KR101760242B1 - 항-ｃｄ40 항체 - Google Patents

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스캇 브로더
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토비아스 리첸버거
산자야 싱
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베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
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Abstract

본 발명은 신규 사람화된 길항성 항-CD40 항체 및 이를 사용하는 치료학적 및 진단학적 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

항-ＣＤ40 항체{ANTI-CD40 ANTIBODIES}
본 발명은 일반적으로 진단 및 치료용의 사람화된 항-CD40 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, CD40을 발현하는 세포에 의해 특징화되는 다양한 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 사람화된 항-CD40 항체 및 이의 사용 방법이 기재되어 있다. 사람화된 항-CD40 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 또한 기재되어 있다.
CD40은 48kDa의 I형 막관통(Integral membrane) 당단백질이고 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. CD40은 정상 및 신생물성 B 세포, 상호 맞물림 세포(interdigitating cell), 암종, 상피 세포(예를 들어, 각질 세포), 섬유아세포(예를 들어, 활막세포) 및 혈소판을 포함하는 다양한 세포 유형 상에서 발현된다. 또한, 이것은 단핵구, 마크로파지, 일부 내피 세포 및 소포성 수지상 세포 상에 존재한다. CD40은 초기에 B 세포 개체 발생에서 발현되는데, CD10 및 CD19의 출현에 이어서, 그러나 CD21, CD23 및 CD24의 발현 및 표면 면역글로불린 M(sIgM)의 출현 전에 B 세포 전구체 상에 나타난다(문헌참조: Uckun et al., 1990, Blood 15:2449). CD40은 또한 편도선 및 골수-유도된 혈장 세포 상에서 검출되었다(문헌참조: Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84:2597).
CD40의 리간드는 TNF 슈퍼패밀리 구성원인 CD40L(또한 CD154, gp39, 및 TRAP로서 언급됨)이다. CD40L은 활성화된 CD4+ T 세포 및 작은 서브세트의 CD8+ T 세포 상에서 주로 발현되는 막관통(transmembrane) 단백질이다(문헌참조: Van Kooten C. and Banchereau, 2000).
CD40과 CD40L의 상호작용은 체액성 및 세포-매개 면역 반응 둘 다를 유도한다. CD40은 상기 리간드-수용체 쌍을 조절하여 B 세포, 및 수지상 세포(DC)를 포함하는 다른 항원-제시 세포(APC)를 활성화시킨다(문헌참조: Toubi and Shoenfeld, 2004); (Kiener, et al., 1995). B 세포 상에서의 CD40의 기능이 광범위하게 연구되어 왔다. B 세포 상에서 CD40의 활성화는 증식, 항체 분비 세포로의 분화 및 2차 림프 기관의 배 중심(germinal center) 내의 이소형 스위칭을 유도한다. 시험관내 연구는 사이토킨 생산(IL-6, IL-10, TNF-α, LT-α), 접착 분자 및 공동자극 수용체(ICAM, CD23, CD80 및 CD86)의 발현, 및 B 림프구에 의한 MHC 부류 I, MHC 부류 II, 및 TAP 수송체의 증가된 발현에 대한 CD40 활성화의 직접적인 효과를 보여주었다(문헌참조: Liu, et al., 1996). 이들 과정의 대부분을 위해, CD40은 사이토킨 또는 다른 수용체-리간드 상호작용과 협력하여 작용한다.
단핵구 및 DC 상의 CD40 시그널 전달은 사이토킨(IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α 및 MIP-1α)의 분비 뿐만 아니라 생존율을 향상시킨다. 이들 APC에 대한 CD40 라이게이션은 또한 ICAM-1, LFA-3, CD80, 및 CD86과 같은 공동자극 분자의 상향조절을 유도한다. CD40 수용체의 활성화는 DC를, T 세포 활성화를 구동시키는 효율적인 APC로 완전히 성숙시키는 중요한 시그널 중 하나 이다(문헌참조: Banchereau and Steinman, 1998) (Van Kooten C. and Banchereau, 2000).
마우스 모델에서의 최근 연구는 수지상 세포에 대한 CD40 시그널 전달이 또한 관절염 및 다발성 경화증과 같은 질환에서 자가면역의 매개체로서 고려되는 TH17 세포의 생성에 중요한 역할을 수행함을 보여주었다(문헌참조: lezzi, et al., 2009) (Perona-Wright, et al., 2009).
효능성 및 길항성 항-마우스 항체 뿐만 아니라 CD40 및 CD40L 녹아웃 마우스의 유용성은 여러 질환 모델에서 CD40-CD40L 상호작용의 역할을 연구하기 위한 가능성을 제공하였다. 차단 항-CD40L의 투여는 SNF1 마우스에서의 홍반성 신염 또는 NOD 마우스에서의 당뇨병과 같은 자연발생 질환을 포함하는 자가면역의 여러 모델 또는 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 또는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)과 같은 실험적으로 유도된 형태의 질환에서 이로운 것으로 입증되었다(문헌참조: Toubi and Shoenfeld, 2004). 마우스내 CIA는 연골 및 골의 침식 이외에 관절 염증의 발생, 콜라겐에 대한 혈청 항체 역가 및 염증 세포의 활막 조직으로의 침윤을 차단시키는 항-CD40L mAb에 의해 억제되었다(문헌참조: Durie, et al., 1993). 홍반성 신염 및 EAE 둘 다에 대해, 항-CD40L이 또한 진행 중인 질환을 완화시킬 수 있는 것으로 입증되었고, 이는 상기 질환의 이펙터 단계에서 CD40-CD40L의 역할을 확인시켜준다(문헌참조: Kalled, et al., 1998); (Howard, et al., 1999).
EAE의 발병에서 CD40-CD40L 상호작용에 대한 역할은 또한 미엘린 염기성 단백질에 특이적인 유전자전이 T 세포 수용체를 갖는 CD40L-결핍 마우스에서 연구되었다. 이들 마우스는 항원을 사용한 프라이밍 후 EAE를 발병하는데 실패하였고 CD4+ T 세포는 휴지 상태(quiescent)로 유지되었고 INF-γ를 생성시키지 않았다(문헌참조: Grewal, et al., 1996).
또한, CD40에 대해 지시된 억제성 항체는 EAE와 같은 염증성 질환 모델에서 이로운 효과를 나타내었다. 라만 및 동료들(Lamann 및 colleagues)은 길항성 마우스 항-사람 CD40 mAb mu5D12및 상기 mAb의 키메라 버젼이 이계교배(outbred) 마모세트 원숭이에서 만성 탈수초성 EAE의 임상적 발현을 효과적으로 예방함을 입증하였다(문헌참조: Laman, et al., 2002); (Boon, et al., 2001). 후속 연구는, 키메라 항-사람 CD40 항체를 사용한 치료학적 처치가 마모세트 EAE 모델에서, MRI-검출가능한 염증을 감소시키고 기존 뇌 병변의 확대를 지연시킴을 보여주었다(문헌참조: Hart, et al., 2005).
효능성 활성을 갖는 항-CD40 항체는 일부 모순되는 결과를 갖는 관절염의 마우스 모델에서 시험되었다. 면역자극제에 대해 예상되는 바와 같이, 상기 효능성 항-마우스 CD40 mAb FGK45는 CIA의 DBA/1 마우스 모델에서 질환을 악화시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Tellander, et al., 2000). 그러나, 다른 만성 CIA 모델 FGK45 및 다른 효능성 항-마우스 CD40 mAb, 3/23에서, 상기 둘 다는 양성 치료학적 효과를 나타냈다(문헌참조: Mauri, et al., 2000). 이러한 그룹에 의해 상기 치료학적 처치 계획에서 효능성 항체가 IFN-γ의 감소된 수준 및 IL-4 및 IL-10의 증가된 수준과 함께 Th2 반응쪽으로의 면역 이탈을 유도함에 의한 이로운 효과를 갖는 것으로 추정되었다(문헌참조: Mauri, et al., 2000).
CD40/CD154 상호작용을 차단시킴에 의한 이식 거부의 예방이 또한 보고되었다. 레서스 원숭이에서의 신장 동종이식(allograft) 연구에서 키메라 항-CD40 길항제인 ch5D12의 사용은 CD40의 길항작용이 질환 변형 및 평균 생존 시간을 100일 초과로 연장시키는데 충분함을 나타낸다. ch5D12가 항-CD86 항체와 조합되고 동종이식 연구 개시 시점에서만 투여되고 사이클로스포린을 사용한 연장된 치료가 수행되는 경우, 4년 초과의 평균 생존 시간이 성취되었고, 이는 상기 조합이 잠재적으로 내성을 유도할 수 있음을 나타낸다(문헌참조: Haanstra, et al., 2005).
따라서, 효율적인 T 세포-의존성 면역 반응을 구동시키는데 있어서 CD40-CD40L 다이애드(dyad)의 주요 역할에 대한 증거를 제공하는 충분한 임상전 연구가 존재한다. 따라서, CD40 시그널 전달의 차단이 RA, 다발성 경화증 또는 건선과 같은 질환에서 병원성 자가면역 질환을 억제하기 위해 적합하고 요구되는 치료학적 전략으로서 인지된다. 그러나, 지금까지, 이전에 개발된 항-CD40 항체가 상당한 부작용을 갖는 것으로 나타난 발견으로 인해 상기 장애의 치료학적 중재를 위해 승인된 CD40 항체는 존재하지 않는다. 따라서, CD40-CD40L의 작용에 간섭하여 CD40 시그널 전달을 차단하기 위해 사용될 수 있는 치료제에 대한 상당한 요구가 남아 있다. 상기 요구는 CD40에 특이적으로 결합하고 항원 결합 특이성, 친화성 및 약동학적 및 약력학적 성질을 나타내어 CD40 기반 장애의 치료학적 개입에 사용되는 새로운 사람화된 항-CD40 항체에 의해 해결될 수 있다.
본 발명은 1nM 미만의 IC50의 길항 작용 활성을 갖는 사람 CD40에 특이적으로 결합하고 B 세포 증식에서 100㎍/ml 이하의 효능 작용을 갖지 않는 사람화된 모노클로날 항체를 제공하고, 여기에서 상기 항체는 추가로, 비-사람 영장류에서 10일 이상의 생체내 반감기를 가짐을 특징으로 한다.
사람화된 모노클로날 항체는 추가로 상기 항체가 30mg/kg 미만의 용량에서 사이노몰거스 원숭이에 대해 8일 초과의 반감기를 가짐을 특징으로 할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 서열 및 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 사람화된 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 모노클로날 항체는 이것이 중쇄 및 경쇄를 포함함을 특징으로 하고, 여기에서 중쇄 CDR1 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 중쇄 CDR2 서열은 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 중쇄 CDR3 서열은 서열번호 16 내지 서열번호 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 경쇄 CDR1 서열은 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖고, 경쇄 CDR2 서열은 서열번호 22 내지 서열번호 23, 경쇄 CDR3 서열은 서열번호 24 내지 서열번호 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 모노클로날 항체는 이것이 서열번호 10의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 13의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 서열번호 19의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함함을 특징으로 한다.
다른 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 모노클로날 항체는 이것이 서열번호 9의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 서열번호 20의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함함을 특징으로 한다.
다른 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 모노클로날 항체는 이것이 서열번호 9의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 서열번호 20의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함함을 특징으로 한다.
다른 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 모노클로날 항체는 이것이 서열번호 11의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 15의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 17의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 서열번호 21의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 23의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3 서열을 포함함을 특징으로 한다.
또한, 발명의 바람직한 항체의 중쇄에 대한 개별 서열이 본원에 기재되어 있다. 본 발명은 예를 들어, 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-CD4 항체에 관한 것이다. 상기 항-CD40 항체는 추가로 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함함을 특징으로 한다.
또한, 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편이 고려된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 27 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 28 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 29 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 30 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 32 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 33 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 34 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 35 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 37 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 38 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 39 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태는 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30의 사람 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 골격 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포함하는 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상응하는 서열번호 26의 경쇄 가변 도메인과 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 사람 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다.
다른 실시형태는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 사람 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 골격 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포함하는 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상응하는 서열번호 31의 경쇄 가변 도메인과 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 사람 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기 진전 실시형태에 기재된 상기 분리된 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이고, 여기에서 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 32이고, 다른 실시형태에서 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 33이고, 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 34이고, 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 35이다.
또한, 서열번호 37, 서열번호 38; 서열번호 39 또는 서열번호 40의 사람 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 골격 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포함하는 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상응하는 서열번호 36의 경쇄와 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 사람 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편이 고려된다.
다른 양상에서, 본 발명은 상기 직전 실시형태에 기재된 분리된 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이고, 여기에서 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 37이고; 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 38이고; 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 39이고; 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 40이다.
본 발명의 항체는 추가로 상기 항체가 CD40L의 부재 하에 B 세포로부터 사이토킨의 생성을 자극시키는데 실패함을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 항체는 추가로 상기 항체가 2배 미만의 결합 속도(on rate)의 감소를 갖는 50% 사람 혈청의 존재 하에 사람 CD40에 결합함을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 항체는 추가로 상기 항체가 1mg/kg의 농도로 포유동물에서 IgM 및 IgG의 생산을 억제시킴을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 항체는 다양한 치료학적, 예방학적, 진단학적 및 기타 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 포유동물에서 CD40 매개된 면역 반응을 차단하기에 충분한 양으로 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 사람 CD40의 기능을 차단하는 방법을 기재하고 있다.
또한, 본원에서 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환의 증상들 중 하나 이상을 감소시키기에 충분한 양으로 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 완화시키는 방법이 고려된다.
예를 들어, 자가면역 또는 염증성 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염(proliferative lupus glomerulonephritis), 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura)(ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종(primary myxoedema), 갑상선 중독증/그레이브 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군(Good pasture's syndrome), 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HB Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 연결 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염을 포함할 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 예시적인 실시형태에서, 상기 포유동물은 류마티스 관절염을 갖는다.
본 발명의 방법은 추가로 TNF-길항제, 질환-변형 항류마티스 약물, CTLA4-길항제, 항-IL-6 수용체 mAb 및 항-CD20 mAb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 치료제를 투여함을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 염증성 질환 또는 자가면역 질환은 CD40 및 CD20 둘 다를 발현하는 세포와 관련된 염증성 질환 또는 자가면역 질환이다.
특정 방법에서, 상기 치료는 비경구 투여 경로에 의해 항체 조성물을 투여함을 포함한다.
특정 방법에서, 상기 치료는 항체 조성물을 정맥내 또는 피하 투여함을 포함한다.
본 발명의 추가의 방법은 본 발명의 항-CD40 항체의 유효량을 사람 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 사람 환자에서 B 세포에 의한 항체 생산을 억제함을 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 사람 환자는 CD40-발현 세포와 관련된 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는다.
예시적 실시형태에서, 상기 사람 환자는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염, 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상선 중독증/그레이브 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HB Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 연결 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 질환을 앓는다.
본 발명의 다른 방법은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 세포에 투여함을 포함하는, 사람 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 것에 관한 것이고, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 사람 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40 항원으로의 결합은 세포의 성장 또는 분화를 억제한다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 CD40 관련된 장애를 갖는 피검체에게 투여함을 포함하는, CD40 관련된 장애를 갖는 피검체를 치료하는 방법이 고려되고, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 사람 CD40에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 CD40으로의 결합은 CD40 관련된 장애의 세포의 성장 또는 분화를 억제한다. 상기 세포는 B 림프아구 세포, 췌장, 폐 세포, 유방 세포, 난소 세포, 결장 세포, 전립선 세포, 피부 세포, 두경부 세포, 방광 세포, 골 세포 또는 신장 세포일 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.
세포의 성장 또는 분화를 억제하기 위한 치료 방법은 만성 림프구 백혈병, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 발덴스트룀 거대글로불린혈증 또는 카포시 육종에 대한 치료에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 세포에 투여함을 포함하는, 말초 B 세포의 고갈을 유도하는 방법이 고려되고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 사람 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40으로의 결합은 상기 세포 고갈을 유도한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 면역 장애를 갖는 피검체에게 투여한다. 예를 들어, 상기 면역 장애는 류마티스 관절염 또는 전신성 홍반성 낭창이다.
또한, 본 발명의 항체를 피검체에게 투여함을 포함하는, 상기 피검체에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법이 고려되고, 여기에서 상기 항체는 상기 피검체에서 CD40의 기능을 차단하는 길항성 항체이다.
바람직하게, 상기 항체는 상기 피검체에서 B 세포 분화 및 항체 이소형 스위칭을 억제하기 위한 유효량으로 투여된다.
다른 실시형태에서, 상기 항체는 상기 피검체에서 T-세포 및 마크로파지에서 접착 분자의 상향 조절 및 사이토킨 및 케모킨 생성을 억제하기 위한 유효량으로 투여된다. 바람직하게, 상기 항체는 상기 피검체에서 수지상 세포의 활성화를 억제하기 위한 유효량으로 투여된다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 상기 피검체에서 비-면역 세포의 접착 분자를 하향-조절하고 염증촉진성 사이토킨, 케모킨, 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 프로스타글란딘의 생성을 억제하기 위한 유효량으로 투여된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라(Enbrel/Humira)의 투여를 포함하는 치료 계획과 조합하여 투여된다.
치료요법을 받는 상기 피검체는 류마티스 관절염을 갖고 단독의 메토트렉세이트 치료에는 비반응성인 피검체이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 치료 계획과 함께 상기 피검체를 치료함을 포함한다.
본 발명의 방법은 추가로 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 단독의 메토트렉세이트, 단독의 엔브렐, 엔브렐 + 메토트렉세이트의 조합으로 치료하는 것에 우수한 효능을 가짐을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 추가로 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 메토트렉세이트에 대해 부적당한 반응을 갖는 환자에서 엔브렐 + MTX를 사용한 치료에 우수한 효능을 가짐을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 항-TNF 제제를 포함하는 치료 계획과 조합하여 투여된다.
특정 실시형태에서, 피검체는 류마티스 관절염을 갖고 단독의 항-TNF 제제를 사용한 치료에 비반응성인 피검체로서 특징화된다. 상기 실시형태에서, 상기 방법은 상기 길항성 항-CD40 항체와 조합된 항-TNF 제제와의 치료를 포함하는 치료 계획으로 상기 피검체를 치료함을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료는 항-TNF 제제를 사용한 치료에 우수한 효능을 갖는다.
여전히 다른 실시형태에서, 상기 방법은 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 단독의 항-TNF 제제에 부적당한 반응을 갖는 환자에서 오레니카 또는 리툭산을 사용한 치료에 우수한 효능을 가짐을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로 (i) 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 고려한다. 상기 조성물에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 세포독성 제제, PEG-캐리어, 효소 또는 마커와 같은 제2 제제에 유리하게 접합될 수 있다.
또한, 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 고려된다.
또한, 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 고려된다.
본 발명은 추가로 포유동물에서 사람 CD40의 기능을 차단하기 위한 약물의 제조를 위한 본원에 기재된 항체의 용도에 관한 것이고, 여기에서 상기 약물은 상기 포유동물에서 CD40 매개된 면역 반응을 차단한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 완화시키기 위한 약물의 제조에 관한 것이다.
예시적인 실시형태에서, 상기 약물은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염, 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상선 중독증/그레이브 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HB Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 연결 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 위해 제조된다.
일부 실시형태에서, 상기 약물은 추가로, TNF-길항제, 질환 변형 항류마티스 약물, CTLA4-길항제, 항-IL-6 수용체 mAb 및 항-CD20 mAb로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 치료제를 포함할 수 있다.
상기 약물은 비경구 경로 투여용으로 제조될 수 있다. 상기 약물은 정맥내 또는 피하용으로 제조될 수 있다.
다른 실시형태는 사람 환자에서 B 세포에 의한 항체 생성 억제용 약물을 제조하기 위한 본원에 기재된 항체의 용도를 고려한다.
다른 실시형태는 사람 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장 및/또는 분화를 억제하기 위한 약물의 제조를 위한 본원에 기재된 항체의 용도를 고려한다.
다른 실시형태는 CD40 관련된 장애를 갖는 피검체 치료용 약물을 제조하기 위한 본원에 기재된 항체의 용도를 고려하고, 여기에서 상기 약물에서 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40으로의 결합은 CD40 관련 장애의 세포의 성장 또는 분화를 억제한다.
상기 약물은 B 림프아구 세포, 췌장, 폐 세포, 유방 세포, 난소 세포, 결장 세포, 전립선 세포, 피부 세포, 두경부 세포, 방광 세포, 골 세포 또는 신장 세포로부터 선택되는 CD40 관련 장애의 세포의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
상기 약물은 만성 림프구 백혈병, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 발덴스트룀 거대글로불린혈증 또는 카포시 육종의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
다른 실시형태는 말초 B 세포의 고갈을 유도하기 위한 약물의 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도를 고려하고, 여기에서 상기 약물의 항체 또는 항원-결합 단편은 사람 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40 항원으로의 결합은 세포의 고갈을 유도한다.
상기 약물은 면역 장애를 갖는 피검체의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
상기 약물은 류마티스 관절염 또는 전신성 홍반성 낭창의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
다른 실시형태는 피검체에서 류마티스 관절염의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도를 고려한다.
상기 약물은 상기 피검체에서 B 세포 분화 및 항체 이소형 스위칭의 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
상기 약물은 상기 피검체에서 T-세포 및 마크로파지내 접착 분자의 상향 조절, 및 사이토킨 및 케모킨 생성의 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
상기 약물은 상기 피검체에서 수지상 세포의 활성화 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
상기 약물은 상기 피검체에서 비-면역 세포내 접착 분자의 하향 조절 및 염증촉진성 사이토킨, 케모킨, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 프로스타글란딘의 생성 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 약물은 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 치료 계획과 조합되어 투여되는 조합 약물로서 제조된다.
다른 실시형태에서, 상기 약물은 조합 약물로서 제조되고 본 발명의 항체를 포함하는 것 외에 상기 약물은 항-TNF 제제를 추가로 포함한다.
도 1: 도 1a. 유동 세포측정기에 의한 측정시 CD40 형질감염된 HEK-293 세포에 대한 사람화된 항체의 결합 곡선 및 상응하는 EC50 값. 도 1b. 유동 세포측정기에 의한 측정시 항체 A, 항체 B 및 항체 C의 CD40 형질감염된 HEK 세포로의 결합 비교. 하나의 실험에 대한 대표적인 데이터를 도시함.
도 2: 유동 세포측정기에 의한 측정시 RAMOS 세포에 대한 사람화된 항체의 결합 곡선 및 상응하는 EC50 값. 하나의 실험에 대한 대표적인 데이터를 도시함.
도 3: 사람 1차 B 세포 증식 검사에서 길항 작용 활성에 대한 마우스 및 사람화된 항체의 시험. (도 3a) 각각의 마우스 전구체 항체에 대한 대표적인 항체 역가 곡선 및 수득한 IC50 값을 도시함. 상기 공여자에 대한 대표적인 데이터를 도시함. (도 3b) 4D11과 비교하여, 다양한 사람화된 항-CD40 항체의 길항작용을 도시하는 억제 곡선의 오버레이.
도 4: 사람 1차 B 세포 증식 검사에서 길항성(IC50) 및 효능성(SI= 자극 지수) 활성에 대한 사람화된 항체를 시험한 결과의 요약. 비교를 위해, 다양한 항-CD40 항체, 4D11, G28.5 및 5D12를 도시함.
도 5: 사람 전혈 검사의 CD40 유도된 CD86 상향 조절의 억제를 위한 항체 B, 항체 A 및 항체 C의 시험. 비교를 위해, 상기 4D11 항-CD40 항체를 도시함. 상기 IgG1 이소형 대조군이 상기 검사에서 어떠한 효과도 나타내지 않음을 도시함. 하나의 공여자에 대한 대표적인 데이터를 도시함.
도 6: 사람 정제된 B 세포 및 사람 전혈에 대해 CD40 유도된 CD86 상향 조절의 억제를 위한 항체 B의 시험 결과의 요약. (A) IC50 및 (B) IC90 값 둘 다에서의 데이터를 도시함. 상기 IgG1 이소형 대조군이 양 검사에서 어떠한 효과를 나타내지 않음을 도시함. 다중 공여자에 대한 데이터(n = 4-5)를 표에 요약함.
도 7: 사이노몰거스 원숭이 전혈 검사에서 CD40 유도된 CD86 상향 조절의 억제를 위한 항체 B, 항체 A 및 항체 C의 시험. 상기 IgG1 이소형 대조군은 상기 검사에서 어떠한 효과도 나타내지 않음. 하나의 공여자에 대한 대표적인 데이터를 도시함.
도 8: 각각의 항체 1 및 10mg/kg의 투여 후 사이노몰거스 원숭이에서 항체 A(좌측 패널) 및 항체 B(우측 패널)에 대한 혈장 농도 시간 곡선. 상기 데이터는 각각의 항체에 대한 3개의 동물로의 투여를 요약한 것임.
도 9: (항체 B) 및 (항체 A)의 투여 전 및 각각의 항체를 사용한 치료 후 3개의 시점에서 사이노몰거스 원숭이 기원의 CD86-양성 B 세포 백분율[%]의 변화. 항체 B(상부 패널) 및 항체 A는 각각 3마리의 동물에게 1 mg/kg(좌측 패널) 또는 10 mg/kg(우측 패널)로 투여됨.
도 10: 1.25 x 106 사람 PBMC의 주사 후 2주째에 NSG 마우스에서 (도 10a) 사람 IgG 및 (도 10b) 사람 IgM 수준. 마우스는 사람 PBMC의 전달 하루 전에 1mg/kg의 용량으로 비히클, 이소형 대조군 및 항체 A, 항체 B 및 항체 C로 치료함.
도 11: 다양한 마우스 항-사람 CD40 항체의 사람 혈소판으로의 결합.
도 12: 전혈에서 사람 B 세포 및 혈소판에 대한 항체 B의 항-CD40 mAb 4D11로의 결합 비교 결과에 대한 요약.
도 13: 야생형 및 녹아웃 IgG1 작제물을 사용한 ADCC 활성
CD40 매개된 시그널 전달은 현재 다양한 표적 장애에 관여하는 것으로서 인지되고 있다. 이들 장애에서의 중재가 치료학적으로 이로움을 보여주는 다양한 임상전 데이터의 유용성에도 불구하고, 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있는 길항작용성 항-CD40 항체가 요구되고 있다. 본 발명은 바람직한 실시형태에서 CD40을 인식하는 사람화된 항체에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 이들 사람화된 항체의 서열은 특정 리드(lead) 마우스 항체의 서열을 기반으로 동정되었다.
용어 "CD40" 및 "CD40 표면 항원"은 정상 B 세포 및 신생물성 B 세포의 표면 상에 발현되는 약 48kD의 당단백질을 나타내고, 이는 세포 증식 및 분화에 관여하는 시그널에 대한 수용체로서 작용한다(문헌참조: Ledbetter et al., 1987, J. Immunol. 138:788-785). CD40을 암호화하는 cDNA 분자는 버킷 림프종 세포주 라지(Raji)로부터 제조된 라이브러리로부터 분리되었다(문헌참조: Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8:1403).
본원에 사용된 바와 같이, CD40을 내인성으로 발현하는 세포는 CD40의 표면 발현을 특징으로 하는 임의의 세포이고, 정상 B 세포 및 신생물성 B 세포, 상호 맞물림 세포, 기저 상피 세포, 암종 세포, 마크로파지, 내피 세포, 소포성 수지상 세포, 편도선 세포 및 골수-유도된 혈장 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, CD40 분자는 사람 CD40 분자이다.
본 발명의 항체는 사람 재조합 및 천연 CD40에 특이적으로 결합한다. 1nM 미만의 IC50의 길항 작용 활성을 갖는 사람 CD40에 특이적으로 결합하고, B 세포 증식에서 100㎍/ml 이하의 효능 작용을 갖지 않는 사람화된 모노클로날 항체는 추가로 비-사람 영장류에서 10일 이상의 생체내 반감기를 가짐을 특징으로 한다.
바람직하게, 항체는 CD40-Fc 접합체의 CD40에 1nM 미만의 EC50으로 특이적으로 결합하고 CD40 발현 세포의 CD40에 2.5nM 미만의 EC50으로 특이적으로 결합한다. 항체의 길항 작용 성질은 이것이 1nM 미만의 IC50의 B 세포 또는 수지상 세포 길항 작용 활성을 갖는 것으로 정의된다. 상기 항체는 추가로 다른 항-CD40 항체(예를 들어, 항-CD40 항체 4D11)와 비교하여 증가된 생체내 반감기를 갖는 보다 우수한 약력학적 성질을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, CD40을 발현하는 세포는 CD40의 표면 발현을 특징으로 하는 임의의 세포이고, 정상 B 세포 및 신생물성 B 세포, 상호 맞물림 세포, 기저 상피 세포, 암종 세포, 마크로파지, 내피 세포, 소포성 수지상 세포, 편도선 세포 및 골수-유도된 혈장 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, CD40 분자는 사람 CD40 분자이다.
본 발명의 항체는 특이적 "CD40 항원 에피토프" 및 "CD40 에피토프"를 인식한다. 본원에 사용된 바와 같이 상기 용어는 항-CD40 항체와 면역반응할 수 있는 분자(예를 들어, 펩타이드) 또는 이 분자의 단편을 나타내고, 예를 들어, 서열번호 26의 경쇄와 서열번호 27, 28, 29 또는 30의 중쇄 중 어느 하나; 또는 서열번호 31의 경쇄와 서열번호 32, 33, 34 또는 35의 중쇄 중 어느 하나; 또는 서열번호 36의 경쇄와 서열번호 37, 38, 39 또는 40의 중쇄 중 어느 하나의 중쇄/경쇄 서열 조합을 갖는 항체 중 어느 하나에 의해 인식되는 CD40 항원 결정인자를 포함한다. CD40 항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편 또는 펩타이드 등에 포함될 수 있다. 상기 에피토프는 가장 일반적으로는 단백질, 짧은 올리고펩타이드, 올리고펩타이드 모사체(즉, CD40 항원의 항체 결합 성질을 모방하는 유기 화합물) 또는 이들의 조합체이다.
항체 또는 면역글로불린의 일반화된 구조는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이들 분자는 전형적으로 약 150,000 달톤이고, 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 공유 결합하여 이종이량체를 형성하고, 이종사량체 분자는 이종이량체의 2개의 동일한 중쇄간의 공유 디설파이드 결합을 통해 형성된다. 경쇄 및 중쇄는 하나의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합하지만, 2개의 중쇄간에 디설파이드 결합의 수는 면역글로불린 이소형에 따라 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격된 쇄 내의 디설파이드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노-말단에서 가변 도메인(VH)에 이어서 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3, 및 CH4), 및 CH1과 CH2 사이의 힌지 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(VL) 및 카복시-말단 불변 도메인(CL)을 갖는다. 상기 VL 도메인은 VH 도메인과 비공유 결합되어 있는 반면, 상기 CL 도메인은 통상적으로 디설파이드 결합을 통해 CH1 도메인에 공유 결합되어 있다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 사료된다(문헌참조: Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663.)
가변 도메인내 특정 도메인은 상이한 항체간에 상당한 차이가 있고, 즉 "초가변"이다. 이들 초가변 도메인은 특정 항원 결정인자에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관여하는 잔기들을 포함한다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서의 초가변성은 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 루프(HVL)로서 공지된 3개의 분절에 집중되어 있다. CDR은 문헌[참조: Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]의 서열 비교에 의해 정의되는 반면, HVL은 구조적으로 문헌[참조: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 기재된 바와 같은 가변 도메인의 3차원 구조에 따라 정의된다. 이들 2개의 방법이 약간 상이한 CDR의 동정을 유도하는 경우, 구조적 정의가 바람직하다. Kabat에 의해 정의된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인 내에서 CDR-L1은 약 24번 내지 34번 잔기에 위치하고, CDR-L2는 약 50번 내지 56번 잔기에 위치하고, CDR-L3은 약 89번 내지 97번 잔기에 위치하고; 중쇄 가변 도메인 내에서 CDR-H1은 약 31번 내지 35번 잔기에 위치하고, CDR-H2는 약 50번 내지 65번 잔기에 위치하고, CDR H3은 약 95번 내지 102번 잔기에 위치한다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 소정의 항체에 특이적인 독특하고 기능성 성질을 한정한다.
각각의 중쇄 및 경쇄 내에 3개의 CDR은 덜 가변적인 경향이 있는 서열을 함유하는 골격 영역(FR)에 의해 분리된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단에서 카복시 말단까지, FR 및 CDR은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 정렬되어 있다. FR의 대부분의 β-시트 입체 배치(configuration)는 각각의 쇄에서 CDR을 서로 근접하게 위치시키는 것뿐만 아니라 다른 쇄 기원의 CDR에도 근접하게 한다. 상기 수득한 입체 구조(conformation)는 항원 결합 부위에 기여하지만(문헌참조: Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669), 모든 CDR 잔기가 항원 결합에 필연적으로 직접 관여하는 것은 아니다.
FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지는 않지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 이펙터 기능을 매개한다. 몇몇 FR 잔기는 하기의 적어도 3가지 방식: 에피토프에의 직접적인 비공유 결합, 하나 이상의 CDR 잔기와의 상호작용, 및 중쇄 및 경쇄간의 계면에 영향을 미침에 의해 항원 결합에 대해 상당한 효과를 갖는 것으로 사료된다. 상기 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지는 않지만, 예를 들어, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC), 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포의 식세포작용(ADCP)에서 항체의 관여와 같은 다양한 Ig 이펙터 기능을 매개한다.
척추동물 면역글로불린의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 2개의 명백하게 구분되는 부류, 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나에 할당된다. 비교에 의해 포유동물 면역글로불린의 중쇄는 불변 도메인의 서열에 따라 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 중 하나에 할당된다. IgG 및 IgA는 추가로 아부류(이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 분류된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 호칭된다. 천연 면역글로불린 부류의 서브유니트 구조 및 3차원 입체 배치는 널리 공지되어 있다.
용어 "항체", "항-CD40 항체", "사람화된 항-CD40 항체", 및 "변이체 사람화된 항-CD40 항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예를 들어, 이특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, CD40 결합을 나타내는 가변 도메인 및 항체의 다른 부분들과 같은 항체 단편을 포함한다.
용어 "모노클로날 항체"(mAb)는 실질적으로 균일한 항체들의 집단의 항체를 나타내는데, 즉 상기 집단내 개별 항체는 최소량으로 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 결정인자, "에피토프"에 대해 지시되고, 고도로 특이적이다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 동일한 에피토프에 지시되는 실질적으로 균일한 집단의 항체의 지표이고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법(문헌참조: Kohler et al., 1975, Nature 256:495), 또는 당업계에 공지된 재조합 DNA 방법(문헌참조: 미국 특허 제4,816,567호), 또는 문헌[참조: Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하고 파지 항체 라이브러리를 사용하여 재조합으로 제조되는 모노클로날의 분리 방법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 기술 또는 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
키메라 항체는 하나의 종(예를 들어, 비사람 포유동물, 예를 들어, 마우스) 기원의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 다른 종(예를 들어, 사람) 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어지고, 제1 종(예를 들어, 마우스) 기원의 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 제2 종(예를 들어, 사람) 기원의 항체의 불변 영역에 대한 DNA 서열에 연결하고 숙주를 상기 연결된 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환시켜 이것이 키메라 항체를 생성하도록 함에 의해 수득될 수 있다. 또한, 상기 키메라 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 영역 또는 도메인이 다른 면역글로불린 부류 또는 이소형 기원의 모노클로날 항체 또는 컨센서스 또는 생식선 서열로부터 기원하는 모노클로날 항체와 동일하거나 이에 상동성이거나 상기 상응하는 서열의 변이체인 항체일 수 있다. 키메라 항체는 이러한 항체의 단편을 포함할 수 있고, 단, 상기 항체 단편은 이의 모 항체의 목적하는 생물학적 활성을 나타내고, 예를 들어, 동일한 에피토프에 결합한다(문헌참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
용어 "항체 단편", "항-CD40 항체 단편", "사람화된 항-CD40 항체 단편", "변이체 사람화된 항-CD40 항체 단편"은 전장의 항-CD40 항체의 일부를 나타내고, 여기서, 가변 영역 또는 기능적 능력, 예를 들어, 특이적 CD40 에피토프 결합이 유지된다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체, 미니바디, 항체 단편으로부터 형성된 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
전장 항체는 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리하여 유용한 항체 단편을 생성시킬 수 있다. 파파인 분해를 사용하여 "Fab" 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원-결합 항체 단편을 생성시키고, 각각은 단일 항원-결합 부위 및 잔류 "Fc" 단편을 갖는다. 상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
Fab' 단편은 CH1 도메인의 C-말단에 항체 힌지 영역 기원의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 추가의 잔기 존재에 의해 Fab 단편과는 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결되는 Fab' 단편의 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"Fv" 단편은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 비공유적으로 단단히 결합되어 있는 이량체로 이루어진 완전한 항원-인식 및 결합 부위를 포함한다. 상기 입체 구조에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sc-Fv" 항체 단편은 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 쇄 Fv 변이체이다. 단일쇄 Fv는 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있다. 상기 scFv 폴리펩타이드는 임의로 또한 VH와 VL 도메인 사이에 위치하는 폴리펩타이드 링커를 포함하여 scFv에 의한 항원 결합을 위해 요구되는 3차원 구조의 형성을 촉진시킬 수 있다(문헌참조: Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315).
다른 인식된 항체 단편은 한쌍의 탠덤 Fd 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하여 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 것들을 포함한다. 이들 "선형 항체"는 예를 들어, 문헌[참조: Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기재된 바와 같이 이특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
사람화된 항체 또는 사람화된 항체 단편은 소정의 항원에 결합할 수 있고 실질적으로 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 FR 및 실질적으로 비-사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 아미노산 서열 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. 상기 비-사람 아미노산 서열은 흔히 "임포트(import)" 서열로서 언급되고 전형적으로 "임포트" 항체 도메인, 특히 가변 도메인으로부터 취해진다. 일반적으로, 사람화된 항체는 사람 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입되는, 비-사람 항체의 적어도 CDR 또는 HVL을 포함한다. 본 발명은 사람 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 표 3 및 표 4에 나타낸 뮤린 모노클로날 항체로부터 유도된 CDR을 함유하는 특이적 사람화된 항-CD40 항체를 기재한다. 이것은 특정 뮤린의 FR 잔기가 사람화된 항체의 기능에 중요할 수 있고 따라서 특정 사람 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기는 상응하는 뮤린 서열의 것들과 동일하도록 변형시키는 것으로 이해될 것이다.
다른 양상에서, 사람화된 항-CD40 항체는 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및 Fv 단편에 포함되는 바와 같음) 모두를 포함하고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-사람 면역글로불린의 CDR에 상응하고, 구체적으로 본원에서 모든 CDR은 본원의 하기의 표 1 내지 표 4에서 상세히 기재된 바와 같은 뮤린 서열이고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 사람 면역글로불린 컨센서스 또는 생식선 서열의 FR이다. 다른 양상에서, 사람화된 항-CD40 항체는 또한 면역글로불린 Fc 영역의 적어도 일부, 전형적으로 사람 면역글로불린의 일부를 포함한다. 통상적으로 상기 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄 둘 다를 포함할 것이다. 상기 항체는 또한 적절하게 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
사람화된 항-CD40 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함하는 임의의 이소형으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 불변 도메인은 사람화된 항체가 세포독성 활성을 나타내는 경우 보체 고정화 불변 도메인일 수 있고, 이소형이 전형적으로 IgG1이다. 상기 세포독성 활성이 바람직하지 않는 경우 상기 불변 도메인은 또 다른 이소형, 예를 들어, IgG2일 수 있다. 다른 사람화된 항-CD40 항체는 하나 이상의 면역글로불린 부류 또는 이소형 기원의 서열을 포함할 수 있고, 목적하는 이펙터 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 도메인을 선택하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 IgG1 항체이고 보다 구체적으로는 이펙터 기능이 녹아웃된 IgG1 항체인 항체를 제공한다.
사람화된 항-CD40 항체의 FR 및 CDR, 또는 HVL은 모 서열과 정확하게 상응할 필요는 없다. 예를 들어, 임포트 CDR 또는 HVL 또는 컨센서스 또는 생식선 FR 서열내 하나 이상의 잔기는 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형(예를 들어, 돌연변이)될 수 있어, 수득한 아미노산 잔기는 모 서열내 상응하는 위치에서 본래의 잔기와 더 이상 동일하지 않지만, 그럼에도 불구하고 상기 항체는 CD40에 결합하는 기능을 보유한다. 상기 변형은 전형적으로 광범위한 것이 아니고 보존적 변형일 것이다. 통상적으로, 사람화된 항체 잔기의 75% 이상, 보다 흔히 90% 이상 및 가장 흔하게는 95% 초과 또는 98% 초과 또는 99% 초과는 모 컨센서스 또는 생식선 FR 및 임포트 CDR 서열의 잔기와 상응할 것이다.
중쇄와 경쇄 가변 영역 간의 계면("VL-VH 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기는 서로에 대해 2개의 쇄의 근접성 또는 배향에 영향을 미치는 것들이다. 쇄간 상호작용에 포함될 수 있는 특정 잔기는 VL 잔기 34번, 36번, 38번, 44번, 46번, 87번, 89번, 91번, 96번, 및 98번 및 VH 잔기 35번, 37번, 39번, 45번, 47번, 91번, 93번, 95번, 100번, 및 103번(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)에 제시된 넘버링 시스템을 사용함)을 포함한다. 미국 특허 제6,407,213호는 또한 VL 잔기 43번 및 85번 및 VH 잔기 43번 및 60번과 같은 잔기들은 상기 상호작용에 포함될 수 있는 것으로 논의되었다. 이들 잔기들은 단지 사람 IgG에 대해 지적된 것이지만 이들은 다양한 종에 적용될 수 있다. 쇄간 상호작용에 포함될 것으로 합당하게 예상되는 중요한 항체 잔기들은 컨센서스 서열로의 치환을 위해 선택된다.
용어 "컨센서스 서열" 및 "컨센서스 항체"는 임의의 특정 부류, 이소형 또는 서브유니트 구조, 예를 들어, 사람 면역글로불린 가변 도메인의 모든 면역글로불린내 각각의 위치에서 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 언급한다. 상기 컨센서스 서열은 특정 종 또는 많은 종의 면역글로불린을 기준으로 할 수 있다. "컨센서스" 서열, 구조 또는 항체는 특정 실시형태에서 기재된 바와 같은 컨센서스 사람 서열을 포괄하고 임의의 특정 부류, 이소형 또는 서브유니트 구조의 모든 사람 면역글로불린내 각각의 위치에서 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 언급하는 것으로 이해된다. 따라서, 상기 컨센서스 서열은 각각의 위치에서 하나 이상의 공지된 면역글로불린 중에 존재하지만 임의의 단일 면역글로불린의 전체 아미노산 서열과 정확하게 동일할 수 없는 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 가변 영역 컨센서스 서열은 임의의 천연적으로 생성된 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득되지 않는다. 문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., and variants thereof]을 참조한다. 중쇄 및 경쇄 컨센서스 서열 및 이의 변이체의 FR은 사람화된 항-CD40 항체의 제조를 위해 유용한 서열을 제공한다. 문헌[예를 들어, 미국 특허 제6,037,454호 및 제6,054,297호]를 참조한다.
사람 생식선 서열은 사람 집단에서 천연적으로 발견된다. 상기 생식선 유전자의 조합은 항체 다양성을 생성시킨다. 항체의 경쇄에 대한 생식선 항체 서열은 보존된 사람 생식선 카파 또는 람다 v-유전자 및 j-유전자로부터 기원한다. 유사하게 중쇄 서열은 생식선 v-, d- 및 j-유전자로부터 기원한다(문헌참조: LeFranc, M-P, and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).
본원에 사용된 바와 같이, "변이체", "항-CD40 변이체", "사람화된 항-CD40 변이체", 또는 "변이체 사람화된 항-CD40" 각각은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 서열로부터 기원하는 적어도 중쇄 가변 뮤린 CDR 또는 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 쥐 모노클로날 항체로부터 유래된 경쇄 쥐 CDR 서열 및 사람 컨센서스 서열로부터 유도된 FR 서열을 갖는 사람화된 항-CD40 항체를 언급한다. 변이체는 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인중 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 것들을 포함하고, 단, 상기 아미노산 변화는 항체의 CD40으로의 결합을 실질적으로 손상시키지 않는다. 본원에서 제조되는 예시적인 사람화된 항체는 항체 A, 항체 B 및 항체 C로서 지정된 것들을 포함하고, 동일한 항체의 상기의 중쇄 및 경쇄 서열은 서열번호 26 내지 40으로 나타낸다.
"분리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수되는 항체이다. 항체의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료학적 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 또는 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질일 수 있다. 하나의 양상에서, 상기 항체는 항체의 중량을 기준으로 적어도 95% 분리를 초과하도록 정제될 것이다.
항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분은 존재하지 않을 것이기 때문에, 분리된 항체는 항체가 제조되는 재조합 세포내 동일계의 항체를 포함한다. 그러나 통상적으로 분리된 항체는 재조합 세포 물질이 제거되는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
용어 "항체 수행능"은 생체내에서 항원의 항체 인식 또는 항체의 효과에 기여하는 인자들을 언급한다. 항체의 아미노산 서열내 변화는 폴딩과 같은 항체 성질에 영향을 줄 수 있고, 항원에 결합하는 항체의 초기 비율(Ka), 항원으로부터의 항체의 해리 상수(Kd), 항원에 대한 항체의 친화성 상수(Kd), 항체의 입체 구조, 단백질 용해도 및 항체의 반감기와 같은 물리적 인자에 영향을 줄 수 있다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "에피토프 태그된"은 "에피토프 태그"에 융합된 항-CD40 항체를 언급한다. "에피토프 태그"는 항체의 제조를 위해 에피토프를 제공하기에 충분한 수의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이고, 이것은 사람화된 항-CD40 항체의 목적하는 활성을 방해하지 않도록 디자인된다. 상기 에피토프 태그는 통상적으로 충분히 고유 특성을 가져 에피토프 태그에 대해 생성된 항체는 실질적으로 다른 에피토프와 교차-반응하지 않는다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유하고, 통상적으로 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기 또는 약 9개 내지 30개 잔기를 함유한다. 에피토프 태그 및 상기 에피토프에 결합하는 항체의 예는 flu HA 태그 폴리펩타이드 및 이의 항체 12CA5(문헌참조: Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(문헌참조: Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616); 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체(문헌참조: Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 에피토프 태그는 "재생(salvage) 수용체 결합 에피토프"이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재생 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 언급한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 세포독성 제제와 접합될 수 있다. 이것은 세포의 기능을 억제하거나 차단하고/하거나 세포 파괴를 유발하는 임의의 물질이다. 상기 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, I131, I125, Y90, 및 Re186), 화학치료제, 및 독소, 예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 및 이의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 세포독성 제제는 표준 과정을 사용하여 본 발명의 사람화된 항체에 커플링될 수 있고, 예를 들어, 항체를 사용한 치료요법에 대해 지명된 환자를 치료하기 위해 사용된다.
"화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 본 발명의 치료학적 항체와 접합될 수 있는 화학치료제에는 많은 예가 있다. 상기 화학치료제의 예로는 티오테파 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴, 아우리스타틴(유사체 모노메틸-아우리스타틴 E 및 모노메틸-아우리스타틴 F를 포함함); 두오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI를 포함함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴; 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히, 칼리케마이신 감마 1l 및 칼리케아마이신 phil1(문헌참조: Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 크로모프로테인 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(Adriamycin™) (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루부신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드라날, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 뎀모콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예를 들어, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존, 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 데카바진; 만노무스틴; 미타브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈(Gemzar™); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 Navelbine™); 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 중 어느 하나의 유도체가 포함된다. 상기 정의에 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함되고, 예를 들어, 타목시펜(NolvadexTM을 포함함), 라록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(FarestonTM)을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM); 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(Megace™), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸(Rivisor™), 레트로졸(Femara™), 및 아나스트로졸(Arimidex™); 및 항-안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 중 어느 하나의 유도체가 포함된다. 상기 제제 중 임의의 하나 이상은 본 발명의 사람화된 항체와 접합하여 다양한 장애의 치료를 위해 유용한 치료제를 제공할 수 있다.
상기 항체는 또한 프로드럭에 접합시킬 수 있다. "프로드럭"은 모 약물에 비해 종양 세포에 대한 세포 독성이 덜한 약제학적으로 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이고, 효소적으로 활성화되거나 보다 활성 형태로 전환될 수 있다. 문헌[참조: Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press]을 참조한다. 유용한 프로드럭은 보다 활성의 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭 펩타이드 함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 당화된 프로드럭, β-락탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭, 및 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기된 화학치료제를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
진단학적 및 치료학적 모니터링 목적을 위해, 본 발명의 항체는 또한 표지, 표지 단독 또는 표지 및 추가의 제2 제제(프로드럭, 화학치료제 등)에 접합시킬 수 있다. 기타 제2 제제와는 구분되는 표지는 검출가능한 화합물 또는 조성물인 제제를 언급하고, 이것은 본 발명의 사람화된 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합시킬 수 있다. 상기 표지는 그 자체가 검출 가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는 효소적 표지의 경우에 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 표지된 사람화된 항-CD40 항체가 제조될 수 있고 시험관내 및 생체내 진단을 포함하는 다양한 응용에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 생체내 전달을 수행하기 위해 리포좀 제제의 일부로서 제형화할 수 있다. "리포좀"은 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 이루어진 소형 소포체이다. 리포좀은 임의로 하나 이상의 약제학적 활성 제제 및/또는 표지에 연결되거나 이와 조합된, 본원에 기재된 사람화된 항-CD40 항체와 같은 화합물 또는 제형을 포유동물에게 전달하기에 유용하다. 리포좀의 성분은 통상적으로 이중층 형태로 배열되고 이는 생물학적 막의 지질 배열과 유사하다.
본 발명의 특정 양상은 본 발명의 사람화된 항체의 하나 이상의 도메인을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. "분리된" 핵산 분자는 통상적으로 항체 핵산의 천연 공급원과 엽합된 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정되고 분리된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와는 구분된다.
본 발명의 다양한 양상에서, 사람화된 항체의 하나 이상의 도메인은 재조합적으로 발현될 것이다. 상기 재조합 발현은 하나 이상의 제어 서열, 즉 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현을 위해 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다. 원핵 세포용으로 적합한 제어 서열은 예를 들어, 프로모터, 오퍼레이터 및 리포좀 결합 부위 서열을 포함한다. 진핵 세포 제어 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 이들 제어 서열은 원핵 숙주 세포 및 진핵 숙주 세포에서 사람화된 항-CD40 항체의 발현 및 제조를 위해 사용될 수 있다.
핵산 서열은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓여지는 경우 "작동적으로 연결된" 것이다. 예를 들어, 핵산 전구서열 또는 분비 리더는 이것이 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있거나, 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있거나; 리보솜 결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키기 위해 위치하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결된 DNA 서열이 연속성이고 분리 리더의 경우 연속성이고 판독 프레임내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 임의로 연속성이다. 연결은 간편한 제한 부위에서의 연결에 의해 성취될 수 있다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 모든 상기 용어는 이의 후손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 전달 횟수와는 상관없이 이로부터 유도된 배양물을 포함한다.
치료 목적을 위한 용어 "포유동물"은 사람, 가축 동물 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 언급한다. 바람직하게, 상기 포유동물은 사람이다.
본원에 사용된 바와 같은 "장애"는 본원에 기재된 사람화된 항-CD40 항체를 사용한 치료로부터 이득될 수 있는 임의의 병태이다. 이것은 포유동물이 미지의 장애에 대한 성향을 갖도록 하는 상기 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 비제한적인 예로서 본원에서 치료될 장애는 암, 혈액암, 양성 및 악성 종양, 백혈병 및 림프암 및 염증, 혈관형성, 자가면역 및 면역학적 장애를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물 세포에서의 병리학적 병태를 언급하거나 이를 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CD40-관련 장애" 또는 CD40-관련 질환"은 CD40을 발현하는 세포의 변형 또는 제거를 나타내는 병태를 언급한다. 이들은 비정상적 증식을 나타내는 CD40-발현 세포 또는 암성 또는 악성 성장과 관련된 CD40-발현 세포를 포함한다. CD40 항원의 비정상적 발현을 나타내는 암의 보다 특정한 예는 B 세포 림프아구종 세포, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 카포시 육종, 골육종, 상피 및 내피 종양, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선, 두경부, 피부(흑색종), 방광 및 신장 암을 포함한다. 상기 장애는 백혈병, B 세포 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트룀 거대글로불린혈증; 골육종, 유잉 육종, 악성 흑색종과 같은 육종을 포함하는 고형 종양, 난소 선암종을 포함하는 선암종, 카포시 육종/카포시 종양 및 편평 세포 암종을 포함하는 고형 종양을 포함하는 림프종을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
CD40-관련 장애는 또한 자가면역 장애 및 염증 장애와 같은 면역계의 질환 및 장애를 포함한다. 상기 병태는 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반성 낭창(SLE), 경피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 장염 및 크론 질환), 폐 염증, 천식 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 경우 용어 "의 성장을 정지시킨다" 또는 "성장 억제성"은 세포, 특히, CD40 항원을 발현하는 신생물성 세포 유형의 성장 또는 증식을 억제함을 언급한다. 따라서, 성장 억제는 예를 들어, S 단계에서 신생물성 세포의 백분율(%)을 상당히 감소시킨다.
용어 "정맥내 주입"은 약 15분 초과의 기간, 일반적으로 대략 30 내지 90분 사이의 기간에 걸쳐 동물 또는 사람 환자의 정맥으로 제제를 도입함을 언급한다.
용어 "정맥내 볼루스" 또는 "정맥내 푸시"는 동물 또는 사람의 정맥으로 약물 투여되어 신체가 대략 15분 이하, 일반적으로 5분 이하에 약물을 수용하는 것을 언급한다.
용어 "피하 투여"는 약물 소켓으로부터 비교적 서방성의 지연 전달에 의해 동물 또는 사람 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓내에 제제의 도입을 나타낸다. 하부 조직으로부터 피부의 상향 및 원거리 핀칭 및 드로잉은 포켓을 생성시킬 수 있다.
용어 "피하 주입"은 30분 이하 또는 90분 이하를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기간 동안 약물 소켓으로부터 비교적 서방성의 지연 전달에 의해 동물 또는 사람 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 포켓내에 약물의 도입을 나타낸다. 임의로, 상기 주입은 동물 또는 사람 환자의 피부 아래 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 수행될 수 있고, 여기에서, 상기 펌프는 30분, 90분 또는 치료 계획의 일정에 걸친 기간 동안과 같은 소정의 기간 동안 소정량의 약물을 전달한다.
용어 "피하 볼루스"는 동물 또는 사람 환자의 피부 아래 약물 투여를 나타ㄴ내, 여기에서 볼루스 약물 전달은 대략적으로 15분 미만이고, 다른 양상에서 5분 미만이며, 다른 양상에서 60초 미만이다. 다른 양상에서, 투여는 피부와 하부 조직간의 포켓내이고, 여기에서 상기 포켓은 하부 조직으로부터 피부를 상향 및 원거리 핀칭 또는 드로잉하여 생성시킬 수 있다.
용어 "치료학적 유효량"은 치료되는 장애의 증상들 중 하나 이상을 경감시키거나 완화시키는 활성 제제의 양을 언급하기 위해 사용된다. 따라서 상기 양은 이로운 환자 결과, 예를 들어, 성장 정지 효과를 갖거나 세포의 고갈을 유발하는 양이다. 하나의 양상에서, 치료학적 유효량은 아폽토시스 활성을 갖거나 세포 사멸을 유도할 수 있다. 다른 양상에서, 치료학적 유효량은 예를 들어, 질환 진행을 늦추는데 효과적인 것으로 나타난 표적 혈청 농도를 언급한다. 효능은 통상적인 방식으로 치료되는 병태에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, CD40을 발현하는 세포를 특징으로 하는 신생물성 질환 또는 장애에서, 효능은 질환 진행 시간을 평가하거나 반응 속도를 결정함에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료" 및 "치료요법" 등은 하나 이상의 증상의 경감 또는 완화, 퇴화, 질환 또는 장애의 진행의 퇴보, 지연 또는 정지를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 임상적으로 목적하거나 이로운 효과를 유도하는 질환 또는 장애에 대한 치료학적 및 예방학적, 또는 억제 대책을 포함하는 것으로 의미된다. 따라서, 예를 들어, 용어 치료는 질환 또는 장애 증상의 개시 전 또는 후에 제제를 투여하여 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 차단하거나 제거함을 포함한다. 다른 예로서, 상기 용어는 질환의 임상적 발현 후 질환 증상과 싸우기 위한 제제의 투여를 포함한다. 추가로, 개시 후 및 임상적 증상이 발병된 후 투여가 제제의 투여가 조직 손상의 정도 또는 전이의 양 또는 정도, 치료가 질환을 완화시키는지의 여부와 같은, 질환 또는 장애의 임상적 파라미터에 영향을 미치는 제제의 투여는 본원에 사용된 바와 같이 "치료" 또는 "치료요법"을 포함한다. 또한, 단독 또는 다른 치료제와 조합된 본 발명의 조성물이 사람화된 CD40 항체 조성물의 사용 부재 하의 증상과 비교하여 치료될 장애의 하나 이상의 증상을 완화시키거나 경감시키는 한, 상기 결과는 장애의 증상 모두가 완화되는지의 여부와 상관없이 기본 장애의 효과적인 치료인 것으로 고려되어야만 한다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료학적 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되고 상기 치료학적 제품의 용도에 관한 지침, 용법, 투여, 금기사항 및/또는 경고문에 대한 정보를 포함하는 지침서를 언급하기 위해 사용된다.
항체
사람화된 항-CD40 항체 및 본 발명의 하나 이상의 사람화된 항-CD40 항체를 포함하는 제조물의 조성물 및 제품이 기술되고 기재된다. 또한, 사람화된 항-CD40 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 결합 제제가 기술된다. 사람화된 항-CD40 항체 및 결합 제제는 세포 성장을 정지시키거나 CD40을 발현하는 세포의 고갈을 유발하거나 다른 한편 표적 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 유도하거나 유발할 수 있다. 사람화된 항-CD40 항체 및 결합 제제는 CD40 표면 항원을 발현하는 세포의 증식을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 사람화된 항-CD40 항체 및 CD40 결합 제제는 각각 적어도 CD40 에피토프를 특이적으로 인식하는 부분(즉, 항원-결합 단편)을 포함한다.
초기 특징 분석에서, CD40 결합 특성 분석을 기준으로 뮤린 항체를 선별하였다.
이들 초기 연구로부터, 표 1에 나타낸 하기의 중쇄 가변 영역 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변 영역을 갖는 뮤린 항체를 선별하였다:
Figure 112012078932196-pct00001
Figure 112012078932196-pct00002
사람 골격 서열은 골격 상동성, CDR 구조, 보존된 정규 잔기, 보존된 계면 팩킹 잔기 및 기타 파라미터를 기준으로 마우스 리드의 각각에 대해 선별하였다.
선택된 다양한 뮤린 항체의 뮤린 중쇄 및 경쇄 CDR은 각각 표 3 및 표 4에 나타낸다:
Figure 112012078932196-pct00003
상기 열거된 H-CDR1은 코티아(Chothia) 넘버링 시스템(문헌참조: Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)을 사용하는 서열을 사용한다. 상기 서열에 대한 캐뱃 넘버링은 굵은 이탤릭체로 나타내고, IMGT 넘버링은 CDR1 및 CDR2에 대해 상기 표에서 밑줄 그은 잔기로 나타낸다. 2H11, 10F2 및 19B10 각각에 대한 H-CDR3의 서열은 TTSYYVGTYGY(서열번호 77)이고 20E2에 대한 H-CDR3의 서열은 ARQDGYRYAMDY(서열번호 78)이다.
Figure 112012078932196-pct00004
또한, 코티아 넘버링 시스템은 굵은 이탤릭체로 나타낸 서열에 대한 캐뱃 넘버링과 함께 표 4에 사용되고, IMGT 넘버링은 밑줄 표시로 나타낸다.
키메라 모 Fab와 비교하여 보다 우수하거나 동등한 결합을 나타내는 Fab는 IgG로의 전환을 위해 선택되었다. 20E2 계열 기원의 클론은 2개의 상이한 IgG 포맷으로 전환되었다: a) lgG4DM (이중 돌연변이체)는 Fc/힌지 영역에 2개의 돌연변이, 즉, 절반-분자 형성을 감소시키는 Ser228Pro 및 추가로 FcγR 결합을 감소시키는 Leu235Glu를 갖고, b) IgG1 KO(이펙터 기능의 녹-아웃)는 Fc 영역에 2개의 돌연변이, 즉 FcγR과 같은 이펙터 기능 및 보체 결합을 감소시키는 Leu234Ala 및 Leu235Ala을 갖는다. 2개의 IgG 포맷은 문헌에 기재되어 있다. 실시예 1은 추가로 상세하게 3개의 후보물의 사람화를 기재하고 있다. 상기 사람화의 결과로 하기에 나타낸 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 사람화된 항체 서열이 수득된다:
Figure 112012078932196-pct00005
Figure 112012078932196-pct00006
Figure 112012078932196-pct00007
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일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 예를 들어, CD40 표면 항원에 결합함에 의해 세포의 증식을 차단하거나 다르게는 세포의 성장을 정지시키거나 이의 고갈, 사멸 또는 다르게는 이의 결실을 유발할 수 있다. 예를 들어, T 및 B 세포 악성종양에서 항종양 효과(예를 들어, 세포 결실 또는 아폽토시스의 존재 또는 부재 하의 성장 정지)는 흔히 악성 종양 세포가 정상적인 림프구의 활성화를 유도하는 자극에 노출되는 경우 발생한다. 상기 활성화-유도된 성장 정지는 항원 수용체 또는 공동 자극 수용체를 통한 시그널과 함께 관찰되었다(문헌참조: 예를 들면, Ashwell et al., 1987, Science 237:61; Bridges et al., 1987, J. Immunol. 139:4242; Page and Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717; 및 Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501). 항체 또는 가용성 리간드에 의한 특이적 결합의 결과로 CD40 자극은 B 세포 림프종 성장을 억제한다(문헌참조: 예를 들면, Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794). 상기 방식으로 악성 종양 세포 성장을 억제하고 CD40 표면 항원에 대해 지시되는 제제는 적합한 제제의 예이다.
CD40 특이적 제제는 CD40(예를 들어, 사람 CD40 또는 이의 변이체)에 결합하는 사람화된 항-CD40 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 상기 CD40 특이적 제제 및 항체는 임의로 세포독성 제제 또는 화학치료제에 접합되거나 융합될 수 있다. 사람화된 항체가 CD40 표면 항원에 결합하고 CD40 발현 세포 유형의 고갈을 유발한다는 양상에서, 결합은 일반적으로 생체내에서 CD40 표면 항원 세포를 귀소(homing)시킴을 특징으로 한다. 적합한 결합 제제는 충분한 친화성 및/또는 결합가로 CD40 항원에 결합하여 CD40 특이적 제제가 항원 발현 세포를 특이적으로 표적화함으로써 치료제로서 유용하다.
일부 양상에서, 상기 사람화된 항체는 CD40 리간드의 CD40으로의 결합을 45% 이상, 50% 이상, 60% 이상 또는 75% 이상 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상까지 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 같은, 항원-결합 단편을 포함하는 사람화된 항-CD40 항체는 상기 본원에 기재된 바와 같은 CDR 항체 A(중쇄 서열 = 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29 또는 서열번호 30; 경쇄 서열 = 서열번호 26), 항체 B(중쇄 서열 = 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 또는 서열번호 35; 경쇄 서열 = 서열번호 31) 및 항체 C(중쇄 서열 = 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39 또는 서열번호 40; 경쇄 서열 = 서열번호 36)로부터 유도된 잔기의 아미노산 서열 및 사람 면역글로불린의 골격 영역으로부터 유도된 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 사람화된 항-CD40 항체는 임의로 컨센서스 또는 생식선 골격 영역에서 특정 아미노산 치환을 포함한다.
이들 골격 위치에서 아미노산 잔기의 특정 치환은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 CDR 또는 HVL의 사람 생식선 골격 영역으로의 "직접적인 스와프"에 의해 형성된 사람화된 항체에서 입증된 것 이상으로, 결합 친화성 및/또는 안정성을 포함하는 항체 수행능의 다양한 측면을 개선시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 중쇄(VH) 서열 및 서열번호 5 내지 서열번호 8의 경쇄(VL) 서열을 갖는 다른 모노클로날 항체를 기재한다(상기 표 1 및 표 2 참조). 이들 뮤린 항체의 CDR 서열은 표 3 및 표 4에 나타내고 상기 CDR을 사람 컨센서스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR에 도입하면 본 발명의 유용한 사람화된 항체를 생성시킬 것이다.
일부 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 상기 사람화된 항-CD40 항체는 상기 표 1 내지 표 4에 나타낸 바와 같은 뮤린 모노클로날 항체의 CDR 또는 HVL을 포함하는 적어도 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 및 사람 생식선 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본원에서 제조된 사람화된 항체는: 항체 A, 항체 B 및 항체 C이고, 이의 다양한 중쇄 및 경쇄 서열은 서열번호 26 내지 서열번호 40으로 나타낸다.
특정 실시형태에서, 서열번호 26의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30 중 어느 하나의 중쇄 서열을 갖는 항체가 고려된다. 대안적인 항체는 서열번호 31의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 중쇄 서열을 갖는 것들을 포함한다. 여전히 추가의 실시형태에서, 서열번호 36의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 중쇄 서열을 갖는 사람화된 항체가 제공된다.
이들 서열의 CDR은 표 3 및 표 4에 나타낸다. 특정 실시형태에서, 상기 예시적인 면역글로불린 간에 스위칭된 CDR 영역(즉, 예를 들어, 항체 A의 1개 또는 2개의 CDR을 항체 C 기원의 유사 CDR과 스위칭한 것)을 갖는 키메라 항체가 유용한 항체를 생성시킬 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시형태에서, 상기 사람화된 항-CD40 항체는 항체 단편이다. 다양한 항체 단편이 일반적으로 상기에서 논의되었고 항체 단편의 제조를 위한 기술이 개발되었다. 단편은 온전한 항체의 단백질 분해를 통해 유도될 수 있다(문헌참조: Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; 및 Brennan et al., 1985, Science 229:81). 대안적으로, 상기 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접 제조될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이(E. coli)로부터 회수할 수 있고 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(문헌참조: Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). 다른 접근법에 의해, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리할 수 있다. 항체 단편의 제조를 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다.
특정 실시형태는 서열번호 26의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30 중 어느 하나의 중쇄 서열을 포함하는 사람화된 항-CD40 항체의 F(ab')2 단편을 포함한다. 대안적인 항체는 서열번호 31의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 중쇄 서열을 갖는 것들을 포함한다. 여전히 추가의 실시형태에서, 서열번호 36의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 중쇄 서열을 갖는 사람화된 항체가 제공된다. 상기 실시형태는 상기 F(ab')2를 포함하는 온전한 항체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 이펙터 기능을 매개하는 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 영역은 CD40-발현 표적 세포에 대한, 항체-의존성 세포성 세포 독성(ADCC), 항체-의존성 세포성 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 반응을 제공할 수 있다. 상기 이펙터 도메인(들)은 예를 들어, Ig 분자의 Fc 영역일 수 있다. 전형적으로, 상기 CD40 결합 제제는 세포독성 백혈구 세포(예를 들어, 천연 킬러(NK) 세포, 식세포작용 세포(예를 들어, 마크로파지) 및/또는 혈청 보체 성분)를 징집하고/하거나 활성화시킨다.
항체의 상기 이펙터 도메인은 임의의 적합한 척추동물 종 및 이소형으로부터 기원할 수 있다. 상이한 동물 종 기원의 이소형은 이펙터 기능을 매개하는 능력에서 차이가 있다. 예를 들어, CDC 및 ADCC/ADCP를 매개하는 사람 면역글로불린의 능력은 일반적으로 각각 다음과 같은 순서이다: IgM
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IgG1
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IgG3 > lgG2 > lgG4 및 IgG1
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IgG3 > IgG2/IgM/IgG4. 뮤린 면역글로불린은 일반적으로 각각 뮤린 IgM
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IgG3
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IgG2b>>IgG2a>>IgG1 및 IgG2b>IgG2a>IgG1>>lgG3의 순서로 CDC 및 ADCC/ADCP를 매개한다. 또 다른 예에서, 뮤린 IgG2a는 ADCC를 매개하고 뮤린 IgG2a 및 IgM 둘 다는 CDC를 매개한다.
항체 변형
상기 사람화된 항-CD40 항체 및 제제는 사람화된 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 암을 치료하는데 있어서 항체의 효과를 증진시키기 위해 이펙터 기능과 관련하여 항체를 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 하나의 그러한 변형은 Fc 영역으로 시스테인 잔기(들)를 도입하여 상기 영역에서 쇄간 디설파이드 결합을 형성하는 것이다. 이와 같이 제조된 상기 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌[참조: 예를 들면, Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; 및 Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922]을 참조한다. 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 문헌[참조: Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565]에 기재된 바와 같이 이종이기능성 교차-링커를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체는 이원 Fc 영역을 함유하도록 가공되어 보체 용해 및 항체의 ADCC 능력을 증진시킬 수 있다. 문헌[Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230]을 참조한다.
ADCC를 지원하는 능력이 개선된 항체는 이들의 Fc 영역의 당화 패턴을 변형시킴에 의해 제조되었다. 이것은 CH2 도메인내 아스파라긴 잔기 N297에서 항체 당화가 ADCC의 전제 조건인 IgG와 Fcγ간의 상호작용에 관여하기 때문에 가능하다. 숙주 세포주는 증가된 2등분 N-아세틸글루코사민 또는 감소된 퓨코스와 같은 변화된 당화를 갖는 항체를 발현하도록 가공되었다. 퓨코스 감소는 2등분 N-아세틸글루코사민의 존재를 증가시키는 것보다 ADCC 활성을 크게 증진시킨다. 더욱이, 퓨코스 저함량 항체에 의한 ADCC의 증진은 FcγRIIIa V/F 다형성과는 무관하다.
항체의 Fc 영역의 아미노산 서열의 변형은 ADCC를 증진시키기 위한 당화 가공에 대한 대안이다. Fcγ 수용체에 대한 사람 IgG1 상의 결합 부위는 광범위한 돌연변이 분석에 의해 결정되었다. 이것은 FcγRIIIa에 대한 결합 친화성을 증가시키고 시험관내 ADCC를 증진시키는 Fc 돌연변이를 갖는 사람화된 IgG1 항체의 제조를 유도한다. 추가로, 많은 상이한 순열(permutation)의 결합 성질, 예를 들어, 다른 FcγR 수용체로의 결합이 변함이 없거나 감소된 특정 FcγR 수용체로의 개선된 결합을 갖는 Fc 변이체가 수득되었다.
다른 양상은 화학치료제, 독소(예를 들어, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소(예를 들어, 방사성 접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 사람화된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함한다.
상기 면역접합체의 제조에 유용한 화학치료제는 상기되어 있다. 유용한 면역접합체를 형성하기 위해 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테세네스 등을 포함한다. 다양한 방사성 핵종이 방사성 접합된 사람화된 항-CD40 항체의 제조를 위해 유용하다. 이의 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다.
상기 사람화된 항-CD40 항체 및 세포독성 또는 화학치료제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[참조: Vitetta et al., 1987, Science 238:1098]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오타이드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. 접합체는 또한 절단가능한 링커와 함께 형성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 항체는 종양 사전표적화에 사용하기 위한 "수용체"(예를 들어, 스트렙트아비딘)에 접합될 수 있다. 상기 과정에서, 상기 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여하고, 이어서 정화제를 사용하여 순환계로부터 미결합된 접합체를 제거하고 이어서 수용체(예를 들어, 아비딘)에 선택적으로 결합하고 세포독성제(예를 들어, 방사성 핵종)에 접합되는 "리간드"를 투여한다.
본원에 기재된 상기 사람화된 항-CD40 항체는 또한 면역리포좀으로서 제형화할 수 있다. 항체 함유 리포좀은 문헌[참조: Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조한다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포좀은 예를 들어, 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀은 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출하여 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본원에 기재된 항체의 Fab' 단편은 디설파이드 상호교환 반응을 통해 문헌[참조: Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288]에 기재된 바와 같은 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학치료제(예를 들어, 독소루비신)은 임의로 상기 리포좀에 함유된다. 예를 들면, 문헌[Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81 (19):1484]을 참조한다.
본원에 기술되고 기재된 항체는 또한 상기 항체를, 프로드럭(예를 들어, 펩티딜 화학치료제)를 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 접합시킴에 의해 ADEPT(항체-지시된 효소 프로드럭 치료요법)에 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[WO 81/01145, WO 88/07378, 및 미국 특허 제4,975,278호]을 참조한다. ADEPT용으로 유용한 면역접합체의 효소 성분은 이를 보다 활성 세포독성 형태로 전환시키기 위한 방식으로 프로드럭에 작용할 수 있는 효소이다. ADEPT에 유용한 특이적 효소는 포스페이트-함유 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 아릴설파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키기 위한 시토신 데아미나제; 펩타이드-함유 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 프로테아제, 예를 들어, 세라티아 프로테아제, 써모라이신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카뎁신(예를 들어, 카뎁신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키기 위한 D-알라닐카복시펩티다제; 당화 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키기 위한 β-락타마제; 및 이들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 그룹으로 유도체화된 약물을 유리된 약물로 전환시키기 위한, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 대안적으로, 효소 활성을 갖는 항체("항체 효소(Abzyme)")는 프로드럭을 유리된 활성 약물로 전환시키기 위해 사용될 수 있다(문헌참조: 예를 들면, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). 항체-항체 효소 접합체는 종양 세포 집단으로 항체 효소 전달을 위해 공지된 방법, 예를 들어, 상기 효소를 상기 논의된 사람화된 항-CD40 항체/이종이기능성 가교결합 시약에 공유 결합시킴에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기된 바와 같은 효소의 하나 이상의 기능성 활성 부분으로 결합된 본원에서 논의된 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제할 수 있다(문헌참조: 예를 들면, Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).
특정 실시형태에서, 예를 들어, 종양 침투를 증가시키기 위해 온전한 항체보다는 사람화된 항-CD40 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 단편의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 상기 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어, 재생 수용체 결합 에피토프를 항체 단편으로 혼입시켜 성취할 수 있다. 하나의 방법에서, 항체 단편의 적당한 영역을 변형(예를 들어, 돌연변이)시킬 수 있거나 상기 에피토프는 펩타이드 태그에 혼입시킬 수 있고, 이어서 이는 예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해 양쪽 말단 중 하나 또는 중간에서 항체 단편과 융합시킨다(문헌참조: WO 96/32478).
다른 실시형태에서, 사람화된 항-CD40 항체의 공유 변형이 또한 포함된다. 공유 변형은 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 티로실 잔기, 카복실 측쇄 그룹(아스파틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴 또는 트레오닐 잔기의 변형을 포함한다. 다른 유형의 공유 변형은 글리코시드를 항체로 화학적 또는 효소적으로 커플링시킴을 포함한다. 상기 변형은 경우에 따라 항체의 화학적 합성 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항체의 공유 변형의 다른 유형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 아미노- 또는 카복시-말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도체화 제제와 반응시킴에 의해 상기 분자로 도입될 수 있다.
항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 성취될 수 있다. 화학적 탈당화는 문헌[참조: Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 기재되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[참조: Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350]에 기재된 바와 같이 다양한 내인성 및 외인성 글리코시다제를 사용하여 성취할 수 있다.
다른 유형의 유용한 공유 변형은 미국 특허 제4,640,835호, 미국 특허 제4,496,689호, 미국 특허 제4,301,144호, 미국 특허 제4,670,417호, 미국 특허 제4,791,192호 및 미국 특허 제4,179,337호 중 하나 이상에 제시된 방식으로, 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에텔린 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나로 연결시킴을 포함한다.
사람화 및 아미노산 서열 변이체
항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-CD40 항체 DNA에 적당한 뉴클레오타이드 변화를 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변이체는 예를 들어, 본원에 예시된 항-CD40 항체의 아미노산 서열내 잔기로부터 결실 및/또는 상기 잔기내로의 삽입 및/또는 상기 잔기의 치환을 포함한다. 임의의 결실, 삽입 및 치환의 조합은 최종 작제물이 되도록 하고, 단, 상기 최종 작제물은 목적하는 특성을 갖는다. 상기 아미노산 변화는 또한 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 사람화된 또는 변이체 항-CD40 항체의 해독후 과정을 변경시킬 수 있다.
돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 항-CD40 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정을 위해 유용한 방법은 문헌[참조: Cunningham and Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 소위 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹이 동정되고(예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음전하 아미노산(전형적으로 알라닌)으로 대체하여 CD40 항원과 상기 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 상기 치환에 기능적 민감성을 보여주는 상기 아미노산 위치는 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가로 또는 다른 변이를 도입하여 가공한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 사전에 결정하고, 돌연변이 자체의 성질은 사전에 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 수행능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 항-CD40 항체 변이체는 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 에피토프 태그에 융합된 항-CD40 항체를 포함한다. 항-CD40 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항-CD40 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 제거된 항-CD40 항체 분자에서 하나 이상의 아미노산 잔기 및 이의 위치에 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발을 위해 가장 목적하는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변형이 또한 고려된다. 보존성 치환은 "바람직한 치환" 표제 하에 표 5에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변화시키면, "예시적 치환"으로 나타내거나 아미노산 부류를 참조로 하기에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 상기 생성물을 스크리닝한다.
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단백질 화학에서, 일반적으로 상기 항체의 생물학적 성질은 (a) 치환 영역에서 예를 들어, 시트 또는 나선 입체구조로서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 변화 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지시키는 것에 대한 이들 효과가 상당히 상이한 치환을 선택함에 의해 성취될 수 있는 것으로 받아들여지고 있다. 천연적으로 발생하는 잔기는 통상의 측쇄 성질을 기준으로 그룹별로 분류된다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존성 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환할 수 있게 할 것이다.
사람화된 또는 변이체 항-CD40 항체의 적당한 입체구조를 유지시키는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화적 안정성을 개선시키거나 비정상적 가교결합을 차단하거나 세포독성 또는 세포억제 화합물로의 확립된 접합점을 제공한다. 역으로, 시스테인 결합(들)은 항체에 부가되어 이의 안정성을 개선시킬 수 있다(특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
한 유형의 치환적 변이체는 모 항체(예를 들어, 사람화된 또는 사람 항체)의 하나 이상의 초가변성 영역 잔기를 치환시킴을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된, 수득된 변이체(들)는 이들이 제조된 모 항체에 비해 생물학적 성질을 개선시킨다. 상기 치환적 변이체를 제조하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙화이다. 간략하게, 수개의 초가변 영역 부위(예를 들어, 6개 또는 7개 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이로써 생성된 상기 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합으로서, 필라멘트성 파지 입자로부터 1가 양식으로 디스플레이한다. 이어서, 파지 디스플레이된 변이체는 이들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 사람 CD40간의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들은 본원에서 숙고된 기술에 따른 치환에 대한 후보물이다. 상기 변이체가 제조되면, 변이체 패널을 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝에 적용하고 하나 이상의 관련 검사에서 우수한 성질을 갖는 항체는 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.
항체의 아미노산 변이체의 다른 유형은 항체의 본래 당화 패턴을 변형시킨다. "변형"이란 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 제거하고/하거나 항체내 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 첨가하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 당화 부위를 첨가하기 위해 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 항체의 당화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 잔기의 측쇄로 부착시킴을 언급한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 측쇄로의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드내 상기 트리펩타이드 서열의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성시킨다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌으로 부착시키는 것을 언급하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 소정의 단백질, 예를 들어, 항체를 당화시키기 위해, 단백질의 아미노산 서열을 가공하여 하나 이상의 상기된 트리펩타이드 서열(N-연결된 당화 부위를 위해)을 함유하도록 한다. 상기 변형은 또한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 본래의 항체의 서열(O-연결된 당화 부위를 위해)로의 부가 또는 치환으로 성취할 수 있다.
항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 이들 방법은 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 항-CD40 항체에 대해, 천연 공급원으로부터의 분리(천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오타이드 매개된(또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
다른 실시형태는 사람화된 항-CD40 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 사람화된 항체의 제조를 위한 재조합 기술을 포함한다. 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 전장 모노클로날 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하는 임의의 목적하는 형태의 항-CD40 항체를 암호화할 수 있다.
일부 실시형태는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태는 서열번호 26, 서열번호 31 또는 서열번호 36의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 양상에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.
사람화된 항-CD40 항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)는 당업계에 공지된 바와 같은 하나 이상의 조절 또는 제어 서열과 융합될 수 있고, 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 함유될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 분자는 독립적으로 사람 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 융합될 수 있어 온전한 항체가 제조될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 부분은 함께 융합되어 단일쇄 항체의 제조를 위한 주형을 제공할 수 있다.
재조합 제조를 위해, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 클로닝(DNA의 증폭)을 위해 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 재조합 항체를 발현하기 위해 많은 적합한 벡터가 이용가능하다. 상기 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다: 시그널 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
상기 사람화된 항-CD40 항체는 또한 융합 폴리펩타이드로서 제조될 수 있고, 여기서 상기 항체는 시그널 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드와 같은 이종성 폴리펩타이드와 융합된다. 상기 선택된 이종성 시그널 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 가공된 것(즉, 시그널 펩티다제에 의해 절단됨)이다. 사람화된 항-CD40 항체 시그널 서열을 인식하지 않고 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 상기 시그널 서열은 원핵세포 시그널 서열에 의해 치환될 수 있다. 상기 시그널 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 지질단백질, 열-안정성 장독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비를 위해, 천연 시그널 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 알파-인자(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함), 산 포스파타제, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제, 또는 WO90/13646에 기재된 시그널로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유동물 세포에서, 포유동물 시그널 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 시그널이 사용될 수 있다. 상기 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임 내 사람화된 항-CD40 항체를 암호화하는 DNA에 연결된다.
발현 및 클로닝 벡터는 상기 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제될 수 있도록 하고 복제 오리진 또는 자발적 복제 서열을 포함하는 서열이다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322 기원의 복제 오리진은 대부분의 그람 네가티브 세균에 대해 적합하다(2-υ). 플라스미드 오리진은 효모를 대해 적합하고, 다양한 바이러스 오리진(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 및 BPV)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터를 위해 유용하다. 일반적으로, 복제 성분의 오리진은 포유동물 발현 벡터에서 요구되지 않는다(상기 SV40 오리진은 전형적으로 이것이 조기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 발현의 동정을 촉진시키는 선별가능한 마커를 암호화하는 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별가능한 마커 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하거나 대안적으로 보충 영양요구성 결핍이거나 다른 대안에서 복합 배지에는 존재하지 않는 특정 영양물을 공급하는 단백질을 암호화하고, 예를 들어, 바실리에 대해 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자가 있다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 억제하기 위한 약물을 사용하는 것이다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고 따라서 선별 과정에서 생존한다. 상기 주요 선별의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다. 포유동물 세포에 대해 공통된 선별 마커는 사람화된 항-CD40 항체를 암호화하는 핵산을 흡수하기 위해 경쟁하는 세포의 동정을 가능하게 하는 것들로서, 예를 들어, DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II(예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이 있다. DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 상기 형질전환체 모두를, DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함에 의해 동정된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우, 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성(예를 들어, DG44)이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.
대안적으로, 항-CD40 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선별 마커, 예를 들어, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포(특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시딕 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별 마커에 대한 선별 제제를 함유하는 배지내 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
재조합 생산이 숙주 세포로서 효모 세포에서 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자(문헌참조: Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39)는 선별 마커로서 사용될 수 있다. TRP1 유전자는 트립토판 중에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다(문헌참조: Jones, 1977, Genetics 85:12). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈에서 trp1 병변(lesion)의 존재는 트립토판 부재 하에 성장에 의한 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2p-결핍 효모 균주, 예를 들어, ATCC 20,622 및 38,626은 LEU2 유전자를 함유하는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.
추가로, 1.6㎛ 환형 플라스미드 pKD1로부터 유도된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 소 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템은 케이 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다(문헌참조: Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙한 재조합 사람 혈청 알부민의 분비를 위해 안정한 다중-카피 발현 벡터는 또한 문헌[참조: Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975]에 기재되어 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 함유하고, 항-CD40 항체 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결되어 있다. 원핵세포 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 세균 프로모터가 또한 적합하다. 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 상기 사람화된 항-CD40 항체를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가모(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
많은 진핵세포 프로모터 서열은 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기의 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70개 내지 80개 염기 업스트림에서 발견되는 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵세포 유전자 3' 말단에는 상기 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 부가하기 위한 시그널일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이들 서열 모두는 진핵세포 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터들을 포함한다.
유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 제어되는 추가의 전사 이점을 갖는다. 이들은 알콜 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 관여하는 효소에 대한 효모 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제73,657호에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서는 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 사람화된 항-CD40 항체 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 파울폭스 바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어되는데, 단, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이어야 한다.
상기 SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터는 간편하게 또한 SV40 바이러스 복제 오리진을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 수득된다. 사람 사이토메갈로바이러스 전 초기(immediate early) 프로모터는 간편하게 HindIII E 제한 단편으로서 수득된다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스 기원의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에, 마우스 세포에서 사람 p-인터페론 cDNA의 발현을 기재하고 있는 문헌[참조: Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]을 참조한다. 대안으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
재조합 발현 벡터에 사용될 수 있는 다른 유용한 요소는 고등 진핵세포에 의해 사람화된 항-CD40 항체를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 사용되는 인핸서 서열이다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵세포 바이러스 기원의 인핸서가 사용된다. 이의 예는 복제 오리진의 후기 측면 상에 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 오리진의 후기 측면 상의 폴리오마 바이러스, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 요소를 증진시키는 기재에 대해 문헌[참조: Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]을 참조한다. 상기 인핸서는 사람화된 항-CD40 항체-암호화 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터내로 스프라이싱될 수 있지만, 바람직하게 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵세포 숙주 세포(효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 다른 다세포 유기체 기원의 핵화된 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA을 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 수 있다. 상기 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비해독 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항-CD40 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 절편을 함유한다. 한가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 문헌[WO94/11026] 및 본원에 기재된 발현 벡터를 참조한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항-CD40 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,888,809호(이의 내용은 본원에 참조로서 인용된다)를 참조한다.
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위해 적합한 숙주 세포는 상기된 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 상기 목적을 위해 적합한 원핵 세포는 진정세균, 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 에스케리키아, 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) 41 P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 장내 세균(Enterobacteriaceae)을 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)이 적합하다. 이들 예는 제한보다는 예시하기 위한 것이다.
원핵세포에 추가로, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵세포 미생물은 사람화된 항-CD40 항체-암호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵세포 숙주 유기체 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 통상적으로 본원에서 이용가능하고 유용하며, 예를 들어, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 윅커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 월티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨러란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토르스(Pichia pastors)(EP 183,070); 캔디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어, 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균류, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 나이거(A. niger)가 있다.
당화된 사람화된 항-CD40 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함하고, 예를 들어, 많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(캐터필러), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에)와 같은 숙주 기원의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포를 포함한다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 종이 대중적으로 이용가능하고, 예를 들어, 아우토그라파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 스트레인이 있고 상기 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 숙주로서 사용될 수 있다.
다른 양상에서, 사람화된 항-CD40의 발현은 척추동물 세포에서 수행된다. 배양(조직 배양) 중 척추동물 세포의 증식은 통상적인 과정이 되었고 기술은 광범위하게 이용가능하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주, 사람 배아 신장 주(현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포(문헌참조: Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR1(문헌참조: CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; 예를 들면, DG44), 마우스 세르톨리 세포(mouse Sertoli cells)(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70), 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 사람 경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 물소 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065), 마우스 포유동물 종양(MMT 060562, ATCC CCL51 ), TR1 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 사람 간세포암 주(Hep G2)이다.
숙주 세포는 사람화된 항-CD40 항체 제조를 위해 상기된 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적당히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
본원에 기재된 사람화된 항-CD40 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어 Ham's F10(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium) ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 듈베코 변형 이글 배지((DMEM), Sigma-Aldrich Co.)가 숙주 세포를 배양하기 위해 적합하다. 추가로, 문헌[참조: Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호, 미국 특허 제5,122,469호, WO 90/103430, 및 WO 87/00195] 중 하나 이상에 기재된 배지 중 어느 하나가 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 하나는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, 젠타마이신), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 이의 균등 에너지원이 보충될 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 보충물이 또한 적당한 농도로 함유될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 이전에 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용되고 당업자에게 자명할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 상기 항체는 세포막주변공간에서 세포내로 제조될 수 있거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내로 제조되는 경우, 상기 세포는 제1 단계로서 단백질을 방출하기 위해 파쇄될 수 있다. 과립 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편들은 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. 문헌[참조: Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167]은 이. 콜라이의 세포막주변 공간으로 분비되는 항체를 분리하기 위한 과정을 기재하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분 이상 해동시킨다. 세포 파쇄물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 상기 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상청액은 먼저 일반적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유니트를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질용해를 억제하기 위한 이전의 임의의 단계 중에 포함될 수 있고 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 차단하기 위해 포함될 수 있다. 다양한 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 항체를 분리할 수 있다.
상기 세포로부터 제조된 상기 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고 친화성 크로마토그래피가 전형적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체내 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 다양하다. 단백질 A를 사용하여 사람 감마 1, 감마 2, 또는 감마 4 중쇄를 기준으로 항체를 정제할 수 있다(문헌참조: 예를 들면, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 사람 감마 3을 위해 추천된다(문헌참조: 예를 들면, Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만 다른 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취될 수 있는 것보다 신속한 유동 속도 및 보다 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 뱅커본드( Bakerbond) ABX™ 수지(문헌참조: J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제를 위해 유용하다. 이온-교환 칼럼 상의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있고, 전형적으로 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행한다.
또한, 본원에 정의된 바와 같은 낮은, 중간정도 및 높은 엄중 조건 하에서 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 대표되는 뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부(예를 들어, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 하이브리드화하는 핵산이 포함된다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 전형적으로 길이가 15개 이상(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개)인 뉴클레오타이드이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 항-CD40 폴리펩타이드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역)를 암호화하는 핵산의 전체 또는 일부의 서열 또는 이의 상보체와 80% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일하다. 본원에 기재된 유형의 하이브리드화 핵산은 예를 들어, 클로닝 프로브로서, 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머 또는 진단 프로브로 사용될 수 있다.
일부 실시형태는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 또는 서열번호 36 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 양상에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은, 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화한다.
다른 양상에서, 바로 직전에 상기된 실시형태에서의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 암호화된 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역은 하나의 실시형태에서, 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 다른 실시형태에서 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열과 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련된 용어 "동일한" 또는 "% 동일성"은 최대 상응하게 비교되고 정렬되는 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 %를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 언급한다. % 동일성을 결정하기 위해, 상기 서열은 최적의 비교 목적(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있음)을 위해 정렬된다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열내 위치가 제2 서열내 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점령되는 경우, 그 분자는 상기 위치에서 동일하다. 2개의 서열간의 % 동일성은 서열에 의해 나누어지는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/총 위치의 #(예를 들어, 중첩 위치) x 100). 일부 실시형태에서, 비교되는 2개의 서열은 적절히 갭이 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다(예를 들어, 비교되는 서열보다 확장되는 추가의 서열은 제외시킴). 예를 들어, 가변 영역 서열이 비교되는 경우, 상기 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 2개의 서열간의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 양쪽 서열내 동일한 위치에서의 CDR을 언급한다(예를 들어, 각각의 서열의 CDR-H1).
2개의 서열간의 % 동일성 또는 % 유사성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 문헌(참조: Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)에서와 같이 변형된 문헌(참조: Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 문헌(참조: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행하여 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산과 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행하여 목적하는 단백질과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적용 갭 정렬을 수득하기 위해, 갭 BLAST를 문헌(참조: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 대안으로, PSI-Blast를 사용하여 분자(Id.)간의 원거리 관계를 검출하는 반복적인 검색을 수행할 수 있다. BLAST, 갭 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 계수를 사용할 수 있다. 서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한 비제한적인 예는 문헌(참조: Myers and Miller, CABIOS (1989))의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)으로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당업계에 공지되어 있고, 문헌[참조: Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]에 기재된 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌[참조: Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup는 검색의 감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup=2인 경우, 비교되는 2개의 서열내 유사 영역은 정렬된 잔기의 쌍을 관찰함에 의해 발견되고; ktup=1인 경우, 단일 정렬된 아미노산이 조사된다. ktup는 단백질 서열에 대해 2 또는 1로 설정되거나 DNA 서열에 대해 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup가 특정되지 않는 경우 디폴트는 단백질에 대해서는 2이고 DNA에 대해서는 6이다. 대안으로, 단백질 서열 정렬은 문헌[참조: Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에 기재된 바와 같이 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.
비-치료학적 용도
본원에 기재된 항체는 친화성 정제 제제로서 유용하다. 상기 공정에서, 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 단백질 A 수지와 같은 고형 상에 고정화시킨다. 고정화된 항체는 정제될 CD40 단백질(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 이후 지지체는 고정화된 항체에 결합된 CD40 단백질을 제외하고는 샘플내 실질적으로 모든 물질을 제거할 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 상기 지지체는 항체로부터 CD40 단백질을 방출시킬 다른 적합한 용매로 세척한다.
사람화된 항-CD40 항체는 또한 CD40 단백질을 검출하고/하거나 정량하는, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 CD40 발현을 검출하는 진단학적 검사에서 유용하다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 진단학적 목적을 위해 항체에 검출가능한 모이어티로 표지시키는 것이 유리할 것이다. 많은 검출가능한 표지가 이용가능하고 방사성 동위원소, 형광성 표지, 효소 기질 표지 등을 포함한다. 상기 표지는 다양한 공지된 기술을 사용하여 간접적으로 항체에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 비오틴과 접합될 수 있고 상기 언급된 3개의 광범위한 카테고리의 표지가 아비딘과 접합될 수 있거나 그 반대일 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 상기 표지는 이의 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안으로, 항체와 표지의 간접적인 접합을 성취하기 위해, 상기 항체는 소형 합텐(예를 들어, 디곡신)과 접합시킬 수 있고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체(예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 따라서, 항체와 표지의 간접적인 접합을 성취할 수 있다.
예시적인 방사성 동위원소 표지는 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I를 포함한다. 상기 항체는 예를 들어, 문헌[참조: Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs]에 기재된 기술을 사용하여 상기 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있다. 방사성 활성은 예를 들어, 섬광 계수기로 측정할 수 있다.
예시적인 형광 표지는 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체로부터 유도된 표지를 포함하고, 댄실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 이용가능하다. 상기 형광성 표지는 예를 들어, 문헌[참조: Current Protocols in Immunology, supra]에 기재된 것들과 같은 공지된 기술을 통해 항체에 접합시킬 수 있다. 형광성은 형광 측정기를 사용하여 정량할 수 있다.
당업계에 공지된 널리-특성 분석된 다양한 효소-기질 표지가 있다(문헌참조: 검토를 위해 미국 특허 제4,275,149호). 상기 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변형을 촉매한다. 예를 들어, 변형은 분광학적으로 측정될 수 있는 기질내 색상 변화일 수 있다. 대안으로, 상기 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변화시킬 수 있다. 형광성 변화를 정량하기 위한 기술은 상기되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전기적으로 여기되고, 이어서 화학적 발광 측정기를 사용하여 측정될 수 있는 광을 방출할 수 있거나 에너지를 형광 수용체에 공여할 수 있다.
효소적 표지의 예는 초파리 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등과 같은 루시페라제를 포함한다. 효소를 항체에 접합시키기 위한 기술은 예를 들어, 문헌[참조: O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다: 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)와 기질로서의 하이드로겐 퍼옥시다제(여기서, 상기 하이드로겐 퍼옥시다제는 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB)와 같은 염료 전구체를 산화시킨다); 알칼리성 포스파타제(AP)와 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 β-D-갈락토시다제(β-D-Gal)와 발색 기질, 예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제 또는 형광성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.
많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해 미국 특허 제4,275,149호 및 미국 특허 제4,318,980호를 참조한다.
다른 실시형태에서, 상기 사람화된 항-CD40 항체는 비표지된 상태로 사용되고 사람화된 항-CD40 항체와 결합하는 표지된 항체로 검출된다.
본원에 기재된 항체는 경쟁 결합 검사, 직접적이고 간접적인 샌드위치 검사 및 면역침전 검사법과 같은 공지된 임의의 검사 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987))을 참조한다.
진단학적 키트
사람화된 항-CD40 항체가 진단학적 키트, 즉, 진단학적 검사를 수행하기 위한 지침서와 함께 소정량의 팩키징된 시약의 조합으로 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 상기 키트는 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체와 같은, 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조 인자를 포함할 수 있다. 추가로, 안정화제, 완충제(예를 들어, 블록 완충제 또는 용해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 실질적으로 검사의 감도를 최적화하는 시약의 용액 중에 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 상기 시약은 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있고, 용해시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함한다.
치료학적 용도
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 사람화된 항-CD40 항체는 본원에 기재된 바와 같은 CD40의 발현과 관련된 다양한 장애의 치료에 유용하다.
상기 사람화된 항-CD40 항체 또는 시약은 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여되고, 경우에 따라 국소 면역억제 치료를 위해 병변내 투여한다(이식 전에 이식편을 항체로 관류시키거나 이와 접촉시킴을 포함함). 상기 사람화된 항-CD40 항체 또는 제제는 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus)로서 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 상기 사람화된 항-CD40 항체는 펄스 주입에 의해 적합하게 투여되고, 특히 감소하는 용량의 항체로 투여된다. 하나의 양상에서, 상기 용량은 주사, 가장 바람직하게는 부분적으로 투여가 일시적이거나 만성적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적당한 항체의 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환 유형, 질환의 중증도 및 경로, 항체가 예방적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당 의사의 소견과 같은 다양한 인자에 따라 다양할 것이다. 상기 항체는 적합하게 한번에 또는 일련의 치료로 환자에게 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 20 mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 15 mg/kg)의 항체가 예를 들어, 1회 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입에 의한 것인지의 여부에 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이다. 전형적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 몇일 또는 오랜 기간 동안 반복적인 투여를 위해, 병태에 따라 상기 치료는 목적하는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 지속한다. 그러나, 다른 용량 치료계획이 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 과정은 통상적인 기술 및 검사에 의해 용이하게 모니터링된다. 예시적인 용량 치료계획은 WO94/04188에 기재되어 있다.
"경감" 및 "완화"와 같은 의미로 본원에 사용되는 용어 "억제"는 질환의 하나 이상의 특징을 감소시킴을 의미한다.
항체 조성물은 우수한 의학적 관행과 일치하는 양식으로 제형화된 용량으로 투여된다. 여기서 고려해야 할 인자는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 의학적 수행자에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여될 "치료학적 유효량"의 항체는 상기의 고려에 의해 지배되고, CD40 발현과 관련된 장애를 예방하거나 경감시키거나 치료하는데 필요한 최소량이다.
상기 항체는 그럴 필요는 없지만 미지의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화한다. 상기 제제의 유효량은 제형 중에 존재하는 사람화된 항-CD40 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에서 사용된 바와 같은 동일한 용량 및 투여 경로 또는 이전에 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
CD40-관련 장애
상기 항-CD40 항체 또는 제제는 CD40의 발현을 특징으로 하는, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, 림프구 또는 수지상 세포)의 부적절한 활성화를 특징으로 하는 CD40-발현 암 또는 면역학적 장애를 치료하거나 예방하기 위해 유용하다. 상기 CD40의 발현은 예를 들어, 세표 표면 상에 증가된 CD40 단백질 및/또는 상기 발현된 CD40의 변형된 항원성으로 인한 것일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따른 면역학적 장애의 치료 또는 예방은 유효량의 항-CD40 항체 또는 제제를, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 피검체에게 투여하여 항체가 (i) CD40을 발현하고 질환 상태와 관련된 활성화된 면역 세포에 결합하고 (ii) 활성화된 면역 세포상에서 세포독성, 세포억제성 또는 면역억제성 효과를 나타냄으로써 성취된다.
면역 세포의 부적절한 활성화를 특징으로 하고 본원에 기재된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 면역학적 질환은 예를 들어, 장애를 뒷받침하는 과민성 반응(들) 유형(들)에 의해 분류될 수 있다. 이들 반응은 전형적으로 4가지 유형으로 분류된다: 과민감성 반응, 세포독성(세포용해성) 반응, 면역 복합체 반응 또는 세포-매개된 면역(CMI) 반응(또한, 지연형 과민감성(DTH) 반응으로 언급됨). 문헌[Fundamental Immunology(William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993)]을 참조한다.
상기 면역학적 질환의 특정 예는 하기를 포함한다: 류마티스 관절염, 자가면역 탈수초성 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염), 내분비 안질환, 포도막염, 전신성 홍반성 낭창, 중증 근무력증, 그레이브 질환, 사구체신염, 자가면역 혈액학적 장애, 염증성 장 질환(예를 들어, 크론 질환 또는 궤양성 장염), 과민증, 알레르기 반응, 쇼그렌 증후군, I형 진성 당뇨병, 원발성 담즙성 간경변, 베게너 육아종증, 섬유근육통, 다발성근염, 피부근육염, 염증성 근염, 다발성 내분비 부전증, 슈미트 증후군, 자가면역 포도막염, 애디슨 질환, 부신염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 위축성 위염, 만성 간염, 루포이드 간염, 죽상 동맥경화증, 아급성 피부 홍반성 낭창, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 심상성 천포창, 천포창, 포진성 피부염, 원형 탈모증, 유천포장, 경피증, 진행성 전신 경화증, CREST 증후군(석회증, 레이노드 현상, 식도 운동 장애, 수지 경화증), 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직성 척추염, 궤양성 장염, 복합 연결 조직 질환, 결절성 다발성 동맥염, 전신 괴사성 혈관염, 아토피성 피부염, 위축성 비염, 굿 파스튜어 증후군, 샤가스 질환, 유육종증, 류마티스 열, 천식, 재발성 낙태, 항-인지질 증후군, 농부폐(farmer's lung), 다형 홍반(erythema multiforme), 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 자가면역 만성 활성 간염, 새 사육자 폐(bird-fancier's lung), 독성 표피 괴사융해, 알포트 증후군(Alport's syndrome), 폐포염, 알레르기 폐포염, 섬유성 폐포염, 간질 폐 질환, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 수혈 반응, 다카야수 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 측두동맥염, 주혈흡충증, 거대 세포 동맥염, 회충증, 아스퍼질러스증, 샘프터 증후군, 습진, 림프종모양 육아종증, 베체트 질환(Behcet's disease), 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 카와사키 질환, 뎅기, 뇌척수염, 심내막염, 심내막 섬유증, 내안구염, 장기 융기성 홍반(erythema elevatum et diutinum), 건선, 태아성 적아구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군(Shulman's syndrome), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 필라리아증, 모양체염, 만성 모양체염, 이종만성 모양체염, 푸흐 모양체염, IgA 신장병, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부증, 심근병증, 이튼-램버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 재발성 다발연골염, 한냉글로불린혈증(cryoglobulinemia), 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 에반 증후군(Evan's syndrome), 급성 호흡 곤란 증후군, 폐 염증, 골다공증, 지연형 과민감성 및 자가면역 성선 부전증.
따라서, 본원에 기재된 방법은 B 림프구 장애(예를 들어, 전신성 홍반성 낭창, 굿 파스튜어 증후군, 류마티스 관절염 및 I형 당뇨병), Th1-림프구의 장애(예를 들어, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 베게너 육아종증, 결핵 또는 이식편 대 숙주 질환) 또는 Th2-림프구의 장애(예를 들어, 아토피성 피부염, 전신성 홍반성 낭창, 아토피성 천식, 비염, 알레르기성 비염, 오멘 증훈, 전신 경화증 또는 만성 이식편 대 숙주 질환)의 치료를 포함한다. 일반적으로 수지상 세포를 포함하는 장애는 Th1-림프구 또는 Th2-림프구의 장애를 포함한다.
류마티스성 관절염(RA)은 인구 약 1%에 영향을 미치는 가장 통상적인 염증성 자가면역 질환 중 하나이다. 효과적인 치료법(예를 들어, MTX 및 항-TNF 제제)이 이용가능하지만, 특히 항-TNF 치료요법에 적절히 응답하지 않는 (환자의 약 30%) 환자들에 대한 의학적 요구를 충족시키지 못한다. 추가로, 환자의 50% 이하는 주로 부작용 뿐만 아니라 증가되는 인지된 수의 환자가 치료학적 이득을 얻지 못하기 때문에 5년 이내에 TNF-길항제 치료를 중단한다. 따라서, RA에서 염증 및 관절 파괴를 표적화하지만 유일하게 TNF의 직접적인 억제에 의존하지 않는 효과적인 치료요법을 확립하는 것이 중요하다. 매우 매력적인 접근법은 공동-자극 세포 경로를 표적화하는 것이다. 공동자극에서 주요 수용체-리간드 쌍 중 하나는 CD40/CD40L이다. 상기 시스템은 면역 세포간의 상호작용 및 면역과 비-면역 세포간의 상호작용을 가능하게 하고, 이 모두는 RA의 병리학에서 중요하다. 본 발명의 길항성 항체를 사용한 CD40의 차단은 RA에서 하기의 효과 중 하나 이상을 가질 수 있다:
1) B 세포 분화 및 항체 이소형 스위칭을 억제하고;
2) T-세포 및 마크로파지에서 사이토킨 및 케모킨 생산 및 접착 분자의 상향조절을 억제하고;
3) 수지상 세포의 활성화를 억제하고;
4) 염증촉진 사이토킨, 케모킨, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 프로스타글란딘의 생성을 억제하고, 비면역 세포(예를 들어, 상피, 내피 및 간엽 세포)내의 접착 분자의 하향 조절을 억제한다.
상기 효과 중 하나를 성취하는 방법은 본원에서 명백하게 고려된다. RA에 추가로, 본 발명의 조성물은 특히 다발성 경화증, 건선(건선성 관절염을 포함함), 소아성 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 낭창 및 고형 기관 이식의 치료 방법에 유용하다.
류마티스 관절염(RA)은 성인에서 대략 1%의 만연성을 갖는 만성 전신성 자가면역 질환이다. 상기 질환은 계속 진행하여 상당한 이환율 및 미성숙한 치사율(치사율은 주로 악화된 심혈관 질환 때문이다)을 유발한다. 현재, 관절 손상이 질환 과정 중에 조기에 발생하고 환자의 30% 이하는 진단시 골 침식의 방사선적 증거를 나타내고 1년 후에는 60%까지 증가하는 것으로 밝혀졌다. 현재 지침서는 명확한 진단이 확정된 후 3개월 내에 통상적인 질환-개질 항류마티스 약물(DMARD)을 사용한 치료요법을 개시할 것을 추천한다. DMARD는 관절 손상을 감소시키거나 예방하고 관절 기능을 유지할 잠재력을 갖는다. 현재, 류마티스 관절염 학자는 대부분의 환자에 대해 초기 DMARD 치료제로서 메토트렉세이트(MTX)를 선택한다.
TNF-길항제 에타너셉트(Enbrel®), 인플릭시마브(Remicade®), 아달리무마브(Humira®), CTLA4-길항제 아바타셉트(Orencia®), 항-IL-6 수용체 mAb 토실리주마브 및 항-CD20 mAb 리툭시마브(Rituxan®)가 RA의 치료에 효과적이다. 현재 지침서는 일반적으로 통상적인 DMARD에 대한 부적당한 반응 후 활성 RA의 치료를 위해 생물학적 DMARD를 사용할 것을 추천한다.
이전의 MTX 치료 없이 조기 공격적 RA를 나타내는 환자에서의 최근 연구는 TNF-길항제와 MTX의 병용이 단일 치료요법으로서 사용되는 각각의 경우보다 우수함을 보여주었다. 가장 두드러진 결과는 병용 치료요법의 상당한 방사선학적 이득이었다. 따라서, MTX와 TNF-억제제의 병용이 공격적 질환 및 공격적 표현형(예를 들어, 높은 활성 스코어, 기능적 손상, 류마티스 인자(RF)에 대한 혈청양성 또는 항-사이클릭 시트룰린화된 펩타이드 항체(CCP), 상승된 CRP, 방사선학적 침식)에 대한 위험성이 매우 높은 환자에서 사용되어야만 한다. 그러나, 본 발명자는 임상적 수행에서 TNF-길항제가 제1 라인 치료요법으로서 사용되는 것은 드물 것으로 예상한다. 미국 류마티스 관절염 학자의 연구 조사는 2005년 4월에 수행되었고, TNF-길항제를 사용해야 한다는 결정에 가장 영향을 미치는 인자가 MTX 또는 다수의 DMARD의 실패, 의사의 평가, 기능성 손상 및 방사선학적 악화 또는 침식임을 보여주었다. 현재, RA를 갖는 환자의 대략 20%는 미국에서 TNF-억제제 치료요법을 받고 있다.
상당수의 RA 환자들은 약물 내성 및 독성 또는 반응의 결여 때문에 생물학적 치료요법을 포함하는 현재 치료로 적절히 도움을 받지 못하고 있다. 환자의 50% 이하는 주로 부작용뿐만 아니라 증가하는 인지되는 수의 환자들이 이들의 반응을 상실하기 때문에 5년 내에 TNF 길항제 치료를 중단한다.
일부 실시형태에서, 면역학적 장애는 T 세포-매개된 면역학적 장애, 예를 들어, 장애와 관련된 활성화된 T 세포가 CD40을 발현하는 T 세포 장애이다. 항-CD40 항체 또는 제제는 상기 CD40-발현 활성화된 T 세포를 고갈시키기 위해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 제제의 투여는 CD40-발현 활성화된 T 세포를 고갈시킬 수 있지만, 휴식기 T 세포는 상기 항-CD40 또는 제제에 의해 실질적으로 고갈되지 않는다. 본원에서, "실질적으로 고갈되지 않는"이란 휴식기 T 세포 중 약 60% 미만, 또는 약 70% 미만 또는 약 80% 미만이 고갈되지 않음을 의미한다.
본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체 및 제제는 또한 CD40-발현 암을 치료하거나 예방하기 위해 유용하다. 본원에 기재된 방법에 따른 CD40-발현 암의 치료 또는 예방은 유효량의 항-CD40 항체 또는 제제를, 치료 또는 예방이 요구되는 피검체에게 투여하여 항체 또는 제제가 (i) CD40-발현 암 세포에 결합하고 (ii) 세포독성 또는 세포억제 효과를 나타내어 CD40-발현 암 세포를 고갈시키거나 이의 증식을 억제함에 의해 성취된다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 CD40-발현 암은 예를 들어, 백혈병, 예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수성 백혈병(예를 들어, 골수아구성, 전골수성, 골수단구성, 단구성 또는 적백혈병), 만성 백혈병, 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병; 진성 다혈구증; 림프종(예를 들어, 호지킨 질환 또는 비호지킨 질환); 다발성 골수종, 발덴스트룀 거대글로불린혈증; 중쇄 질환; 고형 종양, 예를 들어, 육종 및 암종(예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골성 육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 결장직장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 경부암, 자궁암, 고환 종양, 폐 암종, 소형 세포 폐 암종, 비 소형 세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경아교종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종, 비인두암종, 또는 식도 암종)을 포함한다.
약제학적 조성물 및 이의 투여
CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)를 포함하는 조성물은 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암을 갖거나 이의 위험에 처한 피검체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 추가로 CD40 발현 암 또는 면역학적 장애의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에서 CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "피검체"는 CD40-결합제가 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미하고, 예를 들어, 사람 및 비사람 포유동물, 예를 들어, 영장류, 설치류 및 개를 포함한다. 본원에 기재된 방법을 사용한 치료를 위해 구체적으로 의도된 피검체는 사람을 포함한다. 상기 항체 또는 제제는 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 예방 또는 치료에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
상기 약제학적 조성물에 사용하기 위해 바람직한 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 사람화된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것들이다.
일부 실시형태는 서열번호 26, 서열번호 31, 또는 서열번호 36의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특히 바람직한 사람화된 항체 조성물은 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명에서 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 중쇄 서열 중 어느 하나를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 다른 실시형태는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76의 서열 중 어느 하나의 임의의 서열의 경쇄 서열을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다.
RA의 치료가 고려되는 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 단독의 MTX에 적당히 반응하지 않는 중간정도 내지 중증 활성 RA를 갖는 환자에서 주요 임상적 반응을 유도하고 구조적 손상의 진행을 감소시키면서, 징후 및 증상을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 현재 예시적인 당해 치료요법은 엔브렐(Enbrel)/휴미라(Humira)(휴미라 및 엔브렐을 사용한 데이터는 2개의 상이한 환자 집단에서 수득되었다)이다. 본 발명의 조성물은 단독의 MTX에 응답하지 않는 피검체에 대해 엔브렐/휴미라 치료요법 대신에 또는 엔브렐/휴미라 치료법과의 조합으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 6개월째에 ACR20이 화합물 + MTX에 대해 > 85%(GS: 엔브렐 + MTX 71% 대 위약 + MTX 27%, 휴미라 + MTX 12개월째 59% 대 위약 + MTX 24%)*에 의해 결정되는 바와 같이 메토트렉세이트에 대해 부적당한 반응을 갖는 환자에서 엔브렐 + MTX에 대한 우수한 효능을 가질 것이다. 본 발명의 조성물의 보다 우수한 효능에 대한 추가의 기준은 다음을 포함할 수 있다: 엔브렐과 유사한 1년 기간 이상의 구조적 손상의 진행 억제(52주 후 평균 변형된 샤프 스코어 휴미라 + MTX 0.1 대 위약 + MTX 2.7)*. 여전히 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 ACR70(휴미라 + MTX에 대해 20%, 위약 + MTX에 대해 4%)*에 의해 결정되는 바와 같이 메토트렉세이트에 대한 부적당한 반응을 나타내는 환자에서 엔브렐 보다 우수한 "주요 임상적 반응"을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-TNF 제제에 대해 부적당한 반응을 갖는 중간정도 내지 중증 활성 RA를 갖는 환자에서 주요 임상적 반응을 유도하고 구조적 손상의 진행을 감소시키는, 징후 및 증상을 감소시키는 것으로 나타날 수 있다. 현재 골드 표준: 비-항-TNF 생물학적 치료요법. 바람직하게, 상기 피검체에서, 본 발명의 조성물은 항-TNF 제제에 대해 부적당한 반응을 갖는 환자에서 병력적 비교에 의해 비-항-TNF 생물학적(예를 들어, 오렌시아, 리툭산)과 비교하여 열등하지 않은 효능을 갖는다: 6개월째 ACR20은 화합물 + DMARD에 대해 >50%(GS: 오렌시아 + DMARD 50% 대 위약 + DMARD 20%). 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 리툭산과 유사하게 관절 침식 및 관절 공간의 좁아짐에 대해 받아들여진 X-선 스코어링 방법에 의한 평가시 1년 기간 이상의 구조적 손상의 진행을 억제한다(52주 후 평균 변형된 샤프 스코어 리툭산 + MTX 1.0 대 위약 + MTX 2.31).
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 CD40 결합제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. CD40 결합제는 예를 들어, 주입, 볼루스 또는 주사에 의해 투여될 수 있고, 화학치료제와 같은 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신성이거나 국소적일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 투여는 피하 주사에 의한 것이다. 상기 주사용 제형은 예를 들어, 격주 1회로 투여될 수 있는 사전 충전된 주사기로 제조될 수 있다.
본 발명의 항체의 안전성 특성을 결정하고, 이는 바람직하게는 다음과 같은 하나 이상의 특징을 포함할 것이다: 류마티스 관절염을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 다른 약물(예를 들어, DMARD, 스테로이드, NSAID)과 임상적으로 상당한 부작용을 나타내지 않음; 엔브렐과 비교하여, 안전성 또는 내성 문제로 인한 보다 큰 중단율을 나타내지 않음; 항-TNF 제제 또는 다른 통상적으로 사용되는 생물학적 제제 보다 큰 심각한 감염율을 나타내지 않음; 엔브렐과 유사한 주사 부위 반응 또는 주입 반응의 빈도수 및/또는 중증도; 치료요법의 반복 주기에 따른 치료시 약물 내성이 발현되지 않거나 최소의 발현(5% 미만); 중화 항체 부재이거나 최소; 생체내 혈전색전증을 유발할 수 있는 증진된 혈소판 응고/활성화 또는 출혈을 유발할 수 있는 혈소판/내피 기능부전의 증거 부재.
특정 실시형태에서, CD40 결합 제제 조성물은 주사에 의해, 또는 카테터를 수단으로, 좌제에 의해 또는 시알라스틱 막 또는 섬유와 같은, 막을 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질로 이루어진 이식체에 의해 투여된다. 전형적으로, 상기 조성물을 투여하는 경우, 항-CD40 항체 또는 제제가 흡수하지 않는 물질이 사용된다.
다른 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 제제는 제어 방출 시스템으로 전달된다. 하나의 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌참조: Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(문헌참조: Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61). 또한, 문헌(Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351 ; Howard et al., 1 989, J. Neurosurg. 71:105.)을 참조한다. 다른 제어 방출 시스템은 예를 들어, 상기 문헌(Langer)에서 논의된다.
CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)는 치료학적 유효량의 결합제 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
전형적인 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 사람에게 정맥내 또는 피하 투여하기 위해 적합한 약제학적 조성물로서, 통상적인 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 주사 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 경우에 따라, 상기 약제는 또한 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 가용화제 및 국부 마취제(예를 들어, 리그노카인)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 예를 들어, 활성제의 양을 지적하는 앰플 또는 사쉐와 같은 밀봉 컨테이너내 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서의 단위 용량 형태로 별도로 또는 함께 혼합하여 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되어야만 하는 경우, 이것은 멸균 약제 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약제가 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
추가로, 상기 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)를 함유하는 컨테이너 및 (b) 주사용으로 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 컨테이너를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 희석제는 동결건조된 항-CD40 항체 또는 제제의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 임의로 상기 컨테이너(들)와 관련하여 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시된 형태의 공고문일 수 있고, 상기 공고문은 사람 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매에 대한 상기 기관의 승인을 반영한다.
면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 치료 또는 예방에 효과적인 CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)의 양은 표준 임상적 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 검사는 임의로 최적의 용량 범위의 동정을 돕기 위해 사용될 수 있다. 상기 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 단계에 의존하고, 수행자의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
예를 들어, 항-CD40 항체 또는 제제의 독성 및 치료학적 효능은 ED50(집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 과정에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 대형 치료학적 지수를 나타내는 CD40-결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)가 바람직하다. CD40-결합제가 독성 부작용을 나타내는 경우, 환부 조직 부위로 CD40-결합제를 표적화하는 전달 시스템은 비-CD40-발현 세포의 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
세포 배양 검사 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 사람에 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. CD40 결합제의 용량은 전형적으로 거의 독성이 없는 ED50을 포함하는 혈액 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 사용되는 용량 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 상기 방법에 사용되는 임의의 CD40 결합제에 대해, 상기 치료학적 유효 용량은 처음에 세포 배양 검사로부터 평가할 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정되는 바와 같이 IC50(즉 증상의 최대 절반 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위한 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보를 사용하여 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, ELISA 등에 의해 측정될 수 있다.
일반적으로, 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암을 갖는 환자에게 투여되는 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 용량은 전형적으로 피검체의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg이다. 피검체에 투여되는 용량은 피검체의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 50 mg, 약 1 mg 내지 약 30 mg, 약 1 mg 내지 약 20 mg, 약 1 mg 내지 약 15 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 10 mg이다.
예시적인 용량은 1 ng/kg 내지 100 mg/kg을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 13 mg/kg, 약 14 mg/kg, 약 15 mg/kg 또는 약 16 mg/kg이다. 상기 용량은 예를 들어, 매일, 매주 1회(주간), 매주 2회, 매주 3회, 매주 4회, 매주 5회, 매주 6회, 2주 간격으로 또는 1개월 간격으로, 2개월 간격으로 또는 3개월 간격으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 용량은 약 0.5 mg/kg/주, 약 1 mg/kg/주, 약 2 mg/kg/주, 약 3 mg/kg/주, 약 4 mg/kg/주, 약 5 mg/kg/주, 약 6 mg/kg/주, 약 7 mg/kg/주, 약 8 mg/kg/주, 약 9 mg/kg/주, 약 10 mg/kg/주, 약 11 mg/kg/주, 약 12 mg/kg/주, 약 13 mg/kg/주, 약 14 mg/kg/주, 약 15 mg/kg/주 또는 약 16 mg/kg/주이다. 일부 실시형태에서, 상기 용량의 범위는 약 1 mg/kg/주 내지 약 15 mg/kg/주이다.
일부 실시형태에서, CD40 결합제를 포함하는 약제학적 조성물은 결합제에 접합되거나 접합되지 않은 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제는 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 치료제와 병용하여 동시-투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 치료요법은 세포억제, 세포독성 또는 면역억제제를 포함할 수 있다. 병용 치료요법은 또한 예를 들어, 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포의 표면 상에 CD40 이외의 수용체 또는 수용체 복합체를 표적화하는 제제의 투여를 포함할 수 있다. 상기 제제의 예는 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포의 표면에서 분자에 결합하는 제2 비-CD40 항체를 포함한다. 다른 예는 상기 수용체 또는 수용체 복합체를 표적화하는 리간드를 포함한다. 전형적으로, 상기 항체 또는 리간드는 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포 상에 세포 표면 수용체에 결합하고, 세포억제 또는 세포독성 시그널을 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포에 전달함에 의해 항-CD40 항체의 세포독성 또는 세포억제 효과를 증진시킨다.
상기 병용 치료요법 투여는 질환 계수(예를 들어, 증상의 중증도, 증상 수 또는 재발 빈도)에 대한 부가적 또는 공동상승 효과를 가질 수 있다.
병용 투여를 위한 치료학적 치료계획과 관련하여, 특정 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제는 치료제와 동시에 투여된다. 다른 특정 실시형태에서, 상기 치료제는 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여 전 또는 후에 적어도 1시간 및 수개월 간격으로, 예를 들어, 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여 전 또는 후에 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 하루, 1주, 1개월 또는 3개월 간격으로 투여된다.
유용한 부류의 세포독성 또는 면역억제제는 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴스(예를 들어, MMAE 또는 MMAF), DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예를 들어, 시스-플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 착물 및 카보플라틴과 같은 백금 착물), 안트라사이클린, 항생제, 안티폴레이트, 항대사물, 화학치료 감작화제, 두오카마이신, 에토포사이드, 불소화된 피리미딘, 이온투과 담체, 렉시트로프신, 니트로소우레아, 플라티놀, 예비-형성 화합물, 퓨린 항대사물, 푸로마이신, 방사선 감작화제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.
개별 세포독성 또는 면역억제제는 예를 들어, 안드로겐, 안트라마이신(AMC), 아스파라긴아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부설판, 부티오닌 설폭스이민, 캄프토테신, 카보플라틴, 카무스틴(BSNU), CC-1065, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시티딘 아라비노사이드, 사이토칼라신 B, 다카바진, 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 다우노루비신, 데카바진, 도세탁셀, 독소루비신, 에스트로겐, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우라실, 그라미시딘 D, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴(CCNU), 메클로르에타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미톡산트론, 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 플리카마이신, 프로카비진, 스트렙토조토신, 테노포사이드, 6-티오구아닌, 티오TEPA, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 VM-26을 포함한다.
일부 전형적인 실시형태에서, 상기 치료제는 세포독성제이다. 적합한 세포독성 제제는 예를 들어, 돌라스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB 또는 AEVB), DNA 마이너 그루브 결합제(예를 들어, 에네디인 및 렉시트로프신), 두오카마이신, 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 푸로마이신, 빈카 알칼로이드, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 네트로프신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 디스코데르몰리드, 엘레우테로빈, 또는 미톡산트론을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포독성제는 통상적인 화학치료제, 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포사이드이다. 추가로, 강력한 제제, 예를 들어, CC-1065 유사체, 칼리케아미신, 마이탄신, 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신 및 팔리톡신이 항-CD40 항체 또는 이의 제제에 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포독성 또는 세포억제제는 아우리스타틴 E(또한 당업계에서 돌라스타틴-10으로서 공지됨) 또는 이의 유도체이다. 전형적으로, 아우리스타틴 E 유도체는 예를 들어, 아우리스타틴 E와 케토산간에 형성된 에스테르이다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응시켜 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴 유도체는 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 아우리스타틴 E 및 이의 유도체의 합성 및 구조는 예를 들어, 미국 특허원 공보 제2004-0157782 A1호 및 제2005-0238649호; 국제 특허원 번호 제PCT/US03/24209호, 국제 특허원 제PCT/US02/13435호, 및 미국 특허 제6,884,869호; 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 기재되어 있고; 상기 문헌의 기재는 본원에 참조로서 인용된다.
특정 실시형태에서, 세포억제제는 DNA 마이너 그루브 결합제이다(문헌참조: 미국 특허 제6,130,237호). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물이다. 다른 실시형태에서, 상기 마이너 그루브 결합제는 에네디인(예를 들어, 칼리케아미신)이다.
항-튜불린 제제의 예는 탁산(예를 들어, Taxol®(파클리탁셀), Taxotere®(도세탁셀)), T67(툴라리크), 빈카 알킬로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 돌라스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 다른 항튜불린 제제는 예를 들어, 박카틴 유도체, 탁산 유사체(예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드, 및 엘레우테로빈을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포독성제는 마이탄시노이드, 다른 그룹의 항-튜불린 제제이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 마이탄시노이드는 마이탄신 또는 DM-1(ImmunoGen, Inc.; 또한 문헌참조: Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131)이다.
일부 실시형태에서, 상기 치료제는 방사성 동위원소가 아니다.
일부 실시형태에서, 세포독성 또는 면역억제제는 항대사물이다. 항대사물은 예를 들어, 퓨린 길항제(예를 들어, 아조티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸), 디하이드로폴레이트 리덕타제 억제제(예를 들어, 메토트렉세이트), 아사이클로비르, 간시클로비르, 지도부딘, 비다라빈, 리바바린, 아지도티미딘, 시티딘 아라비노사이드, 아만타딘, 디데옥시우리딘, 요오도데옥시우리딘, 포스카메트, 또는 트리플루리딘일 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포독성 또는 면역억제제는 타크롤리무스, 사이클로스포린 또는 라파마이신이다. 추가의 실시형태에서, 세포독성제는 알데스류킨, 알렘투주마브, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 아르센 트리옥사이드, 벡사로텐, 벡사로텐, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 클라드리빈, 다베포에틴 알파, 데니류킨 디프티톡스, 덱스라족산, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에스트라무스틴, 엑세메스탄, 필그라스팀, 플록스우리딘, 플루다라빈, 풀베스트란트, 겜시타빈, 겜투주마브 오조가미신, 고세렐린, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브 메실레이트, 인터페론 알파-2a, 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 레바미솔, 메클로르에타민 또는 질소 머스타드, 메게스트롤, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 난드롤론 펜프로피오네이트, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포르피머 나트륨, 프로카바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 레블리미드, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 토레미펜, 토시투모마브, 트라스투주마브, 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 및 졸레드로네이트이다.
추가의 실시형태에서, 상기 약물은 사람화된 항-HER2 모노클로날 항체; RITUXAN(리툭시마브; Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.); 키메라 항-CD20 모노클로날 항체); OVAREX(AltaRex Corporation, MA); PANOREX(Glaxo Wellcome, NC; 뮤린 IgG2a 항체); 세툭시마브 에리비툭스(Cetuximab Erbitux)(Imclone Systems Inc., NY; 항-EGFR IgG 키메라 항체); 비탁신(Vitaxin) (MedImmune, Inc., MD); Campath I/H (Leukosite, MA; 사람화된 IgG1 항체); 스마트 MI95(Protein Design Labs, Inc., CA; 사람화된 항-CD33 IgG 항체); LymphoCide(Immunomedics, Inc., NJ; 사람화된 항-CD22 IgG 항체); 스마트 ID10(Protein Design Labs, Inc., CA; 사람화된 항-HLA-DR 항체); 온콜림(Oncolym)(Techniclone, Inc., CA; 방사성 표지된 뮤린 항-HLA-Dr10 항체); 알로뮨(Allomune)(BioTransplant, CA; 사람화된 항-CD2 mAb); 아바스틴(Avastin)(Genentech, Inc., CA; 항-VEGF 사람화된 항체);에프라투주마브(Epratuzamab)(Immunomedics, Inc., NJ and Amgen, CA; 항-CD22 항체); 및 CEAcide(Immunomedics, NJ; 사람화된 항-CEA 항체)이다.
다른 적합한 항체는 하기의 항원에 대한 항체를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, 루이스 Y, 루이스 X, 알파 페토단백질, CA 242, 태반 알칼리성 포스파타제, 전립선 특이적 항원, 프로스타트산 포스파타제, 상피 성장 인자, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, 항-트랜스페린 수용체, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, 전립선 특이적 항원, IL-2 수용체, CD20, CD52, CD33, CD22, 사람 융모막의 고나도트로핀, CD38, 뮤신, P21, MPG, 및 Neu 종양 유전자 생성물.
일부 실시형태에서, 치료제는 면역억제제이다. 상기 면역억제제는 예를 들어 간사이클로비르(gancyclovir), 에타너셉트, 타크롤리무스, 사이클로스포린, 라파마이신, 사이크로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸 또는 메토트렉세이트일 수 있다. 대안적으로, 면역억제제는 예를 들어, 글루코코르티코이드(예를 들어, 코티졸 또는 알도스테론) 또는 글루코코르티코이드 유사체(예를 들어, 프레드니손 또는 덱사메타손)일 수 있다.
적합한 사이클로옥시게나제 억제제는 메클로페남산, 메페남산, 카프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 펜부펜, 페노프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 나부메톤, 나프록센, 설린닥, 테녹시캠, 톨메틴, 및 아세틸살리실산을 포함한다.
적합한 리폭시게나제 억제제는 산화환원(Redox) 억제제(예를 들어, 카테콜 부탄 유도체, 노르디하이드로구아이아레트산(NDGA), 마소프로콜, 페니돈, 라노팔렌, 인다졸리논, 나파자트롬, 벤조푸라놀, 알킬하이드록실아민), 및 비-산화환원 억제제(예를 들어, 하이드록시티아졸, 메톡시알킬티아졸, 벤조피란 및 이의 유도체, 메톡시테트라하이드로피란, 보스웰산 및 보스웰산의 아세틸화된 유도체, 및 사이클로알킬 라디칼로 치환된 퀴놀린메톡시페닐아세트산), 및 산화환원 억제제의 전구체를 포함한다.
다른 적합한 리폭시게나제 억제제는 항산화제(예를 들어, 페놀, 프로필 갈레이트, 플라보노이드 및/또는 플라보노이드를 함유하는 천연 발생 기질, 플라본의 하이드록실화된 유도체, 플라보놀, 디하이드로쿼세틴, 루테올, 갈란긴, 오로볼, 칼콘의 유도체, 4,2',4'-트리하이드록시칼콘, 오르토-아미노페놀, N-하이드록시우레아, 벤조푸라놀, 에브셀렌 및 환원 셀레노엔자임의 활성을 증가시키는 종), 철 킬레이트 제제(예를 들어, 하이드록삼산 및 이의 유도체, N-하이드록시우레아, 2-벤질-1-나프톨, 카테콜, 하이드록실아민, 카노졸 트롤록스 C, 카테콜, 나프톨, 설파살라진, 질류톤, 5-하이드록시안트라닐산 및 4-(오메가-아르알킬)페닐알칸산), 이미다졸-함유 화합물(예를 들어, 케토코나졸 및 이트라코나졸), 페노티아진 및 벤조피란 유도체를 포함한다.
또 다른 적합한 리폭시게나제 억제제는 에이코사노이드의 억제제(예를 들어, 옥타데카테트라에노산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사헥사엔산 및 도코사헥사엔산 및 이의 에스테르, PGE1(프로스타글란딘 E1), PGA2(프로스타글란딘 A2), 비프로스톨, 15-모노하이드록시에이코사테트라엔산, 15-모노하이드록시-에이코사트리엔산 및 15-모노하이드록시에이코사펜타엔산, 및 류코트리엔 B5, C5 및 D5), 칼슘 흐름을 방해하는 화합물, 페노티아진, 디페닐부틸아민, 베라파밀, 푸코사이드, 쿠르쿠민, 클로로겐산, 카페산, 5,8,11,14-에이코사테트라이엔산(ETYA), 하이드록시페닐레틴아미드, 로나팔렌, 에스쿨린, 디에틸카바마진, 페난트롤린, 바이칼레인, 프록시크로밀, 티오에테르, 디알릴 설파이드 및 디-(1-프로페닐)설파이드를 포함한다.
류코트리엔 수용체 길항제는 칼시트리올, 온타졸라스트, 바이어 Bay-x-1005, 시바-가이기 CGS-25019C, 에브셀렌, 레오 덴마크 ETH-615, 릴리 LY-293111, 오노 ONO-4057, 테루모 TMK-688, 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingleheim) BI-RM-270, 릴리 LY 213024, 릴리 LY 264086, 릴리 LY 292728, 오노 ONO LB457, 파이저 105696, 페르두 프레데릭 PF 10042, 론-포울렌 로러(Rhone-Poulenc Rorer) RP 66153, 스미스클린 비캠(SmithKline Beecham) SB-201 146, 스미스클린 비캠(SmithKline Beecham) SB-201993, 스미스클린 비캠 SB-209247, 세아를레(Searle) SC-53228, 스미토모(Sumitamo) SM 15178, 아메리칸 홈 프로덕츠(American Home Products) WAY 121006, 베이어 베이(Bayer Bay)-o-8276, 워너-램버트(Warner-Lambert) CI-987, 와너-람베르트 CI-987BPC-15LY 223982, 릴리 LY 233569, 릴리 LY-255283, 마크로넥스(MacroNex) MNX-160, 머크 앤드 코포레이션(Merck and Co.) MK-591, 머크 앤드 코포레이션 MK-886, 오노 ONO-LB-448, 퍼듀 프레데릭(Purdue Frederick) PF-5901, 론-포울렌 로러 RG 14893, 론-포울렌 로러 RP 66364, 론-포울렌 로러 RP 69698, 쉬오노오기(Shionoogi) S-2474, 세아를레(Searle) SC-41930, 세아를레 SC-50505, 세아를레 SC-51146, 세아를레 SC-52798, 스미스클린 비캠 SK 및 F-104493, 레오 덴마크 SR-2566, 타나베 T-757 및 테이진(Teijin) TEI-1338을 포함한다.
제품
다른 양상에서, 상기된 장애의 치료를 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 포함된다. 제품은 컨테이너 및 표지를 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험 튜부를 포함한다. 상기 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 컨테이너는 병태를 치료하기에 효과적인 조성물을 유지하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 컨테이너는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다. 상기 조성물내 활성제는 사람화된 항-CD40 항체이다. 컨테이너 상에 또는 이와 함께 포함된 상기 표지는 조성물이 선택된 병태의 치료를 위해 사용됨을 지적한다. 제품은 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어, 인산-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 요망될 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있고, 다른 완충제, 희석제, 여과제, 바늘, 시린지 및 사용 지침서와 함게 패키지 삽입물을 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예로 추가로 기재되지만 이는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 사람화된 항- CD40 항체의 제조
뮤린 항체 20E2, 및 2H11은 상기된 표 1 및 표 2에 나타낸다. 20E2 및 2H11의 사람화가 완료되었다. 사람 및 뮤린 잔기들이 임의의 주어진 위치에서 사람 또는 뮤린 잔기일 수 있는 방식으로 다양한 라이브러리를 제조하였다. 사람 생식선과 뮤린 항체간에 상이한 상기 아미노산들에 대한 라이브러리를 제조하였다. 모 뮤린 항체의 기능을 보유하는 클론만을 선별하였다.
이러한 방식으로, 항체 A, 항체 B 및 항체 C는 마우스 항체 20E2(항체 A 및 항체 B) 또는 2H11(항체 C)가 사람 IgG1-KO(KO= 녹아웃)/카파 골격으로 클로닝되어 유래된 사람화된 항체이다. IgG1-KO는 Fc 영역에 2개의 돌연변이, 즉, Leu234Ala 및 Leu235Ala를 가져 FcγR 및 보체 결합이 감소되었다.
상기 사람화의 결과로 하기에 나타낸 다양한 사람화된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 수득하였다:
서열번호 41 (가변 경쇄 서열)
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서열번호 42 (가변 중쇄 서열)
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서열번호 52 (가변 경쇄 서열)
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서열번호 71 (가변 중쇄 서열)
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서열번호 72 (가변 중쇄 서열)
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서열번호 73 (가변 중쇄 서열)
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서열번호 74 (가변 경쇄 서열) 항체 10F2Hum 유래의 1
Figure 112012078932196-pct00048
서열번호 75 (가변 경쇄 서열) 항체 10F2Hum 유래의 2
Figure 112012078932196-pct00049
서열번호 76 (가변 경쇄 서열)
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본 발명의 예시적인 사람화된 항체는 하기의 표에 제시된 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 것들이다. 하기의 표에서 굵게 밑줄친 서열은 가변 도메인인 반면 보통의 밑줄치지 않은 서열은 불변 도메인이다:
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가변 영역은 1개 또는 2개의 상이한 적합한 IgG 발현 벡터에 서브클로닝하였다:
A) FcγR 및 보체 결합과 같은 이펙터 기능을 감소시키기 위해 Fc 영역내 Leu234Ala, Leu235Ala 이중 돌연변이를 갖는 사람 IgG1-KO(녹아웃)/카파 포맷
B) IgG4 절반-분자의 발생을 감소시키기 위해 힌지 영역 내에 Ser228Pro 돌연변이를 갖고 FcγR 결합을 추가로 감소시키기 위해 Leu235Glu 돌연변이를 갖는 사람 IgG4-DM(이중 돌연변이)/카파 포맷
2개의 후보 항체 A 및 항체 B를 정제하고 하기의 기준으로 평가하였다:
- CCF의 외관(탁도)
- CCF의 여과 성질
- r단백질 A에 대한 수율
- 용출 및 중화시 탁도
- 가용성 응집물(SEC)
- 순도/ 오염 패턴(SDS)
- 하전 패턴(IEF)
실시예 2: 시험관내 데이터
항체 A, 항체 B 및 항체 C는 공개된 서열을 기준으로 제조된 항체 4D11(Kirin/Astellas) 및 PG-102(PanGenetics)로 특성 분석하였다. 항체 A, 항체 B, 항체 C 및 4D11에 대한 데이터는 하기에 나타낸다. PG-102는 효능 활성 및 B 세포 증식의 단지 불완전 억제를 나타내었다(나타내지 않음). 표 2.2는 수득된 데이터를 요약한다. 상기 데이터의 보다 상세한 기재는 표 2.2에 따른다.
[표 2.2]
Figure 112012078932196-pct00055
A. 세포 CD40 및 재조합 CD40 단백질에 대한 사람화된 항체의 결합
세포 CD40에 대한 사람화된 항체의 특이적 결합은 사람 CD40-형질감염된 HEK293 세포를 사용하는 유동 세포측정기에 의해 분석하였다. 항체 A, 항체 B, 및 항체 C의 농도-의존성 결합을 관찰하였다. 상기 항체는 도 1b에 나타낸 유사한 결합 프로필을 나타내었다. 본 발명의 항체 및 기린 항체 4D11의 EC50 값은 모두 약 1nM의 동일한 범위에 있고, 이는 형질감염된 세포내 고수준의 CD40으로 인해 검사의 감도 한계치에 있을 가능성이 높다. 사람 라모스(Ramos) 세포 상의 세포성 CD40에 대한 사람화된 항체의 특이적 결합은 또한 농도-의존성 결합을 입증하였다. 상기 항체는 약간 상이한 결합 프로필(도 2에 나타냄) 및 0.21 내지 1.22 nM의 EC50 값을 나타내었다. 비-형질감염된 HEK293 세포 또는 T 세포주 HSB-2와 같은 CD40 음성 세포에 대해 어떠한 결합도 검출되지 않았고, 따라서 이는 CD40으로의 선택적 결합을 확인시켜 준다 (데이터는 나타내지 않음).
사람 CD40-Fc 단백질에 결합하는 항체 A, 항체 B 및 항체 C의 친화성은 ForteBio Octet를 통해 측정하였고 해리 상수(KD)가 <100pM임을 밝혔다. 항체 및 CD40-Fc 2가 결합활성 효과로 인해, 100pM 미만의 Kd가 정확하게 측정되지 않는다. 추가로, CD40-Fc로의 결합은 50% 사람 혈청의 부재 및 존재 하에 분석하였고, 결합에 대한 혈청의 어떠한 상당한 효과가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
B. B 세포 활성화/증식 검사에서 사람화된 항체의 활성
사람화된 항체의 활성은 말초 혈액으로부터 유도된 사람 B 세포가 IL-2 및 IL-4의 존재 하에 재조합 CD40L로 자극되는 B 세포 증식 검사에서 시험하였다. 항체 A, 항체 B 및 항체 C는 강력한 B 세포의 증식 억제를 나타내었다(도 3a 및 3b에 나타냄). BI 항체 및 기린 항체 4D11의 억제 곡선 및 IC50 값의 비교는 상기 4D11 항체가 다수의 공여자에 걸쳐 시험되는 경우 보다 높은 효능(도 3b 및 4)을 가짐을 지적한다. CD40L 항체의 부재 하에 효능 활성에 대해 시험되는 경우, 항체 B, 항체 A 및 항체 C는 4D11 항체와 유사하게 10 μg/ml(67 nM) 이하 농도(도 4에 나타냄)에서 배경 수준 이상으로 임의의 B 세포 증식을 유도하지 않았다.
상기 경쟁자 항체 4D11이 약간 보다 강력한 것으로 나타났고 평균 IC50이 약 0.02nM이고 효능 효과가 부재이다. 3개의 BI 항체 및 4D11에 대한 데이터는 도 4 및 상기 표 2.2에 요약한다. 다른 경쟁자 항체, PG-102(클론 5D12로 부터 유도됨)는 또한 상기 검사에서 시험되었고 CD40L의 부재 하에 B 세포 증식을 자극하는 상당한 효능제 효과를 나타내었다(도 4). 따라서, 본 발명자들의 리드 후보물의 효능 활성의 결여는 이들을 PG-102와는 명백히 구분되게 한다.
제2 검사에서, 상기 항체는 사람 B 세포에서 CD86 상향 조절의 억제에 대해 평가하였다. 이 경우에, 상기 검사는 모두 외인성 CD40L의 존재 하에 사람 전혈 또는 정제된 B 세포로 수행할 수 있다. B 세포 증식 데이터와 일치되게, 사람 전혈에서 시험된 항체 B, 항체 A 및 항체 C는 유동 세포측정기에 의한 측정시 CD40-매개된 CD86 상향조절의 강력한 억제를 나타내었다(도 5에 나타냄). 항체 C가 상기 검사에서 4D11과 유사한 효능을 나타내는 반면, 항체 B 및 항체 A의 효능은 다소 약하였다. 정제된 B 세포에 대한 또는 전혈에서의 항체 B 및 4D11의 비교는 항체 B의 효능(IC50 및 IC90 값)이 다른 CD40 함유 세포 또는 혈청의 존재 하에 B 세포와 비교하여 정제된 B 세포에 대해 상대적으로 변화가 없음을 보여주고, 4D11은 전혈 조건 하에서 효능에 급격한 변화를 겪는다(도 6에 나타냄).
전혈 샘플로 수행되는 경우 항체 B, 항체 A 및 항체 C가 사이노몰거스 원숭이 B 세포에 대한 CD86 상향 조절의 억제에 대해 평가될 때 유사한 데이터가 나타났다(도 7에 나타냄). 사이노몰거스 원숭이 전혈에서 시험된 항체 B, 항체 A 및 항체 C는 유동 세포측정에 의한 측정시 CD40-매개된 CD86 상향조절의 강력한 억제를 나타내었다. 따라서, 이들 항체는 모두 사람 CD40에 대한 유사 효능과 함께 사이노몰거스 원숭이 CD40에 대한 기능적 교차-반응성을 보여준다.
항체 B IgG1 KOb 및 항체 B IgG1 WT의 활성은 항체-의존성 세포성 세포독성을 매개하는 능력에 대해 평가하였다(도 13). 상기 검사에서 RAMOS 세포는 이펙터 대 표적 세포가 50:1인 비율에서 사람 PBMC로 항온처리하였다. 항체 B IgG1 KOb 및 항체 B IgG1 WT는 20 ug/ml로부터 적정하고 세포 사멸 정도는 LDH의 방출에 의해 모니터링한다. 나타낸 상기 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 유래한다. 상기 데이터는 항체 A IgG1 Wt 20E2-12-RIgG1 WT가 ADCC의 효과적인 매개인자이고 이펙터 기능을 제거하는 돌연변이를 함유하는 항체 B IgG1 KOb는 ADCC 활성을 갖지 않음을 보여준다.
실시예 3: 약동학적/ 약력학적 연구
A. 사이노몰거스 원숭이내 1 또는 10mg/kg의 항체 A 및 항체 B의 단일 용량 IV 투여
항체 A 및 항체 B는 각각 수컷 사이노몰거스 원숭이((N=3)/용량)에 1 및 10mg/kg으로 IV 투약하였다. 혈액 샘플은 0 내지 504 시간(3주) 시점으로부터 수집하고, 혈청을 회수하고, 샘플은 분석때까지 -20℃에서 저장하였다. 상기 샘플은 상기된 바와 같은 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 모두 IV 투여 후 원숭이에서 2개의 항체의 혈청 농도-시간 프로필 및 약동학적 계수는 하기에 나타낸 도 8 및 표 2.7.1(항체 A) 및 2.7.2(항체 B)에 요약한다. 2개의 항체는 저용량에서 제거율이 주로 표적-매개된 배치와 일치하여 나타나는 것이고, 보다 높은 용량에서 항체가 주로 이화대사작용에 의해 주로 제거됨을 시사하는 용량-의존성 약동학을 보여주었다. 유사한 용량-의존성 약동학적 프로필은 막-관련 표적(예를 들어, CD19, CD20, EGFR, CD146 및 HER2)을 표적화하는 다른 MAb에 대해 관찰하였다. 항체 A에 대한 제거율은 각각 1 및 10mg/kg 용량에 대해 0.8 및 0.1 mL/h/kg이었다. 항체 B에 대한 제거율은 각각 1 및 10mg/kg 용량에 대해 0.7 및 0.1 mL/hr/kg이었다. 유사하게, 항체 A 반감기는 각각 1 및 10mg/kg 용량에 대해 1일 및 13일이고, 항체 B 반감기는 동일한 각각의 용량에 대해 2 및 13일이었다. 항체 B가 항체 A에 대한 동일한 용량과 비교하여 저용량에서 약간 긴 반감기를 갖지만, 이러한 차이는 만성 투여시보다 지연된 노출로 해석되는 것으로 예상되지 않는다. 2개의 화합물에 대한 AUC는 초비례하고 2개의 화합물에 대한 분포 용적(Vss)은 전형적으로 대형의 극성 단백질 치료제에 대해 나타나는 제한된 조직 분포를 나타내는 혈장 용적(약 40mL/kg)과 유사하였다. 전체적으로 2개의 항체간에 약동학적 매개변수에 있어서 감지할만한 차이가 없었다.
[표 2.7.1]
Figure 112012078932196-pct00056

[표 2.7.2]
Figure 112012078932196-pct00057

B. 생체외 약력학적 연구
상기된 PK 연구의 일부로서, 본 발명자들은 항-CD40 항체의 약력학적 효과를 분석하였다. 이러한 목적을 위해 전혈 샘플을 밤새 재조합 CD40L로 항온처리하고, B 세포상의 CD86 발현의 증가는 유동 세포측정기로 측정하였다. 샘플은 투약 후 0일(전처리), 2일, 7일 및 14일째에 분석하였다. CD86 발현의 증가가 비교적 작지만(약 5 내지 20%), 용량-의존성 효과가 관찰되었다(도 9에 나타냄). 10mg/kg의 항체 A 및 항체 B가 투약된 동물 그룹에서, CD86 유도는 상기 용량에서 지연된 노출과 일치하여 2, 7 및 14일째에 완전히 억제되었다. 1mg/kg이 투약된 동물은 2일째 완전한 억제를 나타내었고, 7일째에는 부분 억제가 나타났고, 14일째는 어떠한 억제가 나타나지 않았다. 시간 경과에 따른 약력학적 효과의 상실은 저용량 그룹에서의 항체의 보다 신속한 제거율과 관련된다.
실시예 4: 독성학적 관련 연구: 혈소판 상의 CD40
CD40은 사람 혈소판 상에서 항상성으로 발현하고(문헌참조: Henn, et al., 2001 및 Inwald, et al., 2003), CD40L은 활성화된 혈소판의 세포 표면 상에서 신속하게 및 일시적으로 발현한다(문헌참조: Henn, et al., 2001). FcγR 결합이 없는 항-CD40 항체는 혈소판에 대해 효과를 가질 것으로 예상되지 않지만, 이것이 그 경우임을 직접적으로 입증하는 것은 중요하다. 유동 세포측정 연구를 수행하여 사람 및 사이노몰거스 혈소판에 대한 항-CD40 리드 후보물의 결합을 입증하였다.
이전에 이것은 유동 세포측정기에 의해 G28.5 및 mAb 89 항-CD40 mAb가 휴지기 사람 혈소판에 결합함이 입증되었다(Henn, et al., 2001). 이것은 FITC-표지된 G28.5 항체를 사용하여 확인되었다. 5배 연속 희석된 G28.5를 제조하고 0.5㎍/ml 내지 0.32ng/ml 범위를 사람(2명의 공여자) 또는 사이노몰거스 원숭이(3마리 공여자)로부터 수득된 100㎕의 혈소판 중에서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 추가로, APC-표지된 항-CD45 mAb를 사용하여 다른 CD40+ 세포 유형에 결합된 혈소판을 동정하고 이들 세포를 분석으로부터 배제하였다. 항체 염색 후, 상기 혈소판을 세척하고 옵틸라이즈(Optilyse) C로 고정화시키고 유동 세포측정을 수행하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 CD45- 혈소판에 결합하는 항체를 측정하여 결정하였다.
시판되는 5c3 및 본 발명의 항-CD40 마우스 mAb의 선택된 항체를 FITC-표지시켰다. 라모스 세포에 결합함을 확인하였다. 항체 분자당 FITC 분자의 수는 항체 분자 당 2 내지 4개의 범위의 FITC이다. 시판 및 후보 항-CD40 mAb의 5배 연속 희석액을 0.5㎍/ml 내지 0.32ng/ml의 범위로 제조하고, 실온에서 30분 동안 사람(3명의 공여자) 및 사이노몰거스(2마리 공여자) 혈소판과 항온처리하였다.
사람 혈소판에 대한 마우스 후보물 항-CD40 mAb의 결합을 입증하는 대표적인 그래프는 도 11에 나타낸다. 4개의 후보 모노클로날 항체는 FITC-표지된 이소형 대조군 항체에 비해 사람 혈소판에 특이적으로 결합함을 보여주었다. 10F2, 2H11, 19B10 및 20E2는 혈소판에 상응하게 결합함을 입증하였다. 유사한 경향이 사이노몰거스 혈소판에 대해 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
이들 연구에 추가로 직접적으로 표지된 항체 B 및 4D11은 사람 및 사이노몰거스 원숭이 전혈 샘플에서 혈소판 및 B 세포에 결합하는 능력에 대해 비교하였다(도 12에 나타냄). 4D11은 사람 및 사이노몰거스 원숭이 혈액 샘플에서 2개의 B 세포 및 혈소판에 유사한 결합(EC50에 의해 예시된 바와 같음)을 나타내었다. 항체 B는 유사한 패턴을 나타냈지만 보다 약한 결합 효능을 나타냈다.
실시예 5: NSG 마우스 모델에서 생체내 약리학적 연구
사람화된 항체, 항체 A의 효능은 사람 PBMC가 이식편 대 숙주 반응을 생성시키기 위해 면역결핍 NSG 마우스에 주사된 항체 생산 모델에서 평가하였다. 사람 IgM(hIgM) 및 IgG(hIgG)의 상당한 생성이 이식 후 2주째부터 검출될 수 있다. 5 및 1mg/kg의 용량에서 항체 A를 사용한 처리가 이식 후 2주 및 3주째에 hIgG 및 hIgM 반응을 상당히 억제하였다. 비교인자 항체(4D11)는 단일 5mg/kg의 용량에서 평가하였고, 또한 반응의 폐지를 입증하였다. 제2 연구에서, 모든 항체, 항체 A, 항체 B 및 항체 C는 1mg/kg의 단일 용량에서 시험하였고, 2주째에 IgM 및 IgG 반응을 완전히 억제함을 보여주었다(도 10).
실시예 6: 바이오마커 분석
수용체 상향 조절: 수용체의 CD40L-유도된 상향 조절은 유동 세포측정기로 측정할 수 있다. 사람 전혈은 최적화된 농도의 가용성 CD40L으로 자극시킬 수 있고 완전한 %의 CD20+수용체+세포는 유동 세포측정기로 측정할 수 있다. CD20 양성 세포에 대한 CD86 발현의 % 변화는 항체 A 및 B를 평가하는 사이노몰거스 pk 연구와 병행하여 측정하였다(도 9). 상기 데이터는 항체의 노출과 일치하는 시점에서 CD86 상향 조절의 억제를 보여준다.
표적화된 프로테오믹스: 전혈에서 CD40 자극시 단백질의 증가된 분비는 잠재적인 바이오마커(들)로서 사용될 수 있다. 가용성 CD40L의 최적화된 농도 및 자극 시간은 MDC/CCL22 및 여러 다른 분비된 단백질을 검출하는 루미넥스 멀티플렉스 비드 플랫폼을 사용하여 설정하였다. 임상적 샘플은 항-CD40 mAb의 완전 용량 범위에서 사람 전혈로부터 평가할 것이다.
수용체 점령: CD40 수용체 점령은 사람 전혈에서 B 세포의 유동 세포측정 분석을 기반으로 시험관내 또는 생체외 검사로 측정할 수 있다. 본 발명의 현재 후보 항체 및 비-경쟁 항-CD40 항체 5C3을 사용하여 수용체 점령 검사를 정량할 것이다.
실시예 7: 사람화된 항- CD40 항체의 항종양 활성
일부 경우에, 본 발명의 항체의 항종양 성질을 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 측정은 SCID 마우스 림프종 이종이식 모델에서 사람화된 항-CD40 항체의 항종양 활성을 검사함에 의해 수행할 수 있다. 상기 SCID 모델에 종양을 제공하기 위해 암 세포를 주사할 수 있고, 예를 들어, 5 x 106 백만개의 종양 세포를 약물 처리를 개시하기 13일 전에 SCID 마우스(10/그룹)에 피하 주사할 수 있다. 본 발명의 뮤린 항-CD40 항체 또는 비교군(예를 들어, 대조군 또는 다른 사람화된 항체)은 주당 복강내로 3회 주사(4mg/kg/용량)하고 8 또는 5 용량을 투여한다. 종양의 발생 및 성장은 마우스에서 모니터링하고 종양 용적은 선택된 연구 기간, 예를 들어, 14일 연구 기간 동안 주 간격으로 측정할 수 있다. 바람직하게, 상기 결과는 본 발명의 항체로 처리된 마우스와 비교하여 대조군 마우스에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상의 종양 성장 증가를 보여준다. 바람직하게, 처리 기간 동안, 본 발명의 항체로 처리된 마우스에서 종양 성장은 무시할 수 있을 것이다. 상기 데이터는 시험된 사람화된 항체가 상기 B 림프종 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제하는데 효과적임을 확실히 보여줄 수 있다.
실시예 8: 사람화된 항-CD40 항체에 의한 연장된 생존
상기된 것들과 같은 종양 함유 마우스의 생존에 대한 사람화된 항-CD40 항체의 효능은 SCID 마우스 림프종 이종 이식 모델에서 검사될 수 있다. SCID 마우스(10/그룹)는 항체 치료 3일 전에 1 x 106 백만개의 종양 세포로 정맥내 접종한다. 이어서, 마우스를 본 발명의 뮤린 또는 사람화된 항-CD40 항체 또는 Ig 대조군으로 치료하고, 총 5 용량으로 주당 2회(4mg/kg/용량) 복강내 투여한다. 이어서, 상기 마우스 케이지는 치사율에 대해 매일 조사하여 암을 갖는 피검체의 생존을 연장시키는데 있어서의 항체의 효능 수준을 측정할 수 있다.
특허원, 특허 및 과학적 공보를 포함하는 다양한 문헌이 본원에 인용되고, 이의 전반적인 기재내용은 본원에 참조로 인용된다. 본원의 임의의 참조문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능함을 인정하는 것으로서 해석되지 말아야 한다.
본 발명의 바람직한 양상은 하기의 문단의 실시형태에 따라 기재될 수 있다:
문단 1. IC50이 1nM 미만인 길항작용 활성을 갖는 사람 CD40에 특이적으로 결합하고, B 세포 증식에서 100㎍/ml 이하의 효능작용을 갖지 않으며, 추가로 비-사람 영장류에서 10일 이상의 생체내 반감기를 가짐을 특징으로 하는 사람화된 모노클로날 항체.
문단 2. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 사이노몰거스 원숭이에서 30mg/kg 미만의 용량에서 8일 초과의 반감기를 갖는, 사람화된 모노클로날 항체.
문단 3. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 서열 및 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함하는, 사람화된 모노클로날 항체.
문단 4. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체의 사람화된 항체 또는 항원 결합 단편인, 항체.
문단 5. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 사람화된 항체 또는 항체의 항원 결합 단편인, 항체.
문단 6. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄 CDR1 서열이 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 중쇄 CDR2 서열이 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 중쇄 CDR3 서열이 서열번호 16 내지 서열번호 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 경쇄 CDR1 서열이 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖고, 상기 경쇄 CDR2 서열이 서열번호 22 내지 서열번호 23으로부터 선택되고, 상기 경쇄 CDR3 서열이 서열번호 24 내지 서열번호 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 모노클로날 항체.
문단 7. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 서열번호 10의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 13의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고, 서열번호 19의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
문단 8. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 서열번호 9의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고, 서열번호 20의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
문단 9. 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항-CD40 항체.
문단 10. 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 항-CD40 항체.
문단 12. 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는, 사람화된 항체 또는 항체 단편.
문단 13. 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30의 사람 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 골격 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포하하는 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열번호 26의 상응하는 경쇄 가변 도메인과 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 사람 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편.
문단 14. 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 사람 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 골격 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열번호 31의 상응하는 경쇄 가변과 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 사람 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원-결합 도메인.
문단 15. 서열번호 37, 서열번호 38; 서열번호 39 또는 서열번호 40의 사람 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 골격 영역의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 골격 영역을 포함하는 사람화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 서열번호 36의 상응하는 경쇄와 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 사람 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원-결합 단편.
문단 16. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 CD40L의 부재 하에 B 세포로부터 사이토킨의 생산을 자극하는데 실패한, 항체.
문단 17. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 50% 사람 혈청의 존재 하에 2배 미만의 결합 속도 감소로 사람 CD40에 결합하는 항체.
문단 18. 문단 1에 있어서, 상기 항체가 1mg/kg의 농도로 포유동물에서 IgM 및 IgG 생성을 억제시키는, 항체.
문단 19. 포유동물에서 CD40 매개된 면역 반응을 차단하기에 충분한 양으로 문단 1의 항체를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 사람 CD40의 기능을 차단시키는 방법.
문단 20. 동물에서 이식편 대 숙주 질환의 증상들 중 하나 이상을 감소시키기에 충분한 양으로 문단 1의 항체를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 경감시키는 방법.
문단 21. 문단 20에 있어서, 상기 포유동물이 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염, 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상선 중독증/그레이브 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HB Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 연결 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환을 갖는, 방법.
문단 22. 문단 19에 있어서, 상기 포유동물이 류마티스 관절염을 갖는, 방법.
문단 23. 문단 20에 있어서, TNF-길항제, 질환-변형 항류마티스성 약물, CTLA4-길항제, 항-IL-6 수용체 mAb 및 항-CD20 mAb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 치료제를 추가로 투여함을 포함하는, 방법.
문단 24. 문단 20에 있어서, 상기 염증성 질환 또는 자가면역 질환이 CD40 및 CD20 둘 다를 발현하는 세포와 관련된 염증성 질환 또는 자가면역 질환인, 방법.
문단 25. 문단 19에 있어서, 상기 항-CD40 항체가 비경구 투여 경로에 의해 투여되는, 방법.
문단 26. 문단 19에 있어서, 상기 항-CD40 항체가 정맥내 또는 피하내로 투여되는, 방법.
문단 27. 문단 1의 유효량의 항-CD40 항체를 사람 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 사람 환자에서 B 세포에 의한 항체 생산을 억제하는 방법.
문단 28. 문단 27에 있어서, 상기 사람 환자가 CD40-발현 세포와 관련된 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는, 방법.
문단 29. 문단 27에 있어서, 상기 사람 환자가 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염, 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상선 중독증/그레이브 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군(Good pasture's syndrome), 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HB Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 연결 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 질환을 앓는, 방법.
문단 30. 문단 1의 항체 또는 항원-결합 단편을 세포에 투여함을 포함하는, 사람 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 사람 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40 항원으로의 결합이 세포의 성장 또는 분화를 억제하는, 방법.
문단 31. 문단 1의 항체 또는 항원-결합 단편을 피검체에게 투여함을 포함하는, CD40-관련 장애를 갖는 피검체를 치료하는 방법으로서, 항체 또는 항원-결합 단편이 사람 CD40에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40으로의 결합이 CD40-관련 장애의 세포의 성장 또는 분화를 억제하는, 방법.
문단 32. 문단 31에 있어서, CD40-관련 장애의 세포가 B 림프아구 세포, 췌장, 폐 세포, 유방 세포, 난소 세포, 결장 세포, 전립선 세포, 피부 세포, 두경부 세포, 방광 세포, 골 세포 또는 신장 세포인, 방법.
문단 33. 문단 31에 있어서, CD40-관련 장애가 만성 림프구 백혈병, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 발덴스트룀 거대글로불린혈증 또는 카포시 육종인, 방법.
문단 34. 문단 1의 항체 또는 항원-결합 단편을 세포에게 투여함을 포함하는, 말초 B 세포의 고갈을 유도하기 위한 방법으로서, 항체 또는 항원-결합 단편이 사람 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40 항원으로의 결합이 세포 고갈을 유도하는, 방법.
문단 35. 문단 34에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 면역 장애를 갖는 피검체에게 투여되는, 방법.
문단 36. 문단 34에 있어서, 면역 장애가 류마티스 관절염 또는 전신성 홍반성 낭창인, 방법.
문단 37. 문단 1의 항체를 피검체에게 투여함을 포함하는 피검체내 류마티스 관절염을 치료하는 방법으로서, 상기 항체가 상기 피검체에서 CD40의 기능을 차단하는 길항성 항체인, 방법.
문단 38. 문단 37에 있어서, 상기 항체가 피검체에서 B 세포 분화 및 항체 이소형 스위칭을 억제하기에 유효한 양으로 투여되는, 방법.
문단 39. 문단 37에 있어서, 상기 항체가 피검체에서 T 세포 및 마크로파지내 사이토킨 및 케모킨 생성 및 접착 분자의 상향 조절을 억제하기에 유효한 양으로 투여되는, 방법.
문단 40. 문단 37에 있어서, 상기 항체가 피검체에서 수지상 세포의 활성화를 억제하기에 유효한 양으로 투여되는, 방법.
문단 41. 문단 37에 있어서, 상기 항체가 피검체에서 염증 촉진 사이토킨, 케모킨, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 프로스타글란딘의 생성을 억제하고 비-면역 세포내 접착 분자를 하향 조절하는데 유효한 양으로 투여되는, 방법.
문단 42. 문단 37에 있어서, 상기 항체가 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 치료 계획과 병용하여 투여되는, 방법.
문단 43. 문단 37에 있어서, 상기 피검체가 류마티스 관절염을 갖고 단독의 메토트렉세이트 치료에 비-반응성인 피검체인, 방법.
문단 44. 문단 43에 있어서, 상기 방법이 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 치료 계획으로 상기 피검체를 치료함을 포함하는, 방법.
문단 45. 문단 37에 있어서, 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 단독의 메토트렉세이트, 단독의 엔브렐, 엔브렐 + 메토트렉세이트의 조합을 사용한 치료보다 우수한 효능을 갖는, 방법.
문단 46. 문단 43에 있어서, 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 메토트렉세이트에 부적당한 반응을 갖는 환자에서 엔브렐 + MTX를 사용한 치료보다 우수한 효능을 갖는, 방법.
문단 47. 문단 37에 있어서, 상기 항체가 항-TNF 제제를 포함하는 치료 계획과 병용하여 투여되는, 방법.
문단 48. 문단 37에 있어서, 상기 피검체가 류마티스 관절염을 갖고 단독의 항-TNF 제제를 사용한 치료에 비반응성인 피검체인, 방법.
문단 49. 문단 48에 있어서, 상기 방법이 상기 길항성 항-CD40 항체와 조합된 항-TNF 제제를 사용한 치료를 포함하는 치료 계획으로 상기 피검체를 치료함을 포함하는, 방법.
문단 50. 문단 37에 있어서, 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 항-TNF 제제를 사용한 치료보다 우수한 효능을 갖는, 방법.
문단 51. 문단 48에 있어서, 상기 길항성 항-CD40 항체를 사용한 상기 피검체의 치료가 단독의 항-TNF 제제에 부적당한 반응을 갖는 환자에서 오렌시아 또는 리툭산을 사용한 치료보다 우수한 효능을 갖는, 방법.
문단 52. (i) 문단 8의 항체 또는 항원-결합 단편; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
문단 53. 문단 52에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 제2 제제와 접합되는, 약제학적 조성물.
문단 54. 문단 52에 있어서, 상기 제2 제제가 세포독성제, PEG-담체, 효소 또는 마커인, 약제학적 조성물.
문단 55. 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
문단 56. 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
문단 57. 약물이 포유동물에서 CD40 매개된 면역 반응을 차단하는, 포유동물에서 사람 CD40의 기능을 차단하기 위한 약물의 제조에 있어서 문단 1의 항체의 용도.
문단 58. 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 경감시키기 위한 의약의 제조를 위한 문단 1의 항체의 용도.
문단 59. 문단 58에 있어서, 상기 의약이 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염, 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상선 중독증/그레이브 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HB Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 연결 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 위해 제조되는, 용도.
문단 60. 문단 58에 있어서, 상기 의약이 TNF-길항제, 질환-변형 항류마티스 약물, CTLA4-길항제, 항-IL-6 수용체 mAb 및 항-CD20 mAb로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 치료제를 추가로 포함하는, 용도.
문단 61. 문단 57에 있어서, 상기 의약이 비경구 경로의 투여용으로 제조되는, 용도.
문단 62. 문단 57에 있어서, 상기 의약이 정맥내 또는 피하내로 사용하기 위해 제조되는, 용도.
문단 63. 사람 환자에서 B 세포에 의한 항체 생산의 억제를 위한 의약의 제조에 있어서, 문단 1의 항체의 용도.
문단 64. 사람 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장 및/또는 분화를 억제하기 위한 의약의 제조를 위한, 문단 1의 항체의 용도.
문단 65. 상기 의약내 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40으로의 결합이 CD40-관련 장애의 세포의 성장 또는 분화를 억제하는, CD40-관련 장애를 갖는 환자의 치료용 의약의 제조를 위한 문단 1의 항체의 용도.
문단 66. 문단 65에 있어서, 상기 의약이 B 림프아구 세포, 췌장, 폐 세포, 유방 세포, 난소 세포, 결장 세포, 전립선 세포, 피부 세포, 두경부 세포, 방광 세포, 골 세포 또는 신장 세포로부터 선택되는 CD40 관련 장애의 세포의 치료를 위해 사용되는, 용도.
문단 67. 문단 65에 있어서, 상기 의약이 만성 림프구 백혈병, 버킷 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 발덴스트룀 거대글로불린혈증 또는 카포시 육종의 치료를 위해 사용되는, 용도.
문단 68. 의약의 항체 또는 항원-결합 단편이 사람 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 항원-결합 단편의 CD40 항원으로의 결합이 세포의 고갈을 유도하는, 말초 B 세포의 고갈을 유도하기 위한 의약의 제조에 있어서의 문단 1의 항체의 용도.
문단 69. 문단 68에 있어서, 상기 의약이 면역 장애를 갖는 피검체의 치료를 위한, 용도.
문단 70. 문단 68에 있어서, 상기 의약이 류마티스 관절염 또는 전신성 홍반성 낭창의 치료를 위한, 용도.
문단 71. 피검체에서 류마티스 관절염의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 문단 1의 항체의 용도.
문단 72. 문단 71에 있어서, 상기 의약이 상기 피검체에서 B 세포 분화 및 항체 이소형 스위칭의 억제를 위한, 용도.
문단 73. 문단 71에 있어서, 상기 의약이 상기 피검체에서 사이토킨 및 케모킨 생성 억제 및 T 세포 및 마크로파지에서의 접착 분자의 상향 조절을 위한, 용도.
문단 74. 문단 71에 있어서, 상기 의약이 상기 피검체에서 수지상 세포의 활성화를 억제하기 위한, 용도.
문단 75. 문단 71에 있어서, 상기 의약이 상기 피검체에서 염증 촉진 사이토킨, 케모킨, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 프로스타글란딘의 생성을 억제하고 비-면역 세포에서 접착 분자의 하향 조절을 위한 용도.
문단 76. 문단 71에 있어서, 상기 의약이 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 투여 계획과 조합되어 투여될 조합 약물인, 용도.
문단 77. 문단 71에 있어서, 상기 의약이 항-TNF 제제를 추가로 포함하는, 용도.
본원에 기재된 교시의 적용은 본원에 기재된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 실제로, 다양한 변형이 본원에 포함된 교시 및 수반된 실시예의 관점에서 당업자의 능력 범위 내에 있다. 상기 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH <120> ANTI-CD40 ANTIBODIES <130> 02950-22687US01 <150> US 61/319,574 <151> 2010-03-31 <160> 78 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Murine Lead VH Sequence of 2H11 <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Murine Lead VH Sequence of 10F2 <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 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Asn Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Chain in both BI 655055 and Antibody C <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Chain in both BI 655057 and BI 655058 <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Chain in both BI 655059 and BI 655060 <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Chain in both BI 655061 and BI 655062 <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 1 from Antibody 19B10-Hum <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 2 from Antibody 19B10-Hum <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 3 from Antibody 19B10-Hum <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 4 from Antibody 19B10-Hum <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 5 from Antibody 19B10-Hum <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Phe Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 1 from Antibody 10F2Hum <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 2 from Antibody 10F2Hum <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 3 from Antibody 10F2Hum <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 4 from Antibody 10F2Hum <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 5 from Antibody 10F2Hum <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 6 from Antibody 10F2Hum <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 7 from Antibody 10F2Hum <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light Sequence Version 1 from Antibody 10F2Hum <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light Sequence Version 2 from Antibody 10F2Hum <400> 75 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light Sequence Version 3 from Antibody 10F2Hum <400> 76 Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 for 2H11, 10F2 and 19B10 <400> 77 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 for 20E2 <400> 78 Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10

Claims (15)

  1. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 사람화된 항체로서,
    상기 항체가 서열번호 11의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 15의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 17의 중쇄 CDR3 서열; 및 서열번호 21의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 23의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는, 사람화된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 각각 서열번호 53 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 갖는, 사람화된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 각각 서열번호 35 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는, 사람화된 항체.
  4. 포유동물에서 질환 또는 장애의 증상들 중 하나 이상을 감소시키기에 충분한 양으로 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하거나 완화시키기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 질환 또는 장애가 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 질환 또는 염증성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환이, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 증식성 홍반성 사구체신염(proliferative lupus glomerulonephritis), 염증성 장 질환(IBD), 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura) (ITP), 크론 질환 및 전신성 홍반성 낭창(SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종(primary myxoedema), 갑상선 중독증/그레이브스 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 자가면역 심장염, 애디슨 질환, 미성숙 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿 파스튜어 증후군(Good pasture's syndrome), 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙성 간경변, 활동성 만성 간염(HBs Ag 음성), 잠복성 간경변증, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 복합 조직 결합 질환, 원판상 홍반성 낭창, 및 전신성 혈관염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 선택된 제2 치료제와 병용하여 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 비경구 투여 경로, 정맥내 투여 경로 또는 피하 투여 경로로 투여되는, 약제학적 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제2 제제에 접합되는, 약제학적 조성물.
  9. 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 중쇄 아미노산 서열이 서열번호 35를 포함하고, 상기 경쇄 아미노산 서열이 서열번호 31을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  10. 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열이 서열번호 53을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 서열번호 52를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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