ES2665592T3 - Anticuerpos anti-CD40 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humanizado que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

Description

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Preferiblemente, el anticuerpo se une específicamente a CD40 en el conjugado CD40-Fc con un valor CE50 inferior a 1 nM y CD40 en células que expresan CD40 con un valor CE50 inferior a 2,5 nM. Las propiedades antagonistas del anticuerpo se definen porque poseen un valor CI50 de actividad agonista de células B o células dendríticas inferior a 1 nM. El anticuerpo posee también propiedades farmacocinéticas superiores que tienen mayor semivida in vivo que otros anticuerpos anti-CD40 (p. ej., el anticuerpo anti-CD40 4D11).

Como se usa en este documento, una célula que expresa CD40 es cualquier célula caracterizada por la expresión superficial de CD40, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, células B normales y neoplásicas, células interdigitantes, células epiteliales basales, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliales, células

dendríticas foliculares, células de amígdalas y células plasmáticas derivadas de médula ósea. En algunas realizaciones, la molécula de CD40 es una molécula de CD40 humana.

Los anticuerpos de la presente invención reconocen el "epítopo de antígeno CD40" y el "epítopo CD40" específico. Como se emplean en este documento, los términos se refieren a una molécula (p. ej., un péptido) o un fragmento de una molécula capaz de inmunorreactividad con un anticuerpo anti-CD40 y, por ejemplo, incluyen un determinante antigénico de CD40 reconocido por cualquiera de los anticuerpos que tienen una combinación de secuencia de cadena pesada/cadena ligera de la SEC ID NO.26 de cadena ligera con cualquiera de las SEC ID de cadena ligera NO: 27, 28, 29 o 30; o SEC ID de cadena ligera NO: 31 con cualquiera de las SEC ID de cadena pesada NO 32, 33, 34 o 35; o SEC ID de cadena ligera NO 36 con cualquiera de las SEC ID de cadena pesada NO 37, 38, 39 o 40. Los epítopos de antígeno CD40 pueden incluirse en proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos o similares. Los epítopos son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión a anticuerpos del antígeno CD40), o sus combinaciones.

Los expertos en la técnica conocen la estructura generalizada de los anticuerpos o la inmunoglobulina, estas moléculas son glucoproteínas heterotetrámicas, típicamente de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está covalentemente unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro para formar un heterodímero, y la molécula heterotramérica se forma mediante una unión disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de los heterodímeros. Aunque las cadenas ligeras y pesadas están unidas entre sí por un enlace disulfuro, el número de uniones disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía por el isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también posee puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en el término amino un dominio variable (VH), seguido de tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), como también una región bisagra entre CH1 y CH2. Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable aminoterminal (VL) y un dominio constante carboxiterminal (CL). El dominio VL se asocia no covalentemente con el dominio VH, mientras que el dominio CL está unido covalentemente al dominio CH1 mediante un enlace disulfuro. Se cree que los residuos aminoácidos particulares forman una interconexión entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663.)

Ciertos dominios dentro de los dominios variables difieren en gran medida entre los diferentes anticuerpos, es decir, son "hipervariables". Estos dominios hipervariables contienen residuos que están directamente implicados en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su determinante antigénico específico. La hipervariabilidad, tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada, se concentra en tres segmentos conocidos como regiones determinantes complementarias (CDR) o bucles hipervariables (HVL). Las CDR se definen por la comparación de secuencias en Kabat et al., 1991, en: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., mientras que los HVL se definen estructuralmente de acuerdo con la estructura tridimensional del dominio variable, como se describe en Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Si bien estos dos métodos resultan en identificaciones levemente diferentes de una CDR, se prefiere la definición estructural. Como lo define Kabat, la CDR-L1 está posicionada aproximadamente en los residuos 24-34, la CDR-L2, aproximadamente en los residuos 50-56 y la CDR-L3 aproximadamente en los residuos 89-97 en el dominio variable de cadena ligera; La CDR-H1 está posicionada aproximadamente en los residuos 31-35, la CDR-H2, aproximadamente en los residuos 50-65 y la CDR-H3, aproximadamente en los residuos 95-102 en el dominio variable de cadena pesada; Las CDR1, CDR2, CDR3 de las cadenas ligeras y pesadas definen, por lo tanto, las propiedades únicas y funcionales específicas de un anticuerpo determinado.

Las tres CDR dentro de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se separan mediante regiones flanqueantes (FR), que contienen secuencias que tienden a ser menos variables. Desde el término amino al término carboxi de los dominios variables de cadena pesada y liviana, las FR y CDR se disponen en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La configuración en gran parte de hojas β de los FR trae los CDR dentro de cada una de las cadenas muy cerca el uno del otro, así como a los CDR de la otra cadena. La conformación resultante contribuye al sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669), aunque no todos los residuos de CDR están necesariamente directamente implicados en la unión al antígeno.

Los residuos de FR y los dominios constantes de Ig no están directamente implicados en la unión a antígenos, pero contribuyen a la unión al antígeno y/o median la función efectora del anticuerpo. Se cree que algunos residuos de FR tienen un efecto significativo en la unión al antígeno en por lo menos tres formas: uniendo no covalentemente a un

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glucoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su anticuerpo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). En ciertas realizaciones, la marca del epítopo es un "epítopo de unión al receptor de rescate". Como se usa en esta memoria, la expresión "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse a un agente citotóxico. Esto es cualquier sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o que causa la destrucción de las células. La expresión tiene como fin incluir isótopos radiactivos (como I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, y sus fragmentos. Dichos agentes citotóxicos pueden acoplarse a los anticuerpos humanizados de la presente invención usando procedimientos convencionales, y usarse, por ejemplo, para tratar a un paciente indicado para terapia con el anticuerpo.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Existen numerosos ejemplos de agentes quimioterapéuticos que podrían conjugarse con los anticuerpos terapéuticos de la presente invención. Los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulacetina y bulatacinona); camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin, y bizelesin); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina, auristatinas, (incluyendo análogos de monometil-auristatina E y monometil-auristatina F); duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobin; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina; trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como antibiótico de enediina (p. ej., calquieamicina, especialmente caliquemicina gamma1I y caliquemicina phiI1, véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; esperamicina; como también cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamycin™) (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrin, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epitolona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-trichlorotriethylamine; tricotecanos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina); uretan; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitabronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil; gemcitabina (Gemzar™); 6tioguanina; mercaptopurina; metotrexato ; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina Navelbine™); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterin; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácido so derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en la definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de los receptores de estrógenos receptivos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston™); inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, megestrol acetato (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) y anastrozol (Arimidex™); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácido so derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Uno cualquiera o más de estos agentes se puede conjugar a los anticuerpos humanizados de la presente invención para proveer un agente terapéutico útil para el tratamiento de diversos trastornos.

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Los anticuerpos también pueden conjugarse a profármacos. Un "profármaco" es un precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico para las células tumorales que el fármaco madre y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma más activa. Véanse, por ejemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pág. 375-382, 615th Meeting Belfast y Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Los profármacos útiles incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen β-lactámicos, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos, y profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivar en una forma de profármaco incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente

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Para fines diagnósticos como también de monitoreo terapéutico, los anticuerpos de la invención pueden también conjugarse a una etiqueta, o bien una etiqueta sola o a una etiqueta y un segundo agente adicional (profármaco, agente quimioterapéutico y similar). Una etiqueta, según se distingue de los otros segundos agentes, se refiere a un agente que es un compuesto o composición detectable y que puede conjugarse directa o indirectamente a un anticuerpo humanizado de la presente invención. La etiqueta puede ser en sí misma detectable (p. ej., etiquetas de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. El anticuerpo anti-CD40 humanizado marcado se puede preparar y usar en diversas aplicaciones que incluyen diagnósticos in vitro e in vivo.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden formular como parte de una preparación liposomal con el fin de efectuar su administración in vivo. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos. Los liposomas son útiles en la administración a un mamífero de un compuesto o formulación, como un anticuerpo anti-CD40 humanizado descrito en la presente memoria, opcionalmente acoplado o en combinación con uno o más agentes farmacéuticamente activos y/o etiquetas. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.

Ciertos aspectos de la presente invención relacionados con ácidos nucleicos aislados que codifican uno o más dominios de los anticuerpos humanizados de la presente invención. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia comúnmente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada se distingue de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales.

En diversos aspectos de la presente invención, uno o más dominios de los anticuerpos humanizados se expresarán de manera recombinante. Dicha expresión recombinante puede emplear una o más secuencias de control, es decir, secuencias de polinucleótidos necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo hospedante particular. Las secuencias de control adecuadas para uso en células procarióticas incluyen, por ejemplo, promotor, operador y secuencias del sitio de unión al ribosoma. Las secuencias de control eucariótico incluyen, aunque sin limitarse a ello, promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. Estas secuencias de control se pueden utilizar para expresión y producción de anticuerpo anti-CD40 humanizado en células hospedantes procarióticas y eucarióticas.

Una secuencia de ácido nucleico está "operativamente unida" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una presecuencia de ácido nucleico o líder secretor está operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado como para facilitar la traducción. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de DNA que están siendo unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. No obstante, los potenciadores son opcionalmente contiguos. La unión se puede lograr mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se pueden utilizar enlazadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos.

Como se emplean en esta memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y dichas designaciones incluyen su descendencia. Por lo tanto, "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de allí sin importar el número de transferencias.

El término "mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domesticados y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas como perros, caballos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

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TABLA 2: Anticuerpos murinos iniciales CD40 -Secuencias VK

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Se seleccionaron secuencias flanqueantes humanas para cada ratón basándose en la homología estructural, 5 estructura de CDR, restos canónicos conservados, restos de empaquetamiento de interfaz conservados y otros parámetros.

Los anticuerpos seleccionados de las CDR de cadena pesada y ligera murina de los diversos anticuerpos murinos se indican en las Tablas 3 y 4, respectivamente:

Tabla 3:

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Secuencias CDR de CADENA PESADA

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Nombre del constructo

H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3

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GFNIKDYYVH RIDPEDGDSKYAPKFQG SYYVGTYGY

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SEC ID Nº: 9. SEC ID Nº: 12. SEC ID Nº: 16.

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GFNIKDYYIH RIDPEDGDTKYDPKFQG SYYVGTYGY

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SEC ID Nº: 10. SEC ID Nº: 13. SEC ID Nº: 16.

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GFNIKDYYVH RIDPEDGDTKFAPKFQG SYYVGTYGY

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SEC ID Nº: 9. SEC ID Nº: 14. SEC ID Nº: 16.

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GFTFSDYGMH YISSGNRIIYYADTVKG QDGYRYAMDY

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SEC ID Nº: 11. SEC ID Nº: 15. SEC ID Nº: 17.

El H-CDR1 anteriormente enumerado usa la secuencia que utiliza el sistema de numeración Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948). La numeración Kabats para las secuencias se marca con texto en negrita y cursiva, y la numeración IMGT se muestra con texto subrayado de los residuos en la tabla de arriba para CDR1 y CDR2. Las secuencias para H-CDR3 para cada uno de 2H11, 10F2 y 19B10 es TTSYYVGTYGY (SEC ID NO:77) y para 20E2 es ARQDGYRYAMDY (SEC ID NO:78).

Tabla 4:

Secuencias CDR de CADENA LIVIANA

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Nombre del constructo

L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3

2H11

SASSSVSYML STSNLAS QQRTFYPYT

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SEC ID Nº: 18. SEC ID Nº: 22. SEC ID Nº: 24.

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SATSSVSYIL STSNLAS QQRTFYPYT

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo A (Cadena pesada, IgG1KO)

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Anticuerpo A (Cadena pesada, IgG1)

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Anticuerpo A (Cadena pesada, IgG4DM)

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo A (Pesada, IgG1KOb)

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Anticuerpo B (Cadena ligera)

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Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG1KO)

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Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG1)

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG4 DM)

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Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG1KOb)

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Anticuerpo C (Cadena ligera)

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Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG1KO)

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG1)

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Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG4 DM)

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Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG1KOb)

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En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede, por ejemplo, bloquear la proliferación o detener de otro modo el crecimiento de una célula o provocar su agotamiento, muerte o, de otro modo, su eliminación, por ejemplo, mediante la unión del antígeno de superficie CD40. Por ejemplo, en tumores malignos de células T y B, los efectos 5 antitumorales (p. ej., cese del crecimiento con o sin eliminación celular o apoptosis) a menudo resulta cuando las células malignas se exponen a estímulos que conducen a la activación de linfocitos normales. Esta detención del crecimiento inducida por activación se ha observado con señales a través de receptores de antígenos o receptores coestimuladores (véanse, por ejemplo, Ashwell et al., 1987, Science 237:61; Bridges et al., 1987, J. Immunol. 139:4242; Page y Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717; y Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501). La

10 estimulación CD40, como resultado de la unión específica mediante un anticuerpo o un ligando soluble, inhibe el crecimiento del linfoma de células B (véase, p. ej., Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794). Los agentes que inhiben el crecimiento de células malignas de esta manera y que se dirigen contra el antígeno de superficie CD40 son ejemplos de agentes apropiados.

Los agentes específicos de CD40 incluyen el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-CD40

15 humanizado que se une a CD40 (p. ej., CD40 humana o su variante). Los agentes y anticuerpos específicos de CD40 se pueden conjugar opcionalmente o condensarse a un agente citotóxico o quimioterapéutico. En aspectos en los que el anticuerpo humanizado se une al antígeno de superficie CD40 y causa la reducción de los tipos de células

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Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proveer liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo descrito en esta memoria pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288 mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorrubicina) está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Véase, p. ej., Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19):1484.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden también utilizarse en procedimientos ADEPT (Terapia de Profármacos y Enzimas Dirigida por Anticuerpos), conjugando el anticuerpo a una enzima activadora del profármaco que lo convierte en un profármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico de peptidilo), para un fármaco activo antineoplásico. Véanse, por ejemplo, los documento WO 81/01145, WO 88/07378, y la patente de EE.UU. No.

4.975.278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT es una enzima capaz de actuar sobre un profármaco de manera tal de convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas específicas útiles en procedimientos ADEPT incluyen, aunque sin limitarse a ello, fosfatasa alcalina para convertir profármacos que contienen fosfatasa en fármacos libres; arilsulfatasa para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco antineoplásico, 5-fluorouracil; proteasas, como serratia proteasa, termosilina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L), para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas que escinden los carbohidratos tales como βgalactosidasa y neuraminidasa para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; β-lactamasa para convertir fármacos derivados con β-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, como penicilina amidasa V o penicilina amidasa G, para convertir fármacos derivados en sus amina nitrógenos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos que tienen actividad enzimática ("abzimas") se pueden utilizar para convertir los profármacos en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse por métodos conocidos para administración de la abzima a una población de células tumorales, por ejemplo, uniendo covalentemente la enzima al anticuerpo anti-CD40 humanizado/reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales anteriormente analizados. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo descrito en este documento unida a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima ya descrita en este documento, se pueden construir usando técnicas de DNA recombinante (véase, por ejemplo, Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).

Como se describe en este documento, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración del tumor, por ejemplo. Puede ser conveniente modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su semivida en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, por incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo. En un método, la región apropiada del fragmento de anticuerpo puede alterarse (p. ej, mutarse), o el otro epítopo puede incorporarse en una marca de péptido que luego se condensa al fragmento de anticuerpo en alguno de los extremos o en el medio, por síntesis de DNA o peptídica. Véase, p. ej., el documento WO 96/32478.

En algunas realizaciones, también se incluyen modificaciones covalentes del anticuerpo anti-CD40 humanizado. Las modificaciones covalentes incluyen la modificación de residuos cisteinilo, residuos histidilo, residuos lisinilo y residuos aminoterminales, residuos arginilo, residuos tirosilo, grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo), residuos glutaminilo y asparaginilo, o residuos serilo o treonilo. Otro tipo de modificación covalente implica glucósidos de acoplamiento química o enzimáticamente acoplados al anticuerpo. Dichas modificaciones pueden realizarse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si corresponde. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se pueden introducir en la molécula, haciendo reaccionar los residuos aminoácido direccionados del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos amino o carboxiterminales.

La eliminación de cualquier resto carbohidrato presente en el anticuerpo puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. La deglucosilación química es descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.

259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. La escisión enzimática de restos carbohidrato en anticuerpos puede lograrse mediante el uso de una diversidad de endo y exo-glucosidasas tales como las descritas por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350.

Otro tipo de modificación covalente útil comprende unir el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en una o más de la patente de EE.UU. Nº 4.640.835, patente de EE.UU. Nº 4.496.689, patente de EE.UU. Nº 4.301.144,

patente de EE.UU. Nº 4.670.417, patente de EE.UU. Nº 4.791.192 y patente de EE.UU. Nº 4.179.337.

Humanización y variantes de secuencias de aminoácidos

Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD40 mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el DNA del anticuerpo anti-CD40, o por síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de

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aminoácidos de los anticuerpos anti-CD40 de los ejemplos proporcionados en la presente memoria. Se realiza cualquier combinación de deleciones, inserciones y sustituciones para conseguir la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales del anticuerpo anti-CD40 humanizado o variante, tal como cambiando el número de posición de sitios de glucosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo anti-CD40 que son localizaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis mediante alanina," como se describe por Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). En este caso, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (típicamente alanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno CD40. Después se refinan las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones mediante la introducción de variantes adicionales u otras variantes en o para sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido está predeterminado, no necesita predeterminarse la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se realiza mutagénesis mediante alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se exploran las variantes de anticuerpo anti-CD40 expresadas con respecto a la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino-y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o múltiples restos aminoacídicos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-CD40 fusionado a un marcador de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-CD40 incluyen una fusión al extremo C-terminal Nor del anticuerpo anti-CD40 de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un resto aminoacídico en la molécula de anticuerpo anti-CD40 retirada y un resto diferente insertado en su sitio. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. En la Tabla 5 se proporcionan sustituciones conservadoras bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares", o como se describe más adelante en relación con las clases de aminoácidos, y pueden explorarse los productos.

TABLA 5:

Residuo Original

Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas

Ala (A)

val; leu; ile val

Arg (R)

lys; gln; asn lys

Asn (N)

gin; his; asp, lys; arg gln

Asp (D)

glu; asn glu

Cys (C)

ser; ala ser

Gln (Q)

asn; glu asn

Glu (E)

asp; gln asp

Gly (G)

ala ala

His (H)

arg; asn; gln; lys; arg

Ile (I)

leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L)

ile; norleucina; val; met; ala; phe ile

Lys (K)

arg; gln; asn arg

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Residuo Original

Sustituciones ejemplares Sustituciones preferidas

Met (M)

leu; phe; ile leu

Phe (F)

tyr; leu; val; ile; ala; tyr

Pro (P)

ala ala

Ser (S)

thr thr

Thr (T)

ser ser

Trp (W)

tyr; phe tyr

Tyr (Y)

phe; trp; thr; ser phe

Val (V)

leu; ile; met; phe ala; norleucina; leu

En la química de proteínas, generalmente se acepta que las propiedades biológicas del anticuerpo se pueden lograr seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre al mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo , como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1)

hidrófoba: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrófila neutra: cys, ser, thr;

(3)

ácida: asp, glu;

(4)

básica: asn, gin, his, lys, arg;

(5)

restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromática: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras incluirán cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

También puede sustituirse cualquier resto de cisteína no implicada en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo humanizado anti-CD40 o variante, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula, prevenir el entrecruzamiento aberrante o proporcionar puntos de conjugación establecidos con un compuesto citotóxico o citostático. Por el contrario, puede añadirse uno o más enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más restos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrán mejores propiedades biológicas que el anticuerpo parental a partir del cual se generaron. Una forma conveniente para generar estas variantes de sustitución es mediante maduración de afinidad usando presentación en fagos. En resumen, se hacen mutar varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se manifiestan de una manera monovalente en partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III del fago M13 empaquetados dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos después se exploran con respecto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Para identificar sitios de regiones hipervariables candidatas para la modificación, puede realizarse mutagénesis mediante alanina para identificar restos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa,

o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo CD40 y Dabigatrán humano. Estos restos de contacto y los restos próximos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez que se han generado estas variantes, el panel de variantes se somete a la exploración como se describe en la presente memoria y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo adicional.

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EP 402.226); Pichia pastors (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedantes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedantes adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-CD40 humanizado, glucosilado derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos, incluyendo, p. ej., numerosas cepas baculovíricas y variantes, y las correspondientes células hospedantes de insectos permisivas como Spodoptera frugiperda (cienpies), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca mediterránea) y Bombyx mori (gusano de seda). Una variedad de cepas para transfección se encuentra públicamente disponible, p. ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden usar, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden emplearse como hospedantes.

En otro aspecto, la expresión de anti-CD40 humanizado se lleva a cabo en células de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina, y las técnicas se encuentran muy disponibles. Los ejemplos de líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles son la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10), células de ovario de hámster chino/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; p. ej., DG44), células sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70), células renales del mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34), células hepáticas de rata y búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51), células TR1 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), células MRC 5, células FS4 y línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospedantes se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para producción del anticuerpo anti-CD40 humanizado y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o ampliar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospedantes utilizadas para producir un anticuerpo anti-CD40 humanizado descritas en la presente memoria se pueden cultivar en una diversidad de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Medio Esencial Mínimo (Minimal Essential Medium o MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) y Medio Eagle Modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle's Medium o DMEM), Sigma-Aldrich Co.) son adecuados para cultivar las células hospedantes. Además, cualquiera de los medios descritos en uno o más de Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, patentes estadounidenses No. 4.767.704, No. 4.657.866, No. 4.927.762, No. 4.560.655, No. 5.122.469, documentos WO 90/103430 y WO 87/00195 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células hospedantes. Cualquiera de estos medios puede enriquecerse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y potasio), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Pueden incluirse también otros complementos necesarios en concentraciones adecuadas que sean conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como de temperatura, pH y similares, son aquellas previamente empleadas con la célula hospedante seleccionada, y serán obvias para el experto en la materia.

Cuando se usen técnicas recombinantes, el anticuerpo podrá producirse de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o segregarse directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido de manera intracelular, las células pueden romperse para liberar proteína como una primera etapa. Los restos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, pueden eliminarse, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, se congela pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los sedimentos celulares se eliminan por centrifugación. Si el anticuerpo se segrega en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas previas para inhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el desarrollo de contaminantes fortuitos. Se puede emplear una diversidad de métodos para aislar el anticuerpo de la célula hospedante.

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Takayasu, polimialgia reumática, arteritis temporal, esquistosomiasis, arteritis de células gigantes, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, eczema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Caplan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, psoriasis, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis, ciclitis crónica, ciclitis de Fuch, nefropatía por IgA, púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo a trasplante, cardiomiopatía, síndrome de Eaton-Lambert, policondritis recidivante, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, síndrome de Evan, síndrome de dificultad respiratoria, inflamación pulmonar, osteoporosis, hipersensibilidad del tipo demorada y falla gonadal autoinmunitaria.

Por consiguiente, los métodos descritos en la presente memoria abarcan el tratamiento de trastornos de los linfocitos B (p. ej., lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes de tipo I), de los linfocitos Th1 (p. ej., artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, tuberculosis o enfermedad injerto contra hospedante) o de los linfocitos Th2 (p. ej., dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico, asma atópica rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica o enfermedad de injerto contra hospedante crónica). En general, los trastornos que implican células dendríticas abarcan trastornos de los linfocitos Th1 o Th2.

La artritis reumatoide (RA) es una de las enfermedades autoinmunitarias inflamatorias más comunes que afecta a aproximadamente 1% de la población. Si bien existen tratamientos eficaces (p. ej., . MTX y agentes anti-TNF), existe una gran necesidad médica no satisfecha, especialmente para aquellos pacientes que no responden adecuadamente a las terapias anti-TNF (aproximadamente 30% de los pacientes). Además, hasta 50% de los pacientes discontinúan el tratamiento con antagonistas de TNF dentro de los 5 años, principalmente debido a los eventos adversos, pero también porque un número cada vez mayor de pacientes pierde el beneficio terapéutico. Por lo tanto, es importante establecer terapias eficaces que se dirijan a la inflamación y a la destrucción articular en RA pero que no dependan exclusivamente de la inhibición directa de TNF. Un planteamiento muy atractivo consiste en dirigir las vías celulares coestimuladoras. Uno de los pares receptor-ligando claves en la coestimulación es CD40/CD40L. Este sistema permite interacciones entre células inmunitarias y entre células inmunitarias y no inmunitarias, las cuales son todas importantes en la patogénesis de la RA. El bloqueo de CD40 con un anticuerpo antagonista de la presente invención puede tener uno o más de los siguientes efectos en RA:

1) Inhibir la diferenciación de células B y el cambio de isotipo del anticuerpo;

2) Inhibir la producción de citocinas y quimiocinas y el aumento de moléculas de adhesión en células T y macrófagos;

3) Inhibir la activación de células dendríticas; e

4) Inhibir la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas, metaloproteinasas de matriz, prostaglandina, y reducir las moléculas de adhesión en células no inmunitarias (p. ej., células epiteliales, endoteliales y mesenquimales).

Los usos terapéuticos que logran uno o más de los efectos anteriores se contemplan expresamente en este documento. Además de RA, las composiciones de la presente invención serán particularmente útiles en el tratamiento de la esclerosis múltiple, la psoriasis (incluida la artritis psoriásica), la artritis reumatoide juvenil. enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso sistémico y trasplante de órgano sólido.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad autoinmunitaria crónica y sistémica con una prevalencia de aproximadamente 1% en adultos. La enfermedad sigue causando una importante morbilidad y mortalidad prematura (la mortalidad se debe predominantemente a enfermedad cardiovascular acelerada). Se ha identificado que el daño articular ocurre muy temprano en el curso de la enfermedad, donde hasta 30% de los pacientes exhiben datos radiográficos de erosiones óseas al momento del diagnóstico, aumentando hasta 60% después del primer año. Las pautas actuales recomiendan iniciar la terapia con fármacos antirreumáticos tradicionales modificadores de la enfermedad (DMARD) dentro de los 3 meses de haber establecido un diagnóstico definitivo. Las DMARD tienen el potencial de reducir o prevenir el daño articular y conservar la función articular. Actualmente, los reumatólogos seleccionan el metotrexato (MTX) como la terapia DMARD inicial para la mayoría de los pacientes.

Los antagonista de TNF etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®), el antagonista de CTLA4 abatacept (Orencia®), el receptor anti-IL-6 mAb tocilizumab y el anti-CD20 mAb rituximab (Rituxan®) son eficaces en el tratamiento de RA. Las pautas actuales en general recomiendan usar DMARD biológicas para el tratamiento de RA activa después de una respuesta inadecuada a las DMARD tradicionales.

Estudios recientes en pacientes con RA progresiva temprana sin tratamiento previo con MTX demostraron que la combinación de MTX con un antagonista de TNF fue superior a cada uno de ellos utilizados como monoterapia. El resultado más asombroso fue el significativo beneficio radiológico de la terapia combinada. Por lo tanto, la combinación de MTX e inhibidores de TNF debería usarse en pacientes con el mayor riesgo de enfermedad agresiva y fenotipo agresivo (p. ej., alto puntaje de actividad, debilitación funcional, seropositividad para el factor reumatoide (RF) o anticuerpo peptídico citrulinado (CCP), CRP elevado, erosiones radiográficas). Sin embargo, anticipamos que

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En realizaciones específicas, el agente citotóxico es un ligando de unión al surco menor de DNA. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.130.237). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ligando de unión al surco menor es un compuesto CBI. En otras realizaciones, el ligando de unión al surco menor es una enediina (p. ej., caliqueamicina).

Los ejemplos de agentes antitubulina incluyen, aunque sin limitarse a ello, taxanos (p. ej., Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), vinca-alcaloides (p. ej., vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina), y dolastatinas (p. ej., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (p. ej., epotilona A y B), nocodazol, colquicina y colcimid, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermólido y eleuterobina.

En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes anti-tubulina. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131).

En algunas realizaciones, el agente terapéutico no es un radioisótopo.

En algunas realizaciones, el agente citotóxico o inmunosupresor es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (p. ej., azotioprina o micofenolato mofetil), un inhibidor de dihidrofolato reductasa (p. ej., metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, citidina arabinósido, amantadina, didesoxiuridina, yododesoxiuridina, poscamet o trifluridina.

En otras realizaciones, el agente citotóxico o inmunosupresor es tacrolimus, ciclosporina o rapamicina. En otras realizaciones, el agente citotóxico es aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido de arsénico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoetin alfa, Denileukin diftitox, dexrazoxana, dromostanolona propionato, epirrubicina, Epoetin alfa, estramustina, exemestano, Filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamician, goserelina, idarrubicina, ifosfamida, imatinib mesilato, Interferón alfa-2a, irinotecán, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina o mostaza de nitrógeno, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsalen, mitomicina C, mitotano, nandrolona fenpropionato, oprelvekin, oxaliplatino, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pentostatina, pipobroman, plicamicina, porfímero sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicasa, revlimid, Sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testolactona, tioguanina, toremifeno, Tositumomab, Trastuzumab, tretinoína, mostaza de uracilo, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina y zoledronato.

En realizaciones adicionales, el fármaco es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado. RITUXAN (rituximab; Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.); un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; un anticuerpo IgG2a murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; un anticuerpo quimérico anti-EGFR IgG); Vitaxin (MedImmune, Inc., MD); Campath I/H (Leukosite, MA; un anticuerpo IgG1 humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-CD33 IgG humanizado); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; un anticuerpo anti-CD22 IgG humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-Dr10 murino radiomarcado); Allomune (BioTransplant, CA; un anti-CD2 mAb humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; un anticuerpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ and Amgen, CA; un anticuerpo anti-CD22); y CEAcide (Immunomedics, NJ; un anticuerpo anti-CEA humanizado).

Otros anticuerpos adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos contra los siguientes antígenos: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, alfafetoproteína, CA 242, fosfatasa alcalina placentaria, antígeno específico de próstata, fosfatasa de ácido prostático, factor de crecimiento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor antitransferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, antígeno específico de próstata, receptor de IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22, gonadotropina coriónica humana, CD38, mucina, P21, MPG y producto oncogénico Neu.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetil o metotrexato. Alternativamente, el agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide (p. ej., cortisol o aldosterona) o un análogo de glucocorticoides (p. ej., prednisona o dexametasona).

Los inhibidores de cicloxigenasa adecuados incluyen ácido meclofenámico, ácido mefenámico, carprofeno, diclofenac, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetin y ácido acetilsalicílico.

Los inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores redox (por ejemplo, derivados de catecol-butano, ácido nordihidroguayarético (NDGA), masoprocol, fenidona, lanopaleno, indazolinonas, nafazatrón, benzofuranol, alquilhidroxilamina), e inhibidores no redox (por ejemplo, hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos y sus derivados, metoxitetrahidropirano, ácidos boswélicos y derivados acetilados de ácidos boswélicos, y ácidos quinolinmetoxifenilacéticos sustituidos con radicales cicloalquilo) y precursores de inhibidores redox.

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo A (Cadena pesada, IgG1KO)

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Anticuerpo A (Cadena Pesada, IgGl)

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Anticuerpo A (Cadena pesada, IgG4DM)

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo A (Pesada, IgG1KOb)

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Anticuerpo B (Cadena ligera)

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Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG1KO)

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Anticuerpo B (Cadena Pesada, IgGl)

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG4 DM)

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Anticuerpo B (Cadena pesada, IgG1KOb)

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Anticuerpo C (Cadena ligera)

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Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG1KO)

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Identidad

Secuencia SEC ID NO:

Anticuerpo C (Cadena Pesada, IgGl)

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Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG4 DM)

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Anticuerpo C (Cadena pesada, IgG1KOb)

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Las diversas regiones se subclonaron en uno o dos vectores de expresión de IgG adecuados:

A) un formato IgG1-KO humano (knock-out)/kappa con una mutación doble Leu234Ala, Leu235Ala en la región Fc para reducir la función efectora tal como FcγR y la unión del complemento B) un formato IgG4-DM humano (doble mutante)/kappa con una mutación Ser228Pro en la región bisagra para

reducir la ocurrencia de medias moléculas de IgG4 y una mutación Leu235Glu para reducir aún más la unión de FcγR Los dos candidatos de Anticuerpo A y Anticuerpo B se purificaron y evaluaron mediante los siguientes criterios: Aspecto de CCF (turbidez)

Propiedades de filtración de CCF Rendimiento en rProteinA Turbiedad tras elución y neutralización Agregados solubles (SEC)

5 Patrón de pureza/contaminación (SDS) Patrón de carga (IEF)

Ejemplo 2: Datos in vitro

El Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C se caracterizaron junto con los anticuerpos 4D11 (Kirin/ Astellas) y PG102 (PanGenetics) que se produjeron en base a secuencias publicadas. Los datos para el Anticuerpo, Anticuerpo B,

10 Anticuerpo C y 4D11 se muestran a continuación. PG-102 exhibió actividad agonista y solamente inhibición incompleta de proliferación de células B (no se muestra). La Tabla 2.2. resume los datos obtenidos. A continuación de la Tabla 2.2 se expone una descripción más detallada de los datos.

Tabla 2.2. Resumen de los datos in vitro del Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C y anticuerpo 4D11 anti-CD40 de Kirin.

Parámetro/Ensayo

Anticuerpo A Anticuerpo B Anticuerpo C 4D11

Kd +/-suero hu.

<100 pM <100 pM <100 pM <100 pM

Unión celular (EC50/nM ± SD

1,2 (±0,28) 1,5 (±0,68) 1,7 (±0,28) 0,9 (±0,3)

Proliferación de células B:Antagonismo (IC50/nM±SD)

0,3 (±0,13) 0,2 (±0.10) 0,1 (±0,004) 0,03 (±0,02)

Proliferación de células B:Agonismo (SI*) (IC50/nM±SD)

Sin agonismo (SI <2) Sin agonismo (SI <2) Sin agonismo (SI <2) Sin agonismo (SI <2)

Células dendríticas/IL-12/23p40 Antagonismo (IC50/nM ± SD)

< 1nM < 1nM < 1nM < 1nM

Células dendríticas/IL-12/23p40 Agonismo

Sin agonismo Sin agonismo Sin agonismo Sin agonismo

Reacción cruzada de especies.: Unión Hu/Cyno (relaciones EC50**)

3 2 1 No ensayado

* SI, índice de estimulación; ** Relación > 1 significa mayor unión a Cyno en comparación con humanos

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A. Unión de anticuerpos humanizados a la proteína CD40 celular y CD40 recombinante

La unión específica de anticuerpos humanizados a CD40 celular se analizó por citometría de flujo usando células HEK293 transfectadas con CD40 humana. Se observó la unión dependiente de la concentración de Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C. Los anticuerpos exhibieron un perfil de unión similar en la Figura 1B. Los valores de 20 EC50 de los anticuerpos de la presente invención y del anticuerpo 4D11 de Kirin están todos en el mismo rango de ∼1 nM que es muy probable que esté en el límite de sensibilidad del ensayo debido a los altos niveles de CD40 en las células transfectadas. La unión específica de anticuerpos humanizados a CD40 celular en células Ramos humanas también demostró unión dependiente de la concentración. Los anticuerpos exhibieron perfiles de unión levemente diferentes (se muestran en la Figura 2) y valores CE50 entre 0,21-1,22 nM. No se detectó unión en

25 células CD40 negativas tales como las células HEK293 no transfectadas o la línea de células T HSB-2, confirmando así la unión selectiva a CD40 (no se muestran los datos).

La afinidad de unión del Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C a la proteína CD40-Fc humana se midió mediante el octeto ForteBio y reveló constantes de disociación (KD) de <100 pM. Debido a la avidez de bivalencia del anticuerpo y CD40-Fc los efectos evitan que se determinen precisamente Kds debajo de 100 pM. Además, la unión a

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Claims (1)

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