EA039944B1

EA039944B1 - Применение антител к cd40 для лечения волчаночного нефрита

Info

Publication number: EA039944B1
Application number: EA201890629A
Authority: EA
Inventors: Скотт Роналд Бродёр; Томас Б. Фриман; Джералд Генри Набозни; Мира Рамануджам; Пауль Шолль; Йюрген Штеффген
Original assignee: Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2022-03-30
Also published as: EA201890629A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым гуманизированным антагонистическим антителам к CD40 и терапевтическим и диагностическим методам и композициям применения этих антител для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к применению гуманизированных антител к CD40 для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита.

Предпосылки создания изобретения

CD40 представляет собой имеющий молекулярную массу 48 кДа интегральный мембранный гликопротеин типа I, и он является представителем суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNF). CD40 экспрессируется на широком разнообразии клеточных типов, включая здоровые и неопластические В-клетки, интердигитатные (переплетенные) клетки, клетки карциномы, эпителиальные клетки (например, кератиноциты), фибробласты (например, синовиоциты) и тромбоциты. Он присутствует также на моноцитах, макрофагах, некоторых типах эндотелиальных клеток и фолликулярных дендритных клетках. Для CD40 характерна экспрессия на ранней стадии онтогенеза В-клеток, он появляется на предшественниках В-клеток после появления CD10 и CD19, но перед экспрессией CD21, CD23, CD24 и появлением поверхностного иммуноглобулина М (sIgM) (Uckun и др., Blood 15, 1990, с. 2449). CD40 выявлен также на миндалинах и продуцируемых костным мозгом плазматических клетках (PellatDecounynck и др., Blood 84, 1994, с. 2597).

Лигандом CD40 является CD40L (который обозначают также как CD154, gp39 и TRAP), представитель суперсемейства TNF. CD40L представляет собой трансмембранный белок, который экспрессируется главным образом на активированных CD4⁺-Т-клетках и небольшой подпопуляции CD8⁺-Т-kлеток (см. обзор Van Kooten С. и Banchereau, 2000).

Взаимодействие CD40 с CD40L индуцирует как гуморальные, так и клеточно-опосредованные ответы. CD40 регулирует осуществляемую этой парой лиганд-рецептор активацию В-клеток и других антигенпрезентирующих клеток (АПК), включая дендритные клетки (ДК) (см., обзор (Toubi и Shoenfeld, 2004); (Kiener и др., 1995). Были проведены обширные исследования функции CD40 на В-клетках. Активация CD40 на В-клетках индуцирует пролиферацию, дифференцировку в секретирующие антитела клетки и переключение изотипа в герминативных (зародышевых) центрах вторичных лимфоидных органов. Опыты in vitro продемонстрировали непосредственные воздействия активации CD40 на производство цитокинов (IL-6, IL-10, TNF-α, LT-α), экспрессию молекул адгезии и костимулирующих рецепторов (ICAM, CD23, CD80 и CD86) и повышенную экспрессию молекул ГКГ класса I, ГКГ класса II и ТАРтранспортера В-лимфоцитами (Liu и др., 1996). В большинстве указанных процессов CD40 действует либо совместно с другими цитокинами, либо в сочетании с другими взаимодействиями рецептор-лиганд.

Передача сигналов CD40 на моноцитах и ДК приводит к повышенной выживаемости, а также к секреции цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α и MIP-1a). Сшивание CD40 с этими АПК приводит также к повышающей регуляции костимулирующих молекул (таких как ICAM-1, LFA-3, CD80 и CD86). Активация CD40-рецепторов является одним из имеющих решающее значение сигналов, которые приводят к полному созреванию ДК в эффективные АПК, обеспечивающие Т-клеточную активацию (Banchereau и Steinman, 1998) (Van Kooten С. и Banchereau, 2000).

В современных исследованиях на мышиных моделях установлено, что передача сигналов CD40 на дендритных клетках играет также важную роль в создании ТН17-клеток, которые считаются медиаторами аутоиммунитета при таких болезнях как артрит и рассеянный склероз (Iezzi и др., 2009) (PeronaWright и др., 2009).

Наличие мышей с выключенными CD40 и CD40L, а также агонистических и антагонистических антимышиных антител создает возможность изучать роль взаимодействий CD40-CD40L на нескольких моделях заболеваний. Продемонстрировано благоприятное действие применения блокирующего антитела к CD40L при исследовании на нескольких моделях аутоиммунитета, включая спонтанные заболевания типа волчаночного нефрита у SNF1-мышей или диабета у NOD-мышей, или на экспериментально индуцированных формах болезней типа индуцированного коллагеном артрита (CIA) или экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) (Toubi и Shoenfeld, 2004). Было выявлено ингибирование CIA у мышей, обусловленное МАт к CD40L, которое блокировало развитие воспаления суставов, титры сывороточных антител к коллагену, инфильтрацию воспалительных клеток в субсиновиальную ткань, а также эрозию хряща и кости (Durie и др., 1993). Было продемонстрировано, что как при волчаночном нефрите, так и при ЕАЕ антитело к CD40L обладало также способностью купировать начало болезни, что подтверждает роль CD40-CD40L на эффекторной фазе болезни (Kalled и др., 1998); (Howard и др., 1999).

Таким образом, были проведены доклинические исследования, которые свидетельствуют о решающей роли диады CD40-CD40L в обеспечении эффективного, зависящего от Т-клеток иммунного ответа. Следовательно, блокирование передачи сигналов CD40 рассматривается как приемлемая и нужная терапевтическая стратегия подавления патогенного аутоиммунного ответа при таких болезнях как волчаночный нефрит.

Международное общество нефрологов (ISN)/Общество почечной патологии разработало классификацию волчаночного нефрита, основанного частично на степени почечной недостаточности (См. J.J. Weening и др., The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revisited, J. Am. Soc. Nephrol 15: 2004, cc. 241-250).

- 1 039944

Биопсии почек у SLE (системная красная волчанка) пациентов с волчаночным нефритом показали спектр сосудистых, клубочковых и тубулоинтерстициальных поражений. Поражение клубочков определяется путем локализации иммунного комплекса на мезангиальных, эндотелиальных и эпителиальных клетках. В зависимости от этих изменений волчаночный нефрит может быть разделен на 6 классов, начиная с относительно легкого поражения, проявляющегося отложением иммунного комплекса только в мезангиальном матриксе (класс I) или мезангиальной гиперклеточности (класс II) до глобального склероза в >90% клубочка (класс VI). Пациенты с волчаночным нефритом I или II класса проявляют только асимптоматическую протеинурию, и отсутствует снижение СКФ (скорость клубочковой фильтрации). Эндокапиллярные изменения классифицируются либо как очаговые пролиферативные (класс III) или диффузные пролиферативные (>50% пораженного клубочка, класс IV). Клиническими проявлениями у этих пациентов являются гематурия, симптоматическая протеинурия и потеря СКФ. Чистое эпителиальное поражение (Класс V) проводит к отложению иммунокомплекса вдоль клубочковой базальной мембраны без воспалительных очагов. Эти пациенты страдают главным образом от нефротической протеинурии.

Отсутствует необходимость в иммуносупрессивной терапии для I и II класса и отсутствует эффект лечения после необратимого поражения при VI классе, в то время как волчаночный нефрит III-V поддается лечению с применением иммуносупрессивной терапии. Около 25% пациентов с волчаночным нефритом имеют поражения III класса, 40% IV класса и 10% V класса. Около 1/6 III класса и IV класса также будут иметь 5 класс (перекрывание).

Иммуносупрессивная терапия должна учитывать биопсию почек, и она нацелена на полную ответную реакцию почек (протеинурия <0,5 г/24 ч с нормальной или близкой к нормальной почечной функцией). Кроме глюкокортикоидов, отсутствует одобренная терапия для лечения волчаночного нефрита, тем не менее, было показано, что циклофосфамид или микофенолат (MMF), каждый в комбинации с глюкокортикоидами, индуцируют улучшение клинических симптомов активного волчаночного нефрита и уменьшает риск прогрессирования ХПН. У около 20-30% пациентов, леченных с помощью MMF или циклофосфамида, проявлялась полная почечная ответная реакция (протеинурия <0,5 г/с, без признаков активного воспаления, без ухудшения СКФ) и у других около 20% проявлялась, по меньшей мере, частичная ответная реакция (уменьшение протеинурии на >50%).

Таким образом, комбинация гликокортикостероидов с либо MMF или циклофосфамидом рассматривается в настоящее время как стандартное лечение волчаночного нефрита, которое также соответствует рекомендациям Европейской лиги по борьбе с ревматизмом и Европейской ассоциации специалистов в области заболеваний почек - диализа и трансплантации почки (EULAR/ERA-EDTA). Эти рекомендации также включают гидроксихлорохин для всех пациентов с волчаночным нефритом для уменьшения количества обострений и применение АСЕ-ингибиторов или ARB.

Тем не менее, все лечения, доступные для волчаночного нефрита, могут быть связаны с существенной токсичностью (например, бесплодие, инфекции, злокачественность). Таким образом, процент пациентов с полным объективным ответом остается низким и в пределах пациентов с терапевтическим эффектом, существует высокий процент рецидивов, оправдывающий длительную поддерживающую терапию. Недавно осуществленные клинические испытания третьей стадии для волчаночного нефрита (например, ритуксимаб, абатацепт) не смогли выполнить требования их основных критериев оценки. Если взять в совокупности, в настоящее время существует острая неудовлетворенная потребность новых терапий для волчаночного нефрита. Эта потребность может быть решена с помощью гуманизированных антител к CD40, описанных в настоящей заявке и в US 20110243932, которые специфически связываются с CD40 и которые проявляют антиген-связывающую специфичность, аффиность и фармакокинетические и фармакодинамические свойства, которые предоставляют возможность их применять для терапевтического воздействия при волчаночном нефрите.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способ применения гуманизированного моноклонального антитела для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита (способ согласно изобретению).

В типичных вариантах осуществления, антитело, используемое в способе согласно изобретению, содержит последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей любую из SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4, и последовательность легкой цепи, выбранную из группы, включающей любую из SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 8.

В других вариантах осуществления антитело, используемое в способе согласно изобретению, представляет собой гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое имеет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в любой из

- 2 039944

SEQ ID NO: 1 - 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ

ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID

NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID

NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO. 50 SEQ ID NO: 53, SEQ ID

NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQID

NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQID

NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQID

NO: 72, или SEQ ID NO:73.

В других вариантах осуществления антитело, используемое в способе согласно изобретению, представляет собой гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 76.

В специфических вариантах осуществления, моноклональное антитело, используемое в способе согласно изобретению, содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где последовательность CDR1 тяжелой цепи выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 11, последовательность CDR2 тяжелой цепи выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 тяжелой цепи выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 17; и где последовательность CDR1 легкой цепи имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:18 - SEQ ID NO: 21, последовательность CDR2 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 22 - SEQ ID NO: 23, и последовательность CDR3 легкой цепи выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 25.

В специфических вариантах осуществления моноклональное антитело, используемое в способе согласно изобретению, содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 10, последовательность CDR2 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 13, и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 16; и где указанное антитело содержит последовательность CDR1 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:19, последовательность CDR2 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 22, и последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 24.

В других специфических вариантах осуществления моноклональное антитело, используемое в способе согласно изобретению, содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 9, последовательность CDR2 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 16; и где указанное антитело содержит последовательность CDR1 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 20, последовательность CDR2 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 22, и последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 24.

В другом специфическом варианте осуществления моноклональное антитело, используемое в способе согласно изобретению, содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 9, последовательность CDR2 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 16; и где указанное антитело содержит последовательность CDR1 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 20, последовательность CDR2 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 22, и последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 24.

В другом специфическом варианте осуществления моноклональное антитело, используемое в способе согласно изобретению, содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 11, последовательность CDR2 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15, и последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 17; и где указанное антитело содержит последовательность CDR1 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 21, последовательность CDR2 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 23, и последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 25.

В другом варианте осуществления изобретение относится к применению антитела к CD40 для лечения и/или предотвращения волчанки, где антитело к CD40 содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-4. Кроме того, антитело к CD40 характеризуется тем, что содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в любой из SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 8.

Под объем изобретения также подпадает применение антитела к CD40 для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита, где антитело к CD40 содержит гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое имеет вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 26 соответственно; SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 26 соответственно; SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 26 соот- 3 039944 ветственно; SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 26 соответственно; SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 31 соответственно; SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 31 соответственно; SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 31 соответственно;

SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 31 соответственно; SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 36 соответственно; SEQ

ID NO: 38 и SEQ ID NO: 36 соответственно; SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 36 соответственно; SEQ ID

NO: 40 и SEQ ID NO: 36 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 26 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 26 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 26 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 26 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 31 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 31 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 31 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 31 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 36 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 36 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 36 соответственно.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела, применяемое в способе согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 36 соответственно.

В другом варианте осуществления способ согласно изобретению относится к лечению и/или предотвращению волчаночного нефрита, используя выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с человеческим CD40, где выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит каркасный участок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности каркасного участка человеческой вариабельной области тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, и содержащее/содержащий аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична соответствующей последовательно- 4 039944 сти вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 26.

В другом варианте осуществления способ согласно изобретению относится к лечению и/или предотвращению волчаночного нефрита, используя выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с человеческим CD40, где выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит каркасный участок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности каркасного участка человеческой вариабельной области тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, и содержащее/содержащий аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична соответствующей последовательности вариабельной области легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 31.

В другом аспекте способ согласно изобретению относится к применению выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как описано в варианте осуществления непосредственно выше, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 32; в другом варианте осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 33; в другом варианте осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 34; и в другом варианте осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 35.

В другом варианте осуществления, изобретение относится к лечению и/или предотвращению волчаночного нефрита, используя гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит каркасный участок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности каркасного участка человеческой вариабельной области тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40, и содержащее/содержащий аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична соответствующей последовательности легкой цепи, которая представлена в SEQ ID NO: 36.

В другом аспекте способ согласно изобретению относится к применению выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как описано в варианте осуществления непосредственно выше, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 37; в другом варианте осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 38; в другом варианте осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO:39; и в другом варианте осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в SEQ ID NO: 40.

Настоящее изобретение относится к применению гуманизированного моноклонального антитела, как описано в настоящей заявке, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита (способ согласно изобретению).

Другими словами, настоящее изобретение относится к применению гуманизированного моноклонального антитела, как описано в настоящей заявке, для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита.

Выражаясь снова иначе, настоящее изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу, как описано в настоящей заявке, для применения для лечения и/или предотвращения волчаночного нефрита.

Краткое описание некоторых аспектов фигур

На фиг. 1 показано влияние лигирования CD40 на эндотелиальные клетки человека (HUVEC) клетки в среде, содержащей 100 нг/мл sCD40L и либо антитела В (·) или изотипического контроля (IgG1 антитело человека) (^).

На фиг. 2 показано влияние лигирования CD40 на эпителиальные клетки проксимальных канальцев человека (РТЕС) от трех различных доноров (D1, D2, D3) в среде, содержащей 50 нг/мл sCD40 антитела В.

Подробное описание изобретения

В настоящее время установлено, что опосредованная CD40 передача сигналов участвует в различных целевых нарушениях. Несмотря на наличие результатов ряда доклинических исследований, демонстрирующих, что вмешательство в эти нарушения может обладать терапевтической полезностью, сохраняется потребность в антагонистических антителах к CD40, которые можно применять для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как волчаночный нефрит.

Понятия CD40 и поверхностный антиген CD40 относятся к имеющему массу примерно 48 кДа гликопротеину, экспрессирующемуся на поверхности здоровых и неопластических В-клеток, который действует в качестве рецептора для сигналов, участвующих в пролиферации и дифференцировке клеток (Ledbetter и др., J. Immunol. 138, 1987, cc. 788-785). Молекула кДНК, кодирующая CD40, выделена из библиотеки, созданной на основе клеточной линии Raji лимфомы Беркетта (Stamenkovic и др., EMBO J. 8, 1989, с. 1403).

В контексте настоящего описания клетка, которая эндогенно экспрессирует CD40, представляет собой любую клетку, для которой характерна экспрессия CD40 на их поверхности, включая (но, не ограни- 5 039944 чиваясь только ими) здоровые и неопластические В-клетки, интердигитатные клетки, эпителиальные базальные клетки, клетки карциномы, макрофаги, эндотелиальные клетки, фолликулярные дендритные клетки, клетки миндалин и продуцируемые костным мозгом плазматические клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула CD40 представляет собой молекулу человеческого CD40.

Антитела, предлагаемые в изобретении, специфически связываются с человеческим рекомбинантным и нативным CD40. Гуманизированное моноклональное антитело представляет собой антитело, которое специфически связывается с человеческим CD40, обладает антагонистической активностью, характеризующейся значением IC₅₀, составляющим менее 1 нМ, и при его применении в концентрации вплоть до 100 мкг/мл не обладает агонистическим действием в отношении В-клеточной пролиферации, и указанное антитело отличается также тем, что антитело имеет время полужизни in vivo в организме приматов кроме человека, составляющее по меньшей мере 10 дней.

Общая структура антител или иммуноглобулина хорошо известна специалистам в данной области, эти молекулы представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, как правило, с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью с помощью одной дисульфидной связи с образованием гетеродимера, и гетеротетрамерная молекула образуется посредством ковалентной дисульфидной связи между двумя идентичными тяжелыми цепями гетеродимеров. Хотя легкие и тяжелые цепи связаны с помощью одной дисульфидной связи, количество дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями варьируется в зависимости от изотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также равномерно распределенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет аминоконцевую вариабельную область (VH), за которой расположены три или четыре константных домена (С_Н1, CH2, CH3 и C_H4), а также шарнирный участок между C_H1 и CH2. Каждая легкая цепь имеет две области, аминоконцевую вариабельную область (VL) и карбоксиконцевый константный домен (CL). VL-область нековалентно связана с VH-областью, а CL-домен, как правило, ковалентно связана с C_H1-доменом через дисульфидную связь. Вероятно, определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными областями легких и тяжелых цепей (Chothia и др., J. Mol. Biol. 186, 1985, cc. 651-663).

Определенные участки в вариабельных областях значительно различаются у различных антител, т.е. они являются гипервариабельными. Эти гипервариабельные участки содержат остатки, которые непосредственно участвуют в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении специфической для него антигенной детерминантны. Гипервариабельность в вариабельных областях, как легкой цепи, так и тяжелой цепи, концентрируется в трех сегментах, которые обозначают как определяющие комплементарность участки (гипервариабельные участки) (CDR) или гипервариабельные петли (HVL). CDR определяют путем сравнения последовательностей согласно методу, описанному у Kabat и др., в Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, a HVL структурно определяют на основе трехмерной структуры вариабельной области согласно методу, описанному у Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917. Если эти два метода приводят к некоторым различиям при идентификации CDR, то предпочтительным является определение на основе структуре. Согласно номенклатуре Кэбота CDR-L1 расположен примерно на остатках 24-34, CDR-L2 примерно на остатках 50-56 и CDR-L3 примерно на остатках 89-97 в вариабельной области легкой цепи; CDR-H1 расположен примерно на остатках 31-35, CDR-H2 примерно на остатках 50-65 и CDR-H3 примерно на остатках 95-102 в вариабельной области тяжелой цепи. Таким образом, CDR1, CDR2, CDR3 тяжелых и легких цепей определяют уникальные и функциональные свойства, специфические для данного антитела.

Три CDR в каждой из тяжелых и легких цепей разделены каркасными участками (FR), которые содержат последовательности, в меньшей степени имеющие тенденцию к вариабельности. Начиная с аминоконца по направлению к карбоксиконцу вариабельных областей тяжелых и легких цепей FR и CDR упорядочены следующим образом: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В значительно степени βскладчатая конформация FR позволяет CDR в каждой из цепей находиться в непосредственной близости друг с другом, а также с CDR из другой цепи. Полученная конформация присуща антигенсвязывающему центу (см. Kabat и др., NIH Publ. №о. 91-3242, т. I, 1991, сс 647-669), хотя не является необходимым условием, чтобы все остатки CDR непосредственно участвовали в связывании антигена.

Остатки FR и константные домены Ig не вовлечены непосредственно в связывание антигена, но участвуют в связанной с антигеном и/или опосредуемой антигеном эффекторной функции. Некоторые остатки FR, вероятно, оказывают выраженное воздействие на связывание антигена по меньшей мере тремя путями: путем нековалентного связывания непосредственно с эпитопом, путем взаимодействия с одним или несколькими остатками CDR и путем влияния на поверхность раздела между тяжелыми и легкими цепями. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антигена, но опосредуют различные эффекторные функции Ig.

Легкие цепи иммуноглобулинов позвоночных животных относят к одному или двух четко различимых классов, каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константного доме- 6 039944 на. Для сравнения, тяжелые цепи иммуноглобулинов млекопитающих относят к одному из пяти основных классов с учетом последовательности константных доменов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA дополнительно подразделяют на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG₃, IgG₄, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α,δ,ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации классов нативных иммуноглобулинов хорошо известны.

В контексте настоящего описания понятия антитело, антитело к CD40, гуманизированное антитело к CD40 и вариант гуманизированного антитела к CD40 применяют в наиболее широком смысле, и они относятся, в частности, к моноклональным антителам (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам) и фрагментам антител, таким как вариабельные области и другие участки антител, которые обладают требуемой биологической активностью, например способностью связываться с CD40.

Понятие моноклональное антитело (МАт) относится к антителу из популяции практически гомогенных антител; т.е. индивидуальные антитела в указанной популяции являются идентичными, за исключением встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в очень небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, их мишенью является индивидуальная антигенная детерминанта, эпитоп. Таким образом, прилагательное моноклональные является отличительным признаком практически гомогенной популяции антител, мишенью которых является идентичный эпитоп, и понятие не ограничено требованием к получению антител с помощью какого-либо конкретного метода. Должно быть очевидно, что моноклональные антитела можно получать с помощью любой техники или методологии, известной в данной области; включая, например, метод гибридом (Kohler и др., Nature 256, 1975, с. 495), или методы рекомбинантной ДНК, известные в данной области (см., например, US 4816567), или методы выделения моноклональных, полученных с помощью рекомбинантной ДНК антител с использованием фаговых библиотек антител, которые описаны у Clackson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628 и у Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597.

Химерные антитела состоят из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антител из одного вида (например, из млекопитающего кроме человека, такого как мышь) и константных областей легкой и тяжелой цепи антитела из других видов (например, человека), и их можно получать путем соединения последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области антитела из первого вида (например, мыши), с последовательностями ДНК константных областей антитела из второго вида (например, человека), и трансформации хозяина экспрессионным вектором, содержащим связанные последовательности, что позволяет хозяину продуцировать химерное антитело. В альтернативном варианте химерное антитело может также представлять собой антитело, в котором одна или несколько областей или доменов тяжелой и/или легкой цепи идентичны, гомологичны или являются вариантом соответствующей последовательности в моноклональном антителе из другого класса или изотипа иммуноглобулина или из консенсусной последовательности или последовательности зародышей линии. Химерные антитела могут включать фрагменты указанных антител при условии, что фрагмент антитела обладает требуемой биологической активностью родительского антитела, например способностью связываться с одним и тем же эпитопом (см., например, US 4816567; и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855).

Понятия фрагмент антитела, фрагмент антитела к CD40, фрагмент гуманизированного антитела к CD40 и фрагмент варианта гуманизированного антитела к CD40 относятся к части полноразмерного антитела к CD40, в котором сохраняется вариабельная область или ее функциональная способность, например специфичность связывания с эпитопом CD40. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fd-, Fv-, scFv- и scFv-Fc-фрагмент, димерное антитело (диабоди), линейное антитело, одноцепочечное антитело, минитело, димерное антитело, образованное из фрагментов антитела, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Полноразмерные антитела можно обрабатывать ферментами, такими как папаин или пепсин, с получением требуемых фрагментов антител. Расщепление папаином применяют для получения двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, которые называют Fab-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим центром, при этом оставшуюся часть обозначают как Fc-фрагмент. Fab-фрагмент содержит также константный домен легкой цепи и C_H1-домен тяжелой цепи. После обработки пепсином получают F(ab')₂-фрагмент, который несет два антигенсвязывающих центра и все еще сохраняет способность к перекрестному сшиванию с антигеном.

Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов присутствием дополнительных остатков, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела на С-конце C_H1-домена. F(ab')2фрагменты антител представляют собой пары Fab'-фрагментов, связанных с помощью остатков цистеина в шарнирной области. Известны другие химические сочетания фрагментов антител.

Fv-фрагмент содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий центр, состоящий из димера, включающего вариабельную область одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В этой конфигурации три CDR каждой вариабельной области взаимодействуют с определенным антигенсвязывающим центром на поверхности димера VH-V_L. В целом шесть CDR обусловливают специфичность антитела в отношении связывания антигена.

- 7 039944

Одноцепочечный Fv или scFv-фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fvвариант, содержащий V_H- и VL-области антитела, при этом области присутствуют в одной полипептидной цепи. Одноцепочечный Fv обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним. Полипептид scFv необязательно может содержать также полипептидный линкер, расположенный между V_H- и VL-областями для облегчения образования трехмерной структуры, требуемой для связывания антигена с помощью scFv (см., например, Pluckthun, в: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1991, cc. 269-315).

Другие обладающие способностью к распознаванию фрагменты антител включают фрагменты, которые содержат пару расположенных в виде тандема Fd-сегментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), образующих пару антигенсвязывающих участков. Указанные линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими, что описано, например, у Zapata и др., Protein Eng. 8(10), 1995, cc. 1057-1062.

Гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела представляет собой специфический тип химерного антитела, которое включает вариант аминокислотной последовательности иммуноглобулина или его фрагмента, который обладает способностью связываться с предварительно определенным антигеном и который содержит один или несколько FR, который(е) имеет(ют) аминокислотную последовательность, практически соответствующую последовательности человеческого иммуноглобулина, и один или несколько CDR, который(е) имеет(ют) аминокислотную последовательность, которая практически соответствует аминокислотной последовательности нечеловеческого иммуноглобулина. Указанную нечеловеческую аминокислотную последовательность, которую часто обозначают как импортная последовательность, как правило, получают из импортной области антитела, в частности вариабельной области. В целом гуманизированное антитело включает по меньшей мере CDR или HVL нечеловеческого антитела, встроенные между FR вариабельной области человеческой тяжелой или легкой цепи. В настоящем изобретении описаны специфические гуманизированные антитела к CD40, которые содержат CDR, полученные из мышиных моноклональных антител, которые представлены в табл. 3 и 4, встроенные между FR последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии. Должно быть очевидно, что определенные остатки мышиного FR можно импортировать для обеспечения функции гуманизированных антител, и, следовательно, определенные остатки последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии модифицируют для того, чтобы они были такими же как в соответствующей мышиной последовательности.

В другом объекте изобретения гуманизированное антитело к CD40 содержит практически все из по меньшей мере одной и, как правило, двух вариабельных областей (таких, например, как входящие в Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fabc- и Fv-фрагменты), в которых все или практически все CDR соответствуют CDR нечеловеческих иммуноглобулинов, и согласно настоящему изобретению все CDR представляют собой мышиные последовательности, подробно описанные в представленных ниже табл.1-4, и все или практически все FR представляют собой FR, которые имеют консенсусную последовательность или последовательность зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. В другом объекте изобретения гуманизированное антитело к CD40 включает также по меньшей мере часть Fc-области иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Как правило, антитело должно содержать как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи. Антитело может включать также при необходимости один или несколько из следующих участков: C_H1, шарнирная область, C_H2, C_H3 и/или C_H4 тяжелой цепи.

Гуманизированное антитело к CD40 можно выбирать из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG₂, IgG₃, IgG4, IgA1 и IgA₂. В альтернативном варианте гуманизированное антитело к CD40 может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа иммуноглобулинов, и выбор конкретных константных доменов для оптимизации требуемых эффекторных функций находится в компетенции обычного специалиста в данной области. Конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения являются антитела, которые представляют собой антитела изотипа IgG1 и более конкретно антитела изотипа IgG1, в которых выключены эффекторные функции.

FR и CDR или HVL гуманизированного антитела к CD40 не обязательно должны точно соответствовать родительским последовательностям. Например, один или несколько остатков в импортном CDR или HVL или в консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии FR можно изменять (например, посредством мутагенеза) путем замены, инсерции или делеции, в результате чего полученный аминокислотный остаток становится не идентичным исходному остатку в соответствующем положении любой родительской последовательности, но, тем не менее, антитело сохраняет функцию, такую как способность связываться с CD40. Указанное изменение, как правило, не должно быть обширным и должно представлять собой консервативные изменения. Как правило, по меньшей мере 75% остатков, чаще по меньшей мере 90% и наиболее часто более 95%, или более 98%, или более 99% гуманизированного антитела должно соответствовать остаткам родительской консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии FR и импортных последовательностей CDR.

Остатки иммуноглобулина, которые влияют на поверхность раздела между вариабельными областями тяжелой и легкой цепи (поверхность раздела V_L-V_H), представляют собой остатки, которые влия

- 8 039944 ют на близость или ориентацию двух цепей относительно друг друга. Конкретными остатками, которые могут участвовать во взаимодействиях между цепями, являются остатки V_L 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 и 98 и остатки VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 и 103 (согласно системе нумерации, предложенной Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). В US 6407213 обсуждается также, что в указанном взаимодействии могут участвовать такие остатки как остатки V_L 43 и 85 и остатки VH 43 и 60. Хотя указанные остатки указаны только для человеческого IgG, их можно рассматривать и для других видов. Важные остатки антитела, которые, как ожидается, могут участвовать во взаимодействиях между цепями, отбирают для замены в консенсусной последовательности.

Понятия консенсусная последовательность и консенсусное антитело относятся к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в каждом положении во всех иммуноглобулинах любого класса, изотипа или в любой субъединичной структуре, например вариабельной области человеческого иммуноглобулина. Консенсусная последовательность может базироваться на иммуноглобулинах конкретных видов или множества видов. Под консенсусной/консенсусным последовательностью, структурой или антителом подразумевают консенсусную человеческую последовательность, указанную в конкретных вариантах осуществления изобретения, и понятие относится к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающиеся остатки в каждом положении во всех человеческих иммуноглобулинах конкретного класса, изотипа или субъединичной структуры. Таким образом, консенсусная последовательность содержит аминокислотную последовательность, которая имеет в каждом положении аминокислоту, которая присутствует в одном или нескольких известных иммуноглобулинах, но которая может не представлять собой точную копию полной аминокислотной последовательности любого индивидуального иммуноглобулина. Вариабельную область консенсусной последовательности не получают из какого-либо встречающегося в естественных условиях антитела или иммуноглобулина (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) и его вариантов. Консенсусные последовательности FR тяжелой и легкой цепи и их варианты представляют собой ценные последовательности для получения гуманизированных антител к CD40 (см., например, US 6037454 и 6054297).

Человеческие последовательности зародышевой линии присутствуют в естественных условиях в популяции человеческих антител. Комбинация этих генов зародышевой линии создает разнообразие антител. Последовательности зародышевой линии антитела легкой цепи антитела получают из консервативных человеческих v-генов и j-генов зародышевой линии каппа или лямбда. Аналогично этому последовательности тяжелой цепи получают из v-, d- и j-генов зародышевой линии (LeFranc М-Р и LeFranc G, The Immunoglobulin Facts Book, изд-во Academic Press, 2001).

В контексте настоящего описания понятия вариант, вариант антитела к CD40, гуманизированный вариант антитела к CD40 или вариант гуманизированного антитела к CD40 все означают гуманизированное антитело к CD40, которое содержит по меньшей мере мышиный CDR вариабельной области тяжелой цепи, который имеет любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-4, или последовательность мышиного CDR легкой цепи, полученную из мышиного моноклонального антитела, которая представлена в любой из SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8, и последовательности FR, полученные из человеческих консенсусных последовательностей. К вариантам относятся последовательности, имеющие одну или несколько аминокислотных замен в вариабельных областях одной или обеих легких цепей или тяжелых цепей, при условии, что изменение аминокислоты не оказывает существенного воздействия на связывание антитела с CD40. Примерами гуманизированных антител, полученных согласно настоящему изобретению, являются антитела, обозначенные как антитело А, антитело В и антитело С, и различные последовательности их тяжелых и легких цепей, представленные в SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 40.

Выделенное антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или очищено от компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты естественного окружения антитела представляют собой субстанции, которые могут влиять на диагностическое или терапевтическое применение антитела и могут представлять собой ферменты, гормоны или другие белковые или небелковые растворенные вещества. В одном из объектов изобретения выделенное антитело должно представлять собой антитело, очищенное до степени, превышающей 95 мас.%.

Выделенное антитело представляет собой антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, в которых оно продуцировано, если в нем не присутствует ни один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки, во время которой удаляют рекомбинантный клеточной материал.

Понятие характеристика антитела относится к факторам, которые описывают распознавание антителом антигена или эффективность антитела in vivo. Изменения в аминокислотной последовательности антитела могут влиять на свойства антитела, такие как фолдинг, и могут влиять на физические факторы, такие как начальная скорость связывания антитела с антигеном (k_a), константа диссоциации антитела от антигена (kd), константа аффинности антитела к антигену (Kd), конформация антитела, стабильность белка и время полужизни антитела.

- 9 039944

В контексте настоящего описания понятие эпитопное мечение относится к антителу к CD40, слитому с эпитопной меткой. Эпитопная метка представляет собой полипептид, состоящий из достаточного количества аминокислот для создания эпитопа для производства антитела, при этом ее создают так, чтобы она не оказывала воздействия на требуемую активность гуманизированного антитела к CD40. Эпитопная метка, как правило, является в значительной степени уникальной, в результате чего антитело, которое образуется против эпитопной метки, не дает выраженную перекрестную реакцию с другими эпитопами. Приемлемые полипептиды-метки, как правило, содержат по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и, как правило, содержат примерно 8-50 аминокислотных остатков или примерно 9-30 остатков. Примерами эпитопных меток и антител, которые связываются с эпитопом, являются полипептидметка flu НА (НА вируса гриппа) и соответствующее ему антитело 12СА5 (Field и др., Mol. Cell. Biol. 8, 1988 2159-2165); c-myc-метка и соответствующие антитела 8F9, 3С7, 6Е10, G4, В7 и 9Е10 (Evan и др., Mol. Cell. Biol. 5(12), 1985,, cc. 3610-3616); и метка, включающая гликопротеин D (gD) вируса герпеса простого, и соответствующее антитело (Paborsky и др. Protein Engineering 3(6), 1990, cc. 547-553). В конкретных вариантах осуществления изобретения эпитопная метка представляет собой связывающий антитело эпитоп-спасатель. В контексте настоящего описания понятие связывающий антитело эпитопспасатель относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (такой как IgG1, IgG₂, IgG₃ или IgG4), ответственному за удлинение времени полужизни молекулы IgG in vivo в сыворотке.

Антитела можно конъюгировать также с пролекарствами. Пролекарство представляет собой предшественник или производное фармацевтически активной субстанции См., например, Wilman в: Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemicals Society Transactions, 14, 1986, cc. 375-382, 615-й симпозиум в Белфасте (1986); и Stella и др. в Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, под ред. Borchardt и др., изд- во Humana Press, 1985, cc. 247-267.

Для диагностических целей, а также для мониторинга лечения антитела, применяемые в способе согласно изобретению, можно конъюгировать также с меткой, либо только с меткой, либо с меткой в сочетании с дополнительным вторым агентом (пролекарство и др.). Метка, в отличие от второго дополнительно агента, представляет собой субстанцию, которая представляет собой выявляемое соединение или выявляемую композицию, и ее можно конъюгировать прямо или косвенно с гуманизированным антителом, предлагаемым в настоящем изобретении. Метка сама по себе может представлять собой выявляемую субстанцию (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, как в случае ферментативной метки, она может катализировать химическое изменение соединения или композиции, представляющего/представляющей собой субстрат, которое можно выявлять. Меченое гуманизированное антитело к CD40 можно приготавливать и применять для различных целей, включая диагностику in vitro и in vivo.

Антитела, применяемые в способе согласно изобретению, можно приготавливать таким образом, чтобы они представляли собой часть препарата в виде липосомы, для их эффективного введения in vivo. Липосома представляет собой небольшой пузырек, состоящий из различного типа липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активное вещество, который можно применять для введения млекопитающему соединения или композиции, например гуманизированного антитела к CD40, представленного в настоящем описании, в сочетании или в комбинации с одним или несколькими фармацевтическими действующими веществами и/или метками. Компоненты липосом обычно упорядочены в виде двуслойной структуры, аналогичной липидной структуре биологических мембран.

Понятие млекопитающее, подлежащее лечению, относится к любому животному, которое принадлежит к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также живущих в зоопарке животных, предназначенных для спорта или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.

В контексте настоящего описания понятие нарушение относится к волчаночному нефриту.

Понятие внутривенный болюс или внутривенный импульс относится к введению лекарственного средства животного или человека таким образом, чтобы лекарственное средство поступало в организм в течение примерно 15 мин или менее, как правило, 5 мин или менее.

Понятие подкожное введение относится к интродукции агента под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара. Пощипывание или оттягивание кожи вверх вниз от низлежащей ткани может создавать карман.

Понятие подкожная инфузия относится к интродукции лекарственного средства под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара в течение периода времени, составляющего (но, не ограничиваясь только указанным) 30 мин или менее или 90 мин или менее. Необязательно инфузию можно осуществлять путем подкожной имплантации насоса для введения лекарственного средства, имплантированного под кожу больного животного или человека, при этом насос обеспечивает введение лекарственного средства в предварительно определенном количестве в течение предварительно определенного периода времени, составляющего 30 мин, 90 мин или периода времени, соответствующего продолжительности схемы лечения.

- 10 039944

Понятие подкожный болюс относится к введению лекарственного средства под кожу больного животного или человека, при этом продолжительность введения лекарственного средства в виде болюса составляет менее примерно 15 мин; в другом объекте изобретения менее 5 мин, а еще в одном объекте изобретения в течение менее 60 с. В следующем объекте изобретения введение осуществляют в карман между кожей и низлежащей тканью, где карман можно создавать путем пощипывания или оттягивания кожи вверх вниз от низлежащей ткани.

В контексте настоящего описания понятие терапевтически эффективное количество относится к количеству действующего вещества, при использовании которого происходит ослабление или облечение одного или нескольких симптомов нарушения, подлежащего лечению. Действующее вещество применяют таким образом, что в указанном количестве оно оказывает благоприятное действие на пациента, например действие, проявляющееся в прекращении роста или приводящее к элиминации клеток. В одном из объектов изобретения действующее вещество, взятое в терапевтически эффективном количестве, обладает апоптозной активностью или способностью индуцировать клеточную гибель. В другом объекте изобретения терапевтически эффективное количество относится к концентрации в сыворотке пациента, при которой, как установлено, действующее вещество является эффективным в отношении замедления развития болезни. Эффективность можно оценивать общепринятыми путями в зависимости от подлежащего лечению состояния. Например, при неопластических заболеваниях или нарушениях, отличающихся присутствием клеток, которые экспрессируют CD40, эффективность можно оценивать по времени до прогрессирования заболевания или по уровням ответов.

В контексте настоящего описания понятия лечение и терапия и т.п. относятся к терапевтическим, а также профилактическим или подавляющим мероприятиям в отношении заболевания или нарушения, которые приводят к любому клинически важному или благоприятному действию, включая (но, не ограничиваясь только ими) облегчение или ослабления одного или нескольких симптомов, регресс, замедление или прекращение развития заболевания или нарушения. Таким образом, например, под понятие лечение подпадает введение агента до или после начала проявления симптома заболевания или нарушения, что приводит к предупреждению или устранению одного или нескольких признаков заболевания или нарушения. В другом примере понятие относится к введению агента после клинического проявления болезни для борьбы с симптомами болезни. Кроме того, в контексте настоящего описания понятие лечение или терапия относятся к введению агента после возникновения и после развития клинических симптомов, где введение оказывает воздействие на клинические параметры заболевания или нарушения, такие как степень повреждения ткани или количество и распространение метастазов, вне зависимости от того, приводит или нет лечение к облегчению заболевания. Кроме того, если применение композиций, предлагаемых в изобретении, либо индивидуально, либо в сочетании с другим терапевтическим средством купирует или облегчает по меньшей мере один из симптомов подлежащего лечению нарушения по сравнению с указанным симптомом без применения содержащей гуманизированное антитело к CD40 композиции, результат следует рассматривать как эффективное лечение требуемого нарушения вне зависимости от того, происходит или нет облегчение всех симптомов нарушения.

Понятие листовка-вкладыш в упаковке относится к инструкциям, которые принято включать в предназначенные для продажи упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, методах применения, введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.

Если специально не указано иначе в настоящей заявке, понятия фармацевтическая композиция, фармацевтический препарат и препарат могут использоваться взаимозаменяемо.

Антитела

Гуманизированные антитела к CD40 и связывающие агенты могут использоваться для лечения и/или предотвращения различных заболеваний или нарушений, характеризующихся пролиферацией клеток, который экспрессируют поверхностный антиген CD40, таких как волчаночный нефрит. Гуманизированное антитело к CD40 и CD40-связывающий агент каждое/каждый включает по меньшей мере область, которая специфически распознает CD40 эпитоп (то есть антигенсвязывающий фрагмент).

Способы получения антитела к CD40 ранее были описаны в US 20110243932, полное содержание которого включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Как было ранее описано в US 20110243932, изначально охарактеризованные мышиные антитела отбирали на основании характеристик связывания с CD40.

На основании этих начальных исследований отбирали мышиные антитела, которые имели вариабельные области тяжелых цепей, представленные ниже в табл.1, и вариабельные области легких цепей, представленные ниже в табл.2.

- 11 039944

Таблица 1. Мышиные лидерные антитела к CD40 - последовательности VH

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGR IDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY 2Н11 YVGTYGYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:1)

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVKQRPEKGLEWIGR IDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCTTSY 10F2 YVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:2)

EVQLQQSGAELVRPGASVQLSCTASGFNIKDYYVHWVKQRPEKGLEWIGR

IDPED GDTKF APKFQGKATMT ADT S SNT VYLHL S SLT SEDT AVYYCTT SY

19B10 YVGTYGYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:3)

EVQLVESGGGLVKPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAY ISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTALYYCARQD

20E2 GYRYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:4)

Таблица 2. Мышиные лидерные антитела к CD40 - последовательности VK QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG

2Н11 TKLEIK (SEQ ID NO:5)

QIVLTQSPTIMSASPGEKVIITCSATSSVSYILWFQQKPGTSPKLWIYST

SNLASGVPARFSGSGSGASYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG

10F2 TKLEIK (SEQ ID NO:6)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTFYPYTFGGG 19B10 TKLEIK (SEQ ID NO:7)

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPP KLLIYWTSTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNLQAEDLAVYYCQNDYTY 20E2 PLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:8)

Последовательности человеческих каркасных участков отбирали для каждого мышиного лидерного антитела на основе гомологии каркасных участков, структуры CDR, консервативных канонических остатков, консервативных остатков, образующих поверхность раздела, и других параметров.

Отобранные CDR мышиных тяжелых цепи и легких цепей различных мышиных антител представлены в табл.З и табл.4 соответственно.

Таблица 3. Последовательности CDR тяжелых цепей

Обозначение

конструкции 2Н11	H-CDR1 GFNIKD УУУЯ	H-CDR2 RIDPEDGDSKYAPKFOG	H-CDR3 SYYVGTYGY
	SEQ ID NO:9	SEQ ID NO:12	SEQ ID NO:16
10F2	GFNIKD УУ/Я	RIDPEDGD TKYDPKFOG	SYYVGTYGY
	SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:13	SEQ ID NO:16
19В10	GFNIKD УУУЯ	RIDPEDGD TKFAPKFOG	SYYVGTYGY
	SEQ ID NO:9	SEQ ID NO:14	SEQ ID NO:16
20Е2	GFTF SDYGMH	YISSGNRIIYYAD TVKG	QDGYRYAMDY
	SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:15	SEQ ID NO:17

H-CDR1.

Представленные выше последовательности H-CDR1 определены согласно номенклатуре Хотиа (А1Lazikani и др., JMB 273, 1997, сс. 927-948). Последовательности CDR1 и CDR2, определенные согласно номенклатуре Кэбота, выделены жирным шрифтом и курсивом, а остатки, определенные согласно номенклатуре IMGT, подчеркнуты в указанной выше таблице. Последовательности H-CDR3 для каждого из антител 2Н11, 10F2 и 19В10 представляет собой TTSYYVGTYGY [р NO: 77), а для 20Е2 представляет собой ARQDGYRYAMDY [р NO: 78).

- 12039944

Таблица 4. Последовательности CDR легких цепей

Обозначение

конструкции L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3
2Н11	SASSSVSYML	STSNLAS	OORTFYPYT
	SEQ ID NO:18	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:24
10F2	SATSSVSYIL	STSNLAS	OORTFYPYT
	SEQ ID NO:19	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:24
19В10	SASSSVSYML	STSNLAS	OORTFYPYT
	SEQ ID NO:20	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:24
20Е2	KSSOSLLNSGNOKNYL T	WTSTRES	ONDYTYPLT
	SEQ ID NO:21	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:25

И в этом случае также в табл.4 применяли номенклатуру Хотиа, при этом последовательности, определенные согласно номенклатуре Кэбота, выделены жирным шрифтом и курсивом, а определенные согласно номенклатуре IMGT подчеркнуты.

Fab-фрагменты, для которых обнаружено улучшенное или эквивалентное связывание по сравнению с химерным родительским Fab-фрагментом, отбирали для конверсии в IgG. Клоны из 20Е2-серий превращали в два различных формата IgG: a) IgG4DM (двойной мутанат (double mutant)) имел две мутации в Fc/шарнирной области, а именно, мутацию Ser228Pro, которая приводит к снижению образования половинок молекул, и мутацию Leu235Glu, которая дополнительно снижает связывание FcyR. б) IgGIKO (выключение (knock-out) эффекторных функций) имел две мутации в Fc-области, а именно, Leu234Ala и Leu235Ala, которые снижают эффекторную функцию, такую как связывание FcyR и комплемента. Оба формата IgG описаны в литературе. В примере 1 более подробно описана гуманизация трех антителкандидатов. В результате осуществления указанной гуманизации удалось создать последовательности гуманизированных антител, последовательности легких и тяжелых цепей которых представлены ниже.

Обозначение	Последовательность	SEQ ID NO:
Антитело A (легкая цепь)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTW	26
HQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGS GTDFTLTIS
SLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI
FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
Антитело А (тяжелая цепь, IgGIKO)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDY GMHWVRQAP	27
GKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNS LRAED TALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSAS ТК GP S VF PLAP S S KS Т S GGTAALGCLVKDY F РЕ PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело А (тяжелая цепь,	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDY GMHWVRQAP	28
GKGLEWVAYIS SGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ

- 13 039944

IgGl)	MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSAS ТК GP SVF FLAPS SKS ТSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело A (тяжелая цепь, IgG4DM)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP	29
GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSAS TK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Антитело А (тяжелая, IgGlKOb)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP	30
GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSSAS TK GP SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело В (легкая цепь)	DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYL	31
TWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFT
LTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLS S PVTKS FNRGE C
Антитело В (тяжелая цепь, IgGlKO)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP	32
GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS SAS TK GP SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело В (тяжелая цепь, IgGl)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP	33
GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS SAS TK GP SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS

- 14 039944

	KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело В (тяжелая цепь ,IgG4 DM)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP	34
GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS SAS TK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Антитело В (тяжелая цепь, IgGlKOb)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRLS CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP	35
GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS SAS TK GP SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело С (легкая цепь)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIKRT VAAP SVFIFPPSDEQLKS GTAS WCLLNNF Y PREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	36
Антитело С (тяжелая цепь, IgGlKO)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP	37
GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME
LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSASTKG P SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GAL T S GVHT F PAVLQ S S GLY S LS S WTVP S S S LGTQ T YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело С (тяжелая цепь, IgGl)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP	38
GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME
LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSASTKG P SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GAL T S GVHT F PAVLQ S S GLY S LS S WTVP S S S LGTQ TYI CNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело С (тяжелая цепь ,IgG4 DM)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP	39
GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME
LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSASTKG

- 15 039944

	PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Антитело С (тяжелая цепь, IgGlKOb)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP	40
GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME
LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSASTKG P SVF PLAPS SKS TSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGAL T S GVHT F PAVLQ S S GLY S LS S WTVP S S S LGTQ T YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGWFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированные антитела к CD40, включая их антигенсвязывающие фрагменты, такие как вариабельные области тяжелых и легких цепей, содержат аминокислотную последовательность, которая включает остатки, полученные из CDR антитела А (последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30; последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 26), антитела В (последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35; последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 31) и антитела С (последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40; последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 36), которые описаны выше, и аминокислотные остатки, полученные из каркасных участков человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела к CD40 необязательно включают специфические аминокислотные замены в консенсусных каркасных участках или каркасных участках зародышевой линии.

Специфическая замена аминокислотных остатков в этих каркасных участках может улучшать различные аспекты действия антител, такие как аффинность связывания и/или стабильность, по сравнению с установленными у гуманизированных антител, полученных путем непосредственного обмена CDR или HVL на каркасные участки человеческой зародышевой линии, что продемонстрировано ниже в примерах.

Некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения являются другие моноклональные антитела, последовательности тяжелых цепей (VH) которых представлены в SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 4, а последовательности легких цепей (VL) которых представлены в SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8 (см. выше табл.1 и 2). CDR-последовательности этих мышиных антител представлены в табл.3 и 4, интродукция указанных CDR в FR человеческих консенсусных вариабельных областей тяжелых и легких цепей может приводить к получению приемлемых гуманизированных антител, предлагаемых в настоящем изобретении.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения гуманизированные антитела к CD40, представленные в настоящем описании, содержат по меньшей мере вариабельную область тяжелой или легкой цепи, которая содержит CDR или HVL мышиных моноклональных антител, представленных выше в табл.1-4, и FR вариабельных областей тяжелых и легких цепей человеческой зародышевой линии. В приведенных в качестве примера вариантах осуществления изобретения, созданные гуманизированные антитела представляют собой: антитело А, антитело В и антитело С и их различные последовательности тяжелых и легких цепей, которые приведены в SEQ ID NO: 26-SEQ ID NO: 40.

Конкретными вариантами осуществления изобретения являются антитела, которые имеют последовательность тяжелой цепи, представленную в любой из SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, в сочетании с последовательностью легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 26. В другом варианте антитела имеют последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, в сочетании с последовательностью легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 31. Дополнительными вариантами осуществления изобретения являются гуманизированные антитела, которые имеют последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40, в сочетании с последовательностью легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 36.

CDR указанных последовательностей приведены в табл.3 и 4. В конкретных вариантах осуществления изобретения подразумевается, что химерные антитела с заменами CDR-участков (т.е., например, замена одного или двух CDR в антителе А на аналогичные CDR из антитела С) между этими, приведенны- 16 039944 ми в качестве примеров иммуноглобулинами могут приводить к получению пригодных антител.

В конкретных вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело к CD40 представляет собой фрагмент антитела. Различные фрагменты антител в целом описаны выше, а также описаны методы, разработанные для получения фрагментов антител. Фрагменты можно получать путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, cc. 107-117 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81). В альтернативном варианте фрагменты можно получать непосредственно в рекомбинантных клетках-хозяевах. Например, Fab'-SH-фрагменты можно выделять непосредственно из Е. coli и химически сшивать с получением F(ab')₂-фрагментов (см., например, Carter и др., Bio/Technology 10, 1992, cc. 163-167). Согласно другому подходу F(ab')₂-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантной клеткихозяина. Другие методики получения фрагментов антител должны быть очевидны специалисту в данной области.

К конкретным вариантам осуществления изобретения относится F(ab')2-фрагмент гуманизированного антитела к CD40, который имеет последовательность тяжелой цепи, представленную в любой из SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, в сочетании с последовательностью легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 26. Другим вариантом являются антитела, которые имеют последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, в сочетании с последовательностью легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 31. Дополнительными вариантами осуществления изобретения являются гуманизированные антитела, которые имеют последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40, в сочетании с последовательностью легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 36. Указанные варианты осуществления изобретения могут включать интактное антитело, содержащее указанные F(ab')₂-фрагменты.

Эффекторный домен антитела можно получать из организма любых приемлемых видов позвоночных животных и любых изотипов. Изотипы из организма различных видов животных отличаются по способности опосредовать эффекторные функции. Например, способность человеческого иммуноглобулина опосредовать CDC и ADCC/ADCP, как правило, соответствует следующему порядку: IgM=IgG₁=IgG₃>IgG₂>IgG₄ „IgG^IgGpIgG^IgM/IgG, соответственно.

Способность мышиных иммуноглобулинов опосредовать CDC и ADCC/ADCP, как правило, соответствует следующему порядку:

мышиный IgM^IgG₃»IgG_2b>IgG_2a»IgGi и IgG_2b>IgG_2a>IgG₁»IgG₃ соответственно.

В другом примере мышиный IgG_2a опосредует ADCC, а мышиный IgG_2a и IgM опосредуют CDC.

Модификации антител

Гуманизированные антитела к CD40 и агенты могут включать модификации гуманизированного антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента.

Конъюгаты гуманизированного антитела к CD40 можно получать известными методами, с использованием целого ряда бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидатНС1), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидосоединения (такие как бис(параазидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получать согласно методу, описанному у Vitetta и др., Science, 238, 1987, с. 1098). Меченная с помощью С¹⁴ 1-изотиоцианатобензил3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклеотида с антителом. Конъюгаты можно получать также с использованием расщепляемого линкера.

На основе гуманизированных антитела к CD40, представленных в настоящем описании, можно приготавливать формы типа иммунолипосом.

Содержащие антитело липосомы получают с помощью хорошо известных в данной области методов, например, описанных у Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 82, 1995, с. 3688; Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 77, 1980, с 4030; US 4485045 и 4544545. Липосомы с удлиненным временем жизни в кровотоке описаны в US 5013556.

Наиболее предпочтительные липосомы можно получать методом упаривания с обращенной фазой с использованием липидной композиции, включающей фосфатидилхолин, холестерин и дериватизированный с помощью ПЭГ фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор, получая липосомы требуемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, можно включать в липосомы согласно методу, описанному у Martin и др., J. Biol. Che., 257, 1982, сс. 286-288, посредством реакции образования дисульфидной связи.

В других вариантах осуществления изобретения можно применять также ковалентные модификации гуманизированного антитела к CD40. Ковалентные модификации включают модификацию цистеи

- 17 039944 нильных остатков, гистидильных остатков, лизинильных и аминоконцевых остатков, аргинильных остатков, тирозильных остатков, карбоксильных боковых групп (аспартил или глутамил), глутаминильных и аспарагинильных остатков, или серильных, или треонильных остатков. Другой тип ковалентной модификации включает химическое или ферментативное сшивание гликозидов с антителом. Указанные модификации можно осуществлять с помощью химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления антитела, если это возможно. Для интродукции других типов ковалентных модификаций в молекулу антитела можно применять взаимодействие меченых аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который может взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или аминоконцевыми или карбоксиконцевыми остатками.

Удаление любых углеводных фрагментов, присутствующих на антителе, можно осуществлять химическим или ферментативным путем. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin и др., Arch. Biochem. Biophys. 259, 1987, с. 52 и у Edge и др., Anal. Biochem., 118, 1981, с. 131. Ферментативное отщепление углеводных фрагментов на антителах можно осуществлять с помощью эндо- и экзогликозидаз согласно методу, описанному у Thotakura и др., Meth. Enzymol., 138, 1987, с. 350.

Другой тип пригодной ковалентной модификации предусматривает связывание антитела с одним из многочисленных небелковых полимеров, таких, например, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, с помощью методов, описанных в одном или нескольких US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 и US 4179337.

Гуманизация и варианты аминокислотной последовательности

Варианты аминокислотной последовательности антитела к CD40 можно поучать путем интродукции соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела к CD40 или с помощью пептидного синтеза. Указанные варианты включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител к CD40, представленных в качестве примера в настоящем описании. Для получения конечной конструкции применяют любую комбинацию делеций, инсерции и замен при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Аминокислотные изменения могут также изменять пост-трансляционный процессинг гуманизированного антитела к CD40 или его варианта, например изменение количества или положения сайтов гликозилирования.

Пригодным методом идентификации конкретных остатков или областей в антителе к CD40, которые представляют собой предпочтительные сайты для мутагенеза, является так называемый аланинсканирующий мутагенез, описан у Cunningham и Wells, Science, 244, 1989, сс. 1081-1085). С его помощью идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (как правило, на аланин) для воздействия на взаимодействие аминокислот с антигеном CD40. Те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к заменам, затем усовершенствуют путем интродукции дополнительных или других вариантов в сайты замены или сайтов замены. При этом, хотя сайт для интродукции вариации аминокислотной последовательности является предопределенным, природа самой мутации не является предопределенной. Например, для анализа эффективности мутации в рассматриваемом сайте осуществляют сканирование аланином или неспецифический мутагенез кодона-мишени или области-мишени и полученные в результате экспрессии варианты антитела к CD40 подвергают скринингу в отношении требуемой активности.

Инсерции в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния различной длины от одного остатка до полипептидов, которые содержат сто или большее количество остатков, а также инсерции внутрь последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Примерами концевых инсерции является антитело к CD40, слиток с эпитопом-меткой. Другие инсерционные варианты молекулы антитела к CD40 включают слияние с N- или С-концом антитела к CD40 фермента или полипептида, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке.

Другим типом варианта является вариант, включающий аминокислотную замену. В этих вариантах по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела к CD40 удален, а другой остаток встроен на его место. Представляющими наибольший интерес сайтами для мутагенеза путем замен являются гипервариабельные участки, но можно осуществлять также изменения в FR. Консервативные замены представлены в табл. 5 под названием предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно интродуцировать более существенные замены, обозначенные как Примеры замен, или другие замены, описанные ниже при ссылке на класс аминокислот, и затем продукты можно подвергать скринингу.

- 18 039944

Таблица 5

Исходный остаток	Примеры замен	Предпочтительные замены
Ala (А)	Val; Leu; lie	Val
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Asp; Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu;	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gin (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gin	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
He (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин	Leu
Leu (L)	норлейцин; lie; Val; Met; Ala; Phe	lie
Lys (K)	Arg; Phe; lie	Arg
Met (M)	Leu; Phe; lie	Leu
Phe (F)	Leu; Val; lie; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	lie; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин	Leu

В химии белков является общепринятым, что биологические свойства антитела можно модифицировать путем выбора замен, которые в значительной степени различаются по их воздействию на поддержание (а) структуры каркаса полипептида в области замены, например складчатой или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (в) размера боковой цепи. Встречающиеся в естественных условиях остатки подразделяют на группы на основе общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены предусматривают замену представителя одного из этих классов на представителя другого класса.

Любой из остатков цистеина, не участвующий в поддержании соответствующей конформации гуманизированного антитела к CD40 или его варианта, можно заменять также, как правило, на серин, с целью повышения устойчивости молекулы к окислению и предупреждению аномального перекрестного сшивания или для создания точек для конъюгации с целевым соединением. И наоборот, можно вводить в антитело цистеиновую(е) связь(и) для повышения его стабильности (особенно если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент).

Один из типов создаваемого путем замены варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) в результате вариант(ы), отобранный(е) для дальнейшего усовершенствования, должен(ы) обладать улучшенными биологическими свойствами относительно родительского антитела, из которого оно (они) получено(ы). Приемлемый путь получения таких вариантов на основе замены включает созревание аффинности с использованием фаговой презентации. В целом, метод состоит в следующем: несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации, получая все возможные аминокислотные замены в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антитела презентируются в одновалентной форме на поверхности частиц нитчатого фага в виде слияний с продуктом гена III фага М13, который присутствует в каждой частице. Варианты, которые презентируются фагом, затем подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, аффинности связывания). Для того чтобы выявлять перспективные с точки зрения модификации сайты гипервариабельного участка, можно осуществлять сканирующий мутагенез аланином с целью идентификации остатков гипервариабельного участка, которые наиболее важны для связывания антигена. В альтернативном или дополнительном варианте может оказаться целесообразным анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело с целью выявления точек соприкосновения между антителом и человеческим CD40. Такие остатки в точках соприкосновения и соседние остатки является кандидатами для замены с помощью способов, разработанных при создании настоящего изобрете- 19 039944 ния. После получения таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, представленному в данном описании, и антитела с улучшенными свойствами по данным одного или нескольких соответствующих анализов отбирают для дальнейшей разработки.

Другим типом получения аминокислотного варианта антитела является изменение исходной схемы гликозилирования антитела. Под изменением подразумевают делецию одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, не присутствующих в антителе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может требоваться модифицировать антитела, предлагаемые в изобретении, добавляя сайты гликозилирования. Гликозилирование антител обычно происходит посредством либо N-связывания, либо О-связывания. N-связывание предусматривает присоединение углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности, предназначенные для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Так, присутствие любой их этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Освязанное гликозилирование предусматривает присоединение одного из сахаров, таких как Nацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиаминокислоте, наиболее часто к серину или треонину, хотя можно применять также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Таким образом, для гликозилирования данного белка, например антитела, создают аминокислотную последовательность белка, которая содержит одну или несколько описанных выше трипептидных последовательностей (для сайтов N-гликозилирования). Изменение может также представлять собой добавление или замену одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов Огликозилирования).

Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты аминокислотных последовательностей антитела к CD40, получают с помощью различных методов, известных в данной области. Эти методы включают (но, не ограничиваясь только ими) выделение из природного источника (в случае встречающихся в естественных условиях вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (или сайтнаправленного мутагенеза), ПЦРмутагенеза и кассетного мутагенеза полученного ранее варианта или не являющейся вариантом версии антитела к CD40.

В контексте настоящего описания понятия идентичный или процент идентичности касательно двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Для определения процента идентичности последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, можно интродуцировать бреши в последовательность первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимального сравнительного анализа первичной структуры со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда в положении в первой последовательности находится такой же аминокислотный остаток или нуклеотид, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в указанном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений)х100). В некоторых вариантах осуществления изобретения две сравниваемые последовательности имеют одинаковую длину после интродукции при необходимости брешей в последовательности (например, исключая дополнительную последовательность, простирающуюся за последовательности, подлежащие сравнению). Например, когда сравнивают последовательности вариабельных областей, то лидерные и/или последовательности константных доменов не рассматриваются. При сравнении последовательностей двух последовательностей соответствующий CDR относится к CDR, расположенному в одинаковом положении в обеих последовательностях (например, CDR-H1 каждой последовательности).

Определение процента идентичности или процента сходства между двумя последовательностями можно осуществлять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять для сравнения двух последовательностей, является (но не ограничиваясь только ими) алгоритм Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc. 2264-2268, модифицированный согласно описанному у Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5877. Указанный алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, описанные у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410. Анализ нуклеотидов с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, в которой балл = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющей интерес белок. Анализ белков с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы XBLAST, в которой

- 20 039944 балл = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных представляющему интерес белку. Для осуществления сравнительных анализов первичной структуры, включающей бреши, можно применять программу Gapped BLAST, описанную у Altschul и др., Nucleic Acids, 25, 1997, cc. 3389-3402. В другом варианте можно применять PSI-Blast для осуществления итерационного поиска, позволяющего определять отдаленные взаимосвязи между молекулами (Id.). При применении программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно применять задаваемые по умолчанию параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным примером (но, не ограничиваясь только им) математического алгоритма, который можно применять для сравнения последовательностей, является алгоритм, описанный у Myers и Miller, CABIOS, 1989. Указанный алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ для сравнительного анализа первичной структуры последовательностей GCG. Когда программу ALIGN применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, то можно применять таблицу взвешенных остатков РАМ120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны в данной области и включают ADVANCE и ADAM, описанные у Torellis и Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10, 1994, cc. 3-5; и FASTA, описанный у Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, cc. 2444-2448. В программе FASTA параметр ktup обозначает контрольный параметр, который задает чувствительность и скорость поиска. Если ktup = 2, то сходные области в двух подлежащих сравнению последовательностях выявляют путем просмотра пар выравненных остатков; если ktup = 1, то оценивают индивидуальные выравненные аминокислоты. Для белковых последовательностей можно задавать значение ktup, равное 2 или 1, а для последовательностей ДНК значения в пределах от 1 до 6. В альтернативном варианте сравнительный анализ первичной структуры белковых последовательностей можно осуществлять с помощью алгоритма CLUSTAL W, описанного у Higgins и др., Methods Enzymol. 266, 1996, cc. 383-402.

Терапевтические применения

Гуманизированное антитело к CD40 или агент вводят любыми приемлемыми путями, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриносовой пути введения и, если требуется местное иммуносупрессорное лечение, путем введения в пораженную область (включая перфузию или другой путь обеспечения контакта трансплантата с антителом перед трансплантацией). Гуманизированное антитело к CD40 или агент можно вводить, например, с помощью инфузии или болюса. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, гуманизированное антитело к CD40 можно вводить путем пульсирующей инфузии, прежде всего понижающими дозами антитела. Согласно одному из объектов изобретения дозирование осуществляют путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в том числе в зависимости от того, является ли обработка кратковременной или пролонгированной.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза антитела должна зависеть от ряда факторов, таких как тип заболевания, подлежащего лечению, серьезность и процесс течения заболевания, вводят ли антитело для профилактических или терапевтических целей, предшествующая терапия, история болезни пациента и ответ на антитело, а также от предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или путем серий обработок.

В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 20 мг/кга (например, примерно 0,1-15 мг/кг/дозу) антитела можно сначала вводить пациенту в виде начальной предполагаемой дозой, путем, например, одного или нескольких введений или путем непрерывной инфузии. Как правило, суточная доза должна составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода времени, в зависимости от состояния, лечение продолжают до требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. Однако можно применять другие схемы введения доз. Успех указанной терапии легко оценивать общепринятыми методами и анализами. Пример схемы введения доз представлен в WO 94/04188.

В контексте настоящего описания понятие подавление имеет такое же значение, что и понятия облегчение и купирование, и относится к ослаблению одной или нескольких характеристик заболевания.

Композицию антитела можно включать в препаративную форму, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Важные в этом плане факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, клиническое состояния индивидуального пациента, причину нарушения, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. В этой связи терапевтически эффективное количество антитела, подлежащего введению, регулируют таким образом, чтобы оно представляло собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией CD40.

Антитело необязательно, но в определенных случаях, включают в препаративную форму в сочетании с одним или несколькими агентами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения волчаночного нефрита. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества гуманизированного антитела к CD40, присутствующего в препаративной форме, и других указанных

- 21 039944 выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, в которых их применяли ранее, или с использованием в дозе, составляющей примерно от 1 до 99% от их принятых для применения доз.

Для лечения или предотвращения волчаночного нефрита с помощью способов, представленных в настоящем описании, вводят индивидууму, который нуждается в таком лечении или предупреждении, в эффективном количестве антитело к CD40 или агент, где антитело (I) связывается с активированными иммунными клетками, которые экспрессируют CD40 и которые ассоциированы с болезненным состоянием, и (II) обладает иммуносупрессорным действием на активированные иммунные клетки.

Фармацевтические композиции и их введение

Композицию, содержащую CD40-связывающий агент (например, антитело к CD40), можно вводить индивидууму, который страдает или имеет риск развития волчаночного нефрита. Изобретение относится также к применению CD40-связывающего агента (например, антитела к CD40) для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики или лечения волчаночного нефрита. Понятие индивидуум в контексте настоящего описания означает любого пациента-млекопитающего, которому можно вводить CD40-связывающий агент, включая, например, человека и млекопитающих, кроме человека, таких как приматы, грызуны и собаки. Индивидуумов, включая людей, в частности, можно лечить с использованием способов, представленных в настоящем описании. Антитела или агенты можно вводить индивидуально или в сочетании с другими композициями для профилактики или лечения волчаночного нефрита.

Предпочтительными антителами для применения в указанных фармацевтических композициях являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое/который имеет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в любой из

SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO:

40.

В конкретных вариантах осуществления изобретения композицию CD40-связывающего агента вводят с помощью инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория или с помощью имплантата, где имплантат состоит из пористого, непористого или гелеобразного материала, включая мембрану, такую как мембрана из силастика, или волокно. Как правило, при введении композиции используют вещества, которые не абсорбируют антитело к CD40 или агент.

В других вариантах осуществления изобретения антитело к CD40 или агент вводят с помощью системы с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления изобретения можно использовать насос (см. например, Langer, Science 249, 1990, cc. 1527-1533; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14, 1989, с 201; Buchwald и др., Surgery 88, 1980, с. 507; Saudek и др., N. Engl. J. Med., 321, 1989, с 574). В другом варианте осуществления изобретения можно использовать полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, под ред. Langer и Wise, изд-во CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, под ред. Smolen и Ball, изд-во Wiley, New York, 1984); Ranger и Peppas, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23, 1983, с 61; см. также Levy и др., Science 228, 1985, с. 190; During и др., Ann. Neurol. 25, 1989, с. 351; Howard и др., J. Neurosurg. 81, 1989, с. 105). У Langer, выше, обсуждены другие системы с контролируемым высвобождением.

Связывающий CD40 агент (например, антитело к CD40) можно применять в виде фармацевтических композиций, содержащих в терапевтически эффективном количестве связывающий агент и один или несколько фармацевтически совместимых ингредиентов.

Согласно типичным вариантам осуществления изобретения фармацевтическую композицию приготавливают согласно общепринятым процедурам с получением фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного или подкожного введения человеку. Как правило, композиции для введения путем инъекции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости фармацевтическое средство может содержать также солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для снятия боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо их смешивают с получением стандартной дозы лекарственного средства, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества действующего вещества. В тех случаях, когда фармацевтическое средство предназначено для введения путем инфузии, то его можно разливать по бутылям для инфузий, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. В тех случаях, когда фармацевтическое средство вводят с помощью инъекции, то можно использовать ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором для того, чтобы ингредиенты можно было перемешивать перед введением.

Кроме того, фармацевтическую композицию можно включать в фармацевтический набор, который

- 22 039944 содержит (а) контейнер с CD40-связывающим агентом (например, антителом к CD40) в лиофилизованной форме и (б) второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель (например, стерильную воду) для инъекций. Фармацевтически приемлемый разбавитель можно использовать для восстановления или разведения лиофилизованного антитела к CD40 или агента. Необязательно к указанному(ым) контейнеру(ам) может прилагаться уведомление в форме, утвержденной официальным агентством, разрешающим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, где в уведомлении отражено разрешение агентства на производство, применение или продажу с целью введения людям.

В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит водную композицию, которая имеет концентрацию антитела к CD40 от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл; или от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл; или от приблизительно 120 мг/мл до приблизительно 180 мг/мл; или приблизительно 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мг/мл.

Кроме антитела к CD40, фармацевтическая композиция дополнительно может содержать буфер, стабилизирующее средство и необязательно средство для регулирования уровня рН. Неограничивающие примеры буферных агентов включают одну или несколько солей, таких как хлорид натрия, гидрохлорид аргинина, тиоцианат натрия, тиоцианат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, хлорид кальция, хлорид цинка и ацетат натрия; или соли подходящих кислот, такие как уксусная кислота и аминокислот. Буферный агент добавляют в количестве, достаточном для обеспечения вязкости, подходящей для введения препарата пациенту, например путем инъекции. Фармацевтическая композиция может содержать от приблизительно 100 мМ вплоть до приблизительно 200 мМ соли или буфера, или от приблизительно 120 мМ вплоть до приблизительно 180 мМ соли или буфера. В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит буфер, содержащий ацетат натрия в концентрации от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ и хлорид натрия в концентрации от приблизительно 120 мМ до приблизительно 140 мМ. В другом варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит буфер, содержащий ацетат натрия в концентрации приблизительно 25 мМ и хлорид натрия в концентрации приблизительно 130 мМ.

Неограничивающим примером подходящего стабилизирующего агента является полисорбат 20 (Твин 20). Стабилизирующий агент присутствует в количестве, достаточном для поддержания химической и физической стабильности фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать от приблизительно 0,001 % до приблизительно 0,1 % (мас./об.) стабилизирующего агента; или от приблизительно 0,0015 % до приблизительно 0,015 % (мас./об.) стабилизирующего агента; или приблизительно 0,01 % (мас./об.) стабилизирующего агента.

В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит антитело к CD40 в количестве от приблизительно 120 мг/мл до приблизительно 180 мг/мл; буфер, содержащий ацетат натрия в концентрации от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ и хлорид натрия в концентрации от приблизительно 120 мМ до приблизительно 140 мМ; и поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,0015 до приблизительно 0,015% (мас./об.). В другом варианте осуществления, антитело к CD40 препарат содержит антитело к CD40 в количестве приблизительно 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мг/мл; буфер, содержащий ацетат натрия в концентрации приблизительно 25 мМ и хлорид натрия в концентрации приблизительно 130 мМ; и поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат 20 в концентрации приблизительно 0,01% (мас./об.).

В другом варианте осуществления, каждая из фармацевтических композиций, описанных выше, может содержать от приблизительно 70 мг до приблизительно 250 мг антитела к CD40; или от приблизительно 80 до 240 мг антитела к CD40. В другом варианте осуществления, фармацевтические композиции, описанные выше, содержат 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 или 250 мг антитела к CD40.

Каждая из фармацевтических композиций, описанных выше, имеет значение рН от приблизительно 4,0 до приблизительно 12,0; или от приблизительно 5 до приблизительно 6,0; или приблизительно 5,5. Значение рН может регулироваться путем добавления достаточного количества подходящего средства для регулирования уровня рН, такого как кислота (например, соляная кислота) или основание (например, гидроксид натрия).

В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу применению любой из фармацевтических композиций, содержащих антитело к CD40, как описано в настоящей заявке, для лечения или предотвращения волчаночного нефрита.

Количество связывающего CD40 агента (например, антитела к CD40), которое является эффективным для лечения или предотвращения волчаночного нефрита, для которого характерна экспрессия CD40, можно определять обычными методами клинических исследований. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, результаты которых могут способствовать определению оптимальных пределов доз. Точная доза для применения в препаративной форме также должна зависеть от пути введения и стадии волчаночного нефрита, для которого характерна экспрессия CD40, и она должна приниматься на основе рекомендаций лечащего врача и обстоятельств, характерных для каждого пациента.

- 23 039944

Эффективные дозы можно определять путем экстраполяции на основе кривых дозовой зависимости, полученных по результатам опытов in vitro или на модельных тест-системах с использованием животных.

Например, токсичность и терапевтическую эффективность антитела к CD40 или агента можно определить в клеточных культурах или на экспериментальных животных стандартными фармацевтическими методами, используемыми для определения ED50 (терапевтически эффективная доза для 50% популяции). Предпочтительным является связывающий CD40 агент (например, антитело к CD40), которое имеет высокий терапевтический индекс. В тех случаях, когда при применении связывающего CD40 агента обнаружены токсические побочные действия, то можно использовать систему введения, которая обеспечивает направленный перенос связывающего CD40 агента в область пораженной ткани, для сведения до минимума потенциального повреждения клеток, которые не экспрессируют CD40, и тем самым для снижения побочных действий.

Данные, полученные по результатам анализов на клеточных культурах и исследований на животных, можно использовать при определении предела доз, предназначенных для применения на человеке. Как правило, доза связывающего CD40 агента находится в пределах концентраций в кровотоке, которые включают ED50, обладая при этом низкой токсичностью или не проявляя токсичности. Дозу можно варьировать в указанных пределах в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Для любого связывающего CD40 агента, используемого согласно способу, терапевтически эффективную дозу можно первоначально устанавливать по результатам анализов на клеточных культурах. Дозу можно определить, исходя из данных, полученных на животных моделях, достигая пределов концентраций в плазме крови, которые включают IC50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается ингибирование симптомов, составляющее половину от максимального) по данным, полученным на культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодных доз для человека. Можно определять концентрации в плазме крови, например с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения, ELISA и т.п.

Как правило, доза антитела к CD40 или связывающего CD40 агента, которую вводят пациенту с волчаночным нефритом, для которого характерна экспрессия CD40, составляет примерно от 0,1 до примерно 100 мг/кг веса тела индивидуума. Доза, вводимая индивидууму, составляет от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 15 мг/кг или от примерно 1 до примерно 10 мг/кг веса тела индивидуума.

Примерами доз являются (но не ограничиваются только ими) дозы, составляющие от 1 нг/кг до 100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления изобретения доза составляет примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 11 мг/кг, примерно 12 мг/кг, примерно 13 мг/кг, примерно 14 мг/кг, примерно 15 мг/кг или примерно 16 мг/кг. Дозу можно вводить, например, каждый день, раз в неделю (каждую неделю), два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, раз в две недели или ежемесячно, каждые два месяца или каждые три месяца. В конкретных вариантах осуществления изобретения доза составляет примерно 0,5 мг/кг/неделю, примерно 1 мг/кг/неделю, примерно 2 мг/кг/неделю, примерно 3 мг/кг/неделю, примерно 4 мг/кг/неделю, примерно 5 мг/кг/неделю, примерно 6 мг/кг/неделю, примерно 7 мг/кг/неделю, примерно 8 мг/кг/неделю, примерно 9 мг/кг/неделю, примерно 10 мг/кг/неделю, примерно 11 мг/кг/неделю, примерно 12 мг/кг/неделю, примерно 13 мг/кг/неделю, примерно 14 мг/кг/неделю, примерно 15 мг/кг/неделю или примерно 16 мг/кг/неделю. В некоторых вариантах осуществления изобретения пределы доз составляют от примерно 1 мг/кг/неделю до примерно 15 мг/кг/неделю.

В другом варианте осуществления, доза составляет от приблизительно 70 мг до приблизительно 250 мг в неделю; или от приблизительно 80 до 240 мг в неделю. В другом варианте осуществления, доза составляет приблизительно 80 мг в неделю, 120 мг в неделю, 130 мг в неделю, 140 мг в неделю, 160 мг в неделю, 170 мг в неделю, 180 мг в неделю, 200 мг в неделю, 210 мг в неделю, 220 мг в неделю, мг в неделю, 240 мг в неделю, или 250 мг в неделю.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции, содержащие связывающий CD40 агент, могут дополнительно включать терапевтическое средство, конъюгированное или неконъюгированное со связывающим агентом. Антитело к CD40 или связывающий CD40 агент можно вводить совместно с одним или несколькими терапевтическими средствами, применяемыми для лечения или предотвращения волчаночного нефрита.

Такая комбинированная терапия может область аддитивным или синергетическим действием в отношении признаков заболевания (например, тяжести проявления симптома, количества симптомов или частоты рецидивов).

При применении схем лечения при комбинированном введении в конкретном варианте осуществления изобретения антитело к CD40 или связывающий CD40 агент вводят совместно с терапевтическим средством. В другом конкретном варианте осуществления терапевтическое средство вводят до или после введения антитела к CD40 или связывающего CD40 агента, по меньшей мере, в течение от 1 ч до нескольких месяцев, например, по меньшей мере в течение 1 ч, 5 ч, 12 ч, суток, недели, месяца или трех месяцев до или после введения антитела к CD40 или связывающего CD40 агента.

- 24 039944

В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой иммуносупрессор. Иммуносупрессор может представлять собой, например, ганцикловир, этанерцепт, такролимус, циклоспорин, рапамицин, микофенолат (MMF), циклофосфамид (СуР), азатиоприн, гидроксихлорохин, мизорибин, микофенолата мофетил или метотрексат. Альтернативно, иммуносупрессор может представлять собой, например, глюкокортикоид (например, кортизол или альдестерон) или аналог глюкокортикоида (например, преднизон или дексаметазон). В другом варианте осуществления иммуносупрессор может представлять собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) (например, каптоприл, хинаприл или эналаприл) или блокатор рецепторов ангиотензина-II (ARB) (например, лосартан или кандесартан).

В другом варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство выбирают из группы, включающей микофенолат (MMF), циклофосфамид (СуР), а глюкокортикоид (GC) и кортикостероиды, или любую их комбинацию.

В одном варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой микофенолат (MMF).

В другом варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой циклофосфамид (СуР).

В другом варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой глюкокортикоид (GC).

В другом варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой кортикостероид.

Изделия

Другим объектом изобретения является изделие, содержащее вещества, пригодные для лечения нарушений, описанных выше. Изделие включает контейнер и этикетку. Приемлемыми контейнерами являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и лабораторные пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения конкретного состояния, и может иметь стерильное отверстие для доступа. Например, контейнер может представлять собой мешок или флакон для внутривенного раствора, имеющий запирающее устройство, проницаемое для инъекционной иглы для подкожного введения. Действующее вещество в композиции представляет собой гуманизированное антитело к CD40. На этикетке на контейнере или связанной с ним указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, присутствие которых желательно с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

Изобретение описано ниже с помощью представленных примеров, которые не направлены на ограничение объема изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение гуманизированного антитела к CD40.

Гуманизированные анти-CD4 антитела согласно изобретению могут быть получены в соответствии с процедурами, описанными в US 20110243932. Антитело А, Антитело В и Антитело С представляли собой гуманизированные антитела, имеющие происхождение из мышиного антитела 20Е2 (Антитело А и Антитело В) или из 2Н11 (Антитело С), клонированные в каркасе человеческий IgG1-KO (KO= нокаут)/каппа. IgG1-KO имеет два мутации в Fc области, Leu234Ala и Leu235Ala, которые уменьшают связывание FcyR и комплемента.

В результате такой гуманизации получали различные гуманизированные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей, которые представлены ниже.

- 25 039944

SEQ ID NO: 41 (последовательность вариабельной области легкой цепи):

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 42 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи):

EVQLVKSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYA DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:43 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 44 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYA DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 45 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK

SEQ ID NO: 46 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYA DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS.

- 26 039944

SEQ ID NO: 47 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 48 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYA DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 49 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK

SEQ ID NO: 50 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYA DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 51 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK.

SEQ ID NO: 52 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 53 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYA

DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 54 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPARF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:55 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPARF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:56 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:57 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS.

- 27 039944

SEQ ID NO:58 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:59 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYA PKFQGKVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO:60 (установленная последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDPEDGDSKYA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:61 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:62 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:63 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFA PKFQGKVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:64 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDPEDGDTKFA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:65 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:66 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFA PKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:67 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYD PKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:68 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYD PKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

- 28 039944

SEQ ID NO:69 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYD

PKFQGKVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:70 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYD

PKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:71 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYD

PKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:72 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWIGRIDPEDGDTKYD

PKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:73 (последовательность вариабельной области тяжелой цепи)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYD

PKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:74 (последовательность вариабельной области легкой цепи) 1 из антитела 10F2Hum:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 75 (последовательность вариабельной области легкой цепи) 2 из антитела 10F2Hum:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPARF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 76 (последовательность вариабельной области легкой цепи)

QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPARF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

Примерами гуманизированных антител, предлагаемых в настоящем изобретении, являются антитела, которые имеют последовательности тяжелых и легких цепей, представленные в приведенной ниже таблице. Выделенные жирным шрифтом подчеркнутые последовательности в приведенной ниже таблице соответствуют вариабельным областям, а написанные обычным шрифтом неподчеркнутые последовательности соответствуют константным областям.

- 29 039944

Обозначение	Последовательность	SEQ ID NO:
Антитело А (легкая цепь)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTW HQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI F Р Р S DEQ LKS GTAS WCLLNNF Y PREAKVQWKVDNALQ S GN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC	26
Антитело А (тяжелая цепь, IgGlKO)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS AS ТК GP SVF PLAP S SKS Т S GGTAALGCLVKDY F РЕ PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	27
Антитело А (тяжелая цепь, IgGl)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS AS TK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	28
Антитело А (тяжелая цепь, IgG4DM)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS AS TK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKS RWQ E GNVF S CSVMHEALHNHY TQKSLSLSLGK	29
Антитело А (тяжелая цепь, IgGlKOb)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRL S CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS AS TK GP SVF PLAP S SKS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	30
Антитело В (легкая цепь)	DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYL TWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFT LTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC	31

- 30 039944

Антитело В (тяжелая цепь, IgGlKO)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS SAS ТК GP SVF PLAPS SKS ТSGGTAALGCLVKDYFРЕ PVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	32
Антитело В (тяжелая цепь, igGi)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS S AS TK GP SVF PLAP S SKS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	33
Антитело В (тяжелая цепь ,IgG4 DM)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS S AS TK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT VDKS RWQ E GNVF S CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	34
Антитело В (тяжелая цепь, IgGlKOb)	EVQLVE S GGGLVKPGGS LRL S CAAS GFTFSDYGMHWVRQAP GKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVS S AS TK GP SVF PLAP S SKS T S GGTAALGCLVKDY F PE PVTVSWNS GA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	35
Антитело С (легкая цепь)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL S KADYE KHKVYACEVTHQ GL S S PVTKS FNRGE C	36
Антитело С (тяжелая цепь, IgGlKO)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSASTKG P SVF PLAP S S KS T S GGTAALGCLVKDYF PE PVTVSWNS GAL	37

- 31 039944

	TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGWFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Антитело С (тяжелая цепь, IgGl)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS AS TKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	38
Антитело С (тяжелая цепь ,IgG4 DM)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSAS TKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ FNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLP S SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	39
Антитело С (тяжелая цепь, IgGlKOb)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAP GQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSSAS TKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL T S GVHT F PAVLQ S S GLY S LS S WTVP S S S LGTQ T YICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	40

Вариабельные области субклонировали в одном или двух различных пригодных для IgG экспрессионных векторах.

А) Формат: человеческий IgG1-KO (нокаут)/каппа с двойной мутацией Leu234A1a, Leu235A1a в Fc-области, что приводит к снижению эффекторной функции, такой как связывание FcyR. и комплемента.

Б) Формат: человеческий IgG4-DM (двойной мутант)/каппа с мутацией Ser228Pro в шарнирной области, которая снижает возникновение половинок молекул IgG4, а мутация Leu235Glu дополнительно уменьшает связывание FcyR.

антитело А и антитело В очищали и оценивали согласно следующим критериям:

внешний вид, CCF (мутность);

способность к фильтрации, CCF;

выход на рекомбинантном белке А;

мутность при оценке и нейтрализации;

растворимые агрегаты (SEC);

чистота / особенности загрязнения (ДСН);

Распределение зарядов (IEF).

Пример 2.

SLE представляет собой системной аутоиммунное заболевание, которое характеризуется потерей толерантности В-клеток к различным ауто-антигенам, в особенности нуклеиновым кислотам и их связывающим белкам. Эти ауто-антитела образуют иммунные комплексы, которые откладываются в различных тканях в организме, и в частности с другими факторами, запускают захват воспалительных клеток и медиаторов в почки, что приводит к волчаночному нефриту. Образование ауто-антител зависит от взаи

- 32 039944 модействия Т-клеток с В-клетками в лимфоузле и требует CD40-CD40L для запуска пролиферации Вклеток и образования зародышевых центров. В зародышевом центре CD40-CD40L взаимодействия опосредуют созревание В-клеток путем переключения Ig изотипа, соматической мутации, клонального размножения высокоаффинных В-клеток, и конечной дифференцировки в плазмоциты (Tarlington, 1998). Аберрантная экспрессия CD40L на Т-клетках и тромбоцитах у пациентов с волчанкой (Koshy и др., 1996 и Мапеа и др., 2009) также может служить механизмом для запуска аутореактивных В-клеток. В завершение, повышенная экспрессия CD40L в SLE В-клетках приводит к самопроизвольной продукции аутоантител независимым от Т-клеток образом (Grammer и др., 2003). См. также US 20110243932, полное содержание которого включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Дальнейшим доказательством вовлечения CD40 пути в волчаночный нефрит является повышенные уровни и экспрессия CD40 и CD40L у больных пациентов. Наряду с повышенным связанным с мембраной CD40L, повышен растворимый CD40L в кровотоке пациентов с (Goules и др., 2006), и это повышение коррелирует с активностью заболевания. Повышенная экспрессия CD40 в моноцитах также коррелирует с активностью заболевания при волчаночном нефрите (Kuroiwa и др., 2003). Дополнительно к роли CD40 пути в образовании ауто-антител и воспаления в почках, полученные данные указывают на вовлечение этого пути в модуляции неиммунных клеток, которые способствуют воспалению при волчаночном нефрите. Например, активация эндотелиальных клеток посредством CD40-CD154 взаимодействия запускает продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов, матриксной металлопротеиназы и экспрессию тканевого фактора и повышения плотности молекул адгезии лейкоцитов CD62E, CD106, и CD54 (Pulivenet и др., 2008). Эти события играют важную роль в стимулировании кровоизлияний и накопления активированных Т-клеток в участках воспаления. Мезангиальные клетки почки человека экспрессируют низкие уровни CD40 и активируют этот рецептор в ответ на лечение с применением IFN-γ и активированных CD154+ тромбоцитов от пациентов с SLE. (Delams и др., 2005). Аналогичным образом в проксимальных канальциевых эпителиальных клетках (РТЕС), наблюдают индукцию CD40L опосредованных цитокинов, таких как IL-6, IL-8.

Влияния лигирования CD40 на эндотелиальные клетки человека (HUVEC) и проксимальные канальциевые эпителиальные клетки (РТЕС) человека можно оценивать путем стимуляции этих клеток с помощью CD40L. HUVEC получали от Lonza Allendale, NJ HUVEC P901 (№ кат. С2519А, партия 0000220212). Клетки культивировали в HUVEC среде (Lonza EBM-2 среда с однопулевыми дополнениями) и субкультуральными реагентами: (Lonza Allendale, NJ кат. СС-3156, партия 0000243756). Клетки выращивали в колбах BD Biocoat Collagen I Т75 (BD Biosciences San Jose, CA кат. 356485, партия 1108951). Клетки субкультивировали, используя набор Lonza для субкультуры в соответствии с инструкциями производителя.

На фиг. 1 показано, что растворимый CD40L индуцирует воспалительные цитокины, такие как МСР-1 в HUVEC, что эффективно блокируется с помощью типичного Антитела В (·) или изотипического контроля (IgG1 антитело человека) (^), в зависимости от дозы.

На фиг. 2 показывает ответную реакцию на sCD40L в РТЕС от трех различных доноров-людей. PTECS получали от Lonza, № кат. СС-2553, и включали трех различных доноров (D1, D2, D3). Клетки выращивали в питательной среде для клеток почечного эпителия (Renal Cell Growth Medium (REGM)), содержащей 50 нг/мл sCD40L (рекомбинантный мега CD40L человека, Alexis Biochemical-Enzo Life Science Farmingdale, NY кат. 522-110-C010, партия 26945, 10 мкг/мл). Набор REGM SingleQuot (Lonza, № кат. СС-4127, № партии 0000193027) обеспечивал среду, содержащую 0,5% фетальную бычью сыворотку (FBS), гидрокортизон, фактор роста эпидермиса человека (hEGF), эпинефрин, инсулин, трийодтиронин, трансферин, гентамицин/амфотерицин-В. Результаты на фиг. 2 свидетельствуют о том, что РТЕС от трех различных людей-доноров продуцируют IL-6 в ответ на стимуляцию sCD40L, и этот ответ может ингибироваться дозо-зависимо с помощью антитела В (концентрации антитела А от 0 до 2000 нг/мл.)

Заявитель полагает, что эти результаты и другие раскрытия, как описано в настоящей заявке, устанавливают убедительное обоснование для CD40 пути, играющего центральную роль в патогенезе волчаночного нефрита.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение гуманизированного моноклонального антитела, которое специфически связывается с CD40 человека для предотвращения или лечения волчаночного нефрита, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 53, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 52.
2. Применение гуманизированного моноклонального антитела по п.1, где антителом является антитело IgG1.
3. Применение гуманизированного моноклонального антитела по п.1 или 2, где антитело имеет мутацию Leu234A1a и Leu235A1a.
4. Применение гуманизированного моноклонального антитела по одному из пп.1-3, содержащего тяжелую цепь SEQ ID NO: 35 и легкую цепь SEQ ID NO: 31.

- 33 039944
5. Применение гуманизированного моноклонального антитела по одному из пп.1-4, где указанное антитело вводится парентеральным путем, внутривенно или подкожно.