ES2879552T3

ES2879552T3 - Anticuerpos anti-CD40 y métodos de uso

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Publication number: ES2879552T3
Application number: ES13786884T
Authority: ES
Inventors: Yongke Zhang; Guo-Liang Yu; Weimin Zhu
Original assignee: Apexigen Inc
Current assignee: Apexigen Inc
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2021-11-22
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: AU2013337903B2; EP3925977A1; KR102270618B1; AU2018256638B2; US20230406948A1; JP2020195388A; JP2018166522A; CN104918957A; AU2018256638A1; JP6693745B2; CN104918957B; EP2914627B1; JP2022191360A; DK2914627T3; US20140120103A1; JP7482184B2; HK1213581A1; NZ707086A; US20220049006A1; WO2014070934A1

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al CD40 humano y comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la región VHCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:3, la región VHCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:4 y la región VHCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:5; (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:6, la región VLCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:7, y la región VLCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:8; y una región Fc de IgG1 humana modificada por una mutación S267E.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CD40 y métodos de uso

Antecedentes

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos anti-CD40, composiciones y métodos de uso de los mismos. Tales anticuerpos son útiles, por ejemplo, en métodos para tratar una variedad de enfermedades oncológicas.

Descripción de la técnica relacionada

La mayoría de las leucemias y linfomas se originan a partir de la transformación maligna de células del linaje B. La expresión de antígenos de superficie celular restringidos al linaje B, tales como CD20, los convierte en una diana atractiva para la terapia con anticuerpos. La terapia con anticuerpos ha cambiado drásticamente el tratamiento de los pacientes con linfoma no Hodgkin (NHL) y leucemia linfocítica crónica (LLC). Desde la aprobación de rituximab, el anticuerpo solo o en combinación con quimioterapia ha mejorado notablemente las tasas de respuesta, los resultados a largo plazo y la calidad de vida (Chinn P, Braslawsky G, White C, y otros, Antibody therapy of non-Hodgkin's B-cell lymphoma. Cancer Immunol Immunother 2003; 52:257-280.; Rastetter W, Molina A, White Ca . Rituximab: Expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases. Annu Rev Med 2004; 55:477-503). Sin embargo, un número sustancial de pacientes exhibe resistencia primaria o adquirida al rituximab, lo que sugiere que los enfoques actuales dirigidos a CD20 tienen limitaciones en los resultados clínicos, y existe la necesidad de mejora mediante el desarrollo de nuevos productos inmunoterapéuticos para el linfoma de células B y la leucemia con distintos mecanismos de acción. (Stolz C, Schuler M. Molecular mechanisms of resistance to Rituximab and pharmacologic strategies for its circumvention. Leukemia and lymphoma. 2009; 50(6):873 - 885; Bello C, Sotomayor EM. Monoclonal antibodies for B-cell lymphomas: Rituximab and beyond. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007; 233-242; Dupire S, Coiffier B. Targeted treatment and new agents in diffuse large B cell lymphoma. Int J Hematol 2010; 18 de junio (en línea)), tales como el mAb anti-CD40, APX005.

La función de CD40 en la regulación de las respuestas inmunitarias

La activación completa de las células T requiere dos señales distintas pero sinérgicas. La primera señal, suministrada a través del receptor de antígeno de células T, la proporcionan el antígeno y el complejo MHC en las APC y es responsable de la especificidad de la respuesta inmunitaria. La señal secundaria o coestimuladora es a través de la interacción de CD28 con B7-1 (CD80)/B7-2 (CD86) y CD40 con CD40L, que se requieren para ensamblar una respuesta de células T a escala completa. En ausencia de señales coestimuladoras, las células T pueden experimentar falta de respuesta (anergia) o muerte celular programada (apoptosis) tras la estimulación antigénica.

CD40, un miembro de la superfamilia del receptor de TNF (TNFR), se expresa principalmente en las células B y otras células presentadoras de antígeno (APC) tales como las células dendríticas y los macrófagos. El ligando de CD40 (CD40L) se expresa principalmente en células T activadas.

La interacción de CD40 y CD40L sirve como una señal coestimuladora para la activación de células T. El acoplamiento CD40-CD40L en las células B en reposo induce la proliferación, el cambio de clase de inmunoglobulina, la secreción de anticuerpos y también tiene una función en el desarrollo de centros germinales y la supervivencia de las células B de memoria, todos los cuales son esenciales para las respuestas inmunitarias humorales (Kehry MR. J Immunol 1996; 156:2345-2348). La unión de CD40L a CD40 en las células dendríticas induce la maduración de las DC que se manifiesta por el aumento de la expresión de moléculas coestimuladoras tales como la familia B7 (CD80, CD86) y la producción de citocinas proinflamatorias tales como la interleucina 12. Estas conducen a respuestas potentes de las células T (Stout, R. D., J. Suttles. 1996. Immunol. Today 17:487-492; Brendan O'Sullivan, Ranjeny Thomas. Critical Reviews in Immunology 2003; 23: 83-107; Cella, M., D. Scheidegger, K. Palmer-Lehmann, P. Lane, A. Lanzavecchia, G. Alber. J. Exp. Med. 1996; 184:747-452).

La transducción de señales de CD40 activa múltiples vías, que incluyen NF-KappaB (factor nuclear-KappaB), MAPK (proteína quinasa activada por mitógenos) y STAT3 (transductores de señales y activadores de la transcripción-3) (Pype S y otros, J Biol Chem. 2000 16 de junio; 275(24):18586-93) que regulan la expresión génica a través de la activación de proteínas activadoras, c-Jun, ATF2 (factor de transcripción activador-2) y factores de transcripción Rel (Dadgostar H y otros, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 5 de febrero; 99(3):1497-502). Las proteínas adaptadoras del factor asociado al receptor de TNFR (por ejemplo, TRAF1, TRAF2, t Ra F3, TRAF5 y TRAF6) interactúan con este receptor y sirven como mediadores de la transducción de señales. En dependencia del tipo de célula particular, el acoplamiento de CD40 da como resultado un patrón de expresión génica particular. Los genes activados en respuesta a la señalización de CD40 incluyen numerosas citocinas y quimiocinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alfa y proteína inflamatoria de macrófagos-1Alfa (MIP1Alfa). En ciertos tipos de células, la activación de CD40 puede dar como resultado la producción de radicales citotóxicos (Dadgostar y otros, Supra), COX2 (ciclooxigenasa-2) y producción de NO (óxido nítrico).

La función de CD40 en los tumores

El CD40 no solo se expresa en las células inmunitarias normales, sino también en muchas células malignas. En particular, CD40 se sobreexpresa en NHL de linaje B, leucemias linfocíticas crónicas (CLL), leucemias de células pilosas (HCL), enfermedad de Hodgkin (Uckun FM, Gajl-Peczalska K, Myers DE, y otros, Blood 1990;76:2449-2456; O'Grady JT, Stewart S, Lowrey J y otros, Am J Pathol 1994;144: 21-26), mieloma múltiple (Pellat-Deceunynck C, Bataille R, Robillard N, Harousseau JL, Rapp MJ, Juge-Morineau N, Wijdenes J, Amiot M. Blood. 1994; 84(8):2597-603), así como en carcinomas de la vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe y melanoma maligno (Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher NJ y otros, Immunol Today 1998;19:502-6; Ziebold JL, Hixon J, Boyd A y otros, Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2000; 48: 225-33; Gladue R, Cole S, Donovan C y otros, J Clin Oncol 2006;24 (18S):103s).

La unión de CD40 en la superficie de las células tumorales, que en muchos casos, media un efecto citotóxico directo, da como resultado la regresión del tumor por apoptosis y necrosis (Grewal IS, Flavell RA. Annu Rev Immunol 1998;16:111-35; van Kooten C, Banchereau J. J. Leukoc Biol 2000; 67(1):2-17). Aunque las funciones exactas de CD40 en las células tumorales no están claras (Tong AW, Stone MJ. Cancer Gene Ther. 2003 10(1):1-13), el acoplamiento de CD40 in vitro inhibe el crecimiento de células de tumores sólidos y células de linfoma de células B de alto grado (Magi Khalil y Robert H. Vonderheide. Update Cancer Ther 2007; 2(2): 61-65; Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher Nj , Dawson CW. Immunol Today 1998;19(11):502-6; Funakoshi S, Longo DL, Beckwith M y otros, Blood 1994;83(10):2787-94; Hess S, Engelmann H. J Exp Med 1996;183(1):159-67; Eliopoulos AG, Dawson CW, Mosialos G y otros, Oncogene 1996;13(10):2243-54; von Leoprechting A, van der Bruggen P, Pah1HL, Aruffo A, Simon JC. Cancer Res 1999;59(6): 1287-94). Estos efectos contrastan con la proliferación inducida después del acoplamiento de CD40 en células B no neoplásicas y células dendríticas.

Además de la inhibición directa del tumor, la activación de la señalización de CD40 rescata la función de las células presentadoras de antígeno en huéspedes portadores de tumor y desencadena o restaura respuestas inmunitarias activas contra antígenos asociados a tumor. Se ha informado que los agonistas de CD40 superan la tolerancia de células T en ratones portadores de tumor, evocan respuestas de células T citotóxicas efectivas contra antígenos asociados a tumor y potencian la eficacia de las vacunas antitumorales (Eliopoulos AG, Davies C, Knox PG y otros, Mol Cell Biol 2000;20(15): 5503-15; Tong AW, Papayoti MH, Netto G y otros, Clin Cancer Res 2001;7(3):691-703).

CD40 como diana molecular

CD40 se sobreexpresa en una amplia variedad de células malignas. Las funciones de CD40 en la inhibición de tumores y la estimulación del sistema inmunitario convierten a CD40 en una diana atractiva para una inmunoterapia basada en anticuerpos (van Mierlo GJ, den Boer AT, Medema JP y otros, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(8): 5561-5566; French RR, Chan HT, Tutt AL, Glennie MJ. Nat Med. 1999;5(5):548-553). Los anticuerpos anti-CD40 pueden actuar contra las células cancerosas por medio de múltiples mecanismos: (i) función efectora de anticuerpos tal como ADCC, (ii) un efecto citotóxico directo sobre las células tumorales y (iii) activación de respuestas inmunitarias antitumorales.

Anticuerpos terapéuticos anti-CD40 en desarrollo

Se ha informado que varios anticuerpos anti-CD40 tienen potencial como agentes terapéuticos antitumorales. CP-870,893 es un anticuerpo IgG2 contra CD40 agonista completamente humano desarrollado por Pfizer. Se une a CD40 con una Kd de 3,48 x 10'1° M, pero no bloquea la unión de CD40L (ver por ejemplo, la patente de EE. UU. núm.

7,338,660). CP-870893 no ha mostrado efectos ADCC; posiblemente debido a su isotipo IgG2. Por lo tanto, este anticuerpo actúa como un agonista de CD40 (es decir, no afecta la unión de CD40L), induce la señalización proapoptótica y activa las DC y la vigilancia inmunitaria. Sin embargo, este anticuerpo no media la ADCC.

HCD122 es un anticuerpo IgG1 antagonista de CD40 completamente humano desarrollado por Novartis. Se une a CD40 con una Kd de 5,1 x 10'1° M, bloquea la unión de CD40 a CD40L, inhibe la señalización inducida por el ligando de CD40 y los efectos biológicos sobre las células B y ciertas células de CLL y MM primarios (Tai YT y otros, Cancer Res. 2005 1 de julio;65(13):5898-906; Luqman M, Klabunde S y otros, Blood 112:711-720, 2008). El principal mecanismo de acción de su efecto antitumoral in vivo es ADCC (Long L y otros, 2005 IMF Oral Presentation and Abstract No. 3; Blood 2004, 104(11, Parte 1): Resumen 3281). Debido a su característica antagonista, este anticuerpo puede no inducir directamente una respuesta inmunitaria antitumoral mediada por CD40.

SGN-40 es un anticuerpo IgG1 humanizado desarrollado por Seattle Genetics a partir del clon de anticuerpo de ratón S2C6, que se generó con el uso de una línea celular de carcinoma de vejiga humano como inmunógeno. Se une a CD40 con una Kd de 1,0 x 10'9 M y funciona a través de la potenciación de la interacción entre CD40 y CD40L, por lo que exhibe un efecto agonista parcial (Francisco JA y otros, Cancer Res, 60: 3225-31, 2000). SGN-40 suministra señales de inhibición de la proliferación y apoptosis a un panel de líneas de linfoma B originadas a partir de células de linfoma no Hodgkin de alto grado y MM (Tai YT, Catley LP, Mitsiades CS y otros, Cancer Res 2004;64(8):2846-2852). Los estudios in vitro e in vivo sugieren que tanto la señalización apoptótica como la función efectora de anticuerpos por medio de ADCC contribuyen a la actividad antitumoral de SGN-40 (Law CL, Gordon KA, Collier J y otros: Cancer Res 2005; 65:8331-8338). Un estudio reciente sugirió que la actividad antitumoral de SGN-40 depende significativamente de las interacciones de Fc con las células efectoras y que los macrófagos son los principales efectores que contribuyen a sus actividades terapéuticas (Oflazoglu E y otros, Br J Cancer. 13 de enero de 2009; 100(1): 113-7. Epub 9 de diciembre de 2008). Dado que SGN-40 es un agonista parcial y requiere la expresión de CD40L en células T, SGN-40 puede tener una capacidad limitada para estimular completamente la respuesta inmunitaria antitumoral. El documento WO2003/040170 A2 se refiere a anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a CD40, preferentemente CD40 humano, y que funcionan como agonistas de CD40.

Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de nuevos inmunoterapéuticos que se dirijan a CD40 y que actúen como agonistas de esta diana, activen las células dendríticas y la vigilancia inmunitaria y que activen la ADCC, para proporcionar de este modo mejores propiedades antineoplásicas.

Breve resumen

La invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano y comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la región VHCDR1 expuesta en la SEQ ID No :3, la región VHCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:4 y la región VHCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:5; (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:6, la región VLCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:7 y la región VLCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:8; y una región Fc de IgG1 humana modificada por una mutación S267E.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención. La invención también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención. La invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende el vector de la invención. La invención también proporciona una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

Un aspecto de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la región v Hc DR1 expuesta en la SEQ ID NO:3, la región VHCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:4 y la región VHCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:5; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:6, la región VlCDr 2 expuesta en la SEQ ID NO:7 y la región VLCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:8; o una variante de dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera idénticas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de (i) y (ii) excepto por hasta 8 sustituciones de aminoácidos en dichas regiones CDR. En un ejemplo de los anticuerpos descritos en el presente documento, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1. En un ejemplo adicional, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1. En un ejemplo de este aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En un ejemplo adicional de este aspecto, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.

Otro aspecto adicional de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2. En un ejemplo de este aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1.

En ciertas modalidades, los anticuerpos aislados como se describen en el presente documento están humanizados. Se exponen regiones variables de anticuerpos humanizados ilustrativas en la secuencia de aminoácidos de la región VH de SEQ ID NO:9 y la secuencia de aminoácidos de la región VL de SEQ ID NO:10.

En un ejemplo, un anticuerpo aislado descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo de cadena sencilla, un ScFv, un anticuerpo univalente que carece de una región bisagra, un minicuerpo, un Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2. En ciertas modalidades, los anticuerpos en el presente documento son anticuerpos completos.

Los anticuerpos aislados como se describen en el presente documento comprenden un dominio constante de IgG humana, tal como, pero sin limitarse a, un dominio CH1 de IgG1 o una región Fc de IgG1.

Un ejemplo adicional de la descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite con los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento por la unión a CD40 humano.

En un aspecto de esta descripción, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40, se une con una KD de 0,96 nM o menos. En una modalidad adicional, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40, se une con una Kd de entre 1,1 nM y 0,90 nM. En una modalidad adicional, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40, se une con una Kd de aproximadamente 1,2, 1,1, 1,0, 0,99, 0,98, 0,97, 0,96, 0,95, 0,94, 0,93, 0,92, 0,91, 0,90, 0,85 o aproximadamente 0,80 nM. En otra modalidad, el anticuerpo se une a CD40 con una Kd de aproximadamente 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4 o 1,3 nM.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo: bloquea la unión de CD40 a CD40L; es un agonista de CD40; activa las células presentadoras de antígeno; estimula la liberación de citocinas de las células presentadoras de antígeno; induce la apoptosis de las células tumorales; inhibe la proliferación de células tumorales; destruye las células tumorales por medio de la inducción de funciones efectoras seleccionadas del grupo que consiste en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, citotoxicidad dependiente del complemento y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos; estimula las respuestas de células T antitumorales; reduce los tumores establecidos; inhibe los tumores resistentes a rituximab; o una combinación de uno cualquiera o más de los mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40, que comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende la VHCDR1, la VHCDR2 y la VHCDR3 de cualquiera de las regiones VH mostradas en la Figura 16; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1, la VLCDR2 y la VLCDR3 de la región VL correspondiente de cualquiera de las regiones VL mostradas en la Figura 16; o una variante de dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera idénticas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de (i) y (ii) excepto por hasta 8 sustituciones de aminoácidos en dichas regiones CDR.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD40, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una cualquiera de las regiones VH mostradas en la Figura 16. En un ejemplo, un anticuerpo de este tipo comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la región VL correspondiente, como se muestra en la Figura 16. En otro ejemplo, un anticuerpo de este tipo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además la región variable de cadena ligera correspondiente como se muestra en la Figura 16.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD40, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una cualquiera de las regiones VL mostradas en la Figura 16. En un ejemplo, un anticuerpo de este tipo comprende además una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la región VH correspondiente, como se muestra en la Figura 16. En otro ejemplo, un anticuerpo de este tipo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además la región variable de cadena pesada correspondiente como se muestra en la Figura 16.

La presente descripción también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describe en el presente documento.

La presente descripción también proporciona composiciones que comprenden un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona el anticuerpo de la invención para el uso en un método para tratar a un paciente que tiene un cáncer, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, para de este modo tratar el cáncer. En ciertas modalidades, el cáncer está asociado con una expresión aberrante de c D40. En modalidades adicionales, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas del páncreas, colon, intestino gástrico, próstata, vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente que tiene cáncer y/o enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento, para de este modo tratar al paciente que tiene enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para mejorar los síntomas en un paciente que tiene cáncer y/o enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento, para de este modo mejorar los síntomas en el paciente que tiene cáncer y/o enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:11. En un ejemplo, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:11 y comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:22 o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:22. En ciertos ejemplos, un anticuerpo aislado descrito en el presente documento comprende la cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO:22 y comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:11.

Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:13. En un ejemplo, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:13 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:24. En un ejemplo, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:24.

Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID n O:24. En un ejemplo, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:24 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:13.

En ciertos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:17. En un ejemplo, el anticuerpo aislado que se une a CD40 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:17 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácido expuesta en la SEQ ID NO:28. En un ejemplo, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:28.

Otro aspecto de la descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:28. En un ejemplo, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:28 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:17.

Otro aspecto de la descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:19. En un ejemplo, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:19 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:30. En un ejemplo particular, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:30.

Otro aspecto adicional de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:30. En un ejemplo, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:30 y una región variable de cadena pesada que comprende un secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:19.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR de región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las CDR de región variable de cadena ligera correspondientes, en donde las CDR son como se muestra en la Figura 16.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un epítopo de CD40 expuesto en una cualquiera o más de las SEQ ID NO:196, 197, 199 y 202. En una modalidad particular, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une al epítopo de CD40 expuesto en la SEQ ID NO:202 Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento, que se une a los epítopos de CD40 expuestos en las SEQ ID NO:196, 197, 199 o 202, no comprende las CDR expuestas en las s Eq ID NO:3-8. En una modalidad, el anticuerpo aislado que se une a un epítopo de CD40 expuesto en una o más de las SEQ ID NO:196, 197, 199 y 202, comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la región VHCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:3, la región VHCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:4 y la región VHCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:5; y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:6, la región VLCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:7 y la región VLCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:8; dicho anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende además una región Fc modificada de manera que el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene mayor afinidad de unión a FcyRIIB, mayor ADCC o mayor actividad agonista anti-CD40, o una combinación de los mismos, en comparación con dicho anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una versión no modificada de dicha región Fc. En este sentido, la región Fc comprende una mutación S267E.

La presente descripción también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo de CD40 expuesto en una cualquiera o más de las SEQ ID NO:196, 197, 199 y 202; vectores de expresión que comprenden el polinucleótido aislado y células huésped aisladas que comprenden dicho vector.

La presente descripción también proporciona composiciones que comprenden un portador fisiológicamente excepto y una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos aislados o fragmento de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo de CD40 expuesto en una cualquiera o más de las SEQ ID NO:196, 197, 199 y 202

La presente descripción proporciona además métodos para tratar o mejorar el cáncer en un paciente que comprenden administrar al paciente las composiciones que comprenden los anticuerpos que se unen a un epítopo de CD40 expuesto en una o más de las s Eq ID NO:196, 197, 199 y 202, como se describe en el presente documento. En este sentido, el cáncer puede ser linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de la vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno o NHL o leucemias resistentes a rituximab.

La presente descripción también proporciona métodos para mejorar los síntomas de enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria en un paciente mediante la administración al paciente de las composiciones que comprenden los anticuerpos que se unen a un epítopo de CD40 expuesto en una cualquiera o más de las SEQ ID NO:196, 197, 199 y 202.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la región VH del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la región VL del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos de la región VHCDR1 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la región VHCDR2 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos de la región VHCDR3 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de la región VLCDR1 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoácidos de la región VLCDR2 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de la región VLCDR3 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

La SEQ ID NO:9 es la secuencia de aminoácidos de la región VH de APX005, la versión humanizada del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8, sin un péptido señal.

La SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoácidos de la región VL de APX005, la versión humanizada del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8, sin un péptido señal.

Las SEQ ID NO:11-21 y 33-44 son secuencias de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpos candidatos anti-CD40 de conejo que mostraron actividad funcional (ver la Figura 16).

Las SEQ ID NO:22-32 y 45-56 son secuencias de aminoácidos de cadena ligera de anticuerpos candidatos anti-CD40 de conejo que mostraron actividad funcional (ver la Figura 16).

Las SEQ ID Nos:57-79 son las secuencias de aminoácidos de VHCDR1 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la Figura 16.

Las SEQ ID Nos:80-102 son las secuencias de aminoácidos de VHCDR2 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la Figura 16.

Las SEQ ID Nos:103-125 son las secuencias de aminoácidos de VHCDR3 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la Figura 16.

Las SEQ ID Nos:126-148 son las secuencias de aminoácidos de VLCDR1 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la Figura 16.

Las SEQ ID Nos:149-171 son las secuencias de aminoácidos de VLCDR2 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la Figura 16.

Las SEQ ID Nos:172-194 son las secuencias de aminoácidos de VLCDR3 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la Figura 16.

La SEQ ID NO:195 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 humana que comprende una región Fc con una sustitución S267E.

La SEQ ID NO:196 son los aminoácidos 92-107 de CD40 humano, identificados como un epítopo que se une al anticuerpo APX005.

La SEQ ID NO:197 son los aminoácidos 125-144 de CD40 humano, identificados como un epítopo que se une al anticuerpo APX005.

La SEQ ID NO:198 es la secuencia de aminoácidos de CD40 humano.

La SEQ ID NO:199 es la secuencia de aminoácidos de un péptido CLIPS CD40, del residuo 84-102 de CD40.

La SEQ ID NO:200 es la secuencia de aminoácidos de los residuos 84-102 de CD40 con sustituciones de serina para los residuos de cisteína en la posición 91 y 96.

La SEQ ID NO:201 son los residuos de aminoácidos 122-125 de CD40 humano.

La SEQ ID NO:202 son los residuos de aminoácidos 92-102 de CD40 humano que se unen al anticuerpo APX005. Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1D muestran los resultados del cribado de anticuerpos agonistas por medición de la maduración de DC y la activación de células T como se describe en el Ejemplo 1. 1A: expresión de CD83; 1B: expresión de CD80; 1C: expresión de CD86; 1D: proliferación de células T en una reacción de linfocitos mixtos.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la comparación de candidatos de mayor actividad en la inhibición de la proliferación de células Ramos.

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo de ADCC. Relación de células efectoras (PBMC humanas):diana (célula Ramos) de 40:1.

La Figura 4A y la Figura 4B son gráficos que muestran los resultados del cribado in vivo de la actividad antitumoral de candidatos anti-CD40.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA que demuestra que APX005 se une selectivamente a CD40 pero no a otros miembros de la familia de TNFR.

La Figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA que demuestra que APX005 bloquea la unión de CD40L a CD40.

La Figura 7 es un gráfico que muestra que APX005 no se internaliza tras la unión a células positivas para CD40.

La Figura 8A y la Figura 8B son gráficos que muestran la ADCC mediada por APX005 de células tumorales Ramos (Figura 8A) y Daudi (Figura 8B) positivas para CD40.

La Figura 9A y la Figura 9B son gráficos que muestran la inhibición in vitro de la proliferación de células tumorales Ramos por APX005. Panel A: sin reticulación de Fc; Panel B: con reticulación de Fc.

La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la inducción de la activación de DC por APX005.

Las Figuras 11A y 11B muestran que APX005 se une al CD40 humano y de mono, pero no al CD40 de ratón.

La Figura 12A es un gráfico que muestra la inhibición por APX005 del crecimiento tumoral en un modelo Ramos. La Figura 12B es un gráfico de barras que muestra los niveles de IgG humana sérica en ratones el día 34, dos días después de la última dosificación.

Las Figuras 13A y 13B son gráficos que muestran la inhibición de tumores pretratados y resistentes a rituximab en un modelo de ratón.

La Figura 14 es un gráfico que muestra la inhibición por APX005 del crecimiento tumoral en el modelo de ratón Raji.

La Figura 15 es un gráfico que muestra la potente actividad antitumoral de APX005 contra mieloma múltiple humano en el modelo de xenoinjerto IM-9.

La Figura 16A-16L es un alineamiento de secuencias de secuencias de anticuerpos anti-CD40 de conejo de cadena pesada (Figuras 16A-16F) y de cadena ligera (Figuras 16G-16L). Las CDR1-3 de cadena pesada y ligera están subrayadas. Las SEQ ID NO son las siguientes: Cadena pesada: R-3 y R-6: SEQ ID NO:11, 12; R-8: Se Q ID NO:1; R-9, -16, -18, -24, -33, -36, 19-21, -45, -59: SEQ ID NO:13-21, respectivamente; R-2, R-5, R-7, R-10, R-12, R-20, R-26, R-30, R-35, 19-35, 19-41, 19-57: SEQ ID Nos:33-44, respectivamente. Cadena ligera: R-3 y R-6: SEQ ID NO:22 y 23; R-8: SEQ ID NO:2; R-9, -16, -18, -24, -33, -36, 19-21, -45, -59: SEQ ID NO:24-32, respectivamente; R-2, R-5, R-7, R-10, R-12, R-20, R-26, R-30, R-35, 19-35, 19-41, 19-57: SEQ ID Nos:45-56, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos incluyen el péptido señal de VH y VL. Las secuencias de aminoácidos de VHCDR y VLCDR de R-8 se exponen en las SEQ ID Nos:3-8. Las secuencias de aminoácidos de VHCDR y las secuencias de aminoácidos de VLCDR para los anticuerpos restantes se exponen en las SEQ ID Nos:57-125 y SEQ ID Nos:126-194, respectivamente.

Las Figuras 17A y 17B muestran la inhibición del crecimiento tumoral en el modelo Ramos por APX005 en comparación con SGN-40 y rituximab.

Las Figuras 18A y 18B muestran la inhibición por APX005 del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de linfoma Namalwa humano resistente a rituximab.

La Figura 19 muestra una comparación de la unión de APX005 y APX005S267E a CD40.

La Figura 20 muestra la afinidad de unión de APX005 y mutante APX005 S267E en comparación con otros anticuerpos anti-CD40.

La Figura 21 muestra la actividad agonista de CD40 del mutante APX005 S267E. La EC50 (ng/ml) para este experimento fue la siguiente: APX005: 24,35; APX005 S267E: 4,15; SGN-40: 1264,00; CP870893: 37,00; 19-21: 74,65.

La Figura 22 muestra la actividad ADCC del mutante APX005 S267E.

La Figura 23 muestra la visualización de los epítopos de APX005 en la representación de dibujo (Figura 23A) y la representación de la superficie (Figura 23B) de la estructura de CD40 3QD6. El área del epítopo 92TSEACESCVLHRSCSP107 (SEQ ID NO:196) está mapeada en la estructura cristalina de CD40 y se indica en negrita. Los residuos 125-144, que también se encontraron que se unen al anticuerpo APX005, no se resuelven en la estructura 3QD6, pero en base a los datos disponibles sobre enlaces de cisteína, se espera que estén muy próximos a los residuos 92-107. Por lo tanto, con fines de referencia y visualización, se muestran los residuos 122-125 (SEQ ID NO:201).

Descripción detallada

La presente descripción se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a CD40, en particular anticuerpos que tienen especificidad epitópica específica y propiedades funcionales. Una modalidad de la invención abarca anticuerpos humanizados específicos y fragmentos de los mismos que pueden unirse a CD40 y funcionan como un agonista de CD40 mediante la inducción/potenciación de la señalización celular corriente abajo y los efectos biológicos mediados por CD40. En modalidades más específicas de la invención, los anticuerpos descritos en el presente documento se unen específicamente a CD40 con una afinidad muy alta, tal como una afinidad de al menos entre 980 y 950 picomolar, al menos entre 970 y 950 picomolar, y en ciertas modalidades con una afinidad de 960 picomolar. Los anticuerpos descritos en el presente documento, entre otros atributos, inducen la señalización de CD40 en células tumorales, activan las células dendríticas y la vigilancia inmunitaria, activan la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra las células tumorales, bloquean la unión de CD40 a CD40L; tienen actividad agonista de CD40; activan las células presentadoras de antígeno; estimulan la liberación de citocinas de las células presentadoras de antígeno; inducen la apoptosis de las células tumorales; inhiben la proliferación de células tumorales; destruyen las células tumorales por medio de la inducción de funciones efectoras que incluyen, pero no se limitan a, ADCC, CDC y ADCP; estimulan las respuestas de células T antitumorales; reducen los tumores establecidos; e inhiben los tumores resistentes a rituximab. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener o inducir una combinación de cualquiera de uno o más de estos atributos o actividades.

los ejemplos de la descripción se refieren al uso de anticuerpos anti-CD40 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para el diagnóstico, evaluación y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CD40 o la expresión aberrante del mismo. Los anticuerpos objeto se usan en el tratamiento o prevención de cánceres que incluyen, pero no se limitan a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de la vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias entre otras enfermedades.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro del conocimiento de la técnica, muchas de las cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Tales técnicas se explican completamente en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.(2009); Ausubel y otros, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra Edición, 2001); Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) y otras referencias similares.

Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo.

A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Cada modalidad de esta descripción se aplicará mutatis mutandis a cualquier otra modalidad a menos que se indique expresamente de otro modo.

Pueden usarse técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Estas y técnicas y procedimientos relacionados pueden realizarse generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente descripción. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, biología molecular, química analítica, química de síntesis orgánica y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para tecnología recombinante, biología molecular, microbiología, síntesis química, análisis químicos, preparación, formulación y suministro farmacéuticos y tratamiento de pacientes.

Las modalidades de la presente invención se refieren a anticuerpos que se unen a CD40. En particular, los anticuerpos descritos en el presente documento se unen específicamente a CD40 con una afinidad inesperadamente alta, potencian la actividad de señalización de CD40, activan el sistema inmunitario, activan la ADCC y tienen utilidad terapéutica para el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de CD40.

Las secuencias de anticuerpos ilustrativos, o fragmentos de unión a antígeno, o regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los mismos, se exponen en las SEQ ID NO:1-194.

Como bien se conoce en la técnica, un anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de epítopo, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena sencilla (ScFv), variantes sintéticas de los mismos, variantes naturales, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un fragmento de unión a antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio o fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida. "Diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión de genes (documento WO94/13804; P. Holliger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993) son también una forma particular de anticuerpo contemplada en el presente documento. Los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 también se incluyen en el presente documento (S. Hu y otros, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Ver, por ejemplo, Ward, E. S. y otros, Nature 341, 544-546 (1989); Bird y otros, Science, 242, 423-426, 1988; Huston y otros, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); PCT/US92/09965; documento WO94/13804; P. Holliger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993; Y. Reiter y otros, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu y otros, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996.

El término "fragmento de unión a antígeno" como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento polipeptídico que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une al antígeno de interés, en particular a CD40. En este sentido, un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en el presente documento puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de una secuencia VH y VL expuesta en el presente documento de anticuerpos que se unen a CD40. Un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos específicos para CD40 descritos en el presente documento puede unirse a CD40. En ciertas modalidades, un fragmento de unión a antígeno o un anticuerpo que comprende un fragmento de unión a antígeno previene o inhibe la unión de CD40L a CD40. En ciertas modalidades, el fragmento de unión a antígeno se une específicamente a y/o potencia o modula la actividad biológica de CD40 humano. Dicha actividad biológica incluye, pero no se limita a, señalización celular, activación de células dendríticas,

El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula que puede unirse a un agente de unión selectiva, tal como un anticuerpo, y adicionalmente que puede usarse en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante, preferentemente un determinante polipeptídico, que puede unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo. En ciertas modalidades, los determinantes epitópicos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y en ciertas modalidades pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de equilibrio de disociación es <10'7 o 10'8 M. En algunas modalidades, la constante de equilibrio de disociación puede ser <10'9 M o <10'1° M.

En ciertas modalidades, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, incluyen un conjunto de CDR de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente interpuestos entre un conjunto de región de marco estructural (FR) de cadena pesada y de cadena ligera que proporcionan soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. Como se usa en el presente documento, el término "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. A partir del extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como "CDR1", "CDR2" y "CDR3" respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una sola CDR (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se denomina en el presente documento "unidad de reconocimiento molecular". El análisis cristalográfico de varios complejos antígeno-anticuerpo ha demostrado que los residuos de aminoácidos de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en donde el contacto más extenso del antígeno es con la CDR3 de cadena pesada. Por lo tanto, las unidades de reconocimiento molecular son las principales responsables de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "conjunto de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueantes que enmarcan las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos residuos de FR pueden entrar en contacto con el antígeno unido; sin embargo, las FR son los principales responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión a antígeno, particularmente los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, ciertos residuos amino y ciertas características estructurales están muy altamente conservadas. En este sentido, todas las secuencias de la región V contienen un bucle disulfuro interno de alrededor de 90 residuos de aminoácidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se muestran como motivos de bucle proyectados que forman una superficie de unión a antígeno. Generalmente se reconoce que existen regiones estructurales conservadas de FR que influyen en la forma plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras "canónicas", independientemente de la secuencia de aminoácidos de CDR precisa. Además, se conoce que ciertos residuos de FR participan en contactos no covalentes entre dominios que estabilizan la interacción de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo.

Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse por referencia a Kabat, E. A. y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4ta Edición. US Department of Health and Human Services. 1987, y sus actualizaciones, ahora disponibles en Internet (immuno.bme.nwu.edu).

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea en donde el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (naturales y no naturales) que intervienen en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un solo epítopo. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena sencilla (ScFv), variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento del epítopo) de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un epítopo. No se pretende que esté limitado con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en que se produce (por ejemplo, por hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas así como los fragmentos, etc. descritos anteriormente bajo la definición de "anticuerpo".

La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente moléculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina puede escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, que incluyen el fragmento F(ab')2 que comprende ambos sitios de unión a antígeno. Un fragmento Fv para el uso de acuerdo con ciertos ejemplos de la presente descripción puede producirse mediante escisión proteolítica preferencial de una IgM y, en raras ocasiones, de una molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Sin embargo, los fragmentos Fv se obtienen más comúnmente con el uso de técnicas recombinantes conocidas en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero Vh::Vl no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que conserva gran parte de las capacidades de reconocimiento y unión al antígeno de la molécula de anticuerpo nativa.Inbar y otros, (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman y otros, (1976) Biochem 15:2706-2710; y Ehrlich y otros, (1980) Biochem 19:4091-4096.

En ciertos ejemplos, se contemplan anticuerpos Fv de cadena sencilla o scFV. Por ejemplo, cuerpos Kappa (III y otros, Prot. Eng. 10: 949-57 (1997); minicuerpos (Martin y otros, EMBO J 13: 5305-9 (1994); diacuerpos (Holliger y otros, PNAS 90: 6444-8 (1993); o Janusinas (Traunecker y otros, EMBO J 10: 3655-59 (1991) y Traunecker y otros, Int. J. Cancer Supl. 7: 51-52 (1992), pueden prepararse con el uso de técnicas estándar de biología molecular siguiendo las enseñanzas de la presente solicitud con respecto a la selección de anticuerpos que tienen la especificidad deseada. En otras modalidades más, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos o quiméricos que abarquen los ligandos de la presente descripción. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender CDR y regiones de marco estructural de diferentes anticuerpos, mientras que pueden generarse anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD40 a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. Estos anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de biología molecular recombinante o pueden conjugarse físicamente entre sí.

Un polipéptido Fv de cadena sencilla (sFv) es un heterodímero Vh::Vl unido de forma covalente que se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican Vh y Vl unidos por un enlazador que codifica un péptido. Huston y otros, (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Se han descrito varios métodos para discernir estructuras químicas para convertir las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas agregadas naturalmente, pero químicamente separadas, de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Ver, por ejemplo, las patentes de EE. UU. núm. 5,091,513 y 5,132,405, de Huston y otros; y la patente de EE. UU. núm. 4,946,778, de Ladner y otros.

En ciertos ejemplos, un anticuerpo de unión a CD40 como se describe en el presente documento está en forma de diacuerpo. Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, cada polipéptido comprende un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, los dos dominios están unidos (por ejemplo, mediante un enlazador peptídico) pero no pueden asociarse entre sí para formar un sitio de unión a antígeno: los sitios de unión a antígeno se forman mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (documento WO94/13804).

Un fragmento dAb de un anticuerpo consiste en un dominio VH (Ward, E. S. y otros, Nature 341, 544-546 (1989)).

Cuando se vayan a usar anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que pueden fabricarse en una variedad de formas (Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o puede ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Los diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, con el uso de solo dominios variables, lo que reduce potencialmente los efectos de la reacción antiidiotípica.

Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos biespecíficos completos, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente con el uso de presentación en fago (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces puede prepararse una biblioteca en donde se varíe el otro brazo y se seleccione un anticuerpo de la especificidad apropiada. Se pueden producir anticuerpos biespecíficos completos mediante ingeniería de botón en ojal (J. B. B. Ridgeway y otros, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

En ciertos ejemplos, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden proporcionarse en forma de UniBody®. Un UniBody® es un anticuerpo IgG4 con la región bisagra eliminada (ver GenMab Utrecht, Países Bajos; ver también, por ejemplo, el documento US20090226421). Esta tecnología de anticuerpos patentada crea un formato de anticuerpo estable y más pequeño con una ventana terapéutica anticipada más larga que los formatos de anticuerpo pequeño actuales. Los anticuerpos IgG4 se consideran inertes y, por lo tanto, no interactúan con el sistema inmunitario. Los anticuerpos IgG4 completamente humanos pueden modificarse mediante la eliminación de la región bisagra del anticuerpo para obtener fragmentos de semimolécula que tienen propiedades de estabilidad distintas con relación a la IgG4 intacta correspondiente (GenMab, Utrecht). Reducir a la mitad la molécula de IgG4 deja solo un área en el UniBody® que puede unirse a antígenos afines (por ejemplo, dianas de enfermedades) y, por lo tanto, el UniBody® se une de manera univalente a un solo sitio en las células diana. Para ciertos antígenos de superficie de células cancerosas, esta unión univalente puede no estimular el crecimiento de las células cancerosas, como puede verse con el uso de anticuerpos bivalentes que tienen la misma especificidad antigénica y, por tanto, la tecnología UniBody® puede ofrecer opciones de tratamiento para algunos tipos de cáncer que pueden ser resistentes al tratamiento con anticuerpos convencionales. El pequeño tamaño del UniBody® puede ser un gran beneficio en el tratamiento de algunas formas de cáncer, al permitir una mejor distribución de la molécula en tumores sólidos más grandes y potencialmente aumentar la eficacia.

En ciertos ejemplos, los anticuerpos de la presente descripción pueden adoptar la forma de un nanocuerpo. Los nanocuerpos están codificados por genes únicos y se producen de manera eficiente en casi todos los huéspedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, E. coli (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 6,765,087), mohos (por ejemplo, Aspergillus o Trichoderma) y levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Kluyvermyces, Hansenula o Pichia (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 6,838,254). El proceso de producción es escalable y se han producido cantidades de nanocuerpos de varios kilogramos. Los nanocuerpos pueden formularse como una solución lista para usar que tiene una larga vida útil. El método Nanoclone (ver, por ejemplo, el documento WO 06/079372) es un método patentado para generar nanocuerpos contra una diana deseada, basado en la selección de alta productividad automatizada de células B.

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD40 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describen en el presente documento están humanizados. Esto se refiere a una molécula quimérica, generalmente preparada con el uso de técnicas recombinantes, que tiene un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula basada en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados con dominios constantes o solo las CDR injertadas en regiones de marco estructural apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al epítopo pueden ser de tipo silvestre o estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. Esto elimina la región constante como inmunógeno en individuos humanos, pero permanece la posibilidad de una respuesta inmunitaria a la región variable extraña (LoBuglio, A. F. y otros, (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224; Queen y otros, PNAS (1988) 86:10029-10033; Riechmann y otros, Nature (1988) 332:323-327). Los métodos ilustrativos para la humanización de los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento incluyen los métodos descritos en la patente de EE. UU. núm. 7,462,697. Los anticuerpos humanizados ilustrativos de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención comprenden las secuencias humanizadas proporcionadas en las SEQ ID NO:9 y 10.

Otro enfoque se centra no solo en proporcionar regiones constantes de origen humano, sino también en modificar las regiones variables para remodelarlas lo más cerca posible de la forma humana. Se conoce que las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que varían en respuesta a los epítopos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones de marco estructural (FR) relativamente conservadas en una especie dada y que supuestamente proporcionan un andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un epítopo particular, las regiones variables se pueden "remodelar" o "humanizar" mediante el injerto de CDR derivadas de anticuerpos no humanos en las FR presentes en el anticuerpo humano a modificar. La aplicación de este enfoque a varios anticuerpos se ha informado en Sato, K., y otros, (1993) Cancer Res 53:851-856.Riechmann, L. y otros, (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. y otros, (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. y otros, (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. y otros, (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. y otros, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R. y otros, (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. y otros, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P. y otros, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; y Co, M. S. y otros, (1992) J Immunol 148:1149-1154. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR de los anticuerpos de ratón). En otros ejemplos, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente descripción pueden ser anticuerpos quiméricos. En este sentido, un anticuerpo quimérico está compuesto por un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-CD40 unido operativamente o fusionado de otro modo a una porción Fc heteróloga de un anticuerpo diferente. En ciertas modalidades, el dominio Fc heterólogo es de origen humano. En otras modalidades, el dominio Fc heterólogo puede ser de una clase de Ig diferente del anticuerpo original, que incluye IgA (que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. En modalidades adicionales, el dominio Fc heterólogo puede estar compuesto por dominios CH2 y CH3 de una o más de las diferentes clases de Ig. Como se señaló anteriormente con respecto a los anticuerpos humanizados, el fragmento de unión a antígeno anti-CD40 de un anticuerpo quimérico puede comprender solo una o más de las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento), o puede comprender un dominio variable completo (VL, VH o ambos).

En ciertos ejemplos, un anticuerpo de unión a CD40 comprende una o más de las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento. En este sentido, se ha demostrado en algunos casos que la transferencia de solo el VHCDR3 de un anticuerpo puede realizarse mientras se conserva la unión específica deseada (Barbas y otros, PNAS (1995) 92:2529-2533). Ver también, McLane y otros, PNAS (1995) 92:5214-5218, Barbas y otros, J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2161-2162.

Marks y otros (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describen métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpos en los que se usan cebadores consenso dirigidos al extremo 5' del área del dominio variable o adyacentes al mismo junto con cebadores consenso para la tercera región marco de genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks y otros describen además cómo este repertorio puede combinarse con una CDR3 de un anticuerpo particular. Con el uso de técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden reordenarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3, y los dominios VH o VL completos reordenados combinarse con un dominio VL o VH afín para proporcionar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD40. Después, el repertorio puede presentarse en un sistema huésped adecuado, tal como el sistema de presentación en fago del documento WO92/01047 de modo que puedan seleccionarse anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos adecuados. Un repertorio puede consistir en al menos de aproximadamente 104 miembros individuales y ascender en varios órdenes de magnitud, por ejemplo, hasta aproximadamente 106 a 108 o 1010 o más miembros. Las técnicas análogas de reordenamiento o combinación también se describen en Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), quien describe la técnica en relación con un gen de p-lactamasa pero hace la observación de que el enfoque puede usarse para la generación de anticuerpos.

Una alternativa adicional es generar nuevas regiones VH o VL portadoras de una o más secuencias derivadas de CDR de la descripción descrita en el presente documento con el uso de mutagénesis aleatoria de uno o más genes de VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable completo. Una técnica de este tipo se describe en Gram y otros (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), que usó PCR propensa a errores. Otro método que puede usarse es dirigir la mutagénesis a regiones CDR de genes de VH o VL. Tales técnicas se describen en Barbas y otros, (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) y Schier y otros (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

En ciertos ejemplos, se puede usar una VH y/o VL específica de los anticuerpos descritos en el presente documento para cribar una biblioteca del dominio variable complementario para identificar anticuerpos con propiedades deseables, tales como una mayor afinidad por CD40. Tales métodos se describen, por ejemplo, en Portolano y otros, J. Immunol. (1993) 150:880-887; Clarkson y otros, Nature (1991) 352:624-628.

También pueden usarse otros métodos para mezclar y combinar CDR para identificar anticuerpos que tienen la actividad de unión deseada, tal como la unión a CD40. Por ejemplo: Klimka y otros, British Journal of Cancer (2000) 83: 252-260, describen un proceso de cribado con el uso de una VL de ratón y una biblioteca de VH humanas con conservación de la CDR3 y la FR4 de la VH de ratón. Después de obtener los anticuerpos, la VH se cribó contra una biblioteca de VL humanas para obtener anticuerpos que se unen al antígeno. Beiboer y otros, J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849 describen un proceso de cribado con el uso de una cadena pesada de ratón completa y una biblioteca de cadenas ligeras humanas. Después de obtener los anticuerpos, se combinó una VL con una biblioteca de VH humanas con conservación de la CDR3 del ratón. Se obtuvieron anticuerpos que pueden unirse al antígeno. Rader y otros, PNAS (1998) 95:8910-8915 describen un proceso similar al de Beiboer y otros anterior.

Estas técnicas que se acaban de describir son, en sí mismas, conocidas como tales en la técnica. Sin embargo, el experto podrá usar tales técnicas para obtener anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con varias modalidades de la invención descritas en el presente documento, con el uso de metodología habitual en la técnica.

En el presente documento también se describe un método para obtener un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para el antígeno CD40, el método comprende proporcionar mediante la adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH expuesto en el presente documento, un dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH, opcionalmente por combinación del dominio VH así proporcionado con uno o más dominios VL, y evaluación del dominio VH o la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un miembro de unión específico o un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para CD40 y opcionalmente con una o más propiedades deseadas. Los dominios VL pueden tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se expone en el presente documento. Puede emplearse un método análogo en el que una o más variantes de secuencia de un dominio VL descrito en el presente documento se combinan con uno o más dominios VH.

Un epítopo que "se une específicamente" o "se une preferentemente" (usados indistintamente en el presente documento) a un anticuerpo o un polipéptido es un término bien conocido en la técnica, y los métodos para determinar tal unión específica o preferente también se conocen bien en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferente" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que con la que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferentemente a un epítopo de CD40 es un anticuerpo que se une a un epítopo de CD40 con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que con la que se une a otros epítopos de CD40 o epítopos que no son de CD40. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específicamente o preferentemente a una primera diana puede o no unirse específicamente o preferentemente a una segunda diana. Como tal, la "unión específica" o la "unión preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferente.

La unión inmunológica se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica, por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, como resultado de interacciones electrostáticas, iónicas, atracciones o repulsión hidrófilas y/o hidrófobas, fuerzas estéricas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y otras. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse con el uso de métodos bien conocidos en la técnica. Uno de estos métodos implica medir las velocidades de formación y disociación del complejo antígeno/sitio de unión a antígeno, en donde esas velocidades dependen de las concentraciones de los socios del complejo, la afinidad de la interacción y de los parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante de velocidad de asociación" (Kon) como la "constante de velocidad de disociación" (Koff) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. La relación de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad y, por lo tanto, es igual a la constante de disociación Kd. Ver, generalmente, Davies y otros, (1990) Rev. Anual Biochem. 59:439-473.

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento tienen una afinidad de aproximadamente 100, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 o 199 picomolar, y en algunas modalidades, los anticuerpos pueden tener una afinidad incluso mayor por CD40.

El término "inmunológicamente activo", con referencia a un epítopo que es o "permanece inmunológicamente activo", se refiere a la capacidad de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-CD40) de unirse al epítopo en diferentes condiciones, por ejemplo, después de someter al epítopo a condiciones reductoras y desnaturalizantes.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con ciertos ejemplos preferidos de la presente solicitud puede ser uno que compita por la unión a CD40 con cualquier anticuerpo descrito en el presente documento que (i) se une específicamente al antígeno y (ii) comprende un dominio VH y/o Vl descrito en el presente documento, o comprende una VH CDR3 descrita en el presente documento o una variante de cualquiera de estos. La competencia entre anticuerpos puede ensayarse fácilmente in vitro, por ejemplo con el uso de ELISA y/o por etiquetado con una molécula indicadora específica de un anticuerpo que puede detectarse en presencia de otros anticuerpos no etiquetados, para permitir la identificación de anticuerpos específicos que se unen al mismo epítopo o un epítopo superpuesto. Por lo tanto, en el presente documento se proporciona un anticuerpo específico o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo humano que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento que se une a CD40.

En este sentido, como se usa en el presente documento, los términos "compite con", "inhibe la unión" y "bloquea la unión" (por ejemplo, se refiere a la inhibición/bloqueo de la unión de CD40L a CD40 o se refiere a la inhibición/bloqueo de la unión de un anticuerpo anti-CD40 a CD40) se usan indistintamente y abarcan inhibición/bloqueo tanto parcial como completa/o. La inhibición y el bloqueo también pretenden incluir cualquier disminución medible en la unión de CD40L a CD40 cuando está en contacto con un anticuerpo anti-CD40 como se describe en el presente documento en comparación con el ligando que no está en contacto con un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el bloqueo de CD40L a CD40 en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

Las regiones constantes de inmunoglobulinas muestran menos diversidad de secuencias que las regiones variables y son responsables de la unión a varias proteínas naturales para provocar importantes eventos bioquímicos. En los seres humanos hay cinco clases diferentes de anticuerpos que incluyen IgA (que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. Las características distintivas entre estas clases de anticuerpos son sus regiones constantes, aunque pueden existir diferencias más sutiles en la región V.

La región Fc de un anticuerpo interactúa con varios ligandos y receptores de Fc, lo que imparte una serie de capacidades funcionales importantes denominadas funciones efectoras. Para IgG, la región Fc comprende los dominios CH2 y CH3 de Ig y la bisagra N-terminal que conduce a CH2. Una familia importante de receptores Fc para la clase IgG son los receptores Fc gamma (FcyR). Estos receptores median la comunicación entre los anticuerpos y el componente celular del sistema inmunitario (Raghavan y otros, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch y otros, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). En los seres humanos, esta familia de proteínas incluye FcyRI (CD64), que incluye las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), que incluye las isoformas FcyRlla (que incluye los alotipos H131 y R131), FcyRllb (que incluye FcyRllb-1 y FcyRllb-2) y FcyRllc; y FcyRIII (CD16), que incluye las isoformas FcyRllla (que incluye los alotipos V158 y F158) y FcyRlllb (que incluye los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2) (Jefferis y otros, 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estos receptores típicamente tienen un dominio extracelular que media la unión a Fc, una región transmembrana y un dominio intracelular que puede mediar algún evento de señalización dentro de la célula. Estos receptores se expresan en una variedad de células inmunitarias que incluyen monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (NK) y células T. La formación del complejo Fc/FcyR recluta estas células efectoras a los sitios del antígeno unido, lo que típicamente da como resultado eventos de señalización dentro de las células y respuestas inmunitarias posteriores importantes tales como la liberación de mediadores de inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis y ataque citotóxico.

La capacidad de mediar en las funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial por el cual los anticuerpos destruyen las células diana. La reacción mediada por células en donde las células citotóxicas inespecíficas que expresan los FcyR reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana se denomina citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) Raghavan y otros, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie y otros, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch y otros, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). La reacción mediada por células en donde las células citotóxicas inespecíficas que expresan los FcyR reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la fagocitosis de la célula diana se denomina fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP). Todos los FcyR se unen a la misma región en Fc, en el extremo N-terminal del dominio Cg2 (CH2) y la bisagra anterior. Esta interacción está bien caracterizada estructuralmente (Sondermann y otros, 2001, J Mol Biol 309:737-749) y se han resuelto varias estructuras del Fc humano unido al dominio extracelular del FcYRIIIb humano (código de acceso pdb 1E4K) (Sondermann y otros, 2000, Nature 406:267-273.) (códigos de acceso pdb 1IIS y 1IIX) (Radaev y otros, 2001, J Biol Chem 276:16469-16477.)

Las diferentes subclases de IgG tienen diferentes afinidades por los FcyR, típicamente IgG1 e IgG3 se unen sustancialmente mejor a los receptores que IgG2 e IgG4 (Jefferis y otros, 2002, Immunol Lett 82:57-65). Todos los FcyR se unen a la misma región en Fc de IgG, pero con diferentes afinidades: el aglutinante de alta afinidad FcyRI tiene una Kd para IgG1 de 10'8 M-1, mientras que los receptores de baja afinidad FcyRII and FcyRIII generalmente se unen a 10'6y 10'5 respectivamente. Los dominios extracelulares de FcyRllla y FcYRIIIb son 96 % idénticos, sin embargo, FcyRlllb no tiene un dominio de señalización intracelular. Además, mientras que FcyRI, FcYRIIa/c y FcYRIIIa son reguladores positivos de la activación desencadenada por inmunocomplejos, caracterizados por tener un dominio intracelular que tiene un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM), FcyRllb tiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) y, por lo tanto, es inhibidor. Por lo tanto, los primeros se denominan receptores de activación y FcyRIIb se denomina receptor inhibidor. Los receptores también difieren en el patrón de expresión y los niveles en diferentes células inmunitarias. Otro nivel más de complejidad es la existencia de varios polimorfismos de FcyR en el proteoma humano. Un polimorfismo particularmente relevante con importancia clínica es FcyRllla V158/F158. La IgG1 humana se une con mayor afinidad por el alotipo V158 que por el alotipo F158. Esta diferencia en afinidad, y presumiblemente su efecto sobre ADCC y/o ADCP, ha demostrado ser un determinante significativo de la eficacia del anticuerpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®, una marca registrada de IDEC Pharmaceuticals Corporation). Los pacientes con el alotipo V158 responden favorablemente al tratamiento con rituximab; sin embargo, los pacientes con el alotipo F158 de menor afinidad responden poco (Cartron y otros, 2002, Blood 99:754-758). Aproximadamente el 10-20 % de los seres humanos son homocigotos para V158/V158, el 45 % son heterocigotos para V158/F158 y el 35-45 % de los seres humanos son homocigotos F158/F158 (Lehrnbecher y otros, 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron y otros, 2002, Blood 99:754-758). Por lo tanto, el 80-90 % de los humanos responden poco, es decir, tienen al menos un alelo del FcYRIIIa F158.

La región Fc también interviene en la activación de la cascada del complemento. En la vía clásica del complemento, C1 se une con sus subunidades C1q a fragmentos Fc de IgG o IgM, que ha formado un complejo con antígeno(s). En ciertas modalidades de la invención, las modificaciones a la región Fc comprenden modificaciones que alteran (potencian o disminuyen) la capacidad de un anticuerpo específico para CD40 como se describe en el presente documento de activar el sistema del complemento (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. 7,740,847). Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro y otros, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)).

Por lo tanto, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos anti-CD40 que tienen una región Fc modificada con propiedades funcionales alteradas, tales como actividad de CDC, ADCC o ADCP reducida o potenciada, o afinidad de unión potenciada por un FcyR específico o mayor vida media en suero. Otras regiones Fc modificadas contempladas en el presente documento se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. 7,317,091; 7,657,380; 7,662,925; 6,538,124; 6,528,624; 7,297,775; 7,364,731 emitidas; las solicitudes de EE. UU. publicadas US2009092599; US20080131435; US20080138344; y las solicitudes internacionales publicadas WO2006/105338; WO2004/063351; WO2006/088494; WO2007/024249.

En una modalidad, una o más sustituciones en el Fc pueden aumentar la afinidad de unión a FcyRIIB, potenciar la reticulación de moléculas de CD40 y conducir a una activación de CD40 más fuerte por un anticuerpo anti-CD40. La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD40 que tienen una región Fc modificada en la posición 267 (numeración EU; ver, por ejemplo, Edelman, G.M. y otros, 1969 Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85; ver también el sitio web de la base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) en imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering). Un anticuerpo anti-CD40 de la invención comprende un Fc modificado que comprende una sustitución S267E (Li Fu, Ravetch JV. 2011 Science 333:1030; ver también J. Immunol. 2011, 187:1754-1763; mAbs 2010, 2:181-189). La secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada que comprende un Fc modificado ilustrativo se expone en la SEQ ID NO:195.

Por lo tanto, en ciertas modalidades, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas se fusionan con secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. En ciertas modalidades, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones Ch2 y Ch3. Se prefiere la presencia de la primera región constante de cadena pesada (Ch1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona una mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en modalidades donde relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no tienen un efecto significativo sobre el rendimiento de la combinación de cadenas deseada.

Los anticuerpos de la presente invención (y fragmentos de unión a antígeno y variantes de los mismos) también pueden modificarse de modo que incluyan una etiqueta o marcador de epítopo, por ejemplo, para el uso en aplicaciones de purificación o diagnóstico. Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para fabricar conjugados de anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, los descritos en la patente de EE. UU. núm. 5,208,020 o la patente EP 0425235 B1, y Chari y otros, Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disufuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas o grupos lábiles a esterasas, como se describe en las patentes identificadas anteriormente, con preferencia por los grupos disulfuro y tioéter.

En otra modalidad contemplada, un anticuerpo específico para CD40 como se describe en el presente documento puede conjugarse o unirse operativamente a otro compuesto terapéutico, denominado conjugado en el presente documento. El conjugado puede ser un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, una citocina, un agente antiangiogénico, un inhibidor de tirosina quinasa, una toxina, un radioisótopo u otro agente terapéuticamente activo. Se han descrito anteriormente agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina quinasa y otros agentes terapéuticos, y todos estos agentes terapéuticos mencionados anteriormente pueden ser útiles como conjugados de anticuerpo.

En una modalidad alternativa, el anticuerpo se conjuga o se une operativamente a una toxina, que incluye, pero no se limita a, toxinas de molécula pequeña y toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas. Las toxinas de molécula pequeña incluyen, pero no se limitan a, saporina (Kuroda K y otros, The Prostate 70:1286-1294 (2010); Lip, W l . y otros, 2007 Molecular Pharmaceutics 4:241-251; Quadros EV. y otros, 2010 Mol Cancer Ther; 9(11); 3033-40; Polito L. y otros, 2009 British Journal of Hematology, 147, 710-718), calicheamicina, maitansina (patente de EE. UU. núm. 5,208,020), tricoteno y CC1065. Las toxinas incluyen, pero no se limitan a, RNasa, gelonina, enediínas, ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE40), toxina de Shigella, toxina de Clostridium perfringens y proteína antiviral de hierba carmín.

En una modalidad, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la descripción se conjuga con una o más moléculas de maitansinoide. Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan mediante la inhibición de la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de EE. UU. núm. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como el maitansinol y los ésteres de maitansinol C-3 (patente de EE. UU. núm. 4,151,042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. núm. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. núm. 5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP 0425 235 B1. Liu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico para las células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo.

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan por unión química de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha demostrado eficacia para potenciar la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo potencie la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides se conocen bien en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se describen maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente de EE. UU. núm.

5,208,020 y en las demás patentes y publicaciones que no son patente mencionadas anteriormente. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de maitansinol.

Otro conjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de la calicheamicina puede producir roturas del ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Análogos estructurales de calicheamicina que también pueden usarse (Hinman y otros, 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode y otros, 1998, Cancer Research 58:2925-2928) (patente de EE. UU. núm. 5,714,586; patente de EE. UU. núm. 5,712,374; patente de EE. UU. núm. 5,264,586; patente de EE. UU. núm. 5,773,001). Los análogos de dolastatina 10 tales como auristatina E (AE) y monometilauristatina E (MMAE) pueden ser útiles como conjugados para los anticuerpos descritos en el presente documento o variantes de los mismos (Doronina y otros, 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco y otros, 2003 Blood 102(4): 1458-65). Las toxinas enzimáticamente activas útiles incluyen, pero no se limitan a, cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Ver, por ejemplo, el documento PCT WO 93/21232. La presente descripción contempla además modalidades en las que se forma un conjugado o fusión entre un anticuerpo específico para CD40 como se describe en el presente documento y un compuesto con actividad nucleolítica, por ejemplo, una ribonucleasa o endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa (DNasa).

En una modalidad alternativa, un anticuerpo descrito en el presente documento puede conjugarse o unirse operativamente a un radioisótopo para formar un radioconjugado. Se dispone de una variedad de isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden, en ciertas modalidades más, conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida), un agente terapéutico o un elemento radioactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.). Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxel/paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Una citotoxina ilustrativa preferida es la saporina (disponible en Advanced Targeting Systems, San Diego, CA). Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Por otra parte, un anticuerpo específico para CD40 (que incluye un fragmento funcional del mismo como se proporciona en el presente documento, tal como un fragmento de unión a antígeno) puede conjugarse en ciertas modalidades con restos terapéuticos tales como materiales radioactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos. En ciertas modalidades, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"-tetraacético (DOTA) que puede unirse al anticuerpo por medio de una molécula de unión. Tales moléculas de unión se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo y otros, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson y otros, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman y otros, 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50.

En otra modalidad, se puede conjugar un anticuerpo con un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilizarlo en la preselección del tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación con el uso de un agente de aclaramiento y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido). En una modalidad alternativa, el anticuerpo se conjuga o se une operativamente a una enzima para emplear la terapia de profármacos mediada por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT). La ADEPT puede usarse mediante la conjugación o unión operativa del anticuerpo a una enzima activadora de profármacos que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, ver el documento PCT WO 81/01145) a un fármaco antineoplásico activo. Ver, por ejemplo, el documento PCT WO 88/07378 y la patente de EE. UU. núm. 4,975,278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para la ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de estas y otras modalidades relacionadas incluyen pero no se limitan a fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco antineoplásico, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas que escinden carbohidratos tales como □-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con □-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden usarse para convertir profármacos en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse para el suministro de la abzima a una población de células tumorales.

Los inmunoconjugados pueden prepararse con el uso de una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particulares incluyen propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP) (Carlsson y otros, Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de uno o más componentes escindibles. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil a ácidos (Cancer Research 52: 127-131 (1992); patente de EE. UU. núm. 5,208,020).

En el presente documento también se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos (y polipéptidos) de la invención. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Edición 16, Oslo, A., Ed., (1980).

Los "portadores", como se usa en el presente documento, incluyen portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero que se expone a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 20 (TWEEN™), polietilenglicol (PEG) y poloxámeros (PLURONICS™) y similares.

Como se indica en otra parte en el presente documento, los anticuerpos de la presente descripción inducen la señalización de CD40 en las células tumorales, activan las células dendríticas y la vigilancia inmunitaria, activan la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra las células tumorales, bloquean la unión de CD40 a CD40L; tienen actividad agonista de CD40; activan las células presentadoras de antígenos; estimulan la liberación de citocinas de las células presentadoras de antígenos; inducen la apoptosis de las células tumorales; inhiben la proliferación de células tumorales; destruyen células tumorales por medio de la inducción de funciones efectoras que incluyen, pero no se limitan a, ADCC, CDC y ADCP; estimulan las respuestas de células T antitumorales; reducen los tumores establecidos; e inhiben los tumores resistentes a rituximab. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener o inducir una combinación de cualquiera de uno o más de estos atributos o actividades. Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CD40 pueden evaluarse con el uso de una variedad de métodos conocidos por el experto, tales como ensayos de afinidad/unión (por ejemplo, resonancia de plasmones de superficie, ensayos de inhibición competitiva); ensayos de citotoxicidad, ensayos de viabilidad celular, ensayos de proliferación, activación o diferenciación celular, ensayos de ADCC y CDC, otra actividad celular resultante de eventos de señalización celular por CD40 (por ejemplo, fosforilación de STAT3, producción de citocinas que incluyen IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-Alfa y MlP1Alfa), y la inhibición de células cancerosas y/o crecimiento tumoral con el uso de modelos in vitro o in vivo. Otros ensayos pueden evaluar la capacidad de los anticuerpos descritos en el presente documento de bloquear la unión normal de CD40L a CD40 o las respuestas mediadas por CD40, tales como la señalización celular, la activación de células (por ejemplo, la activación de células inmunitarias, la proliferación; la activación de células presentadoras de antígenos (por ejemplo, células dendríticas, células B, macrófagos) y ensayos de maduración), las respuestas inmunitarias (que incluyen las respuestas humorales y mediadas por células), etc. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden evaluarse también en cuanto a los efectos sobre la internalización de CD40, la eficacia in vitro e in vivo, etc. Tales ensayos pueden realizarse con el uso de protocolos bien establecidos conocidos por el experto (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); o kits comercialmente disponibles.

La presente invención proporciona además en ciertas modalidades un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un dominio CDR o VH o VL como se describe en el presente documento. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN. Estas modalidades y otras relacionadas pueden incluir polinucleótidos que codifican anticuerpos de la invención que se unen a CD40. El término "polinucleótido aislado" como se usa en el presente documento significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el polinucleótido aislado (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

El término "unido operativamente" significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control de la transcripción "unida operativamente" a una secuencia codificante de proteína se liga a la misma de modo que la expresión de la secuencia codificante de la proteína se logre bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

El término "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias polinucleotídicas que pueden afectar la expresión, el procesamiento o localización intracelular de secuencias codificantes a las que están ligadas o unidas operativamente. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo huésped. En modalidades particulares, las secuencias de control de la transcripción para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión ribosómico y una secuencia de terminación de la transcripción. En otras modalidades particulares, las secuencias de control de la transcripción para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias de poliadenilación. En ciertas modalidades, las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder y/o secuencias asociadas de fusión.

El término "polinucleótido" como se refiere en el presente documento significa polímeros de ácido nucleico monocatenarios o bicatenarios. En ciertas modalidades, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de base tales como bromouridina, modificaciones de ribosa tales como arabinósido y 2',3'-didesoxirribosa y modificaciones de enlace internucleotídico tales como fosforotioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosfororoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El término "polinucleótido" incluye específicamente formas de ADN monocatenarias y bicatenarias.

El término "nucleótidos naturales" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos de azúcares modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche y otros, 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec y otros, 1984, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077; Stein y otros, 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon y otros, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539. ; Zon y otros, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford Engl y; Stec y otros, patente de EE. UU. núm. 5,151,510; Uhlmann y Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543. Un oligonucleótido puede incluir un marcador detectable que permita la detección del oligonucleótido o la hibridación del mismo.

El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, o virus) que se usa para transferir información codificante a una célula huésped. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción, y corte y empalme de ARN, si hay intrones presentes.

Como entenderán los expertos en la técnica, los polinucleótidos pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos y segmentos de genes manipulados más pequeños que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. El experto puede aislar tales segmentos naturalmente o modificarlos por síntesis.

Como también reconocerá el experto, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN pueden incluir moléculas de ARNhn, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de manera uno a uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden estar presentes, pero no es necesario, dentro de un polinucleótido de acuerdo con la presente descripción, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte. Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa o pueden comprender una secuencia que codifica una variante o derivado de tal secuencia.

Por lo tanto, de acuerdo con estas modalidades y otras relacionadas, la presente descripción también proporciona polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento. En ciertas modalidades, se proporcionan polinucleótidos que comprenden una parte o la totalidad de una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo como se describe en el presente documento y los complementos de tales polinucleótidos.

En otras modalidades relacionadas, las variantes polinucleotídicas pueden tener identidad sustancial con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser un polinucleótido que comprende al menos 70 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor, identidad de secuencia en comparación con una secuencia polinucleotídica de referencia tal como una secuencia que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, con el uso de los métodos descritos en el presente documento, (por ejemplo, análisis BLAST con el uso de parámetros estándar, como se describe a continuación). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias nucleotídicas teniendo en cuenta la redundancia de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares.

Típicamente, las variantes polinucleotídicas contendrán una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, preferentemente de manera que la afinidad de unión del anticuerpo codificado mediante la variante de polinucleótido no esté sustancialmente disminuida en relación con un anticuerpo codificado mediante una secuencia polinucleotídica expuesta específicamente en el presente documento.

En ciertas otras modalidades relacionadas, los fragmentos polinucleotídicos pueden comprender o consistir esencialmente en varias longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos o complementarios a una secuencia que codifica un anticuerpo como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se proporcionan polinucleótidos que comprenden o consisten esencialmente en al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o más nucleótidos contiguos de una secuencia que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento, así como todas las longitudes intermedias entre ellos. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; que incluyen todos los números enteros a través de 200-500; 500-1000 y similares. Una secuencia polinucleotídica como se describe aquí puede extenderse en uno o ambos extremos por nucleótidos adicionales que no se encuentran en la secuencia nativa. Esta secuencia adicional puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos en cualquier extremo de un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento o en ambos extremos de un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento.

En otra modalidad, se proporcionan polinucleótidos que pueden hibridarse bajo condiciones de moderada a alta rigurosidad con una secuencia polinucleotídica que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se proporciona en el presente documento, o un fragmento del mismo, o una secuencia complementaria del mismo. Las técnicas de hibridación se conocen bien en la técnica de biología molecular. Con fines ilustrativos, las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas para evaluar la hibridación de un polinucleótido como se proporciona en el presente documento con otros polinucleótidos incluyen prelavado en una solución de SSC 5X, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50 °C-60 °C, SSC 5X, durante la noche; seguido de lavado dos veces a 65 °C durante 20 minutos con cada SSC de 2X, 0,5X y 0,2X que contienen SDS al 0,1 %. Un experto en la técnica entenderá que la rigurosidad de la hibridación puede manipularse fácilmente, tal como mediante la alteración del contenido de sal de la solución de hibridación y/o la temperatura a la que se realiza la hibridación. Por ejemplo, en otra modalidad, las condiciones de hibridación adecuadas altamente rigurosas incluyen las descritas anteriormente, con la excepción de que la temperatura de hibridación se aumenta, por ejemplo, a 60 °C-65 °C o 65 °C-70 °C.

En ciertas modalidades, los polinucleótidos descritos anteriormente, por ejemplo, variantes polinucleotídicas, fragmentos y secuencias de hibridación, codifican los anticuerpos de la invención que se unen a c D40 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En otros ejemplos, tales polinucleótidos codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, o CDR de los mismos, que se unen a CD40 al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 70 %, y en ciertos ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % así como una secuencia de anticuerpo expuesta específicamente en el presente documento. En ejemplos adicionales, tales polinucleótidos codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, o CDR de los mismos, que se unen a c D40 con mayor afinidad que los anticuerpos expuestos en el presente documento, por ejemplo, que se unen cuantitativamente al menos aproximadamente el 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 % o 110 % así como una secuencia de anticuerpo expuesta específicamente en el presente documento.

Como se describe en otra parte en el presente documento, la determinación de las estructuras tridimensionales de polipéptidos representativos (por ejemplo, variante de anticuerpos específicos para CD40 como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, una proteína de anticuerpo que tiene un fragmento de unión a antígeno como se proporciona en el presente documento) puede hacerse a través de metodologías de rutina de manera que la sustitución, adición, deleción o inserción de uno o más aminoácidos con aminoácidos naturales o no naturales seleccionados puede modelarse virtualmente para determinar si una variante estructural así derivada conserva las propiedades de relleno de espacio de las especies descritas en el presente documento. El experto conoce una variedad de programas informáticos para determinar las sustituciones de aminoácidos apropiadas (o los polinucleótidos apropiados que codifican la secuencia de aminoácidos) dentro de un anticuerpo de manera que, por ejemplo, se mantenga la afinidad o se logre una mejor.

Los polinucleótidos descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, a pesar de la longitud de la secuencia codificante en sí, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y similares, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto se contempla que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, la longitud total se limita preferentemente por la facilidad de preparación y uso destinado en el protocolo de ADN recombinante. Por ejemplo, se contempla que sean útiles segmentos polinucleotídicos ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2000, aproximadamente 1000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud, y similares, (que incluye todas las longitudes intermedias).

Cuando se comparan secuencias polinucleotídicas, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima, como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente por comparación de las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, generalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas óptimamente.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse con el uso del programa Megalign en el paquete de software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), con el uso de parámetros predeterminados. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suplemento 3, p. 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, p. 626-645 (1990); Methods in Enzymology Vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. y Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971)); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730 (1983).

Alternativamente, el alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y otros, Nucl. Acids Res.

25:3389-3402 (1977), y Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo con los parámetros descritos en el presente documento, para determinar el por ciento de identidad de secuencia entre dos o más polinucleótidos. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. En un ejemplo ilustrativo, las puntuaciones acumulativas pueden calcularse con el uso, para las secuencias nucleotídicas, de los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre <0). La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada cae en la cantidad X desde su máximo valor logrado; la puntuación acumulada va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación de alineamientos BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

En ciertas modalidades, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, generalmente del 5 al 15 por ciento o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico idénticas en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, mediante la división del número de posiciones coincidente por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Los expertos en la técnica apreciarán que, como un resultado de la redundancia del código genético, existen muchas secuencias nucleotídicas que codifican un anticuerpo como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos portan una identidad de secuencia mínima con la secuencia nucleotídica de la secuencia polinucleotídica nativa u original que codifica anticuerpos que se unen a CD40. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan expresamente mediante la presente descripción. En ciertas modalidades, se contemplan específicamente secuencias cuyos codones se han optimizado para la expresión en mamíferos.

Por tanto, en otro ejemplo de la invención, puede emplearse un enfoque de mutagénesis, tal como mutagénesis específica de sitio, para la preparación de variantes y/o derivados de los anticuerpos descritos en el presente documento. Mediante este enfoque, pueden hacerse modificaciones específicas en una secuencia polipeptídica a través de mutagénesis de los polinucleótidos subyacentes que los codifican. Estas técnicas proporcionan un enfoque sencillo para preparar y evaluar variantes de secuencia, por ejemplo, mediante la incorporación de una o más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno o más cambios de secuencia nucleotídica en el polinucleótido.

La mutagénesis específica de sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias oligonucleotídicas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que se atraviesa. Pueden emplearse mutaciones en una secuencia polinucleotídica seleccionada para mejorar, alterar, disminuir, modificar o cambiar de otro modo las propiedades del polinucleótido en sí, y/o alterar las propiedades, actividad, composición, estabilidad o secuencia primaria del polipéptido codificado.

En ciertos ejemplos, los inventores contemplan la mutagénesis de las secuencias polinucleotídicas que codifican un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para alterar una o más propiedades del polipéptido codificado, tales como la afinidad de unión del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, o la función de una región Fc particular, o la afinidad de la región Fc por un FcyR particular. Las técnicas de mutagénesis específica de sitio se conocen bien en la técnica, y se usan ampliamente para crear variantes tanto de polipéptidos como de polinucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio se usa a menudo para alterar una porción específica de una molécula de ADN. En tales ejemplos se emplea un cebador que comprende típicamente aproximadamente de 14 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud o alrededor, con aproximadamente de 5 a aproximadamente 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se altera.

Como apreciarán los expertos en la técnica, en las técnicas de mutagénesis específicas de sitio se emplea a menudo un vector de fago que existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente y su uso generalmente se conoce bien por los expertos en la técnica. Los plásmidos bicatenarios también se emplean de forma habitual en la mutagénesis dirigida al sitio que elimina la etapa de transferencia del gen de interés de un plásmido a un fago.

En general, la mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con la presente descripción se realiza primero mediante la obtención de un vector monocatenario o la fusión de dos cadenas de un vector bicatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara un cebador oligonucleotídico portador de la secuencia mutada deseada, generalmente de forma sintética. Después este cebador se hibrida con el vector monocatenario, y se somete a enzimas que polimerizan el ADN, tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena portadora de la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex en donde una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda cadena porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa luego para transformar células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes portadores del arreglo de la secuencia mutada.

La preparación de variantes de secuencia de los segmentos de ADN que codifican los péptidos seleccionados con el uso de mutagénesis dirigida al sitio proporciona un medio para producir especies potencialmente útiles y no significa que sea limitante, ya que existen otras formas en las que pueden obtenerse las variantes de la secuencia peptídica y las secuencias de Ad N que las codifican. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican la secuencia peptídica deseada pueden tratarse con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Los detalles específicos con respecto a estos métodos y protocolos se encuentran en las enseñanzas de Maloy y otros, 1994; Segal, 1976; Prokop y Bajpai, 1991; Kuby, 1994; y Maniatis y otros, 1982. Como se usa en el presente documento, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos" se refiere a procesos dependientes de plantilla y propagación mediada por vectores que dan como resultado un aumento en la concentración de una molécula de ácido nucleico específica con relación a su concentración inicial, o un aumento en la concentración de una señal detectable, tal como la amplificación. Como se usa en el presente documento, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos" está destinado a referirse a un proceso que implica la extensión dependiente de plantilla de una molécula cebadora. El término proceso dependiente de plantilla se refiere a la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o una de ADN en donde la secuencia de la cadena de ácido nucleico recién sintetizada está dictada por las bien conocidas reglas de apareamiento de bases complementarias (ver, por ejemplo, Watson, 1987). Típicamente, las metodologías mediadas por vectores implican la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Ejemplos de tales metodologías se proporcionan en la patente de EE. UU. núm. 4,237,224. En otro enfoque para la producción de variantes de polipéptidos, puede emplearse recombinación de secuencia recursiva, como se describe en la patente de EE. UU. núm. 5,837,458. En este enfoque, se realizan ciclos iterativos de recombinación y cribado o selección para "desarrollar" variantes polinucleotídicas individuales que tienen, por ejemplo, una mayor afinidad de unión. Ciertas modalidades también proporcionan construcciones en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se describe en el presente documento.

En muchos ejemplos, los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo monoclonal en cuestión se introducen directamente en una célula huésped y la célula se incuba bajo condiciones suficientes para inducir la expresión del anticuerpo codificado. Los anticuerpos de esta descripción se preparan con el uso de técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica en combinación con el polipéptido y las secuencias de ácido nucleico proporcionados en el presente documento. Las secuencias polipeptídicas pueden usarse para determinar las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican el anticuerpo particular descrito de este modo. La secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para reflejar "preferencias" de codones particulares para varios sistemas de expresión de acuerdo con los métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica.

De acuerdo con ciertas modalidades relacionadas se proporciona una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones de la invención; un ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo, CDR, dominio VH o VL, o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención. La descripción también proporciona un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión a partir del ácido nucleico que codifica el mismo. La expresión puede lograrse convenientemente mediante el cultivo bajo condiciones apropiadas de las células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción mediante la expresión, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede aislarse y/o purificarse con el uso de cualquier técnica adecuada, y después usarse como se desee.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se proporciona en el presente documento, y los vectores y moléculas de ácido nucleico que los codifican, pueden aislarse y/o purificarse, por ejemplo, de su ambiente natural, en forma homogénea o sustancialmente pura, o, en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de distinto origen de la secuencia que codifica un polipéptido con la función deseada. El ácido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia nucleotídica como se establece en el presente documento abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto lo requiera de otro modo.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes se conocen bien. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped bacteriano preferido común es E. coli.

La expresión de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. Para una revisión, ver por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, ver revisiones recientes, por ejemplo Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. y otros (1995) Curr. Opinión Biotech 6: 553-560.

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para más detalles, ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2da Edición, Sambrook y otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel y otros, eds., John Wiley & Sons, 1992 o actualizaciones posteriores al mismo.

El término "célula huésped" se usa para referirse a una célula en la que se ha introducido, o que puede introducir en ella, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento, y que además expresa o puede expresar un gen seleccionado de interés, tal como un gen que codifica cualquier anticuerpo descrito en el presente documento. El término incluye la progenie de la célula progenitora, sea la progenie idéntica o no en morfología o en composición genética a la progenitora original, siempre que el gen seleccionado esté presente. Por consiguiente también se contempla un método que comprende la introducción de tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción con el uso de retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección con el uso de bacteriófagos. La introducción puede ir seguida de causar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de las células huésped bajo condiciones para la expresión del gen. En una modalidad, el ácido nucleico se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándar.

La presente descripción también proporciona, en ciertos ejemplos, un método que comprende el uso de una construcción como se indicó anteriormente en un sistema de expresión para expresar un polipéptido particular tal como un anticuerpo específico para CD40 como se describe en el presente documento. El término "transducción" se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, generalmente mediante un fago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucariotas mediante retrovirus. El término "transfección" se usa para referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Varias técnicas de transfección se conocen bien en la técnica y se describen en el presente documento. Ver, por ejemplo, Graham y otros, 1973, Virology 52:456; Sambrook y otros, 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis y otros, 1986, BASIC METHODS 1N MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; y Chu y otros, 1981, Gene 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógenos en las células huésped adecuadas.

El término "transformación" como se usa en el presente documento se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para que contenga un nuevo ADN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula mediante la integración física en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado de manera estable cuando el ADN se replica con la división de la célula. El término "natural" o "nativo" cuando se usa en relación con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huésped y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no están manipulados por un ser humano. De manera similar, "no natural" o "no nativo" como se usa en el presente documento se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado estructuralmente o sintetizado por un ser humano.

Los términos "polipéptido" "proteína" y "péptido" y "glicoproteína" se usan indistintamente y significan un polímero de aminoácidos que no se limita a ninguna longitud particular. El término no excluye modificaciones tales como miristilación, sulfatación, glicosilación, fosforilación y adición o deleción de secuencias señal. Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una o más cadenas de aminoácidos, en donde cada cadena comprende aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos, y en donde dicho polipéptido o proteína puede comprender una pluralidad de cadenas unidas de forma no covalente y/o covalente entre sí por enlaces peptídicos, que tienen la secuencia de proteínas nativas, es decir, proteínas producidas por células naturales y específicamente no recombinantes, o células genéticamente manipuladas o recombinantes, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones, adiciones, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan específicamente los anticuerpos de la presente descripción que se unen a CD40, o secuencias que tienen deleciones, adiciones, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un anticuerpo anti-CD40. Por tanto, un "polipéptido" o una "proteína" pueden comprender una (denominada "un monómero") o una pluralidad (denominada "un multímero") de cadenas de aminoácidos.

El término "proteína aislada" al que se hace referencia en el presente documento significa que una proteína en cuestión (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las que típicamente se encontraría en la naturaleza, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa en una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) no está asociada (mediante interacción covalente o no covalente) con porciones de una proteína con la que la "proteína aislada" está asociada en la naturaleza, (6) está asociada operativamente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza, o (7) no ocurre en la naturaleza. Tal proteína aislada puede codificarse mediante ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, o puede ser de origen sintético o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, investigativo o de otro tipo).

El término "fragmento polipeptídico" se refiere a un polipéptido, que puede ser monomérico o multimérico, que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal y/o una deleción interna o sustitución de un polipéptido natural o producido de manera recombinante. En ciertas modalidades, un fragmento polipeptídico puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos polipeptídicos particularmente útiles incluyen dominios funcionales, que incluyen dominios de unión a antígeno o fragmentos de anticuerpos. En el caso de un anticuerpo anti-CD40, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a: una región CDR, especialmente una región CDR3 de la cadena pesada o ligera; una región variable de una cadena pesada o ligera; una porción de la cadena de un anticuerpo o simplemente su región variable que incluye dos CDR; y similares.

Los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la proteína. Cualquier secuencia de aminoácidos de polipéptido que se proporciona en el presente documento que incluyen un péptido señal también se contempla para cualquier uso descrito en el presente documento sin tal péptido señal o líder. Como reconocería el experto, el péptido señal se escinde generalmente durante el procesamiento y no se incluye en la proteína del anticuerpo activo. El polipéptido también puede fusionarse en marco o conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido.

También puede emplearse una secuencia peptídica enlazadora/espaciadora para separar múltiples componentes polipeptídicos mediante una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y/o terciarias, si se desea. Tal secuencia peptídica enlazadora puede incorporarse en un polipéptido de fusión con el uso de técnicas estándar bien conocidas en la técnica.

Pueden elegirse ciertas secuencias peptídicas espaciadoras, por ejemplo, en base a: (1) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que pueda interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y/o (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido.

En una modalidad ilustrativa, las secuencias peptídicas espaciadoras contienen, por ejemplo, residuos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también pueden incluirse en la secuencia espaciadora.

Otras secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de forma útil como espaciadores incluyen las descritas en Maratea y otros, Gene 40:3946 (l985); Murphy y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); la patente de EE. UU. núm. 4,935,233 y la patente de EE. UU. núm. 4,751,180.

Otros espaciadores ilustrativos pueden incluir, por ejemplo, Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (Chaudhary y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070) y Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (Bird y otros, 1988, Science 242:423-426).

En algunas modalidades, no se requieren secuencias espaciadoras cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica. Pueden fusionarse directamente dos secuencias codificantes sin ningún espaciador o mediante el uso de un polienlazador flexible compuesto, por ejemplo, por el pentámero Gly-Gly-Gly-Gly-Ser repetido de 1 a 3 veces. Tal espaciador se ha usado en la construcción de anticuerpos monocatenarios (scFv) mediante la inserción entre VH y v L (Bird y otros, 1988, Science 242:423-426; Huston y otros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5979-5883).

Un espaciador peptídico, en ciertas modalidades, se diseña para permitir la interacción correcta entre dos hojas beta que forman la región variable del anticuerpo de cadena sencilla.

En ciertas modalidades ilustrativas, un espaciador peptídico tiene entre 1 y 5 aminoácidos, entre 5 y 10 aminoácidos, entre 5 y 25 aminoácidos, entre 5 y 50 aminoácidos, entre 10 y 25 aminoácidos, entre 10 y 50 aminoácidos, entre 10 y 100 aminoácidos, o cualquier rango intermedio de aminoácidos.

En otras modalidades ilustrativas, un espaciador peptídico comprende aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de longitud.

Se contemplan modificación(es) en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo mediante la introducción de cambios nucleotídicos apropiados en un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o una cadena del mismo, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones, y/o inserciones y/o sustituciones de residuos, dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede hacerse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar al anticuerpo final, siempre que la construcción final posea las características deseadas (por ejemplo, unión de alta afinidad a CD40). Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación. Cualquiera de las variaciones y modificaciones descritas anteriormente para los polipéptidos de la presente invención puede incluirse en los anticuerpos de la presente invención.

La presente descripción proporciona variantes de los anticuerpos descritos en el presente documento. En ciertos ejemplos, tales variantes de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, o CDR de los mismos, se unen a CD40 al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 70 %, y en ciertos ejemplos, al menos aproximadamente el 90 % así como una secuencia de anticuerpo específicamente expuesta en el presente documento. En ejemplos adicionales, tales variantes de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, o CDR de los mismos, se unen a CD40 con mayor afinidad que los anticuerpos expuestos en el presente documento, por ejemplo, que se unen cuantitativamente al menos aproximadamente el 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 % o 110 % así como una secuencia de anticuerpo específicamente expuesta en el presente documento.

En ejemplos particulares, un anticuerpo en cuestión puede tener: a) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica, al menos 95 % idéntica, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % o 99 % idéntica, a la región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento; y b) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % o 99 % idéntica, a la región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento. La secuencia de aminoácidos de las regiones de cadena ligera y pesada ilustrativas se expone en las SEQ ID NOs:1-56.

En ejemplos particulares, el anticuerpo puede comprender: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i. una región CDR1 que es idéntica en secuencia de aminoácidos a la región CDR1 de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado descrito en el presente documento; ii. una región CDR2 que es idéntica en secuencia de aminoácidos a la región CDR2 de cadena pesada del anticuerpo seleccionado; y iii. una región CDR3 que es idéntica en secuencia de aminoácidos a la región CDR3 de cadena pesada del anticuerpo seleccionado; y b) un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. una región CDR1 que es idéntica en secuencia de aminoácidos a la región CDR1 de cadena ligera del anticuerpo seleccionado; ii. una región CDR2 que es idéntica en secuencia de aminoácidos a la región CDR2 de cadena ligera del anticuerpo seleccionado; y iii. una región CDR3 que es idéntica en secuencia de aminoácidos a la región CDR3 de cadena ligera del anticuerpo seleccionado; en donde el anticuerpo se une específicamente a una diana seleccionada (por ejemplo, CD40). En unos ejemplos adicionales el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, es una variante de anticuerpo en donde la variante comprende una cadena ligera y pesada idéntica al anticuerpo seleccionado excepto por un máximo de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más sustituciones de aminoácidos en las regiones CDR de las regiones VH y VL. En este sentido, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o en ciertos ejemplos, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones de aminoácidos más en las regiones CDR del anticuerpo seleccionado. Las sustituciones pueden estar en las regiones CDR ya sea en las regiones VH y/o VL. (Ver, por ejemplo, Muller, 1998, Structure 6:1153-1167).

La determinación de las estructuras tridimensionales de polipéptidos representativos (por ejemplo, variantes de anticuerpos específicos para CD40 como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, una proteína de anticuerpo que tiene un fragmento de unión a antígeno como se proporciona en el presente documento) puede hacerse a través de metodologías habituales de manera que la sustitución, adición, deleción o inserción de uno o más aminoácidos con aminoácidos naturales o no naturales seleccionados puede modelarse virtualmente con el propósito de determinar si una variante estructural así derivada retiene las propiedades de relleno de espacio de las especies descritas en el presente documento. Ver, por ejemplo, Donate y otros, 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley y otros, Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman y otros, Science 310:638 (2005); Dietz y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson y otros, Nature 450:176 (2007); Qian y otros, Nature 450:259 (2007); Raman y otros, Science 327:1014-1018 (2010). Algunos ejemplos adicionales no limitantes de algoritmos informáticos que pueden usarse para estos y ejemplos relacionados, tales como para el diseño racional de dominios de unión a antígeno de los mismos anticuerpos específicos para CD40 como se proporciona en el presente documento, incluyen VMD, que es un programa de visualización molecular para la exhibición, animación y análisis de grandes sistemas biomoleculares con el uso de gráficos 3-D y secuencias de comandos integradas (ver el sitio web del Grupo de biofísica computacional y teórica de la Universidad de Illinois en Urbana-Champagne, en ks.uiuc.edu/Research/vmd/. Se conocen muchos otros programas informáticos en la técnica y están disponibles para el experto y que permiten determinar las dimensiones atómicas a partir de modelos de relleno de espacio (radios de van der Waals) de conformaciones de energía minimizada; GRID, que busca determinar regiones de alta afinidad para diferentes grupos químicos, y potencia de esta manera la unión, búsquedas de Monte Carlo, que calculan el alineamiento matemático, y CHARMM (Brooks y otros (1983) J. Comput. Chem. 4:187-217) y AMBER (Weiner y otros (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), que evalúan y analizan los cálculos del campo de fuerza (ver también, Eisenfield y otros (1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam y otros (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; y Kini y otros (1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488). También están disponibles comercialmente una variedad de programas informáticos computacionales apropiados, tales como de Schrodinger (Munich, Alemania).

En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-CD40 y las versiones humanizadas de los mismos se derivan de anticuerpos monoclonales de conejo, y en particular se generan con el uso de tecnología RabMAb®. Estos anticuerpos son ventajosos ya que requieren modificaciones mínimas de la secuencia, de esta manera facilita la conservación de propiedades funcionales después de la humanización con el uso de tecnología de humanización guiada por linaje mutacional (MLG) (ver por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 7,462,697). Por lo tanto, los métodos ilustrativos para producir los anticuerpos anti-CD40 de la presente descripción incluyen la tecnología de anticuerpos monoclonales de conejo RabMab® descrita, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. 5,675,063 y 7,429,487. En este sentido, en ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD40 de la descripción se producen en conejos. En modalidades particulares, se usa un linfocito B inmortal derivado de conejo que puede fusionarse con un esplenocito de conejo para producir una célula híbrida que produce un anticuerpo. El linfocito B inmortal no expresa de forma detectable la cadena pesada de inmunoglobulina endógena y puede contener, en ciertas modalidades, un gen alterado que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina.

Composiciones y métodos de uso

La presente descripción proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos específicos para CD40, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y la administración de tal composición en una variedad de entornos terapéuticos.

La administración de los anticuerpos específicos para CD40 descritos en el presente documento, en forma pura o en una composición farmacéutica apropiada, se puede llevar a cabo por medio de cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes para usos similares. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante la combinación de un anticuerpo o composición que contiene el anticuerpo con un portador, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable apropiado, y pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Además, otros ingredientes farmacéuticamente activos (que incluyen otros agentes antineoplásicos como se describe en otra parte de este documento) y/o excipientes adecuados tales como sales, tampones y estabilizadores pueden, pero no es necesario, estar presentes en la composición. La administración puede lograrse mediante una variedad de rutas diferentes, que incluyen la oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica. Los modos de administración preferidos dependen de la naturaleza de la afección a tratar o prevenir. Se considera efectiva una cantidad que, después de la administración, reduce, inhibe, previene o retrasa la progresión y/o metástasis de un cáncer.

En ciertas modalidades, la cantidad administrada es suficiente para dar como resultado la regresión del tumor, como se indica mediante una disminución estadísticamente significativa en la cantidad de tumor viable, por ejemplo, una disminución de al menos un 50 % en la masa tumoral, o mediante las dimensiones (por ejemplo, disminuida con significación estadística) de escaneo alteradas. En otras modalidades, la cantidad administrada es suficiente para dar como resultado la reducción clínicamente relevante de los síntomas de una indicación de enfermedad particular conocida por el médico experto.

La dosis precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad que se trata y puede determinarse empíricamente con el uso de protocolos de evaluación conocidos o mediante evaluación de las composiciones en sistemas modelo conocidos en la técnica y extrapolación de los mismos. También pueden realizarse ensayos clínicos controlados. Las dosis también pueden variar según la gravedad de la afección a aliviar. Generalmente, una composición farmacéutica se formula y administra para ejercer un efecto terapéuticamente útil mientras se minimizan los efectos secundarios indeseables. La composición puede administrarse una vez o puede dividirse en varias dosis más pequeñas para administrarse a intervalos de tiempo. Para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual.

Las composiciones que contienen anticuerpos específicos para CD40 pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos conocidos contra el cáncer, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también pueden administrarse en combinación con antibióticos.

Las rutas típicas de administración de estas y las composiciones farmacéuticas relacionadas incluyen, por lo tanto, sin limitación, la oral, tópica, transdérmica, por inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención se formulan para permitir que los ingredientes activos contenidos en ellas estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde por ejemplo, una tableta puede ser una única unidad de dosificación, y un recipiente de un anticuerpo específico para CD40 descrito en el presente documento en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. Los métodos actuales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Edición 20 (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composición a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la presente descripción, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés de acuerdo con las enseñanzas del presente documento.

Una composición farmacéutica puede estar en forma de un sólido o líquido. En una modalidad, el(los) portador(es) es(son) partículas, de modo que las composiciones están, por ejemplo, en forma de tableta o polvo. El(los) portador(es) pueden ser líquidos, las composiciones, por ejemplo, un aceite oral, un líquido inyectable o un aerosol, que es útil, por ejemplo, en la administración por inhalación. Cuando se destina para la administración oral, la composición farmacéutica está preferentemente en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, en suspensión y en gel se incluyen dentro de las formas consideradas en este documento como sólidas o líquidas.

Como composición sólida para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en un polvo, gránulo, tableta comprimida, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea o similar. Tal composición sólida contendrá típicamente uno o más diluyentes inertes o portadores comestibles. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja; y un agente colorante. Cuando la composición farmacéutica está en la forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido tal como polietilenglicol o aceite.

La composición farmacéutica puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elíxir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para la administración oral o para el suministro mediante inyección, como dos ejemplos. Cuando se destina para la administración oral, la composición preferida contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y potenciador del sabor. En una composición destinada a administrarse mediante inyección, pueden incluirse uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijados tales como mono- o diglicéridos sintéticos que pueden servir como solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.

Una composición farmacéutica líquida destinada a la administración parenteral u oral debe contener una cantidad de un anticuerpo específico para CD40 como se describe en el presente documento de manera que se obtenga una dosis adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos el 0,01 % del anticuerpo en la composición. Cuando se destina a la administración oral, esta cantidad puede variarse entre el 0,1 y aproximadamente el 70 % del peso de la composición. Ciertas composiciones farmacéuticas orales contienen entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 75 % del anticuerpo. En ciertas modalidades, las composiciones y preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se preparan de modo que una unidad de dosificación parenteral contenga entre 0,01 y 10 % en peso del anticuerpo antes de la dilución.

La composición farmacéutica puede destinarse a la administración tópica, en cuyo caso el portador puede comprender adecuadamente una solución, emulsión, ungüento o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. Los agentes espesantes pueden estar presentes en una composición farmacéutica para la administración tópica. Si está destinada para la administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o un dispositivo de iontoforesis. La composición farmacéutica puede destinarse para la administración rectal, en la forma, por ejemplo, de un supositorio, que se derretirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para la administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Tales bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.

La composición farmacéutica puede incluir varios materiales, que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que formen una cubierta de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de recubrimiento son típicamente inertes, y pueden seleccionarse de, por ejemplo, azúcar, goma laca, y otros agentes de recubrimiento entérico. Alternativamente, los ingredientes activos pueden envolverse en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se una al anticuerpo de la invención y de esta manera ayuda en el suministro del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar en esta capacidad incluyen otros anticuerpos monoclonales o policlonales, una o más proteínas o un liposoma. La composición farmacéutica puede consistir esencialmente en unidades de dosificación que pueden administrarse como un aerosol. El término aerosol se usa para designar una variedad de sistemas que van desde los de naturaleza coloidal hasta los sistemas que consisten en paquetes presurizados. El suministro puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dispensa los ingredientes activos. Los aerosoles pueden suministrarse en sistemas monofásicos, bifásicos, o trifásicos para suministrar el(los) ingrediente(s) activos. El suministro del aerosol incluye el recipiente, los activadores, las válvulas, los subcontenedores, y similares necesarios, que juntos pueden formar un kit. Un experto en la técnica, sin una experimentación indebida, puede determinar los aerosoles preferidos.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante una metodología bien conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica destinada a administrarse mediante inyección puede prepararse mediante la combinación de una composición que comprende un anticuerpo específico para CD40 como se describe en el presente documento y opcionalmente, una o más sales, tampones y/o estabilizadores, con agua destilada estéril para formar una solución. Puede añadirse un tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interactúan de forma no covalente con la composición del anticuerpo para facilitar la disolución o suspensión homogénea del anticuerpo en el sistema de suministro acuoso.

Las composiciones pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva, que variará en dependencia de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado (por ejemplo, el anticuerpo específico para CD40); la estabilidad metabólica y duración de la acción del compuesto; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de la administración; la tasa de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o afección particular; y el sujeto sometido a terapia. Generalmente, una dosis diaria terapéuticamente efectiva es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,001 mg/kg (es decir, 0,07 mg) a aproximadamente 100 mg/kg (es decir, 7,0 g); preferentemente una dosis terapéuticamente efectiva es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,01 mg/kg (es decir, 0,7 mg) a aproximadamente 50 mg/kg (es decir, 3,5 g); con mayor preferencia una dosis terapéuticamente efectiva es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 1 mg/kg (es decir, 70 mg) a aproximadamente 25 mg/kg (es decir, 1,75 g).

Las composiciones que comprenden los anticuerpos específicos para CD40 de la presente descripción también pueden administrarse simultáneamente con, antes, o después de la administración de uno o más de otros agentes terapéuticos. Tal terapia de combinación puede incluir la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica que contiene un compuesto de la invención y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de composiciones que comprenden anticuerpos de la invención y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, un anticuerpo como se describe en el presente documento y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación oral, tal como una tableta o cápsula, o cada agente administrado en formulaciones de dosificación oral separadas. De manera similar, un anticuerpo como se describe en el presente documento y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación parenteral tal como en una solución salina u otra solución fisiológicamente aceptable, o cada agente administrado en formulaciones de dosificación parenterales separadas. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, las composiciones que comprenden los anticuerpos y uno o más agentes activos adicionales pueden administrarse esencialmente al mismo tiempo, es decir, simultáneamente o en momentos escalonados por separado, es decir, secuencialmente y en cualquier orden; se entiende que la terapia de combinación incluye todos estos regímenes.

Por tanto, en ciertas modalidades, también se contemplan las composiciones de anticuerpos anti-CD40 de esta descripción para su administración en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Dichos agentes terapéuticos pueden aceptarse en la técnica como un tratamiento estándar para un estado patológico particular como se describe en el presente documento, tal como artritis reumatoide, inflamación o cáncer. Los agentes terapéuticos ilustrativos contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, DMARD, antiinflamatorios, quimioterapéuticos, radioterapéuticos u otros agentes activos y auxiliares.

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C "); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido v P-16 ); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína), ONTAK™ (denileucina diftitox), esperamicinas, capecitabina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos, que incluyen por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Puede usarse una variedad de otros agentes terapéuticos junto con los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento. En una modalidad, el anticuerpo se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o fármacos antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (que incluyen betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) que incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.

Los AINE ilustrativos se eligen del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 tales como VIOXX® (rofecoxib) y c El EBREX® (celecoxib), y sialilatos. Los analgésicos ilustrativos se eligen del grupo que consiste en acetaminofeno, oxicodona, tramadol o clorhidrato de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos se eligen del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas de TNF (por ejemplo, etanercept (e NBRe L®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®)), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales así como también formas recombinantes de moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Oro (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.

En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en el presente documento son para la administración en conjunto con una citocina. Por "citocina", como se usa en el presente documento, se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas de crecimiento tales como: hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento N-metionil humana y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora de Muller; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen el LIF y el ligando kit (KL). Como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante, y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Las composiciones que comprenden anticuerpos específicos para CD40 descritos en el presente documento pueden administrarse a un individuo que padece una enfermedad como se describe en el presente documento, que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de páncreas, colon, intestino gástrico, próstata, vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis (que incluye artritis reumatoide, artritis reactiva), lupus eritematoso sistémico (s Le ), psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), encefalomielitis, uveítis, miastenia grave, esclerosis múltiple, diabetes insulinodependiente, enfermedad de Addison, enfermedad celíaca, síndrome de fatiga crónica, hepatitis autoinmunitaria, alopecia autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, fibromialgia, pénfigo vulgar, síndrome de Sjogren, enfermedad de Kawasaki, hipertiroidismo/enfermedad de Graves, hipotiroidismo/enfermedad de Hashimoto, endometriosis, esclerodermia, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Wegener, glomerulonefritis, anemia aplásica (que incluye pacientes con anemia aplásica con múltiples transfusiones), hemoglobinuria paroxística nocturna, síndrome mielodisplásico, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmunitaria, síndrome de Evan, síndrome inhibidor del Factor VIII, vasculitis sistémica, dermatomiositis, polimiositis y fiebre reumática, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), penfigoide ampolloso autoinmunitario, enfermedad de Parkinson, sarcoidosis, vitiligo, cirrosis biliar primaria y miocarditis autoinmunitaria.

Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, psoriasis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (IBS), lupus eritematoso, nefritis, enfermedad de Parkinson, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, artritis, artritis reumatoide, asma y varias enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis y vasculitis. En ciertos ejemplos, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, diabetes, gota, síndrome periódico asociado a criopirina y trastorno pulmonar obstructivo crónico. En este sentido, un ejemplo proporciona un método para tratar, reducir la gravedad o prevenir la inflamación o una enfermedad inflamatoria mediante la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones descritas en el presente documento que comprenden anticuerpos anti-CD40.

Para el uso in vivo para el tratamiento de enfermedades humanas, los anticuerpos descritos en el presente documento se incorporan generalmente a una composición farmacéutica antes de la administración. Una composición farmacéutica comprende uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento en combinación con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable como se describe en otra parte del presente documento. Para preparar una composición farmacéutica, se mezcla una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos con cualquier portador(es) o excipiente farmacéutico conocido por los expertos en la técnica como adecuado(s) para el modo de administración particular. Un portador farmacéutico puede ser líquido, semilíquido o sólido. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir, por ejemplo, un diluyente estéril (tal como agua), solución salina, aceite fijado, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro solvente sintético; agentes antimicrobianos (tales como alcohol bencílico y parabenos de metilo); antioxidantes (tales como ácido ascórbico y bisulfito de sodio) y agentes quelantes (tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); tampones (tales como acetatos, citratos y fosfatos). Si se administra por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS) y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol, polipropilenglicol y sus mezclas.

Las composiciones que comprenden anticuerpos específicos para CD40 como se describen en el presente documento pueden prepararse con portadores que protegen al anticuerpo contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como formulaciones de liberación prolongada o recubrimientos. Tales portadores incluyen formulaciones de liberación controlada, tales como, pero sin limitarse a, implantes y sistemas de suministro microencapsulados, y polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, PEG, poliortoésteres, ácido poliláctico y otros conocidos por los expertos en la técnica.

En el presente documento se proporcionan los anticuerpos que se unen a CD40 para el uso en métodos de tratamiento que usan los mismos. En una modalidad, hay un anticuerpo de la presente invención para la administración a un paciente que tiene una enfermedad que implica una expresión inapropiada de CD40, que en el contexto de la presente descripción se entiende que incluye enfermedades y trastornos caracterizados por una expresión o actividad aberrante de CD40, debido a por ejemplo, a alteraciones (por ejemplo, aumentos o disminuciones estadísticamente significativas) en la cantidad de una proteína presente, o la presencia de una proteína mutante, o ambas. Una sobreabundancia puede deberse a cualquier causa, que incluye, pero sin limitarse a, la sobreexpresión a nivel molecular, la aparición prolongada o acumulada en el sitio de acción o el aumento (por ejemplo, de una manera estadísticamente significativa) de la actividad de CD40 con relación a la que normalmente es detectable. Tal sobreabundancia de CD40 puede medirse con relación a la expresión, apariencia o actividad normales de los eventos de señalización de CD40, y dicha medición puede desempeñar un papel importante en el desarrollo y/o evaluación clínica de los anticuerpos descritos en el presente documento.

Los presentes anticuerpos son útiles para el tratamiento de una variedad de cánceres. En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en el presente documento ejercen actividad antitumoral mediante la activación de respuestas inmunitarias antitumorales. En ciertas modalidades, los presentes anticuerpos son útiles para el tratamiento de una variedad de cánceres asociados con la expresión aberrante de CD40. En una modalidad de la invención, se proporciona el anticuerpo de la invención para el uso en un método para el tratamiento de un cáncer que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de páncreas, colon, intestino gástrico, próstata, vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a un paciente con cáncer de un anticuerpo específico para CD40 descrito en el presente documento. Se considera efectiva una cantidad que, después de la administración, inhibe, previene o retrasa la progresión y/o metástasis de un cáncer de una manera estadísticamente significativa (es decir, con relación a un control apropiado como conocerán los expertos en la técnica).

Otro ejemplo de modalidad proporciona un método para prevenir la metástasis de un cáncer que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de páncreas, colon, intestino, próstata, vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a un paciente con cáncer de un anticuerpo específico para CD40 descrito en el presente documento (por ejemplo, una cantidad que, después de la administración, inhibe, previene o retrasa la metástasis de un cáncer de una manera estadísticamente significativa, es decir, con relación a un control apropiado como conocerán los expertos en la técnica).

Otro ejemplo proporciona un método para prevenir un cáncer que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de páncreas, colon, intestino gástrico, próstata, vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a un paciente con cáncer de un anticuerpo específico para CD40 descrito en el presente documento.

Otra modalidad proporciona un anticuerpo de la invención para el uso en un método para tratar, mejorar los síntomas, inhibir la progresión o la prevención de linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de páncreas, colon, intestino gástrico, próstata, vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a un paciente que padece de una o más de estas enfermedades de un anticuerpo específico para CD40 descrito en el presente documento.

Otro ejemplo proporciona un método para tratar, mejorar los síntomas, inhibir la progresión de o para la prevención de una enfermedad autoinmunitaria mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a un paciente que padece de una o más de estas enfermedades de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento. En este sentido, las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis (que incluye artritis reumatoide, artritis reactiva), lupus eritematoso sistémico (SLE), psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), encefalomielitis, uveítis, miastenia grave, esclerosis múltiple, diabetes insulinodependiente, enfermedad de Addison, enfermedad celíaca, síndrome de fatiga crónica, hepatitis autoinmunitaria, alopecia autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, fibromialgia, pénfigo vulgar, síndrome de Sjogren, enfermedad de Kawasaki, hipertiroidismo/enfermedad de Graves, hipotiroidismo/enfermedad de Hashimoto, endometriosis, esclerodermia, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Wegener, glomerulonefritis, anemia aplásica (que incluye los pacientes con anemia aplásica con múltiples transfusiones), hemoglobinuria paroxística nocturna, síndrome mielodisplásico, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmunitaria, síndrome de Evan, síndrome inhibidor del Factor VIII, vasculitis sistémica, dermatomiositis, polimiositis y fiebre reumática, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), penfigoide ampolloso autoinmunitario, enfermedad de Parkinson, sarcoidosis, vitiligo, cirrosis biliar primaria y miocarditis autoinmunitaria.

Otro ejemplo proporciona un método para tratar, mejorar los síntomas, inhibir la progresión de o para la prevención de una enfermedad inflamatoria mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva a un paciente que padece de una o más de estas enfermedades de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento. Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, psoriasis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (IBS), lupus eritematoso, nefritis, enfermedad de Parkinson, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, artritis, artritis reumatoide, asma y varias enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis y vasculitis. En ciertos ejemplos, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, diabetes, gota, síndrome periódico asociado a criopirina y trastorno pulmonar obstructivo crónico.

En otro ejemplo, los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención se usan para determinar la estructura del antígeno unido, por ejemplo, epítopos conformacionales, cuya estructura puede usarse para desarrollar compuestos que tengan o imiten esta estructura, por ejemplo, mediante modelos químicos y métodos SAR.

Varios ejemplos más de la presente invención se refieren, en parte, a aplicaciones de diagnósti

presencia de células o tejidos que expresan CD40. Por lo tanto, la presente descripción proporciona métodos para detectar CD40 en una muestra, tal como la detección de células o tejidos que expresan CD40. Tales métodos pueden aplicarse en una variedad de formatos de detección conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, inmunohistoquímica (IHC), inmunocitoquímica (ICC), hibridación in situ (ISH), hibridación in situ de montaje completo (WISH), hibridación fluorescente in situ de ADN (FISH), citometría de flujo, inmunoensayo enzimático (EIA) e inmunoensayo unido a enzimas (ELISA).

ISH es un tipo de hibridación que usa una cadena de ADN o ARN complementario marcado (es decir, un agente de unión primario) para localizar una secuencia de ADN o ARN específica en una porción o sección de una célula o tejido (in situ), o si el tejido es suficientemente pequeño, todo el tejido (ISH de montaje completo). Un experto en la técnica apreciaría que esto es distinto de la inmunohistoquímica, que localiza proteínas en secciones de tejido con el uso de un anticuerpo como agente de unión principal. La ISH de ADN puede usarse en el ADN genómico para determinar la estructura de los cromosomas. La ISH fluorescente de ADN (FISH) puede usarse, por ejemplo, en diagnósticos médicos para evaluar la integridad cromosómica. La ISH de ARN (histoquímica de hibridación) se usa para medir y localizar los ARNm y otros transcritos dentro de secciones de tejido o montajes completos.

En varios ejemplos, los anticuerpos descritos en el presente documento se conjugan con un marcador detectable que puede detectarse directa o indirectamente. En este sentido, un "conjugado" de anticuerpo se refiere a un anticuerpo anti-CD40 que está unido de forma covalente a un marcador detectable. En la presente descripción, las sondas de ADN, las sondas de ARN, los anticuerpos monoclonales, los fragmentos de unión a antígeno de los mismos y los derivados de anticuerpos de los mismos, tales como un anticuerpo de fragmento variable de cadena sencilla o un anticuerpo etiquetado con epítopo, pueden unirse de forma covalente a un marcador detectable. En la "detección directa", solo se usa un anticuerpo detectable, es decir, un anticuerpo detectable primario. Por lo tanto, la detección directa significa que el anticuerpo que está conjugado con un marcador detectable puede detectarse, per se, sin la necesidad de añadir un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario).

Un "marcador detectable" es una molécula o material que puede producir una señal detectable (tal como visual, electrónica o de otro modo) que indica la presencia y/o concentración del marcador en una muestra. Cuando se conjuga con un anticuerpo, el marcador detectable puede usarse para ubicar y/o cuantificar la diana a la que se dirige el anticuerpo específico. De este modo, la presencia y/o concentración de la diana en una muestra puede detectarse mediante la detección de la señal producida por el marcador detectable. Puede detectarse un marcador detectable directa o indirectamente, y pueden usarse en combinación varios marcadores detectables diferentes conjugados con diferentes anticuerpos específicos para detectar una o más dianas.

Los ejemplos de marcadores detectables, que pueden detectarse directamente, incluyen tintes fluorescentes y sustancias radioactivas y partículas metálicas. Por el contrario, la detección indirecta requiere la aplicación de uno o más anticuerpos adicionales, es decir, anticuerpos secundarios, después de la aplicación del anticuerpo primario. Por lo tanto, la detección se realiza mediante la detección de la unión del anticuerpo secundario o agente de unión al anticuerpo detectable primario. Los ejemplos de agentes de unión o anticuerpos detectables primarios que requieren la adición de un agente de unión o anticuerpo secundario incluyen agentes de unión detectables enzimáticos y agentes de unión o anticuerpos detectables de haptenos.

En algunos ejemplos, el marcador detectable se conjuga con un polímero de ácido nucleico que comprende el primer agente de unión (por ejemplo, en un proceso de ISH, WISH o FISH). En otros ejemplos, el marcador detectable se conjuga con un anticuerpo que comprende el primer agente de unión (por ejemplo, en un proceso de IHC).

Los ejemplos de marcadores detectables que pueden conjugarse con anticuerpos usados en los métodos de la presente descripción incluyen marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, polímeros, partículas poliméricas, partículas metálicas, haptenos y tintes.

Los ejemplos de marcadores fluorescentes incluyen 5-(y 6)-carboxifluoresceína, 5- o 6-carboxifluoresceína, ácido 6-(fluoresceína)-5-(y 6)-carboxamido hexanoico, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina y tintes como Cy2, Cy3 y Cy5, cumarina opcionalmente sustituida que incluye AMCA, PerCP, ficobiliproteínas que incluyen R-ficoeritrina (RPE) y aloficoeritrina (APC), rojo Texas, rojo Princeton, proteína verde fluorescente (GFP) y sus análogos, y conjugados de R-ficoeritrina o aloficoeritrina, marcadores fluorescentes inorgánicos tales como partículas en base a un material semiconductor como nanocristalitos de CdSe recubiertos.

Los ejemplos de marcadores de partículas poliméricas incluyen micropartículas o partículas de látex de poliestireno, PMMA o sílice, que pueden incrustarse con tintes fluorescentes, o micelas o cápsulas de polímero que contienen tintes, enzimas o sustratos.

Los ejemplos de marcadores de partículas metálicas incluyen partículas de oro y partículas de oro recubiertas, que pueden convertirse mediante tinciones de plata. Los ejemplos de haptenos incluyen DNP, isotiocianato de fluoresceína (FITC), biotina y digoxigenina. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (ALP o AP), p-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, p-N-acetilglucosaminidasa, p-glucuronidasa, invertasa, xantina oxidasa, luciferasa de luciérnaga y glucosa oxidasa (GO). Los ejemplos de sustratos de uso común para la peroxidasa de rábano picante incluyen 3,3'-diaminobencidina (DAB), diaminobencidina con mejora de níquel, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), diclorhidrato de bencidina (BDHC), reactivo de Hanker-Yates (HYR), azul de indofenol (IB), tetrametilbencidina (TMB), 4-cloro-1-naftol (CN), alfa-naftol pironina (alfa-NP) odianisidina (OD), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), azul nitro tetrazolio (NBT), cloruro de 2-(p-yodofenil)-3-pnitrofenil-5-fenil tetrazolio (INT), azul tetranitro tetrazolio (TNBT), 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-galactósido/ferroferricianuro (BCIG/FF).

Los ejemplos de sustratos de uso común para la fosfatasa alcalina incluyen Naftol-AS-B 1-fosfato/rojo rápido TR (NABP/FR), Naftol-AS-MX-fosfato/rojo rápido TR (NAMP/FR), Naftol-AS-B1-fosfato/-rojo rápido TR (NABP/FR), naftol-As-MX-fosfato/rojo rápido TR (n Am P/FR), naftol-AS-BI-fosfato/fusquina nueva (NABP/NF), bromocloroindolil fosfato/nitroazul tetrazolio (BCIP/NBT), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiranósido (BCIG).

Los ejemplos de marcadores luminiscentes incluyen luminol, isoluminol, ésteres de acridinio, 1,2-dioxetanos y piridopiridazinas. Los ejemplos de marcadores electroquimioluminiscentes incluyen derivados de rutenio. Los ejemplos de marcadores radioactivos incluyen isótopos radioactivos de yodo, cobalto, selenio, tritio, carbono, azufre y fósforo.

Los marcadores detectables pueden unirse a los anticuerpos descritos en el presente documento o a cualquier otra molécula que se una específicamente a un marcador biológico de interés, por ejemplo, un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico o un polímero. Además, un experto en la técnica apreciará que los marcadores detectables también pueden conjugarse con un segundo, y/o tercer, y/o cuarto, y/o quinto agentes de unión o anticuerpos, etc. Además, el experto en la técnica apreciará que cada agente de unión o anticuerpo adicional usado para caracterizar un marcador biológico de interés puede servir como una etapa de amplificación de la señal. El marcador biológico puede detectarse visualmente con el uso de, por ejemplo, microscopía óptica, microscopía fluorescente, microscopía electrónica donde la sustancia detectable es, por ejemplo, un tinte, una partícula de oro coloidal, un reactivo luminiscente. Las sustancias visualmente detectables unidas a un marcador biológico también pueden detectarse con el uso de un espectrofotómetro. Cuando la sustancia detectable es un isótopo radioactivo, la detección puede realizarse visualmente mediante autorradiografía o no visualmente con el uso de un contador de centelleo. Ver, por ejemplo, Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80, 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.).

La descripción proporciona además kits para detectar CD40 o células o tejidos que expresan CD40 en una muestra, en donde los kits contienen al menos un anticuerpo, polipéptido, polinucleótido, vector o célula huésped como se describe en el presente documento. Un kit descrito en el presente documento puede comprender tampones, enzimas, marcadores, sustratos, perlas u otras superficies a las que se unen los anticuerpos de la descripción y similares, e instrucciones de uso.

Ejemplos

Ejemplo 1

Producción y humanización de anticuerpos anti-CD40

Se inmunizaron cuatro conejos blancos de Nueva Zelanda con Fc-hCD40 de conejo recombinante. Se eligió el conejo con los títulos de suero más altos de unión específica a CD40 humano para la fusión celular. Se identificaron un total de 172 hibridomas como aglutinantes positivos para Fc-hCD40 soluble, de los cuales se encontró que 44 clones eran aglutinantes positivos para CD40 de la superficie celular. Después del ensayo de conglomeración de epítopos, se seleccionaron 24 hibridomas representativos para expresión recombinante y caracterización adicional. El cribado funcional secundario se llevó a cabo como se describe a continuación e incluyó: 1) inducción de la maduración de DC medida por la regulación positiva de CD80, CD83, CD86 (actividad agonista); 2) inducción de la inhibición directa del crecimiento tumoral (actividad agonista); y 3) función efectora del anticuerpo por ADCC. Los candidatos se seleccionaron en base a cribados funcionales duales que incluían dos componentes: 1) afinidad de unión, internalización de anticuerpos, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP); y 2) función de activación/maduración de DC agonista, interacción receptor-ligando, reacción de linfocitos mixtos (MLR), proliferación celular y apoptosis.

Cribado de anticuerpos agonistas por medio de la maduración de células dendríticas

Para aclarar aún más el efecto agonista o antagonista del panel inicial de anticuerpos anti-CD40, se usó un ensayo de maduración de DC como indicador para el cribado de anticuerpos funcionales. Se añadieron anticuerpos anti-CD40 o de control a la solución de cultivo de DC derivada de monocitos humanos durante 2 días. Para el cribado de anticuerpos agonistas se midió la regulación positiva de CD83, uno de los marcadores de maduración más conocidos para las células dendríticas humanas. Se usó como control positivo 5C11, un anticuerpo monoclonal de ratón que induce la maduración de las células dendríticas. Los anticuerpos R-3, R-6, R-8, R-9, R-16, R-18, R-24, R-33, R-36, 19-21, 19-45 y 19-59 aumentaron más del 50 % de la expresión de CD83 en comparación con la Ig control (Figura 1A). La maduración de las DC se determinó además mediante la medición de la regulación positiva inducida por anticuerpos de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 para los anticuerpos seleccionados. Como se muestra en la Figura 1B y la Figura 1C, los anticuerpos R-3, R-8, R-9, R-33 y 19-21 regularon positivamente tanto CD80 como CD86, mientras que los otros anticuerpos solo tuvieron efectos modestos. Estos resultados fueron consistentes con los efectos de modulación de CD83 por estos anticuerpos. Curiosamente, entre los anticuerpos que pueden inducir la maduración de las DC, solo el clon 19-21 mostró una fuerte actividad de potenciación de la proliferación de células T en una reacción de linfocitos mixtos (Figura 1D).

Cribado para la detección de inhibición directa del crecimiento tumoral

El panel de anticuerpos anti-CD40 agonistas se evaluó adicionalmente para detectar la capacidad de inducir la inhibición del crecimiento tumoral de células tumorales que expresan CD40. Todos los anticuerpos anti-CD40 evaluados inhibieron la proliferación de células tumorales. El anticuerpo 19-21 demostró la mayor potencia (Figura 2).

Cribado para la detección de actividad ADCC

Además de la inducción de la activación de APC y la inhibición del crecimiento tumoral, la función efectora del anticuerpo, la ADCC, se usó como un criterio importante para cribar y clasificar los anticuerpos candidatos. Para realizar el ensayo de la ADCC con el uso de PBMC humanas, todos los anticuerpos seleccionados se convirtieron de mAb de conejo en mAb quiméricos con Fab de conejo e IgG1 humana. Como se muestra en la Figura 3, todos los candidatos seleccionados mostraron una actividad ADCC significativa en comparación con el control de IgG1. En base a la actividad ADCC máxima, los mAb de mayor actividad pueden clasificarse como cR-8 > cR-3 > cR-33 > c19-21 > c R-9 > c19-59.

Se seleccionaron cuatro candidatos (c19-21, cR-8, cR-3, cR-33) en base al cribado funcional in vitro. Sus caracterizaciones in vitro se resumen en la Tabla 1. El anticuerpo c19-21 potencia fuertemente la activación de DC y la inhibición del crecimiento tumoral, mientras que los anticuerpos cR-8 y cR-3 mostraron una actividad ADCC más potente.

Tabla 1. Características de 4 anticuerpos anti-CD40 candidatos:

Cribado de la actividad antitumoral in vivo

Como los 4 mejores candidatos mostraron diferentes potencias en diferentes ensayos in vitro, se realizaron estudios in vivo para evaluar y comparar su actividad antitumoral para la selección de los de mayor actividad. Se usó el modelo de xenoinjerto de tumor de Ramos. Los ratones portadores de tumores se trataron por vía i.p. con 5 mg/kg de anticuerpos quiméricos cR-3, cR-8, cR-33 o c19-21, 3 veces por semana para un total de 9 dosis (ocho animales por grupo). Se usó como referencia la actividad antitumoral de rituximab con el mismo régimen. Como se muestra en la Figura 4A, cR-8 y cR-3 mostraron el efecto antitumoral más fuerte. Por el contrario, 19-21 exhibió una actividad antitumoral más baja con un rebote tumoral más rápido después de terminar la dosificación. El efecto antitumoral de cR-33 fue intermedio, pero aún exhibió una mejor eficacia in vivo que rituximab. La potencia in vivo de los anticuerpos cR-3 y cR-8 se evaluó adicionalmente en un estudio de dosis-respuesta. Como se muestra en la Figura 4B, cR-8 mostró una eficacia antitumoral más potente que cR-3 y, por lo tanto, se identificó como el anticuerpo anti-CD40 de mayor actividad.

La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del clon R-8 se expone en las SEQ ID NO:1 y 2. Las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH y VL se exponen en las SEQ ID NO:3-5 y 6 8, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de las secuencias de cadena pesada y ligera de varios de los otros anticuerpos candidatos que mostraron actividad funcional se expone en las SEQ ID NO:11-56. Las secuencias de aminoácidos de VHCDR y VLCDR para estos anticuerpos se proporcionan en las SEQ ID Nos:57-194. La Figura 16 muestra un alineamiento de estas secuencias, que incluye el clon R-8, con las CDR subrayadas.

R-8 se humanizó con el uso de una tecnología de humanización guiada por linaje mutacional (MLG) patentada (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 7,462,697). El marco estructural de la cadena ligera y pesada del R-8 humanizado (APX005) es idéntica en un 95 % a las secuencias de la línea germinal humana. La secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL humanizadas se expone en las SEQ ID NO:9 y 10, respectivamente. Se encontró que la unión de APX005 a CD40 era similar a su clon parental R-8.

Ejemplo 2

Caracterización in vitro del anticuerpo anti-CD40 humanizado APX005

Se realizaron numerosos experimentos in vitro para caracterizar aún más el anticuerpo humanizado APX005.

APX005 se une selectivamente a CD40

La selectividad de unión de APX005 se evaluó mediante ELISA directo a un panel de proteínas de la familia TNFR. Se recubrieron placas de ELISA con un total de 1 pg/ml de proteína de fusión de Fc de conejo y CD40, RANK, TweakR, OX40, DR5 y 4-1BB. El APX005 unido se detectó con el uso de anti-IgG humana conjugada con HRP de cabra. Como se muestra en la Figura 5, APX005 se une selectivamente al CD40 humano pero no a otras proteínas de la familia TNFR evaluadas.

APX005 bloquea la unión de CD40L a CD40

Se realizó un ELISA para evaluar el efecto de APX005 sobre la unión de CD40L a CD40. En particular, se usó CD40L (concentración final de 4 pg/ml) para unir el CD40 humano inmovilizado en una placa ELISA, y se midieron los cambios en la cantidad de unión de CD40L a CD40 después de preincubar CD40 inmovilizado con APX005. La unión de CD40L a CD40 inmovilizado se detectó mediante un anticuerpo monoclonal anti-CD40L de ratón. Como se muestra en la Figura 6, APX005 bloquea la unión de CD40L a CD40. Por el contrario, SGN-40 aumenta la unión.

El complejo APX005/CD40 no está internalizado

Para evaluar la internalización mediada por la diana de APX005 para evaluar su impacto en la actividad ADCC, las células Ramos se incubaron con APX005 durante 4 horas a 37 °C, una temperatura permisiva para la internalización, o a 4 °C durante 30 minutos, una temperatura a la que se minimiza la internalización. Las células se lavaron con tampón de tinción, seguido de incubación con anti-IgG humana de cabra marcado con Alexa 488 durante 30 minutos más a 4 °C. Se realizó un análisis FACS para examinar el nivel de APX005 en la superficie celular. Como se muestra en la Figura 7, no hubo reducción (ligero aumento) del nivel de APX005 en la superficie celular después de la incubación a 37 °C. Los datos sugieren que tras la unión a CD40 el complejo APX005/CD40 no se internalizó en las células tumorales, por lo tanto proporciona las condiciones óptimas para reclutar las células efectoras para la ADCC.

APX005 media la ADCC

Para evaluar la actividad ADCC de APX005 en células tumorales que expresan CD40, se usaron células Ramos y Daudi que expresan CD40 como células diana y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas frescas como células efectoras. La ADCC se midió mediante un ensayo de liberación de calceína-AM. Las células diana se marcaron con calceína-AM (15 uM/106 células), se lavaron y sembraron por triplicado a 5 x 103 por pocillo en placas de 96 pocilios de fondo redondo. Se preincubaron concentraciones crecientes (0,0001-10 |jg/ml) de APX005 o de anticuerpos de control a 4 °C durante 30 minutos, después de lo cual se añadieron células PBMC efectoras de donantes humanos sanos con una relación final de células efectoras:diana de 40:1 en un volumen final de 200 ul por pocillo. Los experimentos se realizaron con el uso de PBMC de al menos tres donantes diferentes. Después de una incubación de 4 horas, se transfirieron 100 j l de sobrenadantes de cultivo a una placa Black View Plate-96 y se leyeron unidades fluorescentes arbitrarias (AFU) en un lector de placas Victor II (excitación de 485 nm/emisión de 535 nm). Porcentaje de lisis específica = (liberación experimental media de AFU - liberación espontánea media de AFU)/(liberación máxima media de AFU - liberación espontánea media de AFU). Como se muestra en la Figura 8, APX005 indujo la ADCC de una manera dependiente de la dosis. Se observó un efecto similar para SGN-40. La diferente sensibilidad de las células Ramos y Daudi a la ADCC puede deberse a diferentes niveles de expresión de CD40 (Cancer Res 2005; 65: 8331-8338).

APX005 inhibe la proliferación de células tumorales

Para evaluar la capacidad de APX005 para inhibir la proliferación de células tumorales, se sembraron células Ramos en placas de fondo plano de 96 pocillos a 50 000 células/pocillo en 200 j l de RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 % que contenía concentraciones variables de APX005, SGN-40 o una IgG humana control. Para la reticulación, se preincubó APX005, SGN-40 o IgG control con fragmentos F(ab')2 de un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico del fragmento Fc en el medio durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadirse a las células. Las células se trataron durante un total de 72 horas. Después, se añadió AlamarBlue® al 10 % (Serotec, Oxford, Reino Unido) a cada pocillo y se incubó durante 24 horas adicionales. La viabilidad celular se midió mediante un lector de fluorescencia CytoFluor con una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Todos los estudios se realizaron dos veces y por triplicado para cada concentración de muestra. Como se muestra en la Figura 9, el monómero APX005 inhibió la proliferación de células Ramos (Figura 9A). Cuando APX005 se reticuló con un anticuerpo secundario, suministró un efecto inhibidor de la proliferación aumentado y dependiente de la dosis (Figura 9B). La reticulación de APX005 puede lograrse in vivo mediante células que expresan el receptor Fc.

APX005 induce la activación de DC

Para evaluar la capacidad de APX005 para estimular la maduración de células DC, se prepararon PBMC por centrifugación en gradiente de densidad con el uso de una solución de aislamiento de linfocitos. Los monocitos adherentes se recolectaron después de la incubación durante 2 horas a 37 °C. Los monocitos aislados se cultivaron con 100 ng/ml de GM-CSF humano recombinante y 100 ng/ml de IL-4 humana recombinante en un medio RPM11640 suplementado con FCS al 10 % en una placa de 24 pocillos. La mitad del medio se cambió después de 3 días. En el día 5 de cultivo, se añadieron 1,3 nM de anticuerpos anti-CD40, CD40L o el anticuerpo control a las células DC, y se cultivaron adicionalmente durante 48 h en una placa de 24 pocillos. Para la tinción del marcador de activación de DC, se usaron anti-CD83, anticuerpo anti-CD86 y anticuerpo anti-CD80 conjugados con PE. El análisis se realizó con el uso de FACS. Los datos provienen de un estudio representativo. Como se muestra en la Figura 10, APX005 indujo una marcada maduración de DC y su efecto parece más potente que SGN-40 y CD40L. El aumento de la activación de DC puede conducir a respuestas de células T antitumorales más potentes.

APX005 tiene reactividad cruzada con CD40 de mono pero no con CD40 de ratón

La reactividad cruzada se evaluó mediante un ELISA directo. Se recubrió un total de 1 jg/m l de CD40 humano, CD40 de mono o CD40 de ratón sobre placas de ELISA seguido de incubación con 1 jg/m l de APX005 o de IgG1 control. Los anticuerpos unidos a CD40 se detectaron con el uso de anti-IgG humana de cabra conjugado con HRP. APX005 reacciona claramente de forma cruzada con CD40 de mono pero no con CD40 de ratón. (Figura 11A)

La reactividad cruzada de APX005 con CD40 de ratón se determinó adicionalmente por FACS mediante la unión a una línea celular A20 de ratón que expresa CD40 de ratón. Se añadió una alícuota de 0,5 x 106 células A20 a placas de 96 pocillos y se incubó con 100 j l de anticuerpo de rata anti-CD40 de ratón diluido, conjugado con PE, anticuerpos APX005 o IgG1 control. Después del lavado, se añadieron 100 j l de anti-IgG (H+L) humana de cabra conjugada con R-PE (Southern Biotech núm. de catálogo 2040-09) a una dilución de 1:200 en PBS a la muestra y se incubaron para la detección de APX005 y de IgG1 humana control. Se usó como control positivo un anticuerpo de rata anti-CD40 de ratón conjugado con PE. Las muestras se resuspendieron con 0,5 ml de PBS y se analizaron mediante FACS. Los datos de FACS mostraron que APX005 no reacciona de forma cruzada con CD40 de ratón (Figura 11B).

En resumen, los experimentos de este ejemplo mostraron que APX005 es un anticuerpo IgG1 humanizado que se une a CD40. APX005 se une específicamente a CD40 con una Kd de 9,6 x 10'10 M y bloquea la unión de CD40L a CD40. Esto difiere del anticuerpo anti-CD40 SGN40 que potencia la interacción CD40-CD40L. Esto sugiere que estos dos anticuerpos se unen a distintos epítopos. In vitro, APX005 mostró una potente actividad ADCC para células de linfoma positivas para CD40 (Ramos y Daudi), así como la capacidad de inhibir directamente la proliferación de células tumorales (Ramos) tras la reticulación. APX005 también estimuló la maduración de las células dendríticas para potenciar la respuesta inmunitaria celular. Además, APX005 mostró reacción cruzada con CD40 de mono.

Ejemplo 3

Caracterización in vivo del anticuerpo anti-CD40 humanizado APX005

Se realizaron numerosos experimentos in vivo para caracterizar aún más el anticuerpo humanizado APX005.

Inhibición con APX005 del crecimiento tumoral en el modelo de Ramos

Para evaluar el efecto de APX005 en el modelo de xenoinjerto de linfoma de células B humanas, se usaron ratones BALB/c nu/nu hembra de 6-8 semanas de edad para la inoculación de células tumorales. Los xenoinjertos se establecieron por inoculación subcutánea de 1 x 107 células tumorales/ratón en los flancos dorsales. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 100 mm3 (50-200 mm3), los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a 3 mg/kg a partir del día 13 (ver Figura 12). La dosis se administró 3 veces por semana para un total de 9 dosis (ocho animales por grupo). Las dimensiones perpendiculares del tumor se midieron con el uso de un calibre de escala Vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon con el uso de la fórmula: Volumen = (largo x ancho2)/2. Como se muestra en la Figura 12A, APX005 demostró una actividad antitumoral potente y duradera. El suero se tomó el día 34, dos días después de la última dosificación, para determinar los niveles de fármaco in vivo mediante la medición de las concentraciones de la IgG humana (ver Figura 12B). La eficacia antitumoral mediada por APX005 fue mayor que la de SGN-40 y persistió mucho después del período de dosificación. El análisis PK de un solo punto mostró que la actividad antitumoral superior de APX005 no se debía a la diferencia de PK.

Inhibición con APX005 de tumores resistentes y pretratados con rituximab

El objetivo de este experimento fue evaluar el efecto de APX005 sobre el linfoma de células B resistente y pretratado con rituximab. Los ratones desnudos portadores de tumores de Ramos establecidos se trataron primero con rituximab a 3 mg/kg durante 5 dosis. El crecimiento tumoral se inhibió parcialmente con rituximab (Figura 13A). Cuando estos tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 700 mm3, se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos (7 animales por grupo) y se volvieron a tratar por vía i.p. con APX005, rituximab, análogo de SGN40 3 mg/kg o control de solución salina durante 3 semanas (Figura 13B). Como se muestra en la Figura 13, los tumores pretratados con rituximab no respondieron al nuevo tratamiento con rituximab, lo que sugiere que estos tumores son resistentes a rituximab (Figura 13B). APX005 exhibió la capacidad de inhibir el crecimiento de tumores resistentes a rituximab.

Inhibición con APX005 del crecimiento tumoral en el modelo de Raji

El objetivo de este experimento fue determinar la relación de dosis y eficacia de APX005 in vivo. Los ratones desnudos portadores de tumores de Raji CD40 positivos establecidos se trataron con APX005 a partir del día 15. Se administraron por vía i.p. dosis de APX005 que variaban de 0,1 mg/kg -10 mg/kg. 3 veces/semana durante 2 semanas (ocho animales por grupo) (ver Figura 14). Se usó solución salina como tratamiento control. Se midieron los volúmenes tumorales en cada día de dosificación. Los niveles séricos de APX005 en cada grupo también se midieron 3 días después de la última dosis para determinar la correlación de la eficacia in vivo con los niveles de APX005 en la circulación. Se observó una clara actividad antitumoral dependiente de la dosis (ver Figura 14). Las diferencias en los volúmenes tumorales fueron significativas (p < 0,05) entre el grupo de control y los grupos de tratamiento con anticuerpos con niveles de dosis > 1 mg/kg en los días 29 a 33. La dosis mínima efectiva se determinó en 1 mg/kg, que correspondía a una concentración sérica media de 0,49 pg/ml en el día 36. Las diferencias en los volúmenes tumorales entre los grupos de dosis de 3, 5 y 10 mg/kg no fueron estadísticamente significativas. Por lo tanto, la actividad antitumoral máxima se logró a dosis > 3 mg/kg con una concentración sérica media > 1,6 pg/ml.

Inhibición del crecimiento tumoral en el modelo MM IM-9 humano por APX005

Para evaluar la actividad antitumoral de APX005 en el modelo de mieloma múltiple humano, se trataron por vía i.p. con APX005 o SGN40 ratones desnudos portadores de tumores IM-9 de mieloma múltiple positivos para CD40 establecidos a partir del día 15. APX005 se administró a 3 mg/kg, 3 veces/semana durante 3 semanas (5 animales por grupo). Se midieron los volúmenes tumorales en cada día de dosificación.

APX005 demostró una potente actividad antitumoral contra el mieloma múltiple humano en el modelo de xenoinjerto IM-9 (ver Figura 15). La eficacia antitumoral mediada por APX005 fue significativamente mayor que la de SGN-40 (p < 0,05).

Inhibición del crecimiento tumoral en el modelo de Ramos por APX005 en comparación con SGN-40 y rituximab

El objetivo de este experimento fue comparar la actividad antitumoral de APX005, rituximab y SGN-40 en un modelo de xenoinjerto de Ramos de linfoma de células B humanas. Los xenoinjertos se establecieron por inoculación subcutánea de células Ramos en los flancos dorsales de ratones SCID C.B-17 hembra. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 200-300 mm3, los animales se distribuyeron aleatoriamente en 6 grupos. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a las dosis indicadas en la Figura 17. La dosis se administró 3 veces por semana para un total de 9 dosis (10 animales por grupo). Las dimensiones perpendiculares del tumor se midieron con el uso de un calibre de escala Vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon con el uso de la fórmula: Volumen = (largo x ancho2)/2. También se determinó y se registró la supervivencia de los ratones.

APX005 demostró actividad antitumoral dependiente de la dosis. El tratamiento con la dosis alta de APX005 (10 mg/kg) dio como resultado una regresión completa del tumor, mientras que rituximab a la misma dosis (10 mg/kg) solo retrasó el crecimiento tumoral, lo que sugiere que APX005 es más eficaz que rituximab en este modelo. APX005 también es más potente que SGN-40 (Figura 17A). APX005 no solo inhibió el crecimiento tumoral sino que también mejoró la supervivencia de los animales portadores de tumores (Figura 17B).

Inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de linfoma de Namalwa humano resistente a rituximab

El objetivo de este experimento fue comparar la actividad antitumoral de APX005, rituximab y SGN-40 en el modelo de linfoma de Namalwa humano resistente a rituximab. Los xenoinjertos se establecieron por inoculación subcutánea de células de Namalwa en los flancos dorsales de ratones SCID C.B-17 hembra. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 200-300 mm3, los animales se distribuyeron aleatoriamente en 6 grupos. Los anticuerpos se administraron por vía i.p. a las dosis indicadas en la Figura 18. La dosis se administró 3 veces por semana para un total de 9 dosis (10 animales por grupo). Las dimensiones perpendiculares del tumor se midieron con el uso de un calibre de escala Vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon con el uso de la fórmula: Volumen = (largo x ancho2)/2. También se determinó y se registró la supervivencia de los ratones.

APX005 demostró una potente actividad antitumoral en el modelo de linfoma de Namalwa resistente a rituximab (Figura 18A). APX005 también mejoró la supervivencia de ratones portadores de tumores resistentes a rituximab (Figura 18B).

En resumen, los experimentos en este ejemplo mostraron que la eficacia de APX005 se examinó en múltiples modelos de tumores de xenoinjerto. APX005 inhibió notablemente el crecimiento tumoral en el modelo de Ramos. Curiosamente, el efecto terapéutico persistió mucho más allá del período de dosificación. El tratamiento con APX005 dio como resultado la inhibición de tumores resistentes y pretratados con rituximab. Se realizó un estudio de búsqueda del rango de dosis en el modelo de Raji y se encontró que la dosis mínima efectiva se determinó como 1 mg/kg, y la actividad antitumoral máxima se observó en dosis > 3 mg/kg. Además del linfoma de células B, APX005 también exhibió una potente actividad antitumoral significativa en el modelo IM-9 de mieloma múltiple humano.

Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que APX005 puede usarse para mejorar el tratamiento de pacientes con NHL, CLL, mieloma múltiple y ciertos tumores sólidos que expresan el CD40 diana. Al unirse a CD40, APX005 recluta células citotóxicas para destruir células tumorales por medio de la ADCC. APX005 también puede inhibir directamente la proliferación de células tumorales y activar la APC por medio de su actividad agonista. In vivo, APX005 inhibió notablemente el crecimiento de múltiples xenoinjertos de tumores humanos que expresan CD40 y mostró efectos antitumorales de larga duración. APX005 también puede inhibir el mieloma múltiple humano y los tumores resistentes y pretratados con rituximab.

Ejemplo 4

El mutante APX005 S267E FC aumenta la unión a fcYRIIB y la actividad agonista de CD40

En un esfuerzo por aumentar la unión al receptor FCy y aumentar la actividad agonista del anticuerpo APX005, la serina (S) en el residuo 267 del Fc de APX005 (IgG1, numeración de EU) se mutó a ácido glutámico (E) para generar el mutante APX005 S267E. La mutación de AGC (S) a GAG (E) en la posición 267 ubicada en la región Fc de la cadena pesada de APX005 se confirmó mediante secuenciación. La región constante de la cadena pesada de IgG1 que comprende la secuencia de la región Fc modificada se proporciona en la SEQ ID NO:195 (esta secuencia incluye CH1, bisagra, CH2 y CH3 de IgG1).

Para evaluar la capacidad del mutante APX005 S276E de unirse a CD40, se purificaron plásmidos de cadena pesada y cadena ligera ApX005 S267E a partir de bacterias transformadas y se transfectaron en células 293-6E. Cuatro días después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos y se evaluaron para determinar su unión a CD40 con el uso de ELISA (placas de ELISA recubiertas con proteína CD40-Fc). Los datos de ELISA mostraron que el mutante APX005 S267E tenía una actividad de unión similar a la de APX005 a CD40 (ver la Figura 19).

En otro experimento, se determinó la capacidad de los anticuerpos CD40 de unirse a la proteína CD40 nativa mediante análisis fAc S con células Ramos vivas. Se recolectaron células Ramos y se bloquearon con 1,5 ml de tampón de bloqueo (BSA/PBS al 0,1 %) durante 30 minutos. Se añadieron a las células anticuerpos a varias concentraciones y se incubaron durante 1 hora. Después del lavado, se añadieron 50 pl de anticuerpo anti-IgG (H+L) humana de cabra conjugado con PE a una dilución de 1:1000 en solución de bloqueo y se incubó durante 30 minutos. Después, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron con 1 m de PBS y se analizaron mediante FACS. Los anticuerpos evaluados fueron el anticuerpo agonista anti-CD40 de conejo 19-21, SGN-40 desarrollado por Seattle Genetics y CP870893 de Pfizer. Como se muestra en la Figura 20, APX005 y el mutante APX005 S267E mostraron afinidad de unión a CD40 similar a SGN40, pero una afinidad 6 veces mayor que CP870893.

Se realizó un experimento para comparar la actividad agonista de CD40 de APX005, el mutante APX005 S267E y otros anticuerpos anti-CD40 en un ensayo de activación de células B. En particular, la actividad agonista de CD40 se evaluó mediante la medición de la regulación positiva de CD86, un marcador de activación de células B, en células B humanas después del tratamiento con varios anticuerpos anti-CD40 in vitro. Se obtuvieron células B humanas frescas mediante el aislamiento de células B de sangre periférica con el uso de un método de selección negativa (All Cells). Las células B se trataron con diferentes anticuerpos humanos a 10, 3,33, 1,11, 0,37, 0,12, 0,04, 0,01 y 0,0045 pg/ml durante 48 horas. Luego, las células se recolectaron y se analizaron para detectar la expresión de CD86 humano en células B vivas mediante citometría de flujo. Se evaluaron 19-21, SGN-40 y CP870893 (ver descripción arriba). Como se muestra en la Figura 21, el mutante APX005 S267E demostró una potencia (EC50) y eficacia (EC100) significativamente mayores en comparación con APX005. APX005 S267E fue el anticuerpo agonista de CD40 más potente entre los anticuerpos anti-CD40 evaluados en este ensayo.

Se realizó un experimento adicional para evaluar la actividad ADCC de APX005 y el mutante APX005 S267E. Específicamente, se ensayó la capacidad de los anticuerpos contra CD40 de mediar los efectos de la ADCC in vitro con el uso de células de Daudi como células diana y PBMC humanas como células efectoras. Las células diana marcadas se sembraron en placas por triplicado a razón de 5 x 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadió una concentración creciente de anticuerpos (50 ul/pocillo en medio completo) a las células marcadas. La concentración final de anticuerpo varió de 0-10 pg/ml (en medio completo). Las células se trataron con los anticuerpos durante 30 minutos a 37 °C. Se sembraron células efectoras (PBMC) en medio completo en células diana, (relación células efectoras/célula diana = 40/1). El volumen final de células efectoras es 100 ul/pocillo. Después de 4 horas de incubación en una incubadora a 37 °C, se transfirieron 100 ul de sobrenadante de cultivo de cada pocillo a una placa de visualización en negro de 96 pocillos y se leyó las RFU con 485 ex/535 em. La lisis específica se calculó de acuerdo con la fórmula: Lisis específica = [(liberación de prueba - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)] X 100. Se usó rituxan como control positivo. Como se muestra en la Figura 22, el mutante APX005 S267E mostró un aumento leve de la actividad ADCC en comparación con el tipo silvestre de APX005.

Ejemplo 5

Caracterización del epítopo de APX005

Este ejemplo describe la caracterización del epítopo de APX005, un anticuerpo anti-CD40 humanizado. Como se describe con más detalle a continuación, se sintetizaron un total de 5841 péptidos lineales y péptidos unidos químicamente en andamios (CLIPS) y se analizaron en cuanto a la unión. Las regiones de unión dominantes se identificaron como 92TSEACESCVLHRSCSP107 (SEQ ID NO:196) y

125PCPVGFFSNVSSAFEKCHPW144 (SEQ ID n O:197). De los residuos de unión identificados, se conoce queT92, E97 y 100VL101 son residuos de contacto entre CD40 y el trímero de CD40L. Específicamente, E97 se considera un residuo de importación para la unión de CD40 al ligando.

La secuencia de la proteína CD40 se expone en la SEQ ID NO:198, y está directamente disponible como una estructura monocristalina: 3QD6. Los residuos de CD40 que se predicen que se unirán al trímero CD40L son E74, Y82, D84, N86 y E117 (ver, por ejemplo, Bajorath y otros, 1995 Biochemistry 34:9884-9892)). Cabe señalar que la numeración de secuencia en la estructura 3QD6 es 20 residuos mayor que los números mencionados en el presente documento. Por lo tanto, los residuos de unión claves predichos son E54, Y62, D64, N66 y E97.

Síntesis de péptidos y procedimientos de cribado.

Se sintetizó una biblioteca de péptidos estructurados para reconstruir epítopos discontinuos de la molécula diana. Esto se hizo con el uso de la tecnología de péptidos unidos químicamente en andamios (CLIPS) patentada de Pepscan (Pepscan Presto, Lelystad, Países Bajos) (ver, por ejemplo, Timmerman y otros (2007). J. Mol. Recognit. 20:283-99; Slootstra y otros (1996). Molecular Diversity 1: 87-96). La tecnología CLIPS proporciona la capacidad de estructurar péptidos en bucles simples, bucles dobles, bucles triples, pliegues en forma de hoja, pliegues en forma de hélice y sus combinaciones. Las plantillas de CLIPS se acoplan a residuos de cisteína. Para este experimento, las cadenas laterales de múltiples cisteínas en los péptidos se acoplaron a una o dos plantillas CLIPS. Por ejemplo, una solución 0,5 mM de la plantilla de T2 CLIPS 1,3-bis(bromometil)benceno se disolvió en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (1:1(v/v)). Esta solución se añadió a las matrices de péptidos. La plantilla CLIPS se une a las cadenas laterales de dos cisteínas presentes en los péptidos unidos en fase sólida de las matrices de péptidos (placa de 455 pocillos con pocillos de 3 ul). Las matrices de péptidos se agitaron suavemente en la solución durante 30 a 60 minutos mientras estaban completamente cubiertas de solución. Por último, las matrices de péptidos se lavaron extensamente con exceso de H2O y se sonicaron en tampón de ruptura que contiene 1 por ciento de SDS/0,1 por ciento de betamercaptoetanol en PBS (pH 7,2) a 70 °C durante 30 minutos, seguido por sonicación en H2O durante otros 45 minutos. Los péptidos portadores de T3 CLIPS se prepararon de manera similar pero con tres cisteínas.

La unión del anticuerpo a cada uno de los péptidos sintetizados se evaluó en un ELISA basado en PEPSCAN. Las matrices de péptidos se incubaron con solución de anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C). Después del lavado, las matrices de péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 de un conjugado de anticuerpo y peroxidasa (SBA, núm. de catálogo 2010-05) durante una hora a 25 °C. Después del lavado, se añadieron el sustrato de peroxidasa sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) y 2 microlitros/mililitro de H2O2 al 3 por ciento. Después de una hora, se midió el desarrollo de color. El desarrollo de color se cuantificó con una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes.

Procesamiento de datos

Los valores obtenidos de la cámara CCD varían entre 0 y 3000 mAU, similar a un lector ELISA de placa de 96 pocillos estándar. Los resultados se cuantificaron y almacenaron en la base de datos Peplab. Los valores de unión se extrajeron para su análisis. Ocasionalmente, un pocillo contenía una burbuja de aire que daba como resultado un valor falso positivo. Las tarjetas se inspeccionaron manualmente y cualquier valor causado por una burbuja de aire se puntuó como 0.

La determinación de los epítopos se realizó mediante una combinación de péptidos superpuestos de 20 mer y mutagénesis de residuo único de 12 áreas específicas de la proteína. Estas 12 áreas se seleccionaron en base a la estructura 3D conocida de CD40 y en los enlaces de cisteína publicados en la proteína. Se sintetizaron un total de 5841 péptidos CLIPS sintetizados químicamente.

La evaluación de los péptidos superpuestos de 20 mer indicó dos regiones de unión distintas: 92TSEACESCVUHRSCSPw (SEQ ID NO:196) y 125PCPVGFFSNVSSAFEKCHPW144 (SEQ ID NO:197). La evaluación de las secuencias superpuestas en las que se añadieron dos reemplazos de alanina dio resultados similares.

Los 12 epítopos candidatos "puntos calientes" que se eligieron contienen cada uno al menos 10 péptidos "control" idénticos en los que no se produce ninguna mutación. La evaluación de estas secuencias control para cada uno de los 12 conjuntos de datos de mutagénesis identificó dos regiones de unión distintas similares: 84TCEEGWHCTSEACESCVLH102 (SEQ ID NO:199) y 125PCPVGFFSNVSSAFEKCHPW144 (SEQ ID NO:197). Las lecturas de ELISA obtenidas son estadísticamente muy significativas (p < 2e-10). Al considerar la superposición de 92TSEACESCVLHRSCSP107 (SEQ ID NO:196) y 84TCEEGWHCTSEACESCVLH102, (SEQ ID NO:199) los residuos 92 102 (SEQ ID NO:202) son posiblemente los residuos más relevantes para la unión. Los datos del conjunto de matrices CLIPS que combinaban tres áreas de secuencia diferentes para identificar epítopos discontinuos no arrojaron información adicional.

El análisis en profundidad de los 2 conjuntos de datos de mutagénesis (84TCEEGWHCTSEACESCVLH102 (SEQ ID NO:199) y 125PCPVGFFSNVSSAFEKCHPW144 (SEQ ID NO:197) no indicó ningún residuo crítico, con la posible excepción de W 144. Sin embargo, la mutagénesis de los residuos 84-102 también se realizó en el péptido lineal, sin CLIPS (secuencia 84TCEEGWHSTSEASESCVLH102 (SEQ ID NO:200), los dos residuos subrayados se reemplazan de C a S). En este péptido linealizado, la unión a APX005 desapareció casi por completo, lo que indica que la unión de este anticuerpo depende específicamente de esas dos cisteínas, o depende del estado conformacional específico al que el péptido fue forzado por el ensamblaje de CLIPS.

La visualización de las áreas 92TSEACESCVLHRSCSP107 (SEQ ID NO:196) y 125PCPVGFFSNVSSAFEKCHPW144 (SEQ ID NO:197) en la estructura cristalina de CD40 mostró que los aminoácidos 92-107 forman una estructura en bucle frente al trímero CD40L (97ESC100 está dentro de 4A del ligando) (ver la Figura 23). Los residuos 125-144 no se resuelven en la estructura 3QD6, pero en base a los datos disponibles sobre enlaces de cisteína, se espera que estén muy próximos a los residuos 92-107. Con fines de visualización, los residuos 122-125 (SEQ ID NO:201) se muestran en la Figura 23.

Por tanto, este experimento describe el mapeo de la unión del anticuerpo humanizado APX005 sobre CD40 con el uso de péptidos lineales y CLIPS, llevado a cabo por Pepscan Presto BV. El mapeo dio como resultado la identificación de dos regiones de unión específicas. Estas son 92TSEACESCVLHRSCSP107 (SEQ ID NO:196) y 125PCPVGFFSNVSSAFEKCHPW144 (SEQ ID NO:197). Dentro de la región 92-107, los residuos 92TSEACESCVLH102 (SEQ ID NO:202) son posiblemente los residuos más relevantes para la unión. De los residuos de unión identificados, se conoce queTg2, E97 y 100VL101 son residuos de contacto entre CD40 y el trímero de CD40L. Específicamente, E97 se considera un residuo de importación para la unión de CD40 al ligando.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al CD40 humano y comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la región VHCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:3, la región VHCDR2 expuesta en la s Eq ID NO:4 y la región VHCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:5; (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:6, la región VLCDR2 expuesta en la SEQ ID n O:7, y la región VLCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:8; y una región Fc de IgG1 humana modificada por una mutación S267E.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que se une a un epítopo de CD40 expuesto en una cualquiera o más de las SEQ ID NO:196, 197, 199 y 202.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une al epítopo de CD40 expuesto en la SEQ ID NO:202.

4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es

a) humanizado; o

b) se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de cadena sencilla y un anticuerpo univalente que carece de una región bisagra; o

c) un anticuerpo completo.

5. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 5.

7. Una célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. La composición de la reivindicación 8 para el uso en un método para tratar o mejorar los síntomas del cáncer en un paciente, el método comprende administrar al paciente la composición de la reivindicación 8, para de este modo tratar o mejorar los síntomas del cáncer.

10. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, carcinomas de la vejiga, riñón, ovario, cuello uterino, mama, pulmón, nasofaringe, melanoma maligno y NHL y leucemias resistentes a rituximab.