas e antígenos de peptídeo bem como extratos celulares de tumor (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328- 332). Células dendríticas podem também ser transduzidas por meios genéticos para expressar aqueles antígenos de tumor também. DCs foram também fundidas diretamente às células de tumor para os propósitos de imunização (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332- 336). Como um método de vacinação, imunização por célula dendrítica pode eficazmente combinada com agonismo de ICOS para ativar (desencadear) mais respostas antitumorais potentes.

[00320] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano é administrado em conjunto com padrão de cuidado, por exemplo, cirurgia, radiação e/ou quimioterapia. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-ICOS pode ser administrado em conjunto com um agente quimioterápico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-ICOS é administrado em conjunto com um ou mais de carboplatina, cisplatina, paclitaxel, nab-paclitaxel, gencitabina ou FOLFOX. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de anti- humano pode ser administrado em conjunto com carboplatina ou nab- paclitaxel. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com carboplatina e paclitaxel. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com cisplatina e pemetrexed. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com cisplatina e gencitabina. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com FOLFOX. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com FOLFIRI. Em uma modalidade, um anticorpo anti-huICOS é administrado em combinação com decarbazina para o tratamento de melanoma. Em algumas modalidades, cisplatina é intravenosamente administrada como uma dose de 100 mg/ml uma vez a cada quatro semanas. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista de ICOS anti-humano pode ser administrado em conjunto com doxorubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina de cisplatina, carmustina, clorambucila, dacarbazina e/ou hidroxiureia de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, adriamicina é intravenosamente administrada como uma dose de 60 mg/ml a 75 mg/ml uma vez a cada 21 dias. Em uma modalidade, o anticorpo anti- huICOS é administrado a um paciente humano que é resistente ao tratamento com pelo menos um fármaco, em que administração do anticorpo anti-huICOS reduz, alivia, ou anula a resistência a pelo menos um fármaco.

[00321] As terapias de combinação observadas acima englobam administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma ou em formulações separadas), e administração separada, no caso, administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes de, simultaneamente, e/ou após, administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com terapia de radiação.

[00322] Outro exemplo de tal combinação é um anticorpo anti- huICOS em combinação com interleucina-2 (IL-2). Em algumas modalidades, a combinação de anticorpo anti-huICOS e IL-2 é para tratar vários cânceres, incluindo para o tratamento de carcinoma de célula renal e melanoma. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- huICOS descritos aqui são combinados com um agonista de via de IL-2 para tratar vários cânceres. A combinação inclui vários agonistas de via de IL-2, tais como aqueles descritos em WO 2012/065086 (Nektar Therapeutics) e WO 2015/125159 (Nektar Therapeutics), os conteúdos do qual são incorporados por referência em sua integridade. WO

2006/138572 (Nektar Therapeutics) fornece conjugados tendo uma ligação degradável e reagentes poliméricos úteis na preparação de tais conjugados, bem como métodos de produção de reagentes poliméricos e conjugados, e é incorporado por referência em sua integridade.

[00323] Em algumas modalidades, a combinação de um anticorpo anti-huICOS como descrito aqui, tal como ICOS.33 IgG1 S267E, e um agonista de via de IL-2, tal como NKTR-214, é administrado a pacientes para tratar câncer. Como descrito em mais detalhes abaixo, NKTR-214 é produzido conjugando uma média de cerca de seis reagentes de polietileno glicol (PEG) com base em FMOC (cloreto de fluorenilmetiloxicarbonila) tendo a seguinte estrutura derivado de (mPEG2-C2-fomc-20K-N-Hidroxissucinimidato, 20 kDa, ("mPEG2-C2- fmoc-20K-NHS"): a uma proteína tendo a seguinte Sequência de Aminoácido 132:

[00324] PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTF KFYMPKKATELKHLQCLEE 60

[00325] ELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMC EYADETATIVEFLNRW 120

[00326] ITFSQSIISTLT 132 (SEQ ID Nº: 219)

[00327] WO 2012/065086 fornece conjugados de uma porção de IL- 2 e um ou mais polímeros não peptídeos, solúveis em água, incluindo polietileno glicol ou um derivado do mesmo. Especificamente, exemplo 2 (parágrafos 202-204) de WO 2012/065086 descreve PEGilação de rIL- 2 com mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS para resultar na estrutura de mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS fornecida acima. Exemplo 1 (parágrafos 63- 66) WO 2015/125159 descreve uma abordagem ampliada para PEGilação de IL-2 com mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS que resulta em RSLAIL-2 (NKTR-214). NKTR-214 é uma citocina que é designada para alvejar CD122, (também conhecido como sub-unidade beta de receptor de interleucina-2, IL-2Rβ), uma proteína encontrada em certas células imunes (por exemplo, Células T CD8+ e Células NK), para expandir estas células para promover seus efeitos antitumoral.

[00328] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS pode ser administrado em combinação com um agente anti-angiogênico.

[00329] Outras terapias de combinação que podem resultar em sinergia com agonismo de ICOS por meio de morte celular são radiação, cirurgia, e privação hormonal.

[00330] Em algumas modalidades, anticorpos anti-huICOS descritos aqui podem ser administrados em conjunto com anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos podem ser usados para alvejar dois antígenos separados. Em uma modalidade, anticorpos anti- huICOS são usados em combinação com anticorpos biespecíficos que alvejam células efetoras expressando receptor Fcα ou Fcγ para células de tumor (veja, por exemplo, Patente U.S. Nºs. 5.922.845 e 5.837.243). Por exemplo, anticorpos biespecíficos de receptor anti-Fc /antígeno antitumoral (por exemplo, Her-2/neu) foram usados para alvejar macrófagos no sítio do tumor. Em uma modalidade, o braço de célula T destas respostas é aumentado por agonismo de ICOS com um anticorpo anti-huICOS. Alternativamente, antígeno pode ser liberado diretamente para DCs pelo uso de anticorpos biespecíficos que se ligam a antígeno de tumor e um marcador de superfície celular específico de célula dendrítica. Em algumas modalidades, anticorpos anti-huICOS são usados em combinação com anticorpos que reduzem ou inativam as proteínas imunossupressivas expressas por um tumor, por exemplo,

anticorpos anti-TGF-β, anticorpos anti-IL-10, e anticorpos de ligante anti-Fas. Infecções Virais Crônicas

[00331] Em outro aspecto, a invenção descrita aqui fornece um método de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti- huICOS, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de modo que o indivíduo é tratado para a doença infecciosa.

[00332] Similar a sua aplicação em tumores como descrito acima, agonismo de ICOS mediado por anticorpo pode ser usado sozinho, ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para melhorar resposta imune a patógenos, toxinas e autoantígenos. Exemplos de patógenos para os quais este método terapêutico pode ser particularmente útil incluem patógenos para os quais não existe vacina eficaz atualmente, ou patógenos para os quais vacinas convencionais são menos do que completamente eficazes. Estes incluem, porém não estão limitados a HIV, Hepatite (A, B, & C), Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Agonismo de ICOS é particularmente útil contra infecções estabelecidas por agentes tais como vírus da imunodeficiência humana (HIV) que apresenta antígenos alterados durante o curso das infecções. Estes novos epítopos são reconhecidos como estranhos no tempo de administração anticorpo ICOS anti-humano, assim provocando uma forte resposta de célula T.

[00333] Alguns exemplos de vírus patogênicos que causam infecções tratáveis por métodos descritos aqui incluem HIV, hepatite (A, B, ou C), vírus da herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, e CMV, vírus Epstein Barr), adenovírus, vírus influenza, flavivírus, ecovírus, rinovírus, vírus coxsackie, coronavírus, vírus sincitial respiratório, vírus da caxumba, rotavírus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus de vaccinia, vírus HTLV, vírus da dengue, papilomavírus, vírus de molusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus da encefalite arboviral.

[00334] Alguns exemplos de bactéria patogênica que causam infecções tratáveis por métodos descritos aqui incluem clamídia, bactérias rickettsiais, micobactéria, estafilococo, estreptococo, pneumonococo, meningococo e gonococo, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilo, cólera, tétano, botulismo, antraz, praga, leptospirose, e bactéria da doença de Lyme.

[00335] Alguns exemplos de fungos patogênicos que causam infecções tratáveis por métodos descritos aqui incluem Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

[00336] Alguns exemplos de parasitas patogênicos que causam infecções tratáveis por métodos descritos aqui incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.

[00337] Os métodos descritos aqui de administração de anticorpos anti-huICOS a um indivíduo podem ser combinados com outras formas de imunoterapia tal como tratamento com citocina (por exemplo, interferons, GM-CSF, G-CSF, IL-2), ou terapia de anticorpo biespecífico. Terapia de Combinação

[00338] Em um aspecto, fornecidos aqui são métodos de terapia de combinação, por exemplo, para o tratamento de câncer, no qual um anticorpo anti-huICOS (por exemplo, um anticorpo anti-huICOS agonista) é administrado em conjunto com um ou mais agentes adicionais, por exemplo, anticorpos, que são eficazes no estímulo de respostas imunes para, deste modo, aumentar, estimular ou regular respostas imunes em um indivíduo. Fornecidos aqui são métodos para tratamento ou retardamento de progressão de câncer em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de um anticorpo anti- huICOS (por exemplo, S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, w 2644) em conjunto com outro agente anticâncer ou terapia de câncer. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS pode ser administrado em conjunto com uma quimioterapia ou agente quimioterápico ou com uma terapia de radiação ou agente radioterapêutico, como descrito acima. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS pode ser administrado em conjunto. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS pode ser administrado em conjunto com uma terapia alvejada ou agente terapêutico alvejado. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS pode ser administrado em conjunto com uma imunoterapia ou agente imunoterápico, por exemplo, um anticorpo monoclonal.

[00339] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-huICOS descrito aqui pode ser combinado com (i) um agonista de outro receptor co-estimulatório e/ou (ii) um antagonista de um sinal inibitório em células T. Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreendendo um anticorpo anti-huICOS e o agonista e/ou antagonista resulta em uma resposta de célula T específica de antígeno aumentada em um indivíduo. Em algumas modalidades, anticorpos anti- ICOS descritos aqui podem ser administrados em conjunto com um agente que alveja moléculas co-estimulatórias e co-inibitórias que são membros da superfamília de imunoglobulinas (IgSF) para aumentar uma resposta imune. Em algumas modalidades, anticorpos anti-ICOS (por exemplo, S267E de IgG1f de ICOS.33, 17C4, 9D5, 3E8, 1D7, e

2644) descritos aqui podem ser administrados em conjunto com um agente que alveja um ligante de uma molécula co-estimulatória ou co- inibitória. Uma família de ligantes ligados à membrana que se liga a receptores coestimulatórios ou co-inibitórios é a família B7, que inclui B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), e B7-H6. Outra família de ligantes ligados à membrana que se ligam a receptores coestimulatórios ou co-inibitórios é a família TNF de moléculas que se ligam a membros da família de receptor de TNF cognato, que incluem CD40, CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137/4-1BB, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, Linfotoxina α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR.

[00340] Em outro aspecto, anticorpos anti-huICOS podem ser usados em combinação com antagonistas de citocinas que inibem ativação de célula T (por exemplo, IL-6, IL-10, TGF-ß, VEGF; ou outras "citocinas imunossupressivas," ou citocinas que estimulam ativação de célula T, para estimular uma resposta imune, por exemplo, para tratamento de doenças proliferativas, tal como câncer.

[00341] Em um aspecto, respostas de célula T são estimuladas por uma combinação de um anticorpo anti-huICOS descrito aqui e um ou mais de (i) um antagonista de uma proteína que inibe ativação de célula T (por exemplo, inibidores de ponto de verificação imune) tal como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, e TIM-4, e (ii) um agonista de uma proteína que estimula ativação de célula T tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD40, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, DR3 e CD28H.

[00342] Agentes exemplares que modulam uma das proteínas acima e podem ser combinados com anticorpos anti-huICOS agonistas, por exemplo, aqueles descritos aqui, para tratamento de câncer, incluem: YERVOY®/ipilimumabe ou tremelimumabe (para CTLA-4), galiximabe (para B7.1), BMS-936558 (para PD-1), pidilizumabe/CT-011 (para PD- 1), KEYTRUDA®/pembrolizumabe/MK-3475 (para PD-1), AMP224 (para B7-DC/PD-L2), BMS-936559 (para B7-H1), MPDL3280A (para B7-H1), CP-870893 ou dacetuzumabe/SGN-40 (CD40 – Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309; Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035), AMG557 (para B7H2), MGA271 (para B7H3 – WO 11/109400), IMP321 (para LAG-3), urelumabe/BMS-663513 e PF- 05082566 (para CD137/4-1BB), varlilumabe/CDX-1127 (para CD27), MEDI-6383 e MEDI-6469 (para OX40), RG-7888 (para OX40L – WO 06/029879), Atacicept (para TACI), muromonabe-CD3 (para CD3), ipilumumabe (para CTLA-4). Portanto, em uma modalidade um anticorpo anti-huICOS (tal como S267E de IgG1f de ICOS.33) é combinado com um anticorpo anti-PD-1 (tal como nivolumabe) e/ou um anticorpo anti-CTLA-4 (tal como ipilimumabe).

[00343] Outras moléculas que podem ser combinadas com anticorpos anti-huICOS agonistas para o tratamento de câncer incluem antagonistas de receptores inibitórios em células NK ou agonistas de receptores de ativação em células NK. Por exemplo, anticorpos anti- huICOS agonistas podem ser combinados com antagonistas de KIR (por exemplo, lirilumabe).

[00344] Ainda outros agentes para terapias de combinação incluem agentes que inibem ou esgotam macrófagos ou monócitos, incluindo, porém não limitado a antagonistas de CSF-1R tais como anticorpos antagonistas de CSF-1R incluindo RG7155 (WO 11/70024, WO 11/107553, WO 11/131407, WO 13/87699, WO 13/119716, WO 13/132044) ou FPA-008 (WO 11/140249; WO 13/169264; WO 14/036357).

[00345] Em algumas modalidades, anticorpos anti-huICOS agonistas descritos aqui são usados com um ou mais agentes agonísticos que se ligam a receptores coestimulatórios positivos, agentes de bloqueio que atenuam sinalização através de receptores inibitórios, e um ou mais agentes que aumentam sistematicamente a frequência de células T antitumoral, agentes que resultam em vias supressivas imunes dentro do microambiente de tumor (por exemplo, bloqueio de envolvimento do receptor inibitório (por exemplo, interações PD-L1/PD-1), esgotam ou inibem (por exemplo, usando um anticorpo anti-CD25 monoclonal (por exemplo, daclizumabe) ou por depleção de contas anti-CD25 ex vivo), inibem enzimas metabólicas tais como IDO, ou revertem/previnem anergia ou exaustão de célula T) e agente que desencadeiam ativação imune inata e/ou inflamação no sítio de tumor.

[00346] Fornecidos aqui são métodos para estímulo de uma resposta imune em um indivíduo que compreende administração a um indivíduo de um agonista de ICOS, por exemplo, um anticorpo, e um ou mais anticorpos imunoestimulatórios adicionais, tais como um antagonista de PD-1, por exemplo, anticorpos antagonistas, um antagonista de PD-L1, por exemplo, anticorpo antagonista, um antagonista de CTLA-4, por exemplo, anticorpo antagonista e/ou um antagonista de LAG3, por exemplo, um anticorpo antagonista, de modo que uma resposta imune seja estimulada no indivíduo, por exemplo, para inibir crescimento de tumor, ou para estimular uma resposta antiviral. Em uma modalidade, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-huICOS agonista e um anticorpo anti-PD-1 antagonista. Em uma modalidade, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-huICOS agonista e um anticorpo anti- PD-L1 antagonista. Em uma modalidade, ao indivíduo é administrado um anticorpo anti-huICOS agonista e um anticorpo anti-CTLA-4 antagonista. Em uma modalidade, pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 antagonista, um anti-PD-L1 antagonista, anti-CTLA-4 antagonista e/ou um anti-LAG3 antagonista) é um anticorpo humano. Alternativamente, pelo menos um anticorpo imunoestimulatório adicional pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado (por exemplo, preparado de um anticorpo anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 e/ou anti-LAG3 de camundongo ou hamster).

[00347] Fornecidos aqui são métodos para tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), que compreende administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e um anticorpo PD-1 antagonista a um indivíduo. Em algumas modalidades o câncer é câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC) ou câncer colorretal (CRC). Em algumas modalidades o câncer é caracterizado por tumores com (i) expressão elevada de CD32A/CD32B (FcγRIIa/Fcγ), e/ou (ii-a) expressão elevada de ICOS ou (ii-b) expressão reduzida de ICOS-L, por exemplo, como detectado por citometria de fluxo ou imuno-histoquímica (IHC). Tipos de tumor com expressão de RNA de ICOS moderada a elevada incluem cânceres de cabeça e pescoço, pulmão, cervical, renal, pancreático, de mama e colorretal, sugerindo que estes cânceres podem também exibir expressão de proteína ICOS elevada. Em certas modalidades, o agonista é administrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-1 é administrado em uma dose subterapêutica, ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica. Também fornecidos aqui são métodos para alteração de um evento adverso associado com tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório. Em uma modalidade, o método compreende administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-PD-1 a um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é um anticorpo monoclonal humano e o anticorpo anti-huICOS agonista é um anticorpo monoclonal humanizado, tal como um anticorpo compreendendo as CDRs ou regiões variáveis dos anticorpos divulgados aqui.

[00348] Anticorpos anti-PD-1 que são conhecidos na técnica podem ser usados nos métodos presentemente descritos. Vários anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a PD-1 com alta afinidade foram descritos em Patente U.S. Nº. 8.008.449. Anticorpos humanos anti-PD-1 divulgados em Patente U.S. Nº. 8.008.449 foram mostrados exibir uma ou mais das seguintes características: (a) se ligam a PD-1 humano com um KD de 1 x 10-7 M ou menos, como determinado pela ressonância de plasmônio de superfície usando um sistema de biossensor Biacore; (b) não se ligam substancialmente a CD28, CTLA- 4 ou ICOS humanos; (c) aumentam proliferação de célula T em um ensaio de Reação de Linfócito Misturado (MLR); (d) aumentam produção de interferon-γ em um ensaio de MLR; (e) aumentam secreção de IL-2 em um ensaio de MLR; (f) se ligam a PD-1 humano e PD-1 de macaco cinomolgo; (g) inibem a ligação de PD-L1 e/ou PD-L2 a PD-1; (h) estimulam respostas de memória específicas de antígeno; (i) estimulam respostas de anticorpo; e (j) inibem crescimento celular de tumor in vivo. Anticorpos anti-PD-1 úteis na presente invenção incluem anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a PD-1 humano e exibem pelo menos uma, em algumas modalidades, pelo menos cinco, das características precedentes.

[00349] Outros anticorpos monoclonais anti-PD-1 foram descritos em, por exemplo, Patentes U.S. Nºs. 6.808.710, 7.488.802, 8.168.757 e

8.354.509, Publicação U.S. Nº. 2016/0272708, e Publicações PCT Nºs. WO 2012/145493, WO 2008/156712, WO 2015/112900, WO 2012/145493, WO 2015/112800, WO 2014/206107, WO 2015/35606, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2017/020291, WO 2017/020858, WO 2016/197367, WO 2017/024515, WO 2017/025051, WO 2017/123557, WO 2016/106159, WO 2014/194302, WO

2017/040790, WO 2017/133540, WO 2017/132827, WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/106061, WO 2017/19846, WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, e WO 2017/133540 cada uma das quais é incorporada por referência em sua íntegra.

[00350] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumabe (também conhecido como OPDIVO®, 5C4, BMS-936558, MDX-1106, e ONO-4538), pembrolizumabe (Merck; também conhecido como KEYTRUDA®, lambrolizumabe, e MK-3475; veja WO2008/156712), PDR001 (Novartis; veja WO 2015/112900), MEDI- 0680 (AstraZeneca; também conhecido como AMP-514; veja, WO 2012/145493), cemiplimabe (Regeneron; também conhecido como REGN-2810; veja WO 2015/112800), JS001 (TAIZHOU JUNSHI PHARMA; veja, Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)), BGB-A317 (Beigene; veja WO 2015/35606 e US 2015/0079109), INCSHR1210 (Jiangsu Hengrui Medicine; também conhecido como SHR-1210; veja WO 2015/085847; Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)), TSR-042 (Tesaro Biopharmaceutical; também conhecido como ANB011; veja WO2014/179664), GLS-010 (Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals; também conhecido como WBP3055; veja Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)), AM-0001 (Armo), STI-1110 (Sorrento Therapeutics; veja WO 2014/194302), AGEN2034 (Agenus; veja WO 2017/040790), MGA012 (Macrogenics, veja WO 2017/19846), ou IBI308 (Innovent; veja WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, e WO 2017/133540).

[00351] Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumabe. Nivolumabe é um anticorpo inibidor de ponto de verificação imune de PD-1 de IgG4 completamente humana (S228P) que seletivamente previne interação com ligantes PD-1 (PD-L1 e PD-L2), desse modo bloqueando a regulação de funções de célula T antitumor (Patente U.S.

Nº. 8.008.449; Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56).

[00352] Em outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizumabe. Pembrolizumabe é um anticorpo de IgG4 monoclonal humanizado (S228P) direcionado contra receptor PD-1 de superfície celular humana (morte programada 1 ou morte celular programada 1). Pembrolizumabe é descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nºs.

8.354.509 e 8.900.587.

[00353] Os anticorpos anti-PD-1 utilizáveis nos métodos descritos também incluem anticorpos isolados que se ligam especificamente à PD-1 humana e competem de forma cruzada pela ligação à PD-1 humana com qualquer anticorpo anti-PD-1 descrito aqui, por exemplo, nivolumabe (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nºs. 8.008.449 e

8.779.105, WO 2013/173223). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 liga-se ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-PD-1 aqui descritos, por exemplo, nivolumabe. A capacidade dos anticorpos para competir de forma cruzada pela ligação a um antígeno indica que estes anticorpos monoclonais se ligam à mesma região de epítopo do antígeno e impedem estericamente a ligação de outros anticorpos de competição de modo cruzado a essa região de epítopo particular. Espera-se que estes anticorpos de competição de modo cruzado tenham propriedades funcionais muito similares àquelas do anticorpo de referência, por exemplo, nivolumabe, em virtude da sua ligação à mesma região de epítopo de PD-1. Anticorpos de competição de modo cruzado podem ser facilmente identificados com base na sua capacidade de competir de forma cruzada com nivolumabe em ensaios de ligação de PD-1 padrão, tais como análise Biacore, ensaios de ELISA ou citometria de fluxo (ver, por exemplo, WO 2013/173223).

[00354] Em certas modalidades, os anticorpos que competem de forma cruzada pela ligação à PD-1 humana com, ou se ligam à mesma região de epítopo do anticorpo humano PD-1, nivolumabe, são anticorpos monoclonais. Para administração a indivíduos humanos, estes anticorpos de competição de modo cruzado são anticorpos quiméricos, anticorpos modificados ou anticorpos humanizados ou humanos. Tais anticorpos monoclonais quiméricos, modificados, humanizados ou humanos podem ser preparados e isolados por métodos bem conhecidos na técnica.

[00355] Os anticorpos anti-PD-1 utilizáveis nos métodos da invenção descrita também incluem porções de ligação ao antígeno dos anticorpos acima. Foi amplamente demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural.

[00356] Os anticorpos anti-PD-1 adequados para utilização nos métodos ou composições descritos são anticorpos que se ligam a PD- 1 com elevada especificidade e afinidade, bloqueiam a ligação de PD- L1 e/ou PD-L2 e inibem o efeito imunossupressor da via de sinalizção de PD-1. Em qualquer das composições ou métodos aqui descritos, um "anticorpo" anti-PD-1 inclui uma porção de ligação ao antígeno ou fragmento que se liga ao receptor PD-1 e exibe as propriedades funcionais similares àquelas de anticorpos totais na inibição da ligação do ligante e super-regulação do sistema imunológico. Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compete de modo cruzado com nivolumabe para ligação à PD-1 humana.

[00357] São aqui fornecidos métodos para o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e um anticorpo antagonista PD-L1 a um indivíduo. Em certas modalidades, o anticorpo anti-huICOS agonista é administrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-PD-L1 é administrado em uma dose subterapêutica ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica. São aqui fornecidos métodos para alterar um evento adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-PD- L1 a um indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anticorpo anti-huICOS agonista é um anticorpo monoclonal humanizado, tal como um anticorpo compreendendo as CDRs ou regiões variáveis dos anticorpos aqui descritos.

[00358] Os anticorpos anti-PD-L1 que são conhecidos na técnica podem ser utilizados nos métodos da presente invenção. Exemplos de anticorpos anti-PD-L1 úteis nos métodos da presente invenção incluem os anticorpos descritos na Patente U.S. Nº. 9.580.507. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PD-L1 descritos na Patente U.S. Nº.

9.580.507 demonstraram exibir uma ou mais das seguintes características: (a) ligar-se à PD-L1 humana com uma KD de 1 x 10-7 M ou inferior, como determinado por SPR usando um sistema biossensor Biacore; (b) aumentar a proliferação de células T em um ensaio de Reação de Linfócitos Mistos (MLR); (c) aumentar a produção de interferon- em um ensaio de MLR; (d) aumentar a secreção de IL-2 em um ensaio de MLR; (e) estimular respostas de anticorpos; e (f) reverter o efeito de células T regulatórias em células efetoras de células T e/ou células dendríticas. Os anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis na presente invenção incluem anticorpos monoclonais que se ligam especificamente à PD-L1 humana e exibem pelo menos uma, em algumas modalidades, pelo menos cinco, das características precedentes.

[00359] Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é BMS- 936559 (também conhecido como 12A4, MDX-1105; ver, por exemplo, Patente U.S. Nº 7.943.743 e WO 2013/173223), atezolizumabe (Roche;

também conhecido como TECENTRIQ®; MPDL3280A, RG7446; ver US

8.217.149; ver, também, Herbst e outros (2013) J Clin Oncol 31 (supl.): 3000), durvalumabee (AstraZeneca; também conhecido como IMFINZI™, MEDI-4736; ver WO 2011/066389), avelumabe (Pfizer; também conhecido como BAVENCIO®, MSB-0010718C; ver WO 2013/079174), STI-1014 (Sorrento; ver WO 2013/181634), CX-072 (Cytomx; ver WO 2016/149201), KN035 (3D Med/Alphamab; ver Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (Março de 2017), LY3300054 (Eli Lilly Co.; ver, por exemplo, WO 2017/034916) ou CK-301 (Checkpoint Therapeutics; ver Gorelik et al., AACR: Abstract 4606 (Abril de 2016)).

[00360] Em certas modalidades, o anticorpo PD-L1 é atezolizumabe (TECENTRIQ®). O azolizumabe é um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal IgG1 totalmente humanizado.

[00361] Em certas modalidades, o anticorpo PD-L1 é durvalumabee (IMFINZI™). Durvalumabee é um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal IgG1 kappa humano.

[00362] Em certas modalidades, o anticorpo PD-L1 é avelumabe (BAVENCIO®). O Avelumabe é um anticorpo anti-PD-L1 monoclonal IgG1 lambda humano.

[00363] Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal anti-PD-L1 é 28-8, 28-1, 28-12, 29-8, 5H1, ou qualquer combinação destes.

[00364] Anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis nos métodos descritos também incluem anticorpos isolados que se ligam especificamente à PD-L1 humana e competem de forma cruzada pela ligação a PD-L1 humana com qualquer anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito, por exemplo, atezolizumabe, durvalumabe e/ou avelumabe. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 liga-se ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 aqui descritos, por exemplo, atezolizumabe, durvalumabe e/ou avelumabe. A capacidade dos anticorpos para competir de forma cruzada pela ligação a um antígeno indica que estes anticorpos se ligam à mesma região de epítopo do antígeno e estericamente impedem a ligação de outros anticorpos de competição de modo cruzado a essa região de epítopo particular. Espera-se que estes anticorpos de competição de modo cruzado tenham propriedades funcionais muito similares àquelas do anticorpo de referência, por exemplo, atezolizumabe e/ou avelumabe, em virtude da sua ligação à mesma região epítopo de PD-L1. Anticorpos de competição de modo cruzado podem ser facilmente identificados com base na sua capacidade de competir de modo cruzado com atezolizumabe e/ou avelumabe em ensaios de ligação a PD-L1 padrão tais como análise Biacore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo (ver, por exemplo, WO 2013/173223).

[00365] Em certas modalidades, os anticorpos que competem de forma cruzada pela ligação a PD-L1 humana com, ou se ligam à mesma região de epítopo do anticorpo humano PD-L1 como, atezolizumabe, durvalumabe, e/ou avelumabe, são anticorpos monoclonais. Para administração a indivíduos humanos, estes anticorpos de competição de modo cruzado são anticorpos quiméricos, anticorpos modificados ou anticorpos humanizados ou humanos. Tais anticorpos monoclonais quiméricos, modificados, humanizados ou humanos podem ser preparados e isolados por métodos bem conhecidos na técnica.

[00366] Os anticorpos anti-PD-L1 utilizáveis nos métodos da invenção descrita também incluem porções de ligação ao antígeno dos anticorpos acima. Foi amplamente demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural.

[00367] Os anticorpos anti-PD-L1 adequados para utilização nos métodos ou composições descritos são anticorpos que se ligam a PD- L1 com elevada especificidade e afinidade, bloqueiam a ligação de PD- 1 e inibem o efeito imunossupressor da via de sinalização de PD-1. Em qualquer das composições ou métodos aqui descritos, um "anticorpo" anti-PD-L1 inclui uma porção de ligação ao antígeno ou fragmento que se liga a PD-L1 e exibe as propriedades funcionais similares àquelas de anticorpos totais na inibição da ligação ao receptor e super-regulação do sistema imunológico. Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compete de modo cruzado com atezolizumabe, durvalumabe, e/ou avelumabe para ligação à PD-L1 humana.

[00368] Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS agonista da presente invenção é combinado com um antagonista de sinalização de PD-1/PD-L1, tal como um antagonista de PD-1 (por exemplo, nivolumabe, também conhecido como MDX1106, como descrito em WO 06/121168) ou um antagonista de PD-L1, em combinação com um terceiro agente imunoterápico (por exemplo, um anticorpo anti-ICOS, tal como S267E de IgG1f de ICOS.33, combinado com nivolumabe e ipilimumabe). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um anticorpo antagonista de CTLA-4. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é YERVOY® (ipilimumabe ou anticorpo 10D1, descrito na Publicação PCT WO 01/14424) ou tremelimumabe (anteriormente ticilimumabe, CP-675206). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista de GITR ou um antagonista de OX-40, tal como os anticorpos anti-GITR ou anti-OX40 aqui descritos. Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um agonista de GITR, tal como um anticorpo GITR agonista. Os anticorpos GITR adequados incluem, por exemplo, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO 06/105021, WO 09/009116) e MK-4166 (WO 11/028683). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista de IDO. Antagonistas IDO adequados incluem, por exemplo, INCB-024360 (WO 2006/122150, WO 07/75598, WO 08/36653, WO 08/36642), indoximod ou NLG-919 (WO 09/73620, WO 09/1156652, WO 11/56652, WO 12/142237) .

[00369] São aqui fornecidos métodos para o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista aqui descrito, e um anticorpo antagonista de CTLA-4 a um indivíduo. Em certas modalidades, o anticorpo anti-huICOS agonista é administrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado em uma dose subterapêutica ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica. São aqui fornecidos métodos para alterar um evento adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e uma dose subterapêutica de anticorpo anti-CTLA-4 a um indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é humano.

[00370] Os anticorpos anti-CTLA-4 que são conhecidos na técnica podem ser utilizados nos métodos da presente invenção. Os anticorpos anti-CTLA-4 da presente invenção ligam-se a CTLA-4 humana de modo a interromper a interação de CTLA-4 com um receptor B7 humano. Como a interação de CTLA-4 com B7 transduz um sinal que leva à inativação de células T portadoras do receptor CTLA-4, o rompimento da interação eficazmente induz, realça ou prolonga a ativação de tais células T, induzindo, realçando ou prolongando uma resposta imune.

[00371] Anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a CTLA-4 com elevada afinidade foram descritos na Patente U.S. Nº. 6.984.720. Outros anticorpos monoclonais anti-CTLA- 4 foram descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nºs. 5.977.318,

6.051.227, 6.682.736 e 7.034.121 e nas Publicações Internacionais Nos. WO 2012/122444, WO 2007/113648, WO 2016/196237 e WO 2000/037504, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua íntegra. Os anticorpos monoclonais humanos anti-CTLA-4 descritos na Patente U.S. Nº. 6.984.720 demonstraram exibir uma ou mais das seguintes características: (a) liga-se especificamente a CTLA-4 humana com uma afinidade de ligação refletida por uma constante de associação de equilíbrio (Ka) de pelo menos cerca de 107 M-1, ou cerca de 109 M-1, ou cerca de 1010 M-1 a 1011 M-1 ou superior, conforme determinado por análise Biacore; (b) uma constante de associação cinética (ka) de pelo menos cerca de 103, cerca de 104 ou cerca de 105 m-1 s-1; (c) uma constante de desassociação cinética (k d) de pelo menos cerca de 103, cerca de 104 ou cerca de 105 m-1 s-1; e (d) inibe a ligação de CTLA-4 a B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86). Os anticorpos anti- CTLA-4 úteis para a presente invenção incluem anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a CTLA-4 humano e exibem pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três das características precedentes.

[00372] Em certas modalidades, o anticorpo CTLA-4 é ipilimumabe (também conhecido como YERVOY®, MDX-010, 10D1; ver Patente U.S. Nº 6.984.720), MK-1308 (Merck), AGEN-1884 (Agenus Inc.; ver WO 2016/196237), ou tremelimumabe (AstraZeneca; também conhecido como ticilimumabe, CP-675.206; ver documento WO 2000/037504 e Ribas, Update Cancer Ther. 2(3): 133-39 (2007)). Em modalidades particulares, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumabe.

[00373] Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é ipilimumabe para utilização nos métodos aqui descritos. O ipilimumabe é um anticorpo monoclonal IgG1 totalmente humano que bloqueia a ligação de CTLA-4 a seus ligantes B7, desse modo estimulando a ativação de células T e melhorando a sobrevida global (OS) em pacientes com melanoma avançado.

[00374] Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é tremelimumabe.

[00375] Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é MK-

1308.

[00376] Em modalidades particulares, o anticorpo CTLA-4 é AGEN-

1884.

[00377] Anticorpos anti-CTLA-4 utilizáveis nos métodos descritos também incluem anticorpos isolados que se ligam especificamente a CTLA-4 humana e competem de forma cruzada pela ligação a CTLA-4 humana com qualquer anticorpo anti-CTLA-4 aqui descrito, por exemplo, ipilimumabe e/ou tremelimumabe. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 liga-se ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-CTLA-4 aqui descritos, por exemplo, ipilimumabe e/ou tremelimumabe. A capacidade dos anticorpos para competir de forma cruzada pela ligação a um antígeno indica que estes anticorpos se ligam à mesma região de epítopo do antígeno e estericamente impedem a ligação de outros anticorpos de competição de modo cruzado a essa região de epítopo particular. Espera-se que estes anticorpos de competição de modo cruzado tenham propriedades funcionais muito similares àquelas do anticorpo de referência, por exemplo, ipilimumabe e/ou tremelimumabe, em virtude da sua ligação à mesma região de epítopo de CTLA-4. Anticorpos de competição de modo cruzado podem ser facilmente identificados com base na sua capacidade de competir de forma cruzada com ipilimumabe e/ou tremelimumabe em ensaios padrão de ligação de CTLA-4 tais como análise Biacore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo (ver, por exemplo, WO 2013/173223).

[00378] Em certas modalidades, os anticorpos que competem de forma cruzada pela ligação a CTLA-4 humana com, ou se ligam à mesma região de epítopo do anticorpo CTLA-4 humano como, ipilimumabe e/ou tremelimumabe, são anticorpos monoclonais. Para administração a indivíduos humanos, estes anticorpos de competição de modo cruzado são anticorpos quiméricos, anticorpos modificados ou anticorpos humanizados ou humanos. Tais anticorpos monoclonais quiméricos, modificados, humanizados ou humanos podem ser preparados e isolados por métodos bem conhecidos na técnica.

[00379] Os anticorpos anti-CTLA-4 utilizáveis nos métodos da invenção descrita também incluem porções de ligação ao antígeno dos anticorpos acima mencionados. Foi amplamente demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural.

[00380] Os anticorpos anti-CTLA-4 adequados para utilização nos métodos ou composições descritos são anticorpos que se ligam a CTLA-4 com alta especificidade e afinidade, bloqueiam a atividade de CTLA-4 e rompem a interação de CTLA-4 com um receptor B7 humano. Em qualquer uma das composições ou métodos aqui descritos, um "anticorpo" anti-CTLA-4 inclui uma porção de ligação ao antígeno ou fragmento que se liga a CTLA-4 e exibe as propriedades funcionais similares àquelas de anticorpos totais na inibição da interacção de CTLA-4 com um receptor humano B7 e super-regulação do sistema imunológico. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 ou porção de ligação a antígeno do mesmo compete de modo cruzado com ipilimumabe e/ou tremelimumabe pela ligação ao CTLA-4 humano.

[00381] Em uma modalidade, o anticorpo anti-huICOS agonista da presente invenção é combinado com um anticorpo anti-CTLA-4, em combinação com um terceiro agente imunoterápico. Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista de GITR ou um antagonista de OX-40, tal como os anticorpos anti-GITR ou anti- OX40 aqui descritos. Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um agonista de GITR, tal como um anticorpo GITR agonístico. Os anticorpos GITR adequados incluem, por exemplo, BMS- 986153, BMS-986156, TRX-518 (WO 06/105021, WO 09/009116) e MK-4166 (WO 11/028683). Em uma modalidade, o terceiro agente imunoterápico é um antagonista de IDO. Antagonistas IDO adequados incluem, por exemplo, INCB-024360 (WO 2006/122150, WO 07/75598,

WO 08/36653, WO 08/36642), indoximod ou NLG-919 (WO 09/73620, WO 09/1156652, WO 11/56652, WO 12/142237).

[00382] São aqui fornecidos métodos para o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer), compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e um anticorpo anti-LAG-3 a um indivíduo. Em outras modalidades, o anticorpo anti- huICOS agonista é administrado em uma dose subterapêutica, o anticorpo anti-LAG-3 é administrado em uma dose subterapêutica ou ambos são administrados em uma dose subterapêutica. São aqui fornecidos métodos para alterar um evento adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa com um agente imunoestimulatório, compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista e uma dose subterapêutica de anticorpo anti- LAG-3 a um indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo monoclonal de sequência humana e o anticorpo anti-huICOS agonista é um anticorpo monoclonal humanizado, tal como um anticorpo compreendendo as CDRs ou regiões variáveis dos anticorpos aqui descritos. Exemplos de anticorpos anti-LAG3 incluem anticorpos compreendendo as CDR ou regiões variáveis de anticorpos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 ou 17E5, que são descritos na Publicação de Patente U.S. N2011/0150892 e WO 2014/008218. Em uma modalidade, um anticorpo anti-LAG-3 é BMS-986016. Outros anticorpos anti-LAG-3 que podem ser utilizados incluem o IMP731 descrito na US 2011/007023 ou IMP-321. Anticorpos anti-LAG-3 que competem com e/ou ligam-se ao mesmo epítopo que qualquer destes anticorpos podem também ser utilizados em tratamentos de combinação.

[00383] Em certas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 liga-se a LAG-3 humana com uma KD de 5 x 10-8 M ou menos, liga-se a LAG-3 humana com uma KD de 1 x 10-8 M ou menos, liga-se ao LAG-3 humano com um KD de 5 x 10-9 M ou menos, ou liga-se ao LAG-3 humano com um KD entre 1 × 10−8 M e 1 × 10-10 M ou menos.

[00384] A administração de anticorpos agonistas anti-huICOS aqui descritos e antagonistas, por exemplo, anticorpos antagonistas, para um ou mais segundos antígenos alvo, tais como LAG-3 e/ou CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 podem aumentar a resposta imune a células cancerígenas no paciente. Cânceres cujo crescimento pode ser inibido utilizando os anticorpos da presente invenção incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia. Exemplos de cânceres para tratamento com a terapia de combinação aqui descrita incluem, porém não se limitam aos descritos acima na discuss de monoterapia com anticorpos agonistas anti-huICOS.

[00385] Em certas modalidades, a combinação de anticorpos terapêuticos aqui descritos pode ser administrada concomitantemente como uma composição única em um transportador farmaceuticamente aceitável, ou concomitantemente como composições separadas com cada anticorpo em um portador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a combinação de anticorpos terapêuticos pode ser administrada sequencialmente. Por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4 e um anticorpo anti-huICOS agonista podem ser administrados sequencialmente, como o anticorpo anti-CTLA-4 sendo administrado primeiro e o anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, ou o anticorpo anti-huICOS agonista sendo administrado primeiro e anticorpo anti-CTLA-4 em segundo lugar. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-PD-1 e um anticorpo anti-huICOS agonista podem ser administrados sequencialmente, coumo o anticorpo anti-PD-1 sendo administrado primeiro e o anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, ou o anticorpo anti-huICOS agonista sendo administrado primeiro e anticorpo anti-PD-1 em segundo lugar. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-PD-L1 e um anticorpo anti-huICOS agonista podem ser administrados sequencialmente, tal como anticorpo anti-PD-L1 sendo administrado primeiro e anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, ou anticorpo anti-huICOS agonista sendo administrado primeiro e anticorpo anti-PD-L1 em segundo lugar. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo anti-LAG-3 e um anticorpo anti-huICOS agonista podem ser administrados sequencialmente, como o anticorpo anti-LAG-3 sendo administrado primeiro e o anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, ou o anticorpo anti-huICOS agonista sendo administrado primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo lugar.

[00386] Além disso, se mais de uma dose da terapia de combinação for administrada sequencialmente, a ordem da administração sequencial pode ser invertida ou mantida na mesma ordem em cada momento de administração, as administrações sequenciais podem ser combinadas com administrações concomitantes, ou qualquer combinação das mesmas. Por exemplo, a primeira administração de uma combinação de anticorpo anti-CTLA-4 e anticorpo anti-huICOS agonista pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-CTLA-4 primeiro e anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, e a terceira administração pode ser sequencial com anticorpo anti-huICOS agonista primeiro e anticorpo anti-CTLA-4 em segundo lugar, etc. Adicionalmente ou alternativamente, a primeira administração de uma combinação anticorpo anti-PD-1 e anticorpo anti-huICOS agonista pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com o anticorpo anti-PD-1 primeiro e o anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, e a terceira administração pode ser sequencial com anticorpo anti-huICOS agonista primeiro e anticorpo anti-PD-1 em segundo lugar, etc. Adicionalmente ou alternativamente, a primeira administração de um anticorpo anti-PD-L1 de combinação e anticorpo anti-huICOS agonista pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-PD-L1 primeiro e anticorpo anti- huICOS em segundo lugar, e a terceira administração pode ser sequencial com anticorpo anti-huICOS agonista primeiro e anticorpo anti-PD-L1 em segundo lugar, etc. Adicionalmente ou alternativamente, a primeira administração de uma anticorpo anti-LAG-3 de combinação e anticorpo anti-huICOS agonista pode ser concomitante, a segunda administração pode ser sequencial com anticorpo anti-LAG-3 primeiro e anticorpo anti-huICOS agonista em segundo lugar, e a terceira administração pode ser sequencial com anticorpo anti-huICOS agonista primeiro e anticorpo anti-LAG-3 em segundo lugar, etc. Outro esquema de dosagem representativo pode envolver uma primeira administração sequencial com o primeiro anticorpo anti-huICOS agonista e o anti- CTLA-4 (e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anti- Anticorpo LAG-3) em segundo lugar, e as administrações subsequentes podem ser concomitantes.

[00387] Em uma modalidade, um anticorpo agonista anti-huICOS, como único agente imunoterápico, ou a combinação de um anticorpo anti-huICOS agonista e um ou mais anticorpos imunoterápicos adicionais (por exemplo, anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti-LAG-3) pode ainda ser combinado com um agente imunogênico, como células cancerígenas, antígenos tumorais purificados (incluindo moléculas de proteínas, peptídeos e carbo-hidrato recombinantes), células, e células transfectadas com genes que codificam citocinas imunoestimulantes (He et al. (2004) J. Immunol. 173: 4919-28). Exemplos não limitativos de vacinas tumorais que podem ser utilizadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como peptídeos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase ou células tumorais transfectadas para expressar a citoquina GM-CSF (descrita também abaixo). Um agonista de ICOS e um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, bloqueio de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3) podem também ser ainda combinados com tratamentos de câncer padrão. Por exemplo, um agonista de ICOS e um ou mais anticorpos adicionais (por exemplo, bloqueio de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3) podem ser combinados com regimes quimioterápicos. Em uma modalidade, um anticorpo agonista anti- huICOS é administrado a um paciente com um anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti- LAG-3 em combinação com decarbazina para o tratamento do melanoma. Em uma modalidade, um anticorpo anti-huICOS agonista é administrado a um paciente com um anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti-LAG- 3 em combinação com interleucina-2 (IL-2) para o tratamento de câncer, incluindo melanoma. Sem desejar ligar-se à teoria, o uso combinado de agonismo de ICOS e antagonismo de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 com quimioterapia pode funcionar sinergicamente, pois a ação citotóxica da maioria dos compostos quimioterápicos pode resultar em níveis aumentados de antígeno tumoral na via de apresentação de antígeno. Outras terapias de combinação que podem resultar em sinergia com um agonismo combinado de ICOS com ou sem, e antagonismo de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 através de citotoxicidade incluem radiação, cirurgia ou privação de hormônio. Em outra modalidade, os inibidores de angiogênese podem ser combinados com um anticorpo anti-huICOS e antagonismo de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3.

[00388] Em uma modalidade, um anticorpo anti-huICOS como como único agente imunoterápicos, ou uma combinação de um anticorpo anti- huICOS e anticorpos bloqueadores de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 também podem também ser utilizados em combinação com anticorpos biespecíficos que alvejam células efetoras que expressam o receptor Fcα ou Fc para células tumorais. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nºs. 5.922.845 e 5.837.243. Anticorpos biespecíficos podem ser utilizados para alvejar dois antígenos separados. A ramificação de célula T destas respostas seria aumentada pelo uso de um agonismo combinado de ICOS e bloqueio de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3.

[00389] Em uma modalidade, um anticorpo anti-ICOS como único agente imunoterápico ou uma combinação de um anticorpo anti-ICOS e um agente imunoestimulador adicional, por exemplo, anticorpo anti- CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti-LAG-3, podem ser usados em conjunto com um agente antineoplásico, como RITUXAN® (rituximabe), HERCEPTIN® (trastuzumabe), BEXXAR® (tositumomabe), ZEVALIN® (ibritumomabe), CAMPATH® (alemtuzumabe), LYMPHOCIDE® (eprtuzumabe), AVASTIN® (bevacizumab) e TARCEVA® (erlotinibe). A título de exemplo e não desejando ligar-se à teoria, tratamento com um anticorpo anticâncer ou um anticorpo anticâncer conjugado a uma toxina pode levar à morte de células de câncer (por exemplo, células tumorais) que podem potenciar uma resposta imune mediada pelo agente imunoestimulatório, por exemplo, anticorpo anti-ICOS, anticorpo anti- TIGIT, anticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1 ou anticorpo anti-LAG-3. Em uma modalidade, um tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, um tumor canceroso) pode incluir um agente anti-câncer, por exemplo, anticorpo, em combinação com um anticorpo anti-huICOS agonista e opcionalmente um agente imunoestimulador adicional, por exemplo, anticorpo anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti-PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 e/ou anticorpo anti-LAG- 3, concomitantemente ou sequencialmente ou qualquer combinação dos mesmos, que pode potenciar uma resposta imune antitumoral pelo hospedeiro.

[00390] São aqui fornecidos métodos para reduzir, melhorar ou anular um evento adverso associado com o tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer) com um agente imunoestimulatório, compreendendo a administração de um anticorpo anti-huICOS agonista com ou sem um anti-CTLA-4 e/ou anticorpo anti- PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3, a um indivíduo.

Em uma modalidade, o método reduz a incidência de colite induzida por anticorpo terapêntico imunoestimulatório ou diarreia administrando um esteroide não absorvível ao paciente.

Tal como aqui utilizado, um "esteroide não absorvível" é um glicocorticoide que exibe um extenso metabolismo de primeira passagem de modo que, após metabolismo no fígado, a biodisponibilidade do esteroide é baixa, isto é, inferior a cerca de 20%. Em uma modalidade aqui descrita, o esteroide não absorvível é budesonida.

A budesonida é um glicocorticosteroide de ação local, que é extensamente metabolizado, principalmente pelo fígado, após administração oral.

ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) é uma formulação oral de budesonida dependente do pH e do tempo desenvolvida para otimizar a liberação de fármaco para o íleo e em todo o cólon.

ENTOCORT EC® é aprovado nos Estados Unidos para o tratamento da doença de Crohn leve a moderada, envolvendo o íleo e/ou o cólon ascendente.

A dose oral habitual de ENTOCORT EC® para o tratamento da doença de Crohn é de 6 a 9 mg/dia.

ENTOCORT EC® é liberado nos intestinos antes de ser absorvido e retido na mucosa intestinal.

Uma vez que atravesse o tecido alvo da mucosa intestinal, o ENTOCORT EC® é amplamente metabolizado pelo sistema do citocromo P450 no fígado em metabólitos com atividade glicocorticoide insignificante.

Portanto, a biodisponibilidade é baixa (cerca de 10%). A baixa biodisponibilidade da budesonida resulta em uma relação terapêutica melhorada em comparação com outros glicocorticoides com metabolismo de primeira passagem menos extenso.

A budesonida resulta em menos efeitos adversos, incluindo menos supressão hipotalâmica-pituitária, do que os corticosteroides de ação sistêmica. No entanto, a administração crônica de ENTOCORT EC® pode resultar em efeitos glicocorticoides sistêmicos, tal como hipercorticismo e supressão adrenal. Ver PDR 58ª. ed. 2004; 608-610.

[00391] Em uma modalidade, um anticorpo anti-ICOS com ou sem antagonista de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3 (isto é, anticorpos terapêuticos imunoestimulatórios contra ICOS e opcionalmente anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3) em conjunto com um esteroide não absorvível podem ser também combinados com um salicilato. Os salicilatos incluem agentes 5-ASA tais como, por exemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia e UpJohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); e mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

[00392] De acordo com os métodos aqui descritos, um salicilato administrado em combinação com um anticorpo anti-huICOS com ou sem anticorpos anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou LAG- 3 e um esteroide não absorvível pode incluir qualquer administração sobreposta ou sequencial do salicilato e do esteroide não absorvível para o propósito de diminuir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimulatórios. Desse modo, por exemplo, os métodos para reduzir a incidência de colite induzida pelos anticorpos imunoestimulatórios aqui descritos abrangem a administração de um salicilato e um não absorvível concomitante ou sequencialmente (por exemplo, um salicilato é administrado 6 horas após um esteroide não absorvível), ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, um salicilato e um esteroide não absorvível podem ser administrados pela mesma via (por exemplo, ambos são administrados oralmente) ou por diferentes vias (por exemplo, um salicilato é administrado oralmente e um esteroide não absorvível é administrado retalmente), o que pode diferir da(s) via(s) usada(s) para administrar os anticorpos anti-huICOS e anti-CTLA-4 e/ou anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3.

[00393] Os anticorpos agonistas anti-huICOS e terapias de anticorpo de combinação aqui descritas podem também ser utilizados em conjunto com outras terapias bem conhecidas que são selecionadas para sua utilidade particular contra a indicação a ser tratada (por exemplo, câncer). Combinações dos anticorpos agonistas anti-huICOS aqui descritos podem ser utilizadas sequencialmente com agente(s) farmaceuticamente aceitável(s) conhecido(s).

[00394] Em uma modalidade, os anticorpos agonistas anti-huICOS e as terapias de anticorpo de combinação aqui descritas podem ser utilizados em combinação (por exemplo, simultaneamente ou separadamente) com um tratamento adicional, tal como irradiação, quimioterapia (por exemplo, utilizando camptotecina (CPT-11), 5- fluoruracila (5-FU), cisplatina, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel, gencitabina, cisplatina, paclitaxel, carboplatina-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu ou camptotecina + apo2l/TRAIL (um combo de 6X)), um ou mais inibidores de proteassoma (por exemplo, bortezomibe ou MG132), um ou mais inibidores de Bcl-2 (por exemplo, BH3I-2' (inibidor de bcl-xl), inibidor de indoleamina dioxigenase-1 (IDO1) (por exemplo, INCB24360), AT-101 (derivados do R-(-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequena), GX-15-070 (obatoclax) ou antagonistas de MCL-1 (proteína- 1 de diferenciação de célula leucemia mieloide)), antagonistas de iAP (inibidor da proteína da apoptose) (por exemplo, smac7, smac4, pequena molécula smac mimético, peptídeos smac sintéticos (ver Fulda et al., Nat Med 2002; 8: 808-15), inibidores ISIS23722 (LY2181308), ou AEG-35156 (GEM-640)), HDAC (histona desacetilase), anticorpos anti- CD20 (por rituximabe), inibidores de angiogênese (por exemplo,

bevacizumabe), agentes antiangiogênicos alvejando VEGF e VEGFR (por exemplo, AVASTIN®), triterpenoides sintéticos (ver Hyer et al., Cancer Research 2005; 65: 4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína inibidora da FLICE celular) (por exemplo, ligantes naturais e sintéticos de PPARγ (receptor  ativado por proliferador de peroxissoma), 5809354 ou 5569100), inibidores de cinase (por exemplo, sorafenibe), trastuzumabe, cetuximabe, tensirolimus, inibidores de mTOR, tais como rapamicina e tensirolimus, bortezomibe, inibidores de JAK2, inibidores de HSP90, inibidores de PI3K-AKT, lenalildomida, inibidores de GSK3β, inibidores de IAP e/ou fármacos genotóxicos.

[00395] Os anticorpos agonistas anti-huICOS e as terapias de anticorpo de combinação aqui descritos podem ainda ser utilizados em combinação com um ou mais agentes citotóxicos antiproliferativos. Classes de compostos que podem ser utilizados como agentes citotóxicos antiproliferativos incluem, porém não se limitam aos seguintes:

[00396] Agentes alquilantes (incluindo, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados da etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos): mostarda de Uracila, Clormetina, Ciclofosfamida (CYTOXAN™) fosfamida, Melfalano, Clorambucil, Pipobromano, Trietilenomelamina, Trietilenotiofosforamina, Bussulfano, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina e temozolomida.

[00397] Antimetabólitos (incluindo, sem limitação, antagonistas de ácido fólico, análogos da pirimidina, análogos da purina e inibidores da adenosina-desaminase): Metotrexato, 5-Fluorouracila, Floxuridina, Citarabina, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Fosfato de Fludarabina, Pentostatina e Gencitabina.

[00398] Agentes antiproliferativos adequados para combinação com anticorpos agonistas anti-huICOS, sem limitação, taxanos, paclitaxel (o paclitaxel está comercialmente disponível como TAXOL™), docetaxel,

discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT), Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona B1, [17]-desidrodesoxipotilona B,

[18]desidrodesoxiepotilona B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A em ponte C6-C8, trans-9,10-desidroeptilona D, cis-9,10- desidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomolida, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (Discodermolida), TZT-1027 (soblidotina), ILX-651 (cloridrato de tasidotina), Halicondrina B, mesilato de eribulina (E-7389), Hemiasterina (HTI-286), E-7974, Cyrptohycins, LY-355703, imunoconjugados de maitansinoide (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1- 38067, T-900607, SB-715992 (ispinesibe), SB-743921, MK-0731, STA- 5312, eleuterobina, 17beta-acetóxi-2-etóxi-6-oxo-B-homo-estra- 1,3,5(10)-trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7- desidróxi-14,16-didemetil-(+)-discodermolidas e criptotilona 1, além de outros agentes estabilizadores de microtubulinas conhecidos na técnica.

[00399] Em algumas modalidades pode ser desejável tornar as células aberrantemente proliferativas quiescentes em conjunção com ou antes do tratamento com anticorpos agonistas anti-huICOS aqui descritos, por exemplo, administrando ao paciente hormônios e esteroides (incluindo análogos sintéticos), tais como 17a-Etinilestradiol, Dietilestilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximesterona, propionato de Dromostanolona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilprednisolona, Metil-testosterona, Prednisolona, Triancinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Acetato de Medroxiprogesterona, Leuprolida, Flutamida, Toremifeno, ZOLADEX™. Quando se empregam os métodos ou composições aqui descritas, outros agentes utilizados na modulação do crescimento tumoral ou metástase em um contexto clínico, tais como antimiméticos,

podem também ser administrados como desejado.

[00400] Os métodos para a administração segura e eficaz de agentes quimioterápicos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Além disso, sua administração é descrita na literatura padrão. Por exemplo, a administração de muitos dos agentes quimioterápicos é descrita em Physicians' Desk Reference (PDR), por exemplo, edição de 1996 (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, EUA); a descrição dos quais é aqui incorporada por referência.

[00401] Os agentes quimioterápicos e/ou terapia de radiação podem ser administrados de acordo com protocolos terapêuticos conhecidos na técnica. Ficará evidente para aqueles versados na técnica que a administração do(s) agente(s) quimioterápico(s) e/ou terapia de radiação pode ser variada dependendo da doença a ser tratada e dos efeitos conhecidos do(s) agente(s) quimioterápico(s) e/ou terapia de radiação nessa doença. Além disso, de acordo com o conhecimento do clínico qualificado, os protocolos terapêuticos (por exemplo, quantidades de dosagem e tempos de administração) podem ser variados em vista dos efeitos observados dos agentes terapêuticos administrados no paciente, e em vista das respostas observadas da doença aos agentes terapêuticos administrados. Resultados

[00402] A resposta do tumor é determinada, por exemplo, pelos Critérios de Avaliação de Resposta modificados em Tumores Sólidos (RECIST) estabelecidos pelo NCI.

[00403] Com respeito às lesões alvo, as respostas à terapia podem incluir:

Resposta Completa Desaparecimento de todas as lesões alvo. (CR) Quaisquer linfonodos patológicos (sejam alvo ou não alvo) deve ter redução no eixo curto (RECIST V1.1) para <10 mm.

Resposta Parcial (PR) Pelo menos um decréscimo de 30% na soma dos diâmetros das lesões-alvo, tomando como (RECIST V1.1) referência os diâmetros da soma basal.

Doença Progressiva Pelo menos um aumento de 20% na soma dos (DP) diâmetros das lesões-alvo, tomando como referência a menor soma do estudo (isso inclui (RECIST V1.1) a soma basal, se essa for a menor no estudo). Além do aumento relativo de 20%, a soma também deve demonstrar um aumento absoluto de pelo menos 5 mm. (Nota: o aparecimento de uma ou mais novas lesões é também considerado progressão).

Doença Estável (SD) Nem encolhimento suficiente para se qualificar para RP nem aumento suficiente para se (RECIST V1.1) qualificar para PD, tomando como referência as menores somas dos diâmetros enquanto sob estudo.

Resposta Completa Desaparecimento de todas as lesões alvo. Imuno-relacionada Quaisquer linfonodos patológicos (sejam alvo (irCR) ou não alvo) deve ter redução no eixo curto para <10 mm. (irRECIST) Resposta Parcial Pelo menos um decréscimo de 30% na soma dos Imuno-relacionada diâmetros das lesões-alvo e de todas as novas (irPR) lesões mensuráveis (isto é, Mudança Percentual em carga tumoral), tomando como referência os (irRECIST) diâmetros da soma basal. Nota: o aparecimento de novas lesões mensuráveis é contabilizado na Carga Tumoral geral, porém não se qualifica automaticamente como doença progressiva até que a soma dos diâmetros aumente em ≥ 20% quando comparada ao nadir.

Doença Progressiva Pelo menos um aumento de 20% na Carga Imuno-relacionada Tumoral (isto é, a soma dos diâmetros das (irPD) lesões alvo e quaisquer novas lesões mensuráveis) tomando como referência a (irRECIST) menor soma do estudo (isso inclui a soma basal se esta for a menor no estudo). Além do aumento relativo de 20%, a soma deve também demonstrar um aumento absoluto de pelo menos 5 mm. Avaliações de tumor usando critérios imuno-relacionados para doença progressiva incorporam a contribuição de novas lesões mensuráveis. Cada mudança percentual líquida na carga tumoral por avaliação é responsável pelo tamanho e pela cinética de crescimento tanto de lesões antigas quanto novas à medida que aparecem.

Doença Estável Imuno- Nem encolhimento suficiente para se qualificar relacionada (irSD) para o riPR nem aumento suficiente para se qualificar para o riPD, tomando como referência (irRECIST) as menores somas dos diâmetros sob o estudo.

[00404] Com respeito às lesões não alvo, as respostas à terapia podem incluir:

Resposta Completa (CR) Desaparecimento de todas as lesões não alvo. Todos os linfonodos devem ser de tamanho (RECISTAR V1.1) não patológico (<10 mm de eixo curto).

Não CR/Não PD Persistência de uma ou mais lesões não alvo.

(RECIST V1.1) Doença Progressiva (PD) Progressão inequívoca de lesões não alvo existentes. O aparecimento de uma ou mais (RECIST V1.1) novas lesões também é considerado progressão.

Resposta Completa Imuno- Desaparecimento de todas as lesões não alvo. relacionada (irCR) Todos os linfonodos devem ser de tamanho não patológico (<10 mm de eixo curto). (irRECIST) Doença Progressiva Imuno- Aumentos em número ou tamanho de lesões relacionada (irPD) não alvo não constituem doença progressiva, a menos que/até que a Carga Tumoral (irRECIST) aumente em 20% (isto é, a soma dos diâmetros em nadir de quaisquer novas lesões mensuráveis pela quantidade requerida). Lesões não alvo não são consideradas na definição de Doença Estável e Resposta Parcial.

[00405] Pacientes tratados de acordo com os métodos aqui descritos preferivelmente experimentam melhora em pelo menos um sinal de câncer. Em uma modalidade, a melhora é medida por uma redução na quantidade e/ou tamanho de lesões tumorais mensuráveis. Em outra modalidade, as lesões podem ser medidas em raios-X de tórax ou filmes de tomografia computadorizada (CT) ou ressonância magnética (MRI). Em outra modalidade, citologia ou histologia pode ser utilizada para avaliar a capacidade de resposta a uma terapia.

[00406] Em uma modalidade, o paciente tratado exibe uma resposta completa (CR), uma resposta parcial (PR), doença estável (SD), doença completa imuno-relacionada (irCR), resposta parcial imuno-relacionada (irPR) ou doença estável imuno-relacionada (irSD). Em outra modalidade, o paciente tratado experimenta encolhimento do tumor e/ou decréscimo da taxa de crescimento, isto é, supressão do crescimento do tumor. Em outra modalidade, a proliferação celular indesejada é reduzida ou inibida. Ainda em outra modalidade, pode ocorrer um ou mais dos seguintes: o número de células cancerígenas pode ser reduzido; tamanho do tumor pode ser reduzido; a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos pode ser inibida, retardada, tornada mais lenta ou interrompida; metástase tumoral pode ser rornada mais lenta ou inibida; o crescimento do tumor pode ser inibido; recorrência do tumor pode ser prevenida ou retardada; um ou mais dos sintomas associados com o câncer podem ser aliviados até certo ponto.

[00407] Em outras modalidades, a administração de quantidades eficazes do anticorpo anti-ICOS (ou combinações de anticorpo anti- ICOS e pelo menos um anticorpo adicional, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 ou anticorpo anti-CTLA-4) de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos produz uma redução no tamanho de um tumor, redução no número de lesões metastáticas que aparecem ao longo do tempo, remissão completa, remissão parcial ou doença estável. Ainda em outras modalidades, os métodos de tratamento produzem uma taxa de benefício clínico comparável (CBR = CR + PR + DP ≥ 6 meses) melhor do que aquela obtida por um anticorpo anti-ICOS apenas (ou qualquer um dos anticorpos combinados apenas). Em outras modalidades, a melhora da taxa de benefício clínico é de cerca de 20% 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais em comparação com o anticorpo anti-ICOS apenas (ou qualquer um dos anticorpos combinados individualmente). Adjuvantes de Vacina

[00408] Anticorpos anti-huICOS aqui descritos podem ser utilizados para realçar respostas imunes específicas de antígeno por coadministração de um anticorpo anti-huICOS com um antígeno de interesse, por exemplo, uma vacina. Consequentemente, são fornecidos aqui métodos para aumentar uma resposta imune a um antígeno em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo: (i) o antígeno; e (ii) um anticorpo anti-huICOS, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de modo que uma resposta imune ao antígeno no indivíduo seja aumentada. O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno de um patógeno. Exemplos não limitativos de tais antígenos incluem aqueles descritos nas seções acima, tais como os antígenos tumorais (ou vacinas contra tumores) descritos acima, ou antígenos das viroses, bactérias ou outros patógenos descritos acima. Detecção e Diagnósticos

[00409] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para detectar a presença de antígeno ICOS humano em uma amostra, ou medir a quantidade de antígeno ICOS humano, compreendendo contatar a amostra e uma amostra de controle com um anticorpo anti- ICOS, por exemplo, um anticorpo ICOS anti-humano monoclonal, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a ICOS humano, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou fragmento do mesmo e ICOS humano. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença de formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença de antígeno ICOS humano na amostra. Além disso, os anticorpos anti-ICOS aqui descritos podem ser utilizados para purificar ICOS humano através de purificação por imunoafinidade.

[00410] A presente invenção é também ilustrada pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como limitativos. O teor de todas as figuras e todas as referências, sequências do Genbank, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido são expressamente incorporados aqui por referência.

EXEMPLOS

[00411] Os seguintes são exemplos não limitativos de anticorpos, composições e métodos da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas de acordo com a descrição geral aqui fornecida. EXEMPLO 1 Geração de Anticorpos Anti-huICOS Totalmente Humanos

[00412] Anticorpos monoclonais anti-huICOS totalmente humanos, e anticorpos totalmente humanos que se ligam ao mesmo epítopo e/ou bloqueiam de forma cruzada a ligação dos anticorpos anti-ICOS totalmente humanos são aqui descritos. Tais anticorpos podem ser gerados usando camundongos transgênicos que expressam genes de anticorpo humano, como descrito no exemplo a seguir. Tecnologia de hibridoma usando HuMab camundongo® e/ou um Kunming camundongo(KM)®

[00413] Anticorpos anti-ICOS foram gerados

[00414] Os anticorpos monoclonais anti-ICOS humanos foram gerados por imunização da cepa HC2/KCo7 de camundongos transgênicos HuMAb® ("HuMAb®" é uma marca comercial de Medarex, Inc., Princeton, New Jersey) e camundongos KM (uma cepa de KM camundongo® contém o transcromossoma SC20 como descrito no WO 02/43478) com 1) um antígeno de ICOS humano solúvel e 2) uma linhagem de célula Hek293T que foi transfectada com o gene ICOS humano que expressa ICOS humano, uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) que expressa ICOS, e uma linhagem celular 300-19 que expressa ICOS. Camundongos HuMAb KC2/KCo7 e camundongos KM foram gerados como descrito nas Patentes U.S. Nºs.

5.770.429 e 5.545.806, a íntegra das descrições dos quais é pelo presente incorporada por referência. Antígeno e Imunização

[00415] Os antígenos eram uma proteína de fusão solúvel compreendendo um domínio extracelular de ICOS fundido com um domínio Fc de anticorpo (proteína quimérica Fc de camundongo-ICOS humano recombinante), células Hek293T, células CHO ou células 300- 19 que foram transfectadas para expressão de superfície de ICOS humano. Os antígenos foram misturados com RIBI monofosforil lipídeo A (MPL) mais sistema adjuvante TDM (Sigma) para as imunizações. Os camundongos acima descritos que foram imunizados com a proteína ICOS solúvel em 15-25 µg de antígeno ICOS recombinante solúvel em PBS ou 1 x 107 células CHO, células Hek293T ou células 300-19 transfectadas para expressão de superfície de ICOS humano em PBS foram misturados 1:1 com o adjuvante. Os camundongos foram injetados com 200 µl dos antígenos preparados na cavidade peritoneal ou subcutânea ou almofada da pata a cada dois a quatorze dias. Os camundongos foram injetados com 100-200 µl de IL21 de camundongo recombinante seguindo as imunizações com antígeno de ICOS. Camundongos que desenvolveram títulos anti-ICOS foram administrados uma injeção intravenosa e/ou injeção na almofada da pata de 10-20 µg de antígeno ICOS recombinante solúvel ou 5 x 106 células CHO, ou células 300-19 transfetadas para expressão de superfície de ICOS humano ou mais injeção intraperitoneal de 15 µg de proteína IL21 de camundongo recombinante em 100 µl de PBS, três a dois dias antes da fusão. Os linfonodos de camundongo e/ou baços de camundongo foram colhidos e as células de linfonodo isoladas e/ou esplenócitos foram utilizados para preparação de hibridoma.

Seleção de HuMab Camundongo® ou KM Camundongo® que Produziu Anticorpos Anti-ICOS ®

[00416] Para selecionar um HuMab camundongo ou KM camundongo® que produziu anticorpos de ligação a ICOS, os soros de camundongos imunizados foram testados por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Em síntese, as placas de microtítulo foram revestidas com Fc de camundongo de ICOS humano recombinante purificada a 1-2 µg/mL em PBS; 50 µl/cavidade foram incubados a 4°C durante a noite, em seguida bloqueadas com 200°C/cavidade de soro de galinha a 5% em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma de camundongos imunizados com ICOS foram adicionadas a cada cavidade e incubadas durante uma hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e em seguida incubadas com um anticorpo policlonal Fc de IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano picante (HRP) durante uma hora em temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS (Moss Inc., produto: ABTS-1000) e analisadas por espectrofotômetro em 415-495 Densidade Ótica (OD). Soros de camundongos imunizados foram em seguida ainda analisados por citometria de fluxo para ligação a uma linhagem celular que expressava ICOS humano, porém não para uma linhagem celular de controle que não expressava ICOS. Em síntese, a ligação de anticorpos anti-ICOS foi avaliada incubando células CHO que expressam ICOS ou células 300-19 com o anticorpo anti-ICOS em uma diluição de 1:20. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um anticorpo IgG anti- humano marcado com ficoeritrina (PE). Análises citométricas de fluxo foram realizadas utilizando um citômetro de fluxo FACScan™ (Becton Dickinson, San Jose, CA). Camundongos que desenvolveram os maiores títulos de anticorpos anti-ICOS foram usados para fusões. As fusões foram realizadas como descrito abaixo. Os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto à atividade anti-ICOS por ELISA e citometria de célula activada por fluorescência (FACS). Preparação de hibridoma

[00417] Os esplenócitos e/ou linfócitos de camundongo isolados de um HuMab camundongo® e/ou um KM camundongo® foram fundidos com uma linhagem de célula de mieloma de camundongo utilizando eletrofusão com base em campo elétrico utilizando um eletroporador de fusão de célula de câmara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc. Glen Burnie, MD). Em síntese, suspensões de única célula de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados foram fundidas com um número igual de células de mieloma de camundongo não secretoras Sp2/0 (linhagens celulares ATCC, CRL 1581). As células foram semeadas a aproximadamente 2 x 104/cavidade em placas de microtítulo de base plana, em seguida incubadas por cerca de duas semanas em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 10% de meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% Origen (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com alto teor de glicose, L- glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM 2- mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e meio de 1x hipoxantina- aminopterina-timidina (HAT) (Sigma, CRL P-7185). Após uma a duas semanas, as células foram cultivadas em meio em que o HAT foi substituído pelo meio de hipoxantina e timidina (HT). Aproximadamente 10 a 14 dias após a semeadura das células, os sobrenadantes de cavidades individuais foram analisados primeiro para determinar se continham anticorpos gama e kappa humanos. Os sobrenadantes que foram classificados positivos para os anticorpos gama e kappa humanos foram em seguida subsequentemente analisados por ELISA e FACS para anticorpos IgG monoclonais anti-ICOS humanos. Os hibridomas secretores de anticorpos foram transferidos para placas de 24 cavidades, novamente analisados e, se ainda positivos para anticorpos monoclonais humanos anti-ICOS, foram subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis foram em seguida cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para posterior caracterização. Os anticorpos monoclonais humanos produzidos foram em seguida purificados por cromatografia em coluna de proteína A. Os anticorpos isolados de interesse particular foram designados como 17C4, 9D5, 3E8, 1D7-a e 1D7-b, como descrito na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 - Anticorpos Isolados Anticorpo Cadeia Pesada Cadeia Leve Domínio Variável Domínio Variável Nome de cadeia pesada de cadeia leve CDR 1, 2, e 3 CDR 1, 2, e 3 SEQ ID Nº SEQ ID Nº SEQ ID Nºs SEQ ID Nºs 17C4 18, 19, e 20 21, 22, e 23 16 17 9D5 26, 27, e 28 29, 30, e 31 24 25 3E8 34, 35, e 36 37, 38, e 39 32 33 1D7 - a 42, 43, e 44 45, 46, e 47 40 41 1D7 - b 42, 43, e 44 49, 50, e 51 40 48 B. Sistema de exibição de mRNA PROfusion®

[00418] Camundongos KM #333819 e #333821 foram imunizados com células CHO que superexpressam ICOS humano, e o baço e os linfonodos de camundongo foram subsequentemente colhidos. O RNA total foi extraído das células do baço e linfonodos e foi transcrito reversamente utilizando iniciadores específicos para as regiões constantes do anticorpo. O cDNA de de anticorpo foi utilizado para gerar uma biblioteca de fragmento variável de única cadeia (scFv) que foi expressa em exibição de mRNA, em que cada proteína scFv foi fundida ao seu mRNA de codificação por meio de uma ligação de puromicina. A biblioteca foi selecionada contra 10 nM de ICOS-Fc humano recombinante, e quaisquer moléculas ligadas foram recuperadas utilizando captura com contas magnéticas de Proteína G e amplificadas por reação de cadeia de polimerase (PCR) para prosseguir no ciclo seguinte. Um total de seis ciclos foi completado, após o que um sinal significativo de ligação de ICOS foi observado por PCR quantitativo (qPCR). A população final foi sequenciada e as regiões variáveis únicas foram clonadas em vetores de expressão de IgG. As proteínas IgG foram expressas utilizando transfecção transitória de células Hek293T para gerar material para ensaios de ligação e funcionais. Anticorpo IgG- 2644, como descrito na Tabela 8 abaixo, foi selecionado. Tabela 8 - Anticorpo IgG-2644 Cadeia Pesada Cadeia Leve Domínio Domínio Variável Domínio Domínio Variável de cadeia leve de cadeia de cadeia Anticorpo CDR 1, 2, e 3 CDR 1, 2, e 3 de cadeia SEQ ID Nº pesada leve Nome SEQ ID Nºs SEQ ID Nºs pesada SEQ ID

SEQ ID SEQ ID Nº Nº Nº 2644 191, 192, e 193 194, 195, e 196 186 189 185 188 EXEMPLO 2 Geração de Anticorpos Anti-ICOS Humanizados Determinação de Sequência de Anticorpo C398.4A de ICOS de Hamster

[00419] Um anticorpo monoclonal de ICOS anti-rato de hamster, Anticorpo Monoclonal C398.4A (anti-H4/ICOS), aqui referido como "anticorpo de hamster parental" ou anticorpo "C398.4A", foi obtido da BioLegend®. O anticorpo C398.4A foi sequenciado usando espectrometria de massa. Especificamente, o C398.4A foi desnaturado em HCl de guanidina a 5,3 M, reduzido com ditiotreitol (40 mM) e alquilado com iodoacetamida (80 mM). Após dessalinizar com uma coluna de dessalinização Zeba de 6 kDa MW, o anticorpo foi enzimaticamente digerido com tripsina, quimiotripsina, pepsina, Lys-C, AspN ou GluC e analisado por espectrometria de massa. O mapeamento peptídico e MS/MS foram utilizados para identificar os peptídeos resultantes e confirmar a sequência de aminoácido. As massas de cadeia pesada e leve intactas foram geradas por clivagem do glicano com PNGaseF, redução do anticorpo com ditiotreitol e alquilação com ácido iodoacético. As cadeias de anticorpo resultantes foram analisadas por LC-MS.

[00420] Os dados de fragmentação de peptídeo resultantes foram alinhados com uma base de dados de proteína personalizada consistindo em três sequências de anticorpo de cadeia leve e cadeia pesada para Cricetulus migratorius presente no GenBank juntamente com sequências de anticorpo determinadas internamente através de sequenciamento de RNA de anticorpos monoclonais derivados de hamsters armênicos. Uma pesquisa na base de dados identificou o locus do gene da sequência GenBank CMU17870 (Acesso U17870) como similar à cadeia leve de C398.4A. As substituições de aminoácidos em CDR3 e a região de estrutura foram observadas na sequência C398.4A quando comparadas com a sequência de cadeia leve de CMU17870. A pesquisa na base de dados identificou o locus de gene da sequência do GenBank, o CMU17166 (Acesso U17166) como similar à região variável de cadeia pesada C398.4A. A região J coincide com uma sequência de hamster internamente identificada HA-VH-7. A região constante da cadeia pesada coincidia com o mesmo isótipo do anticorpo HL4E10 (Acesso HM369133). A região D foi determinada como sendo nova e foi identificada por sequenciamento de novo dos dados de fragmentação de peptídeo. As substituições de aminoácidos em CDR1, CDR2, CDR3 e a região de estrutura variável foram observadas quando comparadas às sequências de cadeia pesada CMU17166 e HA-VH-7. Geração e Avaliação de Anticorpo Quimérico ICOS.4 Com Base no Anticorpo C398.4A

[00421] A sequência da proteína do anticorpo C398.4A foi novamente transladada para dentro da sequência de cDNA. O resíduo de isoleucina/leucina (I/L) na posição 96 na região D (CDRH3) foi expresso com isoleucina ou leucina nesta posição. As regiões variáveis foram clonadas em vetores de expressão contendo uma sequência sinal e regiões constantes de IgG1f humanas, e transfectadas em células CHO-S para a expressão do anticorpo humano quimérico, ICOS.4. Os anticorpos quiméricos foram purificados utilizando 2 L de sobrenadante, cada utilizando 250 mL de coluna de Proteína A no AKTA Avant e foram analisados quanto à atividade no ensaio de células T CHO-OKT3- CD32a/CD25-CD4+. O ensaio de células T CHO-OKT3-CD32a/CD25- CD4+ foi uma cocultura de células CHO irradiadas (crescimento interrompido) transfectadas com um baixo nível de CD3 de cadeia simples (clone OKT3) e um nível mais elevado de CD32A (para ligar o anticorpo de modo cruzado) com células T CD4+ esgotadas de CD25 em uma relação de células CHO:T de 1:4. A linhagem celular CHO foi cultivada em frascos em agitação e irradiada no dia da montagem do ensaio. As células T foram selecionadas a partir de uma camada leucocitária fresca (Stanford Blood Bank) utilizando o kit de isolação de célula T CD4+ RosetteSep (Catálogo 15062) seguido por esgotamento de células CD25+ utilizando as microcontas Miltenyi® CD25 (Catálogo 130-092-983), seguindo as instruções do kit para esgotamento no AutoMACS®.

[00422] O anticorpo ICOS ou controle de isótipo foi titulado a partir de 5 µg/mL por 5 diluições em série, com cada condição estabelecida em triplicata. As culturas foram preparadas em placas de 96 cavidades Costar® tratadas com TC de base plana com 5x104 células T e 1,25x104 células CHO em 200 µL de meio completo (RPMI-1640 (Corning®, Catálogo 10-040-CM) + soro bovino fetal a 10% (FBS) (Gibco®, Catálogo 25140) + 1x Pen Strep (Catálogo Corning 30-002-CL) + HEPES a 10 mM (Catálogo Corning 25-000-CL) + piruvato de sódio a 1 mM (Catálogo Corning 25-000Cl) + 1xMEM (Catálogo Corning 25030-

CL) por cavidade e incubadas durante três dias a 37°C e 5% de CO2.

[00423] Os sobrenadantes de cultura (50 µL/cavidade) foram colhidos no Dia 3 para análise das concentrações de interferon-gama utilizando ensaio de fluorescência resolvida com o tempo homogénea (HTRF) (Cisbio®), leitura utilizando a leitora de microplaca Rubystar® e calculando as concentrações de uma curva padrão utilizando o software Softmax Pro®. O anticorpo ICOS.4 foi testado em um ensaio de célula T funcional utilizando células CHO-OKT3-CD32 e CD4+CD25-T com o anticorpo titulado para comparar os níveis relativos de coestimulação dependente da dose, quando medidos por secreção de interferon-gama. ICOS.4 exibiu um valor de EC50 de 0,018 µg/mL. Seleção de Isótipo

[00424] A seleção de isótipos para anticorpos terapêuticos de imuno- oncologia e, especificamente, para alvos agonistas, é influenciada por duas diferentes considerações a jusante de ligação a FcRs. Como detalhado por Ravetch e colegas (Li e Ravetch, Science 2011; 333: 1030-4; Otten et al., J Immunol. 2008; 181: 6829-36), a ligação de anticorpos a receptores de ativação pode levar a citotoxicidade mediada por célular dependente do anticorpo (ADCC) ou fagocitose celular dependente do anticorpo (ADCP) de células que expressam o alvo. Por outro lado, a ligação de anticorpos preferivelmente ao FcR inibidor pode mediar reticulação multivalente do receptor e sinalização agonista. Como o ICOS pode ser altamente expresso em CD8+ e CD4+ Teffs no microambiente tumoral, o uso de um isótipo que pode mediar ADCC ou ADCP foi considerado uma opção menos atrativa. A atividade ADCC in vitro de anticorpos anti-ICOS também sugeriu que os anticorpos anti- ICOS eram altamente competentes na mediação do ADCC e sustentavam a ideia de que os isótipos indutores de ADCC deveriam ser evitados. Anticorpos que aumentam a afinidade de IgG1 humana para CD32B foram em vez disso considerados como isótipos alternativos. Os isótipos considerados foram a mutação S267E de IgG1, mutações SELF e mutações V12 da IgG1 humana, como mostrado na Tabela 3 acima. Todas as mutações aumentam a afinidade para CD32B e para graus variáveis CD32A, ao mesmo tempo que diminuem a afinidade para CD16 (como mostrado na Tabela 9). Este decréscimo foi previsto reduzir a atividade de ADCC, visto que é o FcR que provavelmente media o esgotamento de células T no tumor. Tabela 9 - Comparação das Propriedades de Ligação de Variante Tipo Selvagem e S267E de IgG1 Humana (µM Kd) Proteína IgG1f IgG1f-S267E CD16-V 97 950 CD16-F 200 >5000 CD32A-H131 530 650 CD32A-R131 960 31 CD32B 3400 87 CD64 0.2 0.2 C1q + ++

[00425] A atividade in vitro no ensaio SEB utilizando células T CD4+ e células B mostrou uma atividade superior do anticorpo S267E de IgG1f em comparação com a IgG1 Humana e outros isótipos, como descrito acima. Com base nos dados destas experiências funcionais, a IgG1f S267E foi escolhida como o anticorpo de indutor. Uma complicação na escolha de IgG1f S267E foi que este isótipo se liga ao complemento C1q com maior afinidade do que a IgG1 humana, o que representou um possível aumento do risco de citólise dependente do complemento (CDC). Surpreendentemente, IgG1f S267E não teve maior atividade de CDC em comparação com IgG1 Humana em teste in vitro. Portanto, a mutação S267E não resultou em um risco aumentado de CDC.

Humanização de Anticorpo ICOS.4

[00426] O anticorpo ICOS.4 foi humanizado por enxerto de CDR de hamster em genes da linhagem germinativa humana (Figura 3), o VH3- 15 foi selecionado para a cadeia pesada e VKI O18 foi selecionado para a cadeia leve com base na homologia da sequência estrutural. A linhagem germinativa humana FW4, JK3, também foi selecionada para a cadeia leve com base na homologia de sequências. A linhagem germinativa humana FW4, JH4, foi selecionada para a cadeia pesada com base na similaridade de sequência, e não continha resíduos que pudessem representar um risco de responsabilidade potencial. Avaliou- se um painel de 26 anticorpos no ensaio de células CHO-OKT3- CD32A/CD4+CD25-T, com uma faixa de intervalo de anticorpos a em 0,2 µg/mL e titulado por quatro diluições, para identificar sequências humanizadas que retêm ligação similar ao anticorpo de hamster parental (C398.4A, isto é, o anticorpo de hamster parental tendo sequências de região pesada e de cadeia leve com as SEQ ID Nºs: 3 e 4, respectivamente).

[00427] Foi identificada uma substituição de resíduo de aminoácido (T94A) para restaurar a ligação do anticorpo enxertado com CDR humanizado, e é localizada na junção de FR3 e CDRH3. Além disso, três anticorpos quiméricos com mutações de responsabilidade na sequência D56, G57 foram também avaliados para verificar se o sítio de isomerização potencial na VL poderia ser removido sem afetar a atividade. A substituição de resíduos D56E foi selecionada para eliminar o sítio de isomerização potencial (D56, G57) na cadeia leve e incorporada na sequência humanizada. Os anticorpos humanizados foram analisados com o isótipo IgG1f, no entanto, o S267E de IgG1f de ICOS.33 foi re-expresso utilizando o isótipo IgG1f S267E. Uma descrição dos anticorpos gerados é fornecida na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10 – Sumário de Anticorpos Gerados Nome do Descrição Anticorpo 1 C398.4A Anticorpo de hamster parental 2 ICOS.1 mG1 Anticorpo ICOS anticamundongo de IgG1 de camundongo derivado de rato 17G9 (não se liga a ICOS humano) 3 ICOS.4 Anticorpo quimérico com regiões variáveis de C398.4A formadas como quatro diferentes variantes (listadas abaixo) 4a ICOS.4 mG1 Variante de IgG1 de camundongo de ICOS.4 4b ICOS.4 mIgG2a Variante de IgG2a de camundongo de ICOS.4 4c ICOS.4 hg1 Variante Humana de IgG1 de ICOS.4 4d ICOS.4 hg1 SE Variante Humana de IgG1 de ICOS.4 com mutação de S267E 5 ICOS.33 ICOS.4 Humanizado (Isótipo de IgG1) com CDRs parentais enxertadas sobre estrutura humana e mutações T94A e D56E 6 S267E de IgG1f ICOS.33 com substituição de S267E de ICOS.33 7 ICOS.34 G1f ICOS.4 Humanizado (Isótipo IgG1) com CDRs parentais enxertadas sobre estrutura humana (também referida como "C398.4A-03") 8 ICOS.35 G1f ICOS.34 mais mutação T94A

[00428] Um conjunto de quatro anticorpos humanizados com base em C398.4A foi testado no ensaio funcional de células CHO-OKT3- CD32a/CD4+ CD25-T, em comparação com o anticorpo quimérico de hamster original, como descrito abaixo no Exemplo 3. S267E de IgG1f de ICOS.33 foi selecionado para posterior caracterização e desenvolvimento. As sequências de região variável de cadeia pesada e leve para S267E de IgG1f de ICOS.33 são mostradas nas SEQ ID Nºs: 5 e 6, respectivamente, e na Figura 4 EXEMPLO 3 Seleção de anticorpo Ensaio de células CHO-scFv-CD3-CD32A/T CD25-CD4+

[00429] A avaliação de ensaio funcional inicial foi realizada utilizando células CHO que expressam o fragmento variável de cadeia simples (scFv) anti-CD3 (OKT3) e a CD32A humana para estimular células T humanas primárias. Este ensaio foi uma cocultura de células CHO irradiadas (cresimento interrompido) transfectadas com um nível baixo de fragmento variável de cadeia simples-CD3 (clone OKT3) e um nível mais elevado de CD32A (para ligação cruzada de anticorpo) com células T CD4+ esgotadas de CD25 em uma relação de células CHO:T de 1:4. A linhagem celular CHO foi cultivada em frascos em agitação e irradiada no dia da montagem do ensaio. As células T foram selecionadas a partir de camadas leucocitárias frescas (Stanford Blood Bank) utilizando o kit de isolamento de células T CD4+ RosetteSep. As células CD25+ foram esgotadas usando microcontas Miltenyi CD25, seguindo as instruções do kit para esgotamento no AutoMACS.

[00430] Anticorpo ICOS ou controle de isótipo (isto é, anticorpo do mesmo isótipo que o anticorpo ICOS, porém que não se liga a nenhuma proteína humana de ocorrência natural, por exemplo, anticorpos contra hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH), toxina da difteria, entre outros) foi titulado de 2 µg/mL por por cinco diluições seriais, com cada condição configurada em triplicata utilizando células T de dois doadores. As culturas foram preparadas em placas de 96 cavidades tratadas com TC de base plana (Costar) com 5 x 104 células T e 1,25 x 104 células CHO em 200 µL de meio completo por cavidade e incubadas durante três dias a 37°C e CO2 a 5%

[00431] Os sobrenadantes de cultura (50 µL/cavidade) foram colhidos no Dia 3 para análise das concentrações de interferon-gama (IFN-) utilizando o ensaio de fluorescência resolvida com o tempo homogênea (HTRF) (Cisbio). As concentrações foram determinadas utilizando a leitora de microplaca Rubystar e calculadas a partir de uma curva padrão utilizando o software Softmax Pro. As placas foram em seguida pulsadas com 0,5 µCi de timidina tritiada por cavidade durante oito horas e congeladas. As células foram colhidas em placas filtrantes (Perkin Elmer) para análise da incorporação de timidina tritiada para avaliar a proliferação.

[00432] O CD32A de FcR permitiu a reticulação de anticorpos, independentemente do subtipo Fc do anticorpo. Esta reticulação permitiu a coestimulação de células T através de agonismo de ICOS, resultando em proliferação realçada e liberação de citocina em comparação com células tratadas com o controle de isótipo. Essa atividade foi observada em células T CD8+, CD4+ e CD25-CD4+. Devido ao sinal-ruído superior no ensaio de célula T CD25-CD4+ esgotadas, estas células foram utilizadas para análise de hibridomas. Os anticorpos com melhor desempenho foram selecionados para subclonagem, purificação e posterior caracterização. O anticorpo monoclonal de hamster parental foi incluído na análise do painel de anticorpos. Como descrito acima, a atividade no ensaio CHO-CD3- CD32 foi utilizada para selecionar um painel de chumbo de anticorpos, que foram re-expressos como anticorpos IgG1 humanos ou outras versões modificadas de IgG1 humana. S267E de IgG1f de ICOS.33 exibiu indução dependente da dose de secreção e proliferação de IFN-  No ensaio de células CHO-scFv-CD3-CD32A/T CD25-CD4+, como mostrado na Figura 5. A EC50 média deste efeito foi de 0,083 nM (± 0,067, n = 6) para proliferação e 0,083 nM (± 0,074, n = 6) para indução de IFN-. A indução da proliferação variou de 2 a 5 vezes nas três maiores concentrações testadas em um total de 6 doadores, enquanto a indução de IFN- variou de 2 a 9 vezes nos mesmos experimentos em comparação com o controle. Experimentos anteriores utilizando CHO- scFv-CD3 (nenhum CD32A) confirmaram que a reticulação é requerida para a atividade agonística de todos os anticorpos ICOS testados. Ensaio de célula T CD25-CD4+ e célula B-SEB

[00433] Nova caracterização da atividade funcional de anticorpos anti-ICOS foi realizada utilizando a Enterotoxina B de Estafilocócica (SEB) como um estímulo de receptor de célula T (TCR) e a adição de anticorpos anti-ICOS para testar a coestimulação. Quando células de sangue periférico humano (PBMC) foram utilizadas no ensaio, anticorpos anti-ICOS não mostraram nenhuma atividade funcional. No entanto, quando células T CD4+ (células T CD4+ totais ou esgotadas de CD25) foram utilizadas em conjunto com células B purificadas, anticorpos anti-ICOS mostraram realçada secreção de interferon-gama (IFN-) em comparação com anticorpos de controle.

[00434] Este ensaio envolveu uma cocultura de células T CD25- CD4+ autólogas e células B. A SEB foi adicionado para uma concentração final fixa de 85 ng/mL para proporcionar estimulação submáxima, e o anticorpo ICOS foi titulado para mostrar um efeito de coestimulação dependente da dose. O propósito deste ensaio foi medir a capacidade de anticorpos ICOS para realçar a ativação de células T no contexto de um sinal de ativação primário (SEB + células B), como evidenciado pelos níveis de indução de IFN-. É benéfico induzir níveis mais elevados de IFN-, porque é uma medida de ativação de células T que reflete a potência dos diferentes anticorpos que exibem o agonismo do receptor de ICOS e o IFN- é um mediador conhecido da imunidade antitumoral.

[00435] Células T foram isoladas por seleção positiva a partir de duas camadas leucocitárias frescas, seguido por descolamento de contas para gerar células T CD4+ não manipuladas (Invitrogen). Células CD25+ foram em seguida esgotadas de células T CD4+ utilizando microcontas CD25 (Miltenyi), seguindo as instruções do kit para esgotamento usando o AutoMACS. As fracções negativas dos isolamentos de CD4 foram em seguida utilizadas para isolar as células B autólogas utilizando contas Miltenyi CD20, seguindo as instruções do kit para selecção positiva utilizando o AutoMACS.

[00436] As células T foram semeadas em placas de cultura tratadas com TC de 96 cavidades de base plana a 5 x 104 células/cavidade com células B autólogas a 3 a 5x104 células/cavidade (dependendo do rendimento de cada doador) com SEB incluídas para uma concentração final de 85 ng/mL. O anticorpo ICOS ou o controle de isótipo foi titulado a partir de 5 µg/mL em 5 diluições seriais para um total de sete pontos, cada uma testada em triplicata. O ensaio foi estabelecido em meio completo com 200 µL/cavidade de volume final. As placas foram incubadas durante 3 dias a 37°C e CO2 a 5%.

[00437] Os sobrenadantes de cultura (50 µL/cavidade) foram colhidos no Dia 3 para análise das concentrações de IFN- utilizando o ensaio HTRF (Cisbio). As concentrações foram determinadas utilizando a leitora de microplaca Rubystar e calculadas a partir de uma curva padrão utilizando o software Softmax Pro.

[00438] Experimentos de cocultura de SEB compararam a produção de IFN- para anticorpos anti-ICOS, ICOS.33 IgG1f, S267E de IgG1f de ICOS.33, 9D5 IgG1f, 9D5 IgG1f S267E, 2644 IgG1f S267E, e Ig1f de controle de anticorpo KLH de controle (Figura 6). O anticorpo de chumbo humanizado ICOS.33 com a mutação S267E (ICOS.33 IgG 1f S267E, como representado no triângulo descendente completo na Figura 6) induziu níveis mais elevados de IFN- do que o mesmo anticorpo com o Fc tipo selvagem (ICOS.33 IgG1f). Os outros anticorpos comparadores testados, isto é, 95D IgG1f, 9D5 IgG1f S267E e 2644 IgG1, também exibiram menor atividade do que S267E de IgG1f de ICOS.33. O Ig 1f de controle de KLH não exibiu nenhuma atividade. O anticorpo ICOS.33 IgG 1f IgG1f aumentou a produção de IFN- até 2,3 vezes em comparação com o anticorpo de controle de um modo dependente da dose em coculturas de células T CD25-CD4+ e B estimuladas por uma dose sub-ideal de SEB. Um total de 20 doadores foram testados utilizando este ensaio, todos apresentando a maior atividade agonista por S267E de IgG1f de ICOS.33, com uma EC50 de 0,020 nM (± 0,018).

[00439] A atividade de anticorpos de ICOS em células T auxiliares foliculares (Tfhs) foi testada desta maneira. Em comparação com o anticorpo de controle 1D12, secreção realçada de IL-10 foi observada após a adição dos anticorpos anti-ICOS 9D5 e ICOS.4. As células Tfh foram classificadas de PBMCs após enriquecimento por seleção de CD4 (kit Invitrogen) por manchamento das células enriquecidas com CD4 para CD4, CD14, CXCR5, CD45RA e CD123 e classificação para células Tfh (CD4+ CXCR5 + CD45RA-CD123-CD14-) usando o Aria II FACS. Células B naïve foram isoladas da fração negativa para CD4 usando o kit Miltenyi. As células B Tfh e naïve foram co-cultivadas em placas de TC de base plana com 96 cavidades com 5e4 células/cavidade de cada e estimuladas com SEB durante 2 dias quando IL-10 e IFN foram medidos por ELISA (BD) e mostraram ser realçadas por anticorpos ICOS. Esta secreção realçada de citocina não requeriu um agente de reticulação exógeno e pode ser realçada incluindo a mutação S267E à IgG1 Humana (Figura 7A e 7B).

[00440] S267E de IgG1f de ICOS.33 foi selecionado para desenvolvimento adicional devido à sua capacidade de estimular a produção de IFN- no ensaio CHO FcR e induzir a proliferação celular (Figura 5), bem como a sua maior atividade funcional no ensaio de SEB em comparação com os outros anticorpos anti-ICOS testados (Figura 6).

EXEMPLO 4 Inversão de supressão da Célula T Regulatória por S267E de IgG1f de ICOS.33

[00441] O objetivo deste estudo foi determinar o efeito de S267E de IgG1f de ICOS.33 sobre a proliferação de célula T efetora (Teff) e na supressão mediada por Treg.

[00442] Placas com a base em U foram revestidas por três horas a 37°C com anti-CD3 (3 µg/mL) em combinação com S267E de IgG1f de ICOS.33 (10 µg/mL) ou anti-KLH, um controle de isótipo que não se liga à proteína ICOS (10 µg/mL) em PBS. Células T CD4+ foram isoladas de camadas leucocitárias frescas inteiras utilizando coquetel de enriquecimento de células T CD4+ RosetteSep em conjunto com a separação Ficoll-Paque, seguindo as instruções do fabricante RosetteSep. Células T CD4+ enriquecidas foram manchadas com anticorpos monoclonais conjugados com fluoroforo direcionados contra CD4, CD25, CD127, CD45RA e CD45RO em tampão de classificação FACS. As células T CD4+ foram em seguida selecionadas em populações celulares Teff (CD4+ CD25loCD127hi), RA + Treg (CD4+ CD25hiCD127lo/CD45RA+/CD45RO-) e RO+Treg (CD4+ CD25hiCD127lo/CD45RA-/CD45RO+) utilizando um classificador de célula FACSAria II. As Tregs classificadas foram marcadas com corante de proliferação CellTrace™ Violet (CTV) de acordo com as instruções do fabricante em uma concentração de 5 µM. As Teffs classificadas foram marcadas com o corante de proliferação CellTrace CFSE™ (CFSE) de acordo com as instruções do fabricante, exceto que foi usados em uma diluição maior de 1,25 µM para reduzir os efeitos citotóxicos observados em experimentos anteriores.

[00443] Cinquenta mil Teffs marcadas por CFSE e classificadas em 100 µL de meio completo foram adicionadas a cada cavidade da placa de 96 cavidades revestida com anti-CD3 e S267E de IgG1f de ICOS.33 ou controle de isótipo. Estas foram preparadas com ou sem anti-CD28 adicionado a 2 µg/mL (para uma concentração final de 1 µg/mL). Os números de titulação de Tregs marcadas com CTV e classificadas em 100 µL de meio completo foram em seguida adicionados a cada cvidde começando com 5x104 Tregs (1:1 Treg para Teff) e reduzindo duas vezes em cavidades subsequentes (1:2, 1:4, etc).

[00444] As culturas foram incubadas durante seis dias a 37°C quando as células foram manchadas com o corante de viabilidade fixável Ghost Red-780 para excluir células mortas. Dados de citometria de fluxo foram colhidos utilizando um citômetro de fluxo BD FACSCanto II. A percentagem de proliferação de Teff foi determinada utilizando o software de análise citométrica de fluxo FACSDiva. A percentagem de proliferação de Teffs foi determinada por bloqueio em Teffs que tinham diluído o seu corante de proliferação CellTrace CFSE após pelo menos um ciclo de divisão.

[00445] Este exemplo mostrou que o S267E de IgG1f de ICOS.33 tanto inverteu a supressão mediada por Treg quanto realçou a proliferação de Teff, como mostrado nas Figura 8A e 8B. Os valores mostrados na legenda nas Figuras 8A e 8B são as relações de Teff:Teg. Desse modo, um valor de 1 significa uma relação de 1 Teff para 1 Treg, um valor de 2 significa 2 Teff para 1 Treg e assim por diante, essencialmente titulando as Tregs. Na relação de 1:1, o S267E de IgG1f de ICOS.33 mostrou um aumento de aproximadamente 4 vezes em proliferação e evidente inversão de supressão mediada por RA+Treg. Foi também observado um aumento de 7 vezes em proliferação e evidente inversão de supressão mediada por RO+Treg, medida pela diferença em percentagem de divisão de Teff entre o controle de isótipo e o anticorpo ICOS. À medida que as Tregs foram tituladas, houve uma diminuição proporcional de supressão evidente e na ausência de Treg houve um aumento de aproximadamente 1,5 vez na percentagem de

Teff dividida em relação ao controle de isótipo. O efeito na presença de Treg poderia ser um resultado de decréscimo da suscetibilidade de Teff à supressão de Treg ou um decréscimo na capacidade supressivva de Tregs. É benéfico que o S267E de IgG1f de ICOS.33 revertesse a supressão mediada por Treg e aumentasse a proliferação de Teff, pois isso mostrou que o S267E de IgG1f de ICOS.33 estimulou a resposta imune. EXEMPLO 5 Função Efetora de Fc In vitro de S267E de IgG1f de ICOS.33

[00446] O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e as atividades de ligação ao fator C1q do complemento de S267E de IgG1f de ICOS.33. Marcação de Células Alvo com Calceína AM

[00447] As células T CD4+ do Doador 2 (Stanford Blood ID W0 70516511239) foram isoladas, ativadas e marcadas com Calceína AM. Em síntese, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram purificadas a partir de camada leucocitária heparinizada por centrifugação gradiente de densidade e lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) suplementada com FBS a 2% (HyClone). As células T CD4+ foram isoladas por seleção negativa utilizando um kit de separação com base em conta magnética (StemCell Technologies) e um separador celular RoboSep automatizado (StemCell Technologies). A partir do isolamento de células T CD4+, Tregs CD25+ foram esgotadas utilizando um kit de separação com base em contas magnéticas (Miltenyi Biotec). Células T CD4+ purificadas foram ressuspensas a 2,5 x 106 células/mL em meio R10 e ativadas com o kit de Ativação/Expansão de Célula T (Miltenyi Biotec) em uma conta por duas células durante três dias a 37°C. No dia 3, as células foram contadas, peletizadas, e ressuspensas a 1 x 106 células/mL em PBS em um tubo cônico de 15 mL. Reagente de calceína AM foi preparado adicionando-se 20 µL de DMSO ultrapuro ao tubo reagente contendo 50 µg de reagente liofilizado. Um volume de 2 µL de Calceína AM reconstituída foi adicionado a células suspensas para cada 1 mL de volume. As células foram centrifugadas e colocadas em uma incubadora a 37°C durante 30 minutos. Após o período de incubação, as células alvo marcadas foram lavadas três vezes com meio de ensaio ADCC, e sua concentração foi ajustada para 105 células/mL em meio de ensaio. Ensaio De Citotoxicidade Celular Dependente De Anticorpo (Adcc) Com Células T Cd4+ Ativadas Como Alvos

[00448] Células efetoras NK humanas primárias foram purificadas de PBMC frescas de dois diferentes doadores (Doadores DDC 9 e 12) e estimuladas com IL-2. Em síntese, as PBMC foram purificadas a partir de amostras de sangue total heparinizadas por centrifugação gradiente de densidade e lavadas com PBS suplementado com FBS a 2% (HyClone). Células NK foram isoladas de PBMC por seleção negativa utilizando um kit de separação com base em conta magnética (Miltenyi Biotech) e um Separador autoMACs (Miltenyi Biotech). Células NK purificadas foram ressuspensas a 1x106 células/mL em meio MyeloCult suplementado com 500 IU/mL de IL-2 e incubadas durante a noite a 37°C.

[00449] No dia seguinte, células efetoras NK ativadas foram lavadas duas vezes em meio de ensaio e sua concentração foi ajustada para 4,33-5x105 células/mL em meio de ensaio. Células alvo marcadas (50 µL/cavidade) foram adicionadas a uma placa de 96 cavidades com a base em U, contendo 50 µL/cavidde de anticorpo teste ou de controle. Células efetoras NK ativadas foram em seguida adicionadas (100 µL/cavidade) para resultar em uma relação final de célula efetora para célula alvo (E:T) de 10:1 e uma concentração final de anticorpo variando de 0,0002 µg/mL a 1 µg/mL. A placa foi então colocada em uma incubadora a 37°C umidificada durante duas horas. O sobrenadante (50 µL/cavidade) foi transferido para uma placa preta óptica de 96 cavidades óptica, e a intensidade de fluorescência foi lida em uma leitora de placas EnVision definido para filtros de excitação 485 e emissão 535.

[00450] As células alvo incubadas com células efetoras na ausência de anticorpo possibilitaram o controle para base de lise independente de anticorpo (lise espontânea), enquanto as células alvo lisadas com 20 µL ou 100 µL/cavidade de tampão Delfia Lysis representaram liberação máxima no ensaio.

[00451] A percentagem de lise celular dependente de anticorpo foi calculada com base na intensidade de fluorescência média (MFI) com a seguinte fórmula:

[00452] A percentagem de lise de célula alvo foi representada para cada anticorpo utilizando o software Prism v5.01 da GraphPad Inc. Resultados ADCC de NK Primária com Células T CD4+ Ativadas como Alvos

[00453] O anticorpo anti-ICOS S267E de IgG1f de ICOS.33 foi testado quanto à sua capacidade de induzir ADCC de células T CD4+ que expressam ICOS como alvos e comparado à ADCC induzida por ICOS.33 IgG1. Dois experimentos foram realizados com pares de doador de células alvo e célula NK. Em cada caso, S267E de IgG1f de ICOS.33 com o isótipo IgG1 modificado induziu menos ADCC de células T CD4+ ativadas do que ICOS.33 IgG1. Os dados destes experimentos estão resumidos na Tabela 11 e Figuras 9A e 9B.

Tabela 11 - Comparação da ADCC Mediado por Anti-ICOS IgG1 e Isótipos IgG1 Modificados .=, Ensaio de Ligação de C1q

[00454] A ligação de S267E de IgG1f de ICOS.33 ao C1q humano foi investigada por ELISA. Todos os anticorpos foram revestidos em uma placa de imunoensaio de alta ligação a 10 µg/mL em PBS a 50 µL por cavidade. Um controle de ligação não específica com cavidades revestidas com apenas PBS foi incluído. A placa foi incubada durante a noite a 4°C. No dia seguinte, a placa e todos os reagentes foram equilibrados em temperatura ambiente; todas as etapas subsequentes foram realizadas em temperatura ambiente. Sítios de ligação de proteína desocupados foram bloqueados com SmartBlock® a 200 µL por cavidade durante 30 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com solução de lavagem (PBS + Tween-20 a 0,05%) a 200 µL/cavidade. Doses graduais de C1q humano (48,00 a 0,76 µM) em tampão de ensaio ELISA foram adicionadas a 50 µL/cavidade. A placa foi incubada durante duas horas e lavada três vezes com solução de lavagem. A ligação de C1q humano a anticorpos imobilizados foi detectada por um mAb anti-C1q de camundongo biotinilado diluído 1:1000 em tampão de ensaio ELISA e incubado durante uma hora. Após a placa ter sido lavada três vezes, estreptavidina-poli-HRP, diluída 1:5000 em tampão conjugado, foi adicionada a 50 µL/cavidade e incubada durante 30 minutos. Uma etapa final de lavagem foi completada, e a placa foi desenvolvida com substrato de TMB a 50 µL/cavidade por 5 minutos. A densidade óptica foi lida a 650 nm na Leitora de Microplaca SpectraMax 340PC384 (Molecular Device). Os dados foram grafados usando Prism, versão

5.01. Resultados S267E de IgG1f de ICOS.33 Liga-se ao Componente C1q do Complemento Humano

[00455] O anticorpo anti-ICOS S267E de IgG1f de ICOS.33 foi testado quanto à sua capacidade de se ligar ao componente C1q do complemento humano em comparação com o ICOS.33 IgG1 em um ensaio ELISA. Verificou-se que S267E de IgG1f de ICOS.33 liga-se a C1q humano com afinidade mais elevada do que ICOS.33 IgG1. Os dados estão resumidos na Figura 10 e Tabela 12. Tabela 12 S267E de IgG1f de ICOS.33 Liga C1q Humano .=,

Conclusão

[00456] S267E de IgG1f de ICOS.33 com uma IgG1 modificada induziu menos morte mediada por ADCC de células T CD4+ expressando ICOS, contudo ligado com maior afinidade ao C1q humano do que um anticorpo anti-ICOS com IgG1 de tipo selvagem. EXEMPLO 6 Atividade antitumoral in vivo Atividade Antitumoral de ICOS Anti-Camundongo como Monoterapia ou Combinada com Outros Agentes

[00457] Variações no isótipo de anticorpos que são específicos para receptores de superfície de células T (tanto coestimulatórios e co- inibitórios) podem alterar a atividade antitumoral. As variantes de isótipo Fc de camundongo tanto de 17G9 e ICOS.4 foram geradas e expressas como isótipos de IgG2a de camundongo. Ambas mostraram atividade antitumoral superior em comparação com variantes de IgG1 de camundongo, como descrito abaixo. Embora não ligado a qualquer teoria, isto foi provavelmente devido ao esgotamento de células T regulatórias (Tregs) no sítio de tumor, bem como à expansão de células T efetoras (Teff) do agonismo mediado por anticorpo de ICOS. Estudos de camundongos com o 17G9 Ab também mostraram uma sub- regulação do receptor ICOS em populações de células T tanto no baço como no tumor. Observou-se que a expressão de ICOS é menor em camundongos tratados com isótipos de Ab que envolvem FcR (mIgG1 e mIgG2a), enquanto que os níveis de receptor estavam inalterados nos camundongos tratados com um Ab sem ligação a FcR (mIgG1 D265A, também referido como "ICOS.1 D265A"). A dependência da interação com FcR sugeriu que a reticulação é necessária para essa sub- regulação. É importante ressaltar que a atividade antitumoral foi demonstrada mesmo que o receptor tenha sido sub-regulado.

[00458] Variantes de IgG1 de camundongo tanto de 17G9 (ICOS.1)

quanto do anticorpo de hamster parental (ICOS.4), foram ambas esperadas que tivessem atividade agonista devido à capacidade de se ligarem a FcRII (receptor inibitório). Como resumido na Tabela 13, ambas as variantes de IgG1 de camundongo demonstraram atividade antitumoral a um nível detectável porém inferior em relação ao isótipo IgG2a, e uma menor redução em Tregs tumorais.

Ao contrário, um anticorpo anti-ICOS que não se liga a FcRs (17G9-IgG1-D265A) não apresentou nenhuma atividade antitumoral.

Embora um isótipo de depleção tal como a IgG2a de camundongo apresente maior atividade antitumoral do que a mIgG1 agonística, a alta expressão de ICOS em Teffs torna este mecanismo de ação menos favorável quando considerado em conjunto com outro tratamento, como tratamento com anticorpo anti-CTLA-4, que é esperado esgotar Tregs de forma mais seletiva.

Consistente com as descobertas in vitro de melhor atividade agonista em isótipos com a mutação S267E, esses isótipos também mostraram atividade antitumoral ligeiramente maior ou equivalente que a de IgG1 Humana em camundongos transgênicos FcR humanos.

Tabela 13 – Sumário de Estudos de Eficácia Usando ICOS Anti- Camundongo como Monoterapia ou Combinado com Outros Agentes Tumor mAbs Atividade Antitumoral Colon Anti-ICOS parental-mIgG2a ou Monoterapia com anti-ICOS IgG2a mIgG1 (ICOS.4) 69% de TGI, 1/10 TF e com ICOS CT26 IgG1 15% de TGI, 0/10 TF Anti-PD-1 4H2-mIgG1-D265A Monoterapia 5% de TGI, 0/10 TF Anti-CTLA-4 9D9-mIgG2b Combinado com anti-ICOS IgG1 83% de TGI, 3/10 TF Monoterapia 15% de TGI, 0/9 TF Combinado com anti-ICOS IgG1 48% de TGI, 0/9 TF Colon Anti-ICOS parental-mIgG2a ou Monoterapia com IgG2b de rato de mIgG1 ou IgG2b de rato anti- ICOS 25% de TGI 0/9 TF e com MC38 ICOS 17G9 anti-ICOS IgG1 6% de TGI, 0/10 TF Anti-PD-1 4H2 mIgG1-D265A Monoterapia 73% de TGI, 1/9 TF Combinado com IgG2b de rato anti- ICOS 92% de TGI, 5/9 TF Thymom Anti-ICOS parental-mIgG2a ou Monoterapia com ICOS IgG2a 69% a mIgG1 de TGI, 2/8 TF e com IgG1 anti- ICOS 11% de TGI, 1/8 TF EG7 Sarcoma Anti-ICOS parental-mIgG2a ou Monoterapia com anti-ICOS IgG2a mIgG1 94% de TGI, 0/8 TF e com IgG1 1956 anti-ICOS 50% de TGI, 2/10 TF Fibrosar Anti-ICOS parental-mIgG2a ou Monoterapia com anti-ICOS IgG2a coma mIgG1 84% de TGI, 6/10 TF e com anti- ICOS IgG1 55% de TGI, 5/10 TF SA1N Atividade Antitumoral de Variantes Fcs IgG1 ICOS

[00459] Para determinar se a IgG1 Humana S267E comporta-se de forma similar aos anticorpos IgG1 de camundongo, porém com mais potência no que diz respeito à ligação de FcR ao CD32, e ao envolvimento do receptor agonista, foram realizados experimentos adicionais de modelo tumoral. Especificamente, para avaliar as variantes do isótipo anti-humano ICOS em camundongos transgênicos do receptor Fc humano (FcR), foram construídos os seguintes anticorpos:

[00460] hIgG1 Anti-ICOS - Anticorpo monoclonal para ICOS de camundongo, ICOS anti-camundongo de hamster/camundongo quimérico, isótipo IgG1 (ICOS.4 hg1);

[00461] SE de hIgG1 Anti-ICOS - anticorpo monoclonal para ICOS de camundongo, ICOS anti-camundongo de hamster/camundongo quimérico, isótipo SE de IgG1 (ICOS.4 hg1 SE), que possui uma mutação que a permite ligar-se a CD32R e CD32B melhor que a versão não modificada; e

[00462] Controle de isótipo IgG1 - um controle de isótipo de IgG1 totalmente humana (DT-1D12 hg1).

[00463] Células de carcinoma do cólon murino MC38 foram implantadas subcutaneamente nos flancos direitos dos camundongos. Os camundongos foram divididos em três grupos de tratamento e doseados com 60 µg de (1) IgG1 anti-ICOS ou (2) SE de IgG1 anti-ICOS ou (3) anticorpo de controle de isótipo IgG1 (isto é, anticorpo do mesmo isótipo que o anticorpo ICOS, porém que não se liga a qualquer proteína murina de ocorrência natural, por exemplo, anticorpos contra KLH, toxina da difteria, entre outros) nos Dias 7, 10 e 14 após o implante. O peso corporal e o tamanho do tumor foram medidos duas vezes por semana até a conclusão do estudo no Dia 52. Se os tumores fossem ≥ 2000 mm3 ou parecessem ulcerados, o animal era eutanizado. Foi observado realce da atividade antitumoral com o tratamento com mAb de SE de IgG1 anti-ICOS a 60 µg por camundongo; a inibição média do crescimento tumoral (TGI) foi de 76% em comparação com 63% para IgG1 anti-ICOS sem a modificação de SE, como mostrado na Tabela 14 e Figuras 11A-C. Nenhuma mudança significativa no peso corporal foi associada com os tratamentos, nem foram observados quaisquer sinais evidentes de toxicidade clínica. Resultados

[00464] No modelo de camundongos transgênicos FcR humano, a administração de SE de IgG1 de ICOS e mAbs de IgG1 de ICOS resultou em 76% e 63% de inibição média do crescimento do tumor (TGI), respectivamente (como mostrado na Tabela 14). Cinco regressões completas foram observadas em cada grupo no nível de dose (60 µg/camundongo) testado (Tabelas 14 e Figuras 11A-C). Nenhum sinal físico de toxicidade ou perda de peso corporal foi observado.

Tabela 14 - Atividade Antitumoral de Variantes Fc de IgG1 de ICOS Média % de TGI Completas Tratamento (µg/camundongo) no Dia 30 Regressõesa Controle de Isótipo de IgG1, 60 µg N/A 0/9 Anti-ICOS.4 hg1b, 60 µg 63 5/9 Anti-ICOS.4 hg1c SE, 60 µg 76 5/9 a Completa regressão = camundongo com tumores <20 mm3 durante pelo menos 3 medições no último dia de estudo. b ICOS.4 com IgG1 humana c ICOS.4 com IgG1 Humana e mutação de S267E Conclusões

[00465] Em um estudo de modelo tumoral singeneico de Ravetch (resumido na Tabela 15), ambas as monoterapias anti-ICOS promoveram modesta atividade antitumoral, com SE de IgG1 anti-ICOS demonstrando eficácia ligeiramente maior no dia 30 (76% vs. 63% do TGI médio) (Tabela 14). Nenhuma mudança significativa no peso corporal foi associada com os tratamentos, nem foram observados quaisquer sinais evidentes de toxicidade clínica. No geral, as monoterapias anti-ICOS promoveram atividade antitumoral, com SE de IgG1 anti-ICOS demonstrando eficácia ligeiramente maior no dia 30 (76% vs. 63% do TGI médio). Ambos os tratamentos resultaram em cinco camundongos que se livraram de seu tumor. Nenhuma mudança significativa no peso corporal foi associada com os tratamentos, nem foram observados quaisquer sinais evidentes de toxicidade clínica. Tabela 15 - Estudos de Farmacologia In Vivo Tipo de Cronograma/Via/Duração do Faixa de Animais por Estudo/Espécie/ Estudo/Veículo/ Doses Grupo (M/F) Cepa Formulação (g/camundo ngo) Atividade Anticorpos administrados IP após o 60 9 por grupo; Antitumoral implante nos Dias 7, 10, e 14 g/camundong coortes de Modelo de tumor o gênero misto Controle de isótipo de IgG1 humana MC38/camundong os C57/B6 Anti-ICOS.4 hg1 transgênicos de Anti-ICOS.4 hg1 SE FcyR humano EXEMPLO 7 Modelo de tumor Sa1N

[00466] O modelo de camundongo com fibrossarcoma Sa1N foi utilizado para avaliar a atividade antitumoral de anticorpos monoclonais anti-ICOS quiméricos. O mIgG1 de ICOS.4 é um bom substituto para o S267E de IgG1s de ICOS.33, porque esta variante ICOS.4 liga-se preferivelmente ao receptor Fc inibitório do camundongo. Visto que o modelo do tumor é realizado em um receptor Fc de camundongo expressando camundongo, isto torna a variante ICOS.4 um bom substituto para o anticorpo humano. A variante mIgG2a de ICOS.4 é um bom substituto para o anticorpo IgG1 de ICOS.33, porque esta variante

ICOS.4 é mais similar à IgG1 humana, pois se liga aos receptores Fc ativadores de camundongos. Além disso, estas variantes foram particularmente relevantes como substitutos, uma vez que nenhuma modificação foi necessária nas suas regiões variáveis, que já reagiram de forma cruzada com a proteína ICOS de camundongo e humana. Ao contrário, a IgG1 murina anti-ICOS.1 (mIgG1) D265A não se liga a FcRs. Um anticorpo IgG1 que não se liga à proteína ICOS foi usado como um controle de isótipo.

[00467] Para avaliar a atividade antitumoral no modelo de fibrossarcoma Sa1N após o tratamento com anticorpos monoclonais quiméricos anti-ICOS substitutos, células Sa1N foram implantadas subcutaneamente nos flancos direitos de camundongos. Os camundongos receberam doses de mAb em cinco grupos de tratamento nos dias 7, 10 e 14 após o implante: D265a de IgG1 (mIgG1) murino anti-ICOS.1 quimérico, mIgG1 anti-ICOS.4 hIgG1 anti-ICOS.4, mIgG2a anti-ICOS.4, ou controle de isótipo IgG1, cada um a 10 mg/kg.

[00468] No dia 15, o tumor e o baço foram colhidos de quatro camundongos por grupo para análise de imunomonitoração. Nos camundongos remanescentes, o peso corporal e o tamanho do tumor foram medidos duas vezes por semana até o término do estudo no Dia

56. Se os tumores fossem ≥ 2000 mm3 ou parecessem ulcerados, os animais eram eutanasiados.

[00469] No dia 23 após o implante, o último dia em que a inibição do crescimento do tumor mediana (TGI) pôde ser calculada com base em 60% dos animais do grupo de tratamento que permaneceram vivos, a eficácia do tratamento dos isótipos anti-ICOS em tumores Sa1N foi evidente quando comparada com o isótipo tratamento controle. Os valores de TGI medianos foram de 21% (D265A de mIgG1 de ICOS.1), 55% (mIgG1 de ICOS.4), 69% (hIgG1 de ICOS.4) e 84% (mIgG2a de ICOS.4). Nenhuma toxicidade era evidente em qualquer grupo de tratamento, como demonstrado por perdas médias e medianas de peso corporal abaixo de 20%.

[00470] Os dados de monitorização imunológica indicaram níveis variáveis de depleção intratumoral de Treg em todos os isótipos anti- ICOS. Além disso, níveis elevados de células T CD8+ intratumorais foram observados em todos os tratamentos com anti-mICOS.4.

[00471] As respostas dos tumores foram em parte correlacionadas com a redução de Treg no Dia 15, o que concorda com a ligação relativa destes mAbs aos receptores Fc. Estes dados sugeriram que um mAb anti-ICOS que reduzisse Tregs seria mais potente do que um que não reduzisse. Tratamento Antitumoral

[00472] No dia 7 após o implante (02 de fevereiro de 2015), 70 camundongos foram randomizados para cinco grupos de 14 ratos de acordo com o volume do tumor (LxWxH/2). Os volumes médios de tumor foram aproximadamente de 134 mm3 para cada grupo. Nos dias 7, 10 e 14, foi administrado o controle de isótipo ou o mAb designado. Os camundongos foram doseados intraperitonealmente (IP). Imuno-Monitorização de Populações de Células T

[00473] Para também estudar a atividade antitumoral em nível celular, imunomonitoração foi realizada para examinar subconjuntos de células imunes em sítios de tumor e para determinar se existe uma ligação entre o tratamento com anticorpo e mudanças nas populações de células linfoides. No dia 15, quatro camundongos de cada grupo de tratamento foram colhidos pelo operador da instalação de animais para tumores e baços. Os tecidos foram primeiro processados em um gentleMACS Octo Dissociator® (Miltenyi, San Diego, CA) e em seguida manchados para diferentes marcadores de células T. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo no citômetro de Fortessa (BD Biosciences, San Jose, CA). Monitoramento pós-tratamento

[00474] Os tumores e os pesos corporais dos camundongos foram medidos duas vezes por semana até o término do estudo. Os tumores foram medidos em três dimensões com um compasso de calibre digital eletrônico, e os dados foram eletronicamente registrados usando o software StudyDirector da Studylog Systems (South San Francisco, CA). Os camundongos foram verificados diariamente quanto a, alterações posturais, cuidados pessoais e respiratórias, bem como letargia. Os camundongos foram eutanizados quando os tumores atingiram o ponto final de 2000 mm3 ou apareceram ulcerados. Resultados Resposta do tumor

[00475] O último dia em que todos os camundongos no estudo estavam vivos foi o dia 14 após o implante, o último dia de dosagem IP. Como resultado, a inibição média do crescimento tumoral (TGI) não pôde ser calculada. No dia 23 após o implante, o último dia em que o TGI mediana pôde ser calculada, a eficácia do tratamento dos isótipos anti-ICOS nos tumores Sa1N foi evidente quando comparado com o tratamento de controle de isótipo. Os valores de TGI medianos foram de 21% (D265A de mIgG1 de ICOS.1), 55% (mIgG1 de ICOS.4), 69% (hIgG1 de ICOS.4) e 84% (mIgG2a de ICOS.4).

[00476] As curvas de crescimento tumoral por grupo de tratamento são mostradas nas Figura 12A-E. A TGI é resumida por grupo de tratamento na Tabela 16. As curvas de crescimento tumoral médias e medianas por grupo de tratamento são apresentadas nas Figuras 13A e 13B.

Tabela 16 – Crescimento de Tumor por Grupo de Tratamento Dia 14 Dia 23 Volume de Volume de

TGI TGI Grupo de Tratamento Tumor Médio Tumor Mediano (%) (%) (mm3) (mm3) Controle de Isótipo 387 N/A 621 N/A mIgG1, 10 mg/kg Anti D265A de mIgG1 de 295 24 493 21 ICOS.1, 10 mg/kg Anti mIgG1 de ICOS.4, 10 326 16 282 55 mg/kg Anti hIgG1 de ICOS.4, 10 322 17 190 69 mg/kg Anti ICOS.4 mIgG2a, 10 264 32 101 84 mg/kg

[00477] As diferenças de eficácia entre os isótipos anti-ICOS demonstraram uma hierarquia de D265A de mIgG2a> hIgG1> mIgG1> mIgG1. A variante de D265A de mIgG1 inerte, que não pode ligar FcR, exibiu alguma atividade antitumoral com 21% de TGI mediana no dia 23. O isótipo mIgG1 não modificado, que pode envolver o receptor Fc inibitório, FcRIIB, pode potenciar o agonismo e neste estudo mostrou 55% de TGI mediana no dia 23. Consistentes com os seus valores de TGI mais elevados, os isótipos mIgG2a e hIgG1 podem ligar receptores de activação murinos e mediar ADCC ou fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) de Tregs que expressam ICOS. Além disso, níveis reduzidos de Tregs intratumorais foram associados à regressão tumoral aumentadaem modelos de tumor de camundongos. Nenhuma toxicidade era evidente em qualquer grupo de tratamento, uma vez que as mudanças médias e medianas do peso corporal foram abaixo de 20%.

Mudanças nas Populações de Células T

[00478] A depleção de Treg foi observada no Dia 15 em grupos tratados com variantes de mIgG2a e hIgG1 do mAb anti-ICOS.4, uma vez que as percentagens de células Foxp3+ foram significativamente inferiores nestes grupos do que no grupo de controle de isótipos, como mostrado nas Figura 14A-D. A mesma tendência foi também observada no grupo tratado com o anticorpo anti-ICOS não depletor (mIgG1). Além disso, o aumento de células T efetoras CD4+ (Teffs) foi evidente em todos os grupos de tratamento com a seguinte classificação: mIgG1> hIgG1> mIgG2a. Esta observação sugeriu que algumas Teffs CD4+, que provavelmente são ICOS+, podem ter sido esgotadas pelo isótipo mIgG2a, que tem o maior potencial de esgotamento. Níveis elevados de células T CD8+ intratumorais também foram observados em todos os tratamentos com anti-mICOS.4. Conclusão

[00479] Como resumido na Tabela 17, em um modelo tumoral singeneico Sa1N estadiado, os isótipos anti-ICOS quiméricos promoveram níveis variados de atividade antitumoral, variando de 21% a 84% de TGI mediana no dia 23. As potências antitumorais das variantes de isótipo neste estudo foram classificadas como segue: D265A de mIgG2a> hIgG1> mIgG1> mIgG1. As respostas tumorais foram em parte correlacionadas com a depleção de Treg no Dia 15, o que concorda com a ligação relativa destes mAbs aos receptores Fc.

[00480] Os resultados deste estudo mostraram que a escolha do isótipo é um importante determinante de tratamento com anticorpo anti- ICOS. O isótipo mIgG2a anti-ICOS, que se liga aos receptores Fc ativadores equivalentes ao isótipo IgG1 Humana, foi capaz de esgotar as Tregs intratumorais e mostrou a maior eficácia na inibição do crescimento tumoral. As variantes do isótipo anti-ICOS quimérico promoveram níveis variáveis de atividade antitumoral. As respostas tumorais foram em parte correlacionadas com o esgotamento de Treg no dia 15, de acordo com a ligação relativa destes mAbs a receptores Fc. Resultados sugeriram que mg2a promoveu a melhor atividade antitumoral. Tabela 17 - Estudos de Farmacologia In vivo Tipo de Cronograma/Via/Duração do Faixa de Animais Estudo/Espécie/Cepa Estudo/Veículo/ Doses por Formulação Grupo (g/camun- (M/F) dongo) Atividade Antitumoral de Anticorpos administrados IP após o 10 mg/kg 14 por anti-ICOS variantes de implante nos Dias 7, 10, e 14; grupo; F isótipo no modelo de Camundongo Controle de Isótipo de tumor Sa1N com IgG1, imunomonitoração de Anti- D265A de mIgG1 de ICOS.1, subconjuntos de célula imune/camundongos A/J mIgG1 anti-ICOS.4, Anti- hIgG1 de ICOS.4, Anti-ICOS.4 mIgG2a EXEMPLO 8 Combinação de Anticorpos Anti-ICOS com um Anticorpo Anti-PD-1 Estudo 1

[00481] Para avaliar a atividade antitumoral no modelo de carcinoma colorretal CT26 após o tratamento com um anticorpo monoclonal anti- ICOS substituto, ICOS.4 (variante de IgG1 de camundongo do anticorpo de hamster parental), em doses variáveis e/ou mAb anti-PD-1, células CT26 foram implantados subcutaneamente nos flancos direitos de camundongos. Quando os tumores atingiram 31 mm3, os camundongos foram randomizados em nove grupos de tratamento de 10 a 14 camundongos cada. Cada camundongo foi doseado nos Dias 7, 10 e 14 após o implante com mAb ou um controle de isótipo (isto é, um anticorpo do mesmo isótipo, porém que não se liga a qualquer proteína de camundongo de ocorrência natural, por exemplo, anticorpos contra KLH, toxina da difteria, entre outros).

[00482] Os camundongos foram pesados e os tumores foram medidos duas vezes por semana até ao final do estudo no Dia 35. Se os tumores fossem ≥ 2000 mm3 ou parecessem ulcerados, os animais eram eutanizados. No dia 15 após o implante, quatro camundongos em quatro grupos de tratamento foram sacrificados para coleta do baço e tumor. Os tecidos foram processados em suspensões celulares individuais e as células foram manchadas utilizando anticorpos de citometria de fluxo para analisar as populações de células T.

[00483] No dia 21 após o implante, o último dia em que a inibição média do crescimento tumoral (TGI) em relação ao anticorpo de controle de isótipo pôde ser calculada, os valores de TGI para anti-ICOS em monoterapia foram de 37% e 33% em 3 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente; O valor de TGI para monoterapia anti-PD-1 foi de 22%. Quando anti-ICOS a 10 mg/kg, 3 mg/kg ou 1 mg/kg foi combinado com mAb anti-PD-1, valores TGI médios >54% foram observados. Quando anti-ICOS a 0,3, 0,1 ou 0,03 mg/kg foi combinado com mAb anti-PD-1, valores TGI médios <40 porém >20%. Nenhuma toxicidade estava evidente em qualquer grupo de tratamento. Tratamento de Anticorpo

[00484] No dia 7 pós-implante de células CT26, 120 camundongos foram randomizados para 10 grupos de 10 a 14 camundongos cada, de acordo com o volume do tumor. Os grupos tinham um volume médio de tumor de aproximadamente 31 mm3. Os camundongos foram doseados com os anticorpos nos dias 7, 10 e 14. Monitoramento pós-tratamento

[00485] Os camundongos foram verificados diariamente quanto a alterações posturais, cuidados pessoais e respiratórias, bem como letargia. Os animais foram pesados pelo menos duas vezes por semana e foram eutanasiados quando a perda de peso foi ≥ 20%. Os flancos de cada animal foram verificados quanto à presença e tamanho de tumores pelo menos duas vezes por semana até a morte, a eutanásia ou o término do período de estudo. Os tumores foram medidos em três dimensões (comprimento [L], largura [W] e altura [H]) com compasso de calibre digital eletrônico e registrados. Os volumes tumorais foram calculados usando a equação: Volume = (LxWxHx0,5). A resposta ao tratamento foi medida em função da inibição do crescimento tumoral (TGI) e foi calculada como: (referência mm3 - artigo teste mm3)/referência mm3x100. Quando o tumor atingiu um volume maior que aproximadamente 2000 mm3 ou apareceu ulcerado, o animal foi eutanizado. Imunomonitorização de populações de células T

[00486] Para investigar o efeito do anticorpo ICOS em populações de células T, os tecidos foram colhidos de quatro camundongos cada em quatro grupos de tratamento no dia 15 após o implante. Os baços e tumores foram homogeneizados em um gentleMACS Octo Dissociator™ (Miltenyi, San Diego, CA). Suspensões unicelulares foram manchadas para marcadores de células T utilizando anticorpos conjugados com fluorocromo. Fluorescência de anticorpo foi detectada por citometria de fluxo em um citômetro Fortessa (BD Biosciences, San Jose, CA) e os resultados foram analisados utilizando o software FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, OR). Análise Estatística

[00487] A média, o desvio padrão (DP) e os valores medianos de tamanhos de tumor e os valores de peso corporal médio foram calculados. O valor médio foi calculado enquanto 100% dos animais do estudo permaneceram vivos; e o valor mediano foi calculado enquanto pelo menos 60% dos animais do estudo permaneceram vivos. Análise unidirecional de variância (ANOVA) foi usada para determinar se as médias entre os grupos de tratamento eram estatisticamente significativamente diferentes; Valores de p≤0,05 foram considerados significativamente diferentes. O software GraphPad Prism® versão 5.01 (GraphPad Software, La Jolla, CA) foi usado para plotar os dados e determinar as diferenças estatísticas entre os grupos. Curvas de crescimento tumoral para camundongos individuais por grupo de tratamento podem ser observadas nas Figuras 15A-J. As curvas de crescimento tumoral média e mediana por grupo de tratamento são apresentadas nas Figura 16A e 16B. Resultados Inibição do Crescimento Tumoral

[00488] No dia 21 após o implante de tumor, o último dia em que a TGI mediana pôde ser calculada, os camundongos tratados com mIgG1 anti-ICOS.4 como monoterapia a 10 mg/kg mostraram 33% de TGI mediana em relação a camundongos tratados com anticorpo mIgG1 de controle. Camundongos tratados com monoterapia de mIgG1 anti- ICOS.4 a 3 mg/kg mostraram TGI a 37% e o mAb de 4H2 anti-PD-1 de único agente mostrou 22% de TGI. No término do período de estudo (Dia 35), as proporções de camundongos livres de tumor foram de 0/10 no grupo de anticorpo de controle, 0/10 no grupo de anti-PD-1, 1/10 no grupo mIgG1 anti-ICOS.4 a 10 mg/kg e 0/10 no grupo mIgG1 anti- ICOS.4 a 3 mg/kg. A combinação de PD-1 anti-camundongo com mIgG1 anti-ICOS.4 em várias doses (10, 3 ou 1 mg/kg) apresentou atividade antitumoral superior àquela de qualquer monoterapia (valores de TGI de 54%, 60% e 66%, respectivamente). Os números de camundongos livres de tumor no término do estudo foram os mesmos nestes grupos (1/10 camundongos livres de tumor), com a exceção da dose de 3 mg/kg que tinha 4/10 camundongos livres de tumor. Além disso, a TGI mediana foi também calculada ao longo dos 21 dias utilizando a diferença relativa na área sob a curva de efeito entre os grupos de controle e de tratamento (Tabela 18).

Tabela - 18 Inibição do Crescimento de Tumpr por Grupo de Tratamento (Relativo ao Controle de Isótipo) Análise de imunomonitorização

[00489] A imunomonitorização foi realizada no dia 15 após o implante em determinados grupos de tratamento (Figura 17A-D). Uma depleção de Tregs Foxp3+ em linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) foi observada nos grupos tratados com mIgG1 anti-ICOS.4 de único agente (10 mg/kg e 3 mg/kg) (Figura 17A). Os camundongos tratados com mIgG1 anti-PD- 1 não mostraram uma redução em Teg Tregs. Os grupos tratados com mIgG1 anti-PD1 ou anti-ICOS.4 a 3 mg/kg também mostraram um aumento no subconjunto de células T CD8+ em TILs (Figura 17B). Em 10 mg/kg, o tratamento com anti-ICOS.4 de único agente pareceu ter os mesmos níveis desse subconjunto em comparação com o grupo controle.

[00490] Os níveis de Ki-67, um marcador para a proliferação celular, foram aumentados no subconjunto de células T efetoras CD4+ após o tratamento com agente único com mIgG1 anti-ICOS.4 a 3 mg/kg (Figura 17C). A percentagem de células positivas para granzima B, um marcador para a atividade citolítica em células T CD8+, também foi atribuída como sendo maior em grupos tratados com mIgG1 anti-ICOS a 3 mg/kg ou apenas com anti-PD-1 (Figura 17D).

Conclusão

[00491] Em um modelo de tumor singeneico CT26 encenado, o mIgG1 anti-ICOS.4 como monoterapia demonstrou TGI mais potente quando mIgG1 anti-ICOS.4 foi dosado em 3 mg/kg (37% de TGI no dia 21, 0/10 camundongos livres de tumor) vs. 10 mg/kg (33% de TGI no dia 21, 0/10 camundongos livres de tumor). Os dados de imunomonitoração mostraram uma percentagem mais alta de células T CD8+, níveis mais elevados de Ki-67 nos efetores CD4+ e maiores níveis de granzima B nas células T CD8+ no grupo de tratamento de 3 mg/kg de mIgG1 anti-ICOS do que no grupo de tratamento de 10 mg/kg. Estes dados sugerem que, para a monoterapia com anti-ICOS, uma dose de 3 mg/kg tem mais atividade antitumoral do que uma dose de 10 mg/kg.

[00492] O tratamento combinado de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 a 10 mg/kg, 3 mg/kg e 1 mg/kg, com mIgG1 anti-PD-1 resultou em valores médios de TGI> 54%, com 1/10 de tumor de camundongo livre para estes grupos de tratamento, exceto anti-ICOS.4 a 3 mg/kg, que tinha 4/10 camundongos livres de tumor. Estes resultados sugerem níveis comparáveis de atividade antitumoral do mIgG1 anti-ICOS em combinação com tratamentos de mIgG1 anti-PD-1 nas três doses mais elevadas. Estudo 2

[00493] Este estudo foi designado para avaliar a atividade antitumoral no modelo de carcinoma colorretal CT26 após o tratamento com um anticorpo monoclonal anti-ICOS substituto, ICOS.4 (variante de IgG1 de camundongo do anticorpo de hamster parental) em doses variáveis e/ou mAb anti-PD-1. Células CT26 foram implantadas subcutaneamente nos flancos direitos de camundongos. Quando os tumores atingiram 45 mm3, os camundongos foram randomizados em nove grupos de tratamento de 15 a 20 camundongos cada. Cada camundongo foi doseado nos dias 9, 12 e 15 após o implante com mAb ou controle de isótipo irrelevante. Os camundongos foram pesados e os tumores foram medidos duas vezes por semana até ao final do estudo no dia 51. Se os tumores fossem ≥ 2000 mm3 ou parecessem ulcerados, os animais eram submetidos à eutanásia. Amostras de sangue total foram retiradas de camundongos em vários pontos de tempo (dia 9, dia 15 e dia 16 após o implante do tumor) para análise. No dia 16 após o implante do tumor, cinco camundongos em oito grupos de tratamento foram sacrificados para coleta do baço e tumor. Os tecidos foram processados em suspensões celulares individuais e as células foram manchadas utilizando anticorpos de citometria de fluxo para analisar as populações de células T.

[00494] No dia 29 após o implante de tumor, o último dia em que a inibição média do crescimento tumoral (TGI) relativa ao anticorpo de controle de isótipo pôde ser calculada, os valores de TGI para anti-ICOS em monoterapia foram de 5% a 30 mg/kg e 33% a 3 mg/kg; a monoterapia anti-PD 1 apresentou um valor de TGI de 74%. Quando o anti-ICOS a 30 mg/kg, 10 mg/kg, 3 mg/kg ou 1 mg/kg foi combinado com mAb anti-PD-1, valores médios de TGI> 74% foram observados. Nenhuma toxicidade era evidente em qualquer grupo de tratamento. Tratamento de Anticorpos

[00495] No dia 9 após o implante de tumor, 200 camundongos foram randomizados para nove grupos de 15 a 20 camundongos cada, de acordo com o volume do tumor. Os grupos tinham um volume médio de tumor de aproximadamente 45 mm3. Os camundongos foram doseados com os anticorpos nos dias 9, 12 e 15. Monitoramento pós-tratamento

[00496] Os animais foram verificados diariamente quanto a alterações posturais, cuidados pessoais e respiratórias, bem como, letargia. Os animais foram pesados pelo menos duas vezes por semana e foram submetidos à eutanásia se a perda de peso fosse ≥ 20%. Os flancos de cada animal foram verificados quanto à presença e tamanho dos tumores pelo menos duas vezes por semana até a morte, a eutanásia ou o término do período de estudo. Os tumores foram medidos em três dimensões (comprimento [L], largura [W] e altura [H]) com calibradores digitais eletrônicos e registrados. Os volumes tumorais foram calculados usando a equação: Volume = (L x W x H x 0,5). A resposta ao tratamento foi medida em função da inibição do crescimento tumoral (TGI) e foi calculada como: (referência mm3 - artigo teste mm3)/referência mm3 x 100. Quando o tumor atingiu um volume maior que aproximadamente 2000 mm3 ou apareceu ulcerado, o animal foi submetido à eutanásia. Imunomonitorização de Populações de Células T

[00497] Vários métodos foram utilizados para investigar o efeito do anticorpo ICOS nas populações de células T e B. Amostras de sangue total foram coletadas de camundongos em vários pontos de tempo (dia 9, dia 15 e dia 16) e, em seguida, processadas para análise. Adicionalmente, os tecidos foram colhidos de cinco camundongos cada em oito grupos de tratamento no dia 16 após o implante. Os baços e tumores foram homogeneizados em um gentleMACS Octo Dissociator™ (Miltenyi, São Diego, CA). Suspensões unicelulares foram manchadas para marcadores de células T utilizando os anticorpos conjugados com fluorocromo. A Fluorescência de anticorpo foi detectada por citometria de fluxo em um citômetro Fortessa (BD Biosciences, São José, CA) e os resultados foram analisados utilizando o software FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, OR). Análise Estatística

[00498] A média, o desvio padrão (DP) e os valores medianos do tamanho do tumor e os valores médios do peso corporal foram calculados. O valor médio foi calculado enquanto 100% dos animais do estudo permaneceram vivos; o valor mediano foi calculado enquanto pelo menos 60% dos animais do estudo permaneceram vivos. Análise de variância unidirecional (ANOVA) foi usada para determinar se as médias entre os grupos de tratamento eram estatisticamente significativamente diferentes; Valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativamente diferentes. O software GraphPad Prism® versão 7.02 (GraphPad Software, La Jolla, CA) foi usado para plotar os dados e determinar as diferenças estatísticas entre os grupos. Curvas de crescimento tumoral para camundongos individuais por grupo de tratamento podem ser vistas nas Figuras 18A-I. As curvas de crescimento tumoral média e mediana por grupo de tratamento são apresentadas nas Figura 19A e 19B. Resultados Inibição do Crescimento Tumoral

[00499] No dia 29 após o implante de tumor, no último dia o TGI médio pôde ser calculado, a eficácia do tratamento das terapias de mAb anti-ICOS nos tumores CT26 foi observada como em monoterapia e em combinação com o mAb anti-PD-1 (Tabela 19). Camundongos tratados com monoterapia de mIgG1 anti-ICOS.4 a 3 mg/kg mostraram TGI a 33% e o mAb de 4H2 anti-PD-1 de único agente mostrou 74% de TGI. No final do período de estudo (dia 51), o número de camundongos livres de tumor era 0/10 no grupo de anticorpo de controle, 8/15 no grupo anti- PD-1 e 1/15 em todas as doses de mIgG1 anti-ICOS.4 (30 mg/kg, 10 mg/kg ou 3 mg/kg). A combinação de anti-PD-1 com mIgG1 anti-ICOS.4 em várias doses (30 mg/kg, 10 mg/kg, 3 mg/kg e 1 mg/kg) mostrou atividade antitumoral superior ou igual à da monoterapia (valores de TGI de 74%, 80%, 87% e 78%, respectivamente). O número de camundongos livres de tumor no término do estudo variou de 8-11/15 nos quatro grupos de combinação.

Tabela 19 - Inibição do Crescimento de Tumor por Grupo de Tratamento (Relativo ao Controle de Isótipo) Dia 29 Volume de % Médio Grupo de Tratamento Tumor Médio de TGI (mm3) 30 mg/kg de mAb de controle de mIgG1 1248 N/A 5 mg/kg de mAb de 4H2 anti-PD-1 327 74% 30 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 1182 5% 10 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 N/A N/A 3 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 838 33% 30 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 328 74% + 5 mg/kg de mAb de 4H2 anti-PD-1 10 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 252 80% + 5 mg/kg de mAb de 4H2 anti-PD-1 3 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 158 87% + 5 mg/kg de mAb de 4H2 anti-PD-1 1 mg/kg de mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 271 78% + 5 mg/kg de mAb de 4H2 anti-PD-1 Análise de imunomonitorização

[00500] A imunomonitorização foi realizada em vários pontos de tempo após o implante em certos grupos de tratamento (Figura 20A-D). No dia 16 após o implante do tumor, observou-se uma depleção de Foxp3+ Tregs em linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em todos os grupos tratados com mAb de mIgGl anti-ICOS.4 (Figura 20A e 20B). Os camundongos portadores de tumor CT26 tratados apenas com mIgG1 anti-PD-1 não mostraram uma redução em TIL Tregs. Embora mais variáveis, as células T CD8+ aumentaram nas TILs em todos os grupos de tratamento versus controle (Figura 20D).

[00501] Os níveis de proteína Ki-67, um marcador de proliferação celular, aumentaram no subconjunto de células T efetoras CD4+ após o tratamento com agente único com anti-PD-1 (aumento moderado) ou mIgG1 anti-ICOS.4 (aumento elevado) (FIGs 21A-C). Um aumento adicional nos níveis de Ki-67 foi observado nos grupos de tratamento de combinação de anti-PD-1 e mIgG1 anti-ICOS.4.

[00502] O ICOS-L, o ligante para ICOS, apresentou níveis mais altos de intensidade de fluorescência média (MFI) nas células B após tratamento com anticorpos anti-ICOS.4. Os níveis de MFI de ICOS-L também foram elevados no sangue total colhido no dia 9, no dia 15 e no dia 16 após implantação do tumor e no baço no dia 16 após implantação do tumor. Parece surgir uma tendência em que a dose mais elevada de mIgG1 anti-ICOS.4 tem a maior MFI para ICOS-L (Figura 22A-D).

[00503] Observando os níveis de ICOS, a perda de expressão do receptor nas células T CD4+ foi observada após o tratamento com anticorpo. Isto foi mais evidente no tumor TILS (Tabela 20). Doses mais elevadas de mIgG1 anti-ICOS.4 correlacionaram-se com níveis mais baixos de ICOS. Dosagem de anticorpos (controle de isótipo a 30 mg/kg e D265A de mIgG1 anti-PD-1 a 5 mg/kg; mAb de mIgG1 anti-ICOS.4 a 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg e 30 mg/kg de níveis de dose) foi por injeção intraperitoneal nos dias 9, 12 e 15 após o implante de células CT26. O sangue total foi coletado em vários pontos no tempo (dia 9, dia 15 e dia 16 após implantação) e o tumor foi colhido no dia 16 após implantação de cinco camundongos em certos grupos de tratamento. A análise de imuno-monitorização através de citometria de fluxo foi realizada em amostras processadas.

Tabela 20 – Expressão de ICOS em Células T CD4+ Tecido Dia após o mIgG1 (30 mpk) mIgG1 de ICOS.4 [% de ICOS] analisad implante [% de ICOS] o 30 mpk 10 mpk 3 mpk PBMC 9 100% 67% 75% 86% PBMC 15 100% 65% 50% 65% PBMC 16 100% - 43% 50% Tumor 16 100% - 18% 15% Conclusões

[00504] Como resumido na Tabela 21, em um modelo tumoral singeneico CT26 encenado, o tratamento com mAb de mIgG1 anti- ICOS.4 mostrou atividade antitumoral como um agente único ou quando combinado com mAb anti-PD-1. Como monoterapia, níveis similares de atividade antitumoral foram observados quando o mIgG1 anti-ICOS.4 foi dosado em 30 mg/kg, 10 mg/kg ou 3 mg/kg, embora a dose de 3 mg/kg tenha a maior média TGI (33%) no dia 29. Os dados de imunomonitoração mostraram uma depleção aumentada de Foxp3+ Tregs (tumor), maior percentagem de células T CD8+ (tumor), níveis mais elevados de proteína Ki-67 em efetores CD4+ (tumor), níveis mais elevados de ICOS-L em células B (sangue total e baço) e perda de expressão de ICOS em células T CD4+ (sangue total e baço) com todas as doses de grupos tratados com mIgG1 anti-ICOS.4. Estes dados mostraram que a monoterapia anti-ICOS tem boa eficácia neste modelo de tumor.

[00505] O tratamento com mIgG1 anti-PD-1 teve uma atividade muito forte nesta experiência. O tratamento combinado de mAb de mIgG1 anti- ICOS.4 a 30 mg/kg, 10 mg/kg, 3 mg/kg e 1 mg/kg, com mIgG1 anti-PD- 1 resultou em valores médios de TGI ≥ 74%, com 8-11/15 camundongos livres de tumor para esses grupos de tratamento. Estes resultados mostraram níveis comparáveis de atividade antitumoral do mIgG1 anti- ICOS em combinação com tratamentos de mIgG1 anti-PD-1 em todas as doses.

A eficácia antitumoral melhorada no modelo CT26 foi observada quando se combinou o mAb anti-ICOS e anti-PD-1. A inibição do crescimento tumoral foi ≥ 74% para cada uma das quatro doses (1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg) de grupos de tratamento anti-ICOS em combinação com anti-PD-1, com pelo menos 8/15 camundongos livres de tumor em cada um desses grupos.

A inibição do crescimento tumoral do mAb anti-ICOS como agente único foi de 33% com 1/15 dos camundongos livres de tumor quando doseados a 3 mg/kg.

A imunomonitorização também apresentou menores Foxp3+ Tregs, maiores porcentagens de células T CD8+, maiores níveis de Ki-67 nos efetores CD4+, maiores níveis de ICOS-L nas células B e menores níveis de expressão do receptor ICOS na monoterapia anti-ICOS.

Tabela 21 Estudos de Farmacologia Não clínica In vivo

Tipo de Cronograma/Via/Duraç Faixa de Animais Estudo/Espécie/Cepa ão do Estudo/Veículo/ Doses por Formulação Grupo (g/cam (M/F) undong o)

Atividade Antitumoral de Anticorpos administrados 1-30 15-20 mAb anti-ICOS em IP após o implante nos mg/kg por combinação com mAb anti- Dias 9, 12, e 15; grupo; F PD-1 no modelo de tumor Controle de Isótipo de CT26 com IgG1 de Camundongo, imunomonitoração de mIgG1 anti-ICOS.4, subconjuntos de células mIgG1 de 4H2 clone imunes/camundongos anti-PD-1 Balb/c

EXEMPLO 9 Atividade Antitumoral do Anticorpo Anti-ICOS em Combinação com Anti-CTLA-4 em um Modelo de Tumor CT26 Sumário

[00506] Para avaliar a atividade antitumoral no modelo de carcinoma colorretal CT26 após tratamento com um anticorpo monoclonal anti- ICOS substituto de Fcs variáveis, ICOS.4 (Variante de IgG1 ou IgG2 de camundongo do anticorpo de hamster parental), e/ou mAb anti-CTAL-4, células CT26 foram implantadas subcutaneamente nos flancos direitos de camundongos. Quando os tumores atingiram 96 mm3, os camundongos foram randomizados em seis grupos de tratamento de 10 a 15 camundongos cada. Cada camundongo foi doseado nos dias 13, 16 e 20 após o implante com mAb ou controle de isótipo (isto é, anticorpo do mesmo isótipo, porém que não se liga a nenhuma proteína de ocorrência natural de camundongo, por exemplo, anticorpos contra KLH, toxina da difteria, entre outros). Os camundongos foram pesados e os tumores foram medidos duas vezes por semana até ao final do estudo no Dia 66. Se os tumores fossem ≥ 2000 mm3 ou parecessem ulcerados, os animais eram submetidos à eutanásia.

[00507] No dia 30 após o implante, o último dia em que a inibição do crescimento do tumor mediana (TGI) em relação ao anticorpo de controle de isótipo pôde ser calculada, os valores de TGI para anti-ICOS em monoterapia foram de 15% e 69% com variantes de mIgG1 e mIgG2a (por exemplo, anticorpo de camundongo quimérico com sequências VH/VL SEQ ID Nºs: 3 e 4 + IgG1 ou IgG2), respectivamente; a monoterapia anti-CTLA-4 mostrou um valor de TGI de -7%. Quando os mAbs anti-ICOS foram combinados com mAb anti-CTLA-4, foram observados valores médios de TGI de 40% (mIgG1) e 79% (mIgG2a). Nenhuma toxicidade era evidente em qualquer grupo de tratamento.

Procedimentos experimentais Anticorpos de Teste e Controles

[00508] Os seguintes anticorpos foram construídos:

[00509] Anticorpo IgG1 de camundongo de ICOS anti-camundongo - mAb anti-ICOS.4, IgG1 de camundongo de isótipo, foi expresso a partir de linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO);

[00510] Anticorpo IgG2a de Camundongo de ICOS Anti- Camundongo - mAb Anti-ICOS.4, isótipo IgG2a de camundongo de isótipo, foi expresso a partir de linhagens celulares CHO;

[00511] Anticorpo IgG2b de camundongo de 9D9 de CTLA-4 anti- camundongo - anticorpo monoclonal para o clone 9D9 de CTLA-4 de camundongo, IgG2b de camundongo de isótipo, foi expresso a partir de uma linhagem celular CHO transfectada e formulado em PBS; e

[00512] Controle de isótipo de IgG1 de Camundongo - Um anticorpo IgG1 totalmente murino, não se ligando a ICOS; preparado a 10 mg/kg em PBS. Preparação de Células Tumorais

[00513] As células CT26 de carcinoma do cólon murino foram adquiridas em American Type Culture Collection (ATCC, Catálogo CRL- 2638) e mantidas in vitro em cultura estéril de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), por menos de 10 passagens. As células foram confirmadas como livres de vírus através do teste de produção de anticorpos de camundongo. Implantação de tumor

[00514] Células CT26 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (HyClone/GE Healthcare, Logan UT, Catálogo 10-040-CM, Lote 16915003) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Gibco, Life Technologies, Catálogo 26140-079, Lote 1704315). As células foram divididas 1:10 a cada três a quatro dias. O flanco direito de cada camundongo foi implantado subcutaneamente com 1x106 células CT26 em 0,2 mL de PBS utilizando uma seringa de 1 cm e uma agulha de meia polegada de calibre 26. Tratamento de Anticorpos

[00515] No dia 13 pós-implante de células CT26, 120 camundongos foram randomizados em seis grupos de 10 a 15 camundongos cada, de acordo com o volume do tumor. Os grupos tinham um volume médio de tumor de aproximadamente 96 mm3. Os camundongos foram doseados com os anticorpos nos dias 13, 16 e 20. Monitoramento pós-tratamento

[00516] Os animais foram verificados diariamente quanto a alterações posturais, cuidados pessoais e respiratórias, bem como, letargia. Os animais foram pesados pelo menos duas vezes por semana e foram submetidos à eutanásia se a perda de peso fosse maior ou igual a 20%. Os flancos de cada animal foram verificados quanto à presença e tamanho dos tumores pelo menos duas vezes por semana até a morte, a eutanásia ou o término do período de estudo. Os tumores foram medidos em três dimensões (comprimento [L], largura [W] e altura [H]) com calibradores digitais eletrônicos e registrados. Os volumes tumorais foram calculados usando a equação: Volume = (L x W x H x 0,5). A resposta ao tratamento foi medida em função da inibição do crescimento tumoral (TGI) e foi calculada como: (referência mm3 - artigo teste mm3)/referência mm3 x 100. Quando o tumor atingiu um volume maior que aproximadamente 2000 mm3 ou apareceu ulcerado, o animal foi eutanizado. Resultados

[00517] Como mostrado na Tabela 22, no dia 30 após o implante do tumor, o último dia em que a TGI mediana pôde ser calculada, a eficácia do tratamento das terapias de mAb anti-ICOS nos tumores de CT26 foi observada como monoterapia e em combinação com mAb anti-CTLA-4.

Os camundongos tratados com variantes anti-ICOS.4 como monoterapia mostraram 15% de TGI mediano (mIgG1) e 69% de TGI (mIgG2a). A combinação de mAb anti-CTLA-4 (-7% de TGI), resultou em TGIs medianos mais elevados, uma vez que a variante de mIgG1 anti-ICOS.4 tinha 40% de TGI e a variante de mg2a anti-ICOS.4 tinha 79% de TGI. No término do período de estudo (dia 66), o número de camundongos livres de tumor foi 0 para todos os grupos. As curvas de crescimento tumoral para camundongos individuais por grupo de tratamento são mostradas nas Figura 23A-F. Dosagem de anticorpos (controle de isótipo a 20 mg/kg; mIgG2b anti-CTLA-4, mIgG1 anti- ICOS.4 e mIgG2a anti-ICOS.4 a 10 mg/kg) foi por injeção intraperitoneal nos dias 13, 16 e 20 após implantação de células CT26.

[00518] As curvas de crescimento tumoral média e mediana por grupo de tratamento são apresentadas nas Figura 24A e 24B. Nenhuma toxicidade era evidente em qualquer grupo de tratamento, uma vez que as alterações médias e medianas do peso corporal foram inferiores a 20%. Tabela 22 Inibição do Crescimento de Tumor por Grupo de Tratamento Dia 30 Volume de % de TGI Grupo de Tratamento Tumor Mediano Mediano (mm3) Controle de Isótipo de mIgG1, 20 mg/kg 1981 N/A mIgG1 anti-ICOS.4, 10 mg/kg 1686 15% mIgG2a anti-ICOS.4, 10 mg/kg 614 69% mIgG2b de 9D9 anti-CTLA-4, 10 mg/kg 2114 -7% mIgG1 anti-ICOS.4, 10 mg/kg + mIgG2b de 9D9 anti- 1195 40% CTLA-4, 10 mg/kg mIgG2a anti-ICOS.4, 10 mg/kg + mIgG2b de 9D9 410 79% anti-CTLA-4, 10 mg/kg

Conclusões

[00519] Como resumido na Tabela 23, em um modelo tumoral singeneico CT26 encenado, ambas as monoterapias de variante de Fc anti-ICOS (isto é, variante de IgG1 ou IgG2 de camundongo ICOS.4 do anticorpo de hamster parental) promoveram modesta atividade antitumoral, com mIgG2a anti-ICOS.4 demonstrando maior eficácia do que mIgG1 anti-ICOS.4 no dia 30 (69% versus 15% de TGI mediano). A combinação dos tratamentos anti-ICOS.4 com mAb anti-CTLA-4 aumentou a eficácia com os TGI médios aumentando para 79% de (mIgG2a) e 40% de (mIgG1). Nenhuma alteração significativa no peso corporal foi associada com os tratamentos nem foram observados quaisquer sinais evidentes de toxicidade clínica. As monoterapias anti- ICOS promoveram atividade antitumoral, com mIgG2a anti-ICOS.4 demonstrando maior eficácia antitumoral no dia 30 (69% versus 15% de TGI mediano). A eficácia antitumoral aumentou quando combinada com o tratamento de mAb anti-CTA-4, com o grupo de combinação de mIgG2a anti-ICOS.4 a 79% de TGI e mIgG1 anti-ICOS.4 a 40% de TGI.

Tabela 23 - Estudos de Farmacologia In vivo Tipo de Cronograma/Via/Duração Faixa Animais Estudo/Espécie/C do Estudo/Veículo/ de por Grupo epa Formulação Doses (M/F) (g/ca mundo ngo) Atividade Anticorpos administrados IP 10-20 10-15 por Antitumoral de após o implante nos Dias 13, mg/kg grupo; F mAb anti-ICOS em 16, e 20; 66 dias; (fêmea) combinação com Controle de Isótipo de IgG1 mAb anti-CTLA-4 de Camundongo, no modelo de mIgG1 anti-ICOS.4, tumor CT26/camundongo mIgG2a anti-ICOS.4, s Balb/c mIgG2b de 9D9 anti-CTLA-4, em PBS EXEMPLO 10 Afinidade, Ligação, Propriedades Biofísicas, Estabilidade Forçada e Imunogenicidade Caracterização de propriedades de ligação

[00520] Células T CD4+ humanas, PBMC de cinomolgo e esplenócitos de rato e camundongo foram ativados por incubação com anti-CD3 específico de espécie ligado à placa (revestido em uma placa de 6 cavidades com 2 mL/cavidade de uma solução de 4 µg/mL em PBS durante 3 horas a 37°C e lavado duas vezes com 1 mL de meio), + 1 µg/mL de anti-CD28 específico de espécies solúveis em meio fresco com 1-2 x 106 células/mL durante 3-4 dias. Deve notar-se que PBMC de cinomolgos e os esplenócitos de camundongo e rato tornam-se principalmente células T após três a quatro dias de ativação de

CD3/CD28. As células foram colhidas, contadas, centrifugadas e novamente suspensas em tampão de coloração + 100 µg/mL de IgG de camundongo para bloquear durante 15 minutos temperatura ambiente. S267E de IgG1f de ICOS.33 foi titulado de 2 µg/mL por diluições seriadas de 4 vezes até 0,002 µg/mL em tampão de coloração e incubado com as células de humano, macaco cinomolgo, rato ou camundongo ativadas durante 30 minutos a 4-8°C em uma placa de fundo em U. As células foram então lavadas duas vezes em 150-200 µL de tampão de lavagem de coloração e novamente suspensas em 50 µL de IgG anti-humano de cabra de APC (Fc gama) diluídos 1:200 em tampão de coloração, suavemente centrifugadas e incubadas 30 minutos a 4-8°C no escuro. As células foram então lavadas uma vez em tampão de lavagem de coloração de 200 µL, novamente suspensas no mesmo e analisadas no citômetro de fluxo FACS Canto.

[00521] Como ilustrado nas Figuras 25A e 25B, S267E de IgG1f de ICOS.33 exibe ligação forte a células T humanas, de macaco cinomolgo, de rato e de camundongo com valores de EC50 que não são significativamente diferentes entre as três espécies.

[00522] Além disso, a avidez de ligação de S257E de IgG1f de ICOS.33 foi comparada com dois diferentes anticorpos competidores anti-ICOS. Em síntese, os anticorpos foram incubados com células T CD4+ ativadas em gelo durante trinta minutos. As células foram em seguida lavadas e os anticorpos ligados foram detectados com um reagente secundário de IgG-PE anti-humano. O sinal foi medido por citometria de fluxo e a intensidade de fluorescência média foi calculada. Como mostrado nas Figuras 26A-B, S267E de IgG1f de ICOS.33 mostrou maior avidez de ligação a células T CD4+ ativadas, como calculado por EC50 em comparação com os dois anticorpos competidores. Como aqui descrito, o termo "EC50", no contexto de um ensaio in vitro utilizando um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, refere-se à concentração de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que induz uma resposta que é 50% da resposta máxima, ou seja, a meio caminho entre a resposta máxima e a linha de base. Na Figura 26A, o EC50 de S267E de IgG1f de ICOS.33 foi de cerca de 0,07 µg/mL, enquanto o EC50 do anticorpo competidor 1 foi de cerca de 1,4 µg/mL e o EC50 do anticorpo competidor 2 foi de cerca de 0,4 µg/mL. Em outras palavras, o EC50 de S267E de IgG1f de ICOS.33 era cerca de 20 vezes inferior à EC50 do anticorpo competidor 1 e cerca de 6 vezes inferior à EC50 para o anticorpo competidor 2. Na Figura 26B, o EC50 de S267E de IgG1f de ICOS.33 foi de cerca de 0,08 µg/mL, enquanto a EC50 do anticorpo competidor 1 foi de cerca de 2,4 µg/mL e o EC50 do anticorpo competidor 2 foi de cerca de 1,0 µg/mL. Em outras palavras, o EC50 de S267E de IgG1f de ICOS.33 era cerca de 30 vezes inferior à EC50 do anticorpo competidor 1 e cerca de 12 vezes inferior à EC50 para o anticorpo competidor 2. Estudos de Afinidade

[00523] Uma vez que o ICOS monomérico humano não estava disponível, experimentos para determinar a verdadeira afinidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 foram feitos usando o fragmento Fab de S267E de IgG1f de ICOS.33 (Lote PC-1804-04) e antígeno Fc de ICOS humano (R & D Systems, 169-CS- 050) com equipamento Biacore™ T200. Os experimentos de ligação foram realizados a 37oC para se obter (ou modelar) a afinidade do anticorpo com o antígeno sob condições in vivo. Um chip CM4 foi revestido covalentemente com reagente de captura anti-hFc da Biacore. A superfície foi bloqueada com etilenodiamina. Em seguida, ICOS humano com uma marcação de Fc foi capturado no chip CM4 e o fragmento Fab de S267E de IgG1f de ICOS.33 foi escoado nas concentrações de 0,91, 2,7, 25, 74, 667 e 2000 nM.

[00524] A constante de taxa de associação (kon) e a constante de taxa de dissociação (koff) foram plotadas por unidades de tempo e resposta (RU) usando o software BIAevaluation, Versão 3.2. Os dados foram ajustados a um modelo de Langmuir 1: 1. A razão koff/kon foi representada pela constante de dissociação (KD) do complexo de anticorpo-antígeno. O chip Biacore foi regenerado com solução de hidróxido de sódio a 50 mM a uma taxa de fluxo de 100 µL/min. A afinidade do anticorpo para o antígeno ICOS humano, conforme medido pelo fragmento Fab de S267E de IgG1f de ICOS.33, foi de 52 nM a 65 nM. Análise Biofísica

[00525] A identidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 foi confirmada por cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC-MS). Para medições de massa de cadeia leve e pesada, a amostra foi desglicosilada, reduzida e alquilada pelo método de teste padrão e analisada usando um instrumento Waters LCT Premier ESI-TOF. A massa de cadeias leves e pesadas de S267E de IgG1f de ICOS.33 foram equivalentes às suas atribuições de massa preditas de 23.795 Da e 50.161 Da, respectivamente, com base na sequência de aminoácido derivada da sequência de DNA.

[00526] A identidade do anticorpo foi determinada por análise da sequência de Edman. O sequenciamento de aminoácidos de terminação N de cadeias leves e pesadas de anticorpo foi realizado com um ABI Procise Automated Protein Sequence Analyzer. As sequências de aminoácido de terminação N observadas de S267E de IgG1f de ICOS.33 foram compatíveis com as sequências de aminoácido previstas para as cadeias leves e pesadas.

[00527] Utilizando o sistema Agilent 2100 BioAnalyzer, determinou- se que o S267E de IgG1f de ICOS.33 migrou a aproximadamente 160 kDa sob condições não redutoras (NR). Sob condições redutoras (R), a cadeia pesada migrou a cerca de 60 kDa e a cadeia leve migrou a cerca de 25 kDa.

[00528] A pureza de S267E de IgG1f de ICOS.33 foi determinada por eletroforese capilar-dodecil sulfato de sódio (CE-SDS). As amostras foram analisadas com um Beckman Coulter Proteome Lab PA 800 plus, sob condições não redutoras e redutoras. S267E de IgG1f de ICOS.33 continha 93,45% de IgG intacta por CE-SDS sob condições não redutoras. Os fragmentos de anticorpos detectados foram os seguintes: uma cadeia leve (1,85%), uma cadeia leve-pesada (0,45%), duas cadeias pesadas (0,88%) e duas cadeias pesadas e uma leve (3,37%). A pureza de S267E de IgG1f de ICOS.33 foi de 96,51% (62,22% de cadeia pesada + 34,29% de cadeia leve) por CE-SDS sob condições redutoras.

[00529] S267E de IgG1f de ICOS.33 foi caracterizado por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para determinar o nível de heterogeneidade do produto. S267E de IgG1f de ICOS.33 apresentou baixa heterogeneidade com 98,1% de pico principal, 0,4% de pico na frente do pico principal e 1,5% tailing shoulder, indicando baixa heterogeneidade química ou conformacional.

[00530] Focagem isoelétrica capilar (cIEF) foi utilizada para caracterizar S267E de IgG1f de ICOS.33 para isoformas de carga. A amostra foi analisada usando um iCE Analyzer Modelo iCE3. S267E de IgG1f de ICOS.33 exibiu uma faixa de ponto isoelétrico (pI) de 7,30 a 7,72 com um pico principal em 7,72 (45.19%). Outros picos observados foram em 7,30 (7,51%), 7,40 (16,21%) e 7,56 (31,10%). A faixa de pI observada estava dentro da faixa normal esperada para amostras de anticorpos IgG1.

[00531] Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC; filtração em gel) acoplada a espalhamento de luz multi-ângulo (MALS) foi realizada para determinar o teor de monômero e a distribuição de MW das principais impurezas de S267E de IgG1f de ICOS.33. Verificou-se que o S267E de IgG1f de ICOS.33 continha mais de 99,8% de monômero. A atribuição de MW por MALS indicou que o componente monomérico tinha um MW de 144.300 Da. Uma quantidade muito pequena de agregado tinha uma evidente MW de 626.800 Da.

[00532] A impressão digital e sequenciamento de peptídeos foram realizados por análise de peptídeos digeridos por LC-MS em uma Waters Acquity UPLC com uma Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm (2,1 x 150 mm; Waters Corporation) acoplada a um espectrômetro de massa LTQ-Orbitrap XL. A identificação da sequência de cadeia leve e pesada foi de 100% utilizando os dados de MS/MS de várias digestões, incluindo tripsina, quimiotripsina e pepsina. O sequenciamento do peptídeo confirmou que o alotipo era IgG1 humano e combinava com a esperada sequência de aminoácido como previsto pela sequência de DNA. Um único local de N-glicosilação foi confirmado como sendo N297 na cadeia pesada. As ligações de dissulfeto foram descobertas ser, como esperado, para um anticorpo monoclonal IgG1 humano. A mutação de S267E feita para aumentar a ligação do receptor CD32b foi também identificada na sequência.

[00533] O perfil de oligossacarídeo de açúcares ligados a N presentes em S267E de IgG1f de ICOS.33 foi determinado por fluorescência induzida por laser capilar (cLIF) utilizando um instrumento Beckman MDQ. Glicanos ligados a N presentes em S267E de IgG1f de ICOS.33 compreendiam uma mistura de açúcares asialo-biantenários sem fucose que variava em relação ao nível de incorporação de galactose. As principais estruturas de glicano foram G0F (30,64%) e G1F (43,65%) e, em menor grau, G2F (19,07%).

[00534] Utilizou-se um calorímetro de varredura diferencial VP- capilar para determinar a estabilidade térmica e a reversibilidade do anticorpo. Os dados foram analisados usando o software Origin 7. A estabilidade térmica estava dentro da faixa aceitável para um anticorpo monoclonal humano típico. Em experimentos de varredura térmica, muitos anticorpos mostram três temperaturas de fusão solucionáveis; a primeira é devido ao desdobramento do domínio de CH2, a segunda é devido ao desdobramento do domínio de Fab, e a terceira é devido ao desdobramento do domínio de CH3. O S267E de IgG1f de ICOS.33 apresentou um termograma com estas três temperaturas de desdobramento: 65,2°C (Tm1), 83,2°C (Tm2), 86,3°C (Tm3). A reversibilidade térmica é um marcador da capacidade de uma proteína se redobrar de volta à sua conformação nativa após uma perturbação, neste caso, calor. Experimentos de reversibilidade térmica a 83,2°C (a segunda temperatura de fusão) mostraram 55,2% de reversibilidade, o que sugere que o anticorpo possui propriedades robustas de redobragem.

[00535] A estabilidade do S267E de IgG1f de ICOS.33 está resumida na Tabela 24. Tabela 24 - Estabilidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 Propriedade Método Resultados Congelamento/Descongelamento UV, SEC Nenhum risco de (uma hora a -80°C, uma hora em RT estabilidade de F/T x 6) revelado Perfil de Solubilidade/Concentração UV, SEC Pelo menos 50 mg/ml em tampão (histidina a 20 mM, pH 6,0, sacarose a 260 mM) Estudo de Estabilidade em Agitação 350 rpm em RT em Nenhum problema de tampão (histidina a agregação observado 20 mM, pH 6,0, sacarose a 260 mM) +/- 0,05% de PS80 durante 7 dias (50 e 10 mg/mL)

EXEMPLO 11 Afinidade de Ligação de S267E de IgG1f de ICOS.33 para FcγRs Humanos por Ressonância de Plasmon de Superfície

[00536] A ligação de Fc‫ץ‬Rs humanos a S267E de IgG1f de ICOS.33 foi estudada por ressonância de plasmon de superfície (SPR) e comparada com o anticorpo de controle IgG1f anti-ICOS. Os anticorpos foram capturados em uma superfície de sensor de proteína A, e uma série de titulação de Fc‫ץ‬Rs foi injetada como analitos.

[00537] Para estes estudos, a proteína A foi imobilizada nas células de fluxo 1-4 do chip sensor CM5 utilizando química padrão de etil (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/N-hidroxissuccinimida (NHS), com bloqueio de etanolamina, em um tampão de execução de HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, 0,05% de tensoativo p20, a uma densidade de ~ 3000 RU. O S267E de IgG1f de ICOS.33 (3 µg/mL) ou anticorpos de controle hIgG1f (3 µg/mL) foram capturados na superfície da proteína A em uma densidade de ~ 400 - 500 RU, e a ligação dos analitos de Fc‫ץ‬R foi testada em tampão de execução consistindo de NaPO4 a 10 mM, NaCl a 130 mM, 0,05% de p20, tampão (PBS-T) pH 7,1 a 25oC, utilizando um tempo de associação de 120 segundos e um tempo de dissociação de 180 segundos a uma taxa de fluxo de 30 µL/min. Para determinar os cinéticos e a afinidade de ligação, testou-se uma série de concentrações de Fc‫ץ‬R (diluição 3: 1) de 1 µM até 0,15 nM (proteínas CD64) ou 10 µM até 1,5 nM (todos os outros Fc‫ץ‬Rs). Os dados cinéticos foram ajustados a um modelo de Langmuir 1:1 ou a um modelo de estado estacionário usando o software de avaliação Biacore T200.

[00538] Os dados do sensograma que demonstraram taxas de associação e dissociação muito rápidas com a ligação de estado estacionário foram ajustados a um modelo de afinidade de estado estacionário 1:1, enquanto aqueles que demonstraram cinéticos mais lentos foram ajustados a um modelo de Langmuir 1:1. Os dados em concentrações de analito único (hCD64 a 0,11 µM e hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16a-F158, hCD16b-NA1 e hCD16b-AN21 a 1,1 µM) foram comparados para o anticorpo de controle anti-ICOS e S267E de IgG1f de ICOS.33, com S267E de IgG1f de ICOS.33 apresentando uma maior resposta de ligação e menor taxa de dissociação para vários dos Fc‫ץ‬Rs, com hCD32a-R131 e hCD32b tendo os aumentos mais notáveis na ligação e taxas de dissociação mais lentas.

[00539] Os valores cinéticos e de afinidade melhor ajustados são mostrados na Tabela 25. Estes dados demonstraram quantitativamente que a mutação de S267E altera a afinidade de ligação para vários FcRs em comparação com o anticorpo de controle hlgGl. Por exemplo, a ligação a hCD32a-R131 melhorou de um KD de 1500 nM (controle hIgG1f) para 34 nM (S267E de IgG1f de ICOS.33), que foi uma melhora de mais de 40 vezes e a ligação a hCD32b melhorou de um KD de mais do que 5000 nM (controle hIgG1f) a 170 nM (S267E de IgG1f de ICOS.33), que foi uma melhora de pelo menos 29 vezes. A ligação a CD32a e CD32b de cinomolgos foi inferior à observada para CD32a e CD32b humanos.

Tabela 25 - Dados cinéticos e de afinidade para a ligação de

[00540] S267E de IgG1f de ICOS.33 para Human FcγRs EXEMPLO 12 Farmacocinética (PK) de S267E de IgG1f de ICOS.33

[00541] Os parâmetros PK obtidos de uma dose única de PK/PD e estudo de tolerabilidade com S267E de IgG1f de ICOS.33 estão resumidos na Tabela 26. A exposição foi proporcional à dose entre 1 mg/kg e 10 mg/kg, com uma meia-vida de 13 a 14 dias. Os anticorpos anti-fármaco (ADA) foram detectados sete dias após a dose em três dos quatro macacos cinomolgos no grupo da dose de 1 mg/kg e continuaram a aumentar até 42 dias após a dose. O aumento no sinal de ADA correspondeu à rápida depuração do anticorpo nestes macacos, e esta parte dos dados afetados pela ADA não foram incluídos na análise dos dados PK.

Tabela 26 - Parâmetros farmacocinéticos de S267E de IgG1f de ICOS.33 após administração intravenosa (IV) a macacos Cinomolgos Estudo Número de Dose Área Sob a T½ Depuração Volume em macacos (mg/kg) Curva (meia- (CLT) estado (AUC)(0-INF) vida) (mL/d/kg) constante (μM × d) (dias) (Vss) (mL/kg) DT15107 4 (2 Fêmeas/2 1 2,2 ± 0,4 13 ± 2,8 3,1 ± 0,46 57 ± 3,9 Machos) 4 (2 Fêmeas/2 10 23 ± 3,8 14 ± 3,3 2,9 ± 0,48 66 ± 11 Machos) Farmacocinética do anticorpo substituto do camundongo em camundongos

[00542] A farmacocinética de um mAb substituto de ICOS anti- camundongo (ICOS.4, variante IgG1 de camundongo do anticorpo de hamster parental) após uma dose intravenosa única a 1 mg/kg e uma única administração intraperitoneal (a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg) foram avaliados em camundongos BALB/c não portadores de tumores, que é uma cepa albina criada em laboratório do camundongo doméstico. O anticorpo apresentou um aumento maior do que proporcional à dose em exposição em uma faixa de dose de 1 mg/kg- 10 mg/kg, como mostrado na Tabela 27. A meia-vida variou de 0,53 dias com a dose mais baixa de 1 mg/kg a 1,5 dias na maior dose de 10 mg/g. A PK não linear em camundongos pareceu ser devida, pelo menos em parte, à disposição do fármaco mediada pelo alvo.

Tabela 27 Parâmetros farmacocinéticos da IgG1 de rato com ICOS.4 após administração intraperitoneal a camundongos EXEMPLO 13 Reatividade Cruzada e Manchamento de Tecido

[00543] Ensaios de ligação demonstraram que a afinidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 (EC50) para células T CD4+ ativadas era similar em camundongos, ratos, macacos cinomolgos e humanos.

[00544] Na análise de reatividade cruzada de tecidos, S267E de IgG1f de ICOS.33 conjugado com FITC foi aplicado a seções congeladas (acetona ou acetona/formalina fixadas) a partir de 20 tecidos humanos normais, um a quatro doadores cada. Manchamento específico foi observado em subconjuntos de linfócitos em tecidos linfoides (timo, amígdala e baço) e ricos em linfoides (estômago e intestino delgado), bem como células mononucleares muito raras dispersas (MNCs) em vários tecidos (tireoide, pele, pulmão, útero e testículos), que estão amplamente associados à inflamação subjacente. Nenhuma marcação positiva foi observada no cérebro, cerebelo, coração, fígado, rim, pâncreas, nervo periférico, cólon, pituitária e próstata. Em tecidos linfoides, os linfócitos positivos foram distribuídos principalmente na medula do timo e na zona de luz do centro germinativo e região interfolicular da amígdala. Estes resultados são consistentes com a imuno-histoquímica anterior (IHQ) com o anticorpo parental ICOS.4.

[00545] Manchamento de IgG1f S267E-FITC também foi avaliado por imunohistoquímica (IHC) em cortes congelados de 10 tecidos normais de macaco cinomolgos, incluindo cérebro, coração, fígado, pulmão, rim, baço, timo, tonsila, pele e testículos. No geral, os padrões de manchamento foram similares aos dos tecidos humanos. A manchamento específico foi observado em subconjuntos de linfócitos em tecidos linfoides (amígdala, baço e timo). Nenhum manchamento inesperado foi observado nos tecidos examinados. EXEMPLO 14 Liberação de citocinas, ativação de complemento e tolerabilidade Liberação de citocinas em sangue total humano tratado com S267E de IgG1f de ICOS.33

[00546] Este estudo foi desenhado para avaliar as respostas de citocinas em células do sangue periférico humano após o tratamento com S267E de IgG1f de ICOS.33 em amostras de sangue total fresco.

[00547] Sangue total heparinizado por sódio normal fresco (100 µl) foi adicionado a placas de base redonda de 96 cavidades. 100 µl de S267E de IgG1f de ICOS.33 ou ICOS.33 diluídos em meio isento de soro AIM V, controle de isótipo mAb anti-KLH-hIgG2-2F5, ou mAb anti- CD28 de TGN (5.11A1) foram adicionados às cavidades para obter uma concentração final de anticorpo de 10 µg/mL por cavidade e um volume final de 200 µL por cavidade. SEB (100 µL) diluído em meio AIM V foi adicionado às cavidades para uma concentração final de 100 ng/mL SEB para obter um volume final de 200 µL por cavidade. Foi adicionado CD3-CD28 (100 µL) diluído em meio AIM V às cavidades para uma concentração final de 1 µg/mL de CD3-CD28 e um volume final de 200 µL por cavidade. LPS (100 µL) diluído em meio AIM V foi adicionado às cavidades para uma concentração final de 10 µg/mL LPS e um volume final de 200 µL por cavidade. As placas foram incubadas em uma incubadora a 5% a 7% de atmosfera de CO2 durante 20 horas a 37°C. Os sobrenadantes de cultura celular plasmática de cada cavidade foram colhidos após 20 horas e armazenados a –20°C. As amostras foram enviadas para a BMS Lawrenceville, NJ (LVL) em um recipiente com gelo seco para desempenho do ensaio.

[00548] Para avaliar a secreção de citocina, 12 µL de padrões pré- misturados, controles e amostras foram transferidos para as placas de ensaio. Contas magnéticas (6 µl) foram adicionadas a cada placa de 384 cavidades, em seguida seladas e incubadas por duas horas em temperatura ambiente em uma agitadora de placas. Após duas horas de incubação, as contas magnéticas foram lavadas duas vezes e foram adicionados 6 µl de anticorpos de detecção em cada cavidade. As placas foram novamente seladas e incubadas em temperatura ambiente em uma agitadora de placa. Estreptavidina-ficoeritrina (6 µL) foi adicionada a cada cavidade contendo os anticorpos de detecção, em seguida incubada durante 30 minutos em temperatura ambiente e lavada duas vezes utilizando uma lavadora de placas. Foi adicionado fluido de revestimento (80 µL) a cada cavidade e as contas foram ressuspensas durante cinco minutos em uma agitadora de placas. Amostras de placas foram lidas usando o sistema matriz de instrumentos Bioplex 3D. Os dados brutos foram medidos como intensidade fluorescente média (MFI). A concentração (pg/mL) foi calculada pelo software Xponent.

[00549] Um painel de 75 citocinas foi avaliado em sangue de oito doadores normais humanos para liberação de citocina mediada por S267E de IgG1f de ICOS.33. A adição de S267E de IgG1f de ICOS.33 a sangue total do doador não mediou a secreção de citocinas em comparação com o controle de isótipo. Estes dados mostraram que o tratamento com S267E de IgG1f de ICOS.33 não leva à síndrome de liberação de citocina (CRS) no sangue total. Estudo de toxicidade intravenosa de dose intermitente em macacos

[00550] Este estudo foi conduzido para determinar a toxicidade potencial e a atividade biológica de S267E de IgG1f de ICOS.33 quando administrado por intravenosamente a macacos uma vez por semana ou uma vez a cada três semanas durante um mês para avaliar a reversibilidade de quaisquer alterações observadas, para determinar exposições sistêmicas a S267E de IgG1f de ICOS.33, para avaliar respostas imunes e fornecer dados para apoiar o uso de S267E de IgG1f de ICOS.33 em humanos. S267E de IgG1f de ICOS.33 foi administrado intravenosamente como uma injeção lenta em bolus em doses de 0 (veículo, uma vez por semana nos Dias 1, 8, 15, 22 e 29), 1,5 mg/kg (uma vez a cada 3 semanas nos dias 1 e 22), 15 mg/kg (uma vez por semana) ou 75 mg/kg (uma vez por semana) a grupos de cinco macacos fêmeas e cinco macacos machos. Todas as doses foram administradas a 2 ml/kg em um veículo/portador consistindo em histidina 20 mM, sacarose a 260 mM, ácido dietileno triamina penta-acético a 50 µM e polissorbato 80 a 0,05% (p/v) (pH 6,0). Como medidas farmacodinâmicas potenciais pelo menos em parte, todos os macacos foram imunizados com hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH, imunógeno para estimular a resposta primária), vetores virais Adenovirus-5 (Ad5)-Gag e Ad5-Nef (imunógeno para estimular resposta de célula T CD8 específica de antígeno) e toxoide do tétano (imunógeno para estimular a resposta secundária) no Dia 1. Por exemplo, imunizando com toxoide do tétano permite a expansão do número de células T específicas para o toxoide do tétano, e permite a avaliação PK/PD de uma população específica de antígeno.

[00551] Os critérios para avaliação incluíram sobrevivência, toxicocinéticas, observações clínicas (incluindo comportamento alimentar), pesos corporais, exames físicos (incluindo respiratórios, cardiovasculares e neurológicos) e oftalmológicos, avaliações de patologia clínica, avaliação da imunogenicidade (do anticorpo anti- S267E de IgG1f de ICOS.33; ADA), avaliações imunotoxicológicas e farmacológicas (incluindo ocupação de receptor e expressão de receptor em células T auxiliares CD4, resposta de anticorpo dependente de célula T (TDAR) a KLH ou toxoide do tétano, fenotipagem de linfócito de sangue periférico, ativação de célula T, Fenotipagem de célula T específica do antígeno, e resposta de recordação ex vivo a peptídeos KLH, Gag ou Nef), pesos de órgãos e análises patológicas macroscópicas e microscópicas. As necropsias agendadas foram realizadas após 1 mês (três/grupo/sexo) e após um período de recuperação de 8 semanas (duas/grupo/sexo).

[00552] Após dosagem repetida, exposições sistêmicas de S267E de IgG1f de ICOS.33 (AUC[0-T]) aumentou aproximadamente dose proporcionalmente de 15 mg/kg a 75 mg/kg (uma vez por semana) sem nenhuma substancial diferença de sexo observada em todas as doses. Após dosagem repetida de 1,5 mg/kg (uma vez a cada três semanas), exposições sistêmicas médias a S267E de IgG1f de ICOS.33 (AUC [0- 504h]) foram menores (0,4x) do que aquelas após a dosagem no dia 1, ao passo que os valores de AUC (0-168h) após a dosagem repetida de 15 mg/kg e 75 mg/kg (QW) foram ligeiramente maiores (2,1 vezes a 2,6 vezes) do que aqueles após a dosagem no Dia 1, sugerindo acúmulo.

[00553] Respostas de ADA emergentes do tratamento foram detectadas em 8 e 2 de 10 macacos/grupo a 1,5 mg/kg (uma vez a cada três semanas) e 15 mg/kg (uma vez por semana), respectivamente, no ou após o Dia 8. Durante a fase de recuperação, ADAs só foram detectados em macacos a 1,5 mg/kg. Após dosagem repetida, as concentrações séricas de S267E de IgG1f de ICOS.33 em macacos com ADAs foram geralmente imensuráveis (isto é, < limite inferior de quantificação; LLOQ) ou menores do que aquelas em macacos sem nenhuma ADA a 1,5 mg/kg e 15 mg/kg, e a presença de ADAs contribuiu para reduzir o valor médio da AUC a 1,5 mg/kg.

[00554] O sumário toxicocinético para S267E de IgG1f de ICOS.33 é mostrado na Tabela 28. Tabela 28 - Resumo Toxicocinético - Valores Médios Combinados por Sexo a Valores foram calculados com a inclusão/excluso dos dados de animais com ADAs emergentes de tratamento detectáveis em ou/e após o Dia 8 (168 horas após a primeira dose) b Valor de exposição sistêmica média foi avaliada de valores individuais de AUC (0-72 h) e AUC (0-168 h). c Valor de exposição sistêmica média foi avaliada de valores individuais de AUC (0-168 h) e AUC (0-336 h), e AUC (0-504h). d Valor de exposição sistêmica média foi avaliada de valores individuais de AUC (0-72 h) e AUC (0-168 h), AUC (0-336 h), e AUC (0-504h). NA = Não aplicável.

[00555] S267E de IgG1f de ICOS.33 foi bem tolerado em todas as doses sem nenhuma observação clínica relacionada com S267E de IgG1f de ICOS.33 ou efeito sobre o peso corporal, avaliações físicas (incluindo respiratória, cardiovascular e neurológica) e oftalmológicas, hematologia, coagulação, química sérica, urinálise, pesos de órgãos e patologia macroscópica ou microscópica. Além disso, não houve nenhum efeito relacionados a S267E de IgG1f de ICOS.33 sobre TDAR para toxoide do tétano, números absolutos de células T citotóxicas, células B e células NK, subtipos de células T (incluindo células T CD4 naïves, células T CD4 de memória efetora, células T CD4 ativadas por CD25+, células T CD4 ativadas por HLA-DR+, células T CD8 naïves, células T CD8 de memória efetora, células T CD8 ativadas por CD25+ e células T CD8 ativadas por HLA-DR+), proliferação de células T CD8+,

e respostas de recordação ex vivo em qualquer dose testada.

[00556] Evidência de efeitos mediados por S267E de IgG1f de ICOS.33 foi observada em todas as doses. A expressão do receptor ICOS nas células T auxiliares CD4 foi próxima de 0% quatro horas após a dose no Dia 1 em todas as doses, o que sugeriu uma sub-regulação e/ou internalização do receptor de ICOS, e permaneceu geralmente abaixo do período de dosagem e recuperação a 15 mg/kg. A baixa expressão do receptor ICOS impediu uma avaliação significativa da ocupação do receptor ICOS. A 1,5 mg/kg administrada uma vez a cada três semanas, a expressão do receptor de ICOS nas células T auxiliares CD4 começou a recuperar-se após o Dia 8, aumentou para 41% antes da administração no Dia 22, diminuiu para 4% após a dose no Dia 22 e aumentou para 42% no dia 29. Uma recuperação completa da expressão do receptor foi observada no dia 43 (91%). A ocupação do receptor está geralmente correlacionada com a expressão do receptor (por exemplo, 71% e 85% de RO nos Dias 22 [antes da administração] e 29). Em geral, os níveis de expressão do receptor ICOS foram inversamente correlacionados com as concentrações séricas de S267E de IgG1f de ICOS.33. Isto foi consistente com a conclusão de que o anticorpo S267E de IgG1f de ICOS.33 causou perda do receptor.

[00557] Houve uma supressão independente da dose de IgM específica para hemocianina (KLH) de lapa de buraco de fechadura (KLH) (até 52% no dia 8) e respostas de IgG (até 78% no dia 29) em relação ao controle de veículo. Supressão da resposta do anticorpo dependente de células T à KLH por S267E de IgG1f de ICOS.33 pode representar um modo de ação alternativo, e foi observado em um estudo anterior em macacos cinomolgos. Apesar de não estar ligada por nenhum mecanismo, a supressão de TDAR por um agonista da via de co-estimulação de ICOS pode estar relacionada com um agonismo prejudicado de células T auxiliares como resultado de uma regulação prematura e sustentada da expressão de ICOS.

[00558] Outros efeitos relacionados com S267E de IgG1f de ICOS.33 em todos ou alguns dos níveis de dose durante a dosagem e/ou período de recuperação incluíram diminuições nos números absolutos médios de células T totais e células T auxiliares CD4, percentagem de células T CD4 reguladoras, percentagem de Células T CD4+ de memória central, percentagem de células T CD8+ de memória central, percentagem de células T Ki67+CD4+ e percentagem de células T CD8Gag+ e Nef+.

[00559] Em conclusão, S267E de IgG1f de ICOS.33 foi clinicamente tolerado por macacos durante um mês em doses intravenosas ≤ 75 mg/kg administradas uma vez por semana. Foram observados efeitos relacionados com S267E de IgG1f de ICOS.33 em todas as doses, como demonstrado pela expressão do receptor de ICOS e alterações de ocupação dos receptores, supressão da resposta de anticorpo dependente de células T à KLH, diminuição dos níveis de certos subconjuntos de células T, diminuição da ativação de células T CD4 e diminuição das percentagens de células T CD8 específicas do antí geno. Muitas dessas alterações ainda eram evidentes no término do per íodo de recuperação a ≥15 mg/kg de QW consistente com a exposição continuada de S267E de IgG1f de ICOS.33 durante todo o período de recuperação e a subsequente sub-regulação sustentada da expressão do receptor de ICOS nestas doses. A dose mais baixa de 1,5 mg/kg administrada uma vez a cada três semanas resultou em menores concentrações séricas de S267E de IgG1f de ICOS.33 após a primeira dose e permitiu a recuperação do receptor na superfície celular antes da segunda dose. Não houve nenhuns resultados adversos relacionados com S267E de IgG1f de ICOS.33. Desse modo, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi considerado como sendo 75 mg/kg (AUC média [0-168h] de 452.000 µg●h/mL). Além disso, para a determinação potencial da dose inicial humana máxima recomendada, 75 mg/kg também foi considerada a maior dose não gravemente tóxica (HNSTD). Farmacocinética intravenosa de dose única e estudo de ocupação de receptores em macacos

[00560] As farmacocinéticas de S267E de IgG1f de ICOS.33 foram avaliadas em macacos naïves em proteína. Todos os macacos foram imunizados intramuscularmente com 2,5 mg de hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH). Após a imunização, os macacos foram administrados intravenosamente S267E de IgG1f de ICOS.33 em histidina a 20 mM (pH 6,0), sacarose a 250 mM, 50 µM de ácido pentético (DPTA) e 0,05% de polissorbato 80 em doses de 0, 1 mg/kg, ou 10 mg/kg (grupos de N = 2/sexo para veículo e 1 mg/kg e 10 mg/kg) via veia femoral. Amostras seriais de sangue (cerca de 0,5 mL) foram coletadas em pré-dose e 6, 24, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 672, 840 e 1008 horas após a dose. As amostras de sangue foram deixadas coagular e depois centrifugadas a 4ºC (1500-2000 x g) para obter soro. Se amostras de soro foram armazenadas a -20ºC e liberadas para análise em gelo seco. As amostras não analisadas no dia da recepção foram armazenadas congeladas em um congelador para manter uma temperatura de ≤ 70°C até serem analisadas.

[00561] As amostras de soro de macaco Cinomolgo foram analisadas utilizando um imunoensaio Gyros® qualificado para a detecção de S267E de IgG1f de ICOS.33. ICOS mG1 humano biotinilado (lote n° 22Oct2015-biotina) foi usado como molécula de captura para S267E de IgG1f de ICOS.33. Amostras, padrões e QCs foram trazidos até uma concentração matriz final de 10% de soro de cinomolgo e carregados em Gyrolab. Foi utilizado o método Wash 2 V2 Wizard com Gyrolab Bioaffy 200 CD. Após as etapas finais de lavagem,

o S267E de IgG1f de ICOS.33 capturado foi detectado utilizando um anticorpo monoclonal específico de Fc IgG anti-Hu de camundongo marcado com Alexa 647, clone 10C7 (Lote No. 15C3483473-10C7A) como a molécula de detecção. A concentração de S267E de IgG1f de ICOS.33 em amostras de soro de cinomolgos foi calculada da intensidade de fluorescência medida por Gyrolab utilizando uma curva de calibração logística de 4 parâmetros (4-PL) gerada de calibradores S267E de IgG1f de ICOS.33.

[00562] A faixa da curva de calibração S267E de IgG1f de ICOS.33 foi de 3 ng/mL a 30.000 ng/mL em soro de macaco cinomolgos. Os limites superior e inferior de quantificação foram de 30.000 ng/mL e 3 ng/mL, respectivamente (isto é, ULOQ 30000 ng/mL, LLOQ 3 ng/mL). As amostras de controle de qualidade foram preparadas a 20 ng/mL, 200 ng/mL, 2.000 ng/mL e 20.000 ng/mL em soro de macaco cinomolgo e analisadas em cada CD para assegurar desempenho de ensaio aceitável. Calibradores, QCs e amostras foram diluídas 10 vezes em PTB. O desempenho do ensaio estava dentro da faixa aceitável: % de CV dos padrões estava abaixo de 25% e a recuperação do CQ estava dentro de ± 30% dos valores nominais.

[00563] Amostras de soro de macaco foram analisadas por ABO/BAS, Lawrenceville, New Jersey, utilizando um imunoensaio de electroquimioluminescência qualificada na plataforma Meso Scale Discovery (MSD) quanto à presença de ADA de S267E de IgG1f anti- ICOS.33. Foi utilizado sobrenadante de células de anticorpo anti- idiotípico de camundongo S267E de IgG1f de ICOS.33 para preparar o controle positivo (PC). Foi utilizado S267E de IgG1f anti-ICOS.33 biotinilado como uma molécula de captura e foi utilizado S267E de IgG1f de ICOS.33 marcado com Sulfo Tag como um reagente de detecção. Os S267E de IgG1f de ICOS.33 biotinilados e S267E de IgG1f de ICOS.33 marcados com Sulfo Tag foram diluídos em PTB e combinados para gerar uma mistura mestre com concentração final de S267E de IgG1f de ICOS.33 biotinilado de 1.000 ng/mL e 1.000 ng/mL de S267E de IgG1f de ICOS.33 marcado com Sulfo Tag. As amostras foram diluídas a 10% da diluição mínima requerida (MRD) na mistura mestre e incubadas a 22°C durante 2 horas. A mistura mestre foi então transferida para uma placa MSD revestida com estreptavidina a 50 µL/cavidade. Após mais uma hora de incubação a 22°C, a placa foi lavada e foi adicionada com o tampão de leitura MSD. A placa foi em seguida lida imediatamente no MSD Sector Imager 6000. A presença de anticorpos S267E de IgG1f anti-ICOS.33 detectáveis em amostras de soro de macaco foi determinada utilizando a relação de sinal da amostra e o sinal negativo da amostra.

[00564] As amostras de soro de macaco foram analisadas por BAR, Lawrenceville, New Jersey. As amostras de soro de macaco Cinomolgos foram analisadas quanto a S267E de IgG1f de ICOS.33 "total" utilizando espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida de fase reversa de digestão de tripsina direta (LC/MS/MS). As amostras de soro de macacos foram também analisadas quanto a S267E de Ig1f de ICOS.33 desamidada e não modificada na posição N329 utilizando LC/MS/MS de captura de alvo de enriquecimento de imunoafinidade. As curvas padrão que definem a faixa do ensaio foram preparadas em soro de cinomolgo obtido comercialmente e analisadas com as amostras do estudo como um conjunto analítico completo. Concentrações para S267E de Ig1f de ICOS.33 "total" foram reportadas em µg/mL por meio de planilha Excel para interpretação toxicocinética e farmacocinética.

[00565] Os valores de parâmetro PK foram calculados usando o método de análise não compartimental (Phoenix WinNonlin 6.4, Certara, Princeton, New Jersey). Valores de exposição abaixo do menor limite de quantificação (LLOQ: < 10 ng/mL (0,07 nM) para S267E de IgG1f de

ICOS.33) não foram utilizados na análise. A área sob a curva desde o tempo 0 até o último tempo de amostragem (AUC(0-T)) foi calculada utilizando uma combinação de somatórios trapezoidais log e lineares.

[00566] Os parâmetros farmacocinéticos de S267E de IgG1f de ICOS.33 após uma única dose intravenosa de 1 mg/kg e 10 mg/kg para macacos cinomolgos estão resumidos na Tabela 29. Após administração intravenosa, as concentrações plasmáticas de S267E de IgG1f de ICOS.33 exibiram declínio exponencial. A depuração acelerada foi observada em três de quatro macacos em um grupo de 1 mg/kg após o Dia 7. Como resultado, apenas os dados de tempo de concentração até ao Dia 14 foram utilizados para todos os animais no grupo da dose de 1 mg/kg para análise e AUC (0-14d) foi reportada eliminar a influência das ADAs. Teste de imunogenicidade das amostras de plasmáticas sugeriu que cinco dos oito macacos incluídos no estudo desenvolveram ADAs, e que os macacos com níveis mais elevados de ADA mostraram depuração mais rápida na dose de 1 mg/kg. AUC (0- 42d) foi reportada para o grupo de 10 mg/kg. S267E de IgG1f de ICOS.33 exibiu um aumento quase proporcional à dose em Cmax e AUC (0-T) e AUC (0-INF). Com o incremento da dose na proporção de 1:10, a Cmax nos macacos machos e fêmeas aumentou na relação de 1:8 e 1:8, respectivamente; e a AUC (0-T) aumentou na relação de 1:16 e 1:11, respectivamente, e a AUC (0-INF) aumentou na relação de 1:11 e 1:11, respectivamente.

[00567] As concentrações de S267E de IgG1f de ICOS.33 intactas e o produto desamidado após uma dose intravenosa de 10 mg/kg foram quantificados utilizando LCMS/MS. As concentrações do produto desamidado variaram entre 0,5% e 8% do S267E de IgG1f de ICOS.33 total em todos os pontos de tempo medidos. A AUC (0-42d) para o produto desamidado foi de 2,9% da exposição do total de S267E de IgG1f de ICOS.33.

Tabela 29 - Resumo Farmacocinético a AUC(0-t) truncada em 14 dias em grupo de dose de 1 mg/kg b AUC(0-42D) reportada para animais em grupo de dose de 10 mg/kg c Número de macacos = 2/sexo d > 20% da AUC é extrapolada.

[00568] Embora a ligação aumentada de C1q tenha sido observada in vitro, a ausência de sinais clínicos evidentes no estudo de dose única em macacos e a ausência de efeitos hemodinâmicos em um modelo de macaco instrumentado cardiovascular mostraram baixo risco de ativação do complemento. S267E de IgG1f de ICOS.33 foi bem tolerado quando administrado intravenosamente como dose única a 1 mg/kg ou 10 mg/kg em macacos cinomolgos com um aumento proporcional da dose em exposição. Nenhuma descoberta de patologia clínica adversa foi observada. EXEMPLO 15 Concorrência de Ligação de Anticorpo Anti-ICOS

[00569] Experimentos de armazenamento de epítopo foram conduzidos para determinar quais anticorpos anti-ICOS competem com os outros que se ligam a huICOS. Armazenamento de epítopo é um processo que usa um imunoensaio competitivo para testar anticorpos de maneira combinatória pareada, e anticorpos que competem pela mesma região de ligação, isto é, o mesmo ou um intimamente relacionado epítopo de um antígeno, são agrupados juntos em caixas. A competição de pares entre anticorpos anti-huICOS foi determinada como segue. Um anticorpo de referência (isto, ICOS.33, 20H4, 27B9, 23B6, 12D10, 23A10, 15B7, 12F3, 13B4, 17H9, 26E11, 23H5, 6D1,

12A9, 5C4, 10B10, 17C4, 1D7, 21E1, 9F11, 15H11, 25B10, 8A10, 4D11, 6D5, 7C6, 26E9, 3E8, 16H4, 25E4 ou 2644) foi ligado superfície de um chip sensor, um anticorpo de teste foi pré-incubado com uma construção de polipeptídeo de huICOS em uma mistura e a mistura pré-incubada foi escoada sobre o chip sensor para determinar o grau em que o anticorpo teste interfere com a ligação da construção do polipeptídeo de hUICOS ao anticorpo de referência na superfície do chip.

Os experimentos de competição foram realizados usando um instrumento BIACORE® Surface Plasmon Resonance (SPR). Especificamente, um anticorpo anti-huICOS de referência foi imobilizado na superfície do chip Sensor Chip CM5 (Série S, GE Healthcare CAT # BR-1005-30), flowcell2, flowcell3 e flowcell4 (5000 unidades de ressonância, RUs) e flowcell1 foi usado como um controle negativo.

Um anticorpo teste (isto é, ICOS.33, 20H4, 27B9, 23B6, 12D10, 23A10, 15B7, 12F3, 13B4, 17H9, 26E11, 23H5, 6D1, 12A9, 5C4, 10B10, 17C4, 1D7, 21E1, 9F11, 15H11, 25B10, 8A10, 4D11, 6D5, 7C6, 26E9, 3E8, 16H4, 25E4 ou 2644) foi diluído para 120 µg/mL (2X) em concentração inicial.

Uma série de diluições do anticorpo teste foi feita diluindo a concentração de anticorpo 1:3 com tampão para sete concentrações diferentes e uma amostra controle (com 0 µg/mL) para obter uma curva de titulação.

Cada série de concentrações de anticorpo foi dividida ao meio.

Na primeira metade da série de concentrações, 40 nM (2X) de antígeno humano ICOS (por exemplo, huICOS/Fc) foi adicionado para compor a concentração final (60 µg/mL - 0,0 µg/mL) e 20 nM de concentração final de antígeno em cada cavidade.

Na segunda metade da série de concentrações, em vez de antígeno, foi adicionado tampão para ter o anticorpo diluído para a mesma concentração e esta metade foi tratada como o branco.

Os complexos dos anticorpos anti-ICOS de teste e huICOS/Fc foram incubados durante duas horas. 40 µL de complexos foram injetados na superfície revestida por anticorpo de referência a 30 µL/min.

Foi utilizado um instrumento BIACORE® T200 SPR e o tampão de execução em HBE-EP, GE Healthcare CAT # BR-1001-88, filtrado, desgaseificado, 0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de Tensoativo P20. A superfície foi regenerada com NaOH a 25 mM (código de ordem: BR-1003-58, GE Healthcare) a 100 µL/min durante cinco segundos. Os dados foram analisados utilizando o Microsoft Excel, onde a concentração de anticorpos de teste foi representada em relação à unidade de resposta correspondente para obter curvas de titulação.

[00570] Os experimentos de competição de ligação determinaram que os anticorpos ICOS.33, 20H4, 27B9, 23B6, 12D10, 23A10, 15B7, 12F3, 13B4, 17H9, 26E11, 23H5, 6D1, 12A9, 5C4, 10B10, 17C4, 1D7, 21E1, 9F11, 15H11, 25B10, 8A10, 4D11, 6D5, 7C6 e 26E9 competem de forma cruzada entre si e bloqueiam a ligação do ligante (B7-H2; ICOS-L) aos huICOS. Os anticorpos 3E8, 16H4 e 25E4 competem entre si, porém não bloqueiam a ligação do ligante a huICOS. Ao contrário, enquanto o anticorpo 2644 foi descoberto competir de forma cruzada com o anticorpo 3E8, ele foi também capaz de bloquear a ligação do ligante ao ICOS. EXEMPLO 16 Mapeamento de Epítopo de Anticorpo Anti-ICOS Mapeamento de Epítopo de Anticorpo Anti-ICOS por Exibição de Levedura

[00571] Os epítopos para anticorpos anti-huICOS 3E8 e ICOS.4 foram determinados exibindo variantes aleatoriamente mutagenizadas do domínio extracelular de ICOS humano (resíduos 21 - 134 de NP_036224.1, fornecido como SEQ ID Nº: 173) por células de levedura (Saccharomyces cerevisiae), e classificar as células de levedura com base na sua ligação ou não ligação a anticorpos particulares. Células de levedura selecionadas foram amplificadas e submetidas a ciclos adicionais de seleção com base na sua capacidade de se ligar a anticorpos anti-ICOS testados. Ver, por exemplo, Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342: 539. Sequências para variantes de huICOS foram determinadas para a levedura resultante e analisadas quanto aos efeitos de cada resíduo sobre ligação do anticorpo. O epítopo de ligação para os anticorpos da presente invenção foi determinado como os locus dentro da sequência de huICOS onde mutações únicas de aminoácidos interrompem a ligação aos anticorpos anti-huICOS da presente invenção.

[00572] Em síntese, a PCR propensa a erros foi utilizada para clonar ADN codificando ICOS humano (codificando os resíduos 21 - 134 de SEQ ID Nº: 1) em construções que permitem a expressão das variantes de huICOS como porções de terminação amino de proteínas de fusão compreendendo ainda uma sequência marcadora myc e proteína da parede celular de levedura Aga1p. Tais construções, quando expressas em levedura (Saccharomyces cerevisiae), exibem os polipeptídeos variantes de huICOS sobre a superfície de células de levedura, ancorados à superfície celular pelo polipeptídeo Aga1p. O marcador c- myc foi utilizado como um controle positivo para classificar as células de levedura que exibem proteínas de fusão huICOS. Estas células de levedura foram em seguida também classificadas para aquelas que expressaram proteínas de fusão huICOS adequadamente dobradas (como determinado por ligação de um anticorpo anti-huICOS de camundongo de controle detectado por um secundário de IgG anti- camundongo de cabra marcado com aloficocianina (APC)), porém não se ligaram aos anticorpos da presente invenção (como determinado por detecção com uma IgG anti-humana de cabra marcada com ficoeritrina (PE) como uma secundária). Estas células de levedura selecionadas foram agrupadas, amplificadas e utilizadas em um ciclo subsequente de seleção. A sequência huICOS foi determinada para construções de levedura remanescente após a seleção.

[00573] Populações de levedura que se ligam a ICOS.4 e 3E8 mostram padrões distintos de mutação, indicando que diferentes epítopos foram reconhecidos por esses dois anticorpos. Experimentos análogos foram realizados com o anticorpo 9D5, que bloqueia a ligação do ligante ICOS ao ICOS e que compete com o ICOS.4. Para os experimentos de 9D5, um modelo molecular da estrutura tridimensional de ICOS com base na estrutura de cristal do complexo CTLA-4/B7-2 (por exemplo, Stamper et al. (2001) Nature 410: 608) foi usado para distinguir quais resíduos de aminoácido são enterrados e que são expostos na superfície para determinar quais das mutações selecionadas eram, mais provavelmente, resíduos de contacto específicos de anticorpo (isto, resíduos de epítopo) ao contrário de meras mutações estruturalmente disruptivas. Os epítopos inferidos de exibição de levedura para ICOS.4, 3E8 e 9D5 são fornecidos na Tabela

30. Os epítopos na Tabela 30 são apresentados como uma lista de resíduo em huICOS da SEQ ID Nº: 1, que inclui a sequência sinal de 20 aminoácidos. Consequentemente, os números de resíduo para huICOS maduro (isto é, proteína ICOS sem a sequência sinal) seriam os resíduos indicados na Tabela 30 reduzidos em 20 (por exemplo, V48 com as sequências sinal ou V28 sem a sequência sinal). Tabela 30 - Epítopos de mAb Anti-ICOS Clone Resíduos ICOS (SEQ ID Nº: 1) ICOS.4 V48, Q50, G70, S71, G72, F114, D115, P116, P117, P118, L123 3E8 D64, K78, S79, L80, K81, F82, S85 9D5 P45, I47, P117, P118, K120

[00574] Foram realizados experimentos de exibição de levedura análogos com ICOS-L (B7-H2) em vez de mAbs anti-ICOS para determinar quais resíduos em ICOS são críticos para a interação de

ICOS/ICOS-L, isto é, o sítio de ligação para ICOS-L em ICOS. O sítio de ligação de ICOS-L foi determindo residir nos resíduos Q50, K52, F114, P117, P118 e F119 de ICOS, como fornecido na SEQ ID NO:1. A inspeção dos epítopos para os mAbs anti-ICOS na Tabela 30 sugere que ICOS.4 e 9D5 devem bloquear a ligação de ICOS-L, ao passo que 3E8 não pode, o que é consistente com o que foi observado experimentalmente (como descrito no Exemplo 15 acima). Mapeamento de Epítopo de Anticorpo Anti-ICOS por HDX-MS

[00575] Experimentos de troca de deutério com os anticorpos ICOS.4 e 9D5 confirmaram que a região de S112 e L123 é contatada quando ICOS está ligado a ICOS-L, O que sugeriu uma região funcional de Epítopo dos resíduos 112-123 de ICOS (SEQ ID Nº: 1), ou SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203). Esta região sobrepõe-se à porção de terminação C do epítopo, determinada por exibição de levedura, e representa o maior aglomerado de resíduos ao longo da sequência primária.

[00576] Os epítopos para os anticorpos anti-huICOS ICOS.4 e 9D5 foram determinados por espectrometria de massa de troca de hidrogénio/deutério (HDX-MS) ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996) como aqui descrito. O ICOS-Fc foi misturado com mAbs na relação de 1:1 e o HDX-MS foi executado durante um minuto, 10 minutos, 4 horas em duplicata.

[00577] Os resultados mostram que ICOS.4 e 9D5 ligam-se ao mesmo epítopo descontínuo, que é mostrado abaixo (epítopo está sublinhado) e na Figura 1

[00578] MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQIL CKYPDIVQQFKMQLLKGGQ 60

[00579] ILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDH SHANYYFCNLSIFDPPPFK 120

[00580] VTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILIC WLTKKKYSSSVHDPNGEY 180

[00581] MFMRAVNTAKKSRLTDVTL 199

[00582] (SEQ ID Nº:1) EXEMPLO 17 Expressão de ICOS em Sangue Periférico e Linfócitos Infiltrantes de Tumores de Pacientes com Câncer de Pulmão, Rim e Colo

[00583] A compreensão da expressão de ICOS em linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) em diferentes tipos de tumores e populações de pacientes ajudou a identificar a indicação de doença relevante e a população de pacientes para terapia de S267E de IgG1f de ICOS.33 eficaz, especialmente em combinação com agentes anti-PD-1 como nivolumabe. A frequência e magnitude da expressão de ICOS e PD-1 em células do sangue periférico e TIL (células T CD8+ e CD4+) foram perfiladas em espécimes de carcinoma de pulmão de célula não pequena, de célula renal e colorretal (CRC).

[00584] Tecidos tumorais frescos e amostras de sangue periférico correspondentes foram obtidos de pacientes com câncer de pulmão, câncer renal ou CRC (ConversantBio, MT Group, Benaroya) e enviados durante a noite a 4°C em hypothermosol FRS (Soluções Biolife) e Solução ACD A (BD Biosciences), respectivamente. Todas as amostras foram processadas e manchadas dentro de 24 horas da cirurgia. Os tecidos tumorais foram pesados e dissociados utilizando o kit de dissociação Miltenyi (Miltenyi, Catálogo 130-095-929), ao passo que as células de sangue periférico foram isoladas após a lise de células vermelhas do sangue (RBC) em RBC Lysis Buffer (BioLegend, Catálogo 420301). As suspensões de células (de tecidos tumorais ou sangue perifico) foram lavadas duas vezes em HBSS (nenhum Ca, nenhum Mg), manchadas com NIR Viability Dye (Molecular Probes by Life Technologies, Catálogo L34976), bloqueadas com soro AB humano em salina tamponada por fosfato da Dulbecco (dPBS), e adicionada a cavidades contendo coqueteis de anticorpos (Tabela 31) para incubação em gelo no escuro durante 45 minutos. As células foram em seguida lavadas duas vezes com dPBS/BSA/azida de Na, fixadas e permeabilizadas utilizando o kit de tampão FOXP3 (BioLegend, Catálogo 421403). Os controles de fluorescência menos um (FMO) foram preparados para todos os anticorpos e usados para determinar as populações de células positivas. Amostras foram adquiridas no citômetro de fluxo de Fortessa (BD Biosciences) e os dados foram analisados utilizando o FlowJo Software (TreeStar).

[00585] Tal como mostrado na Tabela 31, foi planejado um painel para examinar a expressão de marcadores múltiplos e a expressão de ICOS em células T CD8+ e CD4+ foi analisada. Tabela 31 Anticorpos utilizados para manchamento por imunofluorescência para Subconjuntos de Células T

[00586] Para manchamento de células Treg, Teff, células B e NK, tumores frescos de cabeça e pescoço, pulmão, CRC e cânceres do endométrio foram colocados em uma placa de 6 cavidades assentadas sobre gelo, imersas em 1-2 mL de meio de dissociação. Os tumores foram cortados em pequenos pedaços e a solução tumoral foi colocada no homogeneizador Dounce para dissociação. As soluções tumorais foram filtradas através de um filtro de 70 µm com meios de dissociação adicionais e centrifugadas. As células resultantes foram ressuspensas no tampão de manchamento. A amostra de tecido tumoral metastático de omento fresco foi dissociada utilizando o kit de dissociação Miltenyi (Miltenyi, Catálogo 130-095-929). Foram descongeladas amostras de tumores congeladas e adicionado ADNase gota a gota (2 mL de solução de ADNase). O meio de descongelamento (8 mL aquecidos em banho a 37°C) foi adicionado ao tumor e solução de ADNase e filtrado por meio de um filtro de 70 µm. As células foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de manchamento.

[00587] A expressão de ICOS em TIL foi avaliada por análise FACS. Suspensões de células derivadas de tumor foram bloqueadas com tampão de manchamento contendo o corante Near-IR Dead Cell. Os marcadores de população celular de superfície foram manchados com anticorpos (como mostrado na Tabela 32) para determinar populações celulares positivas, seguidas por manchamento intracelular de FOXP3 após fixação e permeabilização. Dados citométricos de fluxo foram colhidos utilizando um citômetro de fluxo Fortessa X-20. Depois de controlar os parâmetros dos marcadores FSC-SSC-Live/Dead para excluir detritos e células mortas, a frequência de células ICOS+ foi determinada para subconjuntos de células CD4+ Teff, Treg, célula T CD8+, célula B e célula NK. A análise citométrica de fluxo de CD4+ foi realizada com o software de análise FlowJo.

Tabela 32 Anticorpos utilizados para manchamento por imunofluorescência de células B, células NK, e Subconjuntos de Células T

[00588] A expressão de ICOS foi avaliada usando o clone anti-ICOS C398.4a em amostras de sangue total de 16 doadores saudáveis e 14 pacientes de câncer de pulmão, 22 de CCR e 14 de CCR. Em comparação com doadores saudáveis, as frequências de células T CD4+ICOS obtidas pacientes com câncer foram maiores (Tabela 33, P < 0,001 para todos os grupos de pacientes com câncer em comparação com doadores saudáveis, teste de Mann-Whitney). As frequências de células T ICOS+CD8+ de pacientes com RCC foram significativamente maiores em comparação com doadores saudáveis. Tabela 33, P < 0,01, Mann-Whitney). Em amostras de sangue de pacientes com câncer de pulmão e CCR, as percentagens de células T ICOS+CD8+ também foram maiores do que em amostras de doadores saudáveis sem atingir significância estatística (Tabela 33).

[00589] Porque frequências mais altas foram observadas do que o relatado na literatura e porque o clone C398.4a manchou positivamente mais células T do que o outro clone comumente usado ISA-3,6,7,8,9,10,

as frequências de células que expressam altos níveis de ICOS (ICOShi) foram também analisados. Consistente com a literatura, as células T CD8+ expressaram quantidades mínimas de ICOShi, comparáveis com a base (Tabela 33). Em células T CD4+, no entanto, as frequências de células ICOShi variaram em média de 3,0% em doadores saudáveis a 4,9% em pacientes com CCR (Tabela 33, RCC vs. saudável: P < 0,05, Mann-Whitney).

[00590] Em seguida, a expressão de ICOS foi avaliada em TIL de 11 pacientes com câncer de pulmão, 21 RCC e 8 pacientes com CRC. Frequências de ICOS+CD4+ e ICOS+CD8+ TIL foram similares entre os tipos de tumor (Tabela 34). Como no sangue periférico, foi medida a alta expressão de ICOS pelas células T CD4+ e CD8+ TIL. Em média, uma percentagem maior de células T CD4+ expressou níveis maiores de ICOS do que células T CD8+ (Tabela 34). Coexpressão de ICOS e PD-1 em TIL também foi medida. Altos níveis de PD-1 (PD-1hi) foram expressos por ICOShi CD4+ TIL com grande variabilidade interpaciente (Tabela 34). Em comparação com a ICOShi CD4+ TIL, uma maior proporção de células T ICOShi cd8+ co-expressou níveis elevados de PD-1 (Tabela 34). Tabela 33 – Frequências mÉDIAS ± SD de ICOS+ e Células T ICOShi CD4+ e CD8+ em Amostras de Sangue Periférico de Doadores Saudáveis e Pacientes com Câncer.

Abreviações: ICOShi: células expressando altos níveis de ICOS; N: Número de amostras; SD: Desvio Padrão; NSCLC: câncer de pulmão de célula não pequena; RCC: carcinoma de célula renal; CRC: carcinoma colorretal .=,

Tabela 34 - Frequências Médias ± SD de ICOS+, ICOShi e Células T PD-1hi ICOShi CD4+ e CD8+ em TIL de Pacientes com Câncer.

Abreviações: SD: Desvio Padrão; ICOShi: células expressando altos níveis de ICOS; TIL: Linfócitos infiltrantes de tumor; NSCLC: câncer de pulmão de célula não pequena; RCC: carcinoma de célula renal; CRC: carcinoma colorretal; N: Número de amostras .=,

[00591] Amostras de tumor humano de pacientes com dois adenocarcinomas de pulmão, um adenocarcinoma endometrial, uma metástase de omento de carcinoma papilar seroso, uma metástase hepática de adenocarcinoma colorretal e um carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço foram dissociados e manchados para análise citométrica de fluxo da expressão de ICOS em várias populações de linfócitos. Das cinco populações diferentes de linfócitos representadas (células T CD4+ Teff, Tregs, CD8+, células B, células NK), CD4+ Teff e Tregs expressaram as maiores frequências de ICOS. Em populações celulares que expressaram ICOS (células T CD4 Teff, Tregs, CD8 e células NK), as Tregs expressaram mais ICOS em uma base por célula em comparação com outros tipos celulares.

[00592] Em resumo, o ICOS foi expresso em níveis mais elevados nas células T CD4+ do que nas células T CD8+ no sangue periférico e TIL. A expressão de ICOS foi variável entre os pacientes e foi similar para os três tipos de tumor testados. Em média, 33% a 48% de ICOShi CD4+ TIL e 62% a 71% de ICOShi CD8+ TIL co-expressaram altos níveis de PD-1. Além disso, as Tregs expressaram níveis mais elevados de ICOS do que as CD4+ Teffs, células T CD8+, células NK e células B no microambiente tumoral humano.

EXEMPLO 18 Estudo de Escala de Dose e Estudo de Coorte de Combinação para Avaliar a Segurança e Tolerabilidade, Farmacocinéticas e Eficácia de S267E de IgG1f de ICOS.33 Sozinho ou em Combinação com um ou mais Anticorpos Anti-PD-1, Um ou Mais Anticorpos Anti-PD-L1, e Um ou mais anticorpos anti-CTLA-4 em Pacientes com Tumores Sólidos Avançados

[00593] Estudo de fase 1/2, aberto, de S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado como uma monoterapia ou em combinação com um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, e/ou um anticorpo anti- CTLA-4 (por exemplo, nivolumabe e/ou ipilimumabe) é realizado em participantes com tumores sólidos avançados. O estudo inclui as seguintes partes: monoterapia de escalonamento de dose (Coortes Preliminares de Segurança e Parte A); terapia combinada de escalonamento de dose com nivolumabe (Parte B) ou ipilimumabe (Parte C); e fase de expansão da dose com nivolumabe (Parte D) ou ipilimumabe (Parte E). Objetivos

[00594] O principal objetivo deste estudo é caracterizar a segurança e a tolerância do S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado isoladamente e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe em participantes com tumores sólidos avançados.

[00595] Os objetivos secundários incluem a exploração da eficácia preliminar de S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado isoladamente e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe em participantes com tumores sólidos avançados; caracterizar a PK de S267E de IgG1f de ICOS.33 quando administrado sozinha e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe em participantes com tumores sólidos avançados; caracterizar a imunogenicidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 quando administrado isoladamente e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe em participantes com tumores sólidos avançados; e monitorar o envolvimento alvo de S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado isoladamente e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe em participantes com tumores sólidos avançados.

[00596] Além disso, os objetivos exploratórios incluem examinar a associação entre atividade antitumoral e medidas específicas de biomarcadores no tecido tumoral e no sangue periférico antes do tratamento e após a administração de S267E de IgG1f de ICOS.33 isolado e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe; caracterizar a(s) relação(ões) entre PK de S267E de IgG1f de ICOS.33 isoladamente e em combinação com PK de nivolumabe ou PK de ipilimumabe e biomarcadores de segurança, eficácia, e/ou clínicos; avaliar a taxa de sobrevida global (OSR) em participantes tratados com S267E de IgG1f de ICOS.33 isolado e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe; caracterizar a PK e imunogenicidade do nivolumabe e ipilimumabe quando administrados em combinação com S267E de IgG1f de ICOS.33; caracterizar a imunogenicidade do nivolumabe e ipilimumabe quando administrados em combinação com S267E de IgG1f de ICOS.33; avaliar o efeito potencial de S267E de IgG1f de ICOS.33 no intervalo QT corrigido (QTc); e explorar associações entre biomarcadores selecionados de sangue periférico e incidência de eventos adversos (EAs) e eventos adversos sérios (SAEs). Planejamento Geral

[00597] Um esquema para o planejamento do estudo é mostrado na Figura 27.

[00598] A monoterapia consiste em duas coortes diferentes, como segue:

[00599] Coortes Preliminares de Segurança: S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado em monoterapia a 2 mg e 8 mg uma vez a cada quatro semanas durante 24 semanas.

[00600] Parte A: S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado em 25 mg, 80 mg, 200 mg, 400 mg e 800 mg uma vez a cada quatro semanas por 24 semanas.

[00601] As partes B e C consistem em diferentes coortes de combinação, incluindo:

[00602] B1: S267E de IgG1f de ICOS.33 administrado uma vez a cada 12 semanas + nivolumabe 480 mg uma vez a cada 4 semanas em um nível de dose inicial de S267E de IgG1f de ICOS.33 recomendado pelo Modelo Bayesiano de Regressão Logística (BLRM) - modelo de Copula e dados de PK/PD disponíveis da Parte A.

[00603] B2: S267E de IgG1f de ICOS.33 uma vez a cada 4 semanas + nivolumabe 480 mg uma vez a cada 4 semanas em um nível de dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 recomendado pelo Modelo Bayesiano de Regressão Logística (BLRM) –Modelo de Copula (BLRM-RD) e dados de PK/PD disponíveis da Parte A.

[00604] C1: S267E de IgG1f de ICOS.33 uma vez a cada 12 semanas + ipilimumabe 3 mg/kg uma vez a cada 4 semanas em um nível de dose inicial de S267E de IgG1f de ICOS.33 recomendado pelo Modelo Bayesiano de Regressão Logística (BLRM) - modelo de Copula e dados de PK/PD disponíveis da Parte A.

[00605] C2: S267E de IgG1f de ICOS.33 uma vez a cada 4 semanas + ipilimumabe 3 mg/kg uma vez a cada 4 semanas a um nível de dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 recomendado pelo Modelo Bayesiano de Regressão Logística (BLRM) - modelo de Copula e dados de PK/PD disponíveis da Parte A.

[00606] As partes B1 e C1 são registradas simultaneamente. As peças B2 e C2 são registradas somente se forem necessários dados adicionais de segurança, PK ou PD para otimizar a dose e/ou a seleção do cronograma.

[00607] As doses de S267E de IgG1f de ICOS.33 para as Partes B e

C (combinação com nivolumabe ou ipilimumabe) são determinadas utilizando todos os dados de segurança (clínicos e laboratoriais), PK e biomarcador de envolvimento/farmacodinâmico alvo disponíveis, bem como, a recomendação de modelação dentro do quadro de modelagem de hierarquia Bayesiana, ou seja, o modelo BLRM-Copula, incorporando perfis de toxicidade de agentes individuais de S267E de IgG1f de ICOS.33 (Coortes Preliminares de Segurança e Parte A) e nivolumabe ou ipilimumabe e quaisquer perfis de toxicidade de combinação disponíveis das Partes B e C (para doses subsequentes de S267E de IgG1f de ICOS.33 nas Partes B e C), modelagem de PK/PD e não excedem a dose máxima administrada (MAD) de monoterapia de S267E de IgG1f de ICOS.33 nas Coortes Preliminares de Segurança e Parte A. Um nível de dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 recomendado pelo modelo BLRM-Copula, ou seja, BLRM-RD, é definido como um conceito genérico de tal forma que um BLRM-RD para qualquer coorte é sempre com base em todas as informações disponíveis e mais atualizadas.

[00608] Em nenhum momento a dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 administrada em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe (Partes B e C) excede a dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 que é demonstrada como segura no braço de escalonamento de dose em monoterapia (Parte A), nem em qualquer momento durante a terapia de combinação nas Partes B e C a dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 excede a dose mais alta determinada para ser tolerada no braço de escalonamento de dose de monoterapia (Parte A). Além disso, o nível de dose inicial de S267E de IgG1f de ICOS.33 utilizado em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe (Partes B e C) é um nível de dose inferior ao da dose de monoterapia (Parte A) que eliminou o período de DLT.

[00609] As partes B1 e C1 consistem em um subestudo de

PK/farmacodinâmico com o objetivo de explorar os cinéticos da sub- regulação e re-expressão dos receptores de ICOS (e/ou alteração em biomarcadores de envolvimento/farmacodinâmicos alvos selecionados) após a administração de S267E de IgG1f de ICOS.33 na presença de doses múltiplas de nivolumabe uma vez a cada 4 semanas (parte B1) ou ipilimumabe uma vez a cada 4 semanas (parte C1).

[00610] Doses diferentes de S267E de IgG1f de ICOS.33 são administradas nas Partes B1 e C1:

[00611] Doses que induzem ou estão previstas para induzir níveis diferentes de sub-regulação do receptor de ICOS, incluindo pelo menos uma dose que induz uma sub-regulação quase completa do receptor (e/ou alteração nos biomarcadores de envolvimento/farmacodinâmicos alvos selecionados) por um período de pelo menos 4 semanas. Estes níveis de dose permitem a caracterização dos cinéticos de re-expressão do receptor de ICOS após uma sub-regulação quase completa por um período de tempo igual a, menor que, e/ou excedendo os intervalos de dosagem usados na Parte A. Compreendendo os cinéticos do receptor de ICOS, pode ajudar informar o teste dos intervalos de dosagem do S267E de IgG1f de ICOS.33 em estudos futuros.

[00612] BLRM-RD: Os níveis de dose são determinados com base em todos os dados de segurança (clínicos e laboratoriais) e de PK disponíveis, bem como, alterações nos marcadores periféricos de envolvimento alvo (por exemplo, sub-regulação de ICOS nas células T e B ICOS+) de porções anteriores ou completas de coortes atuais, e/ou o modelo BLRM/BLRM-Copula, quando aplicável.

[00613] Após 24 semanas de tratamento em monoterapia, ou dois anos de terapia de combinação, o participante pode ser elegível para retratamento. Para a Parte A, as varreduras são coletadas centralmente e podem ser revisadas por revisão central independente cega (BICR) em uma data posterior, ou a qualquer momento durante o estudo. Para as partes B e C, as varreduras são coletadas centralmente para serem revisadas em tempo real pelo BICR.

[00614] Exames físicos, medidas de sinais vitais, eletrocardiograma de 12 derivações (ECG) e avaliações laboratoriais clínicas são realizados em momentos selecionados durante o intervalo de dosagem.

[00615] Os participantes são monitorados de perto para os AEs durante o estudo. O sangue é coletado em visitas de acompanhamento de 30, 60 e 100 dias após a administração do tratamento do estudo para análise farmacocinética.

[00616] Os participantes completam até quatro fases do estudo: triagem, tratamento, acompanhamento de segurança e acompanhamento de resposta/sobrevida, conforme descrito abaixo. A duração total da participação no estudo é de aproximadamente 2 anos. Vacina contra o tétano

[00617] Todos os pacientes nas Partes A, B e C recebem uma vacina contra o tétano aprovada. A administração de um potente antígeno de recordação, como o toxoide do tétano, estimula o sistema imune, induz uma resposta imune e promove um estado mais imunogênico.

[00618] A capacidade de S267E de IgG1f de ICOS.33 para aumentar a resposta de recordação será determinada monitorando anticorpos contra tétano e respostas proliferativas e de citocinas pelas células T CD4+ após a vacinação contra o tétano. Aproximadamente 70% da população geral têm anticorpos protetores do tétano. No entanto, as respostas imunes celulares são geralmente detectáveis no sangue periférico um mês após a vacina contra o tétano. O tétano tem sido usado como um antígeno repórter em pacientes com câncer recebendo imunoterapia com vacinas e pode ser facilmente monitorado. Consequentemente, a vacinação contra o tétano pode fornecer uma potente resposta de recordação com S267E de IgG1f de ICOS.33 isolado e em combinação com nivolumabe ou ipilimumabe.

Triagem

[00619] A fase de triagem dura até 28 dias e ocorre antes da primeira administração do tratamento do estudo. Durante a fase de triagem, a elegibilidade inicial do participante é estabelecida e o consentimento informado por escrito é obtido. As biópsias tumorais são coletadas para todos os participantes, avaliadas centralmente para a expressão de ICOS por imuno-histoquímica, e os resultados são avaliados antes da administração da primeira dose do tratamento de estudo. Os participantes são inscritos usando a Interactive Response Technology (IRT). Fase de Tratamento

[00620] A fase de tratamento na Coorte Preliminar de Segurança e na Parte A consiste em até seis ciclos de tratamento de quatro semanas (1 ciclo = 28 dias). Na Coorte Preliminar de Segurança e na Parte A, cada ciclo de tratamento consiste em monoterapia de S267E de IgG1f de ICOS.33 durante um total de 24 semanas.

[00621] Os níveis de dose para as Partes B e C são determinados com base em todos os dados de segurança (clínicos e laboratoriais) e farmacocinéticos disponíveis, bem como, alterações nos marcadores periféricos de envolvimento alvo (por exemplo, sub-regulação de ICOS nas células T e B ICOS+) de porções anteriores e completas das coortes atuais, e são orientados pelo modelo BLRM/BLRM-Copula, quando aplicável.

[00622] Nas Partes B1 e C1, são utilizados ciclos de quatro semanas, de modo que S267E de IgG1f de ICOS.33 + nivolumabe ou ipilimumabe são administrados a partir do Ciclo 1 Dia 1. Nivolumabe e ipilimumabe são administrados no Dia 1 de cada ciclo. S267E de IgG1f de ICOS.33 é administrado uma vez a cada 12 semanas, ou no Dia 1 de cada terceiro ciclo (Ciclo 1 Dia 1, Ciclo 4 Dia 1, Ciclo 7 Dia 1, etc.). Os participantes das Partes B1 e C1 continuam o tratamento por até um total de 2 anos.

[00623] A fase de tratamento nas Partes B2 e C2 consiste em S267E de IgG1f de ICOS.33 + nivolumabe ou ipilimumabe administrados no Dia 1 de cada ciclo por até um total de 2 anos, e são registrados apenas se dados adicionais de segurança, PK ou PD forem necessários para otimizar a dose e/ou seleção de cronograma.

[00624] Após cada ciclo de tratamento, a decisão de tratar um participante com ciclos adicionais de tratamento do estudo baseia-se em avaliações de avaliação do tumor realizadas a cada 12 semanas (uma vez a cada 12 semanas ± 1 semana) e completadas antes da primeira dose no ciclo seguinte. Progressão de tumor ou finalidades de resposta são avaliadas usando Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) v1.1 ou Diretrizes de Grupo de Trabalho de Câncer de Próstata 3 (PCGW3), apenas para próstata (Scher et al., 2016. Trial Design and Objectives for Castration-Resistant Prostate Cancer: Updated Recommendations From the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group 3. Clin Oncol. 34 (12): 1402-1418).

[00625] O tratamento além da progressão com ciclos adicionais de tratamento do estudo é permitido por até um máximo de 24 semanas para a Parte A e dois anos para as Partes B, C, D e E em participantes selecionados com RECIST inicial v1.1 ou PCGW3 (apenas próstata) definido PD após discussão e concordância entre o Investigador Principal e o Monitor Médico/Diretor do Estudo de BMS de que a avaliação benefício/risco favorece a administração continuada do tratamento do estudo (por exemplo, os participantes continuam a experimentar benefício clínico como avaliado pelo investigador, tolerando tratamento, e atendendo a outros critérios específicos).

[00626] Os participantes com uma resposta de doença progressiva não confirmada (PD), doença estável (SD), resposta parcial (PR) ou resposta completa (CR) no final de um determinado ciclo continuam no próximo ciclo de tratamento. Os participantes são geralmente autorizados a continuar o tratamento do estudo até a primeira ocorrência de 1) conclusão do número máximo de ciclos, 2) confirmação da PD, 3) deterioração clínica sugerindo que nenhum benefício adicional do tratamento é provável, 4) intolerância à terapia ou 5) um participante que satisfaz os critérios para descontinuar o tratamento de estudo. Os participantes individuais com CR confirmada têm a opção de interromper o tratamento do estudo caso a caso, após consulta específica e acordo entre o investigador e o monitor médico/diretor de estudo de BMS, em situações em que benefício/risco justificam a descontinuação do tratamento de estudo. Acompanhamento de segurança

[00627] Após a conclusão de 24 semanas de tratamento do estudo para a Parte A (ou até um máximo de 48 semanas, se aplicável) ou dois anos para as Partes B, C, D e E (ou até um máximo de quatro anos, se aplicável), a decisão é tomada para descontinuar o participante do tratamento do estudo (por exemplo, no final do tratamento [EOT]) e todos os participantes entram no período de acompanhamento de segurança.

[00628] Para os participantes que concluírem todos os ciclos programados de terapia, a visita de EOT é a mesma que a última visita programada e concluída em tratamento e o início da visita de acompanhamento de segurança da Semana 1. Para os participantes que não completaram todos os ciclos programados de tratamento do estudo, a visita de EOT é a visita em tratamento mais recente (com todos os dados de segurança e resposta disponíveis) e é considerado o início da visita de acompanhamento de segurança.

[00629] Após a visita de EOT, todos os participantes são avaliados quanto a quaisquer novos AEs por pelo menos 100 dias após a última dose do tratamento do estudo. As visitas de acompanhamento para monitorizar os AEs ocorrem nos dias 30, 60 e 100 após a última dose ou na data de descontinuação (± 7 dias). Todos os participantes são obrigados a completar as 3 visitas de acompanhamento de segurança clínica, independentemente de iniciarem ou não um novo tratamento anticâncer, exceto os participantes que retirarem o consentimento para a participação no estudo. Acompanhamento de Sobrevivência

[00630] Após a conclusão das visitas de acompanhamento de segurança, todos os participantes tratados com monoterapia e terapia de combinação entram no período de acompanhamento da sobrevida. Os participantes são acompanhados aproximadamente a cada três meses (12 semanas) até a morte, perda do acompanhamento, retirada do consentimento ou conclusão do estudo, o que ocorrer primeiro. A duração desta fase é de até dois anos a partir da primeira dose do tratamento de estudo, embora um período de acompanhamento mais longo seja considerado em casos selecionados, se um sinal de eficácia for evidente. Acompanhamento de Resposta

[00631] Após a conclusão do período de acompanhamento de segurança, os participantes com SD, RP ou CR em curso na visita EOT entram no período de acompanhamento de resposta. Este período ocorre simultaneamente com o período de acompanhamento de sobrevivência para os participantes mencionados. Os participantes continuam a ter avaliações radiológicas e clínicas do tumor aproximadamente a cada 3 meses (12 semanas) até a morte, perda de acompanhamento, retirada do consentimento ou conclusão do estudo, o que ocorrer primeiro. Avaliações de tumores radiológicos para participantes que têm benefícios clínicos contínuos continuam a ser coletadas após os participantes completarem a fase de sobrevivência do estudo. Os participantes que têm progressão da doença após o curso inicial de tratamento em estudo não são avaliados quanto à resposta além da visita ao EOT e podem receber outra terapia dirigida ao tumor,

conforme necessário. Se o participante descontinuar o tratamento por qualquer razão que não seja a DP, o acompanhamento radiológico continuará até que o participante receba tratamento adicional. Tratamento com ciclos adicionais além de 24 semanas

[00632] Todos os participantes são tratados por 24 semanas de monoterapia ou terapia de combinação, a menos que os critérios para descontinuação do tratamento em estudo sejam atendidos anteriormente. Todos os participantes que completaram o tratamento com controle da doença em curso (RC, RP ou DP) ou PD não confirmada são elegíveis para mais 24 semanas de tratamento sob estudo para a Parte A ou durante um total de dois anos para terapia de combinação, em uma base caso a caso, após cuidadosa avaliação e discussão com o Monitor Médico BMS/Diretor do Estudo para determinar se a relação risco/benefício apoia a administração de tratamento adicional sob estudo. Após a conclusão do período adicional de tratamento sob estudo, todos os participantes entram no período de acompanhamento de segurança. Tratamento além da progressão

[00633] O tratamento além da progressão é permitido em participantes selecionados com a PD definida inicial RECIST v1.1 ou PCGW3 (somente próstata) após discussão e concordância com o Monitor Médico da BMS/Diretor do Estudo de que a avaliação benefício/risco favorece a administração continuada do tratamento do estudo (por exemplo, participantes continuam a experimentar benefício clínico conforme avaliado pelo investigador, tolerando o tratamento e atendendo a outros critérios).

[00634] Os participantes são novamente autorizados com um adendo de forma de consentimento informado (ICF) para continuar o tratamento além da progressão. O tratamento além da progressão requer avaliações continuadas do tumor.

Novo tratamento Durante o Acompanhamento da Resposta

[00635] O novo tratamento é permitido neste estudo com a progressão da doença durante o período de Acompanhamento da Resposta. Participantes que completaram aproximadamente 24 semanas de tratamento sob estudo (ou até um máximo de 48 semanas, se aplicável) para a Parte A e aproximadamente dois anos de tratamento sob estudo (ou até um máximo de 4 anos, se aplicável) para as Partes B, C, D e E ou menos em caso de descontinuação devido à CR, que entram no período de acompanhamento de resposta com controle da doença em curso (RC, RP ou SD) e sem qualquer toxicidade significativa são elegíveis para novo tratamento após subsequente progressão da doença confirmada dentro de 12 meses da última dose do tratamento sob estudo, em uma base caso a caso, após cuidadosa avaliação e discussão com o Monitor Médico da BMS/Diretor do Estudo para determinar se a relação risco/benefício apoia a administração de novo tratamento sob estudo e o participante continua a atender aos critérios de elegibilidade para tratamento com tratamento sob estudo.

[00636] Os participantes que satisfizerem aos critérios para novo tratamento são tratados com a monoterapia ou regime de terapia de combinação (por exemplo, a mesma dose e cronograma de dose administrados durante as primeiras 24 semanas), a menos que a(s) dose(s) e o cronograma sejam subsequentemente constatados exceder o mais recente BLRM-RD, caso em que o participante é tratado com o BLRM-RD. Os participantes que entram nesta fase seguem o cronograma processual. As amostras para PK e farmacodinâmicas são coletadas com menor frequência (na predose de cada ciclo de tratamento). Durante o novo tratamento, as amostras de biomarcador farmacodinâmico obtidas de sangue são coletadas. Tipo de Participante e Características da Doença Alvo

[00637] Os participantes devem ter pelo menos 18 anos de idade e ter confirmação histológica ou citológica de câncer colorretal metastático e/ou irressecável (CRC), carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (CECP), câncer de pulmão de célula não pequena (CPNPC), adenocarcinoma de próstata (CPR) e carcinoma urotelial (CCU) com doença mensurável por RECIST v1.1 ou PCGW3 (somente próstata) e ter pelo menos 1 lesão acessível para biópsia além da lesão- alvo.

[00638] Presença de pelo menos 1 lesão com doença mensurável, conforme definido por RECIST v1.1 ou PCGW3 (apenas próstata) para tumores sólidos para avaliação da resposta. Participantes com lesões em um campo anteriormente irradiado como único sítio de doença mensurável são permitidos inscrever-se, desde que a(s) lesão(ões) tenha(m) demonstrado uma progressão clara e possa(m) ser medida(s).

[00639] Os participantes devem ter recebido, e depois progredido ou ter sido intolerantes a, pelo menos 1 regime de tratamento padrão no contexto avançado ou metastático, se tal terapia existe, e foi considerado para todas as outras terapias potencialmente eficazes antes da inscrição.

[00640] Participantes com exposição anterior à terapia com qualquer agente especificamente visando a inibição da via de ponto de verificação (tal como anti-PD-1, anti-PD-L1 ou anti-CTLA-4) são permitidos após um período de limpeza de qualquer tempo superior a 4 semanas a partir do último tratamento. Tipos de tumor câncer colorretal (CCR)

[00641] Histologicamente confirmado CRC que é metastático ou recorrente com progressão documentada da doença.

[00642] Documentar instabilidade de microssatélite, reparo de incompatibilidade, KRAS e estado de BRAF se conhecido.

[00643] Requisito de terapia anterior: os participantes devem ter recebido pelo menos 1, porém não mais de 3, terapias sistêmicas anteriores para doença metastática e/ou irressecável (ou ter progredido dentro de 6 meses de terapia adjuvante).

[00644] O participante deve ter doença metastática incurável (isto é, pacientes com doença que é potencialmente curável por ressecção cirúrgica não são elegíveis para tratamento).

[00645] carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC) (cavidade oral, faringe, laringe)

[00646] HNSCC Histologicamente confirmado incurável, localmente avançado, recorrente ou metastático (cavidade oral, faringe, laringe), Estágio III ou IV e não passível de terapia local com intenção curativa (cirurgia ou radioterapia com ou sem quimioterapia).

[00647] Deve ter ESTADO e subtipo de HPV documentado, especialmente HPV16 e HPV18.

[00648] Os participantes devem ter recebido e depois progredido ou foram intolerantes ou refratários a pelo menos 1, porém não mais de 2 regimes de terapias sistênicas anteriores (por exemplo, quimioterapia com base em platina) para o tratamento de doença metastênica ou doença não ressecável localmente avançada.

[00649] Terapia de radiação curativa anterior deve ter sido completada pelo menos 4 semanas antes da administração do tratamento sob estudo. A radioterapia paliativa focal anterior deve ter sido completada pelo menos duas semanas antes da administração do tratamento sob estudo. câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)

[00650] Os participantes devem ter confirmação histológica ou citológica de NSCLP (pela sétima Associação Internacional para o Estudo do Câncer de Pulmão [IASLC]) com histologia escamosa ou não escamosa que está avançada (metastática e/ou irressecável).

[00651] (1). Os participantes devem ter pelo menos 1, porém não mais de 2, terapias sistêmicas anteriores para NSCLC. A terapia de manutenção, adjuvante, ou neoadjuvante (quimioterapia ou quimioradioterapia) não conta como uma linha adicional de tratamento.

[00652] (2). Os participantes deveriam ter recebido uma quimioterapia com base em platina para NSCLC. A quimioterapia com base em platina pode ter sido em contexto adjuvante, neoadjuvante, ou quimiorradiação. Participantes com doença recorrente/metastática que tenha retornado dentro de 6 meses após a conclusão de tal tratamento são considerados elegíveis para o tratamento sob estudo. A quimioterapia adjuvante prévia ou neoadjuvante é permitida desde que a última administração do regime anterior tenha ocorrido pelo menos 4 semanas antes da inscrição.

[00653] (3). A quimiorradiação definitiva anterior para doença localmente avançada também é permitida desde que a última administração de quimioterapia ou radioterapia (o que foi realizado por último) tenha ocorrido pelo menos 4 semanas antes da inscrição.

[00654] (4). Os participantes com mutações conhecidas de EGFR ou rearranjos de ALK devem ter recebido inibidores de EGFR ou ALK, respectivamente. O estado mutacional de EGFR, ALK, KRAS e ROS1 deve ser documentado, se conhecido. adenocarcinoma da próstata (PRC)

[00655] Confirmação histológica ou citológica de adenocarcinoma da próstata.

[00656] Participantes foram tratados por orquiectomia ou estão recebendo um análogo de hormônio liberador de hormônio de luteinização, e têm um nível de testosterona ≤ 50 ng/dL.

[00657] Doença metastática por qualquer uma das seguintes modalidades: tomografia computadorizada (CT), imageamento por ressonância magnética (MRI) e cintilografia óssea.

carcinoma urotelial (UCC)

[00658] Evidência histológica ou citológica de carcinoma de célula transicional metastático ou cirurgicamente irressecável do urotélio envolvendo a bexiga, a uretra, o ureter ou a pelve renal. Toxicidades Limitantes da Dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 (DLTs)

[00659] Para o propósito de orientar o escalonamento de dose, as DLTs são definidas com base na incidência, intensidade e duração dos AEs para os quais nenhuma causa alternativa clara é identificada. O período de DLT é de 35 dias (5 semanas).

[00660] Nos Coortes Preliminares de Segurança, os participantes que recebem 1 dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 e completam, ou que descontinuam, devido a uma DLT no período de DLT de 4 semanas, são considerados participantes avaliáveis pela DLT para monoterapia com S267E de IgG1f de ICOS.33.

[00661] Na Parte A, os participantes que recebem duas doses de S267E de IgG1f de ICOS.33 e completam, ou que descontinuam devido a uma DLT no período de DLT de 5 semanas, são considerados participantes avaliáveis pela DLT para monoterapia com S267E de IgG1f de ICOS.33.

[00662] Nas Partes B, C, D e E, os participantes que recebem 1 dose de S267E de IgG1f de ICOS.33 ou duas doses de nivolumabe ou ipilimumabe, ou participantes que descontinuam devido a uma DLT no período DLT de tratamento de combinação de 5 semanas, são considerados como participantes avaliados pela DLT para o tratamento de combinação. Os participantes que desistirem do estudo durante o período de avaliação da DLT ou receberem menos do que duas doses por outras razões que não uma DLT na monoterapia (Parte A) ou uma dose em terapia de combinaçãp (Partes B, C, D, E) não são considerados como participantes avaliáveis pela DLT e não são substituídos por um novo participante com o mesmo nível de dose. Participantes na Parte A que têm a dose atrasada durante o período de avaliação pela DLT por outras razões que não uma DLT, são considerados como participantes avaliáveis pela DLT, se eles receberem pelo menos duas doses de terapia.

[00663] Para o propósito de controle de participantes, qualquer AE que atenda aos critérios de DLT, independentemente do ciclo em que ocorre, leva à descontinuação do tratamento sob estudo. Os participantes que desistirem do estudo durante o período de avaliação de DLT de 5 semanas, por outras razões que não uma DLT, podem ser substituídos por um novo participante com o mesmo nível de dose. A incidência de DLT(s) durante o período de avaliação de DLT de 5 semanas é usada nas decisões de escalonamento de dose e para definir a BLRM-RD. Os AEs ocorridos após o período de DLT são considerados para os propósitos de definição da BLRM-RD mediante acordo entre o Patrocinador, o Monitor Médico/Diretor do Estudo e os investigadores.

[00664] Os participantes que sofrem uma DLT entram no período de acompanhamento de segurança do estudo. DLTs que ocorrem após o período de observação de DLT de 4 semanas para Coorte Preliminar de Segurança ou período de observação de DLT de 5 semanas para as Partes A, B e C são considerados na determinação da dose máxima administrada (MAD) para a parte de combinação.

[00665] Este estudo mostrará que os anticorpos anti-ICOS administrados são seguros e eficazes no tratamento do câncer. EXEMPLO 19 Efeitos de Combinação de Doses Crescentes de Anticorpo Anti- ICOS sobre o Crescimento de Tumor

[00666] O efeito de doses crescentes de anticorpo anti-ICOS agonista, S267E de IgG1f de ICOS.33, em combinação com um anticorpo anti-PD-1 foi avaliado sobre a inibição do crescimento de tumor em um modelo de camundongo. Como mostrado na Figura 28, a combinação exibiu eficácia reduzida em doses mais elevadas, isto é, o "efeito de gancho", em que as concentrações próximas da saturação ou de saturação do anticorpo resultam em eficácia diminuída em comparação com a eficácia do anticorpo em concentrações mais baixas, isto é, concentrações que não resultam em saturação.

[00667] Em síntese, os camundongos (com uma média de cerca de 20 mg em peso) com tumores CT26 estabelecidos foram tratados por monoterapia anti-PD-1 ou em combinação com S267E de IgG1f de ICOS.33. O escalonamento da dose anti-ICOS foi iniciado de 0,1 mg/kg com um aumento de três vezes para 10 mg/kg (ou uma dose máxima de aproximadamente 200 µg/dose nivelada de camundongo). O anticorpo anti-PD-1 foi doseado a 10 mg/kg (ou uma dose mínima de aproximadamente 200 µg//dose nivelada de camundongo). Os anticorpos anti-ICOS e anti-PD1 foram administrados no mesmo cronograma (isto é, a cada 4 dias iniciando no dia 7) após o implante de tumor.

[00668] Como mostrado na Figura 28, a inibição máxima do crescimento de tumor (TGI) na terapia de combinação anti-ICOS e anti- PD1 foi observada com uma dose menor do anticorpo anti-ICOS (3 mg/kg) do que a dose máxima testada (10 mg/kg), demonstrando uma diminuição da TGI em doses superiores a 3 mg/kg, ou seja, a eficácia máxima é alcançada em doses de sub-saturação.

Tabela 35

Sumário de Listagem de Sequência

SEQ ID Nº Nome da Sequência Sequência

1 ICOS Humano (NP_036224.1) MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI 40

LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL 80

KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK 120

VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL 160

ICWLTKKKYS SSVHDPNGEY MFMRAVNTAK KSRLTDVTL 199

2 ICOS-L Humano MRLGSPGLLF LLFSSLRADT QEKEVRAMVG SDVELSCACP 40 (NP_001269979.1) EGSRFDLNDV YVYWQTSESK TVVTYHIPQN SSLENVDSRY 80

RNRALMSPAG MLRGDFSLRL FNVTPQDEQK FHCLVLSQSL 120

GFQEVLSVEV TLHVAANFSV PVVSAPHSPS QDELTFTCTS 160

INGYPRPNVY WINKTDNSLL DQALQNDTVF LNMRGLYDVV 200

SVLRIARTPS VNIGCCIENV LLQQNLTVGS QTGNDIGERD 240

KITENPVSTG EKNAATWSIL AVLCLLVVVA VAIGWVCRDR 280

CLQHSYAGAW AVSPETELTE SWNLLLLLS 309

3 Cadeia Pesada de anticorpo de EVQLVESGGG LVKPAGSLTL SCVASGFTFS DYFMHWVRQA 40 hamster parental PGKGLEWVAV IDTKSFNYAT YYSDLVKGRF TVSRDDSQGM 80

VYLQMNNLRK EDTATYYCTA TIAVPYYFDY WGQGTMVTVS 120

SATTTAPSVY PLAPACDSTT STTNTVTLGC LVKGYFPEPV 160

TVSWNSGALT SGVHTFPSVL HSGLYSLSSS VTVPSSTWPS 200

QTVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPGDGSGCKP CTCPGPEVSS 240

VFIFPPKPKD VLTISLSPKV TCVVVDISQD DPEVQFSWFI 280

DGKEVHTAVT QPREEQFNST YRMVSVLPIL HQDWLNGKEF 320

KCKVNSPAFP VPIEKTISKR RGQLQVPQVY TMPPPKEQLT 360

QSQVSLTCMI KGFYPEDIDV AWQKNGQPEQ SFKNTPPVLD 400

TDETYFLYSK LDVKKDDWEK GDTFTCSVVH EALHNHHTEK 440

TLSQRPGK 448

4 Cadeia Leve de anticorpo de DIQMTQSPSS LPASLGDRVT INCQASQDIS NYLSWYQQKP 40 hamster parental GKAPKLLIYY TNLLADGVPS RFSGSGSGRD YSFTISSLES 80

EDIGSYYCQQ YYNYRTFGPG TKLEIKRADA KPTVSIFPPS 120

SEQLGTGSAT LVCFVNNFYP KDINVKWKVD GSEKRDGVLQ 160

SVTDQDSKDS TYSLSSTLSL TKADYERHNL YTCEVTHKTS 200

TAAIVKTLNR NEC 213

5 Domínio Variável de cadeia EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYFMHWVRQA 40 pesada S267E de IgG1f de PGKGLEWVGV IDTKSFNYAT YYSDLVKGRF TISRDDSKNT 80 ICOS.33 LYLQMNSLKT EDTAVYYCTA TIAVPYYFDY WGQGTLVTVS 120

S 121

6 Domínio Variável de cadeia leve DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLSWYQQKP 40 S267E de IgG1f de ICOS.33 GKAPKLLIYY TNLLAEGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP 80

EDIATYYCQQ YYNYRTFGPG TKVDIK 106

7 Cadeia Pesada S267E de IgG1f EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYFMHWVRQA 40 de ICOS.33 PGKGLEWVGV IDTKSFNYAT YYSDLVKGRF TISRDDSKNT 80

LYLQMNSLKT EDTAVYYCTA TIAVPYYFDY WGQGTLVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV 160

SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ 200

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG 240

GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV EHEDPEVKFN 280

WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG 320

KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE 360

EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 400

VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY 440

TQKSLSLSPG 450

8 S267E de IgG1f de ICOS.33 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLSWYQQKP 40 Cadeia Leve GKAPKLLIYY TNLLAEGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP 80

EDIATYYCQQ YYNYRTFGPG TKVDIKRTVA APSVFIFPPS 120

DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE 160

SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 200

SSPVTKSFNR GEC 213

9 S267E de IgG1f de ICOS.33 DYFMH 5 CDRH1

10 S267E de IgG1f de ICOS.33 VIDTKSFNYA TYYSDLVKG 19 CDRH2

11 S267E de IgG1f de ICOS.33 TIAVPYYFDY 10 CDRH3

12 S267E de IgG1f de ICOS.33 QASQDISNYL S 11 CDRL1

13 Anticorpo CDRL2 de hamster YTNLLAD 7 parental

14 CDRL2 de S267E de IgG1f de YTNLLAE 7 ICOS.33

15 CDRL3 de S267E de IgG1f de QQYYNYRT 8 ICOS.33

16 Domínio variável de cadeia MDILCSTLLL LTVPSWVLSQ VTLRESGPAL VKPTQTLTLT 40 pesada 17C4 CTFSGFSLST SGMCVSWIRQ PPGKALEWLA LIDWDDDKFY 80

STSLKTRLTI SKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCARMS 120

TPTYYGLDVW GQGTTVTVSS 140

17 Domínio variável de cadeia leve MRVLAQLLGL LLLCFPGARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT 40 17C4 ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS 80

RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPLTFGG 120

GTKVEIK 127

18 CDRH1 de 17C4 TSGMCVS 7

19 CDRH2 de 17C4 LIDWDDDKFY STSLKT 16

20 CDRH3 de 17C4 MSTPTYYGLD V 11

21 CDRL1 de 17C4 RASQGISSWL A 11

22 CDRL2 de 17C4 AASSLQS 7

23 CDRL3 de 17C4 QQYNSYPLT 9

24 Domínio Variável de Cadeia MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLT 40 Pesada de 9D5 CTFSGFSLGT SGLGVGWIRQ PPGKALEWLA FIYWDDDKRY 80

SPSLKSRLTI TKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCAHRR 120

GFFDYWGQGT LVTVSS 136

25 Domínio Variável de Cadeia MRVLAQLLGL LLLCFPGARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT 40 Leve de 9D5 ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS 80

RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPLTFGG 120

GTKVEIK 127

26 CDRH1 de 9D5 TSGLGVG 7

27 CDRH2 de 9D5 FIYWDDDKRY SPSLKS 16

28 CDRH3 de 9D5 RRGFFDY 7

29 CDRL1 de 9D5 RASQGISSWL A 11

30 CDRL2 de 9D5 AASSLQS 7

31 CDRL3 de 9D5 QQYNSYPLT 9

32 Domínio Variável de cadeia MEFGLTWVFL VALLRGVQCQ VQLVESGGGV VQPGMSLRLS 40 pesada 3E8 CAASGFTFST YGMQWVRQAP GKGLEWVTVI WHDGSHKDYA 80

DSVKGRFTIS RDNSKNTMYL QMNSLRAEDT AVYYCARDRQ 120

TGEGYFDFWG QGTLVTVSS 139

33 Domínio Variável de cadeia leve MRVLAQLLGL LLLCFPGARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT 40 de 3E8 ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS 80

RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPYTFGQ 120

GTKLEIK 127

34 CDRH1 de 3E8 TYGMQ 5

35 CDRH2 de 3E8 VIWHDGSHKD YADSVKG 17

36 CDRH3 de 3E8 DRQTGEGYFD F 11

37 CDRL1 de 3E8 RASQGISSWL A 11

38 CDRL2 de 3E8 AASSLQS 7

39 CDRL3 de 3E8 QQYNSYPYT 9

40 Domínio Variável de cadeia MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLT 40 pesada de 1D7 CTFSGFSLGS NGLGVGWIRQ PPGKALEWLA LIYWDDDKRY 80

SPSLKSRLTI TKDSSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCAHRN 120

SGFDYWGQGI LVTVSS 136

41 Domínio Variável de cadeia leve MRVLAQLLGL LLLCFPGARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT 40 de 1D7 ITCRASQGFS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS 80

RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPYTFGQ 120

GTKLEIK 127

42 CDRH1 de 1D7 SNGLGVG 7

43 CDRH2 de 1D7 LIYWDDDKRY SPSLKS 16

44 CDRH3 de 1D7 RNSGFDY 7

45 CDRL1-a de 1D7 RASQGFSSWL A 11

46 CDRL2-a de 1D7 AASSLQS 7

47 CDRL3-a de 1D7 QQYNSYPYT 9

48 Domínio Variável de Cadeia MRVLAQLLGL LLLCFPGARC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT 40 Leve de 1D7 ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS 80

RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNSYPLTFGG 120

GTKVEIK 127

49 CDRL1-b de 1D7 RASQGISSWL A 11

50 CDRL2-b de 1D7 AASSLQS 7

51 CDRL3-b de 1D7 QQYNSYPLT 9

52 Domínio Constante de cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 pesada de huIgG1f WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

53 Domínio Constante de cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 pesada de S267E de huIgG1f WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 ("SE") YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVE HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

54 Domínio Constante de cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 pesada de S267E/L328F de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 huIgG1f ("AUTO") YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVE HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA FPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

55 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de P238D de huIgG1f WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

56 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de P238D/P271G de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 huIgG1f ("V4") YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

57 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de D270E de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 P238D/P271G ("V4") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEEGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

58 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 E233D/P238D/P271G/A330R ("V7") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPDLLGG 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPRPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

59 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 G237D/P238D/H268D//P271G ("V8") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGD 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS DEDGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

60 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 G237D/P238D/P271G/A330R ("V9") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGD 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPRPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

61 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de D270E de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 G237D/P238D/P271G/A330R

("V9") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGD 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEEGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPRPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

62 Domínio Constante de cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 pesada de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 G237D/P238D/H268D/P271G/A 330R ("V11") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGD 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS DEDGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPRPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

63 Domínio Constante de Cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 Pesada de WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 E233D/G237D/P238D/H268D/P2 71G/A330R ("V12") de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPDLLGD 120

DSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS DEDGEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPRPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

64 Dominio Constante de cadeia RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ 40 leve huKappa WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE 80

KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC 107

65 Sequência Sinal MRAWIFFLLC LAGRALA 17

66 CH1 de terminação C de IgG1(a VDKRV 5 mesma para IgG3 (17-15-15-15), igG3 (17-15-15), IgG3 (17-15),

IgG3 (15-15-15), IgG3 (15), e IgG4

67 articulação superior de IgG1 EPKSCDKTHT 10

68 articulação mediana de IgG1 CPPCP 5

69 articulação inferior de IgG1 (a APELLGG 7 mesma para IgG3 (17-15-15-15), IgG3 (17-15-15), IgG3 (17-15), IgG3 (15-15-15), IgG3 (15), e IgG4)

70 CH1 de terminação C de IgG2 VDKTV 5

71 articulação mediana de IgG2 CCVECPPCP 9

72 articulação inferior de IgG2 APPVAG 6

73 IgG3 (17-15-15-15) articulação ELKTPLGDTT HT 12 superior (a mesma para IgG3 (17-15-15) e IgG3 (17-15))

74 IgG3 (17-15-15-15) articulação CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSC 40 mediana DTPPPCPRCP 50

75 IgG3 (17-15-15) articulação CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCP 35 mediana

76 IgG3 (17-15) articulação CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP 20 mediana

77 IgG3 (15-15-15) articulação EPKS 4 superior (a mesma para IgG3(15))

78 IgG3 (15-15-15) articulação CDTPPPCPRC PEPKSCDTPP PCPRCPEPKS CDTPPPCPRC 40 mediana P 41

79 IgG3 (15) articulação mediana CDTPPPCPRC P 11

80 IgG4 articulação superior ESKYGPP 7

81 IgG4 articulação mediana CPSCP 5

82 IgG4 articulação inferior APEFLGG 7

83 CH1 Humana de IgG1 tipo ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 selvagem WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKV 98

84 CH1 de IgG2 Humana tipo ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 selvagem

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTV 98

85 CH2 de IgG1 Humana Tipo PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 40 Selvagem YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 80

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK 103

86 CH2 Humana de IgG1 com PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 40 A330S/P331S YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 80

EYKCKVSNKA LPSSIEKTIS KAK 103

87 CH3 Humana de IgG1 tipo GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 40 selvagem WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG 80

NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG 106

88 IgG1-IgG2-IgG1f ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVER KCCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPG 326

89 IgG1-IgG2CS-IgG1f ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

90 IgG1-IgG2-IgG1.1f ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRREMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

91 IgG1-IgG2CS-IgG1.1f ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

92 IgG1-IgG2-1gG1f2 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

93 IgG1-IgG2(C219S)-IgG1f2 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

94 IgG2-IgG1f2 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

95 IgG2(C219S)-IgG1f2 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPG 325

96 Articulação de IgG2 humana tipo ERKCCVECPP CPAPPVAG 18 selvagem

97 Articulção de IgG2 Humana com ERKSCVECPP CPAPPVAG 18 C219S

98 Articulação de IgG2/IgG1 ERKCCVECPP CPAPELLGG 19

99 Articulação de IgG2 ERKSCVECPP CPAPELLGG 19 (C219S)/IgG1

100 Articulação de IgG1 Humana tipo EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GG 22 selvagem

101 Articulação de IgG1.1 EPKSCDKTHT CPPCPAPEAE GA 22 (L234A/L235E/G237A

102 CH2 de IgG2 humana tipo PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW 40 selvagem YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK 80

EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTK 103

103 CH3 de IgG2 humana tipo GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 40 selvagem WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG 80

NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 107

104 IgG1f com K de terminação C ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

105 IgG2.3 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

106 IgG2.3G1-AY ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

107 IgG2.3G1-KH ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

108 IgG2.5 ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

109 IgG1.1f ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAEGA 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

110 IgG2.3G1.1f-KH ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

111 IgG1-deltaTHT ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKCPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

112 IgG2.3-maisTHT ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVETHTCP PCPAPPVAGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPGK 329

113 IgG2.3-plusGGG ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVEGGGCP PCPAPPVAGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPGK 329

114 IgG2.5G1.1f-KH ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

115 IgG2.5G1-AY ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

116 IgG2.5G1-KH ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

117 IgG2.5-maisTHT ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVETHTCP PCPAPPVAGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPGK 329

118 IgG1-G2.3G1-AY ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVER KSCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

119 IgG1-G2.3G1-KH ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

120 G2-G1-G1-G1 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

121 G2.5-G1-G1-G1 ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

122 G1-G2.3-G2-G2 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

123 G1-KRGEGSSNLF ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

124 G1-KRGEGS ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

125 G1-SNLF ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

126 IgG1-ITNDRTPR ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

127 G1-SNLFPR ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVER KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

128 G2-RKEGSGNSFL ASTKGPSVFP LAPCSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

129 G2-RKEGSG ASTKGPSVFP LAPCSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

130 G2-NSFL ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

131 IgG2-TIDNTRRP ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

132 G2-NSFLRP ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVEP KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

133 G1-G1-G2-G1-AY ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

134 G1-G1-G2-G1-KH ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPPVAGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPGK 329

135 G2-G2.3-G1-G2-KH ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

136 G2.5-G2.3-G1-G2-KH ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

137 G2-G2.3-G1-G2-AY ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPG 326

138 G2.5-G2.3-G1-G2-AY ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

139 G1-G2.3-G1-G1-KH ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

140 G2-G1-G2-G2-AY ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

141 G2.5-G1-G2-G2-AY ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

142 G1-G2-G1-G1-AY ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCVECPPCP APELLGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

143 G2-G1-G2-G2-KH ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPPVAGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPG 328

144 G2.5-G1-G2-G2-KH ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCDKTHTCP PCPAPPVAGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPGK 329

145 Articulação de IgG1-delta ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KCPPCPAPEL LGGPSVFLFP 120

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV 160

HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS 200

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS 240

LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF 280

FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS 320

PGK 323

146 IgG2-deltaHinge ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCPPCPAPPV AGPSVFLFPP 120

KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVQF NWYVDGVEVH 160

NAKTKPREEQ FNSTFRVVSV LTVVHQDWLN GKEYKCKVSN 200

KGLPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL 240

TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PMLDSDGSFF 280

LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 320

GK 322

147 Articulação de IgG2.5-delta ASTKGPSVFP LAPSSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCPPCPAPPV AGPSVFLFPP 120

KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVQF NWYVDGVEVH 160

NAKTKPREEQ FNSTFRVVSV LTVVHQDWLN GKEYKCKVSN 200

KGLPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL 240

TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PMLDSDGSFF 280

LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 320

GK 322

148 IgG1-deltaG237 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGP 120

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY 160

VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE 200

YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM 240

TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 280

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 320

KSLSLSPG 328

149 IgG2-maisG237 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSCVECPPCP APPVAGGPSV 120

FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 160

GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK 200

CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK 240

NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 280

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS 320

LSLSPGK 327

150 IgG2.4 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCSVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

151 IgG2.3/4 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KSSVECPPCP APPVAGPSVF 120

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 160

VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC 200

KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240

QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 280

GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 320

SLSPGK 326

152 Articulação IgG2 C220S ERKCSVECPP CPAPPVAG 18

153 C220S de articulação de ERKCSVECPP CPAPELLGG 19 IgG2/IgG1

154 Porção de Articulação de IgG2 ERKCCVECPP CPAP 14 tipo selvagem

155 C219S de porção de Articulação ERKSCVECPP CPAP 14 de IgG2

156 C220S de porção de Articulação ERKCSVECPP CPAP 14 de IgG2n

157 C219X de porção de Articulação ERKXCVECPP CPAP 14 IgG2

158 C220X de porção de Articulação ERKCXVECPP CPAP 14 de IgG2

159 Articulação de IgG2 CH1+IgG2 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 (tipo selvagem) WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 80

YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAG 116

160 IgG2 com C219X ERKXCVECPP CPAPPVAG 18

161 IgG2 com C220X ERKCXVECPP CPAPPVAG 18

162 híbrido de IgG2/IgG1 com ERKXCVECPP CPAPELLGG 19 C219X

163 híbrido de IgG2/IgG1 com ERKCXVECPP CPAPELLGG 19 C220X

164 deltaG de híbrido de IgG2/IgG1 ERKCCVECPP CPAPELLG 18

165 híbrido de IgG2/IgG1 com ERKSCVECPP CPAPELLG 18 C219S deltaG

166 híbrido de de IgG2/IgG1 com ERKCSVECPP CPAPELLG 18 C220S deltaG

167 híbrido de IgG2/IgG1 com ERKXCVECPP CPAPELLG 18 C219X deltaG

168 híbrido de IgG2/IgG1 com ERKCXVECPP CPAPELLG 18 C220X deltaG

169 Porção de articulação de IgG2 PVAG 4

170 Porção de articulação de IgG1 SCDKTHT 7

171 Porção 1 de articulação de IgG1 ELLG 4

172 Porção 2 de articulação de IgG1 ELLGG 5

173 Domínio Extracelular Maduro de EINGSANYEM FIFHNGGVQI LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ 40 huICOS (21 – 134 de ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD 80 NP_036224.1) HSHANYYFCN LSIFDPPPFK VTLTGGYLHI YESQ 114

174 Sequência de Nucleotídeo de ATG GAG TTT GGG CTG ACC TGG GTT TTC CTC GTT GCT 36

Domínio Variável de Cadeia CTT TTA AGA GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG 72 Pesada 3E8 GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG ATG TCC 108

CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC 144

AGT ACC TAT GGC ATG CAG TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180

GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG ACA GTT ATA TGG CAT 216

GAT GGA AGT CAT AAA GAC TAT GCA GAC TCC GTG AAG 252

GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC 288

ACG ATG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG 324

GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT CGG CAA 360

ACT GGG GAG GGC TAC TTT GAC TTC TGG GGC CAG GGA 396

ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 417

175 Sequência de Nucleotídeo de ATG AGG GTC CTC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG 36 Domínio Variável de Cadeia CTC TGT TTC CCA GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG 72 Leve 3E8 ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA 108

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT 144

ATT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 180

GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC 216

AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC 252

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC 288

AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC 324

CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCG TAC ACT TTT GGC CAG 360

GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA 381

176 Sequência de Nucleotídeo de ATG GAC ATA CTT TGT TCC ACG CTC CTG CTA CTG ACT 36 Domínio Variável de Cadeia GTC CCG TCC TGG GTC TTA TCC CAG GTC ACC TTG AGG 72 Pesada 17C4 GAG TCT GGT CCT GCG CTG GTG AAA CCC ACA CAG ACC 108

CTC ACA CTG ACC TGC ACC TTC TCT GGG TTC TCA CTC 144

AGC ACT AGT GGA ATG TGT GTG AGC TGG ATC CGT CAG 180

CCC CCA GGG AAG GCC CTG GAG TGG CTT GCA CTC ATT 216

GAT TGG GAT GAT GAT AAA TTC TAC AGC ACA TCT CTG 252

AAG ACC AGG CTC ACC ATC TCC AAG GAC ACC TCC AAA 288

AAC CAG GTG GTC CTT ACA ATG ACC AAC ATG GAC CCT 324

GTG GAC ACA GCC ACG TAT TAC TGT GCA CGG ATG TCA 360

ACA CCT ACC TAC TAC GGT TTG GAC GTC TGG GGC CAA 396

GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 420

177 Sequência de Nucleotídeo de ATG AGG GTC CTC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG 36 Domínio Variável de Cadeia CTC TGT TTC CCA GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG 72 Leve 17C4 ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA 108

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT 144

ATT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 180

GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC 216

AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC 252

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC 288

AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC 324

CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCT CTC ACT TTC GGC GGA 360

GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA 381

178 Sequência de Nucleotídeo de ATG GAC ACA CTT TGC TCC ACG CTC CTG CTG CTG ACC 36 Domínio Variável de Cadeia ATC CCT TCA TGG GTC TTG TCC CAG ATC ACC TTG AAG 72 Pesada 1D7 GAG TCT GGT CCT ACG CTG GTG AAA CCC ACA CAG ACC 108

CTC ACG CTG ACC TGC ACC TTC TCT GGG TTC TCA CTC 144

GGC TCT AAT GGA CTG GGT GTG GGC TGG ATC CGT CAG 180

CCC CCA GGA AAG GCC CTG GAG TGG CTT GCA CTC ATT 216

TAT TGG GAT GAT GAT AAG CGC TAC AGT CCA TCT CTG 252

AAG AGC AGG CTC ACC ATC ACC AAG GAC TCC TCC AAA 288

AAC CAG GTG GTC CTT ACA ATG ACC AAC ATG GAC CCT 324

GTG GAC ACA GCC ACG TAT TAC TGT GCA CAC AGG AAC 360

AGT GGC TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ATC CTG GTC 396

ACC GTC TCC TCA 408

179 Sequência de Nucleotídeo de ATG AGG GTC CTC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG 36 Domínio Variável de cadeia leve CTC TGT TTC CCA GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG 72 1D7 ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA 108

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT 144

TTT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 180

GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC 216

AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC 252

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC 288

AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC 324

CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCT TAC ACT TTT GGC CAG 360

GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA 381

180 Sequência de Nucleotídeo de ATG AGG GTC CTC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG 36 Domínio CTC TGT TTC CCA GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG 72 Variável de Cadeia Leve-b 1D7 ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA 108

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT 144

ATT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 180

GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC 216

AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC 252

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC 288

AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC 324

CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCT CTC ACT TTC GGC GGA 360

GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA 381

181 Sequência de Nucleotídeo de ATG GAC ACA CTT TGC TCC ACG CTC CTG CTG CTG ACC 36 Domínio Variável de Cadeia ATC CCT TCA TGG GTC TTG TCC CAG ATC ACC TTG AAG 72 Pesada 9D5 GAG TCT GGT CCT ACG CTG GTG AAA CCC ACA CAG ACC 108

CTC ACG CTG ACC TGC ACC TTC TCT GGG TTC TCA CTC 144

GGC ACT AGT GGA CTG GGT GTG GGC TGG ATC CGT CAG 180

CCC CCA GGA AAG GCC CTG GAG TGG CTT GCA TTC ATT 216

TAT TGG GAT GAT GAT AAG CGC TAC AGC CCA TCT CTG 252

AAG AGC AGG CTC ACC ATC ACC AAG GAC ACC TCC AAA 288

AAC CAG GTG GTC CTT ACA ATG ACC AAC ATG GAC CCT 324

GTG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA CAC AGA CGG 360

GGC TTT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC 396

ACC GTC TCC TCA 408

182 Sequência de Nucleotídeo de ATG AGG GTC CTC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG 36 Domínio Variável de Cadeia CTC TGT TTC CCA GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG 72 Leve 9D5

ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA 108

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT 144

ATT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 180

GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC 216

AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC 252

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC 288

AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC 324

CAA CAG TAT AAT AGT TAC CCG CTC ACT TTC GGC GGA 360

GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA 381

183 Sequência de Nucleotíceo de GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT 36 ICOS.33kappa GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CAG 72

GCC AGT CAG GAC ATT AGC AAT TAT TTA AGC TGG TAT 108

CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC 144

TAC TAT ACA AAT CTA TTG GCA GAA GGG GTC CCA TCA 180

AGG TTC AGT GGA AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTT ACT 216

TTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA 252

ACA TAT TAC TGT CAA CAG TAT TAT AAC TAT CGG ACG 288

TTC GGC CCT GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGT ACG 324

GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT 360

GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG 396

TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA 432

GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT 468

AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG 504

GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG 540

AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC 576

TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 612

ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG 642

184 Sequência de Nucleotídeo de GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA 36 ICOS.33-g1f-S267E AAG CCT GGG GGG TCC CTT AGA CTC TCC TGT GCA GCC 72

TCT GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT TTC ATG CAC TGG 108

GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTT 144

GGC GTC ATA GAC ACT AAA AGT TTT AAT TAT GCA ACC 180 TAT TAC TCT GAT TTG GTG AAA GGC AGA TTC ACC ATC 216 TCA AGA GAT GAT TCA AAA AAC ACG CTG TAT CTG CAA 252 ATG AAC AGC CTG AAA ACC GAG GAC ACA GCC GTG TAT 288 TAC TGT ACC GCA ACC ATC GCT GTC CCA TAT TAC TTC 324 GAT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC 360 TCA GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG 396 GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG 432 GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA 468 CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC 504 AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC 540 TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG 576 CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC 612 AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC 648 AAG AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC 684 ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG 720 GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG 756 GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA 792 TGC GTG GTG GTG GAC GTG GAG CAC GAA GAC CCT GAG 828 GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG 864 CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC 900 AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC 936 CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG 972 TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC 1008 GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA 1044

GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAG 1080 GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG 1116 GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG 1152

TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG 1188 ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC 1224

TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG 1260

TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG 1296

CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC 1332

CTC TCC CTG TCC CCG GGT TGA 1353

185 Sequência de aminoácido de EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCEASGFIFK YYAMSWVRQA 40 cadeia pesada de IgG-2644 PGKGLEWVSG ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKHTLY 80

LQMNSLRAED TAVYYCAKDG DFDWIHYYYG MDVWGQGTTV 120

TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP 160

VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL 200

GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE 240

LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV 280

KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 320

LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP 360

SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 400

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH 440

NHYTQKSLSL SPG 453

186 Sequência de aminoácido de EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCEASGFIFK YYAMSWVRQA 40 domínio variável de cadeia PGKGLEWVSG ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKHTLY 80 pesada de IgG-2644 LQMNSLRAED TAVYYCAKDG DFDWIHYYYG MDVWGQGTTV 120

TVSS 124

187 Sequência de aminoácido de ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 domínio constante de cadeia WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 pesada de IgG-2644 YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPG 329

188 Sequência de aminoácido de AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP 40 cadeia leve de IgG-2644 GKAPKLLIYD ASSLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP 80

EDFATYYCQQ FNSYPHTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120 SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ 160 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 189 Sequência de Aminoácido de AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SALAWYQQKP 40 domínio variável de cadeia leve GKAPKLLIYD ASSLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP 80 de IgG-2644 EDFATYYCQQ FNSYPHTFGG GTKVEIK 107 190 IgG-2644 cadeia leve Constant RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ 40 Domain Sequência de WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE 80 Aminoácido KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC 107 191 IgG-2644 CDRH1 Sequência de YYAMS 5 Aminoácido 192 IgG-2644 CDRH2 Sequência de GISGSGGSTY YADSVKG 17 Aminoácido 193 Sequência de Aminoácido de DGDFDWIHYY YGMDV 15 CDRH3 de IgG-2644 194 Sequência de Aminoácido de RASQGISSAL A 11 CDRL1 de IgG-2644 195 Sequência de Aminoácido de DASSLES 7 CDRL2 de IgG-2644 196 Sequência de Aminoácido de QQFNSYPHT 9 CDRL3 de IgG-2644 197 Sequência de Nucleotídeo de GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA 36 cadeia pesada de IgG-2644 CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GAA GCC 72 TCT GGA TTC ATC TTT AAA TAC TAT GCC ATG AGC TGG 108

GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC 144 TCA GGT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC 180 GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA 216 GAC AAT TCC AAG CAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC 252 AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTT TAT TAC TGT 288 GCG AAA GAT GGG GAT TTT GAC TGG ATC CAC TAT TAC 324 TAT GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC 360

ACC GTC TCC TCA GCG TCG ACC AAG GGC CCA TCC GTC 396

TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG 432

GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC 468

TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC 504

GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC 540

CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 576

GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC 612

TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC 648

AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC 684

AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA 720

CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA 756

AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT 792

GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA 828

GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC 864

GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG 900

GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC 936

CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG 972

GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA 1008

GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG 1044

CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA 1080

TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG 1116

ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC 1152

GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC 1188

AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC 1224

GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC 1260

AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC 1296

TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG 1332

CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT 1359

198 Sequência de Nucleotídeo de GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA 36 Domínio Variável de Cadeia CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GAA GCC 72 Pesada de IgG-2644 TCT GGA TTC ATC TTT AAA TAC TAT GCC ATG AGC TGG 108

GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC 144

TCA GGT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC 180

GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA 216

GAC AAT TCC AAG CAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC 252

AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTT TAT TAC TGT 288

GCG AAA GAT GGG GAT TTT GAC TGG ATC CAC TAT TAC 324

TAT GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC 360

ACC GTC TCC TCA 372

199 Sequência de Nucleotídeo de GCG TCG ACC AAG GGC CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCA 36 Domínio Constante de Cadeia CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC 72 Pesada de IgG-2644 CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG 108

GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC 144

GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA 180

GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC 216

TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC 252

GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG 288

AGA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA 324

TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA 360

CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC 396

ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC 432

GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC 468

AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT 504

AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC 540

AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG 576

CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC 612

AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG 648

AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA 684

CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG 720

ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC 756

AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG 792

GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC 828

ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC 864

CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG 900

CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT 936

GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC 972

TCC CTG TCC CCG GGT 987

200 Sequência de Nucleotídeo de GCC ATC CAG TTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT 36 Cadeia Leve de IgG-2644 GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG 72

GCA AGT CAG GGC ATT AGC AGT GCT TTA GCC TGG TAT 108

CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC 144

TAT GAT GCC TCC AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA TCA 180

AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT 216

CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA 252

ACT TAT TAC TGT CAA CAG TTT AAT AGT TAC CCT CAC 288

ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGT 324

ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA 360

TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT 396

GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC 432

AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG 468

GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC 504

AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG 540

CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC 576

GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC 612

GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 642

201 Sequência de Nucleotídeo de GCC ATC CAG TTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT 36 Domínio Variável de Cadeia GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG 72 Leve de IgG-2644 GCA AGT CAG GGC ATT AGC AGT GCT TTA GCC TGG TAT 108

CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC 144

TAT GAT GCC TCC AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA TCA 180

AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT 216

CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA 252

ACT TAT TAC TGT CAA CAG TTT AAT AGT TAC CCT CAC 288

ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA 321

202 Sequência de Nucleotídeo de CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG 36 Domínio Constante de Cadeia CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT 72 Leve de IgG-2644 GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG 108

GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA 144

TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC 180

AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG 216

ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC 252

TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG 288

CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 321

203 Sequência de Aminoácido de SIFDPPPFKV TL 12 Epítopo de ICOS.4

204 Domínio Constante de cadeia ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 pesada com lisina de terminação WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 C de huIgG1f YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240

MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

205 Isoforma 2 (Q9Y6W8-2) MKSGLWYFFL FCLRIKVLTG EINGSANYEM FIFHNGGVQI 40

LCKYPDIVQQ FKMQLLKGGQ ILCDLTKTKG SGNTVSIKSL 80

KFCHSQLSNN SVSFFLYNLD HSHANYYFCN LSIFDPPPFK 120

VTLTGGYLHI YESQLCCQLK FWLPIGCAAF VVVCILGCIL 160

ICWLTKKM 168

206 IgG1 Humana (P01857-1) ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40

WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80

YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160

YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 240

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280

LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320

QKSLSLSPGK 330

207 VKI O18 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP 40

GKAPKLLIYD ASNLETGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP 80

EDIATYYCQQ YDNLP 95

208 JK3 FTFGPGTKVD IK 12

209 VH3-15 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NAWMSWVRQA 40

PGKGLEWVGR IKSKTDGGTT DYAAPVKGRF TISRDDSKNT 80 LYLQMNSLKT EDTAVYYCTT 100

210 JH4 YFDYWGQGTL VTVSS 15

211 Cadeia Pesada de mICOS.1- EVDLVETGGG LVQPGGSLKL SCVASGFTFS RYWMFWIRQA 40 mG1 PGKGLEWVSS VSTDGRSTYY PDSVQGRFTI SRNDAENTVY 80

LQMNSLRSED TATYYCAKEG YYDGSYYAYY FDYWGQGVTV 120

TVSSAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP 160

VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP 200

SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP CICTVPEVSS 240

VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV 280

DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF 320

KCRVNSAAFP APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA 360

KDKVSLTCMI TDFFPEDITV EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD 400

TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH EGLHNHHTEK 440

SLSHSPGK 448

212 Cadeia Leve de mICOS.1-mG1 DVQMAQSPSS LAASPGESVS INCKASKSIS KYLAWYQQKP 40

GKANKLLIYS GSTLQSGTPS RFSGSGSGTD FTLTIRNLEP 80

EDFGLYYCQQ HNAYPPTFGT GTKLELKRAD AAPTVSIFPP 120

SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL 160

NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 200

STSPIVKSFN RNEC 214

213 Cadeia Pesada de ICOS.4-mG1 EVQLVESGGG LVKPAGSLTL SCVASGFTFS DYFMHWVRQA 40

PGKGLEWVAV IDTKSFNYAT YYSDLVKGRF TVSRDDSQGM 80

VYLQMNNLRK EDTATYYCTA TIAVPYYFDY WGQGTMVTVS 120

SAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV KGYFPEPVTV 160

TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 200

VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFI 240

FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV 280

EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS VSELPIMHQD WLNGKEFKCR 320

VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP PPKEQMAKDK 360

VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG 400

SYFVYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS 440

HSPGK 445

214 Cadeia Leve de ICOS.4-mG1 DIQMTQSPSS LPASLGDRVT INCQASQDIS NYLSWYQQKP 40

GKAPKLLIYY TNLLADGVPS RFSGSGSGRD YSFTISSLES 80

EDIGSYYCQQ YYNYRTFGPG TKLEIKRADA APTVSIFPPS 120

SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID GSERQNGVLN 160

SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 200

TSPIVKSFNR NEC 213

215 Cadeia Pesada de ICOS.34-G1f EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYFMHWVRQA 40

PGKGLEWVGV IDTKSFNYAT YYSDLVKGRF TISRDDSKNT 80

LYLQMNSLKT EDTAVYYCTT TIAVPYYFDY WGQGTLVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV 160

SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ 200

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG 240

GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN 280

WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG 320

KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE 360

EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 400

VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY 440

TQKSLSLSPG 450

216 Cadeia Leve de ICOS.34-G1f DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLSWYQQKP 40

GKAPKLLIYY TNLLADGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP 80

EDIATYYCQQ YYNYRTFGPG TKVDIKRTVA APSVFIFPPS 120

DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE 160

SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 200

SSPVTKSFNR GEC 213

217 Cadeia Pesada de ICOS.35-G1f EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYFMHWVRQA 40

PGKGLEWVGV IDTKSFNYAT YYSDLVKGRF TISRDDSKNT 80

LYLQMNSLKT EDTAVYYCTA TIAVPYYFDY WGQGTLVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV 160

SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ 200

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG 240

GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN 280

WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG 320

KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE 360

EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 400

VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY 440

TQKSLSLSPG 450

218 Cadeia Leve de ICOS.35-G1f DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLSWYQQKP 40

GKAPKLLIYY TNLLADGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP 80

EDIATYYCQQ YYNYRTFGPG TKVDIKRTVA APSVFIFPPS 120

DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE 160

SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 200

SSPVTKSFNR GEC 213

219 Agonista de via de NKTR-214 PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT 40 FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR 80 IL-2 PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW 120

ITFSQSIIST LT 132

Claims (48)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado humanizado que se liga à molécula de coestimulador induzível humano (ICOS), caracterizado pelo fato de que o anticorpo bloqueia a ligação e/ou a interação de um ligante de ICOS ao ICOS humano e em que o anticorpo: (a) induz a proliferação e a produção de interferon-gama (IFN-γ) em células CD25- CD4+ T com uma EC50 de cerca de 0,01 a cerca de 0,16 nM em um ensaio de cocultura de CHO-OKT3-CD32A in vitro; e/ou (b) induz a produção de IFN-γ em células CD25- CD4+ T com uma EC50 de cerca de 0,002 a cerca de 0,4 nM em uma enterotoxina B estafilocócica em uma célula T CD25- CD4+ e ensaio de cocultura de célula B.

2. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui uma ou mais das seguintes características: (a) liga-se às células T humanas com uma EC50 de cerca de 0,7 nM e células T cinomolgas com uma EC50 de cerca de 0,3 nM; (b) liga-se às células CD4+ T ativadas humanas; (c) não se liga ao CD28 humano ou CTLA-4 humano; (d) ativa pelo menos um linfócito T primário, tal como uma célula CD4+ T efetora (Teff), uma célula T auxiliar follicular (Tfh), e uma célula T reguladora (Treg); (e) induz a fosforilação de proteína cinase B (pAkt) em um ensaio de sinalização de célula T primária in vitro com uma EC50 de cerca de 30 nM; (f) induz a produção de interleucina-10 (IL-10) em resposta à enterotoxina B estafilocócica em um ensaio de cocultura de célula B infantil e Tfh;

(g) induz um maior aumento da proliferação de Teffs estimuladas por CD3 comparado a CD45RA+ Tregs e CD45RO+ Tregs em um ensaio in vitro; (h) reduz a supressão de Teff por Tregs; (i) em que 10 μg/mL do anticorpo não aumenta a produção de citocina em um ensaio de célula sanguínea inteira; (j) aumenta a secreção de pelo menos um de IL-10 e IFN- g por células Tfh in vitro; (k) estimula a sinalização mediada por ICOS; (l) possui afinidade aumentada para CD32B e/ou CD32A; e/ou (m) possui afinidade diminuída para CD16.

3. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo bloqueia a interação de ICOS humano e ICOS-L humano.

4. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao ICOS humano, cinomolgo, camundongo e rato.

5. Anticorpo isolado que se liga à molécula de coestimuldor induzível humano (ICOS), caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 9, 10 e 11, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 12, 14 e 15, respectivamente; (b) domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 18, 19 e 20, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 21, 22 e 23, respectivamente; (c) domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 26, 27 e 28, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 29, 30 e 31, respectivamente; (d) domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 34, 35 e 36, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 37, 38 e 39, respectivamente; (e) regiões CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 42, 43, e 44, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 45, 46, e 47, respectivamente; (f) domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 42, 43, e 44, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 49, 50, e 51, respectivamente; ou (g) domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 191, 192, e 193, respectivamente, e um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 194, 195, e 196, respectivamente.

6. Anticorpo isolado que se liga à molécula de coestimuldor induzível humano (ICOS), caracterizado pelo fato de que as regiões variáveis de cadeias pesada e leve compreendem: (a) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 5 e 6, respectivamente; (b) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 16 e 17, respectivamente; (c) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 24 e 25, respectivamente; (d) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 32 e 33, respectivamente; (e) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 40 e 41, respectivamente; (f) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 40 e 48, respectivamente; ou (g) as sequências de aminoácido de SEQ ID Nos: 186 e 189, respectivamente.

7. Anticorpo isolado caracterizado pelo fato de que compete para ligação ICOS com ou liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo de acordo com a reivindicação 6.

8. Anticorpo isolado anti-ICOS caracterizado pelo fato de que especificamente liga-se a um ou mais resíduos de SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano.

9. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o epítopo ICOS compreende resíduo de aminoácidos SIFDPPPFKVTL (SEQ ID Nº: 203) de ICOS humano.

10. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de tamanho natural.

11. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de tamanho natural IgG1 ou IgG2a.

12. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc comparado à sequência IgG1 humana como mencionado na SEQ ID Nº:

206.

13. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma ou mais substituições de aminoácido realçam a afinidade do anticorpo para FcγRIIb.

14. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma ou mais substituições de aminoácido estão na posição 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, ou 332, de acordo com o índice de EU, ou na posição 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, e/ou 332E, ou em que a região Fc compreende pelo menos duas substituições em 235Y-267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D, 267E-268E, e/ou 267E-328F.

15. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido na região Fc é S267E comparado à sequência IgG1 humana como mencionado na SEQ ID Nº: 206.

16. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo reduziu a atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) comparado a um anticorpo de controle IgG1.

17. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragemento de anticorpo.

18. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, Fab', (Fab')2, Fv, ou scFv.

19. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

20. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

21. Anticorpo monoclonal isolado, de tamanho natural, humanizado que se liga à molécula de coestimulador induzível humano (ICOS), caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID Nº: 7, e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID Nº: 8.

22. Anticorpo monoclonal isolado, de tamanho natural, humanizado que se liga à molécula de coestimulador induzível humano (ICOS), caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada consiste na sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID Nº: 7, e a cadeia leve consiste na sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID Nº: 8.

23. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica a região variável de cadeia pesada e/ou região variável de cadeia leve do anticorpo como definido na reivindicação 5 ou 6.

24. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é um cDNA.

25. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 23 ou 24.

26. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido na reivindicação 25.

27. Método de produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 26, em que o anticorpo é produzido.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que também compreende recuperar o anticorpo da célula hospedeira.

29. Molécula biespecífica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ligada a uma segunda porção funcional.

30. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a molécula biespecífica como definida na reivindicação 29, e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou uma glicoproteína hialuronidase ativa neutra solúvel.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que também compreende um agente terapêutico adicional.

32. Composição de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-PD-1, anti-PD-L1 anticorpo, e/ou um anticorpo anti-CTLA-

4.

33. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que é para o uso como um medicamento.

34. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que é para o uso no tratamento de câncer.

35. Anticorpo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cervical, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer esofágico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer de cólon, câncer de rim, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de célula germinativa, câncer de osso, câncer de fígado, câncer de tiroide, câncer de pele, neoplasma do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, ou câncer relacionado a vírus.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal (CRC), carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC), melanoma, tipo NSCLC- adenocarcinoma (NSCLC-AD), tipo célula escamosa NSCLC (NSCLC- SQC), adenocarcinoma da próstata (PRC), carcinoma de célula renal (RCC), ou carcinoma urotelial (UCC).

37. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que é para o uso no aprimoramento de uma resposta imune.

38. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que está na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

39. Método para tratar ou retardar a progressão de câncer em um ser humano caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao ser humano uma quantidade eficaz de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a molécula biespecífica como definida na reivindicação 29, ou composição como definida na reivindicação 30, 31, ou 32.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino/cervical, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer esofágico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de rim, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de célula germinativa, câncer de osso, câncer de fígado, câncer de tiroide, câncer de pele, neoplasmo do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, ou câncer relacionado a vírus.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que também compreende administrar um ou mais agente terapêutico adicional ao ser humano.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente quimioterápico.

43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-PD- 1, anticorpo anti-PD-L1, e/ou um anticorpo anti-CTLA-4.

44. Método de acordo com a reivindicação 39 a 43, caracterizado pelo fato de que o método compreende pelo menos um ciclo de administração, onde para cada um de pelo menos um ciclo, pelo menos uma dose do anticorpo seja administrada em uma dose de cerca de 375 mg.

45. Método de estimular uma resposta imune em um ser humano caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao ser humano uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou a composição como definida na reivindicação 30, 31, ou 32.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui um tumor e uma resposta imune contra o tumor é estimulada.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui uma infecção viral crônica e uma resposta imune contra a infecção viral é estimulada.

48. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em uma quantidade ou frequência suficiente para obter e/ou manter uma ocupação receptora de menos do que cerca de 80%.