TW201706305A - 具有增強之激動劑活性之針對ｃｄ４０的抗體 - Google Patents

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羅尼 達罕
布萊恩Ｃ 邦哈特
布傑特 迪沃克斯
亞倫Ｐ 亞尼克
相農Ｌ 歐卡達
布蘭達Ｌ 史帝芬斯
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Abstract

本文中提供結合至人類CD40之激動性抗體或其抗原結合部分。此類抗體視情況包含對FcγRIIb具有增強之特異性的Fc區。本發明亦提供藉由向有需要之個體投與本發明抗體來治療癌症或慢性感染之方法。

Description

具有增強之激動劑活性之針對CD40的抗體 相關申請案之交叉引用
本申請案要求2016年3月4日提交之美國臨時申請案第62/303,838號、2015年11月9日提交之第62/252,615號及2015年6月29日提交之第62/186,076號之優先權，其揭示內容均以引用的方式併入本文中。
近期研究揭示，人類癌症及慢性感染可用調節患者對惡性或感染細胞之免疫反應的藥劑進行治療。參見例如，Reck及Paz-Ares(2015)Semin.Oncol.42：402。基於激動性抗CD40抗體，諸如CP-870893及達西珠單抗(dacetuzumab)(SGN-40)可增強此類免疫反應之信念，已嘗試將其用於治療癌症。參見例如，Kirkwood等人(2012)CA Cancer J.Clin.62：309；Vanderheide及Glennie(2013)Clin.Cancer Res.19：1035。近期在小鼠中進行之實驗揭示，對抑制性Fc受體FcγRIIb具有增強之特異性的抗CD40抗體具有增加之抗腫瘤功效。參見例如，WO 2012/087928；Li及Ravetch(2011)Science 333：1030；Li及Ravetch(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci(USA)109：10966；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19：101；White等人(2011)J.Immunol.187：1754。
需要用於治療人類個體之癌症及慢性感染的改良之激動性抗人類CD40抗體。此類抗體較佳相較於活化Fc受體而對抑制性Fc受體FcγRIIb具有增強之特異性，且將展現增強之抗腫瘤及/或抗感染活性。
本文中提供特異性結合至人類CD40(SEQ ID NO：1之成熟序列)的分離之人類化鼠類單株抗體，其視情況具有對結合至FcγRIIb受體之特異性增強之經修飾Fc區。
在某些實施例中，本發明係關於與以下抗體中之一或多種競爭結合、交叉阻斷該一或多種抗體或結合至與該一或多種抗體相同之抗原決定基的抗huCD40抗體或其抗原結合片段：抗體12D6(SEQ ID NO：3及4)、5F11(SEQ ID NO：23及24)、8E8(SEQ ID NO：40及41)、5G7(SEQ ID NO：52及53)及19G3(SEQ ID NO：58及59)，包括人類或人類化抗體。
在某些實施例中，本發明之抗人類CD40抗體或其抗原結合片段在包含一或多個序列或由一或多個序列組成之抗原決定基處結合，該一或多個序列選自由以下組成之群：WGCLLTAVHPEPPTACRE(SEQ ID NO：1之殘基11-28)(抗體12D6)、EPPTACREKQYLINS(SEQ ID NO：1之殘基21-35)(抗體12D6、5G7及19G3)及ECLPCGESE(SEQ ID NO：1之殘基58-66)(抗體5F11)。
在一些實施例中，本發明之抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含CDRH1、CDRH2及CDRH3序列且該輕鏈包含CDRL1、CDRL2及CDRL3序列，該等序列至少部分來源於與抗huCD40抗體12D6、5F11、8E8、5G7或19G3相同之小鼠生殖系V區基因區段及J區基因區段，如表3中所揭示。具體言之，該抗體可包含來源於與以下相同之鼠類生殖系的CDR序列：抗體12D6(至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-39_01及J區生殖系IGHJ4之重鏈CDR序列，及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK1-110_01及J區生殖系IGKJ1之輕鏈CDR序列)、抗體5F11(至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-4_02及J區生殖系IGHJ3之重鏈CDR序列，及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK3-5_01及J區生 殖系IGKJ5之輕鏈CDR序列)、抗體8E8(至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-80_01及J區生殖系IGHJ2之重鏈CDR序列，及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK1-110_01及J區生殖系IGKJ2之輕鏈CDR序列)、抗體5G7(至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-18_01及J區生殖系IGHJ4之重鏈CDR序列，及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK10-96_01及J區生殖系IGKJ2之輕鏈CDR序列)或抗體19G3(至少部分來源於鼠類V區生殖系VH5-9-4_01及J區生殖系IGHJ3之重鏈CDR序列，及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK1-117_01及J區生殖系IGKJ2之輕鏈CDR序列)。
在各種實施例中，本發明之抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含CDRH1、CDRH2及CDRH3序列且該輕鏈包含CDRL1、CDRL2及CDRL3序列，該等序列選自由以下組成之群：抗體12D6-03之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：5之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：6之殘基24-39、55-61及94-102；抗體12D6-22之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：7之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：9之殘基24-39、55-61及94-102；抗體12D6-23之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：10之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：11之殘基24-39、55-61及94-102；抗體12D6-24之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：12之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：9之殘基24-39、55-61及94-102；抗體5F11-17之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：25之殘基31-35、50-66及99-106且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：26之殘基24-38、54-60及93-101；抗體5F11-23之CDR，其中 CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：27之殘基31-35、50-66及99-106且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：28之殘基24-38、54-60及93-101；抗體5F11-45之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：29之殘基31-35、50-66及99-106且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：30之殘基24-38、54-60及93-101；抗體8E8-56之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：42之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：43之殘基24-39、55-61及94-102；抗體8E8-62之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：44之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：45之殘基24-39、55-61及94-102；抗體8E8-67之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：46之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：47之殘基24-39、55-61及94-102；抗體8E8-70之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：48之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：49之殘基24-39、55-61及94-102；抗體8E8-71之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：50之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：51之殘基24-39、55-61及94-102；抗體5G7-22之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：54之殘基31-35、50-66及99-102且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：55之殘基24-34、50-56及89-97；抗體5G7-25之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：56之殘基31-35、50-66及99-102且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：57之殘基24-34、50-56及89-97；抗體19G3-11之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：60之殘基31-35、50-66及99-101且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：62之殘基24-39、55-61及94-102；及抗體19G3-22之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：63之殘基31-35、50-66及99-101且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：64之殘基24-39、55-61及94-102。
在各種實施例中，本發明之抗體包含重鏈，該重鏈包含選自由以下組成之群之可變結構域：12D6(SEQ ID NO：3之殘基1-119)、5F11(SEQ ID NO：23之殘基1-117)、8E8(SEQ ID NO：40之殘基1-122)、5G7(SEQ ID NO：52之殘基1-113)及19G3(SEQ ID NO：58之殘基1-112)；及選自由以下組成之群的包含FcγRIIb特異性Fc區之恆定區：IgG1f(SEQ ID NO：65)、SE(SEQ ID NO：66)、SELF(SEQ ID NO：67)、P238D(SEQ ID NO：68)、V4(SEQ ID NO：69)、V4 D270E(SEQ ID NO：70)、V7(SEQ ID NO：71)、V8(SEQ ID NO：72)、V9(SEQ ID NO：73)、V9 D270E(SEQ ID NO：74)、V11(SEQ ID NO：75)及V12(SEQ ID NO：76)。
在一些實施例中，該抗體包含選自由以下組成之群的特定重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域：12D6-03(分別為SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之殘基1-119及1-112)、12D6-22(分別為SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9之殘基1-119及1-112)、12D6-23(分別為SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11之殘基1-119及1-112)、12D6-24(分別為SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：9之殘基1-119及1-112)、5F11-17(分別為SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26之殘基1-117及1-111)、5F11-23(分別為SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28之殘基1-117及1-111)、5F11-45(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30之殘基1-117及1-111)、8E8-56(分別為SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43之殘基1-122及1-112)、8E8-62(分別為SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45之殘基1-122及1-112)、8E8-67(分別為SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47之殘基1-122及1-112)、8E8-70(SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：49之殘基1-122及1-112)、8E8-71(分別為SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51之殘基1-122及1-112)、5G7-22(分別為SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55之殘基1-113及1-107)、5G7-25(分別為SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57之殘基1-113及1-107)、19G3-11(分別為SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62之殘基1-112及1-112)、及9G3-22(分別為SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64之殘基1-112及1-112)。此等抗體中之任一者可進一步包括含FcγRIIb特異性Fc區之重鏈恆定區，該重鏈恆定區選自由以下組成之群：IgG1f(SEQ ID NO：65)、SE(SEQ ID NO：66)、SELF(SEQ ID NO：67)、P238D(SEQ ID NO：68)、V4(SEQ ID NO：69)、V4 D270E(SEQ ID NO：70)、V7(SEQ ID NO：71)、V8(SEQ ID NO：72)、V9(SEQ ID NO：73)、V9 D270E(SEQ ID NO：74)、V11(SEQ ID NO：75)及V12(SEQ ID NO：76)。此等抗體中之任一者可進一步包含SEQ ID NO：77之輕鏈κ恆定區。
在具體實施例中，本發明之抗體包含：人類化12D6-24抗體，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈及選自由SEQ ID NO：13-22中之任一者組成之群的重鏈；或人類化5F11-45抗體，其包含SEQ ID NO：30之輕鏈及選自由SEQ ID NO：31-39中之任一者組成之群的重鏈。具體抗體包括12D6-24 SE(SEQ ID NO：9及14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NO：9及15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NO：9及13)、12D6-24 V4(SEQ ID NO：9及16)、12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO：9及17)、12D6-24 V8(SEQ ID NO：9及18)、12D6-24 V9(SEQ ID NO：9及19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO：9及20)、12D6-24 V11(SEQ ID NO：9及21)、12D6-24 V12(SEQ ID NO：9及22)、5F11-45 SE(SEQ ID NO：30及31)、5F11-45 SELF(SEQ ID NO：30及32)、5F11-45 V4(SEQ ID NO：30及33)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NO：30及34)、5F11-45 V8(SEQ ID NO：30及35)、 5F11-45 V9(SEQ ID NO：30及36)、5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO：30及37)、5F11-45 V11(SEQ ID NO：30及38)及5F11-45 V12(SEQ ID NO：30及39)，其中分別提供輕鏈及重鏈之序列。
在其他實施例中，本發明之抗huCD40抗體包含與12D6-24 SE(SEQ ID NO：9及14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NO：9及15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NO：9及13)、12D6-24 V4(SEQ ID NO：9及16)、12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO：9及17)、12D6-24 V8(SEQ ID NO：9及18)、12D6-24 V9(SEQ ID NO：9及19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO：9及20)、12D6-24 V11(SEQ ID NO：9及21)、12D6-24 V12(SEQ ID NO：9及22)、5F11-45 SE(SEQ ID NO：30及31)、5F11-45 SELF(SEQ ID NO：30及32)、5F11-45 V4(SEQ ID NO：30及33)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NO：30及34)、5F11-45 V8(SEQ ID NO：30及35)、5F11-45 V9(SEQ ID NO：30及36)、5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO：30及37)、5F11-45 V11(SEQ ID NO：30及38)或5F11-45 V12(SEQ ID NO：30及39)之重鏈及輕鏈序列共有至少80%、85%、90%及95%序列一致性的重鏈及輕鏈。
在又其他實施例中，本發明之抗huCD40抗體包含主要由以下之重鏈及輕鏈序列組成的重鏈及輕鏈：12D6-24 SE(SEQ ID NO：9及14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NO：9及15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NO：9及13)、12D6-24 V4(SEQ ID NO：9及16)、12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO：9及17)、12D6-24 V8(SEQ ID NO：9及18)、12D6-24 V9(SEQ ID NO：9及19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO：9及20)、12D6-24 V11(SEQ ID NO：9及21)、12D6-24 V12(SEQ ID NO：9及22)、5F11-45 SE(SEQ ID NO：30及31)、5F11-45 SELF(SEQ ID NO：30及32)、5F11-45 V4(SEQ ID NO：30及33)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NO：30及34)、5F11-45 V8(SEQ ID NO：30及35)、5F11-45 V9(SEQ ID NO：30及36)、5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO：30及37)、5F11-45 V11(SEQ ID NO：30及38)或5F11-45 V12(SEQ ID NO：30及39)。
在一些實施例中，包含V4或V9 Fc序列變異體的本發明之抗huCD40抗體進一步包含D270E序列變異體。此類抗體包括人類化12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO：9及17)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO：9及20)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NO：30及34)及5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO：30及37)，其中分別提供輕鏈及重鏈之序列。在替代性實施例中，本發明之抗人類CD40抗體包括包含主要由此等重鏈及輕鏈序列組成之重鏈及輕鏈，或包含與此等序列共有至少80%、85%、90%及95%序列一致性之重鏈及輕鏈的抗體。在一些實施例中，相較於具有天然存在之Fc區的抗體，本發明之抗huCD40抗體包含相對於結合至活化受體，對結合至FcγRIIb具有較高特異性的經修飾Fc區。在某些實施例中，本發明之抗huCD40抗體之A/I比小於5，且在較佳實施例中小於1。
在一些實施例中，本發明之抗huCD40抗體包含一或多個重鏈及一或多個輕鏈，諸如兩個重鏈及兩個輕鏈。
本發明另外提供編碼本發明之抗CD40抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈可變區的核酸、包含該等核酸分子之表現載體、經該等表現載體轉形之細胞，及藉由用該等經表現載體轉形之細胞表現抗體且回收抗體來製造該等抗體之方法。
本發明亦提供包含本發明之抗huCD40抗體或其抗原結合片段及載劑的醫藥組合物。
本發明提供一種增強個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之本發明之抗huCD40抗體或其抗原結合片段，使得該個體之免疫反應得到增強。在某些實施例中，個體具有腫瘤且針對該腫瘤之免疫反應得到增強。在另一個實施例中，個體患有病毒感染，例 如慢性病毒感染，且抗病毒免疫反應得到增強。
本發明亦提供一種抑制個體之腫瘤生長之方法，其包含向該個體投與本發明之抗huCD40抗體或其抗原結合片段，使得腫瘤之生長得到抑制。
本發明進一步提供一種例如藉由免疫療法治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量的例如呈醫藥組合物形式的本發明之抗huCD40抗體或其抗原結合片段，由此治療該癌症。在某些實施例中，該癌症為膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、胃腸癌症、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。在某些實施例中，癌症為轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
在某些實施例中，本文所述的調節免疫功能之方法及治療方法包含投與本發明之抗huCD40抗體與例如以下一或多種其他治療劑之組合，或將本發明之抗huCD40抗體與例如以下一或多種其他治療劑以雙特異性藥劑形式投與：例如抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG3抗體、抗GITR抗體、抗OX40抗體、抗CD73抗體、抗TIGIT抗體、抗CD137抗體、抗CD27抗體、抗CSF-1R抗體及/或抗CTLA-4抗體、TLR激動劑，或IDO或TGFβ之小分子拮抗劑。在具體實施例中，將抗huCD40療法與抗PD1及/或抗PD-L1療法組合，例如用結合至人類PD1之抗體或其抗原結合片段或結合至人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段進行治療。
圖1顯示重新編號為118-446的人類IgG1f恆定結構域(SEQ ID NO：65)之序列以更好地說明本文揭示之Fc序列變異體(表4)。經歷變 化之殘基以粗體顯示，且改變之胺基酸在該殘基下以粗體提供。D270E取代加下劃線。C末端離胺酸(K)殘基已在圖1及SEQ ID NO：65中移除，且所有其他重鏈及重鏈恆定結構域序列揭示於序列表中。然而，在其他實施例中，尤其對於編碼本發明之抗huCD40抗體之重鏈及重鏈恆定結構域之核酸構建體，此等序列在蛋白質之C末端處包括另外的離胺酸殘基或在核酸之3'端包括編碼該額外離胺酸之核苷酸。
圖2係說明人類CD40上經本發明抗體結合以及阻斷CD40L結合之抗原決定基群組(「組」)的維恩圖(Venn diagram)。具有重疊之橢圓形或圓形之抗體競爭結合至人類CD40，且在矩形內之抗體阻斷CD40L與人類CD40之結合。
圖3A及3B顯示如藉由IL-6分泌所量測的激動劑抗CD40抗體對樹突狀細胞之活化作用隨Fc序列之變化。參見實例7。構建包含mAb 12D6-24可變結構域及各種人類IgG1f恆定區，包括IgG1f、SE、SELF、P238D、V4、V8、V9及V12變異體的一系列抗體。圖3A呈現使用來自一個供體之細胞獲得的資料，且圖3B呈現使用來自不同供體之細胞獲得的資料。
圖4顯示如藉由細胞表面CD54所量測的激動劑抗CD40抗體對細胞之活化作用隨可變結構域序列之變化。參見實例7。構建包含人類IgG1f-V12恆定區及來自親本(鼠類)抗CD40 mAb 12D6、5G7、8E8、19G3及5F11之可變結構域的一系列抗體。結果繪製為中值螢光強度(MFI)隨抗體濃度之變化的曲線。
圖5顯示包括具有D270取代之抗體在內的本發明之各種抗體之FcγR結合百分比。參見實例8。包括「-sup」之抗體名稱表示由產抗體細胞得到的上清液，而其餘為純化抗體。資料係以在ForteBio Octet系統中量測的抗體與受體之每個組合的最大受體結合百分比值呈現。參見例如實例3。每一組的三個條柱自左至右表示結合至 hCD32a/FcγRIIa-H131(10μM)(帶影線之條柱)、hCD32b/FcγRIIa-R131(10μM)(黑色條柱)及hCD32b/FcγRIIb(1μM)(白色條柱)。
圖6A及6B分別顯示在表現人類CD40及人類Fcγ受體之轉殖基因小鼠中所選本發明之抗CD40抗體對T細胞活化之影響及血小板計數之變化。參見實例9。圖6A顯示如所指示，用所選本發明之抗CD40抗體處理之動物中Tet-OVA反應性CD8+ T細胞之百分比。圖6B顯示抗體注射後24小時的血小板計數佔處理前血小板計數之百分比。該等圖之比較顯示，活化程度與血小板計數減少相關，其中抗體12D6-V11展現最高活化，以及血小板計數之最大減少。參見實例9。圖6C顯示經MC38腫瘤細胞接種且用抗CD40 12D6-24及5F11-45純系之Fc變異體處理之人類化CD40/FcγR小鼠的抗腫瘤反應。結果呈現為平均值+/-SEM。n=7(12D6-24)或6(5F11-45)。參見實例9。圖6D顯示在C中描述之實驗中來自12D6-24組之無腫瘤小鼠用MC38細胞皮下再攻擊且跟蹤腫瘤生長情況。對照組由未經處理之小鼠組成。結果呈現為平均值+/-SEM。n=4。參見實例9。
本發明提供特異性結合至人類CD40(「huCD40」)且具有激動劑活性的分離之抗體，特定言之單株抗體，例如人類化或人類單株抗體。提供各種人類化鼠類抗huCD40單株抗體之序列。在某些實施例中，本文所描述之抗體係來源於特定鼠類重鏈及輕鏈生殖系序列及/或包含特定結構特徵，諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。在其他實施例中，抗體與具有本文中提供之序列的抗CD40抗體競爭CD40結合，或結合至與抗CD40抗體相同之抗原決定基。在一些實施例中，重鏈Fc區之序列經修飾以特異性增強與FcγRIIb之結合。
本文進一步提供製備此類抗體之方法、包含此類抗體或其抗原結合片段之免疫偶聯物及雙特異性分子，以及經調配以含有該等抗體 或片段之醫藥組合物。本文亦提供使用單獨或與其他免疫刺激劑(例如抗體)及/或癌症或抗感染療法組合之抗體增強免疫反應之方法。因此，本文所述之抗huCD40抗體可用於各種治療應用中之治療，包括例如抑制腫瘤生長及治療慢性病毒感染。
定義
為使本發明之描述可更易於理解，首先定義某些術語。在整個【實施方式】中，闡述其他定義。
CD40係指「TNF受體超家族成員5」(TNFRSF5)。除非另外指明或自上下文清晰可見，否則本文中提及之CD40係指人類CD40(「huCD40」)，且抗CD40抗體係指抗人類CD40抗體。人類CD40進一步以GENE ID編號958及MIM(人類孟德爾遺傳(Mendelian Inheritance in Man))：109535描述。人類CD40(NP_00124 1.1)之序列，包括20個胺基酸之信號序列在內，以SEQ ID NO：1提供。
CD40與CD40配位體(CD40L)相互作用，該配位體又稱TNFSF5、gp39及CD154。除非另外指明或自上下文清晰可見，否則本文中提及CD40L係指人類CD40L(「huCD40L」)。人類CD40L進一步以GENE ID NO：959及MIM：300386描述。人類CD40L(NP_000065.1)之序列以SEQ ID NO：2提供。
除非另外指明或自上下文清晰可見，否則如本文所使用術語「抗體」可包括完整抗體及任何抗原結合片段(亦即，「抗原結合部分」)或其單鏈。在一個實施例中，「抗體」係指包含由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈的醣蛋白或其抗原結合片段。每條重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。在某些天然存在之IgG、IgD及IgA抗體中，重鏈恆定區包含三個結構域，即CH1、CH2及CH3。在某些天然存在之抗體中，每條輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，即 CL。VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，間雜有稱為構架區(FR)之更保守區域。每一VH及VL由三個CDR及四個構架區(FR)構成，自胺基末端至羧基末端按以下次序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)之結合。
抗體通常以高親和力特異性結合至其同源抗原，高親和力係以10-7至10-11M或更低之解離常數(KD)反映。一般認為大於約10-6M之任何KD指示非特異性結合。如本文所使用，「特異性結合」至抗原之抗體係指以高親和力結合至抗原及實質上一致之抗原，但不以高親和力結合至不相關抗原的抗體，高親和力意謂KD為10-7M或更低，較佳為10-8M或更低，甚至更佳為5×10-9M或更低，且最佳在10-8M與10-10M之間或更低。若抗原與給定抗原展現高度序列一致性，例如若其與給定抗原序列展現至少80%、至少90%、較佳至少95%、更佳至少97%或甚至更佳至少99%的序列一致性，則其與給定抗原「實質上一致」。舉例而言，特異性結合至人類CD40之抗體亦可與來自某些非人類靈長類動物物種(例如，食蟹獼猴)之CD40交叉反應，但可能不與來自其他物種之CD40，或除CD40外之抗原交叉反應。
除非另外指明，否則免疫球蛋白可來自任何通常已知之同型，包括(但不限於)IgA、分泌性IgA、IgG及IgM。IgG同型在某些物種中劃分成亞類：人類中的IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。免疫球蛋白，例如人類IgG1，存在若干異型，該等異型彼此有至多幾個胺基酸不同。除非另外指明，否則本發明之抗體包含IgG1f恆定結構域(SEQ ID NO：65)。除非另外指明，否則「抗體」可包括例如單株抗體及多株抗體；嵌合抗體及人類 化抗體；人類抗體及非人類抗體；完全合成抗體；以及單鏈抗體。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指抗體中保留與抗原(例如人類CD40)特異性結合之能力的一或多個片段。術語抗體之「抗原結合部分/片段」內所涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL及VH結構域組成之Fv片段，及(v)由VH結構域組成之dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)。分離之互補決定區(CDR)，或由合成連接子接合的兩個或超過兩個分離之CDR的組合可構成抗體之抗原結合域且其能夠結合抗原。
本發明中亦包括單鏈抗體構建體。儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法，藉由合成連接子接合，由此能夠將其製備為單一蛋白質鏈形式，其中VL區與VH區配對形成單價分子，稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分/片段」內。此等及其他可能的構建體描述於Chan及Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10：301中。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用來篩選片段。抗原結合部分/片段可藉由重組DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶或化學裂解來產生。
除非另外指明，否則詞語「片段」在諸如申請專利範圍中提及抗體而使用時，係指抗體之抗原結合片段，由此「抗體或片段」具有與「抗體或其抗原結合片段」相同之含義。
「雙特異性」或「雙功能抗體」為具有兩個不同重鏈/輕鏈對， 由此產生對不同抗原具有特異性之兩個抗原結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可藉由包括融合瘤融合或Fab'片段連接在內的多種方法產生。參見例如，Songsivilai及Lachmann,(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148,1547-1553。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指對特定抗原決定基展示單一結合特異性及親和力之抗體或其中所有抗體對特定抗原決定基展示單一結合特異性及親和力之抗體組合物。通常此類單株抗體將來源於編碼抗體之單細胞或核酸，且將在未有意引入任何序列改變之情況下繁殖。因此，術語「人類單株抗體」係指具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及視情況存在之恆定區的單株抗體。在一個實施例中，人類單株抗體係由融合瘤產生，該融合瘤例如藉由將自轉殖基因或轉殖染色體非人類動物(例如，具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組的轉殖基因小鼠)獲得的B細胞與永生化細胞融合來獲得。
如本文所使用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，諸如(a)自關於人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉殖染色體動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離的抗體；(b)自經轉形以表現抗體之宿主細胞，例如自轉染瘤分離的抗體；(c)自重組、組合人類抗體文庫分離的抗體；及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體包含利用特定人類生殖系免疫球蛋白序列，由生殖系基因編碼，但包括隨後例如在抗體成熟期間發生之重排及突變的可變區及恆定區。如此項技術中所知(參見例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9)：1117-1125)，可變區含有抗原結合結構域，其由重排形成對外來抗原具有特異性之抗體的 各種基因編碼。除重排之外，可變區亦可藉由多個單胺基酸變化(稱為體細胞突變或高突變)進一步修飾以增加抗體對外來抗原之親和力。恆定區將對抗原進一步反應而改變(亦即，同型轉換)。因此，編碼對抗原起反應的輕鏈及重鏈免疫球蛋白多肽之重排及體細胞突變之核酸序列可能與原始生殖系序列不一致，而是將實質上一致或類似(亦即，具有至少80%一致性)。
「人類」抗體(HuMAb)係指具有構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。另外，若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所使用，術語「人類抗體」不意欲包括來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上的抗體。術語「人類」抗體與「完全人類」抗體同義使用。
「人類化」抗體係指在非人類抗體，例如小鼠抗體之CDR結構域外的一些、大部分或所有胺基酸經來源於人類免疫球蛋白之相應胺基酸置換的抗體。在抗體之人類化形式的一個實施例中，在CDR結構域外的一些、大部分或所有胺基酸經來自人類免疫球蛋白之胺基酸置換，而在一或多個CDR區內的一些、大部分或所有胺基酸不變。胺基酸之少量添加、缺失、插入、取代或修飾係容許的，只要其不消除抗體結合至特定抗原之能力即可。「人類化」抗體保留類似於原始抗體之抗原特異性。
「嵌合抗體」係指可變區來源於一個物種且恆定區來源於另一物種之抗體，諸如可變區來源於小鼠抗體且恆定區來源於人類抗體之抗體。「雜交」抗體係指具有不同類型重鏈及輕鏈，諸如小鼠(親本)重鏈及人類化輕鏈，或小鼠(親本)輕鏈及人類化重鏈的抗體。
如本文所使用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE抗體)。
「異型」係指在特定同型組內之天然存在之變異體，該等變異體不同之處在於一個或幾個胺基酸。參見例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1：1。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
如本文所使用，「分離之抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合至CD40的分離之抗體實質上不含特異性結合除CD40以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合至CD40之抗原決定基的分離之抗體可與來自不同物種之其他CD40蛋白質具有交叉反應性。
"由抗體Fc區與某些Fc受體相互作用得到的「效應功能」包括(但未必限於)C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、FcγR介導之效應功能(諸如ADCC及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP))，及細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調。此類效應功能一般需要Fc區與抗原結合結構域(例如，抗體可變結構域)組合。
「Fc受體」或「FcR」為結合至免疫球蛋白Fc區之受體。結合至IgG抗體之FcR包含FcγR家族之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及替代性剪接形式。FcγR家族由三種活化受體(在小鼠中為FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；在人類中為FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一種抑制受體(FcγRIIb或等效地FcγRIIB)組成。人類FcγR之各種特性概述於表1中。大多數先天性效應細胞類型共表現一或多種活化FcγR及抑制性FcγRIIb，而自然殺手(NK)細胞選擇性地表現一種活化Fc受體(小鼠中的FcγRIII及人類中的FcγRIIIA)，而不表現小鼠及人類中之抑制 性FcγRIIb。人類IgG1結合至大部分人類Fc受體且認為其所結合之活化Fc受體的類型與鼠類IgG2a相同。
「Fc區」(片段可結晶區)或「Fc結構域」或「Fc」係指抗體重鏈介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括結合至位於免疫系統各種細胞(例如效應細胞)上之Fc受體或結合至經典補體系統之第一組分(C1q)的C末端區。因此，Fc區包含除第一恆定區免疫球蛋白結構域(例如CH1或CL)外之抗體恆定區。在IgG、IgA及IgD抗體同型中，Fc區在抗體兩個重鏈之每一者中包含CH2及CH3恆定結構域；IgM及IgEFc區在每一多肽鏈中包含三個重鏈恆定結構域(CH結構域2-4)。對於IgG，Fc區包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3以及在Cγ1與Cγ2之間的鉸鏈。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為自C226位或P230位之胺基酸殘基(或此兩個胺基酸之間的胺基酸)延伸至重鏈之羧基末端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD；亦參見美國專利申請公開 案第2008/0248028號之圖3c-3f。人類IgG Fc區之CH2結構域自約胺基酸231延伸至約胺基酸340，而CH3結構域安置於Fc區中CH2結構域之C末端側，亦即，其自IgG之約胺基酸341延伸至約胺基酸447(包括C末端離胺酸)。如本文所使用，Fc區可為天然序列Fc，包括任何異型變異體或變異體Fc(例如非天然存在之Fc)。Fc亦可指分離之此區域，或處於包含Fc之蛋白質多肽，諸如「包含Fc區之結合蛋白」，亦稱為「Fc融合蛋白」(例如抗體或免疫黏附素)之情況下的此區域。
「天然序列Fc區」或「天然序列Fc」包含與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；以及天然序列人類IgG4 Fc區，以及其天然存在之變異體。天然序列Fc包括Fc之各種異型。參見例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1：1。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗原(例如，huCD40)上免疫球蛋白或抗體特異性結合之位點。蛋白質抗原內之抗原決定基可由相鄰胺基酸(通常為線性抗原決定基)或因蛋白質三級摺疊而並置的非相鄰胺基酸(通常為構形抗原決定基)形成。由相鄰胺基酸形成之抗原決定基通常(但並不總是)在暴露於變性溶劑後保留，而藉由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時喪失。抗原決定基通常以獨特的空間構形包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。
術語「抗原決定基定位」係指鑑別抗原上涉及抗體-抗原識別之分子決定子的過程。用於確定給定抗體所結合之抗原決定基的方法為此項技術中所熟知且包括例如免疫墨點法及免疫沈澱分析，其中測試來自(例如，來自CD40)之重疊或相鄰肽與給定抗體(例如，抗CD40抗體)之反應性；x射線結晶學；2維核磁共振；酵母展示(參見實例6)； 及HDX-MS(參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編，(1996))(參見實例5)。
在提及兩個或超過兩個抗體時之術語「結合至相同抗原決定基」意謂如藉由給定方法所測定，抗體結合至相同的胺基酸殘基區段。用於確定抗體是否與本文所述之抗體結合至「CD40上之相同抗原決定基」的技術包括例如抗原決定基定位法，諸如抗原結晶之x射線分析：抗體複合物，其提供抗原決定基之原子解析；以及氫/氘交換質譜法(HDX-MS)。其他方法監測抗體與抗原片段(例如，蛋白質水解片段)或與抗原之經突變之變異體之結合，其中由於抗原序列內之胺基酸殘基修飾引起的結合損失通常視為抗原決定基組分之指示，諸如丙胺酸掃描突變誘發(Cunningham及Wells(1985)Science 244：1081)或突變體標靶序列變異體之酵母展示(參見實例6)。此外，亦可使用抗原決定基定位之計算組合方法。此等方法依賴於所關注之抗體親和分離組合噬菌體展示肽文庫中之特定短肽的能力。預期具有相同或緊密相關之VH及VL或相同CDR序列之抗體結合至相同抗原決定基。
「與另一抗體競爭結合至標靶」之抗體係指抑制(部分或完全)另一抗體與標靶之結合的抗體。兩種抗體是否彼此競爭結合至標靶，亦即，一種抗體是否抑制另一抗體與標靶之結合及達什麼程度均可使用已知之競爭實驗測定。在某些實施例中，抗體與另一抗體競爭且抑制另一抗體結合至標靶達到至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%程度。抑制或競爭之程度可取決於哪個抗體為「阻斷抗體」(亦即，首先與標靶一起培育之冷抗體)而不同。競爭分析可如例如Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harb.Protoc.；2006；doi：10.1101/pdb.prot4277或Ed Harlow及David Lane編輯之「Using Antibodies」第11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(USA)1999中所描述進行。競爭抗體結合至相同抗原決定 基、重疊抗原決定基或相鄰抗原決定基(例如，如藉由位阻證明)。
其他競爭性結合分析包括：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人(1983),Methods in Enzymology 9：242)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人(1986),J.Immunol.137：3614)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane(1988),Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人(1988),Mol.Immunol.25(1)：7)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人(1990),Virology 176：546)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人(1990),Scand.J.Immunol.32：77)。
如本文所使用，術語「特異性結合」、「選擇性結合」、「選擇性地結合」及「特異性地結合」係指抗體結合至預定抗原上之抗原決定基，而不結合至其他抗原。通常，抗體(i)當例如藉由在BIACORE® 2000表面電漿子共振儀中使用預定抗原，例如重組人類CD40作為分析物且以抗體作為配位體進行之表面電漿子共振(SPR)技術，或針對抗體與抗原陽性細胞之結合的史卡查分析(Scatchard analysis)測定時，以大約小於10-7M，諸如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之平衡解離常數(KD)結合；且(ii)以比其對結合至除預定抗原外之非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)或緊密相關抗原之親和力大至少兩倍的親和力結合至預定抗原。因此，「特異性結合至人類CD40」之抗體係指以10-7M或更低，諸如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合至可溶性或結合細胞之人類CD40的抗體。「與獼猴CD40交叉反應」之抗體係指以10-7M或更低，諸如大約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合至獼猴CD40的抗體。
如本文所使用，術語「kassoc」或「KA」係指特定抗體-抗原相 互作用之締合速率常數，而如本文所使用，術語「kdis」或「KD」係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。如本文所使用，術語「KD」係指平衡解離常數，由KD與KA之比率(亦即，KD/KA)得到且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用此項技術中充分確立之方法測定。用於測定抗體KD之較佳方法包括生物層干涉測量術(BLI)分析，較佳使用ForteBio Octet RED裝置(參見實例3)；表面電漿子共振，較佳使用生物感測器系統，諸如BIACORE®表面電漿子共振系統(參見實例4)；或流式細胞測量術及史卡查分析。
在使用抗體或其抗原結合片段之活體外或活體內分析之情況下，術語「EC50」係指抗體或其抗原結合片段誘導最大反應之50%，亦即，最大反應與基線之間之一半之反應的濃度。
術語「結合至固定CD40」係指本文所描述之抗體能夠結合至例如在細胞表面上表現或附接至固體支撐物之CD40。
如本文所使用，術語「交叉反應」係指本文所描述之抗體能夠結合至來自不同物種之CD40。舉例而言，結合人類CD40的本文所描述之抗體亦可結合來自另一物種之CD40(例如，獼猴CD40)。如本文所使用，交叉反應性可藉由在結合分析(例如SPR、ELISA)中偵測與純化抗原之特異性反應性，或與生理學上表現CD40之細胞結合或以其他方式功能上相互作用來量測。用於測定交叉反應性之方法包括如本文中所描述之標準結合分析，例如使用BIACORE®2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)進行的BIACORE®表面電漿子共振(SPR)分析，或流式細胞測量技術。
如本文所使用，術語“天然存在”在應用於一個對象時係指一個對象可在自然界中發現之事實。舉例而言，存在於可由自然界中之來源分離之生物體(包括病毒)中且未在實驗室中經人類有意修飾的多肽或聚核苷酸序列係天然存在的。
「多肽」係指包含至少兩個連續連接之胺基酸殘基的鏈，且鏈長無上限。蛋白質中之一或多個胺基酸殘基可含有修飾，諸如(但不限於)糖基化、磷酸化或二硫鍵。「蛋白質」可包含一或多個多肽。
如本文所使用，術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股的，且可為cDNA。
亦提供對本文提供之抗體序列的「保守序列修飾」，亦即，不消除由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列之抗體與抗原之結合的核苷酸及胺基酸序列修飾。舉例而言，修飾可藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發引入。保守序列修飾包括保守胺基酸取代，其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。此項技術中已確定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，抗CD40抗體中預測之非必需胺基酸殘基較佳經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。鑑別不消除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守取代的方法為此項技術中熟知的。參見例如，Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)94：412-417(1997)。
或者，在另一個實施例中，突變可沿全部或部分抗CD40抗體編碼序列，諸如藉由飽和突變誘發隨機引入，且所得經修飾之抗CD40抗體可針對結合活性之改善進行篩選。
對於核酸，術語「實質上同源」指示兩個核酸或其指定序列在最佳對準並比較時在至少約80%之核苷酸，通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%之核苷酸中一致，具有適當核苷酸插入或缺失。或者，當區段將在選擇性雜交條件下與該股之互補序列雜交時存在實質上同源。
對於多肽，術語「實質上同源」指示兩個多肽或其指定序列在最佳對準並比較時在至少約80%之胺基酸，通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%之中一致，具有適當核苷酸插入或缺失。
兩個序列之間的一致性百分比係隨序列最佳對準時各序列共有之相同位置數目而變化(亦即，同源性%=相同位置數量/位置總數×100)，其中最佳對準係考慮實現兩個序列之最佳對準所需引入的空位數目及每一空位之長度確定。如以下非限制性實例中所述，兩個序列之間序列比較及一致性百分比測定可使用數學演算法完成。
兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之空位權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來測定。亦可使用E.Meyers及W.Miller(CABIOS,4：11-17(1989))之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、12分之空位長度罰分及4分之空位罰分來測定兩個核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比。另外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))演算法(其已併入GCG套裝軟體中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之空位權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來測定。
本文所描述之核酸及蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行檢索，從而例如鑑別相關序列。此等檢索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之NBLAST及XBLAST程式 (2.0版)進行。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程式(得分=100，字長=12)進行，以獲得與本文所描述之核酸分子同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程序(得分=50，字長=3)進行，以獲得與本文所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為實現帶空位之對準以達成比較目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用帶空位之BLAST。當使用BLAST及帶空位之BLAST程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
核酸可存在於全細胞、細胞溶解產物中或以部分純化或實質上純形式存在。當藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術自其他細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸(例如染色體之其他部分)或蛋白質純化分離時，核酸為「分離」或「實質上純」的。參見F.Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
如本文所使用，術語「載體」意欲指能夠運輸其所連接之另一核酸的核酸分子。一種載體類型為「質體」，其係指其中可連接其他DNA區段的環形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA片段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中後可整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其以可操作方式連接之基因的表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此「質體」與「載體」可互換使用。 然而，亦包括提供同等功能之其他表現載體形式，諸如病毒載體(例如複製缺陷性反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所使用，術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指包含並非天然存在於細胞中之核酸的細胞，且可為引入重組表現載體之細胞。應瞭解，此類術語不僅意指特定個體細胞，而且指此類細胞之後代。因為某些修飾可因突變或環境影響而出現在後代中，所以此類後代可能實際上與親本細胞不一致，但仍包括在如本文所使用之術語「宿主細胞」之範圍內。
「免疫反應」係指脊椎動物內針對外來物質之生物反應，該反應保護生物體免受此等物質及由該等物質所引起之疾病影響。免疫反應係藉由免疫系統之細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜伊紅血球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性白血球)及由此等細胞中之任一者或肝產生的引起選擇性靶向、結合至、損害、破壞及/或消除脊椎動物體內之侵入病原體、感染病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞，或在自體免疫或病理性炎症之情況下正常人類細胞或組織的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子及補體)之作用介導。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如效應T細胞或Th細胞，諸如CD4+或CD8+ T細胞，或者抑制或耗盡Treg細胞。「T效應」(「Teff」)細胞係指具有細胞溶解活性之T細胞(例如CD4+及CD8+ T細胞)以及分泌細胞因子且活化及引導其他免疫細胞之T輔助(Th)細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。
如本文所使用，術語「T細胞介導之反應」係指由T細胞，包括效應T細胞(例如CD8+細胞)及輔助T細胞(例如CD4+細胞)介導之反應。T細胞介導之反應包括例如T細胞之細胞毒性及增殖。
如本文所使用，術語「細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應」係指由細胞毒性T細胞誘導之免疫反應。CTL反應主要係由CD8+ T細胞介 導。
「免疫調節劑」或「免疫調控劑」係指可涉及調節、調控或改變免疫反應之試劑，例如信號傳導路徑之組分。「調節」、「調控」或「改變」免疫反應係指免疫系統細胞或此類細胞(例如效應T細胞)活性之任何改變。此類調節包括刺激或抑制免疫系統，其可顯現為各種細胞類型之數目之增加或減少、此等細胞之活性之增加或降低，或可在免疫系統內發生之任何其他變化。已鑑別出抑制性與刺激性免疫調節劑，其中一些可在腫瘤微環境中具有增強之功能。在較佳實施例中，免疫調節劑係位於T細胞表面上。「免疫調節標靶」或「免疫調控標靶」為經靶向以結合物質、試劑、部分、化合物或分子且活性藉由物質、試劑、部分、化合物或分子之結合而改變的免疫調節劑。免疫調節標靶包括例如細胞表面上之受體(「免疫調節受體」)及受體配位體(「免疫調節配位體」)。
「免疫療法」係指藉由包含誘導、增強、抑制或以其他方式改變免疫反應的方法治療罹患疾病或有感染或經歷疾病復發之風險的個體。
「免疫刺激療法(Immunostimulating therapy)」或「免疫刺激性療法(immunostimulatory therapy)」係指使個體之免疫反應增加(誘導或增強)以例如用於治療癌症的療法。
「增強內源性免疫反應」意謂增加個體中現有免疫反應之有效性或效力。此有效性及效力之增加可例如藉由克服抑制內源性宿主免疫反應之機制或藉由刺激增強內源性宿主免疫反應之機制來實現。
如本文所使用，術語「連接」係指兩個或超過兩個分子之締合。連接可為共價或非共價的。連接亦可為基因的(亦即，重組融合)。此類連接可使用多種技術公認之技術實現，諸如化學偶聯及重組蛋白產生。
如本文所使用，「投與」係指使用熟習此項技術者已知之各種方法及遞送系統中之任一者以物理方式向個體引入包含治療劑之組合物。本文所述之抗體的較佳投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注投與。如本文所使用，片語「非經腸投與」意謂除經腸及局部投與之外的通常藉由注射進行之投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。或者，本文所述之抗體可經由不為非經腸之途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部投與。投與亦可例如進行一次、複數次及/或歷經一或多個較長時間段。
如本文所使用，術語「抑制」或「阻斷」可互換使用且涵蓋至少約50%，例如至少約60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之部分及完全抑制/阻斷。
如本文所使用，「癌症」係指以異常細胞在體內不受控生長為特徵的一大類疾病。不受調控之細胞分裂可引起惡性腫瘤或細胞形成，該等腫瘤或細胞侵入鄰近組織且可經由淋巴系統或血流轉移至身體遠端部分。
如本文所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指對個體進行或向個體投與活性劑的任何類型之干預或過程，其目的為逆轉、緩解、改善、抑制或減緩或阻止症狀、併發症、病狀或與疾病相關之生物化學標誌之進展、發展、嚴重程度或復發。預防係指對未患疾病之個體投藥以防止疾病發生，或在疾病發生情況下將其影響降至最低。
術語「有效劑量(effective dose)」或「有效劑量(effective dosage)」定義為足以達成或至少部分達成所需作用之量。藥物或治療劑之「治療有效量」或「治療有效劑量」為藥物在單獨或與另一治療劑組合使用時促進疾病消退之任何量，疾病消退體現在疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率及持續時間增加或因患病引起之損傷或殘疾之預防。藥物之「預防有效量」或「預防有效劑量」為藥物在單獨或與另一治療劑組合投與有發生疾病或經歷疾病復發風險之個體時抑制疾病發生或復發的量。治療劑或預防劑促進疾病消退或抑制疾病發生或復發之能力可使用熟習此項技術者已知之多種方法，諸如在臨床試驗期間在人類個體中、在預測於人類中之功效之動物模型系統中，或藉由在活體外分析中分析藥劑活性來評估。
舉例而言，抗癌劑為減緩個體之癌症進展或促進癌症消退之藥物。在較佳實施例中，治療有效量之藥物促進癌症消退達到消除癌症之程度。「促進癌症消退」意謂有效量之藥物單獨或與抗贅生劑組合之投與引起患者體內腫瘤生長或大小減小、腫瘤壞死、至少一種疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率及持續時間增加、預防由患病引起之損傷或殘疾或以其他方式改善疾病症狀。藥理學有效性係指藥物促進患者體內癌症消退之能力。生理學安全性係指由投與藥物引起之毒性，或在細胞、器官及/或生物體層面上之其他不良生理學作用(不良作用)處於可接受之低水準。
舉例而言，對於腫瘤治療，相對於未經治療之個體，藥物之治療有效量或劑量較佳抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且再更佳至少約80%程度。在最佳實施例中，藥物之治療有效量或劑量完全抑制細胞生長或腫瘤生長，亦即，較佳抑制細胞生長或腫瘤生長達100%程度。化合物抑制腫瘤生長之能力可使用下文描述之分析評估。腫瘤生長之抑制可並非在治療後立即發生，且可僅在一段時間之後或在重複投與之後發生。或者， 組合物之此特性可藉由檢查化合物抑制細胞生長之能力來評價，此類抑制可在活體外藉由熟練從業人員已知之分析量測。在本文所描述之其他較佳實施例中，可觀察到腫瘤消退且可持續至少約20天、更佳至少約40天或甚至更佳至少約60天之時間段。
除非上下文另外清晰可見，否則如本文所使用，「組合」療法意欲涵蓋以協同方式投與兩種或超過兩種治療劑，且包括(但不限於)同時給藥。具體言之，組合療法涵蓋共投藥(例如，投與共調配物或同時投與分開的治療組合物)與連續或依序投藥，其限制條件為在投與一種治療劑時以一定方式調節另一種治療劑之投與。舉例而言，一種治療劑可僅在投與不同治療劑之後投與且能夠作用一段指定時間。參見例如，Kohrt等人(2011)Blood 117：2423。
術語「患者」及「個體」係指接受預防性或治療性治療的任何人類。舉例而言，本文所述之方法及組合物可用於治療患有癌症之個體。
在以下子部分中進一步詳細描述本文所述之各種態樣。
I. 抗CD40抗體
本申請案揭示具有用作治療諸如癌症之疾病之治療劑所需之特性的激動性抗huCD40抗體。此等特性包括以下一或多者：以高親和力結合至人類CD40之能力、在人類個體中之可接受地低的免疫原性、優先結合至FcγRIIb之能力及不存在可能降低該抗體之化學穩定性之序列傾向。
如可根據實例5及6中所描述測定，本文藉由序列揭示之抗CD40抗體結合至人類CD40上之特定抗原決定基。結合至相同或緊密相關之抗原決定基的其他抗體將有可能共有此等所需特性，且可藉由競爭實驗發現。
與本文所揭示之抗huCD40抗體競爭之抗huCD40抗體
與本發明之抗體競爭結合至huCD40之抗huCD40抗體可使用與本文所描述之方案(實例1及2)類似的免疫方案產生。與本文藉由序列揭示之抗huCD40抗體競爭結合之抗體亦可藉由用人類CD40或包含其細胞外結構域(SEQ ID NO：1之殘基21-193)之構建體使小鼠或其他非人類動物免疫，或藉由用含有本文揭示之抗huCD40抗體所結合之抗原決定基的人類CD40之片段進行免疫來產生。所得抗體可藉由此項技術中熟知之方法，針對阻斷12D6、5F11、8E8、5G7及/或19G3與人類CD40結合之能力，例如在ELISA中阻斷與CD40之細胞外結構域及免疫球蛋白Fc結構域之融合蛋白的結合，或例如在FACS中阻斷與在表面上表現huCD40之細胞之結合的能力進行篩選。在各種實施例中，在添加12D6、5F11、8E8、5G7或19G3之前、同時或之後，使測試抗體與CD40-Fc融合蛋白(或在表面上表現huCD40之細胞)接觸。舉例而言，可進行「分組」實驗(實例4)以確定測試抗體是否分在與本文藉由序列揭示之抗體相同之「組」，其中本文藉由序列揭示之抗體作為「參考」抗體，且待測試抗體作為「測試」抗體。減少(特別是在大致化學計量濃度下)本文藉由序列揭示之抗體與人類CD40(與Fc之融合物或在細胞上)之結合的抗體很可能結合相同、重疊或相鄰抗原決定基且因此可共有12D6、5F11、8E8、5G7或19G3之所需功能特性。
因此，本文中提供抗huCD40抗體，例如，如藉由ELISA或FACS，諸如藉由使用以下段落中所描述之分析所量測，其抑制本文所描述之抗huCD40抗體與細胞上huCD40之結合達到至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%程度，及/或其與細胞上huCD40之結合受本文所描述之抗huCD40抗體抑制達到至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%程度。
確定測試抗體是否阻斷參考抗體(亦即，「與其競爭」)之結合的例示性競爭實驗可進行如下：將表現CD40之細胞以每個樣品孔105個細胞接種於96孔盤中。將該盤置於冰上，隨後添加範圍自0至50μg/mL(以50μg/mL之最高濃度開始，三倍滴定)之濃度的未偶聯之測試抗體。可使用不相關IgG作為第一抗體之同型對照且以相同濃度添加(以50μg/mL之最高濃度開始，三倍滴定)。可包括與50μg/mL未標記之參考抗體一起預培育之樣品作為完全阻斷(100%抑制)之陽性對照，且可使用在一次培育中不具有抗體之樣品作為陰性對照(無競爭；0%抑制)。培育30分鐘後，在不洗滌情況下，以每孔2μg/mL之濃度添加經標記，例如經生物素化之參考抗體。樣品在冰上再培育30分鐘。未結合之抗體藉由用FACS緩衝液洗滌細胞來移除。細胞結合之經標記參考抗體用偵測標記之試劑，例如用於偵測生物素之PE偶聯之抗生蛋白鏈菌素(Invitrogen，目錄號S21388)偵測。樣品在FACS Calibur流式細胞儀(BD,San Jose)上獲得且用Flowjo軟體(Tree Star,Inc,Ashland,OR)分析。結果可表示為%抑制。
通常，接著倒轉地進行相同實驗，亦即，測試抗體為參考抗體且參考抗體為測試抗體。在某些實施例中，抗體至少部分(例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)或完全(100%)阻斷另一抗體與標靶，例如人類CD40或其片段之結合，且不管抑制在一種抗體抑或另一抗體為參考抗體時發生。當參考抗體與測試抗體彼此以兩種方式，亦即，在首先添加參考抗體之競爭實驗中及在首先添加測試抗體之競爭實驗中競爭時，該等抗體均「交叉阻斷」彼此與標靶之結合。
若例如在競爭實驗(如實例4中所描述之實驗)中以大致相同濃度存在時，抗huCD40抗體抑制12D6、5F11、8E8、5G7及/或19G3與人 類CD40之結合達到至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%程度，則認為其與本文揭示之抗huCD40抗體競爭。除非另外指明，否則如在前兩段中所概述之競爭ELISA實驗中所量測，當一種抗體以與選自由本發明之抗CD40抗體組成之群之抗體以大致相同之莫耳濃度使用時使所選抗體與人類CD40(SEQ ID NO：1)之結合減少至少20%，則認為該抗體與所選抗體競爭。
結合至相同抗原決定基之抗huCD40抗體
結合至與本文所揭示之抗體相同或類似之抗原決定基的抗huCD40抗體可使用與本文所述之方案(實例1及2)類似的免疫方案產生。所得抗體可針對高親和力結合至人類CD40進行篩選(實例3)。所選抗體可接著在酵母展示分析中進行研究，其中huCD40之序列變異體呈現於酵母細胞表面上(實例6)，或藉由氫-氘交換實驗(實例5)進行研究，由此確定該抗體所結合之確切抗原決定基。
抗原決定基可藉由此項技術中已知之任何方法確定。在各種實施例中，若抗huCD40抗體及本文揭示之抗huCD40 mAb與huCD40之至少一個區域內的一或多個相同殘基接觸；若其與huCD40之至少一個區域內之大部分殘基接觸；若其與huCD40之每一區域內之大部分殘基接觸；若其與沿huCD40完整長度之大部分殘基接觸；若其接觸相同的人類CD40之所有不同區域；若其與人類CD40上任一個區域之所有殘基接觸；或若其與所有相同區域之所有相同殘基接觸，則認為抗huCD40抗體與本文揭示之抗huCD40 mAb結合至相同抗原決定基。抗原決定基「區」為沿一級序列之殘基的群集。
用於測定與本文所描述之抗體結合至「huCD40上相同抗原決定基」之抗體的技術包括抗原：抗體複合物晶體之x射線分析，其提供抗原決定基之原子解析。其他方法監測抗體與抗原片段或突變之抗原變異體之結合，其中由抗原序列內胺基酸殘基之修飾引起的結合損失常 常視為抗原決定基組分之指示。方法亦可依賴於所關注抗體自組合噬菌體展示肽文庫或自標靶蛋白之蛋白酶消化物親和分離特定短肽(呈天然三維形式或呈變性形式)的能力。肽則視為定義對應於用以篩選肽庫之抗體之抗原決定基的榜樣。為定位抗原決定基，亦已開發出計算演算法，經顯示該等演算法可定位構形不連續之抗原決定基。
抗原決定基或包含抗原決定基之區域亦可藉由針對結合至一系列跨越CD40之重疊肽進行篩選來鑑別。或者，可使用Jespers等人(1994)Biotechnology 12：899之方法指導具有與本文所描述之抗CD40抗體相同之抗原決定基且因此具有與本文所描述之抗CD40抗體類似之特性之抗體的選擇。使用噬菌體展示，首先抗CD40抗體之重鏈與(較佳人類)輕鏈譜系配對以選擇CD40結合抗體，且接著新輕鏈與(較佳人類)重鏈譜系配對以選擇具有與本文所描述之抗huCD40抗體相同之抗原決定基或抗原決定基區域的(較佳人類)CD40結合抗體。或者，可藉由編碼抗體重鏈及輕鏈之cDNA的突變誘發來獲得本文所描述之抗體的變異體。
如Cunningham及Wells(1989)Science 244：1081所描述之丙胺酸掃描突變誘發，或針對CD40中胺基酸殘基一些其他形式之點突變誘發(諸如實例6提供之酵母展示法)亦可用於確定針對抗CD40抗體之功能性抗原決定基。
特異性抗體所結合之抗原決定基或抗原決定基區域(「抗原決定基區域」為包含抗原決定基或與抗原決定基重疊之區域)亦可藉由評估抗體與包含CD40片段之肽的結合來確定。可合成包含CD40(例如，人類CD40)之序列的一系列重疊肽並例如在直接ELISA、競爭性ELISA(其中評估肽阻止抗體與結合至微量滴定板之孔之CD40結合的能力)中或在晶片上針對結合進行篩選。此類肽篩選方法可能無法偵測一些不連續之功能性抗原決定基，亦即，涉及沿CD40多肽鏈之一 級序列不相鄰之胺基酸殘基的功能性抗原決定基。
抗原決定基亦可藉由基於MS之蛋白質足跡法，諸如氫/氘交換質譜法(HDX-MS)及蛋白質快速光化學氧化(FPOP)來鑑別。HDX-MS可如例如Wei等人(2014)Drug Discovery Today 19：95進一步描述來進行，其方法特定地以引用的方式併入本文中。亦參見實例5。FPOP可如例如Hambley及Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16：2057中所描述來進行，其方法特定地以引用的方式併入本文中。
抗CD40抗體所結合之抗原決定基亦可藉由結構法測定，諸如X射線晶體結構測定法(例如，WO 2005/044853)；分子建模；及核磁共振(NMR)光譜法，包括有關在游離時及與所關注抗體結合形成之複合物時CD40中不穩定醯胺氫之H-D交換速率的核磁共振測定法(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31：11335；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32：6884)。
關於X射線結晶學，結晶可使用此項技術中之任何已知方法(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50：339；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189：1)，包括微批量法(例如Chayen(1997)Structure 5：1269)、懸滴蒸氣擴散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300)、接晶種及透析實現。需要使用濃度為至少約1mg/mL且較佳為約10mg/mL至約20mg/mL的蛋白質製劑。結晶可最佳在含有濃度範圍為約10%至約30%(w/v)之聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量範圍為約1000至約20,000Da)，較佳約5000至約7000Da，更佳約6000Da之沈澱劑溶液中實現。亦可能需要包括蛋白質穩定劑，例如濃度範圍為約0.5%至約20%之甘油。沈澱劑溶液中亦可能需要適合鹽，諸如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉，其濃度範圍較佳為約1mM至約1000mM。沈澱劑較佳緩衝達到約3.0至約5.0、較佳約4.0之pH值。適用於沈澱劑溶液中之特定緩衝液可變化且為此項技術中熟知的 (Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。適用之緩衝劑之實例包括(但不限於)HEPES、Tris、MES及乙酸鹽。晶體可在各種溫度下生長，包括2℃、4℃、8℃及26℃。
抗體：抗原晶體可使用熟知之X射線繞射技術研究且可使用諸如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.發行；參見例如Blundell及Johnson(1985)Meth.Enzymol.114及115,H.W.Wyckoff等人編，Academic Press；美國專利申請公開案第2004/0014194號)及BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49：37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423,Carter及Sweet編；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56：1313-1323)之電腦軟體改進，該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
除非另外指明，且參照申請專利範圍，抗體所結合之抗原決定基係如藉由實質上如實例5中所描述之HDX-MS方法所確定的抗原決定基。
以高親和力結合之抗CD40抗體
在一些實施例中，與本文所揭示之抗huCD40抗體相同，本發明之抗huCD40抗體以高親和力結合於huCD40，從而增加其作為有效治療劑之可能性。在各種實施例中，本發明之抗huCD40抗體以小於10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM之KD結合至huCD40。在其他實施例中，本發明之抗huCD40抗體以介於2nM與100pM之間之KD結合至huCD40。用於評價抗體對huCD40之結合能力的標準分析包括ELISA、RIA、西方墨點法、生物層干涉測量術(BLI)(參見實例3)及BIACORE® SPR分析(參見實例4)。
抗CD40抗體序列變異體
可容許本文所揭示之抗體序列的一些變化且仍然維持抗體之所 需特性。CDR區係使用Kabat系統描繪(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。因此，本發明進一步提供抗huCD40抗體，其包含與本文揭示之抗體(亦即，12D6、5F11、8E8、5G7及19G3，及其人類化衍生物)之CDR序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之CDR序列。本發明亦提供抗huCD40抗體，其包含與本文揭示之抗體(亦即，12D6、5F11、8E8、5G7及19G3，及其人類化衍生物)之重鏈及/或輕鏈可變結構域序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈及/或輕鏈可變結構域序列。
共有CDR序列或來源於相同鼠類生殖系之抗CD40抗體
鑒於抗原結合特異性主要由CDR決定，與本文所揭示之抗體((亦即，12D6、5F11、8E8、5G7及19G3)共有CDR序列的抗體可能共有其所需特性。在一些實施例中，本發明之抗huCD40抗體包含來源於與抗體12D6、5F11、8E8、5G7或19G3相同之鼠類V區及J區生殖系序列之重鏈及輕鏈可變區。抗體12D6具有來源於鼠類生殖系VH1-39_01及IGHJ4之重鏈，及輕鏈生殖系VK1-110_01及IGKJ1。抗體5F11具有來源於鼠類生殖系VH1-4_02及IGHJ3之重鏈，及輕鏈生殖系VK3-5_01及IGKJ5。抗體8E8具有來源於鼠類生殖系VH1-80_01及IGHJ2之重鏈，及輕鏈生殖系VK1-110_01及IGKJ2。抗體5G7具有來源於鼠類生殖系VH1-18_01及IGHJ4之重鏈，及輕鏈生殖系VK10-96_01及IGKJ2。抗體19G3具有來源於鼠類生殖系VH5-9-4_01及IGHJ3之重鏈，及輕鏈生殖系VK1-117_01及IGKJ2。重鏈D區生殖系序列(構成CDRH3之一部分)並未指定，因為其具有較高變化性而通常難以指定，且因此本發明之抗體可包含來源於所列V及J區生殖系及任何D區 生殖系之重鏈。結合至人類CD40且來源於此等生殖系序列中之一些或全部的其他抗體，特定言之來源於相同V區基因之彼等抗體很可能具有密切相關之序列，且因此預期其將共有相同的所需特性。
如本文所使用，若鼠類抗體之可變區係自使用鼠類生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，且該抗體之序列與該生殖系足夠相關以致相較於任何其他生殖系，其更可能來源於給定生殖系，則該抗體包含「來源於」特定生殖系序列之重鏈或輕鏈可變區。此類系統包括用所關注抗原使小鼠免疫。「得到」抗體序列之鼠類生殖系免疫球蛋白序列可藉由將該抗體之胺基酸序列與鼠類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列相比較且選擇序列最接近(亦即，最高一致性%)該抗體之序列的生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。「來源於」特定生殖系免疫球蛋白序列之鼠類抗體由於例如天然存在之體細胞突變或有意引入之定點突變而相較於該生殖系序列可能含有胺基酸差異。然而，所選鼠類抗體之胺基酸序列通常與由生殖系免疫球蛋白基因(例如，V區)編碼之胺基酸序列至少90%一致。在某些情況中，鼠類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因(例如V區)編碼之胺基酸序列至少95%，或甚至是至少96%、97%、98%或99%一致。通常，來源於特定鼠類生殖系序列之抗體將與由生殖系免疫球蛋白基因(例如，V區)編碼之胺基酸序列展示不超過10個胺基酸之差異。在某些情況中，鼠類抗體可包含與由生殖系免疫球蛋白基因(例如V區)編碼之胺基酸序列之不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸差異。
II. 經工程改造及修飾之抗體
V H 及V L 區
亦提供可使用具有本文所揭示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為工程改造經修飾抗體之起始物質來製備經工程改造及經修飾之抗體，該經修飾之抗體可具有相對於起始抗體有所改變之特性。可 藉由修飾一個或兩個可變區(亦即，VH及/或VL)內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內的一或多個殘基來對抗體進行工程改造。或者或另外，可藉由修飾恆定區內之殘基以例如改變抗體之效應功能來對抗體進行工程改造。
可進行之可變區工程改造之一種類型為CDR移植。此類移植特別適用於使與本文所揭示之抗huCD40抗體競爭結合及/或結合至與本文所揭示之抗huCD40抗體相同之抗原決定基的非人類抗CD40抗體人類化。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中的胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，相較於CDR外之序列，CDR內之胺基酸序列在個別抗體之間更多樣化。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可藉由構建包括來自特定參考抗體之CDR序列移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的表現載體來表現模擬特定參考抗體之特性的重組抗體(參見例如，Riechmann,L.等人(1998)Nature 332：323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321：522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.(USA)86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號；及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
此類構架序列可自公共DNA資料庫或包括生殖系抗體基因序列之公開之參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫，以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」,J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol.24：827-836；其各自之內容以引用之方式明確併入本文中。
用於本文所述之抗體中的較佳構架序列為結構類似於本文所述之抗體所使用之構架序列的構架序列。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植至序列與得到構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所發現之序列一致的構架區上，或CDR序列可移植至相較於生殖系序列含有至多20個氨基酸取代(較佳保守胺基酸取代)的構架區上。舉例而言，已發現在某些情況下，使構架區內之殘基突變以維持或增強抗體之抗原結合能力為有益的(參見例如，Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
本文所描述之經工程改造之抗體包括已對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾例如以改善抗體特性者。常常進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法係使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更具體言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於得到抗體之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與得到抗體之生殖系序列來鑑別。為使構架區序列恢復至其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發或PCR介導之突變誘發而「回復突變」成生殖系序列。亦意圖涵蓋此類「回復突變」之抗體。
構架修飾之另一類型涉及使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫法」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
另一類型可變區修飾係使CDR區內之胺基酸殘基突變以改善所關注抗體之一或多種結合特性(例如親和力)。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變及對抗體結合或其他所關注功能特性 之影響。較佳引入保守修飾。突變可為胺基酸添加、缺失或較佳取代。另外，通常在CDR區域內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基經改變。
抗體CDR中之甲硫胺酸殘基可經氧化，引起潛在化學降解且因此降低抗體效力。因此，亦提供在重鏈及/或輕鏈CDR中之一或多個甲硫胺酸殘基經不經歷氧化降解之胺基酸殘基置換的抗CD40抗體。類似地，去醯胺化位點可自抗CD40抗體，特定言之CDR中移除。較佳消除抗原結合結構域內潛在的糖基化位點以防止可能干擾抗原結合之糖基化。參見例如，美國專利第5,714,350號。
靶向抗原結合
在各種實施例中，本發明之抗體經修飾以選擇性阻斷抗原結合將有害的組織及環境中之抗原結合，但允許抗原結合將有益的抗原結合。在一個實施例中，產生阻斷肽「遮罩」，其特異性結合至抗體之抗原結合表面且干擾抗原結合，該遮罩藉由肽酶可裂解連接子連接至抗體之每一結合臂。參見例如，CytomX之美國專利第8,518,404號。此類構建體可用於治療腫瘤微環境中之蛋白酶含量相較於非腫瘤組織大大增加之癌症。腫瘤微環境中可裂解連接子之選擇性裂解允許遮蔽/阻斷肽之解離，使得選擇性結合腫瘤中之抗原，而非抗原結合可能引起不想要之副作用之周圍組織中之抗原。
或者，在相關實施例中，開發一種包含兩個抗原結合結構域之二價結合化合物(「遮蔽配位體」)，其結合至(二價)抗體之兩個抗原結合表面且干擾抗原結合，其中該兩個結合結構域遮罩藉由例如肽酶可裂解之可裂解連接子彼此(而非抗體)連接。參見例如，Tegopharm Corp.之國際專利申請公開案第WO 2010/077643號。遮蔽配位體可包含或來源於抗體意欲結合之抗原或可獨立地產生。此類遮蔽配位體可用於治療腫瘤微環境中之蛋白酶含量相較於非腫瘤組織大大增加之癌 症。腫瘤微環境中可裂解連接子之選擇性裂解允許兩個結合結構域彼此解離，從而降低對抗體之抗原結合表面的親合力。所引起的遮蔽配位體自抗體解離使得選擇性結合腫瘤中之抗原，而非在抗原結合可能引起不想要之副作用之周圍組織中之抗原。
Fc及經修飾Fc
本發明之抗體可包含本發明之可變結構域與包含不同Fc區之恆定結構域的組合，該等Fc區係基於用於預定用途之抗體的生物活性(如存在)選擇。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25：1369。人類IgG例如可分類成四個亞類：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且其各自包含具有結合至一或多種Fcγ受體(活化受體FcγRI(CD64)；FcγRIIA、FcγRIIC(CD32a、c)；FcγRIIIA及FcγRIIIB(CD16a、b)；及抑制受體FcγRIIB(CD32b)，及補體第一組分(C1q)之獨特型態的Fc區。人類IgG1及IgG3結合至所有Fcγ受體；IgG2結合至FcγRIIAH131，且以較低親和力結合至FcγRIIAR131、FcγRIIIAV158；IgG4結合至FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC及FcγRIIIAV158；且抑制受體FcγRIIB對IgG1、IgG2及IgG3具有比所有其他Fcγ受體低之親和力。Bruhns等人(2009)Blood 113：3716。研究顯示，FcγRI不結合至IgG2，且FcγRIIIB不結合至IgG2或IgG4。同上。一般而言，關於ADCC活性，人類IgG1≧IgG3≫IgG4≧IgG2。因此，舉例而言，可選擇IgG1恆定結構域域而非IgG2或IgG4用於需要ADCC之藥物中；若使表現FcγRIIIA之NK細胞、單核細胞或巨噬細胞活化，則可選擇IgG3；且若抗體用於使過敏患者脫敏，則可選擇IgG4。若希望抗體缺乏所有效應功能，則亦可選擇IgG4。
本文所描述之抗huCD40可變區可連接(例如，共價連接或融合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可屬於任何異型或同型，例如對於IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、 G1m17(z)；對於IgG2：G2m、G2m23(n)；對於IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。參見例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。異型之選擇可受潛在的免疫原性問題影響，例如使抗藥物抗體之形成降至最少。
在較佳實施例中，本發明之抗CD40抗體具有結合至FcγRIIb或增強之與FcγRIIb之結合的Fc，其可提供增強之激動作用。參見例如，WO 2012/087928；Li & Ravetch(2011)Science 333：1030；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19：101；White等人(2011)J.Immunol.187：1754。本文所描述之可變區可連接至Fc變異體，該等變異體增強對抑制受體FcyRIIb之親和力，例如增強細胞凋亡誘導之活性或輔助活性。Li & Ravetch(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)109：10966；美國專利申請公開案2014/0010812。此類變異體可提供具有與FcγRIIb+細胞，包括例如B細胞及單核細胞相關之免疫調節活性的抗體。在一個實施例中，Fc變異體提供相對於一或多種活化受體，選擇性增強之對FcγRIIb之親和力。此類變異體亦可展現增強之FcR介導之交聯，由此引起增強之治療功效。用於改變與FcγRIIb之結合之修飾包括在根據EU索引選自由以下組成之群之位置處的一或多個修飾：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用於增強FcγRIIb親和力之示例性取代包括(但不限於)234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用於增強與FcγRIIb之結合之其他Fc變異體包括235Y-267E、236D-267E、239D- 268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E及267E-328F。具體言之，人類IgG1之S267E、G236D、S239D、L328F及I332E變異體，包括S267E-L328F雙重變異體，在特異性增強對抑制FcγRIIb受體之親和力方面特別有意義。Chu等人(2008)Mol.Immunol.45：3926；美國專利申請公開案2006/024298；WO 2012/087928。對於FcγRIIb(如與FcγRIIaR131相區別)之特異性的增強可藉由添加P238D取代及其他突變(Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.& Selection 26：589；WO 2012/1152410)，以及V262E及V264E(Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135：9723；及WO 2014/184545獲得。參見表4(前述)。
半衰期延長
在某些實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。可進行多種方法。舉例而言，此可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力進行。在一個實施例中，抗體之CH1或CL區內經改變成含有獲自IgG Fc區之CH2結構域之兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所描述。增加與FcRn之結合及/或改善藥物動力學特性之其他例示性Fc變異體包括在位置259、308及434進行之取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加Fc與FcRn之結合的其他變異體包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216；Hinton等人，2006 Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9)：6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall'Acqua等人，Journal of Immunology,2002,169：5171-5180；Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。參見美國專利第8,367,805號。
已經提出對IgG Fc中之某些保守殘基(I253、H310、Q311、H433、N434)進行修飾，諸如N434A變異體(Yeung等人(2009)J.Immunol.182：7663)作為增加FcRn親和力，由此增加抗體在循環中之半衰期的一種方式。WO 98/023289。經顯示，包含M428L及N434S之組合Fc變異體可增加FcRn結合且增加血清半衰期多達五倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28：157。包含T307A、E380A及N434A修飾之組合Fc變異體亦延長IgG1抗體之半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18：1759。此外，亦已顯示包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M及M428L-N434S變異體之組合Fc變異體可延長半衰期。WO 2009/086320。
另外，包含M252Y、S254T及T256E之組合Fc變異體使半衰期增加近4倍。Dall'Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281：23514。已使用增加FcRn親和力但降低pH依賴性的相關IgG1修飾(M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F)產生IgG1構建體(「MST-HN Abdeg」)以用作競爭劑以防止其他抗體與FcRn結合，由此增加其他抗體，即內源性IgG(例如在自體免疫環境下)或另一外源性(治療性)mAb之清除率。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23：1283；WO 2006/130834。
用於增加FcRn結合之其他修飾描述於Yeung等人(2010)J.Immunol.182：7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中。
在某些實施例中，可使用雜交IgG同型增加FcRn結合，且潛在地增加半衰期。舉例而言，IgG1/IgG3雜交變異體可藉由用IgG3中兩種同型不同之位置處的胺基酸取代IgG1在CH2及/或CH3區中之位置來構建。因此，可構建包含一或多個取代，例如274Q、276K、300F、 339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R及436F之雜交變異體IgG抗體。在本文所描述之其他實施例中，IgG1/IgG2雜交變異體可藉由用IgG1中兩種同型不同之位置處的胺基酸取代IgG2之CH2及/或CH3區中之位置來構建。因此，可構建包含一或多個取代，例如以下胺基酸取代中之一或多者的雜交變異體IgG抗體：233E、234L、235L、-236G(提及236位甘胺酸之插入)及327A。參見美國專利第8,629,113號。已產生據稱增加血清半衰期且改善表現之IgG1/IgG2/IgG4序列之雜交體。美國專利第7,867,491號(其中之序列編號18)。
亦可藉由聚乙二醇化增加本發明之抗體之血清半衰期。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)試劑(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團附接至抗體或抗體片段之條件下反應。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋用於使其他蛋白質衍生化之任何PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化(aglycosylated)抗體。蛋白質聚乙二醇化方法為此項技術中已知的且可應用於本文所描述之抗體。參見例如，Nishimura等人之EP 0154316及Ishikawa等人之EP 0401384。
或者，在一些情況下，可能需要降低本發明抗體之半衰期而非使其增加。人類IgG1之Fc中之修飾，諸如I253A(Hornick等人(2000)J.Nucl.Med.41：355)及H435A/R、I253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29：2819)可減少FcRn結合，由此降低半衰期(增加清除率)以用於快速清除率較佳之情形，諸如醫學成像。亦參見 Kenanova等人(2005)Cancer Res.65：622。其他增大清除率之方式包括將本發明之抗原結合結構域格式化為缺乏結合FcRn之能力的抗體片段，諸如Fab片段。此類修飾可將抗體之循環半衰期自數週減少至數小時。必要時，接著可使用抗體片段之選擇性聚乙二醇化以微調(增加)抗體片段之半衰期。Chapman等人(1999)Nat.Biotechnol.17：780。抗體片段亦可與人類血清白蛋白融合，例如在融合蛋白構建體中，以增加半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.89：1904。或者，可用本發明之第一抗原結合結構域及結合至人類血清白蛋白(HSA)之第二抗原結合結構域構建雙特異性抗體。參見國際專利申請公開案WO 2009/127691及其中引用之專利文獻。或者，可將特定多肽序列添加至抗體片段以增加半衰期，例如「XTEN」多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27：1186；國際專利申請公開案WO 2010/091122。
另外的Fc變異體
當使用IgG4恆定結構域時，通常較佳包括取代S228P，其模擬IgG1中之鉸鏈序列且藉此使IgG4分子穩定，例如減少所治療之患者中治療性抗體與內源性IgG4之間的Fab臂交換。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27：767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164：1925。
IgG1構建體之鉸鏈中的潛在蛋白酶裂解位點可藉由D221G及K222S修飾消除，由此增加抗體之穩定性。WO 2014/043344。
Fc變異體對其配位體(Fc受體)之親和力及結合特性可藉由此項技術中已知之多種活體外分析方法(基於生物化學或免疫之分析)測定，該等方法包括(但不限於)平衡方法(例如酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如BIACORE® SPR分析)及其他方法，諸如間接結合分析、競爭性抑制分析、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及層析法(例如凝膠過濾)。此等及其他方法可利用 所檢查組分中之一或多者上的標記及/或採用多種偵測方法，包括(但不限於)發色、螢光、發光或同位素標記。結合親和力及動力學之詳細描述可見於Paul,W.E.編，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其著眼於抗體-免疫原相互作用。
在其他實施例中，抗體之糖基化經修飾以增加或降低效應功能。舉例而言，可藉由使297位之保守天冬醯胺殘基突變(例如N297A)，因此消除補體及FcγRI結合來製備缺乏所有效應功能之去糖基化抗體。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23：403。亦參見Tao及Morrison(1989)J.Immunol.143：2595(IgG1中使用N297Q以消除297位之糖基化)。
雖然去糖基化抗體一般缺乏效應功能，但可引入突變以恢復該功能。去糖基化抗體，例如由N297A/C/D/或H突變產生或在系統(例如大腸桿菌)中產生的不使蛋白質糖基化的抗體，可進一步突變以恢復FcγR結合，例如S298G及/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)或E382V及M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)107：604)。
亦可使用糖基工程改造，藉由改變Fc區之Asn297處碳水化合物鏈之α2,6唾液酸基含量以改變IgG構建體之消炎特性，其中增加α2,6唾液酸化形式之比例引起消炎作用之增強。參見Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26：513。相反，降低具有α2,6唾液酸化碳水化合物之抗體的比例可適用於不想要消炎特性之情況。美國專利申請公開案第2008/0206246號提供例如藉由選擇性純化α2,6唾液酸化形式或藉由酶修飾來改變抗體之α2,6唾液酸化含量的方法。在其他實施例中，Fc區之胺基酸序列可經修飾，例如藉由包括F241A修飾以模擬α2,6唾液酸化之作用。WO 2013/095966。
III. 抗體生理特性
本文所述之抗體可在輕鏈或重鏈可變區中含有一或多個糖基化位點。此類糖基化位點可增加抗體之免疫原性，或因改變抗原結合而改變抗體之pK(Marshall等人(1972)Ann.Rev.Biochem.41：673-702；Gala及Morrison(2004)J.Immunol.172：5489-94；Wallick等人(1988)J.Exp.Med.168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol.37：697-706)。已知糖基化可在含有N-X-S/T序列之基元處發生。在一些情況下，較佳具有不含可變區糖基化之抗huCD40抗體。此可藉由選擇在可變區中不含糖基化基元之抗體或藉由使糖基化區域內之殘基突變來實現。
在某些實施例中，本文所述之抗體不含天冬醯胺異構位點。天冬醯胺之脫醯胺化可在N-G或D-G序列上發生且引起異天冬胺酸殘基之產生，由此將扭接引入多肽鏈中且降低其穩定性(異天冬胺酸作用)。
每一抗體將具有獨特等電點(pI)，其一般在6與9.5之間的pH值範圍內。IgG1抗體之pI通常在7至9.5之pH值範圍內且IgG4抗體之pI通常在6至8之pH值範圍內。由此推測pI在正常範圍外之抗體在活體內條件下可能具有部分展開及不穩定性。因此，較佳具有pI值在正常範圍內之抗CD40抗體。此可藉由選擇pI在正常範圍內之抗體或藉由使帶電表面殘基突變來實現。
每一抗體將具有特徵性熔融溫度，其中熔融溫度愈高，表明活體內總體穩定性愈強(KrishnamurthyR及Manning M C(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：361-71)。一般而言，較佳TM1(初始展開溫度)大於60℃，較佳大於65℃，甚至更佳大於70℃。抗體之熔點可使用差示掃描熱量測定法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando 等人(1999)Immunol.Lett.68：47-52)或圓二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr.Sci.40：343-9)量測。
在一個較佳實施例中，選擇不會迅速降解之抗體。可使用毛細電泳法(CE)及MALDI-MS量測抗體之降解(Alexander A J及Hughes D E(1995)Anal Chem.67：3626-32)。
在另一較佳實施例中，選擇具有最低聚集作用之抗體，聚集作用可觸發不想要之免疫反應及/或經改變或不利之藥物動力學特性。一般而言，在聚集度為25%或更低，較佳20%或更低，甚至更佳15%或更低，甚至更佳10%或更低且甚至更佳5%或更低情況下，抗體為可接受的。聚集可藉由若干技術，包括尺寸排阻管柱(SEC)、高效液相層析法(HPLC)及光散射法量測。
IV. 核酸分子
本文所述之另一態樣係關於編碼本文所述之抗體的核酸分子。核酸可存在於全細胞、細胞溶解產物中或以部分純化或實質上純形式存在。當藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析法、限制酶、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術自其他細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸(例如其他染色體DNA，例如在自然界中連接至分離之DNA的染色體DNA)或蛋白質純化分離時，核酸為「分離」或「實質上純」的。參見F.Ausubel等人編(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述之核酸可為例如DNA或RNA且可含有或可不含有內含子序列。在某些實施例中，核酸為cDNA分子。
本文所述之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於藉由融合瘤(例如，如下文進一步描述，由攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備之融合瘤)表現之抗體，編碼由融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。對於自 免疫球蛋白基因文庫獲得(例如使用噬菌體展示技術)之抗體，編碼抗體之核酸可自文庫回收。
一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，此等DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操作，例如以將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)之另一DNA片段。如此情形中所使用，術語「可操作地連接」意欲意謂兩個DNA片段接合，使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
編碼VH區之分離之DNA可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及/或CH3)之另一DNA分子而轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的(參見例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，例如IgG1區域。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
編碼VL區之分離之DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子而轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的(參見例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼可撓性連接子，例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3之另一片段，使得VH及VL序列可表現為相鄰單鏈蛋白質，其中VL及VH區由可撓性連接子接合(參見例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348：552-554)。
V. 抗體產生
本發明之各種抗體，例如與本文揭示之抗人類CD40抗體競爭或結合至與本文揭示之抗人類CD40抗體相同之抗原決定基者，可使用多種已知技術產生，諸如Kohler及Milstein,Nature 256：495(1975)所描述之標準體細胞雜交技術。儘管體細胞雜交程序係較佳的，但原則上亦可採用其他用於產生單株抗體之技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉形、使用人類抗體基因文庫之噬菌體展示技術。
用於製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統。在小鼠中產生融合瘤為公認之程序。分離經免疫脾細胞用於融合之免疫方案及技術為此項技術中已知的。融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦為已知的。
本文所述之嵌合或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。可使用標準分子生物學技術自所關注之鼠類融合瘤獲得編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA且進行工程改造以使其含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為了產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類可變區連接至人類恆定區(參見例如，Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類CDR區插入人類構架中(參見例如，Winter之美國專利第5,225,539號，及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
在一個實施例中，本文所述之抗體為人類單株抗體。此類針對人類CD40之人類單株抗體可使用帶有部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉殖染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉殖染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb mouse®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排之人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微型基因座，及使內源性μ及κ鏈基因座失活之靶向突變(參見例如，Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且響應於免疫，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變而產生高親和力單株人類IgGK單株(Lonberg,N.等人(1994)，前述；評述於Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101中；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；及Harding,F.and Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠之製備及使用以及此類小鼠所攜帶的基因組修飾進一步描述於Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中，所有該等文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。另外參見，全部頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第 5,874,299號及第5,770,429號；Surani等人之美國專利第5,545,807號；Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在某些實施例中，本文所述之抗體係使用在轉殖基因及轉殖染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖染色體之小鼠來產生。此類小鼠(在本文中稱為「KM小鼠」)詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
再者，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統在此項技術中係可獲得的，且可用於產生本文所述之抗huCD40抗體。舉例而言，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代轉殖基因系統；此類小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號中。
另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖染色體動物系統可在此項技術中獲得，且可用於產生本文所述之抗CD40抗體。舉例而言，可使用稱為「TC小鼠」的攜帶人類重鏈轉殖染色體與人類輕鏈轉殖染色體之小鼠；此類小鼠描述於Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97：722-727中。另外，攜帶人類重鏈及輕鏈轉殖染色體之牛已描述於此項技術中(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於產生本文所述之抗huCD40抗體。
此項技術中描述的用於產生人類抗體，例如人類抗huCD40抗體之另外的小鼠系統包括(i)VelocImmune®小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，其中內源性小鼠重鏈及輕鏈可變區已經由同源重組經人類重鏈及輕鏈可變區置換，其可操作地連接至內源性小鼠恆定區，使得在小鼠中產生嵌合抗體(人類V/小鼠C)且隨後使用標準重組DNA技術將其轉化成完全人類抗體；以及(ii)MeMo®小鼠(Merus Biopharmaccuticals,Inc.)，其中小鼠含有未重排之人類重鏈可變區，但單一重排之人類常見輕鏈可變區。此類小鼠及其產生抗體之用途描述於例如WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。
本文所述之人類單株抗體亦可使用篩選人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體展示方法來製備。此類用於分離人類抗體之噬菌體展示方法係此項技術中公認的。參見例如：Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698；Dower等人之美國專利第號5,427,908號及第5,580,717；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197；及Griffiths等人之美國專利第號5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本文所述之人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已重組以使得可在免疫後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。此類小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
免疫
為產生針對人類CD40之完全人類抗體，含有人類免疫球蛋白基因之小鼠或轉殖基因或轉殖染色體小鼠(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)可用CD40抗原之純化或增濃製劑及/或表現CD40之細胞進行免疫，如例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及WO 98/24884關於其他抗原所描述。或者，可用編碼人類CD40之DNA使小鼠免疫。較佳地，小鼠在第一次輸注時為6-16週齡。舉例而言，可使用重組人類CD40抗原之純化或增濃製劑(5-50μg)經腹膜內使小鼠免疫。在使用CD40抗原之純化或增濃製劑免疫不會產生抗體之情況下，亦可用表 現CD40之細胞，例如細胞株使小鼠免疫以促進免疫反應。
各種抗原之累積經驗顯示，當最初用含抗原之Ribi佐劑腹膜內(IP)或皮下(SC)免疫，接著每隔一週用含抗原之Ribi佐劑進行IP/SC免疫(總共多達10次)時，HuMAb轉殖基因小鼠反應最佳。可在免疫方案之過程內監測免疫反應，其中血漿樣品係藉由眶後抽血獲得。血漿可藉由ELISA及FACS(如下所述)篩選，且具有足夠抗CD40人類免疫球蛋白滴度的小鼠可用於融合。可用抗原經靜脈內對小鼠加強免疫3天，接著將其處死並移除脾及淋巴結。預期每次免疫可能需要進行2-3次融合。通常針對每種抗原對6至24隻小鼠進行免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM品系。另外，HCo7與HCo12轉殖基因可一起在具有兩種不同人類重鏈轉殖基因(HCo7/HCo12)之單一小鼠中培育。
產生針對CD40之單株抗體之融合瘤的產生
為產生製造本文所述之單株抗體的融合瘤，可自經免疫小鼠分離脾細胞及/或淋巴結細胞且使其與適當永生化細胞株，諸如小鼠骨髓瘤細胞株融合。接著可針對抗原特異性抗體之產生篩選所得融合瘤。舉例而言，可使來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞的單細胞懸浮液在50% PEG存在下與Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)融合。細胞以大約2×105塗鋪在平底微量滴定盤中，接著在含有10%胎純系血清、18%「653」條件培養基、5% origen(IGEN)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青黴素、50mg/ml鏈黴素、50mg/ml慶大黴素及1X HAT(Sigma)之選擇性培養基中培育兩週。在大約兩週之後，可在HAT經HT置換之培養基中培養細胞。接著可藉由ELISA，針對人類單株IgM及IgG抗體篩選個別孔。一旦發生大量融合瘤生長，即通常可在10-14天之後觀察培養基。可將分泌融合瘤之抗體再塗鋪，再次篩選，且若對人類IgG仍呈陽性，則可藉由限制性稀釋法次選殖單株抗體至少兩 次。接著可在活體外培養穩定次純系以在組織培養基中產生少量抗體用於表徵。
為純化單株抗體，可使所選融合瘤在兩公升旋轉瓶中生長以用於單株抗體純化。可過濾且濃縮上清液，接著用蛋白質A-瓊脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)進行親和層析。溶離之IgG可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查以確保純度。緩衝溶液可更換為PBS，且濃度可藉由OD280，使用1.43消光係數測定。單株抗體可等分且在-80℃下儲存。
VI. 抗體製造
產生針對CD40之單株抗體之轉染瘤的產生
本發明之抗體，包括提供序列之特定抗體及其他相關抗CD40抗體，可使用例如此項技術中所熟知之重組DNA技術與基因轉染方法之組合，在宿主細胞轉染瘤中產生(Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
舉例而言，為表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術(例如使用表現所關注抗體之融合瘤進行的PCR擴增或cDNA選殖)獲得且該等DNA可插入表現載體中，使得基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此情形中，術語「可操作地連接」意欲意謂抗體基因連接至載體，使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。所選表現載體及表現控制序列與所用表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入獨立載體中或兩種基因插入同一表現載體中。抗體基因係藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上之互補限制位點之連接，或在無限制位點存在時之鈍端連接)插入表現載體中。可使用本文所述之抗體之輕鏈及重鏈可變區，藉由將其插入已編碼所需同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，使得VH區段 可操作地連接至載體內之CH區段且VL區段可操作地連接至載體內之CL區段，由此產生任何抗體同型之全長抗體基因。或者或另外，重組表現載體可編碼信號肽，其促進抗體鏈自宿主細胞之分泌。抗體鏈基因可選殖至載體中，使得信號肽同框連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即，來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽)。
除抗體鏈基因外，重組表現載體可攜帶控制宿主細胞中抗體鏈基因之表現的調控序列。術語「調控序列」意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此類調控序列描述於例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計，包括調控序列之選擇，可取決於諸如待轉形之宿主細胞之選擇、所需蛋白質表現量等因素。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括在哺乳動物細胞中引導高蛋白質表現水準之病毒元件，諸如來源於巨細胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或強化子。或者，可使用非病毒調控序列，諸如泛素啟動子或β-血球蛋白啟動子。再者，調控元件由來自不同來源之序列構成，諸如SRα啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及1型人類T細胞白血病病毒之長末端重複序列(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列之外，重組表現載體可攜帶另外的序列，諸如調控載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)及可選擇標記物基因。可選擇標記物基因有助於已引入載體之宿主細胞的選擇(參見例如，美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，均頒予Axel等人)。舉例而言，可選擇標記物基因通常賦予已引 入載體之宿主細胞對諸如G418、潮黴素或甲胺喋呤(methotrexate)之藥物之抗性。較佳可選擇標記物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞)及neo基因(用於G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現，將編碼重鏈及輕鏈之表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。儘管理論上可在原核或真核宿主細胞中表現本文所述之抗體，但由於真核細胞且尤其哺乳動物細胞與原核細胞相比更可能組裝且分泌經適當摺疊且具免疫活性之抗體，故抗體在真核細胞且最佳哺乳動物宿主細胞中之表現為最佳的。據報導，抗體基因之原核表現不能有效進行活性抗體之高產率產生(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。本發明之抗體亦可在酵母甲醇酵母(Pichia pastoris)之糖基工程改造之品系中產生。Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24：210。
用於表現本文所描述之重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括Urlaub及Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216-4220中描述之dhfr-CHO細胞，且使用DHFR可選擇標記物，例如，如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。詳言之，對於用於NSO骨髓瘤細胞，另一較佳表現系統為WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841 GS中所揭示之基因表現系統。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由培養宿主細胞一段足以允許在宿主細胞中表現該抗體或更佳地，將抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中之時間段而產生。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
本發明之抗體多肽鏈之N末端及C末端可因通常觀察到的轉譯後修飾而不同於預期序列。舉例而言，C末端離胺酸殘基常常自抗體重鏈中缺失。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100：1132。在治療抗體之輕鏈與重鏈上，N端麩醯胺酸殘基及更低程度上麩胺酸酯殘基，時常轉化成焦麩胺酸鹽殘基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97：544；Liu等人(2011)JBC 28611211；Liu等人(2011)J.Biol.Chem.286：11211。
本發明之各種激動劑抗huCD40抗體的胺基酸序列提供於序列表中，序列表概述於表8中。出於上文所提及之原因，C末端離胺酸不包括在序列表中關於重鏈或重鏈恆定結構域之任何序列中。然而，在一替代實施例中，本發明之抗huCD40抗體的每條重鏈，及/或編碼此類抗體或其重鏈或輕鏈之遺傳構建體在重鏈之C末端包括此另外的離胺酸殘基。
VII. 分析
可藉由例如標準ELISA測試本文所述之抗體與CD40之結合。簡言之，用含1-2μg/ml純化之CD40之PBS塗佈微量滴定盤，且接著用含5%牛血清白蛋白之PBS阻斷。向各孔中添加抗體稀釋液(例如，來自經CD40免疫之小鼠的血漿稀釋液)且在37℃下培育1至2小時。用PBS/Tween洗滌盤且接著與偶聯至辣根過氧化酶(HRP)之二次試劑(例如，針對人類抗體，或另外具有人類重鏈恆定區之抗體，一種山羊抗人類IgG Fc特異性多株試劑)一起在37℃下培育1小時。在洗滌之後，藉由ABTS基質(Moss Inc，產品：ABTS-1000)使盤顯影且藉由分光光度計在OD 415-495下進行分析。接著藉由流式細胞測量術，針對結合至表現人類CD40之細胞株但不結合至不表現CD40之對照細胞株進一步篩選來自經免疫小鼠之血清。簡言之，藉由將表現CD40之CHO細胞與1：20稀釋之抗CD40抗體一起培育來評估抗CD40抗體之結合。洗 滌細胞且用PE標記之抗人類IgG Ab偵測結合。流式細胞測量術分析係使用FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson,San Jose,CA)進行。較佳地，使用呈現最高滴度之小鼠進行融合。若打算偵測小鼠抗huCD40抗體，則可使用抗小鼠偵測抗體進行類似實驗。
可使用如上文所描述之ELISA篩選對CD40免疫原顯示陽性反應性的抗體，且因此篩選產生該等抗體之融合瘤。接著可次選殖產生較佳以高親和力結合至CD40之抗體的融合瘤且進一步表徵。接著可自保持親本細胞之反應性(藉由ELISA)之每個融合瘤選出一個純系用於製造細胞庫及用於抗體純化。
為純化抗CD40抗體，可使所選融合瘤在兩公升旋轉瓶中生長以用於單株抗體純化。可過濾且濃縮上清液，接著用蛋白質A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行親和層析。溶離之IgG可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查以確保純度。緩衝溶液可更換為PBS，且濃度可藉由OD280，使用1.43消光係數測定。單株抗體可等分且在-80℃下儲存。
為確定所選抗CD40單株抗體是否結合至獨特抗原決定基，可使用市售試劑(Pierce,Rockford,IL)使每一抗體生物素化。可使用抗生蛋白鏈菌素標記之探針偵測生物素化MAb之結合。使用未標記之單株抗體及生物素化之單株抗體進行的競爭研究可如上文所描述，使用CD40塗佈之ELISA盤進行。
為測定純化抗體之同型，可使用對特定同型之抗體具有特異性之試劑進行同型ELISA。舉例而言，為測定人類單株抗體之同型，可在4℃下用1μg/ml抗人類免疫球蛋白塗佈微量滴定盤各孔隔夜。在用1% BSA阻斷之後，使該等盤與1μg/ml或低於1μg/ml之測試單株抗體或純化之同型對照物在環境溫度下反應一至兩小時。接著可使各孔與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶偶聯之探針反應。使盤顯影， 且如上文所描述進行分析。
為測試單株抗體與表現CD40之活細胞的結合，可使用流式細胞測量術。簡言之，在4℃下，將表現膜結合CD40之細胞株(在標準生長條件下生長)與含有0.1% BSA之PBS中各種濃度之單株抗體混合1小時。在洗滌之後，使細胞與藻紅素(PE)標記之抗IgG抗體在與一次抗體染色相同之條件下反應。可藉由FACScan儀器，使用光散射及側向散射特性對單細胞進行閘控來分析樣品，且測定經標記抗體之結合。除流式細胞測量術分析之外或作為流式細胞測量術分析之替代，可使用螢光顯微鏡檢術進行之替代性分析。可嚴密地如上所描述，對細胞進行染色且藉由螢光顯微鏡檢術檢查。此方法允許觀測個別細胞，但取決於抗原密度，可能具有降低之靈敏度。
可藉由西方墨點法進一步測試抗huCD40抗體與CD40抗原之反應性。簡言之，可由表現CD40細胞製備細胞提取物且進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳之後，將分離之抗原轉印至硝化纖維膜上，用20%小鼠血清阻斷，且用待測試之單株抗體探測。可使用抗IgG鹼性磷酸酶偵測IgG結合且用BCIP/NBT基質錠劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)顯影。
用於分析各種抗CD40抗體之結合親和力、交叉反應性與結合動力學的方法包括此項技術中已知之標準分析，例如生物層干涉測量術(BLI)分析及使用BIACORE® 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)之BIACORE®表面電漿子共振(SPR)分析。
在一個實施例中，抗體特異性結合至人類CD40之細胞外區域。抗體可特異性結合至CD40細胞外結構域內的特定結構域(例如功能結構域)。在某些實施例中，抗體特異性結合至人類CD40之細胞外區域及食蟹獼猴CD40之細胞外區域。較佳地，抗體以高親和力結合至人類CD40。
VIII. 雙特異性分子
本文所述之抗體可用於形成雙特異性分子。抗CD40抗體或其抗原結合片段可經衍生化或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如針對受體之另一抗體或配位體)，以產生結合到至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。本文所述之抗體可實際上經衍生化或連接至超過一個其他功能分子以產生結合至超過兩個不同結合位點及/或標靶分子之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲涵蓋於如本文所使用之術語「雙特異性分子」內。為產生本文所述之雙特異性分子，本文所述之抗體可在功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式連接)至一或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，從而產生雙特異性分子。
因此，本文中提供包含至少一個針對CD40之第一結合特異性及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。在雙特異性分子具有多特異性的本文所述之一個實施例中，該分子可進一步包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本文所描述之雙特異性分子包含至少一個抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv作為結合特異性。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體，或其任何極小片段，諸如Fv或單鏈構建體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所描述，其內容以引用的方式明確地併入。
雖然人類單株抗體為較佳的，但在本文所述之雙特異性分子中可採用的其他抗體為鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
本文所述之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將組成結合特異性偶聯來製備。舉例而言，雙特異性分子之每一結合特異性可分別產生，且隨後彼此偶聯。當結合特異性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑之實例包括蛋白質 A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.第78號，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375中所述之彼等方法。較佳偶聯劑為SATA及磺基-SMCC，均購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合特異性為抗體時，其可藉由兩條重鏈之C末端鉸鏈區之硫氫基鍵結來偶聯。在一個尤佳實施例中，在偶聯之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個，較佳一個硫氫基殘基。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法尤其適用於雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白之情況。本文所述之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可使用此項技術中公認之方法，諸如酶聯結免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析證實。此等分析 一般各自藉由採用對所關注複合物具有特異性之經標記試劑(例如，抗體)偵測備受關注之蛋白質-抗體複合物的存在。
IX. 組合物
另外提供含有一或多種如本文中所描述之抗CD40抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑之調配物的組合物，例如醫藥組合物。此類組合物可包括一種本文所述之抗體或免疫偶聯物或雙特異性分子，或(例如兩種或超過兩種不同的)本文所述之抗體或免疫偶聯物或雙特異性分子之組合。舉例而言，本文所述之醫藥組合物可包含結合至標靶抗原上之不同抗原決定基或具有互補活性之抗體(或免疫偶聯物或雙特異性分子)的組合。
在某些實施例中，組合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml或1-300mg/ml或100-300mg/ml之濃度的抗CD40抗體。
本文所述之醫藥組合物亦可以組合療法投與，亦即，與其他藥劑組合。舉例而言，組合療法可包括本文所描述之抗CD40抗體與至少一種其它抗癌劑及/或T細胞刺激劑(例如，活化劑)之組合。可用於組合療法中之治療劑的實例更詳細地描述於下文關於本文所述抗體之用途的部分中。
在一些實施例中，本文所揭示之治療組合物可包括用於治療癌症之其他化合物、藥物及/或藥劑。此類化合物、藥物及/或藥劑可包括例如化學療法藥物、小分子藥物或刺激對給定癌症之免疫反應的抗體。在一些情況下，治療組合物可包括例如以下一或多者；抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體、抗OX40(亦稱為CD134、TNFRSF4、ACT35及/或TXGP1L)抗體、抗LAG-3抗體、抗CD73抗體、抗CD137抗體、抗CD27抗體、抗CSF-1R抗體、TLR激動劑，或針對IDO或TGFβ之小分子拮抗劑。
如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。較佳地，載劑適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。取決於投與途徑，活性化合物(亦即，抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子)可以材料塗佈以保護化合物免受酸作用及其他可能使化合物失活之自然條件影響。
本文所述之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所需生物活性且不賦予任何非所需毒理學作用之鹽(參見例如，Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括來源於無毒無機酸之彼等鹽，該等無機酸諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物；以及來源於無毒有機酸之彼等鹽，該等有機酸諸如脂族單羧酸及脂族二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族磺酸及芳族磺酸，及其類似物。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及衍生自無毒有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物)之鹽。
本文所述之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血基酯、丁基化羥基甲氧苯(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
可用於本文所述之醫藥組合物中的適合水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持恰當流動性。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物存在。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收之試劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。將此類介質及試劑用於醫藥活性物質為此項技術中已知的。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋將其用於本文所述之醫藥組合物中。亦可將補充活性化合物併入組合物中。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣劑、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，在組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括吸收延遲劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
無菌可注射溶液可藉由將所需量活性化合物與上文所列成分之 一或成分組合併入適當溶劑中，視需要隨後進行滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及來自以上列出之成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，由其預先無菌過濾之溶液得到活性成分加任何另外所需成分之粉末。
可與載劑材料組合以製造單一劑型的活性成分之量將取決於所治療之個體及特定投藥模式而變化。可與載劑材料組合以製造單一劑型的活性成分之量一般將為產生治療作用之組合物的量。一般而言，在100%中，此量將在約0.01%至約99%之活性成分、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%範圍內之活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合。
調整劑量方案以得到最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或可依治療情況之緊急性指示按比例減少或增加劑量。就易於投藥及劑量均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所使用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的物理離散單元；各單元含有經計算以產生所需治療作用之預定量活性化合物與所需醫藥載劑之組合。本文所述之單位劑型之規格係由以下指定且直接取決於以下：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療作用，及(b)用於治療個體敏感之此類活性化合物之混配技術中的固有限制。
對於投與抗體，劑量在每公斤宿主體重約0.0001至100mg範圍內，且更通常在0.01至5mg範圍內。舉例而言，劑量可為0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg範圍內。一種示例性治療方案需要每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、一月一次、每3個月一次或每三至6個月一 次投與。
在一些方法中，同時投與具有不同結合特異性之兩種或超過兩種單株抗體，在此情況下，所投與之每一抗體之劑量在所指示之範圍內。治療性抗體通常在多個情形投與。單次劑量之間的時間間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。時間間隔亦可為不規律的，如藉由量測患者體內針對標靶抗原之抗體的血液含量所指示。在一些方法中，調整劑量以達到約1-1000μg/ml之血漿抗體濃度，且在一些方法中達到約25-300μg/ml。
抗體可以持續釋放調配物形式投與，在此情況下，需要降低投藥的頻率。劑量及頻率取決於抗體在患者體內之半衰期而變化。一般而言，人類抗體顯示最長半衰期，接著為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投藥劑量及頻率可取決於治療為預防性抑或治療性而變化。在預防性應用中，通常在較長時間段內，以相對不頻繁之時間間隔投與相對較低劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短之時間間隔投與相對較高之劑量，直至疾病之進展減慢或終止，且較佳直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善。此後，患者可視情況投與預防方案，不過在許多免疫腫瘤學適應症中，持續治療係不必要的。
本文所述之醫藥組合物中活性成分之實際劑量可變化以便獲得有效達成特定患者、組合物及投與模式之所需治療反應，同時對患者無毒的活性成分之量。所選劑量將取決於多種藥物動力學因素，包括採用的本文所述之具體組合物或其酯、鹽或醯胺之活性；投與途徑；投與時間；所用具體化合物之排泄速率；治療持續時間；與所用具體化合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；以及醫學領域中熟知之類似因素。
「治療有效劑量」的本文所述之抗CD40抗體較佳使得疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀期之頻率或持續時間增加或預防由疾病病痛所致之損傷或失能。在癌症之情況下，治療有效劑量較佳防止與癌症相關之物理症狀進一步惡化。癌症之症狀為此項技術中熟知的且包括例如異常痣特徵；痣外觀改變，包括不對稱性、邊界、顏色及/或直徑；新的有色皮膚區域；異常痣；指甲下區域變暗；乳房結塊；乳頭改變；乳房囊腫；乳房疼痛；死亡；體重減輕；無力；過度疲勞；難以進食；食慾不振；長期咳嗽；呼吸困難加重；咳血、尿血、便血、噁心、嘔吐、肝轉移、肺轉移、骨骼轉移、腹滿、腹脹、腹膜腔積液、陰道出血、便秘、腹部膨脹、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗、發熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、眩暈、發冷、肌肉痙攣、結腸轉移、肺轉移、膀胱轉移、肝轉移、骨骼轉移、腎轉移及胰臟轉移、吞咽困難及其類似症狀。可在第一次投與本發明之激動性抗huCD40 mAb之後立即觀察到治療功效，或其可僅僅在一段時間及/或一系列劑量之後觀察到。此類延遲之功效可僅在若干月治療、長達6、9或12個月之後觀察到。根據一些免疫腫瘤學藥劑所展現的延遲之功效，過早決定本發明之激動性抗huCD40 mAb缺乏治療功效不具決定性。
治療有效劑量可防止或延遲癌症發作，諸如當存在早期或初始疾病病徵時可為所希望的。癌症診斷中所利用之實驗室測試包括化學測試(包括可溶性CD40或CD40L含量之量測)(Hock等人(2006)Cancer 106：2148；Chung及Lim(2014)J.Trans.Med.12：102)、血液學測試、血清學測試及放射學測試。因此，監測前述任一者之任何臨床或生物化學分析均可用於確定特定治療是否為治療癌症之治療有效劑量。一般熟習此項技術者將能夠基於諸如個體之體格、個體之症狀之嚴重程度及所選特定組合物或投與途徑之因素來確定該等量。
本文所描述之組合物可經由一或多種投藥途徑，使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投與。熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或投與模式將取決於所需結果而變化。本文所述之抗體的較佳投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所使用，片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與以外的通常藉由注射進行之投與模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
或者，本文所述之抗體可經由不為非經腸之途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部投與。
活性化合物可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，該等載劑諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法已獲得專利或一般為熟習此項技術者已知。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治療性組合物可用此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一個較佳實施例中，本文所述之治療性組合物可用無針皮下注射裝置投與，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。與本文所述之抗huCD40抗體一起使用的熟知植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示以控制速率施配藥物之植入式微量輸注泵；美國專利第4,486,194號，其 揭示經由皮膚投與藥劑之治療裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流量植入式輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔室隔室之滲透性藥物遞送系統；以及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透性藥物遞送系統。此等專利以引用的方式併入本文中。許多其他此類植入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者已知的。
在某些實施例中，本文所述之抗huCD40抗體可經調配以確保在活體內適當分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除多種高親水性化合物。為確保本文所述之治療化合物跨過BBB(必要時)，其可例如在脂質體中調配。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號；第5,374,548號；及第5,399,331號。脂質體可包含選擇性輸送至特定細胞或器官中，由此增強靶向藥物遞送之一或多個部分(參見例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如，Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；界面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
X. 用途及方法
本文所描述之抗體、抗體組合物及方法具有眾多活體外及活體內效用，包含例如藉由激動CD40信號傳導來增強免疫反應。在一個較佳實施例中，本文所述之抗體為人類抗體或人類化抗體。舉例而 言，本文所描述之抗huCD40抗體可在活體外或離體投與培養之細胞，或例如在活體內投與人類個體，以在多種疾病中增強免疫。因此，本文提供改善個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與本文所述之抗體或其抗原結合片段，使得增強、刺激或上調個體之免疫反應。
較佳個體包括將需要增強免疫反應之人類患者。該等方法特別適合於治療患有可藉由加強免疫反應(例如T細胞介導之免疫反應)治療之病症的人類患者。在一個特定實施例中，該等方法特別適合於在活體內治療癌症。為實現免疫之抗原特異性增強，本文所描述之抗huCD40抗體可與所關注抗原一起投與，或抗原可能已經存在於待治療之個體(例如，帶有腫瘤或帶有病毒之個體)中。當針對CD40之抗體與另一藥劑一起投與時，該兩者可分開或同時投與。
亦涵蓋用於偵測樣品中人類CD40抗原之存在，或量測人類CD40抗原之量的方法，其包含使樣品及對照樣品與特異性結合至人類CD40之人類單株抗體或其抗原結合片段於允許在抗體或其片段與人類CD40之間形成複合物之條件下接觸。接著偵測複合物之形成，其中樣品與對照樣品之間複合物形成之差異指示樣品中存在人類CD40抗原。此外，可使用本文所述之抗CD40抗體，經由免疫親和力純化來純化人類CD40。
鑒於本文所述之抗huCD40抗體能夠增強T細胞反應，例如抗原特異性T細胞反應之共刺激作用，本文提供使用本文所述之抗體刺激、增強或上調抗原特異性T細胞反應，例如抗腫瘤T細胞反應之活體外及活體內方法。
可使用抗CD40抗體增強CD4+及CD8+T細胞反應。T細胞可為Teff細胞，例如CD4+Teff細胞、CD8+Teff細胞；T輔助(Th)細胞；及T細胞毒性(Tc)細胞。
進一步涵蓋增強個體之免疫反應(例如抗原特異性T細胞反應)之方法，其包含向該個體投與本文所述之抗huCD40抗體以使個體之免疫反應(例如抗原特異性T細胞反應)增強。在一個較佳實施例中，個體為帶有腫瘤之個體且針對腫瘤之免疫反應得到增強。腫瘤可為實體腫瘤或液體腫瘤，例如血液惡性病。在某些實施例中，腫瘤為免疫原性腫瘤。在某些實施例中，細胞為非免疫原性的。在某些實施例中，腫瘤為PD-L1陽性。在某些實施例中，腫瘤為PD-L1陰性。個體亦可為帶有病毒之個體且針對病毒之免疫反應得到增強。
進一步提供抑制個體中腫瘤細胞之生長的方法，其包含向該個體投與本文所述之抗huCD40抗體，使得個體中之腫瘤生長得到抑制。亦提供治療個體之慢性病毒感染之方法，其包含向該個體投與本文所述之抗huCD40抗體，使得個體之慢性病毒感染得到治療。
在某些實施例中，抗huCD40抗體係作為輔助療法給予個體。相對於當前標準護理，用抗huCD40抗體治療患有癌症之個體可產生長期的持續反應；至少1、2、3、4、5、10或更多年之長期存活；至少1、2、3、4、5或10或更多年之無復發存活。在某些實施例中，用抗huCD40抗體治療患有癌症之個體防止癌症之復發或使癌症復發延遲例如1、2、3、4、5或10年或更多年。抗CD40治療可用作一線或二線治療。
以下進一步詳細論述此等及本文所述之其他方法。
癌症
本文提供用於治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與本文所述之抗huCD40抗體，使得個體經治療，例如使得癌性腫瘤之生長得到抑制或減少及/或使腫瘤消退。可單獨使用抗huCD40抗體抑制癌性腫瘤生長。或者，抗huCD40抗體可結合另一藥劑，例如，如下所述之其他免疫原性藥劑、標準癌症治療或其他抗體使用。亦提 供與PD-1抑制劑，諸如抗PD-1或抗PD-L1抗體之組合。參見例如，Ellmark等人(2015)OncoImmunology 4：7 e1011484。
因此，本文中提供例如藉由抑制腫瘤細胞生長來治療個體之癌症的方法，其包含向該個體投與治療有效量的本文所描述之抗huCD40抗體，例如12D6、5F11、8E8、5G7或19G3之人類化形式，或其抗原結合片段。該抗體可為人類化抗huCD40抗體(諸如本文所描述之人類化抗huCD40抗體中之任一種)、人類嵌合抗huCD40抗體，或人類化之非人類抗huCD40抗體，例如與本文具體描述之抗huCD40抗體中之至少一種競爭結合，或結合至與本文具體描述之抗huCD40抗體中之至少一種相同之抗原決定基的人類、嵌合或人類化抗huCD40抗體。
生長可使用本發明抗體抑制之癌症包括通常對免疫療法起反應之癌症。待治療之癌症之非限制性實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌症、腎癌(例如，透明細胞癌瘤)、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎臟癌症(例如，腎細胞癌RCC))、前列腺癌(例如，激素難治性前列腺腺癌)、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(多形性膠質母細胞瘤)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌瘤及頭頸癌(或癌瘤)、胃癌、生殖細胞腫瘤、兒科肉瘤、鼻腔鼻竇自然殺傷(sinonasal natural killer)、黑素瘤(例如轉移性惡性黑色素瘤，諸如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌症、肛門區癌、睪丸癌、輸卵管癌瘤、子宮內膜癌瘤、子宮頸癌瘤、陰道癌瘤、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體腫瘤、輸尿管癌、腎盂癌瘤、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體 腺瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌症、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括由石棉誘發之癌症)、病毒相關癌症(例如，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)相關腫瘤)，及來源於兩個主要血球譜系之血液科惡性疾病，亦即，髓系細胞株(其產生粒細胞、紅血球、凝血細胞、巨噬細胞及肥大細胞)或淋巴系細胞株(其產生B細胞、T細胞、NK細胞及漿細胞)，諸如所有類型之白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴細胞性及/或骨髓性白血病，諸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(M0)、骨髓母細胞白血病(M1)、骨髓母細胞白血病(M2；伴隨細胞成熟)、前髓細胞性白血病(M3或M3變體[M3V])、骨髓單核細胞性白血病(M4或伴隨嗜酸性球增多之M4變體[M4E])、單核細胞性白血病(M5)、紅白血病(M6)、巨核母細胞白血病(M7)、孤立性顆粒球性肉瘤及綠色瘤；淋巴瘤，諸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、單核細胞樣B細胞淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、多形性(例如，Ki 1+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、腸T細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、前驅體T淋巴母細胞性淋巴瘤、T淋巴母細胞性淋巴瘤；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、周圍T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、移植後淋巴增生病症、真性組織細胞性淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴譜系之造血系統腫瘤、急性淋巴母細胞性白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、彌漫性組織細胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞 淋巴瘤(CTLC)(亦稱為蕈樣真菌病或塞紮萊症候群(Sezary syndrome)及淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)伴發瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；骨髓瘤，諸如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、冒煙型骨髓瘤(亦稱為惰性骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤及多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛狀細胞淋巴瘤；骨髓譜系之造血系統腫瘤、間充質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；精原細胞瘤、畸胎癌、中樞神經及周圍神經之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經鞘瘤；間充質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌症及畸胎瘤；淋巴譜系之造血系統腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包括(但不限於)T細胞病症，諸如T前淋巴細胞性白血病(T-PLL)，包括小細胞及腦狀細胞型T-PLL；大顆粒淋巴細胞白血病(LGL)，較佳為T細胞類型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；周圍/胸腺後T細胞淋巴瘤(多形性及免疫母細胞性亞型)；血管中心性(鼻)T細胞淋巴瘤；頭部或頸部之癌症、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌；急性骨髓性淋巴瘤，以及該等癌症之任何組合。本文所描述之方法亦可用於治療轉移性癌症、難治性癌症(例如先前免疫療法，例如用阻斷性CTLA-4或PD-1抗體難治之癌症)及復發性癌症。
不管上述如何，本發明之激動劑抗huCD40抗體均不可用於治療表現CD40之血液癌，其可能因CD40激動劑治療而惡化。已知某些癌症可表現CD40且因此經歷此類惡化，且因此可能不包括該等類別。在其他實施例中，測試特定腫瘤樣品中CD40之表現且基於測試結果將其排除在用本發明之激動劑抗huCD40抗體療法之外。
抗huCD40抗體可作為單藥療法投與，或作為唯一免疫刺激療法投與，或其可在癌症疫苗策略中與免疫原性劑組合，該免疫原性劑諸如癌細胞、純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、 細胞及經編碼免疫刺激細胞因子之基因轉染之細胞(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞因子GM-CSF之腫瘤細胞。已設計出針對腫瘤之許多實驗性疫苗接種策略(參見Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring：730-738；亦參見Restifo,N.及Sznol,M.,Cancer Vaccines，第61章，第3023-3043頁，DeVita等人(編)，1997,Cancer：Principles and Practice of Oncology，第五版)。在此等策略之一中，使用自體或同種異體腫瘤細胞製備疫苗。經顯示，此等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。經顯示，GM-CSF係抗原呈遞用於腫瘤疫苗接種之強效活化因子。Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：3539-43。
關於各種腫瘤中之基因表現及大規模基因表現模式之研究已提出所謂腫瘤特異性抗原之定義。Rosenberg,S A(1999)Immunity 10：281-7。在許多情況下，此等腫瘤特異性抗原為在腫瘤中及出現腫瘤之細胞中表現的分化抗原，例如黑素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，經顯示，許多此等抗原可為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞的標靶。CD40激動劑可與腫瘤中表現之重組蛋白及/或肽之集合結合使用以產生針對此等蛋白質之免疫反應。此等蛋白質通常被免疫系統視為自體抗原且因此對其具耐受性。腫瘤抗原可包括蛋白質端粒酶，其為合成染色體端粒所需且在超過85%之人類癌症中及僅僅有限數目之身體組織中表現(Kim等人(1994)Science 266：2011-2013)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白質序列或在兩個不相關序列之 間產生融合蛋白(亦即，費城染色體(Philadelphia chromosome)中之bcr-abl)之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新抗原」，或為來自B細胞腫瘤之個體基因型。
其他腫瘤疫苗可包括來自人類癌症中所涉及之病毒的蛋白質，該等病毒諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡堡氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可與CD40抑制結合使用之腫瘤特異性抗原的另一形式為自腫瘤組織自身分離之經純化熱休克蛋白質(HSP)。此等熱休克蛋白質含有來自腫瘤細胞之蛋白質之片段且此等HSP高效地遞送至抗原呈遞細胞以引起腫瘤免疫性(Suot & Srivastava(1995)Science 269：1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278：117-120)。
樹突狀細胞(DC)為可用於引發抗原特異性反應之強效抗原呈遞細胞。DC可離體產生且載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle等人(1998)Nature Medicine 4：328-332)。DC亦可藉由遺傳方式轉導以表現此等腫瘤抗原。DC亦已與腫瘤細胞直接融合用於免疫目的(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作為一種疫苗接種方法，DC免疫可與CD40激動作用有效組合以活化(釋放)更強效之抗腫瘤反應。
CD40之激動作用亦可與標準癌症治療(例如手術、放射及化學療法)組合。CD40之激動作用可與化學治療方案有效地組合。在此等情形下，可減少所投與之化學治療劑的劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。此類組合之一實例為抗huCD40抗體與達卡巴嗪(decarbazine)組合用於治療黑素瘤。此類組合之另一實例為抗huCD40抗體與介白素-2(IL-2)組合用於治療黑素瘤。CD40激動劑與化學療法組合使用隱含之科學基本原理在於，作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應使得抗原呈遞路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與CD40激動作用協同作用的其他組合 療法為放射、手術及激素去除。此等方案各自在宿主中產生腫瘤抗原源。血管生成抑制劑亦可與CD40激動劑組合。抑制血管生成引起腫瘤細胞死亡，從而可將腫瘤抗原饋送至宿主抗原呈遞路徑中。
本文所述之抗huCD40抗體亦可與使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體組合使用(參見例如，美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩個獨立抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性抗體已用於使巨噬細胞靶向腫瘤部位。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。此等反應之T細胞臂藉由CD40之激動作用來強化。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突狀細胞特異性細胞表面標記物之雙特異性抗體將抗原直接遞送至DC。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監視。許多此等機制可藉由腫瘤表現之免疫抑制蛋白質的失活來解決。此等特別包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配位體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。針對此等實體中之每一者的抗體可與抗huCD40抗體組合使用，以抵消免疫抑制劑之作用且促進宿主之腫瘤免疫反應。
抗CD40抗體能夠有效地取代T細胞輔助活性。Ridge等人(1998)Nature 393：474-478。針對T細胞共刺激分子，諸如CTLA-4(例如，美國專利第5,811,097號)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol.164：2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397：262-266)之活化抗體亦可使T細胞活化程度增加。PD1或PD-L1之抑制劑亦可與抗huCD40抗體組合使用。
亦存在若干實驗性治療方案，其涉及抗原特異性T細胞之離體活 化及擴增及將此等細胞授受性轉移至接受者中以刺激針對腫瘤之抗原特異性T細胞(Greenberg及Riddell(1999)Science 285：546-51)。此等方法亦可用於活化針對諸如CMV之感染物的T細胞反應。在抗CD40抗體存在下之離體活化可增加授受性轉移之T細胞之頻率及活性。
慢性病毒感染
在另一態樣中，本文所述之本發明提供一種治療個體之感染性疾病的方法，其包含向該個體投與抗huCD40抗體或其抗原結合片段，以治療個體之感染性疾病。
類似於如上文所論述的其在腫瘤方面之應用，抗體介導之CD40激動作用可單獨使用，或作為佐劑與疫苗組合使用，以增強針對病原體、毒素及自體抗原之免疫反應。此治療方法特別適用之病原體之實例包括當前無有效疫苗之病原體，或習知疫苗不完全有效之病原體。此等病原體包括(但不限於)HIV、肝炎(A、B及C)、流感、疱疹、梨形鞭毛蟲屬(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲屬(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。CD40激動作用特別適用於針對由在感染過程中存在抗原改變之因素，諸如HIV引起之感染。此等新穎抗原決定基在抗人類CD40抗體投與時識別為外來物，因此引起較強T細胞反應。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的致病性病毒之一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒(flavivirus)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳突狀瘤病毒、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的致病性細菌之一些實例包括衣原體(chlamydia)、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌屬(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌屬(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病細菌(Lymes disease bacteria)。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的致病性真菌之一些實例包括念珠菌屬(白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(煙麯黴(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴屬(Mucorales)(毛黴菌(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴菌屬(rhizophus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可藉由本文所述之方法治療之感染的致病性寄生蟲之一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba sp.)、蘭伯氏梨形鞭毛蟲屬(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondi)、巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，CD40激動作用均可與其他形式免疫療法，諸如細胞激素治療(例如，干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法組合，由此增進腫瘤抗原之呈遞。參見例如，Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123。
疫苗佐劑
可使用本文所述之抗huCD40抗體，藉由將抗huCD40抗體與所關注抗原(例如疫苗)共投與來增強抗原特異性免疫反應。因此，本文提供增強個體針對抗原之免疫反應的方法，其包含向該個體投與：(i)抗原；及(ii)抗huCD40抗體或其抗原結合片段，以使個體針對抗原之免疫反應得到增強。抗原可為例如腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。此類抗原之非限制性實例包括以上部分中所論述之抗原，諸如上文所論述之腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)，或來自上文所述之病毒、細菌或其他病原體的抗原。
活體內及活體外投與本文所述之抗體組合物(例如人類單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫偶聯物)的適合途徑為此項技術中所熟知，且可由一般技術者選擇。舉例而言，抗體組合物可藉由注射(例如靜脈內或皮下)投與。所用分子之適合劑量將取決於個體之年齡及體重以及抗體組合物之濃度及/或調配物。
如先前所描述，本文所述之抗huCD40抗體可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射性毒性劑或免疫抑制劑)一起共投與。抗體可連接至藥劑(呈免疫複合物形式)或可與藥劑分開投與。在後一情形(分開投與)中，抗體可在該藥劑之前、之後或同時投與，或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如放射)共投與。此類治療劑尤其包括抗贅生性劑，諸如小紅莓(doxorubicin)(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑(cisplatin)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀 (carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、達卡巴嗪及環磷醯胺、羥基脲，其本身僅在對患者具有毒性或亞毒性之含量下有效。順鉑每四週一次以100mg/kg劑量靜脈內投與，且阿德力黴素每21天一次以60-75mg/ml劑量靜脈內投與。本文所描述之抗CD40抗體或其抗原結合片段與化學治療劑之共投與提供經由不同機制操作以產生針對人類腫瘤細胞之細胞毒性作用的兩種抗癌劑。此類共投與可解決因產生耐藥性或腫瘤細胞抗原性改變使其不與肽起反應而引起的問題。
包含本文所述之抗體組合物(例如人類抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫偶聯物)及使用說明書的套組亦在本文所述之範疇內。該套組可進一步含有至少一種另外的試劑，或一或多種另外的本文所描述之人類抗體(例如，具有結合至CD40抗原中不同於第一人類抗體之抗原決定基之互補活性的人類抗體)。套組通常包括指示套組內含物之預定用途的標籤。術語標籤包括供應於套組上或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組供應之任何書面或記錄材料。
組合療法
除以上提供之組合療法之外，本文所述之抗CD40抗體亦可用於組合療法中，例如用於治療癌症，如下所述。
本發明提供組合療法之方法，其中將抗huCD40抗體與一或多種另外的藥劑，例如抗體共投與，該等藥劑有效刺激免疫反應，由此進一步增強、刺激或上調個體之免疫反應。
一般而言，本文所描述之抗huCD40抗體可與以下組合：(i)另一共刺激受體之激動劑及/或(ii)T細胞上抑制信號之拮抗劑，其中任一者擴大抗原特異性T細胞反應(免疫核查點調控因子)。大部分共刺激分子及共抑制分子為免疫球蛋白超家族(IgSF)之成員，且本文所述之抗CD40抗體可與靶向IgSF家族一員之藥劑一起投與以增加免疫反應。結合至共刺激或共抑制受體之膜結合配位體的一個重要家族為 B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6。結合至共刺激或共抑制受體之膜結合配位體的另一家族為結合至同源TNF受體家庭成員之TNF家族分子，其包括CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(參見例如，Tansey(2009)Drug Discovery Today 00：1)。
在另一態樣中，抗huCD40抗體可與抑制T細胞活化之細胞因子(例如，IL-6、IL-10、TGF-ß、VEGF；或其他「免疫抑制細胞因子」之拮抗劑或刺激T細胞活化之細胞因子組合使用以刺激免疫反應，例如用於治療增生性疾病，諸如癌症。
在一個態樣中，T細胞反應可藉由本發明之抗huCD40 mAb與以下一或多者之組合來刺激：(i)抑制T細胞活化之蛋白質之拮抗劑(例如免疫檢查點抑制劑)，諸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1及TIM-4；及(ii)刺激T細胞活化之蛋白質之激動劑，諸如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3及CD28H。
調節上述蛋白質之一且可與激動劑抗huCD40抗體，例如本文所 描述者組合用於治療癌症之示例性藥劑包括：YERVOY®/伊派利單抗(ipilimumab)或曲美單抗(tremelimumab)(針對CTLA-4)、加利昔單抗(galiximab)(針對B7.1)、BMS-936558(針對PD-1)、皮立珠單抗(pidilizumab)/CT-011(針對PD-1)、KEYTRUDA®/派立珠單抗(pembrolizumab)/MK-3475(針對PD-1)、AMP224(針對B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(針對B7-H1)、MPDL3280A(針對B7-H1)、MEDI-570(針對ICOS)、AMG557(針對B7H2)、MGA271(針對B7H3-WO 11/109400)、IMP321(針對LAG-3)、優瑞路單抗(urelumab)/BMS-663513及PF-05082566(針對CD137/4-1BB)、瓦里木單抗(varlilumab)/CDX-1127(針對CD27)、MEDI-6383及MEDI-6469(針對OX40)、RG-7888(針對OX40L-WO 06/029879)、阿塞西普(Atacicept)(針對TACI)、莫羅莫那(muromonab)-CD3(針對CD3)、易普單抗(ipilumumab)(針對CTLA-4)。
可與激動劑抗huCD40抗體組合用於治療癌症之其他分子包括NK細胞上抑制受體之拮抗劑或NK細胞上活化受體之激動劑。舉例而言，激動劑抗huCD40抗體可與KIR拮抗劑(例如利瑞路單抗(利瑞路單抗))組合。
用於組合療法之又其他藥劑包括抑制或耗乏巨噬細胞或單核細胞之藥劑，包括(但不限於)CSF-1R拮抗劑，諸如CSF-1R拮抗劑抗體，包括RG7155(WO 11/70024、WO 11/107553、WO 11/131407、WO 13/87699、WO 13/119716、WO 13/132044)或FPA-008(WO 11/140249、WO 13/169264、WO 14/036357)。
一般而言，本文所述之激動劑抗huCD40抗體可與以下一或多者一起使用：連接陽性共刺激受體之激動劑、減弱經由抑制受體進行之信號傳導之阻斷劑，及一或多種全身性增加抗腫瘤T細胞頻率之藥劑、克服腫瘤微環境內不同免疫抑制路徑(例如阻斷抑制受體接合(例 如PD-L1/PD-1相互作用)、耗盡或抑制Treg(例如使用抗CD25單株抗體(例如達利珠單抗)或藉由離體抗CD25珠粒耗盡)、抑制代謝酶(諸如IDO)或逆轉/防止T細胞失能或耗盡)之藥劑，以及觸發腫瘤部位之固有免疫活化及/或炎症之藥劑。
本文提供用於刺激個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與CD40激動劑，例如抗體，及一或多種另外的免疫刺激抗體，諸如PD-1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、PD-L1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、CTLA-4拮抗劑(例如拮抗劑抗體)及/或LAG3拮抗劑(例如拮抗劑抗體)，以刺激個體之免疫反應，例如抑制腫瘤生長或刺激抗病毒反應。在一個實施例中，投與個體激動劑抗huCD40抗體及拮抗劑抗PD-1抗體。在一個實施例中，投與個體激動劑抗huCD40抗體及拮抗劑抗PD-L1抗體。在一個實施例中，投與個體激動劑抗huCD40抗體及拮抗劑抗CTLA-4抗體。在一個實施例中，該至少一種另外的免疫刺激抗體(例如，拮抗劑抗PD-1抗體、拮抗劑抗PD-L1抗體、拮抗劑抗CTLA-4抗體及/或拮抗劑抗LAG3抗體)為人類抗體。或者，該至少一種另外的免疫刺激抗體可為例如嵌合或人類化抗體(例如由小鼠抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體及/或抗LAG3抗體製備)。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及拮抗劑PD-1抗體。在某些實施例中，激動劑抗huCD40抗體係以亞治療劑量投與，抗PD-1抗體係以亞治療劑量投與，或二者均以亞治療劑量投與。本文亦提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及亞治療劑量之抗PD-1抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗PD-1抗體為人類序列單株抗體且激動劑抗huCD40抗體為人類化單株抗體，諸如包含本文所揭示之抗體之CDR或可變區的抗體。
適用於本文所描述之方法中的PD-1拮抗劑包括(但不限於)配位體、抗體(例如單株抗體及雙特異性抗體)及多價藥劑。在一個實施例中，PD-1拮抗劑為融合蛋白，例如Fc融合蛋白，諸如AMP-244。在一個實施例中，PD-1拮抗劑為抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
一種示例性抗PD-1抗體為OPDIVO®/納武單抗(nivolumab)(BMS-936558)或WO 2006/121168中所描述的包含抗體17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4及4A11之一之CDR或可變區的抗體。在某些實施例中，抗PD-1抗體為WO 2012/145493中描述的MK-3475(KEYTRUDA®/派立珠單抗(pembrolizumab)/先前稱拉立珠單抗(lambrolizumab))；WO 2012/145493中描述之AMP-514/MEDI-0680；以及CT-011(皮立珠單抗(pidilizumab)；先前稱CT-AcTibody或BAT；參見例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunotherapy 34：409)。其他已知之PD-1抗體及其他PD-1抑制劑包括WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號，及美國專利公開案第2009/0317368號中所述之PD-1抗體及PD-1抑制劑。亦可使用WO 2013/173223中所揭示之抗PD-1抗體中之任一者。與此等抗體之一競爭結合及/或結合至PD-1上與此等抗體之一相同之抗原決定基的抗PD-1抗體亦可用於組合治療中。
在某些實施例中，抗PD-1抗體以5×10-8M或更低之KD結合至人類PD-1，以1×10-8M或更低之KD結合至人類PD-1，以5×10-9M或更低之KD結合至人類PD-1，或以在1×10-8M與1×10-10M之間或更低之KD結合至人類PD-1。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及拮抗劑PD-L1抗體。在某些實施例中，激動劑抗huCD40抗體係以亞治療劑量投與，抗PD-L1抗體係以亞 治療劑量投與，或二者均以亞治療劑量投與。本文中提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及亞治療劑量之抗PD-L1抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗PD-L1抗體為人類序列單株抗體且激動劑抗huCD40抗體為人類化單株抗體，諸如包含本文所揭示之抗體之CDR或可變區的抗體。
在一個實施例中，抗PD-L1抗體為BMS-936559(WO 2007/005874及美國專利第7,943,743號中稱為12A4)、MSB0010718C(WO 2013/79174)，或包含PCT公開案WO 07/005874及美國專利第7,943,743號中所描述之3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4之CDR或可變區的抗體。在某一實施例中，抗PD-L1抗體為MEDI4736(亦稱為抗B7-H1)或MPDL3280A(亦稱為RG7446)。亦可使用WO 2013/173223、WO 2011/066389、WO 2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國公開案第2009/145493號中所揭示之抗PD-L1抗體中之任一者。與此等抗體中任一者競爭及/或結合至與此等抗體中之任一者相同之抗原決定基的抗PD-L1抗體亦可用於組合治療中。
在又一實施例中，本發明之激動劑抗huCD40抗體與PD-1/PD-L1信號傳導拮抗劑(諸如PD-1拮抗劑或PD-L1拮抗劑)及第三免疫治療劑組合。在一個實施例中，第三免疫治療劑為GITR拮抗劑或OX-40拮抗劑，諸如本文所揭示之抗GITR抗體或抗OX40抗體。
在另一態樣中，免疫腫瘤學藥劑為GITR激動劑，諸如激動性GITR抗體。適合之GITR抗體包括例如BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO 06/105021、WO 09/009116)及MK-4166(WO 11/028683)。
在另一態樣中，免疫腫瘤學藥劑為IDO拮抗劑。適合之IDO拮抗 劑包括例如INCB-024360(WO 2006/122150、WO 07/75598、WO 08/36653、WO 08/36642)、因多莫得(indoximod)或NLG-919(WO 09/73620、WO 09/1156652、WO 11/56652、WO 12/142237)。
本文中提供用於治療過度增生性疾病(例如，癌症)之方法，其包含向個體投與本文所描述之激動劑抗huCD40抗體及CTLA-4拮抗劑抗體。在某些實施例中，激動劑抗huCD40抗體係以亞治療劑量投與，抗CTLA-4抗體係以亞治療劑量投與，或二者均以亞治療劑量投與。本文中提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及亞治療劑量之抗CTLA-4抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體為選自由以下組成之群的抗體：YERVOY®(伊派利單抗(ipilimumab)或抗體10D1，描述於PCT公開案WO 01/14424中)、曲美單抗(tremelimumab)(先前稱為替西單抗(ticilimumab)、CP-675,206)及以下公開案中描述之抗CTLA-4抗體：WO 98/42752、WO 00/37504、美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：摘要編號2505(抗體CP-675206)；及Mokyr等人(1998)Cancer Res.58：5301-5304。亦可使用WO 2013/173223中所揭示之抗CTLA-4中之任一者。
本文提供用於治療過度增生性疾病(例如癌症)之方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及抗LAG-3抗體。在其他實施例中，激動劑抗huCD40抗體係以亞治療劑量投與，抗LAG-3抗體係以亞治療劑量投與，或二者均以亞治療劑量投與。本文中提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體及亞治療劑量之抗LAG-3抗體。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，抗LAG-3抗體為人類序列 單株抗體且激動劑抗huCD40抗體為人類化單株抗體，諸如包含本文所揭示之抗體之CDR或可變區的抗體。抗LAG3抗體之實例包括包含美國專利公開案第US 2011/0150892號及WO 2014/008218中所描述之25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5之CDR或可變區的抗體。在一個實施例中，抗LAG-3抗體為BMS-986016。可使用的其他技術認可之抗LAG-3抗體包括US 2011/007023中描述之IMP731。亦可使用IMP-321。與此等抗體中之任一者競爭及/或結合至與此等抗體中之任一者相同之抗原決定基的抗LAG-3抗體亦可用於組合治療中。
在某些實施例中，抗LAG-3抗體以5×10-8M或更低之KD結合至人類LAG-3，以1×10-8M或更低之KD結合至人類LAG-3，以5×10-9M或更低之KD結合至人類LAG-3，或以在1×10-8M與1×10-10M之間或更低之KD結合至人類LAG-3。
投與本文所描述之激動劑抗huCD40抗體及針對一或多種第二標靶抗原，諸如LAG-3及/或CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1之拮抗劑，例如拮抗劑抗體可增強針對患者體內癌細胞之免疫反應。生長可使用本發明抗體抑制之癌症包括通常對免疫療法起反應之癌症。用本發明之組合療法治療之癌症的代表性實例包括上文在論述激動劑抗huCD40抗體單藥療法中具體列出之彼等癌症。
在某些實施例中，本文中論述之治療抗體之組合可作為醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物同時投與，或作為每一抗體於醫藥學上可接受之載劑中之分開組合物同時投與。在另一個實施例中，治療抗體之組合可依序投與。舉例而言，抗CTLA-4抗體及激動劑抗huCD40抗體可依序投與，諸如先投與抗CTLA-4抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體，或先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗CTLA-4抗體。或者或另外，抗PD-1抗體及激動劑抗huCD40抗體可依序投與，諸如先投與抗PD-1抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體， 或先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗PD-1抗體。或者或另外，抗PD-L1抗體及激動劑抗huCD40抗體可依序投與，諸如先投與抗PD-L1抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體，或先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗PD-L1抗體。或者或另外，抗LAG-3抗體及激動劑抗huCD40抗體可依序投與，諸如先投與抗LAG-3抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體，或先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗LAG-3抗體。
此外，若依序投與超過一次劑量之組合療法，則依序投與之次序在每個投與時間點可顛倒或保持相同次序，依序投與可與同時投與或其任何組合進行組合。舉例而言，抗CTLA-4抗體與激動劑抗huCD40抗體之組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為先投與抗CTLA-4抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體之依序投與，且第三次投與可為先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗CTLA-4抗體之依序投與等。或者或另外，抗PD-1抗體與激動劑抗huCD40抗體之組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為先投與抗PD-1抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體之依序投與，且第三次投與可為先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗PD-1抗體之依序投與等。或者或另外，抗PD-L1抗體與激動劑抗huCD40抗體之組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為先投與抗PD-I1抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體之依序投與，且第三次投與可為先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗PD-L1抗體之依序投與等。或者或另外，抗LAG-3抗體與激動劑抗huCD40抗體之組合之第一次投與可為同時投與，第二次投與可為先投與抗LAG-3抗體且其次投與激動劑抗huCD40抗體之依序投與，且第三次投與可為先投與激動劑抗huCD40抗體且其次投與抗LAG-3抗體之依序投與等。另一代表性給藥方案可涉及先投與激動劑抗huCD40且其次投與抗CTLA-4抗體(及/或抗PD-1 抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)之依序投與之第一次投與，且後續投藥可同時進行。
視情況，作為唯一免疫治療劑之激動劑抗huCD40，或激動劑抗huCD40抗體與一或多種另外的免疫治療抗體(例如，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3阻斷劑)之組合可進一步與免疫原性劑，諸如癌細胞、純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及用編碼免疫細胞因子之基因轉染的細胞組合(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗的非限制性實例包括黑素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞因子GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。CD40激動劑及一或多種另外的抗體(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷劑)亦可進一步與標準癌症治療組合。舉例而言，CD40激動劑及一或多種另外的抗體(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷劑)可有效地與化學治療方案組合。在此等情況下，可減少與本發明之組合一起投與之其他化學治療試劑的劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。此類組合之一實例為CD40激動劑抗體與或不與其他抗體(諸如抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)之組合進一步與達卡巴嗪組合用於治療黑素瘤。另一實例為激動劑抗huCD40抗體與或不與抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3抗體之組合進一步與介白素-2(IL-2)組合用於治療黑素瘤。CD40激動作用及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷與化學療法組合使用暗含的科學基本原理在於，作為大部分化學治療化合物之細胞毒性作用結果的細胞死亡應引起抗原呈遞路徑中腫瘤抗原之含量增加。可經由細胞死亡而與存在或不存在CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷的組合之CD40激動作用產生協同作用的其他 組合療法為放射、手術及激素去除。此等方案各自在宿主中產生腫瘤抗原源。血管生成抑制劑亦可與組合之CD40激動作用及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷組合。抑制血管生成導致腫瘤細胞死亡，其可為饋送至宿主抗原呈遞路徑中之腫瘤抗原之來源。
作為唯一免疫治療劑之激動劑抗huCD40抗體，或CD40激動劑與CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷抗體之組合亦可與使表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞的雙特異性抗體組合使用。參見例如，美國專利第5,922,845號及第5,837,243號。雙特異性抗體可用於靶向兩個獨立抗原。此等反應之T細胞臂將藉由使用組合之CD40激動作用及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷而強化。
在另一實例中，作為唯一免疫治療劑之激動性抗CD40抗體，或抗CD40抗體與另外的免疫刺激劑(例如抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3劑，例如抗體)之組合可結合抗贅生性抗體，諸如RITUXAN®(利妥昔單抗(rituximab))、HERCEPTIN®(曲妥珠單抗(trastuzumab))、BEXXAR®(托西莫單抗(tositumomab))、ZEVALIN®(布突默單抗(ibritumomab))、CAMPATH®(阿侖單抗(alemtuzumab))、LYMPHOCIDE®(依帕珠單抗(eprtuzumab))、AVASTIN®(貝伐單抗(bevacizumab))及TARCEVA®(埃羅替尼(erlotinib))及其類似物。舉例而言且不希望受理論束縛，用抗癌抗體或抗癌抗體與毒素之偶聯物治療可導致癌細胞(例如，腫瘤細胞)死亡，此將增強由免疫刺激劑，例如CD40、TIGIT、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3試劑，例如抗體介導之免疫反應。在一示例性實施例中，過度增生性疾病(例如癌症腫瘤)之治療可包括同時或依序或其任何組合使用的抗癌劑(例如抗體)與激動劑抗huCD40抗體及視情況使用之另外的免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或 抗LAG-3劑，例如抗體)之組合，其可增強宿主之抗腫瘤免疫反應。
本文提供用於改變與用免疫刺激劑治療過度增生性疾病(例如癌症)相關之不良事件的方法，其包含向個體投與激動劑抗huCD40抗體且投與或不投與及亞治療劑量之抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3劑，例如抗體。舉例而言，本文所描述之方法提供一種降低免疫刺激治療性抗體誘發之結腸炎或腹瀉之發病率的方法，其藉由向患者投與不可吸收性類固醇實現。如本文所使用，「不可吸收性類固醇」為展現充分之首次代謝，使得在肝臟中代謝後，類固醇之生物利用率低，亦即，小於約20%的糖皮質激素。在本文所述之一個實施例中，不可吸收性類固醇為布地奈德(budesonide)。布地奈德為局部起效之糖皮類固醇，其在經口投與後主要由肝臟充分代謝。ENTOCORT EC®(Astra-Zeneca)為開發用於使藥物遞送至迴腸及整個結腸最佳化的布地奈德之pH及時間依賴性經口調配物。ENTOCORT EC®在美國被批准用於治療涉及迴腸及/或升結腸之輕度至中度克羅恩氏病(Crohn's disease)。用於治療克羅恩氏病之ENTOCORT EC®的常用口服劑量為6至9毫克/天。ENTOCORT EC®在腸中釋放，隨後經吸收且保留在腸道黏膜中。一旦其穿過腸道黏膜標靶組織，ENTOCORT® EC即在肝臟中藉由細胞色素P450系統充分代謝成具有可忽略之糖皮質激素活性的代謝物。因此，生物利用率低(約10%)。布地奈德之低生物利用率使得治療比相較於首次代謝不太充分之其他糖皮質激素有所改善。與全身起效之皮質類固醇相比，布地奈德產生較少不良作用，包括較低的下丘腦-垂體抑制作用。然而，長期投與ENTOCORT EC®可導致全身性糖皮質激素作用，諸如腎上腺皮質機能亢進及腎上腺抑制。參見PDR，第58版，2004；608-610。
在又其他實施例中，在存在或不存在CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷(亦即，針對CD40之免疫刺激治療抗體及視情況使 用之抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)下CD40激動劑與不可吸收性類固醇之組合可進一步與水楊酸鹽組合。水楊酸鹽包括5-ASA藥劑，諸如：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(AZULFIDINE®，Pharmacia & UpJohn)；奧沙拉嗪(olsalazine)(DIPENTUM®，Pharmacia & UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(COLAZAL®，Salix Pharmaceuticals,Inc.)；及美沙拉嗪(mesalamine)(ASACOL®，Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA®，Shire US；CANASA®，Axcan Scandipharm,Inc.；ROWASA®，Solvay)。
根據本文所描述之方法，在存在或不存在抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3抗體下與激動劑抗huCD40抗體及不可吸收性類固醇組合投與之水楊酸鹽可包括水楊酸鹽與不可吸收性類固醇之任何重疊或依序投與，以達到降低免疫刺激抗體誘發之結腸炎之發病率的目的。因此，舉例而言，用於降低本文所述之免疫刺激抗體誘發之結腸炎之發病率的方法涵蓋水楊酸鹽及不可吸收性類固醇之同時或依序投與(例如水楊酸鹽在不可吸收性類固醇之後6小時投與)，或其任何組合。另外，水楊酸鹽及不可吸收性類固醇可藉由相同途徑投與(例如兩者均經口投與)或藉由不同途徑投與(例如水楊酸鹽係經口投與且不可吸收性類固醇係經直腸投與)，其可不同於用於投與抗huCD40抗體及抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體之途徑。
本文所述之激動劑抗huCD40抗體及組合抗體療法亦可與其他熟知的針對所治療之適應症(例如癌症)具有特定適用性而選擇的療法組合使用。本文所述之激動劑抗huCD40抗體之組合可與已知之醫藥學上可接受之藥劑依序使用。
舉例而言，本文所述之激動劑抗huCD40抗體及組合抗體療法可 與諸如以下之另外的治療組合使用(例如同時或分開)：放射、化學療法(例如使用喜樹鹼(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、順鉑(cisplatin)、小紅莓、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、太平洋紫杉醇、卡鉑(carboplatin)-太平洋紫杉醇(紫杉醇(Taxol))、小紅莓、5-fu或喜樹鹼+apo21/TRAIL(6X combo))、一或多種蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib)或MG132)、一或多種Bcl-2抑制劑(例如BH3I-2'(bcl-xl抑制劑)、吲哚胺雙加氧酶-1(IDO1)抑制劑(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉籽醇衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奧巴拉西(obatoclax))或MCL-1(骨髓性白血病細胞分化蛋白質-1)拮抗劑)、iAP(細胞凋亡蛋白質之抑制劑)拮抗劑(例如smac7、smac4、小分子smac模擬劑、合成smac肽(參見Fulda等人，Nat Med 2002；8：808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(組蛋白脫乙醯基酶)抑制劑、抗CD20抗體(例如利妥昔單抗)、血管生成抑制劑(例如貝伐單抗)、靶向VEGF及VEGFR之抗血管生成劑(例如AVASTIN®)、合成三萜化合物(參見Hyer等人，Cancer Research 2005；65：4799-808)、c-FLIP(細胞FLICE抑制蛋白質)調節劑(例如PPARγ(過氧化物酶體增殖物活化受體γ)之天然及合成配位體、5809354或5569100)、激酶抑制劑(例如索拉非尼(Sorafenib))、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、坦羅莫司(Temsirolimus)、mTOR抑制劑(諸如雷帕黴素(rapamycin)及坦羅莫司)、硼替佐米、JAK2抑制劑、HSP90抑制劑、PI3K-AKT抑制劑、來那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制劑、IAP抑制劑及/或遺傳毒性藥物。
本文所述之激動劑抗huCD40抗體及組合抗體療法可進一步與一或多種抗增殖性細胞毒性劑組合使用。可用作抗增殖性細胞毒性劑之化合物類別包括(但不限於)以下：
烷基化劑(包括(但不限於)氮芥(nitrogen mustards)、伸乙基亞胺衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲(nitrosourea)及三氮烯(triazene))：尿嘧啶氮芥(Uracil mustard)、氮芥(Chlormethine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)(CYTOXANTM)、異環磷醯胺(fosfamide)、美法侖(Melphalan)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、三伸乙基三聚氰胺(Triethylenemelamine)、三伸乙基硫代磷胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲菌素(Streptozocin)、達卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代謝物(包括(但不限於)葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑)：甲胺喋呤(Methotrexate)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巰基嘌呤(6-Mercaptopurine)、6-硫代鳥嘌呤(6-Thioguanine)、磷酸氟達拉賓(Fludarabine phosphate)、噴司他丁(Pentostatine)及吉西他濱。
與激動劑抗huCD40抗體組合之適合抗增殖劑包括(但不限於)：紫杉烷(taxane)、太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇可以TAXOLTM購得)、多烯紫杉醇(docetaxel)、迪斯德莫來(discodermolide，DDM)、迪克斯汀(dictyostatin，DCT)、派洛西德A(Peloruside A)、埃坡黴素(epothilone)、埃坡黴素A、埃坡黴素B、埃坡黴素C、埃坡黴素D、埃坡黴素E、埃坡黴素F、呋喃并埃坡黴素D(furanoepothilone D)、去氧埃坡黴素B1、[17]-去氫去氧埃坡黴素B、[18]去氫去氧埃坡黴素B、C12,13-環丙基-埃坡黴素A、C6-C8橋接埃坡黴素A、反-9,10-去氫埃坡黴素D、順-9,10-去氫埃坡黴素D、16-去甲基埃坡黴素B、埃坡黴素B10、迪斯德莫來(discoderomolide)、帕土匹龍(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(迪斯德莫來)、TZT-1027(索利多汀(soblidotin))、ILX-651(鹽酸塔斯汀 (tasidotin hydrochloride))、軟海綿素B、甲磺酸艾日布林(Eribulin mesylate)(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、斯普新(Cyrptophycin)、LY-355703、類美登素免疫偶聯物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊品斯波(ispinesib))、SB-743921、MK-0731、STA-5312、艾榴塞洛素(eleutherobin)、17β-乙醯氧基-2-乙氧基-6-側氧基-B-高-雌甾-1,3,5(10)-三烯-3-醇、環鏈黴菌素(cyclostreptin)、異勞馬立德(isolaulimalide)、勞馬立德、4-表-7-去羥基-14,16-二去甲基-(+)-迪斯德莫來及塞托斯隆1(cryptothilone 1)，以及此項技術中已知之其他微管穩定劑。
在需要與用本文所述之激動劑抗huCD40抗體組合治療或在用本文所述之激動劑抗huCD40抗體治療前使異常增殖細胞休眠的情況下，亦可投與患者激素及類固醇(包括合成類似物)，諸如17a-炔雌醇、二乙基己烯雌酚、睪固酮、潑尼松(Prednisone)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睾內酯、乙酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲基潑尼龍(Methylprednisolone)、甲基睪固酮(Methyl-testosterone)、潑尼龍(Prednisolone)、曲安西龍(Triamcinolone)、氯三芳乙烯(Chlorotrianisene)、羥基孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺魯米特(Aminoglutethimide)、雌莫司汀(Estramustine)、乙酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、亮丙立德(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、ZOLADEXTM。當採用本文所述之方法或組合物時，必要時，亦可投與用於在臨床環境中調節腫瘤生長或轉移之其他藥劑，諸如止吐劑。
安全且有效投與化學治療劑之方法為熟習此項技術者所知。此外，其投與描述於標準文獻中。舉例而言，許多化學治療劑之投與描 述於Physicians' Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Company,Montvale,N.J.07645-1742,(USA)中；其揭示內容以引用的方式併入本文中。
化學治療劑及/或放射療法可根據此項技術中熟知之治療方案投與。熟習此項技術者將顯而易見，化學治療劑及/或放射療法之投與可取決於所治療之疾病及化學治療劑及/或放射療法對該疾病之已知作用而變化。此外，根據熟練臨床醫師之知識，治療方案(例如劑量及投與時間)可依據觀察到的所投治療劑對患者之影響且依據觀察到的疾病對所投治療劑之反應而變化。
XI. 本發明之特異性激動劑抗CD40抗體之表徵
本發明之激動劑抗CD40抗體係如實例1中所描述獲得。本發明之示例性抗體之可變結構域及CDR序列區提供於序列表中，且概述於表2中。對於來源於相同原始純系之所有抗體，可變結構域及CDR區編號均相同，亦即，本文中提供之人類化變異體不包括任何插入或缺失。
本發明亦提供與本文藉由序列揭示的來源於相同鼠類生殖系序 列，具體言之，V及J區基因區段的彼等抗體有關之抗huCD40抗體。本文揭示之抗體各自的鼠類生殖系序列提供於表3中。
本發明進一步提供由本文揭示之鼠類親本抗體，藉由用人類構架序列置換鼠類構架序列，且具有或不具有用於恢復在人類化過程中另外損失之抗原(人類CD40)親和力或移除序列可靠性之另外突變(「回復突變」)而得到的人類化抗huCD40抗體。參見實例3。
本發明亦提供抗體構建體，其包含本文揭示之新穎可變結構域序列及具有對FcγRIIb之親和力相較於對其他Fc受體(亦即，活化受體)之親和力有所增強之經修飾Fc區的恆定結構域。預期此類具有增強之FcγRIIb特異性的激動性抗huCD40抗體在癌症及慢性感染之治療中展現優良功效。Li及Ravetch(2011)Science 333：1030；White等人(2011)J.Immunol.187：1754。不打算受理論限制，此類特異性激動性抗CD40 mAb可藉由增進樹突狀細胞成熟，促進細胞毒性CD8+ T細胞之擴增及活化，引起抗腫瘤反應增強，來展現增強之輔助作用。同上。不打算受理論限制，由受體群集增加或「交聯」引起的FcR介導之本發明激動劑CD40抗體信號增強可為引起治療功效之重要因素。由抗 體Fc部分接合FcR引起的CD40激動劑抗體之交聯可增加信號強度且藉此增進細胞活化。
抗體對活化Fc受體(A)較之對抑制Fc受體(I)之相對結合親和力可表示為「A/I」，且通常隨IgG抗體Fc區之結構而變化。參見WO 2012/087928。對結合至抑制受體FcγRIIb具有增強之特異性的抗體具有較低的A/I比率。本發明之激動性抗huCD40抗體之較佳抗體具有例如小於5、4、3、2、1、0.5、0.3、0.1、0.05、0.03或0.01之A/I比率。
包含增強FcγRIIb特異性之突變突變的人類IgG1恆定結構域亦提供於序列表中，且概述於表4中並於圖1中繪出。序列變異體係參照SEQ ID NO：65提供之人類IgG1f恆定結構域序列定義。關於Fc區中突變位置(編號)之命名係根據如Kabat等人(1981)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.中之EU索引，其有助於比較具有不同可變結構域長度之抗體中相同位置處之Fc序列。亦參見Edelman等人(1969)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)63：78；WO 2012/130831(使用相同編號系統)。其不匹配序列表中之序列編號。圖1提供表4之Fc序列變異體的圖形表示，熟習此項技術者由此可容易地識別本文揭示之抗體序列中之相應位置。SE及SELF變異體描述於Chu等人(2008)Mol.Immunol.45：3926中。P238D、V4、V7、V8、V9、V11及V12變異體描述於Mimoto等人(2013)Protein Engineering Design & Selection 26：589(例如，其中之表1)中。
對FcγRIIb具有增強之親和力的另外的Fc序列變異體揭示於等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135：9723(及WO 2014/184545)中，包括V262E及V264E，例如與S267E及L328F組合使用。
產生具有D270E突變之另外的變異體以減少在V4及V9 Fc序列變異體中出現的D270異構化，該等序列變異體在加速降解研究中另外展現增大之異構化速率，表明在4℃下於PBS中兩年之後有約12%至16%異構化，與其他變異體之約5%至7%形成比較。參見表5(提供由單一實驗得到之資料，但重複實驗顯示類似值)。用麩胺酸取代270位之天冬胺酸消除此類DG異構化之可能性，產生化學穩定性較高之抗體及較均勻之抗體製劑。V9之其他D270取代，諸如D270A、D270Q、D270S及D270T，有效地消除與FcγRIIa及FcγRIIb受體之結合(KD超過5μM)。儘管D270E突變使得與FcγRIIb受體之結合降低一個數量級，但相較於FcγRIIa，V9-D270E變異體維持對FcγRIIb受體之親和力之有利偏倚，且對FcγRIIb具有可接受之絕對親和力。參見實例8。
量測本發明之各種抗CD40抗體之激動劑活性。參見實例7及圖3A、3B及4。發現激動劑活性取決於決定抗原(人類CD40)結合之可變結構域序列(mAb純系編號)，及決定Fc受體(FcγRIIb)結合之Fc區序列。
藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例不應視作進一步限制。所有圖式及在本申請案通篇引用之所有參考文獻、Genbank序列、專利及公開之專利申請案的內容明確地以引用的方式併入本文中。
實例
實例1
產生針對人類CD40之小鼠單株抗體
使用表現小鼠抗體基因之野生型Balb/c小鼠(Charles Rivers Labs)產生鼠類抗人類CD40單株抗體如下。
抗原
使用huCD40-muFc可溶性重組蛋白作為抗原用於免疫。可溶性融 合蛋白具有91.6 KD之MW且由huCD40之細胞外部分在其C末端連接至小鼠IgG2b Fc構成。此融合蛋白在本文中稱作「huCD40-muFc融合蛋白」。藉由標準重組DNA方法產生融合蛋白，且使其在經轉染之CHO細胞中表現，該等細胞將可溶性融合蛋白分泌至培養物上清液中。用於轉染之CHO宿主細胞係自Invitrogen(目錄號11619-012)獲得。分泌之可溶性融合蛋白經純化以用作免疫原。
小鼠免疫
為產生針對人類CD40之小鼠單株抗體，用純化之huCD40-muFc融合蛋白對Balb/C小鼠進行免疫。小鼠在第一次輸注抗原時為大約2至4月齡。使用純化之重組huCD40-muFc抗原製劑(10μg，由表現該融合蛋白之經轉染哺乳動物細胞純化)，使用兩種免疫方案(A及B)對小鼠進行免疫。方案A由每週四次腳掌(FP)免疫組成且方案B由每週七次皮下(SC)/腹膜內(IP)/踝關節免疫組成。在兩種情況下，免疫原與RIBI佐劑(Sigma目錄號M6536)以1：1混合。
所有小鼠均在第四次免疫之後一週抽血以評估抗原特異性滴度。在處死時，亦自每隻小鼠獲得最終血液。藉由眶後抽血監測免疫反應。藉由ELISA分析，使用免疫所用重組蛋白篩查血漿。方案A中之小鼠在融合之前2天及3天經靜脈內(IV)及在腳掌(FP)中接受用可溶性抗原進行之最後兩次加強免疫。方案B中之小鼠在融合之前2天及3天經靜脈內以及IP及踝關節中接受用可溶性抗原進行之最後兩次加強免疫。
將方案A中之全部四隻小鼠(ID 291763、291764、291765、291766)處死。提取淋巴結及脾細胞且混合用於融合(融合物3582及3583)。方案B僅處死兩隻小鼠(ID 294286及294288)。將來自每隻小鼠之脾及淋巴結混合且融合(融合物3716及3717)。
產生針對人類CD40之單株抗體之融合瘤的產生
使用基於電場之電融合Hybrimune儀器及0.9ml之較大融合腔室(BTX Harvard Apparatus,Inc.,Holliston,MA)將自高滴度Balb/c小鼠分離之小鼠脾細胞及淋巴結與小鼠骨髓瘤融合搭配物融合。將來自經免疫小鼠之淋巴細胞的單細胞懸浮液與等量的P3X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌性小鼠骨髓瘤細胞融合。在平底微量滴定盤中，將所得細胞以2.0×104個細胞/孔塗鋪於添加有胺基喋呤之選擇性ClonaCell-HY培養基E(目錄號03805；STEMCELL Technologies Inc.,Vancouver BC,Canada)中以選擇融合瘤。約7天之後，該培養基更換為培養基E(不含胺基喋呤)。
在10至12天之後，使用均質HTRF分析，針對小鼠IgG/小鼠κ輕鏈抗體之存在篩選個別孔。在此分析中，將由96孔融合盤得到的上清液與定製標記鋱-穴狀化合物之山羊抗小鼠IgG(Fcγ特異性)(Cisbio US Inc.Bedford,MA)及用AlexaFluor 647標記之山羊抗小鼠IgG Fab'2(Jackson ImmunoResearch；目錄號109-605-098)混合。培育1小時。接著在Rubystar讀數器上讀取盤。接著藉由使用經人類CD40轉染之CHO細胞及作為對照物之未經轉染之CHO細胞(融合物3582/3583)進行的FACS，或藉由使用重組蛋白之ELISA，隨後以Daudi B細胞及Jurkat T細胞(融合物3716/3717)作為陰性對照物進行FACS，來篩選對小鼠IgG/小鼠κ輕鏈抗體呈陽性之孔中的融合瘤細胞。將FACS陽性親本株轉移至24孔盤。數天後，藉由FACS再次篩選來自個別孔之細胞上清液以確定IgG對人類CD40之特異性。
藉由連續稀釋選殖一組抗原特異性融合瘤且藉由使用CHO轉染物或Daudi細胞之FACS再次篩選。由融合物3582/3583純化出十九種抗體且由融合物3716/3717純化出二十種抗體，且測試其功能活性。由此組抗體選出五種較強激動劑用於第二次選殖。隨後該五種抗體，即1802.3582.19G3.F10.E1、1802.3583.5G7.F12.G3、1802.3583.8E8.C10.G2、 1802.3716.12D6.B1.E3及1802.3717.5F11.A11.E7提交用於測序及進一步分析。
實例2
完全人類抗huCD40抗體之產生
結合至與本文揭示之人類化抗CD40抗體相同之抗原決定基及/或交叉阻斷本文揭示之人類化抗CD40抗體之結合的完全人類抗huCD40單株抗體可用於本發明之方法中。可使用表現人類抗體基因之轉殖基因小鼠產生此類抗體如下。
抗原
使用huCD40可溶性重組蛋白作為抗原用於免疫。該可溶性融合蛋白係由huCD40之細胞外部分在其C末端連接至小鼠IgG2a Fc構成。此融合蛋白在本文中稱作「huCD40-muFc融合蛋白」。藉由標準重組DNA方法產生融合蛋白，且使其在經轉染之CHO細胞中表現，該等細胞將可溶性融合蛋白分泌至培養物上清液中。用於轉染之CHO宿主細胞係自Invitrogen(目錄號11619-012)獲得。分泌之可溶性融合蛋白經純化以用作免疫原。包括信號序列在內之全長人類CD40序列以SEQ ID NO：1提供。
轉殖基因小鼠
針對人類CD40之完全人類單株抗體係使用來自CMD++；JKD++；KCo5(9272)+^；SC20+基因型之小鼠(下文稱為KM®小鼠)製備。個別轉殖基因名稱在圓括號中，接著為隨機整合之轉殖基因之株系編號。符號++及+指示純合子或半合子；然而，由於小鼠通常使用無法區分隨機整合之人類Ig轉殖基因之雜合性與純合性的基於PCR之分析篩選，故+名稱可給予實際上為此等元件純合的小鼠。在此品系中，內源性小鼠κ輕鏈基因已在同型接合地破壞，如Chen等人(1993)EMBO J.12：811-820中所述，且內源性小鼠重鏈基因已同型接 合地破壞，如WO 2001/09187之實例1中所述。此外，此小鼠品系攜有人類κ輕鏈轉殖基因KCo5，如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所述；攜帶大部分人類κ輕鏈基因座之酵母人工染色體(YAC)，如WO 2000/026373中所述。
小鼠免疫
為產生人類CD40之完全人類單株抗體，用純化之huCD40-muFc融合蛋白對KM小鼠進行免疫。通用免疫方案描述於Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及WO 98/24884中。小鼠在第一次輸注抗原時為大約4月齡。使用純化之重組huCD40-muFc抗原製劑(10μg，自表現融合蛋白之經轉染之哺乳動物細胞純化)或經人類CD40轉染之300-19細胞經腹膜內及皮下對小鼠進行免疫。免疫原與RIBI佐劑(Sigma目錄號M6536)以1：1混合。
以5-7天時間間隔對小鼠免疫五次。第一次及第二次免疫係用重組蛋白進行。第三次免疫係用細胞，第四次免疫係用蛋白質，且第五次免疫係用細胞。在第四次免疫之後一週對小鼠抽血以評估抗原特異性滴度。藉由眶後抽血監測免疫反應。藉由FACS分析，使用經轉染之300-19細胞篩查血漿，且使用對抗人類CD40人類IgG具有最高滴度之小鼠進行融合。小鼠在處死及移除脾之前三天接受藉由靜脈內(IV)及腹膜內(IP)注射經轉染細胞及在之前兩天接受藉由靜脈內(IV)及腹膜內(IP)注射可溶性抗原進行之最後一次加強免疫。
產生針對人類CD40之人類單株抗體之融合瘤的產生
使用基於電場之電融合，使用Cyto Pulse大腔室細胞融合電致孔器(Cyto Pulse Sciences,Inc.,Glen Burnie,MD)將自高滴度KM小鼠分離之小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤融合搭配物融合。將來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞的單細胞懸浮液與等量的P3X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌性小鼠骨髓瘤細胞融合(融合物編號：2541)。在平底微量滴定盤中，將所得細胞以2.0×104個細胞/孔塗鋪於含有高葡萄糖(Cellgro #10-013-CM)及10%胎牛血清(Hyclone #SH30071.03)且補充有β-巰基乙醇(1000X,Gibco #21985-023)、7mM HEPES(Cellgro 25-060-Cl)、另外2mM L-麩醯胺酸(Cellgro 25-005-Cl)、HAT(50X，Sigma #H-0262)、5%融合瘤選殖因子(BioVeris #210001)、10% P388DI(ATCC #CRL TIB-63)條件培養基及青黴素-鏈黴素(100x,Cellgro #30-002-CI)之選擇性DMEM培養基中。在約7天之後，含有HAT之部分培養基更換為含有HT(Cellgro #25-047-CI)之培養基。
在10至12天之後，使用均質HTRF分析，針對人類IgG/人類κ輕鏈抗體之存在篩選個別孔。在此分析中，將來自96孔融合盤之上清液與銪-穴狀合物標記之山羊抗人類IgG(Fc片段特異性)、生物素化山羊抗人類κ輕鏈(Bethyl #A80-115B)、抗生蛋白鏈菌素-XLent混合且培育1小時。接著在RUBYstar讀數器上讀取盤。
接著藉由FACS，使用經人類CD40轉染之300-19細胞及作為對照之未轉染300-19細胞，篩選來自對人類IgG/人類κ輕鏈或人類IgG/人類λ輕鏈抗體呈陽性之孔的融合瘤細胞。將FACS陽性親本株系轉移至24孔盤。數天後，藉由FACS再次篩選來自個別孔之細胞上清液以確定IgG對人類CD40之特異性。
藉由連續稀釋來選殖融合瘤且藉由FACS再次篩選。
實例3
抗huCD40抗體之人類化
使本發明之親本(鼠類)抗體人類化以可能用作人類治療劑。針對每一小鼠可變結構域選擇最接近相配之人類生殖系區序列，且使用此等人類構架區在抗體之「CDR移植物」形式中置換鼠類構架。接著視需要進行另外的胺基酸取代，諸如構架回復突變，以恢復人類化抗體 之結合親和力。進行進一步胺基酸取代以消除序列不穩定性。各種形式本發明抗體之間的序列關係提供於表6中。藉由生物層干涉測量術(BLI)分析，使用Fortebio Octet RED(快速系統擴展偵測(Rapid system-Extended Detection))無標記相互作用分析儀測定各種激動性抗huCD40抗體與可溶性人類CD40之結合。所有研究均在25℃下於10mM NaxPO4、130mM NaCl、0.05%界面活性劑P20(pH 7.1)中進行。簡言之，使用90秒之裝載時間及1000rpm之振盪速度，將抗huCD40抗體上清液(稀釋至10μg/ml或當上清液濃度小於10μg/ml時不不加稀釋即捕捉)捕捉於塗佈蛋白質A之生物感測器(Pall Fortebio #18-5010)上。首先使用180秒之締合時間及解離時間，在1000rpm下針對與1μM重組人類CD40單體(huCD40單體)之結合篩選上清液，其中在結合週期之間有使用10mM甘胺酸(pH 1.5)進行的兩個15秒之調節步驟。接著測試在1μM huCD40單體實驗中展示結合信號之所有上清液與以三倍連續稀釋的七種不同濃度之huCD40單體的結合，其中取決於1μM篩選實驗中結合信號之強度，最高濃度為10μM huCD40單體或1μM huCD40單體。有關所選抗體及其序列變異體之結果示於表6中。
對於人類化抗體，VH及VL管柱提供人類可變結構域生殖系，構架區係基於該人類可變結構域生殖系。「CDR移植」係指包含未修飾親本(小鼠)CDR之可變結構域直接移植至所述人類構架序列上。表6 中所有序列變異體之殘基編號係根據Kabat，且因此表6中序列變化之位置不匹配序列表中抗體序列之殘基編號。加下劃線用於指示意圖校正潛在序列不穩定性之序列修飾，亦即，經歷化學修飾及可能發生之降解而引起產物異質性的殘基。其他序列修飾意圖恢復親和力，通常為構架回復突變(自人類生殖系構架序列恢復成原始鼠類構架殘基)。抗體5G7重鏈中之M69L修飾為構架回復突變及不穩定性校正。
實例4
抗CD40抗體抗原決定基分組實驗
可進行抗原決定基分組實驗以確定哪種抗人類CD40抗體與其他抗體競爭結合至huCD40且因此結合至類似抗原決定基。如下測定抗huCD40抗體之間的逐對競爭，其中使參考抗體結合至感測器晶片之表面，將測試抗體與huCD40多肽構建體以混合物形式預培育，且使預培育之混合物流過感測器晶片以確定測試抗體干擾huCD40多肽構建體與晶片表面上參考抗體之結合的程度。此類競爭實驗可使用BIACORE®SPR儀器進行。簡言之，將參考抗huCD40抗體固定於感測器晶片CM5晶片(S系列，GE Healthcare目錄號BR-1005-30)表面上，使用流槽2、流槽3及流槽4(5000RU)及流槽1作為陰性對照。測試抗體在起始濃度稀釋至120μg/mL(2×)。藉由用緩衝液以1：3稀釋抗體濃度得到七種不同濃度來製備測試抗體之連續稀釋液及對照樣品(0μg/ml)以獲得滴定曲線。將每一抗體濃度系列分成兩半。在第一半濃度系列中，添加40nM(2X)人類CD40抗原((例如，huCD40/Fc)以製備最終濃度系列(60μg/ml-0.0μg/ml)及各孔中20nM之最終抗原濃度。在第二半濃度系列中，以緩衝液代替抗原添加以將抗體稀釋至相同濃度，且此一半經處理作為空白。將測試抗CD40抗體及huCD40/Fc之複合物培育2小時。將40μL複合物以30μL/min注射於塗佈參考抗體之表面上。使用BIACORE® T200表面電漿子共振儀器且操作緩衝 液為HBE-EP(GE Healthcare目錄號BR-1001-88，經過濾脫氣)、0.01M HEPES(pH7.4)、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性劑P20。表面用25mM NaOH(型號：BR-1003-58,GE Healthcare)以100μL/min再生5秒。使用Microsoft Excel分析資料，其中將測試抗體之濃度隨相應反應單元之變化作圖以獲得滴定曲線。
此類關於本發明之抗CD40抗體之抗原決定基分組實驗的結果提供於圖2中。抗體5F11及8E8阻斷配位體(CD40L)結合。本發明之五種抗CD40抗體分成三個抗原決定基組：12D6/5G7/19G3、5F11/5G7/19G3、及8E8。
實例5
藉由HDX進行抗原決定基定位
藉由氫/氘交換質譜(HDX-MS)測定本發明之抗huCD40抗體12D6、5G7、19G3及5F11之抗原決定基。HDX-MS在溶液中藉由監測主鏈醯胺氫原子之氘交換的速率及程度探測蛋白質構形及構形動力學。Huang及Chen(2014)Anal.Bioanalytical Chem.406：6541；Wei等人(2014)Drug Disc.Today 19：95。HDX之水準取決於主鏈醯胺氫原子之溶劑可接近性及蛋白質氫鍵。可藉由MS精確量測在HDX後蛋白質之質量增加。當將此技術與酶消化相結合時，可在肽層面上解析結構特徵，使得表面暴露之肽與摺疊於內部之該等肽，或與蛋白質-蛋白質複合物界面處螯合之該等肽相區別。通常，進行氘標記及後續淬滅實驗，隨後進行酶消化、肽分離及MS分析。
在抗原決定基定位實驗之前，進行非氘化實驗以產生用於重組人類CD40單體(10μM)及CD40與mAb 12D6、5G7、19G3及5F11之蛋白質複合物(1：1莫耳比)的常見肽清單。在HDX-MS實驗中，將5μL各樣品(分別為CD40，或CD40與mAb 12D6、5G7、19G3及5F11之複合物)稀釋於55μL D2O緩衝液(10mM磷酸鹽緩衝液、D2O，pH7.0)中以 起始標記反應。反應進行不同時段：20秒、1分鐘、10分鐘及240分鐘。在每一標記反應時段結束時，藉由添加淬滅緩衝液(含4M GdnCl及0.4M TCEP之100mM磷酸鹽緩衝液，pH 2.5，1：1，v/v)淬滅反應且將50μL經淬滅之樣品注入Waters HDX-MS系統中進行分析。在不存在/存在CD40 mAb情況下監測常見胃酶解肽之氘攝取量。所得序列覆蓋率為82%。
抗CD40 mAb 12D6、5G7、19G3及5F11之HDX抗原決定基提供於表7中。抗體12D6保護兩種肽，其中一個(殘基11-28)包括一部分信號序列且因此本身不太可能為生理學相關的，但指示12D6接觸區域21-28，而mAb 5G7及19G3則不接觸。
實例6
藉由酵母展示進行之抗原決定基定位
藉由在酵母上展示隨機突變誘發之huCD40細胞外區域變異體，且基於其無法結合至特定抗體對此等酵母進行分選來確定所選本發明之嵌合或人類化抗huCD40抗體之抗原決定基。對所選無法結合之酵母細胞進行擴增且基於其無法結合至本發明抗體之特定嵌合或人類化形式，再進行一輪選擇。參見例如，Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342：539。針對所得酵母測定huCD40變異體之序列且分析每一殘基對抗體結合之影響。確定本發明抗體之結合抗原決定基為huCD40序列內單胺基酸突變破壞與本發明之抗huCD40抗體之結合的基因座。
簡言之，使用易錯PCR將編碼人類CD40之DNA選殖至構建體中，使huCD40變異體表現為融合蛋白之胺基末端部分，該等融合蛋白進一步包含c-myc標籤序列及酵母細胞壁蛋白質Aga1p。此類構建體當在酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表現時，在酵母細胞之表面上展示變異體huCD40多肽，其藉由Aga1p多肽錨定至細胞表面。c-myc標籤可視情況用作在給定酵母細胞上展示huCD40融合蛋白之陽性對照。藉由FACS分選酵母細胞，且彙集表現為適當摺疊之huCD40-融合蛋白(如藉由別藻藍蛋白(APC)標記之山羊抗小鼠二次抗體偵測對照小鼠抗huCD40抗體所測定)，但不結合至本發明抗體(如藉由用藻紅素(PE)標記之山羊抗人類IgG作為二次抗體進行偵測所測定)之彼等者，擴增並用於後續數輪選擇中。測定來自數輪選擇之後剩餘之酵母的構建體中的huCD40序列。進行不存在抗huCD40抗體選擇之對照實驗以確定在沿huCD40序列之每一位置處存在良好突變體覆蓋率，且提供基線以將用所選文庫獲得的結果標準化。
實例7
抗CD40抗體之激動劑活性
藉由量測不成熟樹突狀細胞(DC)之活化來評估Fc序列變異對所選本發明抗CD40抗體之激動劑活性的影響。用具有人類IgG1f(對照)、SE、SELF、P238D、V4、V8及V12 Fc序列之抗CD40 mAb 12D6-24構建體進行實驗。使用塑料黏附性或人類CD14-微珠(Miltenyi Biotec)自健康正常供體分離人類單核細胞(CD14+)。將單核細胞與100ng/mL GM-CSF(Miltenyi Biotec)及100ng/mL IL-4(Miltenyi Biotec)一起培養。在第2天及第5天，移除一半培養基且補足。在第6-7天收集不成熟樹突狀細胞。將來自兩個供體之DC與指定濃度之抗體在37℃下培育隔夜。收集細胞培養物上清液且分析人類IL-6產量(Cisbio)。參見圖3A及3B。
對照人類IgG1f抗體當以多達100nM使用時不誘導IL-6分泌，且P238D變異體僅具有較弱誘導作用。相比之下，SE、SELF、V9及V12變異體均大幅增進IL-6分泌，其中V8及V4展現中間作用。此等結果與對FcγRIIb之結合親和力大致相關，且證實使用適當Fc序列變異體可產生具有增強之激動劑活性的抗CD40抗體。
此外，在實驗中，使用具有常見人類IgG1f V12恆定結構域之嵌合抗CD40 mAb構建體評價具有8E8、5G7、12D6、19G3及5F11可變區之抗體之間激動劑活性的差異。在活體外(如前一段中所描述分離)藉由將細胞塗鋪於96孔盤中，添加指定抗體且在37℃下培育隔夜來量測對不成熟樹突狀細胞之活化作用。接著收集細胞且用螢光抗CD54抗體染色，藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行偵測。參見圖4。
對照人類IgG1f抗體不會顯著地引起CD54上調，而12D6大幅引起CD54上調。抗體19G3及8G8之有效性略低於12D6，且抗體5G7及5F11彼此類似且展現相對較低之刺激作用。活化結果未必與對CD40之結合親和力相關，因為抗體5F11具有幾乎最高結合親和力且又為較弱激動劑，而抗體19G3則相反。不管造成該等差異之原因如何，此等結果證實，使用適當抗原結合結構域序列對於獲得具有增強之激動劑活性的抗CD40抗體極為重要。
實例8
DG異構化之糾正
具有V4及V9 Fc變異體序列之本發明抗體展現在D270位不可接受程度的DG異構化。此類異構化為非所需的，因為其導致產物異質性且潛在地降低功效。為減少此類異構化，將V4 Fc在270位之天冬胺酸殘基變為麩胺酸(D270E)，且V9Fc之270位變為丙胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸及蘇胺酸(D270A、D270E、D270Q、D270S、D270T)。自表現此等抗體之細胞獲得上清液且分析其與hCD32/FcγRII 之結合。使用在270位不含突變的所選純化抗體作為對照物。對具有來自mAb 12D6-24及5F11-45之可變結構域的抗體進行此等實驗。結果提供於圖5中。
對於V4及V9 Fc變異體，D270E取代引起受體結合之適度減少。測試的其他V9 Fc變異體(D270A、D270Q、D270S、D270T)引起受體結合較大減少。結果與該抗體為12D6抑或5F11無關。在所有情況下，與三種測試受體(FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131及FcγRIIb)之相對(等級次序)結合保持類似，其中與FcγRIIa-R131及FcγRIIb之結合大致相當，且與FcγRIIa-H131之結合明顯較弱。
對於V4及V9變異體，D270E取代保持可接受地較高FcγR親和力，且維持對FcγRIIb之特異性，此為增強本發明之抗CD40抗體之激動性活性所需的。
實例9
在人類CD40/人類FcγR轉殖基因小鼠中之抗CD40活性
將所選本發明之激動劑抗CD40抗體投與人類CD40及人類Fcγ受體轉殖基因小鼠[CD40-/-hCD40+Fcgra-/-Fcgr1-/-hFCGRI+hFCGRIIA+hFCGRIIB+hFCGRIIIA+hFCGRIIIB+]。人類Fcγ受體轉殖基因小鼠描述於Smith等人(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)109(16)：6181-6中。此類轉殖基因人類CD40/FcγR小鼠特別適合於研究潛在人類治療性抗CD40抗體，該等抗體必需結合至人類CD40及人類FcγR。以Li及Ravetch(2011)Science 333：1030中描述之「DEC-OVA」模型量測激動劑活性且亦量測血小板含量。結果示於圖6A及6B中。顯示最大激動劑活性之抗體，諸如12D6-V11，及較低程度之抗體12D6-V4亦展現24小時血小板計數之最大程度減小。血小板計數減小為一種短暫現象，且其量在注射後7天恢復正常(資料未示出)。
5F11抗體識別與CD40L結合抗原決定基重疊之抗原決定基，不同於12D6抗體結合不同於其CD40L結合抗原決定基之hCD40，類似於CP-870,893。12D6抗體阻斷CP-870,893結合，但5F11抗體則不然(資料未示出)。活體外DC活化分析對於12D6之SE-Fc及V11-Fc變異體展現顯著活性，而12D6 Fc變異體展現相較於5F11變異體增強之活性。儘管12D6-Fc變異體之活體外活性高於野生型IgG1，但活體外研究並不區分不同Fc變異體之活性。因此在人類化CD40/人類FcγR小鼠中評價此等抗體及其Fc變異體之活性。如關於純系CP-870,893所觀察的，此等mAb之選擇性FcγRIIB增強之V11 Fc變異體相較於其FcγRIIA/IIB增強之SE變異體及野生型IgG1子類展示優良的活體內活性。此外，新開發的12D6-V11之活體內活性量值為CP-870,893(IgG2)之活性的約20倍。
對CD40激動性Ab 12D6-24及5F11-45之抗腫瘤活性進行評價。在MC38腫瘤模型中測試每一純系之野生型IgG1、SE及V11突變體的活性。此等抗體之FcγRIIB選擇性增強V11變異體相較於其他測試Fc變異體具有優良之抗腫瘤活性，與其活體內T細胞刺激活性及關於CP-870,893衍生物觀察之抗腫瘤活性層級相符。結果顯示於圖6C中。在CD40 Ab治療之後30天，用MC38腫瘤細胞再攻擊來自12D6-24治療組之無腫瘤小鼠。結果顯示於圖6D中。該組中所有小鼠在再攻擊之兩週內排斥腫瘤，證實單次注射12D6-24介導長期保護作用。
此等資料表明，可藉由Fc工程改造以選擇性增強FcγRIIB接合來增強激動性人類CD40 Ab之抗腫瘤活性且V11 Fc變異體在增強激動作用方面特別有效。
序列表提供成熟重鏈及輕鏈之序列(亦即，序列不包括不包括信號肽)。用於例如在人類細胞中產生本發明之抗體的信號序列以SEQ ID NO：78提供。
等效內容：
熟習此項技術者僅僅使用常規實驗將認識到或能夠確定本文所揭示之具體實施例的許多等效物。此類等效物欲涵蓋於隨附申請專利範圍中。
<110> 美國洛克菲勒大學及美商必治妥美雅史谷比公司
<120> 具有增強之激動劑活性之針對CD40的抗體
<130> 036707.00300/RUBMS12724PCT/RU1281
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<220>
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<212> PRT
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<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(102)
<223> CDRH3
<400> 52
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠可變結構域及人類恆定結構域之嵌合抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(107)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(34)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(56)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(97)
<223> CDRL3
<400> 53
<210> 54
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(113)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(102)
<223> CDRH3
<400> 54
<210> 55
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(107)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(34)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(56)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(97)
<223> CDRL3
<400> 55
<210> 56
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(113)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(102)
<223> CDRH3
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<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(107)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(34)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(56)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(97)
<223> CDRL3
<400> 57
<210> 58
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠可變結構域及人類恆定結構域之嵌合抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(101)
<223> CDRH3
<400> 58
<210> 59
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠可變結構域及人類恆定結構域之嵌合抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(39)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(61)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(102)
<223> CDRL3
<400> 59
<210> 60
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(101)
<223> CDRH3
<400> 60
<210> 61
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(101)
<223> CDRH3
<400> 61
<210> 62
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(39)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(61)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(102)
<223> CDRL3
<400> 62
<210> 63
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(101)
<223> CDRH3
<400> 63
<210> 64
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR及人類構架區及恆定區的人類化抗體
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(112)
<223> 可變結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(39)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(61)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(102)
<223> CDRL3
<400> 64
<210> 65
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
<210> 66
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 66
<210> 67
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 67
<210> 68
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 68
<210> 69
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 69
<210> 70
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 70
<210> 71
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 71
<210> 72
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 72
<210> 73
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 73
<210> 74
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 74
<210> 75
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 75
<210> 76
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1f恆定結構域之變異體
<400> 76
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78

Claims (22)

  1. 一種分離之抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至人類CD40且在交叉阻斷分析中與選自由以下組成之群之一或多種抗體競爭結合至人類CD40：12D6(SEQ ID NO：3及4)、5F11(SEQ ID NO：23及24)、8E8(SEQ ID NO：40及41)、5G7(SEQ ID NO：52及53)及19G3(SEQ ID NO：58及59)。
  2. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合部分，其中該在交叉阻斷分析中之競爭包含當與該所選抗體以相同莫耳濃度使用時在競爭ELISA中使該所選抗體與人類CD40之結合減少至少20%的能力。
  3. 一種分離之抗體或其抗原結合部分，其在以下處特異性結合至人類CD40：a. 包含序列EPPTACREKQYLINS(SEQ ID NO：1之殘基21-35)或由該序列組成之抗原決定基(抗體12D6、5G7及19G3)；或b. 包含序列ECLPCGESE(SEQ ID NO：1之殘基58-66)或由該序列組成之抗原決定基(抗體5F11)。
  4. 一種分離之抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至人類CD40，其包含：a)至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-39_01及J區生殖系IGHJ4之重鏈CDR序列及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK1-110_01及J區生殖系IGKJ1之輕鏈CDR序列(12D6)；b)至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-4_02及J區生殖系IGHJ3之重鏈CDR序列及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK3-5_01及J區生殖系 IGKJ5之輕鏈CDR序列(5F11)；c)至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-80_01及J區生殖系IGHJ2之重鏈CDR序列及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK1-110_01及J區生殖系IGKJ2之輕鏈CDR序列(8E8)；d)至少部分來源於鼠類V區生殖系VH1-18_01及J區生殖系IGHJ4之重鏈CDR序列及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK10-96_01及J區生殖系IGKJ2之輕鏈CDR序列(5G7)；或e)至少部分來源於鼠類V區生殖系VH5-9-4_01及J區生殖系IGHJ3之重鏈CDR序列及至少部分來源於鼠類V區生殖系VK1-117_01及J區生殖系IGKJ2之輕鏈CDR序列(19G3)。
  5. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含CDRH1、CDRH2及CDRH3序列且該輕鏈包含CDRL1、CDRL2及CDRL3序列，該等序列選自由以下組成之群：a)抗體12D6-03之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：5之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：6之殘基24-39、55-61及94-102；b)抗體12D6-22之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：7之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：9之殘基24-39、55-61及94-102；c)抗體12D6-23之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別 包含SEQ ID NO：10之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：11之殘基24-39、55-61及94-102；d)抗體12D6-24之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：12之殘基31-35、50-66及99-108且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：9之殘基24-39、55-61及94-102；e)抗體5F11-17之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：25之殘基31-35、50-66及99-106且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：26之殘基24-38、54-60及93-101；f)抗體5F11-23之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：27之殘基31-35、50-66及99-106且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：28之殘基24-38、54-60及93-101；g)抗體5F11-45之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：29之殘基31-35、50-66及99-106且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：30之殘基24-38、54-60及93-101；h)抗體8E8-56之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：42之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：43之殘基24-39、55-61及94-102；i)抗體8E8-62之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：44之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：45之殘基24-39、55-61及 94-102；j)抗體8E8-67之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：46之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：47之殘基24-39、55-61及94-102；k)抗體8E8-70之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：48之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：49之殘基24-39、55-61及94-102；l)抗體8E8-71之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：50之殘基31-35、50-66及99-111且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：51之殘基24-39、55-61及94-102；m)抗體5G7-22之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：54之殘基31-35、50-66及99-102且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：55之殘基24-34、50-56及89-97；n)抗體5G7-25之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：56之殘基31-35、50-66及99-102且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：57之殘基24-34、50-56及89-97；o)抗體19G3-11之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別包含SEQ ID NO：60之殘基31-35、50-66及99-101且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：62之殘基24-39、55-61及94-102；及p)抗體19G3-22之CDR，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3分別 包含SEQ ID NO：63之殘基31-35、50-66及99-101且CDRL1、CDRL2及CDRL3分別包含SEQ ID NO：64之殘基24-39、55-61及94-102。
  6. 如請求項5之抗體，其包含選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變結構域序列：a)抗體12D6-03之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之殘基1-119及1-112；b)抗體12D6-22之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9之殘基1-119及1-112；c)抗體12D6-23之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11之殘基1-119及1-112；d)抗體12D6-24之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：9之殘基1-119及1-112；e)抗體5F11-17之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26之殘基1-117及1-111；f)抗體5F11-23之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28之殘基1-117及1-111；g)抗體5F11-45之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30之殘基1-117及1-111；h)抗體8E8-56之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43之殘基1-122及1-112；i)抗體8E8-62之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45之殘基1-122及1-112；j)抗體8E8-67之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47之殘基1-122及1-112；k)抗體8E8-70之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO： 45及SEQ ID NO：49之殘基1-122及1-112；l)抗體8E8-71之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51之殘基1-122及1-112；m)抗體5G7-22之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55之殘基1-113及1-107；n)抗體5G7-25之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57之殘基1-113及1-107；o)抗體19G3-11之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62之殘基1-112及1-112；及p)抗體19G3-22之重鏈及輕鏈可變區，其分別包含SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64之殘基1-112及1-112。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體進一步包含經修飾以增強結合至FcγRIIb之特異性的Fc區。
  8. 如請求項7之抗體，其展現小於5之A/I比。
  9. 如請求項8之抗體，其展現小於1之A/I比。
  10. 如請求項7之抗體，其中該經修飾Fc區係在選自由以下組成之群之重鏈恆定區中：SE(SEQ ID NO：66)、SELF(SEQ ID NO：67)、P238D(SEQ ID NO：68)、V4(SEQ ID NO：69)、V4 D270E(SEQ ID NO：70)、V7(SEQ ID NO：71)、V8(SEQ ID NO：72)、V9(SEQ ID NO：73)、V9 D270E(SEQ ID NO：74)、V11(SEQ ID NO：75)及V12(SEQ ID NO：76)。
  11. 如請求項5之抗體，其包含選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈序列：a)抗體12D6-24-P238D之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：9之序列；b)抗體12D6-24-SE之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：14 及SEQ ID NO：9之序列；c)抗體12D6-24-SELF之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：9之序列；d)抗體12D6-24-V4之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：9之序列；e)抗體12D6-24-V4 D270E之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：9之序列；f)抗體12D6-24-V8之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：9之序列；g)抗體12D6-24-V9之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：9之序列；h)抗體12D6-24-V9 D270E之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：9之序列；i)抗體12D6-24-V11之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：9之序列；j)抗體12D6-24-V12之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：9之序列；k)抗體5F11-45-SE之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：30之序列；l)抗體5F11-45-SELF之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：30之序列；m)抗體5F11-45-V4之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：30之序列；n)抗體5F11-45-V4 D270E之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：30之序列；o)抗體5F11-45 V8之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：35 及SEQ ID NO：30之序列；p)抗體5F11-45-V9之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：30之序列；q)抗體5F11-45-V9 D270E之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：30之序列；r)抗體5F11-45-V11之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：30之序列；及s)抗體5F11-45-V12之重鏈及輕鏈，其分別包含SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：30之序列。
  12. 一種編碼如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區的核酸。
  13. 一種表現載體，其包含如請求項12之核酸分子。
  14. 一種經如請求項13之表現載體轉形之細胞。
  15. 一種製備抗人類CD40抗體或其抗原結合部分之方法，其包含：a)在如請求項14之細胞中表現該抗體或其抗原結合部分；及b)自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
  16. 一種醫藥組合物，其包含：a)如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合部分；及b)載劑。
  17. 一種刺激個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如請求項16之醫藥組合物。
  18. 如請求項17之方法，其中該個體具有腫瘤且刺激針對該腫瘤之免疫反應。
  19. 如請求項17之方法，其中該個體患有慢性病毒感染且刺激針對該病毒感染之免疫反應。
  20. 一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量 之如請求項16之醫藥組合物。
  21. 如請求項20之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、子宮癌/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、胃腸癌症、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌症、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。
  22. 一種治療慢性病毒感染之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如請求項16之醫藥組合物。
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