KR20220062036A

KR20220062036A - 환자에서 인간 바이러스 연관된 장애를 방지하는 방법

Info

Publication number: KR20220062036A
Application number: KR1020227011527A
Authority: KR
Inventors: 티나 루비크-쉬네이더; 엘리자베타 트라기아이; 피터 울리히
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2022-05-13
Also published as: CA3148890A1; MX2022003009A; AU2019465294A1; JP2022553493A; WO2021048595A1; US20220332836A1

Abstract

본 개시는 대상체, 특히 고형 장기 이식 환자와 같이 인간 바이러스-연관 장애, 특히 EBV-연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 이러한 장애를 방지하는 방법뿐만 아니라 EBV 로드를 제어하는 방법에 관한 것이다.

Description

환자에서 인간 바이러스 연관된 장애를 방지하는 방법

본 발명은 감염 위험이 있는 개체에서 바이러스 연관된 장애를 방지하는 방법에 관한 것이다.

엡스타인-바 바이러스(EBV)는 성인 집단의 90% 초과가 지속 감염되는, 인간에서 가장 성공적인 병원체 중 하나이다(Cesarman 2014, Cohen 2015). 면역결핍 개체에서의 EBV 감염은 암종(위 또는 코인두) 또는 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종)이 포함되는 악성종양이 포함되는, 모든 종류의 질환과 연관될 수 있다. 말기 장기 부전을 갖는 환자에 있어서는 이식이 치료용으로 선택된다. 그러나 이식의 성공은 장기 거부 반응을 방지하기 위한 면역억제 약물에 좌우된다. EBV-연관 이식-후 림프증식성 장애(PTLD)는 EBV 일차 감염 또는 재활성화와 연관된다. 면역적격 개체에서는 항-바이러스 T 세포 반응이 감염을 제어하지만, EBV는 기억 B 세포 및 일부 다른 세포 유형에서 잠복 상태로 남아 있다. 이식받은 환자에서, 현재의 면역억제 치료법은 항-EBV T 세포 반응을 둔화시켜, EBV-유도 B 세포 증식이 제어되지 않도록 한다. EBV 이식 환자, 특히 EBV 혈청양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 나이브 환자에게는 EBV-연관 이식-후 림프증식성 장애(PTLD)가 발생할 위험이 있다. 또한, EBV-양성 수신체에게는 이러한 심각한 장애가 발생할 위험이 작기는 해도 증가된다. 또 다른 바이러스인 JC 바이러스는 진행 다초점 백색질뇌병증(PML)의 두려운 합병증에 관여된다. EBV에 있어서, JC 바이러스 감염된 세포는 항-바이러스 T-세포 제어 하에 있다. T-세포 기능에 영향을 주는 현재의 면역억제제는 EB 및 JC와 같은 잠복 바이러스의 활성화 위험을 증가시킨다. 신장 이식 후 우수한 단기 결과에도 불구하고, 중기 결과는 성공적이지 않으며, 환자의 30%는 5년째에, 그리고 50%는 10년째에 주로, 칼시뉴린 억제제(CNI) 예컨대 사이클로스포린 A(CsA) 또는 타크롤리무스(Tacrolimus) 독성으로 인해 이의 신장 기능을 소실한다. 시판되는 CNI-비함유 요법 중 하나는 미코페놀산과 조합된 벨라타셉트(Belatacept)(항-CTLA-4 Ig)이다. 벨라타셉트는 CD80/CD86을 차단하며 이에 따라 T 세포 공동자극을, 그리고 결과적으로 T 세포 활성화를 억제한다(Larsen 2005, Vincenti 2005). 벨라타셉트의 사용은 증가된 이식 후 림프증식성 장애(PTLD) 위험으로 인해 EBV 혈청음성 이식 환자에서는 금기된다(Hardinger et al., International Journal of Nephrology and Renovascular Disease 2016:9 139-150). 타크롤리무스를 대체하거나(CNI-비함유) 감소시킴으로써(CNI-상승작용), 새로운 요법은 더 우수한 안전성 프로필 및 더 우수한 장기 이식편 생존을 갖는 표준-케어 효능을 제공할 수 있다. 따라서, EBV 또는 JCV 감염 및 연관된 질환과 같은 바이러스 감염을 조절하거나, 방지하거나, 억제하는, 특히 EBV-양성 또는 EBV-나이브 이식 환자에서의 PTLD 또는 JC 바이러스에 의해 유도된 PML의 발생 가능성을 방지하거나 감소시키는 신규한 치료법에 대한 긴급한 필요성이 존재한다.

이식-후 림프증식성 장애(PTLD)와 같은 엡스타인 바 바이러스(EBV)-연관 장애는 EBV 일차 감염 또는 재활성화와 연관된다. 면역적격 개체에서는 항-바이러스 T 세포 반응이 감염을 제어하지만, EBV는 B 세포 및 일부 다른 세포 유형에서 잠복 상태로 남아 있다. 이식받은 환자에서, 면역억제는 항-EBV T 세포 반응을 둔화시켜, EBV-유도 B 세포 증식이 제어되지 않도록 할 수 있다. 본 발명자들은 CD40 길항제가 이러한 장애의 발생 위험이 있는 대상체에서 EBV-연관 장애의 방지를 위해 적합한 치료임을 확인하였다. 사이클로스포린 A(CsA), CTLA4-Ig 융합 단백질(벨라타셉트) 및 항-CD40 mAb(CFZ533/이스칼리맙)를 시험하는 EBV 제어 검정에서, 본 발명자들은 놀랍게도 CD40 길항제가 CsA 및 벨라타셉트와 대조적으로, 시험관내 EBV 제어를 손상시키지 않음을 확인하였다. 따라서, CD40 길항제, 특히 CFZ533/이스칼리맙과 같은 항 CD40 항체의 사용은 림프증식성 장애(PTLD)와 같은 EBV-연관 이식-후 장애의 위험을 감소시키는 새로운 이식 방법에 대한 기반을 제공한다. 본원에서 개시된 발명은 EBV 혈청양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV-나이브 이식 환자에서 PTLD와 같은 EBV-연관 질환이 발생할 위험을 감소시키는 장기 지속된 필요성에 대한 해결책을 제공한다.

본 개시의 제1 양태에 따르면 대상체에 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 인간 바이러스 연관된 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 이러한 장애를 방지하는 방법이 제공된다.

본 개시의 제1 양태의 하나의 구현예에서, 바이러스는 EBV 또는 사이토메갈로바이러스(CMV)와 같은 인간 헤르페스바이러스 또는 존 컨닝햄 바이러스(JCV)와 같은 베타폴리오마바이러스이다.

본 개시의 제1 양태에 따르면 대상체에 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, EBV-연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 이러한 장애를 방지하는 방법이 제공된다.

본 개시의 제2 양태는 대상체에 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 고형 장기의 이식을 필요로 하는 EBV 혈청음성 환자에 고형 장기를 이식하는 방법에 관한 것이다.

제3 양태에서 본 개시는 대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 EBV 감염을 제어하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 개시의 임의의 상술된 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법은 대상체에 CD40 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 EBV-연관 장애가 발생할 가능성을 감소시키는 방법이다.

또 다른 구현예에서, 본 개시의 임의의 상술된 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 EBV-연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는 방법이다.

하나의 구현예에서 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 대상체가 (i) EBV 혈청양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV-나이브 혈청음성 이식 환자, 또는 (ii) EBV 나이브 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 나이브 환자, 또는 (iii) EBV 혈청양성 또는 혈청음성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 혈청양성 환자인 방법이다.

추가 구현예에서 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 환자가 소아 환자인 방법이다. 또 다른 구현예에서 소아 환자는 간 이식 환자이다.

또 다른 구현예에서, 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 EBV-연관 질환이 발생할 위험이 있는 대상체가 면역억제되거나 면역조절 약물을 제공받고 있는 방법이다.

하나의 구현예에서 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 EBV-연관 장애가 암 또는 림프증식성 질환인 방법이다.

이의 모든 상술된 구현예가 포함되는 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태의 추가 구현예에서, 방법은 이식-후 림프증식성 질환이 발생할 가능성을 감소시킨다.

추가 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법은 EBV 혈청양성 공여체로부터 EBV 혈청음성 수신체로의 고형 장기의 이식을 포함한다.

또 다른 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법은 EBV-연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는 방법이다.

하나의 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법은 대상체가 EBV 양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV-나이브 혈청음성 이식 환자인 방법이다.

추가 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법은 환자가 소아 환자인 방법이다. 또 다른 구현예에서 소아 환자는 간 이식 환자이다.

또 다른 구현예에서, 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법은 대상체가 면역억제되는 방법이다.

본 개시의 제4 양태에서 이의 모든 구현예가 포함되는, 임의의 상술된 양태에 따른 방법은 CD40 길항제가 항체인 방법이다. 하나의 구현예에서 CD40 항체는, 예를 들어 US8568725B2에 기재된 바와 같은 ASKP1240, 예를 들어 US8591900에 기재된 바와 같은 BI655064, 예를 들어 US8669352에 기재된 바와 같은 FFP104, 또는 MEDI4920이다.

본 개시의 상술된 제4 양태의 하나의 구현예에서, 항-CD40 항체는 침묵화된 ADCC 활성을 갖는 항체이다.

또 다른 구현예에서, 본 개시의 제4 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법에서 사용되는 항체는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:

a. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;

b. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;

c. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 13의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체; 및

d. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 14의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체.

하나의 구현예에서, 이의 모든 구현예가 포함되는, 이전 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 항체는 SEQ ID NO: 9의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄 아미노산 서열; 또는 SEQ ID NO: 11의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 양태에서, 이의 모든 구현예가 포함되는, 이전 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용되는 항체는 CFZ533이다.

본 개시의 제5 양태에서, 이의 모든 구현예가 포함되는, 이전 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 치료 유효량의 CD40 항체, 예를 들어, CFZ533 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 개시의 제5 양태의 하나의 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 피하 또는 정맥내 또는 피하 또는 정맥내의 조합이며, 여기서 용량은 항체의 혈장 또는 혈청 농도가 적어도 40 μg/mL이도록 조정될 수 있다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 또 다른 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물은 인간 대상체의 킬로그램 당 활성 성분 3 mg(mg/kg) 초과, 예컨대 10 mg/kg 이상, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg 또는 30 mg/kg 이상일 수 있는 용량으로 투여된다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 또 다른 구현예에서, CD40 항체를 포함하는 약학 조성물의 투여 용량은 인간 대상체 킬로그램 당 활성 성분 약 3 mg 내지 약 30 mg, 예컨대 정맥내(IV) 투여되는 경우 킬로그램 당 활성 성분 약 3 mg 내지 약 30 mg이다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 추가 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 투여 용량은 인간 대상체 킬로그램 당 활성 성분 약 10 mg, 예컨대 IV로 킬로그램 당 활성 성분 약 10 mg이다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 하나의 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 투여 용량은 활성 성분 약 150 mg 내지 약 600 mg, 예컨대 피하(SC) 투여되는 경우 약 150 mg 내지 약 600 mg이다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 하나의 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 투여 용량은 활성 성분 약 300 mg 또는 약 450 mg, 예컨대 SC로 약 300 mg 또는 약 450 mg이다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 추가 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533은 먼저 로딩 용량 요법에 이어 유지 용량 요법으로 투여된다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태의 하나의 구현예는 CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 로딩 투약이 제1 용량의 주 1회, 2회, 3회, 또는 4회 정맥내 또는 피하 주사로 구성되며 유지 투약이 제2 용량의 매주 또는 격주 피하 주사로 구성되고, 여기서 제1 용량은 제2 용량보다 큰 방법에 관한 것이다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태의 또 다른 구현예는 CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 제1 용량이 약 300 mg 내지 약 600 mg이며, 제2 용량이 약 300 mg, 약 450 mg 또는 약 600 mg인 방법에 관한 것이다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태의 하나의 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 로딩 투약은 제1 용량의 1회 또는 2회 정맥내 투여로 구성되고 유지 투약은 제2 용량의 매주 또는 격주 피하 주사로 구성된다.

이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에 따른 또 다른 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 제1 용량은 약 10 mg/kg 또는 약 30 mg/kg이고 제2 용량은 약 300 mg 내지 600 mg이다.

본 개시의 추가적인 제6 양태는 EBV-연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서, 이러한 장애를 방지하는 약제의 제조를 위한, 항-CD40 항체를 포함하는 액체 약학 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 항-CD40 항체는,

a. 제1 로딩 용량 요법으로;

b. 이후 제2 유지 용량 요법으로, 정맥내 또는 피하 투여되고, 여기서 유지 용량은 로딩 용량과 상이하고, 상기 항-CD40 항체는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:

i. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;

ii. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;

iii. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 13의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체;

iv. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 14의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체;

v. 침묵 Fc IgG1 영역을 포함하는 항-CD40 항체; 및

vi. SEQ ID NO: 9의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄 아미노산 서열; 또는 SEQ ID NO: 11의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40 항체.

이의 모든 구현예가 포함되는 제6 양태의 추가 구현예는 이식-후 림프증식성 질환 가능성을 감소시키는 약제의 제조를 위한, 항-CD40 항체를 포함하는 액체 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

이의 모든 구현예가 포함되는 제6 양태의 또 다른 구현예는 고형 장기의 이식을 필요로 하는 EBV 혈청음성 환자에 고형 장기를 이식하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 항-CD40 항체를 포함하는 액체 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 개시의 제6 양태의 또 다른 구현예는 EBV 혈청양성 공여체로부터 EBV 혈청음성 수신체로 고형 장기를 이식하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 항-CD40 항체의 용도에 관한 것이다.

제7 양태에서 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는, 임의의 상술된 양태에 따라 사용하기 위한 항-CD40 항체, 예를 들어 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 항-CD40 항체 치료는 이식-후 일어나고 항체는 항체의 혈장 또는 혈청 농도가 적어도 40 μg/mL이도록 투여된다.

하나의 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는, 제7 양태에 따라 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 항체는 인간 대상체의 킬로그램당 활성 성분 약 3 mg 내지 약 30 mg의 용량으로 투여된다.

하나의 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는, 제7 양태에 따라 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 항체의 용량은 인간 대상체의 킬로그램당 활성 성분 약 10 mg이다.

또 다른 구현예에서 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는, 제7 양태에 따라 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 항체는 활성 성분 약 150 mg 내지 약 600 mg의 용량으로 투여된다.

제7 양태의 하나의 구현예에서 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는, 이전 양태 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 용량은 활성 성분 약 300 mg, 약 450 mg, 또는 약 600 mg이다. 대안적으로, 용량은 활성 성분 300 mg, 450 mg, 또는 600 mg이다.

제7 양태의 하나의 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는 이전 양태 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 항체는 로딩 투약 및 유지 투약으로 투여된다.

제7 양태의 하나의 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는 이전 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 로딩 투약은 제1 용량의 주 1회, 2회, 3회, 또는 4회 피하 주사(들)로 구성되고 유지 투약은 제2 용량의 매주 또는 격주 피하 주사로 구성되고, 제1 용량은 제2 용량보다 높다.

제7 양태의 또 다른 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는 이전 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 제1 용량은 약 300 mg 내지 약 600 mg이며 제2 용량은 약 300 mg, 약 450 또는 약 600 mg이다. 대안적으로, 용량은 300 mg 내지 600 mg이며 제2 용량은 300 mg, 450 또는 600 mg이다.

추가적으로, 제7 양태의 하나의 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는 이전의 제5 및 제6 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 로딩 투약은 제1 용량의 1회, 2회, 3회, 또는 4회 정맥내 투여(들)로 구성되고 유지 투약은 제2 용량의 매주 피하 주사로 구성된다.

추가적으로, 제7 양태의 또 다른 구현예에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는 이전의 제5 및 제6 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 제1 용량은 활성 성분 약 10 mg/kg이고 제2 용량은 약 300 mg, 약 450 mg, 또는 약 600 mg이다. 대안적으로, 제1 용량은 활성 성분 10 mg/kg이며 제2 용량은 300 mg, 450 또는 600 mg이다.

제8 양태에서, 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는 이전 양태 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 고형 장기 이식이 신장 이식, 간 이식, 심장 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 장 이식, 복합 조직 이식, 골수 이식 또는 동종이형 조혈 줄기 세포 이식이다.

본 개시의 제9 양태에 따르면 JCV 연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 이러한 장애를 방지하는 방법이 제공된다.

본 개시의 제10 양태는 대상체에 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 고형 장기의 이식을 필요로 하는 JCV 혈청음성 환자에 고형 장기를 이식하는 방법에 관한 것이다.

제11 양태에서 본 개시는 대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 JCV 감염을 제어하는 방법에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 개시의 임의의 상술된 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 대상체에 CD40 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 JCV 연관 장애가 발생할 가능성을 감소시키는 방법이다.

또 다른 구현예에서, 임의의 상술된 구현예 9, 10 또는 11에 따른 방법은 JCV 연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는 방법이다.

하나의 구현예에서 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 대상체가 JCV 양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV-나이브 혈청음성 이식 환자인 방법이다.

추가 구현예에서 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 환자가 소아 환자인 방법이다. 또 다른 구현예에서 소아 환자는 간 이식 환자이다.

또 다른 구현예에서, 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 JCV 연관 질환이 발생할 위험이 있는 대상체가 면역억제되는 방법이다.

하나의 구현예에서 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태의 임의의 상술된 구현예에 따른 방법은 JCV 연관 장애가 진행 다초점 백색질뇌병증(PML)인 방법이다.

이의 모든 상술된 구현예가 포함되는 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태의 추가 구현예에서, 방법은 PML이 발생할 가능성을 감소시킨다.

추가 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 JCV 혈청양성 공여체로부터 JCV 혈청음성 수신체로의 고형 장기의 이식을 포함한다.

또 다른 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 JCV 연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는 방법이다.

하나의 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 대상체가 JCV 양성 공여체로부터 장기를 제공받는 JCV-나이브 혈청음성 이식 환자인 방법이다.

추가 구현예에서 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 환자가 소아 환자인 방법이다. 또 다른 구현예에서 소아 환자는 간 이식 환자이다.

또 다른 구현예에서, 이의 모든 상술된 구현예가 포함되는, 본 개시의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 대상체가 면역억제되는 방법이다.

본 개시의 제12 양태에서 이의 모든 구현예가 포함되는, 임의의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따른 방법은 CD40 길항제가 상기 본원에서 기재되는 항체인 방법이다.

또 다른 구현예에서, 제12 양태에 따른 항체는 상기 제4 양태에 기재된 항체의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 이의 모든 구현예가 포함되는 제9, 제10 또는 제11 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용되는 항체는 CFZ533이다.

본 개시의 제13 양태에서, 이의 모든 구현예가 포함되는, 제9, 제10 또는 제11 양태 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 치료 유효량의 CD40 항체, 예를 들어, CFZ533 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 개시의 제13 양태의 하나의 구현예에서, CD40 항체, 예를 들어 CFZ533을 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 이의 모든 구현예가 포함되는, 제5 양태에서 상술된 바와 같은 피하 또는 정맥내 또는 피하 또는 정맥내의 조합이다.

본 개시의 제14 양태는 JCV-연관 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 이러한 장애를 방지하는 약제의 제조를 위한, 항-CD40 항체를 포함하는 액체 약학 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 항-CD40 항체는 상술된 본 발명의 제6 양태에 기재된 항체이다.

제15 양태에서 본 개시는 이의 모든 구현예가 포함되는, 임의의 양태 9 내지 14에 따라 사용하기 위한 항-CD40 항체, 예를 들어 CFZ533에 관한 것이며, 여기서 항-CD40 항체 치료는 이식-후 일어나고 항체는 항체의 혈장 또는 혈청 농도가 적어도 40 μg/mL이도록 투여된다.

도 1 대표적 유세포 측정 분석
유세포 측정에 의한 CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포에 대한 관문화 전략. 세포를 CD3 및 CD19 항체로 염색하고, 유세포 측정으로 분석하였다. 첫 번째로, 모든 획득 세포를 전방 산란도(FCS)/측방 산란도(SSC)에서 점 그래프로 도시한 후 CD3+ T 세포 또는 CD19+ B 세포 상에서 추가 관문화하였다(보라색 원). 한 명의 대표 공여체로부터의 상이한 조건을 나타낸다((첫 번째 열: PBMC+배지-EBV(왼쪽 그래프), PBMC+배지+EBV(오른쪽 그래프); 두 번째 열: PBMC+0.1 μM CsA+EBV(왼쪽 그래프), PBMC+50 μg/mL 벨라타셉트+EBV(오른쪽 그래프); 세 번째 열: PBMC+50 μg/mL hIgG1+EBV(왼쪽 그래프), PBMC+50 μg/mL CFZ533+EBV(오른쪽 그래프)).
도 2 4명의 상이한 공여체로부터의 CD3+ T 세포수: 유세포 측정에 의해 측정된 배양 14일 후 PBMC 회귀 검정으로부터의 CD3⁺ T 세포수. 항체(μg/mL 단위) 및 CsA(μM 단위)는 EBV 상청액과의 조합으로 주어진다(음성 대조군 = EBV가 없는 배지인 경우 제외). 점선은 조건 '배지+EBV'로 설정하였다. 데이터를 평균 ± SEM(n=4)으로 나타낸다.
도 3 4명의 상이한 공여체로부터의 CD19⁺ B 세포수: 유세포 측정에 의해 측정된 배양 14일 후 PBMC 회귀 검정으로부터의 CD19⁺ B 세포수. 항체(μg/mL 단위) 및 CsA(μM 단위)는 EBV 상청액과의 조합으로 주어진다(음성 대조군 = EBV가 없는 배지인 경우 제외). 점선은 조건 '배지+EBV'로 설정하였다. 데이터를 평균 ± SEM(n=4)으로 나타낸다.
도 4는 연구 시작 전의 예비 시뮬레이션된 약동학 프로필을 보여주는 그래프이다.
도 5는 유세포 측정에 의한 T 세포 증식에 대한 관문화 전략을 나타낸다. 세포를 생활성 마커가 포함되는 CD3, CD4 및 CD8에 대해 염색하고 T 세포 증식에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 첫 번째 열(왼쪽으로부터 오른쪽으로): 모든 획득 세포를 FCS/SSC 점 그래프로 나타내고 히스토그램 그래프에서 총 생활성 세포(생활성 마커) 상에서 관문화한다. 살아있는 세포로부터, CD3⁺ T 세포를 선택하고 T 세포 증식을 Cell Tracer Violet-양성 세포 상 관문화에 의해 확인하였다. 두 번째 열: 총 생활성 세포로부터, CD4⁺및 CD8⁺ T 세포를 확인하기 위해 사분역을 배치하고, Cell Tracer Violet 표지화에 대해 분석하였다.
도 6은 시험관내 EBV-B 세포/T 세포 공동-배양 모델을 개략한다. 공동-배양 모델은 2개 상으로 구성된다: '프라이밍' 상(7일 배양) 및 '회상' 상(추가 4일 배양). EBV-B 세포 또는 일차 B 세포를 자가 T 세포와 함께 사용하고, 4개의 상이한 농도(10, 50, 100 및 200 μg/mL 또는 배지)로 IgG1 이소형, 항-CD40(CFZ533) 또는 항-CTL-A4 항체(벨라타셉트)와 인큐베이션하였다. 배지 또는 항체를 '프라이밍' 상, '회상' 상 또는 두 상 모두('프라이밍 및 회상')에서 첨가하였다. 11일 공동-배양 후, 세포를 T 세포 증식에 대해 유세포 측정에 의해 및 IFNγ 생산에 대해 ELISA에 의해 분석하였다.
도 7은 유세포 측정에 의해 측정되는 11일 배양 후 EBV-혈청양성 EBV B-세포 및 자가 T 세포를 사용하여 공동-배양의 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 CD3+ T 세포 증식 데이터를 제공한다. 항체(μg/mL)를 '프라이밍' 상(왼쪽), '회상' 상(중간 부분) 또는 '프라이밍 및 회상' 상(왼쪽)에 제공하였다. 점선을 1로 설정하였다(음성 대조군; 0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 10)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 8은 유세포 측정에 의해 측정되는 11일 배양 후 EBV-혈청양성 EBV B-세포 및 자가 T 세포를 사용하여 공동-배양의 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 CD4+ T 세포 증식 데이터를 제공한다. 항체(μg/mL)를 '프라이밍' 상(왼쪽), '회상' 상(중간 부분) 또는 '프라이밍 및 회상' 상(왼쪽)에 제공하였다. 점선을 1로 설정하였다(음성 대조군; 0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 10)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 9는 유세포 측정에 의해 측정되는 11일 배양 후 EBV-혈청양성 EBV B-세포 및 자가 T 세포를 사용하여 공동-배양의 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 CD8+ T 세포 증식 데이터를 제공한다. 항체(μg/mL)를 '프라이밍' 상(왼쪽), '회상' 상(중간 부분) 또는 '프라이밍 및 회상' 상(왼쪽)에 제공하였다. 점선을 1로 설정하였다(음성 대조군; 0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 10)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 10은 유세포 측정에 의해 측정되는 11일 배양 후 EBV-혈청음성 EBV B-세포 및 자가 T 세포를 사용하여 공동-배양의 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 CD3+ T 세포 증식 데이터를 제공한다. 항체(μg/mL)를 '프라이밍' 상(왼쪽), '회상' 상(중간 부분) 또는 '프라이밍 및 회상' 상(왼쪽)에 제공하였다. 점선을 1로 설정하였다(음성 대조군; 0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 7)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 11은 EBV-혈청음성 공여체의 세포로부터 제조된 배양물에서의 CD4+ T 세포 증식 데이터를 제공한다. CD8+ T 세포 증식을 분석하면(도 12), 벨라타셉트는 '회상' 단독 및 '프라이밍 및 회상' 조건에서 10 및 50 μg/mL로 감소 효과만을 가진 반면 100 및 200 μg/mL은 비히클 대조군(0 μg/mL)과 같았다. 흥미롭게도, 벨라타셉트가 '프라이밍' 상에 첨가된 경우에만, 벨라타셉트는 100 및 200 μg/mL의 용량으로 CD8+ T 세포 증식을 증가시켰다. CFZ533은 비히클 대조군(0 μg/mL)에 비해 CD4+ T 세포 증식에 대해 나타난 바와 같이 10 μg/mL('프라이밍' 단독 및 '프라이밍 및 회상' 조건) 및 50 μg/mL('회상' 단독 조건)에서의 유의미하지 않은 약간의 증가를 제외하고, CD8+ T 세포 증식에 대해 큰 효과를 갖지 않았다.
도 12는 EBV-혈청음성 공여체의 세포로부터 제조된 배양물에서의 CD8+ T 세포 증식 데이터를 제공한다. 유세포 측정에 의해 측정되는 11일 배양 후 EBV-혈청음성 EBV B-세포 및 자가 T 세포를 사용하여 공동-배양의 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 CD8+ T 세포 증식 데이터. 항체(μg/mL)를 '프라이밍' 상(왼쪽), '회상' 상(중간 부분) 또는 '프라이밍 및 회상' 상(왼쪽)에 제공하였다. 점선을 1로 설정하였다(음성 대조군; 0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 7)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 13은 EBV-혈청양성 공여체의 세포로부터 제조된 배양물에서의 IFNγ 사이토카인 수준을 제공한다. 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 11일 인큐베이션 후 EBV-혈청양성 EBV-B 세포/자가 T 세포 공동-배양 상청액의 IFNγ 사이토카인 수준. 항체를 '프라이밍' 상(왼쪽) 또는 '회상' 상(중간 부분) 또는 두 상 모두('프라이밍 및 회상'; 왼쪽)에 제공하였다. 항체 농도를 μg/mL로 사용하였다. 점선을 음성 대조군으로 설정하였다(0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 9)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 14는 EBV-혈청음성 공여체의 세포로부터 제조된 배양물에서의 IFNγ 사이토카인 수준을 제공한다. 상응하는 대조군에 대한 비로 표현되는 11일 인큐베이션 후 EBV-혈청음성 EBV-B 세포/자가 T 세포 공동-배양 상청액의 IFNγ 사이토카인 수준. 항체를 '프라이밍' 상(왼쪽) 또는 '회상' 상(중간 부분) 또는 두 상 모두('프라이밍 및 회상'; 왼쪽)에 제공하였다. 항체 농도를 μg/mL로 사용하였다. 점선을 음성 대조군으로 설정하였다(0 μg/mL). 데이터를 평균 + SEM(n=3 내지 6)으로 나타낸다. 각각의 칼럼 위의 수치는 시험된 개체의 총 수를 나타낸다.
도 15는 유세포 측정에 의해 측정된 배양 14일 후 PBMC 회귀 검정으로부터의 CD3+ T 세포수를 제공한다. 항체(μg/mL 단위) 및 CsA(μM 단위)는 EBV 상청액과의 조합으로 주어진다(음성 대조군 = EBV가 없는 배지인 경우 제외). 수평 점선은 조건 '배지+EBV'로 설정하였다. 데이터는 평균 + SEM(n=4)으로 나타낸다.
도 16은 유세포 측정에 의해 측정된 배양 14일 후 NK-세포 고갈 PBMC 회귀 검정으로부터의 CD3⁺ T 세포수를 제공한다. 항체(μg/mL 단위) 및 CsA(μM 단위)는 EBV 상청액과의 조합으로 주어진다(음성 대조군 = EBV가 없는 배지인 경우 제외). 수평 점선은 조건 '배지+EBV'로 설정하였다. 데이터는 평균 + SEM(n=4)으로 나타낸다.
도 17은 유세포 측정에 의해 측정된 배양 14일 후 PBMC 회귀 검정으로부터의 CD19⁺ B 세포수를 제공한다. 항체(μg/mL 단위) 및 CsA(μM 단위)는 EBV 상청액과의 조합으로 주어진다(음성 대조군 = EBV가 없는 배지인 경우 제외). 수평 점선은 조건 '배지+EBV'로 설정하였다. 데이터를 평균 + SEM(n=4); 및 유세포 측정에 의해 측정된 배양 14일 후 NK-세포 고갈 PBMC 회귀 검정으로부터의 CD19⁺ B 세포수로 나타낸다. 항체(μg/mL 단위) 및 CsA(μM 단위)는 EBV 상청액과의 조합으로 주어진다(음성 대조군 = EBV가 없는 배지인 경우 제외). 수평 점선은 조건 '배지+EBV'로 설정하였다. 데이터는 평균 + SEM(n=4)으로 나타낸다.

일반 정의

본원에서 사용된 바와 같이, CD40은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 5라고도 지칭되는 분화 클러스터 40(cluster of differentiation 40)을 지칭한다. 용어 CD40은 달리 기재되지 않는 한, 예를 들어, SEQ ID NO: 19에 정의된 바와 같은, 인간 CD40을 지칭한다.

수치값 x와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어 +/-10%를 의미한다. 수치 범위 또는 숫자 목록의 앞에 사용될 때, "약"이라는 용어는 시리즈의 각각의 숫자에 적용되고, 예를 들어 "약 1 내지 5"라는 어구는 "약 1 내지 약 5"로 해석되어야 하거나, 예를 들어 "약 1, 2, 3, 4"라는 어구는 "약 1, 약 2, 약 3, 약 4 등"으로 해석되어야 한다.

"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지는 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, "실질적으로"라는 단어는 본 개시의 정의로부터 생략될 수 있다.

"포함하는"이라는 용어는 "포함되는" 뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄하고, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나, 추가의 어떤 것을 포함하여, 예를 들어 X + Y가 될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항-CD40 항체" 등은 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) CD40과 상호작용하는 전체 항체를 지칭한다. 자연 발생 "항체"는 디설피드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전형적인 보체계의 첫 번째 구성요소(Clq)가 포함되는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 용어 "항체"에는 예를 들어, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타과 항체, 또는 키메라 항체가 포함된다. 항체는 임의의 이소형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스, 바람직하게는 IgG 및 가장 바람직하게는 IgG1일 수 있다. 예시적인 항체에는 표 1에 나타낸 바와 같은 CFZ533(본원에서 mAb1로도 표시됨) 및 mAb2가 포함된다.

경쇄와 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 점이 인정될 것이다. 역으로, 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3)은 분비, 태반통과 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 규칙에 따라, 불변 영역 도메인의 넘버링은 이들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단은 가변 영역이고 C-말단은 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다. 특히, 용어 "항체"에는 구체적으로 IgG-scFv 형태가 포함된다.

더욱이, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질쇄(단일쇄 Fv(scFv)로서 알려져 있음)로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 참고).

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 조제물을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체가 포함되는 것이다. "인간 항체"는 인간, 인간 조직 또는 인간 세포에 의해 생성될 필요는 없다. 본 개시의 인간 항체에는 인간 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 항체 유전자의 재조합 동안 생체내 접합부에서의 N-뉴클레오티드 부가에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)가 포함될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "Fc 영역"은 CH3, CH2 및 항체의 불변 도메인의 힌지 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 선택적으로, Fc 영역에는 일부 항체 클래스에 존재하는 CH4 도메인이 포함될 수 있다. Fc 영역은 항체의 불변 도메인의 전체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 결합 분자는 항체의 Fc 영역 및 CH1 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 결합 분자는 항체의 Fc 영역 CH3 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 결합 분자는 항체의 불변 도메인으로부터의 Fc 영역, CH1 영역, 및 C_{카파/람다}영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 결합 분자는 불변 영역, 예를 들어 중쇄 불변 영역을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포독성" 활성은 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 당업자에게 잘 알려진 ADCC 검정에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "침묵" 항체는 ADCC 검정으로 측정 시 ADCC 활성이 없거나 낮은 항체를 지칭한다.

하나의 구현예에서, 용어 "ADCC 활성이 없거나 낮은"은 침묵 항체가 표준 ADCC 검정으로 측정 시 50% 미만의 특이적 세포 용해, 예를 들어 10% 미만의 특이적 세포 용해의 ADCC 활성을 나타냄을 의미한다. ADCC 활성이 없음은 침묵 항체가 1% 미만의 ADCC 활성(특이적 세포 용해)을 나타냄을 의미한다.

침묵화된 효과기 기능은 항체의 Fc 영역의 돌연변이에 의해 얻을 수 있고, 당분야에 기재되어 있다: LALA 및 N297A(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); 및 D265A(Baudino et al., 2008, J. lmmunol. 181:6664-69; Strohl, W., 상기 참고). 침묵 Fc IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 LALA 돌연변이체를 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 아글리코실화/비글리코실화 항체를 생성하는 N297A 돌연변이를 포함한다.

본원에서 용어 "치료한다" 또는 "치료"는, 예를 들어, 대상체에 대한 본 발명에 따른 항-CD40 항체 또는 단백질, 예를 들어 mAb1 또는 mAb2 항체의 적용 또는 투여, 또는 대상체로부터 단리된 조직 또는 세포주에 대한 상기 항-CD40 항체를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여로 정의되며, 여기서 그 목적은 EBV 감염의 제어 또는 EBV 감염의 방지이다.

또한, "치료"는 대상체에 대한, 예를 들어 mAb1 또는 mAb2 항체를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여, 또는 대상체로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 대한 상기 항-CD40 항체를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여로 의도되며, 여기서 대상체는 EBV-연관 질환이 발생할 위험이 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 대상체는 이러한 대상체가 생물학적으로, 의학적으로 또는 삶의 질에 있어서 치료로부터 이익을 얻을 경우 이러한 치료를 "필요로 한다". 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유류, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본원에 기재된 장애를 가지고 있거나, 가질 위험이 있는 환자, 예컨대 이식 환자)일 수 있다.

본원에서 사용되는 대상 화합물의 "투여" 또는 "투여하는"이라는 용어는 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 CD40 길항제, 예를 들어 CFZ533의 제공을 의미한다. 하나 이상의 추가 치료제와 "조합된" 투여에는 임의의 순서, 및 임의의 투여 경로로의 동시(병행) 및 연속 투여가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 EBV 감염 제어 또는 EBV 감염 방지를 목적으로, 환자(예컨대, 인간)에게 단회 또는 다회 용량 투여 시 유효한 양의 CD40 길항제, 예를 들어 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, mAb1을 지칭한다.

단독으로 투여되는 개별 활성 성분(예를 들어, 항-CD40 항체, 예를 들어 mAb1)에 적용되는 경우, 이 용어는 그 성분만을 지칭한다. 조합에 적용되는 경우, 조합으로, 연속적으로, 또는 동시에 투여되는지에 관계없이, 이 용어는 치료 효과를 초래하는 활성 성분들을 조합한 양을 지칭한다.

어구 "치료 요법"은 병을 치료하는 데 또는 질환 병태 또는 질환의 발생을 방지하는 데 사용되는 요법, 예를 들어 EBV 로드 또는 EBV-연관 질환의 발생을 감소시키기 위해, EBV 감염의 방지 동안 사용되는 투약을 의미한다. 치료 요법에는 유도 요법, 로딩 요법 및 유지 요법이 포함될 수 있다.

어구 "로딩 요법" 또는 "로딩 기간"은 질환의 최초 치료에 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법, 용도, 키트, 공정, 및 요법(예를 들어, 고형 장기 이식의 이식편 손실을 방지하는 방법)은 로딩 요법을 사용한다. 일부 경우, 로딩 기간은 최대 효능에 도달할 때까지의 기간이다. 로딩 요법의 일반적인 목표는 치료 요법의 최초 기간 동안 환자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 (부분적으로 또는 전체적으로) "로딩 요법" 또는 "로딩 투약"을 사용할 수 있으며, 이는 의사가 유지 요법 동안 사용하는 것보다 더 많은 용량의 약물을 투여하는 것, 의사가 유지 요법 동안 약물을 투여하는 것보다 더 자주 약물을 투여하는 것, 또는 둘 다가 포함될 수 있다. 용량 증량은 유도 요법 동안 또는 후에 발생할 수 있다.

어구 "유지 요법" 또는 "유지 기간"은 유도 기간 후 병의 치료 동안 환자의 유지를 위해, 예를 들어 오랫동안(수 개월 또는 수 년) 환자를 관해 상태로 유지하기 위해 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법, 용도, 및 요법은 유지 요법을 사용한다. 유지 요법은 연속 치료법(예를 들어, 약물을 정기적인 간격으로, 예를 들어 매주, 매월[4주마다], 매년 등으로 투여하는 것) 또는 간헐적 치료법(예를 들어, 중단된 치료, 간헐적 치료, 재발시 치료, 또는 특정한 소정의 기준[예를 들어, 통증, 질환 발현 등] 달성시 치료)을 사용할 수 있다. 유지 요법 동안 용량 증량이 발생할 수 있다.

어구 "투여하기 위한 수단"은 사전 충전된 시린지, 바이알 및 시린지, 주사 펜, 자동주사기, i.v. 드립 및 백, 펌프, 패치 펌프 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 환자에게 약물을 전신 투여하기 위해 이용 가능한 임의의 도구를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 물품을 이용해, 환자가 약물을 자가 투여(즉, 스스로 약물을 투여)할 수 있거나, 의사가 약물을 투여할 수 있다.

발명의 상세한 설명

엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간 헤르페스바이러스 4(HHV4)이며 감마 헤르페스 바이러스 하위과 내의 림포크립토바이러스 속에 속한다. 이들 바이러스는 이의 숙주 세포에서 잠복 감염을 확립하며 잠복 감염된 세포의 증식을 유도한다(문헌[Roizman B. Herpesviridae: general description, taxonomy and classification. In: Roizman B, editor. The herpesviruses. London: Plenum Press, 1996:1_/23]에서 검토됨). EBV는 급성 및 만성 염증성 질환부터 림프 및 상피 악성종양에 이르는, 계속 늘고 있는 임상 장애 스펙트럼과 연관된다. 엡스타인-바 바이러스는 T-세포, B-세포 또는 자연 살해(NK) 세포와 같은 상이한 유형의 림프 세포가 엡스타인-바 바이러스로 감염되는 질환 유형인 림프증식성 질환과 연관된다. 감염된 세포는 과도하게 분열하며 다양한 림프증식성 장애(LPD, 비-암성, 전-암성, 및 암성)가 발생한다. 이들 LPD에는 감염성 단핵구증 및 이후 발생할 수 있는 후속 장애가 포함된다. 비-LPD이지만 EBV-연관된 질환에는 악성종양, 육종, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 코인두 암종, 위암종, 평활근육종 및 "이상한 나라의 앨리스 증후군"이 포함된다(Middeldorp et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 45(2003) 1-/36 2003).

본 발명은 CD40 길항제가 CsA 및 벨라타셉트와 대조적으로, 시험관내 EBV 제어를 손상시키지 않는다는 놀라운 발견에 기반한다. CD40 길항제는 현재 이식 장기 거부의 억제 및 자가면역 질환에 대한 치료법에 대해 임상 개발 중이다. 따라서, 면역억제성 CD40 길항제가 EBV 제어를 손상시키지 않는다는 놀라운 발견은 치료 방법, 예컨대 이식-후 림프증식성 질환(PTLD)과 같은 EBV-연관 질환의 발생 위험이 있는 환자에서의 장기 이식을 위한 방법의 개발을 위한 전제조건이자 기반이다. 따라서, 본 개시는 대상체, 특히 이러한 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 EBV-연관 장애를 방지하는 방법뿐만 아니라 EBV 로드를 제어하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "EBV 제어" 또는 "EBV 감염의 제어"은 본원에서 개시된 바와 같은 치료 유효 용량의 CD40 길항제(예를 들어, CFZ533)를 이용한 대상체의 치료, 특히 환자, 보다 구체적으로 면역-억제를 필요로 하는 환자, 더욱 더 구체적으로 장기 또는 조직 이식을 제공받는 환자의 치료 결과를 지칭하며, 여기서 EBV 제어는 하기 기준 중 어느 하나가 충족되는 경우 달성된다: (i) 환자에서 EBV 잠복성 0 상태(Ruf et al., Transplantation & Volume 97, Number 9, May 15, 2014), (ii) EBV 잠복성 I 상태 또는 (iii) 활성 EBV 감염의 혈청학적 증거의 부재(예를 들어, 특이적 항체를 사용하는 EBV 항체 또는 발현된 EBV 단백질의 검출 부재). 바람직한 구현예에서 상기 열거된 EBV 제어 기준 (i), (ii) 및/또는 (iii)/잠복성 상태는 이식이 일어난 후 적어도 6개월의 기간 동안, 또는 적어도 9개월의 기간 동안, 또는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 15개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 21개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 유지된다.

용어 "EBV 제어" 또는 "EBV 감염의 제어"는 또한 상술된 치료의 결과를 지칭하며, 여기서 치료받은 대상체의 전혈 중 EBV 로드는 EBV 게놈 5000카피/μg DNA 미만, 또는 4500카피/μg DNA 미만, 또는 4000카피/μg DNA 미만, 또는 3500카피/μg DNA 미만, 또는 3000카피/μg DNA 미만, 또는 2500카피/μg DNA 미만, 또는 2000카피/μg DNA 미만, 또는 1500카피/μg DNA 미만, 또는 1000카피/μg DNA 미만이다. 바람직한 구현예에서 전혈 중 상술된 EBV 로드는 이식이 일어난 후 적어도 6개월의 기간 동안, 또는 적어도 9개월의 기간 동안, 또는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 15개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 21개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 유지된다.

용어 "EBV 제어" 또는 "EBV 감염의 제어"는 또한 상술된 치료의 결과를 지칭하며, 여기서 혈장 중 EBV 로드는 3000카피/100 μl 미만, 또는 2500카피/100 μl 미만, 또는 2000카피/100 μl 미만, 또는 1500카피/100 μl 미만, 또는 1000카피/100 μl 미만이다. 바람직한 구현예에서 혈장 중 상술된 EBV 로드는 이식이 일어난 후 적어도 6개월의 기간 동안, 또는 적어도 9개월의 기간 동안, 또는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 15개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 21개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 유지된다.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "EBV 제어" 또는 "EBV 감염의 제어"는 본원에서 개시된 바와 같은 치료 유효 용량의 CD40 길항제(예를 들어, CFZ533)를 이용한 대상체, 특히 환자인 대상체, 보다 구체적으로 면역-억제를 필요로 하는 환자, 더욱 더 구체적으로 장기 또는 조직 이식을 제공받는 환자의 치료 결과를 지칭하며, 여기서 결과는 면역-억제를 필요로 하는 환자, 보다 구체적으로 장기 또는 조직 이식을 제공받았으나 본원에서 개시된 방법에 따라 치료받지 않은 환자에 비해 감소된 EBV 역가 또는 EBV 로드 또는 EBV 감염 상태이며, EBV 로드(예를 들어, EBV DNA 로드)는 적어도 20%만큼, 적어도 30%만큼, 적어도 40%만큼, 적어도 50%만큼, 적어도 60%만큼, 적어도 70%만큼, 적어도 80%만큼, 적어도 90% 또는 90% 초과만큼 감소된다. 바람직한 구현예에서, 감소된 EBV 로드는 이식이 일어난 후 적어도 6개월의 기간 동안, 또는 적어도 9개월의 기간 동안, 또는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 15개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 21개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 유지된다.

용어 "방지한다" 또는 "방지하는"은 일반적으로 예방적 또는 방지적 치료를 지칭하며; 이는 질환, 장애, 및/또는 이와 연관된 증상의 발병을 지연하는 것 또는 방지하는 것과 관련된다. 본원에서 사용되는 용어 "EBV-연관 질환을 방지하는"은 본원에서 개시된 바와 같은 치료 유효 용량의 CD40 길항제(예를 들어, CFZ533)를 이용하는 대상체, 특히 환자인 대상체, 보다 구체적으로 면역-억제를 필요로 하는 환자, 더욱 더 구체적으로 장기 또는 조직 이식을 제공받는 환자의 치료 결과를 지칭하며, 여기서 환자에서는 EBV-연관 질환이 발생하지 않고, 특히 환자에서는 림프증식성 장애(LPD, 감염성 단핵구증 및 이후 발생할 수 있는 후속 장애가 포함되는 비-암성, 전-암성, 및 암성), 또는 악성종양, 육종, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 이식-후 림프증식성 질환 및 "이상한 나라의 앨리스 증후군"이 포함되는 비-LPD이지만 EBV-연관 질환이 발생하지 않는다. 용어 "EBV-연관 질환을 방지하는"은 또한 상술된 바와 같은 대상체의 치료 결과를 지칭하며, 여기서 장기 또는 조직 이식 후 환자에서는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 본원에서 기재된 바와 같은 EBV-연관 질환이 발생하지 않는다. 용어 "EBV-연관 질환을 방지하는"은 또한 장기 이식 후 환자에서 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 이식-후 림프증식성 질환이 발생하지 않는 상황을 지칭한다.

EBV-연관 질환의 방지 효과는 EBV-연관 질환을 진단하고 모니터링하기 위한 최신 검정 및 기술을 사용하여 의사 및 당업자에 의해 수행되는 표준 일상 건강 확인에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 상술된 목적을 위해 적용될 수 있는 각각의 최신 진단 기술을 알고 있다. EBV 바이러스 로드 측정은 PTLD의 위험이 높은 이식 수신체의 모니터링을 위한 일상적 시험이 되었다. PTLD 환자는 거의 항상 전혈 및 혈장 중 고수준의 EBV DNA을 갖는다(Gulley M.L., Tans W., CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2010, p. 350-366; Wagner, H. J et al., 2001. Patients at risk for development of posttransplant lymphoproliferative disorder: plasma versus peripheral blood mononuclear cells as material for quantification of Epstein-Barr viral load by using real-time quantitative polymerase chain reaction. Transplantation 72:1012-1019). 실제로, 고순환 EBV 수준은 치료 동안 모니터링될 수 있는 종양 부담의 척도로서 작용한다(Green, M. 2001. Management of Epstein-Barr virus-induced post-transplant lymphoproliferative disease in recipients of solid organ transplantation. Am. J. Transplant. 1:103-108; Tsai, D. E. et al., 2008. EBV PCR in the diagnosis and monitoring of posttransplant lymphoproliferative disorder: results of a two-arm prospective trial. Am. J. Transplant. 8:1016-1024). 징후 및 증상의 발병 전이라도, 높은 EBV 수준은 임박한 PTLD의 전조의 역할을 하여, 병을 방지하고 질환 진행을 중지시키기 위한 선제적 개입을 허용한다.

EBV-역가, -로드 또는 -감염 상태는, 예를 들어, EBV DNA 로드를 측정함으로써 분석될 수 있으며, 여기서 EBV DNA 정량은 전혈, 혈장 및/또는 B-세포에서 분석될 수 있다(Ruf et. al., Transplantation & Volume 97, Number 9, May 15, 2014). 당업자는 환자에서 EBV 로드 및 감염 상태를 분석하기 위한 기술을 알고 있다. EBV DNA 로드는 EBV 유전자 LMP2, LMP1, EBNA2 및/또는 BZLF1의 발현을 분석함으로써 평가될 수 있다. 가장 강력한 연관성이 B 세포 또는 전혈에서의 바이러스 로드 및 LMP2 간에 관찰되었므로, LMP2의 발현 분석이 바람직하다(Ruf et. al., Transplantation & Volume 97, Number 9, May 15, 2014).

최근 20년 동안, 몇몇 연구는 이식 환자에서 EBV 유전자 발현을 분석하였다(Qu L, Rowe DT. Epstein-Barr virus latent gene expression in uncultured peripheral blood lymphocytes. J Virol 1992; 66: 3715.9; Qu L, Green M, Webber S, et al. Epstein-Barr virus gene expression in the peripheral blood of transplant recipients with persistent circulating virus loads. J Infect Dis 2000; 182: 1013.; Gotoh K, Ito Y, Ohta R, et al. Immunologic and virologic analyses in pediatric liver transplant recipients with chronic high Epstein-Barr virus loads. J Infect Dis 2010; 202: 461.; Kasztelewicz B, Jankowska I, Pawlowska J, et al. Epstein-Barr virus gene expression and latent membrane protein 1 gene polymorphism in pediatric liver transplant recipients. J Med Virol 2011; 83: 2182.).

하나의 구현예에서 본 개시는 대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제(예를 들어, CFZ533과 같은 CD40 항체)를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 이식-후 림프증식성 질환을 방지하는 방법에 관한 것이며, 여기서 대상체는 장기 이식을 제공받았고, 상기 환자에서는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년의 이상의 기간 동안 이식-후 림프증식성 질환이 발생하지 않는다.

또 다른 구현예에서 본 개시는 대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제(예를 들어, CFZ533과 같은 CD40 항체)를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 이식-후 림프증식성 질환을 방지하는 방법에 관한 것이며, 여기서 대상체는 신장 이식, 간 이식, 심장 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 장 이식, 골수 이식 또는 동종이형 조혈 줄기 세포 이식을 제공받았고, 상기 환자에서는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 이식-후 림프증식성 질환이 발생하지 않는다.

본 개시는 추가로 대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 EBV-연관 장애가 발생할 가능성을 감소시키는 방법에 관한 것이다. EBV-연관 장애의 발생 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "가능성을 감소시키는"은 본원에서 개시된 바와 같은 치료 유효 용량의 CD40 길항제(예를 들어, CFZ533과 같은 CD40 항체)를 이용하는 대상체, 특히 환자인 대상체, 보다 구체적으로 면역-억제를 필요로 하는 환자, 더욱 더 구체적으로 장기 또는 조직 이식을 제공받는 환자의 치료 결과를 지칭하며, 여기서 환자는 EBV-연관 장애가 발생할 위험이 감소되고, 위험 감소는 면역-억제를 필요로 하는 환자, 보다 구체적으로 장기 또는 조직 이식을 제공받았으나 본원에서 개시된 방법에 따라 치료받지 않은 환자에 비해 감소된 EBV 역가 또는 EBV 로드 또는 EBV 감염 상태를 특징으로 하며, EBV 역가 또는 EBV 로드 또는 EBV 감염 상태(예를 들어, EBV 역가 또는 EBV 로드 또는 EBV 감염 상태 EBV DNA 로드에 기반함)는 적어도 20%만큼, 적어도 30%만큼, 적어도 40%만큼, 적어도 50%만큼, 적어도 60%만큼, 적어도 70%만큼, 적어도 80%만큼, 적어도 90% 또는 90% 초과만큼 감소된다. 바람직한 구현예에서, 상술된 감소된 EBV 로드는 이식이 일어난 후 적어도 6개월의 기간 동안, 또는 적어도 9개월의 기간 동안, 또는 적어도 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 15개월의 기간 동안, 또는 적어도 18개월의 기간 동안, 또는 적어도 21개월의 기간 동안, 또는 적어도 24개월의 기간 동안, 또는 적어도 3년의 기간 동안, 또는 적어도 4년의 기간 동안, 또는 적어도 5년의 기간 동안, 또는 적어도 6년의 기간 동안, 또는 적어도 7년의 기간 동안, 또는 적어도 8년 이상의 기간 동안 유지된다.

EBV-연관 장애가 발생할 위험 감소를 평가하기 위해 본원에서 개시된 방법에 따라 치료받고 있는 환자와 동일한 치료를 제공받고 있지 않은 환자를 비교하기 위해, 당업자는 본원에서 개시된 방법에 따른 치료 결과를 EBV-연관 장애가 발생하는 이식 환자 상에서 이용 가능한 임상적 통계와 비교하는 데 어려움을 겪지 않을 것이다. 상기 임상적 통계는 더 큰 집단에서, 이식-후 림프증식성 질환의 방지와 같은 개별 EBV-연관 질환의 발생을 개략한다. 상기 질환의 평균 발생 및 경시적 발병을 본원에서 개시된 치료 방법의 결과와 비교할 수 있다.

상술된 방법은 특히 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는 대상체와 관련된다. 바람직한 구현예에서 장기 또는 조직 이식은 고형 장기의 이식이다. 하나의 구현예에서 고형 장기는 신장이다. 또 다른 구현예에서 고형 장기는 간이다. 추가 구현예에서 고형 장기는 심장, 폐, 췌장 또는 장이다. 바람직한 조직 이식은 복합 조직 이식이다.

EBV 혈청양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 혈청음성인 신장 이식 환자는 고위험 환자로 간주되며 국제 결과 가이드라인(Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Transplant Work Group. KDIGO clinical practice guideline for the care of kidney transplant recipients. Am J Transplant. 2009;9(Suppl 3):S1-S155)은 EBV 바이러스 로드가 증가하는 EBV-혈청음성 환자에서 면역억제성 약제의 감소를 권장한다. 따라서, 본원에서 개시된 방법은 특히 EBV-나이브인 환자와 관련되며 여기서 고형 장기 공여체는 EBV 혈청양성이다. EBV 음성, EBV 나이브 및 EBV 혈청음성과 같은 용어들은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

"면역억제" 또는 "면역억제된"은 면역계의 의도적으로 유도된 감소를 지칭한다. 면역억제는 이식 환자에서 장기 거부 반응을 감소시키기 위해 수행된다. 면역억제제는 면역-매개 질환 및 이식의 치료에서 널리 사용된다. 당업자는 이용 가능한 방법 및 기술을 잘 인지하고 있다(Wiseman A., Clin J Am Soc Nephrol 11: 332-343.Feb, 2016). 의도되지 않은 결과는 이식 환자에서 EBV 감염의 억제 실패로 EBV-연관 질환의 발생을 야기한다. 따라서, 본원에서 개시된 방법은 특히 면역억제제를 제공받는 환자와 관련되며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다.

PTLD의 발생률은 신장을 이식 받은 성인에서는 1%이고 더 높은 EBV-혈청음성 상태가 관찰된 소아 환자에서는 더 높다(각각 49% 대 8%(Srivastava T, Zwick DL, Rothberg PG, Warady BA. Posttransplant lymphoproliferative disorder in pediatric renal transplantation. Pediatr Nephrol. 1999;13:748-54). 따라서, 본원에서 개시된 방법은 특히 소아 환자에 관한 것이다.

항-CD40 항체

CD40은 B세포 및 항원-제시 세포(APC), 예컨대 단핵구, 대식구, 및 수지상 세포(DC)에서 구성적으로 발현되는 막관통 당단백질이다. CD40은 혈소판에서도 발현되며, 특정 조건에서는 호산구 및 활성화된 실질 세포에서 발현될 수 있다. B세포에서의 CD40의 결찰은 클론 증식, 사이토카인 분비, 분화, 배 중심 형성, 기억 B세포의 발달, 친화성 성숙, 면역글로불린(Ig) 이소형 전환, 항체 생산, 및 항원 제시의 연장을 비롯한 중요한 효과기 기능 및 B세포 생존을 향상시키는 하류 신호전달을 야기한다. 항원 제시 세포(APC)의 CD154-매개 활성화는 또한 사이토카인 분비 및 CD4+ T 헬퍼세포 및 CD8+ T세포 교차 프라이밍 및 활성화의 조절에 관여되는 CD69, CD54, CD80, 및 CD86이 포함되는 표면 활성화 분자의 발현을 야기한다.

CD154는 막결합 형태와 가용성 형태의 두 가지 형태로 존재한다. 막결합 CD154는 활성화된 CD4+, CD8+, 및 T 림프구, 비만 세포, 단핵구, 호염기구, 호산구, 자연 살해(NK) 세포, 활성화된 혈소판에서 발현되는 막관통 당단백질로서, B세포에서 보고되었다. 이는 또한 혈관 내피 세포에서 낮은 수준으로 발현되고 국소 염증 동안 상향 조절될 수 있다. 가용성 CD154(sCD154)는 막결합 CD154의 단백질분해 후에 형성되고, 세포 활성화 후 림프구 및 혈소판으로부터 탈리된다. 일단 탈리되면, sCD154는 기능을 유지하고, CD40 수용체에 결합하는 능력을 유지한다.

생체내 CD40/CD154 상호작용의 중요한 역할은 CD40 또는 이의 리간드에서의 기능 손실 돌연변이로 인해 고면역글로불린 M(HIGM)을 앓고 있는 환자에 의해 가장 잘 설명된다. HIGM 환자는 T세포 의존적 항체 반응의 심각한 손상, B세포 기억의 부재, 및 거의 없거나 전혀 없는 순환 IgG, IgA, 또는 IgE를 나타낸다. CD40 신호전달에 돌연변이가 있는 환자에서 유사한 표현형 및 질환이 나타남이 기재되었다(van Kooten and Banchereau 2000).

본 개시의 하나의 구현예에서 본원에서 개시된 방법에서 사용되는 CD40 길항제(본원에서 개시되는, 이의 모든 구현예가 포함되는 상이한 양태에서 기재됨)는 CD40 항체이다. 특히 바람직한 구현예에서 CD40 항체는 침묵화된 ADCC 활성을 갖는 항체이다.

침묵화된 ADCC 활성을 갖는 항-CD40 mAb는, 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 특허 US8828396 및 US9221913에 개시되었다. 침묵화된 ADCC 활성을 갖는 항-CD40 mAb는 다른 항-CD40 항체에 비해 개선된 안전성 프로필을 가질 것으로 예측된다. CD40 항체는 고형 장기 이식의 이식편 거부의 방지, 및 특히 신장 이식 또는 간 이식에서 이식편 거부의 방지에 적합한 것으로 알려져 있다. 본원에서 개시된 항-CD40 항체는 고형 장기 이식의 이식편 거부의 방지, 및 특히 신장 이식, 간 이식, 심장 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 장 이식, 또는 복합 조직 이식의 이식편 거부의 방지에 적합하며 동시에 본원에서 개시된 방법에서 사용되기 적합하다.

본 발명자들의 구속력 없는 가설에 따르면, 특허 US8828396 및 US9221913에서 mAb1 및 mAb2로 표시된 두 개의 mAb가 본원에서 개시된 EBV-연관 장애를 방지하는 방법 또는 EBV 로드를 제어하는 방법에서 사용되기 적합하다. CFZ533으로도 지칭되는 항체 mAb1이 특히 바람직하다.

당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위해, mAb1 및 mAb2의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 아래에서 표 1에 제공한다.

본원에서 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 당분야에 알려진 또 다른 항-CD40 mAb는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8568725B2호에 기재된 바와 같은, Astellas Pharma/Kyowa Hakko Kirin Co의 ASKP1240이다.

당분야에 알려진 또 다른 항-CD40 mAb는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8591900호에 기재된 바와 같은, Boehringer Ingelheim의 BI655064이다.

당분야에 알려진 추가의 항-CD40 mAb는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8669352호에 기재된 바와 같은, Fast Forward Pharmaceuticals의 FFP104이다.

상기 언급된 항체들과 동일한 작용 방식의 항체, 소위 바이오시밀러도 본 개시에 포함된다는 것을, 당업자라면 이해할 것이다.

[표 1]

서열 표

하나의 구현예에서, 개시된 방법에서 사용하기 위해 제공되는 항-CD40 항체는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함한다.

하나의 구현예에서, 개시된 방법에서 사용하기 위해 제공되는 항-CD40 항체는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함한다.

하나의 구현예에서, 개시된 방법에서 사용하기 위해 제공되는 항-CD40 항체는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 13의 Fc 영역을 포함한다.

하나의 구현예에서, 개시된 방법에서 사용하기 위해 제공되는 항-CD40 항체는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 14의 Fc 영역을 포함한다.

하나의 구현예에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 상술된 항-CD40 항체는 침묵 Fc IgG1 영역을 포함한다.

바람직한 구현예에서, mAb1로 표시된 항-CD40 항체가 개시된 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 구체적으로, mAb1은 SEQ ID NO: 9의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; mAb2는 SEQ ID NO: 11의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

CFZ533/이스칼리맙은 CD40L(CD154)-유도 CD40 신호전달을 차단하며 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 매개할 수 없는, 완전 인간 모노클로날 Fc-침묵, 비-고갈 항-CD40 항체(IgG1/κ)이다. 현재, CFZ533/이스칼리맙은 이식 장기 거부의 억제 및 자가면역 질환에 대한 치료법에 대해 임상 개발 중이다.

추가 구현예에서 본 개시는 CsA(Neoral®, Novartis)와 조합된 mAb1/CFZ533 또는 mAb2를 사용하여 EBV-연관 장애를 방지하는 방법 또는 EBV 로드를 제어하는 방법을 제공한다.

또 다른 추가 구현예에서 본 개시는 타크롤리무스(Tac, FK506, Prograf®, Astellas)와 조합된 mAb1/CFZ533 또는 mAb2를 사용하여 EBV-연관 장애를 방지하는 방법 또는 EBV 로드를 제어하는 방법을 제공한다.

추가 구현예에서 본 개시는 mTor 억제제, 예컨대 에베롤리무스(Zortress®, Certican®, Novartis)와 조합된 mAb1/CFZ533 또는 mAb2를 사용하여 EBV-연관 장애를 방지하는 방법 또는 EBV 로드를 제어하는 방법을 제공한다.

1. 발현 시스템

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기법에 의해 숙주 세포 내로 전달감염된다. 용어 "전달감염"의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 광범위한 기법, 예컨대 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 전달감염 등을 포괄하는 것이다. 이론적으로는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 방법에서 사용되는 항체를 발현하는 것이 가능하다. 진핵 세포, 특히 포유류 세포가 원핵 세포보다 더 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 수 있기 때문에 이러한 진핵 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균에서 항체의 발현이 논의된다.

특히 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결되는, 하기 암호화 서열 (a) 내지 (b) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:

(a) 각각 mAb1의 전장 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16; 또는

(b) 각각 mAb2의 전장 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18.

본 발명의 방법에서 사용되는 재조합 항체를 발현하기 위한 포유류 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어 문헌[R.J. Kaufman and P.A. (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은, DH FR 선별 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 PCT 공보 WO 87/04462, WO 89/01036, 및 EP0338841에 나타낸 GS 유전자 발현 시스템이다.

항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용해서 배양 배지로부터 회수될 수 있다(예를 들어, 문헌[Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37] 참조).

숙주 세포는 mAb1 또는 mAb2의 발현 및 생산에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다.

2. 약학 조성물

치료 항체는 투여를 위해 준비된 수성 형태로 또는 투여 전에 적합한 희석제로 재구성하기 위한 동결건조물로서 전형적으로 제형화된다. 항-CD40 항체는 동결건조물로서, 또는 예를 들어, 사전 충전된 시린지 내의 수성 조성물로서 제형화될 수 있다.

적합한 제형은 수성 약학 조성물 또는 환자에게 전달하기 위해 고농도의 항체 활성 성분 및 낮은 수준의 항체 응집물을 갖는 용액을 제공하도록 재구성될 수 있는 동결건조물을 제공할 수 있다. 고농도의 항체는 환자에게 전달되어야 하는 물질의 양을 감소시킬 수 있으므로 유용하다. 감소된 투약 부피는 고정된 용량을 환자에게 전달하는 데 소요되는 시간을 최소화한다. 고농도의 항-CD40 항체를 갖는 수성 조성물은 피하 투여에 특히 적합하다.

항-CD40 항체는 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합될 때 약학 조성물로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 항-CD40 항체, 예컨대 mAb1 또는 mAb2 이외에, 담체, 다양한 희석제, 충전제, 염, 완충액, 안정화제, 가용화제, 및 당분야에 잘 알려진 기타 물질을 함유할 수 있다. 담체의 특징은 투여 경로에 좌우될 것이다. 개시된 방법에 사용하기 위한 약학 조성물은 특정 표적 장애의 치료를 위한 추가적인 치료제도 함유할 수 있다.

하나의 특정 구현예에서 본원에서 개시된 방법에서 사용되는 조성물은 하기를 포함하는 pH가 6.0인 수성 제형으로부터 제조되는 동결건조 제형이다:

(i) 150 mg/mL의 mAb1 또는 mAb2,

(ii) 안정화제로서 270 mM의 수크로스,

(iii) 완충제로서 30 mM의 L-히스티딘, 및

(iv) 계면활성제로서 0.06%의 폴리소르베이트 20.

또 다른 특정 구현예에서 본원에서 개시된 방법에서 사용되는 약학 조성물은 pH가 6.0이며 하기를 포함하는 수성 약학 조성물이다:

(i) 150 mg/mL의 mAb1 또는 mAb2,

(ii) 안정화제로서 270 mM의 수크로스,

(iii) 완충제로서 30 mM의 L-히스티딘, 및

(iv) 계면활성제로서 0.06%의 폴리소르베이트 20.

또 다른 특정 구현예에서 본원에서 개시된 방법에서 사용되는 조성물은 하기를 포함하는 동결건조 또는 액체 제형이다:

(i) mAb1 또는 mAb2,

(ii) 안정화제로서 수크로스,

(iii) 완충제로서 L-히스티딘, 및

(iv) 계면활성제로서 폴리소르베이트 20, 그리고 칼시뉴린 억제제(CNI), 예컨대 사이클로스포린(예: CsA, Neoral®, Novartis) 또는 타크롤리무스(예: Tac, FK506, Prograf®, Astellas), 림프구 증식 억제제, 예컨대 미코페놀산(예: MPA; Myfortic®, Novartis) 또는 미코페놀레이트 모페틸(예: MMF; CellCept®, Roche) 또는 증식신호 억제제, 예컨대 에베롤리무스(예: Zortress®, Certican®, Novartis) 또는 시롤리무스(예: Rapamune®, Pfizer) 또는 T세포 공동자극 차단제, 예컨대 벨라타셉트(예: Nulojix®, BMS)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 활성 약학 성분.

3. 투여 경로

전형적으로, 항체 또는 단백질은 예를 들어 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 이러한 투여를 수행하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 국소 또는 경구 투여될 수 있거나 점막을 통해 전달될 수 있는 조성물을 수득할 수도 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 적합한 투여 수단이 특정의 선택된 투여 경로에 적절하게 사용될 수 있다.

가능한 투여 경로의 예에는 비경구(예를 들어, 정맥내(i.v. 또는 I.V. 또는 iv 또는 IV), 근육내(IM), 피내, 피하(s.c. 또는 S.C. 또는 sc 또는 SC), 또는 주입), 경구 및 폐(예를 들어, 흡입), 비강, 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 하기 구성성분이 포함될 수 있다: 살균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.

선택적으로, 항-CD40 치료법은 항-CD40 치료법을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 방법에서 사용되는 항체 또는 단백질의 "로딩 용량/요법"을 투여함으로써 개시될 수 있다. "로딩 용량/요법"은 대상체에게 투여되는 본 발명의 방법에서 사용되는 항-CD40 항체 또는 단백질의 최초 용량/요법을 의도하며, 투여되는 본 발명의 방법에서 사용되는 항체 또는 단백질의 용량은 더 높은 투약 범위 내(즉, 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 예컨대 약 30 mg/kg)에 속한다. "로딩 용량/요법"은 단회 투여, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IV 투여되는 단회 주입, 또는 전체 "로딩 용량/요법"이 약 24시간 내에(또는 질환의 중증도에 따라 여러 번 정맥내 투여가 필요한 경우 첫 달 내에) 투여되는 한, 다회 투여, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IV 투여되는 다회 주입으로 투여될 수 있다. "로딩 용량/요법"의 투여 후, 대상체는 이어서 항-CD40 항체의 하나 이상의 추가 치료 유효 용량을 투여받는다. 후속 치료 유효 용량은, 예를 들어 매주 투약 일정에 따라, 또는 2주 1회(격주), 3주 1회, 또는 4주 1회 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 후속 치료 유효 용량은 일반적으로, 더 낮은 투약 범위 내(즉, 약 0.003 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 예컨대 약 10 mg/kg, 예를 들어 10 mg/kg)에 속한다.

대안적으로, 일부 구현예에서, "로딩 용량/요법" 후, 항-CD40 항체의 후속 치료 유효 용량이 "유지 일정"에 따라 투여되며, 여기서 CD40 항체의 치료 유효 용량은 매주, 격주, 또는 월 1회, 6주 1회, 2개월 1회, 10주 1회, 3개월 1회, 14주 1회, 4개월 1회, 18주 1회, 5개월 1회, 22주 1회, 6개월 1회, 7개월 1회, 8개월 1회, 9개월 1회, 10개월 1회, 11개월 1회, 또는 12개월 1회 투여된다. 이러한 구현예에서, 항-CD40 항체의 치료 유효 용량은, 특히 후속 용량이 더 빈번한 간격으로, 예를 들어, 2주 1회 내지 월 1회 투여되는 경우 더 낮은 투약 범위 내(즉, 약 0.003 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 예컨대 약 10 mg/kg, 예를 들어 10 mg/kg) 또는 특히 후속 용량이 덜 빈번한 간격으로 투여되는 경우, 예를 들어, 후속 용량이 1개월 내지 12개월 간격으로 투여되는 경우, 더 높은 투약 범위 내(즉, 10 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예컨대 30 mg/kg)에 속한다.

일반적으로 투약 시기는 "기준선"으로도 알려져 있는, 활성 화합물(예를 들어, mAb1)의 첫 번째 투약일로부터 측정된다. 그러나, 의료인마다 상이한 명명 규칙을 사용한다.

특히, 0주차는 일부 의료인에 의해 1주차로 지칭될 수 있는 한편, 0일차는 일부 의료인에 의해 1일차로 지칭될 수 있다. 따라서, 동일한 투약 일정을 지칭하면서, 예를 들어 의사마다 용량을 3주차 중/21일차, 3주차 중/22일차, 4주차 중/21일차, 4주차 중/22일차에 제공하는 것으로 표시하는 것이 가능하다. 일관성을 위해, 본원에서는 투약의 첫째 주를 0주차로 지칭하고, 투약의 첫째 날을 1일차로 지칭할 것이다. 그러나 당업자는 이 명명 규칙이 단순히 일관성을 위해 사용되며, 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다, 즉, 의사가 특정 주를 "1주차" 또는 "2주차"라 지칭하는지에 관계없이 매주 투약은 항-CD40 항체, 예를 들어 mAb1의 매주 용량을 제공하는 것이다. 본원에서 언급된 투약량 요법의 예는 도 1 및 도 2에서 확인된다. 용량은 정확한 시점에 제공될 필요가 없으며, 예를 들어, 대략 29일차에 예정된 용량은 그것이 적절한 주에 제공되는 한, 예를 들어, 24일차 내지 34일차에, 예를 들어, 30일차에 제공될 수 있음이 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 어구 "[표시된 용량]의 전달을 허용하기에 충분한 양의 항-CD40 항체를 갖는 용기"는 주어진 용기(예를 들어, 바이알, 펜, 시린지)가 원하는 용량을 제공하는 데 사용될 수 있는 부피의 항-CD40 항체를(예를 들어, 약학 조성물의 일부로서) 그 안에 두었음을 의미하는 데 사용된다. 예로서, 요망되는 용량이 500 mg인 경우, 임상의는 250 mg/ml 농도의 항-CD40 항체 제형을 함유하는 용기로부터 2 ml, 500 mg/ml 농도의 항-CD40 항체 제형을 함유하는 용기로부터 1 ml, 1000 mg/ml 농도의 항-CD40 항체 제형을 함유하는 용기로부터 0.5 ml 등을 사용할 수 있다. 이러한 각각의 경우, 이들 용기는 요망되는 500 mg 용량의 전달을 허용하기에 충분한 양의 항-CD40 항체를 갖는다.

본원에서 사용된 어구 "[표시된 용량]의 [투여 경로] 전달을 허용하는 투약량으로 제형화된"은 주어진 약학 조성물이 표시된 투여 경로(예를 들어, SC 또는 IV)를 통해 요망되는 용량의 항-CD40 항체, 예를 들어 mAb1을 제공하는 데 사용될 수 있음을 의미하기 위해 사용된다. 예로서, 요망되는 피하 용량이 500 mg인 경우, 임상의는 250 mg/ml 농도의 항-CD40 항체 제형 2 ml, 500 mg/ml 농도의 항-CD40 항체 제형 1 ml, 1000 mg/ml 농도의 항-CD40 항체 제형 0.5 ml 등을 사용할 수 있다. 이러한 각각의 경우, 이들 항-CD40 항체 제형은 항-CD40 항체의 피하 전달을 허용하기에 충분히 높은 농도이다. 피하 전달은 전형적으로 약 1 mL 이상(예를 들어, 2 mL)의 부피의 전달을 필요로 한다. 그러나, 예를 들어 패치/펌프 기전을 이용해 더 많은 부피가 경시적으로 전달될 수 있다.

환자에서 EBV-연관 장애를 방지하거나 EBV 로드를 제어하는 약제의 제조를 위한 항-CD40 항체(예를 들어, mAb1)의 용도가 본원에 개시되며, 여기서 약제는 용기에 포함되도록 제형화되고, 각각의 용기는 단위 용량당 적어도 약 75 mg, 150 mg, 300 mg, 또는 600 mg의 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, mAb1)의 전달을 허용하기에 충분한 양의 항-CD40 항체를 갖는다.

EBV-연관 장애를 방지하거나 EBV 로드를 제어하는 약제의 제조를 위한 항-CD40 항체(예를 들어, mAb1)의 용도가 본원에 개시되며, 여기서 약제는 단위 용량당 75 mg, 150 mg, 300 mg, 또는 600 mg의 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, mAb1)의 전신 전달(예를 들어, IV 또는 SC 전달)을 허용하는 투약량으로 제형화된다.

하나의 특정 구현예에서, EBV-연관 장애를 방지하거나 EBV-로드를 제어하는 약제의 제조를 위한, a) 항-CD40 항체, 완충액, 안정화제, 및 가용화제를 포함하는 액체 약학 조성물, 및 b) 이식 환자에게 항-CD40 항체를 피하 투여하기 위한 수단의 용도가 제공되며, 여기서 항-CD40 항체는,

i) 인간 대상체 킬로그램당 활성 성분 약 3 내지 약 30 mg, 예컨대 10 mg의 용량으로 환자에게 3회(격주로 1회) 피하 투여되고;

ii) 이후 인간 대상체 킬로그램당 활성 성분 약 3 내지 약 30 mg, 예컨대 10 mg의 매월 용량으로 환자에게 피하 투여되고, 상기 항-CD40 항체는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:

a) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;

b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;

c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 13의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체;

d) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 14의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체;

e) 침묵 Fc IgG1 영역을 포함하는 항-CD40 항체; 및

f) SEQ ID NO: 9의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄 아미노산 서열; 또는 SEQ ID NO: 11의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-CD40 항체.

실시예 2. 약리학

1. 일차 약리학

mAb1은 높은 친화도(0.3 nM의 Kd)로 인간 CD40에 결합한다. 그러나, 이는 Fcγ 수용체(CD16 포함)에 결합하거나 항체 의존적 세포독성 또는 보체 의존적 세포독성을 매개하지 않는다. mAb1은 인간 백혈구의 재조합 CD154(rCD154) 유도 활성화를 억제하지만, 단핵구 유래 수지상 세포(DC)에 의한 PBMC 증식 또는 사이토카인 생산은 유도하지 않는다. mAb1은 인간 및 비인간 영장류 CD40에 매우 유사한 친화도로 결합한다.

생체 내에서, mAb1은 일차 및 이차 T 세포 의존적 항체 반응(TDAR)을 차단하고, 비 인간 영장류에서 신장 동종이식편의 생존을 연장할 수 있다(Cordoba et al 2015). 또한, mAb1은 생체 내에서 확립된 배 중심(GC)을 손상시킬 수 있다.

인간 전혈 배양을 사용하여 시험관 내에서 CD40 수용체 점유 및 기능적 활성을 동시에 평가하였다. CD20 양성 세포(B 세포)에서 CD69(활성화 마커)의 CD154 유도 발현을 통해 기능적 활성을 정량하고, 형광 표지된 mAb1을 사용하여 CD40 점유를 모니터링하였다. rCD154 유도 CD69 발현의 완전 억제를 위해 mAb1에 의한 거의 완전한 CD40 점유가 요구되었다.

2. 이차 약리학

혈소판 기능 및 혈액 지혈에 대한 mAb1의 효과를 조사하였는데, mAb1이 혈소판 응집 반응을 유도하지 않고 오히려 높은 농도에서 혈소판 응집에 대해 약간의 소정 억제 효과를 나타냄을 시사하였다.

실시예 3. 비임상 독성학 및 안전성 약리학

mAb1을 이용한 독성학 연구는, 항-CD154 mAb를 이용한 임상 시험에서 보고된 바와 같이 혈전색전 사례의 증거가 없었다는 점을 비롯하여, 임의의 유의미한 장기 독성을 나타내지 않았다(Kawai et al 2000). 13주의 GLP 붉은털 원숭이 연구(10, 50 및 150 mg/kg의 매주 투약)에서, mAb1의 약리학과 일치하는 관찰인 진행 중 감염으로 인한 것이라 생각되는 림프양 세포충실성 증가가 22마리의 동물 중 5마리에서 눈에 띄었다. 50 mg/kg의 2마리의 동물의 신장 및 폐에서 염증성 병변이 눈에 띄었고, 두 마리의 동물 중 한 마리에서 눈 및 기관의 병변도 관찰되었다. 신장 및 폐에 대한 mAb1의 직접적인 효과를 배제할 수는 없지만, 기회감염 병원체의 확인을 포함한 증거의 무게는 이러한 소견이 mAb1 매개 면역억제에 대해 이차적일 가능성이 있으며, 감염성 기원임을 제시한다. 이러한 염증 소견을 고려하여, 13주의 독성 연구를 위한 유해 효과 무관찰 수준(No Observed Adverse Effect Level, NOAEL)을 10 mg/kg으로 설정하였다. 사이노몰거스 원숭이에서의 26주 만성 독성 연구에서, 유해한 mAb1 관련 소견은 발견되지 않았다. 이러한 데이터에 기반하여, NOAEL을 150 mg/kg(26주)으로 설정하였다. 평균(모든 동물) Cmax,ss는 매주 1, 50, 및 150(NOAEL) mg/kg S.C.에서 각각 44, 3235, 및 9690 μg/mL이었다. 26주 사이노몰거스 원숭이 연구로부터 유래된 NOAEL은 임상 투약 요법을 뒷받침하는 데 가장 적절한 것으로 간주된다.

사후 조직학적 및 면역조직학적 평가는 비장 및 림프 조직의 피질 B세포 영역에서 GC의 감소를 나타냈다. 회복 동물은 정상 T세포 영역 및 증가된 B세포 영역과 함께 증가된 림프절 세포충실도의 일부 사례를 보여주었고, 이는 약물 중단 후 GC의 재구성과 일치한다. 회복 동물은 mAb1의 혈액 수준이 완전 수용체 점유에 필요한 수준 아래로 떨어진 직후에 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대해 일차 TDAR을 일으킬 수 있었다.

T 세포 의존적 항체 반응(TDAR)인 KLH의 완전한 억제로 인해, mAb1에 대한 항-약물 항체(ADA)의 형성이 예상되지 않으므로 mAb1의 농도가 계속해서 약리적 수준으로 유지될 때 ADA 관련 부작용은 거의 없을 것으로 여겨진다.

조직 교차반응성 연구는 CD40이 면역 세포뿐만 아니라 다양한 조직에도 존재함을 밝혔다. 이것은 CD40이 상처 치유 과정에 대한 반응, 바이러스 방어의 상향 조절 및 염증 관련 매개체와 같은 신호전달에 관여되는 내피 및 상피 세포에서의 발현에 주로 기인한다. mAb1과 같은 길항성 항-CD40 모노클로날 항체는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용한 시험관 내 연구에 의해 확인된 염증 과정에 기여할 것으로 예상되지 않는다.

실시예 4. 비임상 약동학 및 약력학

1. 약동학(PK)

IgG 면역글로불린에 전형적인, mAb1의 일차 제거 경로는 혈장과 평형을 이루는 부위에서 발생하는 단백분해 이화작용을 통한 것일 가능성이 높다. 또한, mAb1-CD40 복합체의 결합 및 내재화는 신속하고 포화 가능한 제거 경로를 초래하였다. 이는 약 10 내지 20 μg/mL에서 변곡점을 나타내는 비선형 mAb1 혈청 농도-시간 프로필에 의해 설명되었다. 전체 제거에 대한 CD40 매개 제거의 기여는 CD40 발현 수준, 내재화 및 수용체 전환율과 함께 mAb1 농도에 좌우된다. 10 내지 20 μg/mL를 초과하는 mAb1의 혈청 농도의 경우, 선형 동역학이 예상되는 반면, 더 낮은 농도에서는 비선형 동역학이 나타났다.

2. 약력학(PD)

사이노몰거스 원숭이의 PK/PD 연구에서, PK 프로필의 변곡점(약 10 μg/mL)은 독립적인 림프구 표적 포화 검정에서 결정된 바와 같이, CD40 포화의 감소와 연관되었다. 따라서, 이 변곡점은 CD40의 포화 수준에 대한 마커 및 표적 연루에 대한 증거로 여겨진다.

CD40 점유와 약력학적 활성 사이의 연관성은 KLH로 면역화한 붉은털 원숭이에서 추가로 실증되었다. 원숭이를 KLH로 3회 면역화하였다(첫 번째는 투약 약 3주 전, 두 번째는 mAb1 투여 2주 후, 세 번째는 mAb1의 완전 세척-제거 후였다). 제2 KLH 백신접종 시 40 μg/mL 초과의 혈장 농도에서 mAb1에 의한 CD40 점유는 회상 항체 반응을 완전히 방지하였다. mAb1이 제거되자, 모든 동물은 제3 KLH에 대해 완전 기억 항체 반응을 일으켰다. 이러한 결과는 기존의 기억 B세포의 기능이 영향을 받지 않았음을 제시한다. mAb1의 완전한 제거 후, 파상풍 변성독소(TTx)로의 면역화는 처리되지 않은 동물과 유사한 항-TTx-IgG/IgM 역가를 야기하였고, mAb1 제거 후 완전 TDAR이 재획득되었음을 실증하였다.

실시예 5. 인간 안전성 및 내약성 데이터

mAb1의 안전성, 내약성, PK 및 PD 활성을 건강한 대상체 및 류마티스 관절염(RA) 환자에서 진행 중인 mAb1의 무작위화, 이중 맹검, 위약 대조, 단회 상승 용량 연구에서 평가 중이다. 총 48명의 대상체가 등록하였다: 최대 3 mg/kg IV 또는 S.C.의 mAb1의 단회 용량을 제공받은 36명의 건강한 대상체, 및 12명의 RA 환자(이들 중 6명은 10 mg/kg IV로 mAb1의 단회 용량을 제공받음). 전체적으로, 건강한 지원자에서 최대 3 mg/kg mAb1의 단회 용량 및 RA 환자에서 단회 10 mg/kg의 mAb1은 안전하였고, 내약성이 우수하였으며, 의심되는 중증 유해 사례(SAE)는 발생하지 않았다. 30 mg/kg IV 용량의 조사가 RA 환자에서 진행 중이다. 이 연구는 여전히 진행 중이므로, 모든 임상 데이터는 사실상 예비적이며 RA 환자에서 최대 10 mg/kg의 용량으로 수행된 중간 분석에 기반한다.

실시예 6. 인간 약동학 및 약력학(건강한 지원자 및 류마티스 관절염 환자)

건강한 대상체뿐만 아니라 류마티스 관절염 환자에서, 단회 IV 또는 SC 투여 후, CFZ533 PK 프로필은 CD40 수용체 점유가 대략 90% 미만으로 떨어졌을 때 더 빠른 제거 및 비선형 PK 프로필을 생성하는 표적 매개 배치와 일치하였다.

중국인 대상체들의 PK 프로필의 일부 개체간 변동성에도 불구하고, 중국인 대상체에서 CFZ533의 배치는 일반적으로 비 중국인 대상체와 유사하였고, 표적 연루도 3 mg/kg IV의 CFZ533(약 4주) 후에 유사하였다. 이 용량 수준에서, 유사한 PK/PD 프로필은 혈장에서의 유리 CFZ533 프로필, 유리 CD40 및 총 CD40을 측정하는 말초 B 세포에서의 CD40 점유, 및 혈장에서의 총 sCD40 농도를 통해 실증되었다.

건강한 대상체에서 SC 투여 후, CFZ533은 인간에서 전형적인 IgG1 항체에 대해 예상되는 바와 같이 빠르게 흡수 및 분배되었다. 3 mg/kg SC에서, CFZ533은 일반적으로 용량 3일(2명의 대상체의 경우 7일) 후 정점에 도달하였으며, 투약 1주일 후에 혈장 농도는 IV 후에서와 동일한 범위에 있었다. 3 mg/kg SC에서, 또한 표적 연루의 지속기간은 약 4주였다.

평균 용량 전에 비해 전혈 B 세포 상의 유리 CD40 및 혈장에서의 총 sCD40 프로필에 의해 측정 시, 10 mg/kg IV의 류마티스 관절염 환자에서, 완전 CD40 점유가 일반적으로 8주 동안 유지되었다. 30 mg/kg IV에서, PK 및 혈장에서의 총 sCD40 프로필은 16주의 표적 연루의 지속기간과 일치한다.

건강한 대상체에서 CFZ533에 의한 CD40 연루는 일반적으로, B 세포 상의 유리 CD40에 의해 측정 시 B 세포에서의 CD40 점유를 추적하는 말초 B 세포 상의 총 CD40의 약 50%의 감소를 야기하였다. 이는 CFZ533에 결합할 때 막 결합 CD40의 내재화 및/또는 탈리(shedding) 때문일 가능성이 있다. 류마티스 관절염 환자에서 말초 B 세포 상의 총 CD40의 감소는 확인되지 않았다.

혈장 내 CFZ533과 전혈 B 세포 상의 CD40 점유(B 세포 상의 유리 CD40) 사이의 관계가 정의되었고, 0.3 내지 0.4 μg/mL의 CFZ533 농도는 전혈 B 세포 상의 완전(90% 이상으로 정의됨) CD40 점유와 연관되었다.

더욱 일반적으로, CFZ533에 대해 비 특이적 및 특이적 제거 경로가 확인되었다. FcRn 수용체에 의해 매개되는 비 특이적 및 고용량 경로는 일반적으로 내인성 IgG에 의해 공유된다. CFZ533의 특이적 표적 매개 배치는 부분적으로 내재화(이후의 리소좀 분해 수반)되고/되거나 막으로부터 탈리되는 CFZ533-CD40 복합체의 형성을 야기하였다. 표적 매개 공정은 CFZ533의 포화 가능한, 비선형 배치를 초래하였다. CFZ533-CD40 복합체의 형성은 용량/농도 의존적이었고, 고농도의 CFZ533에서 포화가 발생하였다.

종합하면, CFZ533의 배치는 CFZ533의 전반적 제거에 대한 특이적(표적 매개) 및 비 특이적 제거 경로의 상대적 기여에 좌우된다. CFZ533 농도가 표적의 농도보다 낮을 때 비선형 PK 거동이 관찰된 반면, CD40 수용체가 포화되는 더 높은 농도에서는, 비특이적 경로가 우세하며, CFZ533의 제거가 선형이었다.

막 결합 수용체를 표적으로 하고 표적 매개 배치를 나타내는 전형적인 IgG1 항체에 대해 예상한 바와 같이, CFZ533의 노출 정도(AUClast)는 용량 증가보다 더 증가하였다(비례성 초과). 결과적으로, 이는 더 고용량에서의 CFZ533의 분배 부피의 감소 및 제거와 연관될 것으로 예상된다.

3 mg/kg(IV 및 SC)의 CFZ533의 단회 용량은(약 3 내지 4주 동안의) 완전(90% 이상) 수용체 점유에 상응하는 CFZ533 농도에서, 제1 KLH 면역화에 대한 항-KLH 반응을 일시적으로 억제하였다. 항-KLH 일차 반응은 CFZ533 농도 및 수반되는 수용체 점유가 감소함에 따라 모든 대상체에서 검출되었다. 모든 대상체는 제2 KLH 면역화(수용체 점유의 손실이 예상된 후 투여됨)에 대해 회상 반응을 일으킬 수 있었다.

데이터는 CFZ533에 의한 CD40 연루가 인간 전혈에서 재조합 인간 CD154(rCD154) 매개 B 세포 활성화를 방지하였음을 제시한다. B 세포에서의 rCD154 유도 CD69 발현은 일반적으로 B 세포에서의 완전 CD40 점유에 상응하는 기간 동안 억제되었다. CD40 점유가 불완전하였을 때, rCD154의 기능적 활성이 회복되었다.

인간에서 확인된 안전성 및 내약성: 단회 상승 용량(0.03 내지 30 mg/kg)의 CFZ533 i.v. 및 3 mg/kg s.c.를 시험하는 제1상 연구(CCFZ533X2101)가 완료되었으며, 시험된 최고 용량(10 mg/kg i.v.)까지 큰 안전성 문제를 나타내지 않았다. 지금까지의 임상 경험에 기반하여, 10 mg/kg i.v. 투약 요법은 이식 환자에서 안전하고 내약성이 있을 것으로 예상된다.

전임상 독성학 연구로부터의 적절한 안전역: 현재까지의 GLP 독성학 연구는 (i) 붉은털 원숭이에서 10, 50 및 150 mg/kg(s.c. 및 i.v.)으로 13주 동안 매주 s.c. 투약, 및 (ii) 사이노몰거스 원숭이에서 1, 50 및 150 mg/kg으로 26주 동안 매주 s.c. 투약으로 CFZ533을 시험하였다. 이들 연구는 12주 또는 24주 동안 제안된 정맥내 요법에서 CFZ533의 사용을 막을 임의의 주요한 발견을 드러내지 않았다. 사이노몰거스 원숭이에서의 26주 독성 연구에서, 항정 상태에서, 150 mg/kg(NOAEL)의 매주 투약 후 8300 μg/mL(Cav,ss)의 평균 농도가 얻어졌다. 1개월의 기간에 걸친 상응하는 전신 노출(AUC, 항정 상태 조건)은 232400 일*μg/mL일 것이며, 이는 첫 달에 걸쳐 예측된 전신 혈장 노출보다 약 57배 더 크다(AUC0-28 일; 도 3). 26주 독성학 연구에서, NOAEL에서의 Cmax, ss는 9495 μg/mL이었으며, 이는 이식 환자에서 제안된 정맥내 요법에 대해 예상되는 Cmax(약 400 μg/mL)보다 24배 더 크다(도 4).

도 4는 10 mg/kg으로 정맥 내 제공된 CFZ533에 대한 예측된 평균 혈장 농도-시간 프로필을 보여준다(코호트 2). 평균 PK 프로필을 연구 1일차, 15일차, 29일차 및 57일차(위약 대조 기간) 및 연구 85일차, 99일차, 113일차 및 141일차(공개-표지 기간)에 i.v. 제공된 10 mg/kg CFZ533에 대해 시뮬레이션하였다. 건강한 대상체에서 FIH 연구 CCFZ533X2101로부터의 코호트 5(3 mg/kg i.v.) PK 데이터의 예비 모델 기반 집단 분석으로부터 얻은 파라미터를 사용하여 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 모델을 적용하였다. 항-CD40 차단제를 이용한 이전의 경험은 인간 tx에서 존재하지 않았으며, 건강한 대상체와 tx 환자 사이의 CD40 생물학(발현, 전환)의 어떠한 잠재적인 차이도 알려지지 않았다. 제안된 i.v. 요법은 전체 치료 기간에 걸쳐 40 μg/mL 초과의 지속된 혈장 농도를 제공할 것으로 예상되어, tx 환자의 표적 조직에서 증가된 CD40 발현을 예상하였다. 40 μg/mL에서의 가로 점선은 혈장 농도를 나타내며, 이를 초과하면, 표적 조직에서 완전 CD40 점유 및 경로 차단이 예상된다(사이노몰거스 원숭이 - 용량군 1 mg/kg에서 26주 독성학 연구의 PD 데이터에 기반함). 첫 달 동안 예상되는 전신 노출(더 높은 투약 빈도)은 4087 일*μg/mL이며(사이노몰거스 - 매주 150 mg/kg의 NOAEL에서의 26주 독성학 연구에서 항정 상태에서 한 달 동안 관찰된 전신 혈장 노출보다 57배 낮음), 예상된 Cmax는 약 400 μg/mL이다.

비인간 영장류의 조직에서의 관련 PD 효과: 26주 독성학 연구(1 mg/kg 용량군)에서 평균 항정 상태 혈장 농도가 38 μg/mL 이상인 동물은 림프절의 피질 B세포 영역에서 배 중심이 완전히 억제되었다. 10 mg/kg i.v. 요법은 전체 치료 기간에 걸쳐(위약 대조 및 공개-표지, 도 3 참고) 40 μg/mL 초과의 지속된 혈장 농도를 제공할 것으로 예상되어, tx 환자에서 더 높은 CD40 발현 및 표적 포화의 상실로 인한 표적 조직에서의 불완전한 PD 효과를 예상하였다.

물질 및 방법

[표 1]

약어 목록

[표 2]

시약 목록

CpG2006 서열: 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3'; 인간 EBV 상청액을 문헌[Traggiai E. Methods Mol Biol. 2012;901:161-70]에 기재된 바와 같이 생산하였다.

항체

[표 3]

항체 목록

화합물

[표 4]

화합물 목록

주의: CsA: 0.1 μM(= 0.121 μg/mL), 1 μM(= 1.21 μg/mL), 10 μM(= 12.1 μg/mL), 20 μM(= 24.2 μg/mL)

설비 및 보충 물질

[표 5]

설비 목록

[표 6]

소프트웨어

배지, 완충액 및 시약

세포 배양 배지: 425 mL RPMI-1640 배지, 5 mL 나트륨 피루베이트(최종 1 mM), 5 mL Pen/Strep(1x), 5 mL 카나마이신(1x), 5 mL MEM-NEAA(최종 1 mM), 5 mL L-글루타민(최종 2 mM), 0.5 mL β-메르캅토에탄올(최종 50 μM), 50 mL FBS(Hyclone; 최종 10%); EBV 배지: 15 mL 세포 배양 배지, 15 mL EBV-상청액(최종 25%), 0.6 mL 트랜스페린(최종 30 ng/mL; 스톡 6 μg/mL); FACS-완충액: 500 mL DPBS, 10 mL FBS(최종 2%), 2 mL EDTA(최종 2 mM); 차단 완충액: 13.5 mL FACS-완충액, 1.5 mL 인간 혈청(최종 10%).

B 세포 불멸화 배지는 최종 농도 2.5 μg/mL CpG2006, 30 ng/mL 트랜스페린 및 30% EBV-상청액으로 '완전 배지'(상기 참고)를 혼합하여 수행하였다. 내부 생성된 EBV-B 세포주 및 세포 공동-배양을 10% Hyclone-FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 1x 카나마이신, 1x NEAA, 1x 나트륨 피루베이트 및 50 μM ß-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지(= 완전 배지) 중에 유지하였다. 냉동 배지는 10% DMSO 및 90% FBS로 구성되었다. MACS-완충액은 0.5% BSA(MACS BSA 스톡 용액을 autoMACS 헹굼 용액으로 1:20 희석함) 및 2 mM EDTA가 보충된 PBS로 구성되었다. 1 mg/mL DNAse를 PBS로 희석하여 10 μg/mL의 최종 농도(스톡 농도)를 얻고, 0.22 μm 필터를 통해 여과하고, 분취하고 -20℃에서 보관하였다. 1 mL 완전 배지 당 10 μL의 스톡 농도를 사용하였다. 1.2 mg 동결건조된 재조합 인간(rh) IL-2를 1.2 mL 세포 배양 등급수로 희석하였다(스톡 농도: 1 mg/mL = 18 MIO IU/1.2 mL = 15 MIO IU/mL). 분취물을 제조하고 -20℃에서 보관하였다. 각각의 실험을 위해, 신선 분취물을 해동하고 실험 기간 동안 4℃에서 유지하였다. 하나의 CFSE 바이알을 18 μL DMSO(스톡 농도: 5 mM)로 희석하였다. 실험 절차를 위해, PBS 중 1:5000으로 사용하였다(최종 농도: 1 μM). 하나의 Cell Trace Violet 바이알을 20 μL DMSO(스톡 농도: 5 mM)로 희석하였다. 실험 절차를 위해, PBS 중 1:2000으로 사용하였다(최종 농도: 2.5 μM).

백혈구 연층으로부터의 인간 공여체 선택: 140명의 건강한 지원자로부터의 백혈구 연층을 사전 동의서의 서명 후 Blutspendezentrum Bern로부터 제공받았다. 이들 공여체로부터의 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 혈장을 단리하고 NBC(NIBR), Basel, Switzerland에서 보관하였다. 실험 시작 전, 모든 공여체를 제조업체의 지침에 따라 인간 항-EBV IgG Elisa 키트(EBV-EBNA)를 사용하여 혈장 중 엡스타인 바 바이러스(EBV)에 대한 IgG 클래스 항체를 측정하여 분석하였다.

EBV-B 세포주 생성: EBV-B 세포주의 생성은 EBV-혈청양성(제1회: 공여체 88, 153 및 139; 제2회: 공여체 90, 125 및 171; 제3회: 공여체 633, 648, 638, 652, 637 및 660) 및 EBV-혈청음성(제1회: 공여체 73, 111 및 173; 제2회: 공여체 289 및 437; 제3회: 공여체 670, 624, 583 및 635)인 선택된 공여체의 PBMC를 사용하여 수행하였다.

첫 번째로, B 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 인간 B 세포 농축 칵테일을 사용하여 선택된 PBMC로부터 정제하고 미희석 EBV-상청액(E. Traggiai, NBC, Novartis로부터 제공받음) 중 1x106 세포/mL로 조정하였다. 원심분리(425xg, 3 h, 37℃) 후, 감염된 B 세포의 상청액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 1x106 세포/mL B 세포 불멸화 배지(3.5) 중에 현탁하였다. 병행하여, 영양공급 세포를 비-자가 공여체로부터 제조하였다. 따라서, PBMC를 단리하고, 50 Gray로 조사하고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 원심분리(425xg, 10분, 4℃) 후, 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포를 완전 배지 중 1x106 세포/mL로 조정하였다. 1 mL 영양공급 세포 및 1 mL 감염된 B 세포를 12-웰 플레이트의 웰마다 분배하였다(최종 2x106 세포/웰/2 mL). 이어서, 세포를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 증식을 위해, 세포를 완전 배지로 1:2로 분할하였다. 세포를 먼저 6-웰 플레이트 내로, 이후 배지가 노란색이 되면 T-75 플라스크 내로 옮겼다. 감염된 EBV-B 세포를 냉동 배지와 함께 추가 사용을 위해 냉동하였다.

EBV-B 세포 또는 B 세포 및 T 세포의 공동-배양: 본 연구를 위한 내부 EBV-B 세포/T 세포 공동-배양 모델을 확립하기 위해, 본 발명자들은 Andorsky 등 (Andorsky 2011)에 의해 공개된 프로토콜을 변형하였다. 여기서, 본 발명자들은 EBV-B 세포 또는 일차 B 세포 및 자가 T 세포를 사용하여 세포를 4개의 상이한 농도(10, 50, 100 및 200 μg/mL 또는 비히클 대조군)의 IgG1 이소형, 항-CD40(CFZ533) 또는 항-CTL-A4 항체(벨라타셉트)와 인큐베이션하였다. 공동-배양 모델은 2개 상으로 구성되었다: '프라이밍' 상(7일 배양) 및 '회상' 상(추가 4일 배양). 항체를 '프라이밍' 상, '회상' 상 또는 두 상 모두('프라이밍 및 회상')에서 첨가하였다. 11일 공동-배양 후, 세포를 T 세포 증식에 대해 유세포 측정에 의해 및 IFNγ 생산에 대해 ELISA에 의해 분석하였다.

EBV-B 세포주의 해동: EBV-B 세포를 생성하고 후속 증식 후 냉동하였다. 실험 시작 1 내지 2주 전, 냉동된 바이알을 37℃ 수조에서의 온건한 진탕에 의해 또는 수동으로 해동하였다. 내용물이 해동되자마자, 바이알의 외부 표면을 70% 에탄올을 사용하여 소독하였다. 해동된 세포를 15 mL 팔콘 튜브로 옮기고 DNase를 함유하는 3 mL의 완전 배지(최종 10 μg/mL)를 천천히 첨가하였다. 이후, 세포를 원심분리하고(365xg, 5분, RT) 상청액을 폐기하고 6 mL의 완전 배지를 첨가하였다. 이어서, 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 6 mL의 세포를 넣고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 신선 배지를 첨가하여 또는 6-웰 플레이트의 몇몇 웰에서 계대하여 또는 배지가 주황색으로 변하면 2 내지 3일마다 배지를 교체하여 배양을 유지하였다. 실험을 위해, EBV-B 세포를 유세포 측정에 의해 CD3, CD19 및 CD20 표면 발현에 대해 분석하였다.

양성 선택에 의한 총 B 세포의 단리: EBV-B 세포와 병행하여, 일차 B 세포도 실험 설정에서 사용하였다. 따라서, 자기 Auto MACS 분리장치를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 인간 CD19 마이크로비드 키트를 사용해서 CD19 양성 B 세포를 단리하였다. 단리 후, 세포를 원심분리하고(300xg, 5분, RT), 상청액을 폐기하고 펠렛을 완전 배지에서 재현탁하였다. 이어서 B 세포를 계수하고, 4℃에서 T-25 플라스크에 보관하고 조사하였다.

EBV-B 세포 및 일차 B 세포의 조사: T-25 플라스크에 유지한 EBV-B 세포 및 단리된 일차 B 세포를 X-선 RS-2000 조사장치로 30 Gray에서 모두 동시에 조사하였다. 조사는 일차 B 세포 및 EBV-B 세포가 이들 공동-배양에서 분열하는 것을 방지할 것이다. 이는 T 세포만 자극에 반응하여 분열 중임을 확실히 할 것이며 APC(여기서는 일차 B 세포 또는 EBV-B 세포)는 항원을 제시할 것이고 배양에서 수 일 후 죽을 것이다.

양성 선택에 의한 총 T 세포의 단리: B 세포 단리로부터의 미표지 세포로, 제조업체의 지침에 따라 EasySep 인간 T 세포 농축 키트를 사용하여 T 세포를 단리하였다. 단리 후, 세포를 원심분리하고(300xg, 5분, RT), 상청액을 폐기하고 펠렛을 완전 배지 중에 재현탁하였다. 이후, T 세포를 계수하고 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.

7일 동안 T 세포의 프라이밍: 단리된 T 세포(2x105/50 μL/웰)를 10 IU/mL rhIL-2를 함유하는 완전 배지 중 96-웰 U형-바닥 플레이트에 분산시켰다. 이후, 2x104 조사된 EBV-B 세포 또는 일차 B 세포(50 μL/웰)를 각각의 웰에 첨가하였다. 음성 대조군 조건(B 세포 단독, EBV-B 세포 단독 및 T 세포 단독)은 50 μL 완전 배지로 충전하였다. 이어서, 100 μL의 상이한 항체 및 농도(아래 참고)를 세포 상부에 놓고 7일 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였으며, 2일마다 150 μL의 기존 배지를 조심스럽게 제거하고 10 IU/mL rhIL-2가 보충된 150 μL 신선 완전 배지를 상부에 첨가하였다. IgG1, 벨라타셉트 및 CFZ533에 대해 사용된 농도는 10, 50, 100 및 200 μg/mL 또는 비히클 대조군이었다.

CellTrace CFSE 및 CellTrace Violet 표지화: 먼저, 매칭되는 공여체로부터의 PBMC를 해동하고 일차 B 세포를 제조업체의 지침에 따라 EasySep 인간 B 세포 농축 키트를 사용하는 음성 선택에 의해 단리하였다. 이어서 일차 B 세포 및 유지된 EBV-B 세포 배양을 CellTrace CFSE 시약으로 표지하였다. 간략하게, 세포를 원심분리하고(365xg, 7분, RT), 상청액을 폐기하고, 펠렛을 5 ml PBS/1% FBS 중에 재현탁하고 원심분리하였다(365xg, 7분, RT). 이후, 세포를 2 mL PBS/1% FBS 중에 재현탁하고 2 mL의 PBS 중 희석된 1 μM CellTrace CFSE 시약(최종 농도 0.5 μM)을 세포에 첨가하여 인큐베이션하였다(8분, 암소에서 37℃). 이후, 동등 부피(여기서, 4 mL)의 사전-가온 FBS를 첨가하여 형광을 켄칭하고 가볍게 혼합하였다. 세포를 원심분리하고(365xg, 10분, RT), 상청액을 폐기하고, 펠렛을 5 ml 완전 배지 중에 재현탁하고 원심분리하였다(365xg, 10분, RT). 이어서, 펠렛을 4 mL 완전 배지 중에 재현탁하고, 인큐베이션하고(1 h, 37℃, 암소), 6 mL 완전 배지로 충전하였다. 세포를 다시 원심분리하고(365xg, 10분, RT), 상청액을 폐기하고 펠렛을 5 mL 완전 배지 중에 재현탁하였다. 계수 후, 염색되고 단리된 일차 B 세포 및 EBV-B 세포를 T-25 플라스크 내로 넣고 기재된 바와 같이 조사하였다. 또한, 소량의 분취물을 취해 세포를 성공적인 CFSE 표지화에 대한 유세포 측정에 의해 분석하였다.

배양된 T 세포에 대해 동일하게 수행하였다. 7일 배양 후, 모든 세포를 멸균 96-웰 V형-바닥 플레이트로 옮기고, 원심분리하고(1000xg, 5분, RT) 펠렛을 200 μL 완전 배지 중에 재현탁하였다. 각각의 조건으로부터 5 μL를 취해 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20 발현 및 성공적인 CFSE 염색에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 잔여 세포를 원심분리하고(1000xg, 5분, RT), 상청액을 폐기하고, 펠렛을 100 μL의 2.5 μM CellTrace Violet 시약 중에 재현탁하여 인큐베이션하였다(20분, 37℃). 이후, 세포를 원심분리하고(365xg, 10분, RT), 상청액을 폐기하고, 100 μL의 사전-가온 FBS를 첨가하여 형광을 켄칭하고 가볍게 혼합하였다. 이후, 세포를 다시 원심분리하고(30분, 37℃), 150 μL의 완전 배지를 첨가하고, 원심분리하고(365xg, 10분, RT), 상청액을 폐기하고 펠렛을 200 μL 완전 배지 중에 재현탁하였다. 모든 세포를 계수하고 각각의 공여체로부터의 분취물을 취해 FACS에 의해 성공적인 CFSE 염색을 확인하였다.

4일 동안의 공동-배양의 회상: 모든 조건에 있어서, 96-웰 U형-바닥 플레이트를 2개씩 사용하였다. 2x104 CellTrace Violet 표지된 T 세포(50 μL/웰)를 각각의 웰에 첨가하고 2x104 조사되고 CellTrace CFSE-표지된 EBV-B 세포 또는 일차 B 세포(50 μL/웰)를 상부에 첨가하였다. 이어서, 상이한 농도의 항체(4.3.5 참고)를 함유하는 100 μL 완전 배지를 첨가하고 4일 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2).

회귀 검정

6명의 건강한 지원자(18-001 내지 18-006)로부터의 백혈구 연층을 Blutspendezentrum Bern으로부터 제공받았다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 제조업체의 지침에 따라 LeucoSep 튜브를 사용하여 단리하고, TC20으로 계수하고 세포 배양 배지(배지, 완충액 및 시약)에서 조정하였다. 모든 조건(표 3-2 참고)을 96-웰 U형-바닥 플레이트에서 5개씩 수행하였고 웰 당 2x105 세포를 함유하였다. PBMC를 37℃에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한 후 EBV-상청액 및 트랜스페린을 함유하는 세포 배양 배지(배지, 완충액 및 시약 참고)를 첨가하였다. 벨라타셉트를 2개의 상이한 농도(10 μg/mL, 50 μg/mL)로, 이소형 hIgG 및 CFZ533을 4개의 상이한 농도(10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL)로 및 CsA를 4개의 상이한 농도(0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM)로 시험하였다. 플레이트를 임의의 보충물을 첨가하지 않고 14일 동안 인큐베이션하였다(37℃, 5% CO2). 14일 후, 세포를 96-웰 V형-바닥 플레이트로 옮기고, RT에서 5분 동안 1000xg에서 인큐베이션하고 수득한 상청액(200 μL)을 추가 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 세포 펠렛을 염색하고 유세포 측정에 의해 분석하였다(FACS 염색 절차).

FACS 염색 절차

회귀 검정으로부터의 세포 펠렛을 FACS-완충액으로 세척하고 4℃에서 20분 동안 차단 완충액으로 차단하였다. 세척하지 않고, CD3-PE 및 CD19-APC로 구성되는 항체 칵테일을 첨가하고 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 FACS-완충액으로 2회 세척하고, 100 μL FACS 완충액 중에 재현탁하고 65 μL의 세포 현탁액을 FortessaX20으로 플레이트에서 획득하고(HTS 판독기) FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 상이한 시점에, 세포를 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20과 같은 표면 발현 마커, 및 성공적인 CellTrace CFSE 또는 CellTrace Violet 표지화에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 추가로, 공동-배양 시간 종료 시, 세포를 생활성 마커, CD3, CD4 및 CD8을 사용하여 T 세포 증식에 대해 분석하였다. 따라서, 세포를 취해, 96-웰 V형-바닥 플레이트에 넣고 200 μL FACS-완충액으로 세척하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고(1000xg, 5분, RT) 4℃에서 30분 동안 상이한 항체(보상을 위한 하나의 또는 상이한 항체 칵테일)로 염색하였다. 2회 세척 및 원심분리 단계 후, 세포를 50 μL FACS-완충액으로 재현탁하고, Micronics 튜브로 옮기고 BD LSRFortessa™ 세포 분석기로 획득하였다.

결과:

인간 공여체 선택: 공동-배양의 시작 전에, 본 발명자들은 전술된 바와 같은 ELISA를 사용하여 EBV 혈청형을 시험하였다. 본 발명자들은 10개의 EBV-혈청양성 공여체(공여체 88, 90, 125, 139, 153, 171, 633, 637, 652 및 660) 및 8개의 EBV-혈청음성 공여체(공여체 73, 111, 289, 437, 583, 624, 635 및 670)를 확인하였다. 이들 공여체로부터, EBV-B 세포주를 상술된 바와 같이 생성하고, 상이한 세포를 단리하여 공동-배양 검정에서 사용하였다.

FACS 결과 I.

세포 공동-배양 모델에 있어서, 본 발명자들은 EBV-B 세포 또는 일차 B 세포 및 자가 T 세포를 사용하였고 세포를 4개의 상이한 농도(10, 50, 100 및 200 μg/mL 또는 비히클 대조군)의 IgG1 이소형, 항-CD40(CFZ533) 또는 항-CTL-A4 항체(벨라타셉트)와 인큐베이션하였다. 관심 항체를 전술된 바와 같이 세포로 '프라이밍', '회상' 또는 '프라이밍 및 회상' 상에 첨가하였다. 11일 공동-배양 후, 세포를 T 세포 증식에 대해 유세포 측정에 의해 및 IFNγ 생산에 대해 ELISA에 의해 분석하였다.

공동-배양이 일차 B 세포 및 자가 T 세포로 구성된 실험에서, 현미경으로 관찰되고 유세포 측정에 의해 획득된 세포 생활성 및 증식 또는 세포 클러스터 형성은 낮았다(EBV-혈청양성 및 EBV-혈청음성). 결과적으로, 결과는 결정적인 것이 아니었고 본 보고서에 나타내지 않는다. 또한, 이는 또한 모든 조건에서 검출 한계 미만인 IFNγ 사이토카인 수준으로 나타났다. 따라서, T 세포 증식(도 7 내지 도 12) 및 IFNγ 사이토카인 수준 결과(도 13 및 도 14)는 EBV-B 세포 및 자가 T 세포를 함유하는 공동-배양에 대해서만 나타낼 것이다.

FACS 결과 II.

종합하면, 본 발명자들은 6명의 상이한 공여체를 사용하고 분석하였다. 본 발명자들은 분석으로부터 2개의 최고 CsA 농도(10 μM 및 20 μM)가 세포에 독성이었으므로, 이를 제거하였다. 또한, 2명의 공여체(18-003 및 18-005)는 본 발명의 양성 대조군으로 작용한 CsA가 T 및 B 세포 증식에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았으므로, 이를 분석으로부터 제외하였다.

다른 4명의 공여체에 있어서, 기재된 관문화 전략(CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포 분석을 위한 관문화 전략 및 도 1)을 사용하여 분석을 수행하였고 결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다.

T 세포 증식에 대한 관문화 전략: 11일의 공동-배양 후, 세포를 생활성 마커가 포함되는 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20에 대해 염색하고 T 및 B 세포 증식에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 6-1에서, T 세포 증식에 대한 관문화 전략을 EBV-B 세포/T 세포 공동-배양을 사용하여 나타낸다. 첫 번째로, 본 발명자들은 점 그래프에서 전방 산란도(FCS)/측방 산란도(SSC) 상에 모든 획득된 세포를 도시한 후 히스토그램 그래프에서 총 생활성 세포(생활성 마커) 상에서 관문화하였다. 살아있는 세포 관문으로부터, CD3+ T 세포를 선택하고 T 세포 증식을 Cell Tracer Violet-양성 세포(첫 번째 열 왼쪽에서 오른쪽으로) 상에서 관문화에 의해 확인하였다. 이어서, 총 생활성 세포로부터, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 확인하기 위해 사분역을 배치하고, Cell Tracer Violet 표지화를 갖는 증식에 대해 분석하였다(두 번째 열).

CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포 분석에 대한 관문화 전략.

14일 후, 세포를 CD3 및 CD19 항체로 염색하고, CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 1에서, 관문화 전략을 나타낸다. 첫 번째로, 본 발명자들은 점 그래프에서 전방 산란도(FCS)/측방 산란도(SSC) 상에 모든 획득된 세포를 도시한 후 점 그래프에서 CD3+ T 세포(상부 보라색 원) 또는 CD19+ B 세포(오른쪽 보라색 원) 상에서 추가 관문화하였다. 한 명의 대표 공여체로부터의 상이한 조건을 나타낸다((첫 번째 열: PBMC+배지-EBV(왼쪽 그래프), PBMC+배지+EBV(오른쪽 그래프); 두 번째 열: PBMC+0.1 μM CsA+EBV(왼쪽 그래프), PBMC+50 μg/mL 벨라타셉트+EBV(오른쪽 그래프); 세 번째 열: PBMC+50 μg/mL hIgG1+EBV(왼쪽 그래프), PBMC+50 μg/mL CFZ533+EBV(오른쪽 그래프)).

EBV-혈청양성 EBV-B 세포/T 세포 공동-배양의 T 세포 증식: 시험관내 연구의 전반적 설계가 도 6에 도시된다. 총 CD3+ T 세포(도 7), CD4+ T 세포(도 8) 및 CD8+ T 세포(도 9)의 T 세포 증식을 조사하기 위해, 상이한 농도(0, 10, 50, 100 또는 200 μg/mL)의 CFZ533 또는 벨라타셉트를 나타낸 상('프라이밍', '회상', '프라이밍 및 회상')에 EBV-혈청양성 EBV-B 세포/T 세포 공동-배양에 제공하고 배지 또는 이소형 대조군과 같은 상응하는 대조군에 대한 비로 분석하였다. 3개의 모든 실험 조건에서, EBV-B 세포는 T 세포 단독 조건에 비해 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 유도하였다(그래프에서 '0 μg/mL'로 나타냄). 벨라타셉트는 항체가 '프라이밍' 및 '회상' 단독 조건에 비해 공동-배양('프라이밍 및 회상' 상)에 2번 주어지는 경우 EBV-B 세포의 존재 하에 EBV-유도 T 세포 증식을 가장 강력히 감소시켰다. 또한, 10 및 50 μg/mL 벨라타셉트는 3개의 모든 조건에서 100 및 200 μg/mL 벨라타셉트보다 약간 더 강력하지만 유의미하지 않은 억제 패턴을 나타내었다. 또한, 100 및 200 μg/mL 벨라타셉트는 '프라이밍 및 회상' 상에서만 T 세포 증식에 대해 감소 효과를 가졌으나 '프라이밍' 또는 '회상' 상에만 첨가되는 경우에는 그렇지 않았다. 대조적으로, CFZ533은 4개의 시험된 농도에서 모두 CD3+ T 세포 증식에 대한 감소 효과를 갖지 않았다.

구체적으로 CD4+ T 세포 증식의 분석에서(도 8), 벨라타셉트는 또한 항체가 '프라이밍' 및 '회상' 단독 조건에 비해 '프라이밍 및 회상' 상에 주어지는 경우 EBV-B 세포의 존재 하에 EBV-유도 T 세포 증식을 가장 강력히 감소시켰다. 또한, 10 및 50 μg/mL 벨라타셉트는 3개의 조건에서 모두 100 및 200 μg/mL 벨라타셉트보다 CD4+ T 세포 증식에 대해 약간 더 강력하지만 유의미하지 않은 억제 패턴을 유도하였다. 또한, 100 및 200 μg/mL 벨라타셉트는 '프라이밍 및 회상' 상에 T 세포 증식에 대해 강력한 감소 효과를 가졌으며, '프라이밍' 또는 '회상' 단독상에서는 더 적은 정도로 효과를 가졌다. 흥미롭게도, 두 고용량 모두 여전히 CD3+ T 세포 증식 결과와 대조적으로 T 세포 증식을 감소시킬 수 있었다. 또한 이전에 나타난 바와 같이, CFZ533은 '프라이밍' 단독 상에서 약간의 감소를 제외하고, 시험된 4개 농도에서 모두 CD4+ T 세포 증식에 대해 감소 효과를 갖지 않았다.

CD8+ T 세포 증식을 분석하면(도 9), 벨라타셉트 및 CFZ533는 이전에 CD3+ T 세포 증식에 대해 나타난 것과 유사한 효과를 가졌다(도 7). EBV-혈청음성 EBV-B 세포/T 세포 공동-배양의 T 세포 증식. 동일한 접근을 사용하여 EBV-혈청음성 공여체로부터 총 CD3+ T 세포(도 10), CD4+ T 세포(도 11) 및 CD8+ T 세포(도 12)의 T 세포 증식을 분석하였다. EBV-혈청양성 공여체에서와 같이, 3개의 실험 조건에서 모두, EBV-B 세포는 T 세포 단독 조건에 비해 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 유도하였다(그래프에서 '0 μg/mL'로 나타냄). CD3+ T 세포 증식에 있어서(도 10), 벨라타셉트는 항체가 '프라이밍' 및 '회상' 단독 조건에 비해 공동-배양('프라이밍 및 회상' 상)에 2번 주어지는 경우 EBV-B 세포의 존재 하에 EBV-유도 T 세포 증식을 가장 강력히 감소시켰다. 또한, 10 및 50 μg/mL 벨라타셉트는 3개의 조건에서 모두 100 및 200 μg/mL 벨라타셉트보다 약간 더 강력하지만 유의미하지 않은 억제 패턴을 나타내었다. 또한, 100 및 200 μg/mL 벨라타셉트는 '프라이밍 및 회상' 조건에서만 T 세포 증식에 대해 감소 효과를, 그리고 '프라이밍' 또는 '회상' 단독 조건에서는 적은 정도로만 효과를 가졌다. 대조적으로, CFZ533은 4개의 모든 시험된 농도에서 CD3+ T 세포 증식에 대한 감소 효과를 갖지 않았다.

구체적으로 CD4+ T 세포 증식의 평가에서(도 11), 벨라타셉트는 3개의 상이한 조건에서 모두 유사하게 강력하게, 그리고 EBV-혈청양성 공여체에 비해 더 강력하게 EBV-B 세포의 존재 하에 EBV-유도 T 세포 증식을 감소시켰다. 흥미롭게도, EBV-혈청양성 공여체로 관찰했을 때 4개 용량(10, 50, 100 및 200 μg/mL) 간에 명백한 차이는 나타나지 않았다. 대조적으로, CFZ533은 10 μg/mL('프라이밍' 단독 및 '프라이밍 및 회상' 조건) 및 50 μg/mL('회상' 단독 조건)에서의 약간의, 그러나 유의미하지 않은 증가를 제외하고, CD4+ T 세포 증식에 대해 효과를 갖지 않았다.

상이한 자극을 사용하는 CD3+ T 세포 및 CD19+ B 세포 증식에 대한 효과.

총 CD3+ T 세포(도 2) 및 CD19+ B 세포(도 3)의 증식을 조사하기 위해, 상이한 농도의 hIgG1 또는 CFZ533(10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL), 벨라타셉트(10 μg/mL 또는 50 μg/mL) 또는 CsA(0.1 μM 또는 1 μM)를 사용하였다. 이미 상기 언급된 바와 같이, 10 μM 및 20 μM CsA는 세포에 독성이었고 이에 따라 분석으로부터 제외하였다. 'EBV 비함유 배지'를 제외한 모든 조건은 EBV 상청액 및 각각의 화합물 또는 항체와 인큐베이션하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 배지 단독(EBV 비함유 배지)으로 인큐베이션된 PBMC에 비해 PBMC가 EBV 상청액과 인큐베이션되는 경우 CD3+ T 세포수의 명확한 증가가 존재하였다. 또한, 대조군 조건(배지+EBV)에 비해 본 발명의 양성 대조군으로 작용할 것으로 예상되므로 0.1 μM 및 1 μM CsA로 CD3+ T 세포수가 크게 감소하였다. 벨라타셉트(10 μg/mL 및 50 μg/mL)로도 동일하게 관찰할 수 있었으나 CsA로보다는 적은 정도였다. CFZ533 및 상응하는 이소형 대조군 hIgG1은 시험된 4개 농도 모두에 있어서 CD3+ T 세포수에 대해 임의의 효과를 갖지 않았다. CD19+ B 세포 증식을 살펴보면(도 3), 배지 단독(EBV 비함유 배지)으로 배양된 PBMC에 비해 PBMC가 EBV 상청액과 인큐베이션되는 경우 CD19+ B 세포수의 명백한 증가가 존재하였다. 또한, 이는 대조군 조건(배지+EBV)에 비해 예상된 바와 같이 0.1 μM 및 1 μM CsA로 CD19+ B 세포수가 크게 증가하였다. 벨라타셉트(10 μg/mL 및 50 μg/mL)는 CD19+ B 세포수의 증가를 야기한 반면 이소형 대조군 hIgG1은 시험된 4개 농도 모두에 있어서 임의의 효과를 갖지 않았다. 대조적으로, CFZ533는 14일 후 아마도 간접적 NK 세포-매개 항체-의존적 세포독성(ADCC)으로 인해 CD19+ B 세포수 감소를 나타내었다. Ristov 등의 간행물(Ristov 2018)에서, 3일 동안 CFZ533과 인큐베이션된 전혈 배양에서 ADCC는 나타나지 않았으며 Cordoba 등의 간행물(Cordoba 2015)에서, CFZ533은 실험 기간에 걸쳐 유의미한 말초 B 세포 고갈을 드러내지 않았다(비인간 영장류에서 신장 이식 100일 후, 13주 및 26주 tox 연구). CD19 감소 측면에서 관찰된 차이는 상이한 실험 설정에 의해 설명할 수 있었다: EBV 회귀 검정에서는 NK 세포가 EBV에 의해 명확히 활성화되며 실험 기간은 이의 증식을 허용하지만, 임의의 특이적 활성화가 없는 3일 검정에서는 ADDC의 수준이 무시할 수 있는 정도였다. NK 세포의 잠재적 관여를 조사하기 위해, 본 발명자들은 NK 세포가 세포 배양 모델에서 유지되거나 고갈되는 새로운 실험 세트를 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 양성 대조군으로 고갈 CD40 mAb인 HCD122를 포함시켰다. 완전 또는 NK 세포-고갈 PMBC 배양에서 CD19+ B 세포수를 분석하는 경우 유사한 결과를 수득하였다. HCD122은 예상된 바와 같이 B 세포를 고갈시키지 않았다. 또 다시, CFZ533은 PBMC 배양에서 NK 세포와 무관하게 이소형 대조군에 비해 CD19+ B 세포수의 감소를 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 NK 세포-매개 ADCC를 배제할 수 있었다. 실제로 CD40-CD40L 상호작용은 생체내 EBV-B 세포 림프종의 확립에 결정적인 것으로 나타났다(Ma et al., 2015).

엡스타인 바 바이러스(EBV)-연관 이식-후 림프증식성 장애(PTLD)는 EBV 일차 감염 또는 재활성화와 연관된다. 면역적격 개체에서는 항-바이러스 T 세포 반응이 감염을 제어하지만, EBV는 B 세포 및 일부 다른 세포 유형에서 잠복 상태로 남아 있다. 이식받은 환자에서, 면역억제는 항-EBV T 세포 반응을 둔화시켜, EBV-유도 B 세포 증식이 제어되지 않도록 할 수 있다. 본 발명자들은 EBV-B 세포의 T 세포-유래 제어에 대한 항-CD40 mAb의 효과 및 결과적으로 B 세포 생장을 검사하였다. 이를 위해 본 발명자들은 항-CD40 mAb(CFZ533/이스칼리맙)와 비교하여 사이클로스포린 A(CsA), CTLA4-Ig 융합 단백질(벨라타셉트)과 인큐베이션된 말초혈 단핵 세포를 사용하는 EBV 회귀 검정을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 EBV-B 세포(혈청-양성 및 혈청-음성) 또는 일차 B 세포와 T 세포의 자가 공동-배양을 사용하여 T 세포 증식 및 IFN 생산에 대한 CD40 또는 CTLA-4의 차단 효과를 평가하였다. 항-CD40 mAb 이스칼리맙이 아닌 벨라타셉트 및 CsA는 T 세포 활성을 감소시켜 시험관내 불멸화된 세포의 과성장을 초래하였다. 또한, 이스칼리맙이 아닌 벨라타셉트는 공동-배양 시스템을 사용하여 EBV-B 세포의 존재 하에 EBV-매개 T 세포 증식 및 IFNγ 분비를 감소시켰다. 결론적으로, 이스칼리맙은 CsA 및 벨라타셉트와 대조적으로, 시험관내 EBV 제어를 손상시키지 않아서, 이스칼리맙이 투약된 이식 환자의 PTLD의 위험이 감소될 수 있음을 제시한다.

EBV B 세포/T 세포 공동-배양 모델에서, CFZ533/이스칼리맙이 아닌 벨라타셉트는 EBV-B 세포의 존재 하에 EBV-매개 T 세포 증식 및 IFNγ 분비를 감소시켰다. 벨라타셉트의 억제 효과는 조합된 "프라이밍" 및 "회상" 배양에서 및 CD4+ T 세포 상에서 가장 주목할 만하였다.

CFZ533/이스칼리맙이 아니라 벨라타셉트 및 CsA는 T 세포 활성을 감소시켜 시험관내 불멸화된 B 세포의 과성장을 야기하였다. 이들 결과는 이스칼리맙이 벨라타셉트에 비해 신장 장기 이식 수신체에서 개선된 안전성 프로필을 가짐을 나타낸다. CFZ533/이스칼리맙은 벨라타셉트와 대조적으로, 시험관내 EBV 제어를 손상시키지 않아서, CFZ533/이스칼리맙이 투약된 이식 환자의 PTLD의 위험이 감소됨을 제시한다. 유사한 결론을 EBV 회귀 검정에 기반하여 CsA/CNI에 대해 도출할 수 있다. 이들 결과는 EBV 감염의 증가된 발생률이 관찰되지 않은 CNI-비함유 치료법으로서 이스칼리맙을 사용하는 현재의 임상 신장 이식 데이터와 일치하는 것으로 나타난다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> A method for preventing human virus associated disorders in patients <130> PAT058676 <151> PCT filing date <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 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Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 10 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 11 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 15 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420 ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacgcc 900 tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350 <210> 16 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60 atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180 tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240 tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300 ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 17 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420 ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggccgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900 tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350 <210> 18 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60 atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180 tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240 tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300 ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 19 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275

Claims

대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 EBV-연관 장애를 방지하는 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 소아 환자인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는, 방법.
제3항에 있어서, 대상체가 EBV 혈청양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV-혈청음성 이식 환자인, 방법.
제3항에 있어서, 환자가 간 이식 환자인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 대상체가 면역억제되는, 방법.
제3항에 있어서, EBV-연관 장애가 암 또는 림프증식성 질환인, 방법.
대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 EBV-연관 장애가 발생할 가능성을 감소시키는 방법.
제8항에 있어서, 환자가 소아 환자인, 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는, 방법.
제10항에 있어서, 대상체가 EBV 양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 혈청음성 이식 환자인, 방법.
제10항에 있어서, 환자가 간 이식 환자인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 대상체가 면역억제되는, 방법.
제10항에 있어서, EBV-연관 장애가 암 또는 림프증식성 질환인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 방법이 이식-후 림프증식성 질환의 가능성을 감소시키는, 방법.
대상체에 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 고형 장기의 이식을 필요로 하는 환자에게 고형 장기를 이식하는 방법.
제16항에 있어서, 환자가 소아 환자인, 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 대상체가 EBV 양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 혈청음성 이식 환자인, 방법.
제18항에 있어서, 환자가 간 이식 환자인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 대상체가 면역억제되는, 방법.
대상체에 치료 유효 용량의 CD40 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 EBV 감염을 제어하는 방법.
제21항에 있어서, 환자가 소아 환자인, 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 대상체가 장기 또는 조직 이식을 거치게 되는, 방법.
제23항에 있어서, 대상체가 EBV 양성 공여체로부터 장기를 제공받는 EBV 혈청음성 이식 환자인, 방법.
제24항에 있어서, 환자가 간 이식 환자인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 대상체가 면역억제되는, 방법.
제1항, 제8항, 제16항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, CD40 길항제가 항-CD40 항체인, 방법.
제27항에 있어서, CD40 길항제가 ASKP1240, BI655064 및 FFP104로 구성되는 항-CD40 항체의 군으로부터 선택되는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 항체가 침묵화된 ADCC 활성을 갖는 항-CD40 항체인, 방법.
제27항에 있어서, 항체가
e. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;
f. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 기재된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함하는 항-CD40 항체;
g. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 13의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체; 및
h. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인, 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인, 및 SEQ ID NO: 14의 Fc 영역을 포함하는 항-CD40 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
제28항 또는 제30항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 9의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 10의 경쇄 아미노산 서열; 또는 SEQ ID NO: 11의 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 12의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 항체가 CFZ533인, 방법.
제32항에 있어서, 항체 CFZ533이 CsA, 타크롤리무스 또는 에버롤리무스와 같은 mTor 억제제와의 조합으로 사용되는, 방법.