TWI494126B - 抗ｃｄ４０抗體 - Google Patents

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TWI494126B
TWI494126B TW100111112A TW100111112A TWI494126B TW I494126 B TWI494126 B TW I494126B TW 100111112 A TW100111112 A TW 100111112A TW 100111112 A TW100111112 A TW 100111112A TW I494126 B TWI494126 B TW I494126B
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Sanjaya Singh
Tobias Litzenburger
Scott Brodeur
Keith A Canada
Rachel Barrett
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Description

抗CD40抗體
概言之，本發明係關於用於診斷及治療應用之人類化抗CD40抗體。更具體而言，本發明揭示人類化抗CD40抗體及用於治療特徵在於表現CD40之細胞之各種疾病或病症之方法。本發明亦揭示包含人類化抗CD40抗體之醫藥組合物及套組。
CD40係48 kDa I型膜內在糖蛋白，且係腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之成員。多種類型之細胞上表現CD40，包括正常及腫瘤性B細胞、交錯突細胞、癌瘤細胞、上皮細胞(例如角質形成細胞)、成纖維細胞(例如滑膜細胞)及血小板。CD40亦存在於單核細胞、巨噬細胞、一些內皮細胞及濾泡樹突細胞上。CD40在B細胞個體發育之早期表現，其在CD10及CD19出現後、且在表現CD21、CD23、CD24及出現表面免疫球蛋白M(sIgM)之前出現在B細胞前體上(Uckun等人，1990,Blood 15:2449)。亦已在扁桃體及骨髓源漿細胞上檢測到CD40(Pellat-Decounynck等人，1994,Blood 84:2597)。
CD40之配體係CD40L(亦稱作CD154、gp39及TRAP)，其係TNF超家族成員。CD40L係主要在活化CD4+ T細胞及一小亞群CD8+ T細胞上表現之跨膜蛋白(由Van Kooten C.及Banchereau綜述，2000)。
CD40與CD40L之相互作用誘導體液及細胞介導之免疫反應。CD40調節此配體-受體對以活化B細胞及其他抗原呈遞細胞(APC)，包括樹突細胞(DC)(由Toubi及Shoenfeld,2004；Kiener等人，1995綜述)。業內已廣泛研究了CD40對B細胞之功能。在次級淋巴樣器官之生髮中心中，CD40對B細胞之活化誘導增殖、分化為抗體分泌細胞及同型(isotype)轉換。活體外研究已顯示，CD40活化對B淋巴細胞產生細胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、LT-α)、表現黏著分子及共刺激受體(ICAM、CD23、CD80及CD86)以及提高MHC I類、MHC II類及TAP轉運蛋白之表現具有直接效應(Liu等人，1996)。在大多數該等過程中，CD40與細胞因子或其他受體-配體相互作用協同作用。
CD40在單核細胞及DC上之信號傳導導致存活延長以及分泌細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α及MIP-1α)。CD40在該等APC上之配基化亦導致共刺激分子(例如ICAM-1、LFA-3、CD80及CD86)上調。CD40受體之活化係使得DC可完全成熟為有效APC、從而驅動T細胞活化之一關鍵信號(Banchereau及Steinman,1998)(Van Kooten C.及Banchereau,2000)。
在小鼠模型中之最新研究顯示，CD40在樹突細胞上之信號傳導在TH17細胞產生中亦具有重要作用，TH17細胞被視為諸如關節炎及多發性硬化症等疾病中之自體免疫介導物(Iezzi等人，2009)(Perona-Wright等人，2009)。
CD40及CD40L剔除小鼠以及激動性及拮抗性抗小鼠抗體之可用性使得可研究CD40-CD40L相互作用在若干種疾病模型中之作用。已證實，投與阻斷性抗CD40L在若干種自體免疫模型中有益，包括自發性疾病(例如SNF1小鼠中之狼瘡性腎炎或NOD小鼠中之糖尿病)或疾病之實驗誘導形式(例如膠原誘導性關節炎(CIA)或實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE))(Toubi及Shoenfeld,2004)。抗CD40L mAb可抑制小鼠中之CIA，其阻斷關節炎症之發生、針對膠原之血清抗體滴度、發炎細胞浸潤至滑液下組織中以及軟骨及骨侵蝕(Durie等人，1993)。對於狼瘡性腎炎及EAE二者，已證實抗CD40L亦可減輕進行性疾病，從而確認了CD40-CD40L在疾病效應期中之作用(Kalled等人，1998)；(Howard等人，1999)。
亦在CD40L缺陷型小鼠中研究CD40-CD40L相互作用在EAE發生中之作用，該等小鼠攜帶對髓磷脂鹼性蛋白具有特異性之轉基因T細胞受體。該等小鼠在經抗原初免後不會發生EAE，且CD4+ T細胞保持休眠且不產生INF-γ(Grewal等人，1996)。
此外，針對CD40之抑制性抗體在諸如EAE等發炎疾病模型中顯示有益效應。Lamann及合作者證實，拮抗性小鼠抗人類CD40 mAb mu5D12及此mAb之嵌合形式可在遠親雜交絨猴中有效防止慢性脫髓鞘性EAE之臨床表現(Laman等人，2002)；(Boon等人，2001)。隨訪研究顯示，在絨猴EAE模型中，使用嵌合抗人類CD40抗體之治療性治療降低MRI可檢測炎症並延遲已存在腦部損傷之擴大(Hart等人，2005)。
在關節炎小鼠模型中測試具有激動活性之抗CD40抗體，且獲得一些矛盾性結果。如對免疫刺激劑所預期，顯示激動性抗小鼠CD40 mAb FGK45在CIA之DBA/1小鼠模型中可加重疾病(Tellander等人，2000)。然而，在另一慢性CIA模型FGK45中，以及另一激動性抗小鼠CD40 mAb(3/23)二者皆表現積極治療效應(Mauri等人，2000)。此治療組假定，此治療性治療方案中之激動性抗體藉由誘導朝向Th2反應之免疫偏離及降低IFN-γ含量且升高IL-4及IL-10之含量來產生有益效應(Mauri等人，2000)。
亦已記錄可藉由阻斷CD40/CD154相互作用來防止移植排斥。嵌合抗CD40拮抗劑ch5D12在羅猴腎異體移植研究中之應用表明，CD40之拮抗作用足以達成疾病緩解並將平均存活時間延長超過100天。在將ch5D12與抗CD86抗體組合且僅在開始異體移植研究時給予，之後使用環孢菌素(cyclosporine)進行延長治療時，獲得超過4年之平均存活時間，從而表明此組合可有效誘導耐受性(Haanstra等人，2005)。
因此，有眾多臨床前研究證實，CD40-CD40L二聯體在驅動有效T細胞依賴性免疫反應中具有決定性作用。因此，業內公認阻斷CD40信號傳導係在諸如RA、多發性硬化症或牛皮癬等疾病中抑制致病性自體免疫反應之適宜且必需之治療策略。然而，迄今為止，由於先前在研發中顯示抗CD40抗體具有顯著副作用，故尚無CD40抗體獲批用於該等病症之治療性干預。因此，業內仍非常需要可用於干預CD40-CD40L之作用並阻斷CD40信號傳導之治療藥劑。可藉由新穎人類化抗CD40抗體來滿足此需要，該等抗體特異性結合CD40且其所顯示抗原結合特異性、親和性及藥物代謝動力學及藥效學特性使得其可用於治療性干預基於CD40之病症。
本發明提供人類化單株抗體，其中該抗體特異性結合人類CD40，其在B細胞增殖中具有IC50小於1 nM之拮抗活性且在高達100 μg/ml濃度下不具有激動作用，且其中該抗體之特徵另外在於，該抗體在非人靈長類中之活體內半衰期係至少10天。
人類化單株抗體之特徵可另外在於，在小於30 mg/kg之劑量下，抗體在食蟹猴中之半衰期大於8天。
在實例性實施例中，本發明抗體包含選自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任一者組成之群之重鏈序列及選自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中任一者組成之群之輕鏈序列。
在其他實施例中，抗體係人類化抗體或抗體之抗原結合片段，其具有以下中之任一者之重鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73。
在其他實施例中，抗體係人類化抗體或抗體之抗原結合片段，其包含以下輕鏈可變域胺基酸序列：SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76。
在具體實施例中，本文所述單株抗體之特徵在於，其包含重鏈及輕鏈，其中重鏈CDR1序列選自由SEQ ID NO: 9至SEQ ID NO:11組成之群，重鏈CDR2序列選自由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15組成之群，且重鏈CDR3序列選自由SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:17組成之群；且其中輕鏈CDR1序列選自由SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:21組成之群，輕鏈CDR2序列係SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:23，且輕鏈CDR3序列選自由SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:25組成之群。
在具體實施例中，本文所述單株抗體之特徵在於，其包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO: 10、重鏈CDR2序列SEQ ID NO:13及重鏈CDR3序列SEQ ID NO:16，且其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO:19、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO:24。
在其他具體實施例中，本文所述單株抗體之特徵在於，其包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO: 9、重鏈CDR2序列SEQ ID NO:14及重鏈CDR3序列SEQ ID NO:16，且其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO:20、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO:24。
本文亦闡述本發明較佳抗體中重鏈之個別序列。例如，本發明係關於抗CD40抗體，其包含SEQ ID NO:1至4中任一者之重鏈可變域序列。該抗CD40抗體之特徵另外在於，其包含SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:8中任一者之輕鏈可變域序列。
亦涵蓋人類化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40及SEQ ID NO: 36。
另一實施例係關於特異性結合人類CD40之分離抗體或抗原結合片段，其包含人類化重鏈可變域，該人類化重鏈可變域包含框架區，該框架區之胺基酸序列與人類可變域重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中之框架區胺基酸序列至少90%一致；且包含與SEQ ID NO:26之對應輕鏈可變域至少90%一致之輕鏈胺基酸序列。
另一實施例係關於特異性結合人類CD40之分離抗體或抗原結合片段，其包含人類化重鏈可變域，該人類化重鏈可變域包含框架區，該框架區之胺基酸序列與人類可變域重鏈胺基酸序列SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中之框架區胺基酸序列至少90%一致；且包含與SEQ ID NO:31之對應輕鏈可變域至少90%一致之輕鏈胺基酸序列。
亦涵蓋特異性結合人類CD40之分離抗體或抗原結合片段，其包含人類化重鏈可變域，該人類化重鏈可變域包含框架區，該框架區之胺基酸序列與人類可變域重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40中之框架區胺基酸序列至少90%一致；且包含與SEQ ID NO:36之對應輕鏈至少90%一致之輕鏈胺基酸序列。
本發明抗體之特徵可另外在於，該等抗體在不存在CD40L時不能刺激B細胞產生細胞因子。
本發明抗體之特徵可另外在於，該等抗體在50%人類血清存在下與人類CD40結合，且結合速率(on rate)降低二倍以下。
本發明抗體之特徵可另外在於，該抗體在哺乳動物中在1 mg/kg濃度下抑制IgM及IgG產生。
本發明抗體可用於各種治療性方法、預防性方法、診斷性方法及其他方法中。舉例而言，本發明闡述在哺乳動物中阻斷人類CD40之功能之方法，其包含向該哺乳動物投與包含本發明抗體之組合物，該抗體之量足以在該哺乳動物中阻斷CD40介導之免疫反應。
本文亦涵蓋治療或改善哺乳動物之移植物抗宿主病之方法，其包含向該哺乳動物投與包含本發明抗體之組合物，該抗體之量足以在該動物中減少移植物抗宿主病之一或多個症狀。
例如，自體免疫性或發炎疾病可包括(但不限於)類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病(Crohn's Disease)及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病(Graves disease)、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病(Addison's disease)、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏(Good pastures's)症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏(Sjogren's)症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。在實例性實施例中，哺乳動物患有類風濕性關節炎。
本發明方法可另外包含投與選自由以下組成之群之第二治療藥劑：TNF拮抗劑、疾病緩解抗風濕藥、CTLA4拮抗劑、抗IL-6受體mAb及抗CD20 mAb。
在具體實施例中，發炎疾病或自體免疫性疾病係與表現CD40及CD20二者之細胞有關之發炎疾病或自體免疫性疾病。
在具體實施例中，治療涉及藉由非經腸投與途徑投與抗體組合物。
在具體實施例中，治療涉及以靜脈內或皮下方式投與抗體組合物。
本發明其他方法包含在人類患者中抑制B細胞產生抗體，其包含向該人類患者投與有效量之本發明抗CD40抗體。
更具體而言，人類患者患有與表現CD40之細胞有關之發炎疾病或自體免疫性疾病。
在實例性實施例中，人類患者患有選自由自體免疫性或發炎疾病組成之群之自體免疫性疾病，該自體免疫性或發炎疾病選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
本發明另一方法係關於抑制表現人類CD40抗原之細胞生長，其包含向該等細胞投與本發明抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人類細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原之結合抑制該等細胞之生長或分化。
亦涵蓋治療患有CD40相關病症之個體之方法，其包含向該個體投與本發明抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人類CD40特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與CD40之結合抑制CD40相關病症細胞之生長或分化。該等細胞可係(但不限於)B類淋巴母細胞(lymphoblastoid cells)、胰細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巢細胞、結腸細胞、前列腺細胞、皮膚細胞、頭頸細胞、膀胱細胞、骨細胞或腎細胞。
抑制細胞生長或分化之治療方法可用於治療慢性淋巴細胞白血病、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)或卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)。
亦涵蓋誘導清除外周B細胞之方法，其包含向該等細胞投與本發明抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人類細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原之結合誘導清除該等細胞。
在具體實施例中，將抗體或抗原結合片段投與患有免疫病症之個體。舉例而言，該免疫病症係類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡。
亦涵蓋治療個體之類風濕性關節炎之方法，其包含向該個體投與本發明抗體，其中該抗體係在該個體中阻斷CD40功能之拮抗性抗體。
較佳地，以在個體中有效抑制B細胞分化及抗體同型轉換之量投與該抗體。
在其他實施例中，以在該個體之T細胞及巨噬細胞中有效抑制細胞因子及趨化因子產生及黏著分子上調之量投與該抗體。較佳地，以在該個體中有效抑制樹突細胞活化之量投與該個體。
在其他實施例中，該方法之特徵另外在於，以在該個體之非免疫細胞中可有效抑制促發炎細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素產生及下調黏著分子之量投與該抗體。
在具體實施例中，抗體係與包含投與甲胺喋呤及/或投與Enbrel/Humira之方案組合投與。
接受該療法之個體係患有類風濕性關節炎且對單獨之甲胺喋呤治療無反應者。
在具體實施例中，該方法包含用包含投與甲胺喋呤及/或投與Enbrel/Humira之方案治療該個體。
本發明方法之特徵可另外在於，用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效優於使用單獨之甲胺喋呤、單獨之Enbrel、Enbrel+甲胺喋呤之組合來治療。
本發明方法之特徵可另外在於，用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效在對甲胺喋呤無充分反應之患者中優於使用Enbrel+MTX之治療。
在具體實施例中，抗體係與包含抗TNF藥劑之方案組合投與。
在具體實施例中，可將個體描述為患有類風濕性關節炎且對使用單獨之抗TNF藥劑之治療無反應者。在該等實施例中，該方法可包含用包含以抗TNF藥劑以及該拮抗性抗CD40抗體治療之方案治療該個體。
在具體實施例中，用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效優於用抗TNF藥劑治療。
在其他實施例中，該方法之特徵在於，用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效在對單獨之抗TNF藥劑無充分反應之患者中優於用Orencia或 Rituxan治療。
本發明另外涵蓋醫藥組合物，其包含：(i)本文所述抗體或抗原結合片段；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。在該等組合物中，抗體或其抗原結合片段可有利地與第二藥劑(例如細胞毒性劑、PEG載體、酶或標記物)偶聯。
本文亦涵蓋編碼以下中之任一者之重鏈可變區胺基酸序列之分離多核苷酸：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQI DN O:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID. NO. 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73。
本文亦涵蓋編碼以下中之任一者之輕鏈可變區胺基酸序列之分離多核苷酸：SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76。
本發明另外係關於本文所述抗體之用途，其用於製造在哺乳動物中阻斷人類CD40功能之藥物，其中該藥物在該哺乳動物中阻斷CD40介導之免疫反應。
在一實施例中，本發明係關於製造用於治療或改善哺乳動物之移植物抗宿主病之藥物。
在實例性實施例中，製造該藥物用於治療選自由以下組成之群之自體免疫性或發炎疾病：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
在一些實施例中，該藥物可另外包含選自由以下組成之群之第二治療藥劑：TNF拮抗劑、疾病緩解抗風濕藥、CTLA4拮抗劑、抗IL-6受體mAb及抗CD20 mAb。
可製造該藥物以供用於非經腸投與途徑。可製造該藥物以供靜脈內或皮下使用。
另一實施例涵蓋本文所述抗體之用途，其用於製造在人類患者中抑制B細胞產生抗體之藥物。
另一實施例涵蓋本文所述抗體之用途，其用於製造抑制表現人類CD40抗原之細胞之生長及/或分化之藥物。
另一實施例涵蓋本文所述抗體之用途，其用於製造治療患有CD40相關病症之個體之藥物，其中該藥物中抗體或抗原結合片段與CD40之結合抑制CD40相關病症細胞之生長或分化。
可製造該藥物以供用於治療CD40相關病症中選自以下之細胞：B類淋巴母細胞、胰細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巢細胞、結腸細胞、前列腺細胞、皮膚細胞、頭頸細胞、膀胱細胞、骨細胞或腎細胞。
可製造該藥物以供用於治療慢性淋巴細胞白血病、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血症或卡波西氏肉瘤。
另一實施例涵蓋本發明抗體之用途，其用於製造誘導清除外周B細胞之藥物，其中該藥物中之抗體或抗原結合片段與人類細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原之結合誘導清除該等細胞。
可製造該藥物以供用於治療患有免疫病症之個體。
可製造該藥物以供用於治療類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡。
另一實施例涵蓋本發明抗體之用途，其用於製造治療個體之類風濕性關節炎之藥物。
可製造該藥物以供用於在該個體中抑制B細胞分化及抗體同型轉換。
可製造該藥物以供用於在該個體之T細胞及巨噬細胞中抑制細胞因子及趨化因子產生及黏著分子上調。
可製造該藥物以供用於在該個體中抑制樹突細胞活化。
可製造該藥物以供用於在該個體之非免疫細胞中抑制促發炎細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素之產生及下調黏著分子。
在某些實施例中，將該藥物製造為組合藥物以與包含投與甲胺喋呤及/或投與Enbrel/Humira之方案組合投與。
在其他實施例中，將該藥物製造為組合藥物且該藥物除包含本發明抗體外另外包含抗TNF藥劑。
現已公認CD40介導之信號傳導參與多種目標病症。儘管可獲得許多臨床前數據顯示在該等病症中之干預將在治療上有益，但業內仍需要可用於治療自體免疫性疾病之拮抗性抗CD40抗體。本發明之較佳實施例係關於識別CD40之人類化抗體。在具體實施例中，已基於某些主要小鼠抗體之序列確定了該等人類化抗體之序列。
術語「CD40」及「CD40表面抗原」係指在正常及腫瘤性B細胞表面上表現之約48kD糖蛋白，其用作信號受體參與細胞增殖及分化(Ledbetter等人，1987,J. Immunol.138:788-785)。已自文庫分離編碼CD40之cDNA分子，該文庫係自伯基特淋巴瘤細胞系Raji製備(Stamenkovic等人，1989,EMBOJ. 8:1403)。
本文所用內源性表現CD40之細胞係特徵為表面表現CD40之任何細胞，包括(但不限於)正常及腫瘤性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌瘤細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞及骨髓源漿細胞。在一些實施例中，CD40分子係人類CD40分子。
本發明抗體與人類重組及天然CD40特異性結合。人類化單株抗體，其中該抗體與人類CD40特異性結合，其在B細胞增殖中具有IC50小於1 nM之拮抗活性且在高達100 μg/ml濃度下不具有激動作用，且其中該抗體之特徵另外在於，該抗體在非人靈長類中之活體內半衰期係至少10天。
較佳地，抗體與CD40在CD40-Fc偶聯物中以小於1 nM之EC50特異性結合，且與CD40在表現CD40之細胞中以小於2.5 nM之EC50特異性結合。抗體之拮抗性特性定義為其B細胞或樹突細胞拮抗活性IC50小於1 nM。抗體另外具有較優藥物代謝動力學特性，其活體內半衰期相對於其他抗CD40抗體(例如，抗CD40抗體4D11)有所延長。
本文所用表現CD40之細胞係特徵為表面表現CD40之任何細胞，包括(但不限於)正常及腫瘤性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌瘤細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞及骨髓源漿細胞。在一些實施例中，CD40分子係人類CD40分子。
本發明抗體識別特異性「CD40抗原表位」及「CD40表位」。本文所用該等術語係指能與抗CD40抗體具有免疫反應性之分子(例如，肽)或分子片段，且包括(例如)可由具有以下重鏈/輕鏈序列組合之任一抗體識別之CD40抗原決定簇：輕鏈SEQ ID NO.26與重鏈SEQ ID NO: 27、28、29或30中之任一者；或輕鏈SEQ ID NO: 31與重鏈SEQ ID NO 32、33、34或35中之任一者；或輕鏈SEQ ID NO 36與重鏈SEQ ID NO 37、38、39或40中之任一者。CD40抗原表位可包括在蛋白質、蛋白質片段、肽或類似物中。最常見表位係蛋白質、短寡肽、寡肽模擬物(即，模擬CD40抗原之抗體結合特性之有機化合物)或其組合。
抗體或免疫球蛋白之一般化結構為熟習此項技術者所熟知，該等分子係通常為約150,000道爾頓之異四聚糖蛋白，其由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈組成。每個輕鏈藉由一個二硫鍵與重鏈共價連接而形成異二聚體，且異四聚分子係經由異二聚體中兩個相同重鏈之間之共價二硫鍵來形成。儘管輕鏈及重鏈係藉由一個二硫鍵連接在一起，但兩個重鏈之間之二硫鍵數可隨免疫球蛋白同型而變。每一重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫鍵。每一重鏈在胺基末端具有可變域(VH )，之後係三個或四個恆定域(CH1 、CH2 、CH3 及CH4 )，以及CH1 與CH2 之間之鉸鏈區。每一輕鏈具有兩個域，即胺基末端可變域(VL )及羧基末端恆定域(CL )。VL 域與VH 域非共價結合，而CL 域一般經由二硫鍵與CH1 域共價連接。人們相信，特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成介面(Chothia等人，1985,J. Mol. Biol. 186:651-663)。
在不同抗體之間，可變域內之某些域廣泛不同，即具有「超變性」。該等超變域含有直接參與每一特定抗體與其特異性抗原決定簇之結合及特異性之殘基。輕鏈可變域與重鏈可變域二者中之超變性均集中於三個稱作互補決定區(CDR)或超變環(HVL)之區段中。CDR係在以下文獻中藉由序列對比來定義：Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.；而HVL係根據可變域之三維結構在結構上定義，如Chothia及Lesk,1987,J. Mol. Biol. 196: 901-917中所述。其中該兩種方法鑑別之CDR略有不同，結構定義較佳。如由Kabat所定義，在輕鏈可變域中，CDR-L1大致位於殘基24-34處，CDR-L2大致位於殘基50-56處，且CDR-L3大致位於殘基89-97處；在重鏈可變域中，CDR-H1大致位於殘基31-35處，CDR-H2大致位於殘基50-65處，且CDR-H3大致位於殘基95-102處。重鏈及輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3由此界定對於給定抗體具有特異性之獨特功能特性。
每一重鏈及輕鏈內之三個CDR係由框架區(FR)來間隔，框架區含有可變性通常較低之序列。自重鏈及輕鏈可變域之胺基末端至羧基末端，FR及CDR係以以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR之較大β-摺疊構型使每一鏈內之CDR彼此緊鄰且與另一鏈中之CDR緊鄰。所得構象有助於抗原結合位點(參見Kabat等人，1991,NIH Publ.第91-3242號，第I卷，第647-669頁)，但並非所有CDR殘基皆必須直接參與抗原結合。
FR殘基及Ig恆定域並不直接參與抗原結合，但有助於抗原結合及/或介導抗體效應子功能。人們認為，一些FR殘基以至少三種方式對抗原結合產生顯著效應：直接與表位非共價結合，與一或多個CDR殘基相互作用，及影響重鏈及輕鏈之間之介面。恆定域並不直接參與抗原結合，但介導各種Ig效應子功能，例如介導抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
可基於恆定域之胺基酸序列將脊椎動物免疫球蛋白之輕鏈分配至兩個顯著不同之種類(卡帕(κ)及蘭布達(λ))中之一類。藉由比較，根據恆定域之序列將哺乳動物免疫球蛋白之重鏈分配至五個主要類別中之一類中：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。將IgG及IgA進一步分為亞類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同免疫球蛋白種類之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。各天然免疫球蛋白種類之亞單元結構及三維構型為人所熟知。
本文所用術語「抗體」、「抗CD40抗體」、「人類化抗CD40抗體」及「變體人類化抗CD40抗體」具有最廣泛含義且明確涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及表現期望生物學活性(例如CD40結合)之抗體片段(例如可變域及抗體之其他部分)。
術語「單株抗體」(mAb)係指實質上均質之抗體群中之抗體，即該群中之個別抗體除可能少量存在之天然突變外均相同。單株抗體針對單一抗原決定簇(即「表位」)具有高度特異性。因此，修飾詞「單株」指示實質上均質且針對相同表位之抗體群，且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。應理解，單株抗體可藉由業內已知之任何技術或方法來製備；包括(例如)雜交瘤方法(Kohler等人，1975,Nature 256:495)，或業內已知之重組DNA方法(例如，參見美國專利第4,816,567號)，或使用噬菌體抗體文庫藉由以下文獻中所述技術分離以重組方式產生之單株抗體之方法：Clackson等人，1991,Nature 352: 624-628；及Marks等人，1991,J. Mol. Biol. 222: 581-597。
嵌合抗體係由來自一物種(例如，非人哺乳動物，例如小鼠)之抗體重鏈及輕鏈可變區及另一物種(例如，人類)抗體之重鏈及輕鏈恆定區組成，且可藉由以下方式來獲得：連接來自第一物種(例如，小鼠)之編碼抗體可變區之DNA序列與來自第二物種(例如人類)之編碼抗體恆定區之DNA序列，並用含有該等經連接序列之表現載體轉化宿主，從而使其可產生嵌合抗體。或者，嵌合抗體亦可係重鏈及/或輕鏈中之一或多個區域或域與來自另一免疫球蛋白種類或同型之單株抗體中之對應序列相同、同源或係其變體、或來自共有序列或種系序列者。嵌合抗體可包括該等抗體之片段，前提係抗體片段表現其親代抗體之期望生物學活性，例如與相同表位結合(例如，參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1984,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855)。
術語「抗體片段」、「抗CD40抗體片段」、「人類化抗CD40抗體片段」、「變體人類化抗CD40抗體片段」係指全長抗CD40抗體之一部分，其中保留可變區或功能能力，例如特異性CD40表位結合。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、雙鏈抗體、線性抗體、單鏈抗體、微小抗體、自抗體片段形成之雙鏈抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。
可用諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶處理全長抗體以生成可用抗體片段。使用木瓜蛋白酶消化來產生兩個相同的稱作「Fab」片段之抗原結合抗體片段(各自具有單一抗原結合位點)及殘留「Fc」片段。Fab片段亦含有輕鏈恆定域及重鏈CH1 域。胃蛋白酶處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能交聯抗原。
Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在CH1 域之C末端存在額外殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。F(ab')2 抗體片段係藉由鉸鏈區中之半胱胺酸殘基連接之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
「Fv」片段含有完整抗原識別及結合位點，該位點係由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域呈緊密非共價連接之二聚體組成。在此構造中，每一可變域之三個CDR相互作用，從而在該VH -VL 二聚體之表面上界定抗原結合位點。該六個CDR共同賦予該抗體抗原結合特異性。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段係包含抗體VH 及VL 域之單鏈Fv變體，其中該等域存於單一多肽鏈中。單鏈Fv能識別並結合抗原。scFv多肽亦可視需要含有位於VH 域與VL 域之間之多肽連接體，以促進scFv形成用於抗原結合之期望三維結構(例如，參見Pluckthun,1994,In The Pharmacology of monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York,第269-315頁)。
其他已識別抗體片段包括彼等包含串聯Fd區段(VH -CH1 -VH -CH1 )對以形成抗原結合區對者。該等「線性抗體」可為雙特異性或單特異性，如(例如)Zapata等人，1995,ProteinEng. 8(10):1057-1062中所述。
人類化抗體或人類化抗體片段係特定類型之嵌合抗體，其包括免疫球蛋白胺基酸序列變體或其片段，其能結合預定抗原，且其包含一或多個實質上具有人類免疫球蛋白胺基酸序列之FR及一或多個實質上具有非人類免疫球蛋白胺基酸序列之CDR。此非人類胺基酸序列通常稱作「輸入」序列，通常取自「輸入」抗體域，尤其可變域。通常，人類化抗體至少包括非人類抗體之CDRs或HVLs，插入人類重鏈或輕鏈可變域之FRs之間。本發明闡述特定人類化抗CD40抗體，其含有表3及4所示源自鼠類單株抗體之CDRs插入人類種系序列重鏈及輕鏈可變域之FRs之間。應理解，某些鼠類FR殘基可能對人類化抗體之功能重要，且因此將某些人類種系序列重鏈及輕鏈可變域殘基修飾以與對應鼠類序列中之彼等相同。
在另一態樣中，人類化抗CD40抗體包含實質上所有至少一個(通常兩個)可變域(諸如含於例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中者)，其中所有或實質上所有CDRs對應於非人類免疫球蛋白之CDRs，且在本文中特別是所有CDRs係本文下表1至4中所詳述之鼠類序列，且所有或實質上所有FRs係人類免疫球蛋白共有序列或種系序列之FRs。在另一態樣中，人類化抗CD40抗體亦包括免疫球蛋白Fc區之至少一部分，通常係人類免疫球蛋白中者。通常，抗體含有輕鏈以及至少重鏈可變域二者。若適宜，抗體亦可包括重鏈CH1 、鉸鏈、CH2 、CH3 及/或CH4 區中之一或多者。
人類化抗CD40抗體可選自任一種類免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任一同型(包括IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 )。舉例而言，恆定域可係補體固定之恆定域，其中期望人類化抗體表現細胞毒性活性，且同型通常係IgG1 。倘若不期望該細胞毒性活性，則恆定域可為另一同型，例如IgG2 。替代性人類化抗CD40抗體可包含來自不止一種免疫球蛋白種類或同型之序列，且熟習此項技術者可熟練選擇特定恆定域來優化期望效應子功能。在具體實施例中，本發明所提供抗體係IgG1抗體，且更具體而言係剔除效應子功能之IgG1抗體。
人類化抗CD40抗體之FR及CDR或HVL不需要與親代序列精確對應。舉例而言，可藉由取代、插入或缺失來改變(例如，誘變處理)輸入CDR或HVL或共有或種系FR序列中之一或多個殘基，從而使得所得胺基酸殘基與任一親代序列中對應位置之原始殘基不再相同，但抗體仍保留與CD40結合之功能。該改變通常可並非廣泛改變且可係保守改變。通常，至少75%人類化抗體殘基可與親代共有或種系FR及輸入CDR序列中之彼等殘基對應，更通常有至少90%、且最通常有超過95%或超過98%或超過99%之殘基對應。
影響重鏈與輕鏈可變區之間之介面(「VL -VH 介面」)之免疫球蛋白殘基係彼等影響兩條鏈相對於彼此之接近或定向者。某些可能參與鏈間相互作用之殘基包括VL 殘基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98以及VH 殘基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103(採用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda，Md.,1987)中所述之編號系統)。美國專利第6,407,213號亦論述，諸如VL 殘基43及85以及VH 殘基43及60等殘基亦可能參與此相互作用。儘管僅針對人類IgG闡述該等殘基，但其亦適用於其他物種。選擇合理地預期參與鏈間相互作用之重要抗體殘基用於共有序列中之取代。
術語「共有序列」及「共有抗體」係指在任一特定種類、同型或亞單元結構之所有免疫球蛋白(例如人類免疫球蛋白可變域)中之每一位置包含最常出現之胺基酸殘基的胺基酸序列。共有序列可係基於特定物種或多個物種之免疫球蛋白。「共有」序列、結構或抗體可理解為涵蓋某些實施例中所述之共有人類序列，且係指在任一特定種類、同型或亞單元結構之所有人類免疫球蛋白中之每一位置包含最常出現之胺基酸殘基之胺基酸序列。因此，共有序列含有在每一位置具有存於一或多種已知免疫球蛋白中之胺基酸之胺基酸序列，但其可能並不完全複製任一單一免疫球蛋白之整個胺基酸序列。可變區共有序列並非係自任何天然產生之抗體或免疫球蛋白及其變體獲得(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)。重鏈及輕鏈共有序列及其變體之FR為人類化抗CD40抗體之製備提供可用序列。例如，參見美國專利第6,037,454號及第6,054,297號。
人類種系序列天然存於人類種群中。該等種系基因之組合產生抗體多樣性。抗體輕鏈之種系抗體序列來自保守人類種系κ或λ v-基因及j-基因。類似地，重鏈序列來自種系v-、d-及j-基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G，「The Immunoglobulin Facts Book」Academic Press,2001)。
本文所用「變體」、「抗CD40變體」、「人類化抗CD40變體」或「變體人類化抗CD40」各自係指人類化抗CD40抗體，其至少具有來自SEQ ID NO: 1至4中任一序列之重鏈可變鼠類CDR，或源自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中任一者所示之鼠類單株抗體之輕鏈鼠類CDR序列，及源自人類共有序列之FR序列。變體包括彼等在輕鏈或重鏈可變域之一者或兩者中具有一或多處胺基酸變化者，前提係該等胺基酸變化不會實質上損害抗體與CD40之結合。本文所產生之實例性人類化抗體包括彼等稱為抗體A、抗體B及抗體C者，且其各重鏈及輕鏈序列展示於SEQ ID NO 26至SEQ ID NO:40中。
「經分離」抗體係已經鑑別且已自其天然環境組份中分離及/或回收之抗體。抗體天然環境中之污染物組份係彼等可干擾抗體之診斷性或治療性應用之材料，且可係酶、激素或其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在一態樣中，可將抗體純化至以抗體重量計分離度至少大於95%。
由於抗體天然環境中之至少一種組份不會存在，故分離抗體包括產生其之重組細胞內之原位抗體。然而，分離抗體通常可藉由至少一個純化步驟來製備，其中移除重組細胞材料。
術語「抗體性能」係指有助於抗體識別抗原或抗體之活體內效力之因素。抗體胺基酸序列之變化可影響諸如摺疊等抗體特性，且可影響諸如以下等物理因素：抗體與抗原結合之初始速率(ka )、抗體與抗原之解離常數(kd )、抗體對抗原之親和常數(Kd)、抗體構象、蛋白質穩定性及抗體半衰期。
本文所用術語「經表位標記」係指抗CD40抗體與「表位標籤」融合。「表位標籤」係具有足量胺基酸以為抗體產生提供表位之多肽，且其經設計以使得其不干擾人類化抗CD40抗體之期望活性。表位標籤通常具有充分獨特性以使得針對該表位標籤產生之抗體實質上不會與其他表位交聯。適宜標籤多肽一般含有至少6個胺基酸殘基且通常含有約8至50個胺基酸殘基或約9至30個殘基。表位標籤及結合表位之抗體之實例包括流感HA標籤多肽及其抗體12CA5(Field等人，1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165)；c-myc標籤及其8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體(Evan等人，1985,Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616)；及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標籤及其抗體(Paborsky等人，1990,Protein Engineering 3(6): 547-553)。在某些實施例中，表位標籤係「補救受體結合表位」。本文所用術語「補救受體結合表位」係指IgG分子(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )Fc區中之表位，其負責延長IgG分子之活體內血清半衰期。
在一些實施例中，本發明抗體可與細胞毒性劑偶聯。細胞毒性劑係抑制或阻止細胞機能及/或引起細胞破壞之任何物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如I131 、I125 、Y90 及Re186 )、化學治療藥劑及毒素(例如細菌、真菌、植物或動物源酶活性毒素)及其片段。該等細胞毒性劑可藉由標準程序與本發明人類化抗體偶合，且其可用於(例如)治療適用抗體療法之患者。
「化學治療藥劑」係可用於治療癌症之化學化合物。化學治療藥劑有多種實例可與本發明治療性抗體偶聯。該等化學治療藥劑之實例包括烷基化劑，例如噻替哌(thiotepa)及環磷醯胺；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及烏得哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基密胺，包括六甲密胺(altretamine)、三伸乙基密胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫化磷醯胺及三羥甲基密胺；番荔枝內酯(acetogenin)(尤其係布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑制素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包括其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin))；克利特非辛(cryptophycin)(尤其係克利特非辛1及克利特非辛8)；多拉司他汀(dolastatin)；奧瑞斯他汀(auristatin)(包括類似物單甲基-奧瑞斯他汀E及單甲基-奧瑞斯他汀F)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CBI-TMI)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)；曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其係卡奇黴素γ1I及卡奇黴素φI1(例如，參見Agnew,Chem. Intl. Ed. Engl.,33:183-186)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，例如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素發色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)(AdriamycinTM )(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(例如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；乙醯葡醛酸內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布希(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(eflornithine)；依利乙銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美坦辛(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)及柄型菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；尼群克林(nitraerine)；噴托他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；口比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細格孢氮雜酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其係T-2毒素、疣皰菌素A(verrucarin A)、杆孢菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethane)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶薩托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替哌；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多西紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)(GemzarTM )；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)(NavelbineTM )；諾安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶口令(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；及上述藥劑中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，例如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM )、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、鹽酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FarestonTM )；抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中之雌激素產生，例如4(5)-咪唑、胺魯米特、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MegaceTM )、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RivisorTM )、來曲唑(letrozole)(FemaraTM )及阿那曲唑(anastrozole)(ArimidexTM )；及抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述藥劑中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。該等藥劑中之任何一或多者可與本發明人類化抗體偶聯以提供可用於治療各種病症之治療藥劑。
亦可使抗體與前藥偶聯。「前藥」係醫藥活性物質之前體或衍生物形式，其對腫瘤細胞之細胞毒性與母體藥物相比較小，且能酶促活化或轉化為活性更強之形式。例如，參見Wilman,1986,「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」，Biochemical Society Transactions,14，第375-382頁，615th Meeting Belfast；及Stella等人，1985，「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」，Directed Drug Delivery,Borchardt等人(編輯)，第247-267頁，Humana Press。可用前藥包括(但不限於)含有磷酸根之前藥、含有硫代磷酸根之前藥、含有硫酸根之前藥、含有肽之前藥、經D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含有β-內醯胺之前藥、含有視需要經取代之苯氧基乙醯胺之前藥及含有視需要經取代之苯基乙醯胺之前藥、5-氟胞嘧啶前藥及其他5-氟尿苷前藥，其可轉化成具有更高活性之無細胞毒性藥物。可衍生為前藥形式之細胞毒性藥物之實例包括(但不限於)彼等上文所述之化學治療藥劑。
出於診斷性以及治療性監測目的，亦可使本發明抗體與標記(單獨之標記或標記及額外第二藥劑(前藥、化學治療藥劑及諸如此類))偶聯。標記與其他第二藥劑不同，其係指可檢測化合物或組合物藥劑，且其可與本發明人類化抗體直接或間接偶聯。標記可係自身可檢測(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記情況下，標記可催化受質化合物或組合物發生可檢測之化學變化。可製備經標記人類化抗CD40抗體並用於各種應用中，包括活體外及活體內診斷學。
可將本發明抗體調配為脂質體製劑之一部分以實現其活體內遞送。「脂質體」係由各種類型之脂質、磷脂及/或表面活性劑組成之小囊泡。脂質體可用於向哺乳動物遞送化合物或調配物，例如本文所揭示之人類化抗CD40抗體，該抗體視需要與一或多種醫藥活性藥劑及/或標記偶合或組合。脂質體之組份通常以雙層結構排列，此與生物膜之脂質排列類似。
本發明某些態樣係關於分離核酸，其編碼本發明人類化抗體之一或多個域。「經分離」核酸分子係自至少一種污染物核酸分子鑑別並分離之核酸分子，其在抗體核酸之天然來源中通常與該污染物核酸分子相結合。分離核酸分子與存於天然細胞中之核酸分子不同。
在本發明各態樣中，重組表現人類化抗體之一或多個域。該重組表現可採用一或多種控制序列，即在特定宿主有機體中表現可操作連接之編碼序列所需之多核苷酸序列。適用於原核細胞中之控制序列包括(例如)啟動子、操縱子及核糖體結合位點序列。真核控制序列包括(但不限於)啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。該等控制序列可用於在原核及真核宿主細胞中表現及產生人類化抗CD40抗體。
在使核酸序列與另一核酸序列具有功能性聯繫時，該核酸序列經「可操作連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列與編碼該多肽之核酸可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列轉錄，則該啟動子或增強子與該序列可操作連接；或若核糖體結合位點之定位可促進轉譯，則該核糖體結合位點與該編碼序列可操作連接。通常，「可操作連接」意指所連接DNA序列係鄰接序列，且在分泌前導序列情形下係鄰接序列且位於閱讀框內。然而，增強子視需要鄰接。可藉由在便捷之限制位點處接合來完成連接。若不存在該等位點，則可使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。
本文所用措辭「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有該等名稱皆包括其子代。因此，「轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物而不考慮轉移次數。
用於治療目的之術語「哺乳動物」係指任何歸類為哺乳動物之動物，包括人類、家畜及農場動物，以及動物園動物、運動用動物或寵物，例如狗、馬、貓、牛及諸如此類。較佳地，哺乳動物係人類。
本文所用「病症」係可受益於使用本文所述人類化抗CD40抗體治療之任何病況。該術語包括慢性及急性病症或疾病，包括彼等使哺乳動物易患所述病症之病理學病況。本文欲治療之非限制性實例或病症包括癌症、骨髓惡性腫瘤、良性及惡性腫瘤、白血病及淋巴惡性腫瘤及發炎、血管生成性、自體免疫性及免疫性病症。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中特徵通常在於細胞生長失調之生理學病況。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。
本文所用術語「CD40相關病症」或「CD40相關疾病」係指需要改良或消除表現CD40之細胞之病況。該等病況包括顯示異常增殖之表現CD40之細胞或與癌性或惡性生長有關之表現CD40之細胞。更具體而言，顯示異常表現CD40抗原之癌症之實例包括B類淋巴母細胞、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、骨肉瘤、表皮及內皮腫瘤、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、頭頸癌、皮膚癌(黑色素瘤)、膀胱癌及腎癌。該等病症包括(但不限於)白血病、淋巴瘤(包括B細胞淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤)、多發性骨髓瘤、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血症；實體腫瘤，包括肉瘤(例如骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma))、惡性黑色素瘤、腺癌(包括卵巢腺癌)、卡波西氏肉瘤/卡波西氏腫瘤及鱗狀細胞癌。
CD40相關病症亦包括免疫系統疾病及病症，例如自體免疫病症及發炎病症。該等病況包括(但不限於)類風濕性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮症、休格連氏症候群、多發性硬化症、牛皮癬、發炎腸病(例如，潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、肺炎症、哮喘及特發性血小板減少性紫癜(ITP)。
本文所用片語「停滯......生長」或「生長抑制性」係指抑制細胞、尤其表現CD40抗原之腫瘤性細胞類型之生長或增殖。因此，生長抑制(例如)顯著降低S期腫瘤性細胞之百分比。
術語「靜脈內輸注」係指在動物或人類患者靜脈中經大於約15分鐘、一般介於約30至90分鐘之間之一段時間引入藥劑。
術語「靜脈內濃注」或「靜脈內推注」係指將藥物投與至動物或人類之靜脈中，從而使機體在約15分鐘或更短、一般5分鐘或更短時間內接受藥物。
術語「皮下投與」係指在動物或人類患者之皮膚下、較佳在皮膚與基底組織之間之囊內藉由自藥物貯器相對緩慢之持續遞送來引入藥物。將皮膚向上捏離或拉離基底組織可產生囊。
術語「皮下輸注」係指在動物或人類患者之皮膚下、較佳在皮膚與基底組織之間之囊內經一段時間(包括(但不限於)30分鐘或更短、或90分鐘或更短)藉由自藥物貯器相對緩慢之持續遞送來引入藥物。視需要，輸注可藉由皮下植入藥物遞送幫浦(植入動物或人類患者之皮膚下)來實施，其中該幫浦經預定時間段(例如30分鐘、90分鐘或跨越整個治療方案之時間段)遞送預定量之藥物。
術語「皮下濃注」係指在動物或人類患者之皮膚下投與藥物，其中濃注藥物遞送短於約15分鐘；在另一態樣中，短於5分鐘；且在另一態樣中，短於60秒。在另一態樣中，在皮膚與基底組織之間之囊內投與，其中該囊可藉由將皮膚向上掐離或拉離基底組織來產生。
所用術語「治療有效量」係指活性藥劑可解除或改善所治療病症之一或多種症狀之量。在此情況下，其係具有有益患者結果(例如生長停滯效應)或引起細胞缺失之量。在一態樣中，治療有效量具有細胞凋亡活性，或能誘導細胞死亡。在另一態樣中，治療有效量係指已顯示可有效(例如)減慢疾病進展之目標血清濃度。可端視欲治療病況以習用方式來量測功效。舉例而言，在特徵為表現CD40之細胞之腫瘤性疾病或病症中，可藉由評價至疾病進展時間或測定反應率來量測功效。
本文所用「治療」及「療法」及類似術語意欲包括針對疾病或病症之治療性以及預防性或抑制性措施，其產生任何臨床上期望或有益之效應，包括(但不限於)減輕或解除疾病或病症之一或多個症狀、使疾病或病症消退、減慢或停止疾病或病症之進展。因此，例如，術語治療包括在疾病或病症之症狀發作之前或之後投與藥劑，由此預防或消除疾病或病症之一或多個體徵。作為另一實例，該術語包括在疾病之臨床表現後投與藥劑，從而抵抗該疾病之症狀。此外，在發作後及在已出現臨床症狀後投與藥劑包含本文所用「治療」或「療法」，其中不論該治療是否引起疾病改善，投與皆影響疾病或病症之臨床參數，例如組織損傷度或轉移之量或程度。另外，只要單獨或與另一治療藥劑組合之本發明組合物與未使用人類化CD40抗體組合物時相比減輕或改善所治療病症之至少一個症狀，不論是否減輕該病症之所有症狀，該結果即應視為可有效治療潛在病症。
所用術語「包裝插頁」係指通常包括於治療產品商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、投與、禁忌症及/或關於使用該等治療產品之警告的資訊。
抗體
本文闡述並揭示人類化抗CD40抗體以及包含本發明一或多種人類化抗CD40抗體之組合物及製品。本文亦闡述包括人類化抗CD40抗體之抗原結合片段之結合劑。人類化抗CD40抗體及結合劑可停滯細胞生長，引起表現CD40之細胞缺失或誘導或引起針對靶細胞之細胞毒性或細胞抑制效應。人類化抗CD40抗體及結合劑可用於治療多種特徵為表現CD40表面抗原之細胞增殖之疾病或病症。人類化抗CD40抗體及CD40結合劑各自包括至少一個特異性識別CD40表位之部分(即，抗原結合片段)。
在初步表徵中，鼠類抗體係基於CD40結合表徵來選擇。
根據該等初始研究，選擇具有表1中所示以下重鏈可變區及表2中所示輕鏈可變區之鼠類抗體：
基於框架同源性、CDR結構、保守標準殘基、保守介面封裝殘基及其他參數來選擇每一小鼠前導序列之人類框架序列。
各種鼠類選擇抗體之鼠類重鏈及輕鏈CDR分別展示於表3及表4中：
上文所列示H-CDR1使用藉由Chothia編號系統編號之序列(Al-Lazikani等人，(1997) JMB 273,927-948)。序列之Kabats編號表示為上表CDR1及CDR2中殘基之粗斜體文字且IMGT編號顯示為加下劃線文字。2H11、10F2及19B10中每一者之H-CDR3序列係TTSYYVGTYGY (SEQ ID NO:77)且20E2之H-CDR3序列係ARQDGYRYAMDY (SEQ ID NO:78)。
同樣，表4中使用Chothia編號系統，且序列之Kabats編號表示為粗斜體文字且IMGT編號顯示為加下劃線文字。
選擇與嵌合親代Fab相比顯示較佳或相等結合之Fab來轉化為IgG。將來自20E2系列之純系轉化為兩個不同IgG模式：a) IgG4DM(雙重突變體(double mutant))在Fc/鉸鏈區具有兩處突變，Ser228Pro降低半分子形成且Leu235Glu進一步降低FcγR結合；b) IgG1KO(剔除(knock-out)效應子功能)在Fc區具有兩處突變Leu234Ala及Leu235Ala，其降低諸如FcγR及補體結合等效應子功能。兩種IgG模式皆闡述於文獻中。實例1更詳細地闡述三種候選者之人類化。該人類化之結果產生人類化抗體序列，其具有下文所展示之重鏈及輕鏈序列：
在一些實施例中，抗原結合片段可經由(例如)結合CD40表面抗原來(例如)阻斷增殖或停滯細胞生長或引起細胞之清除、死亡或其缺失。舉例而言，在T及B細胞惡性腫瘤中，在惡性細胞暴露於引起正常淋巴細胞活化之刺激物時，經常引發抗腫瘤效應(例如，生長停滯伴隨或不伴隨細胞缺失或細胞凋亡)。已觀察到此活化誘導之生長停滯具有經由抗原受體或共刺激受體之信號(例如，參見Ashwell等人，1987,Science 237:61；Bridges等人，1987,J. Immunol. 139:4242；Page及Defranco,1988,J. Immunol. 140:3717；及Beckwith等人，1990,J. Natl. Cancer Inst. 82:501)。由於抗體或可溶性配體之特異性結合，CD40刺激抑制B細胞淋巴瘤生長(例如，參見Funakoshi等人，1994,Blood 83:2787-2794)。以此方式抑制惡性細胞生長且針對CD40表面抗原之藥劑係適宜藥劑之實例。
CD40特異性藥劑包括人類化抗CD40抗體結合CD40之抗原結合片段(例如，人類CD40或其變體)。CD40特異性藥劑及抗體可視需要與細胞毒性或化學治療藥劑偶聯或融合。在人類化抗體結合CD40表面抗原並導致清除表現CD40之細胞類型之態樣中，結合之特徵一般在於尋靶至活體內CD40表面抗原細胞。適宜結合劑以足夠高親和性及/或親合力結合CD40抗原，從而使得CD40特異性藥劑可藉由特異性靶向表現抗原之細胞來用作治療藥劑。
在一些態樣中，人類化抗體使CD40配體與CD40之結合降低至少45%、至少50%、至少60%或至少75%或至少80%、或至少90%、或至少95%。
在一些實施例中，人類化抗CD40抗體(包括其抗原結合片段，例如重鏈及輕鏈可變域)包含源自上文所述CDR抗體A(重鏈序列=SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30；輕鏈序列=SEQ ID NO:26)、抗體B(重鏈序列=SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；或SEQ ID NO:35；輕鏈序列=SEQ ID NO:31)及抗體C(重鏈序列=SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40；輕鏈序列=SEQ ID NO:36)之殘基之胺基酸序列及源自人類免疫球蛋白框架區之胺基酸殘基。人類化抗CD40抗體視需要在共有或種系框架區包括特異性胺基酸取代。
在該等框架位置處之特異性胺基酸殘基取代可相對於藉由將CDR或HVL「直接交換」至人類種系框架區中形成之人類化抗體中所示者改良各方面抗體性能(包括結合親和性及/或穩定性)，如下文實例中所示。
在一些實施例中，本發明闡述具有重鏈(VH)序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4及輕鏈(VL)序列SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8(參見上文表1及2)之其他單株抗體。該等鼠類抗體之CDR序列展示於表3及4中，將該等CDR置於人類共有重鏈及輕鏈可變域之FR中可產生可用本發明人類化抗體。
在某些具體實施例中，本文所揭示人類化抗CD40抗體至少包含具有上文表1至4中所示鼠類單株抗體CDR或HVL之重鏈或輕鏈可變域及人類種系重鏈及輕鏈可變域之FR。在實例性實施例中，本文所產生人類化抗體係：抗體A、抗體B及抗體C，且其各重鏈及輕鏈序列展示於SEQ ID NO 26至SEQ ID NO:40中。
在具體實施例中，涵蓋具有以下之抗體：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中任一者之重鏈序列以及輕鏈序列SEQ ID NO:26。備選抗體包括具有以下之彼等：重鏈序列SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO SEQ ID NO:35以及輕鏈序列SEQ ID NO:31。在其他實施例中，提供具有以下之人類化抗體：重鏈序列SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40以及輕鏈序列SEQ ID NO:36。
該等序列之CDR展示於表3及4中。在具體實施例中，預計在該等實例性免疫球蛋白之間具有轉換CDR區(即，例如轉換用來自抗體C之類似CDR抗體A之一個或兩個CDR)之嵌合抗體可產生可用抗體。
在某些實施例中，人類化抗CD40抗體係抗體片段。上文已概述各種抗體片段且已研發出多種技術來產生該等抗體片段。可經由蛋白水解消化完整抗體來獲得片段(例如，參見Morimoto等人，1992,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人，1985,Science 229:81)。或者，可在重組宿主細胞中直接產生片段。舉例而言，可直接自大腸桿菌(E. coli)回收Fab'-SH片段，並實施化學偶合以形成F(ab')2 片段(例如，參見Carter等人，1992,Bio/Technology 10:163-167)。藉由另一方法，可直接自重組宿主細胞培養物中分離F(ab')2 片段。熟練從業者可瞭解產生抗體片段之其他技術。
某些實施例包括人類化抗CD40抗體之F(ab')2 片段，其包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中任一者之重鏈序列以及輕鏈序列SEQ ID NO:26。備選抗體包括具有以下之彼等：重鏈序列SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35以及輕鏈序列SEQ ID NO:31。在其他實施例中，提供具有以下之人類化抗體：重鏈序列SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40以及輕鏈序列SEQ ID NO:36。該等實施例可包括包含此一F(ab')2 之完整抗體。
在一些實施例中，抗體或抗體片段包括介導效應子功能之恆定區。恆定區可提供針對表現CD40之靶細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)反應。效應子域可為(例如)Ig分子之Fc區。通常，CD40結合劑募集及/或活化細胞毒性白血細胞(例如，天然殺傷(NK)細胞、吞噬作用細胞(例如，巨噬細胞)及/或血清補體組份)。
抗體之效應子域可來自任何適宜脊椎動物物種及同型。來自不同動物物種之同型介導效應子功能之能力不同。舉例而言，人類免疫球蛋白介導CDC及ADCC/ADCP之能力一般分別具有以下次序：IgMIgG1 IgG3 >IgG2 >IgG4 及IgG1 IgG3 >IgG2 /IgM/IgG4 。鼠類免疫球蛋白一般分別以以下次序來介導CDC及ADCC/ADCP：鼠類IgMIgG3 >>IgG2b >IgG2a >>IgG1 及IgG2b >IgG2a >IgG1 >>IgG3 。在另一實例中，鼠類IgG2a 介導ADCC，而鼠類IgG2a 及IgM二者介導CDC。
抗體修飾
人類化抗CD40抗體及藥劑可包括對人類化抗CD40抗體或其抗原結合片段之修飾。舉例而言，可期望在效應子功能方面修飾抗體，以增強抗體在治療癌症中之效力。一該修飾係將半胱胺酸殘基引入Fc區中，由此使得在此區域中可形成鏈間二硫鍵。由此生成之同二聚抗體可具有經改良之內化能力及/或增強之補體介導細胞殺傷及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。例如，參見Caron等人，1992,J. Exp Med. 176:1191-1195；及Shopes,1992,J. Immunol. 148:2918-2922。亦可使用異雙功能性交聯劑來製備具有增強之抗腫瘤活性之同二聚抗體，如Wolff等人，1993,Cancer Research 53:2560-2565中所述。或者，抗體可經改造以含有雙重Fc區，從而增強抗體之補體溶胞及ADCC能力。參見Stevenson等人，1989,Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230。
已藉由修改抗體Fc區之糖基化模式來生成支持ADCC之能力經改良之抗體。此係可能的，此乃因抗體在CH2 域中天冬醯胺殘基N297處之糖基化參與ADCC必需之IgG與Fcγ受體之間之相互作用。宿主細胞系已經改造以表現具有經改變糖基化(例如增加平分型N-乙醯葡萄糖胺或減少岩藻糖)之抗體。減少岩藻糖比增加平分型N-乙醯葡萄糖胺之存在更大程度地增強ADCC活性。另外，低岩藻糖抗體之ADCC增強與FcγRIIIa V/F多態性無關。
修飾抗體Fc區中之胺基酸序列係增強ADCC之糖基化改造之備選方案。已藉由廣泛突變分析來確定Fcγ受體在人類IgG1 上之結合位點。此導致生成具有Fc突變之人類化IgG1 抗體，該等突變提高對FcγRIIIa之結合親和性並增強活體外ADCC。另外，已獲得結合特性具有多種不同變更之Fc變體，例如與特異性FcγR受體之結合增強且與其他FcγR受體之結合不變或減小。
另一態樣包括免疫偶聯物，其包含與細胞毒性劑偶聯之人類化抗體或其片段，該細胞毒性劑係例如化學治療藥劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性偶聯物)。
上文已闡述可用於產生該等免疫偶聯物之化學治療藥劑。可用於形成可用免疫偶聯物之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石柱素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、石鹼草(Sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、線菌毒素(mitogellin)、侷限麴菌素、酚黴素、依諾黴素(enomycin)、單端孢黴烯及諸如此類。多種放射性核素可用於產生放射性偶聯之人類化抗CD40抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。
人類化抗CD40抗體與細胞毒性劑或化學治療劑之偶聯物可藉由已知方法使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、亞胺基硫(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)已二胺)、雙重氮衍生物(例如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可入Vitetta等人，1987,Science 238:1098中所述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰醯苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)係偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑。偶聯物亦可使用可裂解連接體來形成。
在另一實施例中，可將抗體與「受體」(例如抗生蛋白鏈菌素)偶聯以供用於腫瘤預靶向。在此程序中，將抗體-受體偶聯物投與患者，之後使用清除劑自循環移除未結合偶聯物，且隨後投與選擇性結合受體之「配體」(例如，抗生物素蛋白)，該配體與細胞毒性劑(例如，放射性核素)偶聯。
亦可將本文所揭示人類化抗CD40抗體調配為免疫脂質體。含有抗體之脂質體係藉由業內已知之方法來製備，例如以下文獻中所闡述：Epstein等人，1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688；Hwang等人，1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。循環時間延長之脂質體揭示於(例如)美國專利第5,013,556號中。
尤其有用之脂質體可使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物藉由反相蒸發法來生成。經由具有指定孔徑之濾膜擠出脂質體以獲得具有期望直徑之脂質體。可經由二硫化物互換反應使本文所揭示抗體之Fab'片段與脂質體偶聯，如Martin等人，1982,J. Biol. Chem. 257:286-288中所述。化學治療藥劑(例如多柔比星)視需要含於脂質體內。例如，參見Gabizon等人，1989,J. National Cancer Inst. 81(19):1484。
本文闡述並揭示之抗體亦可藉由使抗體與活化前藥之酶偶聯來用於ADEPT(抗體導向酶前藥療法)程序，該酶將前藥(例如，肽基化學治療藥劑)轉化為活性抗癌藥物。例如，參見WO 81/01145、WO 88/07378及美國專利第4,975,278號。可用於ADEPT之免疫偶聯物中之酶組份係能作用於前藥而將其轉化為活性更強之細胞毒性形式之酶。可用於ADEPT之具體酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶，其用於將含磷酸酯前藥轉化為游離藥物；芳基硫酸酯酶，其用於將含硫酸酯前藥轉化為游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其用於將非毒性5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷菌(Serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶及組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B及L)，其用於將含肽前藥轉化為游離藥物；D-內胺醯羧肽酶，其用於轉化含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶及神經胺酸酶，其用於將糖基化前藥轉化為游離藥物；β-內醯胺酶，其用於將經β-內醯胺衍生之藥物轉化為游離藥物；及青黴素醯胺酶，例如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶，其用於將胺氮處分別經苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生之藥物轉化為游離藥物。或者，可使用具有酶活性之抗體(「抗體酶」)來將前藥轉化為游離活性藥物(例如，參見Massey,1987,Nature 328: 457-458)。可藉由已知方法來製備抗體-抗體酶偶聯物以供將抗體酶遞送至腫瘤細胞群，例如，藉由使酶與上述人類化抗CD40抗體/異雙功能性交聯試劑共價結合來製備。或者，可使用重組DNA技術構造融合蛋白，其包含本文所揭示抗體之至少抗原結合區及與之相連之上述酶的至少功能活性部分(例如，參見Neuberger等人，1984,Nature 312:604-608)。
在某些實施例中，可期望使用人類化抗CD40抗體片段而非完整抗體以(例如)促進腫瘤滲透。可期望修飾抗體片段以延長其血清半衰期。此可藉由(例如)將補救受體結合表位納入抗體片段中來達成。在一方法中，可改變(例如，突變)抗體片段中之適宜區域，或可藉由(例如)DNA或肽合成將表位納入肽標籤中，隨後使該標籤在末端或在中部與抗體片段融合。例如，參見WO 96/32478。
在其他實施例中，亦包括人類化抗CD40抗體之共價修飾。共價修飾包括對以下基團之修飾：半胱胺醯基殘基、組胺醯基殘基、離胺醯基及胺基末端殘基、精胺醯基殘基、酪胺醯基殘基、羧基側基團(天冬胺醯基或麩胺醯基)、麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基或絲胺醯基或蘇胺醯基殘基。另一共價修飾類型涉及使糖苷與抗體化學或酶促偶合。若適用，該等修飾可藉由化學合成或藉由抗體之酶促或化學裂解來製備。可藉由使抗體之靶向胺基酸殘基與能與所選側鏈或胺基-或羧基-末端殘基反應之有機衍生劑反應來將抗體之其他共價修飾類型引入分子中。
抗體上存在之任何碳水化合物部分之移除可以化學或酶促方式來完成。化學去糖基化闡述於以下文獻中：Hakimuddin等人，1987,Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人,1981,Anal. Biochem.,118:131。抗體上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用多種內切糖苷酶及外切糖苷酶來達成，如Thotakura等人，1987,Meth. Enzymol 138:350中所述。
可用共價修飾之另一類型包含使抗體與多種非蛋白質性聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)中之一者以以下文獻中之一或多者所述之方式連接：美國專利第4,640,835號、美國專利第4,496,689號、美國專利第4,301,144號、美國專利第4,670,417號、美國專利第4,791,192號及美國專利第4,179,337號。
人類化及胺基酸序列變體
抗CD40抗體之胺基酸序列變體可藉由將適宜核苷酸變化引入抗CD40抗體DNA中或藉由肽合成來製備。該等變體包括(例如)本文實例中抗CD40抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構造物，前提係最終構造物具有期望特徵。胺基酸變化亦可改變人類化或變體抗CD40抗體之轉譯後過程，例如改變糖基化位點之數目或位置。
可用於鑑別抗CD40抗體中係較佳誘變位置之某些殘基或區域之方法稱作「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(Science,244:1081-1085(1989))中所述。此處，殘基或目標殘基群(例如帶電荷殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)已確定且經中性或帶負電荷胺基酸(通常係丙胺酸)取代以影響胺基酸與CD40抗原之相互作用。然後藉由在取代位點或針對取代位點引入另外或其他變體來改良彼等顯示對取代具有功能敏感性之胺基酸位置。因此，在預先確定引入胺基酸序列變異之位點時，突變本身之性質無需預先確定。舉例而言，為分析給定位點處突變之性能，在目標密碼子或區域處實施丙胺酸掃描誘變或隨機誘變並針對期望活性篩選所表現之抗CD40抗體變體。
胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基末端融合(長度介於一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽的範圍內)以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括與表位標籤融合之抗CD40抗體。抗CD40抗體分子之其他插入性變體包括酶或可提高抗體血清半衰期之多肽與抗CD40抗體N-或C-末端之融合。
另一類型之變體係胺基酸取代變體。該等變體在抗CD40抗體分子中移除至少一個胺基酸殘基並在該位置處插入不同殘基。用於取代誘變之最受關注的位點包括超變區，但亦涵蓋FR改變。保守取代展示於表5之「較佳取代」標題下。若該等取代引起生物活性改變，則可引入更重要之改變(命名為「實例性取代」，或如下文參照胺基酸種類所進一步闡述)，並篩選產物。
在蛋白質化學中，一般公認抗體之生物學特性可藉由選擇維持以下特性之效應顯著不同之取代來達成：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如呈摺疊或螺旋構象，(b)分子在靶位點處之電荷或疏水性，或(c)側鏈體積。根據常見側鏈特性將天然殘基分為以下各類：
(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性親水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)鹼性：asn、gin、his、lys、arg；
(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及
(6)芳香族：trp、tyr、phe。
非保守性取代使得需要將該等種類中一者之成員交換為另一種類。
亦可取代(一般用絲胺酸)維持人類化或變體抗CD40抗體之適當構象時未涉及之任何半胱胺酸殘基，從而提高分子之氧化穩定性，預防異常交聯，或提供與細胞毒性或細胞抑制化合物之已確認交聯點。相反，可將半胱胺酸鍵添加至抗體以提高其穩定性(尤其在抗體係諸如Fv片段等抗體片段時)。
一類取代型變體涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)中之一或多個超變區殘基。通常，所選用於進一步研發之所得變體可相對於產生該等變體之親代抗體具有改良之生物特性。產生該等取代型變體之便捷方法係使用噬菌體展示實施之親和性成熟。簡言之，使若干超變區位點(例如6至7個位點)突變以在每一位點產生所有可能的胺基酸取代。由此產生之抗體變體以單價方式以與每一顆粒內所封裝之M13基因III產物之融合形式自絲狀噬菌體顆粒展示出來。然後針對生物學活性(例如結合親和性)來篩選噬菌體展示之變體。為確定修飾之候選超變區位點，可實施丙胺酸掃描誘變以確定顯著促進抗原結合之超變區殘基。或者或另外，有利的是分析抗原-抗體複合物之晶體結構以確定抗體與人類CD40之間之接觸點。該等接觸殘基及附近殘基係本文所述技術之候選取代殘基。產生該等變體後，立即如本文所述對變體組進行篩選，且可選擇在一或多個相關分析中具有優良特性之抗體以供進一步研發。
抗體之另一類胺基酸變體改變抗體之原始糖基化模式。「改變」意指缺失一或多個存於抗體中之碳水化合物部分及/或添加一或多個抗體中不存在之糖基化位點。
在一些實施例中，可期望修飾本發明抗體以添加糖基化位點。抗體之糖基化通常係N-連接或O-連接。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺酸殘基側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外之任何胺基酸)係碳水化合物部分經酶連接至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，多肽中存在該等三肽序列中之任一者均可產生潛在糖基化位點。O-連接糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連接至羥基胺基酸，最常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。因此，為糖基化特定蛋白(例如抗體)，改造該蛋白質之胺基酸序列以含有上述三肽序列中之一或多者(對於N-連接糖基化位點)。亦可藉由一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加或取代於原始抗體序列中來改變(對於O-連接糖基化位點)。
編碼抗CD40抗體胺基酸序列變體之核酸分子係由業內已知之多種方法製備。該等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然胺基酸序列變體情況下)或藉由抗CD40抗體之預先製備之變體或非變體形式實施寡核苷酸介導(或定點)誘變、PCR誘變及盒式誘變製備。
多核苷酸、載體、宿主細胞及重組方法
其他實施例涵蓋包含編碼人類化抗CD40抗體之序列之分離多核苷酸、包含該多核苷酸之載體及宿主細胞，以及產生人類化抗體之重組技術。分離之多核苷酸可編碼抗CD40抗體之任何期望形式，包括例如全長單株抗體、Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段、雙鏈抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。
一些實施例包括包含編碼抗體或抗體片段之序列之分離多核苷酸，該抗體或抗體片段具有以下中之任一者之重鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40。一些實施例包括包含編碼抗體或抗體片段之序列之分離多核苷酸，該抗體或抗體片段具有輕鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:36。
在一態樣中，分離多核苷酸序列編碼抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區:SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:36。
包含編碼人類化抗CD40抗體或其片段或鏈之序列之多核苷酸可與一或多個業內已知調節或控制序列融合，且可含於業內已知之適宜表現載體或宿主細胞中。編碼重鏈或輕鏈可變域之每一多核苷酸分子皆可獨立地與編碼恆定域(例如人類恆定域)之多核苷酸序列融合，從而使得能產生完整抗體。或者，可使多核苷酸或其部分融合在一起，從而提供產生單鏈抗體之模板。
對於重組產生，將編碼抗體之多核苷酸插入可複製載體中以供選殖(擴增DNA)或表現。可使用多種適合表現重組抗體之載體。載體組份一般包括(但不限於)以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。
人類化抗CD40抗體亦可以融合多肽形式產生，其中抗體與異源多肽融合，例如信號序列或在成熟蛋白質或多肽之胺基末端具有特異性裂解位點之其他多肽。所選異源性信號序列通常係宿主細胞可識別及加工(即，藉由信號肽酶裂解)者。對於不能識別並加工人類化抗CD40抗體信號序列之原核宿主細胞而言，信號序列可由原核信號序列取代。信號序列可為(例如)鹼性磷酸酶、青黴素酶、脂蛋白、耐熱腸毒素II前導序列及諸如此類。對於酵母分泌，可用(例如)以下信號來取代天然信號序列：得自酵母轉化酶α-因子(包括酵母菌屬(Saccharomyces)及克魯維酵母屬(Kluyveromyces) α-因子前導序列)之前導序列、酸性磷酸酶、人白色念珠菌(C. albicans)葡糖澱粉酶或WO90/13646中所述之信號。在哺乳動物細胞中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列(例如單純皰疹病毒gD信號)。該前體區之DNA在閱讀框中與編碼人類化抗CD40抗體之DNA接合。
表現及選殖載體含有使載體能在一或多個所選宿主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列係使載體能獨立於宿主染色體DNA而複製者，且其包括複製起點或自主複製序列。用於多種細菌、酵母及病毒之該等序列為業內所熟知。來自質粒pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏(Gram)陰性細菌，2-υ質粒起點適用於酵母，且多種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV及BPV)可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組份(通常可僅使用SV40起點，此乃因其含有早期啟動子)。
表現及選殖載體可含有編碼可選擇標記物之基因以有助於對表現之鑑別。典型可選擇標記基因編碼如下蛋白質：賦予對抗生素或其他毒素(例如，胺苄西林(ampicillin)、新黴素、甲胺蝶呤或四環素)之抗性；或者，係營養缺陷之補體；或在其他備選方案中供應複合培養基中不存在之特定營養素，例如編碼桿菌(Bacilli)之D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇方案之一個實例利用藥物來停滯宿主細胞之生長。彼等經異源基因成功轉化之細胞產生賦予抗藥性之蛋白質，且因此可在該選擇方案中存活。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。哺乳動物細胞之常用可選擇標記物係彼等使得能鑑別可吸收編碼人類化抗CD40抗體之核酸之感受態細胞者，例如DHFR(二氫葉酸還原酶)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II(例如靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶及諸如此類。首先藉由在含有甲胺蝶呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉化體來鑒定經DHFR選擇基因轉化之細胞。在採用野生型DHFR時，適宜宿主細胞係DHFR活性缺陷之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如DG44)。
或者，經編碼抗CD40抗體、野生型DHFR蛋白及另一可選擇標記物(例如胺基葡萄糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))之DNA序列轉化或共轉化之宿主細胞(尤其含有內源性DHFR之野生型宿主)可藉由在含有針對該等可選擇標記物之選擇劑(例如胺基糖苷抗生素，例如卡那黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之培養基中使細胞生長來進行選擇。例如，參見美國專利第4,965,199號。
倘若使用酵母細胞作為宿主細胞來實施重組產生，則可使用存於酵母質粒YRp7中之TRP1基因(Stinchcomb等人，1979,Nature 282: 39)作為可選擇標記物。TRP1基因為缺少在色胺酸中生長之能力之酵母突變體菌株(例如，ATCC第44076號或PEP4-1)提供選擇標記物(Jones,1977,Genetics 85:12)。則酵母宿主細胞基因組中trp1損傷之存在可提供有效環境以藉由在不存在色胺酸時生長來檢測轉化。類似地，Leu2p缺陷型酵母菌株(例如ATCC 20,622或38,626)係藉由具有LEU2基因之已知質粒來補足。
另外，可使用得自1.6 μm環形質粒pKD1之載體來轉化克魯維酵母。或者，已報導用於大規模產生重組牛凝乳酶之表現系統可用於乳酸克魯維酵母(K. lactis.)(Van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135)。亦已揭示藉由克魯維酵母屬之工業菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白之穩定多拷貝表現載體(Fleer等人，1991,Bio/Technology 9:968-975)。
表現及選殖載體通常含有宿主有機體可識別且與編碼抗CD40抗體或其多肽鏈之核酸分子可操作連接之啟動子。適用於原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(例如tac啟動子)。其他已知細菌啟動子亦適宜。用於細菌系統之啟動子亦可含有與編碼人類化抗CD40抗體之DNA可操作連接之Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知多種真核啟動子序列。事實上，所有真核基因皆具有富AT區，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因之轉錄起始點上游70至80個鹼基處發現之另一序列係CNCAAT區，其中N可為任一核苷酸。在大多數真核基因之3'端處為AATAAA序列，其可能係向編碼序列之3'端添加聚A尾之信號。所有該等序列皆以適宜方式插入真核表現載體中。
適用於酵母宿主之啟動序列之實例包括以下酶之啟動子：3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、己糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡糖激酶。
誘導型啟動子之另一優點係藉由生長條件來控制轉錄。該等啟動子包括以下酶之酵母啟動子區：醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之衍生物酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸去氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶。用於酵母表現之適宜載體及啟動子進一步闡述於EP 73,657中。酵母增強子亦可有利地與酵母啟動子一起使用。
在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄人類化抗CD40抗體受(例如)自以下獲得之啟動子控制：病毒基因組，例如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、肝炎B病毒及猿猴病毒40(SV40)；異源性哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，前提係該等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子係便捷地以SV40限制性片段形式獲得，其亦含有SV40病毒複製起點。人類巨細胞病毒之立即早期啟動子係便捷地以HindIII E限制性片段形式獲得。使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改形式闡述於美國專利第4,601,978號中。亦可參見Reyes等人，1982,Nature 297:598-601，其揭示在來自單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表現人類p-干擾素cDNA。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)長末端重複序列作為啟動子。
可用於重組表現載體之另一可用元件係增強子序列，其用於提高高等真核生物中編碼人類化抗CD40抗體之DNA之轉錄。現已知多種增強子序列來自哺乳動物基因(例如珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括位於複製起點遲側(late side)上之SV40增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點遲側上之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。關於活化真核啟動子之增強元件之描述亦可參見Yaniv,1982,Nature 297:17-18。可將增強子剪接至載體中人類化抗CD40抗體編碼序列之5'或3'位置處，但較佳位於啟動子之5'位點。
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類細胞或來自其他多細胞有機體之有核細胞)中之表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。該等序列一般可自真核生物或病毒DNA或cDNA之5'及偶而3'非轉譯區獲得。該等區域含有在編碼抗CD40抗體之mRNA之非轉譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種可用轉錄終止組份係牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。在一些實施例中，人類化抗CD40抗體可使用CHEF系統來表現。(例如，參見美國專利第5,888,809號，其揭示內容係以引用方式併入本文中。)
在本文載體中選殖或表現DNA之適宜宿主細胞係上述原核細胞、酵母細胞或高等真核細胞。適用於此目的之原核生物包括真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷菌屬(例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans))及志賀氏菌屬(Shigella)，以及桿菌屬(例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如於1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41P))、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌)及鏈黴菌屬(Streptomyces)。一較佳大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌294(ATCC 31，446)，但其他菌株(例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325))亦適合。該等實例係例示性而非限制性。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母等真核微生物亦係人類化抗CD40抗體編碼載體之適宜選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見麵包酵母(baker's yeast)係最常用低等真核宿主微生物。然而，一般可使用多種其他屬、種及菌株且可用於本文中，例如裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬宿主，例如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克海姆克魯維酵母(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦爾特克魯維酵母(K. waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)及馬科斯克魯維酵母(K. marxianus)；子囊菌酵母屬(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；裏氏木黴菌(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙鏈孢黴菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，例如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，例如鏈孢黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及曲黴菌屬(Aspergillus)宿主(例如構巢麯黴(A. nidulans)及黑麯黴(A. niger))。
表現糖基化人類化抗CD40抗體之適宜宿主細胞得自多細胞有機體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞，包括(例如)多種杆狀病毒株及變體及來自諸如以下等宿主之對應許可昆蟲宿主細胞：草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白線斑蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)(蠶)。多種轉染用病毒株可自公開途徑獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV之L-1變體及家蠶NPV之Bm-5株，且該等病毒尤其可用於轉染草地貪夜蛾細胞。
亦可採用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙草之植物細胞培養物作為宿主。
在另一態樣中，人類化抗CD40之表現係在脊椎動物細胞中實施。脊椎動物細胞在培養(組織培養)中之繁殖已成為常規程序且技術隨處可得。可用哺乳動物宿主細胞系之實例係經SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人類胚腎系(293系或經亞選殖以供在懸浮培養中生長之293細胞，Graham等人，1977,J. Gen Virol. 36: 59)、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR1(CHO，Urlaub等人，1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例如DG44)、小鼠睪丸支持細胞(TM4,Mather,1980,Biol. Reprod. 23:243-251)、猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人類宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)、水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)、人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)、人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)、小鼠乳房腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)、TR1細胞(Mather等人，1982,Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68)、MRC 5細胞、FS4細胞及人類肝細胞瘤系(Hep G2)。
用上述用於產生人類化抗CD40抗體之表現或選殖載體來轉化宿主細胞，並在習用營養培養基中培養，該等營養培養基經修改以適於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼期望序列之基因。
可在多種培養基中培養用於產生本文所述人類化抗CD40抗體之宿主細胞。市售培養基適用於培養宿主細胞，例如Ham's F10(Sigma-Aldrich公司，St. Louis,Mo.)、最小必需培養基((MEM)，Sigma-Aldrich公司)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich公司)及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma-Aldrich公司)。另外，可使用以下文獻中之一或多者闡述之任一培養基來作為宿主細胞之培養基：Ham等人，1979,Meth. Enz. 58: 44；Barnes等人，1980,Anal. Biochem. 102: 255；美國專利第4,767,704號、美國專利第4,657,866號、美國專利第4,927,762號、美國專利第4,560,655號、美國專利第5,122,469號、WO 90/103430及WO 87/00195。該等培養基中之任一者可根據需要補加有激素及/或其他生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗生素(例如慶大黴素)、痕量元素(定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括其他補加物。諸如溫度、pH及諸如此類等培養條件係彼等先前用於所選表現用宿主細胞者，且對熟習此項技術者而言係顯而易見的。
在使用重組技術時，抗體可在細胞內、在壁膜間隙中產生，或直接分泌至培養基中。若在細胞內產生抗體，則作為第一步驟可使細胞破裂以釋放蛋白質。可藉由離心或超濾移除微粒碎片，即宿主細胞或溶解片段。Carter等人，1992,Bio/Technology 10:163-167闡述分離分泌至大腸桿菌壁膜間隙中之抗體之程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲磺醯氟(PMSF)存在下經約30分鐘使細胞糊劑解凍。可藉由離心移除細胞碎片。倘若抗體分泌至培養基中，則通常首先使用市售蛋白質濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自該等表現系統之上清液。在任一前述步驟中可包括諸如PMSF等蛋白酶抑制劑以抑制蛋白質水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。可使用多種方法自宿主細胞分離抗體。
可使用(例如)羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化自細胞製備之抗體組合物，其中親和層析係常用純化技術。蛋白質A作為親和配體之適合性取決於存於抗體中之任一免疫球蛋白Fc域之物種及同型。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(例如，參見Lindmark等人，1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13)。推薦蛋白質G用於所有小鼠同型及人類γ3(例如，參見Guss等人，1986 EMBO J. 5:1567-1575)。親和配體所附接之基質最經常為瓊脂糖，但亦可使用其他基質。機械上穩定之基質(例如定孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)使得可達成較使用瓊脂糖更快之流速及更短之處理時間。倘若抗體包含CH3 域，則Bakerbond ABXTM 樹脂(J. T. Baker,Phillipsburg,N.J.)可用於純化。端視欲回收抗體亦可使用其他蛋白質純化技術，例如在離子交換管柱上分級分離、乙醇沉澱、反相HPLC、在二氧化矽上層析、在肝素SEPHAROSETM 上層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬胺酸管柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱。
在任何初步純化步驟後，可使用pH介於約2.5至4.5之間之洗脫緩衝液對包含目標抗體及污染物之混合物實施低pH疏水作用層析，通常係在低鹽濃度(例如，約0-0.25 M鹽)下實施。
亦包括如本文所定義在低中及高嚴格性條件下與表示為編碼抗體或抗體片段之分離多核苷酸序列之核苷酸序列的全部或一部分(例如，編碼可變區之部分)雜交之核酸，該抗體或抗體片段具有分別包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:36。雜交核酸之雜交部分通常長至少15個(例如，20個、25個、30個或50個)核苷酸。雜交核酸之雜交部分與編碼抗CD40多肽(例如，重鏈或輕鏈可變區)或其補體的核酸之一部分或全部之序列至少80%(例如至少90%、至少95%或至少98%)一致。本文所述類型之雜交核酸可用作(例如)選殖探針、引物(例如PCR引物)或診斷探針。
一些實施例包括包含編碼抗體或抗體片段之序列的分離多核苷酸，該抗體或抗體片段具有與以下任一者之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之重鏈可變區胺基酸序列:SEQ ID NO: 1至4、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40。一些實施例包括包含編碼抗體或抗體片段之序列之分離多核苷酸，該抗體或抗體片段具有與以下任一者之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之輕鏈可變域胺基酸序列：SEQ ID NO:5至8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:36。
在一態樣中，分離多核苷酸序列編碼具有重鏈可變域及輕鏈可變區之抗體或抗體片段，該重鏈可變域及輕鏈可變區各自包括與如下抗體或抗體片段之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列：具有分別包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:36。
本文所用術語「一致」或「一致性百分比」在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中係指兩個或更多個序列或子序列在進行對比及對齊(以獲得最大對應性)時相同或有指定百分比之核苷酸或胺基酸殘基相同。為測定一致性百分比，將序列對齊以達成最佳對比目的(例如，可在第一胺基酸或核酸序列中引入空位以與第二胺基酸或核酸序列達成最佳對齊)。然後對比對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置與第二序列中之對應位置由相同胺基酸殘基或核苷酸佔據，則該等分子在該位置處一致。兩個序列之間之一致性百分比係該等序列所共有之一致性位置數目之函數(即，一致性%=一致性位置數/總位置數(例如，重疊位置數)x100)。在一些實施例中，所對比兩個序列在視需要(例如，不包括延伸出所對比序列外之額外序列)於序列內引入空位後長度相同。舉例而言，在對比可變區序列時，不考慮前導序列及/或恆定域序列。在兩個序列之間之序列對比中，「對應」CDR係指兩個序列中相同位置處之CDR(例如，每一序列之CDR-H1)。
兩個序列之間一致性百分比或相似性百分比之測定可使用數學算法來完成。用於對比兩個序列之數學算法之較佳非限制性實例係Karlin及Altschul之算法(1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)，其根據Karlin及Altschul,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877加以修改。此一算法已納入Altschul等人之NBLAST及XBLAST程式中(1990,J. Mol. Biol. 215:403-410)。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程式(分數=100，字長=12)來實施，從而獲得與編碼目標蛋白質之核酸同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可用XBLAST程式(分數=50，字長=3)來實施，從而獲得與目標蛋白質同源之胺基酸序列。出於對比目的，為獲得加空位對齊，可如Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所述來利用Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast來實施迭代搜索，其檢測分子之間之遠距離聯繫(同一文獻)。在利用BLAST、Gapped BLAST及PSI-Blast程式時，可使用各程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。用於對比序列之另一較佳非限制性實例係Myers及Miller之算法(CABIOS(1989))。此一算法已納入對齊程式(2.0版)中，其係GCG序列對齊軟體包之一部分。在利用對齊程式來對比胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘差表、等於12之空位長度罰分及等於4之空位罰分。用於序列分析之其他算法為業內已知且包括ADVANCE及ADAM，如Torellis及Robotti,1994,Comput. Appl. Biosci. 10:3-5中所述；及FASTA，如Pearson及Lipman,1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8中所述。在FASTA內，ktup係設定靈敏度及搜索速度之控制選項。若ktup=2，則藉由檢查對齊殘基對來發現所對比兩個序列中之相似區域；若ktup=1，則檢查單一對齊胺基酸。對於蛋白質序列，可將ktup設定為2或1，或對於DNA序列設定為1至6。若未指定ktup，則對於蛋白質預設值為2且對於DNA預設值為6。或者，蛋白質序列對齊可使用CLUSTAL W算法來實施，如Higgins等人，1996,Methods Enzymol.266：383-402所述。
非治療性應用
本文所述抗體可用作親和純化劑。在此方法中，使用業內熟知方法將抗體固定在諸如蛋白質A樹脂等固相上。使固定抗體與含有欲純化CD40蛋白(或其片段)之樣品接觸，且隨後用適宜溶劑洗滌載體，從而可移除樣品中除與固定抗體結合之CD40蛋白以外之實質上所有材料。最後，用另一適宜溶劑洗滌載體，從而可自抗體釋放CD40蛋白。
人類化抗CD40抗體亦可用於診斷性分析中以檢測及/或量化CD40蛋白，例如在特定細胞、組織或血清中檢測CD40表現。
在一些實施例中，例如處於診斷性目的，可有利地用可檢測部分標記抗體。可使用多種可檢測標記，包括放射性同位素、螢光標記、酶受質標記及諸如此類。可使用多種已知技術使標記與抗體間接偶聯。舉例而言，可使抗體與生物素偶聯，且可使上文所述三大類標記中之任一種與抗生物素蛋白偶聯，或反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結合，且標記由此可以該間接方式與抗體偶聯。或者，為達成標記與抗體之間接偶聯，可使抗體與較小半抗原(例如地高辛(digoxin))偶聯且使一種不同類型之上述標記與抗半抗原抗體(例如，抗地高辛抗體)偶聯。由此，可達成標記與抗體之間接偶聯。
實例性放射性同位素標記包括35 S、14 C、125 I、3 H及131 I。使用(例如)以下文獻中所述之技術可用放射性同位素標記抗體：Current Protocols in Immunology，第1及2卷，1991,Coligen等人編輯，Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs。可藉由(例如)閃爍計數來量測放射性。
實例性螢光標記包括得自以下之標記：稀土螯合物(銪螯合物)或螢光素及其衍生物、羅丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯(dansyl)、麗絲胺(Lissamine)、藻紅蛋白及德克薩斯紅(Texas Red)。可經由已知技術使螢光標記與抗體偶聯，例如Current Protocols in Immunology(上述文獻)中所揭示之彼等。可使用螢光計來量化螢光。
業內已知多種經充分表徵之酶-受質標記(例如，綜述參見美國專利第4,275,149號)。酶一般催化發色受質進行可使用各種技術量測之化學改變。舉例而言，改變可係可以分光光度計法量測之受質顏色變化。或者，酶可改變受質之螢光或化學發光。量化螢光變化之技術如上文所述。化學發光受質可藉由化學反應經電子激發，隨後可發射可使用(例如)化學發光計量測之光線或向螢光受體提供能量。
酶標記之實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶，美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸去氫酶、脲酶、過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶及諸如此類。偶聯酶與抗體之技術闡述於(例如)以下文獻中：O'Sullivan等人，1981,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，Methods in Enzym.(J. Langone及H. Van Vunakis編輯)，Academic pressmN.Y.,73: 147-166。
酶-受質組合之實例包括(例如)：辣根過氧化物酶(HRPO)與作為受質之過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB))；鹼性磷酸酶(AP)與作為發色受質之磷酸對硝基苯酯；及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Ga1)與發色受質(例如對硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶或螢光受質4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷酶)。
熟習此項技術者可瞭解多種其他酶-受質組合。該等組合之一般綜述參見美國專利第4,275,149號及美國專利第4,318,980號。
在另一實施例中，使用未標記人類化抗CD40抗體且用結合該人類化抗CD40抗體之經標記抗體來檢測。
本文所述抗體可用於任一已知分析方法中，例如競爭性結合分析、直接及間接三明治(sandwich)分析及免疫沉澱分析。例如，參見Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press公司，1987)。
診斷套組
人類化抗CD40抗體可用於診斷套組中，即預定量試劑與實施診斷分析之說明書之經包裝組合。倘若用酶標記抗體，則套組可包括酶所需受質及輔因子(例如提供可檢測發色團或螢光團之受質前體)。另外，可包括其他添加劑，例如穩定劑、緩衝液(例如封阻緩衝液或溶胞緩衝液)及諸如此類。各種試劑之相對量可大幅變化以使該等試劑在溶液中之濃度可顯著優化分析之靈敏度。試劑可以乾粉形式(通常經凍乾)提供，其包括在溶解後可使試劑溶液具有適宜濃度之賦形劑。
治療性應用
在另一實施例中，本文所揭示人類化抗CD40抗體可用於治療如本文所述各種與CD40之表現有關之病症。
人類化抗CD40抗體或藥劑係藉由任何適宜方式來投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內，且若需要局部免疫抑制治療，則實施病灶內投與(包括灌注或以其他方式使移植物在移植前與抗體接觸)。人類化抗CD40抗體或藥劑可以(例如)輸注或濃注形式來投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。另外，人類化抗CD40抗體係藉由脈衝輸注適當投與，尤其係以抗體之遞減劑量來投與。在一態樣中，藉由注射來實施投藥，最佳藉由靜脈內或皮下注射來投藥，此部分取決於投與係短期或長期投與。
在預防或治療疾病時，抗體之適宜劑量可取決於多種因素，例如如上文所定義欲治療疾病之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體之目的係預防性抑或治療性、先前治療、患者臨床史及對抗體之反應，以及主治醫師之決定。抗體係一次性或經一系列治療以適當方式投與患者。
端視疾病類型及嚴重程度，不論係(例如)藉由一或多次分開投與或藉由連續輸注來投與，向患者投與之抗體初始候選劑量為約1 μg/kg至20 mg/kg(例如0.1-15 mg/kg)。端視上文所提及之因素，典型日劑量可介於約1 μg/kg至100 mg/kg或更高範圍內。對於經數天或更長時間重複投與，端視病況，持續治療直至疾病症狀出現期望抑制。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可藉由習用技術及分析容易地監測。實例性劑量方案係揭示於WO 94/04188中者。
本文所用術語「抑制」在與「改善」及「減輕」相同之上下文中意指減少疾病之一或多個特徵。
可以與良好醫療實踐一致之方式對抗體組合物進行調配、配量及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。欲投與抗體之「治療有效量」可取決於該等因素，且係預防、改善或治療與CD40表現有關之病症所需之最小量。
抗體不必(但視需要)與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於人類化抗CD40抗體存於調配物中之量、病症或治療之類型及上述其他因素。該等其他藥劑通常以與上文所用相同之劑量及投與途徑來使用或係上文所用劑量之約1%至99%。
CD40相關病症
抗CD40抗體或藥劑可用於治療或預防表現CD40之癌症或特徵為(例如)因免疫細胞(例如，淋巴細胞或樹突細胞)之不當活化而表現CD40之免疫病症。該CD40之表現可歸因於(例如)CD40蛋白在細胞表面上之含量升高及/或所表現CD40之抗原性有所改變。根據本文所述方法對免疫病症之治療或預防係藉由向需要該治療或預防之個體投與有效量之抗CD40抗體或藥劑來達成，該抗體藉此(i)與表現CD40且與該疾病狀態相關之經活化免疫細胞結合，且(ii)對該經活化免疫細胞產生細胞毒性、細胞抑制性或免疫抑制性效應。
特徵為免疫細胞之不當活化且可藉由本文所述方法來治療或預防之免疫疾病可根據(例如)該病症之基礎超敏反應之類型來分類。該等反應通常可分為四類：過敏性反應、細胞毒性(細胞溶解性)反應、免疫複合物反應或細胞介導之免疫(CMI)反應(亦稱作遲髮型超敏(DTH)反應)。(例如，參見Fundamental Immunology(William E. Paul編輯，Raven Press,N.Y.，第3版，1993)。)
該等免疫疾病之具體實例包括以下疾病：類風濕性關節炎、自體免疫性去髓鞘疾病(例如，多發性硬化症、過敏性腦脊髓炎)、內分泌性眼病、葡萄膜視網膜炎、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、腎小球腎炎、自體免疫性血液病、發炎腸病(例如，克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)、過敏反應、過敏症反應、休格連氏症候群、I型糖尿病、原發性膽汁性肝硬化、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、纖維肌痛、多肌炎、皮肌炎、發炎肌炎、多發性內分泌不足、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、自體免疫性葡萄膜炎、艾迪生氏病、腎上腺炎、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、自體免疫性甲狀腺病、惡性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、類狼瘡性肝炎、動脈粥樣硬化、亞急性皮膚紅斑狼瘡、甲狀旁腺功能減退、德雷斯勒氏症候群(Dressler's syndrome)、自體免疫性血小板減少症、特發性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常天皰瘡、天皰瘡、皰疹樣皮炎、斑禿、類天皰瘡、硬皮症、進行性全身性硬化症、CREST症候群(鈣質沉著症、雷諾現象(Raynaud's phenomenon)、食管活動不良、指端硬化及毛細管擴張)、雄性及雌性自體免疫性不育、強直性脊柱炎、潰瘍性結腸炎、混合性結締組織病、結節性多動脈炎、全身性壞死性血管炎、特應性皮炎、特應性鼻炎、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、恰加斯氏病(Chagas' disease)、結節病、風濕熱、哮喘、復發性流產、抗磷脂症候群、農民肺(farmer's lung)、多形紅斑、心臟切開術後症候群、柯興症候群(Cushing's syndrome)、自體免疫性慢性活動性肝炎、養鳥人肺、中毒性表皮壞死松解症、阿爾波特氏症候群(Alport's syndrome)、肺泡炎、過敏性肺泡炎、纖維化肺泡炎、間質性肺病、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應、高安動脈炎(Takayasu's arteritis)、風濕性多肌痛、顳動脈炎、血吸蟲病、巨細胞動脈炎、蛔蟲病、曲黴菌病、阿司匹林哮喘三聯症(Sampter's syndrome)、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫病、貝切特氏病(Behcet's disease)、類風濕塵肺(Caplan's syndrome)、川崎病(Kawasaki's disease)、登革熱(dengue)、腦脊髓炎、心內膜炎、心內膜心肌纖維化症、眼內炎、持久性隆起性紅斑、牛皮癬、胎兒成紅細胞增多症、嗜酸細胞性筋膜炎、輸血後紫癜症候群(Shulman's syndrome)、費爾蒂症候群(Felty's syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異色睫狀體炎、福克斯睫狀體炎(Fuch's cyclitis)、IgA腎病、過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥、心肌病、肌無力症候群(Eaton-Lambert syndrome)、復發性多軟骨炎、冷球蛋白血症、沃爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulemia)、埃文斯症候群(Evan's syndrome)、急性呼吸窘迫症候群、肺炎症、骨質疏鬆、遲髮型超敏反應及自體免疫性性腺衰竭。
因此，本文所述方法涵蓋治療以下細胞之病症：B淋巴細胞(例如，全身性紅斑狼瘡、古巴士德氏症候群、類風濕性關節炎及I型糖尿病)、Th1 淋巴細胞(例如，類風濕性關節炎、多發性硬化症、牛皮癬、休格連氏症候群(Sjorgren's syndrome)、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病、原發性膽汁性肝硬化、韋格納氏肉芽腫病、肺結核或移植物抗宿主病)或Th2 淋巴細胞(例如，特應性皮炎、全身性紅斑狼瘡、特應性哮喘、鼻炎結膜炎、過敏性鼻炎、歐門氏症候群(Omenn's syndrome)、全身性硬化症或慢性移植物抗宿主病)。通常，涉及樹突細胞之病症涉及Th1 淋巴細胞或Th2 淋巴細胞病症。
類風濕性關節炎(RA)係最常見發炎自體免疫性疾病之一，其影響約1%之人群。儘管可獲得有效治療(例如MTX及抗TNF藥劑)，但仍存在大量未滿足之醫療需要，尤其係對於彼等對抗TNF療法無充分反應之患者(約30%患者)。另外，高達50%之患者在5年內中斷TNF拮抗劑治療，此主要係由於不良事件所致，但亦係由於經驗證喪失治療益處之患者的數量日益增加。因此，重要的是確立靶向RA中之炎症及關節損壞但並不僅僅依賴對TNF之直接抑制之有效療法。極有吸引力之方法係靶向共刺激性細胞路徑。共刺激中之關鍵受體-配體對之一係CD40/CD40L。此系統容許免疫細胞間及免疫細胞與非免疫細胞之間發生相互作用，該等相互作用在RA之發病機制中皆具有重要意義。用本發明拮抗性抗體阻斷CD40在RA中可具有以下效應中之一或多者：
1)抑制B細胞分化及抗體同型轉換；
2)在T細胞及巨噬細胞中抑制細胞因子及趨化因子產生及黏著分子上調；
3)抑制樹突細胞活化；及
4)在非免疫細胞(例如上皮細胞、內皮細胞及間質細胞)中抑制促發炎細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素之產生，並下調黏著分子。
達成上述效應中之一或多者之方法明確涵蓋於本文中。除RA外，本發明組合物尤其可用於治療多發性硬化症、牛皮癬(包括牛皮癬關節炎)、幼年型類風濕性關節炎、發炎腸病、全身性紅斑狼瘡及實體器官移植之方法中。
類風濕性關節炎(RA)係慢性全身性自體免疫性疾病，其在成年人中之患病率為約1%。該疾病持續引發顯著發病率及早發性死亡(死亡主要係由於加速心臟血管疾病所致)。現已確定，關節損傷在病程中出現極早，有高達30%之患者在診斷時有放射影像證據顯示骨侵蝕，且在1年後增加至60%。當前準則推薦在已確認明確診斷後3個月內用傳統疾病緩解抗風濕藥(DMARD)開始治療。DMARD可減少或預防關節損傷並保持關節功能。當前，風濕病學家選擇甲胺喋呤(MTX)作為大多數患者之初始DMARD療法。
TNF拮抗劑依那西普(etanercept)(Enbrel)、英利昔單抗(infliximab)(Remicade)、阿達木單抗(adalimumab)(Humira)；CTLA4拮抗劑阿巴他塞(abatacept)(Orencia)；抗IL-6受體mAb托珠單抗(tocilizumab)及抗CD20 mAb利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan)可有效治療RA。當前準則一般推薦在發現對傳統DMARD無充分反應後使用生物性DMARD來治療活動性RA。
在患有早期侵襲性RA且先前未接受MTX治療之患者中之最新研究顯示，MTX與TNF拮抗劑之組合優於作為單一療法使用之每一者。最驚人結果係組合療法具有顯著放射性益處。因此，應在侵襲性疾病及侵襲性表型風險最大(例如高活動性分數、功能受損、類風濕因子(RF)或抗環瓜胺酸肽抗體(CCP)呈血清陽性、CRP升高、放射影像性侵蝕)之患者中使用MTX與TNF抑制劑之組合。然而，預期在臨床實踐中，TNF拮抗劑將很少用做一線療法。美國風濕病學家在2005年4月進行之調查顯示，對使用TNF拮抗劑之決定影響最大之因素係：MTX或多種DMARD之失效、醫師之整體評價、功能受損及放射影像性惡化或侵蝕。當前，在美國估計有20%之RA患者接受TNF抑制劑療法。
由於藥物耐受不良及藥物毒性或缺少反應，包括生物療法在內之當前治療對大部分RA患者無足夠幫助。高達50%之患者在5年內中斷TNF拮抗劑治療，此主要係由於不良事件所致，但亦係由於經驗證喪失反應之患者的數量日益增加。
在一些實施例中，免疫病症係T細胞介導之免疫病症，例如T細胞病症，其中與病症有關之活化T細胞表現CD40。可投與抗CD40抗體或藥劑以排除該等表現CD40之活化T細胞。在一具體實施例中，投與抗CD40抗體或藥劑可排除表現CD40之活化T細胞，同時抗CD40或藥劑未實質上排除靜止T細胞。在此上下文中，「未實質上排除」意指少於約60%或少於約70%或少於約80%之靜止T細胞未排除。
本文所述抗CD40抗體及藥劑亦可用於治療或預防表現CD40之癌症。根據本文所述方法治療或預防表現CD40之癌症係藉由向需要該治療或預防之個體投與有效量之抗CD40抗體或藥劑來達成，該抗體或藥劑藉此(i)與表現CD40之癌細胞結合，及(ii)產生細胞毒性或細胞抑制效應以排除表現CD40之癌細胞或抑制其增殖。
可藉由本文所述方法治療或預防之表現CD40之癌症包括(例如)白血病，例如急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病(例如，成髓細胞性白血病、前髓細胞性白血病、骨髓單核細胞性白血病、單核細胞性白血病或紅白血病)、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病或慢性淋巴細胞白血病；真性紅細胞增多症；淋巴瘤(例如，霍奇金氏病或非霍奇金氏病)；多發性骨髓瘤、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血症；重鏈病；實體腫瘤，例如肉瘤及癌瘤(例如，纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞瘤(Wilms' tumor)、宮頸癌、子宮癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、鼻咽癌或食管癌)。
醫藥組合物及其投與
可將包含CD40結合劑(例如，抗CD40抗體)之組合物投與患有免疫病症或表現CD40之癌症或具有罹患該等疾病之風險之個體。本發明另外提供CD40結合劑(例如，抗CD40抗體)在製造用於預防或治療表現CD40之癌症或免疫病症之藥物中之用途。本文所用術語「個體」意指可投與CD40結合劑之任何哺乳動物患者，包括(例如)人類及非人哺乳動物，例如靈長類動物、齧齒類動物及狗。明確意欲使用本文所述方法治療之個體包括人類。在免疫病症或表現CD40之癌症之預防或治療中，抗體或藥劑可單獨或與其他組合物組合投與。
用於該等醫藥組合物中之較佳抗體係彼等包含具有以下中之任一者之重鏈可變區胺基酸序列的人類化抗體或抗體片段：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40。
一些實施例包括包含編碼抗體或抗體片段之序列之分離多核苷酸，該抗體或抗體片段具有輕鏈可變域胺基酸序列SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:36。尤佳人類化抗體組合物包含抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:36。本發明內涵蓋編碼以下重鏈序列中之任一者之分離多核苷酸：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73。其他實施例係關於編碼以下序列中之任一者之輕鏈序列的分離核酸：SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76。
在某些實施例中，在患有中度至重度活動性RA且對單獨之MTX無充分反應之患者中，倘若意欲治療RA，則方法中可使用本發明組合物來減少體徵及症狀，誘發主要臨床反應並降低結構性損傷之進展。當前此療法之實例係：Enbrel/Humira(使用Humira及Enbrel之數據係在兩個不同患者群中獲得)。可使用本發明組合物來代替Enbrel/Humira療法或與Enbrel/Humira療法組合用於對單獨之MTX無反應之個體。較佳地，在該等實施例中，在對甲胺喋呤無充分反應之患者中，本發明組合物之功效將優於Enbrel+MTX，如藉由(例如)以下所確定：在6個月時，化合物加MTX之ACR20>85%(GS：Enbrel+MTX為71%，相對於安慰劑+MTX為27%，在12個月時Humira+MTX為59%，相對於安慰劑+MTX為24%)*。本發明組合物優良功效之其他標準可包括：與Enbrel類似，在一年時間內抑制結構性損傷之進展(對於52週後之平均改良Sharp分數，Humira+MTX為0.1，相對於安慰劑+MTX為2.7)*。在其他實施例中，組合物在已對甲胺喋呤無充分反應之患者中產生優於Enbrel之「主要臨床反應」，如藉由以下所量測：ACR70(Humira+MTX為20%，安慰劑+MTX為4%)*。
在其他實施例中，在患有中度至重度活動性RA且已對抗TNF藥劑無充分反應之患者中，可能需要本發明組合物來減少體徵及症狀，誘發主要臨床反應並降低結構性損傷之進展。當前金標準(Gold standard)：非抗TNF性生物療法。較佳地，在該等個體中，藉由在已對抗TNF藥劑無充分反應之患者中之歷史性比較，本發明組合物之功效不低於非抗TNF生物療法(例如Orencia、Rituxan)：在6個月時，化合物加DMARD之ACR20>50%(GS：Orencia+DMARD為50%，相對於安慰劑+DMARD為20%)。在其他實施例中，與Rituxan類似，本發明組合物在一年時間內抑制結構性損傷之進展，如藉由公認X射線評分法對關節侵蝕及關節腔狹窄所評價(對於52週後之平均改良Sharp分數，Rituxan+MTX為1.0，相對於安慰劑+MTX為2.31)。
已知且可使用多種遞送系統來投與CD40結合劑。引入方法包括(但不限於)真皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。CD40結合劑可藉由(例如)輸注、濃注或注射來投與，且可與諸如化學治療藥劑等其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部投與。在較佳實施例中，藉由皮下注射來投與。可在(例如)預填充注射器中製備用於該等注射之調配物，其可每隔一週投與一次。
可測定本發明抗體之安全性特徵且較佳包括一或多個諸如以下等特徵：與常用於治療類風濕性關節炎之其他藥物(例如DMARD、類固醇、NSAID)無臨床上顯著之不良相互作用；N因安全性或耐受性問題所致之中斷率不高於Enbrel；嚴重感染率不高於抗TNF藥劑或其他常用生物藥劑；注射位點反應或輸注反應之頻率及/或嚴重性與Enbrel類似；在多個治療週期後未產生抗藥性或抗藥性極小(低於5%)；未中和或最低程度地中和抗體；無證據顯示增強了可引起活體內血栓栓塞事件之血小板聚集/活化或可引起流血之血小板/內皮功能障礙。
在具體實施例中，CD40結合劑組合物係藉由注射、借助導管、借助栓劑或借助植入體來投與，該植入體係有孔、無孔或凝膠狀材料，其包括諸如矽橡膠模等膜或纖維。通常，在投與組合物時，使用抗CD40抗體或藥劑不能吸附之材料。
在其他實施例中，抗CD40抗體或藥劑係以受控釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(例如，參見Langer,1990,Science 249:1527-1533；Sefton,1989,CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald等人，1980,Surgery 88:507；Saudek等人，1989,N. Engl. J. Med. 321:574)。在另一實施例中，可使用聚合材料。(例如，參見Medical Applications of Controlled Release(Langer及Wise編輯，CRC Press,Boca Raton,Fla.,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen及Ball編輯，Wiley,New York,1984)；Ranger及Peppas,1983,Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61。亦參見Levy等人，1985,Science 228:190；During等人，1989,Ann. Neurol. 25:351；Howard等人，1989,J. Neurosurg. 71:105。)其他受控釋放系統論述於(例如)Langer(上述文獻)中。
CD40結合劑(例如，抗CD40抗體)可以包含治療有效量之結合劑及一或多種醫藥相容成份之醫藥組合物形式來投與。
在典型實施例中，根據常規程序將醫藥組合物調配為適用於靜脈內或皮下投與人類之醫藥組合物。通常，注射投與用組合物係存於無菌等滲水性緩衝液中之溶液。若需要，醫藥物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(例如利多卡因(lignocaine))以減輕注射位點之疼痛。通常，各成份係單獨或混合在一起以單位劑型來供應，例如，作為凍乾乾粉或無水濃縮物存於諸如安瓿或藥囊等標明活性劑之量的密封容器中。倘若醫藥物係藉由輸注來投與，則可將其分配至含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶中。倘若醫藥物係藉由注射來投與，則可提供含有注射用無菌水或鹽水之安瓿以使得可在投與之前混合各成份。
此外，可以醫藥套組形式來提供醫藥組合物，其包含(a)含有呈凍乾形式之CD40結合劑(例如，抗CD40抗體)之容器及(b)含有醫藥上可接受之注射用稀釋劑(例如，無菌水)之第二容器。醫藥上可接受之稀釋劑可用於重建或稀釋凍乾抗CD40抗體或藥劑。視需要，該(等)容器可附帶有監管醫藥物或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告顯示政府機構已批准用於人類投與之製造、使用或銷售。
CD40結合劑(例如，抗CD40抗體)在治療或預防免疫病症或表現CD40之癌症中之有效量可藉由標準臨床技術來確定。另外，可視需要採用活體外分析來幫助確定最佳劑量範圍。調配中所用確切劑量亦可取決於投與途徑及免疫病症或表現CD40之癌症之階段，且應根據從業醫師之判斷及各患者之情況來決定。可根據得自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線來推斷有效劑量。
舉例而言，抗CD40抗體或藥劑之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由測定ED50 (在50%群體中治療有效之劑量)之標準醫藥程序來測定。表現較大治療指數之CD40結合劑(例如，抗CD40抗體)較佳。倘若CD40結合劑表現毒性副作用，則可使用將CD40結合劑靶向受影響組織位點之遞送系統以使對不表現CD40之細胞之潛在損傷降至最低，且由此減少副作用。
自細胞培養分析及動物研究獲得之數據可用於調配用於人類之劑量範圍。CD40結合劑之劑量通常在具有極低毒性或無毒性之循環濃度(包括ED50 )範圍內。該劑量可在此範圍內端視所用劑型及所用投與途徑而變。對於該方法中所用任一CD40結合劑而言，可首先根據細胞培養分析來估計治療有效劑量。可在動物模型中調配劑量以達成如在細胞培養物中所測定之循環血漿濃度範圍，其包括IC50 (即測試化合物可達成症狀半最大抑制之濃度)。該資訊可用於更準確地確定人類之可用劑量。血漿中含量可藉由(例如)高效液相層析、ELISA及諸如此類來量測。
通常，抗CD40抗體或CD40結合劑投與患有免疫病症或表現CD40之癌症之患者之劑量通常為約0.1 mg/kg個體體重至約100 mg/kg。投與個體之劑量為約0.1 mg/kg個體體重至約50 mg/kg、約1 mg/kg至約30 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約15 mg/kg、或約1 mg/kg至約10 mg/kg。
實例性劑量包括(但不限於)1 ng/kg至100 mg/kg。在一些實施例中，劑量為約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約11 mg/kg、約12 mg/kg、約13 mg/kg、約14 mg/kg、約15 mg/kg或約16 mg/kg。該劑量可以諸如以下等頻率來投與：每日、每週一次(一週一次)、每週兩次、每週三次、每週四次、每週五次、每週六次、每兩週一次或每月一次、每兩個月一次或每三個月一次。在具體實施例中，劑量為約0.5 mg/kg/週、約1 mg/kg/週、約2 mg/kg/週、約3 mg/kg/週、約4 mg/kg/週、約5 mg/kg/週、約6 mg/kg/週、約7 mg/kg/週、約8 mg/kg/週、約9 mg/kg/週、約10 mg/kg/週、約11 mg/kg/週、約12 mg/kg/週、約13 mg/kg/週、約14 mg/kg/週、約15 mg/kg/週或約16 mg/kg/週。在一些實施例中，劑量介於約1 mg/kg/週至約15 mg/kg/週範圍內。
在一些實施例中，包含CD40結合劑之醫藥組合物可另外包含與該結合劑偶聯或未偶聯之治療藥劑。抗CD40抗體或CD40結合劑可與一或多種用於治療或預防免疫病症或表現CD40之癌症之治療藥劑組合共投與。舉例而言，組合療法可包括細胞抑制劑、細胞毒性劑或免疫抑制劑。組合療法亦可包括(例如)投與靶向活化淋巴細胞、樹突細胞或表現CD40之癌細胞表面上除CD40以外之受體或受體複合物之藥劑。此一藥劑之實例包括第二非CD40抗體，其與活化淋巴細胞、樹突細胞或表現CD40之癌細胞表面上之分子結合。另一實例包括靶向此一受體或受體複合物之配體。通常，此一抗體或配體與活化淋巴細胞、樹突細胞或表現CD40之癌細胞上之細胞表面受體結合，且藉由將細胞抑制或細胞毒性信號遞送至活化淋巴細胞、樹突細胞或表現CD40之癌細胞中來增強抗CD40抗體之細胞毒性或細胞抑制效應。
該組合療法投與可對疾病參數(例如，症狀嚴重度、症狀數或復發頻率)產生累加或協同效應。
對於組合投與之治療方案，在一具體實施例中，將抗CD40抗體或CD40結合劑與治療藥劑同時投與。在另一具體實施例中，在投與抗CD40抗體或CD40結合劑之前或之後投與治療藥劑，即在投與抗CD40抗體或CD40結合劑之前或之後至少一小時且最長數月、例如至少一小時、5小時、12小時、1天、1週、1個月或3個月投與治療藥劑。
細胞毒性劑或免疫抑制劑之可用種類包括(例如)微管蛋白抑制劑、奧瑞斯他汀(例如，MMAE或MMAF)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化劑(例如，鉑錯合物，例如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)及三核鉑錯合物及卡鉑)、蒽環類抗生素、抗生素、抗葉酸素、抗代謝物、化學療法增敏劑、多卡米星、依託泊苷、氟化嘧啶、離子載體、萊克森(lexitropsin)、亞硝基脲、順氯胺鉑(platinol)、預形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素、放射增敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼(vinca alkaloid)或諸如此類。
個別細胞毒性劑或免疫抑制劑包括(例如)雄激素、胺茴黴素(anthramycin)(AMC)、天冬醯胺酶、5-氮胞苷、硫唑嘌呤、博萊黴素、白消安、丁硫胺酸硫酸亞胺、喜樹鹼、卡鉑、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙素(colchicine)、環磷醯胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、松胞菌素B(cytochalasin B)、達卡巴嗪、放線菌素D(原放線菌素)、柔紅黴素、胺烯咪胺(decarbazine)、多西他賽(docetaxel)、多柔比星、雌激素、5-氟去氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短桿菌肽D(gramicidin D)、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(CCNU)、雙氯乙基甲胺、美法倉、6-巰基嘌呤、甲胺喋呤、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbizine)、鏈脲黴素(streptozotocin)、替尼泊苷(tenoposide)、6-硫鳥嘌呤、噻替哌、托泊替康、長春花鹼、長春新鹼、長春瑞濱、VP-16及VM-26。
在一些典型實施例中，治療藥劑係細胞毒性劑。適宜細胞毒性劑包括(例如)多拉司他汀(例如，奧瑞斯他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB或AEVB)、DNA小溝結合劑(例如，烯二炔及萊克森)、多卡米星、紫杉烷(例如，紫杉醇及多西他賽)、嘌呤黴素、長春花生物鹼、CC-1065、SN-38、托泊替康、嗎啉基-多柔比星、根黴素、氰基嗎啉基-多柔比星、棘黴素(echinomycin)、考布他汀(combretastatin)、紡錘菌素(netropsin)、埃博黴素A及B、雌莫司汀、念珠藻素(cryptophysins)、西馬多丁(cemadotin)、類美坦辛、圓皮海綿內酯(discodermolide)、艾榴素或米托蒽醌。
在一些實施例中，細胞毒性劑係係習用化學治療藥，例如多柔比星、紫杉醇、美法倉、長春花生物鹼、甲胺喋呤、絲裂黴素C或依託泊苷。另外，可使諸如CC-1065類似物、卡奇黴素、美坦辛、多拉司他汀10類似物、根黴素及海葵毒素(palytoxin)等有效藥劑與抗CD40抗體或其藥劑相連。
在具體實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑係奧瑞斯他汀E(業內亦稱作多拉司他汀10)或其衍生物。通常，奧瑞斯他汀E衍生物係(例如)在奧瑞斯他汀E與酮酸之間形成之酯。舉例而言，可使奧瑞斯他汀E與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯戊酸反應以分別產生AEB及AEVB。其他典型奧瑞斯他汀衍生物包括AFP、MMAF及MMAE。奧瑞斯他汀E及其衍生物之合成及結構闡述於(例如)以下文獻中：美國專利申請公開案第2004-0157782 A1號及第2005-0238649號；國際專利申請案第PCT/US03/24209號、國際專利申請案第PCT/US02/13435號及美國專利第6,884,869號、第6,323,315號、第6,239,104號、第6,034,065號、第5,780,588號、第5,665,860號、第5,663,149號、第5,635,483號、第5,599,902號、第5,554,725號、第5,530,097號、第5,521,284號、第5,504,191號、第5,410,024號、第5,138,036號、第5,076,973號、第4,986,988號、第4,978,744號、第4,879,278號、第4,816,444號及第4,486,414號，其揭示內容係以引用方式併入本文中。
在具體實施例中，細胞毒性劑係DNA小溝結合劑。(例如，參見美國專利第6,130,237號。)舉例而言，在一些實施例中，小溝結合劑係CBI化合物。在其他實施例中，小溝結合劑係烯二炔(例如，卡奇黴素)。
微管蛋白抑制劑之實例包括(但不限於)紫杉烷(例如，Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他賽))、T67(Tularik)、長春花生物鹼(例如，長春新鹼、長春花鹼、長春地辛及長春瑞濱)及多拉司他汀(例如，奧瑞斯他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他微管蛋白抑制劑包括(例如)漿果赤黴素(baccatin)衍生物、紫杉烷類似物(例如，埃博黴素A及B)、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙素及秋水仙胺(colcimid)、雌莫司汀、念珠藻素、西馬多丁、類美坦辛、考布他汀、圓皮海綿內酯及艾榴素。
在一些實施例中，細胞毒性劑係類美坦辛，其係另一類微管蛋白抑制劑。舉例而言，在具體實施例中，類美坦辛係美坦辛或DM-1(ImmunoGen公司；亦參見Chari等人，1992,Cancer Res. 52:127-131)。
在一些實施例中，治療藥劑不係放射性同位素。
在一些實施例中，細胞毒性劑或免疫抑制劑係抗代謝物。抗代謝物可為(例如)嘌呤拮抗劑(例如，咪唑硫嘌呤或嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil))、二氫葉酸還原酶抑制劑(例如甲胺喋呤)、無環鳥苷(acyclovir)、丙氧鳥苷(gangcyclovir)、齊多夫定(zidovudine)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韋林(ribavarin)、疊氮胸腺嘧啶、阿糖胞苷、金剛烷胺、二去氧尿苷、碘去氧尿苷、膦甲酸鈉(poscamet)或曲氟尿苷(trifluridine)。
在其他實施例中，細胞毒性劑或免疫抑制劑係他羅利姆(tacrolimus)、環孢菌素或雷帕黴素(rapamycin)。在其他實施例中，細胞毒性劑係阿地白介素(aldesleukin)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、阿利維a酸(alitretinoin)、別嘌呤醇(allopurinol)、六甲密胺、胺磷汀(amifostine)、阿那曲唑、三氧化二砷、貝沙羅汀(bexarotene)、卡普睪酮、卡培他濱、塞來昔布(celecoxib)、克拉屈濱(cladribine)、達依泊汀α(Darbepoetin alfa)、地尼白介素2(Denileukin diftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、丙酸屈他雄酮、表柔比星、阿法依泊汀(Epoetin alfa)、雌莫司汀、依西美坦、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷、氟達拉濱、氟維司群(fulvestrant)、吉西他濱、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、戈舍瑞林、伊達比星、異環磷醯胺、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、干擾素α-2a、伊立替康、來曲唑、醛氫葉酸(leucovorin)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥(meclorethamine)或氮芥(nitrogen mustard)、甲地孕酮、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤、甲氧沙林(methoxsalen)、絲裂黴素C、米托坦、苯丙酸諾龍(nandrolone phenpropionate)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、帕米德諾內(pamidronate)、培加酶(pegademase)、培門冬酶(pegaspargase)、培非司亭(pegfilgrastim)、噴托他汀、哌泊溴烷、普卡黴素、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、丙卡巴肼、奎納克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、雷利度胺(revlimid)、沙格司亭(Sargramostim)、鏈脲黴素、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾內酯、硫鳥嘌呤、托瑞米芬、托西莫單抗(Tositumomab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、維甲酸(tretinoin)、尿嘧啶氮芥、戊柔比星(valrubicin)、長春花鹼、長春新鹼、長春瑞濱及唑來磷酸(zoledronate)。
在其他實施例中，該藥物係人類化抗HER2單株抗體；RITUXAN(利妥昔單抗；Genentech公司，South San Francisco,Calif.)；嵌合抗CD20單株抗體；OVAREX(AltaRex公司，MA)；PANOREX(Glaxo Wellcome,NC；鼠類IgG2a抗體)；Cetuximab Erbitux(Imclone Systems公司，NY；抗EGFR IgG嵌合抗體)；Vitaxin(MedImmune公司，MD)；Campath I/H(Leukosite,MA；人類化IgG1抗體)；Smart MI95(Protein Design Labs公司，CA；人類化抗CD33 IgG抗體)；LymphoCide(Immunomedics公司，NJ；人類化抗CD22 IgG抗體)；Smart ID10(Protein Design Labs公司，CA；人類化抗HLA-DR抗體)；Oncolym(Techniclone公司，CA；放射性標記之鼠類抗HLA-Dr10抗體)；Allomune(BioTransplant,CA；人類化抗CD2 mAb)；Avastin(Genentech公司，CA；抗VEGF人類化抗體)；依帕珠單抗(Epratuzamab)(Immunomedics公司，NJ及Amgen,CA；抗CD22抗體)；及CEAcide(Immunomedics,NJ；人類化抗CEA抗體)。
其他適宜抗體包括(但不限於)針對以下抗原之抗體：CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis Y、Lewis X、α-胎蛋白、CA 242、胎盤鹼性磷酸酶、前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生長因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、轉鐵蛋白受體抗體、p97、MUC1-KLH、CEA、gp100、MART1、前列腺特異性抗原、IL-2受體、CD20、CD52、CD33、CD22、人類絨毛膜促性腺激素、CD38、黏蛋白、P21、MPG及Neu癌基因產物。
在一些實施例中，治療藥劑係免疫抑制劑。免疫抑制劑可為(例如)丙氧鳥苷、依那西普、他羅利姆、環孢菌素、雷帕黴素、環磷醯胺、硫唑嘌呤、嗎替麥考酚酯或甲胺喋呤。或者，免疫抑制劑可為(例如)糖皮質激素(例如，皮質醇或醛甾酮)或糖皮質激素類似物(例如，潑尼松(prednisone)或地塞米松(dexamethasone))。
適宜環加氧酶抑制劑包括甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲芬那酸(mefenamic acid)、卡洛芬(carprofen)、二氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、芬布芬(fenbufen)、非諾洛芬(fenoprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、舒林酸(sulindac)、替諾昔康(tenoxicam)、托美汀(tolmetin)及乙醯水楊酸。
適宜脂氧合酶抑制劑包括氧化還原抑制劑(例如，兒茶酚丁烷衍生物、去甲二氫愈創木酸(NDGA)、馬索羅酚(masoprocol)、菲尼酮(phenidone)、藍諾帕蘭(lanopalen)、吲唑啉酮、那法雜卓(naphazatrom)、苯并呋喃酚、烷基羥胺)及非氧化還原抑制劑(例如，羥基噻唑、甲氧基烷基噻唑、苯并吡喃及其衍生物、甲氧基四氫吡喃、乳香酸及乳香酸之乙醯化衍生物以及經環烷基取代之喹啉甲氧基苯基乙酸)及氧化還原抑制劑之前體。
其他適宜脂氧合酶抑制劑包括抗氧化劑(例如，酚、沒食子酸丙酯、類黃酮及/或含有類黃酮之天然受質、黃酮之羥基化衍生物、黃酮醇、二氫槲皮素、四羥黃酮、高良薑黃素(galangin)、奧洛波爾(orobol)、查耳酮(chalcone)衍生物、4,2',4'-三羥基查耳酮、鄰胺基苯酚、N-羥基脲、苯并呋喃酚、依布硒(ebselen)及提高還原性含硒酶活性之物質)、鐵螯合劑(例如，氧肟酸及其衍生物、N-羥基脲、2-苄基-1-萘酚、兒茶酚、羥胺、鼠尾草酚trolox C、兒茶酚、萘酚、柳氮磺胺吡啶、齊留通(zyleuton)、5-羥基鄰胺基苯甲酸及4-(ω-芳基烷基)苯基鏈烷酸)、含咪唑化合物(例如，酮康唑(ketoconazole)及伊曲康唑(itraconazole))、吩噻嗪及苯并吡喃衍生物。
其他適宜脂氧合酶抑制劑包括類花生酸抑制劑(例如，十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳六烯酸及二十二碳六烯酸及其酯、PGE1(前列腺素E1)、PGA2(前列腺素A2)、維前列醇(viprostol)、15-單羥基二十碳四烯酸、15-單羥基-二十碳三烯酸及15-單羥基二十碳五烯酸及白三烯B5、C5及D5)、干擾鈣流動之化合物、吩噻嗪、二苯基丁胺、維拉帕米(verapamil)、岩藻糖苷、薑黃素、綠原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸(ETYA)、羥苯基維甲醯胺、藍諾帕蘭、七葉苷(esculin)、乙胺嗪、菲羅啉、黃岑素(baicalein)、普昔羅米(proxicromil)、硫醚、二烯丙基硫醚及二-(1-丙烯基)硫醚。
白三烯受體拮抗劑包括骨化三醇(calcitriol)、昂唑司特(ontazolast)、Bayer Bay-x-1005、Ciba-Geigy CGS-25019C、依布硒、Leo Denmark ETH-615、Lilly LY-293111、Ono ONO-4057、Terumo TMK-688、Boehringer Ingleheim BI-RM-270、Lilly LY 213024、Lilly LY 264086、Lilly LY 292728、Ono ONO LB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF 10042、Rhone-Poulenc Rorer RP 66153、SmithKline Beecham SB-201146、SmithKline Beecham SB-201993、SmithKline Beecham SB-209247、Searle SC-53228、Sumitamo SM 15178、American Home Products WAY 121006、Bayer Bay-o-8276、Warner-Lambert CI-987、Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982、Lilly LY 233569、Lilly LY-255283、MacroNex MNX-160、Merck and Co. MK-591、Merck and Co. MK-886、Ono ONO-LB-448、Purdue Frederick PF-5901、Rhone-Poulenc Rorer RG 14893、Rhone-Poulenc Rorer RP 66364、Rhone-Poulenc Rorer RP 69698、Shionoogi S-2474、Searle SC-41930、Searle SC-50505、Searle SC-51146、Searle SC-52798、SmithKline Beecham SK及F-104493、Leo Denmark SR-2566、Tanabe T-757及Teijin TEI-1338。
製品
在另一態樣中，包括含有可用於治療上述病症之材料之製品。該製品包含容器及標記。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器容納可有效治療病況之組合物且可具有無菌出入口。舉例而言，容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺入塞子之小瓶。組合物中之活性藥劑係人類化抗CD40抗體。容器上或與容器相連之標記指示，該組合物係用於治療所選病況。製品可另外包含第二容器，該第二容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包括根據商業及用戶角度考慮所期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、注射器及寫有使用說明之包裝插頁。
本發明進一步闡述於以下實例中，該等實例不欲限制本發明之範圍。
實例
實例1：人類化抗CD40抗體之產生
鼠類抗體20E2及2H11展示於上文表1及2中。20E2及2H11純系之人類化已完成。製備一文庫，使人類及鼠類殘基改變為在任意給定位置處可存在一個人類或鼠類殘基。此一文庫係針對在人類種系與鼠類抗體之間不同之彼等胺基酸製備。僅選擇保留親代鼠類抗體功能之純系。
以此方式，抗體a、抗體B及抗體C係源自選殖至人類IgG1-KO(KO=剔除)/κ骨架中之小鼠抗體20E2(抗體A及抗體B)或2H11(抗體C)之人類化抗體。IgG1-KO在Fc區中具有兩處突變Leu234Ala及Leu235Ala，從而降低FcγR及補體結合。
該等人類化之結果產生不同人類化重鏈及輕鏈可變序列，如下文所示：
本發明實例性人類化抗體係彼等具有下表中所示重鏈及輕鏈序列者。下表中之粗體加下劃線序列係可變域，而正常無下劃線序列係恆定域：
將可變區亞選殖至一個或兩個不同適宜IgG表現載體中：
A)　人類IgG1-KO(剔除)/κ模式，其在Fc區中具有Leu234Ala與Leu235Ala雙重突變以降低諸如FcγR及補體結合等效應子功能
B)　人類IgG4-DM(雙重突變體)/κ模式，其在鉸鏈區中具有Ser228Pro突變以降低IgG4半分子之出現率，且具有Leu235Glu突變以進一步降低FcγR結合
純化兩個候選者(抗體A及抗體B)並藉由以下標準進行評估：
-　CCF外觀(濁度)
-　CCF之過濾特性
-　r蛋白質A之產率
-　洗脫及中和後之濁度
-　可溶聚集體(SEC)
-　純度/濃度模式(SDS)
-　電荷模式(IEF)
實例2：活體外數據
抗體A、抗體B及抗體C係與基於所公開序列製備之抗體4D11(Kirin/Astellas)及PG-102(PanGenetics)一起表徵。抗體A、抗體B、抗體C及4D11之數據展示於下文中。PG-102顯示激動活性且僅不完全抑制B細胞增殖(未顯示)。表2.2.概述所得數據。在表2.2之後更詳細地闡述數據。
A.　人類化抗體與細胞CD40及重組CD40蛋白之結合
藉由流式細胞術使用經人類CD40轉染之HEK293細胞來分析人類化抗體與細胞CD40之特異性結合。觀察到抗體A、抗體B及抗體C具有濃度依賴性結合。該等抗體顯示圖1B中所示之類似結合曲線。本發明抗體及Kirin抗體4D11之EC50值皆在約1 nM之相同範圍內，該範圍最有可能係分析之靈敏度限值，此乃因在經轉染細胞中含有大量CD40。人類化抗體與人類Ramos細胞上之細胞CD40之特異性結合亦顯示濃度依賴性結合。該等抗體顯示略有不同之結合曲線(展示於圖2中)及介於0.21 nM至1.22 nM之間之EC50值。在諸如未經轉染之HEK293細胞或T細胞系HSB-2等CD40陰性細胞上未檢測到結合，由此確認對CD40之選擇性結合(數據未顯示)。
抗體A、抗體B及抗體C與人類CD40-Fc蛋白結合之親和性係經由ForteBio Octet來量測，且揭示解離常數(KD )<100 pM。由於抗體及CD40-Fc之二價親合力效應使得不能精確測定低於100 pM之Kd。另外，在不存在及存在50%人類血清時分析與CD40-Fc之結合，且觀察到血清對結合無顯著效應(數據未顯示)。
B.　人類化抗體在B細胞活化/增殖分析中之活性
在B細胞增殖分析中測試人類化抗體之活性，其中在IL-2及IL-4存在下用重組CD40L刺激得自外周血之人類B細胞。抗體A、抗體B及抗體C顯示可有效抑制B細胞增殖(展示於圖3A及3B中)。與BI抗體及Kirin抗體4D11之抑制曲線及IC50值作對比，表明4D11抗體在多個供體之間測試時具有較高效能(圖3B及4)。當在不存在CD40L之情形下測試激動活性時，與4D11抗體類似，抗體(抗體B、抗體A及抗體C)在高達10 μg/ml(67 nM)之濃度下不誘導任何超過背景程度之B細胞增殖(展示於圖4中)。
競爭抗體4D11似乎有效性略高，其平均IC50為約0.02 nM且不存在激動性效應。三種BI抗體及4D11之數據概述於圖4及上文表2.2中。在此分析中亦測試另一競爭抗體PG-102(得自純系5D12)，其在不存在CD40L時顯示刺激B細胞增殖之顯著激動劑效應(圖4)。因此，吾人之主要候選者因缺少激動活性而可與PG-102明確區分。
在第二分析中，在人類B細胞中評價抗體對CD86上調之抑制。在此情形下，可用人類全血或在純化B細胞中實施該分析，二者皆係在外源CD40L存在下進行。與B細胞增殖數據一致，如藉由流式細胞術所量測，在人類全血中測試之抗體B、抗體A及抗體C顯示可有效抑制CD40介導之CD86上調(展示於圖5中)。抗體C在此分析中所顯示效能與4D11類似，而抗體B及抗體A之效能稍弱。在純化B細胞上或在全血中對比抗體B與4D11顯示，抗體B之效能(IC50及IC90值)在純化B細胞中與在存在其他含CD40細胞或血清時之B細胞中相比相對不變，而4D11之效能在全血條件下發生劇烈變化(展示於圖6)。
在用全血樣品來評價抗體B、抗體A及抗體C在食蟹猴B細胞中對CD86上調之抑制時獲得類似數據(展示於圖7中)。如藉由流式細胞術所量測，在食蟹猴全血中測試之抗體B、抗體A及抗體C顯示可有效抑制CD40介導之CD86上調。因此該等抗體皆對食蟹猴CD40顯示功能性交叉反應性，且對人類CD40具有類似效能。
評價抗體B IgG1KOb及抗體B IgG1WT介導抗體依賴性細胞毒性之能力之活性(圖13)。在此分析中，將RAMOS細胞與人類PBMC以50:1之效應子：靶細胞比率一起培育。自20 μg/ml逐步增加抗體B IgG1KOb及抗體B IgG1WT之量，且藉由LDH之釋放來監測細胞死亡程度。所顯示數據來自一個代表性實驗。數據顯示，抗體A IgG1Wt 20E2-12-RIgG1WT係ADCC之有效介導物，且含有可消除效應子功能之突變之抗體B IgG1Kob不具有ADCC活性。
實例3：藥物代謝動力學/藥效學研究
A.　在食蟹猴中以1 mg/kg或10 mg/kg之單劑量靜脈內投與抗體A及抗體B
將抗體A及抗體B各自以1 mg/kg及10 mg/kg靜脈內投與雄性食蟹猴(N=3/劑量)。自0-504 hr(3週)收集血樣，回收血清，且將樣品儲存在-20℃下直至分析。藉由上述三明治ELISA來分析樣品。在兩次靜脈內投藥後兩種抗體在猴中之血清濃度-時間曲線及藥物代謝動力學參數概述於圖8及下文所示之表2.7.1(抗體A)及表2.7.2(抗體B)中。兩種抗體皆顯示劑量依賴性藥物代謝動力學，表明在低劑量下，清除主要歸因於與靶介導處理保持一致，而在較高劑量下，抗體主要藉由分解代謝來清除。已觀察到靶向膜結合靶(例如CD19、CD20、EGFR、CD146及HER2)之其他Mab具有類似的劑量依賴性藥物代謝動力學曲線。在1 mg/kg及10 mg/kg劑量下，抗體A之清除率分別為0.8 mL/h/kg及0.1 mL/h/kg。在1 mg/kg及10 mg/kg劑量下，抗體B之清除率分別為0.7 mL/h/kg及0.1 mL/h/kg。類似地，在1 mg/kg及10 mg/kg劑量下，抗體A之半衰期分別為1天及13天，且抗體B在相同劑量下之半衰期分別為2天及13天。儘管抗體B在較低劑量下之半衰期比相同劑量之抗體A略長，但預計此差異不能理解為在長期投與後暴露更持久。兩種化合物之AUC係超比例的且兩種化合物之分佈容積(Vss)與血漿容積(約40 mL/kg)近似，從而表現出通常在大型極性蛋白質治療中觀察到之有限組織分佈。總之，兩種抗體之藥物代謝動力學參數之間不存在顯著差異。
B.　離體藥效學研究
作為上述PK研究之一部分，分析抗CD40抗體之藥效學效應。為此，將全血樣品與重組CD40L一起培育過夜並藉由流式細胞術來測定B細胞上CD86表現之增加。在第0天(處理前)、投藥後第2天、第7天及第14天分析樣品。儘管CD86表現之增加相對較小(約5-20%)，但仍觀察到劑量依賴性效應(展示於圖9中)。在投與10 mg/kg抗體A及抗體B之動物組中，在第2天、第7天及第14天完全抑制CD86誘導，與在此劑量下之持續暴露一致。投與1 mg/kg之動物在第2天顯示完全抑制，在第7天顯示部分抑制，且在第14天顯示無抑制。低劑量組中藥效學效應隨時間而喪失與抗體之較快清除相關。
實例4：毒理學相關研究：血小板上之CD40
CD40在人類血小板上組成型表現(Henn等人，2001)及(Inwald等人，2003)，而CD40L在活化血小板之細胞表面上快速瞬時表現(Henn等人，2001)。儘管預期無FcγR結合之抗CD40抗體不會對血小板產生效應，但重要的是直接證實確實如此。實施流式細胞術研究來證實主要抗CD40候選者與人類及食蟹猴血小板之結合。
先前已藉由流式細胞術證實，G28.5及mAb 89抗CD40 mAb與靜止人類血小板結合(Henn等人，2001)。使用經FITC標記之G28.5抗體對此進行確認。製備G28.5之5倍連續稀釋液且在室溫下以0.5 μg/ml至0.32 ng/ml之範圍在100 μl得自人類(2個供體)或食蟹猴(3個供體)之血小板中培育30分鐘。另外，使用經APC標記之抗CD45 mAb來鑑別與其他CD40+ 細胞類型結合之血小板以自分析排除該等細胞。在抗體染色後，洗滌血小板並用Optilyse C固定且實施流式細胞術。測定平均螢光強度(MFI)作為與CD45- 血小板結合之抗體之量度。
對市售5c3及本發明所選抗體抗CD40小鼠mAb實施FITC標記。確認與Ramos細胞之結合。每個抗體分子之FITC分子數介於每個抗體分子2至4個FITC範圍內。製備市售及候選抗CD40 mAb之5倍連續稀釋液(介於0.5 μg/ml至0.32 ng/ml範圍內)且將其與人類(3個供體)及食蟹猴(2個供體)血小板在室溫下一起培育30分鐘。
顯示小鼠候選抗CD40 mAb與人類血小板結合之代表性圖表展示於圖11中。四種候選單株抗體與經FITC標記之同型對照抗體相比顯示與人類血小板特異性結合。10F2、2H11、19B10及20E2顯示與血小板之結合相當。對於食蟹猴血小板觀察到類似傾向(數據未顯示)。
除該等研究外，在人類及食蟹猴全血樣品中對比直接標記之抗體B及4D11與血小板及B細胞結合之能力(展示於圖12中)。在人類及食蟹猴血樣中，4D11顯示與B細胞及血小板二者之結合類似(如藉由EC50所例示)。抗體B顯示類似模式但結合效能遠遠較弱。
實例5：在NSG小鼠模型中之活體內藥理學研究
在抗體產生模型中評估人類化抗體(抗體A)之功效，其中將人類PBMC注射至免疫缺陷型NSG小鼠中以產生移植物抗宿主反應。在移植物植入後最初2週時可檢測到大量產生人類IgM(hIgM)及IgG(hIgG)。用抗體A以5 mg/kg及1 mg/kg之劑量處理在移植物植入後第2週及第3週時顯著抑制hIgG及hIgM反應。以5 mg/kg之單劑量評估競爭抗體(4D11)且亦顯示可消除該反應。在第二研究中，以1 mg/kg之單劑量測試所有抗體(抗體A、抗體B及抗體C)且顯示在第2週完全抑制IgM及IgG反應(圖10)。
實例6：生物標記物分析
受體上調： CD40L誘導之受體上調可藉由流式細胞術來量測。可用優化濃度之可溶性CD40L來刺激人類全血，且CD20+受體+細胞之總體百分比可藉由流式細胞術來量測。量測CD20陽性細胞上CD86表現之百分比變化，並實施食蟹猴pk研究來評價抗體A及B(圖9)。數據顯示，在與抗體暴露一致之時間點抑制CD86上調。
靶向蛋白質組： 可使用全血中蛋白質在CD40刺激後增加之分泌來作為潛在生物標記物。使用檢測MDC/CCL22及若干種其他分泌蛋白之Luminex多重珠粒平臺來確立可溶性CD40L之優化濃度及刺激時間。將以全劑量範圍之抗CD40 mAb來評價來自人類全血之臨床樣品。
受體佔有率： 可在基於人類全血中B細胞之流式細胞術分析之活體外或離體分析中測定CD40受體佔有率。將使用本發明當前候選抗體及非競爭性抗CD40抗體5C3來量化受體佔有率分析。
實 例7：人類化抗CD40抗體之抗腫瘤活性
在一些情形下，可期望測定本發明抗體之抗腫瘤特性。此一測定可藉由分析人類化抗CD40抗體在SCID小鼠淋巴瘤異種移植模型中之抗腫瘤活性來實施。此一SCID模型可經癌細胞注射以呈現腫瘤，例如可在開始藥物治療前13天將5x 106 (百萬)個腫瘤細胞皮下注射至SCID小鼠(10只/組)中。每週3次(4 mg/kg/劑量)腹膜內給予本發明鼠類抗CD40抗體或對比抗體(例如，對照或其他人類化抗體)，且投與8次或5次劑量。在小鼠中監測腫瘤之出現及生長且在所選研究階段期間(例如14天之研究階段)每週量測腫瘤體積。較佳地，結果將顯示，在對照小鼠中腫瘤生長係經本發明抗體治療之小鼠之2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。較佳地，在治療階段中，在經本發明抗體治療之小鼠中，腫瘤生長可忽略不計。該等數據可證實，所測試人類化抗體在此B淋巴瘤異種移植模型中可有效抑制腫瘤生長。
實例8：藉由人類化抗CD40抗體延長存活
人類化抗CD40抗體對帶瘤小鼠(例如上述之彼等)之存活之功效可在SCID小鼠淋巴瘤異種移植模型中加以分析。在抗體治療前3天向SCID小鼠(10只/組)靜脈內接種1×106 (百萬)個腫瘤細胞。然後用本發明鼠類或人類化抗CD40抗體或Ig對照治療小鼠，其係每週兩次(4 mg/kg/劑量)腹膜內投與，總計5次劑量。然後每天檢查小鼠籠中之死亡率以測定抗體延長患有癌症之個體之存活的功效程度。
本文引用各種參考文獻，包括專利申請案、專利及科學出版物，該等參考文獻之揭示內容係全文以引用方式併入本文中。本文中對任何參考文獻之引用或表述皆不應視為承認該參考文獻可用作本發明之先前技術。
可根據以下段落中之實施例來闡述本發明較佳態樣：
段落1.　一種人類化單株抗體，其中該抗體與人類CD40特異性結合，且其在B細胞增殖中具有IC50小於1 nM之拮抗活性且在高達100 μg/ml濃度下不具有激動作用，且其中該抗體之特徵另外在於，該抗體在非人靈長類中之活體內半衰期係至少10天。
段落2.　如段落1之人類化單株抗體，其中該抗體在小於30 mg/kg之劑量下在食蟹猴中之半衰期大於8天。
段落3.　如段落1之抗體，其中該抗體包含選自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任一者組成之群之重鏈序列及選自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8中任一者組成之群之輕鏈序列。
段落4.　如段落1之抗體，其中該抗體係人類化抗體或抗體之抗原結合片段，其具有以下中之任一者之重鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73。
段落5.　如段落1之抗體，其中該抗體係人類化抗體或抗體之抗原結合片段，其包含以下輕鏈可變域胺基酸序列：SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76。
段落6.　如段落1之單株抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈CDR1序列選自由SEQ ID NO: 9至SEQ ID NO:11組成之群，重鏈CDR2序列選自由SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15組成之群，且重鏈CDR3序列選自由SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:17組成之群；且其中輕鏈CDR1序列選自由SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:21組成之群，輕鏈CDR2序列係SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:23，且輕鏈CDR3序列選自由SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:25組成之群。
段落7.　如段落1之單株抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO: 10、重鏈CDR2序列SEQ ID NO:13及重鏈CDR3序列SEQ ID NO:16，且其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO:19、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO:24。
段落8.　如段落1之單株抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO: 9、重鏈CDR2序列SEQ ID NO:14及重鏈CDR3序列SEQ ID NO:16，且其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO:20、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO:22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO:24。
段落9.　一種抗CD40抗體，其包含SEQ ID NO:1至4中任一者之重鏈可變域序列。
段落10.　一種抗CD40抗體，其包含SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:8中任一者之輕鏈可變域序列。
段落12.　一種人類化抗體或抗體片段，其具有分別包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:40及SEQ ID NO: 36。
段落13.　一種特異性結合人類CD40之分離抗體或抗原結合片段，其包含人類化重鏈可變域，該人類化重鏈可變域包含框架區，該框架區之胺基酸序列與人類可變域重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中之框架區胺基酸序列至少90%一致；且包含與SEQ ID NO:26之對應輕鏈可變域至少90%一致之輕鏈胺基酸序列。
段落14.　一種特異性結合人類CD40之分離抗體或抗原結合片段，其包含人類化重鏈可變域，該人類化重鏈可變域包含框架區，該框架區之胺基酸序列與人類可變域重鏈胺基酸序列SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中之框架區胺基酸序列至少90%一致；且包含與SEQ ID NO:31之對應輕鏈可變域至少90%一致之輕鏈胺基酸序列。
段落15.　一種特異性結合人類CD40之分離抗體或抗原結合片段，其包含人類化重鏈可變域，該人類化重鏈可變域包含框架區，該框架區之胺基酸序列與人類可變域重鏈胺基酸序列SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO: 40中之框架區胺基酸序列至少90%一致；且包含與SEQ ID NO:36之對應輕鏈至少90%一致之輕鏈胺基酸序列。
段落16.　如段落1之抗體，其中該等抗體在不存在CD40L時不能刺激B細胞產生細胞因子。
段落17.　如段落1之抗體，其中該等抗體在50%人類血清存在下與人類CD40結合，且結合速率降低二倍以下。
段落18.　如段落1之抗體，其中該抗體在1 mg/kg濃度下抑制哺乳動物中IgM及IgG之產生。
段落19.　一種在哺乳動物中阻斷人類CD40之功能之方法，其包含向該哺乳動物投與包含如段落1之抗體之組合物，該抗體之量足以阻斷該哺乳動物中CD40介導之免疫反應。
段落20.　一種治療或改善哺乳動物之移植物抗宿主病之方法，其包含向該哺乳動物投與包含如段落1之抗體之組合物，該抗體之量足以在該動物中減少移植物抗宿主病之一或多個症狀。
段落21.　如段落20之方法，其中該哺乳動物患有選自由以下組成之群之自體免疫性或發炎疾病：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、l型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
段落22.　如段落19之方法，其中該哺乳動物患有類風濕性關節炎。
段落23.　如段落20之方法，其另外包含投與選自由以下組成之群之第二治療藥劑：TNF拮抗劑、疾病緩解抗風濕藥、CTLA4拮抗劑、抗IL-6受體mAb及抗CD20 mAb。
段落24.　如段落20之方法，其中該發炎疾病或自體免疫性疾病係與表現CD40及CD20二者之細胞有關之發炎疾病或自體免疫性疾病。
段落25.　如段落19之方法，其中該抗CD40抗體係藉由非經腸投與途徑來投與。
段落26.　如段落19之方法，其中該抗CD40抗體係以靜脈內或皮下方式來投與。
段落27.　一種在人類患者中抑制B細胞產生抗體之方法，其包含向該人類患者投與有效量之如段落1之抗CD40抗體。
段落28.　如段落27之方法，其中該人類患者患有與表現CD40之細胞有關之發炎疾病或自體免疫性疾病。
段落29.　如段落27之方法，其中該人類患者患有選自由自體免疫性或發炎疾病組成之群之自體免疫性疾病，該自體免疫性或發炎疾病選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
段落30.　一種抑制表現人類CD40抗原之細胞生長之方法，其包含將如段落1之抗體或抗原結合片段投與該等細胞，該抗體或抗原結合片段與人類細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原之結合抑制該等細胞之生長或分化。
段落31.　種治療患有CD40相關病症之個體之方法，其包含向該個體投與如段落1之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人類CD40特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與CD40之結合抑制該CD40相關病症細胞之生長或分化。
段落32.　如段落31之方法，其中該CD40相關病症中之該等細胞係B類淋巴母細胞、胰細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巢細胞、結腸細胞、前列腺細胞、皮膚細胞、頭頸細胞、膀胱細胞、骨細胞或腎細胞。
段落33.　如段落31之方法，其中該CD40相關病症係慢性淋巴細胞白血病、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血症或卡波西氏肉瘤。
段落34.　一種誘導清除外周B細胞之方法，其包含向該等細胞投與如段落1之抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段與人類細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原之結合誘導清除該等細胞。
段落35.　如段落34之方法，其中將該抗體或抗原結合片段投與患有免疫病症之個體。
段落36.　如段落34之方法，其中該免疫病症係類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡。
段落37.　一種治療個體之類風濕性關節炎之方法，其包含向該個體投與如段落1之抗體，其中該抗體係在該個體中阻斷CD40功能之拮抗性抗體。
段落38.　如段落37之方法，其中該抗體係以在該個體中有效抑制B細胞分化及抗體同型轉換之量來投與。
段落39.　如段落37之方法，其中該抗體係以在該個體之T細胞及巨噬細胞中有效抑制細胞因子及趨化因子產生及黏著分子上調之量來投與。
段落40.　如段落37之方法，其中該抗體係以在該個體中有效抑制樹突細胞活化之量來投與。
段落41.　如段落37之方法，其中該抗體係以在該個體之非免疫細胞中可有效抑制促發炎細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素產生及下調黏著分子之量來投與。
段落42.　如段落37之方法，其中該抗體係與包含投與甲胺喋呤及/或投與Enbrel/Humira之方案組合投與。
段落43.　如段落37之方法，其中該個體係患有類風濕性關節炎且對單獨之甲胺喋呤治療無反應之個體。
段落44.　如段落43之方法，其中該方法包含用包含投與甲胺喋呤及/或投與Enbrel/Humira之方案來治療該個體。
段落45.　如段落37之方法，其中用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效優於使用單獨之甲胺喋呤、單獨之Enbrel、Enbrel+甲胺喋呤之組合來治療。
段落46.　如段落43之方法，其中在對甲胺喋呤無充分反應之患者中用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效優於使用Enbrel+MTX來治療。
段落47.　如段落37之方法，其中該抗體係與包含抗TNF藥劑之方案組合投與。
段落48.如段落37之方法，其中該個體係患有類風濕性關節炎且對使用單獨之抗TNF藥劑之治療無反應之個體。
段落49.如段落48之方法，其中該方法包含用包含以抗TNF藥劑以及該拮抗性抗CD40抗體治療之方案來治療該個體。
段落50.如段落37之方法，其中用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效優於用抗TNF藥劑來治療。
段落51.如段落48之方法，其中在對單獨之抗TNF藥劑無充分反應之患者中用該拮抗性抗CD40抗體治療該個體之功效優於用Orencia或Rituxan來治療。
段落52.一種醫藥組合物，其包含：(i)如段落8之抗體或抗原結合片段；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
段落53.如段落52之醫藥組合物，其中該抗體或其抗原結合片段第二藥劑偶聯。
段落54.如段落52之醫藥組合物，其中該第二藥劑係細胞毒性劑、PEG載體、酶或標記物。
段落55.一種分離多核苷酸，其編碼以下中之任一者之重鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO: 1至4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID. NO. 50、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73。
段落56.　一種分離多核苷酸，其編碼以下中之任一者之輕鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76。
段落57.　一種如段落1之抗體之用途，其用於製造在哺乳動物中阻斷人類CD40之功能之藥物，其中該藥物在該哺乳動物中阻斷CD40介導之免疫反應。
段落58.　一種如段落1之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物之移植物抗宿主病之藥物。
段落59.　如段落58之用途，其中該藥物經製造用於治療選自由以下組成之群之自體免疫性或發炎疾病：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症/格雷夫斯病、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、l型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
段落60.　如段落58之用途，其中該藥物另外包含選自由以下組成之群之第二治療藥劑：TNF拮抗劑、疾病緩解抗風濕藥、CTLA4拮抗劑、抗IL-6受體mAb及抗CD20 mAb。
段落61.　如段落57之用途，其中該藥物經製造用於非經腸投與途徑。
段落62.　如段落57之用途，其中該藥物經製造以供靜脈內或皮下使用。
段落63.　一種如段落1之抗體之用途，其用於製造在人類患者中抑制B細胞產生抗體之藥物。
段落64.　一種如段落1之抗體之用途，其用於製造抑制表現人類CD40抗原之細胞之生長及/或分化之藥物。
段落65.　種如段落1之抗體之用途，其用於製造治療患有CD40相關病症之個體之藥物，其中該藥物中該抗體或抗原結合片段與CD40之結合抑制該CD40相關病症細胞之生長或分化。
段落66.　如段落65之用途，其中該藥物用於治療CD40相關病症中選自以下之細胞：B類淋巴母細胞、胰細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巢細胞、結腸細胞、前列腺細胞、皮膚細胞、頭頸細胞、膀胱細胞、骨細胞或腎細胞。
段落67.　如段落65之用途，其中該藥物用於治療慢性淋巴細胞白血病、伯基特氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、沃爾登斯特倫氏巨球蛋白血症或卡波西氏肉瘤。
段落68.　一種如段落1之抗體之用途，其用於製造誘導清除外周B細胞之藥物，其中該藥物中該抗體或抗原結合片段與人類細胞表面CD40抗原特異性結合，其中該抗體或抗原結合片段與該CD40抗原之結合誘導清除該等細胞。
段落69.　如段落68之用途，其中該藥物用於治療患有免疫病症之個體。
段落70.　如段落68之用途，其中該藥物用於治療類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡。
段落71.　一種如段落1之抗體之用途，其用於製造治療個體之類風濕性關節炎之藥物。
段落72.　如段落71之用途，其中該藥物係用於在該個體中抑制B細胞分化及抗體同型轉換。
段落73.　如段落71之用途，其中該藥物係用於在該個體之T細胞及巨噬細胞中抑制細胞因子及趨化因子產生及黏著分子上調。
段落74.　如段落71之用途，其中該藥物係用於在該個體中抑制樹突細胞活化。
段落75.　如段落71之用途，其中該藥物係用於在該個體之非免疫細胞中抑制促發炎細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶、前列腺素之產生及下調黏著分子。
段落76.　如段落71之用途，其中該藥物係欲與包含投與甲胺喋呤及/或投與Enbrel/Humira之方案組合投與之組合藥物。
段落77.　如段落71之用途，其中該藥物另外包含抗TNF藥劑。
本文所揭示教示內容之應用並不限於本文所述之具體實施例。實際上，熟習此項技術者根據本文所含教示內容及隨附實例能作出各種修改。該等修改意欲含於隨附申請專利範圍之範疇內。
<110>　德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
<120>　抗CD40抗體
<130>　02950-22687us01
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<223>　10F2之CD40鼠類前導VH序列
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<223>　來自抗體10F2Hum之可變重鏈序列形式4
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<223>　來自抗體10F2Hum之可變重鏈序列形式5
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<223>　來自抗體10F2Hum之可變重鏈序列形式6
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<223>　來自抗體10F2Hum之可變重鏈序列形式7
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<223>　來自抗體10F2Hum之可變輕鏈序列形式1
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<220>
<223>　2H11、10F2及19B10之重鏈CDR3
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<213>　人工序列
<220>
<223>　20E2之重鏈CDR3
<400>　78
圖1：A.人類化抗體對經CD40轉染之HEK-293細胞之結合曲線及對應EC50值，如藉由流式細胞術所量測。B.對抗體A、抗體B及抗體C與經CD40轉染之HEK細胞之結合的比較，如藉由流式細胞術所量測。展示一個實驗之代表性數據。
圖2：人類化抗體對RAMOS細胞之結合曲線及對應EC50值，如藉由流式細胞術所量測。展示一個實驗之代表性數據。
圖3：在人類原代B細胞增殖分析中測試小鼠及人類化抗體之拮抗活性。(A)繪示每種小鼠前體抗體之代表性抗體滴定曲線及所得IC50值。展示一個供體之代表性數據。(B)繪示不同人類化抗CD40抗體與4D11相比之拮抗作用之抑制曲線的疊加。
圖4：在人類原代B細胞增殖分析中測試人類化抗體之拮抗性(IC50)及激動性(SI=刺激指數)活性之結果的概述。展示各種抗CD40抗體、4D11、G28.5及5D12以供比較。
圖5：在人類全血分析中測試抗體B、抗體A及抗體C對CD40誘導之CD86上調之抑制。展示4D11抗CD40抗體以供比較。IgG1同型對照在此分析中顯示無效應。展示一個供體之代表性數據。
圖6：在人類純化B細胞上及人類全血中測試抗體B對CD40誘導之CD86上調之抑制之結果的概述。繪示在(A)IC50及(B) IC90兩點之數據。IgG1同型對照在任一分析中皆顯示無效應。表中概述多個供體(n=4-5)之數據。
圖7：在食蟹猴全血分析中測試抗體B、抗體A及抗體C對CD40誘導之CD86上調之抑制。IgG1同型對照在此分析中顯示無效應。展示一個供體之代表性數據。
圖8：在投與1 mg/kg及10 mg/kg之每種抗體後，抗體A(左圖)及抗體B(右圖)在食蟹猴中之血漿濃度時間曲線3。數據係每種抗體投與3個動物之歸納。
圖9：來自食蟹猴之CD86陽性B細胞在投與(抗體B)及(抗體A)之前及在用每種抗體處理後之3個時間點之百分比變化。抗體B(上圖)及抗體A係各自以1 mg/kg(左圖)或10 mg/kg(右圖)投與3個動物。
圖10：在注射1.25 x 106 人類PBMC後2週NSG小鼠中之(A)人類IgG及(B)人類IgM之含量。在轉移人類PBMC之前一天以1 mg/kg之劑量用媒劑、同型對照及抗體(抗體A、抗體B及抗體C)處理小鼠。
圖11：各種小鼠抗人類CD40抗體與人類血小板之結合。
圖12：抗體B與抗CD40 mAb 4D11在全血中之人類B細胞及血小板上進行結合對比之結果概述。
圖13：野生型及剔除IgG1構造物之ADCC活性。
(無元件符號說明)

Claims (46)

  1. 一種與人類CD40特異性結合之人類化抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈序列及輕鏈序列選自由以下組成之群：a)該重鏈CDR1序列選自由SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：11組成之群，重鏈CDR2序列選自由SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：15組成之群，及重鏈CDR3序列選自由SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：17組成之群；及b)該輕鏈CDR1序列選自由SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：21組成之群，輕鏈CDR2序列係SEQ ID NO：22至SEQ ID NO：23，及輕鏈CDR3序列選自由SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：25組成之群。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO：10、重鏈CDR2序列SEQ ID NO：13及重鏈CDR3序列SEQ ID NO：16，及其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO：19、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO：22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO：24。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO：9、重鏈CDR2序列SEQ ID NO：14及重鏈CDR3序列SEQ ID NO：16，及其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO：20、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO：22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO：24。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO：11、重鏈CDR2序列SEQ ID NO：15及重鏈CDR3序 列SEQ ID NO：17，及其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO：21、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO：23及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO：25。
  5. 一種與人類CD40特異性結合之人類化單株抗體或抗體片段，其具有包含以下胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變區：分別SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：36；分別SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：36；分別SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：36；及分別SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：36。
  6. 一種如請求項1之抗體之用途，其用於製造抑制人類CD40活化之藥物。
  7. 種如請求項1之抗體之用途，其用於製造藉由抑制人類CD40活化治療或改善人類患者疾病或病症之藥物。
  8. 如請求項7之用途，其中該疾病或病症係選自由下列組成之群：移植物抗宿主病、自體免疫或發炎疾病及表現CD40之癌症。
  9. 一種如請求項1之抗體之用途，其用於製造藉由抑制人類CD40活化治療自體免疫或發炎疾病或病症之藥物，其中該自體免疫或發炎疾病選自由以下組成之群：類 風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡、腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病(Crohn's Disease)及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症、格雷夫斯病(Graves disease)、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病(Addison's disease)、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏(Good pastures's)症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏(Sjogren's)症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
  10. 如請求項7之用途，其中該藥物另外包含選自由以下組成之群之第二治療劑：細胞抑制劑、細胞毒性劑或免疫抑制劑。
  11. 如請求項7之用途，其中製造該藥物用於非經腸、靜脈內或皮下投與途徑。
  12. 一種醫藥組合物，其包含：(i)如請求項1之抗體；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
  13. 一種如請求項1之抗體之用途，其用於製造用於治療或改善哺乳動物類風濕性關節炎之藥物。
  14. 一種與人類CD40特異性結合之人類化抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO：11、重鏈CDR2序列SEQ ID NO：15及重鏈CDR3序列SEQ ID NO：17，及其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO：21、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO：23及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO：25。
  15. 一種與人類CD40特異性結合之人類化抗體，其中該抗體包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO：9、重鏈CDR2序列SEQ ID NO：12及重鏈CDR3序列SEQ ID NO：16，及其中該抗體包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO：18、輕鏈CDR2序列SEQ ID NO：22及輕鏈CDR3序列SEQ ID NO：24。
  16. 一種與人類CD40特異性結合之人類化抗體，其中該抗體包含重鏈可變區SEQ ID NO：44及輕鏈可變區SEQ ID NO：43。
  17. 一種與人類CD40特異性結合之人類化抗體，其中該抗體包含重鏈可變區SEQ ID NO：53及輕鏈可變區SEQ ID NO：52。
  18. 一種與人類CD40特異性結合之人類化抗體，其中該抗體包含重鏈可變區SEQ ID NO：58及輕鏈可變區SEQ ID NO：56。
  19. 一種與人類CD40特異性結合之人類化單株抗體或抗體片段，其包含重鏈SEQ ID NO：30及輕鏈SEQ ID NO：26。
  20. 一種與人類CD40特異性結合之人類化單株抗體或抗體片段，其包含重鏈SEQ ID NO：35及輕鏈SEQ ID NO：31。
  21. 一種與人類CD40特異性結合之人類化單株抗體或抗體片段，其包含重鏈SEQ ID NO：40及輕鏈SEQ ID NO：36。
  22. 一種如請求項14之抗體之用途，其用於製造藉由抑制人 類CD40活化治療或改善自體免疫或發炎疾病或病症之藥物，其中該自體免疫或發炎疾病選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡、腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症、格雷夫斯病、惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
  23. 如請求項22之用途，其中製造該藥物用於非經腸、靜脈內或皮下投與途徑。
  24. 一種如請求項15之抗體之用途，其用於製造藉由抑制人類CD40活化治療或改善自體免疫或發炎疾病或病症之藥物，其中該自體免疫或發炎疾病選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、多發性硬化症、增生性狼瘡、腎小球腎炎、發炎腸病(IBD)、牛皮癬、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、克羅恩氏病及全身性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲狀腺炎、原發性黏液水腫、甲狀腺毒症、格雷夫斯病、 惡性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性心炎、艾迪生氏病、過早絕經、1型糖尿病、古巴士德氏症候群、重症肌無力、自體免疫性溶血性貧血、特發性白血球減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性活動性肝炎(HBs Ag陰性)、隱源性肝硬化、休格連氏症候群、皮肌炎、硬皮症、混合性結締組織疾病、盤狀紅斑狼瘡及全身性血管炎。
  25. 如請求項24之用途，其中製造該藥物用於非經腸、靜脈內或皮下投與途徑。
  26. 一種如請求項19之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物類風濕性性關節炎之藥物。
  27. 如請求項26之用途，其中製造該藥物用於非經腸、靜脈內或皮下投與途徑。
  28. 一種如請求項20之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物類風濕性性關節炎之藥物。
  29. 如請求項28之用途，其中製造該藥物用於非經腸、靜脈內或皮下投與途徑。
  30. 一種如請求項21之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物類風濕性性關節炎之藥物。
  31. 如請求項30之用途，其中製造該藥物用於非經腸、靜脈內或皮下投與途徑。
  32. 一種如請求項19之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物全身性紅斑狼瘡(SLE)之藥物。
  33. 如請求項32之用途，其中該哺乳動物係人類患者。
  34. 一種如請求項20之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物全身性紅斑狼瘡(SLE)之藥物。
  35. 如請求項34之用途，其中該哺乳動物係人類患者。
  36. 一種如請求項21之抗體之用途，其用於製造治療或改善哺乳動物全身性紅斑狼瘡(SLE)之藥物。
  37. 如請求項36之用途，其中該哺乳動物係人類患者。
  38. 一種醫藥組合物，其包含：(i)如請求項19之抗體；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
  39. 一種醫藥組合物，其包含：(i)如請求項20之抗體；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
  40. 一種醫藥組合物，其包含：(i)如請求項21之抗體；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
  41. 一種醫藥組合物，其包含：(i)如請求項14之抗體；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
  42. 一種醫藥組合物，其包含：(i)如請求項15之抗體；及(ii)醫藥上可接受之賦形劑。
  43. 一種分離之多核苷酸，其編碼與人類CD40特異性結合之人類化單株抗體或抗體片段，其具有重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列，其中該重鏈可變區胺基酸序列包含以下任一者：SEQ ID NO：1至4、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73；及輕鏈可變區胺基酸序列包含以下任一者：SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76。
  44. 如請求項43之多核苷酸，其中該重鏈可變區胺基酸序列包含以下任一者：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40；及輕鏈可變區胺基酸序列包含以下任一者：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：36。
  45. 如請求項43之多核苷酸，其中該重鏈可變區胺基酸序列包含以下任一者：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73；及輕鏈可變區胺基酸序列包含以下任一者：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76。
  46. 如請求項43之多核苷酸，其中該重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列係選自由以下組成之群：分別SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：26；分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：31；分別SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：36；分別SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：36；分別SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：36；及分別SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：36。
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