MX2012011112A - Anticuerpos anti-cd40. - Google Patents

Anticuerpos anti-cd40.

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MX2012011112A
MX2012011112A MX2012011112A MX2012011112A MX2012011112A MX 2012011112 A MX2012011112 A MX 2012011112A MX 2012011112 A MX2012011112 A MX 2012011112A MX 2012011112 A MX2012011112 A MX 2012011112A MX 2012011112 A MX2012011112 A MX 2012011112A
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MX
Mexico
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seq
antibody
sequence
light chain
heavy chain
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MX2012011112A
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Tobias Litzenburger
Sanjaya Singh
Rachel Barret
Scott Brodeur
Keith A Canada
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Boehringer Ingelheim Int
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos anti-CD40 antagonistas humanizados y a métodos terapéuticos y diagnósticos, y a composiciones para el uso de los mismos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD40 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a anticuerpos anti-CD40 humanizados para uso diagnóstico y terapéutico. Más específicamente, se describen anticuerpos anti-CD40 humanizados y métodos de uso para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos caracterizados por células que expresan CD40. También se describen composiciones farmacéuticas y kits que comprenden el anticuerpo anti-CD40 humanizado.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La CD40 es una glucoproteína de membrana integral de tipo I de 48kDa y un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). La CD40 se expresa en una diversidad de tipos celulares que incluyen células B normales y neoplásicas, interdigitando células, carcinomas, células epiteliales (p. ej., queratinocitos), fibroblastos (p. ej., sinoviocitos) y plaquetas. También está presente en monocitos, macrófagos, algunas células endoteliales y células dendríticas foliculares. La CD40 se expresa tempranamente en ontogenia de células B, apareciendo en precursores de células B después de la aparición de CD10 y CD19, pero antes de la expresión de CD21 , CD23, CD24, y de la aparición de inmunoglobulina superficial M (slgM) (Uckun et al., 1990, Blood 15:2449). La CD40 también se ha detectado en células plasmáticas derivadas de célula ósea y de amígdalas (Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84:2597).
El ligando de CD40 es CD40L (también denominado CD154, gp39, y TRAP), un miembro de la superfamilia de TNF. La CD40L es una proteína de transmembrana expresada predominantemente en células T CD4+ activadas y un pequeño subconjunto de células T CD8+ (Revisado por (Van Kooten C. y Banchereau, 2000).
La interacción de CD40 con CD40L induce respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales. La CD40 regula este par ligando-receptor para activar las células B y otras células que presentan antígenos (APC), incluyendo las células dendríticas (DCs) (Revisado por (Toubi and Shoenfeld, 2004); (Kiener, et al., 1995). La función de CD40 en las células B ha sido extensamente estudiada. La activación de CD40 en células B induce proliferación, diferenciación en células que segregan anticuerpos e isotipo que cambia en centros germinales de órganos linfoides secundarios. Los estudios in vitro han demostrado efectos directos de la activación de CD40 en la producción de citocinas (IL-6, IL-10, TNF-a, LT-a), expresión de moléculas de adhesión y receptores coestimuladores (ICAM, CD23, CD80 y CD86), y mayor expresión de MHC de clase I, MHC de clase II y transportador TAP por linfocitos B (Liu, et al., 1996). Para la mayoría de estos procesos, la CD40 actúa en conjunto con otras citocinas u otras interacciones receptor-ligando.
La señalización de CD40 en monocitos y DC produce mayor supervivencia, como también secreción de citocinas (IL-1 , IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-a y MIP-1q. La ligadura de CD40 en estos APC también conduce a un aumento de las moléculas coestimuladoras tales como (ICAM-1 , LFA-3, CD80 y CD86). La activación de los receptores de CD40 es una de las señales críticas que permiten la maduración completa de DC en APC eficientes que conducen a la activación de las células T (Banchereau and Steinman, 1998) (Van Kooten C. and Banchereau, 2000).
Estudios recientes en modelos de ratón demostraron que la señalización de CD40 en células dendríticas también juega un papel importante en la generación de células TH17 que se consideran mediadores de autoinmunidad en enfermedades como la artritis y la esclerosis múltiple (lezzi, et al., 2009) (Perona-Wright, et al., 2009).
La disponibilidad de ratones con genes inactivados de CD40 y CD40L, como también los anticuerpos anti-ratón agonistas y antagonistas ofreció la posibilidad de estudiar la función de las interacciones CD40-CD40L en varios modelos de enfermedad. Se ha demostrado que la administración de anti-CD40L bloqueante es beneficiosa en varios modelos de autoinmunidad, incluyendo enfermedades espontáneas como la nefritis lúpica en ratones SNF1 o la diabetes en ratones NOD o en formas experimentalmente inducidas de enfermedad, como artritis inducida por colágeno (CIA) o encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (Toubi and Shoenfeld, 2004). La CIA en ratones fue inhibida por un mAb anti-CD40L que bloqueó el desarrollo de la inflamación articular, las titulaciones de anticuerpos en suero a colágeno, la infiltración de células inflamatorias en el tejido subsinovial, además de la erosión de cartílago y hueso (Durie, et al., 1993). Tanto como para nefritis lúpica como para EAE, se demostró que el anti-CD40L podría también aliviar la enfermedad continua, confirmando la función de CD40-CD40L en la fase efectora de la enfermedad (Kalled, et al., 1998); (Howard, et al., 1999).
La función para las interacciones CD40-CD40L en el desarrollo de EAE también se estudió en ratones deficientes de CD40L que portaban un receptor de células T transgénico específico para la proteína básica mielina. Estos ratones no desarrollaron EAE después de cebar con antígeno, y las células T CD4+ permanecieron quiescentes y no produjeron INF-a (Grewal, et al., 1996). Asimismo, los anticuerpos inhibidores dirigidos contra CD40 demostraron efectos beneficiosos en modelos de enfermedad inflamatoria, como EAE. Lamann y colegas demostraron que CD40 mAb mu5D12 antihumano de ratón antagonista y una versión quimérica de este mAb previenen eficazmente la expresión clínica de EAE desmielinante crónica en monos marmoset exogámicos (Laman, et al., 2002); (Boon, et al., 2001). Un estudio de seguimiento demostró que el tratamiento terapéutico con el anticuerpo CD40 antihumano quimérico reduce la inflamación detectable mediante MRI y retrasa el agrandamiento de lesiones cerebrales pre-existentes en el modelo de EAE de monos marmoset (Hart, et al., 2005).
Se ensayaron anticuerpos anti-CD40 con actividad agonista en modelos de ratón de artritis con algunos resultados conflictivos. Como se esperaba para un agente inmunoestimulador, se demostró que CD40 mAb FGK45 anti-ratón agonista exacerba la enfermedad en el modelo de ratón DBA/1 de CIA (Tellander, et al., 2000). No obstante, en otro modelo de CIA crónica FGK45, y en otro CD40 mAb, 3/23 anti-ratón agonista, se exhibieron resultados terapéuticos positivos (Mauri, et al., 2000). Este grupo manifestó que los anticuerpos agonistas en este régimen de tratamiento terapéutico tienen un efecto beneficio, induciendo la desviación inmunitaria hacia una respuesta Th2 con menores niveles de IFN- a y menores niveles de IL-4 y IL-10 (Mauri, et al., 2000).
La prevención del rechazo al trasplante mediante el bloqueo de interacciones CD40/CD154 también se ha documentado. El uso de ch5D12, un antagonista anti-CD40 quimérico, en estudios de aloinjertos renales en monos rhesus, indica que el antagonismo de CD40 es suficiente para la modificación de la enfermedad y la prolongación de la supervivencia media pasados los 100 días. Cuando se combinó ch5D12 con un anticuerpo anti-CD86 y se administró solamente al inicio de los estudios de aloinjertos con posterior tratamiento prolongado con ciclosporina, se logró una supervivencia media mayor a 4 años, lo que indica que esta combinación puede inducir potencialmente la tolerancia (Haanstra, et al., 2005).
Por lo tanto, existen extensos estudios clínicos que aportan pruebas de la función crucial de la diada CD40-CD40L en conducir una eficiente respuesta inmunitaria dependiente de células T. El bloqueo de la señalización de CD40 se reconoce, por lo tanto, como una estrategia terapéutica adecuada y necesaria para suprimir una respuesta autoinmunitaria patogénica en enfermedades tales como RA, esclerosis múltiple o psoriasis. No obstante, hasta la fecha, no existen anticuerpos CD40 que hayan sido aprobados para intervención terapéutica de dichos trastornos debido a los hallazgos que demostraron previamente que los anticuerpos anti-CD40 generaban efectos colaterales importantes. Por consiguiente, existe una importante necesidad de agentes terapéuticos que puedan usarse para intervenir en la acción de CD40-CD40L y bloquear la señalización de CD40. Esta necesidad podría cubrirse con los nuevos anticuerpos anti-CD40 humanizados que se unen espécíficamente a CD40 y que muestran las propiedades de especificidad de unión al antígeno, afinidad, farmacocinética y farmacodinámica que permiten su uso en la intervención terapéutica de trastornos basados en CD40.
LA INVENCIÓN La presente invención provee un anticuerpo monoclonal humanizado en el que dicho anticuerpo se une específicamente a CD40 humana que tiene una actividad antagonista CI50 inferior a 1 nM y no tiene agonismo hasta 100 µg/ml en la proliferación de células B, y donde dicho anticuerpo se caracteriza además porque el anticuerpo posee una semivida in vivo en primates no humanos de por lo menos 10 días.
El anticuerpo monoclonal humanizado puede además caracterizarse porque el anticuerpo posee una semivida en monos cynomolgus de más de 8 días con una dosis inferior a 30 mg/kg.
En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo de la invención comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada entre el grupo que consiste en cualquier SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 4 y una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO: 8.
En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO: 40, SEC ID N°: 42, SEC ID N°: 44, SEC ID N°: 46, SEC ID N°: 48, SEC ID NO. 50 SEC ID N°: . 53, SEC ID N°: 57, SEC ID N°: 58, SEC ID N°: 59, SEC ID N°: 60, SEC ID N°: 61 , SEC ID N°: 62, SEC ID N°: 63, SEC ID N°: 64, SEC ID N°: 65, SEC ID N°: 66, SEC ID N°: 67, SEC ID N°: 68, SEC ID N°: 69, SEC ID N°: 70, SEC ID N°: 71. SEC ID N°: 72 o I SEC ID N°: 73.
En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antígeno que de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de SEC ID NO: 5 a SEC ID NO:8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 , SEC ID NO:36, SEC ID NO:41 , SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:47, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51 , SEC ID NO:52, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56, SEC ID NO:74, SEC ID NO:75 o SEC ID NO:76.
En realizaciones especificas, el anticuerpo monoclonal descrito en esta memoria se caracteriza porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la secuencia de la cadena pesada CDR1 se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID NO: 9 a la SEC ID NO:11 , una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 12 a la SEC ID NO: 15 y una secuencia CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:16 a la SEC ID NO:17; y donde la secuencia CDR1 de cadena ligera tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:18 a la SEC ID NO:21 , una secuencia CDR2 de cadena ligera de la SEC ID NO:22 a la SEC ID NO:23 y una secuencia CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:24 a la SEC ID NO:25.
En realizaciones específicas, el anticuerpo monoclonal descrito en esta memoria se caracteriza porque comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 10, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NÓ: 13 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 16, y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 19, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 24.
En otras realizaciones específicas, el anticuerpo monoclonal descrito en esta memoria se caracteriza porque comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 9, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 14 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 16 y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 20, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 24.
En otra realización específica, el anticuerpo monoclonal descrito en esta memoria se caracteriza porque comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 9, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 14 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 16 y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 20, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 24.
En otra realización especifica, el anticuerpo monoclonal descrito en esta memoria se caracteriza porque comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 11 , una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 15 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 17 y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 21 , una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 23 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 25.
También se describen en este documento secuencias individuales para cadenas pesadas de los anticuerpos preferidos de la invención. La invención, por ejemplo, se refiere a un anticuerpo anti-CD40 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4. El anticuerpo anti-CD40 se caracteriza también porque comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO: 8.
También se contempla un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:27 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO.36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:36, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 26, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 28 y SEC ID NO: 26, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 29 y SEC ID NO: 26, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 26, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 32 y SEC ID NO: 31 , respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 33 y SEC ID NO: 31 , respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 34 y SEC ID NO: 31, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 35 y SEC ID NO: 31 , respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 37 y SEC ID NO: 36, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 38 y SEC ID NO: 36, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 39 y SEC ID NO: 36, respectivamente.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 40 y SEC ID NO: 36, respectivamente.
Otra realización se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40 humana, que comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de dominio variable humana de SEC ID NO: 27, SEC ID NO:28, SEC ID NO:29 o SEC ID NO:30, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica al dominio variable de cadena ligera correspondiente de la SEC ID NO:26.
Otra realización se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40 humana, que comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de domino variable humana de la SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34 o SEC ID NO:35, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica a una variable de cadena ligera correspondiente de SEC ID NO:31.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión al antígeno descrito en la realización inmediatamente anterior, en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:32; en otra realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:33; en otra realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:34; y en otra realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:35.
También se contempla un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40. humana, que comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de dominio variable humana de SEC ID NO: 37, SEC ID N°:38; SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica a una cadena ligera correspondiente de SEC ID NO:36.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión al antígeno descrito en la realización inmediatamente anterior, en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:37; en otra realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:38¡ en otra realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:39; y en otra realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es SEC ID NO:40.
Los anticuerpos de la presente invención pueden además caracterizarse porque dichos anticuerpos no pueden estimular la producción de citocinas de células B en ausencia de CD40L.
Los anticuerpos de la presente invención pueden además caracterizarse porque dichos anticuerpos se unen a CD40 humana en presencia de 50% de suero humano con una reducción de la constante de afinidad de menos del doble.
Los anticuerpos de la presente invención pueden además caracterizarse porque dicho anticuerpo produce la inhibición de la producción de IgM e IgG en un mamífero a una concentración de 1 mg/kg.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en diversos métodos terapéuticos, profilácticos, diagnósticos y otros. Por ejemplo, la presente invención describe un método para bloquear la función de CD40 humana en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una composición que comprende un anticuerpo de la invención en una cantidad suficiente para bloquear una respuesta inmunitaria mediada por CD40 en dicho mamífero.
También se contempla en este documento un método para tratar o aliviar la enfermedad injerto contra hospedante en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una composición que comprende un anticuerpo de la invención en una cantidad suficiente para disminuir uno o más de los síntomas de la enfermedad injerto contra hospedante en dicho animal.
A modo de ejemplo, la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria puede incluir, aunque sin limitarse a ello, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primario, enfermedad tirotoxicosis/Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1 , síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica. En realizaciones ilustrativas, el mamífero padece artritis reumatoide.
Los métodos de la invención pueden además comprender la administración de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de TNF, un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad, un antagonista de CTLA4, un receptor anti-IL-6 mAb y un anti-CD20 mAb.
En realizaciones específicas, la enfermedad inflamatoria o la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria asociada con células que expresan tanto CD40 como CD20.
En métodos específicos, el tratamiento implica administrar la composición de anticuerpos por una ruta de administración parenteral.
En métodos específicos, el tratamiento implica administrar la composición de anticuerpos por vía intravenosa o subcutánea.
Métodos adicionales de la invención comprenden inhibir la producción de anticuerpos por parte de las células B en un paciente humano, que comprende administrar a dicho paciente humano una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD40 de la invención.
Más específicamente, el paciente humano tiene una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria asociada con células que expresan CD40.
En realizaciones ilustrativas, el paciente humano sufre de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primario, enfermedad tirotoxicosis/Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1 , síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica.
Otro método de la invención se refiere a inhibir la proliferación de células que expresan el antígeno de CD40 humana, que comprende administrar el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención a las células, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno se une específicamente al antígeno CD40 de la superficie de células humanas, donde la unión del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno CD40 inhibe la proliferación o diferenciación de las células.
También se contempla un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado con CD40, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención, donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une específicamente a CD40 humana, donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a CD40 inhibe la proliferación o diferenciación de las células del trastorno asociado con CD40. Las células pueden, pero sin limitarse a ello, ser células B linfoblastoides, pancreáticas, células de pulmón, células mamarías, células ováricas, células de colon, células de próstata, células de piel, células de cabeza y cuello, células de vejiga, células óseas o células renales.
El método de tratamiento para inhibir la proliferación o diferenciación de células puede ser útil en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma de células T, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom o sarcoma de Kaposi.
También se contempla un método para inducir la reducción de células B periféricas, que comprende administrar a las células el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención, donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno CD40 de la superficie celular humana, donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígenos al antígeno CD40 induce la reducción de las células.
En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto que padece un trastorno inmunitario. Por ejemplo, el trastorno inmunitario es artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico.
También se contempla un método para tratar la artritis reumatoide en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo de la invención, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo antagonista que bloquea la función de CD40 en dicho sujeto.
Preferiblemente, el anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la diferenciación de células B y un cambio de isotipo de anticuerpo en dicho sujeto.
En otras realizaciones, el anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la producción de citocinas y quimiocinas y el aumento de moléculas de adhesión en células T y macrófagos en dicho sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la activación de células dendríticas en dicho sujeto.
En otras realizaciones, el método se caracteriza también porque el anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas, metaloproteinasas de matriz, prostaglandinas y para disminuir las moléculas de adhesión en células no inmunitarias en dicho sujeto.
En realizaciones específicas, el anticuerpo se administra en combinación con un régimen que comprende la administración de metotrexato y/o la administración de Enbrel/Humira.
El sujeto que recibe la terapia padece artritis reumatoide y ha sido sensible al tratamiento con metotrexato solo.
En realizaciones específicas, el método comprende tratar a dicho sujeto con un régimen que comprende la administración de metotrexato y/o la administración de Enbrel/Humira.
El método de la invención puede además caracterizarse porque el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con metotrexato solo, Enbrel solo, una combinación de Enbrel+metotrexato.
El método de la invención puede además caracterizarse porque el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con Enbrel +MTX en pacientes que tienen una respuesta inadecuada al metotrexato.
En realizaciones específicas, el anticuerpo se administra en combinación con un régimen que comprende un agente anti-TNF.
En realizaciones específicas, el sujeto se caracteriza porque padece artritis reumatoide y por una respuesta no sensible al tratamiento con agente anti-TNF solo. En dichas realizaciones, el método puede comprender tratar a dicho sujeto con un régimen que comprende el tratamiento con un agente anti-TNF en combinación con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista.
En realizaciones específicas, el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con un agente anti-TNF.
Incluso en otras realizaciones, el método se caracteriza porque el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con Orencia o Rituxan en pacientes que tienen una respuesta inadecuada a un agente anti-TNF solo.
La presente invención contempla además una composición farmacéutica que comprende: (i) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno descrito en esta memoria; y (¡i) un excipiente farmacéuticamente aceptable. En dichas composiciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede conjugarse ventajosamente a un segundo agente, como por ejemplo un agente citotóxico, un vehículo PEG, una enzima o un marcador.
También se contempla en la presente un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 48, SEC ID. NO 50, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61 , SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71 , SEC ID NO: 72 o la SEC ID NO: 73.
También se contempla en la presente invención un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO:8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 , SEC ID NO:36, SEC ID NO:41 , SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:47, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51 , SEC ID NO:52, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56, SEC ID NO:74, SEC ID NO:75 o SEC ID NO:76.
La invención también se refiere al uso de los anticuerpos descritos en este documento para la elaboración de un medicamento para bloquear la función de la CD40 humana en un mamífero, donde el medicamento bloquea una respuesta inmunitaria mediada por CD40 en dicho mamífero.
En una realización, la invención se refiere a la elaboración de un medicamento para tratar o aliviar la enfermedad injerto contra hospedante en un mamífero.
En realizaciones ilustrativas, el medicamento se elabora para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica ¡diopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primarlo, enfermedad tirotoxicosis/Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1, síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica.
En algunas realizaciones, el medicamento puede además comprender la administración de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de TNF, un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad, un antagonista de CTLA4, un receptor anti-IL-6 mAb y un anti-CD20 mAb.
El medicamento puede elaborarse para uso en una ruta de administración parenteral. El medicamento puede elaborarse para uso intravenoso o subcutáneo.
Otra realización contempla un uso de los anticuerpos descritos en este documento para la elaboración de un medicamento para la inhibición de la producción de anticuerpos por parte de las células B en un paciente humano.
Otra realización contempla un uso de los anticuerpos descritos en este documento para la elaboración de un medicamento para la inhibición de la proliferación y/o diferenciación de células que expresan el antígeno CD40 humano.
Otra realización contempla el uso de los anticuerpos descritos en este documento para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno asociado con CD40, donde la unión del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno en dicho medicamento a CD40 inhibe la proliferación o la diferenciación de células del trastorno asociado a CD40.
El medicamento puede elaborarse para uso en el tratamiento de las células, en un trastorno asociado a CD40, seleccionadas entre células B linfoblastoides, pancreáticas, células de pulmón, células mamarias, células ováricas, células de colon, células de próstata, células de piel, células de cabeza y cuello, células de vejiga, células óseas o células renales.
El medicamento puede elaborarse para uso en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma de células T, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, macroglobulin mia de Waldenstrom o sarcoma de Kaposi.
Otra realización contempla el uso de los anticuerpos de la invención en la elaboración de un medicamento para inducir la reducción de células B periféricas, donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del medicamento se une específicamente a un antígeno CD40 de la superficie celular humana, donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígenos al antígeno CD40 induce la reducción de las células.
El medicamento puede elaborarse para uso en el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno autoinmunitario.
El medicamento puede elaborarse para uso en el tratamiento de artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico.
Otra realización contempla el uso de los anticuerpos de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide en un sujeto.
El medicamento puede elaborarse para uso en la inhibición de la diferenciación de células B y cambios de isotipo del anticuerpo en dicho sujeto.
El medicamento puede elaborarse para uso en la inhibición de la producción de citocinas y quimiocinas y el aumento de moléculas de adhesión en células T y macrófagos en dicho sujeto.
El medicamento puede elaborarse para uso en la inhibición de la activación de células dendríticas en dicho sujeto.
El medicamento puede elaborarse para uso en la inhibición de la producción de citocinas inflamatorias, quimiocinas, metaloproteinasas de matriz, prostaglandinas, y en la reducción de moléculas de adhesión en células no inmunitarias en dicho sujeto.
En ciertas realizaciones, el medicamento se elabora como un medicamento combinado para administrar en combinación con un régimen que comprende la administración de metotrexato y/o la administración de Enbrel/Humira.
En otras realizaciones, el medicamento se elabora como un medicamento combinado, y el medicamento, además de comprender los anticuerpos de la invención, comprende también un agente anti-TNF.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS La Figuras 1A: Curvas de unión y valores CE50 correspondientes de anticuerpos humanizados en células HEK-293 transfectadas con CD40 medidas por citometría de flujo. La Figura 1B: Comparación de unión de Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C a células transfectadas con CD40 medida por citometría de flujo. Se muestran los datos representativos de un experimento Figura 2: Curvas de unión y valores CE50 correspondientes de anticuerpos humanizados en células RAMOS medidas por citometría de flujo. Se muestran los datos representativos de un experimento.
Figuras 3A ~ZB Pruebas de anticuerpos de ratón y humanizados para la actividad antagonista en ensayos de proliferación de células B primarias humanas. Fig. 3A Se representan las curvas de titulación de anticuerpos representativos y valores CI50 resultantes para cada anticuerpo precursor de ratón. Se muestran los datos representativos de un donante. Fig. 3B Superposición de las curvas de inhibición que representan el antagonismo de diversos anticuerpos anti-CD40 humanizados en comparación con 4D11.
Figura 4: Pruebas del Anticuerpo B, Anticuerpo A y Anticuerpo C para inhibición de aumento de CD86 inducido por CD40 en ensayos de sangre completa humana. Se muestra el anticuerpo 4D1 1 anti-CD40 para comparación. El control del isotipo lgG1 no demostró efectos en este ensayo. Se muestran los datos representativos de un donante.
Figuras 5: Pruebas del Anticuerpo B, Anticuerpo A y Anticuerpo C para inhibición de aumento de CD86 inducido por CD40 en ensayos de sangre completa humana de mono cynomolgus. El control del isotipo lgG1 no demostró efectos en este ensayo. Se muestran los datos representativos de un donante.
Figuras 6A-6B: Curvas de tiempo de concentración en plasma para el Anticuerpo Fig. 6A (panel izquierdo) y el Anticuerpo Fig. 6B (panel derecho) en mono cynomolgus tras la administración de 1 y 10 mg/kg de cada anticuerpo. Los datos equivalen al resumen de la administración a 3 animales de cada anticuerpo.
Figura 7: Cambio de porcentaje de células B CD86-positivas de monos cynomolgus antes de la administración de (Anticuerpo B) y (Anticuerpo A) y en 3 puntos de tiempo después del tratamiento con cada anticuerpo. Se administraron el Anticuerpo B (paneles superiores) y el Anticuerpo A a 3 animales cada uno con 1 mg/kg (paneles izquierdos) o 10 mg/kg (paneles derechos). .
Figura 8A: Niveles de IgG humana y Figura B IgM humana en ratones NSG 2 semanas después de la inyección de 1.25 x 106 PBMC humano. Los ratones se trataron con vehículo, un control de isotipo y anticuerpos Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C en una dosis de 1 mg/kg un día antes de la transferencia de PBMC humano Figura 9: Unión de los distintos anticuerpos CD40 antihumano de ratón a plaquetas humanas.
Figura 10: Actividad ADCC con constructos de lgG1 con genes inactivados y de tipo salvaje DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La señalización mediada por CD40 se reconoce ahora como implicada en una diversidad de trastornos diana. A pesar de la disponibilidad de una diversidad de datos clínicos que muestran que la intervención en estos trastornos sería terapéuticamente beneficiosa, aún existe la necesidad de anticuerpos anti-CD40 antagonistas que puedan usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. La presente invención, en las realizaciones preferidas, se refiere a anticuerpos humanizados que reconocen CD40. En realizaciones específicas, se ha identificado la secuencia de estos anticuerpos humanizados basándose en las secuencias de ciertos anticuerpos de ratón iniciales.
Las expresiones "CD40" y "antígeno de superficie CD40" se refieren a una glucoproteína de aproximadamente 48 kD expresada en la superficie de células B normales y neoplásicas, que actúa como un receptor de señales implicadas en la proliferación y diferenciación celular (Ledbetter et al., 1987, J. Immunol. 138:788-785). Una molécula de cDNA que codifica CD40 ha sido aislada de una genoteca preparada a partir de la línea celular de linfoma de Burkitt Raji (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8:1403).
Como se usa en este documento, una célula que expresa de manera endógena CD40 es cualquier célula caracterizada por la expresión superficial de CD40, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, células B normales y neoplásicas, células interdigitantes, células epiteliales básales, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliales, células dendríticas foliculares, células de amígdalas y células plasmáticas derivadas de médula ósea. En algunas realizaciones, la molécula de CD40 es una molécula de CD40 humana.
Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a CD40 recombinante humana y nativa. Un anticuerpo monoclonal humanizado en el que dicho anticuerpo se une específicamente a CD40 humana que tiene una actividad antagonista CI50 inferior a 1nM y no tiene agonismo hasta 100 *g/ml en la proliferación de células B, y donde dicho anticuerpo se caracteriza además porque el anticuerpo posee una semivida in vivo en primates no humanos de por lo menos 10 días.
Preferiblemente, el anticuerpo se une específicamente a CD40 en el conjugado CD40-Fc con un valor CE50 inferior a 1 nM y CD40 en células que expresan CD40 con un valor CE50 inferior a 2.5 nM. Las propiedades antagonistas del anticuerpo se definen porque poseen un valor CI50 de actividad agonista de células B o células dendríticas inferior a 1 nM. El anticuerpo posee también propiedades farmacocinéticas superiores que tienen mayor semivida in vivo que otros anticuerpos anti-CD40 (p. ej., el anticuerpo anti-CD40 4D11).
Como se usa en este documento, una célula que expresa CD40 es cualquier célula caracterizada por la expresión superficial de CD40, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, células B normales y neoplásicas, células interdigitantes, células epiteliales básales, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliales, células dendríticas foliculares, células de amígdalas y células plasmáticas derivadas de médula ósea. En algunas realizaciones, la molécula de CD40 es una molécula de CD40 humana.
Los anticuerpos de la presente invención reconocen el "epítopo de antígeno CD40" y el "epítopo CD40" específico. Como se emplean en este documento, los términos se refieren a una molécula (p. ej., un péptido) o un fragmento de una molécula capaz de inmunorreactividad con un anticuerpo anti-CD40 y, por ejemplo, incluyen un determinante antigénico de CD40 reconocido por cualquiera de los anticuerpos que tienen una combinación de secuencia de cadena pesada/cadena ligera de la SEC ID NO.26 de cadena ligera con cualquiera de las SEC ID de cadena ligera NO: 27, 28, 29 o 30; o SEC ID de cadena ligera NO: 31 con cualquiera de las SEC ID de cadena pesada NO 32, 33, 34 o 35; o SEC ID de cadena ligera NO 36 con cualquiera de las SEC ID de cadena pesada NO 37, 38, 39 o 40. Los epítopos de antígeno CD40 pueden incluirse en proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos o similares. Los epítopos son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión a anticuerpos del antígeno CD40), o sus combinaciones.
Los expertos en la técnica conocen la estructura generalizada de los anticuerpos o la inmunoglobulina, estas moléculas son glucoproteínas heterotetrámicas, típicamente de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está covalentemente unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro para formar un heterodímero, y la molécula heterotramérica se forma mediante una unión disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de los heterodímeros. Aunque las cadenas ligeras y pesadas están unidas entre sí por un enlace disulfuro, el número de uniones disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía por el isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también posee puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en el término amino un dominio variable (VH), seguido de tres o cuatro dominios constantes (CHi, CH2, CH3 y CH4), como también una región bisagra entre CHI y CH2- Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable aminoterminal (VL) y un dominio constante carboxiterminal (CL). El dominio VL se asocia no covalentemente con el dominio VH, mientras que el dominio CL está unido covalentemente al dominio CHI mediante un enlace disulfuro. Se cree que los residuos aminoácidos particulares forman una interconexión entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663.) Ciertos dominios dentro de los dominios variables difieren en gran medida entre los diferentes anticuerpos, es decir, son "hipervariables". Estos dominios hipervariables contienen residuos que están directamente implicados en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su determinante antigénico específico. La hipervariabilidad, tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada, se concentra en tres segmentos conocidos como regiones determinantes complementarias (CDR) o bucles hipervariables (HVL). Las CDR se definen por la comparación de secuencias en Kabat et al., 1991 , en: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., mientras que los HVL se definen estructuralmente de acuerdo con la estructura tridimensional del dominio variable, como se describe en Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Si bien estos dos métodos resultan en identificaciones levemente diferentes de una CDR, se prefiere la definición estructural. Como lo define Kabat, la CDR-L1 está posicionada aproximadamente en los residuos 24-34, la CDR-L2, aproximadamente en los residuos 50-56 y la CDR-L3 aproximadamente en los residuos 89-97 en el dominio variable de cadena ligera; La CDR-H1 está posicionada aproximadamente en los residuos 31-35, la CDR-H2, aproximadamente en los residuos 50-65 y la CDR-H3, aproximadamente en los residuos 95-102 en el dominio variable de cadena pesada. Las CDR1 , CDR2, CDR3 de las cadenas ligeras y pesadas definen, por lo tanto, las propiedades únicas y funcionales específicas de un anticuerpo determinado.
Las tres CDR dentro de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se separan mediante regiones flanqueantes (FR), que contienen secuencias que tienden a ser menos variables. Desde el término amino al término carboxi de los dominios variables de cadena pesada y liviana, las FR y CDR se disponen en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La configuración en ß-lámina de las FR aproxima las CDR dentro de cada una de las cadenas entre sí como también a las CDR de la otra cadena. La conformación resultante contribuye al sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., 1991 , NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669), aunque no todos los residuos de CDR están necesariamente directamente implicados en la unión al antígeno.
Los residuos de FR y los dominios constantes de Ig no están directamente implicados en la unión a antígenos, pero contribuyen a la unión al antígeno y/o media la función efectora del anticuerpo. Se cree que algunos residuos de FR tienen un efecto significativo en la unión al antígeno en por lo menos tres formas: uniendo no covalentemente a un epítopo, interactuando con uno o más residuos de CDR y afectando la interconexión entre las cadenas pesadas y ligeras. Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión al antígeno pero median diversas funciones efectoras de Ig, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
Las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas de vertebrados se asignan a una de las clases claramente distintas, kappa (?) y lambda (?), en base a la secuencia de aminoácidos del dominio constante. En comparación, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de mamíferos se asignan a una de cinco clases principales, de acuerdo con la secuencia de los dominios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA también se dividen en subclases (isotipos), p. ej., IgG^ lgG2, lgG3, lgG4, IgA! e lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? ? µ, respectivamente. Se conocen las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las clases de inmunoglobulinas nativas.
Las expresiones "anticuerpo", "anticuerpo anti-CD40", "anticuerpo anti-CD40 humanizado" y "anticuerpo anti-CD40 humanizado variante" se usan en el presente documento en el sentido más amplio y abarcan específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud total), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos tales como dominios variables y otras porciones de anticuerpos que exhiben una actividad biológica deseada, p. ej., unión CD40.
La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; es decir, los anticuerpos individuales en esa población son idénticos, excepto por mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo determinante antigénico, un "epítopo". Por lo tanto, el modificador "monoclonal" es indicativo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos dirigidos hacia el epítopo idéntico y no se interpretará que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Se ha de entender que los anticuerpos monoclonales pueden realizarse mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica; incluyendo, p. ej., el método de hibridoma ( Kohler et al., 1975, Nature 256:495), o métodos de DNA recombinante conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4,816,567), o métodos de producción monoclonal recombinante que utilizan genotecas de anticuerpos de fago, usando las técnicas descritas en Clackson et al., 1991 , Nature 352: 624-628, y Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol. 222: 581-597.
Los anticuerpos quiméricos consisten en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de una especie (p. ej., un mamífero no humano tal como un ratón) y los anticuerpos de las regiones constantes de cadena pesada y ligera de otras especies (p. ej., humana) y pueden obtenerse uniendo las secuencias de DNA que codifican las regiones variables del anticuerpo de la primera especie (p. ej., ratón) a las secuencias de DNA para las regiones constantes del anticuerpo de la segunda especie (p. ej., humana) y transformando un hospedante con un vector de expresión que contiene las secuencias unidas para permitirle producir un anticuerpo quimérico. Alternativamente, el anticuerpo quimérico también podría ser uno en el que una o más regiones o dominios de la cadena pesada y/o ligera sean idénticos con, homólogos a, o una variante de la correspondiente secuencia en un anticuerpo monoclonal de otra clase o isotipo de inmunoglobulina, o de una secuencia de líneas germinales o de consenso. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que el fragmento de anticuerpo exhiba la actividad biológica deseada de su anticuerpo madre, por ejemplo unión al mismo epítopo (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4,816, 567; y Morrison et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 6851-6855).
Las expresiones "fragmento de anticuerpo", "fragmento de anticuerpo anti-CD40", "fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado", "fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado variante" se refieren a una porción de un anticuerpo anti-CD40 de longitud total, en el que se retiene una región variable o una capacidad funcional, por ejemplo unión al epítopo CD40 específico. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, aunque sin limitarse a ello, un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, un diacuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo monocatenario, un minicuerpo, un diacuerpo formado a partir de fragmentos de anticuerpo y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos de longitud total pueden tratarse con enzimas tales como papaína o pepsina para generar fragmentos de anticuerpos útiles. La digestión con papaína se utiliza para producir dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento Fe residual. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CHi de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina da un fragmento F (ab' que tiene dos sitios de unión al antígeno y es todavía capaz de reticular el antígeno.
Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la presencia de residuos adicionales que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo en el término C del dominio CHi. Los fragmentos de anticuerpo F (ab')2 son pares de fragmentos Fab' unidos por residuos cisteína en la región bisagra. Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
El fragmento "Fv" contiene un reconocimiento del antígeno completo y el sitio de unión que consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo.
Un fragmento de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" es una variante Fv monocatenaria que comprende los dominios VH y VL de un anticuerpo donde los dominios están presentes en una cadena de polipéptidos simple. El Fv monocatenario es capaz de reconocer la unión al antígeno. El polipéptido scFv puede opcionalmente contener también un enlazador polipeptídico posicionado entre los dominios VH y VL con el fin de facilitar la formación de una estructura tridimensional deseada para la unión al antígeno mediante scFv (véase, p. ej., Pluckthun, 1994, en The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315).
Otros fragmentos de anticuerpo incluyen aquellos que comprenden un par de segmentos Fd tándem (VH-CHI-VH-CHI) para formar un par de regiones de unión al antígeno. Estos "anticuerpos lineales" pueden ser biespecíficos o monoespecíficos según se describe, por ejemplo, en Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062.
Un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado es un tipo específico de anticuerpo quimérico que incluye una variante de la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina, o su fragmento, capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una o más FR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una o más CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Esta secuencia de aminoácidos no humana que a menudo se denomina secuencia "importada" típicamente se toma de un dominio de anticuerpo "importado", particularmente un dominio variable. En general, un anticuerpo humanizado incluye por lo menos las CDR o HVL de un anticuerpo no humano, insertado entre las FR de un dominio variable de cadena pesada o ligera humano. La presente invención describe anticuerpos anti-CD40 humanizados específicos que contienen las CDR derivadas de los anticuerpos monoclonales murinos que se muestran en las Tablas 3 y 4 insertados entre las FR de los dominios variables de cadena pesada y ligera de la secuencia de líneas germinales humanas. Se ha de entender que ciertos residuos FR murinos pueden ser importantes para la función de los anticuerpos humanizados y, en consecuencia, ciertos dominios variables de cadena pesada y ligera de la secuencia de líneas germinales humanas se modifican para ser los mismos que aquellos de la correspondiente secuencia murina.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-CD40 humanizado comprende sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables (como el contenido, por ejemplo en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y Fv) en los que todas, o sustancialmente todas las CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana, y específicamente en el presente documento, todas las CDR son secuencias murinas según se detalla en las Tablas 1 a 4 del presente documento, y todas, o sustancialmente todas las FR son aquellas de un consenso o secuencia de líneas germinales de inmunoglobulina humana. En otro aspecto, un anticuerpo anti-CD40 humanizado también incluye por lo menos una porción de una región Fe de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Comúnmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir una o más de las bisagras Cm, CH2. CH3 y/o CH de la cadena pesada, según sea apropiado.
Un anticuerpo anti-CD40 humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG , lgG2l lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Por ejemplo, el dominio constante puede ser un dominio constante fijo de complemento donde se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, y el isotipo sea típicamente IgGi. Si no se desea dicha actividad citotóxica, el dominio constante puede ser otro isotipo, p. ej., lgG2. Un anticuerpo anti-CD40 humanizado alternativo puede comprender las secuencias de más de una clase o isotipo de inmunoglobulina, y seleccionar dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas están dentro de la práctica ordinaria en la técnica. En realizaciones específicas, la presente invención provee anticuerpos que son anticuerpos lgG1 y más particularmente anticuerpos lgG1 en los que hay una inactivación de las funciones efectoras.
Las FR y CDR, o HVL, de un anticuerpo anti-CD40 humanizado no necesitan corresponderse precisamente con las secuencias parentales. Por ejemplo, uno o más residuos en la CDR importada, o HVL, o la secuencia FR de líneas germinales o consenso puede alterarse (p. ej., mutagenizarse) por sustitución, inserción o eliminación de modo tal que el residuo de aminoácidos resultante ya no sea idéntico al residuo original en la correspondiente posición en ninguna de las secuencias parentales, pero el anticuerpo, no obstante, retiene la función de unión a CD40. Dicha alteración típicamente no será extensa y será una alteración conservadora. Usualmente, por lo menos 75% de los residuos de anticuerpo humanizado se corresponderán con aquellos de la FR de líneas germinales o consenso parental y las secuencias CDR importadas, más a menudo por lo menos 90%, y los más frecuentemente más de 95%, o más de 98% o más de 99%.
Los residuos de inmunoglobulina que afectan la interconexión entre las regiones variables de cadena pesada y ligera ("la interface VL-VH") son aquellos que afectan la proximidad u orientación de las dos cadenas una respecto de la otra. Ciertos residuos que pueden estar implicados en interacciones intercatenarias incluyen los residuos VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91 , 96 y 98, y los residuos VH 35, 37, 39, 45, 47, 91 , 93, 95, 100 y 103 (utilizando el sistema de numeración expuesto en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). La. patente estadounidense No. 6,407,213 también analiza que los residuos tales como los residuos VL 43 y 85, y los residuos VH 43 y 60 también pueden estar implicados en esta interacción. Si bien estos residuos se indican para IgG humana solamente, son aplicables en otras especies. Se seleccionan residuos de anticuerpo importantes que se espera razonablemente que estén implicados en interacciones entre cadenas para sustitución en la secuencia de consenso.
Las expresiones "secuencia dé consenso" y "anticuerpo de consenso" se refieren a una secuencia de aminoácidos que comprende el residuo de aminoácidos que ocurre con mayor frecuencia en cada ubicación en todas las inmunoglobulinas de cualquier clase particular, isotipo o estructura subunitaria, p. ej., un dominio variable de inmunoglobulina humana. La secuencia de consenso puede basarse en inmunoglobulinas de una especie particular o de muchas especies. Se entiende que una secuencia o estructura de "consenso", o anticuerpo abarca una secuencia humana de consenso según se describe en ciertas realizaciones, y se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de aminoácidos que ocurren con mayor frecuencia en cada ubicación en todas las ¡nmunoglobulinas humanas de cualquier clase, isotipo o estructura subunitaria particular. Por lo tanto, la secuencia de consenso contiene una secuencia de aminoácidos que tiene en cada posición un aminoácido que está presente en una o más ¡nmunoglobulinas conocidas, pero que puede no duplicar exactamente toda la secuencia de aminoácidos de cualquier inmunoglobulina individual. La secuencia de consenso de región variable no se obtiene de ningún anticuerpo o inmunoglobulina producida naturalmente. Kabat et al., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., y sus variantes. Las FR de secuencias de consenso de cadena pesada y ligera, y sus variantes, proveen secuencias útiles para la preparación de anticuerpos anti-CD40 humanizados. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 6.037.454 y 6.054.297.
Las secuencias de líneas germinales humanas se hallan naturalmente en la población humana. Una combinación de esos genes de líneas germinales genera diversidad de anticuerpos. Las secuencias de anticuerpos dé líneas germinales para la cadena ligera del anticuerpo vienen de genes v y genes j de kappa o lamba de líneas germinales humanas conservadas. De modo similar, las secuencias de cadena pesada vienen de genes v, d y j de líneas germinales (LeFranc, M-P, and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).
Como se emplea en esta memoria, "variante", "variante anti-CD40", "variante anti-CD40 humanizada" o "anti-CD40 variante humanizada" se refieren a un anticuerpo anti-CD40 humanizado que tiene por lo menos una CDR murina variable de cadena pesada de cualquiera de las secuencias de SEC ID NO: 1 a 4 o una secuencia CDR murina de cadena ligera derivada del anticuerpo monoclonal murino que se muestra en cualquiera de las SEC ID NO:5 a SEC ID NO:8 y las secuencias FR derivadas de secuencias de consenso humano. Las variantes incluyen aquellas que tienen uno o más cambios de aminoácidos en uno o ambos dominios variables de cadena ligera o pesada, siempre que el cambio de aminoácido no obstaculice sustancialmente la unión del anticuerpo a CD40. Los anticuerpos humanizados ilustrativos producidos en este documento incluyen aquellos diseñados como Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C, y las diversas secuencias de cadena pesada y ligera de los mismos se muestran en las SEC ID NO 26 a SEC ID NO: 40.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes del entorno natural del anticuerpo son aquellos materiales que pueden interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden ser enzimas, hormonas u otros solutos proteináceos o no proteináceos. En un aspecto, el anticuerpo se purificará hasta por lo menos más del 95% de aislamiento en peso del anticuerpo.
Un anticuerpo aislado incluye un anticuerpo in situ dentro de células recombinantes en las que se produce, ya que por lo menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Comúnmente, no obstante, un anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación en la que se elimina el material celular recombinante.
La expresión "desempeño del anticuerpo" se refiere a factores que contribuyen al reconocimiento del anticuerpo de antígenos o la eficacia de un anticuerpo in vivo. Los cambios en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden afectar las propiedades del anticuerpo tales como pliegue, y pueden influir en los factores físicos tales como índice inicial de unión del anticuerpo al antígeno (ka), constante de disociación del anticuerpo del antígeno (kd), constante de afinidad del anticuerpo hacia el antígeno (Kd), conformación del anticuerpo, estabilidad de proteína y semivida del anticuerpo.
La expresión "epítopo marcado" cuando se usa en esta memoria, se refiere a un anticuerpo anti-CD40 condensado a una "marca de epítopo". Una "marca de epítopo" es un polipéptido que tiene un número suficiente de aminoácidos como para proveer un epítopo para producción de anticuerpos; aún así tiene un diseño tal que no interfiere con la actividad deseada del anticuerpo anti-CD40 humanizado. La marca de epítopo por lo general es lo suficientemente única como para que un anticuerpo generado contra esa marca de epítopo no reaccione de manera sustancialmente cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos marcados adecuados en general contienen por lo menos 6 residuos de aminoácidos y usualmente contienen aproximadamente 8 a 50 residuos de aminoácidos, o aproximadamente 9 a 30 residuos. Los ejemplos de marcas de epítopos y el anticuerpo que se une al epítopo incluyen el polipéptido de marca HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; la marca c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616; y la marca de la glucoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su anticuerpo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). En ciertas realizaciones, la marca del epítopo es un "epítopo de unión al receptor de rescate". Como se usa en esta memoria, la expresión "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula de IgG (como IgGi, lgG2, lgG3 o lgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse a un agente citotóxico. Esto es cualquier sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o que causa la destrucción de las células. La expresión tiene como fin incluir isótopos radiactivos (como I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, y sus fragmentos. Dichos agentes citotóxicos pueden acoplarse a los anticuerpos humanizados de la presente invención usando procedimientos convencionales, y usarse, por ejemplo, para tratar a un paciente indicado para terapia con el anticuerpo.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Existen numerosos ejemplos de agentes quimioterapéuticos que podrían conjugarse con los anticuerpos terapéuticos de la presente invención. Ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquiisulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulacetina y bulatacinona); camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin, y bizelesin); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina, auristatinas, (incluyendo análogos de monometil-auristatina E y monometil-auristatina F)¡ duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobin; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina; trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como antibiótico de enediina (p. ej., calquieamicina, especialmente caliquemicina gammal l y caliquemicina phiM, véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; esperamicina; como también cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamycin™) (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrin, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epitolona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-tricloro trietilamina; tricotecanos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina); uretan; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitabronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil; gemcitabina (Gemzar™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato ; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina Navelbine™); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterin; xeloda; ibandronato; CPT-1 1 ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácido so derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en la definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de los receptores de estrógenos receptivos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston™); inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, megestrol acetato (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) y anastrozol (Arimidex™); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácido so derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Uno cualquiera o más de estos agentes se pueden conjugar a los anticuerpos humanizados de la presente invención para proveer un agente terapéutico útil para el tratamiento de diversos trastornos.
Los anticuerpos también pueden conjugarse a profármacos. Un "profármaco" es un precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico para las células tumorales que el fármaco madre y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma más activa. Véanse, por ejemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy", en Biochemical Society Transactions, 14, pág. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, en: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pág. 247-267, Humana Press. Los profármacos útiles incluyen, aunque sin limitarse a ello, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glucosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida y profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivar en una forma de profármaco incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Para fines diagnósticos como también de monitoreo terapéutico, los anticuerpos de la invención pueden también conjugarse a una etiqueta, o bien una etiqueta sola o a una etiqueta y un segundo agente adicional (profármaco, agente quimioterapéutico y similar). Una etiqueta, según se distingue, de los otros segundos agentes, se refiere a un agente que es un compuesto o composición detectable y que puede conjugarse directa o indirectamente a un anticuerpo humanizado de la presente invención. La etiqueta puede ser en sí misma detectable (p. ej., etiquetas de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. El anticuerpo anti-CD40 humanizado marcado se puede preparar y usar en diversas aplicaciones que incluyen diagnósticos in vitro e in vivo.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden formular como parte de una preparación liposomal con el fin de efectuar su administración in vivo. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos. Los liposomas son útiles en la administración a un mamífero de un compuesto o formulación, como un anticuerpo anti-CD40 humanizado descrito en la presente memoria, opcionalmente acoplado o en combinación con uno o más agentes farmacéuticamente activos y/o etiquetas. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.
Ciertos aspectos de la presente invención relacionados con ácidos nucleicos aislados que codifican uno o más dominios de los anticuerpos humanizados de la presente invención. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia comúnmente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada se distingue de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales.
En diversos aspectos de la presente invención, uno o más dominios de los anticuerpos humanizados se expresarán de manera recombinante. Dicha expresión recombinante puede emplear una o más secuencias de control, es decir, secuencias de polinucleótidos necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo hospedante particular. Las secuencias de control adecuadas para uso en células procarióticas incluyen, por ejemplo, promotor, operador y secuencias del sitio de unión al ribosoma. Las secuencias de control eucariótico incluyen, aunque sin limitarse a ello, promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. Estas secuencias de control se pueden utilizar para expresión y producción de anticuerpo anti-CD40 humanizado en células hospedantes procarióticas y eucarióticas.
Una secuencia de ácido nucleico está "operativamente unida" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una presecuencia de ácido nucleico o líder secretor está operativamente unido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado como para facilitar la traducción. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de DNA que están siendo unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. No obstante, los potenciadores son. opcionalmente contiguos. La unión se puede lograr mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se pueden utilizar enlazadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos.
Como se emplean en esta memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y dichas designaciones incluyen su descendencia. Por lo tanto, "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de allí sin importar el número de transferencias.
El término "mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domesticados y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas como perros, caballos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
Un "trastorno", como se usa en esta memoria, es cualquier estado que se beneficiaría del tratamiento con un anticuerpo anti-CD40 humanizado descrito en este documento. Esto incluye trastornos o enfermedades agudas o crónicas, incluyendo aquellas patologías que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitativos de trastornos a tratar en este documento incluyen cáncer, neoplasias hematológicas, tumores benignos y malignos, leucemias y tumores linfoides, y trastornos inflamatorios, angiogénicos, autoinmunitarios e inmunológicos.
Los 'términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos, que típicamente se caracteriza por una proliferación celular desregulada. Los ejemplos incluyen cáncer, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.
Como se emplean en. esta memoria, , las expresiones "trastorno asociado a CD40" o "enfermedad asociada a CD40" se refieren a una afección en la que se indica la modificación o eliminación de células que expresan CD40. Esto incluye células que expresan CD40 que demuestran una proliferación anormal o células que expresan CD40 asociadas con tumores malignos o cancerosos. Ejemplos más particulares de tipos de cáncer que demuestran expresión anormal del antígeno CD40 incluyen células B linfoblastoides, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma de células T, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, tumores epidérmicos y endoteliales, pancreáticos, de pulmón, de mama, de ovario, de colon, de próstata , de cabeza y cuello, de piel (melanoma), de vejiga y de riñon. Dichos trastornos incluyen, aunque sin limitarse a ello, leucemias, linfomas, incluyendo linfoma de células B y linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom; tumores sólidos, incluyendo sarcomas, como osteosarcoma, sarcoma de Ewing, melanoma maligno, adenocarcinoma, incluyendo adenocarcinoma de ovario, sarcoma de Kaposi/tumor de Kaposi y carcinoma de células escamosas.
Un trastorno asociado a CD40 también incluye enfermedades y trastornos del sistema inmunitario, como trastornos autoinmunitarios y enfermedades inflamatorias. Dichas afecciones incluyen, aunque sin limitarse a ello, artritis reumatoide (RA), lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerodermia, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), inflamación pulmonar, asma y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP).
La expresión "que cesa el crecimiento de" o "inhibidor del crecimiento" cuando se usa en esta memoria se refiere a inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula, especialmente una célula neoplásica del tipo que expresa el antígeno CD40. Por lo tanto, la inhibición del crecimiento, por ejemplo, reduce significativamente el porcentaje de células neoplásicas en la fase S.
La expresión "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un agente en la vena de un animal o de un paciente humano durante un periodo superior a aproximadamente 15 minutos, en general entre aproximadamente 30 y 90 minutos.
La expresión "bolo intravenoso" se refiere a la administración de un fármaco en la vena de un animal o ser humano de modo tal que el cuerpo recibe el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, en general 5 minutos o menos.
La expresión "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un agente debajo de la piel de un animal o paciente humano, preferiblemente dentro de una cavidad entre la piel y el tejido subyacente, mediante administración relativamente lenta y sostenida desde un receptáculo con el fármaco. La punción de la piel hacia arriba y hacia afuera desde el tejido subyacente puede crear la cavidad.
La expresión "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco debajo de la piel de un animal o ser humano, preferiblemente dentro de una cavidad entre la piel y el tejido subyacente, mediante administración relativamente lenta y sostenida desde un receptáculo con fármaco por un periodo de tiempo que incluye, aunque sin limitarse a ello, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión puede realizarse por implante subcutáneo de una bomba de administración de fármacos implantada debajo de la piel del animal o ser humano, donde la bomba suministra una cantidad predeterminada de fármaco por un periodo de tiempo predeterminado, como 30 minutos, 90 minutos, o un tiempo que abarca la longitud del régimen de tratamiento.
La expresión "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco debajo de la piel de un animal o ser humano, donde la administración del fármaco en bolo demora menos de aproximadamente 15 minutos; Oen otro aspecto, menos de 5 minutos e incluso en otro aspecto menos de 60 segundos. Incluso en otro aspecto, la administración se realiza dentro de una cavidad entre la piel y el tejido subyacente, donde la cavidad puede crearse mediante punción de la piel hacia arriba y hacia afuera del tejido subyacente.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se utiliza para hacer referencia a una cantidad de un agente activo que alivia o mejora uno o más de los síntomas del trastorno que se está tratando. Al hacerlo, es aquella cantidad que produce un resultado beneficioso en el paciente, por ejemplo, un efecto de cese del crecimiento, o que causa la eliminación de la célula. En un aspecto, la cantidad terapéuticamente eficaz tiene actividad apoptótica, o es capaz de inducir la muerte celular. En otro aspecto, la cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una concentración en suero diana que se ha demostrado que es eficaz, por ejemplo, en demorar la progresión de la enfermedad. La eficacia se puede medir de manera convencional, dependiendo de la afección a tratar. Por ejemplo, en enfermedades o trastornos neoplásicos caracterizados por células que expresan CD40, la eficacia se puede medir evaluando el tiempo para la progresión de la enfermedad, o determinando los índices de respuesta.
Los términos "tratamiento" y "terapia" y similares, como se emplean en esta memoria, pretenden incluir medidas terapéuticas y profilácticas, o supresoras para una enfermedad o trastorno, conduciendo a cualquier efecto clínicamente conveniente o beneficioso, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, el alivio de uno o más síntomas, la regresión, demora o cese de la progresión de la enfermedad o el trastorno. Por consiguiente, por ejemplo, el término tratamiento incluye la administración de un agente antes o después del inicio de un síntoma de una enfermedad o trastorno, previniendo o eliminando así uno o más signos de la enfermedad o el trastorno. Como otro ejemplo, el término incluye la administración de un agente después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad. Además, la administración de un agente después del inicio y después de que se han manifestado los síntomas clínicos donde la administración afecta los parámetros clínicos de la enfermedad o el trastorno, como el grado de lesión a los tejidos o la cantidad o grado de metástasis, ya sea que el tratamiento conduzca o no al alivio de la enfermedad, comprende "tratamiento" o "terapia" tal como se emplean en esta memoria. A su vez, siempre que las composiciones de la invención, o bien solas o en combinación con otro agente terapéutico alivien o disminuyan por lo menos un síntoma del trastorno que se esté tratando en comparación con ese síntoma en ausencia del uso de la composición de anticuerpo CD40 humanizado, el resultado debe considerarse un tratamiento eficaz del trastorno subyacente, independientemente de si se aliviaron todos los síntomas del trastorno o no.
El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, administración, contraindicaciones y/o advertencias respecto del uso de dichos productos terapéuticos.
Anticuerpos En la presente se describen anticuerpos anti-CD40 humanizados, y composiciones y artículos de fabricación que comprenden uno o más de los anticuerpos anti-CD40 humanizados de la presente invención. Además, se describen agentes de unión que incluyen un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-CD40 humanizado. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados y los agentes de unión pueden cesar la proliferación de las células, causar la eliminación de células que expresan CD40 o inducir o causar un efecto citotóxico o citostático sobre las células diana.
Los anticuerpos anti-CD40 humanizados y los agentes de unión se pueden utilizar en el tratamiento de una diversidad de enfermedades o trastornos caracterizados por la proliferación de células que expresan el antígeno de superficie CD40. Un anticuerpo anti-CD40 humanizado y un agente de unión CD40 incluyen cada uno por lo menos una porción que reconoce específicamente un epítopo CD40 (es decir, un fragmento de unión al antígeno).
En la caracterización inicial, se seleccionaron anticuerpos murinos en base a la caracterización de unión CD40.
A partir de estos estudios iniciales, se seleccionaron anticuerpos murinos que tenían regiones variables de cadena pesada, los cuales se muestran en la Tabla 1 , y regiones variables de cadena ligera, los cuales se muestran en la Tabla 2: TABLA 1 : Anticuerpos murinos iniciales CD40 - Secuencias VH EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYVHVWKQRPEKGLEWIGRIDPEDGDSKYA PKFQGKAT TADTSSNTAYLHLSSLTSED 2H11 TAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTLTVSS (SEC ID NO:1 ) EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEKGLEWIGRIDPEDGDTKYDP KFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSED 10F2 TAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEC ID NO:2) EVQLQQSGAELVRPGASVQLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGRIDPEDGDTKFA PKFQGKATMTADTSSNTVYLHLSSLTSED 19B10 TAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEC ID NO:3) EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGNRIIYYA DTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSED 20E2 TALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTSVTVSS(SEC ID NO:4) TABLA 2: Anticuerpos murinos iniciales CD40 - Secuencias VK QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFG GSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYY H11 CQQRTFYPYTFGGGTKLEIK (SEC ID NO:5) QIVLTQSPTI SASPGEKVIITCSATSSVSYILWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGS GSGASYSLTISRMEAEDAATYY 0F2 CQQRTFYPYTFGGGTKLEIK (SEC ID NO:6) QIVLTQSPAI SASPGEKVTITCSASSSVSY LWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSG SGSGTSYSLTISRMEAEDAATY 9B10 YCQQRTFYPYTFGGGTKLEIK (SEC ID NO:7) DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNL 0E2 QAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKLELK (SEC ID NO:8) Se seleccionaron secuencias flanqueantes humanas para cada ratón basándose en la homología estructural, estructura de CDR, restos canónicos conservados, restos de empaquetamiento de interfaz conservados y otros parámetros.
Los anticuerpos seleccionados de las CDR de cadena pesada y ligera murina de los diversos anticuerpos murinos se indican en las Tablas 3 y 4, respectivamente: TABLA 3: Secuencias CDR de CADENA PESADA Nombre del constructo H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 2H11 GFNIKD YYVW RIDPEDGDSKYAPKFQG SYYVGTYGY SEC ID NO: 9 SEC ID NO: 12 SEC ID NO: 16 10F2 GFNIKD YYIH RIDPEDGDTKYDPKFQG SYYVGTYGY SEC ID NO: 13 SEC ID NO: 16 SEC ID NO: 10 19B10 GFNIKD YYVH RIDPEDGD TKFAPKFQG SYYVGTYGY SEC ID NO: 14 SEC ID NO: 16 SEC ID NO: 9 20E2 GFTFSDYGMH YISSGNRII YYAD TVKG QDGYRYAMDY SEC ID NO: 17 SEC ID NO: 11 SEC ID NO: 15 El H-CDR1 anteriormente enumerado usa la secuencia que utiliza el sistema de numeración Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948). La numeración Kabats para las secuencias se marca con texto en negrita y cursiva, y la numeración IMGT se muestra con texto subrayado de los residuos en la tabla de arriba para CDR1 y CDR2. Las secuencias para H-CDR3 para cada uno de 2H11 , 10F2 y 19B10 es TTSYYVGTYGY (SEC ID NO:77) y para 20E2 es ARQDGYRYAMDY (SEC ID NO:78).
TABLA 4: Secuencias CDR de CADENA LIGERA Nombre del constructo L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3 2H11 SASSSVSYML STSNLAS QQRTFYPYT SEC ID NO: 18 SEC ID NO: 22 SEC ID NO: 24 10F2 SATSSVSYIL STSNLAS QQRTFYPYT SEC ID NO: 19 SEC ID NO: 22 SEC ID NO: 24 19B10 SASSSVSYML STSNLAS QQRTFYPYT SEC ID NO: 20 SEC ID NO: 22 SEC ID NO: 24 20E2 KSSQSLLNSGNQKNYL T WTSTRES QNDYTYPLT SEC ID NO: 21 SEC ID NO: 23 SEC ID NO: 25 Nuevamente, el sistema de numeración Chothia se utiliza en la Tabla 4 con la numeración Kabats para las secuencias marcada con texto en negrita y cursiva, y la numeración IMGT se muestra con texto subrayado de los residuos en la tabla de arriba para CDR1 y CDR2.
Los Fab que mostraron una unión mejor o igual en comparación con el Fab original quimérico se seleccionaron para conversión a IgG. Los clones de la serie 20E2 se convirtieron a dos formatos IgG diferentes: a) lgG4DM (mutante doble) tiene dos mutaciones en la región bisagra Fe/, Ser228Pro que reduce la formación de media molécula y Leu235Glu que además reduce la unión FcyR. b) IgGI KO (inactivación de las funciones efectoras) tiene dos mutaciones en la región Fe, Leu234Ala y Leu235Ala, que reducen la función efectora tal como FcyR y complementan la unión. Ambos formatos de IgG se describen en la bibliografía. El ejemplo 1 describe la humanización de tres candidatos en más detalle. Los resultados de dicha humanización produjeron secuencias de anticuerpo humanizado, que tienen las secuencias de cadena pesada y ligera que se muestran a continuación: En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno puede, por ejemplo, bloquear la proliferación o cesar el crecimiento de una célula, o causar su reducción, muerte o eliminación, por ejemplo, a través de la unión al antígeno de superficie CD40. Por ejemplo, en tumores malignos de células T y B, los efectos antitumorales (p. ej., cese del crecimiento con o sin eliminación celular o apoptosis) a menudo resulta cuando las células malignas se exponen a estímulos que conducen a la activación de linfocitos normales. El cese del crecimiento inducido por activación se ha observado con señales a través de los receptores del antígeno o de receptores coestimuladores (véanse, p. ej., Ashwell et al., 1987, Science 237:61 ; Bridges et al., 1987, J. Immunol. 139:4242; Page and Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717; y Beckwith et al., 1990, J. Nati. Cáncer Inst. 82:501). La estimulación CD40, como resultado de la unión especifica mediante un anticuerpo o un ligando soluble, inhibe el crecimiento del linfoma de células B (véase, p. ej., Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794). Los agentes que inhiben el crecimiento de células malignas de esta manera y que se dirigen contra el antígeno de superficie CD40 son ejemplos de agentes apropiados.
Los agentes específicos de CD40 incluyen el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-CD40 humanizado que se une a CD40 (p. ej., CD40 humana o su variante). Los agentes y anticuerpos específicos de CD40 se pueden conjugar opcionalmente o condensarse a un agente citotóxico o quimioterapéutico. En aspectos en los que el anticuerpo humanizado se une al antígeno de superficie CD40 y causa la reducción de los tipos de células que expresan CD40, la unión en general se caracteriza por autodirigir la célula del antígeno de superficie CD40 in vivo. Los agentes de unión adecuados unen el antígeno CD40 con suficiente afinidad y/o avidez como para que el agente específico de CD40 sea útil como agente terapéutico dirigiendo específicamente una célula que expresa el antígeno.
En algunos aspectos, el anticuerpo humanizado disminuye la unión del ligando CD40 a CD40 en por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 60% o por lo menos 75% o por lo menos 80%, o por lo menos 90%, o por lo menos 95%.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 humanizados, incluyendo sus fragmentos de unión al antígeno, como los dominios variables de cadena pesada y ligera, comprenden una secuencia de aminoácidos de los residuos derivados de las CDR Anticuerpo A (secuencia de cadena pesada = SEC ID NO:27; SEC ID NO: 28; SEC ID NO:29 o SEC ID NO:30; secuencia de cadena ligera = SEC ID NO:26), Anticuerpo B (secuencia de cadena pesada = SEC ID NO:32; SEC ID NO: 33; SEC ID NO: 34; o SEC ID NO:35; secuencia de cadena ligera = SEC ID NO:31) y Anticuerpo C (secuencia de cadena pesada = SEC ID NO:37; SEC ID NO: 38; SEC ID NO:39 o SEC ID NO:40; secuencia de cadena ligera = SEC ID NO:36;) descritos anteriormente y residuos de aminoácidos derivados de regiones flanqueantes de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados opcionalmente incluyen sustituciones de aminoácidos específicas en las regiones consenso o flanqueantes de línea germinal.
La sustitución específica de restos aminoacídicos en estas posiciones flanqueantes puede mejorar varios aspectos del comportamiento del anticuerpo, incluyendo la afinidad de unión y/o estabilidad, con respecto a lo demostrado en anticuerpos humanizados formados por "cambio directo" de CDR o HVL en regiones flanqueantes de línea germinal humana, como se muestra en los ejemplos a continuación.
En algunas realizaciones, la presente invención describe otros anticuerpos monoclonales con secuencias de cadena pesada (VH) de SEC ID NO:1 a SEC ID NO:4 y secuencias de cadena ligera (VL) de SEC ID NO:5 a SEC ID NO:8 (véanse Tablas 1 y 2 anteriores). La secuencia CDR de estos anticuerpos murinos que se muestran en las Tablas 3 y 4, disponiendo dichas CDR en FR en dominios variables de cadenas pesada y ligera de consenso humano producirán los anticuerpos humanizados útiles de la presente invención.
En algunas realizaciones específicas, los anticuerpos humanizados anti-CD40 descritos en esta memoria comprenden por lo menos un dominio variable de cadena pesada o ligera que comprende las CDR o HVL de los anticuerpos monoclonales murinos como se muestra en las Tablas 1 a 4 de arriba y las FR de los dominios variables de cadena ligera y pesada de la línea germinal humana. En realizaciones ilustrativas, los anticuerpos humanizados creados en esta memoria son: Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C y las diversas secuencias de cadena ligera y pesada de los mismos se muestran en la SEC ID NO 26 a la SEC ID NO:40.
En realizaciones específicas, se contemplan anticuerpos que tienen una secuencia de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 27, SEC ID NO:28, SEC ID NO:29 o SEC ID NO:30 en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEC ID NO:26. Los anticuerpos alternativos incluyen aquellos que tienen una secuencia de cadena pesada de SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34 o SEC ID NO SEC ID NO:35, en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEC ID NO:31. En realizaciones adicionales, se proveen anticuerpos humanizados que tienen una secuencia de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 37, SEC ID N°:38; SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40, en combinación con una secuencia de cadena ligera de la SEC ID NO:36.
Las CDR de estas secuencias se muestran en las Tablas 3 y 4. En realizaciones específicas, se contempla que los anticuerpos quiméricos con regiones CDR alteradas (es decir, por ejemplo, cambio de una o dos CDR del Anticuerpo A con la CDR análoga del Anticuerpo C) entre estas inmunoglobulinas ilustrativas pueden producir anticuerpos útiles.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 humanizado es un fragmento de anticuerpo. Se han descrito anteriormente en general diversos fragmentos de anticuerpos y se han creado técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos pueden derivarse mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, p. ej., Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; y Brennan et al., 1985, Science 229:81). Alternativamente, los fragmentos pueden producirse directamente en células hospedantes recombinantes. Por ejemplo, fragmentos de Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F (ab')2 (véase, p. ej., Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). Mediante otro planteamiento, los fragmentos F (ab')2 pueden aislarse directamente a partir de un cultivo de células hospedantes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán obvias para el experto en la técnica.
Ciertas realizaciones incluyen un fragmento F (ab')2 de anticuerpo anti-CD40 humanizado que comprende una secuencia de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29 o SEC ID NO: 30 en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEC ID NO: 26. Los anticuerpos alternativos incluyen aquellos que tienen una secuencia de cadena pesada de SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34 o SEC ID NO: 35, en combinación con una secuencia de cadena ligera de SEC ID NO: 31. En realizaciones adicionales, se proveen anticuerpos humanizados que tienen una secuencia de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 37, SEC ID N°:38; SEC ID NO: 39 o SEC ID NO: 40, en combinación con una secuencia de cadena ligera de la SEC ID NO: 36. Dichas realizaciones pueden incluir un anticuerpo intacto que comprenda dicho F (ab')2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluye una región constante que media la función efectora. La región constante puede proveer respuestas de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra una célula diana que expresa CD40. El dominio(s) efector puede ser, por ejemplo, una región Fe de una molécula de Ig. Típicamente, el agente de unión CD40 recoge y/o activa glóbulos blancos citotóxicos (p. j., linfocitos citotóxicos naturales (NK), células fagocíticas (p. ej., macrófagos) y/o componentes de complemento en suero).
El dominio efector de un anticuerpo puede pertenecer a cualquier especie e isotipo de animal vertebrado adecuado. Los isotipos de diferentes especies animales difieren en su capacidad de mediar las funciones efectoras. Por ejemplo, la capacidad de la inmunoglobulina humana de mediar CDC y ADCC/ADCP está en general en el orden de lgM=lgGi=lgG3>lgG2>lgG4 e lgGi~lgG3>lgG2/lgM/lgG4) respectivamente. Las inmunoglobulinas murinas median CDC y ADCC/ADCP en general en el orden de lgM«lgG3»lgG2b>lgG2a»lgGi y lgG2b>lgG2a>lgG1»lgG3 murina, respectivamente. En otro ejemplo, la lgG2a murina media ADCC mientras que ambas lgG2a y IgM murinas median CDC.
Modificaciones de anticuerpos Los anticuerpos anti-CD40 humanizados y los agentes pueden incluir modificaciones del anticuerpo anti-CD40 humanizado o su fragmento de unión al antígeno. Por ejemplo, puede ser conveniente modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, como para potenciar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Dicha modificación es la introducción de residuo(s) cisteína en la región Fe, permitiendo así la formación del enlace disulfuro intercatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener mejor capacidad de internalización y/o mayor destrucción celular mediada por complemento y/o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véanse, por ejemplo, Carón et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; y Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922. Los anticuerpos homodiméricos que tienen mejor actividad antitumoral pueden también prepararse usando entrecruzadores heterobifuncionales, como se describe en Wolff et al., 1993, Cáncer Research 53: 2560-2565. Alternativamente, un anticuerpo puede modificarse para contener regiones Fe duales, potenciando la lisis complementaria y la capacidad de ADCC del anticuerpo. Véase Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.
Los anticuerpos con mejor capacidad de soportar ADCC se han generado modificando el patrón de glucosilación de su región Fe. Esto es posible ya que la glucosilación del anticuerpo en el residuo asparagina, N297, en el dominio CH2 está implicada en la interacción entre los receptores IgG y Fcy de pre-requisito para ADCC. Se han modificado líneas de células hospedantes para expresar anticuerpos con glucosilación alterada, como mayor N-acetilglucosamina de bisección o menor fucosa. La reducción de fucosa provee mayor potenciación de la actividad ADCC que lo que se logra aumentando la presencia de N-acetilglucosamina de bisección. Además, la potenciación de ADCC por anticuerpos de baja fucosa es independiente del polimorfismo FcyRIIIa V/F.
La modificación de la secuencia de aminoácidos de la región Fe de anticuerpos es una alternativa a la modificación de glucosilación para potenciar ADCC. El sitio de unión en IgGi humana para receptores FCY se ha determinado mediante un amplio análisis mutacional. Esto condujo a la generación de anticuerpos IgG^ humanizados con mutaciones Fe que aumentan la afinidad de unión hacia FcYRIIIa y potencian ADCC in vitro. Además, se han obtenido variantes de Fe con muchas permutaciones de propiedades de unión diferentes, p. ej., mejor unión a receptores FcyR específicos con unión inalterada o disminuida a otros receptores FcyR.
Otro aspecto incluye inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo humanizado o sus fragmentos conjugados a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, una toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados se ha descrito precedentemente en este documento. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se pueden utilizar para formar inmunoconjugados útiles incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos que no son de unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, proteínas alfa-sarcina, Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PÁPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, los tricotecenos y similares. Está disponible una diversidad de radionúclidos para la producción de anticuerpos anti-CD40 humanizados radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 1311, 131 In, 90Y y 186Re.
Los conjugados del anticuerpo anti-CD40 humanizado y el agente citotóxico o quimioterapéutico pueden realizarse por métodos conocidos, usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como HCL de dimetil adipimidato), ésteres activos (como disuccinimidil suberato), aldehidos (como glutareldehído), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos bis-fluoro activos (como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como se describe en Vitetta et al., 1987, Science 238:1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminepentaacético (MX-DTPA) marcado con carbón 14 es un agente quelante ilustrativo para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Los conjugados también se pueden formar con un enlazador escindible.
En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (como estreptavidina) para utilización en la pre-diana de tumores. En este procedimiento, el conjugado anticuerpo-receptor se administra a un paciente tras la eliminación de conjugado no unido de la circulación, usando un agente depurador y luego administración de un "ligando" que se une selectivamente al receptor (p. ej., avidina), siendo el ligando conjugado a un agente citotóxico (p. ej., un radionúclido).
Los anticuerpos anti-CD40 humanizados descritos en esta memoria pueden también formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4030; y en las patentes estadounidenses No. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas que tienen mejor tiempo de circulación se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 5.013.556.
Liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proveer liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo descrito en esta memoria pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288 mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorrubicina) está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Véase, p. ej., Gabizon et al., 1989, J. National Cáncer Inst. 81(19):1484.
Los anticuerpos descritos en este documento pueden también utilizarse en procedimientos ADEPT (Terapia de Profármacos y Enzimas Dirigida por Anticuerpos), conjugando el anticuerpo a una enzima activadora del profármaco que lo convierte en un profármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico de peptidilo), para un fármaco activo antineoplásico. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 81/01145, WO 88/07378, y la patente estadounidense No. 4.975.278. El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT es una enzima capaz de actuar sobre un profármaco de manera tal de convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas específicas útiles en procedimientos ADEPT incluyen, aunque sin limitarse a ello, fosfatasa alcalina para convertir profármacos que contienen fosfatasa en fármacos libres; arilsulfatasa para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco antineoplásico, 5-fluorouracil; proteasas, como serratia proteasa, termosilina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L), para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas que escinden los carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; ß-lactamasa para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, como penicilina amidasa V o penicilina amidasa G, para convertir fármacos derivados en sus amina nitrógenos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos que tienen actividad enzimática ("abzimas") se pueden utilizar para convertir los profármacos en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse por métodos conocidos para administración de la abzima a una población de células tumorales, por ejemplo, uniendo covalentemente la enzima al anticuerpo anti-CD40 humanizado/reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales anteriormente analizados. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo descrito en este documento unida a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima ya descrita aquí, se pueden construir usando técnicas de DNA recombinante (véase, por ejemplo, Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).
En ciertas realizaciones, puede ser conveniente usar un fragmento de anticuerpo anti-CD40 humanizado, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración del tumor, por ejemplo. Puede ser conveniente modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su semivida en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, por incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo. En un método, la región apropiada del fragmento de anticuerpo puede alterarse (p. ej, mutarse), o el otro epítopo puede incorporarse en una marca de péptido que luego se condensa al fragmento de anticuerpo en alguno de los extremos o en el medio, por síntesis de DNA o peptídica. Véase, p. ej., el documento WO 96/32478.
En otras realizaciones, también se incluyen modificaciones covalentes del anticuerpo anti-CD40 humanizado. Modificaciones covalentes incluyen la modificación de residuos cisteinilo, residuos histidilo, residuos lisinilo y residuos aminoterminales, residuos arginilo, residuos tirosilo, grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo), residuos glutaminilo y asparaginilo, o residuos serilo o treonilo. Otro tipo de modificación covalente implica glucósidos de acoplamiento química o enzimáticamente acoplados al anticuerpo. Dichas modificaciones pueden realizarse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si corresponde. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se pueden introducir en la molécula, haciendo reaccionar los residuos aminoácido direccionado del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos amino o carboxiterminales.
La eliminación de cualquier resto carbohidrato presente en el anticuerpo puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. La deglucosilación química es descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981 , Anal. Biochem., 118:131. La escisión enzimática de restos carbohidrato en anticuerpos puede lograrse mediante el uso de una diversidad de endo y exo-glucosidasas tales como las descritas por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350.
Otro tipo de modificación covalente útil comprende unir el anticuerpo a uno de una diversidad de polímeros no proteináceos, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, en el modo expuesto en una o más de las patentes estadounidenses No. 4.640.835, No. 4.496.689, No. 4.301.144, No. 4.670.417, No. 4.791.192 y No. 4.179.337.
Humanización y variantes de secuencias de aminoácidos Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD40 mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el DNA del anticuerpo anti-CD40, o por síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-CD40 de los ejemplos proporcionados en la presente memoria. Se realiza cualquier combinación de deleciones, inserciones y sustituciones para conseguir la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales del anticuerpo anti-CD40 humanizado o variante, tal como cambiando el número de posición de sitios de glucosilación.
Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo anti-CD40 que son localizaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis mediante alanina," como se describe por Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). En este caso, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (típicamente alanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno CD40. Después se refinan las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones mediante la introducción de variantes adicionales u otras variantes en o para sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido está predeterminado, no necesita predeterminarse la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se realiza mutagénesis mediante alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se exploran las variantes de anticuerpo anti-CD40 expresadas con respecto a la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de uno solo o múltiples restos aminoacídicos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-CD40 fusionado a un marcador de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-CD40 incluyen una fusión al extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una vanante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un resto aminoacídico en la molécula de anticuerpo anti-CD40 retirada y un resto diferente insertado en su sitio. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. En la Tabla 5 se proporcionan sustituciones conservadoras bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares", o como se describe más adelante en relación con las clases de aminoácidos, y pueden explorarse los productos.
TABLA 5: Resto Original Sustituciones Ejemplares Sustituciones Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp, lys; arg gln Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) ala ala His (H) arg; asn; gln; lys; arg lie (1) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) ile; norleucina; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) tyr; leu; val; ile; ala; tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) phe;trp; thr; ser phe Val (V) leu; ile; met; phe; ala; norleucina; leu TABLA 6: Resumen de los resultados de las pruebas de anticuerpos humanizados para actividad antagonista (CI50) y agonista (Sl= índice de estimulación) en un ensayo de proliferación de células B primarias humanas. Se exhiben diversos anticuerpos anti-CD40, 4D11 , G28.5 y 5D12, para comparación.
NT=No ensayado TABLA 7: Resumen de los resultados de las pruebas del Anticuerpo B para inhibición del aumento de CD86 inducido por CD40 en células B purificadas humanas y sangre completa humana. Se representan los datos en ambos puntos (A) CI50 y (B) CI90. El control del isotipo lgG1 no demostró efectos en ninguno de estos ensayos. En la tabla se resumen los datos de múltiples donantes (n=4-5).
TABLA 8: Resumen de los resultados de la comparación de la unión de Anticuerpo B a anti-CD40 mAb 4D11 en células B humanas y plaquetas en sangre completa.
En la química de proteínas, generalmente está aceptado que las propiedades biológicas del anticuerpo pueden conseguirse mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales: (1 ) hidrófoba: norleucina, met, ala, val, leu, ile, (2) hidrófila neutra: cys, ser, thr, (3) ácida: asp, glu, (4) básica: asn, gin, his, lys, arg, (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro, y (6) aromática: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras incluirán cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
También puede sustituirse cualquier resto de cisteína no implicada en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo humanizado anti-CD40 o variante, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula, prevenir el entrecruzamiento aberrante o proporcionar puntos de conjugación establecidos con un compuesto citotóxico o citostático. Por el contrario, puede añadirse uno o más enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).
Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más restos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrán mejores propiedades biológicas que el anticuerpo parental a partir del cual se generaron. Una forma conveniente para generar estas variantes de sustitución es mediante maduración de afinidad usando presentación en fagos. En resumen, se hacen mutar varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se manifiestan de una manera monovalente en partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III del fago M13 empaquetados dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos después se exploran con respecto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Para identificar sitios de regiones hipervariables candidatas para la modificación, puede realizarse mutagénesis mediante alanina para identificar restos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo CD40 y Dabigatrán humano. Estos restos de contacto y los restos próximos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez que se han generado estas variantes, el panel de variantes se somete a la exploración como se describe en la presente memoria y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo adicional.
Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo.
Por "alteración" se entiende la deleción de uno o más restos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo.
En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar los anticuerpos de la invención para añadir sitios de glucosilación. La glucosilación de los anticuerpos típicamente es una N-glucosilación o una O-glucosilación. N-glucosilación se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La O-glucosilación se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. De esta manera, para glucosilar una proteína dada, por ejemplo un anticuerpo, la secuencia de aminoácidos de la proteína se modifica por ingeniería genética para que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de N-glucosilación). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o la sustitución de, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de O-glucosilación).
Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia del anticuerpo anti-CD40 se preparan por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitarse a ello, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que ocurren naturalmente) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis PCR y mutagénesis cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-CD40.
Polinucleótidos, vectores, células hospedantes y métodos recombinantes Otras realizaciones abarcan polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado, vectores y células hospedantes que comprenden los polinucleótidos, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo humanizado. Los polinucleótidos aislados pueden codificar cualquier forma deseada del anticuerpo anti-CD40, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud total, fragmentos Fab, Fab', F (ab')2, y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de cualquier SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40. Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 31 o SEC ID NO: 36.
En un aspecto, la secuencia(s) de polinucleótidos aislada codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:27 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31, respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:40 y SEC ID NO: 36, respectivamente.
El polinucleótido(s) que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado o su fragmento o cadena puede condensarse a una o más secuencias reguladoras o de control, como se conoce en la técnica, y puede estar contenido en vectores de expresión o células hospedantes adecuadas, como se conoce en la técnica. Cada una de las moléculas de polinucleótidos que codifica los dominios variables de cadena pesada y ligera puede condensarse independientemente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio constante, como un dominio constante humano, permitiendo la producción de anticuerpos intactos. Alternativamente, los polinucleótidos o sus porciones se pueden condensar entre sí, proporcionando un molde para la producción de un anticuerpo monocatenario.
Para producción recombinante, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se inserta en un vector replicable para clonación (amplificación del DNA) o para expresión. Existen muchos vectores adecuados para expresar el anticuerpo recombinante. Los componentes del vector en general incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción.
Los anticuerpos anti-CD40 humanizados pueden también producirse como polipéptidos de fusión, en los cuales el anticuerpo se condensa con un polipéptido heterólogo, como una secuencia de señal u otro polipéptido que tienen un sitio de escisión específico en el término amino de la proteína o el polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es típicamente una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por una célula hospedante. Para células hospedantes procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal del anticuerpo anti-CD40 humanizado, la secuencia de señal puede sustituirse con una secuencia de señal procariótica. La secuencia de señal puede ser, por ejemplo, una fosfatasa alcalina, penicilinasa, lipoproteína, enterotoxina termoestable II inicial y similares. Para secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede sustituirse, por ejemplo, con una secuencia inicial obtenida de levadura invertasa alfa-factor (incluyendo iniciadores del a-factor de Saccharomyces y Kluyveromyces), fosfatasa ácida, C. albicans glucoamilasa u otra señal descrita en el documento WO90/13646. En células mamíferas, se pueden usar las secuencias de señal mamíferas, como también los iniciadores secretores víricos, por ejemplo, la señal del virus del herpes simple gD. El DNA para dicha región precursora se liga en el marco de lectura al DNA que codifica el anticuerpo anti-CD40 humanizado.
Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedantes seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del DNA cromosómico hospedante, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Dichas secuencias se conocen por una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2-? es adecuado para levadura, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV y BPV) son útiles para vectores de clonación en células mamíferas. En general, el origen de replicación del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión mamífera (el origen SV40 puede usarse típicamente solamente porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen que codifica un marcador seleccionable para facilitar la identificación de expresión. Los genes de marcadores seleccionables típicos codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, o alternativamente, son deficiencias auxotróficas de complemento, o en otras alternativas suministran nutrientes específicos que no están presentes en medios complejos, p. ej., el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para cesar el crecimiento de una célula hospedante. Aquellas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los fármacos y, por lo tanto, sobrevive al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Los marcadores seleccionables comunes para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado, tal como DHFR (dihidrofolato reductasa), timidina cinasa, metalotioneína-l y -II (como genes de metalotioneína de primate), adenosina desaminasa, ornitina decarboxilasa, y similares. Las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedante apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (p. ej., DG44).
Alternativamente, las células hospedantes (particularmente las hospedantes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de DNA que codifican el anticuerpo anti-CD40, la proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionarle, tal como un antibiótico aminoglucosídico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.965.199.
Si la producción recombinante se realiza en una célula de levadura como célula hospedante, el gen TRP1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) se puede utilizar como marcador seleccionable. El gen TRP1 provee un marcador de selección para una cepa muíante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula hospedante de levadura provee entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes de Leu2p, como ATCC 20,622 y 38,626, se complementan con plásmidos conocidos que portan el gen LEU2.
Además, los vectores derivados de 1.6 del plásmido circular pKD1 se pueden usar para transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se reportó un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina de ternero recombinante para K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). También se han descrito vectores de expresión de múltiples copias, estables para secreción de albúmina de suero recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces (Fleer et al., 1991 , Bio/Technology 9:968-975).
Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedante y está operativamente unido a la molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD40 o su cadena de polipéptidos. Los promotores adecuados para uso con hospedantes procarióticos incluyen un promotor phoA, ß-lactamasa y sistemas promotores de lactosa, fosfatasa alcalina, sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) operativamente unida al DNA que codifica el anticuerpo anti-CD40 humanizado.
Se conocen muchas secuencias promotoras eucarióticas. Virtualmente, todos los genes eucarióticos poseen una región AT-rich ubicada aproximadamente 25 a 30 bases en dirección 5" del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases en dirección 5" del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser un nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición del extremo poly A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariótica.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con hospedantes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenase, hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-e-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.
Los promotores inducibles tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento. Esto incluye las regiones promotoras de levadura para alcohol deshidrogenasa 2, ispcitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas derivadas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotienina, glicerilaldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen también en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levadura se utilizan también ventajosamente con promotores de levadura.
La transcripción del anticuerpo anti-CD40 humanizado desde vectores en células hospedantes mamíferas es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el polioma virus, virus de la viruela aviar, adenovirus (como Adenovirus 2), papiloma virus bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y virus símico 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, p. ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedantes.
Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen vírico de replicación de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano convenientemente se obtiene como un fragmento de restricción Hindlll E. Un sistema para expresar DNA en hospedantes mamíferos que usa el papiloma virus bovino como vector se describe en la patente estadounidense No. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente estadounidense No. 4.601.978. Véase también Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601 , que describe la expresión de p-interferón cDNA humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor.
Otro elemento útil que se puede emplear en un vector de expresión recombinante es una secuencia potenciadora, que se utiliza para aumentar la transcripción de un DNA que codifica un anticuerpo anti-CD40 humanizado mediante eucariotas superiores. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora a partir de genes mamíferos (p. ej., globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, no obstante, se emplea un potenciador proveniente de virus de células eucarióticas. Ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lateral tardío del origen de repjicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lateral tardío del origen de replicación y los potenciadores del adenovirus. Véase también Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 para una descripción de los elementos potenciadores para activación de promotores eucarióticos. El potenciador puede empalmarse en el vector en la posición 5' o 3' a la secuencia codificante del anticuerpo anti-CD40 humanizado, pero preferiblemente se ubica en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células hospedantes eucarióticas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) pueden también contener secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mRNA. Dichas secuencias comúnmente están disponibles desde el extremo 5' y ocasionalmente 3', regiones no traducidas de DNA o cDNA eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica el anticuerpo anti-CD40. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión utilizado en el mismo. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 humanizados se pueden expresar utilizando el sistema CHEF. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.888.809. cuya descripción se incorpora a la presente memoria por referencia).
Células hospedantes adecuadas para clonar o expresar el DNA en los vectores de este documento son procariotas, levadura o eucariotas superiores que ya se han descrito en el presente documento. Procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos gramnegativos y grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, p. ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p. ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescans y Shigella, como también as Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (p. ej., B. licheniformis 41 P descrita en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedante de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31 ,446), aunque son adecuadas también otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 ,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos.
Además de los procariotas, los microbios eucarióticos tales como levaduras u hongos filamentosos son hospedantes de clonación o expresión adecuadas para vectores que codifican el anticuerpo anti-CD40. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadería, es la que se utiliza más comúnmente entre los microorganismos hospedantes eucarióticos inferiores. Sin embargo, se dispone comúnmente de una cantidad de otros géneros, especies y cepas que son útiles para la presente invención, como Schizosaccharomyces pombe; hospedantes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedantes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.
Células hospedantes adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-CD40 humanizado, glucosilado derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos, incluyendo, p. ej., numerosas cepas baculovíricas y variantes, y las correspondientes células hospedantes de insectos permisivas como Spodoptera frugiperda (cienpies), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca mediterránea) y Bombyx mori (gusano de seda). Una variedad de cepas para transfección se encuentra públicamente disponible, p. ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden usar, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden emplearse como hospedantes.
En otro aspecto, la expresión de anti-CD40 humanizado se lleva a cabo en células de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina, y las técnicas se encuentran muy disponibles. Los ejemplos de líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles son la línea de riñon de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), la línea de riñon embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión , (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10), células de ovario de hámster chino/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216; p. ej., DG44), células sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70), células renales del mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34), células hepáticas de rata y búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51), células TR1 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), células MRC 5, células FS4 y línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células hospedantes se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para producción del anticuerpo anti-CD40 humanizado y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o ampliar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Las células hospedantes utilizadas para producir un anticuerpo anti-CD40 humanizados descritas en la presente memoria se pueden cultivar en una diversidad de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Medio Esencial Mínimo (Minimal Essential Médium o MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) y Medio Eagle Modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle's Médium o DMEM), Sigma-Aldrich Co.) Son adecuados para cultivar las células hospedantes. Además, cualquiera de los medios descritos en uno o más de Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, patentes estadounidenses No. 4.767.704, No. 4.657.866, No. 4.927.762, No. 4.560.655, No. 5.122.469, documentos WO 90/103430 y WO 87/00195 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células hospedantes. Cualquiera de estos medios puede enriquecerse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y potasio), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Pueden incluirse también otros complementos necesarios en concentraciones adecuadas que sean conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como de temperatura, pH y similares, son aquellas previamente empleadas con la célula hospedante seleccionada, y serán obvias para el experto en la materia.
Cuando se usen técnicas recombinantes, el anticuerpo podrá producirse de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o segregarse directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido de manera intracelular, las células pueden romperse para liberar proteína como una primera etapa. Los sedimentos de partículas, o bien células hospedantes o fragmentos lisados, se pueden eliminar, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son segregados al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, se congela pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los sedimentos celulares se eliminan por centrifugación. Si el anticuerpo se segrega en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas previas para inhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el desarrollo de contaminantes fortuitos. Se puede emplear una diversidad de métodos para aislar el anticuerpo de la célula hospedante.
La composición del anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica de purificación típica. La adaptabilidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basen en cadenas pesadas humanas gammal , gamma2 o gamma4 (véase, p. ej., Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para gamma3 humana (véase, p. ej., Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567- 1575). Una matriz a la que está unida un ligando de afinidad es por lo general agarosa, pero existen otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinl) benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que la agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ.) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas, como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como columna de ácido poliaspártico), cromatofoco, SDS-PAGE y precipitación de sulfato de amonio, están también disponibles, dependiendo del anticuerpo que se ha de recuperar.
Después de cualquier etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un a pH entre aproximadamente 2.5-4.5, típicamente a bajas concentraciones salinas (p. ej., aproximadamente 0-0.25M de sal).
También se incluyen ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de restricción baja, moderada y alta, como se define en este documento, para toda o una porción (p. ej., la porción que codifica la región variable) de la secuencia de nucleótidos representada por la secuencia(s) de polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO:27 y la SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31, respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:; 36, respectivamente. La porción hibridante del ácido nucleico hibridante tiene típicamente por lo menos 15 (p. ej., 20, 25, 30 o 50) nucleótidos de longitud. La porción hibridante del ácido nucleico hibridante es por lo menos 80%, p. ej., por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98%, idéntica a la secuencia de una porción o todo el ácido nucleico que codifica un polipéptido anti-CD40 (p. ej., una región variable de cadena pesada o de cadena ligera), o su complemento. Los ácidos nucleicos hibridantes del tipo descrito en la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, como una sonda de clonación, un cebador, p. ej., un cebador PCR, o una sonda de diagnóstico.
Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que incluyen secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40.. Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que incluyen secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de domino variable de cadena ligera que es por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 o SEC ID NO: 36.
En un aspecto, la secuencia(s) de polinucleótidos aislados codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde cada uno incluye una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO:27 y la SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente SEC ID NO:40 y SEC ID NO: 36, respectivamente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido en la realización descrita inmediatamente antes, en donde el dominio variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo codificado incluye una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de, en una realización, la SEC ID NO:27 y la SEC ID NO:26, respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:28 y la SEC ID NO:26, respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:29 y la SEC ID NO:26, respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:30 y la SEC ID NO:26, respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:32 y la SEC ID NO:31 , respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:33 y la SEC ID NO:31 , respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:34 y la SEC ID NO:31 , respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:35 y la SEC ID NO:31 , respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:37 y la SEC ID NO:36, respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:38 y la SEC ID NO:36, respectivamente; en otra realización, la SEC ID NO:39 y la SEC ID NO:36, respectivamente; y en otra realización, la SEC ID NO:40 y la SEC ID NO:36, respectivamente.
Tal como se emplean en esta memoria, las expresiones "idéntico/a" o "porcentaje de identidad," en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen el mismo porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son ¡guales, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima. Para determinar el porcentaje de identidad, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el residuo de aminoácidos o el nucleótido como la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad=Núm. de posiciones idénticas/Núm. total de posiciones (p. ej., posiciones superpuestas) x100). En algunas realizaciones, las dos secuencias que se comparan tienen la misma longitud después de que se han introducido espacios dentro de las secuencias, según corresponda (p. ej., excluyendo la secuencia adicional que se extiende más allá de las secuencias que se están comparando). Por ejemplo, cuando se comparan secuencias de región variable, las secuencias de dominio inicial y/o constante no se consideran. Para comparaciones de secuencias entre dos secuencias, una CDR "correspondiente" se refiere a una CDR en la misma ubicación en ambas secuencias (p. ej., CDR-H1 de cada secuencia).
La determinación del porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido y no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin and Altschul, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntaje=100, longitud de palabra=12, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas a un ácido nucleico que codifica una proteína de interés. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntaje=50, longitud de palabra=3, para obtener las secuencias de aminoácidos homologas a la proteína de interés. Para obtener alineaciones espaciadas para fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo preferido y no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de yers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software para alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Se conocen en la técnica algoritmos adicionales para análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en Torellis and Robottí, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda. Si ktup=2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que se están comparando buscando pares de residuos alineados; si ktup=1 , se examinan aminoácidos alineados individuales. Ktup puede regularse en 2 o 1 para secuencias de proteínas, entre 1 y 6 para secuencias de DNA. Si no se especifica ktup por defecto, éste es 2 para proteínas y 6 para DNA. Alternativamente, la alineación de secuencias de proteínas puede llevarse a cabo usando el algoritmo CLUSTAL W, como se describe en Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.
Usos no terapéuticos Los anticuerpos descritos en esta invención son útiles como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina de Proteína A, usando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína CD40 (o su fragmento) a purificar, y luego se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará prácticamente todo el material en la muestra, excepto la proteína CD40, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente; el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará la proteína CD40 del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-CD40 humanizados son también útiles en ensayos diagnósticos para detectar y/o cuantificar la proteína CD40, por ejemplo, detectar la expresión de CD40 en células, tejidos o sueros específicos.
Será ventajoso en algunas realizaciones, por ejemplo, para fines diagnósticos, marcar el anticuerpo con un resto detectable. Existen numerosas etiquetas detectables, incluyendo radioisótopos, etiquetas fluorescentes, etiquetas de sustratos de enzimas y similares. La etiqueta puede conjugarse indirectamente con el anticuerpo, usando diversas técnicas conocidas. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de etiquetas mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, por lo tanto, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo en este modo indirecto. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo puede conjugarse con un pequeño hapteno (como digoxina), y uno de los diferentes tipos de etiquetas ya mencionados se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (p. ej., anticuerpo anti-digoxina). Por lo tanto, se puede lograr la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo.
Etiquetas de radioisótopos ilustrativas incluyen 35S, 14C, 125l, 3H y 131l. El anticuerpo puede etiquetarse con el radioisótopo, usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, 1991 , Coligen et al., Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs. La radiactividad se puede medir, por ejemplo, por recuento de centelleos.
Están disponibles etiquetas fluorescentes ilustrativas derivadas de quelatos tórreos raros (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina y Texas Rojo. Las etiquetas fluorescentes se pueden conjugar al anticuerpo mediante técnicas conocidas, como aquellas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.
Se conocen en la técnica diversas etiquetas enzima-sustrato bien caracterizadas (véase, p. ej., la patente estadounidense No. 4.275.149 para revisión). La enzima en general cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la alteración puede ser un cambio de color en un sustrato que puede medirse de manera espectrofotométrica. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimiluminiscencia del sustrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se han descrito anteriormente en la presente invención.
El sustrato quimiluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y puede luego emitir luz que puede medirse, usando un quimiluminómetro, por ejemplo, o dona energía a un aceptor fluorescente.
Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenase, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocídicas (como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen, por ejemplo, en O'Sullivan et al., 1981 , Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166.
Ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, donde la peroxidasa de hidrógeno oxida el precursor de tinte tal como ortofenileno diamina (OPD) o hidrocloruro de S.S'.S.S'-tetrametil benzidina (TMB); fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico tal como p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil^-D-galactosidasa.
Existen muchas otras combinaciones de enzima-sustrato disponibles para los expertos en la técnica. Para una revisión general de estas combinaciones, véanse las patentes estadounidenses No. 4.275.149 y No. 4.318.980.
En otra realización, el anticuerpo anti-CD40 humanizado se utiliza no marcado y se detecta con un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo anti-CD40 humanizado.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, como ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Véase, p. ej., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Kits de diagnóstico Un anticuerpo anti-CD40 humanizado se puede utilizar en un kit de diagnóstico, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. Si el anticuerpo está etiquetado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima, tal como un precursor de sustrato que provee un cromóforo o fluoróforo detectable. Además, se pueden incluir otros aditivos como estabilizantes, tampones (por ejemplo un tampón en bloque o tampón de lisis), y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar en gran medida para proveer concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden ser provistos como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proveen una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
Usos terapéuticos En otra realización, un anticuerpo anti-CD40 humanizado descrito en esta memoria es útil en el tratamiento de diversos trastornos asociados con la expresión de CD40, como se describe en esta memoria.
El agente o anticuerpo anti-CD40 humanizado se administra por medios adecuados, incluyendo la administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea el tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional (lo que incluye perfundir o poner en contacto el injerto con el anticuerpo antes del trasplante). El agente o anticuerpo anti-CD40 humanizado puede administrarse, por ejemplo, como una infusión o un bolo. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-CD40 humanizado se administra adecuadamente por infusión de pulsos, particularmente con dosis en descenso del anticuerpo. En un aspecto, la dosis se administra por inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá de una diversidad de factores, como el tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió anteriormente, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo, y de la discreción del médico que atiende. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.
Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial para administrar al paciente es aproximadamente 1 pg/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0.1-15 mg/kg) de anticuerpo, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación típica diaria podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se sostiene hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Un régimen de dosificación ilustrativo es aquel descrito en el documento WO 94/04188.
El término "supresión" se utiliza en la presente invención en el mismo contexto que "alivio" para referirse a la disminución de una o más características de la enfermedad.
La composición del anticuerpo se formulará, dosificará y administrará en un modo coherente con las buenas prácticas médicas. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, el mamífero particular que se esté tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el esquema de administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo que se ha de administrar será regida por dichas consideraciones y será la cantidad necesaria mínima para prevenir, aliviar o tratar el trastorno asociado con la expresión de CD40.
El anticuerpo no necesita formularse, pero opcionalmente se formula, con uno o más agentes actualmente utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo anti-CD40 humanizado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores ya analizados. En general se utilizan en la misma dosis y con las rutas de administración utilizadas anteriormente en la presente invención o aproximadamente entre 1 y 99% de las dosis empleadas aquí.
Trastornos asociados a CD40 Los agentes o anticuerpos anti-CD40 son útiles para tratar o prevenir un tumor maligno que expresa CD40 o un trastorno inmunológico caracterizado por la expresión de CD40, p. ej., por activación inapropiada de células inmunitarias (p. ej., linfocitos o células dendríticas). Dicha expresión de CD40 puede deberse, por ejemplo, a un aumento en los niveles de la proteína CD40 en la superficie de las células y/o antigenicidad alterada de la CD40 expresada. El tratamiento o la prevención del trastorno inmunológico, de acuerdo con los métodos descritos en la presente invención, se logra administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento o prevención, una cantidad eficaz del agente o anticuerpo anti-CD40, donde el anticuerpo (i) se une a las células inmunitarias activadas que expresan CD40 y que se asocian con el estado de enfermedad, y (ii) ejerce un efecto citotóxico, citostático o inmunosupresor sobre las células inmunitarias activadas.
Enfermedades inmunológicas que se caracterizan por activación inapropiada de células inmunitarias y que pueden tratarse o prevenirse con los métodos descritos en esta memoria pueden clasificarse, por ejemplo, por el tipo(s) de reacción o reacciones de hipersensibilidad subyacentes al trastorno. Estas reacciones típicamente se clasifican en cuatro tipos: reacciones anafilácticas, reacciones citotóxicas (citolíticas), reacciones complejas inmunitarias o reacciones de inmunidad mediada por células (CMI) (también denominadas reacciones de hipersensibilidad de tipo demorado (DTH)). (Véase, p. ej., Fundamental Immunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993).) Ejemplos específicos de dichas enfermedades inmunológicas incluyen las siguientes: artritis reumatoide, enfermedades desmielinantes autoinmunitarias (p. ej., esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, enfermedad de Grave, glomerulonefritis, trastorno hepatológico autoinmunitario, enfermedad intestinal inflamatoria (p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), anafilaxis, reacción alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus de tipo I, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, polimiositis, dermatomiositis, miositis inflamatoria, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, uveítis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, adrenalitis, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatitis crónica, hepatitis lúpica, aterosclerosis, lupus eritematoso cutáneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressier, trombocitopenia autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, pénfigo vulgar, dermatitis herpetiforme, alopecia arcata, penfigoide, esclerodermia, esclerosis sistémica progresiva, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia) y telangiectasia), esterilidad autoinmunitaria masculina y femenina, espondilitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad del tejido conjuntivo mixto, poliarteritis nodosa, vasculitis necrosante sistémica, dermatitis atópica, rinitis atópica, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumática, asma, aborto recurrente, síndrome anti-fosfolipidico, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Cushing, hepatitis activa crónica autoinmunitaria, neumopatía de los avicultores, necrólisis epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolitis, alveolitis alérgica, alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reacción de transfusión, arteritis de Takayasu, polimialgia reumática, arteritis temporal, esquistosomiasis, arteritis de células gigantes, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, eczema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Captan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, psoriasis, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis, ciclitis crónica, ciclitis de Fuch, nefropatía por IgA, púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo a trasplante, cardiomiopatía, síndrome de Eaton-Lambert, policondritis recidivante, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, síndrome de Evan, síndrome de dificultad respiratoria, inflamación pulmonar, osteoporosis, hipersensibilidad del tipo demorada y falla gonadal autoinmunitaria.
Por consiguiente, los métodos descritos en la presente memoria abarcan el tratamiento de trastornos de los linfocitos B (p. ej., lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes de tipo I), de los linfocitos Thi (p. ej., artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, tuberculosis o enfermedad injerto contra hospedante) o de los linfocitos Th2 (p. ej., dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico, asma atópica rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica o enfermedad de injerto contra hospedante crónica). En general, los trastornos que implican células dendríticas abarcan trastornos de los linfocitos Thi o Th2.
La artritis reumatoide (RA) es una de las enfermedades autoinmunitarias inflamatorias más comunes que afecta a aproximadamente 1 % de la población. Si bien existen tratamientos eficaces (p. ej., MTX y agentes anti-TNF), existe una gran necesidad médica no satisfecha, especialmente para aquellos pacientes que no responden adecuadamente a las terapias anti-TNF (aproximadamente 30% de los pacientes). Además, hasta 50% de los pacientes discontinúan el tratamiento con antagonistas de TNF dentro de los 5 años, principalmente debido a los eventos adversos, pero también porque un número cada vez mayor de pacientes pierde el beneficio terapéutico. Por lo tanto, es importante establecer terapias eficaces que se dirijan a la inflamación y a la destrucción articular en RA pero que no dependan exclusivamente de la inhibición directa de TNF. Un planteamiento muy atractivo consiste en dirigir las vías celulares coestimuladoras. Uno de los pares receptor-ligando claves en la coestimulación es CD40/CD40L. Este sistema permite interacciones entre células inmunitarias y entre células inmunitarias y no inmunitarias, las cuales son todas importantes en la patogénesis de la RA. El bloqueo de CD40 con un anticuerpo antagonista de la presente invención puede tener uno o más de los siguientes efectos en RA: 1) Inhibir la diferenciación de células B y el cambio de isotipo del anticuerpo, 2) Inhibir la producción de citocinas y quimiocinas y el aumento de moléculas de adhesión en células T y macrófagos, 3) Inhibir la activación de células dendríticas, e 4) Inhibir la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas, metaloproteinasas de matriz, prostaglandina, y reducir las moléculas de adhesión en células no inmunitarias (p. ej., células epiteliales, endoteliales y mesenquimales).
Métodos para lograr uno o más de los efectos mencionados se contemplan expresamente en la presente invención. Además de RA, las composiciones de la presente invención serán particularmente útiles en métodos de tratamiento de esclerosis múltiple, psoriasis (incluyendo artritis psoriásica), artritis reumatoide juvenil, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso sistémico y trasplante de órgano sólido.
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad autoinmunitaria crónica y sistémica con una prevalencia de aproximadamente 1% en adultos. La enfermedad sigue causando una importante morbilidad y mortalidad prematura (la mortalidad se debe predominantemente a enfermedad cardiovascular acelerada). Se ha identificado que el daño articular ocurre muy temprano en el curso de la enfermedad, donde hasta 30% de los pacientes exhiben datos radiográficos de erosiones óseas al momento del diagnóstico, aumentando hasta 60% después del primer año. Las pautas actuales recomiendan iniciar la terapia con fármacos antirreumáticos tradicionales modificadores de la enfermedad (DMARD) dentro de los 3 meses de haber establecido un diagnóstico definitivo. Las DMARD tienen el potencial de reducir o prevenir el daño articular y conservar la función articular. Actualmente, los reumatólogos seleccionan el metotrexato (MTX) como la terapia DMARD inicial para la mayoría de los pacientes.
Los antagonistas de TNF etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®), el antagonista de CTLA4 abatacept (Orencia®), el receptor anti-IL-6 mAb tocilizumab y el anti-CD20 mAb rituximab (Rituxan®) son eficaces en el tratamiento de RA. Las pautas actuales en general recomiendan usar DMARD biológicas para el tratamiento de RA activa después de una respuesta inadecuada a las DMARD tradicionales.
Estudios recientes en pacientes con RA progresiva temprana sin tratamiento previo con MTX demostraron que la combinación de MTX con un antagonista de TNF fue superior a cada uno de ellos utilizados como monoterapia. El resultado más asombroso fue el significativo beneficio radiológico de la terapia combinada. Por lo tanto, la combinación de MTX e inhibidores de TNF debería usarse en pacientes con el mayor riesgo de enfermedad agresiva y fenotipo agresivo (p. ej., alto puntaje de actividad, debilitación funcional, seropositividad para el factor reumatoide (RF) o anticuerpo peptídico citrulinado (CCP), CRP elevado, erosiones radiográficas). Sin embargo, anticipamos que en la práctica clínica sería extraño que los antagonistas de TNF se usaran como terapia de primera línea. Un estudio de reumatólogos estadounidenses realizado en abril de 2005 demostró que los factores que más influenciaban la decisión de usar un antagonista de TNF eran: el fracaso de MTX o múltiples terapias DMARD, evaluación global médica, debilitamiento funcional y empeoramiento radiográfico o erosiones. Actualmente, se estima que 20% de los pacientes con RA reciben terapia inhibidora de TNF en los Estados Unidos.
Un porcentaje sustancial de pacientes que padecen RA no recibe alivio adecuado con los tratamientos actuales, incluyendo las terapias biológicas, o bien debido a la intolerancia a los fármacos y la toxicidad, o por falta de respuesta. Hasta 50% de los pacientes discontinúan el tratamiento con antagonistas de TNF dentro de los 5 años, principalmente debido a los eventos adversos, pero también porque un número cada vez mayor de pacientes pierde su respuesta.
En algunas realizaciones, el trastorno inmunológico es un trastorno inmunológico mediado por células T, como un trastorno de células T en el que las células T activadas se asocian con el trastorno que expresa CD40. Los agentes o anticuerpos anti-CD40 se pueden administrar para reducir dichas células T activadas que expresan CD40. En una realización específica, la administración de agentes o anticuerpos anti-CD40 puede reducir las células T activadas que expresan CD40, mientras que las células T en reposo no son sustancialmente reducidas por el agente o anticuerpo anti-CD40. En este contexto, "no sustancialmente reducidas" significa que menos de aproximadamente 60%, o menos de aproximadamente 70% o menos de aproximadamente 80% de las células T en reposo no disminuyen.
Los agentes o anticuerpos anti-CD40 descritos en la presente invención también son útiles para tratar o prevenir un tumor maligno que expresa CD40. El tratamiento o la prevención de un tumor maligno que expresa CD40, de acuerdo con los métodos descritos en la presente invención, se logra administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento o prevención, una cantidad eficaz del agente o anticuerpo anti-CD40, donde el agente o anticuerpo (i) se une a las células que expresan CD40, y (ii) ejerce un efecto citotóxico o citostático para reducir o inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan CD40.
Cánceres que expresan CD40 que pueden tratarse o prevenirse con los métodos descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, leucemia, como leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (p. ej., mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica o eritroleucemia), leucemia crónica, leucemia mielocítica (granulocítica) crónica o leucema linfocítica crónica; policitemia vera; linfoma (p. ej., enfermedad de Hodgkin o enfermedad no Hodgkin); mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom; enfermedad de cadena pesada; tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (p. ej., fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfoangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo o carcinoma esofágico).
Composiciones farmacéuticas y su administración Una composición que comprende un agente de unión a CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) se puede administrar a un sujeto que padece o que presenta riesgo de padecer un trastorno inmunológico o una neoplasia maligna que expresa CD40. La invención provee además el uso de un agente de unión a CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar una neoplasia maligna o un trastorno inmunológico que expresa CD40. El término "sujeto" tal como se emplea en esta memoria significa cualquier paciente mamífero al que se le puede administrar un agente de unión a CD40, incluyendo por ejemplo seres humanos y mamíferos no humanos, como primates, roedores y perros. Los sujetos específicamente destinados para el tratamiento que emplea los métodos descritos en la presente invención incluyen seres humanos. Los anticuerpos o agentes se pueden administrar o bien solos o en combinación con otras composiciones en la prevención o el tratamiento del trastorno inmunológico o la neoplasia maligna que expresa CD40.
Anticuerpos preferidos para uso en dichas composiciones farmacéuticas son aquellos que comprenden anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40.
Algunas realizaciones incluyen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 31 o SEC ID NO: 36. Se prefieren particularmente composiciones de anticuerpos humanizados que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:27 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31, respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:36, respectivamente. Dentro de la presente invención se contemplan los polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las secuencias de cadena pesada de SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO: 40, SEC ID N°: 42, SEC ID N°: 44, SEC ID N°: 46, SEC ID N°: 48, SEC ID N°: 53, SEC ID N°: 57, SEC ID N°: 58, SEC ID N°: 59, SEC ID N°: 60, SEC ID N°: 61 , SEC ID N°: 62, SEC ID N°: 63, SEC ID N°: 64, SEC ID N°: 65, SEC ID N°: 66, SEC ID N°: 67, SEC ID N°: 68, SEC ID N°: 69, SEC ID N°: 70, SEC ID N°: 71 , SEC ID N°: 72 o la SEC ID N°: 73. Otras realizaciones se refieren a ácidos nucleicos aislados que codifican una secuencia de cadena liviana de cualquiera de las secuencias de SEC ID NO: 5 a SEC ID NO:8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 , SEC ID NO:36, SEC ID NO:41 , SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:47, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51 , SEC ID NO:52, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56, SEC ID NO:74, SEC ID NO:75 o SEC ID NO:76.
En ciertas realizaciones, si se contempla el tratamiento de RA, las composiciones de la invención pueden utilizarse en métodos para reducir signos y síntomas, induciendo una respuesta clínica importante y reduciendo la progresión del daño estructural en pacientes con RA moderada a severamente activa que no responden adecuadamente a MTX solo. Un ejemplo actual de dicha terapia es: Enbrel/Humira (Los datos con Humira y Enbrel se obtuvieron en dos poblaciones de pacientes distintas). Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar en lugar de una terapia de Enbrel/Humira o en combinación con terapia de Enbrel/Humira para sujetos que no responden a MTX solo. Preferiblemente, en dichas realizaciones, las composiciones de la invención tendrán una eficacia superior a Enbrel +MTX en pacientes que han tenido una respuesta inadecuada al metotrexato, según lo determinado por ejemplo por: ACR20 a 6 meses >85% para el compuesto más MTX (GS: Enbrel +MTX 71% vs. Placebo + MTX 27%, Humira + MTX a 12 meses 59% vs. Placebo + MTX 24%)*. Otros criterios de eficacia superior de las composiciones de la invención pueden incluir: Inhibición de progresión de daño estructural en un período de un año similar a Enbrel (después de 52 semanas con un puntaje de Sharp modificado medio Humira + MTX 0.1 vs. Placebo + MTX 2.7)*. Incluso en otras realizaciones, las composiciones producen una "Respuesta clínica importante" superior a Enbrel en pacientes que han tenido una respuesta inadecuada a metotrexato según lo medido por ACR70 (20% para Humira + MTX, 4% para Placebo + MTX)*.
En otras realizaciones, las composiciones de la invención se pueden indicar para reducir signos y síntomas, induciendo una respuesta clínica importante y reduciendo la progresión de daño estructural en pacientes con RA moderada a severamente activa que han tenido una respuesta inadecuada a los agentes anti-TNF. El mejor tratamiento disponible actualmente: terapia biológica no anti-TNF. Preferiblemente, en dichos sujetos las composiciones de la invención poseen una eficacia no inferior en comparación con la terapia biológica no anti-TNF (p. ej., Orencia, Rituxan) por comparación histórica en pacientes que han tenido una respuesta inadecuada a un agente anti-TNF: ACR20 a 6 meses >50% para el compuesto más DMARD (GS: Orencia + DMARD 50% vs. placebo + DMARD 20%). Incluso en otras realizaciones, las composiciones de la invención inhiben la progresión del daño estructural en un periodo de un año evaluada por métodos de puntaje de rayos X aceptados para erosión articular y angostamiento del espacio articular, similar a Rituxan (después de 52 semanas con un puntaje de Sharp modificado medio + MTX 1.0 vs. Placebo + MTX 2.31 ).
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar el agente de unión a CD40. Los métodos de introducción incluyen, aunque sin limitarse a ello, las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. El agente de unión a CD40 se puede administrar, por ejemplo, por infusión, bolo o inyección, y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos tales como agentes quimioterapéuticos. La administración puede ser sistémica o local. En realizaciones preferidas, la administración es por inyección subcutánea. Formulaciones tales como las inyecciones se pueden preparar, por ejemplo, en jeringas prellenadas que pueden administrarse una vez cada quince días.
Las características de seguridad de los anticuerpos de la invención se determinarán y preferiblemente incluirán más patrones tales cómo: interacciones adversas clínicamente no significativas con otros medicamentos comúnmente utilizados para tratar artritis reumatoide (p. ej., DMARD, esferoides, AINE,); una tasa de discontinuidad no mayor debida a cuestiones de tolerabilidad que Enabrel; tasa de infecciones graves no mayor que aquella de los agentes anti-TNF u otros agentes biológicos comúnmente utilizados; frecuencia y/o gravedad de reacciones en el sitio de inyección o reacción de infusión similar a Enbrel; desarrollo mínimo o ninguno de resistencia a los fármacos (menos de 5%) tres ciclos repetidos de terapia; ninguno o muy pocos anticuerpos neutralizantes; ningún signo de aumento de agregación/activación plaquetaria que podría conducir a eventos tromboembólicos in vivo o disfunción plaquetaria/endotelial que podría conducir a hemorragia.
En realizaciones específicas, la composición del agente de unión a CD40 se administra por inyección, mediante un catéter, medíante un supositorio o mediante un implante, siendo el implante de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo una membrana, como membrana sialástica, o una fibra. Típicamente, cuando se administra la composición, se utilizan materiales que el agente o anticuerpo anti-CD40 no absorbe.
En otras realizaciones, el anticuerpo o agente anti-CD40 se administra en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede emplear una bomba (véanse, p. ej., Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 ; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos. (Véanse, p. ej., Medical Applications of Controlled Reléase (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Ratón, Fia., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Véanse también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Otros sistemas de liberación controlada se analizan, por ejemplo, en Langer, supra.
Un agente de unión a CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) puede administrarse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de unión y uno o más ingredientes farmacéuticamente compatibles.
En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa o subcutánea a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración por inyección son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Si es necesario, la composición farmacéutica puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se proveen o bien separadamente o juntos en la forma de dosificación, por ejemplo, como un polvo liofilizado o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o saché que indica la cantidad de agente activo. Si la composición farmacéutica se ha de administrar por infusión, se puede dispensar con un frasco de infusión que contiene la formulación farmacéutica estéril acuosa o en solución salina. Si la composición farmacéutica se administra por inyección, se puede proveer una ampolla o solución salina de modo que los ingredientes se mezclen antes de la administración.
Además, la composición farmacéutica se puede proveer como un kit que comprende (a) un envase que contiene un agente de unión a CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) en forma liofilizada y (b) un segundo envase que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable (p. ej., estéril) para inyección. El diluyente farmacéuticamente aceptable se puede utilizar para reconstitución o dilución del agente o anticuerpo anti-CD40 liofilizado. Opcionalmente asociado a dicho envase(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la elaboración, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, que refleja la aprobación de la elaboración, uso o venta para administración humana por parte de la agencia.
La cantidad del agente(s) de unión a CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) que es eficaz en el tratamiento o la prevención de un trastorno inmunológico o un tumor maligno que expresa CD40 se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en la formulación dependerá también de la ruta de administración, y de la etapa del trastorno inmunológico o cáncer que expresa CD40, y deberá decidirse según el criterio del médico y de las circunstancias particulares del paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis y respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro.
Por ejemplo, la toxicidad y la eficacia terapéutica del agente o anticuerpo anti-CD40 pueden determinarse en cultivos celulares o animales experimentales mediante procedimientos farmacéuticos convencionales para determinar la DE5o (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). Se prefiere un agente de unión a CD40 (p. ej., un anticuerpo anti-CD40) que exhibes un gran índice terapéutico. Si un agente de unión a CD40 exhibe efectos colaterales tóxicos, se puede utilizar un sistema de administración que dirija al agente de unión a CD40 hacia el sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células que no expresan CD40 y reducir así los efectos colaterales.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosis del agente de unión a CD40 típicamente yace dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier agente de unión a CD40 utilizado en el método, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modélos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logre una inhibición media máxima de los síntomas) según lo determinado en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar más precisamente una dosis útil en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento, ELISA y similares.
En general, la dosis de un anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40 administrada a un paciente con un trastorno inmunológico o cáncer que expresa CD40 es típicamente aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. La dosis administrada a un sujeto es aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto.
Dosis ilustrativas incluyen, aunque sin limitarse a ello, entre 1 ng/kg y 100 mg/kg. En algunas realizaciones, una dosis es de aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg o aproximadamente 16 mg/kg. La dosis se puede administrar, por ejemplo, una vez por semana (semanalmente), dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, quincenalmente o mensualmente, cada dos meses o cada tres meses. En realizaciones específicas, la dosis es de aproximadamente 0.5 mg/kg por semana, aproximadamente. 1 mg/kg por semana, aproximadamente 2 mg/kg por semana, aproximadamente 3 mg/kg por semana, aproximadamente 4 mg/kg por semana, aproximadamente 5 mg/kg por semana, aproximadamente 6 mg/kg por semana, aproximadamente 7 mg/kg por semana, aproximadamente 8 mg/kg por semana, aproximadamente 9 mg/kg por semana, aproximadamente 10 mg/kg por semana, aproximadamente 11 mg/kg por semana, aproximadamente 12 mg/kg por semana, aproximadamente 13 mg/kg por semana, aproximadamente 14 mg/kg por semana, aproximadamente 15 mg/kg por semana o aproximadamente 16 mg/kg por semana. En algunas realizaciones, las dosis oscilan entre aproximadamente 1 mg/kg/ y aproximadamente 15 mg/kg/semana.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión a CD40 pueden además comprender un agente terapéutico, o bien conjugado o no conjugado al agente de unión. El anticuerpo anti-CD40 o el agente de unión a CD40 puede co-administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos para el tratamiento o la prevención de trastornos inmunológicos o tumores malignos que expresan CD40. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un agente citostático, citotóxico o inmunosupresor. La terapia de combinación también puede incluir, por ejemplo, la administración de un agente que direcciona un receptor o complejo de receptores distinto de CD40 en la superficie de los linfocitos activados, las células dendríticas o las células cancerosas que expresan CD40. Un ejemplo de dicho agente incluye un segundo anticuerpo no CD40 que se une a una molécula en la superficie de un linfocito activado, célula dendrítica o célula cancerosa que expresa CD40. Otro ejemplo incluye un ligando que se une a dicho receptor o complejo de receptores. Típicamente, dicho anticuerpo o ligando se une a un receptor de superficie celular en los linfocitos activados, la célula dendrítica o la célula cancerosa que expresa CD40 y potencia el efecto citostático o citotóxico del anticuerpo anti-CD40 enviando una señal citostática o citotóxica al linfocito activado, célula dendrítica o célula cancerosa que expresa CD40.
La administración de dicha terapia combinada puede tener un efecto aditivo o sinérgico sobre los parámetros de la enfermedad (p. ej., intensidad de un síntoma, cantidad de síntomas o frecuencia de relapso).
Con respecto a los regímenes terapéuticos para administración combinatoria, en una realización específica, un anticuerpo anti-CD40 o agente de unión a CD40 se administra concurrentemente con un agente terapéutico. En otra realización específica, el agente terapéutico se administra antes o después de la administración del anticuerpo anti-CD40 o el agente de unión a CD40, por lo menos una hora y hasta varios meses, por ejemplo por lo menos una hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes o tres meses antes o después de la administración del anticuerpo anti-CD40 o el agente de unión a CD40.
Clases útiles de agentes citotóxicos o inmunosupresores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas (p. ej., MMAE o MMAF), agentes para ligandos de unión al surco menor de DNA, inhibidores de replicación de DNA, agentes alquilantes (p. ej., complejos de platino tales como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizantes de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinóles, compuestos preformadores, antimetatabolitos de purina, puromicinas, sensibilizantes de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, vinca-alcaloides o similares.
Agentes citotóxicos o inumunosupresores individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfán, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatino, colquicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorrubicina, un estrógeno, 5-fluordesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenopósido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.
En algunas realizaciones típicas, el agente terapéutico es un agente citotóxico. Agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (p. ej., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB o AEVB), agentes para ligandos de unión al surco menor de DNA (p. ej., enediinas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (p. ej., paclitaxel y docetaxel), puromicinas, vinca-alcaloides, CC-1065, SN-38, topotecán, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotin, maitansinoides, discodermólido, eleuterobina o mitoxantrona.
En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un quimioterapéutico convencional, tal como doxorrubicina, paclitaxel, melfalán, metotrexato, mitomicina C o etopósido. Además, los agentes potentes tales como análogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina pueden unirse a los anticuerpos anti-CD40 o sus agentes.
En algunas realizaciones específicas, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocida en la técnica como dolastatina-10) o su derivado. Típicamente, el derivado de auristatina E es, p. ej., un éster formado entre aurastatina E y un ácido ceto. Por ejemplo, una auristatina E puede hacerse reaccionar con ácido paraacetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina típicos incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y estructura de la auristatina E y sus derivados se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses No. 2004-0157782 A1 y 2005-0238649; en las solicitudes de patentes internacionales No. PCT/US03/24209 No.
PCT/US02/13435 y en las patentes estadounidenses No. 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191 ; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414; cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria por referencia.
En realizaciones específicas, el agente citotóxico es un ligando de unión al surco menor de DNA. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.130.237). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ligando de unión al surco menor es un compuesto CBI. En otras realizaciones, el ligando de unión al surco menor es una enediina (p. ej., caliqueamicina).
Ejemplos de agentes antitubulina incluyen, aunque sin limitarse a ello, taxanos (p. ej., Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), vinca-alcaloides (p. ej., vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina), y dolastatinas (p. ej., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (p. ej., epotilona A y B), nocodazol, colquicina y colcimid, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermólido y eleuterobina.
En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes anti-tubulina. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., 1992, Cáncer Res. 52:127-131).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico no es un radioisótopo.
En algunas realizaciones, el agente citotóxico o inmunosupresor es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (p. ej., azotioprina o micofenolato mofetil), un inhibidor de dihidrofolato reductasa (p. ej., metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, citidina arabinósido, amantadina, didesoxiuridina, yododesoxiuridina, poscamet o trifluridina.
En otras realizaciones, el agente citotóxico o inmunosupresor es tacrolimus, ciclosporina o rapamicina. En otras realizaciones, el agente citotóxico es aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido de arsénico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoetin alfa, Denileukin diftitox, dexrazoxana, dromostanolona propionato, epirrubicina, Epoetin alfa, estramustina, exemestano, Filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamician, goserelina, idarrubicina, ifosfamida, imatinib mesilato, Interferón alfa-2a, irinotecán, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina o mostaza de nitrógeno, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsalen, mitomicina C, mitotano, nandrolona fenpropionato, oprelvekin, oxaliplatino, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pentostatina, pipobroman, plicamicina, porfímero sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicasa, revlimid, Sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testolactona, tioguanina, toremifeno, Tositumomab, Trastuzumab, tretinoína, mostaza de uracilo, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina y zoledronato.
En realizaciones adicionales, el fármaco es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado. RITUXAN (rituximab; Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.); un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; un anticuerpo lgG2a murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; un anticuerpo quimérico anti-EGFR IgG); Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD); Campath l/H (Leukosite, MA; un anticuerpo lgG1 humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-CD33 IgG humanizado); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; un anticuerpo anti-CD22 IgG humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-Dr10 murino radiomarcado); Allomune (BioTransplant, CA; un anti-CD2 mAb humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; un anticuerpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ and Amgen, CA; un anticuerpo anti-CD22); y CEAcide (Immunomedics, NJ; un anticuerpo anti-CEA humanizado).
Otros anticuerpos adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos contra los siguientes antígenos: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, alfafetoproteína, CA 242, fosfatasa alcalina placentaria, antígeno específico de próstata, fosfatasa de ácido prostático, factor de crecimiento epidérmico, MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor antitransferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gp10O, MART1 , antígeno específico de próstata, receptor de IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22, gonadotropina coriónica humana, CD38, mucina, P21 , MPG y producto oncogénico Neu.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente inmunosupresor. El agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetil o metotrexato. Alternativamente, el agente inmunosupresor puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide (p. ej., cortisol o aldosterona) o un análogo de glucocorticoides (p. ej., prednisona o dexametasona).
Inhibidores de cicloxigenasa adecuados incluyen ácido meclofenámico, ácido mefenámico, carprofeno, diclofenac, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetin y ácido acetilsalicílico.
Inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores de redox (p. ej., derivados de catecol butano, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), masoprocol, fenidona, lanopalen, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquilhidroxilamina) e inhibidores no redox (p. ej., hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos y sus derivados, metoxitetrahidropirano, áciods boswélicos y derivados acetilados de ácido boswélicos, y ácidos quinolinemetoxifenilacéticos sustituidos con radicales cicloalquilo) y precursores de inhibidores de redox.
Otros inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen antioxidantes (p. ej., fenoles, propilgalato, flavonoides y/o sustratos naturales que contienen flavonoides, derivados hidroxilados de las flavonas, flavonol, dihidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de calcona, 4,2,,4'-trihidroxicalcona1 orto-aminofenoles, N-hidroxiureas, benzofuranoles, ebselen y especies que aumentan la actividad de las selenoenzimas reductoras), agentes quelantes de hierro (p. ej., ácidos hidroxámicos y sus derivados, N-hidroxiureas, 2-bencil-1-naftol, catecoles, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfasalazina, zyleuton, ácido 5-hidroxiantranílico y 4-(ácidos omega-arialquil)fenilalcanoicos), compuestos que contienen imidazol (p. ej., cetoconazol e itraconazol), fenotiazinas y derivados de benzopirano.
Incluso otros inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen eicosanoides (p. ej., ácidos octadecatetraenoico, eicosatetraenoico, docosapentaenoico, eicosahexaenoico y docosahexaenoico y sus ésteres, PGE1 (prostaglandina E1), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, ácido 15-monohidroxieicosatetraenoico, 15-monohidroxi-eicosatrienoico y 15-monohidroxiicosapentaenoico, y leucotrienos B5, C5 y D5), compuestos que interfieren con los flujos de calcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamil, fuscosido, curcumina, ácido clorogénico, ácido cafeico , ácido 5,8,11,14-eicosatetraienoico (ETYA), hidroxifenilretinamida, lonapalen, esculin, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicaleína, proxicromil, tioéteres, dialilsulfuro y di-(1-propenil) sulfuro.
Antagonistas de los receptores de leucotrieno incluyen calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111 , Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingelheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert Cl-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck and Co. MK-591 , Merck and Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901 , Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKNne Beecham SK y F-104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 y Teijin TEI-1338.
Artículos de elaboración En otro aspecto, se incluye un artículo de elaboración que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de elaboración comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los envases pueden estar formados de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril. Por ejemplo, el envase puede tener una bolsa con solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica. El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-CD40 humanizado. La etiqueta en el envase o asociada al envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. El artículo de elaboración puede además comprender un segundo envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
La invención se describe además en los siguientes ejemplos, que no tienen como fin limitar el alcance de la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Producción de anticuerpo anti-CD40 humanizado Los anticuerpos murinos 20E2 y 2H11 se muestran en las Tablas 1 y anteriormente expuestas. Se ha completado la humanización de 20E2 y 2H11. Se creó una genoteca donde los residuos humanos y murinos variaron en modo tal que en cualquier posición determinada podía haber o bien un residuo humano o uno murino. Dicha genoteca se creó para aminoácidos que eran diferentes entre la línea germinal humana y el anticuerpo murino. Se seleccionaron solamente los clones que retenían la función del anticuerpo murino parental.
De este modo, se humanizaron el Anticuerpo a, el Anticuerpo B y el Anticuerpo C derivados de anticuerpo 20E2 de ratón (Anticuerpo A y Anticuerpo B) o 2H11 (Anticuerpo C) clonados en la estructura principal lgG1-KO (KO=inactivada-out)/kappa humana. lgG1-KO tiene dos mutaciones en la región Fe, Leu234Ala y Leu235Ala para reducir FcyR y unión de complemento.
Los resultados de dicha humanización produjeron diversas secuencias variables de cadena pesada y ligera humanizadas que se muestran a continuación: SEC ID NO: 41 (secuencia de cadena ligera variable): DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLI YWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGG TKVEIK SEC ID NO: 42 (secuencia de cadena pesada variable): EVQLVKSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAM DYWGQGTL TVSS SEC ID NO: 43 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLI YWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGG TKVEIK SEC ID NO: 44 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ NSLRAEDTALYYCARQDGYRYAM DYWAQGTLVTVSS SEC ID NO: 45 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLI YWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGT KVEIK SEC ID NO: 46 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAM DYWGQGTLVTVSS.
SEC ID NO: 47 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLT HQQKPGQPPKLL IYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGG TKVEIK SEC ID NO: 48 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAM DYWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 49 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLL IYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAG TKVEIK SEC ID NO: 50 (secuencia de cadena ligera variable) EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAM DYWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 51 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLI YWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGT KVEIK.
SEC ID NO: 52 (secuencia de cadena ligera variable) DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYLT HQQKPGQPPKLLI YWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGG TKVEIK SEC ID NO: 53 (secuencia de cadena pesada variable) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAM DYWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 54 (secuencia de cadena ligera variable) QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLA SGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEC ID NO: 55 (secuencia de cadena ligera variable) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEC ID NO: 56 (secuencia de cadena ligera variable) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEC ID NO: 57 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRID PEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTY GYWGQGTLVTVSS.
SEC ID NO: 58 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEW GRID PEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTY GYWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 59 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRID PEDGDSKYAPKFQGKVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTY GYWGQGTLVTVSS.
SEC ID NO: 60 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDP E DG DS KYAPKFQG KATMTADTSTSTVYM ELSS LRSE DTAVYYCTTS YYVGTYG YWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 61 (secuencia de cadena pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRID PEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTY GYWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 62 (secuencia de cadena pesada variable): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRID PEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYG YWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 63 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRID PEDGDTKFAPKFQGKVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYG YWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 64 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDP EDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGY WGQGTLVTVSS SEC ID NO: 65 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRID PEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYG YWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 66 (secuencia pesada variable) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRID PEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYG YWGQGTLVTVSS SEC ID NO: 67 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPE DGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGY WGQGTTVTVSS SEC ID NO: 68 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEW GRIDPE DGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGY WGQGTTVTVSS SEC ID NO: 69 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEW GRIDPE DGDTKYDPKFQGKVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGY WGQGTTVTVSS SEC ID NO: 70 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWMGRIDPE DGDTKYDPKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGY WGQGTTVTVSS SEC ID NO: 71 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPE DGDTKYDPKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGY WGQGTTVTVSS SEC ID NO: 72 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWIGRIDPED GDTKYDPKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYW GQGTTVTVSS SEC ID NO: 73 (secuencia pesada variable) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPE DG DTKYD P KFQG RVTMTADTSTDTAYM E LSS LRS E DTAVYYCTTS YYVGTYG Y WGQGTTVTVSS SEC ID NO: 74 (secuencia ligera variable) 1 del anticuerpo 10F2Hum: DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEC ID NO: 75 (secuencia ligera variable) 2 del anticuerpo 10F2Hum: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK SEC ID NO: 76 (secuencia ligera variable) QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK Anticuerpos humanizados ilustrativos de la presente invención son aquellos que tienen las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas en la siguiente tabla. Las secuencias subrayadas y en negrita en la tabla siguiente son los dominios variables, mientras que las secuencias no subrayadas normales son los dominios constantes: Las diversas regiones se subclonaron en uno o dos vectores de expresión de IgG adecuados: A) un formato lgG1-KO (inactivado)/kappa humano con una mutación doble Leu234Ala, Leu235Ala en la región Fe para reducir la función efectora tal como FcyR y la unión de complemento B) un formato lgG4-D (mutante doble)/kappa humano con una mutación Ser228Pro en la región bisagra para reducir la aparición de medias moléculas lgG4 y una mutación Leu235Glu para reducir más la unión FcyR Los dos candidatos de Anticuerpo A y Anticuerpo B se purificaron y evaluaron mediante los siguientes criterios: - Aspecto de CCF (turbidez) - Propiedades de filtración de CCF - Rendimiento en rProteínaA - Turbidez tras elución y neutralización - Agregados solubles (SEC) - Patrón de pureza / contaminación (SDS) - Patrón de carga (IEF) Ejemplo 2: Datos in vitro El Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C se caracterizaron junto con los anticuerpos 4D11 (Kirin/ Astellas) y PG-102 (PanGenetics) que se produjeron en base a secuencias publicadas. Los datos para el Anticuerpo, Anticuerpo B, Anticuerpo C y 4D11 se muestran a continuación. PG-102 exhibió actividad agonista y solamente inhibición incompleta de proliferación de células B (no se muestra). La Tabla 2.2. Resume los datos obtenidos. A continuación de la Tabla 2.2 se expone una descripción más detallada de los datos.
Tabla 2.2. Resumen de datos in vitro del Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C y anticuerpo de Kirin 4D11 y anti-CD40.
* SI, índice de estimulación; ** Relación > 1 significa mayor unión a Cyno en comparación con humanos A. Unión de anticuerpos humanizados a la proteína CD40 celular y CD40 recombinante La unión específica de anticuerpos humanizados a CD40 celular se analizó por citometría de flujo usando células HEK-293 transfectadas con CD40 humana. Se observó la unión dependiente de la concentración de Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C. Los anticuerpos exhibieron un perfil de unión similar en la Figura 1 B. Los valores CE50 de los anticuerpos de la presente invención y el anticuerpo de Kirin 4D11 están todos en el mismo intervalo ~1 nM que está más probablemente en el límite de sensibilidad del ensayo debido a los altos niveles de CD40 en las células transfectadas. La unión específica de anticuerpos humanizados a CD40 celular en células Ramos humanas también demostró unión dependiente de la concentración. Los anticuerpos exhibieron perfiles de unión levemente diferentes (se muestran en la Figura 2) y valores CE50 entre 0.21-1.22 nM. No se detectó unión en células CD40 negativas tales como las células HEK293 no transfectadas o la línea de células T HSB-2, confirmando así la unión selectiva a CD40 (no se muestran los datos).
La afinidad de unión del Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C a la proteína CD40-Fc humana se midió mediante el octeto ForteBio y reveló constantes de disociación (KD) de <100 pM. Debido a la avidez de bivalencia del anticuerpo y CD40-Fc los efectos evitan que se determinen precisamente Kds debajo de 100 pM. Además, la unión a CD40-Fc se analizó en ausencia y presencia de 50% de suero humano y no se observó ningún efecto significativo del suero en la unión (no se muestran datos) B. Actividad de anticuerpos humanizados en ensayos de activación/proliferación de células B La actividad de los anticuerpos humanizados se ensayó en un ensayo de proliferación de células B en el que las células B humanas derivadas de sangre periférica se estimulan con CD40L recombinante en presencia de IL-2 e IL-4. El Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C demostraron una inhibición potente de la proliferación de células B (se muestra en las Figuras 3A y 3B). La comparación con las curvas de inhibición y los valores CI50 de los anticuerpos de Bl y el anticuerpo de Kirin 4D11 indica que el anticuerpo 4D1 1 tiene potencial más alto (Figura 3B y tabla 6) cuando se ensaya en donantes múltiples. Cuando se ensaya la actividad agonista en ausencia de CD40L, los anticuerpos Anticuerpo B, Anticuerpo A y Anticuerpo C no inducen ninguna proliferación de células B encima de los niveles de fondo a concentraciones hasta 10 pg/ml (67 nM) (se muestra en la Tabla 6) similar al anticuerpo 4D11.
El anticuerpo competidor 4D11 pareció ser levemente más potente con un CI50 promedio de -0.02 nM y ausencia de efectos agonistas. Los datos para los tres anticuerpos Bl y 4D11 se resumen en la tabla 6 y en la Tabla 2.2 anterior. Otro anticuerpo competidor, PG-102 (derivado del clon 5D12), también estudiado en este ensayo, exhibió efectos agonistas significativos estimulando la proliferación de células B en ausencia de CD40L (Tabla 6). En consecuencia, la falta de actividad agonista de cuatro candidatos iniciales los diferencia claramente de PG-102.
En un segundo ensayo, los anticuerpos se evaluaron para inhibición de aumento de CD86 en células B humanas. En este caso, el ensayo se llevó a cabo con sangre completa humana o células B purificadas, ambas en presencia de CD40L exógeno. De acuerdo con los datos de proliferación de células B, el Anticuerpo B, el Anticuerpo A y el Anticuerpo C ensayados en sangre completa humana demostraron inhibición potente de aumento de CD86 mediado por CD40 según lo medido por citometría de flujo (se muestra en la Figura 4). El Anticuerpo C exhibió potencia similar a 4D11 en este ensayo, mientras que la potencia del Anticuerpo B y el Anticuerpo A fue algo más débil. La comparación del Anticuerpo B y 4D11 en células B purificadas o en sangre completa muestra que la potencia del Anticuerpo B (valores CI50 y CI90) permanece relativamente inalterada para células B purificadas en comparación con células B en presencia de otras células o suero que portan CD40, mientras que 4D11 sufre un drástico cambio en potencia en las condiciones de sangre completa (se muestra en la Tabla 7).
Se han creado datos similares cuando el Anticuerpo B, el Anticuerpo A y el Anticuerpo C se evaluaron para inhibición de aumento de CD86 en células B de mono cynomolgus cuando se realizó con muestras de sangre completa (se muestra en la Figura 5). El Anticuerpo B, Anticuerpo A y Anticuerpo C ensayados en sangre completa de mono cynomolgus demostraron inhibición potente de aumento de CD86 mediado por CD40, según lo medido por citometría de flujo. Estos anticuerpos demuestran, por lo tanto, la reactividad cruzada funcional a CD40 de mono cynomolgus con potencia similar a la CD40 humana.
La actividad de IgGI KOb del Anticuerpo B e IgGIWT del Anticuerpo B se evaluó para capacidad de mediar en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (Figura 10). En este ensayo, se incubaron células RAMOS con PBMC humanos en una relación efectora célula diana de 50:1. IgGI KOb del Anticuerpo By IgGIWT del Anticuerpo B se titularon a partir de 20 ug/ml, y el grado de muerte celular se monitoreó por liberación de LDH. Los datos exhibidos pertenecen a un experimento respectivo. Los datos muestran que IgGIWt 20E2-12-RlgG1WT del Anticuerpo A es un mediador eficaz de ADCC y que IgGI KOb del Anticuerpo B, que contiene las mutaciones que eliminan la función efectora, no tiene actividad ADCC.
Ejemplo 3: Estudios de farmacocinética/farmacodinámica A. Administración iv única de Anticuerpo A y Anticuerpo B a 1 o 10 mg/kg en monos cynomolgus El Anticuerpo A y el Anticuerpo B se dosificaron cada uno a 1 y 10 rng/kg a monos cynomolgus macho (N=3)/dosis. Se extrajeron muestras de sangre de 0-504 h (3 semanas), se recuperó el suero y las muestras se conservaron a -20°C hasta el análisis. Las muestras se analizaron por sándwich ELISA como se describió anteriormente. Los perfiles de concentración-tiempo en suero de ambos anticuerpos en monos después de las dosis iv y los parámetros de farmacocinética se resumen en las Figuras 6A y 6B y en las Tablas 2.7.1 (Anticuerpo A) y 2.7.2 (Anticuerpo B) que se exponen a continuación. Ambos anticuerpos demostraron farmacocinéticas dependientes de la dosis que indican que se atribuye una depuración con una dosis baja predominantemente a una disposición mediada por la diana consistente, mientras que con la dosis más alta el anticuerpo se depura principalmente por catabolismo. Se observaron perfiles similares de farmacocinética dependiente de la dosis para otros MAbs que se dirigen a dianas asociadas con membranas (p. ej., CD19, CD20, EGFR, CD146 y HER2). La depuración del Anticuerpo A fue de 0.8 y 0.1 mL/h/kg para las dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente. La depuración del Anticuerpo B fue de 0.7 y 0.1 mL/h/kg para las dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente. De manera similar, la semivida del Anticuerpo A fue de 1 y 13 días para las dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente y la semivida del Anticuerpo B fue de 2 y 13 días para las mismas dosis respectivas. Si bien el Anticuerpo B tuvo una semivida marginalmente más prolongada en la dosis más baja en relación con la misma dosis para el Anticuerpo A, no se esperaría que esta diferencia se tradujera en exposición más sostenida tras la administración crónica. La AUC para ambos compuestos fue supraproporcional y el volumen de de distribución (Vss) para ambos compuestos se aproximó a aquel del volumen en plasma (~40 mL/kg), exhibiendo la distribución de tejido limitada que típicamente se ve en productos terapéuticos de proteínas polares grandes. En términos generales, no hubo diferencias apreciables en cuanto a los parámetros de farmacocinética entre los dos anticuerpos.
Tabla 2.7.1 : Parámetros de farmacocinética del Anticuerpo A en monos cynomolgus macho (N=3)/dosis después de una sola dosis iv de 1 y 10 mg/kg Tabla 2.7.2: Parámetros de farmacocinética del Anticuerpo B en monos cynomolgus macho (N=3)/dosis después de una sola dosis iv de 1 y 10 mg/kg B. Estudio de farmacodinámica ex vivo Como parte del estudio de PK anteriormente descrito, se analizaron los efectos de farmacodinámica de los anticuerpos anti-CD40. Con este fin, se incubaron muestras de sangre completa con CD40L recombinante durante una noche y se determinó el aumento de expresión de CD86 en células B por citometria de flujo. Las muestras se analizaron en el día 0 (pre-tratamiento), día 2, 7 y 14 después de la administración de la dosis. Si bien el aumento en la expresión de CD86 fue relativamente pequeño (-5-20-%), se observó un efecto dependiente de la dosis (se muestra en la Figura 7). En el grupo de animales a los que se les administraron 10 mg/kg del Anticuerpo A y el Anticuerpo B, la inducción de CD86 se inhibió completamente en los días 2, 7 y 14 consistentemente con la exposición sostenida en esta dosis. Los animales que recibieron la dosis de 1 mg/kg demostraron inhibición completa en el día 2, inhibición parcial en el día 7 y ninguna inhibición en el día 14. La pérdida del efecto de farmacodinámica con el transcurso del tiempo se correlaciona con una depuración más rápida del anticuerpo en el grupo de la dosis baja.
Ejemplo 4: Estudios relacionados con toxicología: CD40 en plaquetas La CD40 se expresa constitutivamente en plaquetas humanas (Henn, et al., 2001) y (Inwald, et al., 2003), mientras que CD40L se expresa rápida y transitoriamente en la superficie celular de células activadas (Henn, et al., 2001). Si bien no se esperaría que los anticuerpos anti-CD40 sin unión FcyR tuvieran efectos sobre las plaquetas, es importante demostrar directamente que éste es el caso. Se realizaron estudios de citometría de flujo para demostrar la unión de los anticuerpos iniciales anti-CD40 a plaquetas de seres humanos y cynomolgus.
Previamente, se ha demostrado mediante citometría de flujo que G28.5 y mAb 89 anti-CD40 mAb se unen a las plaquetas humanas en reposo (Henn, et al., 2001). Esto se confirmó usando el anticuerpo G28.5 marcado con FITC. Se realizaron diluciones en serie de 5 veces de G28.5 y se incubó un intervalo de 0.5 pg/ml a 0.32ng/ml en 100 µ? de plaquetas obtenidas de seres humanos (2 donantes) o monos cynomolgus (3 donantes) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Además, se usó anti-CD45 mAb marcado con APC para identificar las plaquetas unidas a otros tipos de células CD40+ como para excluir estas células del análisis. Después de la tinción del anticuerpo, las plaquetas se lavaron y se fijaron con Optilyse C y se realizó la citometría de flujo. Se determinó la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) como una medida de la unión del anticuerpo a las plaquetas CD45.
Los anticuerpos comercialmente disponibles 5c3 y los anticuerpos de la invención mAB de ratón anti-CD40 se marcaron con FITC. Se confirmó la unión a células Ramos. La cantidad de moléculas FITC por molécula de anticuerpo osciló entre 2 y 4 FITC por molécula de anticuerpo. Se realizaron cinco diluciones en serie del candidato mAB anti-CD40 mAb comercial, oscilando entre 0.5 pg/ml y 0.32 ng/ml, y se incubaron con plaquetas humanas (3 donantes) y de cynomolgus (2 donantes) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
En la Figura 9 se muestra un gráfico representativo que demuestra la unión del mAB anti-CD40 de ratón candidato a las plaquetas humanas. Los cuatro anticuerpos monoclonales candidatos exhibieron unión específica a las plaquetas, en comparación con el anticuerpo de control isotipo marcado con FITC. 10F2, 2H11 , 19B10 y 20E2 demostraron unión comparable a las plaquetas. Se observó una tendencia similar en las plaquetas de cynomolgus (no se muestran los datos).
Además de estos estudios, se comparó la capacidad del Anticuerpo B directamente marcado y 4D11 de unir plaquetas y células B en muestras de sangre completa humanas y de monos cynomolgus (se muestra en la Tabla 8). 4D11 exhibió unión similar (según lo ejemplificado por CE50) tanto a células B como a plaquetas en las muestras de sangre humanas y de monos cynomolgus. El Anticuerpo B demostró un patrón similar pero una potencia de unión mucho más débil.
Ejemplo 5: Estudios de farmacología in vivo en el modelo de ratón NSG La eficacia de los anticuerpos humanizados, el Anticuerpo A, se evaluó en el modelo de producción de anticuerpos donde se inyectaron PBMC de seres humanos a ratones NSG inmunodeficientes con el fin de generar una respuesta injerto contra hospedante. Se puede detectar una producción significativa de IgM humana (hlgM) e IgG (hlgG) comenzando 2 semanas después del injerto. El tratamiento con el Anticuerpo A a en dosis de 5 y 1 mg/kg inhibió significativamente la respuesta de hlgG y hlgM en las semanas 2 y 3 después del injerto. Se evaluó un anticuerpo comparativo (4D11) con una única dosis de 5 mg/kg y también demostró abolición de la respuesta. En un segundo estudio, todos los anticuerpos, el Anticuerpo A, Anticuerpo B y Anticuerpo C, se ensayaron con una única dosis de 1 mg/kg y demostraron la inhibición total de la respuesta de IgM e IgG en la semana 2 (Figuras 8A-8B).
Ejemplo 6: Análisis de biomarcadores Aumento de receptores: El aumento inducido por CD40L de los receptores se puede medir por citometría de flujo. Se puede estimular sangre completa humana con una concentración optimizada de CD40L soluble y el porcentaje total de CD20+Receptor+ células se puede medir por citometría de flujo. El cambio en porcentaje de expresión de CD86 en células CD20 positivas se midió en paralelo al estudio pk de cyanomologous que evalúa los Anticuerpos A y B (Figura 7). Los datos muestran la inhibición del aumento de CD86 en puntos de tiempo consistentes con la exposición de los anticuerpos.
Proteinómica direccionada: La mayor secreción de proteínas tras la estimulación de CD40 en sangre completa puede utilizarse como biomarcador(es) potencial. Se establecieron una concentración optimizada de CD40L soluble y tiempo de estimulación usando la plataforma de perlas multiplex Luminex que detecta MDC/CCL22 y varias otras proteínas segregadas. Las muestras clínicas se evaluarán a partir de sangre completa en una gama de dosis total de anti-CD40 mAb.
Ocupación de receptores: La ocupación del receptor de CD40 se puede determinar en un ensayo in vitro o ex vivo basado en un análisis citométrico de flujo de células B en sangre completa humana. Candidatos actuales El anticuerpo de la presente invención y el anticuerpo anti-CD40 no competitivo 5C3 se usarán para cuantificar el ensayo de ocupación del receptor.
Ejemplo 7: Actividad antitumoral del anticuerpo anti-CD40 humanizado En algunos casos, puede ser conveniente determinar las propiedades antitumorales de los anticuerpos de la presente invención. Dicha determinación puede realizarse ensayando la actividad antitumoral del anticuerpo anti-CD40 humanizado en un modelo de xenotrasplante de linfoma de ratón SCID. A dicho modelo de SCID se le pueden inyectar células cancerosas para presentar un tumor, p. ej., 5x 106 millones de células tumorales subcutáneamente en ratones SCID (1 O/grupo) trece días antes del comienzo del tratamiento con el fármaco. Los anticuerpos anti-CD40 murinos de la presente invención o una comparación (p. ej., control u otro anticuerpo humanizado) se administran por vía intraperitoneal 3 veces por semana (4 mg/kg/dosis) con 8 o 5 dosis administradas. El desarrollo y crecimiento de tumores se monitorea en el ratón, y el volumen del tumor se puede medir semanalmente durante el periodo de estudio seleccionado, p. ej., un periodo de estudio de 14 días. Preferiblemente, los resultados mostrarán un incremento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces en el crecimiento de los tumores en ratones control comparado con los ratones tratados con los anticuerpos de la presente invención. Preferiblemente, durante el periodo de tratamiento, el crecimiento del tumor en los ratones tratados con los anticuerpos de la invención será insignificante. Dichos datos pueden corroborar que el anticuerpo humanizado ensayado es eficaz para suprimir el crecimiento tumoral en este modelo de xenoinjerto de linfoma B.
Ejemplo 8: Supervivencia prolongada por el anticuerpo anti-CD40 humanizado La eficacia del anticuerpo anti-CD40 humanizado en la supervivencia de ratones que portan el tumor como aquellos anteriormente descritos se puede ensayar en un modelo de xenoinjerto de linfoma de ratón SCID. Los ratones SCID (1 O/grupo) se inoculan por vía intravenosa con 1 x 106 millones de células tumorales tres días antes del tratamiento con el anticuerpo. Los ratones luego se tratan con los anticuerpos anti-CD40 murinos o humanizados de la presente invención o con un control de Ig, administrado por vía intraperitoneal dos veces por semana (4 mg/kg/dosis) por un total de cinco dosis. Las jaulas de los ratones pueden examinarse diariamente para mortalidad a fin de determinar el nivel de eficacia de los anticuerpos para prolongar la supervivencia de un sujeto que padece cáncer.
Diversas referencias, incluyendo solicitudes de patentes, patentes y publicaciones científicas se citan en el presente documento, y las descripciones de las mismas se incorporan a la presente memoria por referencia en su totalidad. La cita o identificación de cualquier referencia de la presente memoria no se interpretará como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.
Aspectos preferidos de la presente invención se pueden describir de acuerdo con las realizaciones preferidas en los siguientes párrafos: Párrafo ! Un anticuerpo monoclonal humanizado en el que dicho anticuerpo se une específicamente a CD40 humana que tiene una actividad antagonista CI50 inferior a 1nM y no tiene agonismo hasta 100 mg/ml en la proliferación de células B, y donde dicho anticuerpo se caracteriza además porque el anticuerpo posee una semivida in vivo en primates no humanos de por lo menos 10 días.
Párrafo 2. El anticuerpo monoclonal humanizado del Párrafo 1 en el que dicho anticuerpo posee una semivida en monos cynomolgus de más de 8 días con una dosis inferior a 30 mg/kg.
Párrafo 3. El anticuerpo del Párrafo 1 , en el que el anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada entre el grupo que consiste en cualquier SEC ID NO: 1 a SEC ID NO: 4 y una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO: 8.
Párrafo 4. El anticuerpo del Párrafo 1 , en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un antígeno que se une a un fragmento de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de cualquier SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO: 40, SEC ID N°: 42, SEC ID N°: 44, SEC ID N°: 46, SEC ID N°: 48, SEC ID NO. 50 SEC ID N°: . 53, SEC ID N°: 57, SEC ID N°: 58, SEC ID N°: 59, SEC ID N°: 60, SEC ID N°: 61 , SEC ID N°: 62, SEC ID N°: 63, SEC ID N°: 64, SEC ID N°: 65, SEC ID N°: 66, SEC ID N°: 67, SEC ID N°: 68, SEC ID N°: 69, SEC ID N°: 70, SEC ID N°: 71 , SEC ID N°: 72 o la SEC ID N°: 73.
Párrafo 5. El anticuerpo del Párrafo 1 , en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un antígeno que se une a un fragmento de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de cualquier SEC ID NO: 5 a SEC ID NO:8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 , SEC ID NO:36, SEC ID NO:41 , SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:47, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51 , SEC ID NO:52, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56, SEC ID NO:74, SEC ID NO:75 o SEC ID NO:76.
Párrafo 6. El anticuerpo monoclonal del Párrafo 1 , en el que el dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la secuencia CDR1 de cadena pesada se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID NO: 9 a la SEC ID NO:1 1 , una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:12 a la SEC ID NO:15 y una secuencia CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:16 a la SEC ID NO:17; y donde la secuencia CDR1 de cadena ligera tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:18 a la SEC ID NO:21 , una secuencia CDR2 de cadena ligera de la SEC ID NO:22 a la SEC ID NO:23 y una secuencia CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:24 a la SEC ID NO:25.
Párrafo 7. El anticuerpo monoclonal del Párrafo 1 , en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 10, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 13 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 16 y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 19, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 24.
Párrafo 8. El anticuerpo monoclonal del Párrafo 1 , en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 9, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 14 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 16 y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 20, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 24.
Párrafo 9. Un anticuerpo anti-CD40 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4 Párrafo 10. Un anticuerpo anti-CD40 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO: 8.
Párrafo 12. Un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:27 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:; 36, respectivamente.
Párrafo 13. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40 humana, que comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de dominio variable humana de SEC ID NO: 27, SEC ID NO:28, SEC ID NO:29 o SEC ID NO:30, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica al dominio variable de cadena ligera correspondiente de la SEC ID NO:26.
Párrafo 14. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40 humana, que comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de domino variable humana de la SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34 o SEC ID NO:35, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica a una variable de cadena ligera correspondiente de SEC ID NO:31.
Párrafo 15. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40 humana, que comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de dominio variable humana de SEC ID NO: 37, SEC ID N°:38; SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica a una cadena ligera correspondiente de SEC ID NO:36.
Párrafo 16. El anticuerpo del Párrafo 1 , en el que dichos anticuerpos no puede estimular la producción de citocinas de células B en ausencia de CD40L.
Párrafo 17. El anticuerpo del Párrafo 1 , en el que dichos anticuerpos se unen a la CD40 humana en presencia de 50% suero humano con una reducción del índice inferior a dos veces.
Párrafo 18. El anticuerpo del Párrafo 1 , en el que dicho anticuerpo produce la inhibición de la producción de IgM e IgG en un mamífero a una concentración de 1 mg/kg.
Párrafo 19. Un método para bloquear la función de CD40 humana en un mamífero, que comprende administrar ha dicho mamífero una composición que comprende un anticuerpo del Párrafo 1 en una cantidad suficiente para bloquear una respuesta inmunitaria mediada por CD40 en dicho mamífero.
Párrafo 20. Un método para tratar o aliviar la enfermedad injerto contra hospedante en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una composición que comprende un anticuerpo del Párrafo 1 en una cantidad suficiente para disminuir uno o más de los síntomas de la enfermedad injerto contra hospedante en dicho animal.
Párrafo 21. El método del Párrafo 20, en el que dicho mamífero tiene una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primario, tirotoxicosis Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1, síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica.
Párrafo 22. El método del Párrafo 19, en el que dicho mamífero padece artritis reumatoide.
Párrafo 23. El método del Párrafo 20, que además comprende la administración de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de TNF, un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad, un antagonista de CTLA4, un receptor anti-IL-6 mAb y un anti-CD20 mAb.
Párrafo 24. Un método según el Párrafo 20, en el que dicha enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria asociada con células que expresan tanto CD40 como CD20.
Párrafo 25. El método del Párrafo 19, en el que dicho anticuerpo anti-CD40 se administra por la ruta de administración parenteral.
Párrafo 26. El método del Párrafo 19, en el que dicho anticuerpo anti-CD40 se administra por vía intravenosa o subcutánea.
Párrafo 27. Un método para inhibir la producción de anticuerpos por parte de las células B en un paciente humano, que comprende administrar a dicho paciente humano una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD40 del Párrafo 1.
Párrafo 28. El método del Párrafo 27, en el que dicho paciente humano tiene una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria asociada con células que expresan CD40.
Párrafo 29. El método del Párrafo 27, en el que dicho paciente humano sufre de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primario, tirotoxicosis/Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1 , síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica.
Párrafo 30. Un método para inhibir la proliferación de células que expresan el antígeno de CD40 humano, que comprende administrar el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del Párrafo 1 a las células, donde el anticuerpo o el fragmento que se une al antígeno se une específicamente al antígeno CD40 de superficie de células humanas, donde la unión del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno, al antígeno CD40 inhibe la proliferación o diferenciación de las células.
Párrafo 31. Un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado con CD40, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del Párrafo 1 , donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une específicamente a CD40 humana, donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno a CD40 inhibe la proliferación o diferenciación de las células del trastorno asociado con CD40.
Párrafo 32. El método del Párrafo 31 , en el que las células del trastorno asociado a CD40 son células B linfoblastoides, pancreáticas, células de pulmón, células mamarias, células ováricas, células de colon, células de próstata, células de piel, células de cabeza y cuello, células de vejiga, células óseas o células renales.
Párrafo 33. El método del Párrafo 31 , en el que el trastorno asociado a CD40 es leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma de células T, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom o sarcoma de Kaposi.
Párrafo 34. Un método para inducir la reducción de células B periféricas, que comprende administrar a las células el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del Párrafo 1 , donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno CD40 de la superficie celular humana, donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, al antígeno CD40 induce la reducción de las células.
Párrafo 35. El método del Párrafo 34, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se administra a un sujeto que padece un trastorno inmunitario.
Párrafo 36. El método del Párrafo 34, en el que el trastorno inmunitario es artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico.
Párrafo 37. Un método para tratar la artritis reumatoide en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo del Párrafo 1 , donde dicho anticuerpo es un anticuerpo antagonista que bloquea la función de CD40 en dicho sujeto.
Párrafo 38. El método del Párrafo 37, en el que dicho anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la diferenciación de células B y un cambio de isotipo del anticuerpo en dicho sujeto.
Párrafo 39. El método del Párrafo 37, en el que dicho anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la producción de citocinas y quimiocinas y el aumento de moléculas de adhesión en células T y macrófagos en dicho sujeto.
Párrafo 40. El método del Párrafo 37, en el que dicho anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la activación de células dendriticas en dicho sujeto.
Párrafo 41. El método del Párrafo 37, en el que dicho anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para inhibir la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas, metaloproteinasas de matriz, prostaglandinas y para disminuir las moléculas de adhesión en células no inmunitarias en dicho sujeto.
Párrafo 42. El método del Párrafo 37, en el que dicho anticuerpo se administra en combinación con un régimen que comprende la administración de metotrexato y/o la administración de Enbrel/Humira.
Párrafo 43. El método del Párrafo 37, en el que dicho sujeto es un sujeto que padece artritis reumatoide y no ha sido sensible al tratamiento con metotrexato solo.
Párrafo 44. El método del Párrafo 43, en el que dicho método comprende tratar a dicho sujeto con un régimen que comprende la administración de metotrexato y/o la administración de Enbrel/Humira.
Párrafo 45. El método del Párrafo 37, en el que el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con metotrexato solo, Enbrel solo, una combinación de Enbrel+metotrexato.
Párrafo 46. El método del Párrafo 43, en el que el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con Enbrel +MTX en pacientes que tienen una respuesta inadecuada al metotrexato.
Párrafo 47. El método del Párrafo 37, en el que dicho anticuerpo se administra en combinación con un régimen que comprende un agente anti-TNF.
Párrafo 48. El método del Párrafo 37, en el que dicho sujeto es un sujeto que padece artritis reumatoide y no ha sido sensible al tratamiento con un agente anti-TNF solo.
Párrafo 49. El método del Párrafo 48, en el que dicho método comprende tratar a dicho sujeto con un régimen que comprende el tratamiento con un agente anti-TNF en combinación con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista.
Párrafo 50. El método del Párrafo 37, en el que dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con un agente anti-TNF.
Párrafo 51. El método del Párrafo 48, en el que el tratamiento de dicho sujeto con dicho anticuerpo anti-CD40 antagonista posee una eficacia superior al tratamiento con Orencia o Rituxan en pacientes que tienen una respuesta inadecuada a un agente anti-TNF solo.
Párrafo 52. Una composición farmacéutica que comprende :(i) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del Párrafo 8; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Párrafo 53. Una composición farmacéutica del Párrafo 52, en la que dicho anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se conjuga a un segundo agente.
Párrafo 54. La composición farmacéutica del Párrafo 52, en la que dicho segundo agente es un agente citotóxico, un vehículo de PEG, una enzima o un marcador.
Párrafo 55. Un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO: 40, SEC ID N°: 42, SEC ID N°: 44, SEC ID N°: 46, SEC ID N°: 48, SEC ID. N° 50, SEC ID N°: 53, SEC ID N°: 57, SEC ID N°: 58, SEC ID N°: 59, SEC ID N°: 60, SEC ID N°: 61 , SEC ID N°: 62, SEC ID N°: 63, SEC ID N°: 64, SEC ID N°: 65, SEC ID N°: 66, SEC ID N°: 67, SEC ID N°: 68, SEC ID N°: 69, SEC ID N°: 70, SEC ID N°: 71 , SEC ID N°: 72 o la SEC ID N°: 73.
Párrafo 56. Un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO:8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 , SEC ID NO:36, SEC ID NO:41 , SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:47, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51 , SEC ID NO:52, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56, SEC ID NO:74, SEC ID NO.75 o SEC ID NO:76.
Párrafo 57. Un uso de un anticuerpo del Párrafo 1 en la elaboración de un medicamento para bloquear la función de la CD40 humana en un mamífero, donde el medicamento bloquea una respuesta inmunitaria mediada por CD40 en dicho mamífero.
Párrafo 58. Un uso de un anticuerpo del Párrafo 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar o aliviar la enfermedad injerto contra hospedante en un mamífero.
Párrafo 59. El uso del Párrafo 58, en el que dicho medicamento se elabora para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primario, enfermedad tirotoxicosis/Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1 , síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica.
Párrafo 60. Un uso de acuerdo con el Párrafo 58, donde dicho medicamento comprende además un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de TNF, un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad, un antagonista de CTLA4, un receptor anti-IL-6 mAb y un anti-CD20 mAb.
Párrafo 61. Un uso de acuerdo con el Párrafo 57, en el que dicho medicamento se elabora para uso por la ruta de administración parenteral.
Párrafo 62. Un uso de acuerdo con el Párrafo 57, en el que dicho medicamento se elabora para uso intravenoso o subcutáneo.
Párrafo 63. Un uso del anticuerpo del Párrafo 1 en la elaboración de un medicamento para la inhibición de la producción de anticuerpos por parte de las células B en un paciente humano.
Párrafo 64. Un uso de un anticuerpo del Párrafo 1 para la elaboración de un medicamento para la inhibición de la proliferación y/o diferenciación de células que expresan el antígeno CD40 humano.
Párrafo 65. Un uso de un anticuerpo del Párrafo 1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno asociado con CD40, donde la unión del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno en dicho medicamento a CD40 inhibe la proliferación o la diferenciación de células del trastorno asociado a CD40.
Párrafo 66. Un uso de acuerdo con el Párrafo 65, en el que el medicamento se utiliza para el tratamiento de las células en un trastorno asociado a CD40 seleccionadas entre células B linfoblastoides, pancreáticas, células de pulmón, células mamarias, células ováricas, células de colon, células de próstata, células de piel, células de cabeza y cuello, células de vejiga, células óseas o células renales.
Párrafo 67. El método de acuerdo con el Párrafo 65, en el que el medicamento se utiliza para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma de células T, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom o sarcoma de Kaposi.
Párrafo 68. Un uso de un anticuerpo del Párrafo 1 en la elaboración de un medicamento para inducir la reducción de células B periféricas, donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del medicamento se une específicamente a un antígeno CD40 de la superficie celular humana, donde la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, al antígeno CD40 induce la reducción de las células.
Párrafo 69. El uso de acuerdo con el Párrafo 68, en el que el medicamento es para el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno inmunitario.
Párrafo 70. El uso de acuerdo con el Párrafo 68, en el que el medicamento es para el tratamiento de artritis reumatoide o lupus eritematoso sistémico.
Párrafo 71. Un uso de un anticuerpo del Párrafo 1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide en un sujeto.
Párrafo 72. El uso de acuerdo con el Párrafo 71 , en el que el medicamento es para la inhibición de diferenciación de células B y un cambio de isotipo del anticuerpo en dicho sujeto.
Párrafo 73. El uso de acuerdo con el Párrafo 71 , en el que el medicamento es para la inhibición de la producción de citocinas y quimiocinas y el aumento de moléculas de adhesión en células T y macrófagos en dicho sujeto.
Párrafo 74. El uso de acuerdo con el Párrafo 71 en el que el medicamento es para la inhibición de la activación de células dendríticas en dicho sujeto.
Párrafo 75. El uso de acuerdo con el Párrafo 71, en el que el medicamento es para la inhibición de la producción de citocinas inflamatorias, quimiocinas, metaloproteinasas de matriz, prostaglandinas, y para la reducción de moléculas de adhesión en células no inmunitarias en dicho sujeto.
Párrafo 76. El uso de acuerdo con el Párrafo 71 , en el que el medicamento se elabora como un medicamento combinado para administrar en combinación con un régimen que comprende la administración de metotrexato y/o la administración de Enbrel/Humira.
Párrafo 77. El uso de acuerdo con el Párrafo 71 , en el que el medicamento además comprende un agente anti-TNF.
La aplicación de las enseñanzas descritas en la presente memoria no se limita al alcance de las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones estarán dentro de la capacidad de la persona con experiencia en la técnica en vista de las enseñanzas contenidas aquí y en los ejemplos adjuntos. Se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. - Un anticuerpo humanizado, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera se seleccionan del grupo que consiste en: a) una secuencia de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 9 a la SEC ID NO:11 , una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:12 a la SEC ID NO: 15 y una secuencia CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 16 a la SEC ID NO: 17, b) la secuencia de cadena ligera CDR1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 18 a SEC ID NO:21 , una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO:22 a SEC ID NO:23 y una secuencia CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo consistente en SEC ID NO:24 a SEC ID NO:25.
2. - El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 10, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID ??.?3 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO:16; y en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO:19, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO:22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO:24.
3. - El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 9, una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 14 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 16; y en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 20, una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 22 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO:24.
4. - El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 11 , una secuencia CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 15 y una secuencia CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 17; y en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 21 , una secuencia CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 23 y una secuencia CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 25.
5. - Un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmento de anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:27 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:28 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:29 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:30 y SEC ID NO:26, respectivamente; SEC ID NO:32 y SEC ID NO:31, respectivamente; SEC ID NO:33 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:34 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:35 y SEC ID NO:31 , respectivamente; SEC ID NO:37 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:38 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:39 y SEC ID NO:36, respectivamente; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:36, respectivamente.
6. - Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a CD40 humana, que comprende a) un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de dominio variable humana de SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34 o SEC ID NO:35, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica a una variable de cadena ligera correspondiente de SEC ID NO:31 ; o b) un dominio variable de cadena pesada humanizado que comprende una región flanqueante que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de dominio variable humana de SEC ID NO: 37, SEC ID N°:38¡ SEC ID NO:39 o SEC ID NO: 40, y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera por lo menos 90% idéntica a una cadena ligera correspondiente de SEC ID NO:36.
7. - Un anticuerpo monoclorial humanizado o fragmento de unión al antígeno, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une específicamente a CD40 humana que tiene una actividad antagonista CI50 inferior a 1nM y no tiene agonismo hasta 100 µg ml en la proliferación de células B, y en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se caracteriza además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno posee una semivida in vivo en primates no humanos de por lo menos 10 días; y en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del anticuerpo posee opcionalmente una semivida en monos cynomolgus de más de 8 días con una dosis inferior a 30 mg/kg.
8. - Un método para bloquear la función de la CD40 humana en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una composición que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en una cantidad suficiente para bloquear una respuesta inmunitaria mediada por CD40 en dicho mamífero.
9. - Un método para tratar o aliviar una enfermedad o trastorno en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una composición que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en una cantidad suficiente para disminuir uno o más de los síntomas de la enfermedad o trastorno en el mamífero.
10. - El método de la reivindicación 9, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en: enfermedad de injerto contra hospedante, enfermedad autoinmune o inflamatoria y trastorno relacionado con CD40.
11. - El método de la reivindicación 10, en el que la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, glomerulonefritis lúpica proliferativa, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), psoriasis, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis de Hashimoto, mixoedema primario, enfermedad tirotoxicosis/Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, carditis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus de tipo 1 , síndrome de Good Pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa (HBs Ag negativa), cirrosis criptogénica, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, lupus eritematoso discoide y vasculitis sistémica.
12. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 8-11 , que comprende, además, administrar un segundo agente terapéutico seleccionado.
13. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en el que dicho anticuerpo se administra por una vía de administración parenteral, vía intravenosa o vía subcutánea.
14. - Una composición farmacéutica que comprende:(i) el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable; y en donde el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se conjuga opcionalmente a un segundo agente.
15. - Un polinucleótido aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera, donde la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada comprende cualquiera de las SEC ID NO: 1 a 4, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:33, SEC ID NO:34, SEC ID NO:35, SEC ID NO:37, SEC ID NO:38, SEC ID NO:39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 48, SEC ID. NO: 50, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61 , SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71 , SEC ID NO: 72 o la SEC ID NO: 73; y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera comprende cualquiera de las SEC ID NO: 5 a SEC ID NO:8, SEC ID NO:26, SEC ID NO:31 , SEC ID NO:36, SEC ID NO:41 , SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:47, SEC ID NO:49, SEC ID NO:50, SEC ID NO:51 , SEC ID NO:52, SEC ID NO:54, SEC ID NO:55, SEC ID NO:56, SEC ID NO:74, SEC ID NO:75 o SEC ID NO:76.
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