JP2024510811A - Ｕｐａｒ抗体及びその融合タンパク質 - Google Patents

Ｕｐａｒ抗体及びその融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

本開示は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチド（例えば、ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質）、及び当該ｕＰＡＲ結合ポリペプチドとサイトカインまたはそのバリアントとを含む融合タンパク質である。本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合ポリペプチド及び融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにそれを用いたがんを治療する方法を更に提供する。本開示は、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５及びｐ４０ポリペプチドを更に提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／１６５，３１３号の利益を主張するものであり、その開示全体が参照により本明細書に援用される。
免疫療法は、急速に台頭してきているがんの治療法である。免疫療法は、（ｉ）望ましい免疫応答を増強する（例えば、刺激性免疫受容体をアゴナイズする）ように、または望ましくない免疫応答を阻害する（例えば、抑制性免疫チェックポイント分子をアンタゴナイズする）ように、調節分子を適宜アゴナイズまたはアンタゴナイズすることが可能な免疫チェックポイント分子モジュレーター、（ｉｉ）免疫系の調節及び誘導を助けるタンパク質分子であるサイトカイン、及び（ｉｉｉ）特定の抗原／病原体に対する免疫学的記憶応答をもたらす分子（または組み合わせ）であるがんワクチンの一般的なカテゴリーに分類される。現在臨床では有望な免疫療法が使用され、開発中の新しい薬物／薬剤のパイプラインも順調であるが、単独で、または他のカテゴリーの免疫療法、標的療法及び従来の細胞毒性療法との組み合わせで使用するための新しい免疫療法が望まれている。
一態様において、本開示は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質であって、
（ａ）ｉ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）、ＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）、またはＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｉｉ）ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）、またはＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）、またはＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
（ｂ）ｉｖ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｖ）ＤＴＳ（配列番号７）、ＫＶＳ（配列番号１５）、ＡＡＴ（配列番号２３）、またはＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
ｖｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）、ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）、ＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと
を含む、抗原結合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号３３、配列番号３４配列番号３７、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＦＳＬＴＮＹＧ配列番号１１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＫＶＳ（配列番号１５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
ｃ）ＶＨドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
ｄ）ＶＨドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
ｅ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、
ｆ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、
ｇ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、
ｈ）ＶＨドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または
ｉ）ＶＨドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸リンカーにより結合される。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）、またはＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２４６）を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、単一ドメイン抗体、またはナノボディを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５６～７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７２～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を更に含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号４５、４６、４９、５３、または５４の抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４７、４８、５０、５１、５２、及び５５の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを含む。
抗原結合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）抗体ＨＣは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
ｂ）抗体ＨＣは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
ｃ）抗体ＨＣは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）抗体ＨＣは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
ｅ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、
ｆ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
ｇ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
ｈ）抗体ＨＣは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、または
ｉ）抗体ＨＣは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号２３８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、約５×１０－８Ｍ未満、約１×１０－８Ｍ未満、約５×１０－９Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約５×１０－１０Ｍ未満、または約１×１０－１０Ｍ未満のＫＤでヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドに結合したヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合し、それにより、抗原結合タンパク質に結合する蛍光標識抗体により検出される蛍光シグナルが生成され、ＥＣ５０値は、約０．１ｎＭ～約３．０ｎＭである。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインまたはヒトｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインに結合する。
一態様において、本開示は、上述の抗原結合タンパク質と結合が競合する、その単離された抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様において、本開示は、上述の抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する、その単離された抗原結合タンパク質を提供する。
一態様において、本開示は、上述の抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一態様において、本開示は、上述の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
一態様において、本開示は、上述のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを提供する。
一態様において、本開示は、上述の発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
別の態様において、本開示は、上記の抗原結合タンパク質を産生する方法であって、抗原結合タンパク質を発現する条件下で、上述の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、方法は、宿主細胞から抗原結合タンパク質を単離することを更に含む。
一態様において、本開示は、ｕＰＡＲの活性または発現に関連する疾患または障害を治療または予防するための、ｕＰＡＲに特異的に結合する抗原結合タンパク質の使用であって、治療上有効な量の上述の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、使用を提供する。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の上述の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法を提供する。
一態様において、本開示は、（ｉ）上述の抗原結合タンパク質と、（ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントとを含む、融合タンパク質を提供する。
融合タンパク質の特定の実施形態において、抗原結合タンパク質及びサイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーにより連結される。
融合タンパク質の特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１２からなる群から選択される。
融合タンパク質の特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、少なくとも１つのインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）サブユニットを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットは、ｐ３５及びｐ４０の一方または両方を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、ｐ３５は、配列番号８１の位置Ｍ１２、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、Ｌ１６１、及びＤ１８８に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦもしくはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、またはこれらの組み合わせを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ及びＤ１８８Ｎを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｃ７４Ｋを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、ｐ３５は、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、ｐ４０は、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、Ｃ１７７のアミノ酸置換は、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される。
融合タンパク質の特定の実施形態において、Ｃ２５２のアミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。
融合タンパク質の特定の実施形態において、ｐ４０は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーによって結合されたｐ３５及びｐ４０サブユニットを含む単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５６）を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、ｓｃＩＬ－１２は、配列番号８８または配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
一態様において、本開示は、上述の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一態様において、本開示は、上述の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
一態様において、本開示は、上述のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを提供する。
一態様において、本開示は、上述の発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
別の態様において、本開示は、上述の融合タンパク質を産生する方法であって、融合タンパク質を発現する条件下で、上述の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、方法は、宿主細胞から融合タンパク質を単離することを更に含む。
一態様において、本開示は、ｕＰＡＲの活性または発現に関連する疾患または障害を治療または予防するための、ｕＰＡＲに特異的に結合する融合タンパク質の使用であって、治療上有効な量の上述の医薬組成物または上述の融合タンパク質を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、使用を提供する。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の上述の医薬組成物または上述の融合タンパク質を患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、医薬組成物または融合タンパク質は、サイトカインもしくはそのバリアントまたは第２の融合タンパク質と同時に投与され、ここで、第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質とは異なるサイトカインまたはそのバリアントを含む。
特定の実施形態において、医薬組成物または融合タンパク質は、サイトカインもしくはそのバリアントまたは第２の融合タンパク質と逐次的に投与され、ここで、第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質とは異なるサイトカインまたはそのバリアントを含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットを含む。
特定の実施形態において、患者の腫瘍における融合タンパク質のクリアランス速度は、患者の血清における融合タンパク質のクリアランス速度よりも遅い。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットを患者に投与することを含み、
（ａ）融合タンパク質は、
（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットもしくはそのバリアント、またはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットもしくはそのバリアントとを含み、
（ｂ）非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットもしくはそのバリアント、またはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットもしくはそのバリアントを含み、
ここで、融合タンパク質がＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントを含む場合、非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントを含み、融合タンパク質がＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントを含む場合、非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットは、逐次的に投与される。
特定の実施形態において、融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットの一方または両方は、静脈内投与される。
特定の実施形態において、融合タンパク質が最初に投与され、続いて、融合タンパク質が患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、非融合ＩＬ－１２サブユニットが投与される。
特定の実施形態において、融合タンパク質が最初に投与され、続いて、融合タンパク質の濃度が患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、非融合ＩＬ－１２サブユニットが投与される。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を患者に投与することを含み、
（ａ）第１の融合タンパク質は、
（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）上の第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントとを含み、
（ｂ）第２の融合タンパク質は、
（ｉ）ｕＰＡＲ上の第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントとを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じである。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、逐次的に投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方は、静脈内投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第１の融合タンパク質が患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、第２の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第１の融合タンパク質の濃度が患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、第２の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第２の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第２の融合タンパク質が患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、第１の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第２の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第２の融合タンパク質の濃度が患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、第１の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方は、
ａ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む、抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方は、
ａ）ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む、抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方は、
ａ）ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む、抗原結合タンパク質を含む。
一態様において、本開示は、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含む組み合わせを提供し、
（ａ）第１の融合タンパク質は、
（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）上の第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントとを含み、
（ｂ）第２の融合タンパク質は、
（ｉ）ｕＰＡＲ上の第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントとを含む。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じである。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。
一態様において、本開示は、（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質と、（ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントとを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質及びサイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーにより連結される。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１２からなる群から選択される。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、少なくとも１つのインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）サブユニットを含む。
特定の実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットは、ｐ３５及びｐ４０の一方または両方を含む。
特定の実施形態において、ｐ３５は、配列番号８１の位置Ｍ１２、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、Ｌ１６１、及びＤ１８８に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦまたはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、これらの組み合わせを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ及びＤ１８８Ｎを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｃ７４Ｋを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む。
特定の実施形態において、ｐ３５は、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ｐ４０は、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、Ｃ１７７のアミノ酸置換は、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｃ２５２アミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。
特定の実施形態において、ｐ４０は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーによって結合されたｐ３５及びｐ４０サブユニットを含む単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を含む。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５６）を含む。
特定の実施形態において、ｓｃＩＬ－１２は、配列番号８８または配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、
（ａ）
ｉ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）、ＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）、またはＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｉｉ）ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）、またはＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）、またはＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
（ｂ）
ｉｖ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｖ）ＤＴＳ（配列番号７）、ＫＶＳ（配列番号１５）、ＡＡＴ（配列番号２３）、またはＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
ｖｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）、ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）、ＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含む。
特定の実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号３３、配列番号３４配列番号３７、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＦＳＬＴＮＹＧ配列番号１１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＫＶＳ（配列番号１５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
ｃ）ＶＨドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
ｄ）ＶＨドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
ｅ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、
ｆ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、
ｇ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、
ｈ）ＶＨドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または
ｉ）ＶＨドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸リンカーにより結合される。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）、またはＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２４６）を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、単一ドメイン抗体、またはナノボディを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５６～７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７２～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を更に含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４５、４６、４９、５３、または５４の抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４７、４８、５０、５１、５２、及び５５の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを含む。
融合タンパク質の特定の実施形態において、
ａ）抗体ＨＣは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
ｂ）抗体ＨＣは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
ｃ）抗体ＨＣは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）抗体ＨＣは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
ｅ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、
ｆ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
ｇ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
ｈ）抗体ＨＣは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、または
ｉ）抗体ＨＣは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２３８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、約５×１０－８Ｍ未満、約１×１０－８Ｍ未満、約５×１０－９Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約５×１０－１０Ｍ未満、または約１×１０－１０Ｍ未満のＫＤでヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドに結合したヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合し、それにより、抗体またはその断片に結合する蛍光標識抗体により検出される蛍光シグナルが生成され、ＥＣ５０値は、約０．１ｎＭ～約３．０ｎＭである。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインまたはヒトｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインに結合する。
一態様において、本開示は、配列番号８１の位置Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、及びＬ１６１に１つ以上のアミノ酸置換を含む、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドを提供する。
特定の実施形態において、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドは、Ｓ２７及びＤ１８８の一方または両方のアミノ酸置換を更に含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦまたはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、これらの組み合わせを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｃ７４Ｋを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む。
特定の実施形態において、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドは、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本開示は、（ｉ）上述の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドと、（ｉｉ）１つ以上の融合パートナーとを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの凝集を低減する部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの発現を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの血清半減期を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、ターゲティング部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する。
一態様において、本開示は、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドを提供する。
特定の実施形態において、Ｃ１７７のアミノ酸置換は、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｃ２５２アミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。
特定の実施形態において、ｐ４０は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本開示は、（ｉ）上述の操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドと、（ｉｉ）１つ以上の融合パートナーとを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの凝集を低減する部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの発現を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの血清半減期を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、ターゲティング部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する。
一態様において、本開示は、（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチドと、（ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントとを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、アミノ酸リンカーによりサイトカインに連結される。
特定の実施形態において、サイトカインは、その機能性断片、その機能性バリアントまたはその循環置換バリアントを含む。
特定の実施形態において、サイトカインは、１つ以上の任意選択のアミノ酸リンカーを介して、サイトカインが結合特異性を有する受容体の全部または一部に連結される。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、ｕＰＡＲに特異的に結合することが可能なウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）ポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
特定の実施形態において、ｕＰＡバリアントは、ｕＰＡのアミノ酸末端断片（ＡＴＦ）である。
特定の実施形態において、ＡＴＦは、配列番号９１に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態において、ｕＰＡのＡＴＦは、１つ以上のアミノ酸置換または欠失を含む。
特定の実施形態において、ｕＰＡは、配列番号９０に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態において、サイトカインは循環置換ＩＬ－２であり、受容体はＩＬ－２Ｒαである。
特定の実施形態において、サイトカインは循環置換ＩＬ－１５であり、受容体はＩＬ－１５Ｒαである。
特定の実施形態において、サイトカインは循環置換ＩＬ－１であり、受容体はＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－１ＲＩＩである。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質である。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、抗ｕＰＡＲ抗体のｓｃＦｖ断片である。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１１１、及び１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９８、９９、１１１、及び１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合剤、サイトカイン及び受容体は、ヒト起源のものである。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の上述の融合タンパク質を患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、がんは、黒色腫、癌腫、芽細胞腫及びリンパ腫からなる群から選択される。
一態様において、本開示は、炎症性疾患を治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の上述の融合タンパク質を患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、炎症性疾患は、ＩＢＤ及びＲＡからなる群から選択される。
一態様において、本開示は、上述の少なくとも１つの融合タンパク質と、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一態様において、本開示は、
１つ以上の任意選択のアミノ酸リンカーを介して、
（ｉ）サイトカインもしくはそのバリアント、または
（ｉｉ）チェックポイント分子モジュレーターに連結されたウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、サイトカインは、その機能性断片、その機能性バリアントまたはその循環置換バリアントを含む。
特定の実施形態において、サイトカインは、１つ以上の任意選択のアミノ酸リンカーを介して、サイトカインが結合特異性を有する受容体の全部または一部に連結される。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、ｕＰＡＲに特異的に結合することが可能なウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）ポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
特定の実施形態において、ｕＰＡバリアントは、ｕＰＡのアミノ酸末端断片（ＡＴＦ）である。
特定の実施形態において、ＡＴＦは、配列番号９１に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態において、ｕＰＡのＡＴＦは、１つ以上のアミノ酸置換または欠失を含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはチェックポイント分子モジュレーターは、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、４－１ＢＢＢ（ＣＤ１３１）またはそのリガンド、ＯＸ４０またはそのリガンド、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１抗体、ＣＴＬＡ－４、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＧＩＴＲまたはそのリガンド、ＩＣＯＳまたはそのリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０またはそのリガンドからなる群から選択される。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の上述の融合タンパク質を患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、がんは、黒色腫及びリンパ腫からなる群から選択される。
一態様において、本開示は、炎症性疾患を治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の上述の融合タンパク質を患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、炎症性疾患は、ＩＢＤ及びＲＡからなる群から選択される。
一態様において、本開示は、上述の少なくとも１つの融合タンパク質と、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一態様において、本開示は、患者のがんを治療するための免疫療法の方法であって、上述の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、方法は、標的がん療法を患者に行うことを更に含む。
特定の実施形態において、方法は、化学療法、放射線療法またはその両方から選択される従来の細胞傷害性療法を患者に行うことを更に含む。
特定の実施形態において、方法は、がんワクチン、チェックポイント阻害剤またはモノクローナル抗体から選択される免疫療法を行うことを更に含む。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、Ｍ２５、またはアミノ酸レベルで少なくとも８０％の同一性を有するＭ２５に対して相同なアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、Ｐ２５、またはアミノ酸レベルで少なくとも８０％の同一性を有するＰ２５に対して相同なアミノ酸配列を含む。
ヒトｕＰＡＲのＤＩＩ－ＤＩＩＩドメイン（Ａ）またはＤＩＩＩドメイン単独（Ｂ）に対する抗ｕＰＡＲ抗体の結合データを示す。 ヒトｕＰＡＲまたはマウスｕＰＡＲを発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞の表面上に発現されたヒト（Ａ）及びマウス（Ｂ）ｕＰＡＲに対する抗ｕＰＡＲ抗体の結合データを示す。抗ｕＰＡＲ抗体を滴定により細胞とインキュベートし、試験した抗体濃度にわたる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を決定した。 ｐ３５ Ｃ７４バリアントとｐ４０ Ｃ１７７バリアントとの間のＯｃｔｅｔ結合データを示す。Ｘ軸に沿って、各データ点に記載された第１のアミノ酸は、ｐ３５ Ｃ７４置換に対応し、各データ点に記載された第２のアミノ酸は、ｐ４０ Ｃ１７７置換に対応する（すなわち、「Ｋ－Ｓ」のデータ点は、ｐ３５ Ｃ７４Ｋバリアントとｐ４０ Ｃ１７７Ｓバリアントとの間の結合親和性である）。 いくつかの例示的なＩＬ－１２サブユニット融合タンパク質の模式図を示す。Ａは、単鎖ヒトＩＬ－１２ ｐ３５／ｐ４０融合タンパク質を示す。Ｂは、ｐ３５／血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたはマウス血清アルブミン）融合タンパク質を示す。Ｃは、Ｆａｂ／Ｆｃ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン融合タンパク質と対合したｐ３５／Ｆｃ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン融合タンパク質を示す。各Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体化を容易にするために、ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）変異を含有する。Ｄは、ｐ４０／ｓｃＦｖ融合タンパク質を示す。Ｅは、ｐ３５／タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）融合タンパク質を示す。Ｆは、ｓｃＦｖ／Ｆｃ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン融合タンパク質と対合したｐ３５／Ｆｃ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン融合タンパク質を示す。各Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体化を容易にするために、ＫｉＨ変異を含有する。Ｇは、ｐ４０／Ｆａｂドメイン融合タンパク質を示す。Ｈは、ｐ４０／ＩｇＧ融合タンパク質を示す。ｐ４０タンパク質は、ＩｇＧの各ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結される。 放射性標識した腫瘍標的化ＩＬ－１２サブユニットｐ４０（Ａ）及びｐ３５（Ｂ）のＰＥＴ／ＣＴイメージングによる腫瘍及び血清中薬物動態を示す。マウスの腫瘍及び血液中の腫瘍標的化サブユニットを経時的に測定し、最大曝露の％を決定した。腫瘍標的化ｐ４０は、抗ｕＰＡＲ抗体Ｍ３７とｐ４０のＦａｂフォーマットでの融合体であった。腫瘍標的化ｐ３５は、抗ｕＰＡＲ抗体Ｍ３７とｐ３５のＫｉＨフォーマットでの融合体であった。 ＣＤ８＋（Ａ）及びＣＤ４＋（Ｂ）Ｔ細胞におけるＳｔａｔ４リン酸化％によって測定した、セルベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－１２活性データを示す。ＩＬ－１２サブユニットは、規定の濃度にわたり、Ｔ細胞に１：１の比率で加えた。 Ｔ細胞によるインターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ分泌によって測定した、セルベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－１２活性データを示す。ＩＬ－１２サブユニットは、規定の濃度にわたり、Ｔ細胞に１：１の比率で加えた。 マウス腫瘍モデルの腫瘍（Ａ）及び肝臓（Ｂ）におけるＩＬ－１２サブユニットの蓄積を示す。ＩＬ－１２サブユニット分子は、非標的化ｓｃＩＬ１２、標的化Ｆａｂ－ｐ４０、非標的化ｐ３５－ＭＳＡ、標的化ＩｇＧ－ｐ４０、及び標的化ｐ３５－ＫｉＨであった。「％ＩＤ／ｇ」は、組織１グラムあたりの注射量のパーセントに相当する。 ｓｃＩＬ－１２または２用量のｐ３５－ＭＳＡとｐ４０－Ｆａｂの組み合わせの投与を受けたマウスにおける血清中インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ濃度を示す。 ｕＰＡＲ発現ＨＥＫ細胞／Ｔ細胞の共培養でのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳｔａｔ４リン酸化％によって測定した、セルベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－１２活性データを示す。ＩＬ－１２サブユニットは、規定の濃度にわたり、ｕＰＡＲ発現ＨＥＫ細胞に１：１の比率で加えた後、ＣＤ８＋Ｔ細胞とコインキュベートした。 ＲＫＯ異種移植腫瘍マウスモデルにおける腫瘍組織中の特定の融合タンパク質の蓄積を示す。 ＲＫＯ異種移植腫瘍マウスモデルにおける血清中の特定の融合タンパク質の蓄積を示す。
本明細書で提供されるのは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチド（例えば、ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質）、及び当該ｕＰＡＲ結合ポリペプチドとサイトカインまたはそのバリアントとを含む融合タンパク質である。本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合ポリペプチド及び融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにそれを用いたがんを治療する方法を更に提供する。本開示は、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５及びｐ４０ポリペプチドを更に提供する。
一般に、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学ならびにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野においてよく知られ、一般的に使用されるものである。本明細書で提供される方法及び技術は、特に記載のない限り、一般に、当該技術分野においてよく知られている従来の方法に従って、また、本明細書全体を通して引用及び考察される一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるように実施することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施することができる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学及び製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその研究室での手順及び技術は、当該技術分野においてよく知られ、一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化及び送達、ならびに患者の治療には、標準的な技術が使用される。
本明細書で特に定義のない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に提供する定義が、いかなる辞書または外部の定義よりも優先される。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または」の使用は、別段の指示がない限り、「及び／または」を意味する「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定するものではない。
本発明がより容易に理解され得るように、まず特定の用語を定義しておく。
抗原結合タンパク質
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原またはエピトープに特異的に結合するまたは免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子または免疫グロブリン由来分子を指し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含み、また、限定するものではないが、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組み換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ＶＨＨ）断片を含む機能性抗体断片も含む。したがって、抗体は、単一ドメイン抗体であるか、または少なくとも１つの可変軽鎖及び少なくとも１つの可変重鎖を含む。一実施形態において、少なくとも１つの可変軽鎖及び少なくとも１つの可変重鎖は、単一ポリペプチド鎖として連結される。「抗体」または「抗原結合タンパク質」という用語は、生殖細胞系列に由来する抗体を含む。「抗体」または「抗原結合タンパク質」という用語は、遺伝子操作されたまたは別様に改変された免疫グロブリンの形態、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）などを含む。別段の指示がない限り、「抗体」または「抗原結合タンパク質」という用語は、その機能性抗体断片を包含することを理解されたい。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、多重特異性である（すなわち、２つ以上の異なる標的分子または同じ標的分子上の２つ以上のエピトープに結合する）。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、二重特異性であり、例えば、２つの異なる標的分子または同じ標的分子上の２つのエピトープに結合する。特定の実施形態において、抗体は、三重特異性であり、例えば、少なくとも３つの異なる標的分子に結合する。
抗原結合タンパク質は、一価または多価であり得、すなわち、１つ以上の抗原結合部位を有する。一価の抗原結合タンパク質の非限定的な例としては、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、Ｖ（ＮＡＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリン及びナノボディが挙げられる。多価の抗原結合タンパク質は、２つ、３つ、４つ以上の抗原結合部位を有することができる。多価の抗原結合タンパク質の非限定的な例としては、全長免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２断片、ビス－ｓｃＦｖ（またはタンデムｓｃＦｖもしくはＢｉＴＥ）、ＤＡＲＴ、ダイアボディ、ｓｃＤｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ｆｃ－ｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＦｙｎｏｍＡＢ、クアドローマ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤｕｏＢｏｄｙ、トリアボディ及びテトラボディが挙げられる。いくつかの実施形態において、多価の抗原結合タンパク質は、二価であり、すなわち、２つの結合部位が存在する。いくつかの実施形態において、多価の抗原結合タンパク質は、二重特異性であり、すなわち、抗原結合タンパク質は、２つの異なる標的または１つの標的分子上の２つの異なる標的部位を指向する。いくつかの実施形態において、多価の抗原結合タンパク質は、２つを超える、例えば、３つまたは４つの異なる抗原に対して、それぞれ３つまたは４つの異なる結合部位を含む。そのような抗原結合タンパク質は、多価であり、かつ多重特異性であり、特に、それぞれ三重または四重特異性である。
本明細書で使用される場合、「単鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗原結合タンパク質である。ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインは、当該技術分野で認識されている任意の適切なリンカーを介して連結される。そのようなリンカーには、繰り返しのＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖは、一般に、抗体定常ドメイン領域を含まないが、本開示のｓｃＦｖは、ｓｃＦｖの様々な特性を改変するために、例えば、限定するものではないが、血清または組織半減期を増加させるために、抗体定常ドメイン領域（例えば、抗体Ｆｃドメイン）に連結または結合されてもよい。ｓｃＦｖは、一般に、約２５ｋＤａの分子量を有し、約２．５ｎｍの流体力学的半径を有する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、タンデムｓｃＦｖを含み、すなわち、第１のｓｃＦｖが第２のｓｃＦｖに連結されている。第１及び第２のｓｃＦｖは、同じアミノ酸配列であり得、及び／または同じエピトープに結合することができる。あるいは、第１及び第２のｓｃＦｖは、異なるアミノ酸配列であり得、及び／または異なるエピトープに結合することができる。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」または「Ｆａｂ」は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片である。
本明細書で使用される場合、「ＶＨＨ」、「ナノボディ」、または「重鎖のみ抗体」は、ラクダ、ラマ、アルパカを含むラクダ科の種に由来する単一重鎖可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質である。ＶＨＨは、一般に、約１５ｋＤａの分子量を有する。
一実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインの存在は、細胞傷害性免疫応答を誘導し、及び／または補体（例えば、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰまたはＣＤＣエフェクター機能）を活性化するのに有利であり得る。Ｆｃドメインを含む例示的な抗体形態は、限定するものではないが、全長免疫グロブリン、ＤＶＤ－Ｉｇ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ－Ｆｃ．ｓｃＦｖ融合体、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体（例えば、ｂｓＡｂ、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、Ｔｓ２Ａｂ、ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）など）、ＤｕｏＢｏｄｙ及び／またはＣｒｏｓｓＭａｂである。活性型Ｆｃドメインは、腫瘍微小環境において、Ｔ細胞及び他のエフェクター細胞による炎症促進性サイトカイン放出の可能性を増加させ得、これは、治療作用機序の一部であると考えられている。Ｆｃドメインは、完全に活性化されてもよいし、免疫系の過剰な刺激を回避するために、部分的にサイレンシングされてもよい。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、不活性であり、炎症促進性サイトカイン放出を刺激しないが、抗原結合タンパク質の半減期及び／または安定性の改善は保たれる。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択される定常領域を含む。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２ＢまたはＩｇＧ３アイソタイプからなる群から選択される定常領域を含む。
本開示の抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質のドメインを連結する（例えば、ｓｃＦｖを形成するためにＶＨ及びＶＬを連結する、または多重特異性抗原結合タンパク質を形成するために複数の結合ドメインを連結する）ための１つ以上のリンカーを含み得る。
リンカーの例示的な例としては、グリシンポリマー（Ｇｌｙ）ｎ；グリシン－セリンポリマー（ＧｌｙｎＳｅｒ）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８の整数である）；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；及び当該技術分野において知られている他のフレキシブルリンカーが挙げられる。
グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質などの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することが可能であり得る。グリシンは、他の小さな側鎖アミノ酸よりも非常に多くのΦ－Ψ空間を利用でき、より長い側鎖を持つ残基よりもはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１：１１７３－１４２（１９９２））。当業者であれば、特定の実施形態における抗原結合タンパク質の設計には、完全にまたは部分的に柔軟性のあるリンカーが含まれ得、そのため、リンカーは、所望の構造を提供するために、フレキシブルリンカーのストレッチだけでなく、低い柔軟性を付与する１つ以上のストレッチも含み得ることを認識するであろう。
しかしながら、リンカー配列は、例えば、ヒトＣＨ１及びＣκ配列の最初の部分に対応するアミノ酸ストレッチまたはヒトＩｇＧのヒンジ領域の下部に対応するアミノ酸ストレッチを使用して、天然リンカー配列に類似するように選択することができる。
ｓｃＦｖ部分において、ＶＬドメインとＶＨドメインを接続するペプチドリンカーの設計は、一般に、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒなどの小さな非極性または極性残基からなるフレキシブルリンカーである。ｓｃＦｖ部分の可変ドメインを接続する特定の例示的なリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーであり、式中、４は、モチーフの例示的な繰り返し数である。特定の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、またはＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２４６）を含む。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４７）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。
他の例示的なリンカーとしては、次のアミノ酸配列：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ；ＴＧＥＫＰ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５５２５－５５３０（１９９７））；ＧＧＲＲ；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）（ｎ＝１、２、３、４または５）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６－１１６０（１９９６））；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１０６６－１０７０（１９９０））；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８））、ＧＧＲＲＧＧＧＳ；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ；及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７－１６４４（２００３））が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、フレキシブルリンカーは、タンパク質及びペプチドの３Ｄ構造をモデリングすることが可能なコンピュータープログラムを使用して、またはファージディスプレイ法によって、合理的に設計することができる。
抗体は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み得る。ＶＬ及びＶＨの各ドメインは、３つのＣＤＲのセットを更に含む。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指す。一般に、各重鎖可変ドメインに３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、各軽鎖可変ドメインに３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ以外の部分を指すものとして当該技術分野において知られている。一般に、各重鎖可変ドメインに４つのＦＲ（ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、及びＨＦＲ４）があり、各軽鎖可変ドメインに４つのＦＲ（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、及びＬＦＲ４）がある。したがって、抗体可変領域アミノ酸配列は、式ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４によって表すことができる。式の各セグメント、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４は、別個のアミノ酸配列（またはそれをコードするポリヌクレオチド配列）を表し、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を含む変異がなされてもよい。特定の実施形態において、抗体可変軽鎖アミノ酸配列は、式ＬＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＲ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＲ４によって表すことができる。特定の実施形態において、抗体可変重鎖アミノ酸配列は、式ＨＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＲ４によって表すことができる。
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかのよく知られているスキームのいずれかを使用して容易に決定することができ、これらには、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５．（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ ｅｔ ａｌ．，“ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎｕａｒｙ；２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒ Ａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１ Ｊｕｎ．８；３０９（３）：６５７－７０，（「ＡＨｏ」ナンバリングスキーム）によって記載されているものなどが含まれる。
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、識別に使用されるスキームに応じて変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造的なアライメントに基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造的な情報に基づいている。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方のスキームのナンバリングは、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、いくつかの抗体では、挿入文字、例えば、「３０ａ」によって提供される挿入及び欠失が生じる。この２つのスキームでは、特定の挿入及び欠失（「ｉｎｄｅｌ」）を異なる位置に配置するため、ナンバリングに差が生じることになる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームと類似している。
したがって、別段の指定がない限り、抗体またはその断片、例えば、その可変ドメインの「ＣＤＲ」もしくは「相補性決定領域」、または個々の特定のＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２）は、既知のスキームのいずれかによって定義される相補性決定領域（または特定の相補性決定領域）を包含すると理解されたい。同様に、別段の指定がない限り、抗体またはその断片、例えば、その可変ドメインの「ＦＲ」もしくは「フレームワーク領域」、または個々の特定のＦＲ（例えば、「ＨＦＲ１」、「ＨＦＲ２」）は、既知のスキームのいずれかによって定義されるフレームワーク領域（または特定のフレームワーク領域）を包含すると理解されたい。いくつかの場合において、特定のＣＤＲまたはＦＲの識別のためのスキームは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されたＣＤＲのように指定される。他の場合において、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
特定の実施形態において、本明細書で開示される抗原結合タンパク質は、ヒト化される。本明細書で使用される場合、「ヒト化される」または「ヒト化」という用語は、ヒト抗体により類似するように改変された抗原結合タンパク質を指す。本明細書で開示されるマウス抗原結合タンパク質などの非ヒト抗原結合タンパク質は、治療のためにヒトに投与すると、負の免疫応答を惹起するであろう。したがって、非ヒト（例えば、マウス）抗原結合タンパク質をヒト化することは、後の治療的使用に有利である。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、リサーフェーシングによりヒト化される（すなわち、非ヒトフレームワークの溶媒露出残基を、よりヒトらしくなるようにリモデリングする）。リサーフェーシング戦略は、ＷＯ２００４／０１６７４０、ＷＯ２００８／１４４７５７、及びＷＯ２００５／０１６９５０に詳述されており、そのそれぞれが参照により本明細書に援用される。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲグラフティングによりヒト化される（すなわち、マウス抗原結合タンパク質ＣＤＲをヒト抗体アクセプターフレームワークに挿入する）。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、抗体の抗原結合部位と、それが結合するエピトープとの間の相互作用の強さを指す。当業者には容易に理解されるように、抗体または抗原結合タンパク質の親和性は、解離定数（ＫＤ）としてモル濃度単位（Ｍ）で報告され得る。本開示の抗体は、１０－８～１０－１４Ｍの範囲のＫＤ値を有し得る。高親和性抗体は、１０－９Ｍ（１ナノモル、ｎＭ）以下のＫＤ値を有する。例えば、高親和性抗体は、約１ｎＭ～約０．０１ｎＭの範囲のＫＤ値を有し得る。高親和性抗体は、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、または約０．１ｎＭのＫＤ値を有し得る。非常に親和性の高い抗体は、１０－１２Ｍ（１ピコモル、ｐＭ）以下のＫＤ値を有する。親和性の弱いまたは低い抗体は、１０－１～１０－４Ｍの範囲のＫＤ値を有し得る。低親和性抗体は、１０－４Ｍ以上、例えば、１０－４Ｍ、１０－３Ｍ、１０－２Ｍ、または１０－１ＭのＫＤ値を有し得る。
特定の抗原決定基（例えば、ｕＰＡＲ）に結合する抗体の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者に知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器での分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかにより測定することができる。
本開示に使用される様々な抗体定常ドメインのアミノ酸配列は、以下の表１に示される。
抗原結合タンパク質ヘテロ二量体化
本開示の一態様において、２つのＦｃドメインを含む抗原結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホールペアリング（ＫｉＨ）によりヘテロ二量体化される。この二量体化技術は、ＣＨ３ドメインの界面に操作された突出（「ノブ」）及び空洞（「ホール」）を利用する。第１または第２のＣＨ３ドメインのいずれかの界面に好適な位置及び寸法のノブまたはホールが存在する場合、隣接する界面にそれぞれ対応するホールまたはノブを操作するだけでよく、それにより、ＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面におけるＦｃドメインのペアリングが促進され、強化される。「ノブ」は、第１のＦｃドメインのＣＨ３部分の界面から突き出ている、少なくとも１つのアミノ酸側鎖、典型的には大きい側鎖を指す。この突出は、第２のＦｃドメインのＣＨ３部分の「ホール」と相補的であり、「ホール」によって受容される「ノブ」を形成する。「ホール」は、第２のＦｃドメインのＣＨ３部分の界面から引っ込んでいる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖、典型的には小さい側鎖である。この技術は、例えば、米国特許第５，８２１，３３３号；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７－６２１（１９９６）；及びＣａｒｔｅｒ Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７－１５（２００１）に記載されている。
ノブとして機能し得る例示的なアミノ酸残基としては、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。ＣＨ３ドメインに存在するアミノ酸残基が、ノブのアミノ酸残基により置き換えまたは置換され得る。置換に好ましいアミノ酸には、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）などの小さな側鎖を含む任意のアミノ酸が含まれ得る。
ホールとして機能し得る例示的なアミノ酸残基としては、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）が挙げられる。ＣＨ３ドメインに存在するアミノ酸残基が、ホールのアミノ酸残基により置き換えまたは置換され得る。置換に好ましいアミノ酸には、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）などの大きいまたは嵩高い側鎖を含む任意のアミノ酸が含まれ得る。
ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来し得る。ＣＨ３ドメインに対する例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３９４Ｓ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。特定の例示的な組み合わせは、第１のＣＨ３ドメインに対するノブ変異のＴ３６６ＹまたはＴ３６６Ｗ、及び第２のＣＨ３ドメインに対するホール変異のＹ４０７ＴまたはＹ４０７Ｖである。
特定の実施形態において、ＫｉＨ Ｆｃドメインは、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含むノブＦｃ部分と、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むホールＦｃ部分とを含む。特定の実施形態において、ホールＦｃ部分は、Ｅｕナンバリングに従って、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを更に含む。
本開示の特定の実施形態において、２つのＦｃドメインを含む抗原結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換（ＦＡＥ）によりヘテロ二量体化される。Ｐ２２８Ｓのヒンジ変異を保有するヒトＩｇＧ１は、Ｆ４０５ＬまたはＫ４０９ＲのＣＨ３ドメイン変異を含有し得る。２つの抗体を還元剤と混合すると、ＦＡＥがもたらされる。この技術は、米国特許第９，２１２，２３０号及びＬａｂｒｉｊｎ Ａ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（１３）：５１４５－５１５０（２０１３）に記載されている。
本開示の特定の実施形態において、２つのＦｃドメインを含む抗原結合タンパク質は、静電的ステアリング効果によりヘテロ二量体化される。この二量体化技術は、静電的ステアリングを利用して、ＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面におけるＦｃドメインのペアリングを促進し、強化する。２つのＣＨ３ドメイン間の電荷相補性は、ホモ二量体化（同じ電荷のペアリング）よりもヘテロ二量体化（反対の電荷のペアリング）が優先されるように変更される。この方法では、静電反発力により、ホモ二量体化が阻止される。例示的なアミノ酸残基置換としては、第１のＣＨ３ドメインのＫ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及び／またはＫ３７０Ｄ、ならびに第２のＣＨ３ドメインのＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及び／またはＥ３５７Ｋを挙げることができる。この技術は、米国特許出願公開第２０１４／０１５４２５４Ａ１号及びＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５（２５）：１９６３７－１９６４６（２０１０）に記載されている。
本開示の特定の実施形態において、２つのＦｃドメインを含む抗原結合タンパク質は、疎水性相互作用によりヘテロ二量体化される。この二量体化技術は、静電的相互作用の代わりに疎水性相互作用を利用して、ＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面におけるＦｃドメインのペアリングを促進し、強化する。例示的なアミノ酸残基置換としては、第１のＣＨ３ドメインのＫ４０９Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｅ、Ｙ３４９Ｓ、及び／またはＳ３５４Ｃ、ならびに第２のＣＨ３ドメインのＤ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、Ｑ３４７Ｒ、Ｅ３５７Ｗ、及び／またはＹ３４９Ｃを挙げることができる。第１のＣＨ３ドメインと第２のＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸残基置換の好ましいペアには、Ｋ４０９Ｗ：Ｄ３９９Ｖ、Ｋ４０９Ｗ：Ｆ４０５Ｔ、Ｋ３６０Ｅ：Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ：Ｅ３５７Ｗ、及びＳ３５４Ｃ：Ｙ３４９Ｃが含まれる。この技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２８Ａ１号に記載されている。
本開示の特定の実施形態において、２つのＦｃドメインを含む抗原結合タンパク質は、ロイシンジッパー融合体の使用によりヘテロ二量体化される。抗体鎖の各ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合されたロイシンジッパードメインがヘテロ二量体化を強制する。この技術は、Ｗｒａｎｉｋ Ｂ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７（５２）：４３３３１－４３３３９（２０１２）に記載されている。
本開示の特定の実施形態において、２つのＦｃドメインを含む抗原結合タンパク質は、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）体の使用によりヘテロ二量体化される。ＩｇＧ及びＩｇＡフォーマットに由来するＣＨ３ドメインにより、ヘテロ二量体化が強制される。この技術は、Ｍｕｄａ Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２４（５）：４４７－４５４（２０１１）に記載されている。
別段の指示がない限り、本明細書で採用される抗体定常領域ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８－８５（１９６９）に記載されるＥＵナンバリングスキームに対応する。
重鎖及び／または軽鎖のヘテロ二量体化ならびに非対称抗体の生成及び精製の更なる方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｋｌｅｉｎ Ｃ．，ｍＡＢｓ ４（６）：６５３－６６３（２０１２）、及び米国特許第９，４９９，６３４号を参照されたく、そのそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
限定するものではないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変更を含む、Ｆｃ機能を変更するための追加のＦｃドメイン変異が想定される。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｅｕナンバリングに従って、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常ドメインを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｅｕナンバリングに従って、Ｐ３２９Ｇアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常ドメインを含む。
ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチド
本明細書で使用される場合、「ｕＰＡＲ」または「ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体」または「ウロキナーゼ受容体」または「ｕＰＡ受容体」または「ＣＤ８７」または「分化抗原群８７」という用語は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の標的を指す。ｕＰＡＲは、Ｌｙ－６／ｕＰＡＲ／アルファ－神経毒素ファミリーの３つの異なるドメインから構成される。３つのドメインは全て、主要なリガンドであるウロキナーゼの高親和性結合に関与する。主要なリガンドのウロキナーゼの他に、ｕＰＡＲは、ビトロネクチン、ｕＰＡＲ関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ）、及び膜タンパク質のインテグリンファミリーを含む、いくつかの他のタンパク質と相互作用する。
本明細書で使用される場合、「結合ポリペプチド」または「結合タンパク質」という用語は、標的タンパク質（例えば、ｕＰＡＲ）に特異的に結合するポリペプチドに対応する。結合ポリペプチドには、上記の抗原結合タンパク質だけでなく、標的タンパク質のリガンドも含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、結合ポリペプチドは、ｕＰＡＲに特異的に結合することが可能なウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）ポリペプチドまたはそのバリアントである。特定の実施形態において、ｕＰＡバリアントは、ｕＰＡのアミノ酸末端断片（ＡＴＦ）である。特定の実施形態において、ＡＴＦは、配列番号９１に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を有するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、ｕＰＡのＡＴＦは、１つ以上のアミノ酸置換または欠失を含む。特定の実施形態において、ｕＰＡは、配列番号９０に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を有するアミノ酸配列を有する。
一態様において、本開示は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質であって、
（ａ）ｉ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）、ＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）、またはＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｉｉ）ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）、またはＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）、またはＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
（ｂ）ｉｖ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、
ｖ）ＤＴＳ（配列番号７）、ＫＶＳ（配列番号１５）、ＡＡＴ（配列番号２３）、またはＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
ｖｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）、ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）、ＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含む、抗原結合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、本開示の抗原結合タンパク質は、上記ならびに表３及び表８に記載されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性または同一性を含む。
特定の実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号３３、配列番号３４配列番号３７、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本開示の抗原結合タンパク質は、上記ならびに表３及び表８に記載されるＶＨまたはＶＬアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性または同一性を含む。
特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＦＳＬＴＮＹＧ配列番号１１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＫＶＳ（配列番号１５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＬドメインは、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、
ａ）ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
ｂ）ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
ｃ）ＶＨドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
ｄ）ＶＨドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
ｅ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、
ｆ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、
ｇ）ＶＨドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、
ｈ）ＶＨドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または
ｉ）ＶＨドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸リンカーにより結合される。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）またはＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、単一ドメイン抗体、またはナノボディを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５６～７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７２～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を更に含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号４５、４６、４９、５３、または５４の抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４７、４８、５０、５１、５２、及び５５の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを含む。
特定の実施形態において、
ａ）抗体ＨＣは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
ｂ）抗体ＨＣは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
ｃ）抗体ＨＣは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）抗体ＨＣは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
ｅ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、
ｆ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
ｇ）抗体ＨＣは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
ｈ）抗体ＨＣは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、または
ｉ）抗体ＨＣは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、抗体ＬＣは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、約５×１０－８Ｍ未満、約１×１０－８Ｍ未満、約５×１０－９Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約５×１０－１０Ｍ未満、または約１×１０－１０Ｍ未満のＫＤでヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドに結合したヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合し、それにより、抗原結合タンパク質に結合する蛍光標識抗体により検出される蛍光シグナルが生成され、ＥＣ５０値は、約０．１ｎＭ～約３．０ｎＭである。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインまたはヒトｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインに結合する。
一態様において、本開示は、上記の抗原結合タンパク質と結合が競合する、単離された抗原結合タンパク質を提供する。
一態様において、本開示は、上記の抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する、単離された抗原結合タンパク質を提供する。
一態様において、本開示は、上記の抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一態様において、本開示は、上記の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
一態様において、本開示は、上記のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを提供する。
一態様において、本開示は、上記の発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
別の態様において、本開示は、上述の抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（ｉ）上述の宿主細胞を、抗原結合タンパク質の発現が可能な条件下で培養するステップと、
（ｉｉ）抗原結合タンパク質を回収するステップと、任意選択により、
（ｉｉｉ）抗原結合タンパク質を更に精製及び／または改変及び／または製剤化するステップとを含む、方法を提供する。
サイトカイン及びそのバリアント
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」は、「リンホカイン」（リンパ球によって作られるサイトカイン）、「モノカイン」（単球によって作られるサイトカイン）、「ケモカイン」（走化活性を有するサイトカイン）、及び「インターロイキン」（ある白血球によって作られ、他の白血球に作用するサイトカイン）を含む一般的な用語である。サイトカインは、サイトカインを分泌する細胞（オートクリン作用）、隣接細胞（パラクリン作用）、または場合により遠隔の細胞（内分泌作用）に作用し得る。炎症促進性サイトカインは、主に活性化したマクロファージ及び樹状細胞によって産生され、炎症反応の上方制御に関与し、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αが含まれるが、これらに限定されない。ケモカインは、通常、最初の２つのシステイン残基の間隔に応じて４つのグループに割り当てられる：Ｃ－Ｃケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、単球走化性因子タンパク質またはＭＣＰ－１、単球炎症性タンパク質またはＭＩＰ－１α、及びＭＩＰ－１β）、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン（例えば、成長関連がん遺伝子またはＧＲＯ／ＫＣとも呼ばれるＩＬ－８）、Ｃケモカイン（例えば、リンホタクチン）、及びＣＸＸＸＣケモカイン（例えば、フラクタルカイン）。抗炎症性サイトカインは、炎症反応を抑制または制御する、一連の免疫調節分子である。サイトカインは、特定のサイトカイン阻害剤及び可溶性サイトカイン受容体と協働して免疫応答を調節する。主要な抗炎症性サイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）－１受容体アンタゴニスト、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、及びＩＬ－１３が含まれるが、これらに限定されない。白血病抑制因子、インターフェロン－アルファ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－βは、様々な状況下で、抗炎症性サイトカインまたは炎症促進性サイトカインのいずれかに分類される。ＩＬ－１、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－１８に特異的なサイトカイン受容体もまた、炎症促進性サイトカインの阻害剤として機能する。
本明細書で開示される融合タンパク質のサイトカインポリペプチドは、任意のサイトカインであり得、そのバリアント、例えば、その機能性断片、またはその循環置換バリアントを含む。有用なサイトカインには、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７ファミリーメンバー、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－３０（ＩＬ－２７ｐ２８）、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、ＩＬ－３６ｇ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＣＬＣＦ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｏｘｆｅｒｒｉｔｉｎ、アポリポタンパク質ｅ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）インターフェロン－アルファ（ＩＦＮα）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮβ）、またはインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１２からなる群から選択される。特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、少なくとも１つのインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）サブユニット（例えば、ｐ３５及びｐ４０）を含む。特定の実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットは、ｐ３５及びｐ４０の一方または両方を含む。特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーによって結合されたｐ３５ポリペプチド及びｐ４０ポリペプチドを含む単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を含む。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、参照ポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持しているポリペプチドを指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、その一次アミノ酸配列が別の参照ポリペプチドとは異なるものである。一般に、参照ポリペプチドとバリアントの配列は、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であることから、差異は限定的である。バリアントと参照ポリペプチドは、アミノ酸配列が１つ以上の修飾（例えば、置換、付加、及び／または欠失）により異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものである場合もあれば、そうでない場合もある。ポリペプチドのバリアントは、アレルバリアントのように自然に生じる場合もあれば、自然に発生することが知られていないバリアントである場合もある。加えて、本明細書で使用される「バリアント」という用語は、タンパク質及びペプチドの循環置換を含む。
本明細書で使用される場合、「循環置換された」及び「循環置換」「（ＣＰまたはｃｐ）」という用語は、線状タンパク質またはその同族核酸配列を得、ネイティブのＮ末端及びＣ末端を融合させて（タンパク質または組み換えＤＮＡ法を使用して、直接的にまたはリンカーを介して）環状分子を形成し、次いで、環状分子を異なる位置で切断（開環）して元の分子の末端とは異なる末端を持つ新しい線状タンパク質または同族核酸分子を形成する概念的プロセスを指す。したがって、循環置換は、タンパク質（任意選択のリンカー以外）の配列、構造、及び機能を保持しつつ、異なる位置に新しいＣ末端及びＮ末端を生成するものであり、本開示の一態様に従って、元のリガンドと比較して、所望のポリペプチド融合パートナーとの融合にとって改善された配向をもたらす。循環置換はまた、本明細書で定義されるように、循環置換された直鎖分子をもたらす任意のプロセスも含む。一般に、循環置換分子は、線状分子としてｄｅ ｎｏｖｏ発現され、形式的には、環化及び開環のステップを経ない。本明細書において、分子の特定の循環置換は、循環置換タンパク質の場合、その間のペプチド結合が除去されたアミノ酸残基を含む括弧によって示される。例えば、ＩＬ６（Ｑ１８２／Ｑ１８０）という表記は、非置換または非修飾のネイティブＩＬ６の残基Ｑ１８２とＱ１８０の間に開環部位（ペプチド結合が除去される位置）が生じた循環置換ＩＬ６成長因子を指し、したがって、新しく生成されたＮ末端は、以前は残基１８２であったグルタミンであり、新しく生成されたＣ末端は、以前は残基１８０であったグルタミンである。循環置換タンパク質、及びその作製方法は、Ｕ．Ｓ．９，３５９，４１５に詳述されており、参照により本明細書に援用される。
「非置換」、「ネイティブ」、「野生型」、または「非修飾」リガンド、ポリペプチド、タンパク質、サイトカインという用語は、例えば、上記のように循環置換分子に再構成される前のサイトカインの参照点を提供するために本明細書に使用される。典型的に、非修飾サイトカインは、一般にｉｎ ｖｉｖｏで生じる場合のサイトカインまたはタンパク質の独立したドメインのアミノ末端及びカルボキシ末端ならびにアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ末端及びカルボキシ末端ならびにアミノ酸配列を有する。非修飾サイトカインは、完全な成熟形態または成熟形態の前駆体（プロタンパク質など）であり得る。
本明細書で使用される場合、「断片」は、参照タンパク質よりも短いポリペプチドのセグメントを指す。タンパク質の断片は、末端（カルボキシまたはアミノ末端）及び／または内部の欠失を有し得る。一般に、タンパク質の断片は、少なくとも４（例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、または少なくとも１００以上）のアミノ酸長である。本明細書に記載されるタンパク質、融合タンパク質または断片のいずれかの生物学的に活性な断片または生物学的に活性なバリアントは、野生型の全長参照タンパク質の活性の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％またはそれ以上）を有する。ｕＰＡＲ結合ポリペプチドの場合、関連する活性は、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが標的ｕＰＡＲ受容体に結合する能力である。サイトカインポリペプチドの場合、関連する活性は、その受容体に結合し、適宜アゴナイズまたはアンタゴナイズする能力である。その使用目的に応じて、ポリペプチド、生物学的に活性な断片、またはその生物学的に活性なバリアントは、任意の種のものであり得るが、好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、またはヒト）であり、最も好ましくは、ヒトである。
したがって、本開示は、全長ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるｕＰＡＲ結合ポリペプチド、サイトカイン及び対応する受容体または受容体断片を含む、本発明の融合タンパク質の様々なポリペプチド）の（ｉ）生物学的に活性なバリアント及び（ｉｉ）生物学的に活性な断片またはその生物学的に活性なバリアントを提供することが理解される。全長、好ましくは成熟した野生型タンパク質またはタンパク質の断片の生物学的に活性なバリアントは、付加、欠失、または置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、もしくは５０の保存的アミノ酸置換を含有し得る。保存的置換は、あるアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することである。保存的置換は、次の群：バリン、アラニン及びグリシン；ロイシン、バリン、及びイソロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン、システイン、及びトレオニン；リジン及びアルギニン；ならびにフェニルアラニン及びチロシンのうちの置換を含む。非極性の疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正の電荷を帯びた（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負の電荷を帯びた（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。上記の極性基、塩基性基または酸性基の１つのメンバーを同じ群の別のメンバーで置換することは、保存的置換とみなすことができる。対照的に、非保存的置換は、あるアミノ酸を異なる特徴を有する別のアミノ酸で置換することである。欠失バリアントは、（２つ以上のアミノ酸セグメントのうち）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２，１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸セグメントまたは非連続の単一アミノ酸を欠き得る。付加（付加バリアント）は、（ａ）少なくとも５アミノ酸を含有する全長野生型ポリペプチドまたはその断片と、（ｂ）内部または末端（ＣまたはＮ）における無関係または異種アミノ酸配列とを含有する融合タンパク質を含む。そのような融合タンパク質の文脈において、「異種アミノ酸配列」という用語は、（ａ）以外のアミノ酸配列を指す。したがって、本明細書に記載されるペプチド及び異種アミノ酸配列を含有する融合タンパク質は、天然に存在するタンパク質の全部または一部とは配列が一致しない。異種配列は、例えば、組み換えタンパク質の精製に使用される配列（例えば、ＦＬＡＧまたはポリヒスチジン（ヘキサヒスチジンまたは６ｘＨｉｓ））であり得る。
操作されたインターロイキン１２サブユニット
ＩＬ－１２は、ｐ３５サブユニット（すなわち、ＩＬ－１２ ｐ３５）及びｐ４０サブユニット（すなわち、ＩＬ－１２ ｐ４０）で構成されるヘテロ二量体である。ＩＬ－１２の最適な活性は、ヘテロ二量体が形成され、ＩＬ－１２受容体（例えば、ＩＬ－１２Ｒβ１／ＩＬ－１２Ｒβ２ヘテロ二量体）に結合したときに達成される。２つのサブユニット（ｐ３５及びｐ４０）は、一緒に連結して単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を形成することができ、それにより、ヘテロ二量体の組み立ての必要性をなくし、ＩＬ－１２の活性を高めることができる。しかしながら、ｓｃＩＬ－１２は、全身投与する場合、高い毒性を示す。したがって、各ＩＬ－１２サブユニットを別々に供給するのが有利である。
残念ながら、ＩＬ－１２サブユニットは、治療目的での発現及び精製が困難である。ｐ３５は、ほとんど発現しない。ｐ３５を融合パートナー、例えば、抗体もしくはその断片、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結することによって発現を改善することができる。ｐ３５はまた、凝集しやすい。ｐ４０も同様の課題を示す。ｐ４０は、融合パートナーを用いずに発現させることができるが、その精製組成物は、ｐ４０ホモ二量体が混ざることが多い（約１５～２０％）。ｐ４０はまた、３７℃で経時的に二量体化しやすく、凝集しやすい。本開示は、互いの結合親和性を維持しながら、これらの課題を克服することができる、操作されたＩＬ－１２サブユニット（すなわち、ｐ３５及びｐ４０バリアント）を提供する。
一態様において、本開示は、配列番号８１の位置Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、及びＬ１６１に１つ以上のアミノ酸置換を含む、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドを提供する。
特定の実施形態において、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドは、Ｓ２７及びＤ１８８の一方または両方のアミノ酸置換を更に含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦまたはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、これらの組み合わせを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｃ７４Ｋを含む。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む。
特定の実施形態において、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドは、配列番号８１、配列番号８２、もしくは配列番号８３のアミノ酸配列、または配列番号８１、配列番号８２、もしくは配列番号８３に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含む。
更なる態様において、本開示は、（ｉ）上述の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドと、（ｉｉ）１つ以上の融合パートナー（例えば、機能性部分または抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質）とを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの凝集を低減する部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの発現を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの血清半減期を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、ターゲティング部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する。
一態様において、本開示は、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドを提供する。
特定の実施形態において、Ｃ１７７のアミノ酸置換は、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｃ２５２アミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。
特定の実施形態において、ｐ４０は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、もしくは配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、もしくは配列番号８７に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性もしくは同一性を含むアミノ酸配列を含む。
更なる態様において、本開示は、（ｉ）上述の操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドと、（ｉｉ）１つ以上の融合パートナー（例えば、機能性部分または抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質）とを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの凝集を低減する部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの発現を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの血清半減期を増加させる部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、ターゲティング部分を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の融合パートナーは、血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する。
例示的なＩＬ－１２アミノ酸配列は、以下の表２に示される。
融合タンパク質
上記のｕＰＡＲ抗原結合タンパク質を含む、本明細書に記載されるウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチドは、１）サイトカインまたはそのバリアント及び２）チェックポイント分子モジュレーターの一方または両方に連結（すなわち、結合または融合）することができる。ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質は、連結されたタンパク質（すなわち、サイトカインまたはチェックポイント分子モジュレーター）をｕＰＡＲ発現腫瘍にターゲティングするのに有用である。
「チェックポイント分子モジュレーター」という語句は、望ましい免疫応答を増強する（例えば、免疫刺激性チェックポイント分子をアゴナイズするまたは免疫抑制性チェックポイント分子をアンタゴナイズする）ように、または望ましくない免疫応答を阻害する（例えば、不適切な応答に対する免疫刺激性チェックポイント分子をアンタゴナイズする）ように、チェックポイント分子を適宜アゴナイズまたはアンタゴナイズすることが可能なタンパク質またはペプチドを指す。刺激性または共刺激性チェックポイント分子には、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ及びそのリガンド、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３１（４－１ＢＢＢ及びそのリガンド）が含まれるが、これらに限定されない。抑制性チェックポイント分子には、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３，ジオキシゲナーゼ）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＰＤ－１（プログラム細胞死１受容体）ならびにそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）及びＰＤ－Ｌ２（プログラム死リガンド２）、ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のｖドメインＩｇ抑制因子）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の融合タンパク質に使用されるチェックポイント分子モジュレーターには、抑制性もしくは刺激性チェックポイント分子、その機能性断片、その機能性誘導体またはその循環置換バリアントが含まれる。
抗原結合タンパク質に加えて、ｕＰＡＲ結合ポリペプチドは、ｕＰＡＲ統合相互作用を遮断するインテグリンに由来するペプチドを含むことができる。そのようなペプチドの１つは、アミノ酸配列ＰＲＹＱＨＩＧＬＶＡＭＦＲＱＮＴＧ（配列番号１５７）を有するＭ２５であり、これは、フィブリノゲン、ビトロネクチン、及びサイトカインで刺激した内皮細胞へのリンパ球の接着を阻害するＭａｃ－１のβ２サブユニットに由来するペプチドである。Ｍ２５はまた、ｕＰＡＲとβ１の会合を遮断し、フィブロネクチン及びコラーゲン上でのヒト血管平滑筋細胞のβ１－インテグリン依存性伸展及び遊走を阻害した（Ｓｉｍｏｎ ＤＩ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７５：１０２２８－３４）。ｕＰＡＲ－インテグリン複合体形成を阻害する第２のペプチドである、アミノ酸配列ＡＥＳＴＹＨＨＬＳＬＧＹＭＹＴＬＮ（配列番号１５８）を有するＰ２５は、腫瘍細胞のビトロネクチンへの接着を減少させ、腫瘍細胞のフィブロネクチンへの接着を増加させることができた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｕｉｊｍ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５９：９７１－８２）。
一態様において、本開示は、（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質と、（ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントとを含む、融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質及びサイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーにより連結される。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１２からなる群から選択される。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、少なくとも１つのインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）サブユニット（例えば、ｐ３５及びｐ４０）を含む。特定の実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットは、ｐ３５及びｐ４０の一方または両方を含む。例えば、限定するものではないが、融合タンパク質は、（ｉ）ｕＰＡＲに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、（ｉｉ）ｐ３５ポリペプチドとを含む。あるいは、融合タンパク質は、（ｉ）ｕＰＡＲに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、（ｉｉ）ｐ４０ポリペプチドとを含む。
特定の実施形態において、ｐ３５ポリペプチドは、配列番号８１の位置Ｍ１２、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、Ｌ１６１、及びＤ１８８に１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦまたはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、これらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ及びＤ１８８Ｎを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｃ７４Ｋを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む。特定の実施形態において、ｐ３５は、配列番号８１、配列番号８２、もしくは配列番号８３のアミノ酸配列、または配列番号８１、配列番号８２、もしくは配列番号８３に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性もしくは同一性を含むアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ｐ４０ポリペプチドは、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｃ１７７のアミノ酸置換は、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される。特定の実施形態において、Ｃ２５２アミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。特定の実施形態において、ｐ４０ポリペプチドは、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、もしくは配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、もしくは配列番号８７に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性もしくは同一性を含むアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、アミノ酸リンカーによって結合されたｐ３５ポリペプチド及びｐ４０ポリペプチドを含む単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を含む。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５６）を含む。特定の実施形態において、ｓｃＩＬ－１２は、配列番号８８もしくは配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８８もしくは配列番号８９に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列類似性もしくは同一性を含むアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、
ａ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む、抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、
ａ）ＧＦＳＬＴＮＹＧ配列番号１１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＫＶＳ（配列番号１５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、
ａ）ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む、抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、
ａ）ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
ｂ）ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインとを含む、抗原結合タンパク質を含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｅ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｆ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｇ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、
ｈ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
特定の実施形態において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、アミノ酸リンカーにより結合される。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）またはＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、単一ドメイン抗体、またはナノボディを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５６～７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７２～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を更に含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号４５、４６、４９、５３、または５４の抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４７、４８、５０、５１、５２、及び５５の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを含む。
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｆ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｇ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、
ｈ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣ、または
ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む抗体ＬＣを含む。
別の態様において、本開示は、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含む組み合わせを提供し、
（ａ）第１の融合タンパク質は、
（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）上の第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントとを含み、
（ｂ）第２の融合タンパク質は、
（ｉ）ｕＰＡＲ上の第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントとを含む。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じである。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。
機能性部分
本開示のタンパク質（例えば、ｕＰＡＲ結合タンパク質、サイトカイン、及び融合タンパク質）は、本開示のタンパク質に所望の生物活性を付与する機能性部分に更にコンジュゲート（すなわち、連結、結合、または融合）され得る。機能性部分は、タンパク質機能性部分と非タンパク質機能性部分（例えば、ＰＥＧまたは多糖）の両方を含む。例えば、限定するものではないが、サイトカインまたはそのバリアントは、サイトカインまたはそのバリアントの半減期を延長する目的で、任意選択のリンカーを介して、免疫グロブリンのＦｃ領域またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にコンジュゲートされ得る（例えば、ＩＬ－１２ ｐ３５－ＨＳＡまたはＩＬ－１２ ｐ４０－ＨＳＡコンジュゲート）。
特定の実施形態において、機能性部分は、免疫グロブリンのＦｃ領域（すなわち、Ｆｃドメイン）である。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＷＯ２０１６／１００７８８（参照により本明細書に援用される）に記載される一本鎖リンカーを介して、本開示のタンパク質（例えば、ｕＰＡＲ結合タンパク質、サイトカイン、及び融合タンパク質）に連結され得る。これらのリンカーは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合した、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１定常領域に連結された免疫グロブリン軽鎖（ＣＬ）の定常領域（ｓｃＣＬＣＨ１またはｓｃＣＨ１ＣＬリンカー）を含む。例えば、本開示の融合タンパク質（例えば、抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質に連結されたサイトカイン）は、ｓｃＣＬＣＨ１またはｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介して、免疫グロブリンのＦｃ領域に更に連結され得る。このタイプのリンカーは、本開示の融合タンパク質に、改善された生物活性及び増加した半減期などの好ましい特性を本開示の融合タンパク質に付与する。
本開示の融合タンパク質は、分解及び／またはクリアランスまたは捕捉に抵抗する血清アルブミン分子、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで更に安定化し、その半減期が増加し得る。これらの血清アルブミン分子は、天然に存在するタンパク質であり、それ自体がｉｎ ｖｉｖｏで長い半減期を有する。
リンカー
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ｕＰＡＲ結合タンパク質、サイトカインタンパク質、及び融合タンパク質）のいずれも、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上）のリンカー部分を含むことができ、これらは、融合タンパク質のポリペプチドの１つ以上（または全て）を連結し、１つ以上のサイトカインタンパク質を連結し、または１つ以上のｕＰＡＲ結合タンパク質を連結する（例えば、ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質のＶＨ及びＶＬドメインを連結する）。特定の実施形態において、リンカーは、アミノ酸リンカーであり、長さは１アミノ酸長であり得るが、より長くてもよい。例えば、リンカーペプチドは、少なくとも２（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、または少なくとも５５以上）のアミノ酸長であり得る。リンカーペプチドは、任意のアミノ酸を含有し得る。
特定の実施形態において、本開示のタンパク質に存在する任意の１つ以上のリンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）、及び／またはＳｅｒ（Ｓ）から選択されるアミノ酸を含む人工フレキシブルポリペプチドから選択される。特定の実施形態において、リンカーは、一般式（ＧＧＧＳ（配列番号１５１））ｎまたは（ＧＧＧＧＳ（配列番号１５２））ｎまたは（ＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１５３））ｎまたは（ＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号１５４））ｎのポリペプチドから構成され、式中、ｎは、１～１０の整数である。特定の実施形態において、各リンカーは、約１～約１００アミノ酸、例えば、約１～５０アミノ酸、約１～２５アミノ酸、約１～１５アミノ酸、約１～１０アミノ酸、約４～２４アミノ酸、約５～２０アミノ酸、約５～１５アミノ酸、及び約５～１０アミノ酸を含む、ポリペプチドである。特定の実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ（配列番号１５５））ｎであり、式中、ｎは、２または４である。任意のリンカーは、例えば、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、及びＡｓｐ（Ｄ）などのアミノ酸を更に含み得る。
特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）またはＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）を含む。特定の実施形態において、アミノ酸リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳを含む。
特定の実施形態において、リンカーは、１つ以上のムチンタンパク質またはタンパク質（例えば、ＭＵＣ遺伝子（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ２１）によってコードされる任意のタンパク質）のムチンドメインを含み得る。ムチンドメインタンパク質及びポリペプチドは、高度のグリコシル化を含有し、それにより、ムチンタンパク質及びムチンドメインを含む他のポリペプチドは、構造上、堅固なランダムコイルとして振る舞うことができる。ムチンドメインのロッド状の性質は、生物活性タンパク質（例えば、サイトカイン）と融合パートナー（例えば、ｕＰＡＲ結合タンパク質）を強固に分離することができ、それにより、どの融合パートナーでも活性が消失しにくくなる。
本開示に従って有用であるそのようなムチンドメインポリペプチドは、ＷＯ２０１３／１８４９３９及びＷＯ２０１３／１８４９３８に記載されており、参照により本明細書に援用される。これらのリンカーは、本開示の融合タンパク質のポリペプチド間（例えば、ＡＴＦポリペプチドとサイトカインポリペプチドとの間）に最適な間隔をもたらすか、または、例えば、融合タンパク質におけるムチンドメインの位置にかかわらず、融合タンパク質全体の半減期を増加させるのに有用である。例えば、ムチンドメインは、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し得る。ムチンドメインポリペプチドリンカーは、ＷＯ２０１３／１８４９３８に記載されるように、本発明の融合タンパク質の半減期を増加させるように同じく機能し得る免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に更に連結され得る。
精製タグ
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ｕＰＡＲ結合タンパク質、サイトカインタンパク質、及び融合タンパク質）のいずれも、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上）の精製タグを含むことができ、これらは、本明細書に記載されるタンパク質の精製を容易にする。特定の実施形態において、精製タグは、ａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号２４０）である。特定の実施形態において、精製タグは、６ｘＨｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２４１）である。ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグの一方または両方は、単一のタンパク質上に任意の順序で存在し得る。特定の実施形態において、精製タグは、本明細書に記載されるタンパク質にｇｌｙ－ｓｅｒリンカーにより連結される。特定の実施形態において、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ＧＧＳ及び／またはＧＧＳＧＧＧ（配列番号２４２）を含む。特定の実施形態において、精製は、ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号２４３）、ＧＧＳＧＧＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号２４４）、及びＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２４５）のいずれか１つである。
抗原結合タンパク質、サイトカイン、及び融合タンパク質の発現
一態様において、本明細書で開示される抗原結合タンパク質（例えば、抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質）、サイトカインもしくはそのバリアント（例えば、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５または操作されたＩＬ－１２ ｐ４０）、または融合タンパク質（例えば、抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質－サイトカイン融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドまたは核酸が提供される。これらのポリヌクレオチドを発現させることを含む、抗原結合タンパク質、サイトカイン、または融合タンパク質の作製方法も提供される。
本明細書で開示される抗原結合タンパク質、サイトカイン、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的に、所望の量の抗原結合タンパク質または融合タンパク質を産生するために使用され得る宿主細胞に導入するための発現ベクターに挿入される。したがって、特定の態様において、本開示は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこれらのベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、細胞に所望の遺伝子を導入し、発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために本明細書で使用される。当業者に知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般に、本発明と適合性のあるベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞に進入する及び／または複製する能力を含む。
本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が採用され得る。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、ＭＯＭＬＶなど）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。その他は、内部リボソーム結合部位を含むポリシストロン系の使用を伴う。更に、ＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を付与し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結させてもよいし、同時形質転換によって同じ細胞に導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には、追加のエレメントを必要とし得る。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、更には、転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルが含まれ得る。いくつかの実施形態において、クローニングされた可変領域遺伝子は、上で考察されたように合成された重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒト定常領域遺伝子）とともに発現ベクターに挿入される。
他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ポリシストロン性構築物を使用して発現され得る。そのような発現系において、抗体の重鎖及び軽鎖などの複数の目的の遺伝子産物が、単一のポリシストロン性構築物から産生され得る。このような系は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用して、真核生物宿主細胞で比較的に高レベルのポリペプチドを提供する。適合するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に記載されており、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。当業者であれば、そのような発現系を使用して、本出願に開示される全範囲のポリペプチドを効果的に産生することができることを理解するであろう。
より一般的には、抗体またはその断片をコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されたら、適切な宿主細胞に発現ベクターを導入することができる。すなわち、宿主細胞が形質転換され得る。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者によく知られた様々な技術によって達成することができる。これらには、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ” Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０－４７２ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照されたい。プラスミドの宿主への導入は、エレクトロポレーションによるものであり得る。形質転換された細胞は、軽鎖及び重鎖の産生に適切な条件下で成長させ、重鎖及び／または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標識細胞分取解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞に変化をもたらす、ＤＮＡのレシピエント宿主細胞への導入を指す広い意味で使用されるものとする。
これと同じ意味で、「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からポリペプチドを単離するためのプロセスの説明において、「細胞」及び「細胞培養」という用語は、特に明示されない限り、抗体の供給源を示すために区別なく使用される。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、遠心した全細胞、または培地と浮遊細胞の両方を含有する細胞培養液からのいずれかからの回収を意味し得る。
一実施形態において、抗体発現または融合タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物由来のものである。当業者であれば、発現させる所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を決定することができる。例示的な宿主細胞株としては、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶ－１（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を含むＣＶ－１の誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、細胞株は、細胞株から発現される抗体のグリコシル化に変更を与える（例えば、脱フコシル化）（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）またはＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）細胞）（Ｂｉｏｗａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））。宿主細胞株は、典型的に、商業的サービス、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開されている文献から入手可能である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生では、所望のポリペプチドを多量に得るためのスケールアップが可能である。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養するための技術は、当該技術分野において知られており、例えば、エアリフトリアクターもしくは連続攪拌リアクターでの均一系懸濁培養、または、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジでの固定化もしくは包括細胞培養が含まれる。必要であれば及び／または所望により、ポリペプチドの溶液は、慣用のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上のクロマトグラフィー及び／または（イムノ）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
本発明で取り上げられる抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、細菌もしくは酵母などの非哺乳動物細胞または植物細胞で発現させることもできる。この点に関して、細菌などの様々な単細胞非哺乳動物微生物、すなわち、培養または発酵で成長可能である微生物も形質転換できることが理解されよう。形質転換しやすい細菌には、腸内細菌科のメンバー、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが含まれる。細菌で発現される場合、タンパク質は、封入体の一部となり得ることも更に理解されよう。タンパク質は、単離され、精製され、次いで、機能性分子に組み立てられる必要がある。
原核生物に加えて、真核微生物も使用され得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母が真核微生物のなかでも最も一般的に使用されているが、他の菌株メンバーも一般的に利用可能である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現の場合、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４－１に対して選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有している（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。そのため、酵母宿主細胞ゲノムの特徴であるｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの不在下での成長による形質転換体の検出に有効な環境がもたらされる。
抗原結合タンパク質、サイトカイン、及び融合タンパク質を投与する方法
本開示の抗原結合タンパク質、サイトカイン、または融合タンパク質、更には、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載される宿主細胞または本明細書に記載される組成物を調製し、対象に投与する方法は、当業者によく知られており、または当業者によって容易に決定される。本開示の抗原結合タンパク質の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、または局所であり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与を含む。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質または融合タンパク質は、静脈内投与される。本明細書で使用される眼内という用語は、結膜下、硝子体内、球後、または房内を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される局所という用語は、液体または溶液の点眼薬、乳剤（例えば、水中油型乳剤）、懸濁剤、及び軟膏剤による投与を含むが、これらに限定されない。
これらの全ての投与形態は、本開示の範囲内にあることが明確に企図されるが、投与形態は、注射用溶液であり得る。通常、好適な注射用医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択により、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。しかしながら、本明細書における教示に適合する他の方法において、修飾抗体は、有害な細胞集団の部位に直接送達され得、それにより、罹患組織の治療薬剤への曝露が増加する。
関連する状態の治療のための本開示の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬、及び治療が予防であるか治療であるかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。通常、患者は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために、当業者に知られている常法を使用して滴定され得る。
前述したように、本開示の抗原結合タンパク質または融合タンパク質、そのコンジュゲートまたは組み換え体は、哺乳動物の障害のｉｎ ｖｉｖｏ治療のために、薬学的に有効な量で投与され得る。この点において、本開示の抗原結合タンパク質は、投与を容易にし、活性剤の安定性を促進するように製剤化されることが理解されよう。
本開示に係る医薬組成物は、典型的に、薬学的に許容される非毒性の無菌担体、例えば、生理食塩水、非毒性の緩衝液、保存剤などを含む。本出願の目的上、抗原結合タンパク質の薬学的に有効な量は、抗原への効果的な結合を達成し、利益を得るのに十分な量、例えば、疾患もしくは障害の症状を改善するか、物質もしくは細胞を検出するのに十分な量を意味するものとする。腫瘍細胞の場合、抗原結合タンパク質は、典型的に、新生物または免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用することが可能であり、これらの細胞の死滅を増加させる。当然のことながら、本開示の医薬組成物は、修飾結合ポリペプチドの薬学的に有効な量を提供するために、単回用量または多用量で投与され得る。
本開示の範囲に沿って、本開示の抗原結合タンパク質は、前述の治療方法に従って、治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量でヒトまたは他の動物に投与され得る。本開示の抗原結合タンパク質は、そのようなヒトまたは他の動物に、既知の技術に従って、本開示の抗原結合タンパク質を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の剤形で投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態及び特徴は、組み合わせられる活性成分の量、投与経路及び他のよく知られている変数によって決定されることが当業者には認識されるであろう。更に、当業者であれば、本開示に記載される抗原結合タンパク質を１種以上含むカクテルが特に有効であることが証明され得ることは理解するであろう。同様に、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載される宿主細胞（特に、ＣＡＲを有する免疫細胞）または本明細書に記載される組成物は、上記の治療方法に従って、治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量でヒトまたは他の動物に投与され得る。
本明細書で使用される「有効性」または「ｉｎ ｖｉｖｏ有効性」は、例えば、標準的な眼科効果判定基準などの標準的な効果基準を使用した、本開示の医薬組成物による治療に対する応答を指す。本開示の医薬組成物を使用した治療の成功またはｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、意図する目的に対する組成物の有効性、すなわち、所望の効果をもたらす組成物の能力を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、特定の疾患について確立された標準的な方法によってモニタリングすることができる。加えて、疾患に特異的な様々な臨床化学パラメーター及び他の確立された標準的な方法が使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物及び細胞は、１つ以上の異なる医薬化合物と組み合わせて投与される。一般に、本明細書に記載される化合物及び細胞の治療的使用は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、放射線療法またはワクチン療法からなる群から選択される１つ以上の治療法との組み合わせであってもよい。
治療方法
本開示の抗原結合タンパク質、サイトカイン、または融合タンパク質を投与することによって、患者におけるｕＰＡＲの発現に関連する疾患または障害を治療する方法が本明細書に記載される。特定の実施形態において、ｕＰＡＲの発現に関連する疾患または障害は、がん（例えば、ｕＰＡＲ発現癌またはｕＰＡＲ発現腫瘍）である。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の本明細書に記載される医薬組成物、ｕＰＡＲ結合タンパク質、または融合タンパク質を患者に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、医薬組成物または融合タンパク質は、サイトカインもしくはそのバリアントまたは第２の融合タンパク質と同時に投与され、ここで、第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質とは異なるサイトカインまたはそのバリアントを含む。
特定の実施形態において、医薬組成物または融合タンパク質は、サイトカインもしくはそのバリアントまたは第２の融合タンパク質と逐次的に投与され、ここで、第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質とは異なるサイトカインまたはそのバリアントを含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのバリアントは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットを含む。
特定の実施形態において、患者の腫瘍における融合タンパク質のクリアランス速度は、患者の血清における融合タンパク質のクリアランス速度よりも遅い。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットを患者に投与することを含み、
（ａ）融合タンパク質は、
（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットもしくはそのバリアント、またはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットもしくはそのバリアントとを含み、
（ｂ）非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットもしくはそのバリアント、またはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットもしくはそのバリアントを含み、
ここで、融合タンパク質がＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントを含む場合、非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントを含み、融合タンパク質がＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントを含む場合、非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットは、逐次的に投与される。
特定の実施形態において、融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットの一方または両方は、静脈内投与される。
特定の実施形態において、融合タンパク質が最初に投与され、続いて、融合タンパク質が患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、非融合ＩＬ－１２サブユニットが投与される。
特定の実施形態において、融合タンパク質が最初に投与され、続いて、融合タンパク質の濃度が患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、非融合ＩＬ－１２サブユニットが投与される。
一態様において、本開示は、がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を患者に投与することを含み、
（ａ）第１の融合タンパク質は、
（ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）上の第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントとを含み、
（ｂ）第２の融合タンパク質は、
（ｉ）ｕＰＡＲ上の第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
（ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントとを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じである。
特定の実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、逐次的に投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方は、静脈内投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第１の融合タンパク質が患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、第２の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第１の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第１の融合タンパク質の濃度が患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、第２の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第２の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第２の融合タンパク質が患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、第１の融合タンパク質が投与される。
特定の実施形態において、第２の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、第２の融合タンパク質の濃度が患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、第１の融合タンパク質が投与される。
本明細書に記載される方法の他の好適な改変及び適合は、本明細書で開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な等価物を使用して行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。ここまで特定の実施形態を詳細に説明してきたが、実施形態は、以下の実施例を参照することにより、より明確に理解されるであろう。実施例は、例示のみを目的に含まれるものであり、限定を意図するものではない。
実施例１－親抗ｕＰＡＲ抗体の作製及び特性評価
組み換えヒトｕＰＡＲ及びマウスｕＰＡＲの細胞外ドメインタンパク質を交互に注射することにより、ＮＺＢＷマウスを免疫化した。ハイブリドーマを作製し、ＥＬＩＳＡ及びｕＰＡＲ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞でヒト及びマウスｕＰＡＲに対してスクリーニングし、ヒト及びマウスｕＰＡＲに対する結合特異性を有する抗体を同定した。上位のクローンを、１）ヒトｕＰＡあり及びなしのヒトｕＰＡＲ、２）マウスｕＰＡあり及びなしのマウスｕＰＡＲ、及び３）Ｈ４７Ｃ／Ｎ２５９Ｃ変異を有するヒトｕＰＡＲを含む、ｕＰＡＲのリガンドｕＰＡが結合したバリアント（リガンド結合したコンフォメーションを模倣するヒトｕＰＡＲバリアント）に対する結合について、ＥＬＩＳＡによって更にスクリーニングした。以下のアミノ酸配列をスクリーニングに使用した：
ヒトｕＰＡＲ－Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ融合体
ＬＲＣＭＱＣＫＴＮＧＤＣＲＶＥＥＣＡＬＧＱＤＬＣＲＴＴＩＶＲＬＷＥＥＧＥＥＬＥＬＶＥＫＳＣＴＨＳＥＫＴＮＲＴＬＳＹＲＴＧＬＫＩＴＳＬＴＥＶＶＣＧＬＤＬＣＮＱＧＮＳＧＲＡＶＴＹＳＲＳＲＹＬＥＣＩＳＣＧＳＳＤＭＳＣＥＲＧＲＨＱＳＬＱＣＲＳＰＥＥＱＣＬＤＶＶＴＨＷＩＱＥＧＥＥＧＲＰＫＤＤＲＨＬＲＧＣＧＹＬＰＧＣＰＧＳＮＧＦＨＮＮＤＴＦＨＦＬＫＣＣＮＴＴＫＣＮＥＧＰＩＬＥＬＥＮＬＰＱＮＧＲＱＣＹＳＣＫＧＮＳＴＨＧＣＳＳＥＥＴＦＬＩＤＣＲＧＰＭＮＱＣＬＶＡＴＧＴＨＥＰＫＮＱＳＹＭＶＲＧＣＡＴＡＳＭＣＱＨＡＨＬＧＤＡＦＳＭＮＨＩＤＶＳＣＣＴＫＳＧＣＮＨＰＤＬＤＶＱＹＲＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
マウスｕＰＡＲ－Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ融合体
ＬＱＣＭＱＣＥＳＮＱＳＣＬＶＥＥＣＡＬＧＱＤＬＣＲＴＴＶＬＲＥＷＱＤＤＲＥＬＥＶＶＴＲＧＣＡＨＳＥＫＴＮＲＴＭＳＹＲＭＧＳＭＩＩＳＬＴＥＴＶＣＡＴＮＬＣＮＲＰＲＰＧＡＲＧＲＡＦＰＱＧＲＹＬＥＣＡＳＣＴＳＬＤＱＳＣＥＲＧＲＥＱＳＬＱＣＲＹＰＴＥＨＣＩＥＶＶＴＬＱＳＴＥＲＳＬＫＤＥＤＹＴＲＧＣＧＳＬＰＧＣＰＧＴＡＧＦＨＳＮＱＴＦＨＦＬＫＣＣＮＹＴＨＣＮＧＧＰＶＬＤＬＱＳＦＰＰＮＧＦＱＣＹＳＣＥＧＮＮＴＬＧＣＳＳＥＥＡＳＬＩＮＣＲＧＰＭＮＱＣＬＶＡＴＧＬＤＶＬＧＮＲＳＹＴＶＲＧＣＡＴＡＳＷＣＱＧＳＨＶＡＤＳＦＰＴＨＬＮＶＳＶＳＣＣＨＧＳＧＣＮＳＰＴＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
ヒトｕＰＡ－Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ融合体
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＳＮＥＬＨＱＶＰＳＮＣＤＣＬＮＧＧＴＣＶＳＮＫＹＦＳＮＩＨＷＣＮＣＰＫＫＦＧＧＱＨＣＥＩＤＫＳＫＴＣＹＥＧＮＧＨＦＹＲＧＫＡＳＴＤＴＭＧＲＰＣＬＰＷＮＳＡＴＶＬＱＱＴＹＨＡＨＲＳＤＡＬＱＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮＰＤＮＲＲＲＰＷＣＹＶＱＶＧＬＫＰＬＶＱＥＣＭＶＨＤＣＡＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
マウスｕＰＡ－Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ融合体
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＧＳＶＬＧＡＰＤＥＳＮＣＧＣＱＮＧＧＶＣＶＳＹＫＹＦＳＲＩＲＲＣＳＣＰＲＫＦＱＧＥＨＣＥＩＤＡＳＫＴＣＹＨＧＮＧＤＳＹＲＧＫＡＮＴＤＴＫＧＲＰＣＬＡＷＮＡＰＡＶＬＱＫＰＹＮＡＨＲＰＤＡＩＳＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮＰＤＮＱＫＲＰＷＣＹＶＱＩＧＬＲＱＦＶＱＥＣＭＶＨＤＣＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、及びＭ４３と命名された抗体は、それぞれリガンドｕＰＡに関係なくヒトｕＰＡＲに結合したことから、更なる特性評価のために選択した。
Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、及びＭ４３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列ならびにＨＣＤＲ１～３及びＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下の表３に示す。
抗ｕＰＡＲ抗体Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、及びＭ４３の結合親和性を決定した。結合親和性分析は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術に基づくＯｃｔｅｔプラットフォームを使用して実施した。簡潔に述べると、ｕＰＡＲ抗体を、抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）センサーにより固定化した。各ｕＰＡＲ抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で試験した。ロードは、ヒスチジンタグ付きヒトｕＰＡＲ（Ｓｉｎｏ＃１０９２５－Ｈ０８Ｈ）であった。裸のセンサーを対照として使用した。ヒトｕＰＡＲに対する各抗体の結合親和性を以下の表４に示す。
ヒスチジンタグ付きヒトｕＰＡＲを１０μｇ／ｍＬの濃度でセンサーに固定したＯｃｔｅｔプラットフォームを使用して、追加の結合親和性分析を実施した。ロードは、Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、及びＭ４３のそれぞれであった。裸のセンサーを対照として使用した。ヒトｕＰＡＲを固定化した場合のヒトｕＰＡＲに対する各抗体の結合親和性を以下の表５に示す。各抗体は、１ｐＭ未満の結合親和性を示したことから、アビディティ効果が示唆される。
各抗体のｕＰＡＲ結合エピトープを、上述のＯｃｔｅｔプラットフォームを使用して特性評価した。ビオチン化したヒトｕＰＡＲバリアント、ｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインまたはｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインを、ＳＡセンサーにより１０μｇ／ｍｌで１８０秒間捕捉し、続いて、Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ４３またはＡＴＮ５６８を２００ｎＭの濃度で１５０秒間結合させた。ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメイン及びＤＩＩＩドメインには、以下のアミノ酸配列を使用した：
ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインＨｉｓＡｖｉタグ
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＧＮＳＧＲＡＶＴＹＳＲＳＲＹＬＥＣＩＳＣＧＳＳＤＭＳＣＥＲＧＲＨＱＳＬＱＣＲＳＰＥＥＱＣＬＤＶＶＴＨＷＩＱＥＧＥＥＧＲＰＫＤＤＲＨＬＲＧＣＧＹＬＰＧＣＰＧＳＮＧＦＨＮＮＤＴＦＨＦＬＫＣＣＮＴＴＫＣＮＥＧＰＩＬＥＬＥＮＬＰＱＮＧＲＱＣＹＳＣＫＧＮＳＴＨＧＣＳＳＥＥＴＦＬＩＤＣＲＧＰＭＮＱＣＬＶＡＴＧＴＨＥＰＫＮＱＳＹＭＶＲＧＣＡＴＡＳＭＣＱＨＡＨＬＧＤＡＦＳＭＮＨＩＤＶＳＣＣＴＫＳＧＣＮＨＰＤＬＤＶＱＹＲＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインＨｉｓＡｖｉタグ
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＧＰＩＬＥＬＥＮＬＰＱＮＧＲＱＣＹＳＣＫＧＮＳＴＨＧＣＳＳＥＥＴＦＬＩＤＣＲＧＰＭＮＱＣＬＶＡＴＧＴＨＥＰＫＮＱＳＹＭＶＲＧＣＡＴＡＳＭＣＱＨＡＨＬＧＤＡＦＳＭＮＨＩＤＶＳＣＣＴＫＳＧＣＮＨＰＤＬＤＶＱＹＲＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、及びＭ４３は、ヒトｕＰＡＲのＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインに結合するが、Ｍ１は、ＤＩＩＩ単独でも同様に結合可能である（図１Ａ、図１Ｂ）。Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、及びＭ４３のそれぞれは、ｕＰＡＲリガンドのｕＰＡのｕＰＡＲへの結合に関係なく、ｕＰＡＲに結合することがわかった。抗ｕＰＡＲ抗体のＡＴＮ－６５８を比較対象として使用した。
抗体とｕＰＡリガンドの競合結合を試験するために、ヒトｕＰＡをＳＡセンサーにより３．２μｇ／ｍｌ（２００ｎＭ）で４５秒間捕捉した。ヒト組み換えタンパク質ｕＰＡＲ－Ｈｉｓを１００ｎＭで１８０秒間ロードし、続いて、Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ４３またはＡＴＮ５６８を２００ｎＭの濃度で１５０秒間結合させた。
抗体競合アッセイをＯｃｔｅｔプラットフォームを使用して実施した。抗体競合アッセイは、ビオチン化したヒトｕＰＡＲをＳＡセンサー上に捕捉させることによって実施した。次いで、Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ４３及びＡＴＮ－６５８を、所定の飽和濃度でヒトｕＰＡＲに結合する第１のリガンドとしてロードした。第１のリガンドが飽和に達したら、Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ４３、及びＡＴＮ－５６８を第２のリガンドとしてロードして、Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ４３またはＡＴＮ－６５８と競合させた。第２のリガンド結合溶液には、第２のリガンドの結合中の解離を防ぐために、同じ濃度の第１のプレロードリガンドが含まれた。Ｍ１は、比較抗体ＡＴＮ－６５８とのみ競合することがわかった。Ｍ５は、Ｍ４３と競合した。Ｍ１、Ｍ８、またはＭ４３のいずれも、ヒトｕＰＡＲに対する結合について互いに競合しなかったことから、３つの抗体は、ヒトｕＰＡＲに対して固有のエピトープを有することが示された（すなわち、抗体は非競合的である）。マトリックス競合アッセイデータを以下の表６に示す。
次に、細胞の表面上に発現されたヒト及びマウスｕＰＡＲに結合する能力について、抗体を試験した。ヒトｕＰＡＲまたはマウスｕＰＡＲを発現するように操作されたヒトＨＥＫ２９３細胞を色素標識し、非標識の親ＨＥＫ２９３細胞と混合した。細胞を各１００ｎＭのヒト及びマウスｕＰＡ（ｕＰＡＲリガンド）と３０分間インキュベートし、次いで、ｕＰＡＲ抗体の滴定により３０分間処理した。抗マウス－ＩｇＧ－フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された二次抗体を使用して、ｕＰＡＲ抗体の結合を検出した。試験した抗体濃度にわたる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を図２Ａ及び図２Ｂに示す。ＥＣ５０値を以下の表７に示す。ｕＰＡリガンドを用いない場合の細胞結合のＥＣ５０の値は、ｕＰＡリガンドを用いた実験と同様であった。Ｍ１、Ｍ５、Ｍ８、Ｍ４３のＥＣ５０結合値は全て、比較対象のＡＴＮ－６５８よりも優れていた。
実施例２－親抗ｕＰＡＲ抗体のヒト化
上記の抗ｕＰＡＲ親抗体Ｍ１、Ｍ８、及びＭ４３をヒト化に進めた。まず、１）ヒト抗体配列に対する各マウス抗体の天然ヒト化同一性パーセント、２）免疫原性の領域（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＭＨＣ－ＩＩ抗原性エピトープ）、３）抗体のミスフォールディング問題（例えば、凝集及び熱安定性）、及び４）翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、各抗体の様々なパラメーターを決定した。ＰＴＭには、脱アミド部位（例えば、Ａｓｎ－Ｇｌｙ（ＮＧ）、アスパラギンからアスパラギン酸／イソアスパラギン酸への変化をもたらす）、異性化部位（例えば、Ａｓｐ－Ｇｌｙ（ＤＧ）、Ａｓｐ／Ａｓｐ（ＤＤ）、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への変化をもたらす）、グリコシル化部位（例えば、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＮＸＳ）アミノ酸モチーフ、式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸であり、例えば、ＮＬＳ）、酸化部位（例えば、Ｍｅｔ及び／またはＴｒｐアミノ酸、これらは、表面に露出し、及び／または抗体のＣＤＲ中にある場合もある）、タンパク質分解部位（例えば、Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＤＳ）及び／またはＡｓｐ－Ｐｒｏ（ＤＰ）アミノ酸モチーフ）が含まれる。
次いで、ヒト化抗体を作製した。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列ならびにＨＣＤＲ１～３及びＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下の表８に示す。抗体の定常領域を含む全長重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を以下の表９に示す。単鎖可変（ｓｃＦｖ）フォーマット抗体のアミノ酸配列を以下の表１０に示す。

ヒト化抗ｕＰＡＲ抗体Ｍ１、Ｍ８、及びＭ４３の結合親和性を決定した。結合親和性分析は、上記のＯｃｔｅｔプラットフォームを使用して実施した。簡潔に述べると、ｕＰＡＲ抗体を抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）センサーにより固定化した。各ｕＰＡＲ抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で試験した。ロードは、ヒスチジンタグ付きヒトｕＰＡＲであり、５０ｎＭから開始し、その後２倍希釈で滴定した。試験したヒト化抗体のヒトｕＰＡＲに対する結合親和性を以下の表１１に示す。注目すべきことに、ヒト化抗体は、親抗体と比較して、ヒトｕＰＡＲに対して同様の結合親和性を保持していた。
実施例３－インターロイキン１２（ＩＬ－１２）の操作
ＩＬ－１２は、ｐ３５サブユニット及びｐ４０サブユニットからなるヘテロ二量体サイトカインであり、これらが会合してＩＬ－１２ｐ７０を形成する。ＩＬ－１２は、抗原提示細胞によって発現され、免疫腫瘍学のライフサイクルにおいて複数の役割を果たす。ＩＬ－１２は、免疫応答の強力な刺激剤であるが、毒性の問題からＩＬ－１２の臨床上での使用は限られている。局所送達により毒性を下げることができるが、全身送達は難しい。
ｐ３５サブユニット及びｐ４０サブユニットの一方または両方を操作することで、いくつかの利点が得られる。各サブユニットに「ロック・アンド・キー」の変異セットを加えることで、２つのサブユニット間の親和性を調節し、特異性を高めることができる。例えば、操作されたサブユニットに導入される変異は、野生型サブユニットに対する認識を減少させ、更に毒性を低下させ得る。ｐ３５とｐ４０の間の界面に存在する対の電荷残基を操作して更なる特異性を導入することもできる。
ＩＬ１２ｐ３５／ＩＬ１２ｐ４０のシステイン残基操作
最初の最適化戦略の一環として、安定性及び発現を改善するために、ｐ３５及びｐ４０のいくつかの点変異を同定した。ｐ３５のＣ７４とｐ４０のＣ１７７間には、分子間ジスルフィド架橋が形成される。２つのサブユニット間の結合親和性を保持または改善しつつ、ジスルフィド架橋を除去するｐ３５のＣ７４及びｐ４０のＣ１７７におけるアミノ酸置換について、スクリーニングを実施した。ｐ３５については、置換Ｃ７４Ｓ、Ｓ（ＳＳ１）、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｗ、及びＹを作製した。ｐ４０については、置換Ｃ１７７Ｓ、Ｈ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、及びＮを作製した。Ｓ（ＳＳ１）は、ｐ３５のＣ１５Ｓ、Ｃ８８Ｓ、及びＣ７４Ｓ置換に対応する。Ｃ１５Ｓ／Ｃ８８Ｓペアは、内部ジスルフィド架橋を除去する。次いで、各ｐ３５ Ｃ７４バリアントをｐ４０ Ｃ１７７バリアントのそれぞれに対して試験した。結合親和性を上記のＯｃｔｅｔプラットフォームを使用して測定した。簡潔に述べると、センサーに５～１０μｇ／ｍＬのｐ３５またはｐ４０のいずれかをローディングした。捕捉化合物を５００ｎＭ～７．８ｎＭの濃度範囲で提供した。図３に示されるように、いくつかのｐ３５／ｐ４０バリアントペアは、高い結合親和性を示した。
更なる結合親和性の特性評価のために、特定のｐ３５／ｐ４０バリアントペアを選択した。具体的には、ｐ３５ Ｃ７４Ｄ、Ｋ、Ｗ、及びＹバリアントは、ｐ４０ Ｃ１７７ＳまたはＣ１７７Ｆバリアントのいずれかと対合した。完全な結合親和性データを以下の表１２及び１３に示す。以下に示されるように、各ｐ３５／ｐ４０バリアントペアは、高い結合親和性を示した。
上述のジスルフィド架橋置換に加えて、ｐ４０の遊離チオールも同定した（Ｃ２５２）。この部位もまたＣ２５２Ｓ置換になるように操作して、遊離チオールを除去した。
ＩＬ１２ｐ３５／ＩＬ１２ｐ４０の操作－安定性の向上
ｐ３５及びｐ４０を融合パートナーに連結することで安定性及び産生量を改善することができるが（以下参照）、融合パートナーなしで安定性が改善するようにサブユニットを操作することは有利であろう。特に、ｐ３５は、それ自体が不安定であり、適切なフォールディング及び発現には、融合パートナーまたはｐ４０に相当助けられている。
当初、ｐ３５のＳ２７Ｄ及びＤ１８８Ｎ変異は、指向性分子進化法を介して同定された（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１００（３）：１１６３－１１６８．２００３を参照されたい）。ｐ３５の置換は、収量の増加に有用である。
ｐ３５には、いくつかの表面露出疎水性領域及び柔軟性領域が同定された。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリング及びシミュレーションアプローチを使用して、ｐ３５の安定性を改善し得る潜在的なアミノ酸変異（すなわち、置換、欠失、及び／または挿入）を同定した。最初のパスとして、８５の単一点変異を、デルタ－デルタＧ（ｄｄＧ、すなわち、ＷＴと変異体ｐ３５のデルタＧの差）、可溶性、位置特異的スコアマトリックス（ｐｓｓｍ）スコア、及びエピトープ予測によってランク付けした。このプロセスでは、良好な可溶性のために溶媒露出疎水性残基の代わりに極性残基を導入し、良好なコアパッキングのために嵩高い疎水性残基を内部に導入することを試みた。それぞれ個々の変異体の発現及び安定性について、ウェスタンブロットにより試験した。ウェスタンブロット分析の後、タンパク質を精製し、ＨＰＬＣによって試験して、単量体％及び凝集％を決定した。ウェスタンブロットによって試験した点変異を以下の表１４に示す。サンプルＩＤ番号７０～９０は、ｐ３５マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合体であった。ｐ３５－ＭＳＡ融合体の全てが発現したが、太字のイタリック体で示したサンプルＩＤ番号（ＩＤ７２、７５、７６、８０、８２、８３）が、試験したなかでも最良の発現を示した。
ウェスタンブロット分析の後、サンプルＩＤ番号６９～９０（ｐ３５－ＭＳＡ融合体）をＨＰＬＣによって試験して、単量体％及び凝集体％を決定した。結果を以下の表１５に示す。ＷＴ ｐ３５に比べて、いくつかのｐ３５点変異体がより大きな単量体含量率を享受していることを示している。
単一の点変異体のスクリーニングの結果により、ｐ３５の発現及び安定性を改善するいくつかの点変異が明らかになった。特に、以下の単一ｐ３５変異体は、ＷＴ ｐ３５－ＭＳＡ融合体の値と同様か、またはそれを上回る単量体％値を示した：
Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｆ３９Ｄ、Ｆ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｍ１１１Ｆ、Ｍ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１Ｄ、Ｌ１６１Ｑ。
二重変異体であるＱ３５Ｅ／Ｎ２８Ｒもまた、ＷＴｐ３５－ＭＳＡ融合体の値を上回る単量体％値を示した。
二重変異は、これらのパラメーターを更に改善するために試験される。
ＩＬ１２ｐ３５／ＩＬ１２ｐ４０融合体
ＩＬ－１２サブユニットのｐ３５及びｐ４０は、実施可能な治療薬としてＩＬ－１２を使用可能にする前に克服すべき製造上の課題がいくつかある。ｐ３５は、ほとんど発現しない。ｐ３５を融合パートナー、例えば、抗体もしくはその断片、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結することによって発現を改善することができる。ｐ３５はまた、凝集しやすい。ｐ４０も同様の課題を示す。ｐ４０は、融合パートナーを用いずに発現させることができるが、その精製組成物は、ｐ４０ホモ二量体が混ざることが多い（約１５～２０％）。ｐ４０はまた、３７℃で経時的に二量体化しやすく、凝集しやすい。
様々な融合パートナーを用いて、ｐ３５及びｐ４０サブユニットの３７℃の安定性を試験した。ｐ４０は、抗体Ｆａｂ融合パートナー及び２つのｐ４０サブユニットをＩｇＧ分子の各ＣＨ３ドメインに連結させた全長ＩｇＧ融合パートナーを用いて試験した。Ｆａｂ及び全長抗体は、上記の抗ｕＰＡＲ抗体から誘導した。ｐ３５は、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合パートナー及びＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３抗体断片融合パートナーを用いて試験した。ｐ３５とｐ４０のサブユニットがアミノ酸リンカーにより連結されている単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）も試験した。例示的なＩＬ－１２サブユニット融合タンパク質を図４に示す。各融合タンパク質は、ＨＰＬＣ分析によって試験して、０時間、２４時間、４８時間、１週間、２週間における３７℃での凝集体形成及び二量体形成を測定した。各融合タンパク質の結果を以下の表１６～表２１に示す。これらの結果は、ｐ３５及びｐ４０サブユニットを様々な融合パートナーに連結すると、凝集体形成及び二量体形成を減少できることを示している。
次に、ｐ３５－ＭＳＡ融合タンパク質及びｐ４０－ｆａｂ融合タンパク質の互いに対する結合親和性について、３７℃で経時的に試験した。上記のＯｃｔｅｔプラットフォームを使用し、ビオチン化したｐ３５－ＭＳＡを５０ｎＭ～０．７８ｎＭの濃度範囲で固定化し、ｐ４０－ｆａｂを１０－２０μｇ／ｍＬの濃度でロードした。０時間、４時間、２４時間、及び４７時間での結合親和性データを以下の表２２に報告する。これらの結果は、３７℃で４７時間後であっても、ｐ３５／ｐ４０の親和性が高いままであることを示している。
実施例４－スプリットＩＬ－１２活性
ＩＬ－１２の治療上の利益は、少なくとも部分的には、ｐ３５サブユニットとｐ４０サブユニットがヘテロ二量体化してＩＬ－１２ｐ７０を形成することを可能にすることで達成される。その目的を達成するため、異なる融合パートナーを持つ各サブユニットのヘテロ二量体化の能力を試験した。試験した融合タンパク質の組み合わせを以下の表２３に示す。
上述の組み合わせをセルベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－１２活性アッセイで試験した。簡潔に述べると、凍結Ｔ細胞（アッセイ開始前の９日間、ｒｈＩＬ－２＋ＣＤ３／ＣＤ２８と培養）を解凍し、３００，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃で１時間静置した。ＩＬ－１２サブユニットをＴ細胞に１：１の比率で加えた（各分子の最終開始濃度は２５０ｎＭ）。次いで、リン酸化したＳｔａｔ４（ｐＳｔａｔ４）及びＩＦＮガンマを検出した。ｐＳｔａｔ４検出アッセイでは、細胞及びＩＬ－１２サブユニットを３７℃で４５分間インキュベートした。ＩＦＮガンマ検出アッセイでは、細胞及びＩＬ－１２サブユニットを３７℃で２４時間インキュベートした後、上清を回収した。
各組み合わせを、ＣＤ８＋（図６Ａ）及びＣＤ４＋（図６Ｂ）Ｔ細胞におけるＳｔａｔ４リン酸化の誘導能力について試験した。簡潔に述べると、各サンプルから得た細胞を固定し、蛍光フィコエリトリン（ＰＥ）で標識した抗ｐＳｔａｔ４抗体とインキュベートした。次いで、蛍光を検出した。ＥＣ５０値及びｓｃＩＬ－１２に対するＥＣ５０倍率変化を、ＣＤ８＋Ｔ細胞については表２４に、ＣＤ４＋Ｔ細胞については表２５に以下に示す。
各組み合わせを、細胞におけるＩＦＮガンマ産生の誘導能力についても試験した（図７）。ＭＳＤ Ｔ－Ｐｌｅｘサイトカインアッセイシステムを利用した。ＭＳＤアッセイは、ＥＬＩＳＡベースアッセイであり、ＭＳＤプレートにはＩＦＮガンマに対する捕捉抗体が予めコーティングしてある。サンプルをプレート上でインキュベートした後、同じくＩＦＮガンマに結合する標識検出抗体を化学発光検出に利用した。ＥＣ５０値及びｓｃＩＬ－１２に対するＥＣ５０の倍率変化を以下の表２６に示す。
実施例５－抗ｕＰＡＲ／ＩＬ－１２サブユニット融合体
ＩＬ－１２の治療効力を毒性問題を軽減しながら高めるために、ＩＬ－１２サブユニット（ｐ３５及びｐ４０）を上記の親抗ｕＰＡＲ抗体に連結した。ｕＰＡＲ抗体－ＩＬ－１２サブユニット融合体は、サブユニットを標的のｕＰＡＲ発現組織または細胞（例えば、腫瘍組織または細胞）に送達することができ、それにより、強力なＩＬ－１２活性が標的部位でのみ回復することを確実にする。その目的を達成するため、異なるｕＰＡＲ抗体融合パートナーを持つ各サブユニットのヘテロ二量体化の能力を試験した。試験した融合タンパク質の組み合わせ及びｐ３５とｐ４０の間の結合親和性を以下の表２７に示す。ｕＰＡＲ（ｕＰＡＲ－ｈｉｓ及びｕＰＡＲ－Ｆｃ）に対するｕＰＡＲ抗体融合体の結合親和性も以下に示す。
次に、特定の融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルで試験し、放射性標識した腫瘍標的化ＩＬ－１２サブユニットｐ４０（図５Ａ）及びｐ３５（図５Ｂ）のＰＥＴ／ＣＴイメージングによる腫瘍及び血清中薬物動態を示した。マウスの腫瘍及び血液中の腫瘍標的化サブユニットを経時的に測定し、最大曝露の％を決定した。腫瘍標的化ｐ４０は、抗ｕＰＡＲ抗体Ｍ３７とｐ４０のＦａｂフォーマットでの融合体であった。腫瘍標的化ｐ３５は、抗ｕＰＡＲ抗体Ｍ３７とｐ３５のＫｉＨフォーマットでの融合体であった。簡潔に述べると、ＣＴ２６腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ジルコニウム－８９（８９Ｚｒ）標識融合タンパク質をモル質量１５．５～１６．９ｎｍｏｌ／ｋｇ（目標：１６．４ｎｍｏｌ／ｋｇ）及び放射線量１８２～１９２μＣｉで２００μＬを静脈内注射により（尾静脈）投与した。その後、注射後４時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び１６８時間にマウスをＰＥＴ／ＣＴにより撮像した。各撮像時点で、ガンマ計数のために採血した。
標的化ＩＬ－１２サブユニットの腫瘍クリアランスは、血清クリアランスよりも遅く、腫瘍特異的なアセンブリを促進した。
腫瘍及び肝臓での蓄積を示すために、上述の融合タンパク質もｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルで試験した。３つの抗ｕＰＡＲ抗体融合タンパク質を腫瘍標的化化合物として使用し、非標的化ｓｃＩＬ－１２またはｐ３５－ＭＳＡ融合タンパク質と比較した。３つの標的化融合タンパク質は、Ｆａｂ－ｐ４０）、ＩｇＧ－ｐ４０、及びｐ３５－ＫｉＨであった。各化合物は、マウスでの組織蓄積を追跡するために放射性標識した。アッセイは、８９Ｚｒ標識融合タンパク質を用いて上記のとおり実施した。図８Ａに示されるように、標的化化合物は、腫瘍内に蓄積した後、時間の経過とともに消失し始めた。非標識化化合物は、蓄積しなかった。図８Ｂは、経時的な肝臓への蓄積を示し、化合物のクリアランス進行を示している。標的化化合物は、クリアランスの速度が遅く、非標的化化合物と比較して良好な保持を示している。
次いで、融合体をヒト化マウスモデルで試験して、逐次的に投与したヒトＩＬ－１２サブユニットのｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験した。免疫不全ＮＣＧマウスを１×１０７個のヒトＰＢＭＣの注射によりヒト化した。１４日後、ＰＢＳ（ビヒクル）、ｓｃＩＬ－１２、または２用量のスプリットＩＬ－１２分子を用いてマウスを治療した。スプリットＩＬ－１２分子の場合、ｐ３５－ＭＳＡをｐ４０－Ｆａｂとともに投与した。ｓｃＩＬ－１２は、０．２４ｍｇ／ｋｇで投与したが、スプリットＩＬ－１２分子は、それぞれ０．６ｍｇ／ｋｇ（ｓｃＩＬ－１２の２．５倍用量）及びそれぞれ６ｍｇ／ｋｇ（ｓｃＩＬ－１２の２５倍用量）で投与した。注射の間隔は、５分未満とした。次いで、血清中薬物動態及び薬力学（血清ＩＦＮガンマ濃度）分析のために、様々な時点でマウスから血清を採取した。データは、スプリット融合分子がｉｎ ｖｉｖｏで機能することを示している。データはまた、単鎖とスプリット分子との間で同様の薬力学応答を示しており、そのため、以下の実験において、これらの治療の血清活性と腫瘍活性を区別することができる（図９）。注目すべきことに、ｓｃＩＬ－１２の２．５倍の用量では、ＩＦＮガンマ産生が減少したことから、スプリットＩＬ－１２融合体を用いることで、オフターゲット毒性問題が軽減されることを示している。このデータは、スプリットＩＬ－１２分子のｉｎ ｖｉｖｏにおけるアセンブリング能力を更に示している。
追加の融合タンパク質を、二重ターゲティングの可能性（すなわち、抗体－ｐ３５融合体及び抗体－ｐ４０融合体であり、各抗体は、同じ標的タンパク質上の異なるエピトープに結合する）とあわせて試験した。ＩＬ－１２サブユニットを、ヒトｕＰＡＲに結合する抗体バリアントＭ１及びＭ８に結合した。このアッセイにおいて、ＩＬ－１２ｐ７０複合体は、ヒトｕＰＡＲ陽性ＨＥＫ細胞に様々な要素を順次添加し、続いて、洗浄することによって構築される。次いで、ｕＰＡＲ発現ＨＥＫ細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞とインキュベートし、当該Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ４活性を決定した。Ｍ３７抗体は、非標的化対照として使用した。この抗体は、マウスｕＰＡＲに結合し、ヒトｕＰＡＲと交差反応しない。ｓｃＩＬ－１２は、非標的化単一化合物として使用した。ｓｃＩＬ１２－Ｍ８ Ｆａｂ融合体は、標的化単一化合物として使用した。Ｍ３７－ｐ４０－Ｆａｂ及びＭ３７－ｐ３５－ＫｉＨは、非標的化陰性対照として使用した。Ｍ８－ｐ４０－Ｆａｂ及びＭ３７－ｐ３５－ＫｉＨは、単一の標的化組み合わせとして組み合わせて使用した（すなわち、ＩＬ－１２サブユニットの一方のみがｕＰＡＲに標的化されている）。Ｍ８－ｐ４０－Ｆａｂ及びＭ１－ｐ３５－ＫｉＨ－Ｆａｂは、二重標的化組み合わせとして組み合わせて使用した（すなわち、ＩＬ－１２サブユニットのｐ３５及びｐ４０の両方がｕＰＡＲに標的化されている）。簡潔に述べると、以下のプロトコルによりアッセイを実施した：
１）５０，０００個のｕＰＡＲ発現ＨＥＫ細胞を９６ウェルＵ底低接着／結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ商品番号４５２０）の各ウェルに播種した。
２）プレートを遠心し、第１の分子の滴定液１００μＬで細胞を再懸濁した。
３）細胞及び第１の分子を４℃で３０分間インキュベートした。
４）細胞を遠心し、２回洗浄した。
５）第２の分子の滴定液１００μＬで細胞を再懸濁した。
６）細胞及び分子を４℃で３０分間インキュベートした。
７）細胞を遠心し、３回洗浄した。
８）先に凍結しておいたヒトＴ細胞（３７℃で１時間静置）を１００，０００細胞／ウェルでウェルに加えた。
９）プレートをインキュベーター内に１時間置いた（３７℃）。
１０）プレートを遠心し、洗浄し、下流の染色プロトコルを開始した。
Ｔ細胞のインキュベーションステップ後、当該Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ４活性を決定した。
非標的化サブユニットまたは非標的化ｓｃＩＬ－１２は、標的化サブユニットと比較して、活性の低下を示した。単一の標的化組み合わせは、全ての非標的化アプローチと比べて、活性の向上を示した。最後に、二重標的化サブユニットは、個々に標的化されたペアと比較して活性が改善され、標的化ｓｃＩＬ－１２と比較して活性のほとんどを回復しており、全身毒性の減少を享受している（図１０）。
上述の融合タンパク質は、親抗ｕＰＡＲ抗体を用いて作製した。ヒト化抗ｕＰＡＲ抗体を用いた同様の融合タンパク質も作製した。Ｍ１融合体のアミノ酸配列を以下の表２８に示す。Ｍ８融合体のアミノ酸配列を以下の表２９に示す。Ｍ４３融合体のアミノ酸配列を以下の表３０に示す。
実施例６－追加のｕＰＡＲターゲティング融合タンパク質
実施例６の融合タンパク質の設計
実施例６に従って設計及び／または合成した融合タンパク質構築物を表３１に示す。表３１に示されるこれらのアミノ酸配列のいくつかは、以下の実験例の対照として使用される。マウスモデル及びマウス細胞系での試験のために、マウスタンパク質またはマウス実験で良好な結合になるように改変されたヒトタンパク質を伴う配列を含めた。マウスタンパク質またはマウス実験のために改変したヒトタンパク質を使用した構築物のいずれも完全ヒトタンパク質で置き換えることができる。
哺乳動物細胞での発現のために、表３１に示されるいくつかの融合タンパク質構築物にＮ末端リーダー配列を加えた。また、組み換え手順中の精製を容易にするために、６ｘＨｉｓ及びＦＬＡＧタグならびにアビジンポリペプチドも、表３１に示されるいくつかの融合タンパク質構築物に加えた。
実施例６の融合タンパク質の表３１中の構築物は、例えば、所望の生物活性を失うことなく、アミノ酸組成またはポリペプチド分子間のリンカー分子の長さを変更することができることが理解される。様々なポリペプチドの融合体の順序は変更することができ、例えば、ｕＰＡＲターゲティングドメイン領域が融合タンパク質のサイトカインまたは免疫チェックポイントモジュレーター部分のＮ末端またはＣ末端にあってもよいし、Ｆｃ融合タンパク質またはヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）融合タンパク質などの他の融合タンパク質が任意選択のリンカーを介して表３１中の構築物に加えられてもよい。表３１中の略語には、単鎖（ｓｃ）、循環置換（ｃｐ）、スクランブル配列（ｓｓ）が含まれる。
実施例６の組み換え手順、タンパク質発現及びタンパク質精製
遺伝子合成及び哺乳動物発現ベクターへのサブクローニング
設計した構築物を発現させるための遺伝子の合成及びサブクローニングは、標準的な分子生物学的手法を使用して実施した。
タンパク質発現
全てのタンパク質を、ＥＸＰＩ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元のプロトコルに従って使用して発現させた。
タンパク質精製
発現培養上清を回収した後、融合タンパク質の性質に応じて発現タンパク質を捕捉した。ＩｇＧ Ｆｃ（マウスまたはヒト）を含有するタンパク質は、プロテインＡカラム上に捕捉し、最大５カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄した。ランニング緩衝液のｐＨを下げることによってタンパク質をカラムから溶出し、ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液で直接中和した。次いで、精製したタンパク質をＰＢＳに対して一晩透析した。ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）融合体を含有するタンパク質については、上清中のタンパク質をＮｉ－ＮＴＡセファロース樹脂上に捕捉し、漸増濃度のイミダゾールで溶出した。次いで、精製したタンパク質をＰＢＳに対して一晩透析した。
ＩＬ－２及びＩＬ－１５ベースの融合タンパク質のヒトまたはマウスｕＰＡＲに対する結合のカイネティクス測定－実施例６
ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）を製造元のプロトコルに従って使用して改変したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＣＭ５センサーチップ上に、組み換えマウスｕＰＡＲ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５３１－ＰＡ－１００）を捕捉した。試験分子を３０μｌ／分の流速で２分間、濃度範囲を段階的に増加させながらチップ上を通過させた。アナライトの解離を１０分間測定した。３Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間流すことによって、チップを再生した。得られたセンサグラムを装置固有のソフトウェアを用いて解析して構築物の結合親和性を算出した。結果を表３２に示す。
組み換えヒトｕＰＡＲ ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、８０７－ＵＫ－１００／ＣＦ）をビオチン化し、次いで、製造元のプロトコルに従ってＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ストレプトアビジンセンサーチップ上に捕捉した。アナライトとも呼ばれる目的の分子を、３０μｌ／分の流速で３分間、濃度範囲を段階的に増加させながらチップ上を通過させた。アナライトの解離を２０分間測定した。３Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間流すことによって、チップを再生した。得られたセンサグラムを装置固有のソフトウェアを用いて解析して構築物の結合親和性を算出した。結果を表３２に示す。
全体として、ヒトベースのＩＬ－２またはＩＬ－１５のｕＰＡ－ＡＴＦとの融合体は、０．５９～２．２ｎＭの範囲でヒトｕＰＡＲに強固に結合した（表３２の配列番号９８、９９及び１００を参照）。これらの融合分子は、対照分子の配列番号２０（ヒトｕＰＡ－ＡＴＦ；０．２４ｎＭ）と比較して、わずかに低い効力で結合した。ＩＬ－２及びＩＬ－１５のマウスｕＰＡ－ＡＴＦとの融合体は、配列番号１０４（マウスｕＰＡ－ＡＴＦ；０．１４ｎＭ）と同様の効力（０．１４～０．２４ｎＭ）で結合したマウスｕＰＡＲに結合する。更に、Ｎ２２Ｙ、Ｗ３０Ｒの点変異体を組み込んだヒトｕＰＡ－ＡＴＦにヒトｃｐＩＬ－２：ＩＬ－２Ｒαが融合された配列番号１１０は、０．１２ｎＭのＫＤでマウスｕＰＡＲに強固に結合した。これらのデータは、ＩＬ－２及びＩＬ－１５ベースの配列のｕＰＡＲターゲティング部分（この場合、Ｎ末端またはＣ末端で融合したｕＰＡ－ＡＴＦ）との融合体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ｕＰＡＲに対する強力な結合を保持することを示している。
ヒトＴ細胞上のＩＬ－２受容体を活性化するように設計された分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力－実施例６
ＩＬ－２またはＩＬ－１５のヒト配列ベースの融合体を含有する分子の効力を評価するために、ＨＨ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２１０５（商標））を、漸増濃度の配列番号９８、９９、１００、１１０、９４、１０６、及び１０７と３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、溶解し、ＳＴＡＴ５ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ （Ｐｈｏｓｐｈｏ）［ｐＹ６９４／ｐＹ６９９］Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８５－８６１１２－１１）を製造元のプロトコルに従って使用してＳＴＡＴ５のリン酸化を検出した。ＳＴＡＴ５のリン酸化は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体活性化により誘導される受容体近位のシグナル伝達イベントである。データを表３３に示す。
非標的化の親の循環置換ｃｐＩＬ－２：ＩＬ２Ｒα融合タンパク質である配列番号９４は、ＨＨ ｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて１．１ｎＭのＥＣ５０を示した。Ｃ末端にｕＰＡＲターゲティングドメインを含むｃｐＩＬ－２：ＩＬ２ Ｒα融合タンパク質、すなわち、配列番号９９、１０６及び１１０は、同等の強力さであり、それぞれ１．５ｎＭ、１．６ｎＭ、及び２．１ｎＭのＥＣ５０であった。配列番号９８である、Ｎ末端にｕＰＡＲターゲティングドメインを含むｃｐＩＬ－２：ＩＬ２ Ｒα融合タンパク質は、ＥＣ５０が７～１０ｎＭであり、あまり強力ではなかった。非標的化の親のｈＩＬ－１５Ｒａ（ｓｕｓｈｉ）：ｃｐＩＬ－１５融合タンパク質である配列番号９５は、ＨＨ ｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて、配列番号９４よりも強力であり、０．０３９ｎＭのＥＣ５０であった。Ｎ末端にターゲティングドメインを持つ配列番号９５のバリアントもまた、配列番号９４よりも強力であり、配列番号１００及び１０７のＥＣ５０は、それぞれ０．１８ｎＭ及び０．０９９ｎＭであった。要約すると、Ｃ末端にｕＰＡＲターゲティングドメインを持つ配列番号９４の標的化バリアント及びＮ末端にターゲティングドメインを持つ配列番号９５の標的化バリアントは全て、その非標的化親分子と同等の効力を持っていることから、ｕＰＡＲターゲティングモチーフとの融合は、サイトカインドメインの同族受容体への結合を立体的に阻害／干渉しないことが示唆される。
初代マウス脾細胞上のＩＬ－２受容体を活性化するように設計された分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力－実施例６
ＩＬ－２またはＩＬ－１５のマウス配列ベースの融合体を含有する分子の効力を調べるために、脾細胞を野生型マウスの脾臓から採取し、漸増濃度の配列番号９６、マウスＦｃ：マウスＩＬ－１５Ｒａ：ｃｐＩＬ－１５、配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０５と３０分間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、表面及び細胞内マーカーに対する蛍光標識抗体で染色し、マウスＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を標準的なフローサイトメトリー技術を使用して検出した。結果を表３４に示す。
組み換え野生型ＩＬ－２（ｒＩＬ－２）は、高親和性ＩＬ－２受容体を発現する細胞を選択的に刺激し、この受容体は、正常なマウス及び健常なヒトでは、主にＴｒｅｇによって発現されている。かなり高い濃度では、ｒＩＬ－２は、中親和性ＩＬ－２受容体複合体を発現することにより、ＮＫ細胞及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞のサブセットを活性化することもできる。循環置換マウスｃｐＩＬ－２：ＩＬ２Ｒα融合タンパク質である配列番号９６は、ｒＩＬ－２と比べて、中親和性受容体を発現する細胞に対してより強力になるように操作した。これは、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５誘導が同等であり、ＥＣ５０がそれぞれ２１．６ｎＭ、１９．０ｎＭ、及び２３．２ｎＭであることによって示されている。Ｃ末端にｕＰＡＲターゲティングドメインを持つマウスｃｐＩＬ－２：ＩＬ２Ｒα融合タンパク質、すなわち、配列番号１０１は、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞に対して同様に強力であり、ＥＣ５０はそれぞれ１６．５ｎＭ、１９．５ｎＭ、及び２７．３ｎＭであった。同様に、Ｎ末端にｕＰＡＲターゲティングドメインを持つマウスｃｐＩＬ－２：ＩＬ２Ｒα融合タンパク質、すなわち、配列番号１０５は、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びメモリーＣＤ８Ｔ細胞に対して、それぞれ２１．９ｎＭ、３４．９ｎＭ、及び３８．０ｎＭのＥＣ５０を示した。ｒＩＬ－２とは対照的に、ｒｍＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体複合体に対する親和性がＣＤ２５の存在によって増強されないので、Ｔｒｅｇに対して選択的活性化を示さない。これは、マウスＦｃ：マウスＩＬ－１５Ｒａ：ｃｐＩＬ－１５によるＴｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５誘導が同等であり、ＥＣ５０がそれぞれ０．６０ｎＭ、０．０４７ｎＭ、及び０．１５ｎＭであることによって示されている。Ｎ末端にｕＰＡＲターゲティングドメインを持つマウスＩＬ－１５Ｒａ（ｓｕｓｈｉ）：ｃｐＩＬ－１５融合タンパク質、すなわち、配列番号１０２は、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞に対して同様の効力を示し、ＥＣ５０はそれぞれ１．７ｎＭ、０．１５ｎＭ、及び０．５０ｎＭであった。配列番号９４及び配列番号９５のｕＰＡＲ標的化バリアントの場合と同様に、マウスオルソログのｕＰＡＲ標的化バリアントは全て、その非標的化親分子と同等の効力を持っていることから、ｕＰＡＲターゲティングモチーフとの融合は、初代マウスＴｒｅｇ、ＮＫ細胞及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞上に発現される同族受容体へのサイトカインドメインの結合を立体的に阻害／干渉しないことが示唆される。
ｕＰＡＲを発現するマウス腫瘍細胞株へのＩＬ－２またはＩＬ－１５ベース分子の結合－実施例６
マウス同種移植腫瘍株４Ｔ１、ＣＴ２６、ＥＭＴ６（前者は全てＡＴＣＣ（登録商標）から入手）及びＭＣ３８（ＮＣＩから入手）は、フローサイトメトリーによって検出されるように、蛍光標識抗マウスｕＰＡＲ（ＣＤ８７）抗体で染色することによって、細胞表面上にマウスｕＰＡＲを発現することが示された。接着細胞をＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＣＥＬＬＳＴＲＩＰＰＥＲ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ番号２５０５６ＣＩ）で浮遊させ、洗浄し、次いで、漸増濃度の試験分子とインキュベートした（表３５参照）。４℃で６０分間インキュベーションした後、細胞を蛍光標識抗Ｈｉｓ抗体で染色し、標準的なフローサイトメトリー技術を使用して分析した。平均蛍光強度を試験物質の濃度に対してプロットし、ＥＣ５０値を４パラメーターロジスティック曲線フィッティングを使用して算出した。
配列番号９４及び配列番号１１０のＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける薬物動態－実施例６
腫瘍に対する血清中に循環するタンパク質の比を決定するために、単回投与ＰＫ実験をメスのＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した。腫瘍サイズが２００～４００ｍｍ３の範囲になった時点で、マウスへの投与を行った。マウスに、０時間で、３０μｇの配列番号９４または７５μｇの配列番号１１０のいずれかを皮下投与し、次いで、投与後０．５、２、４、８、及び２４時間に終末出血を採取し、個々の動物の血清に処理した。同一動物の腫瘍も採取し、下流の濃度分析のために急速凍結した。血清サンプルをヒトＩＬ－２特異的ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）アッセイによって分析した。腫瘍サンプルをホモジナイズし、同じ検出アッセイによって濃度を測定した。薬物動態パラメーターをＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈｏｅｎｉｘ）のノンコンパートメントモデルを使用して決定した。結果を表３６に示す。
ＣｍａｘとＡＵＣの両方について、腫瘍曝露と全身曝露の比（Ｔ／Ｓ）を比較すると、ｕＰＡＲ標的化ＩＬ－２である配列番号１１０は、非標的化対照分子の配列番号９４と比較して、より大きな腫瘍浸透の比率を示し、配列番号９４では、血清に対する腫瘍での曝露は同様の比率を示した。
ＩＬ－１０受容体を活性化するように設計された分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力－実施例６
ＳＴＡＴ３リン酸化は、ＩＬ－１０受容体の結合及び活性化に応じた受容体近位のシグナル伝達イベントである。ＩＬ－１０の融合体を含有する分子の効力を調べるために、ヒト末梢血単核細胞を漸増濃度のｓｃＩＬ－１０：ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ（ｓｃＩＬ１０ ３ａａリンカー））；＝ｓｃＩＬ－１０：ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ＋５ＡＡリンカー＋ｈｕＰＡ－ＡＴＦと同等である配列番号１３６）と１時間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、表面及び細胞内マーカーに対する蛍光標識抗体で染色し、マウスＢ細胞、単球、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を標準的なフローサイトメトリー技術を使用して検出した。データを表３７に示す。
両分子は、様々な細胞種にわたり、互いに非常に類似した効力を有することから、ＩＬ－１０分子のｕＰＡＲターゲティング部分（この場合、ヒトｕＰＡ－ＡＴＦ）との融合は、ヒト免疫細胞上に発現されるＩＬ－１０受容体に結合し、活性化する分子の能力に影響しないことを裏付けている。
ＩＬ－１２受容体を活性化するように設計されたｕＰＡＲ標的化分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力－実施例６
ＨＥＫ－ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ－１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＩＬ－１２誘導によるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１経路の活性化をモニタリングすることによって、生物活性ＩＬ－１２をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するために特別に設計されたヒト胚腎細胞である。この細胞株は、ＳＴＡＴ４誘導性プロモーターの制御下で、誘導性分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１β細胞を、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕ及び１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地中に５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を、様々な濃度のＩＬ－１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１９－ＩＬ－００５／ＣＦ）または配列番号１４１とともに、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートすることによってＳＥＡＰ産生を検出し、次いで、プレートリーダーで６３０ｎｍで読み取った。
配列番号１４１のヒトｕＰＡ－ＡＴＦ構築物に融合させた単鎖ヒトＩＬ－１２構築物は、野生型ヒトＩＬ－１２（１８ｐＭ）と比較して、同様の効力（２７ｐＭ）を有することから、ＩＬ－１２のｕＰＡ－ＡＴＦとの融合は、ＩＬ－１２受容体に結合し、活性化する分子のＩＬ－１２部分の能力に影響しないことが示唆される。
ヒト４－１ＢＢ受容体を活性化するように設計されたｕＰＡＲ標的化分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力－実施例６
４－１ＢＢリガンドを含有する融合タンパク質を、Ｐｒｏｍｅｇａ社の４－１ＢＢ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用してアッセイした。アッセイは、応答エレメントの下流で４－１ＢＢ及びルシフェラーゼを安定発現する４－１ＢＢエフェクター細胞を使用する。ルシフェラーゼの発現は、リガンドが受容体に結合すると誘導される。アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施した。用量反応曲線を、漸増濃度で試験分子をインキュベートし、発現されたルシフェラーゼから生成される光を測定することによって作成した。データを表３８に示す。
組み換えヒト４－１ＢＢリガンド単量体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２２９５－４Ｌ－０２５／ＣＦ）は、アッセイで活性を示さなかったことから、未架橋の４－１ＢＢＬ単量体は、通常４－１ＢＢＬは三量体として機能するため、４－１ＢＢを活性化することができないことが示唆される。Ｎ末端またはＣ末端にヒトｕＰＡ－ＡＴＦを融合させた連結４－１ＢＢＬ三量体（配列番号１３０及び配列番号１３１）は、０．１５ｎＭのＥＣ５０を有するヒトｕＰＡ－ＡＴＦに融合されていない連結４－１ＢＢＬ三量体分子（配列番号１２９）と比較して、より強力なＥＣ５０（及びより高い最大シグナル）を有している。これらの結果は、ヒトｕＰＡＲターゲティングドメインｕＰＡ－ＡＴＦとの融合により、おそらく細胞表面上のｕＰＡＲへの強力な結合によるアビディティの影響から、４－１ＢＢを介したシグナル伝達に２～３倍強力な活性がもたらされる可能性を示唆している。それにもかかわらず、４－１ＢＢＬとｕＰＡ－ＡＴＦの融合タンパク質は、４－１ＢＢに機能的に結合し、４－１ＢＢを介してシグナル伝達を行うことができる。
ヒト単球上のＧＭ－ＣＳＦ受容体を活性化するように設計された分子のｉｎｖｉｔｒｏにおける効力－実施例６
ＧＭ－ＣＳＦのヒト配列ベースの融合体を含有する分子の効力を評価するために、Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５９３．２（商標））を、漸増濃度の組み換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５－ＧＭ－０５０／ＣＦ）、配列番号１３８または配列番号１０３と３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を固定し、透過処理し、ｐＳＴＡＴ５に特異的な蛍光標識抗体で細胞内染色し、標準的なフローサイトメトリー技術を使用して分析した。データを表３９に示す。
組み換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）は、Ｕ９３７ ｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて１８．６ｐＭのＥＣ５０を示すように、ＳＴＡＴ５リン酸化の強力な誘導因子である。ヒトｕＰＡＲターゲティングドメインをＧＭ－ＣＳＦのＣ末端に融合させ、配列番号１３８とした。配列番号１３８は、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において、およそ２０倍強力であり、ＥＣ５０は、１．２８ｐＭであった。配列番号１３８と、漸増濃度のヒトｕＰＡＲターゲティングドメイン単独である配列番号１０３とをコインキュベーションすると、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ単独と同様に効力が低下した。これらの結果は、ｕＰＡＲターゲティングモチーフとＧＭ－ＣＳＦの融合が、受容体結合の結果としてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する融合タンパク質の能力に悪影響を与えず、むしろ、その活性を増強させるようであることを示唆している。
例示的な融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態
特定のヒト抗ｕＰＡＲ－ＩＬ－１２サブユニット融合タンパク質をマウス腫瘍モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏ分析した。具体的には、投与後のいくつかの時点で、マウスの血清及び腫瘍組織中の試験融合タンパク質のレベルを検出した。本セクションに使用した融合タンパク質を以下の表４０に示す。実験の詳細は、以下の表４１に概説する。
上記の研究に使用したモデルは、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＳＣ ＲＫＯヒト結腸直腸癌異種移植モデルであった。腫瘍モデルを作製するために、各マウスにＲＫＯ腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍サイズが約２５０ｍｍ３に達した時点で、無作為化に使用した。最終投与後０．５、１、４、２４、４８、７２時間に腫瘍及び血清サンプルを採取した。サンプル中のｐ３５、ｐ４０、またはｐ７０の検出には、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを製造プロトコルに従って使用した。
図１１に示されるように、各群で試験した融合タンパク質は、全ての試験時点で腫瘍組織中で検出され、レベルは比較的安定していた。データは、融合タンパク質が腫瘍組織で産生的に蓄積されることを示している。図１２に示されるように、特定の群では、血清中の融合タンパク質レベルが経時的に徐々に低下することから、融合タンパク質は、標的腫瘍組織中の融合タンパク質を除き、系から速やかに排出されることを示している。

Claims (202)

  1. ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質であって、
    （ａ）ｉ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）、ＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）、またはＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、
    ｉｉ）ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）、またはＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
    ｉｉｉ）ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）、またはＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
    （ｂ）ｉｖ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、
    ｖ）ＤＴＳ（配列番号７）、ＫＶＳ（配列番号１５）、ＡＡＴ（配列番号２３）、またはＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
    ｖｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）、ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）、ＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと
    を含む、前記抗原結合タンパク質。
  2. 前記ＶＨドメインが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  4. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＫＶＳ（配列番号１５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  5. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  6. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  7. ａ）前記ＶＨドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＨドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
    ｃ）前記ＶＨドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
    ｄ）前記ＶＨドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
    ｅ）前記ＶＨドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、
    ｆ）前記ＶＨドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、
    ｇ）前記ＶＨドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、
    ｈ）前記ＶＨドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または
    ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  8. 前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、アミノ酸リンカーにより結合される、請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
  9. 前記アミノ酸リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
  10. 前記アミノ酸リンカーが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）、またはＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２４６）を含む、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
  11. 前記抗原結合タンパク質が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、単一ドメイン抗体、またはナノボディを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  12. 配列番号５６～７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  13. 配列番号７２～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を更に含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  14. 配列番号４５、４６、４９、５３、または５４の抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４７、４８、５０、５１、５２、及び５５の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  15. ａ）前記抗体ＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記抗体ＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
    ｃ）前記抗体ＨＣが、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
    ｄ）前記抗体ＨＣが、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
    ｅ）前記抗体ＨＣが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、
    ｆ）前記抗体ＨＣが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    ｇ）前記抗体ＨＣが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    ｈ）前記抗体ＨＣが、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、または
    ｉ）前記抗体ＨＣが、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、
    請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
  16. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  17. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  18. 配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  19. 配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  20. 配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  21. 配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  22. 配列番号２３８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
    配列番号２３９のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  23. 前記抗原結合タンパク質が、約５×１０－８Ｍ未満、約１×１０－８Ｍ未満、約５×１０－９Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約５×１０－１０Ｍ未満、または約１×１０－１０Ｍ未満のＫＤでヒトｕＰＡＲに結合する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  24. 前記抗原結合タンパク質が、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲに結合する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  25. 前記その抗原結合タンパク質が、ｕＰＡＲリガンドに結合したヒトｕＰＡＲに結合する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  26. 前記抗原結合タンパク質が、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合し、それにより、前記抗原結合タンパク質に結合する蛍光標識抗体により検出される蛍光シグナルが生成され、ＥＣ５０値は、約０．１ｎＭ～約３．０ｎＭである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  27. 前記抗原結合タンパク質が、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合する、請求項２６に記載の抗原結合タンパク質。
  28. 前記抗原結合タンパク質が、ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインまたはヒトｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインに結合する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  29. 請求項１～２８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質と結合が競合する、その単離された抗原結合タンパク質。
  30. 請求項１～２８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する、その単離された抗原結合タンパク質。
  31. 請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  32. 請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  33. 請求項３２に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  34. 請求項３３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  35. 請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を産生する方法であって、前記抗原結合タンパク質を発現する条件下で、請求項３４に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  36. 前記宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を単離することを更に含む、請求項３５に記載の方法。
  37. ｕＰＡＲの活性または発現に関連する疾患または障害を治療または予防するための、ｕＰＡＲに特異的に結合する抗原結合タンパク質の使用であって、治療上有効な量の請求項３１に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記使用。
  38. がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の請求項３１に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  39. （ｉ）請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントと
    を含む、融合タンパク質。
  40. 前記抗原結合タンパク質及び前記サイトカインまたはそのバリアントが、アミノ酸リンカーにより連結される、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  41. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の融合タンパク質。
  42. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、少なくとも１つのインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）サブユニットを含む、請求項３９または４０に記載の融合タンパク質。
  43. 前記ＩＬ－１２サブユニットが、ｐ３５及びｐ４０の一方または両方を含む、請求項４２に記載の融合タンパク質。
  44. 前記ｐ３５が、配列番号８１の位置Ｍ１２、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、Ｌ１６１、及びＤ１８８に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
  45. 前記アミノ酸置換が、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦもしくはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４４に記載の融合タンパク質。
  46. 前記アミノ酸置換が、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む、請求項４４または４５に記載の融合タンパク質。
  47. 前記アミノ酸置換が、Ｓ２７Ｄ及びＤ１８８Ｎを含む、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  48. 前記アミノ酸置換が、Ｃ７４Ｋを含む、請求項４４～４７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  49. 前記アミノ酸置換が、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む、請求項４４～４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  50. 前記ｐ３５が、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含む、請求項４４～４９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  51. 前記ｐ４０が、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
  52. 前記Ｃ１７７のアミノ酸置換が、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される、請求項５１に記載の融合タンパク質。
  53. 前記Ｃ２５２のアミノ酸置換が、Ｃ２５２Ｓである、請求項５１または５２に記載の融合タンパク質。
  54. 前記ｐ４０が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含む、請求項５１または５２に記載の融合タンパク質。
  55. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、アミノ酸リンカーによって結合されたｐ３５及びｐ４０サブユニットを含む単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を含む、請求項３９または４０に記載の融合タンパク質。
  56. 前記アミノ酸リンカーが、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５６）を含む、請求項５５に記載の融合タンパク質。
  57. 前記ｓｃＩＬ－１２が、配列番号８８または配列番号８９のアミノ酸配列を含む、請求項５５または５６に記載の融合タンパク質。
  58. 請求項３９～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
  59. 請求項３９～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  60. 請求項５９に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  61. 請求項６０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  62. 請求項３９～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、前記融合タンパク質を発現する条件下で、請求項６１に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  63. 前記宿主細胞から前記融合タンパク質を単離することを更に含む、請求項６２に記載の方法。
  64. ｕＰＡＲの活性または発現に関連する疾患または障害を治療または予防するための、ｕＰＡＲに特異的に結合する融合タンパク質の使用であって、治療上有効な量の請求項５８に記載の医薬組成物または請求項３９～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記使用。
  65. がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の請求項５２に記載の医薬組成物または請求項３９～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  66. 前記医薬組成物または融合タンパク質が、サイトカインもしくはそのバリアントまたは第２の融合タンパク質と同時に投与され、ここで、前記第２の融合タンパク質は、前記第１の融合タンパク質とは異なるサイトカインまたはそのバリアントを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記医薬組成物または融合タンパク質が、サイトカインもしくはそのバリアントまたは第２の融合タンパク質と逐次的に投与され、ここで、前記第２の融合タンパク質は、前記第１の融合タンパク質とは異なるサイトカインまたはそのバリアントを含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットを含む、請求項６６または６７に記載の方法。
  69. 前記患者の腫瘍における前記融合タンパク質のクリアランス速度が、前記患者の血清における前記融合タンパク質のクリアランス速度よりも遅い、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットを前記患者に投与することを含み、
    （ａ）前記融合タンパク質は、
    （ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットもしくはそのバリアント、またはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットもしくはそのバリアントとを含み、
    （ｂ）前記非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットもしくはそのバリアント、またはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットもしくはそのバリアントを含み、
    ここで、前記融合タンパク質がＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントを含む場合、前記非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントを含み、前記融合タンパク質がＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントを含む場合、前記非融合ＩＬ－１２サブユニットは、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントを含む、前記方法。
  71. 前記融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットが、逐次的に投与される、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記融合タンパク質及び非融合ＩＬ－１２サブユニットの一方または両方が、静脈内投与される、請求項７０または７１に記載の方法。
  73. 前記融合タンパク質が最初に投与され、続いて、前記融合タンパク質が前記患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、前記非融合ＩＬ－１２サブユニットが投与される、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記融合タンパク質が最初に投与され、続いて、前記融合タンパク質の濃度が前記患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、前記非融合ＩＬ－１２サブユニットが投与される、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
  75. がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を前記患者に投与することを含み、
    （ａ）前記第１の融合タンパク質は、
    （ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）上の第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントとを含み、
    （ｂ）前記第２の融合タンパク質は、
    （ｉ）ｕＰＡＲ上の第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントとを含む、前記方法。
  76. 前記第１のエピトープ及び第２のエピトープが、同じである、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記第１のエピトープ及び第２のエピトープが、異なる、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が、逐次的に投与される、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方が、静脈内投与される、請求項７５～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記第１の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、前記第１の融合タンパク質が前記患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、前記第２の融合タンパク質が投与される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記第１の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、前記第１の融合タンパク質の濃度が前記患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、前記第２の融合タンパク質が投与される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記第２の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、前記第２の融合タンパク質が前記患者の腫瘍に蓄積するのに十分な時間量が経過した後に、前記第１の融合タンパク質が投与される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記第２の融合タンパク質が最初に投与され、続いて、前記第２の融合タンパク質の濃度が前記患者の血清中で実質的に減少するのに十分な時間量が経過した後に、前記第１の融合タンパク質が投与される、請求項７５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方が、
    ａ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
    ｂ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインと
    を含む、抗原結合タンパク質を含む、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方が、
    ａ）ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
    ｂ）ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインと
    を含む、抗原結合タンパク質を含む、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方または両方が、
    ａ）ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＨドメインと、
    ｂ）ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ＶＬドメインと
    を含む、抗原結合タンパク質を含む、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。
  87. 第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含む組み合わせであって、
    （ａ）前記第１の融合タンパク質は、
    （ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）上の第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットまたはそのバリアントとを含み、
    （ｂ）前記第２の融合タンパク質は、
    （ｉ）ｕＰＡＲ上の第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットまたはそのバリアントとを含む、前記組み合わせ。
  88. 前記第１のエピトープ及び第２のエピトープが、同じである、請求項８７に記載の組み合わせ。
  89. 前記第１のエピトープ及び第２のエピトープが、異なる、請求項８７に記載の組み合わせ。
  90. （ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質と、
    （ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントと
    を含む、融合タンパク質。
  91. 前記抗原結合タンパク質及び前記サイトカインまたはそのバリアントが、アミノ酸リンカーにより連結される、請求項９０に記載の融合タンパク質。
  92. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１２からなる群から選択される、請求項９０または９１に記載の融合タンパク質。
  93. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、少なくとも１つのインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）サブユニットを含む、請求項９０または９１に記載の融合タンパク質。
  94. 前記ＩＬ－１２サブユニットが、ｐ３５及びｐ４０の一方または両方を含む、請求項９３に記載の融合タンパク質。
  95. 前記ｐ３５が、配列番号８１の位置Ｍ１２、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、Ｌ１６１、及びＤ１８８に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項９４に記載の融合タンパク質。
  96. 前記アミノ酸置換が、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦもしくはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項９５に記載の融合タンパク質。
  97. 前記アミノ酸置換が、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む、請求項９５または９６に記載の融合タンパク質。
  98. 前記アミノ酸置換が、Ｓ２７Ｄ及びＤ１８８Ｎを含む、請求項９５～９７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  99. 前記アミノ酸置換が、Ｃ７４Ｋを含む、請求項９５～９８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  100. 前記アミノ酸置換が、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む、請求項９５～９９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  101. 前記ｐ３５が、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含む、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  102. 前記ｐ４０が、配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項９４に記載の融合タンパク質。
  103. 前記Ｃ１７７のアミノ酸置換が、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される、請求項１０２に記載の融合タンパク質。
  104. 前記Ｃ２５２のアミノ酸置換が、Ｃ２５２Ｓである、請求項１０２または１０３に記載の融合タンパク質。
  105. 前記ｐ４０が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含む、請求項１０２～１０４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  106. 前記サイトカインまたはそのバリアントが、アミノ酸リンカーによって結合されたｐ３５及びｐ４０サブユニットを含む単鎖ＩＬ－１２（ｓｃＩＬ－１２）を含む、請求項９０～９３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  107. 前記アミノ酸リンカーが、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５６）を含む、請求項１０６に記載の融合タンパク質。
  108. 前記ｓｃＩＬ－１２が、配列番号８８または配列番号８９のアミノ酸配列を含む、請求項１０６または１０７に記載の融合タンパク質。
  109. 前記抗原結合タンパク質が、
    （ａ）ｉ）ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）、ＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）、またはＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、
    ｉｉ）ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）、またはＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
    ｉｉｉ）ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）、またはＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
    （ｂ）ｉｖ）ＳＳＶＳＹ（配列番号６）、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、
    ｖ）ＤＴＳ（配列番号７）、ＫＶＳ（配列番号１５）、ＡＡＴ（配列番号２３）、またはＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び
    ｖｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）、ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）、ＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと
    を含む、請求項９０～１０８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  110. 前記ＶＨドメインが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
  111. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＦＮＩＫＤＥＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＤＰＥＮＧＤＴ（配列番号４）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＴＧＧＮＹＶＧＷＦＰＹ（配列番号５）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＳＳＶＳＹ（配列番号６）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳ（配列番号７）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＷＳＳＮＰＰＹ（配列番号８）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
  112. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＦＳＬＴＮＹＧ（配列番号１１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＷＳＤＧＧＴ（配列番号１２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＲＧＧＲＳＤＬＦＡＹ（配列番号１３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１４）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＫＶＳ（配列番号１５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号１６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
  113. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＮＴＦＴＤＹＧ（配列番号１９）またはＧＴＴＦＴＤＹＧ（配列番号４１）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＮＴＮＴＧＥＰ（配列番号２０）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＨＹＳＦＤＹ（配列番号２１）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＥＮＩＹＳＮ（配列番号２２）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＡＡＴ（配列番号２３）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号２４）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
  114. ａ）前記ＶＨドメインが、ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２７）のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＩＹＰＲＳＧＮＴ（配列番号２８）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＡＧＫＤＹＧＳＴＹＡＤＹ（配列番号２９）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬドメインが、ＳＳＶＳＳＲＹ（配列番号３０）のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＧＴＳ（配列番号３１）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＨＳＤＰＬＴ（配列番号３２）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
  115. ａ）前記ＶＨドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＨドメインが、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
    ｃ）前記ＶＨドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、
    ｄ）前記ＶＨドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、
    ｅ）前記ＶＨドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、
    ｆ）前記ＶＨドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、
    ｇ）前記ＶＨドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、
    ｈ）前記ＶＨドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、または
    ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１０９～１１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  116. 前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、アミノ酸リンカーにより結合される、請求項１１５に記載の融合タンパク質。
  117. 前記アミノ酸リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１４８）を含み、式中、ｎは、１～５の整数である、請求項１１６に記載の融合タンパク質。
  118. 前記アミノ酸リンカーが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５０）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２４６）を含む、請求項１１６に記載の融合タンパク質。
  119. 前記抗原結合タンパク質が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄＡｂ断片、単一ドメイン抗体、またはナノボディを含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  120. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号５６～７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９０～１１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  121. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号７２～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を更に含む、請求項９０～１１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  122. 配列番号４５、４６、４９、５３、または５４の抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と、配列番号４７、４８、５０、５１、５２、及び５５の抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを含む、請求項９０～１１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  123. ａ）前記抗体ＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記抗体ＨＣが、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
    ｃ）前記抗体ＨＣが、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
    ｄ）前記抗体ＨＣが、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、
    ｅ）前記抗体ＨＣが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、
    ｆ）前記抗体ＨＣが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
    ｇ）前記抗体ＨＣが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、
    ｈ）前記抗体ＨＣが、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、または
    ｉ）前記抗体ＨＣが、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、前記抗体ＬＣが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、
    請求項１２２に記載の融合タンパク質。
  124. 配列番号１８９のアミノ酸配列を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  125. 配列番号２１３のアミノ酸配列を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  126. 配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  127. 配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  128. 配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  129. 配列番号１９４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  130. 配列番号２３８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
    配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
    配列番号２３９のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と
    を含む、請求項９０～１１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  131. 前記抗原結合タンパク質が、約５×１０－８Ｍ未満、約１×１０－８Ｍ未満、約５×１０－９Ｍ未満、約１×１０－９Ｍ未満、約５×１０－１０Ｍ未満、または約１×１０－１０Ｍ未満のＫＤでヒトｕＰＡＲに結合する、請求項９０～１３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  132. 前記抗原結合タンパク質が、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲに結合する、請求項９０～１３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  133. 前記抗原結合タンパク質が、ｕＰＡＲリガンドに結合したヒトｕＰＡＲに結合する、請求項９０～１３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  134. 前記抗原結合タンパク質が、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合し、それにより、前記抗体またはその断片に結合する蛍光標識抗体により検出される蛍光シグナルが生成され、ＥＣ５０値は、約０．１ｎＭ～約３．０ｎＭである、請求項９０～１３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  135. 前記抗原結合タンパク質が、ｕＰＡＲリガンドの存在下で、ヒトｕＰＡＲ発現細胞上のヒトｕＰＡＲに結合する、請求項９０～１３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  136. 前記抗原結合タンパク質が、ヒトｕＰＡＲ ＤＩＩ－ＤＩＩＩドメインまたはヒトｕＰＡＲ ＤＩＩＩドメインに結合する、請求項９０～１３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  137. 配列番号８１の位置Ｓ２７、Ｎ２８、Ｑ３５、Ｆ３９、Ｓ４４、Ｃ７４、Ｍ１１１、Ｖ１１４、Ｍ１１９、Ｍ１４５、Ｆ１５０、及びＬ１６１に１つ以上のアミノ酸置換を含む、操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  138. Ｓ２７及びＤ１８８の一方または両方のアミノ酸置換を更に含む、請求項１３７に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  139. 前記アミノ酸置換が、Ｍ１２Ｓ、Ｓ２７Ｄ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３５Ｅ、Ｆ３９ＤもしくはＦ３９Ｈ、Ｓ４４Ｋ、Ｃ７４Ｋ、Ｃ７４Ｄ、Ｃ７４Ｗ、Ｃ７４ＹもしくはＣ７４Ｑ、Ｍ１１１ＦもしくはＭ１１１Ｗ、Ｖ１１４Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１４５Ｌ、Ｆ１５０Ｙ、Ｌ１６１ＤもしくはＬ１６１Ｑ、Ｄ１８８Ｎ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３７または１３８に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  140. 前記アミノ酸置換が、Ｎ２８Ｒ及びＱ３５Ｅを含む、請求項１３７～１３９のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  141. 前記アミノ酸置換が、Ｃ７４Ｋを含む、請求項１３７～１４０のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  142. 前記アミノ酸置換が、Ｓ２７Ｄ、Ｃ７４Ｋ、及びＤ１８８Ｎを含む、請求項１３７～１４１のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  143. 配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のアミノ酸配列を含む、請求項１３７～１４２のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチド。
  144. （ｉ）請求項１３７～１４３のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドと、
    （ｉｉ）１つ以上の融合パートナーと
    を含む、融合タンパク質。
  145. 前記１つ以上の融合パートナーが、前記操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの凝集を低減する部分を含む、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  146. 前記１つ以上の融合パートナーが、前記操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの発現を増加させる部分を含む、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  147. 前記１つ以上の融合パートナーが、前記操作されたＩＬ－１２ ｐ３５ポリペプチドの血清半減期を増加させる部分を含む、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  148. 前記１つ以上の融合パートナーが、ターゲティング部分を含む、請求項１４４～１４７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  149. 前記１つ以上の融合パートナーが、血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または抗原結合タンパク質を含む、請求項１４４～１４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  150. 前記抗原結合タンパク質が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する、請求項１４９に記載の融合タンパク質。
  151. 配列番号８４の位置Ｃ１７７及びＣ２５２に１つ以上のアミノ酸置換を含む、操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチド。
  152. 前記Ｃ１７７のアミノ酸置換が、Ｃ１７７Ｓ、Ｃ１７７Ｆ、Ｃ１７７Ｍ、Ｃ１７７Ｈ、Ｃ１７７Ｉ、またはＣ１７７Ｑからなる群から選択される、請求項１５１に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチド。
  153. 前記Ｃ２５２のアミノ酸置換が、Ｃ２５２Ｓである、請求項１５１または１５２に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチド。
  154. 前記ｐ４０が、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含む、請求項１５１～１５３のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチド。
  155. （ｉ）請求項１５１～１５４のいずれか１項に記載の操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドと、
    （ｉｉ）１つ以上の融合パートナーと
    を含む、融合タンパク質。
  156. 前記１つ以上の融合パートナーが、前記操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの凝集を低減する部分を含む、請求項１５５に記載の融合タンパク質。
  157. 前記１つ以上の融合パートナーが、前記操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの発現を増加させる部分を含む、請求項１５５に記載の融合タンパク質。
  158. 前記１つ以上の融合パートナーが、前記操作されたＩＬ－１２ ｐ４０ポリペプチドの血清半減期を増加させる部分を含む、請求項１５５に記載の融合タンパク質。
  159. 前記１つ以上の融合パートナーが、ターゲティング部分を含む、請求項１５５～１５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  160. 前記１つ以上の融合パートナーが、血清アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または抗原結合タンパク質を含む、請求項１５５～１５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  161. 前記抗原結合タンパク質が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）に特異的に結合する、請求項１６０に記載の融合タンパク質。
  162. （ｉ）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチドと、
    （ｉｉ）サイトカインまたはそのバリアントと
    を含む、融合タンパク質。
  163. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、アミノ酸リンカーにより前記サイトカインに連結される、請求項１６２に記載の融合タンパク質。
  164. 前記サイトカインが、その機能性断片、その機能性バリアントまたはその循環置換バリアントを含む、請求項１６２または１６３に記載の融合タンパク質。
  165. 前記サイトカインが、１つ以上の任意選択のアミノ酸リンカーを介して、前記サイトカインが結合特異性を有する受容体の全部または一部に連結される、請求項１６２～１６４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  166. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、ｕＰＡＲに特異的に結合することが可能なウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）ポリペプチドまたはそのバリアントを含む、請求項１６２～１６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  167. 前記ｕＰＡバリアントが、ｕＰＡのアミノ酸末端断片（ＡＴＦ）である、請求項１６６に記載の融合タンパク質。
  168. 前記ＡＴＦが、配列番号９１に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１６７に記載の融合タンパク質。
  169. 前記ｕＰＡのＡＴＦが、１つ以上のアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１６７または１６８に記載の融合タンパク質。
  170. 前記ｕＰＡは、配列番号９０に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１６６に記載の融合タンパク質。
  171. 前記サイトカインが循環置換ＩＬ－２であり、前記受容体がＩＬ－２Ｒαである、請求項１６２～１７０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  172. 前記サイトカインが循環置換ＩＬ－１５であり、前記受容体がＩＬ－１５Ｒαである、請求項１６２～１７０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  173. 前記サイトカインが循環置換ＩＬ－１であり、前記受容体がＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－１ＲＩＩである、請求項１６２～１７０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  174. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、抗ｕＰＡＲ抗原結合タンパク質である、請求項１６２～１６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  175. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、抗ｕＰＡＲ抗体のｓｃＦｖ断片である、請求項１６２～１６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  176. 配列番号９８、９９、１００、１０６、１０７、１１１、及び１１３からなる群から選択される、請求項１６２～１６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  177. 配列番号９８、９９、１１１、及び１１２からなる群から選択される、請求項１６２～１６５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  178. 前記ｕＰＡＲ結合剤、サイトカイン及び受容体が、ヒト起源のものである、請求項１６２～１７７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  179. がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の請求項１６２～１７８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  180. 前記がんが、黒色腫、癌腫、芽細胞腫及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項１７９に記載の方法。
  181. 炎症性疾患を治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の請求項１６２～１７８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  182. 前記炎症性疾患が、ＩＢＤ及びＲＡからなる群から選択される、請求項１８１に記載の方法。
  183. 請求項１６２～１７８のいずれか１項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  184. １つ以上の任意選択のアミノ酸リンカーを介して、
    （ｉ）サイトカインもしくはそのバリアント、または
    （ｉｉ）チェックポイント分子モジュレーター
    に連結されたウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
  185. 前記サイトカインが、その機能性断片、その機能性バリアントまたはその循環置換バリアントを含む、請求項１８４に記載の融合タンパク質。
  186. 前記サイトカインが、１つ以上の任意選択のアミノ酸リンカーを介して、前記サイトカインが結合特異性を有する受容体の全部または一部に連結される、請求項１８４または１８５に記載の融合タンパク質。
  187. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、ｕＰＡＲに特異的に結合することが可能なウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）ポリペプチドまたはそのバリアントを含む、請求項１８４～１８６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  188. 前記ｕＰＡバリアントが、ｕＰＡのアミノ酸末端断片（ＡＴＦ）である、請求項１８７に記載の融合タンパク質。
  189. 前記ＡＴＦが、配列番号９１に記載されるアミノ酸配列、または配列番号９１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８７または１８８に記載の融合タンパク質。
  190. 前記ｕＰＡのＡＴＦが、１つ以上のアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１８８または１８９に記載の融合タンパク質。
  191. 前記サイトカインまたはチェックポイント分子モジュレーターが、ＩＬ－２、循環置換ＩＬ－２（ｃｐＩＬ－２）、ＩＬ－１５、循環置換ＩＬ１５（ｃｐＩＬ－１５）、ＩＬ－６、循環置換ＩＬ－６（ｃｐＩＬ－６）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、４－１ＢＢＢ（ＣＤ１３１）またはそのリガンド、ＯＸ４０またはそのリガンド、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１抗体、ＣＴＬＡ－４、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＧＩＴＲまたはそのリガンド、ＩＣＯＳまたはそのリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０またはそのリガンドからなる群から選択される、請求項１８４～１９０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  192. がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の請求項１８４～１９１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  193. 前記がんが、黒色腫及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項１９２に記載の方法。
  194. 炎症性疾患を治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療上有効な量の請求項１８４～１９１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  195. 前記炎症性疾患が、ＩＢＤ及びＲＡからなる群から選択される、請求項１９４に記載の方法。
  196. 請求項１８４～１９１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  197. 患者のがんを治療するための免疫療法の方法であって、請求項１６２または１８４に記載の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  198. 標的がん療法を前記患者に行うことを更に含む、請求項１９７に記載の方法。
  199. 化学療法、放射線療法またはその両方から選択される従来の細胞傷害性療法を前記患者に行うことを更に含む、請求項１９８に記載の方法。
  200. がんワクチン、チェックポイント阻害剤またはモノクローナル抗体から選択される免疫療法を行うことを更に含む、請求項１９７～１９９のいずれか１項に記載の方法。
  201. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、Ｍ２５、またはアミノ酸レベルで少なくとも８０％の同一性を有するＭ２５に対して相同なアミノ酸配列を含む、請求項１６２または１８４に記載の融合タンパク質。
  202. 前記ｕＰＡＲ結合ポリペプチドが、Ｐ２５、またはアミノ酸レベルで少なくとも８０％の同一性を有するＰ２５に対して相同なアミノ酸配列を含む、請求項１６２または１８４に記載の融合タンパク質。
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