KR20230160294A - Upar 항체 및 이를 갖는 융합 단백질 - Google Patents

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KR20230160294A
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조슈아 헤이버
유안 후
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Abstract

본 개시내용은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드(예를 들어, uPAR 항원 결합 단백질), 및 상기 uPAR 결합 폴리펩티드 및 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 개시내용은 본 개시내용의 uPAR 결합 폴리펩티드 및 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하여 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 조작된 IL-12 p35 및 p40 폴리펩티드를 추가로 제공한다.

Description

UPAR 항체 및 이를 갖는 융합 단백질
관련 출원
본 출원은 2021년 3월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/165,313의 이익을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
배경
면역요법은 암 치료에 있어 급속도로 떠오르는 치료법이다. 면역요법은 다음의 일반적인 범주에 속한다: (i) 바람직한 면역 반응을 강화하거나(예를 들어, 자극성 면역 수용체에 작용) 바람직하지 않은 면역 반응을 억제(예를 들어, 억제성 면역 체크포인트에 길항)하기 위해 적절하게 조절 분자에 작용하거나 길항할 수 있는 면역 체크포인트 분자 조절제; (ii) 면역 체계를 조절하고 지시하는 데 도움이 되는 사이토카인, 단백질 분자; 및 (iii) 특정 항원/병원체에 대한 면역학적 기억 반응을 생성하는 암 백신, 분자(또는 조합). 유망한 면역요법이 현재 개발 중인 신약/제제의 고무적인 파이프라인과 함께 임상에 있지만, 단독으로 사용하거나 다른 범주의 면역요법, 표적 요법 및 기존 세포독성 요법과 함께 사용할 수 있는 새로운 면역요법을 개발하는 것이 바람직할 것이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는:
(a) 다음을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인:
i) GFNIKDEY(서열번호: 3), GFSLTNYG (서열번호: 11), GNTFTDYG(서열번호: 19), GTTFTDYG(서열번호: 41), 또는 GYTFTSYG(서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열;
ii) IDPENGDT(서열번호: 4), IWSDGGT(서열번호: 12), INTNTGEP(서열번호: 20), 또는 IYPRSGNT(서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열; 및
iii) TGGNYVGWFPY(서열번호: 5), ARGGRSDLFAY(서열번호: 13), AHYSFDY(서열번호: 21) 또는 AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열; 및
(b) 다음을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인:
iv) SSVSY (서열번호: 6), QSIVHSNGNTY (서열번호: 14), ENIYSN (서열번호: 22), SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열;
v) DTS (서열번호: 7), KVS (서열번호: 15), AAT (서열번호: 23), 또는 GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열; 및
vi) QQWSSNPPY (서열번호: 8), FQGSHVPYT (서열번호: 16), QHFWGTPWT (서열번호: 24), QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, VH 도메인은 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 37, 서열번호: 42, 또는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
항원 결합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열 포함한다.
항원 결합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GFSLTNYG (서열번호: 11)의 HCDR1 아미노산 서열, IWSDGGT (서열번호: 12)의 HCDR2 아미노산 서열, ARGGRSDLFAY (서열번호: 13)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 QSIVHSNGNTY (서열번호: 14)의 LCDR1 아미노산 서열, KVS (서열번호: 15)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 FQGSHVPYT (서열번호: 16)의 LCDR3 아미노산 서열 포함한다.
항원 결합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열 포함한다.
항원 결합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열 포함한다.
항원 결합 단백질의 특정 구현형태에서:
a) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고;
b) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하고;
c) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고;
d) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하고;
e) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하고;
f) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하고;
g) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고;
h) VH 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고; 또는
i) VH 도메인은 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 아미노산 링커로 부착된다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 149), GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG (서열번호: 150), 또는 GGGSGGGGSG (서열번호: 246)을 포함한다:
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), dAb 단편, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 56-71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 72-78 중 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 45, 46, 49, 53, 또는 54의 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및 서열번호: 47, 48, 50, 51, 52, 및 55의 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
항원 결합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
c) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
d) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
e) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나;
f) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
g) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나;
h) 항체 HC는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
i) 항체 HC는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 189의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 213의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 약 5 x 10-8 M 미만, 약 1 x 10-8 M 미만, 약 5 x 10-9 M 미만, 약 1 x 10-9 M 미만, 약 5 x 10-10 M 미만, 또는 약 1 x 10-10 M 미만의 KD로 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 이의 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드-결합된 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합함으로써, 항원 결합 단백질에 결합하는 형광-표지된 항체로 검출되는 형광 신호를 생성하며, EC50 값은 약 0.1 nM 내지 약 3.0 nM이다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 uPAR DII-DIII 도메인 또는 인간 uPAR DIII 도메인에 결합한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 항원 결합 단백질과의 결합에 대해 경쟁하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 항원 결합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항원 결합 단백질을 발현시키는 조건 하에서 상기 언급된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, 상기 기재된 항원 결합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 항원 결합 단백질을 분리하는 것을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 uPAR 활성 또는 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, uPAR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 용도를 제공하며, 상기 용도는 치료 유효량의 상기 언급된 약제학적 조성물을 그러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 언급된 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 위에 언급된 항원 결합 단백질; 및 (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질 및 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커로 연결된다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 원형 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10 또는 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 적어도 하나의 인터류킨-12(IL-12) 서브유닛을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, IL-12 서브유닛은 p35 및 p40 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, p35는 서열번호: 81의 위치 M12, S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, L161, 및 D188에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 N28R 및 Q35E를 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D 및 D188N을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 C74K를 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D, C74K 및 D188N을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, p35는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, p40은 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, C177 아미노산 치환은 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I, 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택된다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, C252 아미노산 치환은 C252S이다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, p40은 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커에 의해 부착된 p35 및 p40 서브유닛을 포함하는 단일 사슬 IL-12(scIL-12)를 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 서열 GGSGGGGSGG(서열번호: 156)를 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서, scIL-12는 서열번호: 88 또는 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 융합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 위에 언급된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 융합 단백질을 발현시키는 조건 하에서 위에 언급된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, 위에 언급된 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 uPAR 활성 또는 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, uPAR에 특이적으로 결합하는 융합 단백질의 용도를 제공하며, 상기 용도는 치료 유효량의 상기 언급된 약제학적 조성물 또는 융합 단백질을 그러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 언급된 약제학적 조성물 또는 상기 언급된 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 약제학적 조성물 또는 융합 단백질은 사이토카인 또는 이의 변이체 또는 제2 융합 단백질과 동시에 투여되며, 여기서 제2 융합 단백질은 제1 융합 단백질과 상이한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 약제학적 조성물 또는 융합 단백질은 사이토카인 또는 이의 변이체 또는 제2 융합 단백질과 순차적으로 투여되며, 여기서 제2 융합 단백질은 제1 융합 단백질과 상이한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 p35 서브유닛 또는 IL-12 p40 서브유닛을 포함한다.
특정 구현양태에서, 환자의 종양에서의 융합 단백질 제거율은 환자의 혈청에서의 융합 단백질 제거율보다 느리다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서:
(a) 융합 단백질은:
(i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체, 또는 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체; 및
(b) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체, 또는 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 비-융합 IL-12 서브유닛을 포함하고,
여기서 융합 단백질이 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 경우, 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고, 융합 단백질이 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 경우, 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛은 순차적으로 투여된다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛 중 하나 또는 둘 다 정맥내로 투여된다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질이 먼저 투여되고, 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되기에 충분한 시간이 경과한 후에 비-융합 IL-12 서브유닛이 투여된다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질이 먼저 투여되고, 환자의 혈청에서 융합 단백질 농도가 실질적으로 감소하기에 충분한 시간이 경과한 후 비-융합 IL-12 서브유닛이 투여된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서:
(a) 제1 융합 단백질은:
(i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
(b) 제2 융합 단백질은:
(i) uPAR 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일하다.
특정 실시 양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 상이하다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 순차적으로 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두는 정맥내로 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질이 먼저 투여된 후, 제1 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되는 데 충분한 시간이 경과한 후에 제2 융합 단백질이 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질을 먼저 투여된 후, 환자의 혈청에서 제1 융합 단백질 농도를 실질적으로 감소시키기에 충분한 시간이 경과한 후에 제2 융합 단백질이 투여된다.
특정 구현양태에서, 제2 융합 단백질이 먼저 투여된 후, 제2 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되는 데 충분한 시간이 경과한 후에 제1 융합 단백질이 투여된다.
특정 구현양태에서, 제2 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 환자의 혈청에서 제2 융합 단백질 농도를 실질적으로 감소시키기에 충분한 시간이 경과한 후에 제1 융합 단백질이 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 다는 다음을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다:
a) GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 다는 다음을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다:
a) GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열(서열번호: 23), 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 다는 다음을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다:
a) GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31), 의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
한 측면에서, 본 개시내용은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 포함하는 조합물을 제공하며, 여기서:
(a) 제1 융합 단백질은:
(i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
(b) 제2 융합 단백질은:
(i) uPAR 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일하다.
특정 실시 양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 상이하다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및 (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질 및 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커로 연결된다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 원형 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10 또는 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 적어도 하나의 인터류킨-12(IL-12) 서브유닛을 포함한다.
특정 구현양태에서, IL-12 서브유닛은 p35 및 p40 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
특정 구현양태에서, p35는 서열번호: 81의 위치 M12, S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, L161, 및 D188에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 N28R 및 Q35E를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D 및 D188N을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 C74K를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D, C74K 및 D188N을 포함한다.
특정 구현양태에서, p35는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, p40은 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현양태에서, C177 아미노산 치환은 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I, 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현양태에서, C252 아미노산 치환은 C252S이다.
특정 구현양태에서, p40은 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커에 의해 부착된 p35 및 p40 서브유닛을 포함하는 단일 사슬 IL-12(scIL-12)를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 서열 GGSGGGGSGG(서열번호: 156)를 포함한다.
특정 구현양태에서, scIL-12는 서열번호: 88 또는 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
(a) 항체 중쇄 가변(VH) 도메인은:
i) GFNIKDEY (서열번호: 3), GFSLTNYG (서열번호: 11), GNTFTDYG (서열번호: 19), GTTFTDYG (서열번호: 41), 또는 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열;
ii) IDPENGDT (서열번호: 4), IWSDGGT (서열번호: 12), INTNTGEP (서열번호: 20), 또는 IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열; 및
iii) TGGNYVGWFPY (서열번호: 5), ARGGRSDLFAY (서열번호: 13), AHYSFDY (서열번호: 21), 또는 AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
(b) 항체 경쇄 가변(VL) 도메인은:
iv) SSVSY (서열번호: 6), QSIVHSNGNTY (서열번호: 14), ENIYSN (서열번호: 22), SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열;
v) DTS (서열번호: 7), KVS (서열번호: 15), AAT (서열번호: 23), 또는 GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열; 및
vi) QQWSSNPPY (서열번호: 8), FQGSHVPYT (서열번호: 16), QHFWGTPWT (서열번호: 24), QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, VH 도메인은 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 37, 서열번호: 42, 또는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GFSLTNYG 서열번호: 11)의 HCDR1 아미노산 서열, IWSDGGT (서열번호: 12)의 HCDR2 아미노산 서열, ARGGRSDLFAY (서열번호: 13)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 QSIVHSNGNTY (서열번호: 14)의 LCDR1 아미노산 서열, KVS (서열번호: 15)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 FQGSHVPYT (서열번호: 16)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호:35의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
c) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나;
d) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
e) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
f) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하거나;
g) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하거나;
h) VH 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
i) VH 도메인은 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 아미노산 링커로 부착된다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 149), GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG (서열번호: 150), 또는 GGGSGGGGSG (서열번호: 246)을 포함한다:
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), dAb 단편, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 56-71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 72-78 중 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 45, 46, 49, 53, 또는 54의 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및 서열번호: 47, 48, 50, 51, 52, 및 55의 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질의 특정 구현양태에서:
a) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
c) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
d) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
e) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나;
f) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
g) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나;
h) 항체 HC는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
i) 항체 HC는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 189의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 213의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 융합 단백질은 서열번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; 및 서열번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 약 5 x 10-8 M 미만, 약 1 x 10-8 M 미만, 약 5 x 10-9 M 미만, 약 1 x 10-9 M 미만, 약 5 x 10-10 M 미만, 또는 약 1 x 10-10 M 미만의 KD로 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드-결합된 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합함으로써, 항체 또는 이의 단편에 결합하는 형광-표지된 항체로 검출되는 형광 신호를 생성하며, EC50 값은 약 0.1 nM 내지 약 3.0 nM이다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 uPAR DII-DIII 도메인 또는 인간 uPAR DIII 도메인에 결합한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열번호: 81의 위치 S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, 및 L161에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드를 제공한다.
특정 구현양태에서, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드는 S27 및 D188 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 N28R 및 Q35E를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 C74K를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D, C74K 및 D188N을 포함한다.
특정 구현양태에서, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (i) 위에 언급된 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드; 및 (ii) 하나 이상의 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 표적화 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 항원 결합 단백질을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드를 제공한다.
특정 구현양태에서, C177 아미노산 치환은 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현양태에서, C252 아미노산 치환은 C252S이다.
특정 구현양태에서, p40은 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (i) 위에 언급된 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드; 및 (ii) 하나 이상의 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 표적화 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 항원 결합 단백질을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드; 및 (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 아미노산 링커를 통해 사이토카인에 연결된다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 이의 기능적 단편, 이의 기능적 변이체 또는 이의 원형 순열 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 하나 이상의 임의의 아미노산 링커를 통해 사이토카인이 결합 특이성을 갖는 수용체의 전부 또는 일부에 연결된다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 uPAR에 특이적으로 결합할 수 있는 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, uPA 변이체는 uPA의 아미노산 말단 단편(ATF)이다.
특정 구현양태에서, ATF는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현양태에서, uPA의 ATF는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
특정 구현양태에서, uPA는 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 원형 순열 IL-2이고 수용체는 IL-2Rα이다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 원형 순열 IL-15이고 수용체는 IL-15Rα이다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 원형 순열 IL-1이고 수용체는 IL-1RI, IL-1RII이다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 항-uPAR 항원 결합 단백질이다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 항-uPAR 항체의 scFv 단편이다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 98, 99, 100, 106, 107, 111 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 98, 99, 111 및 112로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합제, 사이토카인 및 수용체는 인간 기원이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 언급된 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 암은 흑색종, 암종, 모세포종 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 언급된 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 염증성 질환은 IBD 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 적어도 하나의 융합 단백질 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 임의의 아미노산 링커를 통해:
(i) 사이토카인 또는 이의 변이체; 또는
(ii) 체크포인트 분자 조절제에 연결된 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 이의 기능적 단편, 이의 기능적 변이체 또는 이의 원형 순열 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인은 하나 이상의 임의의 아미노산 링커를 통해 사이토카인이 결합 특이성을 갖는 수용체의 전부 또는 일부에 연결된다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 uPAR에 특이적으로 결합할 수 있는 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, uPA 변이체는 uPA의 아미노산 말단 단편(ATF)이다.
특정 구현양태에서, ATF는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현양태에서, uPA의 ATF는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 체크포인트 분자 조절제는 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 원형 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10, IL-12, IL-15, GM-CSF, IFNγ, IFNα, 4-1BBB(CD131) 또는 이의 리간드, OX40 또는 이의 리간드, PD-1, PD-L1, 항-PD-1 항체, CTLA-4, 항-CTLA4 항체, GITR 또는 이의 리간드, ICOS 또는 이의 리간드, CD27, CD70, CD40 또는 이의 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 언급된 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 암은 흑색종 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 상기 언급된 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 염증성 질환은 IBD 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 적어도 하나의 융합 단백질 및 임의의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 언급된 융합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 암을 치료하기 위한 면역요법 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 상기 방법은 환자에게 표적화된 암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 상기 방법은 화학요법, 방사선 요법 또는 둘 모두로부터 선택된 통상적인 세포독성 요법을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 상기 방법은 암 백신, 체크포인트 억제제 또는 모노클로날 항체로부터 선택된 면역요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 M25 또는 아미노산 수준에서 적어도 80% 동일성을 갖는 이와 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, uPAR 결합 폴리펩티드는 P25 또는 아미노산 수준에서 적어도 80% 동일성을 갖는 이와 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
도 1a-도 1b는 인간 uPAR의 DII-DIII 도메인(도 1a) 또는 DIII 도메인 단독(도 1b)에 대한 항-uPAR 항체 결합 데이터를 도시한다.
도 2a-도 2b는 인간 uPAR 또는 마우스 uPAR을 발현하도록 조작된 HEK 293 세포의 표면 상에 발현된 인간(도 2a) 및 마우스(도 2b) uPAR에 대한 항-uPAR 항체 결합 데이터를 도시한다. 항-uPAR 항체를 적정을 통해 세포와 함께 인큐베이션하고 테스트된 항체 농도에 걸쳐 중앙 형광 강도(MFI) 값을 결정했다.
도 3은 p35 C74 변이체와 p40 C177 변이체 사이의 옥테트 결합 데이터를 도시한다. X축을 따라 각 데이터 포인트에 대해 언급된 첫 번째 아미노산은 p35 C74 치환에 상응하고 각 데이터 포인트에 대해 언급된 두 번째 아미노산은 p40 C177 치환에 상응한다(즉, "K-S" 데이터 포인트는 p35 C74K 변이체와 p40 C177S 변이체 사이의 결합 친화도이다).
도 4a-도 4h는 몇몇 예시적인 IL-12 서브유닛 융합 단백질의 개략도를 도시한다. 도 4a는 단일 사슬 인간 IL-12 p35/p40 융합 단백질을 도시한다. 도 4b는 p35/혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 마우스 혈청 알부민) 융합 단백질을 도시한다. 도 4c는 Fab/Fc CH2-CH3 도메인 융합 단백질과 쌍을 이루는 p35/Fc CH2-CH3 도메인 융합 단백질을 도시한다. 각 Fc 도메인은 이종이량체화를 촉진하기 위한 노브-인-홀(KiH, Knob-in-Hole) 돌연변이를 함유한다. 도 4d는 p40/scFv 융합 단백질을 도시한다. 도 4e는 p35/직렬 scFv(scFv2) 융합 단백질을 도시한다. 도 4f는 scFv/Fc CH2-CH3 도메인 융합 단백질과 쌍을 이루는 p35/Fc CH2-CH3 도메인 융합 단백질을 도시한다. 각 Fc 도메인은 이종이량체화를 촉진하기 위한 KiH 돌연변이를 함유한다. 도 4g는 p40/Fab 도메인 융합 단백질을 도시한다. 도 4h는 p40/IgG 융합 단백질을 도시한다. p40 단백질은 IgG의 각 CH3 도메인의 C 말단에 연결된다.
도 5a-도 5b는 방사선표지된 종양-표적화 IL-12 서브유닛 p40(도 5a) 및 p35(도 5b)의 PET/CT 영상화로부터의 종양 및 혈청 약동학을 도시한다. 시간이 지남에 따라 마우스의 종양과 혈액에서 종양-표적 서브유닛을 측정하고 최대 노출 %를 결정했다. 종양 표적화된 p40은 Fab 형식에서 항-uPAR 항체 M37과 p40의 융합체였다. 종양 표적화된 p35는 KiH 형식에서 항-uPAR 항체 M37과 p35의 융합체였다.
도 6a-도 6b는 CD8+(도 6a) 및 CD4+(도 6b) T 세포에서 Stat4 인산화 %로 측정된 세포-기반 시험관내 IL-12 활성 데이터를 도시한다. IL-12 서브유닛은 언급된 농도에 대해 1:1 비율로 T 세포에 첨가되었다.
도 7은 T 세포에 의한 인터페론(IFN) 감마 분비에 의해 측정된 세포-기반 시험관내 IL-12 활성 데이터를 도시한다. IL-12 서브유닛은 언급된 농도에 대해 1:1 비율로 T 세포에 첨가되었다.
도 8a-도 8b는 마우스 종양 모델의 종양(도 8a) 및 간(도 8b)에서의 IL-12 서브유닛 축적을 도시한다. IL-12 서브유닛 분자는 비-표적화 scIL12, 표적화 Fab-p40, 비-표적화 p35-MSA, 표적화 IgG-p40 및 표적화 p35-KiH였다. "% ID/g"는 조직 그램당 주입된 용량의 퍼센트에 상응한다.
도 9는 scIL-12 또는 p35-MSA와 p40-Fab의 조합을 두 가지 용량으로 투여받은 마우스의 혈청 인터페론(IFN) 감마 농도를 도시한다.
도 10은 uPAR-발현 HEK 세포/T 세포 공동-배양에서 CD8+ T 세포의 Stat4 인산화 %로 측정된 세포-기반 시험관내 IL-12 활성 데이터를 도시한다. IL-12 서브유닛은 CD8+ T 세포와 공동-인큐베이션하기 전에 언급된 농도에 대해 1:1 비율로 uPAR 발현-HEK 세포에 첨가했다.
도 11은 RKO 이종이식 종양 마우스 모델에서 종양 조직 내 선택된 융합 단백질의 축적을 도시한다.
도 12는 RKO 이종이식 종양 마우스 모델에서 혈청 내 선택된 융합 단백질의 축적을 도시한다.
유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드(예를 들어, uPAR 항원 결합 단백질), 및 상기 uPAR 결합 폴리펩티드 및 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질이 본원에 제공된다. 본 개시내용은 본 개시내용의 uPAR 결합 폴리펩티드 및 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하여 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 조작된 IL-12 p35 및 p40 폴리펩티드를 추가로 제공한다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질, 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 해당 분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다. 본원에 제공된 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행되고, 달리 명시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 해당 분야에서 일반적으로 수행되거나 본원에 기술된 바와 같이 제조업체의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 이들의 실험실 절차 및 기술은 잘 알려져 있고 당업계에서 통상적으로 사용된다. 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 제조, 제형화, 전달, 환자 치료에는 표준 기술이 사용된다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "포함하는" 및 "포함된"과 같은 다른 형태뿐만 아니라 "포함하는"이라는 용어의 사용은 제한적이지 않다.
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록 특정 용어를 먼저 정의한다.
항원 결합 단백질
본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "항원 결합 단백질"은 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하거나 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 유래 분자를 의미하며, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 모두를 포함할 뿐만 아니라 단편 항원-결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디, VHH) 단편을 포함하나 이로 제한되지 않는 기능성 항체 단편을 포함한다. 따라서 항체는 단일 도메인 항체일 수 있거나 적어도 하나의 가변 경쇄 및 적어도 하나의 가변 중쇄를 포함할 수 있다. 한 구현양태에서, 적어도 하나의 가변 경쇄 및 적어도 하나의 가변 중쇄는 단일 폴리펩티드 사슬로서 연결된다. 용어 "항체" 또는 "항원 결합 단백질"에는 생식계열 유래 항체가 포함된다. "항체" 또는 "항원 결합 단백질"이라는 용어에는 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 이종접합 항체(예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 직렬 디-scFv, 직렬 트리-scFv) 등과 같은 유전적으로 조작되거나 달리 변형된 형태의 면역글로불린이 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "항체" 또는 "항원 결합 단백질"은 이의 기능성 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 다중특이적이다(즉, 2개 이상의 상이한 표적 분자에 결합하거나 동일한 표적 분자 상의 2개 이상의 에피토프에 결합한다). 특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 이중특이적이며, 예를 들어 2개의 상이한 표적 분자 또는 동일한 표적 분자 상의 2개의 에피토프에 결합한다. 특정 구현양태에서, 항체는 삼중특이적이며, 예를 들어 적어도 3개의 상이한 표적 분자에 결합한다.
항원 결합 단백질은 1가 또는 다가, 즉 하나 이상의 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 1가 항원 결합 단백질의 비-제한적 예에는 scFv, Fab, scFab, dAb, VHH, V(NAR), DARPin, 아필린 및 나노바디가 포함된다. 다가 항원 결합 단백질은 2개, 3개, 4개 이상의 항원 결합 부위를 가질 수 있니다. 다가 항원 결합 단백질의 비-제한적 예에는 전장 면역글로불린, F(ab')2 단편, bis-scFv(또는 직렬 scFv 또는 BiTE), DART, 디아바디, scDb, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-Fc-scFab, IgG-scFv, scFv-Fc, scFv-fc-scFv, Fv2-Fc, FynomABs, 쿼드로마, 크로스맙, 듀오바디, 트리아바디 및 테트라바디가 포함된다. 일부 구현양태에서, 다가 항원 결합 단백질은 2가, 즉 2개의 결합 부위가 존재한다. 일부 구현양태에서, 다가 항원 결합 단백질은 이중특이적, 즉 항원 결합 단백질은 2개의 상이한 표적 또는 하나의 표적 분자 상의 2개의 상이한 표적 부위에 대해 지시된다. 일부 구현양태에서, 다가 항원 결합 단백질은 각각 3개 또는 4개의 상이한 항원에 대해 2개 초과, 예를 들어 3개 또는 4개의 상이한 결합 부위를 포함한다. 이러한 항원 결합 단백질은 다가이고 다중특이적, 구체적으로 각각 3중- 또는 4중-특이적이다.
본원에 사용된 "단일-사슬 가변 단편"(scFv)은 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항원 결합 단백질이다. scFv의 VH 및 VL 도메인은 임의의 적절한 기술 인식 링커를 통해 연결된다. 이러한 링커에는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. scFv에는 일반적으로 항체 불변 도메인 영역이 없지만, 본 개시내용의 scFv는 항체 불변 도메인 영역(예를 들어, 항체 Fc 도메인)에 연결되거나 부착되어 증가된 혈청 또는 조직 반감기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 scFv의 다양한 특성을 변경할 수 있다. scFv는 일반적으로 약 25 kDa의 분자량과 약 2.5 nm의 유체역학적 반경을 갖는다. 특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 직렬 scFv, 즉 제2 scFv에 연결된 제1 scFv를 포함한다. 제1 및 제1 scFv는 동일한 아미노산 서열일 수 있고/있거나 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 scFv는 상이한 아미노산 서열일 수 있고/거나 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "Fab 단편" 또는 "Fab"은 가변 경쇄(VL) 도메인 및 경쇄의 불변 도메인(CL), 및 가변 중쇄(VH) 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 경쇄 단편을 포함하는 항체 단편이다.
본원에 사용된 "VHH", "나노바디" 또는 "중쇄 단독 항체"는 낙타, 라마, 알파카를 포함하는 낙타과의 종으로부터 유래된 단일 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질이다. VHH는 일반적으로 약 15 kDa의 분자량을 갖는다.
한 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 존재는 세포독성 면역 반응을 유도하고/하거나 보체(예를 들어, ADCC/ADCP 또는 CDC 이펙터 기능)를 활성화하는 데 유리할 수 있다. Fc 도메인을 포함하는 예시적인 항체 형식은 이에 제한되지 않지만 전장 면역글로불린, DVD-Ig, scFv-Fc 및scFv-Fc, scFv 융합체, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체(예를 들어, bsAb, Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Ts1Ab, Ts2Ab, 노브-인투-홀(KiH)), 듀오바디 및/또는 크로스맙이다. 활성 Fc 도메인은 종양 미세환경에서 T 세포 및 기타 이펙터 세포에 의한 친-염증성 사이토카인 방출 가능성을 증가시킬 수 있으며, 이는 치료 작용 메커니즘의 일부인 것으로 여겨진다. Fc 도메인은 면역계의 과도한 자극을 피하기 위해 완전히 활성화되거나 부분적으로 침묵될 수 있다. 일부 구현양태에서, Fc 도메인은 불활성이고 친-염증성 사이토카인 방출을 자극하지 않지만 여전히 항원 결합 단백질의 반감기 및/또는 안정성을 개선한다. 일부 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 영역을 포함한다. 다른 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 뮤린 IgG1, IgG2A, IgG2B 또는 IgG3 이소형으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 영역을 포함한다.
본 개시내용의 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질의 도메인을 연결하기 위한 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다(예를 들어, VH 및 VL을 연결하여 scFv를 형성하거나, 다중 결합 도메인을 연결하여 다중특이적 항원 결합 단백질을 형성).
링커의 예시적인 예에는 글리신 중합체 (Gly)n; 글리신-세린 중합체 (GlynSer)n(여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 정수이다); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다.
글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 비구조화되어 있으므로 본원에 기술된 항원 결합 단백질과 같은 융합 단백질의 도메인 사이에서 중성 테더 역할을 할 수 있다. 글리신은 다른 작은 측쇄 아미노산보다 상당히 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고 더 긴 측쇄를 가진 잔기보다 훨씬 덜 제한적이다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 1: 1173-142 (1992)). 당업자는 특정 구현양태에서 항원 결합 단백질의 설계가 전부 또는 부분적으로 가요성 링커를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이며, 따라서 링커는 가요성 링커 스트레치뿐만 아니라 원하는 구조를 제공하기 위해 가요성을 덜 부여하는 하나 이상의 스트레치를 포함할 수 있다.
그러나 링커 서열은, 예를 들어 인간 CH1 및 Cκ 서열의 시작 부분에 상응하는 아미노산 스트레치 또는 인간 IgG의 힌지 영역의 하부 부분에 상응하는 아미노산 스트레치를 사용하여 천연 링커 서열과 유사하도록 선택될 수 있다.
scFv 모이어티에서 VL 및 VH 도메인을 연결하는 펩티드 링커의 설계는 일반적으로 예를 들어 Gly, Ser 및 Thr과 같은 작은 비극성 또는 극성 잔기로 이루어진 가요성 링커이다. scFv 모이어티의 가변 도메인을 연결하는 구체적인 예시적인 링커는 (Gly4Ser)4 링커이며, 여기서 4는 모티프의 예시적인 반복 횟수이다. 특정 구현양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG, GGGGSGGGGSGGGGS, 또는 GGGSGGGGSG (서열번호: 246)을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다. 특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGS)n(서열번호: 247)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다.
다른 예시적인 링커에는 다음 아미노산 서열이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: GGG; DGGGS; TGEKP(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci.94: 5525-5530 (1997)); GGRR; (GGGGS)n (서열번호: 148) 여기서 n = 1, 2, 3, 4 또는 5이다(Kim et al, Proc. Natl. Acad. Sci.93: 1156-1160 (1996)); EGKSSGSGSESKVD (Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 1066-1070 (1990)); KESGSVSSEQLAQFRSLD (Bird et al., Science 242:423- 426 (1988)), GGRRGGGS; LRQRDGERP; LRQKDGGGSERP; 및 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)). 대안적으로, 단백질 및 펩티드의 3D 구조를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하거나 파지 디스플레이 방법을 통해 가요성 링커를 합리적으로 설계할 수 있다.
항체는 가변 경쇄(VL) 도메인 및 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 VL 및 VH 도메인은 3개의 CDR 세트를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비-연속 서열을 의미한다. 일반적으로 각 중쇄 가변 도메인에는 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 있고 각 경쇄 가변 도메인에는 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다. "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 일반적으로 각 중쇄 가변 도메인에는 4개의 FR(HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4)이 있고, 각 경쇄 가변 도메인에는 4개의 FR(LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4)이 있다. 따라서, 항체 가변 영역 아미노산 서열은 식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로 표시될 수 있다. 식의 각 부분, 즉 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 포함하여 돌연변이될 수 있는 별개의 아미노산 서열(또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)을 나타낸다. 특정 구현양태에서, 항체 가변 경쇄 아미노산 서열은 식 LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4로 표시될 수 있다. 특정 구현양태에서, 항체 가변 중쇄 아미노산 서열은 식 HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4로 표시될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 다음을 포함하여 다수의 잘 알려진 방식을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다: Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 ("Chothia" numbering scheme), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745. ("Contact" numbering scheme), Lefranc M P et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1):55-77 ("IMGT" numbering scheme), 및 Honegger A 및 Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70, ("AHo" numbering scheme).
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 카바트(Kabat) 방식은 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면, 코티아(Chothia) 방식은 구조적 정보를 기반으로 한다. 카바트 및 코티아 방식에 대한 넘버링은 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하며, 삽입은 삽입 문자, 예를 들어 "30a"에 의해 수용되고 일부 항체에는 결실이 나타난다. 두 가지 방식은 특정 삽입 및 삭제("indel")를 서로 다른 위치에 배치하여 차등 넘버링을 초래한다. 접촉(Contact) 방식은 복합 결정 구조 분석을 기반으로 하며 여러 측면에서 코티아 넘버링 방식과 유사하다.
따라서 달리 명시하지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 이의 가변 도메인의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역" 또는 개별적으로 지정된 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2)은 임의의 공지된 방식에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 상보적 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, 달리 명시하지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 이의 가변 도메인의 "FR" 또는 "프레임워크 영역" 또는 개별적으로 지정된 FR(예를 들어, "HFR1", "HFR2")은 임의의 공지된 방식에 의해 정의된 바와 같은(또는 특정) 프레임워크 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에는, 카바트, 코티아 또는 접촉 방법에 의해 정의된 CDR과 같은 특정 CDR 또는 FR의 식별 방식이 지정된다. 다른 경우에는 CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
특정 구현양태에서, 본원에 개시된 항원 결합 단백질은 인간화된다. 본원에 사용된 용어 "인간화된" 또는 "인간화"는 인간 항체와 더욱 유사하게 되도록 변경된 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본원에 개시된 뮤린 항원 결합 단백질과 같은 비-인간 항원 결합 단백질은 치료를 위해 인간에게 투여되는 경우 음성 면역 반응을 유발할 것이다. 따라서 이후의 치료 용도를 위해 비-인간(예를 들어 뮤린) 항원 결합 단백질을 인간화하는 것이 유리하다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 재포장(resurfacing)을 통해 인간화된다(즉, 비-인간 프레임워크의 용매-접근가능한 잔기를 리모델링하여 더욱 인간과 유사하게 된다). 재포장 전략은 WO2004/016740, WO2008/144757, 및 WO2005/016950에 더 자세히 설명되어 있으며, 이들 각각은 참고로 본원에 포함된다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 CDR 이식(즉, 뮤린 항원 결합 단백질 CDR을 인간 항체 수용체 프레임워크에 삽입)을 통해 인간화된다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 항체의 항원 결합 부위와 이것이 결합하는 에피토프 사이의 상호작용 강도를 의미한다. 당업자가 쉽게 이해하는 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단백질 친화도는 몰농도(M) 단위의 해리 상수(KD)로서 보고될 수 있다. 본 개시내용의 항체는 10-8 내지 10-14 M 범위의 KD 값을 가질 수 있다. 고친화도 항체는 10-9 M(1나노몰, nM) 이하의 KD 값을 갖는다. 예를 들어, 고친화도 항체는 약 1 nM 내지 약 0.01 nM 범위의 KD 값을 가질 수 있다. 고친화도 항체는 약 1 nM, 약 0.9 nM, 약 0.8 nM, 약 0.7 nM, 약 0.6 nM, 약 0.5 nM, 약 0.4 nM, 약 0.3 nM, 약 0.2 nM, 또는 약 0.1 nM의 KD 값을 가질 수 있다. 친화도가 매우 높은 항체는 KD 값이 10-12 M(1피코몰, pM) 이하이다. 약하거나 낮은 친화도 항체는 10-1 내지 10-4 M 범위의 KD 값을 가질 수 있다. 낮은 친화도 항체는 10-4 M 이상의 KD 값, 예를 들어 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M 또는 10-1 M을 가질 수 있다.
특정 항원 결정기(예를 들어, uPAR)에 결합하는 항체의 능력은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(BIAcore 기기에서 분석)(Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 검정(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다.
본 개시내용에 사용된 다양한 항체 불변 도메인 아미노산 서열은 아래 표 1에 열거되어 있다.
표 1 - 항체 불변 도메인 아미노산 서열
항원 결합 단백질 이종이량체화
본 개시내용의 한 측면에서, 2개의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질은 노브-인투-홀 쌍(KiH)을 통해 이종이량체화된다. 이 이량체화 기술은 CH3 도메인의 인터페이스에 조작된 돌기("노브")와 공동("홀")을 활용한다. 적절하게 위치되고 치수화된 노브 또는 홀이 제1 또는 제2 CH3 도메인의 인터페이스에 존재하는 경우, 인접한 인터페이스에서 각각 상응하는 홀 또는 노브를 조작하면 되며, 따라서 CH3/CH3 도메인 인터페이스에서 Fc 도메인 쌍을 촉진하고 강화한다. "노브"는 제1 Fc 도메인의 CH3 부분의 인터페이스에서 돌출된 적어도 하나의 아미노산 측쇄, 일반적으로 더 큰 측쇄를 의미한다. 돌출부는 제2 Fc 도메인의 CH3 부분에 있는 "홀"에 상보적이고 홀에 의해 수용되는 "노브"를 생성한다. "홀"은 적어도 하나의 아미노산 측쇄, 일반적으로 더 작은 측쇄이며, 이는 제2 Fc 도메인의 CH3 부분의 인터페이스에서 물러난다. 이 기술은, 예를 들어 US Patent No. 5,821,333; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-621 (1996); 및 Carter P., J. Immunol. Methods 248: 7-15 (2001)에 기재되어 있다.
노브로 작용할 수 있는 예시적인 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)을 포함한다. CH3 도메인에 존재하는 아미노산 잔기는 노브 아미노산 잔기로 대체되거나 치환될 수 있다. 치환될 바람직한 아미노산은 알라닌(A), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D), 글리신(G), 세린(S), 트레오닌(T), 또는 발린(V)과 같은 작은 측쇄를 갖는 임의의 아미노산을 포함할 수 있다.
홀로 작용할 수 있는 예시적인 아미노산 잔기에는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)이 포함된다. CH3 도메인에 존재하는 아미노산 잔기는 홀 아미노산 잔기로 대체되거나 치환될 수 있다. 치환될 바람직한 아미노산에는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 트립토판(W)과 같이 크거나 부피가 큰 측쇄를 갖는 임의의 아미노산이 포함될 수 있다.
CH3 도메인은 인간 IgG1 항체로부터 유래될 수 있다. CH3 도메인에 대한 예시적인 아미노산 치환은 T366Y, T366W, F405A, F405W, Y407T, Y407A, Y407V, T394S, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 예시적인 조합은 제1 CH3 도메인의 노브 돌연변이에 대한 T366Y 또는 T366W이고 제2 CH3 도메인의 홀 돌연변이에 대한 Y407T 또는 Y407V이다.
특정 구현양태에서, KiH Fc 도메인은 Eu 넘버링에 따라 아미노산 치환 T366W를 포함하는 노브 Fc 부분 및 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V를 포함하는 홀 Fc 부분을 포함한다. 특정 구현양태에서, 홀 Fc 부분은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 치환 H435R 및 Y436F를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현양태에서, 2개의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질은 Fab 팔 교환(FAE)을 통해 이종이량체화된다. P228S 힌지 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1은 F405L 또는 K409R CH3 도메인 돌연변이를 함유할 수 있다. 두 항체를 환원제와 혼합하면 FAE가 발생한다. 이 기술은 US Patent No. 9,212,230 및 Labrijn A.F., Proc Natl Acad Sci USA 110(13): 5145-5150 (2013)에 설명되어 있다.
본 개시내용의 특정 구현양태에서, 2개의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질은 정전기 조정 효과를 통해 이종이량체화된다. 이 이량체화 기술은 정전기 조정을 활용하여 CH3/CH3 도메인 인터페이스에서 Fc 도메인 쌍을 촉진하고 강화한다. 2개의 CH3 도메인 사이의 전하 상보성은 동종이량체화(동일한 전하쌍)보다 이종이량체화(반대 전하쌍)를 선호하도록 변경된다. 이 방법에서는 정전기적 반발력이 동종이량체화를 방지한다. 예시적인 아미노산 잔기 치환은 제1 CH3 도메인에서 K409D, K392D 및/또는 K370D, 및 제2 CH3 도메인에서 D399K, E356K 및/또는 E357K를 포함할 수 있다. 이 기술은 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0154254 A1 및 Gunasekaran K., J Biol Chem 285(25): 19637-19646 (2010)에 설명되어 있다.
본 개시내용의 특정 구현양태에서, 2개의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질은 소수성 상호작용 효과를 통해 이종이량체화된다. 이 이량체화 기술은 정전기적 상호작용 대신 소수성 상호작용을 활용하여 CH3/CH3 도메인 인터페이스에서 Fc 도메인 쌍을 촉진하고 강화한다. 예시적인 아미노산 잔기 치환은 제1 CH3 도메인에 K409W, K360E, Q347E, Y349S 및/또는 S354C, 및 제2 CH3 도메인에 D399V, F405T, Q347R, E357W 및/또는 Y349C를 포함할 수 있다. 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 사이의 바람직한 아미노산 잔기 치환 쌍은 K409W:D399V, K409W:F405T, K360E:Q347R, Y349S:E357W, 및 S354C:Y349C를 포함한다. 이 기술은 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0307628 A1에 설명되어 있다.
본 개시내용의 특정 구현양태에서, 2개의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질은 류신 지퍼 융합의 사용을 통해 이종이량체화된다. 항체 사슬의 각 CH3 도메인의 C 말단에 융합된 류신 지퍼 도메인은 이종이량체화를 강제한다. 이 기술은 Wranik B., J Biol Chem 287(52): 43331-43339 (2012)에 기재되어 있다.
본 개시내용의 특정 구현양태에서, 2개의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질은 가닥 교환 조작된 도메인(SEED, Strand Exchange Engineered Domain) 본체의 사용을 통해 이종이량체화된다. IgG 및 IgA 형식에서 유래된 CH3 도메인은 이종이량체화를 강제한다. 이 기술은 Muda M., Protein Eng. Des. Sel. 24(5): 447-454 (2011)에 기재되어 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 항체 불변 영역 넘버링은 Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85 (1969)에 기재된 바와 같이 EU 넘버링 방식에 상응한다.
중쇄 및/또는 경쇄의 이종이량체화 및 비대칭 항체의 생성 및 정제에 대한 추가적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Klein C., mABs 4(6): 653-663 (2012), 및 U.S. Patent No. 9,499,634를 참조하고, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
변경된 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포 독성(CDC)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 Fc 기능을 변경하기 위해 추가적인 Fc 도메인 돌연변이가 구상된다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Eu 넘버링에 따라 L234A 및 L235A 아미노산 치환을 갖는 IgG1 불변 도메인을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Eu 넘버링에 따라 P329G 아미노산 치환을 갖는 IgG1 불변 도메인을 포함한다.
유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드
본원에 사용된 용어 "uPAR" 또는 "유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체" 또는 "유로키나제 수용체" 또는 "uPA 수용체" 또는 "CD87" 또는 "분화 클러스터 87"은 본원에 기재된 항원 결합 단백질의 표적을 지칭한다. uPAR은 Ly-6/uPAR/알파-신경 독소 계열의 세 가지 다른 도메인으로 이루어진다. 세 가지 도메인 모두 1차 리간드인 유로키나제의 고친화도 결합에 관여한다. 1차 리간드 유로키나제 외에도 uPAR은 비트로넥틴, uPAR 연관 단백질(uPARAP) 및 막 단백질의 인테그린 계열을 포함하는 여러 다른 단백질과 상호작용한다.
본원에 사용된 용어 "결합 폴리펩티드" 또는 "결합 단백질"은 표적 단백질(예를 들어, uPAR)에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 상응한다. 결합 폴리펩티드에는 전술한 바와 같은 항원 결합 단백질뿐만 아니라 표적 단백질에 대한 리간드도 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현양태에서, 결합 폴리펩티드는 uPAR에 특이적으로 결합할 수 있는 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체이다. 특정 구현양태에서, uPA 변이체는 uPA의 아미노산 말단 단편(ATF)이다. 특정 구현양태에서, ATF는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현양태에서, uPA의 ATF는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 특정 구현양태에서, uPA는 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는:
(a) 다음을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인:
i) GFNIKDEY (서열번호: 3), GFSLTNYG (서열번호: 11), GNTFTDYG (서열번호: 19), GTTFTDYG (서열번호: 41), 또는 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열;
ii) IDPENGDT (서열번호: 4), IWSDGGT (서열번호: 12), INTNTGEP (서열번호: 20), 또는 IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열; 및
iii) TGGNYVGWFPY (서열번호: 5), ARGGRSDLFAY (서열번호: 13), AHYSFDY (서열번호: 21), 또는 AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열; 및
(b) 다음을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인:
iv) SSVSY (서열번호: 6), QSIVHSNGNTY (서열번호: 14), ENIYSN (서열번호: 22), SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열;
v) DTS (서열번호: 7), KVS (서열번호: 15), AAT (서열번호: 23), 또는 GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열; 및
vi) QQWSSNPPY (서열번호: 8), FQGSHVPYT (서열번호: 16), QHFWGTPWT (서열번호: 24), QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 상기 및 표 3표 8에 제시된 임의의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 유사성 또는 동일성을 포함한다.
특정 구현양태에서, VH 도메인은 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 37, 서열번호: 42, 또는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 상기 및 표 3표 8에 제시된 임의의 VH 또는 VL 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 유사성 또는 동일성을 포함한다.
특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GFSLTNYG (서열번호: 11)의 HCDR1 아미노산 서열, IWSDGGT (서열번호: 12)의 HCDR2 아미노산 서열, ARGGRSDLFAY (서열번호: 13)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 QSIVHSNGNTY (서열번호: 14)의 LCDR1 아미노산 서열, KVS (서열번호: 15)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 FQGSHVPYT (서열번호: 16)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
b) VL 도메인은 SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서:
a) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호:35의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
c) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나;
d) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
e) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
f) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하거나;
g) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하거나;
h) VH 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
i) VH 도메인은 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 아미노산 링커로 부착된다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 149), 또는 GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG (서열번호: 150)을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), dAb 단편, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 56-71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 72-78 중 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 45, 46, 49, 53, 또는 54의 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및 서열번호: 47, 48, 50, 51, 52, 및 55의 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서:
a) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
b) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
c) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
d) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
e) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나;
f) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
g) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나;
h) 항체 HC는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
i) 항체 HC는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현형태에서, 항원 결합 단백질은 약 5 x 10-8 M 미만, 약 1 x 10-8 M 미만, 약 5 x 10-9 M 미만, 약 1 x 10-9 M 미만, 약 5 x 10-10 M 미만, 또는 약 1 x 10-10 M 미만의 KD로 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드-결합된 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합함으로써, 항원 결합 단백질에 결합하는 형광-표지된 항체로 검출되는 형광 신호를 생성하며, EC50 값은 약 0.1 nM 내지 약 3.0 nM이다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 인간 uPAR DII-DIII 도메인 또는 인간 uPAR DIII 도메인에 결합한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 결합에 대해 상기 기재된 항원 결합 단백질과 경쟁하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 항원 결합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기에 언급된 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(i) 항원 결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 언급된 숙주 세포를 배양하는 단계;
(ii) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계; 및 임의로
(iii) 항원 결합 단백질을 추가로 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함한다.
사이토카인 및 이의 변이체
본원에서 사용된 "사이토카인"은 "림포카인"(림프구에 의해 만들어진 사이토카인), "모노카인"(단핵구에 의해 만들어진 사이토카인), "케모카인"(화학주성 활성을 갖는 사이토카인) 및 "인터류킨"(하나의 백혈구에서 만들어지고 다른 백혈구에 작용하는 사이토카인)을 포함하는 일반적인 용어이다. 사이토카인은 이를 분비하는 세포(자가분비 작용), 근처 세포(주변분비 작용), 또는 일부 경우에는 먼 세포(내분비 작용)에 작용할 수 있다. 친-염증성 사이토카인은 주로 활성화된 대식세포와 수지상 세포에 의해 생성되며 염증 반응의 상향-조절에 관여하며 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 케모카인은 일반적으로 처음 두 시스테인 잔기의 간격에 따라 4개 군으로 분류된다: C-C 케모카인(예를 들어, RANTES, 단핵구 화학유인 단백질 또는 MCP-1, 단핵구 염증 단백질 또는 MIP-1α 및 MIP-1β), C-X-C 케모카인(예를 들어, 성장 관련 종양 유전자 또는 GRO/KC라고도 하는 IL-8), C 케모카인(예를 들어, 림포탁틴) 및 CXXXC 케모카인(예를 들어, 프락탈카인). 항-염증성 사이토카인은 친-염증성 반응을 약화시키거나 조절하는 일련의 면역조절 분자이다. 사이토카인은 특정 사이토카인 억제제 및 용해성 사이토카인 수용체와 협력하여 면역 반응을 조절한다. 주요 항-염증성 사이토카인에는 인터류킨(IL)-1 수용체 길항제, IL-4, IL-10, IL-11 및 IL-13이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 백혈병 억제 인자, 인터페론-알파, IL-6, IL-10 및 형질전환 성장 인자(TGF)-β는 다양한 상황에서 항-염증성 또는 친-염증성 사이토카인으로 분류된다. IL-1, TNF-α 및 IL-18에 대한 특정 사이토카인 수용체는 친-염증성 사이토카인에 대한 억제제로도 기능한다.
본원에 개시된 융합 단백질의 사이토카인 폴리펩티드는 이의 변이체, 예를 들어 이의 기능적 단편, 또는 이의 원형 순열 변이체를 포함하는 임의의 사이토카인일 수 있다. 유용한 사이토카인에는 IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p35, IL-12p40, IL-13, IL-15, IL-17 계열 구성원, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23p19, IL-30(IL-27p28), IL-33, IL-34, IL-35, IL-35p35, IL-36Ra, IL-36a, IL-36b, IL-36g, IL- 37, IL-38, LIF, CNTF, 온코스타틴 M, CLCF-1, GM-CSF, 옥스페리틴, 아포지단백질 e, 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인터페론-알파(IFNα), 인터페론-베타(IFNβ) 또는 인터페론-알파 감마(IFNγ)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 원형 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10 또는 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 적어도 하나의 인터류킨-12(IL-12) 서브유닛(예를 들어, p35 및 p40)을 포함한다. 특정 구현양태에서, IL-12 서브유닛은 p35 및 p40 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커에 의해 부착된 p35 폴리펩티드 및 p40 폴리펩티드를 포함하는 단일 사슬 IL-12(scIL-12)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 참조 폴리펩티드와 상이하지만 필수 특성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 다른 참조 폴리펩티드와 1차 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 참조 폴리펩티드와 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 차이점이 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 첨가 및/또는 결실)에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩된 것일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생하는 것일 수도 있고, 자연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수도 있다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "변이체"는 단백질 및 펩티드의 원형 순열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "원형 순열" 및 "원형으로 순열된" "(CP 또는 cp)"는 선형 단백질 또는 이의 동족 핵산 서열을 취하고 천연 N- 및 C-말단(직접 또는 링커를 통해, 단백질 또는 재조합 DNA 방법론 사용)을 융합시켜 원형 분자를 형성한 다음 다른 위치에서 원형 분자를 절단(개방)하여 말단이 원래 분자의 말단과 상이한 새로운 선형 단백질 또는 동족 핵산 분자를 형성하는 개념적 과정을 의미한다. 따라서 원형 순열은 단백질의 서열, 구조 및 기능(임의의 링커 제외)을 보존하는 한편, 본 개시내용의 한 측면에 따르면, 상이한 위치에서 새로운 C- 및 N-말단을 생성하여 원래의 리간드와 비교하여 원하는 폴리펩티드 융합 파트너를 융합하기 위한 향상된 배향을 초래한다. 원형 순열은 또한 본원에 정의된 바와 같이 원형 순열 직쇄 분자를 생성하는 임의의 과정을 포함한다. 일반적으로 원형 순열 분자는 선형 분자로 새롭게 발현되며 공식적으로 원형화 및 개방 단계를 거치지 않는다. 본원에서 분자의 특정 원형 순열은 원형 순열 단백질의 경우 펩티드 결합이 제거되는 아미노산 잔기를 함유하는 괄호로 표시된다. 예를 들어, IL6(Q182/Q180)이라는 명칭은 순열되지 않거나 변형되지 않은 천연 IL6의 Q182와 Q180 잔기 사이에 개방 부위(펩티드 결합이 제거되는 위치)가 발생한 원형 순열 IL6 성장 인자를 지정하며, 새로 생성된 N-말단은 이전에 잔기 182였던 글루타민이고, 새로 생성된 C-말단은 이전에 잔기 180이었던 글루타민이다. 원형 순열 단백질 및 이를 생산하는 방법은 본원에 참조로 포함되는 U.S. 9,359,415에 더 자세히 설명되어 있다.
예를 들어, "비순열된", "천연", "야생형" 또는 "비변형" 리간드, 폴리펩티드, 단백질, 사이토카인이라는 용어는 위에서 설명한 대로 원형 순열 분자로 재배열되기 전에 사이토카인에 대한 기준점을 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 전형적으로, 비변형 사이토카인은 사이토카인의 아미노 및 카복시 말단 및 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노 및 카복시 말단 및 아미노산 서열 또는 일반적으로 생체 내에서 발생하는 단백질의 독립 도메인을 갖는다. 비변형 사이토카인은 완전히 성숙한 형태이거나 성숙한 형태의 전구체(예를 들어, 프로단백질)일 수 있다.
본원에서 사용된 "단편"은 참조 단백질보다 짧은 폴리펩티드의 세그먼트를 의미한다. 단백질 단편에는 말단(카복시 또는 아미노 말단) 및/또는 내부 결실이 있을 수 있다. 일반적으로, 단백질의 단편은 적어도 4개(예를 들어, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개 또는 적어도 100개 이상)의 아미노산 길이일 수 있다. 본원에 기술된 임의의 단백질, 융합 단백질 또는 단편의 생물학적 활성 단편 또는 생물학적 활성 변이체는 야생형, 전장 참조 단백질의 활성의 적어도 25%(예를 들어, 적어도: 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99%; 99.5%, 또는 100% 이상)를 갖는다. uPAR 결합 폴리펩티드의 경우, 관련된 활성은 uPAR 결합 폴리펩티드가 표적 uPAR 수용체에 결합하는 능력이다. 사이토카인 폴리펩티드의 경우, 관련 활성은 수용체에 결합하고 적절하게 작용하거나 길항하는 능력이다. 의도된 용도에 따라, 폴리펩티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 생물학적 활성 변이체는 임의의 종이 될 수 있지만, 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 게르빌쥐, 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 말, 고래, 원숭이 또는 인간)이고 가장 바람직하게는 인간이다.
따라서 본 개시내용은 전장 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은uPAR 결합 폴리펩티드, 사이토카인 및 상응하는 수용체 또는 수용체 단편을 포함하는 본 발명의 융합 단백질의 다양한 폴리펩티드)의 (i) 생물학적 활성 변이체 및 (ii) 이의 생물학적 활성 단편 또는 생물학적 활성 변이체를 제공하는 것으로 이해된다. 전장, 바람직하게는 성숙한 야생형 단백질의 생물학적 활성 변이체 또는 단백질의 단편은 첨가, 결실 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50개의 보존적 아미노산 치환과 같은 치환을 함유할 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존적 치환에는 다음 군내의 치환이 포함된다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신, 발린 및 이소류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인 및 트레오닌; 라이신 및 아르기닌; 그리고 페닐알라닌 및 티로신. 비극성 소수성 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함된다. 음전하를 띤(산성) 아미노산에는 아스파르트산과 글루탐산이 포함된다. 위에서 언급한 극성, 염기성 또는 산성 군의 한 구성원이 동일한 군의 다른 구성원으로 치환되는 것은 보존적 치환으로 간주될 수 있다. 대조적으로, 비-보존적 치환은 하나의 아미노산을 다른 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 결실 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 세그먼트(두 개 이상의 아미노산 중) 또는 비연속 단일 아미노산이 부족할 수 있다. 첨가(첨가 변이체)에는 다음을 함유하는 융합 단백질이 포함된다: (a) 적어도 5개의 아미노산을 함유하는 전장, 야생형 폴리펩티드 또는 이의 단편; 및 (b) 내부 또는 말단(C 또는 N) 관련이 없거나 이종 아미노산 서열. 이러한 융합 단백질의 맥락에서, "이종 아미노산 서열"이라는 용어는 (a) 이외의 아미노산 서열을 의미한다. 따라서 본원에 기술된 펩티드 및 이종 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질은 자연 발생 단백질의 전부 또는 일부에 서열이 일치하지 않는다. 이종 서열은, 예를 들어 재조합 단백질의 정제에 사용되는 서열(예를 들어 FLAG 또는 폴리히스티딘(헥사히스티딘 또는 6xHis))일 수 있다.
조작된 인터류킨 12 서브유닛
IL-12는 p35 서브유닛(즉, IL-12 p35)와 p40 서브유닛(즉, IL-12 p40)로 구성된 이종이량체이다. IL-12의 최적 활성은 이종이량체가 형성되고 IL-12 수용체를 결합할 때(예를 들어, IL-12Rβ1/IL-12Rβ2 이종이량체) 달성된다. 2개의 서브유닛(p35 및 p40)는 함께 연결되어 단일 사슬 IL-12(scIL-12)를 형성할 수 있으므로 이종이량체 조립의 필요성이 제거되고 IL-12의 활성이 증가된다. 그러나, scIL-12는 전신 투여 시 독성이 매우 높다. 따라서 각 IL-12 서브유닛를 별도로 공급하는 것이 유리하다.
안타깝게도 IL-12 서브유닛은 치료 목적으로 발현 및 정제가 어렵다. p35는 발현이 거의 또는 전혀 되지 않는다. p35를 항체나 이의 단편, 또는 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 융합 파트너에 연결함으로써 발현을 향상시킬 수 있다. p35는 또한 응집되기 쉽다. p40도 비슷한 문제를 보여준다. p40은 융합 파트너 없이 발현될 수 있지만, 정제된 조성물은 p40 동종이량체(약 15-20%)로 오염되는 경우가 많다. p40은 또한 37℃에서 시간이 지남에 따라 이량체화 및 응집되는 경향이 있다. 본 개시내용은 서로의 결합 친화도를 유지하면서 이러한 과제를 극복할 수 있는 조작된 IL-12 서브유닛(즉, p35 및 p40 변이체)을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열번호: 81의 위치 S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, 및 L161에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드를 제공한다.
특정 구현양태에서, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드는 S27 및 D188 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 N28R 및 Q35E를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 C74K를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D, C74K 및 D188N을 포함한다.
특정 구현양태에서, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 (i) 위에 언급된 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드; 및 (ii) 하나 이상의 융합 파트너(예를 들어, 기능성 모이어티 또는 항-uPAR 항원 결합 단백질)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 표적화 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 항원 결합 단백질을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드를 제공한다.
특정 구현양태에서, C177 아미노산 치환은 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I, 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현양태에서, C252 아미노산 치환은 C252S이다.
특정 구현양태에서, p40은 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86 또는 서열번호: 87에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 (i) 위에 언급된 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드; 및 (ii) 하나 이상의 융합 파트너(예를 들어, 기능성 모이어티 또는 항-uPAR 항원 결합 단백질)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 표적화 모이어티를 포함한다.
특정 구현양태에서, 하나 이상의 융합 파트너는 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 항원 결합 단백질을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합한다.
예시적인 IL-12 아미노산 서열은 아래 표 2에 제시되어 있다.
표 2 - IL-12 아미노산 서열
융합 단백질
상기 기재된 uPAR 항원 결합 단백질을 포함하여, 본원에 기재된 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드는 1) 사이토카인 또는 이의 변이체, 및 2) 체크포인트 분자 조절제 중 하나 또는 둘 모두에 연결(즉, 부착 또는 융합)될 수 있다. uPAR 항원 결합 단백질은 연결된 단백질(즉, 사이토카인 또는 체크포인트 분자 조절제)을 uPAR-발현 종양에 표적화하는 데 유용하다.
"체크포인트 분자 조절제"라는 어구는 바람직한 면역 반응을 향상(예를 들어, 면역 자극 체크포인트 분자를 작용하거나 면역 억제 체크포인트 분자를 길항)시키거나 바람직하지 않은 면역 반응을 억제(예를 들어, 부적절한 반응에 대한 면역 자극 체크포인트 분자의 길항)하기 위해 적절하게 체크포인트 분자를 작용시키거나 길항할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 자극 또는 동동자극 체크포인트 분자에는 CD27, CD70, CD28, CD40, CD40 리간드, CD122, CD137, OX40, GITR 및 이의 리간드, ICOS, CD131(4-1BBB 및 이의 리간드)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 억제 체크포인트 분자에는 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3, B7-H4, BTLA(B 및 T 림프구 감쇠제), CTLA-4(세포독성 T 림프구-연관 단백질 4), IDO(인돌아민 2,3, 디옥시게나제), KIR(킬러-세포 면역글로불린-유사 수용체), LAG3(림프구 활성화 유전자-3), PD-1(프로그램화된 세포 사멸-1 수용체) 및 이의 리간드 PD-L1(프로그램된 사멸 리간드 1) 및 PD-L2(프로그램화된 사멸 리간드 2), TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-함유 단백질 3), VISTA(T 세포 활성화의 v-도메인 Ig 억제제)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 융합 단백질에 사용되는 체크포인트 분자 조절제는 억제성 또는 자극성 체크포인트 분자, 이의 기능적 단편, 이의 기능적 유도체 또는 이의 원형 순열 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 단백질 이외에, uPAR 결합 폴리펩티드는 uPAR 통합 상호작용을 차단하는 인테그린으로부터 유래된 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 펩티드 중 하나는 아미노산 서열 PRYQHIGLVAMFRQNTG(서열번호: 157)를 갖는 M25, 피브리노겐, 비트로넥틴 및 사이토카인-자극 내피 세포에 대한 백혈구 접착을 억제하는 Mac-1의 β2 서브유닛에서 유래된 펩티드이다. M25는 또한 uPAR과 β1의 연관을 차단하고 피브로넥틴 및 콜라겐에서 인간 혈관 평활근 세포의 β1-인테그린 의존성 확산 및 이동을 손상시켰다(Simon DI, et al. (2000) J Biol Chem. 275:10228-34). uPAR-인테그린 복합체 형성을 억제하는 두 번째 펩티드인, 아미노산 서열 AESTYHHLSLGYMYTLN(서열번호: 158)을 갖는 P25는 비트로넥틴에 대한 종양 세포 부착을 감소시키고 피브로넥틴에 대한 종양 세포 부착을 증가시킬 수 있었다(van der Pluijm G, et al. (2001) Am J Pathol. 1 59:971-82).
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및 (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질 및 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커로 연결된다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 원형 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10 또는 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 적어도 하나의 인터류킨-12(IL-12) 서브유닛(예를 들어, p35 및 p40)을 포함한다. 특정 구현양태에서, IL-12 서브유닛은 p35 및 p40 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 그러나 이에 제한되지는 않고 융합 단백질은 (i) uPAR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및 (ii) p35 폴리펩티드를 포함한다. 대안적으로, 융합 단백질은 (i) uPAR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및 (ii) p40 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현양태에서, p35 폴리펩티드는 서열번호: 81의 위치 M12, S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, L161, 및 D188에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 N28R 및 Q35E를 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D 및 D188N을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 C74K를 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 치환은 S27D, C74K 및 D188N을 포함한다. 특정 구현양태에서, p35는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 유사성 또는 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, p40 폴리펩티드는 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현양태에서, C177 아미노산 치환은 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현양태에서, C252 아미노산 치환은 C252S이다. 특정 구현양태에서, p40 폴리펩티드는 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 유사성 또는 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 아미노산 링커에 의해 부착된 p35 폴리펩티드 및 p40 폴리펩티드를 포함하는 단일 사슬 IL-12(scIL-12)를 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 서열 GGSGGGGSGG(서열번호: 156)를 포함한다. 특정 구현양태에서, scIL-12는 서열번호: 88 또는 서열번호: 89의 아미노산 서열, 또는 서열번호: 88 또는 서열번호: 89에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 유사성 또는 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
특정 구현양태에서, 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) GFSLTNYG (서열번호: 11)의 HCDR1 아미노산 서열, IWSDGGT (서열번호: 12)의 HCDR2 아미노산 서열, ARGGRSDLFAY (서열번호: 13)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) QSIVHSNGNTY (서열번호: 14)의 LCDR1 아미노산 서열, KVS (서열번호: 15)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 FQGSHVPYT (서열번호: 16)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
특정 구현양태에서, 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
특정 구현양태에서, 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고
b) SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
특정 구현양태에서, 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호:35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
b) 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
c) 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
d) 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
e) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
f) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
g) 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
h) 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는
i) 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
특정 구현양태에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 아미노산 링커로 부착된다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1과 5 사이의 정수이다. 특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 149), 또는 GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG (서열번호: 150)을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), dAb 단편, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 56-71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 72-78 중 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 서열번호: 45, 46, 49, 53, 또는 54의 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및 서열번호: 47, 48, 50, 51, 52, 및 55의 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
b) 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
c) 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
d) 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
e) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
f) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
g) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC;
h) 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC; 또는
i) 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 항체 HC, 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 항체 LC.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 포함하는 조합물을 제공하며, 여기서:
(a) 제1 융합 단백질은:
(i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
(b) 제2 융합 단백질은:
(i) uPAR 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일하다.
특정 구현양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 상이하다.
기능성 모이어티
본 개시내용의 단백질(예를 들어, uPAR 결합 단백질, 사이토카인 및 융합 단백질)은 본 개시내용의 단백질에 바람직한 생체활성을 부여하는 기능적 모이어티에 추가로 접합(즉, 연결, 부착 또는 융합)될 수 있다. 기능성 모이어티는 단백질 기능성 모이어티와 비-단백질 기능성 모이어티(예를 들어, PEG 또는 다당류)를 모두 포함한다. 예를 들어, 제한 없이 사이토카인 또는 이의 변이체는 사이토카인 또는 이의 변이체의 반감기를 연장할 목적으로 임의의 링커를 통해 면역글로불린의 Fc 영역 또는 인간 혈청 알부민(HSA)에 접합될 수 있다(예를 들어, IL-12 p35-HSA 또는 IL-12 p40-HSA 접합체).
특정 구현양태에서, 기능성 모이어티는 면역글로불린의 Fc 영역(즉, Fc 도메인)이다. 특정 구현양태에서, Fc 영역은 본원에 참고로 포함된 WO 2016/100788에 기재된 바와 같이 단일 사슬 링커를 통해 본 개시내용의 단백질(예를 들어, uPAR 결합 단백질, 사이토카인 및 융합 단백질)에 연결될 수 있다. 이들 링커는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄(scCLCH1 또는 scCH1CL 링커)의 CH1 불변 영역에 연결된 면역글로불린 경쇄(CL)의 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 융합 단백질(예를 들어, 항-uPAR 항원 결합 단백질에 연결된 사이토카인)은 scCLCH1 또는 scCH1CL 링커를 통해 면역글로불린의 Fc 영역에 추가로 연결될 수 있다. 이러한 유형의 링커는 본 개시내용의 융합 단백질에 대한 개선된 생체활성 및 증가된 반감기와 같은 유리한 특성을 본 개시내용의 융합 단백질에 부여한다.
본 개시내용의 융합 단백질은 생체내에서 추가로 안정화될 수 있고 이의 반감기는 혈청 알부민 분자, 예를 들어 분해 및/또는 제거 또는 격리에 저항하는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합함으로써 증가될 수 있다. 이들 혈청 알부민 분자는 생체내에서 그 자체로 긴 반감기를 갖고 있는 자연적으로 발생하는 단백질이다.
링커
본원에 기술된 임의의 단백질(예를 들어, uPAR 결합 단백질, 사이토카인 단백질 및 융합 단백질)은 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상)의 링커 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 융합 단백질의 폴리펩티드 중 하나 이상(또는 전부)을 연결하거나, 하나 이상의 사이토카인 단백질을 연결하거나, 하나 이상의 uPAR 결합 단백질을 연결한다(예를 들어, uPAR 항원 결합 단백질의 VH 및 VL 도메인을 연결한다). 특정 구현양태에서, 링커는 길이가 하나의 아미노산일 수 있지만 길이가 더 길 수 있는 아미노산 링커이다. 예를 들어, 링커 펩티드는 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개)의 아미노산 길이이다. 링커 펩티드는 임의의 아미노산을 함유할 수 있다.
특정 구현양태에서, 본 개시내용의 단백질에 존재하는 임의의 하나 이상의 링커는 Gly(G) 및/또는 Ser(S)로부터 선택된 아미노산을 포함하는 인공 가요성 폴리펩티드로부터 선택된다. 특정 구현양태에서, 링커는 일반식 (GGGS(서열번호: 151))n 또는 (GGGGS(서열번호: 152))n 또는 (SGGSGGG(서열번호: 153))n 또는 (GGSGGSG(서열번호: 154))n의 폴리펩티드로 구성되어 있으며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이다. 특정 구현양태에서, 각각의 링커는 약 1 내지 약 100개의 아미노산, 예를 들어 약 1-50개의 아미노산, 약 1-25개 아미노산, 약 1-15개 아미노산, 약 1-10개 아미노산, 약 4-24개 아미노산, 약 5-20개 아미노산, 약 5-15개 아미노산, 및 약 5-10개 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 구현양태에서, 링커는 (GGGGS(서열번호: 155))n이고, 여기서 n은 2 또는 4이다. 임의의 링커는, 예를 들어 Lys(K), Thr(T), Glu(E) 및 Asp(D)과 같은 아미노산을 포함한다.
특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이다. 특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 149) 또는 GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(서열번호: 150)을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGS를 포함한다.
특정 구현양태에서, 링커는 하나 이상의 뮤신 단백질 또는 단백질의 뮤신 도메인(예를 들어, MUC 유전자(예를 들어, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, MUC21)에 의해 인코딩된 임의의 단백질)을 포함할 수 있다. 뮤신 도메인 단백질 및 폴리펩티드는 뮤신 단백질 및 뮤신 도메인을 포함하는 기타 폴리펩티드가 경직된 무작위 코일로 행동하도록 구조적으로 허용하는 높은 수준의 글리코실화를 함유한다. 뮤신 도메인의 막대-유사 특성은 생체활성 단백질(예를 들어, 사이토카인)을 융합 파트너(예를 들어, uPAR 결합 단백질)로부터 견고하게 분리할 수 있으므로 융합 파트너의 활성 손실에 덜 민감하다.
본 개시내용에 따라 유용한 이러한 뮤신 도메인 폴리펩티드는 본원에 참고로 포함된 WO 2013/184939 및 WO 2013/184938에 기재되어 있다. 이들 링커는 본 개시내용의 융합 단백질의 폴리펩티드 사이(예를 들어, ATF 폴리펩티드와 사이토카인 폴리펩티드 사이)에 최적의 간격을 제공하거나 예를 들어, 융합 단백질 내 뮤신 도메인의 위치에 상관없이 전체적으로 융합 단백질의 반감기 증가를 제공하는데 유용하다. 예를 들어, 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 뮤신-도메인이 존재할 수 있다. 뮤신 도메인 폴리펩티드 링커는 WO 2013/184938에 기술된 바와 같이 본 발명의 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 기능을 할 수도 있는 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역에 추가로 연결될 수 있다.
정제 태그
본원에 기술된 임의의 단백질(예를 들어, uPAR 결합 단백질, 사이토카인 단백질 및 융합 단백질)은 하나 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 이상)의 정제 태그를 포함할 수 있으며, 정제 태그는 본원에 기술된 단백질의 정제를 촉진한다. 특정 구현양태에서, 정제 태그는 avi 태그(GLNDIFEAQKIEWHE; 서열번호: 240)이다. 특정 구현양태에서, 정제 태그는 6xHis 태그(HHHHHH; 서열번호: 241)이다. avi 태그와 6xHis 태그 중 하나 또는 둘 모두는 단일 단백질에 임의의 순서로 존재할 수 있다. 특정 구현양태에서, 정제 태그는 gly-ser 링커를 사용하여 본원에 기술된 단백질에 연결된다. 특정 구현양태에서, gly-ser 링커는 GGS 및/또는 GGSGGG(서열번호: 242)를 포함한다. 특정 구현양태에서, 정제는 GGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE(서열번호: 243), GGSGGHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE(서열번호: 244) 및 GGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSHHHHHH(서열번호: 245) 중 어느 하나이다.
항원 결합 단백질, 사이토카인 및 융합 단백질의 발현
한 측면에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-uPAR 항원 결합 단백질)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 사이토카인 또는 이의 변이체(예를 들어, 조작된 IL-12 p35 또는 조작된 IL-12 p40), 또는 융합 단백질(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-uPAR 항원 결합 단백질-사이토카인 융합 단백질)이 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함하는 항원 결합 단백질, 사이토카인, 또는 융합 단백질을 제조하는 방법도 제공된다.
본원에 개시된 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 사이토카인 또는 융합 단백질은 일반적으로 원하는 양의 항원 결합 단백질 또는 융합 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있는 숙주 세포로의 도입을 위해 발현 벡터에 삽입된다. 따라서, 특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이들 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본원에서 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 원하는 유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하는 데 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 적합한 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 세포에 진입 및/또는 복제하는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적을 위해 수많은 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 한 부류는 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, RSV, MMTV, MOMLV 등) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 활용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 가진 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다. 추가적으로, 염색체에 DNA가 통합된 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 프로토트로피(prototrophy), 살생물제 저항성(예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나 공동-형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 최적의 mRNA 합성을 위해서 추가 요소가 필요할 수도 있다. 이러한 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호가 포함될 수 있다. 일부 구현양태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자)와 함께 발현 벡터에 삽입된다.
다른 구현양태에서, 항원 결합 단백질은 폴리시스트론 구성물을 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 다중 관심 유전자 생성물은 단일 폴리시스트론 구성물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 진핵 숙주 세포에서 비교적 높은 수준의 폴리펩티드를 제공하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 유리하게 사용한다. 호환가능한 IRES 서열은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 No. 6,193,980에 기재되어 있다. 당업자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 개시된 전체 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생산하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
보다 일반적으로, 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 즉, 숙주 세포가 형질전환될 수 있다. 플라스미드를 숙주 세포에 도입하는 것은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 여기에는 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 외피 DNA를 사용한 세포 융합, 미세주입 및 온전한 바이러스 감염이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988) 참조. 숙주 내로의 플라스미드 도입은 전기천공에 의해 이루어질 수 있다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄 생산에 적합한 조건에서 성장하고 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 검정된다. 예시적인 검정 기술에는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 형광-활성화 세포 분류 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 유전자형을 변화시키고 결과적으로 수용 세포에 변화를 초래하는 DNA를 수용 숙주 세포에 도입하는 것을 의미하는 넓은 의미로 사용되어야 한다.
같은 맥락에서, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성되고 적어도 하나의 이종 유전자를 인코딩하는 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다. 재조합 숙주로부터 폴리펩티드를 분리하는 과정에 대한 설명에서, "세포" 및 "세포 배양물"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 달리 말하면, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 회전된 전체 세포로부터 또는 배지와 현탁된 세포를 모두 함유하는 세포 배양으로부터를 의미할 수 있다.
한 구현양태에서, 항체 발현 또는 융합 단백질 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 포유동물 기원이다. 당업자는 발현될 원하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 결정할 수 있다. 예시적인 숙주 세포주는 DG44 및 DUXB11(차이니즈 햄스터 난소 계통, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁 경부 암종), CV-1(원숭이 신장 계통), COS(SV40 T 항원을 갖는 CV-1의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장주), SP2/O(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), 293(인간 신장) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 한 구현양태에서, 세포주는 그로부터 발현된 항체의 변경된 글리코실화, 예를 들어 어푸코실화를 제공한다(예를 들어, PER.C6®(Crucell) 또는 FUT8-녹아웃 CHO 세포주(Potelligent® 세포)(Biowa, Princeton, 뉴저지)). 숙주 세포주는 일반적으로 아메리칸 조직 배양 컬렉션(American Tissue Culture Collection)과 같은 상업용 서비스나 출판된 문헌에서 구할 수 있다.
시험관내 생산을 통해 대규모로 원하는 폴리펩티드를 대량 생산할 수 있다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포 배양을 위한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로스 마이크로비즈 또는 세라믹 카트리지 상에서 고정되거나 포획된 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 원하는 경우, 폴리펩티드 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스를 통한 크로마토그래피 및/또는 (면역-) 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명에서 특징으로 하는 항원 결합 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한 박테리아, 효모 또는 식물 세포와 같은 비-포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 박테리아와 같은 다양한 단세포 비-포유동물 미생물도 형질전환될 수 있으며, 즉 배양 또는 발효에서 성장할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 형질전환되기 쉬운 박테리아에는 대장균(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 계통과 같은 장내세균과의 구성원; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 간균과(Bacillaceae); 폐렴구균(Pneumococcus); 연쇄구균(Streptococcus), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 박테리아에서 발현될 때 단백질은 봉입체의 일부가 될 수 있음이 추가로 이해될 것이다. 단백질은 분리, 정제된 다음 기능성 분자로 조립되어야 한다.
원핵생물 이외에 진핵생물도 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 빵 효모는 진핵 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용되지만, 다른 여러 균주도 일반적으로 사용할 수 있다. 사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980))이 일반적으로 사용된다. 이 플라스미드는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 이미 함유하고 있다(Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 효모 숙주 세포 게놈의 특징인 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재시 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
항원 결합 단백질, 사이토카인 및 융합 단백질을 투여하는 방법
본 개시내용의 항원 결합 단백질, 사이토카인 또는 융합 단백질뿐만 아니라 본원에 기술된 핵산, 본원에 기술된 벡터, 본원에 기술된 숙주 세포 세포 또는 본원에 기술된 조성물을 제조하고 대상체에게 투여하는 방법은 널리 공지되어 있거나 또는 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질의 투여 경로는, 예를 들어 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 비경구에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여가 포함된다. 특정 구현양태에서, 항원 결합 단백질 또는 융합 단백질은 정맥내로 투여된다. 본원에서 사용된 용어 안구내에는 결막하, 유리체강내, 안구뒤 또는 전방내가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 국소라는 용어는 액체 또는 용액 점안액, 에멀젼(예를 들어, 수중유 에멀젼), 현탁액 및 연고를 사용한 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
이러한 모든 투여 형태가 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 명백히 고려되지만, 투여 형태는 주사를 위한 용액일 수 있다. 일반적으로, 주사용 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 임의로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시에 부합하는 다른 방법에서, 변형된 항체는 유해한 세포 집단의 부위에 직접 전달되어 치료제에 대한 병든 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
관련 상태의 치료를 위한 본 개시내용의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 기타 약물, 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 포함하는 다양한 요인에 따라 다양하다. 일반적으로 환자는 인간이지만 트렌스제닉 포유동물을 포함한 비-인간 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.
이전에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 항원 결합 단백질 또는 융합 단백질, 이의 접합체 또는 재조합체는 포유동물 장애의 생체내 치료를 위해 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 항원 결합 단백질은 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제형화될 것이라는 것이 인식될 것이다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 전형적으로 생리 식염수, 무독성 완충제, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용되는 무독성 멸균 담체를 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, 항원 결합 단백질의 약제학적 유효량은 항원에 대한 효과적인 결합을 달성하고 이익을 달성하고, 예를 들어 질환 또는 장애의 증상을 개선하거나 물질이나 세포를 검출하기에 충분한 양을 의미한다. 종양 세포의 경우, 항원 결합 단백질은 전형적으로 신생물 또는 면역반응성 세포 상의 선택된 면역반응성 항원과 상호작용할 수 있고 이들 세포의 사멸을 증가시킬 수 있다. 물론, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 변형된 결합 폴리펩티드의 약제학적 유효량을 제공하기 위해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 범위에 따라, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 치료 또는 예방 효과를 생성하기에 충분한 양으로 전술한 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 공지된 기술에 따라 본 개시내용의 항원 결합 단백질을 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 제조된 통상적인 투여 형태로 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은 이것이 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 잘 알려진 변수에 의해 결정된다는 것이 당업자라면 인식할 것이다. 당업자는 본 개시내용에 기술된 항원 결합 단백질의 하나 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 유사하게, 본원에 기술된 핵산, 본원에 기술된 벡터, 본원에 기술된 숙주 세포 세포(특히 CAR을 보유하는 면역 세포) 또는 본원에 기술된 조성물은 치료 또는 예방 효과를 생성하기에 충분한 양으로 상기 기술된 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "효능" 또는 "생체내 효능"은, 예를 들어 표준 안과학적 반응 기준과 같은 표준화된 반응 기준을 사용하여 본 개시내용의 약제학적 조성물에 의한 치료법에 대한 반응을 지칭한다. 본 개시내용의 약제학적 조성물을 사용하는 치료법의 성공 또는 생체내 효능은 의도된 목적에 대한 조성물의 유효성, 즉 원하는 효과를 유발하는 조성물의 능력을 지칭한다. 생체내 효능은 특정 질환에 대해 확립된 표준 방법으로 모니터링할 수 있다. 또한, 다양한 질환 특이적 임상 화학 매개변수 및 기타 확립된 표준 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 세포는 하나 이상의 상이한 약제학적 화합물과 조합하여 투여된다. 일반적으로, 본원에 기술된 화합물 및 세포의 치료적 용도는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법, 방사선 요법 또는 백신 요법의 군으로부터 선택된 하나 이상의 요법과 병용될 수 있다.
치료 방법
본 개시내용의 항원 결합 단백질, 사이토카인 또는 융합 단백질을 투여함으로써 환자에서 uPAR 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 특정 구현양태에서, uPAR 발현과 연관된 질환 또는 장애는 암(예를 들어, uPAR-발현 암 또는 uPAR-발현 종양)이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 기재된 약제학적 조성물, uPAR 결합 단백질 또는 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현양태에서, 약제학적 조성물 또는 융합 단백질은 사이토카인 또는 이의 변이체 또는 제2 융합 단백질과 동시에 투여되며, 여기서 제2 융합 단백질은 제1 융합 단백질과 상이한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 약제학적 조성물 또는 융합 단백질은 사이토카인 또는 이의 변이체 또는 제2 융합 단백질을 순차적으로 투여하며, 여기서 제2 융합 단백질은 제1 융합 단백질과 상이한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 사이토카인 또는 이의 변이체는 IL-12 p35 서브유닛 또는 IL-12 p40 서브유닛을 포함한다.
특정 구현양태에서, 환자의 종양에서의 융합 단백질 제거율은 환자의 혈청에서의 융합 단백질 제거율보다 느리다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서:
(a) 융합 단백질은:
(i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체, 또는 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
(b) 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체, 또는 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고,
여기서 융합 단백질이 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 경우, 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고, 융합 단백질이 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 경우, 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛은 순차적으로 투여된다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛 중 하나 또는 둘 모두는 정맥내로 투여된다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질이 먼저 투여되고, 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되기에 충분한 시간이 경과한 후에 비-융합 IL-12 서브유닛이 투여된다.
특정 구현양태에서, 융합 단백질이 먼저 투여되고, 환자의 혈청에서 융합 단백질 농도가 실질적으로 감소하기에 충분한 시간이 경과한 후 비-융합 IL-12 서브유닛이 투여된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서:
(a) 제1 융합 단백질은:
(i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
(b) 제2 융합 단백질은:
(i) uPAR 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
(ii) IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일하다.
특정 실시 양태에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 상이하다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 순차적으로 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두는 정맥내로 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질이 먼저 투여된 후, 제1 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되는 데 충분한 시간이 경과한 후에 제2 융합 단백질이 투여된다.
특정 구현양태에서, 제1 융합 단백질이 먼저 투여된 후, 환자의 혈청에서 제1 융합 단백질 농도를 실질적으로 감소시키기에 충분한 시간이 경과한 후에 제2 융합 단백질을 투여한다.
특정 구현양태에서, 제2 융합 단백질이 먼저 투여된 후, 제2 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되는 데 충분한 시간이 경과한 후에 제1 융합 단백질이 투여된다.
특정 구현양태에서, 제2 융합 단백질이 먼저 투여된 후, 환자의 혈청에서 제2 융합 단백질 농도를 실질적으로 감소시키기에 충분한 시간이 경과한 후에 제1 융합 단백질을 투여한다.
본원에 개시된 구현양태의 범위를 벗어나지 않고 적절한 등가물을 사용하여 본원에 설명된 방법의 다른 적절한 수정 및 적용이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 이제 특정 구현양태를 상세히 설명했지만, 이는 단지 설명의 목적으로 포함되고 제한하려는 의도가 아닌 다음 실시예를 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1 - 모 항-uPAR 항체의 생성 및 특성화
NZBW 마우스는 재조합 인간 uPAR과 마우스 uPAR 세포외 도메인 단백질을 교대로 주입하여 면역화되었다. 인간 및 마우스 uPAR에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 확인하기 위해 하이브리도마를 생성하고 ELISA에서 및 uPAR 과발현 HEK293 세포에서 인간 및 마우스 uPAR에 대해 스크리닝했다. 1) 인간 uPA가 있거나 없는 인간 uPAR, 2) 마우스 uPA가 있거나 없는 마우스 uPAR, 3) H47C/N259C 돌연변이가 있는 인간 uPAR(리간드-결합 구조를 모방한 인간 uPAR 변이체)을 포함하여, uPAR 리간드 uPA-결합 변이체에 대한 결합에 대해 상위 클론을 ELISA로 추가로 스크리닝했다. 스크리닝을 위해 다음 아미노산 서열이 사용되었다:
인간 uPAR-His-Avi태그 융합
마우스 uPAR-His-Avi태그 융합
인간 uPA-His-Avi태그 융합
마우스 uPA-His-Avi태그 융합
M1, M5, M8 및 M43으로 지정된 항체는 리간드 uPA와 독립적으로 각각 인간 uPAR에 결합했으며 추가 특성화를 위해 선택되었다.
M1, M5, M8 및 M43에 대한 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 HCDR1-3 및 LCDR1-3 아미노산 서열은 아래 표 3에 제시되어 있다.
표 3 - 모 항체 서열
항-uPAR 항체 M1, M5, M8 및 M43의 결합 친화도를 결정했다. 생물층 간섭계(BLI) 기술을 기반으로 하는 옥테트 플랫폼을 사용하여 결합 친화도 분석을 수행했다. 간략하게, uPAR 항체는 항-마우스 Fc(AMC) 센서를 통해 고정되었다. 각 uPAR 항체는 10 μg/mL의 농도에서 테스트되었다. 로드는 히스티딘-태그된 인간 uPAR(Sino#10925-H08H)이었다. 빈 센서가 대조군으로 사용되었다. 인간 uPAR에 대한 각 항체의 결합 친화도는 아래 표 4에 기재되어 있다.
표 4 - 모 항체 결합 친화도 데이터
10 μg/mL의 농도로 센서에 고정된 히스티딘-태그된 인간 uPAR이 있는 옥테트 플랫폼을 사용하여 추가 결합 친화도 분석을 수행했다. 로드는 각각 M1, M5, M8, M43이었다. 빈 센서가 대조군으로 사용되었다. 인간 uPAR이 고정되었을 때 인간 uPAR에 대한 각 항체의 결합 친화도는 아래 표 5에 기재되어 있다. 각 항체는 1 pM 미만의 결합 친화도를 나타냈는데, 이는 결합력 효과를 시사한다.
표 5 - 결합 친화도 데이터
각 항체에 대한 uPAR 결합 에피토프는 위에 언급된 옥테트 플랫폼을 사용하여 특성화되었다. 비오티닐화된 인간 uPAR 변이체, uPAR DII-DIII 도메인 또는 uPAR DIII 도메인은 SA 센서에 의해 10 μg/ml에서 180초 동안 포획된 후, M1, M5, M8, M43 또는 ATN 568이 150초 동안 200 nM 농도로 결합되었다. DII-DIII 도메인 및 DIII 도메인에 대해 다음 아미노산 서열이 사용되었다:
인간 uPAR DII-DIII 도메인 HisAvi 태그
인간 uPAR DIII 도메인 HisAvi 태그
M1, M5, M8 및 M43은 인간 uPAR의 DII-DIII 도메인에 결합하는 반면, M1은 DIII 단독에도 결합할 수 있다(도 1a, 도 1b). 각각의 M1, M5, M8 및 M43은 uPAR 리간드인 uPAR에 대한 uPA 결합과 독립적으로 uPAR에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 항-uPAR 항체 ATN-658이 비교자로 사용되었다.
항체와 uPA 리간드 경쟁 결합을 테스트하기 위해, 인간 uPA를 SA 센서에 의해 3.2 μg/ml(200 nM)에서 45초 동안 포착했다. 인간 재조합 단백질 uPAR-His를 180초 동안 100 nM로 로딩한 다음, M1, M5, M8, M43 또는 ATN 568을 150초 동안 200 nM의 농도로 로딩했다.
항체 경쟁 검정은 옥테트 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 항체 경쟁 검정은 SA 센서에서 비오티닐화 인간 uPAR을 포착하여 수행되었다. 그런 다음 M1, M5, M8, M43 및 ATN-658을 미리 결정된 포화 농도에서 인간 uPAR에 결합하는 제1 리간드로 로딩했다. 제1 리간드가 포화 상태에 도달하면, M1, M5, M8, M43 및 ATN-568이 M1, M5, M8, M43 또는 ATN-658과 경쟁하는 제2 리간드로 로딩되었다. 제2 리간드 결합 용액은 제2 리간드 결합 동안 해리를 방지하기 위해 동일한 농도의 제1 프리로드 리간드를 함유했다. M1은 비교자 항체인 ATN-658과만 경쟁하는 것으로 밝혀졌다. M5는 M43과 경쟁했다. M1, M8 또는 M43 중 어느 것도 인간 uPAR에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하지 않았는데, 이는 3개의 항체가 인간 uPAR에 대한 고유한 에피토프를 가지고 있음을 나타낸다(즉, 항체는 비-경쟁적이다). 매트릭스 경쟁 검정 데이터는 아래 표 6에 기재되어 있다.
표 6 - 항체 경쟁 요약 데이터. 경쟁을 보여주는 값은 굵은 글씨로 표시되어 있다.
다음으로 세포 표면 상에 발현된 인간 및 마우스 uPAR에 결합하는 능력에 대해 항체를 테스트했다. 인간 uPAR 또는 마우스 uPAR을 발현하도록 조작된 인간 HEK293 세포를 염료-표지하고 표지되지 않은 모 HEK293 세포와 혼합하였다. 세포를 각각 100 nM의 인간 및 마우스 uPA(uPAR 리간드)와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후 uPAR 항체의 적정으로 30분 동안 처리했다. uPAR 항체 결합은 항-마우스-IgG-피코에리트린(PE)-표지 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 테스트된 항체 농도에 걸친 중간 형광 강도(MFI) 값이 도 2a 도 2b에 제시되어 있다. EC50 값은 아래 표 7에 제시되어 있다. uPA 리간드 없이 세포 결합의 EC50 값은 uPA 리간드를 사용한 실험과 유사했다. M1, M5, M8, M43 EC50 결합 값은 모두 비교자 ATN-658보다 우수했다.
표 7 - 세포 결합 검정에서 항-PAR 항체의 EC50 값
실시예 2 - 모 항-uPAR 항체의 인간화
상기에서 설명한 항-uPAR 모 항체 M1, M8 및 M43은 인간화를 위해 수행되었다. 1) 인간 항체 서열에 대한 각 마우스 항체의 자연적 인간화 퍼센트 동일성; 2) 면역원성 영역(예를 들어, T 세포, B 세포 및 MHC-II 항원성 에피토프); 3) 항체 잘못접힘 문제(예를 들어, 응집 및 열 안정성); 및 4) 번역-후 변형(PTM)을 포함하여 각 항체에 대한 다양한 매개변수를 먼저 결정했다. PTM에는 탈아미드화 부위(예를 들어, 아스파라긴을 아스파르테이트/이소아스파르테이트로의 변화를 야기시키는 Asn-Gly(NG)), 이성질화 부위(예를 들어, 아스파르테이트를 이소아스파르테이트로의 변화를 야기하는 Asp-Gly(DG), Asp/Asp(DD)), 글리코실화 부위(예를 들어, Asn-X-Ser/Thr(NXS) 아미노산 모티프, 여기서 "X"는 NLS와 같은 임의의 아미노산이다), 산화 부위(예를 들어, 표면 노출되고/되거나 항체의 CDR에 있는 Met 및/또는 Trp 아미노산), 단백질분해 부위(예를 들어 Asp-Ser(DS) 및/또는 Asp-Pro(DP) 아미노산 모티프)가 포함된다.
그런 다음 인간화 항체가 생성되었다. 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열 및 HCDR1-3 및 LCDR1-3 아미노산 서열은 아래 표 8에 제시되어 있다. 항체의 불변 영역을 포함하는 전장 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 아미노산 서열은 아래 표 9에 제시되어 있다. 단일 사슬 가변(scFv) 형식 항체 아미노산 서열은 아래 표 10에 제시되어 있다.
표 8 - 인간화 항체 VH/VL 및 HCDR1-3/LCDR1-3 아미노산 서열
표 9 - 인간화 항체 전장 아미노산 서열
표 10 - ScFv 항체 아미노산 서열
인간화 항-uPAR 항체 M1, M8 및 M43의 결합 친화도를 결정했다. 위에서 설명한 대로 옥테트 플랫폼을 사용하여 결합 친화도 분석을 수행했다. 간략하게, uPAR 항체는 항-인간 Fc(AHC) 센서를 통해 고정되었다. 각 uPAR 항체는 10 μg/mL의 농도에서 테스트되었다. 로드는 50 nM에서 시작하여 후속 2배 희석으로 적정을 통해 제공되는 히스티딘-태그된 인간 uPAR이었다. 인간 uPAR에 대한 테스트된 인간화 항체의 결합 친화도는 아래 표 11에 제시되어 있다. 특히, 인간화 항체는 모 항체와 비교하여 인간 uPAR에 대해 유사한 결합 친화도를 유지했다.
표 11 - 인간화 항체 결합 친화도 데이터
실시예 3 - 인터류킨 12(IL-12) 조작
IL-12는 p35 서브유닛과 p40 서브유닛으로 구성된 이종이량체 사이토카인으로, 결합하여 IL-12p70을 형성한다. IL-12는 항원 제시 세포에 의해 발현되며 면역-종양학 수명주기에서 다양한 역할을 한다. IL-12는 면역 반응의 강력한 자극제이지만, 독성 문제로 인해 임상에서 IL-12 사용이 제한되었다. 국소 전달은 독성을 감소시킬 수 있지만, 이는 전신 전달을 배제한다.
p35 서브유닛과 p40 서브유닛 중 하나 또는 둘 모두를 조작하면 여러 가지 이점이 있다. 두 서브유닛 사이의 친화력을 조절하고 특이성을 향상시키기 위해 각 서브유닛에서 "자물쇠와 열쇠" 돌연변이 세트를 만들 수 있다. 예를 들어, 조작된 서브유닛에 도입된 돌연변이는 야생형 서브유닛에 대한 인식을 감소시켜 독성을 더욱 감소시킬 수 있다. p35와 p40 사이의 인터페이스에 있는 쌍을 이루는 전하 잔기를 조작하여 특이성을 추가로 도입할 수 있다.
IL12p35/IL12p40 시스테인 잔기 조작
초기 최적화 전략의 일환으로, 안정성과 발현을 향상시키기 위한 여러 점 돌연변이가 p35 및 p40에서 확인되었다. p35의 C74와 p40의 C177 사이에는 분자간 이황화 가교가 형성된다. 두 서브유닛 간의 결합 친화도를 유지하거나 향상시키면서, 이황화 가교를 제거하기 위한 p35의 C74 및 p40의 C177에서 아미노산 치환을 사용하여 스크린을 수행하였다. p35의 경우, 치환 C74S, S(SS1), D, K, R, Q, W 및 Y가 생성되었다. p40의 경우, 치환 C177S, H, M, F, Y, R, K, E, Q, I, W 및 N이 생성되었다. S(SS1)은 p35에서 C15S, C88S 및 C74S 치환에 상응한다. C15S/C88S 쌍은 내부 이황화 가교에서 제거된다. 그런 다음 각 p35 C74 변이체를 각 p40 C177 변이체에 대해 테스트했다. 위에서 설명한 옥테트 플랫폼을 사용하여 결합 친화도를 측정했다. 간단히 말해서, 센서에는 5-10 μg/mL의 p35 또는 p40이 로딩되었다. 포착 화합물은 500 nM 내지 7.8 nM의 농도 범위로 제공되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 몇몇 p35/p40 변이체 쌍은 높은 결합 친화도를 입증하였다.
추가 결합 친화도 특성화를 위해 선택된 p35/p40 변이체 쌍을 선택했다. 구체적으로 p35 C74D, K, W 및 Y 변이체는 p40 C177S 또는 C177F 변이체와 쌍을 이루었다. 전체 결합 친화도 데이터는 아래 표 1213에 제시되어 있다. 아래 표시된 대로 각 p35/p40 변이체 쌍은 높은 결합 친화도를 나타냈다.
표 12 - p35 C74D, K, W 및 Y에 대한 p40 C177S 결합 친화도
표 13 - p35 C74D, K, W 및 Y에 대한 p40 C177F 결합 친화도
위에 언급된 이황화 가교 치환 외에도, 유리 티올이 p40(C252)에서 확인되었다. 이 부위는 또한 유리 티올을 제거하기 위해 C252S 치환으로 조작되었다.
IL12p35/IL12p40 조작 - 안정성 향상
p35 및 p40을 융합 파트너에 연결하면 안정성과 생산 수율이 향상될 수 있지만(아래 참조), 융합 파트너 없이 안정성을 향상하도록 서브유닛을 조작하는 것이 유리할 것이다. 특히 p35는 그 자체로 불안정하며 적절한 접힘 및 발현을 위해 융합 파트너 또는 p40의 도움을 많이 받는다.
처음에, p35에서 S27D 및 D188N 돌연변이는 지시된 분자 진화 접근법을 통해 확인되었다(Leong et al. PNAS. 100(3): 1163-1168. 2003). p35 치환은 수율 증가에 유용하다.
여러 표면 노출된 소수성 영역과 가요성 영역이 p35에서 확인되었다. p35 안정성을 향상시킬 수 있는 잠재적인 아미노산 돌연변이(즉, 치환, 결실 및/또는 삽입)를 확인하기 위해 인실리코(in silico) 모델링 및 시뮬레이션 접근 방식이 사용되었다. 첫 번째 통과로 85개의 단일 점 돌연변이가 델타-델타 G(ddG, 즉 WT와 돌연변이 p35에 대한 델타 G 간의 차이), 용해도, 위치-특이적 점수측정 매트릭스(pssm) 점수 및 에피토프 예측을 기준으로 순위가 매겨졌다. 이 공정은 보다 우수한 용해도를 위해 용매-노출된 소수성 잔기 대신 극성 잔기를 도입하고 보다 우수한 코어-패킹을 위해 내부적으로 부피가 큰 소수성 잔기를 도입하려고 시도했다. 각 단일 돌연변이체는 웨스턴 블롯을 통해 발현 및 안정성에 대해 테스트되었다. 웨스턴 블롯 분석 후, 단백질을 정제하고 HPLC로 테스트하여 % 단량체 및 % 응집을 결정했다. 웨스턴 블롯으로 테스트된 점 돌연변이는 아래 표 14에 제시되어 있다. 샘플 ID 번호 70-90은 p35-뮤린 혈청 알부민(MSA) 융합체였다. 모든 p35-MSA 융합체가 발현되었지만, 굵은 이탤릭체 텍스트로 표시된 샘플 ID 번호(ID 72, 75, 76, 80, 82, 83)는 테스트된 것 중에서 가장 잘 발현되었다.
표 14 - 웨스턴 블롯으로 발현에 대해 테스트된 점 돌연변이
웨스턴 블롯 분석 후, 샘플 ID 번호 69-90(p35-MSA 융합체)을 HPLC로 테스트하여 % 단량체 및 % 응집체를 결정했다. 결과는 아래 표 15에 제시되어 있으며, 이는 여러 p35 점 돌연변이가 WT p35에 비해 더 큰 % 단량체 함량을 누렸다는 것을 보여준다.
표 15 - % 단량체 및 % 응집체 함량에 대해 테스트된 점 돌연변이
단일 점 돌연변이 스크린의 결과는 p35 발현 및 안정성을 향상시키는 여러 점 돌연변이를 밝혀냈다. 특히, 다음 단일 p35 돌연변이체는 WT p35-MSA 융합체에 대한 값과 유사하거나 이를 초과하는 % 단량체 값을 나타냈다: M12S, S27D, F39D, F39H, S44K, M111F, M111W, V114I, M119L, M145L, F150Y, L161D, L161Q.
이중 돌연변이체인 Q35E/N28R도 WT p35-MSA 융합체에 대한 값을 초과하는 % 단량체 값을 나타냈다.
이러한 매개변수를 더욱 개선하기 위해 이중 돌연변이를 테스트할 예정이다.
IL12p35/IL12p40 융합
IL-12 서브유닛 p35 및 p40은 IL-12가 실행가능한 치료제로 사용되기 전에 극복해야 할 몇 가지 제조 문제를 제시한다. p35는 거의 또는 전혀 발현되지 않는다. p35를 항체나 이의 단편, 또는 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 융합 파트너에 연결시킴으로써 발현을 향상시킬 수 있다. p35는 또한 응집되기 쉽다. p40도 비슷한 문제를 보인다. p40은 융합 파트너 없이 발현될 수 있지만, 정제된 조성물은 p40 동종이량체(약 15-20%)로 오염되는 경우가 많다. p40은 또한 37℃에서 시간이 지남에 따라 이량체화 및 응집되는 경향이 있다.
p35 및 p40 서브유닛은 다양한 융합 파트너를 사용하여 37℃에서 안정성에 대해 테스트되었다. p40은 IgG 분자의 각 CH3 도메인에 연결된 두 개의 p40 서브유닛을 갖는 항체 Fab 융합 파트너와 전장 IgG 융합 파트너를 사용하여 테스트되었다. Fab 및 전장 항체는 위에서 설명한 항-uPAR 항체로부터 유래되었다. p35는 마우스 혈청 알부민(MSA) 융합 파트너 및 CH1-힌지-CH2-CH3 항체 단편 융합 파트너를 사용하여 테스트되었다. p35 및 p40 서브유닛이 아미노산 링커로 연결된 단일 사슬 IL-12(scIL-12)도 테스트되었다. 예시적인 IL-12 서브유닛 융합 단백질은 도 4에 도시되어 있다. 각 융합 단백질을 HPLC 분석으로 테스트하여 37℃에서 0시간, 24시간, 48시간, 1주 및 2주 동안 응집체 및 이량체 형성을 측정했다. 각각의 융합 단백질에 대한 결과는 아래 표 16 내지 표 21에 기재되어 있다. 결과는 p35 및 p40 서브유닛을 다양한 융합 파트너에 연결하면 응집체 및 동종이량체 형성을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
표 16 - p40 서브유닛 단독. 예측 분자량(Da) - 37087. 굵은 값은 단량체를 나타낸다. 다른 값은 응집체 및 이량체를 나타낸다. 예측된 MW와 계산된 MW의 차이는 부분적으로 단백질 글리코실화에 기인한다.
표 17 - p40-Fab 융합체. 예측 분자량(Da) - 62310. 굵은 값은 단량체를 나타낸다. 다른 값은 응집체 및 이량체를 나타낸다. 예측된 MW와 계산된 MW의 차이는 부분적으로 단백질 글리코실화에 기인한다.
표 18 - p40-IgG 융합체. 예측 분자량(Da) - 215845. 굵은 값은 단량체를 나타낸다. 다른 값은 응집체 및 이량체를 나타낸다. 예측된 MW와 계산된 MW의 차이는 부분적으로 단백질 글리코실화에 기인한다.
표 19 - p35-MSA 융합체. 예측 분자량(Da) - 92118. 굵은 값은 단량체를 나타낸다. 다른 값은 응집체 및 이량체를 나타낸다. 예측된 MW와 계산된 MW의 차이는 부분적으로 단백질 글리코실화에 기인한다.
표 20 - p35-CH1-힌지-CH2-CH3 항체 단편 융합체. 예측 분자량(Da) - 124339. 굵은 값은 단량체를 나타낸다. 다른 값은 응집체 및 이량체를 나타낸다. 예측된 MW와 계산된 MW의 차이는 부분적으로 단백질 글리코실화에 기인한다.
표 21 - scIL-12. 예측 분자량(Da) - 61001. 굵은 값은 단량체를 나타낸다. 다른 값은 응집체 및 이량체를 나타낸다. 예측된 MW와 계산된 MW의 차이는 부분적으로 단백질 글리코실화에 기인한다.
p35-MSA 융합 단백질과 p40-fab 융합 단백질은 시간 경과에 따라 37℃에서 서로 결합 친화도에 대해 테스트되었다. 위에 설명된 옥테트 플랫폼을 사용하여, 비오티닐화 p35-MSA를 10-20 μg/mL 농도의 로드로서 p40-fab를 사용하여 50 nM 내지 0.78 nM의 농도 범위에서 고정화했다. 0시간, 4시간, 24시간 및 47시간에서의 결합 친화도 데이터는 아래 표 22에 보고되어 있다. 결과는 37℃에서 47시간 후에도 p35/p40 친화도가 높게 유지된다는 것을 보여준다.
표 22 - 37℃에서의 p35-MSA/p40-fab 결합 친화도
실시예 4 - 스플릿 IL-12 활성
IL-12의 치료적 이점은 p35 서브유닛과 p40 서브유닛이 이종이량체화되어 IL-12p70을 형성할 수 있을 때 적어도 부분적으로 달성된다. 이를 위해, 서로 다른 융합 파트너를 가진 각 서브유닛의 이종이량체화 능력이 테스트되었다. 테스트된 융합 단백질 조합은 아래 표 23에 기재되어 있다.
표 23 - IL-12 서브유닛 조합
위에 언급된 조합은 세포-기반 시험관내 IL-12 활성 검정에서 테스트되었다. 간략하게, 동결된 T 세포(검정 시작 전 9일 동안 rhIL-2 + CD3/CD28과 함께 배양됨)를 해동하고 300,000개 세포/웰로 시딩하고 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다. IL-12 서브유닛을 1:1 비율로 T 세포에 첨가했다(각 분자의 최종 시작 농도는 250 nM). 인산화된 Stat4(pStat4) 및 IFN 감마가 검출되었다. pStat4 검출 검정을 위해, 세포와 IL-12 서브유닛을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션했다. IFN 감마 검출 검정을 위해, 세포와 IL-12 서브유닛을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 상층액을 수집했다.
각 조합은 CD8+(도 6a) 및 CD4+(도 6b) T 세포에서 Stat4 인산화를 유도하는 능력에 대해 테스트되었다. 간략하게, 각 샘플의 세포를 고정하고 형광단 피코에리트린(PE)으로 표지된 항-pStat4 항체와 함께 인큐베이션했다. 그런 다음 형광을 검출하였다. EC50 값 및 scIL-12에 대한 EC50 배수 변화는 CD8+ T 세포에 대해 아래 표 24에, CD4+ T 세포에 대해 표 25에 제시되어 있다.
표 24 - CD8+ T 세포에서 % pStat4 형성에 대한 EC50 값
표 25 - CD4+ T 세포에서 % pStat4 형성에 대한 EC50 값
각 조합은 세포에서도 IFN 감마 생산을 유도하는 능력에 대해 테스트되었다(도 7). MSD T-플렉스 사이토카인 검정 시스템이 사용되었다. MSD 검정은 ELISA-기반 검정이고, 여기서 MSD 플레이트는 IFN 감마에 대한 포획 항체로 사전 코팅되어 있다. 샘플을 플레이트에서 인큐베이션한 후, IFN 감마에도 결합하는 표지된 검출 항체를 화학발광 검출에 사용했다. EC50 값 및 scIL-12에 대한 EC50 배수 변화는 아래 표 26에 기재되어 있다.
표 26 - IFN 감마 생산에 대한 EC50 값
실시예 5 - 항-uPAR/IL-12 서브유닛 융합
독성 문제를 줄이면서 IL-12의 치료 효능을 향상시키기 위해, IL-12 서브유닛(p35 및 p40)를 위에서 설명한 모 항-uPAR 항체에 연결했다. uPAR 항체-IL-12 서브유닛 융합체는 서브유닛을 표적 uPAR 발현 조직 또는 세포(예를 들어, 종양 조직 또는 세포)에 전달할 수 있으며, 이로써 강력한 IL-12 활성이 표적 부위에서만 회복되도록 할 수 있다. 이를 위해, 상이한 uPAR 항체 융합 파트너를 갖는 각 서브유닛의 이종이량체화 능력이 테스트되었다. 테스트된 융합 단백질 조합 및 p35와 p40 사이의 결합 친화도는 아래 표 27에 제시되어 있다. uPAR에 대한 uPAR 항체 융합체(uPAR-his 및 uPAR-Fc) 사이의 결합 친화도도 아래에 제시되어 있다.
표 27 - uPAR 항체-IL-12 서브유닛 융합체에 대한 결합 친화도
*IgG 분자의 결합력으로 인해 친화도 값이 수득되지 않음
다음으로 선택된 융합 단백질을 생체내 마우스 종양 모델로 테스트하여 방사선표지된 종양-표적화된 IL-12 서브유닛 p40(도 5a) 및 p35(도 5b)의 PET/CT 영상화로부터 종양 및 혈청 약동학을 보여주었다. 시간이 지남에 따라 마우스의 종양과 혈액에서 종양-표적화된 서브유닛을 측정하고 최대 노출 비율(%)을 결정했다. 종양-표적화된 p40은 Fab 형식의 항-uPAR 항체 M37과 p40의 융합체였다. 종양 표적화된 p35는 KiH 형식의 항-uPAR 항체 M37과 p35의 융합체였다. 간략하게 말하면, CT26 종양 보유 BALB/c 마우스에 지르코늄-89(89Zr)-표지된 융합 단백질을 15.5-16.9 nmol/kg(표적: 16.4 nmol/kg)의 몰 질량과 182-192μCi의 방사성 용량을 200 μL에서 정맥내 주사(꼬리 정맥)로 투여했다. 이후 주사 후 4시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 168시간에 마우스를 PET/CT를 통해 영상화했다. 각 영상화 시점에서 감마 계산을 위해 혈액을 수집했다.
표적화된 IL-12 서브유닛의 종양 제거는 혈청 제거보다 느려 종양 특이적 조립을 촉진했다.
종양 및 간 축적을 보여주기 위해 생체내 마우스 종양 모델로 상기 언급된 융합 단백질을 또한 테스트하였다. 3개의 항-uPAR 항체 융합 단백질을 종양 표적화된 화합물로 사용하고 비-표적화된 scIL-12 또는 p35-MSA 융합 단백질과 비교했다. 세 가지 표적화된 융합 단백질은 Fab-p40, IgG-p40 및 p35-KiH이었다. 마우스에서 조직 축적을 추적하기 위해 각 화합물을 방사성 표지했다. 검정은 89Zr-표지된 융합 단백질을 사용하여 위와 같이 수행되었다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 표적화된 화합물은 시간이 지남에 따라 소멸되기 시작하기 전에 종양에 축적되었다. 표적화되지 않은 화합물은 축적되지 않았다. 도 8b는 시간 경과에 따른 간 축적을 보여주며, 화합물의 점진적인 제거를 입증한다. 표적화된 화합물은 더 느린 속도로 제거되었으며, 이는 표적화되지 않은 화합물에 비해 유지력이 더 우수함을 나타낸다.
그런 다음 융합체를 인간화 마우스 모델에서 테스트하여 순차적으로 투여된 인간 IL-12 서브유닛의 생체내 활성을 테스트했다. 면역 결핍 NCG 마우스를 1 x 107 인간 PBMC를 주사하여 인간화했다. 14일 후 마우스를 PBS(비히클), scIL-12 또는 2회 용량의 분할된 IL-12 분자로 처리했다. 분할된 IL-12 분자의 경우, p35-MSA를 p40-Fab과 함께 투여했다. scIL-12는 0.24 mg/kg으로 투여되었고, 분할된 IL-12 분자는 각각 0.6 mg/kg(scIL-12 용량의 2.5x) 및 각각 6 mg/kg(scIL-12 용량의 25x)으로 투여되었다. 주사 간격은 5분 미만이었다. 이어서, 혈청 약동학 및 약력학(혈청 IFN 감마 농도) 분석을 위해 다양한 시점에서 마우스를 샘플링하여 혈청을 채취했다. 데이터는 분할 융합 분자가 생체 내에서 기능한다는 것을 보여준다. 데이터는 또한 다음 실험에서 이들 치료법의 혈청 및 종양 활성을 구별할 수 있도록 단일 사슬과 분할 분자 사이의 유사한 약력학적 반응을 보여준다(도 9). 특히, scIL-12 용량의 2.5x인 용량은 IFN 감마 생성을 감소시키며, 이는 분할 IL-12 융합체의 표적 외 독성 문제가 감소했음을 나타낸다. 이 데이터는 분할된 IL-12 분자가 생체 내에서 조립되는 능력을 추가로 입증한다.
이중 표적화(즉, 각 항체가 동일한 표적 단백질의 상이한 에피토프에 결합하는 항체-p35 융합체 및 항체-p40 융합체)의 가능성과 함께 추가 융합 단백질을 테스트했다. IL-12 서브유닛은 인간 uPAR에 결합하는 항체 변이체 M1 및 M8에 부착되었다. 이 검정에서 IL-12p70 복합체는 인간 uPAR 양성 HEK 세포에 다양한 성분을 순차적으로 첨가하고 세척하여 구축된다. 그런 다음 uPAR 발현 HEK 세포를 CD8+ T 세포와 함께 인큐베이션하고 상기 T 세포에 대한 pSTAT4 활성을 측정했다. M37 항체는 비표적화된 대조군으로 사용되었는데, 이는 이 항체가 마우스 uPAR에 결합하고 인간 uPAR과 교차 반응하지 않기 때문이다. scIL-12는 비표적화된 단일 화합물로 사용되었다. scIL12-M8 Fab 융합체는 표적화된 단일 화합물로 사용되었다. M37-p40-Fab 및 M37-p35-KiH를 비표적화된 음성 대조군으로 조합하여 사용했다. M8-p40-Fab 및 M37-p35-KiH는 단일 표적화된 조합으로 조합되어 사용되었다(즉, IL-12 서브유닛 중 하나만이 uPAR를 표적으로 한다). M8-p40-Fab 및 M1-p35-KiH-Fab는 이중 표적화된 조합으로 조합되어 사용되었다(즉, IL-12 서브유닛 p35 및 p40 둘 모두 uPAR를 표적으로 한다). 간략하게, 검정은 다음 프로토콜에 따라 수행되었다:
1) 96-웰 U 바닥, 낮은 부착/결합 플레이트(Corning Product # 4520)에서 웰당 50,000 uPAR 발현 HEK 세포를 시딩했다.
2) 플레이트를 회전시키고, 첫 번째 분자의 적정액 100 μL로 세포를 재현탁시켰다.
3) 세포와 첫 번째 분자를 4℃에서 30분간 인큐베이션했다.
4) 세포를 회전시키고 두 번 세척했다.
5) 세포를 두 번째 분자의 적정액 100 μL로 재현탁시켰다.
6) 세포와 분자를 4℃에서 30분간 인큐베이션했다.
7) 세포를 회전시키고 세 번 세척했다.
8) 이전에 동결된 인간 T 세포(37℃에서 1시간 동안 휴지)를 웰당 100,000개 세포로 웰에 첨가했다.
9) 플레이트를 인큐베이터에 1시간 동안 두었다(37℃).
10) 플레이트를 회전시키고 세척한 후 다운스트림 염색 프로토콜을 시작했다.
T 세포 인큐베이션 단계 후에, 상기 T 세포에 대한 pSTAT4 활성을 결정하였다.
표적화되지 않은 서브유닛 또는 표적화되지 않은 scIL-12는 표적화된 서브유닛에 비해 활성이 감소한 것으로 나타났다. 단일 표적화된 조합은 모든 비표적화된 접근법에 비해 향상된 활성을 보여주었다. 마지막으로, 이중 표적화된 서브유닛은 개별적으로 표적화된 쌍에 비해 향상된 활성을 가지며 표적화된 scIL-12에 비해 대부분의 활성을 회복하는 동시에 감소된 전신 독성을 누린다(도 10).
위에 언급된 융합 단백질은 모 항-uPAR 항체를 사용하여 생성되었다. 인간화 항-uPAR 항체를 갖는 유사한 융합 단백질도 생성되었다. M1 융합체에 대한 아미노산 서열은 하기 표 28에 제시되어 있다. M8 융합체에 대한 아미노산 서열은 하기 표 29에 제시되어 있다. M43 융합체에 대한 아미노산 서열은 하기 표 30에 제시되어 있다.
표 28 - 인간화 M1 항체-IL-12 서브유닛 융합체 아미노산 서열
표 29 - 인간화 M8 항체-IL-12 서브유닛 융합체 아미노산 서열
표 30 - 인간화 M43 항체-IL-12 서브유닛 융합체 아미노산 서열
실시예 6 - 추가적인 uPAR 표적화 융합 단백질
융합 단백질 실시예 6의 설계
실시예 6에 따라 설계 및/또는 합성된 융합 단백질 구성물은 표 31에서 찾아볼 수 있다. 표 31에서 찾은 이들 아미노산 서열 중 일부는 다음 실험 실시예에 대한 대조군으로 사용되었다. 마우스 실험에서 더 나은 결합을 위해 변형된 마우스 단백질 또는 인간 단백질과 관련된 서열은 마우스 모델 및 마우스 세포 시스템에서 테스트할 목적으로 포함된다. 마우스 실험을 위해 변형된 마우스 단백질 또는 인간 단백질을 사용하는 임의의 구성물은 완전한 인간 단백질로 대체될 수 있다.
포유동물 세포에서의 발현을 위해, N-말단 리더 서열을 표 31에 있는 특정 융합 단백질 구성물에 첨가했다. 또한, 재조합 과정 동안 정제를 용이하게 하기 위해 표 31에 있는 특정 융합 단백질 구성물에 6xHis 및 FLAG 태그와 아비딘 폴리펩티드를 첨가했다.
실시예 6의 융합 단백질의 표 31의 구성물은 변형되어, 예를 들어 원하는 생체활성의 손실 없이 아미노산 조성 또는 폴리펩티드 분자 사이의 링커 분자의 길이를 변형시키기 위해 변형될 수 있는 것으로 이해된다. 다양한 폴리펩티드의 융합 순서는, 예를 들어 uPAR 표적화 도메인 영역이 융합 단백질의 사이토카인 또는 면역 체크포인트 조절자 부분의 N-말단 또는 C-말단에 있을 수 있도록 또는 Fc 융합 단백질 또는 인간 혈청 알부민(HAS) 융합 단백질과 같은 임의의 링커를 통해 다른 융합 단백질이 표 31의 구성물에 첨가될 수 있수 있도록 변경될 수 있다. 표 31의 약어는 다음을 포함한다: 단일 사슬(sc); 원형 순열(cp) 스크램블 서열(ss).
표 31 - 실시예 6에 기술된 폴리펩티드의 아미노산 서열
실시예 6에 대한 재조합 과정, 단백질 발현 및 단백질 정제
유전자 합성 및 포유류 발현 벡터로의 서브클로닝
설계된 구성물의 발현을 위한 유전자의 합성 및 서브클로닝은 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 수행되었다.
단백질 발현
모든 단백질은 제조업체의 프로토콜에 따라 EXPI293™ 발현 시스템 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 발현되었다.
단백질 정제
발현 배양 상층액을 수확한 후, 융합 단백질의 성질에 따라 발현된 단백질을 포획하였다. IgG Fc(마우스 또는 인간)를 함유하는 단백질을 단백질 A 컬럼에 포획하고 최대 PBS의 5 컬럼 부피로 컬럼을 세척했다. 실행 완충액의 pH를 낮추어 단백질을 컬럼에서 용출하고 트리스 완충액 pH 8로 직접 중화했다. 그런 다음 정제된 단백질을 PBS에 대해 밤새 투석했다. 헥사히스티딘(6xHis) 융합체를 함유한 단백질의 경우, 상층액의 단백질을 Ni-NTA 세파로스 수지에 포착하고 증가하는 농도의 이미다졸로 용리했다. 정제된 단백질을 PBS에 대해 밤새 투석하였다.
인간 또는 마우스 uPAR에 대한 IL-2 및 IL-15-기반 융합 단백질의 결합에 대한 동역학 측정 - 실시예 6
재조합 마우스 uPAR-Fc(R&D Systems, Cat. No. 531-PA-100)는 제조사의 프로토콜에 따라 인간 항체 포획 키트(GE Healthcare, Cat. No. BR100839)를 사용하여 변형된 BIACORE™ CM5 센서 칩에 포획되었다. 테스트 분자는 증가하는 농도 범위로 단계적으로 2분 동안 30 μl/분의 유속으로 칩 위로 통과되었다. 분석물의 해리를 10분 동안 측정했다. 3 M MgCl2를 30초간 흘려 칩을 재생성시켰다. 생성된 센서그램을 네이티브 인스트루먼트 소프트웨어로 분석하여 구성물의 결합 친화도를 계산하였고, 그 결과를 표 32에 나타내었다.
재조합 인간 uPAR his(R&D Systems, 807-UK-100/CF)을 비오티닐화한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 BIACORE™ 스트렙타비딘 센서 칩에 포획했다. 분석물이라고도 하는 관심 분자는 증가하는 농도 범위로 단계적으로 3분 동안 30 μl/분의 유속으로 칩 위로 통과되었다. 분석물의 해리를 20분 동안 측정했다. 3 M MgCl2를 30초간 흘려 칩을 재생성시켰다. 생성된 센서그램을 네이티브 인스트루먼트 소프트웨어로 분석하여 구성물의 결합 친화도를 계산하였고, 그 결과를 표 32에 나타내었다.
전체적으로, uPA-ATF에 대한 인간 기반 IL-2 또는 IL-15 융합체는 0.59-2.2 nM 범위로 인간 uPAR에 단단히 결합되었다(표 32, 서열번호: 98, 99 및 100 참조). 이들 융합 분자는 대조군 분자인 서열번호: 20(인간 uPA-ATF; 0.24 nM)에 비해 약간 낮은 효능으로 결합했다. 마우스 uPA-ATF에 대한 IL-2 및 IL-15 융합체는 서열번호: 104(마우스 uPA-ATF; 0.14 nM)에 유사한 효능(0.14-0.24 nM)으로 결합된 마우스 uPAR에 결합한다. 추가적으로, N22Y, W30R 점 돌연변이체를 갖는 인간 uPA-ATF에 융합된 인간 cpIL-2:IL-2Rα인 서열번호: 110은 0.12 nM의 KD로 마우스 uPAR에 단단히 결합되어 통합된다. 이러한 데이터는 IL-2 및 IL-15 기반 서열을 uPAR 표적화 모이어티, 이 경우 N- 또는 C-말단에 융합된 uPA-ATF에 융합하면 시험관내에서 uPAR에 대한 강력한 결합을 유지한다는 것을 나타낸다.
표 32
인간 T 세포에서 IL-2 수용체를 활성화하도록 설계된 분자의 시험관내 효능 - 실시예 6
IL-2 또는 IL-15의 인간 서열-기반 융합체를 함유하는 분자의 효능을 평가하기 위해, HH 세포(ATCC® CRL-2105™)를 증가하는 농도의 서열번호: 98, 99, 100, 110, 94, 106 및 107과 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 세포를 세척하고 용해한 후, STAT5 알파/베타(Phospho) [pY694/pY699] Multispecies InstantOne™ ELISA 키트(ThermoFisher Scientific, Cat No. 85-86112-11)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 STAT5의 인산화를 검출하였다. STAT5의 인산화는 IL-2/IL-15 수용체 활성화 시 유도되는 수용체-근위 신호전달 이벤트이다. 데이터는 표 33에 제시되어 있다.
비표적화된 모 원형 순열 cpIL-2:IL2Rα 융합 단백질, 서열번호: 94는 HH pSTAT5 검정에서 1.1 nM의 EC50을 나타냈다. C-말단 uPAR 표적화 도메인, 즉 서열번호: 99, 106 및 110을 갖는 cpIL-2:IL2 Rα 융합 단백질은 각각 1.5 nM, 1.6 nM 및 2.1 nM의 EC50으로 유사하게 효능이 있었다. 서열번호: 98, N-말단 uPAR 표적화 도메인을 갖는 cpIL-2:IL2 Rα 융합 단백질은 7-10 nM의 EC50으로 덜 효능이 있었다. 비표적화된 모 hIL-15Ra(sushi):cpIL-15 융합 단백질인 서열번호: 95는 HH pSTAT5 검정에서 EC50이 0.039 nM로 서열번호: 94보다 더 효능이 있다. N-말단 표적화 도메인을 갖는 서열번호: 95의 변이체는 또한 서열번호: 100 및 107에 대해 각각 0.18 nM 및 0.099 nM의 EC50으로 서열번호: 94보다 더 효능이 있었다. 요약하면, C-말단 uPAR 표적화 도메인을 갖는 서열번호: 94의 표적화된 변이체 및 N-말단 표적화 도메인을 갖는 서열번호: 95의 표적화된 변이체는 모두 그들의 비표적화된 모 분자와 동등한 효력이었으며, 이는 uPAR 표적화 모티프에 대한 융합은 동족 수용체에 결합하는 사이토카인 도메인을 입체적으로 방해/간섭하지 않는다는 것을 시사한다.
표 33
1차 마우스 비장세포 상에 IL-2 수용체를 활성화하도록 설계된 분자의 시험관내 효능 - 실시예 6
IL-2 또는 IL-15의 마우스 서열-기반 융합체를 함유하는 분자의 효능을 조사하기 위해, 야생형 마우스의 비장으로부터 비장세포를 수확하고, 증가하는 농도의 서열번호: 96, 마우스 Fc: 마우스 IL-15Ra:cpIL-15, 서열번호: 101, 서열번호: 102 및 서열번호: 105로 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 고정하고 표면 및 세포내 마커에 대한 형광-표지된 항체로 염색하여 표준 유세포 분석 기술을 사용하여 마우스 NK 세포, CD8 T 세포 및 CD4+CD25+ Foxp3+ 조절 T 세포(Tregs)에 대한 STAT5 인산화를 검출하였다. 결과를 표 34에 나타내었다.
재조합 야생형 IL-2(rIL-2)는 고친화도 IL-2 수용체를 발현하는 세포를 선택적으로 자극하며, 이는 정상 쥐와 건강한 인간에서 주로 Tregs에 의해 발현된다. 훨씬 더 높은 농도에서 rIL-2는 중간 친화도 IL-2 수용체 복합체의 발현으로 인해 NK 세포 및 기억 CD8 T 세포의 하위집합도 활성화할 수 있다. 원형 순열 마우스 cpIL-2:IL2Rα 융합 단백질, 서열번호: 96은 rIL-2에 비해 중간 친화도 수용체를 발현하는 세포에서 더욱 강력해지도록 조작되었다. 이는 각각 21.6 nM, 19.0 nM 및 23.2 nM의 EC50을 갖는 Tregs, NK 세포 및 기억 CD8 T 세포에서 pSTAT5의 동등한 효력 유도에 의해 입증된다. C-말단 uPAR 표적화 도메인, 즉 서열번호:101을 갖는 마우스 cpIL-2:IL2 Rα 융합 단백질은 Tregs, NK 세포 및 기억 CD8 T 세포에서 유사하게 효능이 있었고 EC50은 각각 16.5 nM, 19.5 nM 및 27.3 nM이었다. 유사하게, N-말단 uPAR 표적화 도메인, 즉 서열번호: 105를 갖는 마우스 cpIL-2:IL2 Rα 융합 단백질은 Tregs, NK 세포 및 기억 CD8 T 세포에서 각각 21.9 nM, 34.9 nM 및 38.0 nM의 EC50을 나타냈다. rIL-2와 대조적으로, rmIL-15는 CD25의 존재에 의해 IL-2/IL-15 수용체 복합체에 대한 친화도가 향상되지 않기 때문에 Tregs에 대한 선택적 활성화를 나타내지 않는다. 이는 EC50이 각각 0.60 nM, 0.047 nM 및 0.15 nM인 마우스 Fc: 마우스 IL-15Ra:cpIL-15에 의한 Tregs, NK 세포 및 기억 CD8 T 세포에서 pSTAT5의 유사한 유도에 의해 입증된다. N-말단 uPAR 표적화 도메인, 즉 서열번호: 102를 갖는 마우스 IL-15Ra(sushi):cpIL-15 융합 단백질은 Tregs, NK 세포 및 기억 CD8 T 세포에 대해 각각 1.7 nM, 0.15 nM 및 0.50 nM의 EC50을 갖는 유사한 효능을 나타냈다. 서열번호: 94 및 서열번호: 95의 uPAR-표적화된 변이체의 경우와 마찬가지로, 뮤린 오솔로그의 uPAR-표적화된 변이체는 모두 그들의 비표적화된 모 분자와 동등한 효능이었으며, 이는 uPAR 표적화 모티프에 대한 융합이 1차 마우스 Tregs, NK 세포 및 기억 CD8 T 세포에서 발현되는 동족 수용체에 결합하는 사이토카인 도메인을 입체적으로 방해/간섭하지 않는다는 것을 시사한다.
표 34
uPAR을 발현하는 마우스 종양 세포주에 대한 IL-2 또는 IL-15-기반 분자의 결합 - 실시예 6
마우스 동계 종양 계통 4T1, CT26, EMT6(이전에 모두 ATCC®에서 구입) 및 MC38(NCI에서 구입)은 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같이 형광 표지된 항-마우스 uPAR(CD87) 항체로 염색하여 세포 표면에서 마우스 uPAR을 발현하는 것으로 나타났다. 부착된 세포를 CORNING® CELLSTRIPPER® 용액(Cat. No. 25056CI)으로 들어올리고 세척한 다음 증가하는 농도의 테스트 분자와 함께 인큐베이션했다(표 35 참조). 4℃에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 형광 표지된 항-His 항체로 염색하고 표준 유세포 분석 기술을 사용하여 분석했다. 평균 형광 강도를 테스트 제품 농도에 대해 플롯팅하고 4-매개변수 로지스틱 곡선 핏을 사용하여 EC50 값을 계산했다.
표 35
서열번호: 94 및 서열번호: 110의 MC38 종양-보유 마우스에서의 약동학 - 실시예 6
종양과 비교하여 혈청에서 순환하는 단백질의 비율을 결정하기 위해, MC38 종양-보유 암컷 C57BL/6 마우스에서 단일 용량 PK 실험을 수행했다. 종양 크기가 200-400 mm3 범위일 때 마우스에 투여했다. 0시점에 30 μg의 서열번호: 94 또는 75μg의 서열번호: 110을 마우스에게 피하 투여한 후 말단 혈액을 수집하여 투여 후 0.5, 2, 4, 8 및 24시간에 각 개별 동물에 대한 혈청에 대해 처리했다. 동일한 동물로부터 종양도 수확하고 다운스트림 농도 분석을 위해 급속 냉동했다. 혈청 샘플을 인간 IL-2-특이적 MSD(Meso-Scale Discovery) 검정으로 분석했다. 종양 샘플을 균질화하고 동일한 검출 검정으로 농도를 측정했다. 약동학적 매개변수는 WinNonlin(Phoenix)의 비-구획 모델을 사용하여 결정되었다. 결과를 표 36에 나타내었다.
Cmax 및 AUC 모두에 대한 종양 노출 대 전신 노출(T/S)의 비율을 비교할 때, uPAR-표적화 IL-2인 서열번호: 110은 비표적화된 대조군 분자, 서열번호: 94에 비해 더 큰 종양 침투 비율을 보여주었고, 이는 혈청과 비교하여 종양에서의 노출 비율이 유사함을 나타낸다.
표 36
IL-10 수용체를 활성화하도록 설계된 분자의 시험관 내 효능 - 실시예 6
STAT3 인산화는 IL-10 수용체의 결합 및 활성화에 반응하여 수용체-근위 신호전달 이벤트이다. IL-10의 융합체를 함유하는 분자의 효능을 알아보기 위해, 인간 말초 혈액 단핵 세포를 증가하는 농도의 scIL-10:CL:CH1:Fc(scIL10 3aa 링커); = 서열번호: 136은 scIL-10:CL:CH1:Fc + 5AA 링커 + huPA-ATF와 동등)와 함께 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 고정하고 표면 및 세포내 마커에 대해 형광-표지된 항체로 염색하여 표준 유세포 분석 기술을 사용하여 마우스 B 세포, 단핵구, CD4 및 CD8 T 세포에서 STAT3의 인산화를 검출했다. 데이터는 표 37에 제시되어 있다.
두 분자는 다양한 세포 유형에 걸쳐 서로 매우 유사한 효능을 가지며, 이는 IL-10 분자와 uPAR 표적화 모이어티, 이 경우 인간 uPA-ATF의 융합이 인간 면역 세포에 발현되는 IL-10 수용체에 결합하고 활성화하는 분자의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 뒷받침한다.
표 37
IL-12 수용체를 활성화하도록 설계된 uPAR 표적화된 분자의 시험관 내 효능 - 실시예 6
HEK-BLUE™ IL-12 세포(InvivoGen)는 NF-κB/AP-1 경로의 IL-12-유도 활성화를 모니터링하여 시험관내에서 생체활성 IL-12를 검출하도록 특별히 설계된 인간 배아 신장 세포이다. 세포주는 STAT4-유도성 프로모터의 제어하에 유도성 분비 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. HEK-Blue IL-1β 세포를 4.5 g/L 글루코스, 2 mM L-glu 및 10% 열 불활성화 FBS(Gibco)를 함유하는 DMEM 배지에 50,000개 세포/웰로 플레이팅했다. 세포를 다양한 농도의 IL-12(R&D Systems, Cat. No. 219-IL-005/CF) 또는 서열번호: 141과 함께 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 인큐베이션했다. QUANTI-Blue™(InvivoGen)를 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음 630 nm에서 플레이트 판독기로 판독하여 SEAP 생산을 검출 하였다.
서열번호: 141의 인간 uPA-ATF 구성물에 융합된 단일 사슬 인간 IL-12 구성물은 야생형 인간 IL-12(18 pM)와 비교하여 유사한 효능(27 pM)을 가지며, 이는 uPA-ATF에 대한 IL-12의 융합이 분자의 IL-12 부분이 IL-12 수용체에 결합하고 활성화하는 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
인간 4-1BB 수용체를 활성화하도록 설계된 uPAR-표적화된 분자의 시험관내 효능 - 실시예 6
4-1BB 리간드를 함유하는 융합 단백질은 프로메가(Promega)의 4-1BB 생체검정 키트를 사용하여 검정되었다. 검정은 반응 요소의 다운스트림에서 4-1BB 및 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 4-1BB 이펙터 세포를 사용한다. 루시퍼라제 발현은 리간드가 수용체에 결합할 때 유도된다. 검정은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 증가하는 농도에서 테스트 분자를 인큐베이션하고 발현된 루시퍼라제로부터 생성된 빛을 측정하여 용량 반응 곡선을 생성했다. 데이터는 표 38에 제시되어 있다.
재조합 인간 4-1BB 리간드 단량체(R&D Systems Cat. No. 2295-4L-025/CF)는 검정에서 활성을 나타내지 않았는데, 이는 4-1BBL이 일반적으로 삼량체로 기능하기 때문에 가교되지 않은 4-1BBL 단량체가 4-1BB를 활성화할 수 없음을 시사한다. N- 또는 C-말단에서 인간 uPA-ATF에 융합된 연결된 4-1BBL 삼량체(서열번호: 130 및 서열번호: 131)는 EC50 0.15 nM호 더 강력한 EC50(및 인간 uPA-ATF(서열번호: 129)에 융합되지 않은 연결된 4-1BBL 삼량체 분자와 비교하여 더 높은 최대 신호)을 갖는다. 이러한 결과는 잠재적으로 세포 표면의 uPAR에 대한 강력한 결합으로 인한 결합력 영향으로 인해, 인간 uPAR-표적화 도메인 uPA-ATF에 대한 융합이 4-1BB를 통한 신호전달에서 2~3배 더 강력한 활성을 초래할 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고 4-1BBL과 uPA-ATF의 융합 단백질은 기능적으로 4-1BB를 통해 결합하고 신호전달을 할 수 있다.
표 38
인간 단핵구 상의 GM-CSF 수용체를 활성화하도록 설계된 분자의 시험관내 효능 - 실시예 6
GM-CSF의 인간 서열-기반 융합체를 함유하는 분자의 효능을 평가하기 위해, U937 세포(ATCC® CRL-1593.2™)를 증가하는 농도의 재조합 인간 GM-CSF(R&D Systems, cat # 215-GM-050/CF), 서열번호: 138 또는 서열번호: 103과 함께 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 고정시키고, 투과화시키고, pSTAT5에 특이적인 형광 표지된 항체로 세포내 염색하고, 표준 유세포측정 기술을 사용하여 분석하였다. 데이터는 표 39에 제시되어 있다.
재조합 인간 GM-CSF(rhGM-CSF)는 U937 pSTAT5 검정에서 18.6 pM의 EC50으로 입증된 바와 같이 STAT5 인산화의 강력한 유도제이다. 인간 uPAR-표적화 도메인은 서열번호: 138의 GM-CSF의 C-말단에 융합되었다. 서열번호: 138은 EC50이 1.28 pM로 STAT5 인산화를 유도하는데 약 20배 더 강력했다. 증가하는 농도의 인간 uPAR-표적화 도메인 단독인 서열번호: 103과 서열번호: 138의 공동-인큐베이션은 rhGM-CSF 단독과 유사하게 감소된 효능을 초래하였다. 이러한 결과는 uPAR-표적화 모티프와 GM-CSF의 융합이 수용체 결합의 결과로 STAT5 인산화를 유도하는 융합 단백질의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않고 오히려 그 활성을 향상시키는 것으로 보인다는 것을 시사한다.
표 39
예시적인 융합 단백질의 생체내 약동학
선별 인간 항-uPAR - IL-12 서브유닛 융합 단백질을 마우스 종양 모델에서 생체내 분석했다. 구체적으로, 테스트된 융합 단백질의 수준은 투여 후 여러 시점에 마우스의 혈청 및 종양 조직에서 검출되었다. 이 섹션에 사용된 융합 단백질은 아래 표 40에 제시되어 있다. 실험 세부사항은 아래 표 41에 요약되어 있다.
표 40 - 융합 단백질의 아미노산 서열
표 41 - 검정 세부사항
위 연구에 사용된 모델은 암컷 NOD/SCID 마우스의 SC RKO 인간 대장암 이종이식 모델이었다. 종양 모델을 생성하기 위해, 각 마우스에 RKO 종양 세포를 피하 접종했다. 종양 크기가 ~ 250 mm3에 도달했을 때 무작위화가 사용되었다. 종양 및 혈청 샘플은 마지막 투여 후 0.5, 1, 4, 24, 48, 72시간에 채취되었다. 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery, MSD) 검정은 제조 프로토콜에 따라 샘플에서 p35, p40 또는 p70을 검출하는 데 사용되었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 각 군에서 테스트된 융합 단백질은 모든 시점의 고환에서 종양 조직에서 검출되었으며, 수준은 상대적으로 안정적으로 유지되었다. 데이터는 융합 단백질이 종양 조직에 생산적으로 축적된다는 것을 보여준다. 도 12에 도시된 바와 같이, 선택된 군의 경우, 혈청 내 융합 단백질의 수준은 시간이 지남에 따라 꾸준히 떨어졌으며, 이는 융합 단백질이 표적 종양 조직의 융합 단백질을 제외하고 시스템에서 빠르게 제거됨을 입증한다.

Claims (202)

  1. 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 분리된 항원 결합 단백질로서,
    (a) 다음을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인:
    i) GFNIKDEY (서열번호: 3), GFSLTNYG (서열번호: 11), GNTFTDYG (서열번호: 19), GTTFTDYG (서열번호: 41), 또는 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열;
    ii) IDPENGDT (서열번호: 4), IWSDGGT (서열번호: 12), INTNTGEP (서열번호: 20), 또는 IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열; 및
    iii) TGGNYVGWFPY (서열번호: 5), ARGGRSDLFAY (서열번호: 13), AHYSFDY (서열번호: 21), 또는 AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열; 및
    (b) 다음을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인:
    iv) SSVSY (서열번호: 6), QSIVHSNGNTY (서열번호: 14), ENIYSN (서열번호: 22), SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열;
    v) DTS (서열번호: 7), KVS (서열번호: 15), AAT (서열번호: 23), 또는 GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열; 및
    vi) QQWSSNPPY (서열번호: 8), FQGSHVPYT (서열번호: 16), QHFWGTPWT (서열번호: 24), QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열
    을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 37, 서열번호: 42, 또는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GFSLTNYG (서열번호: 11)의 HCDR1 아미노산 서열, IWSDGGT (서열번호: 12)의 HCDR2 아미노산 서열, ARGGRSDLFAY (서열번호: 13)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 QSIVHSNGNTY (서열번호: 14)의 LCDR1 아미노산 서열, KVS (서열번호: 15)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 FQGSHVPYT (서열번호: 16)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
    c) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나;
    d) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
    e) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    f) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하거나;
    g) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하거나;
    h) VH 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    i) VH 도메인은 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인은 아미노산 링커로 부착되는, 항원 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수인, 항원 결합 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 149), GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG (서열번호: 150), 또는 GGGSGGGGSG (서열번호: 246)을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), dAb 단편, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함하는, 항원 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 56-71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 72-78 중 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 항원 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 45, 46, 49, 53, 또는 54의 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및 서열번호: 47, 48, 50, 51, 52, 및 55의 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  15. 제14항에 있어서,
    a) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    c) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
    d) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    e) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나;
    f) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    g) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    h) 항체 HC는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    i) 항체 HC는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 서열번호: 189의 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 서열번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬;
    서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, 및
    서열번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 약 5 x 10-8 M 미만, 약 1 x 10-8 M 미만, 약 5 x 10-9 M 미만, 약 1 x 10-9 M 미만, 약 5 x 10-10 M 미만, 또는 약 1 x 10-10 M 미만의 KD로 인간 uPAR에 결합하는, 항원 결합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR에 결합하는, 항원 결합 단백질.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이의 항원 결합 단백질이 uPAR 리간드-결합된 인간 uPAR에 결합하는, 항원 결합 단백질.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합함으로써, 약 0.1 nM 내지 약 3.0 nM의 EC50 값으로 상기 항원 결합 단백질에 결합하는 형광-표지된 항체로 검출되는 형광 신호를 생성하는, 항원 결합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합하는, 항원 결합 단백질.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 인간 uPAR DII-DIII 도메인 또는 인간 uPAR DIII 도메인에 결합하는, 항원 결합 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질과 결합하기 위해 경쟁하는 이의 분리된 항원 결합 단백질.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 이의 분리된 항원 결합 단백질.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  33. 제32항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  34. 제33항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 항원 결합 단백질을 발현시키는 조건 하에서 제34항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 생산하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 숙주 세포로부터 상기 항원 결합 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. uPAR 활성 또는 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, uPAR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 용도로서, 치료 유효량의 제31항의 약제학적 조성물을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 용도.
  38. 치료 유효량의 제31항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법.
  39. (i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질; 및
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질 및 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 아미노산 링커로 연결된, 융합 단백질.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 순환 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10 또는 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 적어도 하나의 인터류킨-12(IL-12) 서브유닛을 포함하는, 융합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 상기 IL-12 서브유닛이 p35 및 p40 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 융합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 상기 p35가 서열번호: 81의 위치 M12, S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, L161, 및 D188에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  45. 제44항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함하는, 융합 단백질.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 N28R 및 Q35E를 포함하는, 융합 단백질.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 S27D 및 D188N을 포함하는, 융합 단백질.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 C74K를 포함하는, 융합 단백질.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 S27D, C74K 및 D188N을 포함하는, 융합 단백질.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p35가 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  51. 제43항에 있어서, 상기 p40이 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  52. 제51항에 있어서, 상기 C177 아미노산 치환이 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 C252 아미노산 치환이 C252S인, 융합 단백질.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 p40이 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  55. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 아미노산 링커에 의해 부착된 p35 및 p40 서브유닛을 포함하는 단일-사슬 IL-12(scIL-12)를 포함하는, 융합 단백질.
  56. 제55항에 있어서, 상기 아미노산 링커가 서열 GGSGGGGSGG(서열번호: 156)를 포함하는, 융합 단백질.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 scIL-12가 서열번호: 88 또는 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  58. 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  59. 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  60. 제59항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  61. 제60항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  62. 융합 단백질을 발현시키는 조건 하에서 제61항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 생산하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  64. uPAR 활성 또는 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, uPAR에 특이적으로 결합하는 융합 단백질의 용도로서, 치료 유효량의 제58항의 약제학적 조성물 또는 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 용도.
  65. 치료 유효량의 제52항의 약제학적 조성물 또는 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 융합 단백질이 사이토카인 또는 이의 변이체 또는 제2 융합 단백질과 동시에 투여되고, 여기서 제2 융합 단백질이 제1 융합 단백질과 상이한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 또는 융합 단백질이 사이토카인 또는 이의 변이체 또는 제2 융합 단백질과 순차적으로 투여되고, 여기서 제2 융합 단백질이 제1 융합 단백질과 상이한 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-12 p35 서브유닛 또는 IL-12 p40 서브유닛을 포함하는, 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 종양에서의 융합 단백질 제거율이 환자의 혈청에서의 융합 단백질 제거율보다 더 느린, 방법.
  70. 치료 유효량의 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 융합 단백질은:
    (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
    (ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체, 또는 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
    (b) 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체, 또는 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고,
    여기서 상기 융합 단백질이 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 경우, 상기 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 융합 단백질이 IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는 경우, 상기 비-융합 IL-12 서브유닛은 IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛이 순차적으로 투여되는, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 융합 단백질 및 비-융합 IL-12 서브유닛 중 하나 또는 둘 모두가 정맥내로 투여되는, 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 상기 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되도록 충분한 양의 시간이 경과한 후에 상기 비-융합 IL-12 서브유닛을 투여하는, 방법.
  74. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 환자의 혈청 내 융합 단백질 농도를 실질적으로 감소시키기에 충분한 양의 시간이 경과한 후에 상기 비-융합 IL-12 서브유닛을 투여하는, 방법.
  75. 치료 유효량의 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 제1 융합 단백질은:
    (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
    (ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
    (b) 제2 융합 단백질은:
    (i) uPAR 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
    (ii) IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 제1 에피토프와 제2 에피토프가 동일한, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 제1 에피토프와 제2 에피토프가 상이한, 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 및 상기 제2 융합 단백질이 순차적으로 투여되는, 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 및 상기 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두가 정맥내로 투여되는, 방법.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 상기 제1 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되도록 충분한 양의 시간이 경과한 후에 상기 제2 융합 단백질을 투여하는, 방법.
  81. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 상기 제1 융합 단백질 농도가 환자의 혈청에서 실질적으로 감소하도록 충분한 양의 시간이 경과한 후에 제2 융합 단백질을 투여하는, 방법.
  82. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 상기 제2 융합 단백질이 환자의 종양에 축적되도록 충분한 양의 시간이 경과한 후에 상기 제1 융합 단백질을 투여하는, 방법.
  83. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질을 먼저 투여한 후, 상기 제2 융합 단백질 농도가 환자의 혈청에서 실질적으로 감소하도록 충분한 양의 시간이 경과한 후에 상기 제1 융합 단백질을 투여하는, 방법.
  84. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두가:
    a) GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
    b) SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함하는, 방법.
  85. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두가:
    a) GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
    b) ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함하는, 방법.
  86. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두가:
    a) GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
    b) SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함하는, 방법.
  87. 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 포함하는 조합물로서,
    (a) 제1 융합 단백질은:
    (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
    (ii) IL-12 p35 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하고; 그리고
    (b) 제2 융합 단백질은:
    (i) uPAR 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
    (ii) IL-12 p40 서브유닛 또는 이의 변이체를 포함하는, 조합물.
  88. 제87항에 있어서, 제1 에피토프와 제2 에피토프가 동일한, 조합물.
  89. 제87항에 있어서, 제1 에피토프와 제2 에피토프가 상이한, 조합물.
  90. (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질; 및
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  91. 제90항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질 및 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 아미노산 링커로 연결된, 융합 단백질.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 순환 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10 또는 IL-12로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  93. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 적어도 하나의 인터류킨-12(IL-12) 서브유닛을 포함하는, 융합 단백질.
  94. 제93항에 있어서, 상기 IL-12 서브유닛이 p35 및 p40 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 융합 단백질.
  95. 제94항에 있어서, p35가 서열번호: 81의 위치 M12, S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, L161, 및 D188에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  96. 제95항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함하는, 융합 단백질.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 N28R 및 Q35E를 포함하는, 융합 단백질.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 S27D 및 D188N을 포함하는, 융합 단백질.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 C74K를 포함하는, 융합 단백질.
  100. 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 S27D, C74K 및 D188N을 포함하는, 융합 단백질.
  101. 제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p35가 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  102. 제94항에 있어서, 상기 p40이 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
  103. 제102항에 있어서, 상기 C177 아미노산 치환이 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 상기 C252 아미노산 치환이 C252S인, 융합 단백질.
  105. 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p40이 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  106. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 이의 변이체가 아미노산 링커에 의해 부착된 p35 및 p40 서브유닛을 포함하는 단일-사슬 IL-12(scIL-12)를 포함하는, 융합 단백질.
  107. 제106항에 있어서, 상기 아미노산 링커가 서열 GGSGGGGSGG(서열번호: 156)를 포함하는, 융합 단백질.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 상기 scIL-12가 서열번호: 88 또는 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  109. 제90항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이:
    (a) 다음을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인:
    i) GFNIKDEY (서열번호: 3), GFSLTNYG (서열번호: 11), GNTFTDYG (서열번호: 19), GTTFTDYG (서열번호: 41), 또는 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열;
    ii) IDPENGDT (서열번호: 4), IWSDGGT (서열번호: 12), INTNTGEP (서열번호: 20), 또는 IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열; 및
    iii) TGGNYVGWFPY (서열번호: 5), ARGGRSDLFAY (서열번호: 13), AHYSFDY (서열번호: 21), 또는 AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열; 및
    (b) 다음을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인:
    iv) SSVSY (서열번호: 6), QSIVHSNGNTY (서열번호: 14), ENIYSN (서열번호: 22), SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열;
    v) DTS (서열번호: 7), KVS (서열번호: 15), AAT (서열번호: 23), 또는 GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열; 및
    vi) QQWSSNPPY (서열번호: 8), FQGSHVPYT (서열번호: 16), QHFWGTPWT (서열번호: 24), QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열
    을 포함하는, 융합 단백질.
  110. 제109항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 37, 서열번호: 42, 또는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 도메인은 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 또는 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  111. 제109항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GFNIKDEY (서열번호: 3)의 HCDR1 아미노산 서열, IDPENGDT (서열번호: 4)의 HCDR2 아미노산 서열, TGGNYVGWFPY (서열번호: 5)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 SSVSY (서열번호: 6)의 LCDR1 아미노산 서열, DTS (서열번호: 7)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQWSSNPPY (서열번호: 8)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  112. 제109항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GFSLTNYG (서열번호: 11)의 HCDR1 아미노산 서열, IWSDGGT (서열번호: 12)의 HCDR2 아미노산 서열, ARGGRSDLFAY (서열번호: 13)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 QSIVHSNGNTY (서열번호: 14)의 LCDR1 아미노산 서열, KVS (서열번호: 15)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 FQGSHVPYT (서열번호: 16)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  113. 제109항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GNTFTDYG (서열번호: 19), 또는 GTTFTDYG (서열번호: 41)의 HCDR1 아미노산 서열, INTNTGEP (서열번호: 20)의 HCDR2 아미노산 서열, AHYSFDY (서열번호: 21)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 ENIYSN (서열번호: 22)의 LCDR1 아미노산 서열, AAT (서열번호: 23)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QHFWGTPWT (서열번호: 24)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  114. 제109항에 있어서,
    a) VH 도메인은 GYTFTSYG (서열번호: 27)의 HCDR1 아미노산 서열, IYPRSGNT (서열번호: 28)의 HCDR2 아미노산 서열, AGKDYGSTYADY (서열번호: 29)의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b) VL 도메인은 SSVSSRY (서열번호: 30)의 LCDR1 아미노산 서열, GTS (서열번호: 31)의 LCDR2 아미노산 서열, 및 QQYHSDPLT (서열번호: 32)의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호:35의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) VH 도메인은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
    c) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나;
    d) VH 도메인은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나;
    e) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    f) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하거나;
    g) VH 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하거나;
    h) VH 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    i) VH 도메인은 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  116. 제115항에 있어서, 상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인은 아미노산 링커로 부착되는, 융합 단백질.
  117. 제116항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 (GGGGS)n (서열번호: 148)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수인, 융합 단백질.
  118. 제116항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 149), GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG (서열번호: 150), 또는 GGGSGGGGSG (서열번호: 246)을 포함하는, 융합 단백질.
  119. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), dAb 단편, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함하는, 융합 단백질.
  120. 제90항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 서열번호: 56-71 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  121. 제90항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 서열번호: 72-78 중 어느 하나의 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  122. 제90항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 45, 46, 49, 53, 또는 54의 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및 서열번호: 47, 48, 50, 51, 52, 및 55의 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  123. 제122항에 있어서,
    a) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b) 항체 HC는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    c) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나;
    d) 항체 HC는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하거나;
    e) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나;
    f) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나;
    g) 항체 HC는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하거나;
    h) 항체 HC는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    i) 항체 HC는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 LC는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  124. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 189의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  125. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  126. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 융합 단백질.
  127. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 융합 단백질.
  128. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 융합 단백질.
  129. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및
    서열번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 융합 단백질.
  130. 제90항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 238의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬;
    서열번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, 및
    서열번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 융합 단백질.
  131. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 약 5 x 10-8 M 미만, 약 1 x 10-8 M 미만, 약 5 x 10-9 M 미만, 약 1 x 10-9 M 미만, 약 5 x 10-10 M 미만, 또는 약 1 x 10-10 M 미만의 KD로 인간 uPAR에 결합하는, 융합 단백질.
  132. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR에 결합하는, 융합 단백질.
  133. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 uPAR 리간드-결합된 인간 uPAR에 결합하는, 융합 단백질.
  134. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합함으로써, 약 0.1 nM 내지 약 3.0 nM의 EC50 값으로 상기 항체 또는 이의 단편에 결합하는 형광-표지된 항체로 검출되는 형광 신호를 생성하는, 융합 단백질.
  135. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 uPAR 리간드의 존재 하에 인간 uPAR-발현 세포 상의 인간 uPAR에 결합하는, 융합 단백질.
  136. 제90항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 인간 uPAR DII-DIII 도메인 또는 인간 uPAR DIII 도메인에 결합하는, 융합 단백질.
  137. 서열번호: 81의 위치 S27, N28, Q35, F39, S44, C74, M111, V114, M119, M145, F150, 및 L161에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  138. 제137항에 있어서, S27 및 D188 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함하는, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 M12S; S27D; N28R; Q35E; F39D 또는 F39H; S44K; C74K, C74D, C74W, C74Y, 또는 C74Q; M111F 또는 M111W; V114I; M119L; M145L; F150Y; L161D 또는 L161Q; D188N; 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  140. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 N28R 및 Q35E를 포함하는, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  141. 제137항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 C74K를 포함하는, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  142. 제137항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 S27D, C74K 및 D188N을 포함하는, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  143. 제137항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 81, 서열번호: 82, 또는 서열번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드.
  144. (i) 제137항 내지 제143항 중 어느 한 항의 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드; 및
    (ii) 하나 이상의 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질
  145. 제144항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  146. 제144항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  147. 제144항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 조작된 IL-12 p35 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  148. 제144항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 표적화 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  149. 제144항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 항원 결합 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  150. 제149항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는, 융합 단백질.
  151. 서열번호: 84의 위치 C177 및 C252에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드.
  152. 제151항에 있어서, 상기 C177 아미노산 치환이 C177S, C177F, C177M, C177H, C177I 또는 C177Q로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드.
  153. 제151항 또는 제152항에 있어서, 상기 C252 아미노산 치환이 C252S인, 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드.
  154. 제151항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p40이 서열번호: 84, 서열번호: 85, 서열번호: 86, 또는 서열번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드.
  155. (i) 제151항 내지 제154항 중 어느 한 항의 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드; 및
    (ii) 하나 이상의 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질
  156. 제155항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  157. 제155항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  158. 제155항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 조작된 IL-12 p40 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  159. 제155항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 표적화 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
  160. 제155항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 융합 파트너가 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 항원 결합 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  161. 제160항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)에 특이적으로 결합하는, 융합 단백질.
  162. (i) 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드; 및
    (ii) 사이토카인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  163. 제162항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 아미노산 링커를 통해 사이토카인에 연결된, 융합 단백질.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, 상기 사이토카인이 이의 기능성 단편, 이의 기능성 변이체 또는 이의 원형 순열 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
  165. 제162항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인이 하나 이상의 임의의 아미노산 링커를 통해 사이토카인이 결합 특이성을 갖는 수용체의 전부 또는 일부에 연결되는, 융합 단백질.
  166. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 uPAR에 특이적으로 결합할 수 있는 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
  167. 제166항에 있어서, 상기 uPA 변이체가 uPA의 아미노산 말단 단편(ATF)인, 융합 단백질.
  168. 제167항에 있어서, 상기 ATF가 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  169. 제167항 또는 제168항에 있어서, uPA의 상기 ATF가 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는, 융합 단백질.
  170. 제166항에 있어서, 상기 uPA가 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  171. 제162항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인이 원형 순열 IL-2이고 수용체가 IL-2Rα인, 융합 단백질.
  172. 제162항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인이 원형 순열 IL-15이고 수용체가 IL-15Rα인, 융합 단백질.
  173. 제162항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인이 원형 순열 IL-1이고 수용체가 IL-1RI, IL-1RII인, 융합 단백질.
  174. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 항-uPAR 항원 결합 단백질인, 융합 단백질.
  175. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 항-uPAR 항체의 scFv 단편인, 융합 단백질.
  176. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 98, 99, 100, 106, 107, 111 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  177. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 98, 99, 111 및 112로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  178. 제162항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 uPAR 결합제, 사이토카인 및 수용체가 인간 기원인, 융합 단백질.
  179. 치료 유효량의 제162항 내지 제178항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법.
  180. 제179항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 암종, 모세포종 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  181. 치료 유효량의 제162항 내지 제178항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 염증성 질환을 치료하는 방법.
  182. 제181항에 있어서, 상기 염증성 질환이 IBD 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  183. 제162항 내지 제178항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 융합 단백질 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  184. 하나 이상의 임의의 아미노산 링커를 통해
    (i) 사이토카인 또는 이의 변이체; 또는
    (ii) 체크포인트 분자 조절제
    에 연결된 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR) 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  185. 제184항에 있어서, 상기 사이토카인이 이의 기능성 단편, 이의 기능성 변이체 또는 이의 원형 순열 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
  186. 제184항 또는 제185항에 있어서, 상기 사이토카인이 하나 이상의 임의의 아미노산 링커를 통해 사이토카인이 결합 특이성을 갖는 수용체의 전부 또는 일부에 연결되는, 융합 단백질.
  187. 제184항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 uPAR에 특이적으로 결합할 수 있는 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
  188. 제187항에 있어서, 상기 uPA 변이체가 uPA의 아미노산 말단 단편(ATF)인, 융합 단백질.
  189. 제187항 또는 제188항에 있어서, 상기 ATF가 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  190. 제188항 또는 제189항에 있어서, uPA의 상기 ATF가 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는, 융합 단백질.
  191. 제184항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 체크포인트 분자 조절제가 IL-2, 원형 순열 IL-2(cpIL-2), IL-15, 원형 순열 IL-15(cpIL-15), IL-6, 원형 순열 IL-6(cpIL-6), IL-10, IL-12, IL-15, GM-CSF, IFNγ, IFNα, 4-1BBB(CD131) 또는 이의 리간드, OX40 또는 이의 리간드, PD-1, PD-L1, 항-PD-1 항체, CTLA-4, 항-CTLA4 항체, GITR 또는 이의 리간드, ICOS 또는 이의 리간드, CD27, CD70, CD40 또는 이의 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  192. 치료 유효량의 제184항 내지 제191항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법.
  193. 제192항에 있어서, 상기 암이 흑색종 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  194. 치료 유효량의 제184항 내지 제191항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 염증성 질환을 치료하는 방법.
  195. 제194항에 있어서, 상기 염증성 질환이 IBD 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  196. 제184항 내지 제191항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 융합 단백질 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  197. 제162항 또는 제184항의 융합 단백질을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하기 위한 면역요법 방법.
  198. 제197항에 있어서, 표적화된 암 요법을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  199. 제198항에 있어서, 화학요법, 방사선 요법 또는 둘 모두로부터 선택된 통상적인 세포독성 요법을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  200. 제197항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 암 백신, 체크포인트 억제제 또는 모노클로날 항체로부터 선택된 면역요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  201. 제162항 또는 제184항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 M25 또는 아미노산 수준에서 적어도 80% 동일성을 갖는 이와 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  202. 제162항 또는 제184항에 있어서, 상기 uPAR 결합 폴리펩티드가 P25 또는 아미노산 수준에서 적어도 80% 동일성을 갖는 이와 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
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