CN107922500A - 具有增强的激动剂活性的抗cd40抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与人CD40结合的激动性抗体或其抗原结合部分。这类抗体任选地包含对于FcγRIIb具有增强的特异性的Fc区。本发明还提供了通过将本发明的抗体施用需要所述抗体的受试者来治疗癌症或慢性感染的方法。

Description

具有增强的激动剂活性的抗CD40抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月4日提交的美国临时申请号62/303,838、于2015年11月9日提交的美国临时申请62/252,615以及于2015年6月29日提交的美国临时申请62/186,076的优先权，其公开内容全部通过提述并入本文。
背景技术
最近的研究揭示，可以使用调节患者对恶性或感染细胞的免疫应答的药剂来治疗人类癌症和慢性感染。参见例如Reck&Paz-Ares(2015)Semin.Oncol.42:402。人们基于激动性抗CD40抗体可能可以增强这种免疫应答的认识，已经尝试了使用激动性抗CD40抗体如CP-870893和dacetuzumab(SGN-40)等，来治疗癌症。参见例如Kirkwood等人(2012)CACancer J.Clin.62:309；Vanderheide&Glennie(2013)Clin.Cancer Res.19:1035。最近的小鼠实验揭示，具有增强的对于抑制性Fc受体FcγRIIb的特异性的抗CD40抗体具有增加的抗肿瘤功效。参见例如WO 2012/087928；Li&Ravetch(2011)Science 333:1030；Li&Ravetch(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci(USA)109:10966；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19:101；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。
需要改进的激动性抗人CD40抗体用于治疗人类受试者的癌症和慢性感染。与活化性Fc受体相比，这样的抗体将优选地对抑制性Fc受体FcγRIIb具有增强的特异性，并且将表现出增强的抗肿瘤和/或抗感染活性。
发明概述
本文提供了与人CD40(SEQ ID NO:1的成熟序列)特异性结合的分离的人源化鼠单克隆抗体，任选地具有修饰的Fc区，所述修饰的Fc区可增强与FcγRIIb受体结合的特异性。
在某些实施方案中，本发明涉及抗huCD40抗体或其抗原结合片段，其与以下抗体中的一种或多种抗体竞争结合、交叉阻断、或结合相同的表位：抗体12D6(SEQ ID NO:3和4)，5F11(SEQ ID NO:23和24)，8E8(SEQ ID NO:40和41)，5G7(SEQ ID NO:52和53)以及19G3(SEQ ID NO:58和59)，包括人或人源化抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗人CD40抗体或其抗原结合片段结合这样的表位，该表位包含或为选自下组的一个或多个序列：WGCLLTAVHPEPPTACRE(SEQ ID NO:1的残基11-28)(抗体12D6)，EPPTACREKQYLINS(SEQ ID NO:1的残基21-35)(抗体12D6、5G7和19G3)，以及ECLPCGESE(SEQ ID NO:1的残基58-66)(抗体5F11)。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，其中，重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，并且轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，所述序列至少部分源自与抗huCD40抗体12D6、5F11、8E8、5G7或19G3相同的小鼠种系V区基因区段和J区基因区段，如表3所示。具体而言，所述抗体可以包含源自与以下抗体相同的鼠类种系的CDR序列：抗体12D6(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-39_01和J区种系IGHJ4，并且轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ1)，抗体5F11(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-4_02和J区种系IGHJ3，并且轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK3-5_01和J区种系IGKJ5)，抗体8E8(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-80_01和J区种系IGHJ2，并且轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ2)，抗体5G7(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-18_01和J区种系IGHJ4，并且轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK10-96_01和J区种系IGKJ2)，或抗体19G3(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH5-9-4_01和J区种系IGHJ3，并且轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK1-117_01和J区种系IGKJ2)。
在不同实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，其中，重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，上述序列选自：抗体12D6-03的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:5的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:6的残基24-39、55-61和94-102；抗体12D6-22的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:7的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；抗体10D6-23的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:11的残基24-39、55-61和94-102；抗体12D6-24的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；抗体5F11-17的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:25的残基31-35、50-66和99-106，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:26的残基24-38、54-60和93-101；抗体5F11-23的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:27的残基31-35、50-66和99-106，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28的残基24-38、54-60和93-101；抗体5F11-45的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:29的残基31-35、50-66和99-106，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:30的残基24-38、54-60和93-101；抗体8E8-56的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:43的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-62的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:45的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-67的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:46的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:47的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-70的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:48的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:49的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-71的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:50的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:51的残基24-39、55-61和94-102；抗体5G7-22的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:54的残基31-35、50-66和99-102，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:55的残基24-34、50-56和89-97；抗体5G7-25的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:56的残基31-35、50-66和99-102，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:57的残基24-34、50-56和89-97；抗体19G3-11的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:60的残基31-35、50-66和99-101，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:62的残基24-39、55-61和94-102；以及抗体19G3-22的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:63的残基31-35、50-66和99-101，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:64的残基24-39、55-61和94-102。
在不同实施方案中，本发明的抗体包含这样的重链，该重链包含选自下组的可变结构域：D6(SEQ ID NO:3的残基1-119)，5F11(SEQ ID NO:23的残基1-117)，8E8(SEQ IDNO:40的残基1-122)，5G7(SEQ ID NO:52的残基1-113)以及19G3(SEQ ID NO:58的残基1-112)，其中恒定区包含选自下组的FcγRIIb特异性Fc区：IgG1f(SEQ ID NO:65)，SE(SEQ IDNO:66)，SELF(SEQ ID NO:67)，P238D(SEQ ID NO:68)，V4(SEQ ID NO:69)，V4 D270E(SEQID NO:70)，V7(SEQ ID NO:71)，V8(SEQ ID NO:72)，V9(SEQ ID NO:73)，V9 D270E(SEQ IDNO:74)，V11(SEQ ID NO:75)，以及V12(SEQ ID NO:76)。
在一些实施方案中，抗体包括选自下组的具体重链可变结构域和轻链可变结构域：12D6-03(分别是SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的残基1-119和1-112)，12D6-22(分别是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112)，12D6-23(分别是SEQ ID NO:10和SEQID NO:11的残基1-119和1-112)，12D6-24(分别是SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112)，5F11-17(分别是SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的残基1-117和1-111)，5F11-23(分别是SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的残基1-117和1-111)，5F11-45(分别是SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30的残基1-117和1-111)，8E8-56(分别是SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的残基1-122和1-112)，8E8-62(分别是SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的残基1-122和1-112)，8E8-67(分别是SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的残基1-122和1-112)，8E8-70(SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49的残基1-122和1-112)，8E8-71(分别是SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的残基1-122和1-112)，5G7-22(分别是SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的残基1-113和1-107)，5G7-25(分别是SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的残基1-113和1-107)，19G3-11(分别是SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的残基1-112和1-112)，以及9G3-22(分别是SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的残基1-112和1-112)。这些抗体中的任一者可以进一步包含这样的重链恒定区，所述重链恒定区包含FcγRIIb特异性Fc区，所述重链恒定区选自：IgG1f(SEQ IDNO:65)，SE(SEQ ID NO:66)，SELF(SEQ ID NO:67)，P238D(SEQ ID NO:68)，V4(SEQ ID NO:69)，V4 D270E(SEQ ID NO:70)，V7(SEQ ID NO:71)，V8(SEQ ID NO:72)，V9(SEQ ID NO:73)，V9 D270E(SEQ ID NO:74)，V11(SEQ ID NO:75)，以及V12(SEQ ID NO:76)。这些抗体中的任一者可以进一步包含SEQ ID NO:77的轻链κ恒定区。
在具体的实施方案中，本发明的抗体包含人源化12D6-24抗体或人源化5F11-45抗体，所述人源化12D6-24抗体包含SEQ ID NO:9的轻链和选自SEQ ID NO:13-22中的任一项的重链，所述人源化5F11-45抗体包含SEQ ID NO:30的轻链和选自SEQ ID NO:31-39中的任一项的重链。具体的抗体包括12D6-24 SE(SEQ ID NO:9和14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NO:9和15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NO:9和13)、12D6-24 V4(SEQ ID NO:9和16)、12D6-24 V4D270E(SEQ ID NO:9和17)、12D6-24 V8(SEQ ID NO:9和18)、12D6-24 V9(SEQ ID NO:9和19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO:9和20)、12D6-24 V11(SEQ ID NO:9和21)、12D6-24V12(SEQ ID NO:9和22)、5F11-45 SE(SEQ ID NO:30和31)、5F11-45 SELF(SEQ ID NO:30和32)、5F11-45 V4(SEQ ID NO:30和33)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NO:30和34)、5F11-45V8(SEQ ID NO:30和35)、5F11-45 V9(SEQ ID NO:30和36)、5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO:30和37)、5F11-45 V11(SEQ ID NO:30和38)、以及5F11-45 V12(SEQ ID NO:30和39)，其中给出的分别为轻链和重链序列。
在另外的实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含与以下各项的重链和轻链共享至少80％、85％、90％和95％序列同一性的重链和轻链：12D6-24 SE(SEQ ID NO:9和14)，12D6-24 SELF(SEQ ID NO:9和15)，12D6-24 P238D(SEQ ID NO:9和13)，12D6-24 V4(SEQID NO:9和16)，12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO:9和17)，12D6-24 V8(SEQ ID NO:9和18)，12D6-24 V9(SEQ ID NO:9和19)，12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO:9和20)，12D6-24 V11(SEQID NO:9和21)，12D6-24 V12(SEQ ID NO:9和22)，5F11-45 SE(SEQ ID NO:30和31)，5F11-45 SELF(SEQ ID NO:30和32)，5F11-45 V4(SEQ ID NO:30和33)，5F11-45 V4 D270E(SEQID NO:30和34)，5F11-45 V8(SEQ ID NO:30和35)，5F11-45 V9(SEQ ID NO:30和36)，5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO:30和37)，5F11-45 V11(SEQ ID NO:30和38)，或5F11-45 V12(SEQID NO:30和39)。
在又另外的实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包括主要由以下重链和轻链序列组成的重链和轻链：12D6-24 SE(SEQ ID NO:9和14)，12D6-24 SELF(SEQ ID NO:9和15)，12D6-24 P238D(SEQ ID NO:9和13)，12D6-24 V4(SEQ ID NO:9和16)，12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO:9和17)，12D6-24 V8(SEQ ID NO:9和18)，12D6-24 V9(SEQ ID NO:9和19)，12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NO:9和20)，12D6-24 V11(SEQ ID NO:9和21)，12D6-24 V12(SEQ ID NO:9和22)，5F11-45 SE(SEQ ID NO:30和31)，5F11-45 SELF(SEQ ID NO:30和32)，5F11-45 V4(SEQ ID NO:30和33)，5F11-45V4 D270E(SEQ ID NO:30和34)，5F11-45 V8(SEQ ID NO:30和35)，5F11-45 V9(SEQ ID NO:30和36)，5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NO:30和37)，5F11-45 V11(SEQ ID NO:30和38)，或5F11-45 V12(SEQ ID NO:30和39)。
在一些实施方案中，包含V4或V9Fc序列变体的本发明的抗huCD40抗体进一步包含D270E序列变体。这样的抗体包括人源化12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NO:9和17)、12D6-24V9 D270E(SEQ ID NO:9和20)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NO:30和34)以及5F11-45 V9D270E(SEQ ID NO:30和37)，其中给出的分别为重链和轻链的序列。在替代的实施方案中，本发明的抗人CD40抗体包括这样的抗体：其包含基本上由这些重链和轻链的序列组成的重链和轻链，或者包含与这些序列共享至少80％、85％、90％和95％序列同一性的重链和轻链。在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含修饰的Fc区，所述修饰的Fc区结合FcγRIIb的特异性(相对于结合活化性受体)高于具有天然存在的Fc区的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体的A/I比率小于5，并且在优选的实施方案中小于1。
在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含一个或多个重链和一个或多个轻链，如两个重链和两个轻链。
本发明进一步提供编码本发明抗CD40抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可变区的核酸、包含所述核酸分子的表达载体、用所述表达载体转化的细胞、以及通过从用表达载体转化的细胞中表达抗体并回收抗体来生产抗体的方法。
本发明还提供了包含本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段和载体的药物组合物。
本发明提供了增强受试者的免疫应答的方法，包括给受试者施用有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得受试者的免疫应答增强。在某些实施方案中，受试者患有肿瘤，并且针对所述肿瘤的免疫应答增强。在另一个实施方案中，受试者有病毒感染(例如慢性病毒感染)，并且抗病毒免疫应答增强。
本发明还提供了抑制受试者体内的肿瘤生长的方法，包括给受试者施用本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得肿瘤的生长受到抑制。
本发明进一步提供了例如通过免疫疗法治疗癌症的方法，包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段(例如药物组合物)，由此治疗癌症。在某些实施方案中，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫癌/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、以及病毒相关癌症。在某些实施方案中，癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
在某些实施方案中，本文所述的调节免疫功能的方法和治疗方法包括施用本发明的抗huCD40抗体与一种或多种其他治疗剂的组合，或者施用作为与一种或多种其他治疗剂的双特异性试剂的本发明的抗huCD40抗体，所述其他治疗剂例如，抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗CD137抗体、抗CD27抗体、抗CSF-1R抗体、抗CTLA-4抗体、TLR激动剂、或小分子IDO或TGFβ拮抗剂。在具体的实施方案中，抗huCD40疗法与抗PD1和/或抗PD-L1疗法(例如，用与人PD1结合的抗体或其抗原结合片段或用与人PD-L1结合的抗体或其抗原结合片段进行治疗)组合。
附图简要说明
图1示出了人IgG1f恒定结构域的序列(SEQ ID NO:65)，重编号为118-446以更好地展示本文公开的Fc序列变体(表4)。被改变的残基用粗体表示，在残基下方以粗体表示改变后的氨基酸。D270E取代标有下划线。在图1和SEQ ID NO:65中，以及序列表中公开的所有其他重链和重链恒定结构域序列中均已经除去了C末端赖氨酸(K)残基。然而，在其他实施方案中，特别是在编码本发明的抗huCD40抗体的重链和重链恒定结构域的核酸构建体中，这些序列在蛋白质C-端包括额外的赖氨酸残基、或在核酸的3'端包含编码额外赖氨酸的核苷酸。
图2是展示人CD40上被本发明的抗体结合的表位基团(“箱”)以及阻断CD40L结合的维恩图。具有重叠的椭圆或圆圈的抗体竞争与人CD40结合，落入长方形的抗体阻断CD40L与人CD40结合。
图3A和图3B示出了激动性抗-CD40抗体对树突细胞的激活(以IL-6分泌来量度)随Fc序列的变化。参见实施例7。构建了一系列包含mAb12D6-24可变结构域和多种人IgG1f恒定区(包括IgG1f、SE、SELF、P238D、V4、V8、V9和V12变体)的抗体。图3A呈现了使用来自一个供体的细胞获得的数据，图3B呈现了使用来自另一不同供体的细胞获得的数据。
图4示出了激动性抗CD40抗体对细胞的激活(由细胞表面CD54来量度)随可变结构域序列的变化。参见实施例7。构建了一系列包含人IgG1f-V12恒定区和来自亲本(鼠)抗CD40mAb12D6、5G7、8E8、19G3和5F11的可变结构域的抗体。结果以中值荧光强度(MFI)随抗体浓度的变化来作图。
图5示出了本发明的各种抗体(包括具有D270取代的抗体)的FcγR结合百分比。参见实施例8。抗体名称包括“-sup”者表示抗体生成细胞的上清液，其他则是纯化的抗体。数据呈现为在ForteBio Octet系统中测量的每种抗体与受体组合的最大受体结合值的百分比。例如参见实施例3。每组三个条柱从左到右表示与hCD32a/FcγRIIa-H131(10μM)的结合(阴影线条柱)、与hCD32b/FcγRIIa-R131(10μM)的结合(黑色条柱)和与hCD32b/FcγRIIb(1μM)的结合(白色条柱)。
图6A和图6B分别示出了选定的本发明抗CD40抗体在表达人CD40和人Fcγ受体的转基因小鼠中对于T细胞激活和血小板计数变化的影响。参见实施例9。图6A示出了如所指示的选定的本发明抗CD40抗体治疗的动物体内的Tet-OVA反应性CD8+T细胞的百分比。图6B示出了在注射抗体24小时后的血小板计数，以治疗前血小板计数的百分比表示。各图的比较显示，活化水平与血小板计数减少相关，抗体12D6-V11表现出最高的活化，但是血小板计数的减小也是最大的。参见实施例9。
图6C示出了用MC38肿瘤细胞接种、并用抗-CD40 12D6-24和5F11-45克隆的Fc变体治疗的人源化CD40/FcγR小鼠的抗肿瘤应答。结果以平均值±SEM.n＝7(12D6-24)或6(5F11-45)呈现。参见实施例9。
图6D示出了对来自C中描述的实验中12D6-24组的无肿瘤小鼠皮下注射MC38细胞进行再挑战(re-challenge)，并追踪肿瘤生长。对照组由未受过处理的小鼠组成。结果以平均值±SEM呈现，n＝4。参见实施例9。
发明详述
本发明提供了与人CD40(“huCD40”)特异性结合并具有激动剂活性的分离的抗体，特别是单克隆抗体，例如人源化或人单克隆抗体。给出了多种人源化鼠抗huCD40单克隆抗体的序列。在某些实施方案中，本文描述的抗体源自特定的鼠类重链和轻链种系序列，和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。在其他实施方案中，所述抗体与本文给出序列的抗CD40抗体竞争CD40结合、或本文给出序列的抗CD40抗体结合CD40上相同的表位。在一些实施方案中，对重链Fc区的序列进行修饰以特异性地增强与FcγRIIb的结合。
本文进一步提供了制备此类抗体的方法、包含此类抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物和双特异性分子、以及配制成含有所述抗体或片段的药物组合物。本文还提供单独使用所述抗体或与其他免疫刺激剂(例如抗体)和/或癌症治疗或抗感染疗法组合使用所述抗体以增强免疫应答的方法。因此，本文所述的抗huCD40抗体可以在各种各样的治疗性应用(包括例如抑制肿瘤生长和治疗慢性病毒感染)的治疗中使用。
定义
为了更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。更多的定义在整个详细说明中列出。
CD40是指“TNF受体超家族成员5”(TNFRSF5)。除非另外指出或从上下文显而易见，否则本文提及的CD40是指人CD40(“huCD40”)，并且抗CD40抗体是指抗人CD40抗体。在GENEID NO:958和MIM(Mendelian Inheritance in Man):109535中对人CD40进行了进一步描述。人CD40的序列(NP_001241.1)，包括20个氨基酸信号序列，提供于SEQ ID NO:1。
CD40与CD40配体(CD40L)相互作用，CD40配体又名TNFSF5、gp39和CD154。除非另外指明或从上下文清楚可见，否则本文对CD40L提述是指人CD40L(“huCD40L”)。在GENE IDNO:959和MIM:300386中对人CD40L进行了进一步描述。人CD40L(NP_000065.1)的序列提供于SEQ ID NO:2。
除非另外指出或从上下文显而易见，否则本文所用的术语“抗体”可以包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合片段。每个重链由一个重链可变区(本文缩写为VH)和一个重链恒定区构成。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。在某些天然存在的抗体中，每个轻链由一个轻链可变区(本文缩写为VL)和一个轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域——CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插入有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个框架区(FR)构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因素(包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
抗体通常以高亲和力与其同源抗原特异性结合，表现为10-7至10-11M或更低的解离常数(KD)。通常认为大于约10-6M的任何KD都指示非特异性结合。如本文所使用的，与某种抗原“特异性结合”的抗体是指以高亲和力结合至该抗原和与之基本上相同的抗原的抗体，这意味着KD为10-7M或更小，优选地10-8M或更小，甚至更优选地5×10-9M或更小，最优选地在10-8M与10-10M之间或更小，但不以高亲和力与无关抗原结合。如果某种抗原表现出与给定抗原具有高度的序列同一性(例如，如果其表现出与该给定抗原的序列具有至少80％、至少90％、优选地至少95％、更优选地至少97％、甚至更优选地至少99％的序列同一性)，则该抗原与该给定抗原“基本上相同”。通过举例，与人CD40特异性结合的抗体也可能与来自某些非人灵长类物种(例如食蟹猴)的CD40交叉反应，但可能不与来自其他物种的CD40或CD40以外的抗原交叉反应。
除非另外指明，免疫球蛋白可以来自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。在某些物种中IgG同种型被划分为亚类：人类中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如人IgG1)，以几种同种异型存在，它们之间至多有几个氨基酸不同。除非另外指明，否则本发明的抗体包含IgG1f恒定结构域(SEQ ID NO:65)。除非另外指明，否则“抗体”可以例如包括：单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人抗体和非人抗体；完全合成抗体；以及单链抗体。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的保留与抗原(例如人CD40)特异性结合的能力的一个或多个片段。术语抗体的“抗原结合部分/片段”内涵盖的抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL结构域、VH结构域、CL结构域、以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包括两个由绞链区的二硫桥键连接的Fab'片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iv)由抗体的单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；以及(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)。分离的互补决定区(CDR)或由合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合，如果能结合抗原的话，可以构成抗体的抗原结合结构域。
单链抗体构建体也包括在本发明中。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是它们可以使用重组方法通过合成接头来把它们接合起来，该合成接头使它们能够被制备为单一蛋白链，其中VL区和VH区配对以便形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”内。在Chan&Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10:301中描述了这些和其他可能的构建体。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式来筛选这些片段的效用。抗原结合部分/片段可以通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。
除非另外指明，则当结合抗体使用时(比如在权利要求书中)，词语“片段”是指抗体的抗原结合片段，使得“抗体或片段”与“抗体或其抗原结合片段”具有相同的含义。
“双特异性的”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对的人工杂交抗体，产生对不同抗原具有特异性的两个抗原结合位点。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai&Lachmann,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等人，(1992)J.Immunol.148，1547-1553。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体，或者指抗体的组合物，其中所有抗体都显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。典型地，这样的单克隆抗体将会源自单个细胞或编码抗体的核酸，并且将会进行增殖而不会有意地引入任何序列改变。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区、以及任选的恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，杂交瘤例如是通过将获自转基因或转染色体非人类动物(例如具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)与无限增殖化细胞进行融合而获得的。
如本文所使用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，比如：(a)从人免疫球蛋白基因的转基因的或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，以及(d)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段来制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体包含利用由种系基因编码的特定人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区，但是包括随后的(例如在抗体成熟期间发生的)重排和突变。如本领域已知的(参见例如Lonberg(2005)NatureBiotech.23(9)：1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，抗原结合结构域由多种基因编码，该多种基因重排以形成对外来抗原具有特异性的抗体。除了重排之外，可以通过多个单氨基酸改变(称为体细胞突变或超突变)来进一步修饰可变区以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将会进一步响应于抗原而改变(即同种型转换)。因此，在响应于抗原经过重排和体细胞突变后，编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的核酸序列可能与原始种系序列不相同，而是实质上相同或相似(即具有至少80％的同一性)。
“人”抗体(HuMAb)是指可变区中的框架区和CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也源自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(比如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体是同义使用的。
“人源化”抗体是指这样的抗体，其中非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR结构域以外的一些、大部分或全部氨基酸都被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域以外的一些、大部分或全部氨基酸都已经被源自人免疫球蛋白的氨基酸置换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸都未改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们不会消除抗体与特定抗原结合的能力即可。“人源化”抗体保留了与原始抗体类似的抗原特异性。
“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种且恒定区源自另一物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体且恒定区源自人抗体的抗体。“杂交”抗体是指具有不同类型的重链和轻链的抗体，比如小鼠(亲本)重链和人源化轻链，或反之亦然。
如本文所使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
“同种异型”是指特定同种型组内的天然存在的变体，这些变体在一个或几个氨基酸中是不同的。参见例如Jefferis等人(2009)mAbs 1:1。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
如在此使用的，“分离的抗体”是指该抗体基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性地结合CD40的分离的抗体基本上不含特异性地结合不同于CD40的抗原的抗体)。然而，与CD40的表位特异性结合的分离的抗体可能与来自不同物种的其他CD40蛋白具有交叉反应性。
源自抗体Fc区与某些Fc受体相互作用的“效应子功能”包括但不一定限于C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能(比如ADCC和抗体依赖的细胞介导的吞噬作用，ADCP)以及细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)的下调。此类效应子功能通常需要将Fc区与抗原结合结构域(例如抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包括FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种活化性受体(小鼠的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人类的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIb或等同的FcγRIIB)组成。在表1中总结了人FcγR的各种性质。大多数先天性效应细胞类型共同表达一种或多种活化性FcγR和抑制性FcγRIIb，而自然杀伤(NK)细胞选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠的FcγRIII和人类的FcγRIIIA)，但是不表达小鼠或人类的抑制性FcγRIIb。人IgG1与大多数人Fc受体结合，并且就其结合的活化性Fc受体的类型而言被认为等同于鼠IgG2a。
表1
人FcγR的特性
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”是指介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合的抗体的重链的C末端区域，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)结合。因此，Fc区包含将第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1或CL)排除在外的抗体恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，在每个抗体的两条重链中，Fc区包含CH2和CH3恒定结构域；在每条多肽链中，IgM和IgE Fc区包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从C226或P230位置的氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基末端，其中，根据如Kabat中的EU索引进行编号：Kabat等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesd，MD；还可参见美国公开专利申请号2008/0248028的图3c-3f。人IgG Fc区的CH2结构域从氨基酸231周围延伸至氨基酸340周围，而CH3结构域定位在Fc区中CH2结构域的C端侧，即其从IgG(包括C末端赖氨酸)的氨基酸341周围到氨基酸447周围。如本文所使用的，Fc区可以是天然序列Fc(包括任何同种异型变体)或变体Fc(例如非天然存在的Fc)。Fc还可以指在分离的情况下或在包含Fc的蛋白质多肽(比如“包含Fc区的结合蛋白”，也称为“Fc融合蛋白”，例如抗体或免疫粘附素)的情况下的区域。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括：天然序列人IgG1Fc区；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；以及天然序列人IgG4Fc区及其天然存在的变体。天然序列Fc包括各种同种异型的Fc。参见例如Jefferis等人(2009)mAbs 1:1。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原(例如huCD40)上的位点。蛋白质抗原内的表位可以由连续的氨基酸形成(通常是线性表位)或由通过蛋白质的三级折叠而并置的不连续氨基酸形成(通常是构象性表位)。由连续氨基酸形成的表位通常是但不总是在暴露于变性溶剂时被保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位典型地在独特的空间构象中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
术语“表位定位”是指鉴定抗原上参与抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。用于确定给定抗体与哪些表位结合的方法是本领域熟知的，并且例如包括：免疫印迹法和免疫沉淀法测定，其中，测试(例如来自CD40)的重叠或连续肽与给定抗体(例如抗CD40抗体)的反应性；X线衍射晶体分析法；二维核磁共振；酵母展示(参见实施例6)；以及HDX-MS(参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods，Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris编辑(1996))(参见实例5)。
术语“结合相同的表位”，就两种或更多种抗体而言，是指抗体与相同的氨基酸残基片段结合，如通过给定方法所确定的。用于确定抗体是否与本文所述的抗体结合“CD40上的相同表位”的技术包括例如表位定位方法，比如提供了表位的原子解析的抗原-抗体复合物晶体的X-射线分析，以及氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段(例如蛋白水解片段)的结合或与抗原的突变变体的结合，其中由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰引起的结合丧失通常被认为是表位组分的指示，如丙氨酸扫描诱变法(Cunningham&Wells(1985)Science 244:1081)或突变靶序列变体的酵母展示(参见实施例6)。另外，还可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。预期具有相同的或紧密相关的VH和VL或具有相同的CDR序列的抗体与相同的表位结合。
“与另一种抗体竞争结合靶标”的抗体是指(部分地或完全地)抑制另一种抗体与靶标结合的抗体。两种抗体是否相互竞争与靶标结合(即一种抗体是否以及以何种程度抑制另一种抗体与靶标的结合)可以使用已知的竞争实验来确定。在某些实施方案中，抗体竞争、并抑制另一种抗体与靶标结合达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可能是不同的，取决于哪种抗体是“阻断抗体”(即首先与靶标温育的冷抗体)。竞争测定可以如以下所述来进行：例如，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harb.Protoc.；2006；doi：10.1101/pdb.prot4277或第11章“UsingAntibodies”，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY,(USA)1999。竞争抗体与相同表位、重叠的表位或相邻的表位结合(例如由空间位阻证明)。
其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见Stahli等(1983)Methods in Enzymology 9:242)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等(1986)J.Immunol.137:3614)；固相直接标记的测定法，固相直接标记的夹心测定(参见Harlow和Lane(1988)，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等(1988)Mol.Immunol.25(1)：7)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等(1990)Virology 176:546)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等(1990)Scand.J.Immunol.32:77)。
如本文所使用的术语“特异性结合”和“选择性地结合(selectively binds)”是指抗体与预定抗原上的表位结合但不与其他抗原结合。通常，抗体(i)当例如在使用预定抗原(例如重组人CD40)作为分析物、抗体作为配体的2000表面等离子共振仪中通过表面等离振子共振(SPR)技术、或通过抗体与抗原结合的Scatchard分析进行测定时，结合的平衡解离常数(KD)是大约小于10-7M，比如大约小于10-8M、10-9M或10-10M、甚至更低，并且(ii)与预定抗原结合，其亲和力比与除所述预定抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少大两倍。因此，“与人CD40特异性结合”的抗体是指与可溶性的或结合细胞的人CD40结合的抗体，其KD是10-7M或更小，例如小于10-8M、10-9M或10-10M、甚至更低。“与食蟹猴CD40交叉反应”的抗体是指与食蟹猴CD40结合的抗体，其KD是10-7M或更低，比如大约小于10-8M、10-9M或10-10M、甚至更低。
如本文所使用的术语“kassoc”或“KA”是指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，而如本文所使用的术语“kdis”或“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如本文所使用的术语“KD”是指从KD与KA之比(即KD/KA)获得的平衡解离常数，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域中确立的方法来确定。用于确定的抗体的KD的优选方法是：生物膜层干涉技术(BLI)分析(优选地使用ForteBio Octet RED装置，参见实例3)，表面等离子体共振(优选地使用生物传感器系统，比如表面等离子体共振系统，见实例4)，或流式细胞术和Scatchard分析。
在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内测定的情况下，术语“EC50”是指诱导最大应答的50％的应答(即在最大应答与基线之间的一半)的抗体或其抗原结合片段的浓度。
术语“与固定化的CD40结合”是指本文描述的抗体与CD40结合的能力，例如，在细胞表面表达或附接至固体支持物。
如本文所使用的术语“交叉反应”是指本文所述的抗体与来自不同物种的CD40结合的能力。例如，本文所述的与人CD40结合的抗体还可以与来自另一物种(例如，食蟹猴CD40)的CD40结合。如本文所使用的，交叉反应性可以通过在结合测定(例如SPR、ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性、或检测与生理性表达CD40的细胞的结合或功能性相互作用来进行测量。用于测定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如通过使用2000SPR仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)的表面等离子体共振(SPR)分析、或流式细胞术技术。
如本文所使用的术语“天然存在的”所应用的物体是指可以在自然界中找到的物体。例如，可以从自然界的来源中分离出、并且尚未由人类在实验室中有意地进行修饰的在有机体(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是自然发生的。
“多肽”是指包含至少两个连续地连接的氨基酸残基的链，对链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。
如本文所使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cDNA。
还提供了对本文提供的抗体序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码的抗体或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。例如，可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，比如定点诱变和PCR介导的诱变。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。在本领域中已经限定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下项的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗CD40抗体中预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基置换。鉴定没有消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中熟知的。参见例如Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；以及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)94:412-417(1997)。
可替代地，在另一个实施方案中，可以沿全部或部分抗CD40抗体编码序列随机引入突变，比如通过饱和诱变，并且可以对得到的经修饰的抗CD40抗体进行筛选以改善结合活性。
对于核酸而言，术语“实质性的同源性”表示两个核酸或其指定的序列在最佳比对和比较时是完全相同的，在至少约80％、通常是至少约90％至95％、更优选地是至少约98％至99.5％的核苷酸中具有合适的核苷酸插入或缺失。可替代地，当这些片段与链的互补序列在选择性杂交条件下杂交时，存在实质性的同源性。
对于多肽而言，术语“实质性的同源性”表示两个多肽或其指定的序列在最佳比对和比较时是完全相同的，在至少约80％、通常是至少约90％至95％、更优选地是至少约98％至99.5％的氨基酸中具有合适的氨基酸插入或缺失。
两个序列之间的百分比同一性是当对序列进行最佳比对时(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)的函数，最佳比对的确定考虑到空位的数量、以及每个空位的长度，这需要引入两个序列的最佳比对。两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性实例中所述。
两个核苷酸序列间的百分比同一性可以使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller算法，CABIOS4:11-17(1989)，其已经结合到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法来确定，所述算法已经整合到使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、并且空隙权重为16、14、12、10、8、6或4且长度权重为1、2、3、4、5或6的GCG软件的GAP程序包中。
本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如鉴定相关序列。这样的搜索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来执行。可以用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与在此所述核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本文所述的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的空位BLAST程序。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如，NBLAST和XBLAST)的默认参数。
核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式中。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCl条带，柱色谱，琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其他)从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分)或蛋白质)纯化时，核酸是“分离的”或“呈现为基本上纯的”。参见F.Ausubel等人编辑的CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
本文使用的术语“载体”是指能够转运它所连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以向其中连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以被连入病毒基因组。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并且因此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与之可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般来说，在重组DNA技术中实用的常见表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括的是提供等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意在是指包含天然不存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是已经引入了重组表达载体的细胞。应当理解，这样的术语不仅意指特定的主题细胞，还意指此类细胞的后代。由于在后续世代中突变或环境影响可能发生一些修饰，事实上这样的后代可能与亲代细胞不完全相同，但是仍然包括在这里使用的术语“宿主细胞”的范围内。
“免疫应答”是指脊椎动物体内针对外源药剂的生物学反应，其反应保护生物体对抗这些药剂以及由这些药剂引起的疾病。免疫应答是由免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)以及由这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用来介导的，其导致选择性靶向、结合、损伤、破坏被病原体感染的细胞或组织、癌性的或其他异常细胞、或者在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常的人类细胞或组织、和/或将其从病原体侵入的脊椎动物体内消除。免疫反应例如包括激活或抑制T细胞，例如效应T细胞或Th细胞，比如CD4+或CD8+T细胞，或抑制或消耗Treg细胞。“效应性T”(“Teff”)细胞是指具有细胞溶解活性的T细胞(例如CD4+和CD8+T细胞)以及分泌细胞因子并激活和引导其他免疫细胞的辅助性T(Th)细胞，但是不包括调节性T细胞(Treg细胞)。
如本文所使用的术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞介导的应答，T细胞包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)。T细胞介导的应答例如包括T细胞的细胞毒性和增殖。
如本文所使用的术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
“免疫调制剂(免疫调制剂)”或“免疫调节剂(immunoregulator)”是指可以参与对免疫应答的调制、调节或修饰的药剂(例如信号传导途径的组分)。对免疫应答进行“调制”、“调节”或“修饰”是指免疫系统的细胞或这种细胞(例如效应T细胞)的活性的任何改变。这种调制包括免疫系统的刺激或抑制，这可以通过各种细胞类型的数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或减少或免疫系统内可能发生的任何其他变化来表现。已经鉴定了抑制性和刺激性免疫调制剂，其中一些可能在肿瘤微环境中具有增强的功能。在优选的实施方案中，免疫调制剂位于T细胞的表面上。“免疫调制靶标”或“免疫调节靶标”是通过物质、药剂、部分、化合物或分子的结合而靶向或其活性通过所述结合而改变。免疫调制靶标例如包括细胞表面上的受体(“免疫调制性受体”)和受体配体(“免疫调制性配体”)。
“免疫疗法”是指通过包括对免疫应答进行诱导、增强、抑制或修饰的方法来治疗罹患疾病或有风险遭遇或患有疾病复发的受试者。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指导致增加(诱导或增强)受试者的免疫应答以例如治疗癌症的疗法。
“增强内源性免疫应答”是指增加受试者的现有的免疫应答的有效性或效力。例如可以通过克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源宿主免疫应答的机制来实现这种有效性和效力的增加。
如本文所使用的术语“连接”是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(即重组融合的)。这样的连接可以使用多种本领域公认的技术来实现，比如化学缀合和重组蛋白的产生。
如本文所使用的“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的抗体的优选的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊髓或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的短语“肠胃外施用”意指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可替代地，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径施用，比如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。还可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内执行给药。
如本文所使用的术语“抑制”或“阻断”可以互换使用，并且包括至少约50％(例如至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)的部分和完全抑制/阻断。
如本文所使用的，“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的一大类疾病。不受调节的细胞分裂可能导致形成恶性肿瘤或侵入邻近组织的细胞，并且可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部位。
如本文所使用的术语“治疗”是指对受试者进行的任何类型的干预或过程或给受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生化指标的进展、发展、严重性或复发。预防是指对没有疾病的受试者施用，以防止疾病发生或在发生时尽量减小其效应。
术语“有效量(effective dose)”或“有效剂量(effective dosage)”被定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量(therapeuticallyeffective amount)”或“治疗有效剂量(therapeutically effective dosage)”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量(prophylactically effective amount)”或“预防有效剂量(prophylactically effective dosage)”是当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。
举例而言，抗癌剂是减缓癌症进展或促进癌症消退的药物。在优选的实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”是指单独或与抗肿瘤剂联合施用有效量的药物而导致肿瘤的生长或大小减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频度和持续时间增加、预防由于罹患疾病而引起的损伤或残疾、或患者的疾病症状的缓解。药理学有效性是指药物促进患者癌症消退的能力。生理学安全性是指由所施用药物在细胞、器官和/或生物体层面上造成的可接受的低度毒性或其他不良生理学作用(副作用)。
举例而言，对于肿瘤的治疗，药物的治疗有效量或剂量优选地抑制细胞生长或肿瘤生长，相对于未治疗的受试者抑制至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，并且还更优选地至少约80％。在最优选的实施方案中，药物的治疗有效量或剂量完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即优选地100％地抑制细胞生长或肿瘤生长。化合物抑制肿瘤生长的能力可以使用下文所述的测定来评估。治疗后可能不会立即发生对肿瘤生长的抑制，并且可能仅在一段时间后或在重复施用之后发生。可替代地，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评估组合物的这种性质，这种抑制可以通过本领域技术人员已知的测定而在体外进行测量。在本文所述的其他优选实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且可以持续至少约20天，更优选地至少约40天，甚至更优选地至少约60天。
除非从上下文中另外明确，否则如本文所使用的“组合”疗法意味着包括以协作方式施用两种或更多种治疗剂，并且包括但不限于同时施用。具体而言，组合疗法包括共同施用(例如施用共配制剂或同时施用分开的治疗性组合物)和连续或顺序施用，条件是一种治疗剂的施用以某种方式以另一种治疗剂的施用为条件。例如，一种治疗剂只有在施用不同的治疗剂并使其在规定的时间内起作用之后才能施用。参见例如Kohrt等人(2011)Blood117:2423。
术语“患者”和“受试者”是指任何接受预防性或治疗性治疗的人。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗患有癌症的受试者。
在下面的小节中对本文描述的各个方面进行了进一步的详细描述。
I.抗CD40L抗体
本申请公开了具有所期望的性质的激动性抗huCD40抗体用作治疗疾病(比如癌症)的治疗剂。这些性质包括以下各项中的一种或多种：以高亲和力与人CD40结合的能力，在人类受试者中可接受的低免疫原性，优先结合FcγRIIb的能力，以及不存在可能降低抗体化学稳定性的序列缺陷。
本文公开的抗CD40抗体通过序列与人CD40上的特异性表位结合，如可如实施例5和6中所述进行测定。与相同的或紧密相关的表位结合的其他抗体可能会共享这些所期望的性质，并且可能通过竞争实验而被发现。
与本文公开的抗huCD40抗体竞争的抗huCD40抗体
与本发明的抗体竞争结合huCD40的抗huCD40抗体可以使用类似于本文所述的免疫方案(实施例1和2)来产生。通过序列与本文公开的抗huCD40抗体竞争结合的抗体还可以通过使用人CD40或包含其胞外结构域的构建体(SEQ ID NO:1的残基21-193)免疫小鼠或其他非人类动物、或通过使用包含本文公开的抗huCD40抗体所结合的表位的人CD40的片段进行免疫来产生。对所得到的抗体可以通过本领域熟知的方法来筛选其阻断12D6、5F11、8E8、5G7和/或19G3与人CD40结合的能力，所述方法例如是在ELISA中阻断与CD40的细胞外结构域和免疫球蛋白Fc结构域的融合蛋白的结合、或例如FACS阻断与其表面上表达huCD40的细胞结合的能力。在不同实施方案中，在添加12D6、5F11、8E8、5G7或19G3之前、同时或之后，使测试抗体与CD40-Fc融合蛋白(或在其表面上表达huCD40的细胞)接触。例如，可以进行“分箱”实验(实施例4)以确定测试抗体是否通过序列落入与本文公开的抗体相同的“箱”中，其中本文中通过序列公开的抗体为“参考”抗体、并且将要进行测试的抗体为“测试”抗体。降低本文公开的抗体与人CD40(以Fc融合或在细胞上)通过序列结合的抗体可能在相同的、重叠的或相邻的表位处结合，特别是在大致化学计量浓度下，并且因而可能共享12D6、5F11、8E8、5G7或19G3的理想功能特性。
因此，本文提供了抗huCD40抗体，所述抗huCD40抗体抑制本文所述的抗huCD40抗体与细胞上的huCD40结合达至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，和/或其与细胞上的huCD40的结合受到本文所述的抗huCD40抗体的抑制达至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，例如通过ELISA或FACS进行测量，比如通过使用以下段落中所述的测定法。
确定测试抗体是否阻断参考抗体(即“与其竞争”)的示例性竞争实验可以如下进行：将表达CD40的细胞以每个样品孔105个细胞接种在96孔板中。将板置于冰上，然后加入浓度在从0μg/mL至50μg/mL的范围内的未缀合的测试抗体(从最高浓度50μg/mL开始三倍滴定)。可以使用不相关的IgG作为第一抗体的同种型对照，并且以相同的浓度添加(从最高浓度50μg/mL开始三倍滴定)。可以包括用50μg/mL未标记的参考抗体预温育的样品作为完全阻断(100％抑制)的阳性对照，并且在初次温育中没有抗体的样品可以用作阴性对照(无竞争；0％抑制)。温育30min后，以每孔2μg/mL的浓度加入标记的(例如生物素化的)参考抗体而不洗涤。样品在冰上再温育30分钟。通过用FACS缓冲液洗涤细胞来除去未结合的抗体。用检测标记物的试剂来检测细胞结合的标记参考抗体，例如用于检测生物素的缀合有PE的链霉亲和素(Invitrogen，目录号S21388)。在FACS Calibur流式细胞仪(BD，San Jose)上采集样品，并用Flowjo软件(Tree Star，Inc，Ashland，OR)进行分析。结果可以表示为％抑制。
通常，然后以相反的方式进行相同的实验，即测试抗体是参考抗体、并且参考抗体是测试抗体。在某些实施方案中，抗体至少部分地(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或完全地(100％)阻断另一种抗体与靶标的结合，例如人CD40或其片段，并且无论当一种或另一种抗体是参照抗体时是否发生了抑制。当在两种方式(即在首先加入参考抗体的竞争性实验以及首先加入测试抗体的竞争性实验)下抗体彼此竞争时，参考抗体和测试抗体彼此“交叉阻断”与靶标的结合。
如果抗huCD40抗体当以大致相等的浓度存在时(例如50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如在如实施例4中描述的竞争性实验中)抑制12D6、5F11、8E8、5G7和/或19G3与人CD40的结合达至少10％、20％、30％、40％、40％或更多，则认为抗huCD40抗体与本文公开的抗huCD40抗体竞争。除非另外指明，否则如果抗体当以大致相等的摩尔浓度使用时以至少减少所选择的抗体与人CD40(SEQ ID NO:1)的结合达至少20％(如在前两个段落中所描述的竞争性ELISA实验中所测量的)，则认为所述抗体与选自由本发明的抗CD40抗体组成的组中的抗体竞争。
与相同表位结合的抗huCD40抗体
与本文公开的抗体结合相同或相似表位的抗huCD40抗体可以使用与本文所述那些相似的免疫方案(实施例1和2)来产生。可以筛选所得抗体而用于与人CD40的高亲和力结合(实施例3)。然后可以在酵母展示测定中或通过氢-氘交换实验(实施例5)研究所选择的抗体，以确定抗体所结合的精确表位，在酵母展示中huCD40的序列变体呈递在酵母细胞的表面上(实施例6)。
可以通过本领域已知的任何方法进行表位测定。在不同实施方案中，在以下条件下认为抗huCD40抗体与本文公开的抗huCD40mAb结合相同的表位：如果它们与huCD40的至少一个区域内的一个或多个相同残基接触；如果它们与huCD40的至少一个区域内的大部分残基接触；如果它们与huCD40的每个区域内的大部分残基接触；如果它们与huCD40的整个长度上的大多数触点接触；如果它们在人CD40的所有相同的独特区域内进行接触；如果抗huCD40抗体与人CD40上任何一个区域处的所有残基接触；或者如果它们与所有相同区域的所有相同的残基接触。表位“区”是沿一级序列的残基簇。
用于确定抗体是否与本文所述的抗体结合“huCD40上的相同表位”的技术包括提供了表位的原子解析的抗原-抗体复合物晶体的X-射线分析。其他方法监测抗体与抗原片段的结合或抗原的突变变体，其中由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰引起的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。方法还可以依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中或从靶蛋白的蛋白酶消化物中亲和分离特定短肽(天然三维形式或变性形式)的能力。然后将肽视为与用于筛选肽文库的抗体对应的表位的定义的先导物。对于表位定位，也已开发了计算算法，已经证明它们能够定位构象不连续的表位。
包含所述表位的表位或区域也可以通过筛选与一系列跨CD40的重叠肽结合来进行鉴定。可替代地，Jespers等人的方法(1994)Biotechnology 12:899可以用于指导选择具有与本文所述的抗CD40抗体相同的表位且因此具有相似性质的抗体。使用噬菌体展示，首先将抗CD40抗体的重链与(优选地是人的)轻链库配对以选择CD40结合抗体，然后将新的轻链与(优选地是人的)重链库配对以选择具有与本文所述的抗huCD40抗体相同的表位或表位区的(优选地是人的)CD40结合抗体。可替代地，本文所述的抗体的变体可以通过对编码抗体重链和轻链的cDNA进行诱变而获得。
如Cunningham&Wells(1989)Science 244:1081所述的丙氨酸扫描诱变或CD40中氨基酸残基的一些其他形式的点诱变(比如实施例6提供的酵母展示方法)也可以用于测定抗CD40抗体的功能性表位。
也可通过评估抗体与包含CD40片段的肽的结合来确定表位或表位区(“表位区”是包含表位或与表位重叠的区域)。可以合成包含CD40(例如人CD40)序列的一系列重叠肽并筛选结合，例如在直接ELISA、竞争ELISA(其中评估肽阻止抗体与结合于微量滴定板的孔的CD40结合的能力)中或在芯片上。这类肽筛选方法可能无法检测一些不连续的功能性表位，即涉及沿CD40多肽链的一级序列不连续的氨基酸残基的功能性表位。
还可以通过基于MS的蛋白质足迹法(比如氢/氘交换质谱(HDX-MS)和快速光化学氧化蛋白质(FPOP))来鉴定表位。可以进行HDX-MS，例如，Wei等人(2014)Drug DiscoveryToday 19:95，其方法在此通过引用具体并入。还参见实施例5。可以进行FPOP，例如，Hambley&Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057，其方法在此通过引用具体并入。
抗CD40抗体所结合的表位还可以通过结构方法来确定，比如X射线晶体结构测定(例如WO 2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱学，包括NMR测定CD40中不稳定的酰胺氢当游离时和当与感兴趣的抗体结合成的复合物时的H-D交换率(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31:11335；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32:6884)。
关于X射线晶体学，可以使用本领域已知的任何方法完成结晶(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50:339；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1)，包括microbatch(例如Chayen(1997)Structure 5:1269)、悬滴蒸气扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300)、接种和透析。期望使用浓度为至少约1mg/mL(优选地约10mg/mL至约20mg/mL)的蛋白质制剂。在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量范围为从约1000Da至约20,000Da，优选地约5000Da至约7000Da，更优选地约6000Da，浓度范围为从约10％至约30％(w/v))的沉淀剂溶液中可以最好地实现结晶。也可能需要包括蛋白质稳定剂，例如浓度范围从约0.5％至约20％的甘油。合适的盐(比如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠)也可能在沉淀剂溶液中是理想的，优选地浓度范围为约1mM至约1000mM。优选地将沉淀剂缓冲至pH约3.0至约5.0，优选地约4.0。可用在沉淀剂溶液中的特定缓冲液可以改变，并且在本领域中是熟知的(Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag，New York)。可用的缓冲液的实例包括但不限于HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可以在很宽的温度范围内生长，包括2℃、4℃、8℃和26℃。
抗体：抗原晶体可使用为人熟知的X射线衍射技术进行研究并且可使用计算机软件(比如X-PLOR(Yale University，1992，由Molecular Simulations，Inc.精细化；参见，例如Blundell&Johnson(1985)Meth.Enzymol.114&115，H.W.Wyckoff等人编辑，AcademicPress；美国专利申请公开号2004/0014194)，以及BUSTER(Bricogne(1993)ActaCryst.D49:37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423，Carter&Sweet编辑；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56:1313-1323)，其公开内容在此通过引用整体并入。
除非另外指明，并且参考权利要求书，抗体结合的表位是通过HDX-MS方法测定的表位，基本上如实施例5中所述。
以高亲和力结合的抗CD40抗体
在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体与huCD40以高亲和力结合，如本文公开的抗huCD40抗体一样，从而增加其作为有效治疗剂的可能性。在不同实施方案中，本发明的抗huCD40抗体以小于10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM的KD与huCD40结合。在其他实施方案中，本发明的抗huCD40抗体以2nM与100pM之间的KD与huCD40结合。评估抗体对huCD40的结合能力的标准测定包括ELISA、RIA、蛋白质印迹法、生物层干涉测量(BLI)(参见实施例3)和SPR分析(参见实施例4)。
抗CD40抗体序列变体
本文公开的抗体序列中的一些变化是可以被容忍的，并且仍然保持抗体所希望的性质。使用Kabat系统(Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)来划分CDR区。因此，本发明进一步提供了包含与本文公开的抗体的CDR序列(即12D6、5F11、8E8、5G7和19G3及其人源化衍生物)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的抗huCD40抗体。本发明还提供了抗huCD40抗体，其包含的重链和/或轻链可变结构域序列与本文公开的抗体(即12D6、5F11、8E8、5G7和19G3及其人源化衍生物)的重链和/或轻链可变域序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
具有相同CDR序列的、或源自相同鼠类种系的抗CD40抗体
鉴于抗原结合特异性主要由CDR确定，与本文公开的抗体(即12D6、5F11、8E8、5G7和19G3)具有相同CDR序列的抗体很可能具有相同的期望性质。在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含源自与抗体12D6、5F11、8E8、5G7或19G3相同的鼠V区和J区种系序列的重链和轻链可变区。抗体12D6具有源自鼠类种系VH1-39_01和IGHJ4的重链以及源自种系VK1-110_01和IGKJ1的轻链。抗体5F11具有源自鼠类种系VH1-4_02和IGHJ3的重链以及源自种系VK3-5_01和IGKJ5的轻链。抗体8E8具有源自鼠类种系VH1-80_01和IGHJ2的重链以及源自种系VK1-110_01和IGKJ2的轻链。抗体5G7具有源自鼠类种系VH1-18_01和IGHJ4的重链以及源自种系VK10-96_01和IGKJ2的轻链。抗体19G3具有源自鼠类种系VH5-9-4_01和IGHJ3的重链以及源自种系VK1-117_01和IGKJ2的轻链。没有指定重链D区种系序列(构成CDRH3的一部分)，因为考虑到这些序列具有高度可变性而经常难以指配，因此本发明的抗体可以包含源自列出的V区和J区种系以及任何D区种系的重链。其他可与人CD40结合并且源自这些种系序列中的一些或全部的抗体(特别是源自相同的V区基因的那些抗体)可能在序列上是密切近缘的，并且因此将预期具有相同的所期望的性质。
如本文所使用的，如果鼠抗体的可变区获自使用鼠类种系免疫球蛋白基因的系统，而且抗体序列与该种系充分近缘，因而更可能源自该种系而不是源自任何其他种系，则该鼠抗体包含“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这类系统包括用感兴趣的抗原来免疫小鼠。通过对抗体的氨基酸序列与鼠类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并选择在序列上与所述抗体的序列最接近(即最大％同一性)的种系免疫球蛋白序列，可以鉴定抗体的序列所“源自”的(多种)鼠类种系免疫球蛋白序列。“源自”特定种系免疫球蛋白序列的鼠抗体与种系序列相比可能包含氨基酸差异，这是由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变引起的。然而，所选择的鼠抗体通常在氨基酸序列上与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在某些情况下，鼠抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列可以具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。典型地，源自特定小鼠种系序列的抗体将展示出与种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，鼠抗体可以包含与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列不超过5个、或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸的差异。
II.工程化的和修饰的抗体
VH和VL区
还提供了工程化的和经修饰的抗体，它们可以使用具有本文公开的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来制备，所述修饰抗体可以具有与起始抗体相比有所改变的性质。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内的一个或多个残基，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内的一个或多个残基，来对抗体进行工程化。另外地或可替代地，抗体可以通过修饰恒定区内的残基来工程化，例如以改变抗体的(多种)效应子功能。
一种类型的可以进行的可变区工程化是CDR移植。这种移植特别用于人源化与本文公开的抗huCD40抗体竞争结合和/或与本文公开的抗huCD40抗体结合相同表位的非人抗CD40抗体。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基而与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体来表达模拟特定参考抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的特定参考抗体的CDR序列(参见例如Riechmann，L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones，P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.(USA)86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
这种框架序列可以从公众DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人类种系序列数据库中以及以下文件中找到：Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776-798；以及Cox，J.P.L.等人(1994)“ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur.J.Immunol.24:827-836；其中每一个的内容通过引用明确地并入本文。
用于本文所述的抗体的优选框架序列是与本文所述的抗体使用的框架序列在结构上相似的框架序列。可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列移植到这样的框架区上，所述框架区具有与在框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列，或者可以把CDR序列移植到与种系序列相比含有多达20个(优选保守的)氨基酸取代的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，对框架区内的残基进行突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
本文所述的工程化抗体包括其中已经对VH和/或VL内的框架残基进行修饰以例如改善抗体性质的那些抗体。通常进行这种框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，经历体细胞突变的抗体可以含有与抗体来源的种系序列不同的框架残基。这类残基可以通过将抗体框架序列与抗体来源的种系序列进行比较来鉴定。为了使框架区序列返回到它们的种系构型，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。这类“回复突变”抗体也包括在内。
另一种类型的框架修饰包括突变框架区内的(或甚至一个或多个CDR区内的)一个或多个残基，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也被称为“去免疫化”，在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有更详细的描述。
另一种类型的可变区修饰是使CDR区内的氨基酸残基突变以改善靶抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入(多个)突变以及对于抗体结合或其他感兴趣的功能性质的作用。优选地引入保守修饰。突变可以是氨基酸添加、缺失或优选取代。此外，CDR区内通常不超过1、2、3、4或5个残基被改变。
抗体的CDR中的甲硫氨酸残基可以被氧化，从而导致潜在的化学降解以及随之发生的抗体效力的降低。因此，还提供了用不经历氧化降解的氨基酸残基来置换重链和/或轻链CDR中的一个或多个甲硫氨酸残基的抗CD40抗体。类似地，可以从抗CD40抗体中(特别是在CDR中)去除脱酰胺位点。优选地消除抗原结合结构域内潜在的糖基化位点以防止可能干扰抗原结合的糖基化。参见例如美国专利号5,714,350。
靶向性的抗体结合
在不同的实施方案中，对本发明的抗体进行修饰，以便选择性地在抗原结合有害的组织和环境中阻断抗原结合，而在抗原结合有利的组织和环境中允许抗原结合。在一个实施方案中，产生一种封闭肽“掩蔽物”，其特异性结合抗体的抗原结合表面并且干扰抗原结合，该掩蔽物通过肽酶可裂解的接头与抗体的每个结合臂连接。参见例如CytomX的美国专利号8,518,404。这类构建体可用于治疗这样的癌症，在此类癌症中，肿瘤微环境中的蛋白酶水平与非肿瘤组织相比大大增加。可裂解的接头在肿瘤微环境中的选择性裂解允许掩蔽物/阻断肽的解离，使得抗原选择性地结合在肿瘤中、而不是在抗原结合可能引起不希望的副作用的外周组织中。
可替代地，在相关的实施方案中，开发包含两个抗原结合结构域的二价结合化合物(“掩蔽配体”)，其结合至抗体的两个抗原结合表面并干扰抗原结合，其中两个结合结构域掩蔽物通过可裂解接头(例如可被肽酶裂解的接头)彼此连接(但不连接抗体)。参见例如Tegopharm Corp.的国际专利公开号WO 2010/077643。掩蔽配体可以包含或者源自抗体要结合的抗原，或者可以独立地生成。这类掩蔽配体可用于治疗这样的癌症，在此类癌症中，肿瘤微环境中的蛋白酶水平与非肿瘤组织相比大大增加。可裂解接头在肿瘤微环境中的选择性裂解允许两个结合结构域彼此分离，从而降低抗体的抗原结合表面的亲合力。掩蔽配体与抗体的解离使得抗原选择性地结合在肿瘤中，而不是在抗原结合可能引起不希望的副作用的外周组织中。
Fc和经修饰的Fc
本发明的抗体可以包含与包含本发明的可变结构域与不同Fc区的恒定结构域的组合，其中所述Fc区是基于针对预期用途的抗体的生物活性(如果有的话)来选择的。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25:1369。例如，人IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚类，每个亚类所包含的Fc区具有独特的与一种或多种Fcγ受体结合的特征(激活性受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA、FcγRIIC(CD32a、c)、FcγRIIIA和FcγRIIIB(CD16a，b)以及抑制性受体FcγRIIB(CD32b))结合并用于补体的第一种成分(C1q)。人IgG1和IgG3与所有Fcγ受体结合；IgG2与FcγRIIAH131结合，并且以低亲和力与FcγRIIAR131和FcγRIIIAV158结合；IgG4与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIAV158结合；并且抑制性受体FcγRIIB对于IgG1、IgG2和IgG3的亲和力低于所有其他Fcγ受体。Bruhns等人(2009)Blood113:3716。研究显示，FcγRI不结合IgG2，并且FcγRIIIB不结合IgG2或IgG4。Id.总体而言，对于ADCC活性，人IgG1≧IgG3>>IgG4≧IgG2。因此，例如，对于需要ADCC的药物，可以选择IgG1恒定结构域(而不是IgG2或IgG4)；如果对表达FcγRIIIA的NK细胞、巨噬细胞和单核细胞进行活化，则可以选择IgG3；并且如果抗体用于使过敏患者脱敏，则可以选择IgG4。如果期望抗体丧失全部效应子功能，则也可以选择IgG4。
本文描述的抗huCD40可变区可以连接(例如共价连接或融合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc，所述Fc可以是任何同种型或同种异型，例如，对于IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。参见例如Jefferis等人(2009)mAbs 1:1。同种异型的选择可能受到潜在的免疫原性考量的影响，例如为了尽量减小抗药抗体的形成。
在优选的实施方案中，本发明的抗CD40抗体具有这样的Fc，其可与FcγRIIb结合或具有增强的与FcγRIIb的结合，可以提供增强的激动作用。参见例如WO 2012/087928；Li&Ravetch(2011)Science 333:1030；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19:101；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。本文所述的可变区可以连接至增强对于抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体，以便例如增强细胞凋亡诱导活性或辅助活性。Li&Ravetch(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)109:10966；美国公开专利申请2014/0010812。这类变体可以提供具有与FcγRIIb+细胞有关的免疫调制活性的抗体，包括例如B细胞和单核细胞。在一个实施方案中，相对于一种或多种活化受体，Fc变体提供对于FcγRIIb的选择性增强的亲和力。这类变体也可以表现出增强的FcR介导的交联，从而导致治疗功效增强。用于改变与FcγRIIb的结合的修饰包括在选自于由234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332组成的组(根据EU索引)的位置处的一个或多个修饰。用于增强FcγRIIb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcγRIIb结合的其他Fc变体包括235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和267E-328F。具体而言，人IgG1的S267E、G236D、S239D、L328F和I332E变体(包括S267E-L328F双变体)对于特异性增强对抑制性FcγRIIb受体的亲和力有特别的价值。Chu等人(2008)Mol.Immunol.45:3926；美国公开专利申请2006/024298；WO 2012/087928。通过添加P238D取代和其他突变(Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.&Selection 26:589；WO2012/1152410)以及V262E和V264E(Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135:9723和WO2014/184545)，可以获得增强的对于FcγRIIb(区别于FcγRIIaR131)的特异性。参见表4(见上文)。
半衰期延长
在某些实施方案中，对抗体进行修饰以增加其生物半衰期。有多种方法可用。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来实现。在一个实施方案中，在抗体的CH1或CL区内做出改变，使其包含取自某一IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如在Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述的。其他示例性的可增加与FcRn结合和/或改善药代动力学性质的Fc变体包括在位置259、308和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。其他可增加Fc结合FcRn的变体包括：250E，250Q，428L，428F，250Q/428L(Hinton等人，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)，256A，272A，305A，307A，311A，312A，378Q，380A，382A，434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry，2001，276(9)：6591-6604)，252F，252Y，252W，254T，256Q，256E，256D，433R，434F，434Y，252Y/254T/256E，433K/434F/436H(Dall’Acqua等人，Journal of Immunology，2002，169:5171-5180，Dall’Acqua等人，2006，Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。参见美国专利号8,367,805。
已经有人提议修饰IgG Fc中的某些保守残基(I253，H310，Q311，H433，N434)的，比如N434A变体(Yeung等人(2009)J.Immunol.182:7663)，以增加FcRn亲和力，从而增加循环中抗体的半衰期。WO 98/023289。包含M428L和N434S的组合Fc变体已经示出增加FcRn结合并使血清半衰期增加高达五倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28:157。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体也延长了IgG1抗体的半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18:1759。另外，包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M和M428L-N434S变体的组合Fc变体也显示出延长了半衰期。WO2009/086320。
此外，一种包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体使半衰期增加近4倍。Dall’Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281:23514。有人使用可增加FcRn亲和力但减少pH依赖性的相关的IgG1修饰(M252Y-S254T256E-H433K-N434F)创造了一种IgG1构建体(“MST-HNAbdeg”)，用于作为竞争剂防止其他抗体与FcRn结合，从而导致其他抗体[或是内源性IgG(例如在自身免疫性环境中)，或是另一种外源性(治疗性)mAb)]的清除的增加。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23:1283；WO 2006/130834。
在Yeung等人(2010)J.Immunol.182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中描述了其他用于增加FcRn结合的修饰。
在某些实施方案中，可以使用杂交IgG同种型来增加FcRn结合，并且可能增加半衰期。例如，通过在IgG1的CH2和/或CH3区中在IgG1/IgG3这两种同种型相异的位置上用来自IgG3的氨基酸取代IgG1的位置，可以构建IgG1/IgG3杂交变体。因此，可以构建包含一个或多个取代(例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F)的杂交变体IgG抗体。在本文所述的其他实施方案中，通过在IgG2的CH2和/或CH3区中在IgG1/IgG2这两种同种型相异的位置上用来自IgG1的氨基酸取代IgG2的位置，可以构建IgG1/IgG2杂交变体。因此，可以构建包含一个或多个取代的杂交变体IgG抗体，所述取代例如是以下氨基酸取代中的一个或多个：233E、234L、235L、-236G(是指在位置236处插入甘氨酸)和327A。参见美国专利号8,629,113。已经产生了IgG1/IgG2/IgG4序列的杂交体，其据称可以增加血清半衰期并改善表达。美国专利号7,867,491(其中序列号18)。
本发明的抗体的血清半衰期也可以通过聚乙二醇化来增加。抗体可以被聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)试剂(比如PEG的反应性酯或醛衍生物)在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下进行反应。优选地，经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而进行聚乙二醇化。如本文所使用的术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用于对其他蛋白质进行衍生化的任何形式的PEG，比如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是非糖基化抗体。用于对蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本文所述的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0154316以及Ishikawa等人的EP 0401384。
可替代地，在某些情况下，可能需要降低、而不是增加本发明抗体的半衰期。人IgG1的Fc中的修饰(比如I253A(Hornick等人(2000)J.Nucl.Med.41:355)和H435A/R、I253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29:2819))可以降低FcRn结合，因此降低半衰期(增加清除率)而在优选快速清除的情况下*(比如医学成像)使用。还参见Kenanova等人(2005)Cancer Res.65:622。其他提高清除率的手段包括将本发明的抗原结合结构域作为丧失结合FcRn的能力的抗体片段，比如Fab片段。这种修饰可以将抗体的循环半衰期从几周缩短到几小时。然后如果需要，可以使用抗体片段的选择性聚乙二醇化来微调(增加)抗体片段的半衰期。Chapman等人(1999)Nat.Biotechnol.17:780。抗体片段也可以与人血清白蛋白(例如在融合蛋白构建体中)融合，以增加半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat’lAcad.Sci.89:1904。可替代地，双特异性抗体可以用本发明的第一抗原结合结构域和与人血清白蛋白(HSA)结合的第二抗原结合结构域来构建。参见国际公开专利申请WO 2009/127691和其中引用的专利参考文献。可替代地，可以将专门的多肽序列加入到抗体片段中以增加半衰期，例如“XTEN”多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27:1186；国际公开专利申请WO 2010/091122。
其他Fc变体
当使用IgG4恒定结构域时，通常优选加入取代S228P，该取代模拟IgG1中的铰链序列，由此使IgG4分子稳定，例如减少治疗性抗体与所治疗的患者的内源性IgG4之间的Fab臂交换。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27:767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164:1925。
通过D221G和K222S修饰可以消除IgG1构建体铰链中潜在的蛋白酶裂解位点，从而增加抗体的稳定性。WO 2014/043344。
Fc变体对其配体(Fc受体)的亲和力和结合性质可以通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，所述体外测定方法包括但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))、或动力学(例如SPR分析)、以及其他方法如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。这些方法和其他方法可以利用所检查的一种或多种组分上的标记，和/或采用多种检测方法包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul，W.E.编辑，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)中找到，其重点在于抗体-免疫原相互作用。
在再其他实施方案中，修饰抗体的糖基化以增加或减少效应子功能。例如，通过使297位上的保守天冬酰胺残基(例如N297A)突变可以制备丧失所有效应子功能的无糖基化的抗体，从而消除补体和FcγRI的结合。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23:403。还参见Tao&Morrison(1989)J.Immunol.143:2595(使用IgG1中的N297Q来清除297位的糖基化)。
尽管非糖基化抗体通常丧失效应子功能，但是可以引入突变来恢复此功能。非糖基化抗体(例如那些来自N297A/C/D/或H突变并在不使蛋白质糖基化的系统(例如大肠杆菌)中产生的非糖基化抗体)可以进一步突变以恢复FcγR结合，例如S298G和/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)、或E382V和M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)107:604)。
糖工程学也可以用于通过改变附接在Fc区的Asn297处的碳水化合物链的α2,6唾液酸含量来修饰IgG构建体的抗炎特性，其中α2,6唾液酸化形式的比例增加导致了抗炎效应增强。参见Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26:513。相反，具有α2,6唾液酸化碳水化合物的抗体比例的减少在不需要抗炎特性的情况下可能是有用的。在美国公开专利申请号2008/0206246中提供了修饰抗体的α2,6唾液酸化含量的方法，例如通过选择性纯化α2,6唾液酸化形式或通过酶修饰。在其他实施方案中，可以修饰Fc区的氨基酸序列以模拟α2,6唾液酸化的作用，例如通过包含F241A修饰。WO 2013/095966。
III.抗体物理特性
本文所述的抗体可以在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。这样的糖基化位点可能导致抗体的免疫原性增加或由于抗原结合改变而导致抗体的pK改变(Marshall等人(1972)Ann.Rev.Biochem.41:673-702；Gala和Morrison(2004)J.Immunol.172:5489-94；Wallick等人(1988)J.Exp.Med.168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人(2000)MolImmunol.37:697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。在一些情况下，抗huCD40抗体优选不包含可变区糖基化。这可以通过选择在可变区中不包含糖基化基序的抗体或通过使糖基化区域内的残基突变来实现。
在某些实施方案中，本文所述的抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在N-G或D-G序列上，并且导致产生引入多肽链中的扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效应)的异天冬氨酸残基。
每种抗体将具有独特的等电点(pI)，其通常落在6至9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI通常落入6-8的pH范围内。有推测认为，在正常范围以外的pI的抗体在体内条件下可能具有一些展开和不稳定性。因此，优选的是具有包含落入正常范围内的pI值的抗CD40抗体。这可以通过选择具有正常范围的pI的抗体或通过使带电表面残基突变来实现。
每种抗体将具有特征性的解链温度，具有较高的解链温度表明更大的体内整体稳定性(Krishnamurthy R和Manning M C(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3:361-71)。通常，TM1(初始去折叠的温度)优选地高于60℃，优选地高于65℃，甚至更优选地高于70℃。抗体的熔点可以使用差示扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol.Lett.68:47-52)或圆二色性法(Murray等人(2002)J.Chromatogr.Sci.40:343-9)来测量。
在一个优选的实施方案中，选择不会迅速降解的抗体。可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander A J和Hughes D E(1995)Anal Chem.67:3626-32)测量抗体的降解。
在另一个优选的实施方案中，选择聚集效应最小的抗体，聚集效应可能引起不希望的免疫应答和/或改变或不利的药代动力学性质。通常，抗体在以下聚集是可接受的：25％或更少，优选地20％或更少，甚至更优选地15％或更少，甚至更优选地10％或更少，甚至更优选地5％或更少。可以通过几种技术来测量聚合，包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射。
IV.核酸分子
本文所述的另一方面涉及编码本文所述的抗体的核酸分子。核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物中，或为部分纯化或基本上纯的形式。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱色谱、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术)从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如与自然界中分离的DNA连接的染色体DNA)或蛋白质)纯化时，核酸是“分离的”或“呈现为基本上纯的”。参见F.Ausubel等人编辑的(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可以不含有内含子序列。在某些实施例中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术获得本文所述的核酸。对于杂交瘤表达的抗体(例如，由如以下进一步描述的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段有效地连接到编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”旨在意指连接两个DNA片段，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框架内。
编码VH区的分离的DNA可以通过将VH编码DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子可操作地连接而转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，VH编码DNA可以可操作地连接到仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将VL编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，编码VH-和VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头的另一片段(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段)，使得VH和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过接头接合(参见例如Bird等人，Science 242:423-426，1988；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348:552-554)。
V.抗体产生
本发明的各种抗体，例如那些与本文公开的抗人CD40抗体竞争或与相同表位结合的抗体，可以使用多种已知技术进行制备，比如Kohler和Milstein，Nature 256:495(1975)中描述的标准体细胞杂交技术。虽然优选的是体细胞杂交程序，但是原则上也可以使用其他产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化，使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是一个非常成熟的过程。分离用于融合的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
本文所述的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠类杂交瘤获得，并且使用标准分子生物学技术工程进行改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如Cabilly等的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人类框架中(参见例如Winter的美国专利号5,225,539和Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一个实施方案中，本文所述的抗体是人单克隆抗体。这种针对人CD40的人单克隆抗体可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb (Medarex，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微小基因座，以及灭活内源性μ和κ链基因座的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等人(1994)，见上文；在Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101中综述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMan小鼠的制备和使用、以及这些小鼠携带的基因组修饰进一步在以下文献中进行描述：Taylor，L.等人(1992)Nucleic Research 20:6287-6295；Chen，J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen，J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor，L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；和Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，所有这些专利的全部内容特别通过引用整体并入本文。进一步参见以下专利：Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92/03918、WO 93/12227、WO94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在某些实施方案中，使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)产生本文所述的抗体。这种在本文中称为“KM小鼠”的小鼠在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中进行了详细描述。
另外，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中是可用的，并且可以用于产生本文所述的抗huCD40抗体。例如，可以使用被称为Xeno小鼠(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统；例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6，150,584和6,162,963中描述了这类小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中是可用的，并且可以用于产生本文所述的抗CD40抗体。例如，可以使用被称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠；在Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97:722-727中描述了这类小鼠。此外，在本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，并且可以用于产生本文所述的抗huCD40抗体。
本领域中描述的用于产生人抗体(例如人抗huCD40抗体)的其他小鼠系统包括：(i)小鼠(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)，其中内源性小鼠重链和轻链可变区已经经由同源重组而用人重链和轻链可变区进行置换，可操作地连接至内源性小鼠恒定区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，然后使用标准重组DNA技术随后转化为完全人抗体；以及(ii)小鼠(Merus Biopharmaceuticals，Inc.)，其中小鼠含有未重排的人重链可变区，但是包含单个的重排的人共同轻链可变区。在例如WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861和US 2012/0073004中描述了这类小鼠及其用于产生抗体的用途。
本文所述的人单克隆抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。在本领域中建立了用于分离人抗体的这类噬菌体展示方法。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及Griffiths等人的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。
本文所述的人单克隆抗体还可以使用SCID小鼠来制备，其中人免疫细胞已经被重构，使得可以在免疫时产生人抗体应答。在例如Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了这类小鼠。
免疫
为了产生针对人CD40的完全人抗体，可以用CD40抗原和/或表达CD40的细胞的纯化或富集制剂来免疫小鼠或含有人免疫球蛋白基因(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)的转基因或转染色体小鼠，如对于其他抗原所描述的，例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和WO 98/24884。可替代地，可以用编码人CD40的DNA来免疫小鼠。优选地，小鼠在第一次输注时将是6-16周龄。例如，重组人CD40抗原的纯化或富集制剂(5-50μg)可以用于腹膜内免疫小鼠。在使用CD40抗原的纯化或富集制剂进行的免疫不产生抗体的情况下，还可以用表达CD40的细胞(例如细胞系)免疫小鼠以促进免疫应答。
各种抗原的累积经验已经示出，当最初用Ribi氏佐剂中的抗原进行腹膜内(IP)或皮下(SC)免疫接种、随后用Ribi佐剂中的抗原每隔一周进行IP/SC免疫(最多总共10次)时，HuMAb转基因小鼠反应最好。可以在免疫方案的过程中监测免疫应答，血浆样品是通过眶后采血获得的。可以通过ELISA和FACS(如下所述)来血浆筛选，并且具有足够的抗CD40人免疫球蛋白的效价的小鼠可以用于融合。在处死和去除脾脏和淋巴结前3天用抗原对小鼠进行静脉内加强。预计需要每次免疫进行2-3次融合。对于每种抗原一般免疫6至24只小鼠。通常使用HCo7、HCo12和KM菌株。另外，HCo7和HCo12转基因两者都可以一起转入具有两种不同的人重链转基因(HCo7/Hco12)的单个小鼠。
产生抗CD40的单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了产生本文所述的单克隆抗体的杂交瘤，来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞可以被分离并将其融合至适当的永生化细胞系(比如小鼠骨髓瘤细胞系)。对得到的杂交瘤进行筛选而用于产生抗原特异性抗体。例如，来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液可以与具有50％PEG的Sp2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞以约2×105铺板在平底微量滴定板中，然后在含有10％胎儿克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma)的培养基中进行两周的温育。大约两周后，细胞可以在HAT被HT置换的培养基中培养。然后可以通过ELISA对单个孔中的人单克隆IgM和IgG抗体进行筛选。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后观察培养基。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且如果人IgG仍然呈阳性，则可以通过有限稀释而将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化单克隆抗体，选定的杂交瘤可以在2升转瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。在用蛋白质A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析之前，可以过滤并浓缩上清液。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱进行检查以确保纯度。缓冲溶液可以交换到PBS中，并且可以通过OD280使用1.43的消光系数来确定浓度。单克隆抗体可以被等分并保存在-80℃下。
VI.抗体生产
产生抗CD40的单克隆抗体的转染瘤的生成
本发明的抗体(包括提供序列的特异性抗体和其他相关的抗CD40抗体)可以使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合而在宿主细胞转染瘤中产生(Morrison，S.(1985)Science 229:1202)。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，编码部分或全长轻链和重链的DNA可以通过标准分子生物学技术(例如使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得，并且可以将DNA插入到表达载体中，使得所述基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“可操作地连接”旨在是指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体及表达控制序列以使其可与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体中，或者将两种基因插入相同的表达载体中。通过标准方法(例如抗体基因片段上的和载体上的互补限制性位点的连接，或者在不存在限制性位点的条件下的平端连接)将抗体基因插入表达载体中。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可以用于通过将其插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接到载体内的(多个)CH区段，并且VL区段可操作地连接到载体内的CL区段。另外地或可替代地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合在框内连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，重组表达载体可以携带控制宿主细胞中的抗体链基因表达的调控序列。术语“调控序列”意在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。例如在Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中描述了这类调节序列。本领域技术人员将理解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可以取决于此类因素，如待转化的宿主细胞的选择或所希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调控序列包括指导蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，比如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。更进一步，由不同来源的序列组成的调节元件，比如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人类T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除了抗体链基因以及调控序列之外，重组表达载体可以携带另外的序列，如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因促进其中已经引入载体的宿主细胞的选择(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665以及5,179,017)。例如，通常，选择性标记基因对其中已经引入载体的宿主细胞赋予对药物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR”宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的(多个)表达载体转染到宿主细胞中。不同形式的术语“转染”意在涵盖常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然在理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但是在真核细胞(最优选地是哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是最优选的，因为这类真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能组装和分泌适当折叠的免疫活性抗体。已经报道了抗体基因的原核表达对产生高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。本发明的抗体也可以在酵母巴斯德毕赤酵母的糖基改造的菌株中产生。Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24:210。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与例如在Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR选择性标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、以及SP2细胞。具体而言，为了与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统在是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许在宿主细胞中表达该抗体或更优选地将该抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中的时间段来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法将抗体从培养基中回收。
由于通常观察到的翻译后修饰，本发明的抗体多肽链的N端和C端可能与预期的序列不同。例如，通常在抗体重链中缺失C末端赖氨酸残基。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100:1132。N末端谷氨酰胺残基和较少程度的谷氨酸残基经常在治疗性抗体的轻链和重链两者上都转化为焦谷氨酸残基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97:544；Liu等人(2011)JBC 28611211；Liu等人(2011)J.Biol.Chem.286:11211。
在序列表中提供了本发明的各种激动剂抗huCD40抗体的氨基酸序列，其总结于表8。由于上述原因，C末端赖氨酸不包括在序列表中的任何重链或重链恒定结构域的序列中。然而，在替代性实施方案中，本发明抗huCD40抗体的每条重链，和/或编码这种抗体或其重链或轻链的基因构建体，在重链的C末端包括这个附加的赖氨酸残基。
VII.测定法
可以通过例如标准ELISA来测试本文所述的抗体与CD40的结合。简言之，将微量滴定板用在PBS中1-2μg/mL的纯化CD40进行包被，然后用PBS中5％的牛血清白蛋白进行封闭。将抗体的稀释液(例如来自CD40免疫小鼠的血浆稀释液)加入到每个孔中，并在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤平板，然后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级试剂(例如用于人抗体，或者具有人重链恒定区的抗体、山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃下温育1小时。洗涤后，将板用ABTS底物(Moss Inc，产品：ABTS-1000)显影，并且用分光光度计在OD415-495下进行分析。然后通过流式细胞术进一步筛选来自免疫小鼠的血清而与表达人CD40的细胞系结合、但不与不表达CD40的对照细胞系结合。简言之，通过在1:20稀释度下用抗CD40抗体对表达CD40的CHO细胞进行温育而评估抗CD40抗体的结合。洗涤细胞并用PE标记的抗人IgG抗体来检测结合。使用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞术分析。优选地，发展为最高效价的小鼠将用于融合。如果要检测小鼠抗huCD40抗体，可以使用抗小鼠检测抗体进行类似的实验。
如上所述的ELISA可以用于筛选抗体，从而对产生与CD40免疫原呈阳性反应性的抗体的杂交瘤进行筛选。产生优选地以高亲和力与CD40结合的抗体的杂交瘤然后可被亚克隆并进一步表征。然后可以选择保留亲本细胞反应性(通过ELISA)的来自各个杂交瘤的一个克隆而用于制备细胞库并用于抗体纯化。
为了纯化抗CD40抗体，选择的杂交瘤可以在2升旋转瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。在用蛋白质A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析之前，可以过滤并浓缩上清液。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱进行检查以确保纯度。缓冲溶液可以交换到PBS中，并且可以通过OD280使用1.43的消光系数来确定浓度。单克隆抗体可以被等分并保存在-80℃下。
为了确定所选择的抗CD40单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。生物素化的MAb结合可以用链霉亲和素标记的探针进行检测。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的CD40包被的ELISA板进行。
为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以在4℃下用1μg/mL的抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭后，将板与1μg/mL或更少的测试单克隆抗体或纯化同种型对照在环境温度下反应一到两个小时。然后可以使孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针进行反应。如上所述显色并分析平板。
为了测试单克隆抗体与表达CD40的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简言之，将表达膜结合CD40的细胞系(在标准生长条件下生长)与在含有0.1％BSA的PBS中的各种浓度的单克隆抗体在4℃下混合1小时。洗涤后，在与第一抗体染色相同的条件下使细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体进行反应。可以通过FACScan仪器利用光散射和侧向特性对样品进行分析，以确定单个细胞的门控并确定标记抗体的结合。可以使用使用荧光显微镜的替代测定(另外地或代替)流式细胞术测定法。细胞可以如上所述进行完全染色并通过荧光显微镜进行检查。此方法允许个别细胞的可视化，但是可能具有降低的灵敏度，取决于抗原的密度。
可以通过Western印迹法进一步测试抗huCD40抗体与CD40抗原的反应性。简言之，可以从表达CD40的细胞中制备细胞提取物并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清进行封闭，并且用待测单克隆抗体进行探测。可以使用抗IgG碱性磷酸酶来检测IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)进行显色。
用于分析各种抗CD40抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定发，例如生物层干涉测量(Biolayer Iterferometry,BLI)分析以及使用2000SPR仪器(Biacore Ab，Uppsala，Sweden)的表面等离子体共振(SPR)分析。
在一个实施方案中，抗体特异性地与人CD40的胞外区结合。抗体可以特异性地与CD40细胞外结构域内的特定结构域(例如功能结构域)结合。在某些实施方案中，抗体特异性地与人CD40的胞外区和食蟹猴CD40的胞外区结合。优选地，抗体以高亲和力与人CD40结合。
VIII.双特异性分子
本文所述的抗体可以用于形成双特异性分子。抗CD40抗体或其抗原结合片段可以被衍生化或连接到另一功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体)，以产生与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本文所述的抗体事实上可以被多于一个其他功能性分子衍生化或连接至多于一个其他功能性分子，以产生与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这类多特异性分子也意图包括在本文中使用的术语“双特异性分子”中。为了产生本文所述的双特异性分子，本文所述的抗体可以与一种或多种其他结合分子(比如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)进行功能性连接，以便得到双特异性分子。
因此，本文提供了包含至少一种针对CD40的第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本文所述的双特异性分子是多特异性的实施方案中，分子可以进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性分子由于结合特异性而包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv)。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，比如在Ladner等人的美国专利号4,946,778中所述的Fv或单链构建体，其内容明确地通过引用并入。
尽管人单克隆抗体是优选的，但是在本文所述的双特异性分子中可以采用的其他抗体是鼠类的、嵌合的和人源化的单克隆抗体。
本文所述的双特异性分子可以通过使用本领域已知的方法来对组分结合特异性进行缀合来制备。例如，双特异性分子的每种结合特异性都可以分开产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用各种偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的实施例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)以及磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:8648)。其他方法包括在以下文献中描述的那些方法：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)，以及Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375)。优选的配接剂是SATA和sulfo-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两条重链的C-端铰链区的巯基键合而缀合。在特别优选的实施方案中，铰链区在缀合之前被修饰以含有奇数个巯基残基，优选地是一个。
可替代地，两种结合特异性都可以在相同的载体中编码并在相同的宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，这种方法是特别有用的。本文所述的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。在以下专利中描述了用于制备双特异性分子的方法：例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以使用本领域公认的方法(比如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定)来确认。这些测定法中的每一个通常通过采用对感兴趣的复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。
IX.组合物
进一步提供了包含一种或多种如本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段的组合物(例如药物组合物)，其与药学上可接受的载体一起配制。这类组合物可以包括本文所述的抗体或免疫偶联物或双特异性分子中的一种抗体或(例如两种或更多种不同的)抗体的组合。例如，本文所述的药物组合物可以包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性物质)的组合。
在某些实施方案中，组合物包含浓度为至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、或者在1-300mg/ml或100-300mg/ml的抗CD40抗体。
本文所述的药物组合物也可以在联合疗法中施用，即与其他药剂联合施用。例如，联合疗法可以包括本文所述的抗CD40抗体与至少一种其他抗癌剂和/或T细胞刺激剂(例如活化剂)进行组合。在下文关于本文所述的抗体的用途的章节中更详细地描述了可以在组合疗法中使用的治疗剂的实例。
在一些实施方案中，本文公开的治疗性组合物可以包括用于治疗癌症的其他化合物、药物和/或药剂。这类化合物、药物和/或试剂可以包括例如化疗药物、小分子药物或刺激对于给定癌症的免疫应答的抗体。在一些情况下，治疗性组合物可以包括例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体、抗LAG-3抗体、抗CD73抗体、抗CD137抗体、抗CD27抗体、抗CSF-1R抗体、TLR激动剂或IDO或TGFβ的小分子拮抗剂中的一种或多种。
如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。依据施用途径，可将活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被在材料中以保护化合物免于可使化合物失活的酸和其它自然条件的作用。
本文所述的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物学活性并且不赋予任何不希望的毒理学作用的盐(参见例如Berge，S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实施例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的以及从诸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族酸和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括从诸如钠、钾、镁、钙等碱金属衍生的以及从诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒有机胺衍生的盐。
本文描述的药用组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实施例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可以用于在此公开的药用组合物中的适合的水性和非水性载体的实施例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其适合的混合物、植物油如橄榄油以及可注射有机酯例如油酸乙酯。恰当的流动性例如可通过使用涂层材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序并且通过包括不同抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸苯酚等)两者来确保防止微生物的出现。可能还希望的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可以通过包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的吸收延长。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散体以及用于无菌的可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。用于药物活性物质的此类介质和药剂的使用是本领域中已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于本文所述的药物组合物中。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗性组合物典型地在制造和贮藏条件下必须是无菌和稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载体可以是包含以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其适合的混合物。可以例如通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂(例如，糖)、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的一种药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)而使可注射组合物的吸收延长。
可以通过以下各项来制备无菌可注射溶液：将活性化合物以所需的量，根据需要，与一种以上列举的成分或这些成分的组合并入适当的溶剂中，然后进行灭菌微孔过滤。通常，通过将活性化合物并入无菌媒剂来制备分散液，该无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上列举的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冻干(冷冻干燥)技术，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的受试者以及具体施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。一般来说，在百分之百以外，这种量的范围将会是约百分之0.01至约百分之九十九的活性成分，优选地从约百分之0.1至约百分之70，最优选地从约百分之1至约百分之30的活性成分与药学上可接受的载体进行组合。
调节剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干分次剂量或者可以由治疗情况的紧迫性所指示的按比例减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物以便于施用和剂量统一。如在此使用的单位剂型是指作为针对待治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药物载体相关的所希望的治疗效果的活性化合物的预定量。本文描述的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：(a)活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果，和(b)本领域中配制用于治疗个体的敏感性的这种活性化合物的固有限制。
为了施用抗体，剂量范围为约0.0001mg/kg至100mg/kg，更经常地为0.01mg/kg至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三至六个月一次。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，每种抗体的施用剂量落入所指示的范围内。治疗性抗体经常被多次施用。单次剂量之间的间隔例如可以是每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者中的靶抗原的血液水平所指示的，间隔还可以是无规律的。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆多肽抗体浓度，并且在一些方法中是约25-300μg/ml。
可以按持续释放制剂施用抗体，在此情况下，需要较低频度的施用。剂量和频度取决于患者中抗体的半衰期而变化。通常，人源化抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。施用的剂量和频度可以变化，取决于治疗是预防性的还是治疗性的。在预防性应用中，相对较低的剂量在较长的时间内以相对不频繁的时间间隔进行施用。有些病人终身接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的时间间隔施用相对较高的剂量，直到疾病进展减缓或终止，并且优选地直至患者显示出疾病症状部分或完全缓解。此后，患者可以任选地施用预防性方案，尽管在许多免疫肿瘤学适应症中，继续治疗是不必要的。
本文所述的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化以便于获得有效实现对于具体的患者、组合物、以及施用方式来说希望的治疗应答而对患者无毒的量的活性成分。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的本文所述的具体组合物、或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。
本文所述的抗CD40抗体的“治疗有效剂量”优选地致使疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频度和持续时间增加、或预防由于罹患疾病而引起的损伤或残疾。在癌症的语境中，治疗有效剂量优选地防止与癌症相关的全身症状的进一步恶化。癌症症状是本领域中熟知的，并且包括例如不寻常的痣特征，痣外观的改变(包括不对称性、边界、颜色和/或直径)、新的着色的皮肤区域、异常的痣、指甲下的发黑区域、乳房肿块、乳头变化、乳房囊肿、乳房疼痛、死亡、体重减轻、无力、过度疲劳、进食困难、食欲不振、慢性咳嗽、呼吸困难加重、咳血、尿血、便血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹部饱胀感、胃气胀、腹腔积液、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、呕血、大量出汗、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、寒战、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移和胰腺转移、吞咽困难等。在第一次施用本发明的激动性抗huCD40mAb之后可以立即观察到治疗功效，或者仅在一段时间和/或一系列剂量之后才能观察到治疗功效。这种延迟的疗效只有在治疗数月之后才能观察到，最长可达6个月、9个月或12个月。鉴于某些免疫肿瘤剂所展示的延迟功效，关键的是不要提前确定本发明的激动性抗huCD40mAb缺乏治疗功效。
治疗有效剂量可以预防或延迟癌症的发作，比如在存在疾病的早期或初步征兆时可能是期望的。用于诊断癌症的实验室测试包括化学(包括测量可溶性CD40或CD40L水平)(Hock等人(2006)Cancer 106:2148；Chung&Lim(2014)J.Trans.Med.12:102)、血液学、血清学和放射学。因此，监测任何前述的任何临床或生物化学测定可以用于确定特定治疗是否是用于治疗癌症的治疗有效量。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重程度以及所选择的具体组合物或途径等因素来确定这种量。
本文所述的组合物可以通过一种或多种施用途径使用本领域已知的多种方法中的一种或多种来施用。如本领域技术人员应理解的，施用途径和/或方式将根据所希望的结果而变化。本文所述的抗体的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外途径施用，例如通过注射或输注。如在此使用的措辞“肠胃外施用”意指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。
可替代地，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径给药，比如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。
活性化合物可以用保护化合物免于快速释放的载体进行制备，比如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法取得了专利或是本领域的技术人员已知的。参见例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以用本领域已知的医学装置来施用治疗性组合物。例如，在优选实施例中，可以用无针皮下注射装置，如美国专利号号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所披露的装置施用本文所述的治疗性组合物。与本文描述的抗huCD40抗体一起使用的公知的植入物和模块的实施例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入式微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流速可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔区室的渗透性药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透性药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本文所述的抗huCD40抗体以确保体内正确分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为确保本人所述的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制到例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包括被选择性运输至特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括：叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
X.用途及方法
本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如通过激动CD40信号传导来增强免疫应答。在优选的实施方案中，本文所述的抗体是人或人源化抗体。例如，本文所述的抗huCD40抗体可以在体外或离体培养中施用于细胞，或例如体内施用于人类受试者以增强各种疾病的免疫力。因此，本文提供了改变受试者的免疫应答的方法，包括给受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段，使得受试者的免疫应答得到增强、刺激或上调。
优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。这些方法特别适用于治疗患有可以通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)进行治疗的病症的人类患者。在特定的实施方案中，这些方法特别适合于癌症的体内治疗。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将本文所述的抗huCD40抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者体内(例如携带肿瘤或携带病毒的受试者)。当CD40的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以分开施用或同时施用。
还包括用于检测样品中人CD40抗原的存在或测量人CD40抗原的量的方法，所述方法包括使样品和对照样品与人单克隆抗体或其抗原结合片段在允许抗体或其片段与人CD40之间形成复合物的条件下与人CD40结合。然后检测复合物的形成，其中，样品与对照样品相比形成不同的复合物指示样品中存在人CD40抗原。而且，在此描述的抗-CD40L抗体还可以经由免疫亲和纯化用于纯化人CD40。
鉴于本文所述的抗huCD40抗体增强T细胞应答的共刺激(例如抗原特异性T细胞应答)的能力，本文提供了使用本文所述的抗体对抗原特异性T细胞应答(例如抗肿瘤T细胞应答)进行刺激、增强或上调的体外和体内方法。
使用抗CD40抗体可以增强CD4+和CD8+T细胞应答。T细胞可以是Teff细胞，例如CD4+Teff细胞、CD8+Teff细胞、辅助性T(Th)细胞和细胞毒性T(Tc)细胞。
进一步包括增强受试者的免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)的方法，包括给受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，使得受试者免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)增强。在优选的实施方案中，受试者是携带肿瘤的受试者，并且针对所述肿瘤的免疫应答增强。肿瘤可以是实体瘤或液体瘤(例如恶性血液病)。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阴性的。受试者也可能是携带病毒的受试者，并且针对病毒的免疫应答增强。
进一步提供了用于抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，包括给受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，使得受试者的肿瘤的生长受到抑制。还提供了治疗受试者的慢性病毒感染的方法，包括给受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，使得在受试者得以治疗慢性病毒感染。
在某些实施方案中，将抗huCD40抗体作为辅助疗法施用受试者。相对于目前的护理标准，用抗huCD40抗体治疗患有癌症的受试者可能导致长期的持久应答；至少1、2、3、4、5、10或更多年的长期存活，至少1、2、3、4、5或10年或更多年的无复发存活。在某些实施方案中，用抗huCD40抗体治疗患有癌症的受试者防止癌症复发或延迟癌症复发达例如1、2、3、4、5或10年或更多年。抗CD40治疗可以用作一线或二线治疗。
下面进一步详细描述了本文所述的这些和其他方法。
癌症
本文提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括给受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，使得受试者得到治疗，例如使得癌性肿瘤的生长受到抑制或降低和/或肿瘤退化。可以单独使用抗huCD40抗体来抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，抗huCD40抗体可以与另一种药剂(例如其他免疫原性药剂)、标准癌症治疗或其他抗体联合使用，如下所述。还提供了与PD-1抑制剂(比如抗PD-1或抗PD-L1抗体)的组合。参见例如Ellmark等人(2015)OncoImmunology 4:7e1011484。
因此，本文提供了治疗受试者的癌症(例如通过抑制肿瘤细胞的生长)的方法，包括给受试者施用治疗有效量的本文所述的抗huCD40抗体，例如人源化形式的12D6、5F11、8E8、5G7或19G3或其抗原结合片段。抗体可以是人源化抗huCD40抗体(比如本文所述的任何人源化抗huCD40抗体)、人嵌合抗huCD40抗体或人源化非人huCD40抗体，例如与至少一种本文具体描述的抗huCD40抗体竞争结合或与相同表位结合的人嵌合或人源化抗huCD40抗体。
使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症包括典型地对免疫疗法起反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实施例包括：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、恶性胶质瘤(多形性成胶质细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌症(或癌)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤，比如皮肤或眼内恶性黑素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的癌症)、病毒相关的癌症(例如人乳头瘤病毒(HPV)相关肿瘤)、以及来源于两种主要血细胞谱系(即产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞的髓系细胞系或产生B细胞、T细胞、NK细胞和血浆细胞的淋巴细胞系)的恶性血液病，比如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病(比如急性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性白血病和慢性骨髓性白血病(CML))、未分化的AML(M0)、成髓细胞性白血病(M1)、成髓细胞性白血病(M2；细胞成熟)、早幼粒细胞白血病(M3或M3变体[M3V])、粒单细胞白血病(M4或M4变体，具有嗜酸性粒细胞增多[M4E])、单核细胞白血病(M5)、红白血病(M6)、成巨核细胞白血病(M7)、孤立粒细胞肉瘤、以及绿色瘤；淋巴瘤，比如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T-淋巴细胞；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、真性组织细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴系的造血系统肿瘤、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样肉芽肿或赛塞利综合征)以及具有沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症的淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，比如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、阴燃骨髓瘤(也称惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，以及毛细胞淋巴瘤；骨髓系的造血系统肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎瘤、中枢和外周神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质起源肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、色素性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌，淋巴系和造血系统肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞疾病，比如T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞型和脑样细胞型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选T细胞类型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/后胸腺T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈部癌症、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓性淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本文所述的方法还可以用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如先前的免疫疗法难以治疗的癌症，例如用阻断性CTLA-4或PD-1抗体)和复发性癌症。
尽管如此，本发明的激动剂抗huCD40抗体可能不能用于治疗可能被CD40激动剂治疗加重的具有CD40表达的血液性癌。已知某些癌症表达CD40并因此可能会发生这种恶化，因此可以概括性地排除。在其他实施方案中，对特定肿瘤样品测试CD40的表达，并且根据测试结果排除用本发明的激动剂抗huCD40抗体的疗法。
抗huCD40抗体可以作为单一疗法或作为唯一的免疫刺激疗法施用，或者其可与癌症疫苗策略中的免疫原性试剂结合，比如癌性细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞以及用编码免疫刺激性细胞因子的基因进行转染的细胞(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实施例包括黑素瘤抗原的肽(比如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶)、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。已经设计了很多用于针对肿瘤的疫苗的实验策略(参见Rosenberg，S.，2000，Development of Cancer Vaccines，ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis，C.，2000，ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat，D.2000，ASCOEducational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCO Educational Book Spring：730-738；参见also Restifo，N.和Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp.3023-3043DeVita等人(编辑)，1997，癌症：Principles and Practice of Oncology，第五版)。在这些策略之一中，使用自体的或同种异体的肿瘤细胞制备疫苗。当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗已经显示出是最有效的。已经显示GM-CSF是肿瘤疫苗接种抗原呈递的有效激活剂。Dranoff,et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:3539-43。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究导致了所谓的肿瘤特异性抗原的定义。Rosenberg，S A(1999)Immunity 10:281-7。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和肿瘤产生的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以被证明是在宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。CD40激动剂可以与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合联合使用，以产生对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统看作是自身抗原，因此对其是耐受的。肿瘤抗原可以包括蛋白质端粒酶，其是合成染色体端粒所需要的，并且其在超过85％的人类癌症和仅在有限数量的体细胞组织中表达(Kim等人(1994)Science 266:2011-2013)。由于改变蛋白质序列或在两个不相关的序列之间产生融合蛋白(即费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变，肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”，或者是来自B细胞肿瘤的独特型。
其他肿瘤疫苗可以包括来自人类癌症涉及的病毒(比如人类乳头状瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)的病毒的蛋白质。可以与CD40抑制联合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织自身分离的纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白片段，并且这些HSP被高效地递送至抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫(Suot&Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278:117-120)。
树突细胞(DC)是可以用于引发抗原特异性应答的有效的抗原呈递细胞。可以离体生产DC，并加载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人(1998)NatureMedicine 4:328-332)。还可以通过遗传手段转导DC以表达这些肿瘤抗原。为了免疫的目的，DC也直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫可以有效地与CD40激动剂结合以激活(发动)更有效的抗肿瘤应答。
CD40的激动还可以与标准的癌症治疗(例如手术、放疗和化疗)相结合。CD40的激动可以有效地与化疗方案相结合。在这些情况下，可以减少施用的化疗剂的量(Mokyr等人(1998)癌症Research 58:5301-5304)。这种组合的实施例是抗CD40抗体与达卡巴嗪组合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一个实施例是抗huCD40抗体与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。CD40激动剂和化疗联合使用背后的科学原理是细胞死亡是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果，应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平增加。可能通过细胞死亡导致与CD40激动作用协同作用的其他联合治疗是放疗、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中形成肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与CD40激动剂组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，其可能将肿瘤抗原送入宿主抗原呈递途径。
本文所述的抗huCD40抗体还可以与将表达效应细胞的Fcα或Fcγ受体靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两种单独的抗原。例如，已经使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性反应。这些应答的T细胞臂将通过CD40的激动作用而得到增强。可替代地，通过使用与肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记物结合的双特异性抗体可以将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主的免疫监视。这些机制中的许多机制都可以通过使由肿瘤表达的免疫抑制蛋白失活来克服。这些尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)、以及Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274:1363-1365)。针对这些实体中的每一种的抗体都可以与抗huCD40抗体组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并且有利于宿主的肿瘤免疫应答。
抗CD40抗体能够有效地取代辅助性T细胞的活性。Ridge等人(1998)Nature 393:474-478。可以提供T细胞共刺激分子的活化性抗体以增加T细胞激活水平，比如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol.164:2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)、以及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397:262-266)。PD1或PD-L1的抑制剂也可以与抗huCD40抗体一起使用。
还有几种实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体激活和扩增以及将这些细胞过继转移到受体中以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell(1999)Science 285:546-51)。这些方法还可以用于激活T细胞对感染性病原体(比如CMV)的应答。存在抗CD40抗体的体外活化可以增加过继转移的T细胞的频度和活性。
慢性病毒感染
另一方面，本文所述的发明提供了治疗受试者的感染性疾病的方法，包括给受试者施用抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得所述受试者的感染性疾病得到治疗。
与上文讨论的将其应用于肿瘤相似，抗体介导的CD40激动作用可以单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用，以增强针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。对于这种治疗方法特别有用的病原体的实施例包括目前没有有效疫苗的病原体、或常规疫苗不完全有效的病原体。这些病原体包括但不限于HIV、肝炎(A、B、C)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾、利什曼虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。CD40激动作用特别地可用于针对由药剂建立的感染，比如感染过程中呈递改变的抗原的HIV。这些新的表位在施用抗人CD40抗体时被识别为是外来的，因此引起强烈的T细胞应答。
引起可通过本文所述的方法治疗的感染的病原性病毒的一些实施例包括：HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、传染性软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒以及虫媒脑炎病毒。
引起可通过本文所述的方法治疗的感染的致病细菌的一些实例包括：衣原体、立克次氏体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病以及莱姆病病菌。
引起可通过本文所述的方法治疗的感染的致病性真菌的一些实施例包括：假丝酵母属(白色念珠菌、克鲁丝酵母、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新型隐球菌、曲霉菌属(烟曲霉菌、黑曲霉菌等)、毛霉菌属(毛霉菌、犁头霉、根霉)、申克氏孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌以及荚膜组织胞浆菌。
引起可通过本文所述的方法治疗的感染的致病性寄生虫的一些实例包括：溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福勒氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属、兰伯贾第虫、隐孢子虫属、卡氏肺孢菌、间日疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体、巴西日圆线虫。
在所有上述方法中，CD40激动剂可以与其他形式的免疫疗法组合，比如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法，其提供了肿瘤抗原的增强呈递。参见例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123。
疫苗佐剂
本文描述的抗huCD40抗体可以用于通过共同施用抗huCD40抗体和感兴趣的抗原(例如疫苗)来增强抗原特异性免疫应答。因此，本文提供了增强受试者的对抗原的免疫应答的方法，包括给受试者施用：(i)抗原；以及(ii)抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得受试者的对抗原的免疫应答得到增强。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这类抗原的非限制性实施例包括上文讨论的那些抗原，比如以上讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)，或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
本文所述的体内和体外抗体组合物(例如，人单克隆抗体，多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的合适的施用途径是本领域公知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本文所述的抗huCD40抗体可以与一种或多种其他治疗剂(例如细胞毒性剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)共同施用。抗体可以连接至药剂(以免疫复合物)或可以与药剂分开施用。在后一种情况下(单独施用)，抗体可以在药剂之前、之后或同时施用，或者可以与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共同施用。这些治疗剂尤其包括抗肿瘤剂，比如多柔比星(阿霉素)、顺铂博莱霉素硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪和环磷酰胺羟基脲，其本身仅在有毒或无毒的水平上有效。顺铂每四周一次以100mg/ml的剂量静脉内施用，阿霉素每21天一次以60-75mg/ml的剂量静脉内施用。本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同施用提供了两种抗癌剂，其经由对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同机制而起作用。这种共同施用可以解决由于对药物的抗性发展或肿瘤细胞的抗原性改变而使它们与抗体不反应的问题。
本文所述的范围还涵盖包含本文所述的抗体组合物(例如人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)与使用说明书的试剂盒。试剂盒可以进一步包含至少一种附加试剂或本文所述的一种或多种附加人抗体(例如具有与CD40抗原中不同于第一人类抗体的表位结合的具有互补活性的人抗体)。试剂盒通常包括指示该试剂盒内容物的预期用途的标签。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何书写或记录的材料，或以其他方式随试剂盒附带的任何书写或记录的材料。
联合疗法
除了上文提供的联合疗法之外，本文所述的抗CD40抗体还可以用于例如用于治疗癌症的联合治疗，如下所述。
本发明提供联合治疗的方法，其中将抗huCD40抗体与一种或多种有效刺激免疫应答从而进一步增强、刺激或上调受试者的免疫应答的其他药剂(例如抗体)共同施用。
通常，本文所述的抗huCD40抗体可以与(i)另一共刺激性受体的激动剂和/或(ii)T细胞上抑制性信号的拮抗剂进行组合，所述两种药剂均导致抗原特异性T细胞反应放大(免疫检查点调节剂)。大多数共刺激和共抑制分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员，并且本文所述的抗CD40抗体可以与靶向IgSF家族成员的试剂一起施用以增加免疫应答。与共刺激或共抑制受体结合的一个重要的膜结合配体家族是B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)以及B7-H6。与共刺激或共抑制性受体结合的另一个膜结合配体家族是与相关的TNF受体家族成员结合的TNF家族分子，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(参见例如Tansey(2009)Drug Discovery Today00:1)。
另一方面，抗huCD40抗体可以与抑制T细胞活化的细胞因子拮抗剂(例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF)或其他“免疫抑制细胞因子”)或刺激T细胞活化的细胞因子联合使用，用于刺激免疫应答，例如用于治疗增殖性疾病(比如癌症)。
在一个方面，可以通过本发明的抗huCD40mAb与以下一种或多种药剂的联合来刺激T细胞应答：(i)抑制T细胞活化的蛋白拮抗剂(例如免疫检查点抑制剂)，比如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4，以及(ii)刺激T细胞活化的蛋白激动剂、比如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。
可调节上述蛋白之一并且可以与激动剂抗huCD40抗体(例如本文所述者)联合用于治疗癌症的示例性药剂包括：/伊匹单抗或曲美木单抗(针对CTLA-4)、加利昔单抗(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、pidilizumab/CT-011(针对PD-1)、/派姆单抗/MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3-WO 11/109400)、IMP321(针对LAG-3)、urelumab/BMS-663513和PF-05082566(针对CD137/4-1BB)、varlilumab/CDX-1127(针对CD27)、MEDI-6383和MEDI-6469(针对OX40)、RG-7888(针对OX40L-WO 06/029879)、阿塞西普(针对TACI)、莫罗单抗-CD3(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。
可以与激动剂抗huCD40抗体组合用于治疗癌症的其他分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的激活性受体的激动剂。例如，激动剂抗huCD40抗体可以与KIR的拮抗剂(例如，lirilumab)进行组合。
用于联合疗法的其他药剂包括抑制或消除巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，比如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO 11/70024，WO 11/107553，WO11/131407，WO 13/87699，WO 13/119716，WO 13/132044)或FPA-008(WO 11/140249；WO 13/169264；WO 14/036357)。
通常，本文所述的激动剂抗huCD40抗体可以与以下各项中的一种或多种共同使用：结合阳性共刺激受体的激动剂，通过抑制性受体减弱信号传导的阻断剂，以及一种或多种全身性增加抗肿瘤T细胞的频度的药剂、克服肿瘤微环境内不同免疫抑制途径(例如阻断抑制性受体接合(例如PD-L1/PD-1相互作用)、通过消耗或抑制Treg(例如使用抗CD25单克隆抗体(例如达珠单抗或通过离体抗CD25珠子耗竭)、抑制代谢酶(比如IDO)或逆转/预防T细胞无反应性或衰竭)的药剂、以及在肿瘤部位触发先天性免疫激活和/或炎症的药剂。
本文提供了用于刺激受试者的免疫应答的方法，包括给受试者施用CD40激动剂(例如抗体)和一种或多种附加免疫刺激性抗体，比如PD-1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、PD-L1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、CTLA-4拮抗剂(例如拮抗剂抗体)和/或LAG3拮抗剂(例如拮抗剂抗体)，使得受试者的免疫应答受到刺激，以例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一个实施方案中，给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗性抗PD-1抗体。在一个实施方案中，给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗性抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，所述至少一种附加的免疫刺激性抗体(例如拮抗性抗PD-1、拮抗性抗PD-L1、拮抗性抗CTLA-4和/或拮抗性抗LAG3抗体)是人抗体。可替代地，所述至少一种附加的免疫刺激性抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(例如由小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4和/或抗LAG3制备的)。
本文提供了用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗性PD-1抗体。在某些实施方案中，以亚治疗剂量施用激动剂抗huCD40抗体，以亚治疗剂量施用抗PD-1抗体，或以亚治疗剂量施用两者。本文还提供了改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在某些实施例中，该受试者是人。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体，激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，比如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。
在本文所述方法中使用的合适的PD-1拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如单克隆抗体和双特异性抗体)以及多价药剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，比如AMP-244。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
示例性的抗PD-1抗体是/纳武单抗(BMS-936558)或包括抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4和4A11之一的CDR或可变区的抗体(在WO2006/019010中描述)。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是：WO 2012/145493中描述的MK-3475(/派姆单抗/原为lambrolizumab)；WO 2012/145493中描述的AMP-514/MEDI-0680；以及CT-011(pidilizumab；先前是CT-AcTibody或BAT；参见例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunotherapy 34:409)。其他已知的PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括在WO 2009/014708、WO03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149、以及美国专利公开号2009/0317368中描述的那些PD-1抗体和PD-1抑制剂。也可以使用WO 2013/173223中公开的任何抗PD-1抗体。与这些抗体之一竞争结合PD-1或与PD-1上的相同表位结合也可以用于联合治疗中。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体以5×10-8M或更低的KD与人PD-1结合，以1×10-8M或更低的KD与人PD-1结合，与5×10-9M或更低的KD与人PD-1结合，或以1×10-8M与1×10-10M之间的KD与人PD-1结合。
本文提供了用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗性PD-L1抗体。在某些实施方案中，以亚治疗剂量施用激动剂抗huCD40抗体，以亚治疗剂量施用抗PD-L1抗体，或以亚治疗剂量施用两者。本文提供了改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施例中，该受试者是人。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体，激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，比如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(在WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中称为12A4)、MSB0010718C(WO 2013/79174)、或包含3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的CDR或可变区的抗体，这些都在PCT公开WO 07/005874和美国专利号7,943,743中进行描。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(也称为抗B7-H1)或MPDL3280A(也称为RG7446)。也可以使用在WO 2013/173223、WO 2011/066389、WO2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国公开号2009/145493中公开的任何抗PD-L1抗体。与任何这些抗体竞争和/或结合相同表位的抗PD-L1抗体也可以用于联合治疗。
在又一个实施方案中，将本发明的激动剂抗huCD40抗体与PD-1/PD-L1信号传导的拮抗剂(比如PD-1拮抗剂或PD-L1拮抗剂)结合，与第三免疫治疗剂结合。在一个实施方案中，第三免疫治疗剂是GITR拮抗剂或OX-40拮抗剂，比如本文公开的抗GITR或抗OX40抗体。
另一方面，免疫肿瘤剂是GITR激动剂，比如激动性GITR抗体。合适的GITR抗体例如包括BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO 06/105021，WO 09/009116)以及MK-4166(WO11/028683)。
另一方面，免疫肿瘤剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂例如包括INCB-024360(WO2006/122150，WO 07/75598，WO 08/36653，WO 08/36642)、indoximod或NLG-919(WO 09/73620，WO 09/1156652，WO 11/56652，WO 12/142237)。
本文提供了用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括给受试者施用本文所述的激动剂抗huCD40抗体和CTLA-4拮抗剂抗体。在某些实施方案中，以亚治疗剂量施用激动剂抗huCD40抗体，以亚治疗剂量施用抗CTLA-4抗体，或以亚治疗剂量施用两者。本文提供了改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实例中，受试者是人。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体是选自下组的抗体：(伊匹单抗或抗体10D1，在PCT公开专利WO 01/14424中进行描述)、曲美木单抗(原先是替西木单抗，CP-675,206)、以及在以下出版物中描述的抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：摘要号2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等人(1998)CancerRes.58:5301-5304。也可以使用WO 2013/173223中公开的任何抗CTLA-4抗体。
本文提供了用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和抗LAG-3抗体。在进一步的实施方案中，以亚治疗剂量施用激动剂抗huCD40抗体，以亚治疗剂量施用抗LAG-3抗体，或以亚治疗剂量施用两者。本文提供了改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗LAG-3抗体。在某些实施例中，该受试者是人。在某些实施方案中，抗LAG-3抗体是人序列单克隆抗体，激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，比如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。抗LAG3抗体的实施例包括包含抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体，其在美国专利公布号US 2011/0150892和WO 2014/008218中进行了描述。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可以使用的其他领域公认的抗LAG-3抗体包括US 2011/007023中描述的IMP731。也可以使用IMP-321。与任何这些抗体竞争和/或结合相同表位的抗LAG-3抗体也可以用于联合治疗。
在某些实施方案中，抗LAG-3抗体以5×10-8M或更低的KD与人LAG-3结合，以1×10- 8M或更低的KD与人LAG-3结合，与5×10-9M或更低的KD与人LAG-3结合，或以1×10-8M与1×10-10M之间的KD与人LAG-3结合。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体与针对一种或多种第二靶抗原(比如LAG-3和/或CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1)的拮抗剂(例如拮抗剂抗体)的施用可以增强针对患者的癌细胞的免疫应答。使用本公开内容的抗体可以抑制其生长的癌症包括典型地对免疫疗法有反应的癌症。用本公开内容的联合疗法治疗的癌症的代表性实施例包括在用激动剂抗huCD40抗体的单一疗法的讨论中具体列出的那些癌症。
在某些实施方案中，本文讨论的治疗性抗体的组合可以在药学上可接受的载体中作为单一组合物同时施用，或者以与药学上可接受的载体中的每种抗体分开的组合物的形式同时施用。在另一个实施方案中，治疗性抗体的组合可以顺序施用。例如，可以依次施用抗CTLA-4抗体和激动剂抗huCD40抗体，比如首先施用抗CTLA-4抗体、并且其次施用激动剂抗huCD40抗体，或首先施用激动剂抗huCD40抗体、并且其次施用抗CTLA-4抗体。另外地或可替代地，可以依次施用抗PD-1抗体和激动剂抗huCD40抗体，比如首先施用抗PD-1抗体、并且其次施用激动剂抗huCD40抗体，或首先施用激动剂抗huCD40抗体、并且其次施用抗PD-1抗体。另外地或可选地，可以依次施用抗PD-L1抗体和激动剂抗huCD40抗体，比如首先施用抗PD-L1抗体、并且其次施用激动剂抗huCD40抗体，或首先施用激动剂抗huCD40抗体、并且其次施用抗PD-L1抗体。另外地或可替代地，可以依次施用抗LAG-3抗体和激动剂抗huCD40抗体，比如首先施用抗LAG-3抗体、并且其次施用激动剂抗huCD40抗体，或首先施用激动剂抗huCD40抗体、并且其次施用抗LAG-3抗体。
此外，如果多于一个剂量的组合疗法顺序施用，则顺序施用的顺序可以在每个施用时间点逆转或保持相同顺序，顺序施用可以与同时施用或其任何组合进行组合例如，抗CTLA-4抗体和激动剂抗huCD40抗体组合的第一次施用可以是并行的，第二次施用可以先是抗CTLA-4抗体、然后是激动剂抗huCD40抗体，第三次施用可以先是激动剂抗huCD40抗体、然后是抗CTLA-4抗体，等等。另外地或可替代地，抗PD-1抗体和激动剂抗huCD40抗体组合的第一次施用可以是并行的，第二次施用可以先是抗PD-1抗体、然后是激动剂抗huCD40抗体，第三次施用可以先是激动剂抗huCD40抗体、然后是抗PD-1抗体，等等。另外地或可替代地，抗PD-L1抗体和激动剂抗huCD40抗体组合的第一次施用可以是并行的，第二次施用可以先是抗PD-L1抗体、然后是激动剂抗huCD40抗体，第三次施用可以先是激动剂抗huCD40抗体、然后是抗PD-L1抗体，等等。另外地或可替代地，抗LAG-3抗体和激动剂抗huCD40抗体组合的第一次施用可以是并行的，第二次施用可以先是抗LAG-3抗体、然后是激动剂抗huCD40抗体，第三次施用可以先是激动剂抗huCD40抗体、然后是抗LAG-3抗体，等等。另一种代表性的给药方案可以包括先是激动剂抗huCD40、然后是抗CTLA-4抗体(和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)的首次施用，并且随后的施用可以是同时的。
任选地，作为唯一免疫治疗剂的激动剂抗huCD40或激动剂抗huCD40抗体与一种或多种附加免疫治疗性抗体(例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/PD-L1和/或抗LAG-3阻断剂)的组合可以进一步与免疫原性试剂(比如癌细胞)、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白质、肽和碳水化合物分子)、细胞、以及用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞进行组合(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实施例包括黑素瘤抗原的肽(比如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶)、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步讨论)。还可以将CD40激动剂与一种或多种附加抗体(例如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂)进一步与标准癌症治疗组合。例如，CD40激动剂与一种或多种附加抗体(例如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂)可以有效地与化疗方案组合。在这些情况下，有可能减少以本公开的组合(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)施用的其他化疗剂的量。这种组合的实施例是CD40激动剂抗体与或不与另外的抗体(比如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)进一步地与去氨氮脲联合用于治疗黑素瘤。另一个实施例是激动剂抗huCD40抗体与或不与抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或LAG-3抗体的组合进一步地与白细胞介素-2(IL-2)联合用于治疗黑素瘤。CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断与化疗联合使用背后的科学原理是细胞死亡，这是大多数细大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果，应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平增加。可以导致与CD40激动作用协同、与通过细胞死亡的CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断作用协同或不协同的其他联合疗法包括辐射、手术或激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中形成肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与组合的CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂进行组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，这可以是馈送到宿主抗原呈递途径中的肿瘤抗原的来源。
作为唯一免疫治疗剂的激动剂抗huCD40抗体、或CD40激动剂与CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断抗体的组合也可以与将Fcα或Fcγ受体表达效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用。参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243。双特异性抗体可以用于靶向两种单独的抗原。这些应答的T细胞臂将通过使用组合的CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断而得到增强。
在另一个实例中，作为单一免疫治疗剂的激动性抗CD40抗体或抗CD40抗体与附加免疫刺激剂的组合(例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/PD-L1抗体和/或LAG-3试剂，例如抗体)可以与抗肿瘤抗体(比如(利妥昔单抗)、(曲妥珠单抗)、(托西莫单抗)、(ibritumomab)、(阿仑单抗)、(eprtuzumab)、(贝伐单抗)以及(埃罗替尼)等)结合使用。通过举例且不希望受理论约束，用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体进行治疗可以导致癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，其会增强由免疫刺激剂(例如CD40、TIGIT、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3剂，例如抗体)介导的免疫应答。在一个示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如癌肿瘤)的治疗可以包括抗癌剂(例如抗体)与激动剂抗huCD40抗体和任选的附加免疫刺激剂(例如抗-可以增强抗肿瘤免疫应答的CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂，例如抗体)同时或顺序或以其任何组合施用，其会增强宿主的抗肿瘤免疫应答。
本文提供了用免疫刺激剂改变与治疗过度增殖性疾病(例如癌症)相关的不良事件的方法，包括给受试者施用激动剂抗huCD40抗体，连同或不连同亚治疗量的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂(例如抗体)。例如，本文所述的方法提供了通过给患者施用不可吸收的类固醇来降低免疫刺激性治疗性抗体诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。如本文所使用的，“不可吸收类固醇”是显示广泛的首过代谢的糖皮质激素，使得在肝脏中代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本文所述的一个实施方案中，不可吸收的类固醇是布地奈德。布地奈德是一种局部作用的糖皮质激素，口服后主要由肝脏代谢。(Astra-Zeneca)是一种布地奈德的pH和时间依赖性口服制剂，用于对到回肠和整个结肠的药物递送进行优化。在美国被批准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩氏病。用于治疗克罗恩病的常用口服剂量为6至9mg/天。在肠道中释放，然后被吸收并保留在肠道粘膜中。一旦通过肠道粘膜靶组织，被肝脏中的细胞色素P450系统广泛地代谢成具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用度较低(约10％)。布地奈德的低生物利用度与其他具有较少广泛首过代谢的糖皮质激素相比导致了改善的治疗率。布地奈德导致的副作用比全身作用的皮质类固醇少，包括较少的下丘脑-垂体抑制。然而，的长期施用可以导致全身糖皮质激素效应，比如皮质醇增多和肾上腺抑制。参见PDR第58版，2004；608-610。
在更进一步的实施方案中，将具有或不具有CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻滞作用CD40激动剂(即抗CD40的免疫刺激性治疗性抗体和任选的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)与不可吸收类固醇结合可以进一步与水杨酸酯进行组合。水杨酸盐包括5-ASA剂，例如像柳氮磺吡啶(Pharmacia&UpJohn)；olsalazine(Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(SalixPharmaceuticals，Inc.)；和美沙拉嗪(Procter&Gamble Pharmaceuticals；Shire US；Axcan Scandipharm，Inc.；Solvay)。
根据本文所述的方法，将水杨酸盐与激动剂抗huCD40抗体(具有或不具有抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或LAG-3抗体)联合施用，并且为了减少免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率，非吸收性类固醇可以包括水杨酸盐和非吸收性类固醇的任何重叠或依序施用。因此，例如，用于降低由本文所述的免疫刺激性抗体诱导的结肠炎发病率的方法包括同时或依序施用水杨酸盐和不可吸收的水杨酸盐(例如水杨酸盐在不可吸收的类固醇之后6小时施用)或其组合。此外，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同的途径施用(例如两者口服施用)或通过不同的途径施用(例如口服施用水杨酸盐，经直肠施用不可吸收的类固醇)，其不同于用于施用抗huCD40和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的途径。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体和组合抗体疗法还可以与针对被治疗的适应症(例如癌症)特别有用的其他公知疗法联合使用。本文所述的激动剂抗huCD40抗体的组合可以与已知的(多种)药学上可接受的试剂依次使用。
例如，本文所述的激动剂抗huCD40抗体和联合抗体疗法可以与附加治疗联合使用，所述附加治疗比如辐射、化疗(例如使用喜树碱(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、多柔比星、伊立替康、紫杉醇、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(紫杉酚)、阿霉素、5-fu或喜树碱+apo21/TRAIL(6X联合体))、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2'(bcl-x1抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉)或MCL-1(髓样白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如smac7、smac4、小分子模拟物、合成smac肽(参见Fulda等人，Nat Med 2002；8:808-15)、ISIS23722(LY21813)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如)、合成三萜(参见Hyer等人，Cancer Research 2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如PPARγ的天然和合成配体(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如索拉非尼)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、替西罗莫司、mTOR抑制剂(比如雷帕霉素和替西罗莫司)、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、Lenalildomide、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂和/或基因毒性药物。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体和组合抗体疗法可以进一步与一种或多种抗增殖细胞毒剂组合使用。可以用作抗增殖细胞毒性剂的化合物类别包括但不限于以下：
烷化剂(包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶芥子酸、氯甲噻吩、环磷酰胺(CYTOXANTM)、磺胺苯丙氨酸、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷酸胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。
除了在本文中已知的其他微管稳定剂之外，用于与激动剂抗huCD40抗体组合的合适的抗增殖剂(但不限于)紫杉烷、紫杉醇(紫杉醇市售为TAXOLTM)、多西他赛、盘皮海绵内酯(DDM)、dictyostatin(DCT)、Peloruside A、埃坡霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、埃坡霉素D、埃坡霉素E、埃坡霉素F、呋喃艾波酯D、脱氧埃坡霉素B1、[17]-脱氢埃坡霉素B、[18]脱氢脱氧埃坡霉素B、C12,13-环丙基-埃坡霉素A、C6-C8桥联埃坡霉素A、反式-9,10-脱氢埃坡霉素D、顺式-9,10-脱氢埃坡霉素D、16-去甲基倍他米松B、埃博霉素B10、discoderomide、帕土匹龙(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(盘皮海绵内酯)、TZT-1027(soblidotin)、ILX-651(盐酸奎尼丁)、软海绵素B、甲磺酸艾日布林(E-7389)、哈米特林(HTI-286)、E-7974、Cyrptophycins、LY-355703、美登木素生物碱免疫缀合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(ispinesib)、SB-743921、MK-0731、STA-5312、艾榴塞洛素、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-HOMO-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、cyclostreptin、isolaulimalide、laulimalide、4-表-7-脱羟基14,16-二去甲基-(+)-圆皮海绵内酯、以及cryptothilone 1。
在希望在使用本文描述的激动剂抗huCD40抗体进行治疗时结合使用或在之前使异常增殖细胞静止的情况下，可以给患者施用激素和类固醇(包括合成类似物)，比如17α炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、ZOLADEXTM。当采用本文所述的方法或组合物时，也可以根据需要施用用于在临床环境中调节肿瘤生长或转移的其他药剂，比如抗有丝分裂剂。
用于安全且有效地施用这些化疗剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，在标准文献中描述了它们的施用。例如，在Physicians'Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics Company，Montvale，NJ 07645-1742，(USA))中描述了许多化疗剂的施用；其公开内容通过提述并入本文。
化疗剂和/或放射疗法可以根据本领域公知的治疗方案施用。对于本领域技术人员显而易见的是，(多种)化疗剂和/或放射疗法的施用可以根据所治疗的疾病以及化疗剂和/或放射疗法对于此疾病的已知效果而改变。而且，根据熟练的临床医师的知识，鉴于所观察到的所施用的治疗剂对患者的作用、并且鉴于所观察到的疾病对所施用的治疗剂的反应，可以改变治疗方案(例如给药量和施用次数)。
XI.本发明的特异性激动剂抗CD40抗体的表征
如实施例1中所述获得本发明的激动剂抗CD40抗体。在序列表中提供了本发明的示例性抗体的可变结构域和CDR序列区，并总结在表2中。对于源自同一原始克隆的所有抗体，可变结构域和CDR区编号是相同的，即本文提供的人源化变体不包括任何插入或缺失。
表2
抗体可变结构域和CDR
克隆 链 可变结构域 CDR1 CDR2 CDR3
12D6 重链 1-119 31-35 50-66 99-108
12D6 轻链 1-112 24-39 55-61 94-102
5F11 重链 1-117 31-35 50-66 99-106
5F11 轻链 1-111 24-38 54-60 93-101
8E8 重链 1-122 31-35 50-66 99-111
8E8 轻链 1-112 24-39 55-61 94-102
5G7 重链 1-113 31-35 50-66 99-102
5G7 轻链 1-107 24-34 50-56 89-97
19G3 重链 1-112 31-35 50-66 99-101
19G3 轻链 1-112 24-39 55-61 94-102
本发明还提供由于与本文公开的抗huCD40抗体源自相同的鼠类种系序列，特别是V和J区基因区段，而与本文公开的抗huCD40抗体的在序列上近缘的抗huCD40抗体。在表3提供了本文公开的每种抗体的鼠类种系序列。
表3
抗huCD40mAb的小鼠种系序列
本发明进一步提供了人源化抗huCD40抗体，其源自本文公开的鼠亲本抗体，用人框架序列置换了鼠框架序列，且具有或没有另外的突变(“回复突变”)来恢复会在人源化过程中丧失的抗原(人CD40)亲和力或消除序列负担。参见实施例3。
本发明还提供了抗体构建体，其包含本文公开的新颖的可变结构域序列以及具有修饰的Fc区的恒定结构域，所述修饰的Fc区对于FcγRIIb的亲和力相比于对其他Fc受体(即活化性受体)的亲和力增强。这种具有增强的FcγRIIb特异性的激动性抗huCD40抗体预期会在治疗癌症和慢性感染方面表现出优异的功效。Li&Ravetch(2011)Science 333:1030；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。不旨在受到理论的限制，这种FcγRIIb特异性激动性抗CD40mAb可以通过增加促进细胞毒性CD8+T细胞的扩增和激活的树突细胞的成熟而展示出增强的佐剂作用，从而导致抗肿瘤应答增强。见上文引文。不意图受到理论的限制，由于本发明的受体聚集或“交联”增加而导致的激动剂CD40抗体的FcR介导的信号增强可能是治疗功效的主要原因。CD40激动剂抗体通过抗体的Fc部分的FcR接合交联可以增加信号强度，从而增强细胞的活化。
活化性(A)Fc受体相对于抑制性(I)Fc受体的抗体的相对结合亲和力可以表示为“A/I”比率，且典型地随IgG抗体的Fc区的结构而变化。参见WO2012/087928。具有增强的与抑制性受体FcγRIIb结合的特异性的抗体具有较低的A/I比率。对本发明激动性抗huCD40抗体而言优选的抗体具有例如小于5、4、3、2、1、0.5、0.3、0.1、0.05、0.03或0.01的A/I比率。
包含用于增强FcγRIIb特异性的突变的人IgG1恒定结构域也提供在序列表中，并且概括在表4中，同时在图1中示出。序列变体参考在SEQ ID NO:65中给出的人IgG1f恒定结构域序列来定义。关于Fc区中的突变的位置(编号)的命名是根据EU索引(Kabat等人(1981)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)，这利于对具有不同可变域长度的抗体中的等同位置的Fc序列进行比较。还参见Edelman等人(1969)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)63:78；WO 2012/130831(使用相同的编号系统)。它与序列表中的序列编号不匹配。图1提供了表4的Fc序列变体的图形表示，本领域技术人员可以从中容易地识别本文公开的抗体序列中的对应位置。在Chu等人(2008)Mol.Immunol.45:3926.P238D中描述了SE和SELF变体，在Mimoto等人(2013)Protein Engineering Design&Selection 26:589中描述了V4、V7、V8、V9、V11和V12变体(例如其中的表1)。
表4
Fc序列变体
在Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135:9723(以及WO 2014/184545)中描述了对FcγRIIb的亲和力增强的附加Fc序列变体，包括V262E和V264E，例如用于与S267E和L328F组合。
另外产生了具有D270E突变的变体，以减少发生在V4和V9Fc序列变体中的D270异构化，这两种变体在加速降解研究中表现出高的异构化率，在PBS中4℃下两年后提示12-16％的异构化，而其他变体则为5-7％。参见表5(提供的是来自单个实验的数据，但重复实验显示了可比较的值)。用270位谷氨酸取代270位的天冬氨酸消除了这种DG异构化的可能性，导致更具化学稳定性的抗体和更均匀的抗体制备物。V9的其他D270取代，比如D270A、D270Q、D270S和D270T，有效地消除了与FcγRIIa和FcγRIIb受体的结合(KD大于5μM)。尽管D270E突变使与FcγRIIb受体的结合降低了一个数量级，但是V9-D270E变体在亲和力方面保留了对FcγRIIb受体的偏好(与FcγRIIa相比)，并且保持可接受的对FcγRIIb的绝对亲和力。参见实施例8。
表5
Fc序列变体对Fcγ受体的亲和力
(KD(nM))
名称 FcγRIIa-H131 FcγRIIa-R131 FcγRIIb
IgG1f 530 850 3900
SE 520 22 98
SELF 1100 2 11
P238D >5000 >5000 950
V4 >5000 1900 150
V4-D270E >5000 >5000 1800
V7 >5000 1600 84
V8 >5000 1400 93
V9 >5000 420 15
V9-D270A、Q、S、T >5000 >5000 >5000
V9-D270E >5000 >5000 150
V11 - 450 15
V12 >5000 490 21
对本发明的各种抗CD40抗体的激动剂活性进行了测量。参见实施例7，以及图3A、图3B和图4。发现激动剂活性既依赖于可变结构域序列，其决定抗原(人CD40)结合，也依赖于Fc区的序列，其决定Fc受体(FcγRIIb)结合。
通过以下实施例进一步说明本公开内容，这些实施例不应被解释为进一步的限制。本申请通篇引用的所有附图和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容明确地并入本文作为参考。
实施例
实施例1
针对人CD40的小鼠单克隆抗体的产生
使用表达小鼠抗体基因的野生型Balb/c小鼠(Charles Rivers Labs)产生了鼠抗人CD40单克隆抗体，如下所述。
抗原
使用huCD40-muFc可溶性重组蛋白作为用于免疫的抗原。该可溶性融合蛋白的MW为91.6KD，由huCD40的胞外部分以及与其C-端连接的小鼠IgG2b Fc组成。这种融合蛋白在本文中被称为“huCD40-muFc融合蛋白”。通过标准重组DNA方法产生融合蛋白，并且在转染的CHO细胞中表达，转染的CHO细胞将可溶性融合蛋白分泌到培养上清液中。用于转染的CHO宿主细胞获自Invitrogen(Cat#11619-012)。纯化分泌的可溶性融合蛋白以用作免疫原。
小鼠的免疫
为了产生抗人CD40的小鼠单克隆抗体，用纯化的huCD40-muFc融合蛋白来免疫Balb/c小鼠。在第一次输注抗原时，小鼠大约2-4个月大。使用纯化的重组huCD40-muFc抗原制剂(10μg，从表达融合蛋白的转染的哺乳动物细胞中纯化)用两种免疫方案(A和B)免疫小鼠。方案A由每周四次经足垫(FP)免疫组成，方案B由每周七次皮下(SC)/腹膜内(IP)/Hock免疫组成。在这两种情况下，均将免疫原与RIBI佐剂(Sigma Cat#M6536)以1:1混合。
第四次免疫后一周，对所有小鼠进行放血以评估抗原特异性滴度。在处死的时候也从每只小鼠获得终末血。通过眶后采血来监测免疫反应。使用用于免疫接种的重组蛋白通过ELISA分析来筛查血浆。方案A的小鼠在融合前第2天和在融合前第3天用可溶性抗原通过静脉内(IV)和在脚垫中(FP)的方式接受两次最终加强免疫。方案B的小鼠在融合前第2天和在融合前第3天用可溶性抗原通过静脉内(IV)以及IP和hock方式接受两次最终加强免疫。
方案A的所有四只小鼠(ID291763、291764、291765、291766)都被处死。提取淋巴结和脾细胞并混合以融合(融合物3582和3583)。方案B的小鼠只有两只(ID294286和294288)被处死。将每只小鼠的脾脏和淋巴结混合并融合(融合物3716和3717)。
产生抗人CD40的单克隆抗体的杂交瘤的生成
使用基于电场的电融合Hybrimune仪器和大型0.9ml融合室(BTX HarvardApparatus，Inc.，Holliston，MA)使从高滴度Balb/c小鼠中分离的小鼠脾细胞和淋巴结与小鼠骨髓瘤融合伴侣进行融合。使来自免疫小鼠的淋巴细胞的单细胞悬浮液与等数目的P3X63Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌性小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将得到的细胞以2.0×104个细胞/孔在选择性ClonaCell-HY培养基E(目录#03805；STEMCELL TechnologiesInc.，Vancouver BC，Canada)的平底微量滴定板中进行平板接种，培养基中添加氨基喋呤以选择杂交瘤。大约7天后，用培养基E(无氨基蝶呤)替换所述培养基。
10至12天后，使用均相HTRF测定法来筛选各单独的孔是否存在小鼠IgG/小鼠κ轻链抗体。在此测定中，将96孔融合板的上清液与定制的带标记的铽穴状化合物(Terbium-Cryptate))山羊抗小鼠IgG(Fcγ特异性)(Cisbio US Inc.Bedford，MA)和用AlexaFluor647标记的山羊抗小鼠IgG Fab'2(Jackson ImmunoResearch；目录号109-605-098)混合。温育进行1小时。然后在Rubystar读板器上读取平板。然后，对于小鼠IgG/小鼠κ轻链抗体为阳性的孔的杂交瘤细胞，通过FACS或者ELISA进行筛选，其中所述FACS用人CD40转染的CHO细胞和CHO未转染细胞作为对照(融合物3582/3583)；所述ELISA使用重组蛋白，然后进行针对Daudi Daudi B细胞和Jurkat T细胞的FACS作为阴性对照(融合物3716/3717)。将FACS阳性亲本品系转移至24孔板。几天后，通过FACS对单独孔的细胞上清液进行重新筛选以确认对人CD40的IgG特异性。
将一组抗原特异性杂交瘤通过连续稀释进行克隆，并使用CHO转染子或Daudi细胞通过FACS进行重新筛选。对来自融合物3582/3583的十九种抗体和来自融合物3716/3717的二十种抗体进行纯化，并测试其功能活性。从这组抗体中，选择五个强激动剂进行第二次亚克隆。这五种抗体，即1802.3582.19G3.F10.E1、1802.3583.5G7.F12.G3、1802.3583.8E8.C10.G2、1802.3716.12D6.B1.E3和1802.3717.5F11.A11.E7，随后进行测序和进一步的分析。
实施例2
完全人抗huCD40抗体的产生
与本文公开的人源化抗CD40抗体结合相同表位和/或交叉阻断本文公开的人源化抗CD40抗体的结合的完全人抗huCD40单克隆抗体可能在本发明的方法中有用。这样的抗体可以使用表达人抗体基因的转基因小鼠产生，如下所述。
抗原
使用huCD40可溶性重组蛋白作为用于免疫的抗原。该可溶性融合蛋白由huCD40的胞外部分以及连接于其C-端的小鼠IgG2a Fc组成。这种融合蛋白在本文中被称为“huCD40-muFc融合蛋白”。通过标准重组DNA方法产生融合蛋白，并且在经转染的CHO细胞中表达，该细胞将可溶性融合蛋白分泌到培养上清液中。用于转染的CHO宿主细胞获自Invitrogen(Cat#11619-012)。纯化分泌的可溶性融合蛋白用作免疫原。全长人CD40的序列，包括信号序列，在SEQ ID NO:1提供。
转基因小鼠
使用CMD++、JKD++、KCo5(9272)+^、SC20+基因型的小鼠(以下称为小鼠)制备针对人CD40的完全人单克隆抗体。各自的转基因名称在括号内，随后是随机整合的转基因的株号。符号++和+表示纯合子或半合子；然而，由于小鼠例行使用基于PCR的测定进行筛选，而测定不允许我们区分随机整合的人Ig转基因的杂合性和纯合性，有可能实际上是纯合子的小鼠被注上了+号。在此品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经如Chen等人(1993)EMBOJ.12:811-820所述被纯合破坏，并且内源小鼠重链基因已经如WO2001/09187的实施例1中所述被纯合破坏。此外，此小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5(如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851所述)、载有大部分人κ轻链基因座的酵母人工染色体(YAC)(如WO 2000/026373中所述)。
小鼠的免疫
为了产生人CD40的完全人单克隆抗体，用纯化的huCD40-muFc融合蛋白来免疫KM小鼠。全身免疫方案描述于Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和WO 98/24884。在第一次输注抗原时，小鼠大约4个月大。将纯化的重组huCD40-muFc抗原制剂(10μg，从表达融合蛋白的转染的哺乳动物细胞中纯化)或用人CD40转染的300-19细胞用于腹膜内和皮下免疫小鼠。将免疫原与RIBI佐剂(Sigma Cat#M6536)以1:1混合。
小鼠以5-7天的间隔免疫5次。用重组蛋白进行第一次和第二次免疫。用细胞进行第三次免疫，用蛋白质进行第四次免疫，并且用细胞进行第五次免疫。最后免疫后一周，对小鼠进行放血以评估抗原特异性滴度。通过眶后采血来监测免疫反应。使用转染的300-19细胞通过FACS分析来筛选血浆，并且将具有抗人CD40人IgG的最高滴度的小鼠用于融合。小鼠在处死和取出脾脏之前两天静脉内(IV)和腹膜内(IP)注射可溶性抗原、并在之前三天注射转染细胞，以最终加强免疫。
产生抗人CD40的人单克隆抗体的杂交瘤的生成
使用Cyto Pulse大室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，GlenBurnie，MD)，利用基于电场的电融合，使从高滴度KM小鼠体内分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤融合伴侣进行融合。使来自免疫小鼠的淋巴细胞的单细胞悬浮液与等量的P3X63Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌性小鼠骨髓瘤细胞进行融合(融合号：2541)。将得到的细胞以2.0×104个细胞/孔在选择性DMEM培养基中在平底微量滴定板中进行平板接种，所述选择性DMEM培养基含有高葡萄糖(Cellgro#10-013-CM)和10％胎牛血清(Hyclone#SH30071.03)，并且补充有β-巯基乙醇(1000X，Gibco#21985-023)、7mM HEPES(Cellgro 25-060)、附加2mM L-谷氨酰胺(Cellgro 25-005-Cl)、HAT(50X，Sigma#H-0262)、5％杂交瘤克隆因子(BioVeris#210001)、10％P388DI(ATCC#CRRL TIB-63)条件培养基和青霉素-链霉素(100x，Cellgro#30-002-CI)。大约7天后，用含有HT的培养基(Cellgro#25-047-CI)更换一些含有HAT的培养基。
10至12天后，使用均相HTRF测定法来筛选存在人IgG/人κ轻链抗体的单独的孔。在此测定中，将96孔融合板的上清液与铕-穴状化合物标记的山羊抗人IgG(Fc片段特异性的)、生物素化的山羊抗人κ轻链(Bethyl#A80-115B)、链霉亲和素-XLent混合，并温育1小时。然后在RUBYstar读板器上读取平板。
然后通过FACS使用用人CD40转染的300-19细胞和300-19未转染细胞作为对照，筛选人IgG/人κ轻链或人IgG/人λ轻链抗体阳性的孔的杂交瘤细胞。将FACS阳性亲本品系转移至24孔板。几天后，通过FACS对单独孔的细胞上清液进行重新筛选以确认对人CD40的IgG特异性。
将杂交瘤通过连续稀释进行克隆并通过FACS进行重新筛选。
实施例3
抗huCD40抗体的人源化
将本发明的亲本(鼠类)抗体进行人源化以用于人类治疗剂的潜在用途。为每个小鼠可变结构域选择最接近的匹配的人类种系区序列，并且使用这些人框架区来置换这些抗体的“CDR移植物”形式中的鼠框架。然后根据需要进行附加的氨基酸取代(比如框架回复突变)，以恢复人源化抗体的结合亲和力。进行进一步的氨基酸取代以消除序列负担(sequence liabilities)。表6提供了本发明的各种形式的抗体之间的序列关系。使用Fortebio Octet RED(快速系统扩展检测)无标记交互分析仪器通过生物层干涉测量(BLI)分析来确定各种激动性抗huCD40抗体与可溶性人CD40的结合。所有研究均在25℃下在10mMNaxPO4、130mM NaCl、0.05％表面活性剂P20(pH 7.1)中进行。简言之，使用加载时间90s和摇动速度1000rpm，在蛋白A包被的生物传感器(Pall Fortebio#18-5010)上捕获抗huCD40抗体上清液(稀释至10μg/mL、或如果上清液浓度低于10μg/mL则在不稀释的情况下捕获)。首先筛选上清液与1μM重组人CD40单体(huCD40单体)的结合，使用180s的缔合和解离时间，于1000rpm，在两个结合循环之间进行两个使用10mM甘氨酸(pH1.5)、15s的调节步骤。然后对所有在1μMhuCD40单体实验中显示出结合信号的上清液，以三倍稀释系列测试与七种不同浓度的huCD40单体的结合，其中最高浓度是10μM huCD40单体或1μM huCD40单体，取决于1μM筛选实验中结合信号的强度。在表6中显示了所选抗体及其序列变体的结果。
表6
抗CD40抗体的结合亲和力
*＝为了比较的目的，当在与5F11-45抗体平行的相同测定中运行时，亲本5F11显示KD为8.2nM(而不是4.7nM)。
对于人源化抗体，VH列和VL列提供了框架区所基于的人可变结构域种系。“CDR移植物”是指这样的可变结构域，其包含直接移植到所给出的人类框架序列上的未修饰亲本(小鼠)CDR。表6中的所有序列变体的残基编号均根据Kabat，因此表6中的序列变化的位置与序列表中抗体序列的残基编号不匹配。用下划线标明旨在纠正潜在的序列负担的序列修饰，所谓序列负担即容易受到化学修饰和潜在的降解，从而导致产物异质性的的残基。其他序列修饰旨在恢复亲和力，通常是框架回复突变(从人种系框架序列回复到原始鼠框架残基)。抗体5G7重链中的M69L修饰既是框架回复突变，又是负担纠正。
实施例4
抗CD40抗体表位分箱实验
可以进行表位分箱实验以确定哪些抗人CD40抗体与哪些抗人CD40抗体竞争与huCD40结合，从而结合相似的表位。如下测定抗huCD40抗体之间的两两竞争，其中将参考抗体结合至传感器芯片的表面，将测试抗体与huCD40多肽构建体在混合物中预温育，并且使经预温育的混合物流过传感器芯片以确定测试抗体干扰huCD40多肽构建体与芯片表面上的参考抗体进行结合的程度。这样的竞争实验可以使用SPR仪器进行。简言之，将参考抗huCD40抗体固定到传感器芯片CM5芯片(Series GE，GE Healthcare CAT#BR-1005-30)的表面、流动池2、流动池3和流动池4(5000RU)上，并且将流动池1用作阴性对照。测试抗体稀释至120μg/mL(2倍)的起始浓度。通过用七种不同浓度的缓冲液和对照样品(具有0μg/mL)稀释1:3浓度的抗体来制成测试抗体的一系列稀释物，以获得滴定曲线。将每个抗体浓度系列分成两半。在浓度系列的第一半部中，加入40nM(2倍)人CD40抗原(例如huCD40/Fc)以得到每孔中的最终浓度系列(60μg/mL-0.0μg/mL)以及20nM的最终抗原浓度。在浓度系列的第二半部中，用缓冲液代替抗原加入来将抗体稀释到相同的浓度，将这一半部作为空白组。将测试抗CD40抗体和huCD40/Fc的复合物温育2小时。将40μL复合物以30μL/min注射到参考抗体包被的表面上。使用T200表面等离子体共振仪，运行缓冲液为经过滤和脱气的HBE-EP(GE Healthcare CAT#BR-1001-88)、0.01M HEPES(pH 7.4),0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20。用25mM NaOH(订购代码：BR-1003-58，GEHealthcare)以100μL/min使表面再生5秒。使用Microsoft Excel对数据进行分析，其中以测试抗体的浓度对相应的响应单位进行绘图以获得滴定曲线。
在图2中提供了本发明的抗CD40抗体的这种表位分箱实验的结果。抗体5F11和8E8阻断配体(CD40L)结合。本发明的五种抗CD40抗体落入三个表位组——12D6/5G7/19G3、5F11/5G7/19G3和8E8。
实施例5
通过HDX进行表位定位
通过氢/氘交换质谱(HDX-MS)确定本发明的抗huCD40抗体12D6、5G7、19G3和5F11的表位。HDX-MS通过监测主链酰胺氢原子的氘交换率和程度来探测溶液中的蛋白质构象和构象动力学。Huang&Chen(2014)Anal.Bioanalytical Chem.406:6541；Wei等人(2014)DrugDisc.Today 19:95。HDX的水平取决于主链酰胺氢原子和蛋白质氢键的溶剂可及性。可以通过MS精确测量HDX上的蛋白质的质量增加。当此技术与酶消化配合使用时，可以解析在肽水平上的结构特征，使得表面暴露的肽与折叠在内部的肽或从蛋白-蛋白复合物界面处隔离的肽区分开。通常，进行氘标记和随后的淬灭实验，然后进行酶消化、肽分离和MS分析。
在表位定位实验之前，进行非氘代实验以产生用于重组人CD40单体(10μM)以及CD40与mAb 12D6、5G7、19G3和5F11(1:1摩尔比)的蛋白质复合物的共同肽的列表。在HDX-MS实验中，将5μL的每种样品(CD40或CD40与mAbs 12D6、5G7、19G3和5F11的复合物)稀释到55μL的D2O缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，D2O，pH7.0)中以开始标记反应。反应进行不同的时间段：20秒，1sec，10min和240min。在每个标记反应时段结束时，通过加入淬灭缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液，具有4M GdnCl和0.4M TCEP，pH 2.5,1:1，v/v的)将反应淬灭，并且将50μL淬灭的样品注入Waters HDX-MS系统进行分析。在缺乏/存在CD40mAb的条件下监测共同胃蛋白酶消化肽的氘摄取水平。获得的序列覆盖率为82％。
表7中提供了抗CD40单克隆抗体12D6、5G7、19G3和5F11的HDX表位。抗体12D6保护了两种肽，其中一种(残基11-28)包含信号序列的一部分，因此其本身不太可能是生理上重要的，但是表明12D6与区域21-28接触，而mAbs 5G7和19G3不发生这样的接触。
表7
HDX表位
实施例6
借助酵母展示的表位定位
通过在酵母上展示随机诱变的huCD40胞外区变体、并基于酵母不能与特定抗体结合来分选这些酵母，由此确定本发明的选定的嵌合或人源化抗huCD40抗体的表位。对所选择的不能结合的酵母细胞进行扩增，并且进行额外的几轮基于其不能与本发明的抗体的特定嵌合或人源化形式结合的选择。参见例如Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342:539。测定所得的酵母的huCD40变体的序列，并且分析每个残基对抗体结合的影响。将huCD40序列内如下所述的基因座确定为本发明抗体的结合表位：该基因座处单个氨基酸突变破坏与本发明抗huCD40抗体的结合。
简言之，使用易错PCR将编码人CD40的DNA克隆到构建体中，所述构建体允许huCD40变体作为融合蛋白的氨基末端部分表达，该融合蛋白进一步包含c-myc标签序列和酵母细胞壁蛋白Aga1p。此类构建体当在酵母(酿酒酵母)中表达时，在酵母细胞的表面上展示变体huCD40多肽，这些变体huCD40多肽通过Aga1p多肽锚定于细胞表面。c-myc标签可以任选地用作展示给定酵母细胞上huCD40融合蛋白的阳性对照。通过FACS来对酵母细胞进行分选，对如下所述的细胞进行合并、扩增并用于随后的几轮选择：所述细胞表达正确折叠的huCD40-融合蛋白(通过用别藻蓝蛋白(APC)标记的山羊抗小鼠IgG二抗检测到对照小鼠抗huCD40抗体的结合来确定)、但不与本发明的抗体结合(通过用藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人IgG作为二抗进行检测来确定)。对于经过几轮选择后剩余的酵母，测定来自这些酵母的构建体的huCD40序列。进行没有抗huCD40抗体选择的对照实验以确认huCD40序列全长上的每个位置处的良好的突变体覆盖，并且提供一条基线用于归一化用所选择的文库获得的结果。
实施例7
抗CD40抗体的激动剂活性
通过测量未成熟树突细胞(DC)的活化来评估Fc序列变异对选定的本发明抗CD40抗体的激动剂活性的影响。使用具有人IgG1f(对照)、SE、SELF、P238D、V4、V8和V12Fc序列的抗CD40mAb 12D6-24构建体进行实验。使用塑料粘附或人CD14微珠(Miltenyi Biotec)从健康正常供体中分离人单核细胞(CD14+)。用100ng/mL GM-CSF(Miltenyi Biotec)和100ng/mL IL-4(Miltenyi Biotec)培养单核细胞。在第2天和第5天移除一半培养基并补加。在第6-7天收获未成熟的树突细胞。将来自两个供体的DC与指定浓度的抗体一起在37℃下温育过夜。收集细胞培养上清液并测定人IL-6的产生(Cisbio)。参见图3A和图3B。
对照的人IgG1f抗体当以高达100nM使用时未诱导IL-6分泌，而P238D变体仅有微弱的诱导。相比之下，SE、SELF、V9和V12变体均显著地增强了IL-6分泌，其中V8和V4展现出中等的效应。这些结果与对FcγRIIb的结合亲和力大致相关，并且确认了使用适当的Fc序列变体可以得到激动剂活性增强的抗CD40抗体。
另外，在使用具有共同的人IgG1f V12恒定结构域的嵌合抗CD40mAb构建体的实验中评估了具有8E8、5G7、12D6、19G3和5F11可变区的抗体之间的激动剂活性的差异。如下所述测定了体外对未成熟树突细胞(如前面的段落中所述进行分离的)的激活作用：将细胞铺在96孔板中，按照指示加入抗体，并在37℃下温育过夜。收集细胞并用荧光抗CD54抗体染色，通过荧光激活细胞分选(FACS)检测所述荧光抗CD54抗体。参见图4。
对照人IgG1f抗体没有显著地引起CD54上调，而12D6引起剧烈的CD54上调。抗体19G3和8G8与12D6相比效力有一定程度减小，而抗体5G7和5F11彼此相似，展现出相对较低的刺激作用。抗体5F11具有几乎最高的结合亲和力、却还是弱激动剂，而抗体19G3恰恰相反，由此可见活化结果不一定与对CD40的结合亲和力相关。无论这些差异的原因如何，这些结果证实使用合适的抗原结合结构域序列对于获得具有增强的激动剂活性的抗CD40抗体是重要的。
实施例8
DG异构化的纠正
具有V4和V9Fc变体序列的本发明的抗体在D270位展现出不可接受的DG异构化水平。这种异构化是不希望的，因为它导致产物异质性和潜在的功效降低。为了减少这种异构化，将V4Fc的270位的天冬氨酸残基变更为谷氨酸(D270E)，将V9Fc的270位变更为丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸(D270A、D270E、D270Q、D270S、D270T)。从表达这些抗体的细胞中获得上清液，并且测定与hCD32/FcγRII的结合。使用在第270位没有突变的选定纯化抗体作为对照。这些实验是在具有来自mAb 12D6-24和mAb 5F11-45的可变结构域的抗体上进行的。在图5中提供了结果。
对于V4和V9Fc变体，D270E取代均导致受体结合的少许降低。其他测试的V9Fc变体(D270A、D270Q、D270S、D270T)导致受体结合的更大的降低。结果与抗体是12D6还是5F11无关。在所有情况下，与所测试的三种受体(FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131和FcγRIIb)的相对(排列顺序)结合保持相似，其中与FcγRIIa-R131和FcγRIIb的结合大致相同，而与FcγRIIa-H131的结合显著较弱。
对于V4和V9变体两者，D270E取代均保持可接受的高FcγR亲和力，并且保持对FcγRIIb的特异性，该特异性是增强本发明抗CD40抗体的激动活性所需的。
实施例9
人CD40/人FcγR转基因小鼠中的抗CD40活性
将选定本发明的激动性抗CD40抗体施用给人CD40和人Fcγ受体的转基因小鼠[CD40-/-hCD40+Fcgra-/-Fcgr1-/-hFCGRI+hFCGRIIA+hFCGRIIB+hFCGRIIIA+hFCGRIIIB+]。人Fcγ受体的转基因小鼠在Smith等人(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)109(16):6181-6中描述。这种转基因人CD40/FcγR小鼠非常适合研究潜在的人类治疗性抗CD40抗体，因为这些抗体必然与人CD40和人FcγR结合。在“DEC-OVA”模型(在Li&Ravetch(2011)Science333:1030中有描述)中测量了激动剂活性，还测量了血小板水平。结果显示在图6A和图6B中。显示出最大激动剂活性的抗体(如12D6-V11，以及程度较之为低的12D6-V4)也在24小时表现出血小板计数的最大降低。血小板计数的减少是一种暂时现象，注射后7天水平恢复正常(数据未示出)。
5F11抗体识别与CD40L结合表位重叠的表位，这不像12D6抗体，12D6抗体与hCD40的结合不同于其CD40L结合表位，与CP-870,893类似。12D6抗体阻断CP-870,893结合，但5F11抗体不阻断此结合(数据未示出)。体外DC激活测定已经证实12D6的SE-Fc和V11-Fc变体的显著的活性，而与5F11变体相比，12D6Fc变体显示出增强的活性。尽管12D6-Fc变体的体外活性大于野生型IgG1，但体外研究并没有区分不同Fc变体的活性。因此我们评估了这些抗体及其Fc变体在人源化CD40/人FcγR小鼠中的活性。如对于克隆CP-870,893所观察到的，这些单克隆抗体的选择性FcγRIIB增强的V11Fc变体在体内显示出与其FcγRIIA/IIB增强的SE变体以及野生型IgG1亚类相比优异的活性。而且，新开发的12D6-V11的体内活性的大小比CP-870,893(IgG2)的活性高大约20倍。
对CD40激动性Abs 12D6-24和5F11-45的抗肿瘤活性进行评估。测试每个克隆的野生型IgG1、SE和V11突变体在MC38肿瘤模型中的活性。与其他被测试的Fc变体相比，这些抗体的FcγRIIB选择性增强的V11变体具有优异的抗肿瘤活性，与它们的体内T细胞刺激活性以及CP-870,893衍生物观察到的抗肿瘤活性层级一致。结果显示在图6C中。在其CD40Ab治疗30天后，对12D6-24治疗组的无肿瘤小鼠用MC38肿瘤细胞进行再挑战。结果显示在图6D中。这组中的所有小鼠在再挑战两周内排斥了肿瘤，表明单次注射12D6-24介导了长期的保护。
这些数据表明，可以通过Fc工程化选择性地增强FcγRIIB接合来增强激动性人CD40抗体的抗肿瘤活性，而且V11Fc变体对于增强激动作用是特别有效的。
表8
序列表概述
序列表提供了成熟重链和轻链的序列(即序列不包括信号肽)。用于例如在人细胞中产生本发明抗体的信号序列提供于SEQ ID NO:78。
等同物：
本领域的技术人员仅仅使用常规实验就将认识到或能够确认本文公开的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在被以下权利要求书所涵盖。
序列表
<110> 洛克菲勒大学和百时美施贵宝公司
<120> 具有增强的激动剂活性的抗CD40抗体
<130> 036707.00300/RUBMS12724PCT/RU1281
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(20)
<220>
<221> 肽
<222> (21)..(277)
<220>
<221> 域
<222> (21)..(193)
<223> 胞外域
<220>
<221> 域
<222> (194)..(215)
<223> 跨膜域
<220>
<221> 域
<222> (216)..(277)
<223> 胞内域
<400> 1
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 3
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(119)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(108)
<223> CDRH3
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(112)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(39)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(61)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(102)
<223> CDRL3
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Thr Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Ile His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(119)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(108)
<223> CDRH3
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(108)
<223> CDRH3
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 22
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
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<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(108)
<223> CDRH3
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chimeric antibody with mouse 可变域 and human constant
domain
<220>
<221> 域
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<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(106)
<223> CDRH3
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Ile Leu Gln Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
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Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 24
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chimeric antibody with mouse 可变域 and human constant
domain
<220>
<221> 域
<222> (1)..(111)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(38)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(101)
<223> CDRL3
<400> 24
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Asn Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 25
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(117)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(106)
<223> CDRH3
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ile Leu Gln Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 26
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(111)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(38)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> CDRL3
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Asn Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
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Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 27
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(117)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(106)
<223> CDRH3
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Ile Leu Gln Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 28
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(111)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(38)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(60)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(101)
<223> CDRL3
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Asn Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 29
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(117)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(106)
<223> CDRH3
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
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<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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Gln Val Gln Phe Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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<212> PRT
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<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ser Pro Gly
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(112)
<223> 可变域
<220>
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<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
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<222> (1)..(112)
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<220>
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
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435 440
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<213> 人工序列
<220>
<223> chimeric antibody with mouse 可变域 and human constant
domain
<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(113)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(102)
<223> CDRH3
<400> 54
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195 200 205
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<220>
<223> humanized antibody with mouse CDRs and human framework and
constant regions
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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<223> chimeric antibody with mouse 可变域 and human constant
domain
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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210 215
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<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
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<222> (99)..(101)
<223> CDRH3
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
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210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
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340 345 350
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 64
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有小鼠CDR和人框架区及恒定区的人源化抗体
<220>
<221> 域
<222> (1)..(112)
<223> 可变域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(39)
<223> CDRL1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(61)
<223> CDRL2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(102)
<223> CDRL3
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
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180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 65
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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275 280 285
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
<400> 69
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 70
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 71
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
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<210> 72
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
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<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
<400> 73
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180 185 190
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 74
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
<400> 74
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Glu Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 75
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
<400> 75
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 76
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1f恒定域的变体
<400> 76
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala

Claims (22)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其与人CD40特异性结合，并且在交叉阻断测定中与选自下组的一种或多种抗体竞争结合人CD40：12D6(SEQ ID NO:3和4)、5F11(SEQ IDNO:23和24)、8E8(SEQ ID NO:40和41)、5G7(SEQ ID NO:52和53)以及19G3(SEQ ID NO:58和59)。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中，在交叉阻断测定中的竞争包括在竞争ELISA中当以等摩尔浓度与所选择的抗体一起使用时将所选择的抗体与人CD40的结合减少至少20％的能力。
3.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其与人CD40特异性结合于：
a.包含序列EPPTACREKQYLINS(SEQ ID NO:1的残基21-35)或由该序列组成的表位(抗体12D6、5G7和19G3)；或
b.包含序列ECLPCGESE(SEQ ID NO:1的残基58-66)或由该序列组成的表位(抗体5F11)。
4.一种与人CD40特异性结合的分离的抗体或其抗原结合部分，其包含：
a)至少部分源自鼠V区种系VH1-39_01和J区种系IGHJ4的重链CDR序列，以及
至少部分源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ1的轻链CDR序列(12D6)；
b)至少部分源自鼠V区种系VH1-4_02和J区种系IGHJ3的重链CDR序列，以及
至少部分源自鼠V区种系VK3-5_01和J区种系IGKJ5的轻链CDR序列(5F11)；
c)至少部分源自鼠V区种系VH1-80_01和J区种系IGHJ2的重链CDR序列，以及
至少部分源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ2的轻链CDR序列(8E8)；
d)至少部分源自鼠V区种系VH1-18_01和J区种系IGHJ4的重链CDR序列，以及
至少部分源自鼠V区种系VK10-96_01和J区种系IGKJ2的轻链CDR序列(5G7)；或者
e)至少部分源自鼠V区种系VH5-9-4_01和J区种系IGHJ3的重链CDR序列，以及
至少部分源自鼠V区种系VK1-117_01和J区种系IGKJ2的轻链CDR序列(19G3)。
5.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，包含如下所述的重链和轻链，其中该重链包含选自下组的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，并且所述轻链包含选自下组的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列：
a)抗体12D6-03的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:5的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:6的残基24-39、55-61和94-102；
b)抗体12D6-22的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:7的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；
c)抗体12D6-23的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:10的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:11的残基24-39、55-61和94-102；
d)抗体12D6-24的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-108，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；
e)抗体5F11-17的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:25的残基31-35、50-66和99-106，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:26的残基24-38、54-60和93-101；
f)抗体5F11-23的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:27的残基31-35、50-66和99-106，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28的残基24-38、54-60和93-101；
g)抗体5F11-45的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:29的残基31-35、50-66和99-106，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:30的残基24-38、54-60和93-101；
h)抗体8E8-56的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:42的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:43的残基24-39、55-61和94-102；
i)抗体8E8-62的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:44的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:45的残基24-39、55-61和94-102；
j)抗体8E8-67的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:46的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:47的残基24-39、55-61和94-102；
k)抗体8E8-70的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:48的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:49的残基24-39、55-61和94-102；
l)抗体8E8-71的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:50的残基31-35、50-66和99-111，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:51的残基24-39、55-61和94-102；
m)抗体5G7-22的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:54的残基31-35、50-66和99-102，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:55的残基24-34、50-56和89-97；
n)抗体5G7-25的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:56的残基31-35、50-66和99-102，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:57的残基24-34、50-56和89-97；
o)抗体19G3-11的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:60的残基31-35、50-66和99-101，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:62的残基24-39、55-61和94-102；以及
p)抗体19G3-22的CDR，其中，CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:63的残基31-35、50-66和99-101，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:64的残基24-39、55-61和94-102。
6.权利要求5的抗体，包含选自下组的重链和轻链可变结构域序列：
a)抗体12D6-03的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的残基1-119和1-112；
b)抗体12D6-22的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112；
c)抗体12D6-23的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的残基1-119和1-112；
d)抗体12D6-24的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112；
e)抗体5F11-17的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的残基1-117和1-111；
f)抗体5F11-23的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的残基1-117和1-111；
g)抗体5F11-45的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的残基1-117和1-111；
h)抗体8E8-56的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的残基1-122和1-112；
i)抗体8E8-62的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的残基1-122和1-112；
j)抗体8E8-67的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的残基1-122和1-112；
k)抗体8E8-70的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:49的残基1-122和1-112；
l)抗体8E8-71的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的残基1-122和1-112；
m)抗体5G7-22的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的残基1-113和1-107；
n)抗体5G7-25的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的残基1-113和1-107；
o)抗体19G3-11的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的残基1-112和1-112；以及
p)抗体19G3-22的重链和轻链可变区，分别包含SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的残基1-112和1-112。
7.前述权利要求中任一项的抗体，其中，所述抗体进一步包含经修饰以增强与FcγRIIb结合的特异性的Fc区。
8.权利要求7的抗体，所述抗体表现出小于5的A/I比率。
9.权利要求8的抗体，所述抗体表现出小于1的A/I比率。
10.权利要求7的抗体，其中，所述修饰的Fc区在重链恒定区中，所述重链恒定区选自下组：SE(SEQ ID NO:66)，SELF(SEQ ID NO:67)，P238D(SEQ ID NO:68)，V4(SEQ ID NO:69)，V4 D270E(SEQ ID NO:70)，V7(SEQ ID NO:71)，V8(SEQ ID NO:72)，V9(SEQ ID NO:73)，V9D270E(SEQ ID NO:74)，V11(SEQ ID NO:75)，以及V12(SEQ ID NO:76)。
11.权利要求5的抗体，其包含选自下组的重链和轻链序列：
a)抗体12D6-24-P238D的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:9的序列；
b)抗体12D6-24-SE的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:9的序列；
c)抗体12D6-24-SELF的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:9的序列；
d)抗体12D6-24-V4的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:9的序列；
e)抗体12D6-24-V4 D270E的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:9的序列；
f)抗体12D6-24-V8的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:9的序列；
g)抗体12D6-24-V9的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:9的序列；
h)抗体12D6-24-V9 D270E的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:9的序列；
i)抗体12D6-24-V11的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:9的序列；
j)抗体12D6-24-V12的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:9的序列；
k)抗体5F11-45-SE的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:30的序列；
l)抗体5F11-45-SELF的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:30的序列；
m)抗体5F11-45-V4的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:30的序列；
n)抗体5F11-45-V4 D270E的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:30的序列；
o)抗体5F11-45V8的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:30的序列；
p)抗体5F11-45-V9的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:30的序列；
q)抗体5F11-45-V9 D270E的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:30的序列；
r)抗体5F11-45-V11的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:30的序列；以及
s)抗体5F11-45-V12的重链和轻链，分别包含SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:30的序列。
12.一种核酸，其编码权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合部分的重链和/或轻链可变区。
13.一种表达载体，其包含权利要求12的核酸分子。
14.用权利要求13的表达载体转化的细胞。
15.一种制备抗人CD40抗体或其抗原结合部分的方法，包括：
a)在权利要求14的细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分；以及
b)从所述细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
16.一种药物组合物，包括：
a)权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合部分；以及
b)载体。
17.一种刺激受试者的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用权利要求16的药物组合物。
18.权利要求17的方法，其中，所述受试者有肿瘤，并且针对所述肿瘤的免疫应答被刺激。
19.权利要求17的方法，其中，所述受试者有慢性病毒感染，并且针对所述病毒感染的免疫应答被刺激。
20.一种治疗癌症的方法，包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求16的药物组合物。
21.权利要求20的方法，其中，所述癌症由以下各项组成的组：膀胱癌，乳腺癌，子宫癌/宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，睾丸癌，食道癌，胃肠癌，胰腺癌，结肠直肠癌，结肠癌，肾癌，头颈癌，肺癌，胃癌，生殖细胞癌，骨癌，肝癌，甲状腺癌，皮肤癌，中枢神经系统肿瘤，淋巴瘤，白血病，骨髓瘤，肉瘤，以及病毒相关癌症。
22.一种治疗慢性病毒感染的方法，包括：向需要治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求16的药物组合物。
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