CN117440972A - Upar抗体和具有所述抗体的融合蛋白 - Google Patents

Upar抗体和具有所述抗体的融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本公开提供了尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽(例如，uPAR抗原结合蛋白)，以及包含所述uPAR结合多肽和细胞因子或其变体的融合蛋白。本公开还提供了包含本公开的uPAR结合多肽和融合蛋白的药物组合物以及用其治疗癌症的方法。本公开还提供了工程化IL‑12p35和p40多肽。

Description

UPAR抗体和具有所述抗体的融合蛋白
相关申请
本申请要求2021年3月24日提交的美国临时专利申请序列号63/165,313的权益，该美国临时专利申请的全部公开内容据此通过引入并入本文。
背景技术
免疫疗法是一种快速新兴的癌症治疗方式。免疫疗法分为以下几大类：(i)能够适当地激动或拮抗调节分子以增强期望的免疫应答(例如，激动刺激性免疫受体)或抑制不期望的免疫应答(例如，拮抗抑制性免疫检查点分子)的免疫检查点分子调节剂；(ii)帮助调节和指导免疫系统的细胞因子、蛋白质分子；以及(iii)对特异性抗原/病原体产生免疫记忆应答的癌症疫苗、分子(或组合)。虽然有前景的免疫疗法现在已进入临床，并且正在开发令人鼓舞的新药物/药剂管线，但是仍期望开发新的免疫疗法来单独使用或与其他类别的免疫疗法、靶向疗法和常规细胞毒性疗法组合使用。
发明内容
一方面，本公开提供了一种与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的分离的抗原结合蛋白，其包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含：
i)GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)、GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)、GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)、GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)或GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列；
ii)IDPENGDT(SEQ ID NO:4)、IWSDGGT(SEQ ID NO:12)、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)或IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列；以及
iii)TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)、AHYSFDY(SEQ IDNO:21)或AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含：
iv)SSVSY(SEQ ID NO:6)、QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)、ENIYSN(SEQ ID NO:22)、SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列；
v)DTS(SEQ ID NO:7)、KVS(SEQ ID NO:15)、AAT(SEQ ID NO:23)或GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列；以及
vi)QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)、FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)、QHFWGTPWT(SEQ IDNO:24)、QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在所述抗原结合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQID NO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
在所述抗原结合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)的HCDR1氨基酸序列、IWSDGGT(SEQID NO:12)的HCDR2氨基酸序列、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)的LCDR1氨基酸序列、KVS(SEQID NO:15)的LCDR2氨基酸序列和FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)的LCDR3氨基酸序列。
在所述抗原结合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ IDNO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
在所述抗原结合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在所述抗原结合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
b)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；
c)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
d)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；
e)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列；
f)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；
g)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；
h)所述VH结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列；或者
i)所述VH结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VH结构域和VL结构域通过氨基酸接头附接。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:149)、GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)或GGGSGGGGSG(SEQ ID NO:246)。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)、dAb片段、单结构域抗体或纳米抗体。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:56-71中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白还包含SEQ ID NO:72-78中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:45、46、49、53或54的抗体重链(HC)氨基酸序列和SEQ ID NO:47、48、50、51、52和55的抗体轻链(LC)氨基酸序列。
在所述抗原结合蛋白的某些实施方案中：
a)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
b)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
c)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
d)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
f)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
g)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
h)所述抗体HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或者
i)所述抗体HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链；以及包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的第三多肽链。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白以小于约5x10-8M、小于约1x10-8M、小于约5x10-9M、小于约1x10-9M、小于约5x10-10M或小于约1x10-10M的KD结合人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合uPAR配体结合的人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR，从而产生用与所述抗原结合蛋白结合的荧光标记抗体检测的荧光信号，EC50值为约0.1nM至约3.0nM。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合人uPAR DII-DIII结构域或人uPARDIII结构域。
一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白，其与以上叙述的抗原结合蛋白竞争结合。
另一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白，其与以上叙述的抗原结合蛋白结合相同表位。
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含以上叙述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂。
一方面，本公开提供了一种分离的核酸分子，其包含编码以上叙述的抗原结合蛋白的多核苷酸序列。
一方面，本公开提供了一种表达载体，其包含以上叙述的多核苷酸序列。
一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含以上叙述的表达载体。
另一方面，本公开提供了一种产生上述抗原结合蛋白的方法，其包括在表达所述抗原结合蛋白的条件下培养以上叙述的宿主细胞。
在某些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞中分离所述抗原结合蛋白。
一方面，本公开提供了与uPAR特异性结合的抗原结合蛋白用于治疗或预防与uPAR活性或表达相关的疾病或病症的用途，所述用途包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的以上叙述的药物组合物。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的以上叙述的药物组合物。
一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)以上叙述的抗原结合蛋白；以及(ii)细胞因子或其变体。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述抗原结合蛋白和所述细胞因子或其变体通过氨基酸接头连接。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述细胞因子或其变体选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10或IL-12。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含至少一个白介素-12(IL-12)亚基。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述IL-12亚基包含p35和p40中的一种或两种。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述p35包含在SEQ ID NO:81的位置M12、S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150、L161和D188处的一个或多个氨基酸取代。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D和D188N。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述氨基酸取代包括C74K。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述p35包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述p40包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述C252氨基酸取代是C252S。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述p40包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含单链IL-12(scIL-12)，所述scIL-12包含通过氨基酸接头附接的p35和p40亚基。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQID NO:156)。
在所述融合蛋白的某些实施方案中，所述scIL-12包含SEQ ID NO:88或SEQ IDNO:89的氨基酸序列。
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含以上叙述的融合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂。
一方面，本公开提供了一种分离的核酸分子，其包含编码以上叙述的融合蛋白的多核苷酸序列。
一方面，本公开提供了一种表达载体，其包含以上叙述的多核苷酸序列。
一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含以上叙述的表达载体。
另一方面，本公开提供了一种产生以上叙述的融合蛋白的方法，其包括在表达所述融合蛋白的条件下培养以上叙述的宿主细胞。
在某些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞中分离所述融合蛋白。
一方面，本公开提供了与uPAR特异性结合的融合蛋白用于治疗或预防与uPAR活性或表达相关的疾病或病症的用途，所述用途包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的以上叙述的药物组合物或以上叙述的融合蛋白。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的以上叙述的药物组合物或以上叙述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述药物组合物或融合蛋白与细胞因子或其变体或第二融合蛋白同时施用，其中所述第二融合蛋白包含与所述第一融合蛋白不同的细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述药物组合物或融合蛋白与细胞因子或其变体或第二融合蛋白顺序施用，其中所述第二融合蛋白包含与所述第一融合蛋白不同的细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含IL-12p35亚基或IL-12p40亚基。
在某些实施方案中，所述患者的肿瘤中的所述融合蛋白清除率低于所述患者的血清中的所述融合蛋白清除率。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的融合蛋白和非融合IL-12亚基，其中：
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体，或IL-12p40亚基或其变体；并且
(b)非融合IL-12亚基包含IL-12p35亚基或其变体，或IL-12p40亚基或其变体，
其中当所述融合蛋白包含IL-12p35亚基或其变体时，所述非融合IL-12亚基包含IL-12p40亚基或其变体，并且当所述融合蛋白包含IL-12p40亚基或其变体时，所述非融合IL-12亚基包含IL-12p35亚基或其变体。
在某些实施方案中，所述融合蛋白和非融合IL-12亚基顺序施用。
在某些实施方案中，所述融合蛋白和非融合IL-12亚基中的一种或两种静脉内施用。
在某些实施方案中，首先施用所述融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述非融合IL-12亚基。
在某些实施方案中，首先施用所述融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述非融合IL-12亚基。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中：
(a)所述第一融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)上的第一表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体；并且
(b)所述第二融合蛋白包含：
(i)与uPAR上的第二表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p40亚基或其变体。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是相同的。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是不同的。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白顺序施用。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种静脉内施用。
在某些实施方案中，首先施用所述第一融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第一融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述第二融合蛋白。
在某些实施方案中，首先施用所述第一融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第一融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述第二融合蛋白。
在某些实施方案中，首先施用所述第二融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第二融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述第一融合蛋白。
在某些实施方案中，首先施用所述第二融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第二融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述第一融合蛋白。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种包含抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQID NO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种包含抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ ID NO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种包含抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQID NO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
一方面，本公开提供了一种包含第一融合蛋白和第二融合蛋白的组合，其中：
(a)所述第一融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)上的第一表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体；并且
(b)所述第二融合蛋白包含：
(i)与uPAR上的第二表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p40亚基或其变体。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是相同的。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是不同的。
一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的抗原结合蛋白；以及(ii)细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白和所述细胞因子或其变体通过氨基酸接头连接。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10或IL-12。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含至少一个白介素-12(IL-12)亚基。
在某些实施方案中，所述IL-12亚基包含p35和p40中的一种或两种。
在某些实施方案中，所述p35包含在SEQ ID NO:81的位置M12、S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150、L161和D188处的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D和D188N。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括C74K。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
在某些实施方案中，所述p35包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述p40包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
在某些实施方案中，所述C252氨基酸取代是C252S。
在某些实施方案中，所述p40包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含单链IL-12(scIL-12)，所述scIL-12包含通过氨基酸接头附接的p35和p40亚基。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:156)。
在某些实施方案中，所述scIL-12包含SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含：
i)GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)、GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)、GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)、GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)或GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列；
ii)IDPENGDT(SEQ ID NO:4)、IWSDGGT(SEQ ID NO:12)、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)或IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列；以及
iii)TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)、AHYSFDY(SEQ IDNO:21)或AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含：
iv)SSVSY(SEQ ID NO:6)、QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)、ENIYSN(SEQ ID NO:22)、SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列；
v)DTS(SEQ ID NO:7)、KVS(SEQ ID NO:15)、AAT(SEQ ID NO:23)或GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列；以及
vi)QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)、FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)、QHFWGTPWT(SEQ IDNO:24)、QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQID NO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)的HCDR1氨基酸序列、IWSDGGT(SEQID NO:12)的HCDR2氨基酸序列、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)的LCDR1氨基酸序列、KVS(SEQID NO:15)的LCDR2氨基酸序列和FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)的LCDR3氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ IDNO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
b)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；
c)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
d)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；
e)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列；
f)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；
g)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；
h)所述VH结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列；或者
i)所述VH结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VH结构域和VL结构域通过氨基酸接头附接。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:149)、GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)或GGGSGGGGSG(SEQ ID NO:246)。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)、dAb片段、单结构域抗体或纳米抗体。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:56-71中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白还包含SEQ ID NO:72-78中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:45、46、49、53或54的抗体重链(HC)氨基酸序列和SEQ ID NO:47、48、50、51、52和55的抗体轻链(LC)氨基酸序列。
在所述融合蛋白的某些实施方案中：
a)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
b)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
c)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
d)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
f)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
g)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
h)所述抗体HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或者
i)所述抗体HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的第一多肽链；以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第二多肽链。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链；以及包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的第三多肽链。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白以小于约5x10-8M、小于约1x10-8M、小于约5x10-9M、小于约1x10-9M、小于约5x10-10M或小于约1x10-10M的KD结合人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合uPAR配体结合的人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR，从而产生用与所述抗体或其片段结合的荧光标记抗体检测的荧光信号，EC50值为约0.1nM至约3.0nM。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合人uPAR DII-DIII结构域或人uPARDIII结构域。
一方面，本公开提供了一种工程化IL-12p35多肽，其包含在SEQ ID NO:81的位置S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150和L161处的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述工程化IL-12p35多肽还包含S27和D188氨基酸取代中的一种或两种。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括C74K。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
在某些实施方案中，所述工程化IL-12p35多肽包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)以上叙述的工程化IL-12p35多肽；以及(ii)一种或多种融合配偶体。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含减少所述工程化IL-12p35多肽的聚集的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p35多肽的表达的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p35多肽的血清半衰期的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含靶向部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)或抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合。
一方面，本公开提供了一种工程化IL-12p40多肽，其包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
在某些实施方案中，所述C252氨基酸取代是C252S。
在某些实施方案中，所述p40包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)以上叙述的工程化IL-12p40多肽；以及(ii)一种或多种融合配偶体。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含减少所述工程化IL-12p40多肽的聚集的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p40多肽的表达的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p40多肽的血清半衰期的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含靶向部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)或抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合。
一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽；以及(ii)细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽通过氨基酸接头与所述细胞因子连接。
在某些实施方案中，所述细胞因子包括其功能片段、其功能变体或其环状排列的变体。
在某些实施方案中，所述细胞因子经由一个或多个任选的氨基酸接头与所述细胞因子对其具有结合特异性的受体的全部或部分连接。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽包含能够特异性结合uPAR的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)多肽或其变体。
在某些实施方案中，所述uPA变体是uPA的氨基酸末端片段(ATF)。
在某些实施方案中，所述ATF具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，或与如SEQID NO:91所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，uPA的所述ATF包含一个或多个氨基酸取代或缺失。
在某些实施方案中，所述uPA具有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO:90所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述细胞因子是环状排列的IL-2，并且所述受体是IL-2Rα。
在某些实施方案中，所述细胞因子是环状排列的IL-15，并且所述受体是IL-15Rα。
在某些实施方案中，所述细胞因子是环状排列的IL-1，并且所述受体是IL-1RI、IL-1RII。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽是抗uPAR抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽是抗uPAR抗体的scFv片段。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:98、99、100、106、107、111和113。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:98、99、111和112。
在某些实施方案中，所述uPAR结合剂、细胞因子和受体是人源的。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的以上叙述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、癌、胚细胞瘤和淋巴瘤。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的炎性疾病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的以上叙述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述炎性疾病选自由以下项组成的组：IBD和RA。
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含至少一种以上叙述的融合蛋白和任选的药学上可接受的赋形剂。
一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：
尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽，其经由一个或多个任选的氨基酸接头与以下项连接：
(i)细胞因子或其变体；或者
(ii)检查点分子调节剂。
在某些实施方案中，所述细胞因子包括其功能片段、其功能变体或其环状排列的变体。
在某些实施方案中，所述细胞因子经由一个或多个任选的氨基酸接头与所述细胞因子对其具有结合特异性的受体的全部或部分连接。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽包含能够特异性结合uPAR的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)多肽或其变体。
在某些实施方案中，所述uPA变体是uPA的氨基酸末端片段(ATF)。
在某些实施方案中，所述ATF具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，或与如SEQID NO:91所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，uPA的所述ATF包含一个或多个氨基酸取代或缺失。
在某些实施方案中，所述细胞因子或检查点分子调节剂选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFNγ、IFNα、4-1BBB(CD131)或其配体、OX40或其配体、PD-1、PD-L1、抗PD-1抗体、CTLA-4、抗CTLA4抗体、GITR或其配体、ICOS或其配体、CD27、CD70、CD40或其配体。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的以上叙述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤和淋巴瘤。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的炎性疾病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的以上叙述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述炎性疾病选自由以下项组成的组：IBD和RA。
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含至少一种以上叙述的融合蛋白和任选的药学上可接受的赋形剂。
一方面，本公开提供了一种用于治疗患者的癌症的免疫疗法的方法，其包括向有需要的患者施用以上叙述的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用靶向癌症疗法。
在某些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用选自化学疗法、放射疗法或两者的常规细胞毒性疗法。
在某些实施方案中，所述方法还包括施用选自癌症疫苗、检查点抑制剂或单克隆抗体的免疫疗法。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽包含M25或在氨基酸水平上与其同源的具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述uPAR结合多肽包含P25或与其同源的在氨基酸水平上具有至少80％同一性的氨基酸序列。
附图说明
图1A-图1B描绘了针对人uPAR的DII-DIII结构域(图1A)或单独的DIII结构域(图1B)的抗uPAR抗体结合数据。
图2A-图2B描绘了针对在被工程化以表达人uPAR或小鼠uPAR的HEK 293细胞的表面上表达的人(图2A)和小鼠(图2B)uPAR的抗uPAR抗体结合数据。在滴定期间将抗uPAR抗体与细胞一起孵育，并测定在测试抗体浓度下的中值荧光强度(MFI)值。
图3描绘了p35 C74变体与p40 C177变体之间的Octet结合数据。沿着X轴，针对每个数据点列举的第一个氨基酸对应于p35 C74取代，并且针对每个数据点列举的第二个氨基酸对应于p40 C177取代(即，“K-S”数据点是p35 C74K变体与p40 C177S变体之间的结合亲和力)。
图4A-图4H描绘了若干示例性IL-12亚基融合蛋白的示意图。图4A描绘了单链人IL-12p35/p40融合蛋白。图4B描绘了p35/血清白蛋白(例如，人血清白蛋白或小鼠血清白蛋白)融合蛋白。图4C描绘了与Fab/Fc CH2-CH3结构域融合蛋白配对的p35/Fc CH2-CH3结构域融合蛋白。每个Fc结构域含有杵入臼(KiH)突变以促进异二聚化。图4D描绘了p40/scFv融合蛋白。图4E描绘了p35/串联scFv(scFv2)融合蛋白。图4F描绘了与scFv/Fc CH2-CH3结构域融合蛋白配对的p35/Fc CH2-CH3结构域融合蛋白。每个Fc结构域含有KiH突变以促进异二聚化。图4G描绘了p40/Fab结构域融合蛋白。图4H描绘了p40/IgG融合蛋白。p40蛋白与IgG的每个CH3结构域的C末端连接。
图5A-图5B描绘了来自放射性标记的肿瘤靶向IL-12亚基p40(图5A)和p35(图5B)的PET/CT成像的肿瘤和血清药代动力学。测量随时间在小鼠的肿瘤和血液中的肿瘤靶向亚基，并且测定最大暴露的％。肿瘤靶向p40是Fab形式的抗uPAR抗体M37与p40的融合体。肿瘤靶向p35是KiH形式的抗uPAR抗体M37与p35的融合体。
图6A-图6B描绘了如通过CD8+(图6A)和CD4+(图6B)T细胞中的％Stat4磷酸化所测量的基于细胞的体外IL-12活性数据。将IL-12亚基在所列举的浓度下以1:1的比率添加到T细胞中。
图7描述了如通过T细胞的干扰素(IFN)γ分泌所测定的基于细胞的体外IL-12活性数据。将IL-12亚基在所列举的浓度下以1:1的比率添加到T细胞中。
图8A-图8B描绘了小鼠肿瘤模型的肿瘤(图8A)和肝脏(图8B)中的IL-12亚基累积。IL-12亚基分子是非靶向scIL12、靶向Fab-p40、非靶向p35-MSA、靶向IgG-p40和靶向p35-KiH。“％ID/g”对应于每克组织注射剂量的百分比。
图9描绘了接受两个剂量的scIL-12或p35-MSA和p40-Fab的组合的小鼠中的血清干扰素(IFN)γ浓度。
图10描绘了如通过表达uPAR的HEK细胞/T细胞共培养物中CD8+T细胞中的％Stat4磷酸化所测量的基于细胞的体外IL-12活性数据。在与CD8+T细胞共孵育之前，将IL-12亚基在所列举的浓度下以1:1的比率添加到表达uPAR的HEK细胞中。
图11描绘了RKO异种移植肿瘤小鼠模型中肿瘤组织中选择的融合蛋白的积累。
图12描绘了RKO异种移植肿瘤小鼠模型中血清中选择的融合蛋白的积累。
具体实施方式
本文提供了尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽(例如，uPAR抗原结合蛋白)，以及包含所述uPAR结合多肽和细胞因子或其变体的融合蛋白。本公开还提供了包含本公开的uPAR结合多肽和融合蛋白的药物组合物以及用其治疗癌症的方法。本公开还提供了工程化IL-12p35和p40多肽。
通常，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学以及杂交使用的命名法是本领域众所周知且常用的。除非另外指定，否则本文所提供的方法和技术通常是根据本领域众所周知并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法进行的。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书、如本领域通常完成或如本文所述进行的。本文所述的与分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域熟知且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。
为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。
抗原结合蛋白
如本文所用，术语“抗体”或“抗原结合蛋白”是指与抗原或表位特异性结合或发生免疫反应的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白来源的分子，并且包括多克隆和单克隆抗体两种，以及功能性抗体片段，包括但不限于片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH)片段。因此，抗体可以是单结构域抗体或包含至少一条可变轻链和至少一条可变重链。在一个实施方案中，至少一条可变轻链和至少一条可变重链连接为单条多肽链。术语“抗体”或“抗原结合蛋白”包括种系来源的抗体。术语“抗体”或“抗原结合蛋白”包括免疫球蛋白的遗传工程化或以其他方式修饰的形式，诸如胞内抗体、肽段抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、串联二scFv、串联三scFv)等。除非另有说明，否则术语“抗体”或“抗原结合蛋白”应理解为涵盖其功能抗体片段。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白是多特异性的(即，与两个或更多个不同的靶分子结合或与同一靶分子上的两个或更多个表位结合)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白是双特异性的，并且例如与两个不同的靶分子或同一靶分子上的两个表位结合。在某些实施方案中，抗体是三特异性的，并且例如与至少三个不同的靶分子结合。
抗原结合蛋白可以是单价的或多价的，即具有一个或多个抗原结合位点。单价抗原结合蛋白的非限制性实例包括scFv、Fab、scFab、dAb、VHH、V(NAR)、DARPin、affilin和纳米抗体。多价抗原结合蛋白可以具有两个、三个、四个或更多个抗原结合位点。多价抗原结合蛋白的非限制性实例包括全长免疫球蛋白、F(ab')2片段、双scFv(或串联scFv或BiTE)、DART、双抗体、scDb、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-Fc-scFab、IgG-scFv、scFv-Fc、scFv-fc-scFv、Fv2-Fc、FynomAB、quadroma、CrossMab、DuoBody、三抗体和四抗体。在一些实施方案中，多价抗原结合蛋白是二价的，即存在两个结合位点。在一些实施方案中，多价抗原结合蛋白是双特异性的，即抗原结合蛋白针对两个不同靶标或一个靶分子上的两个不同靶位点。在一些实施方案中，多价抗原结合蛋白包括多于两个(例如，三个或四个)不同结合位点，分别针对三个或四个不同抗原。这种抗原结合蛋白是多价和多特异性的，特别是分别是三特异性或四特异性的。
如本文所用，“单链可变片段”(scFv)是包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)的抗原结合蛋白。scFv的VH和VL结构域经由任何适当的本领域公认的接头连接。此类接头包括但不限于重复的GGGGS氨基酸序列或其变体。scFv一般不含抗体恒定结构域区，尽管本公开的scFv可连接或附接到抗体恒定结构域区(例如，抗体Fc结构域)以改变scFv的各种特性，包括但不限于增加血清或组织半衰期。scFv一般具有约25kDa的分子量和约2.5nm的流体动力学半径。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含串联scFv，即与第二scFv连接的第一scFv。第一和第二scFv可以是相同的氨基酸序列和/或与相同的表位结合。另选地，第一和第二scFv可以是不同的氨基酸序列和/或与不同的表位结合。
如本文所用，“Fab片段”或“Fab”是包含轻链片段以及重链的可变重链(VH)结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含轻链的可变轻链(VL)结构域和恒定结构域(CL)。
如本文所用，“VHH”、“纳米抗体”或“仅有重链的抗体”是包含来源于骆驼科的种的单一重链可变结构域的抗原结合蛋白，所述骆驼科的种包括骆驼、美洲驼、羊驼。VHH一般具有约15kDa的分子量。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含Fc结构域。Fc结构域的存在可能有利于诱导细胞毒性免疫应答和/或激活补体(例如，ADCC/ADCP或CDC效应功能)。包括但不限于Fc结构域的示例性抗体形式是全长免疫球蛋白、DVD-Ig、scFv-Fc和scFv-Fc、scFv融合体、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体(诸如例如bsAb、Bs1Ab、Bs2Ab、Bs3Ab、Ts1Ab、Ts2Ab、杵入臼(KiH))、DuoBody和/或CrossMab。活性Fc结构域可增加肿瘤微环境中T细胞和其他效应细胞释放促炎细胞因子的可能性，这被认为是治疗作用机制的一部分。Fc结构域可以是完全活性的或部分沉默的，以避免免疫系统的过度刺激。在一些实施方案中，Fc结构域是无活性的并且不刺激促炎细胞因子释放，但仍然改善抗原结合蛋白的半衰期和/或稳定性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自由以下项组成的组的恒定区：人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含选自由以下项组成的组的恒定区：鼠IgG1、IgG2A、IgG2B或IgG3同种型。
本公开的抗原结合蛋白可包含用于连接抗原结合蛋白的结构域的一个或多个接头(例如，连接VH和VL以形成scFv，或连接多个结合结构域以形成多特异性抗原结合蛋白)。
接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物(Gly)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(GlynSer)n，其中n是至少一、二、三、四、五、六、七或八的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头。
甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此能够充当融合蛋白(诸如本文所述的抗原结合蛋白)的结构域之间的中性系链。甘氨酸比其他小侧链氨基酸进入显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基限制更少(Scheraga,Rev.Computational Chem.1:1173-142(1992))。本领域技术人员将认识到，特定实施方案中抗原结合蛋白的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包括柔性接头片段以及赋予较小柔性以提供期望结构的一个或多个片段。
然而，可以例如使用对应于人CH1和Cκ序列的起始部分的氨基酸片段或对应于人IgG的铰链区的下部的氨基酸片段来选择接头序列以类似于天然接头序列。
scFv部分中连接VL和VH结构域的肽接头的设计是通常由小的非极性或极性残基(诸如Gly、Ser和Thr)构成的柔性接头。连接scFv部分的可变结构域的特别示例性接头是(Gly4Ser)4接头，其中4是基序的示例性重复数量。在某些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG、GGGGSGGGGSGGGG S或GGGSGGGGSG(SEQ ID NO:246)。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGS)n(SEQ ID NO:247)，其中n是介于1与5之间的整数。
其他示例性接头包括但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS；TGEKP(Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.94:5525-5530(1997))；GGRR；(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n＝1、2、3、4或5(Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.93:1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci.87:1066-1070(1990))；KESGSVSSEQLAQFRSLD(Bird等人,Science 242:423-426(1988))、GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；以及GSTSGSGKPGSGEGSTKG(Cooper等人,Blood,101(4):1637-1644(2003))。另选地，可以使用能够模拟蛋白质和肽的3D结构的计算机程序或者通过噬菌体展示方法合理地设计柔性接头。
抗体可包含可变轻链(VL)结构域和可变重链(VH)结构域。每个VL和VH结构域还包含一组三个CDR。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的非连续序列。一般来讲，在每个重链可变结构域中有三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且在每个轻链可变结构域中有三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。“框架区”或“FR”是本领域已知的，是指重链和轻链的可变结构域的非CDR部分。一般来讲，在每个重链可变结构域中有四个FR(HFR1、HFR2、HFR3和HFR4)，并且在每个轻链可变结构域中有四个FR(LFR1、LFR2、LFR3和LFR4)。因此，抗体可变区氨基酸序列可以由式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4表示。式中的每个片段(即FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4)代表可以突变的离散氨基酸序列(或编码其的多核苷酸序列)，包括一个或多个氨基酸取代、缺失和插入。在某些实施方案中，抗体可变轻链氨基酸序列可以由式LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4表示。在某些实施方案中，抗体可变重链氨基酸序列可以由式HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4表示。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745。(“Contact”编号方案)；Lefranc M P等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegger A和Pluckthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool,”J MolBiol,2001年6月8日；309(3):657-70,(“AHo”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都基于最常见的抗体区序列长度，其中插入由插入字母例如“30a”提供，并且缺失出现在一些抗体中。这两种方案将某些插入和缺失(“indel”)置于不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面类似于Chothia编号方案。
因此，除非另外指定，否则给定抗体或其片段(诸如其可变结构域)的“CDR”或“互补决定区”或单个指定CDR(例如，HCDR1、HCDR2)应理解为涵盖如由已知方案中的任一种所定义的(或特定)互补决定区。同样地，除非另外指定，否则给定抗体或其片段(诸如其可变结构域)的“FR”或“框架区”或单个指定FR(例如，“HFR1”、“HFR2”)应理解为涵盖如由已知方案中的任一种所定义的(或特定)框架区。在一些情况下，指定用于鉴定特定CDR或FR的方案，诸如CDR如由Kabat、Chothia或Contact方法所定义。在其他情况下，给定CDR或FR的特定氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文所公开的抗原结合蛋白是人源化的。如本文所用，术语“人源化的”或“人源化”是指已被改变以使其更像人抗体的抗原结合蛋白。非人抗原结合蛋白(诸如本文所公开的鼠抗原结合蛋白)如果施用于人用于治疗，则将引发阴性免疫反应。因此，有利的是将非人(例如，鼠)抗原结合蛋白人源化以用于以后的治疗用途。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白通过表面重塑(resurfacing)被人源化(即，改造非人框架的溶剂可及残基，使得它们变得更像人)。表面重塑策略更详细地描述于WO2004/016740、WO2008/144757和WO2005/016950，它们中的每一者通过引用并入本文。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白通过CDR移植(即，将鼠抗原结合蛋白CDR插入人抗体受体框架中)被人源化。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体的抗原结合位点和与其结合的表位之间的相互作用的强度。如本领域技术人员容易理解的，抗体或抗原结合蛋白亲和力可以摩尔浓度(M)报告为解离常数(KD)。本公开的抗体可具有10-8至10-14M范围内的KD值。高亲和力抗体具有10-9M(1纳摩尔，nM)和更低的KD值。例如，高亲和力抗体可具有约1nM至约0.01nM范围内的KD值。高亲和力抗体可具有约1nM、约0.9nM、约0.8nM、约0.7nM、约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM、约0.2nM或约0.1nM的KD值。极高亲和力抗体具有10-12M(1皮摩尔，pM)和更低的KD值。弱或低亲和力抗体可具有10-1至10-4M范围内的KD值。低亲和力抗体可具有10-4M和更高(诸如10-4M、10-3M、10-2M或10-1M)的KD值。
抗体与特异性抗原决定簇(例如，uPAR)结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，所述技术例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。
本公开中使用的各种抗体恒定结构域氨基酸序列在下表1中列举。
表1-抗体恒定结构域氨基酸序列
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抗原结合蛋白异二聚化
在本公开的一方面，包含两个Fc结构域的抗原结合蛋白通过杵入臼配对(KiH)被异二聚化。这种二聚化技术利用工程化到CH3结构域的界面中的突起(“杵”)和空腔(“臼”)。当在第一或第二CH3结构域的界面处存在适当定位和尺寸的杵或臼时，仅需要在相邻界面处分别工程化对应的杵或臼，从而促进和增强CH3/CH3结构域界面中的Fc结构域配对。“杵”是指从第一Fc结构域的CH3部分的界面突起的至少一条氨基酸侧链，通常是较大的侧链。突起产生与第二Fc结构域的CH3部分中的“臼”互补并被其接纳的“杵”。“臼”是从第二Fc结构域的CH3部分的界面退去的至少一条氨基酸侧链，通常是较小的侧链。这种技术描述于例如美国专利号5,821,333；Ridgway等人,Protein Engineering 9:617-621(1996)；以及Carter P.,J.Immunol.Methods 248:7-15(2001)。
可充当杵的示例性氨基酸残基包括精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。CH3结构域中现有的氨基酸残基可被杵氨基酸残基替代或取代。待取代的优选氨基酸可包括具有小侧链的任何氨基酸，诸如丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)。
可充当臼的示例性氨基酸残基包括丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。CH3结构域中现有的氨基酸残基可被臼氨基酸残基替代或取代。待取代的优选氨基酸可包括具有大或庞大侧链的任何氨基酸，诸如精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。
CH3结构域可以来源于人IgG1抗体。CH3结构域的示例性氨基酸取代包括T366Y、T366W、F405A、F405W、Y407T、Y407A、Y407V、T394S以及它们的组合。某个示例性组合是用于第一CH3结构域上的杵突变的T366Y或T366W以及用于第二CH3结构域上的臼突变的Y407T或Y407V。
在某些实施方案中，根据Eu编号，KiH Fc结构域包含含有氨基酸取代T366W的杵Fc部分和含有氨基酸取代T366S、L368A、Y407V的臼Fc部分。在某些实施方案中，根据Eu编号，臼Fc部分还包含氨基酸取代H435R和Y436F。
在本公开的某些实施方案中，包含两个Fc结构域的抗原结合蛋白通过Fab臂交换(FAE)而异二聚化。具有P228S铰链突变的人IgG1可含有F405L或K409R CH3结构域突变。将这两种抗体与还原剂混合产生FAE。这种技术描述于美国专利号9,212,230和LabrijnA.F.,Proc Natl Acad Sci USA 110(13):5145-5150(2013)。
在本公开的某些实施方案中，包含两个Fc结构域的抗原结合蛋白通过静电转向效应而异二聚化。这种二聚化技术利用静电转向来促进和增强CH3/CH3结构域界面中的Fc结构域配对。改变两个CH3结构域之间的电荷互补性以有利于异二聚化(相反电荷配对)而不是同二聚化(相同电荷配对)。在该方法中，静电排斥力防止同二聚化。示例性氨基酸残基取代可包括第一CH3结构域中的K409D、K392D和/或K370D以及第二CH3结构域中的D399K、E356K和/或E357K。这种技术描述于美国专利申请公开号2014/0154254A1和GunasekaranK.,J Biol Chem 285(25):19637-19646(2010)。
在本公开的某些实施方案中，包含两个Fc结构域的抗原结合蛋白通过疏水相互作用效应而异二聚化。这种二聚化技术利用疏水相互作用而不是静电相互作用来促进和增强CH3/CH3结构域界面中的Fc结构域配对。示例性氨基酸残基取代可包括第一CH3结构域中的K409W、K360E、Q347E、Y349S和/或S354C以及第二CH3结构域中的D399V、F405T、Q347R、E357W和/或Y349C。第一CH3结构域与第二CH3结构域之间的优选氨基酸残基取代对包括K409W:D399V、K409W:F405T、K360E:Q347R、Y349S:E357W和S354C:Y349C。这种技术描述于美国专利申请公开号2015/0307628A1。
在本公开的某些实施方案中，包含两个Fc结构域的抗原结合蛋白通过使用亮氨酸拉链融合体而异二聚化。与抗体链的每个CH3结构域的C末端融合的亮氨酸拉链结构域强制异二聚化。这种技术描述于Wranik B.,J Biol Chem 287(52):43331-43339(2012)。
在本公开的某些实施方案中，包含两个Fc结构域的抗原结合蛋白通过使用链交换工程化结构域(SEED)体而异二聚化。来源于IgG和IgA形式的CH3结构域强制异二聚化。这种技术描述于Muda M.,Protein Eng.Des.Sel.24(5):447-454(2011)。
除非另有说明，否则本文使用的所有抗体恒定区编号对应于EU编号方案，如Edelman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85(1969)中所述。
重链和/或轻链的异二聚化以及不对称抗体的产生和纯化的其他方法是本领域已知的。参见例如Klein C.,mABs 4(6):653-663(2012)和美国专利号9,499,634，它们中的每一者通过引用并入本文。
设想另外的Fc结构域突变以改变Fc功能，包括但不限于改变的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些实施方案中，根据Eu编号，抗原结合蛋白包含具有L234A和L235A氨基酸取代的IgG1恒定结构域。
在某些实施方案中，根据Eu编号，抗原结合蛋白包含具有P329G氨基酸取代的IgG1恒定结构域。
尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽
如本文所用，术语“uPAR”或“尿激酶纤溶酶原激活物受体”或“尿激酶受体”或“uPA受体”或“CD87”或“分化簇87”是指本文所述的抗原结合蛋白的靶标。uPAR由Ly-6/uPAR/α-神经毒素家族的三个不同结构域构成。所有三个结构域都参与主要配体尿激酶的高亲和力结合。除了主要配体尿激酶之外，uPAR还与若干种其他蛋白质相互作用，包括玻连蛋白、uPAR相关蛋白(uPARAP)和膜蛋白的整联蛋白家族。
如本文所用，术语“结合多肽”或“结合蛋白”对应于与靶蛋白(例如，uPAR)特异性结合的多肽。结合多肽包括但不限于如上所述的抗原结合蛋白，以及靶蛋白的配体。在某些实施方案中，所述结合多肽是能够特异性结合uPAR的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)多肽或其变体。在某些实施方案中，所述uPA变体是uPA的氨基酸末端片段(ATF)。在某些实施方案中，所述ATF具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，uPA的所述ATF包含一个或多个氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，所述uPA具有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO:90所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
一方面，本公开提供了一种与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的分离的抗原结合蛋白，其包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含：
i)GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)、GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)、GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)、GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)或GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列；
ii)IDPENGDT(SEQ ID NO:4)、IWSDGGT(SEQ ID NO:12)、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)或IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列；以及
iii)TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)、AHYSFDY(SEQ IDNO:21)或AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含：
iv)SSVSY(SEQ ID NO:6)、QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)、ENIYSN(SEQ ID NO:22)、SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列；
v)DTS(SEQ ID NO:7)、KVS(SEQ ID NO:15)、AAT(SEQ ID NO:23)或GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列；以及
vi)QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)、FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)、QHFWGTPWT(SEQ IDNO:24)、QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合蛋白包含与如上所示以及表3和表8中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3氨基酸序列中的任一个的至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性。
在某些实施方案中，所述VH结构域包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且VL结构域包含SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合蛋白包含与如上所示以及表3和表8中的VH或VL氨基酸序列中的任一个的至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性。
在某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQID NO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)的HCDR1氨基酸序列、IWSDGGT(SEQID NO:12)的HCDR2氨基酸序列、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)的LCDR1氨基酸序列、KVS(SEQID NO:15)的LCDR2氨基酸序列和FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ IDNO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中：
a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
b)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；
c)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
d)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列；
e)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列；
f)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列；
g)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；
h)所述VH结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列；或者
i)所述VH结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VH结构域和VL结构域通过氨基酸接头附接。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:149)或GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)、dAb片段、单结构域抗体或纳米抗体。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:56-71中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白还包含SEQ ID NO:72-78中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:45、46、49、53或54的抗体重链(HC)氨基酸序列和SEQ ID NO:47、48、50、51、52和55的抗体轻链(LC)氨基酸序列。
在某些实施方案中：
a)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
b)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
c)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
d)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
f)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
g)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
h)所述抗体HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或者
i)所述抗体HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白以小于约5x10-8M、小于约1x10-8M、小于约5x10-9M、小于约1x10-9M、小于约5x10-10M或小于约1x10-10M的KD结合人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合uPAR配体结合的人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR，从而产生用与所述抗原结合蛋白结合的荧光标记抗体检测的荧光信号，EC50值为约0.1nM至约3.0nM。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合人uPAR DII-DIII结构域或人uPARDIII结构域。
一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白，其与上述抗原结合蛋白竞争结合。
一方面，本公开提供了一种分离的抗原结合蛋白，其与上述抗原结合蛋白结合相同表位。
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含上述抗原结合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂。
一方面，本公开提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述抗原结合蛋白的多核苷酸序列。
一方面，本公开提供了一种表达载体，其包含上述多核苷酸序列。
一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含上述表达载体。
另一方面，本公开提供了一种制备以上叙述的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(i)在允许所述抗原结合蛋白表达的条件下培养以上叙述的宿主细胞；
(ii)回收所述抗原结合蛋白；以及任选地
(iii)进一步纯化和/或修饰和/或配制所述抗原结合蛋白。
细胞因子及其变体
如本文所用，“细胞因子”是包括“淋巴因子”(由淋巴细胞产生的细胞因子)、“单核因子”(由单核细胞产生的细胞因子)、“趋化因子”(具有趋化活性的细胞因子)和“白介素”(由一种白细胞产生并作用于其他白细胞的细胞因子)的通用术语。细胞因子可作用于分泌它们的细胞(自分泌作用)，作用于附近细胞(旁分泌作用)，或在一些情况下作用于远处细胞(内分泌作用)。促炎细胞因子主要由活化的巨噬细胞和树突细胞产生，并且参与炎性反应的上调，并且包括但不限于IL-1β、IL-6和TNF-α。趋化因子通常根据它们的前两个半胱氨酸残基的间隔分为4组：C-C趋化因子(例如，RANTES、单核细胞趋化蛋白或MCP-1、单核细胞炎性蛋白或MIP-1α和MIP-1β)、C-X-C趋化因子(例如，IL-8，也称为生长相关癌基因或GRO/KC)、C趋化因子(例如，淋巴细胞趋化因子)和CXXXC趋化因子(例如，fractalkine)。抗炎细胞因子是一系列抑制或控制促炎反应的免疫调节分子。细胞因子与特异性细胞因子抑制剂和可溶性细胞因子受体协同作用以调节免疫应答。主要抗炎细胞因子包括但不限于：白介素(IL)-1受体拮抗剂、IL-4、IL-10、IL-11和IL-13。在各种情况下，白血病抑制因子、干扰素-α、IL-6、IL-10和转化生长因子(TGF)-β被分类为抗炎或促炎细胞因子。IL-1、TNF-α和IL-18的特异性细胞因子受体也作为促炎细胞因子的抑制剂起作用。
本文所公开的融合蛋白的细胞因子多肽可以是任何细胞因子，包括其变体，诸如其功能片段或其环状排列的变体。有用的细胞因子包括但不限于：IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-15、IL-17家族成员、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-23p19、IL-30(IL-27p28)、IL-33、IL-34、IL-35、IL-35p35、IL-36Ra、IL-36a、IL-36b、IL-36g、IL-37、IL-38、LIF、CNTF、制瘤素M、CLCF-1、GM-CSF、氧化铁蛋白(Oxferritin)、载脂蛋白e、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-α(IFNα)、干扰素-β(IFNβ)或干扰素-γ(IFNγ)。在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10或IL-12。在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含至少一个白介素-12(IL-12)亚基(例如，p35和p40)。在某些实施方案中，所述IL-12亚基包含p35和p40中的一种或两种。在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含单链IL-12(scIL-12)，所述scIL-12包含通过氨基酸接头附接的p35多肽和p40多肽。
如本文所用，术语“变体”是指与参考多肽不同但保留基本特性的多肽。多肽的典型变体在其一级氨基酸序列上与另一参考多肽不同。一般来讲，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽在氨基酸序列上可因一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)而不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是未知天然存在的变体。另外，如本文所用的术语“变体”包括蛋白质和肽的环状排列。
如本文所用，术语“环状排列”和“环状排列的”“(CP或cp)”是指这样的概念性过程：即取一种线性蛋白质或其同源核酸序列，并融合天然N和C末端(直接或通过接头、使用蛋白质或重组DNA方法)以形成环状分子，然后在不同位置切割(打开)该环状分子以形成新的线性蛋白质或同源核酸分子，其末端不同于原始分子的末端。因此，环状排列保留了蛋白质的序列、结构和功能(除任选的接头外)，同时在不同位置产生新的C和N末端，根据本公开的一方面，这使得与原始配体相比，用于融合期望多肽融合配偶体的取向得到改善。环状排列还包括产生环状排列的直链分子的任何过程，如本文所定义。一般来讲，环状排列的分子被从头表达为线性分子，并且不正式经历环化和打开步骤。本文的分子的特定环状排列用括号表示，在环状排列的蛋白质的情况下，括号中含有其间的肽键被消除的氨基酸残基。例如，名称IL6(Q182/Q180)表示环状排列的IL6生长因子，其中开放位点(肽键被消除的位置)出现在未排列或未修饰的天然IL6的残基Q182与Q180之间，因此新产生的N末端是原来是残基182的谷氨酰胺，而新产生的C末端是原来是残基180的谷氨酰胺。环状排列的蛋白质及其产生方法更详细地描述于U.S.9,359,415，该文献通过引入并入本文。
术语“未排列”、“天然”、“野生型”或“未修饰”配体、多肽、蛋白质、细胞因子例如在本文中用于提供细胞因子在重排为如上所述的环状排列的分子之前的参考点。通常，未修饰的细胞因子具有基本上对应于细胞因子或蛋白质的独立结构域的氨基和羧基末端和氨基酸序列的氨基和羧基末端和氨基酸序列，因为它一般在体内发生。未修饰的细胞因子可以是完全成熟形式或成熟形式的前体(诸如原蛋白)。
如本文所用，“片段”是指多肽的比参考蛋白短的片段。蛋白质的片段可以具有末端(羧基或氨基末端)和/或内部缺失。一般来讲，蛋白质的片段将是至少四个(例如，至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或至少100个或更多个)氨基酸长。本文所述的蛋白质、融合蛋白或片段中的任一种的生物活性片段或生物活性变体具有野生型全长参考蛋白的至少25％(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％或甚至更高)的活性。在uPAR结合多肽的情况下，相关活性是uPAR结合多肽与靶uPAR受体结合的能力。在细胞因子多肽的情况下，相关活性是结合其受体并适当激动或拮抗的能力。根据它们的预期用途，多肽、其生物活性片段或生物活性变体可以是任何物种，但优选地是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠、狗、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人)，并且最优选地是人。
因此，应理解，本公开提供了全长多肽(例如，本发明的融合蛋白的各种多肽，包括如本文所述的uPAR结合多肽、细胞因子和对应受体或受体片段)的(i)生物活性变体和(ii)其生物活性片段或生物活性变体。全长、优选成熟的野生型蛋白质或蛋白质的片段的生物活性变体可以含有添加、缺失或取代，诸如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、12、15、20、25、30、35、40或50个保守氨基酸取代。保守取代是一个氨基酸取代另一个具有相似特征的氨基酸。保守取代包括以下组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组的一个成员被同一组的另一个成员的任何取代可以被认为是保守取代。相比之下，非保守取代是一个氨基酸取代另一个具有不同特征的氨基酸。缺失变体可以缺乏一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸区段(两个或更多个氨基酸)或不连续单个氨基酸。添加(添加变体)包括含有以下项的融合蛋白：(a)含有至少五个氨基酸的全长野生型多肽或其片段；以及(b)内部或末端(C或N)无关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的上下文中，术语“异源氨基酸序列”指除(a)以外的氨基酸序列。因此，含有本文所述的肽和异源氨基酸序列的融合蛋白在序列上不对应于天然存在的蛋白质的全部或部分。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如，FLAG或多组氨酸(六组氨酸或6xHis))。
工程化白介素12亚基
IL-12是由p35亚基(即，IL-12p35)和p40亚基(即，IL-12p40)构成的异二聚体。当异源二聚体形成并与IL-12受体(例如，IL-12Rβ1/IL-12Rβ2异二聚体)结合时，实现IL-12的最佳活性。这两个亚基(p35和p40)可以连接在一起以形成单链IL-12(scIL-12)，从而消除对异二聚体装配的需要并增加IL-12的活性。然而，当全身施用时，scIL-12具有高毒性。因此，有利的是单独供应每个IL-12亚基。
不幸的是，IL-12亚基难以表达和纯化以用于治疗目的。p35显示出几乎没有表达。可以通过将p35连接到融合配偶体(诸如抗体或其片段或者人血清白蛋白(HSA))来提高表达。p35也易于聚集。p40显示出相似的挑战。p40可以在没有融合配偶体的情况下表达，但纯化的组合物通常被p40同二聚体(约15-20％)污染。p40还易于在37℃下随时间二聚化和聚集。本公开提供了可以克服这些挑战同时保持彼此的结合亲和力的工程化IL-12亚基(即，p35和p40变体)。
一方面，本公开提供了一种工程化IL-12p35多肽，其包含在SEQ ID NO:81的位置S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150和L161处的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述工程化IL-12p35多肽还包含S27和D188氨基酸取代中的一种或两种。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括C74K。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
在某些实施方案中，所述工程化IL-12p35多肽包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列具有至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)以上叙述的工程化IL-12p35多肽；以及(ii)一种或多种融合配偶体(例如，功能部分或抗uPAR抗原结合蛋白)。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含减少所述工程化IL-12p35多肽的聚集的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p35多肽的表达的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p35多肽的血清半衰期的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含靶向部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)或抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合。
一方面，本公开提供了一种工程化IL-12p40多肽，其包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
在某些实施方案中，所述C252氨基酸取代是C252S。
在某些实施方案中，所述p40包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ IDNO:87所示的氨基酸序列包含至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)以上叙述的工程化IL-12p40多肽；以及(ii)一种或多种融合配偶体(例如，功能部分或抗uPAR抗原结合蛋白)。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含减少所述工程化IL-12p40多肽的聚集的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p40多肽的表达的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p40多肽的血清半衰期的部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含靶向部分。
在某些实施方案中，所述一种或多种融合配偶体包含血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)或抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合。
示例性IL-12氨基酸序列在下表2中列举。
表2–IL-12氨基酸序列
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/>
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融合蛋白
可以将本文所述的尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽(包括上述uPAR抗原结合蛋白)连接(即，附接或融合)到1)细胞因子或其变体和2)检查点分子调节剂中的一种或两种。uPAR抗原结合蛋白可用于将连接的蛋白质(即，细胞因子或检查点分子调节剂)靶向表达uPAR的肿瘤。
短语“检查点分子调节剂”是指能够适当地激动或拮抗检查点分子以增强期望的免疫应答(例如，激动免疫刺激性检查点分子或拮抗免疫抑制性检查点分子)或抑制不期望的免疫应答(例如，针对不适当的应答拮抗免疫刺激性检查点分子)的蛋白质或肽。刺激或共刺激检查点分子包括但不限于：CD27、CD70、CD28、CD40、CD40配体、CD122、CD137、OX40、GITR及其配体、ICOS、CD131(4-1BBB及其配体)。抑制性检查点分子包括但不限于：腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3、B7-H4、BTLA(B和T淋巴细胞衰减因子)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、IDO(吲哚胺2,3,双加氧酶)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞激活基因-3)、PD-1(程序性细胞死亡-1受体)及其配体PD-L1(程序性死亡配体1)和PD-L2(程序性死亡配体2)、TIM-3(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白3)、VISTA(T细胞激活的v结构域Ig抑制剂)。在本公开的融合蛋白中使用的检查点分子调节剂可包括抑制性或刺激性检查点分子、其功能片段、其功能衍生物或其环状排列的变体。
除了抗原结合蛋白外，uPAR结合多肽可以包含来源于阻断uPAR整合相互作用的整联蛋白的肽。一种这样的肽是具有氨基酸序列PRYQHIGLVAMFRQNTG(SEQ ID NO:157)的M25，一种来源于Mac-1的β2亚基的肽，抑制白细胞与纤维蛋白原、玻连蛋白和细胞因子刺激的内皮细胞的粘附。M25还阻断uPAR与β1的缔合并削弱人血管平滑肌细胞在纤连蛋白和胶原上的β1-整联蛋白依赖性扩散和迁移(Simon DI等人,(2000)J Biol Chem.275:10228–34)。抑制uPAR-整联蛋白复合物形成的第二肽即具有氨基酸序列AESTYHHLSLGYMYTLN(SEQ ID NO:158)的P25能够减少肿瘤细胞与玻连蛋白的附接并增加肿瘤细胞与纤连蛋白的附接(vander Pluijm G等人,(2001)Am J Pathol.159:971–82)。
一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含：(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的抗原结合蛋白；以及(ii)细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白和所述细胞因子或其变体通过氨基酸接头连接。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10或IL-12。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含至少一个白介素-12(IL-12)亚基(例如，p35和p40)。在某些实施方案中，所述IL-12亚基包含p35和p40中的一种或两种。例如，但决不限制，所述融合蛋白包含：(i)与uPAR特异性结合的抗原结合蛋白；以及(ii)p35多肽。另选地，所述融合蛋白包含：(i)与uPAR特异性结合的抗原结合蛋白；以及(ii)p40多肽。
在某些实施方案中，所述p35多肽包含在SEQ ID NO:81的位置M12、S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150、L161和D188处的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D和D188N。在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括C74K。在某些实施方案中，所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。在某些实施方案中，所述p35包含SEQID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列包含至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述p40多肽包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。在某些实施方案中，所述C252氨基酸取代是C252S。在某些实施方案中，所述p40多肽包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQID NO:87所示的氨基酸序列包含至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含单链IL-12(scIL-12)，所述scIL-12包含通过氨基酸接头附接的p35多肽和p40多肽。在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:156)。在某些实施方案中，所述scIL-12包含SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列包含至少约80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相似性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQID NO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)的HCDR1氨基酸序列、IWSDGGT(SEQID NO:12)的HCDR2氨基酸序列、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)的LCDR1氨基酸序列、KVS(SEQID NO:15)的LCDR2氨基酸序列和FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ ID NO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQID NO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ IDNO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白的所述抗原结合蛋白包含：
a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域；
b)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域；
c)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域；
d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域；
e)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域；
f)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL结构域；
g)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL结构域；
h)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL结构域；或者
i)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，所述VH结构域和VL结构域通过氨基酸接头附接。在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:149)或GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)、dAb片段、单结构域抗体或纳米抗体。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:56-71中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白还包含SEQ ID NO:72-78中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:45、46、49、53或54的抗体重链(HC)氨基酸序列和SEQ ID NO:47、48、50、51、52和55的抗体轻链(LC)氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：
a)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗体LC；
b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗体LC；
c)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列的抗体LC；
d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗体LC；
d)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗体LC；
f)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的抗体LC；
g)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的抗体LC；
h)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的抗体LC；或者
i)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的抗体HC和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的抗体LC。
另一方面，本公开提供了一种包含第一融合蛋白和第二融合蛋白的组合，其中：
(a)所述第一融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)上的第一表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体；并且
(b)所述第二融合蛋白包含：
(i)与uPAR上的第二表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p40亚基或其变体。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是相同的。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是不同的。
功能部分
本公开的蛋白质(例如，uPAR结合蛋白、细胞因子和融合蛋白)还可缀合(即，连接、附接或融合)到赋予本公开的蛋白质期望的生物活性的功能部分。官能部分包括蛋白质功能部分和非蛋白质功能部分(例如，PEG或多糖)。例如，但决不限制，为了延长细胞因子或其变体(例如，IL-12p35-HSA或IL-12p40-HSA缀合物)的半衰期，可经由任选的接头将细胞因子或其变体缀合到免疫球蛋白的Fc区或人血清白蛋白(HSA)。
在某些实施方案中，功能部分是免疫球蛋白的Fc区(即，Fc结构域)。在某些实施方案中，可以经由如WO 2016/100788(其通过引用并入本文)中所述的单链接头将Fc区连接到本公开的蛋白质(例如，uPAR结合蛋白、细胞因子和融合蛋白)。这些接头包含与免疫球蛋白的Fc区融合的与免疫球蛋白重链的CH1恒定区连接的免疫球蛋白轻链(CL)的恒定区(scCLCH1或scCH1CL接头)。例如，还可经由scCLCH1或scCH1CL接头将本公开的融合蛋白(例如，与抗uPAR抗原结合蛋白连接的细胞因子)连接到免疫球蛋白的Fc区。这种类型的接头赋予本公开的融合蛋白有利的特性，诸如赋予本公开的融合蛋白改善的生物活性和增加的半衰期。
本公开的融合蛋白可通过与抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白分子(例如，人血清白蛋白(HSA))结合而在体内进一步稳定并且增加它们的半衰期。这些血清白蛋白分子是本身在体内具有长半衰期的天然存在的蛋白质。
接头
本文所述的任何蛋白质(例如，uPAR结合蛋白、细胞因子蛋白和融合蛋白)可以包括一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或者七个或更多个)接头部分，它们连接融合蛋白的一个或多个(或全部)多肽、连接一个或多个细胞因子蛋白或者连接一个或多个uPAR结合蛋白(例如，连接uPAR抗原结合蛋白的VH和VL结构域)。在某些实施方案中，接头是长度可以是一个氨基酸但长度可以更长的氨基酸接头。例如，接头肽可以是至少两个(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或至少55个或更多个)氨基酸长。接头肽可以含有任何氨基酸。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质中存在的任何一个或多个接头选自包含选自Gly(G)和/或Ser(S)的氨基酸的人工柔性多肽。在某些实施方案中，所述接头由通式(GGGS(SEQ ID NO:151))n或(GGGGS(SEQ ID NO:152))n或(SGGSGGG(SEQ ID NO:153))n或(GGSGGSG(SEQ ID NO:154))n的多肽构成，其中n是1至10的整数。在某些实施方案中，每个接头是包含约1至约100个氨基酸(诸如约1-50个氨基酸、约1-25个氨基酸、约1-15个氨基酸、约1-10个氨基酸、约4-24个氨基酸、约5-20个氨基酸、约5-15个氨基酸和约5-10个氨基酸)的多肽。在某些实施方案中，所述接头是(GGGGS(SEQ ID NO:155))n，其中n是2或4。任何接头还可包含氨基酸，诸如Lys(K)、Thr(T)、Glu(E)和Asp(D)。
在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:149)或GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)。在某些实施方案中，所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGS。
在某些实施方案中，所述接头可包含一种或多种粘蛋白或蛋白质的粘蛋白结构域(例如，由MUC基因编码的任何蛋白质(例如，MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9、MUC11、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20、MUC21))。粘蛋白结构域蛋白和多肽含有高度糖基化，其在结构上允许粘蛋白和包含粘蛋白结构域的其他多肽表现为硬化的随机卷曲。粘蛋白结构域的杆状性质可以将生物活性蛋白(例如，细胞因子)与融合配偶体(例如，uPAR结合蛋白)严格分离，从而对任一融合配偶体的活性损失不太敏感。
根据本公开有用的此类粘蛋白结构域多肽描述于WO 2013/184939和WO 2013/184938，这些文献通过引用并入本文。这些接头可用于提供本公开的融合蛋白的多肽之间(例如，ATF多肽与细胞因子多肽之间)的最佳间隔，或例如提供整个融合蛋白的半衰期的增加，而不管粘蛋白结构域在融合蛋白中的位置如何。例如，粘蛋白结构域可存在于融合蛋白的N末端或C末端。粘蛋白结构域多肽接头还可与免疫球蛋白多肽的Fc区连接，所述Fc区也可起增加本发明的融合蛋白的半衰期作用，如WO 2013/184938中所述。
纯化标签
本文所述的任何蛋白质(例如，uPAR结合蛋白、细胞因子蛋白和融合蛋白)可以包括一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或者七个或更多个)纯化标签，它们促进本文所述的蛋白质的纯化。在某些实施方案中，纯化标签是avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:240)。在某些实施方案中，纯化标签是6xHis标签(HHHHHH；SEQ ID NO:241)。avi标签和6xHis标签中的一种或两种可以任何顺序存在于单个蛋白质上。在某些实施方案中，纯化标签通过gly-ser接头与本文所述的蛋白质连接。在某些实施方案中，gly-ser接头包含GGS和/或GGSGGG(SEQ ID NO:242)。在某些实施方案中，纯化是GGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:243)、GGSGGHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:244)和GGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSHHHHHH(SEQID NO:245)中的任一种。
抗原结合蛋白、细胞因子和融合蛋白的表达
一方面，提供了编码本文所公开的抗原结合蛋白(例如，抗uPAR抗原结合蛋白)、细胞因子或其变体(例如，工程化IL-12p35或工程化IL-12p40)或者融合蛋白(例如，抗uPAR抗原结合蛋白-细胞因子融合蛋白)的多核苷酸或核酸。还提供了制备抗原结合蛋白、细胞因子或融合蛋白的方法，其包括表达这些多核苷酸。
通常将编码本文所公开的抗原结合蛋白、细胞因子或融合蛋白的多核苷酸插入表达载体中以引入可用于产生期望量的抗原结合蛋白或融合蛋白的宿主细胞中。因此，在某些方面，本公开提供了包含本文所公开的多核苷酸的表达载体以及包含这些载体和多核苷酸的宿主细胞。
本文使用术语“载体”或“表达载体”以意指根据本发明用作用于将期望的基因引入细胞中并在细胞中表达该基因的媒介物的载体。如本领域技术人员已知的，此类载体可容易地选自由以下项组成的组：质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。一般来讲，与本发明相容的载体将包含选择标记、促进期望基因克隆的适当限制位点以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
许多表达载体系统可用于本发明的目的。例如，一类载体利用来源于动物病毒诸如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(例如，RSV、MMTV、MOMLV等)或SV40病毒的DNA元件。其他涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，可通过引入一个或多个允许选择转染宿主细胞的标记来选择已将DNA整合到其染色体中的细胞。该标记可提供营养缺陷型宿主的原养型、杀生物剂抗性(例如，抗生素)或对重金属诸如铜的抗性。可以将选择标记基因直接连接到待表达的DNA序列，或通过共转化将其引入相同细胞中。mRNA的最佳合成可能还需要另外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施方案中，将克隆的可变区基因与如上所讨论合成的重链和轻链恒定区基因(例如，人恒定区基因)一起插入表达载体中。
在其他实施方案中，可使用多顺反子构建体来表达抗原结合蛋白。在此类表达系统中，可从单个多顺反子构建体中产生多个感兴趣的基因产物，诸如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980，该专利以其全文通过引用并入本文用于所有目的。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本申请所公开的全部范围的多肽。
更一般来讲，一旦已经制备编码抗体或其片段的载体或DNA序列，就可将表达载体引入适当的宿主细胞中。也就是说，可转化宿主细胞。可以通过本领域技术人员熟知的各种技术将质粒引入宿主细胞中。这些包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与包膜DNA融合、显微注射和完整病毒感染。参见Ridgway,A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”第24.2章,第470-472页,Vectors,Rodriguez和Denhardt编辑(Butterworths,Boston,Mass.1988)。可以通过电穿孔将质粒引入宿主中。使转化细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
如本文所用，术语“转化”应在广义上使用，是指将DNA引入接受宿主细胞中，从而改变基因型并因此导致接受细胞的变化。
沿着同样的思路，“宿主细胞”是指已经用使用重组DNA技术构建并编码至少一种异源基因的载体转化的细胞。在从重组宿主中分离多肽的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，表示抗体的来源，除非另外明确指定。换句话说，从“细胞”中回收多肽可意指从离心后的完整细胞中回收，或者从含有培养基和悬浮细胞两者的细胞培养物中回收。
在一个实施方案中，用于抗体表达或融合蛋白表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的。本领域技术人员可以确定最适合在其中表达期望基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR阴性)、HELA(人宫颈癌)、CV-1(猴肾系)、COS(CV-1与SV40 T抗原的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、293(人肾)等。在一个实施方案中，所述细胞系提供了由其表达的抗体的改变的糖基化，例如无岩藻糖基化(例如，PER.(Crucell)或FUT8敲除的CHO细胞系(/>细胞)(Biowa,Princeton,N.J.))。宿主细胞系通常可从商业服务机构(例如，美国组织培养物保藏中心)或从公开的文献中获得。
体外产生允许扩大规模以得到大量的期望多肽。在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的，并且包括均相悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)或固定或截留细胞培养(例如，在中空纤维、微囊、琼脂糖微珠或陶瓷盒中)。如果必要和/或需要，可以通过常规层析方法来纯化多肽的溶液，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析和/或(免疫)亲和层析。
也可以在非哺乳动物细胞诸如细菌或酵母或植物细胞中表达编码本发明特征的抗原结合蛋白的基因。在这点上，应当理解，也可以转化各种单细胞非哺乳动物微生物诸如细菌，即能够在培养或发酵中生长的那些。对转化敏感的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应当理解，当在细菌中表达时，蛋白质可以成为包涵体的一部分。必须分离、纯化蛋白质，然后将其组装成功能分子。
除了原核生物之外，还可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，尽管许多其他菌株也是常用的。对于在酵母属(Saccharomyces)中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,Nature,282:39(1979)；Kingsman等人,Gene,7:141(1979)；Tschemper等人,Gene,10:157(1980))。该质粒已经含有TRP1基因，该基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株(例如，ATCC号44076或PEP4-1)提供了选择标记(Jones,Genetics,85:12(1977))。trp1损伤的存在作为酵母宿主细胞基因组的特征然后为在不存在色氨酸的情况下检测生长转化提供了有效的环境。
施用抗原结合蛋白、细胞因子和融合蛋白的方法
制备本公开的抗原结合蛋白、细胞因子或融合蛋白以及本文所述的核酸、本文所述的载体、本文所述的宿主细胞或本文所述的组合物以及将其施用于受试者的方法是本领域技术人员熟知的或容易确定的。本公开的抗原结合蛋白的施用途径可以是例如口服、肠胃外、通过吸入或局部。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。在某些实施方案中，抗原结合蛋白或融合蛋白静脉内施用。如本文所用的术语“眼内”包括但不限于结膜下、玻璃体内、眼球后或前房内。如本文所用的术语“局部”包括但不限于用液体或溶液滴眼剂、乳剂(例如，水包油乳剂)、混悬剂和软膏剂施用。
虽然所有这些施用形式都被清楚地预期在本公开的范围内，但施用形式将是用于注射的溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可包含缓冲剂(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在与本文的教导相容的其他方法中，可以将修饰的抗体直接递送到不利细胞群体的部位，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。
用于治疗相关疾患的本公开的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用的方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。
如前所讨论，本公开的抗原结合蛋白或融合蛋白、其缀合物或重组体可以用于体内治疗哺乳动物病症的药学有效量施用。在这点上，应当理解，所公开的抗原结合蛋白将被配制成有利于施用并促进活性剂的稳定性。
根据本公开的药物组合物通常包括药学上可接受的无毒无菌载剂，诸如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。出于本申请的目的，抗原结合蛋白的药学有效量应被认为意指足以实现与抗原的有效结合并实现益处(例如，改善疾病或病症的症状或者检测物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况下，抗原结合蛋白通常将能够与肿瘤细胞或免疫反应性细胞上的选定免疫反应性抗原相互作用，并增加这些细胞的死亡。当然，本公开的药物组合物可以单剂量或多剂量施用以提供药学有效量的经修饰的结合多肽。
与本公开的范围一致，本公开的抗原结合蛋白可根据上述治疗方法以足以产生治疗或预防效果的量施用于人或其他动物。本公开的抗原结合蛋白可以以通过根据已知技术将本公开的抗原结合蛋白与常规药学上可接受的载剂或稀释剂组合而制备的常规剂型施用于此类人或其他动物。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载剂或稀释剂的形式和特征由将与其组合的活性成分的量、施用途径和其他熟知变量决定。本领域技术人员还将理解，包含本公开中所述的一种或多种抗原结合蛋白的混合物可证明是特别有效的。类似地，本文所述的核酸、本文所述的载体、本文所述的宿主细胞(特别是携带CAR的免疫细胞)或本文所述的组合物可根据上述治疗方法以足以产生治疗或预防效果的量施用于人或其他动物。
如本文所用的“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化反应标准(诸如标准眼科反应标准)得到的本公开的药物组合物对疗法的反应。使用本公开的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指该组合物对其预期目的的有效性，即该组合物产生其期望效果的能力。体内功效可通过针对特定疾病确立的标准方法来监测。另外，可使用各种疾病特定临床化学参数和其他确立的标准方法。
在一些实施方案中，本文所述的化合物和细胞与一种或多种不同的药物化合物组合施用。一般来讲，本文所述的化合物和细胞的治疗用途可与选自由抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法、放射疗法或疫苗疗法组成的组的一种或多种疗法组合。
治疗方法
本文描述了通过施用本公开的抗原结合蛋白、细胞因子或融合蛋白来治疗患者的与uPAR表达相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，与uPAR表达相关的疾病或病症是癌症(例如，表达uPAR的癌症或表达uPAR的肿瘤)。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物、uPAR结合蛋白或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述药物组合物或融合蛋白与细胞因子或其变体或第二融合蛋白同时施用，其中所述第二融合蛋白包含与所述第一融合蛋白不同的细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述药物组合物或融合蛋白与细胞因子或其变体或第二融合蛋白顺序施用，其中所述第二融合蛋白包含与所述第一融合蛋白不同的细胞因子或其变体。
在某些实施方案中，所述细胞因子或其变体包含IL-12p35亚基或IL-12p40亚基。
在某些实施方案中，所述患者的肿瘤中的所述融合蛋白清除率低于所述患者的血清中的所述融合蛋白清除率。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的融合蛋白和非融合IL-12亚基，其中：
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体，或IL-12p40亚基或其变体；并且
(b)非融合IL-12亚基包含IL-12p35亚基或其变体，或IL-12p40亚基或其变体，
其中当所述融合蛋白包含IL-12p35亚基或其变体时，所述非融合IL-12亚基包含IL-12p40亚基或其变体，并且当所述融合蛋白包含IL-12p40亚基或其变体时，所述非融合IL-12亚基包含IL-12p35亚基或其变体。
在某些实施方案中，所述融合蛋白和非融合IL-12亚基顺序施用。
在某些实施方案中，所述融合蛋白和非融合IL-12亚基中的一种或两种静脉内施用。
在某些实施方案中，首先施用所述融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述非融合IL-12亚基。
在某些实施方案中，首先施用所述融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述非融合IL-12亚基。
一方面，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中：
(a)所述第一融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)上的第一表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体；并且
(b)所述第二融合蛋白包含：
(i)与uPAR上的第二表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p40亚基或其变体。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是相同的。
在某些实施方案中，所述第一表位和第二表位是不同的。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白顺序施用。
在某些实施方案中，所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种静脉内施用。
在某些实施方案中，首先施用所述第一融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第一融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述第二融合蛋白。
在某些实施方案中，首先施用所述第一融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第一融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述第二融合蛋白。
在某些实施方案中，首先施用所述第二融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第二融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述第一融合蛋白。
在某些实施方案中，首先施用所述第二融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第二融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述第一融合蛋白。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本文所公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等效物对本文所述的方法进行其他合适的修改和调适，这将是显而易见的。现已详细描述某些实施方案，通过参考以下实施例将使实施方案得到更清楚的理解，包括所述实施例只是出于说明目的，并不意图进行限制。
实施例
实施例1-亲本抗uPAR抗体的产生和表征
通过交替注射重组人uPAR和小鼠uPAR细胞外结构域蛋白对NZBW小鼠进行免疫。产生杂交瘤并在ELISA中和在过表达uPAR的HEK293细胞中针对人和小鼠uPAR进行筛选，以鉴定对人和小鼠uPAR具有结合特异性的抗体。通过ELISA进一步筛选排名靠前的克隆与uPAR配体uPA结合的变体的结合，所述变体包括1)具有和不具有人uPA的人uPAR，2)具有和不具有小鼠uPA的小鼠uPAR，以及3)具有H47C/N259C突变的人uPAR(模拟配体结合的构象的人uPAR变体)。以下氨基酸序列用于筛选：
人uPAR-His-AviTag融合体
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRGGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE
小鼠uPAR-His-AviTag融合体
LQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDEDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPTGGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE
人uPA-His-AviTag融合体
MYRMQLLSCIALSLALVTNSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCAGGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE
小鼠uPA-His-AviTag融合体
MYRMQLLSCIALSLALVTNSGSVLGAPDESNCGCQNGGVCVSYKYFSRIRRCSCPRKFQGEHCEIDASKTCYHGNGDSYRGKANTDTKGRPCLAWNAPAVLQKPYNAHRPDAISLGLGKHNYCRNPDNQKRPWCYVQIGLRQFVQECMVHDCGGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE
指定为M1、M5、M8和M43的抗体各自独立于配体uPA结合人uPAR并被选择用于进一步表征。
M1、M5、M8和M43的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)氨基酸序列以及HCDR1-3和LCDR1-3氨基酸序列在下表3中列举。
表3-亲本抗体序列
/>
测定抗uPAR抗体M1、M5、M8和M43的结合亲和力。基于生物层干涉测量(BLI)技术使用Octet平台进行结合亲和力分析。简言之，经由抗小鼠Fc(AMC)传感器固定uPAR抗体。以10μg/mL的浓度测试每种uPAR抗体。负载是组氨酸标记的人uPAR(Sino#10925-H08H)。使用裸传感器作为对照。每种抗体对人uPAR的结合亲和力在下表4中列举。
表4-亲本抗体结合亲和力数据
uPAR抗体 KD(M) k on(1/Ms) k dis(1/s) Full R2
M8 1.08E-09 5.84E+05 6.30E-04 0.994079
M43 7.47E-09 1.18E+06 8.83E-03 0.998659
M1 5.11E-10 6.64E+05 3.40E-04 0.999416
M5 3.31E-08 2.91E+04 9.62E-04 0.983345
使用Octet平台进行另外的结合亲和力分析，将组氨酸标记的人uPAR以10μg/mL的浓度固定在传感器上。负载是M1、M5、M8和M43中的每一种。使用裸传感器作为对照。当固定人uPAR时，每种抗体对人uPAR的结合亲和力在下表5中列举。每种抗体显示出小于1pM的结合亲和力，表明存在亲合力效应。
表5-结合亲和力数据
uPAR抗体 KD(M) k on(1/Ms) k dis(1/s) Full R2
M8 <1.0E-12 3.11E+05 <1.0E-07 0.985572
M43 <1.0E-12 5.54E+05 <1.0E-07 0.990357
M1 <1.0E-12 4.48E+05 <1.0E-07 0.982889
M5 <1.0E-12 2.83E+04 <1.0E-07 0.985581
使用以上叙述的Octet平台表征每种抗体的uPAR结合表位。通过SA传感器以10μg/ml捕获生物素化的人uPAR变体、uPAR DII-DIII结构域或uPAR DIII结构域180秒，随后结合浓度为200nM的M1、M5、M8、M43或ATN 568 150秒。以下氨基酸序列用于DII-DIII结构域和DIII结构域：
人uPAR DII-DIII结构域HisAvi标签
MYRMQLLSCIALSLALVTNSGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRGGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE
人uPAR DIII结构域HisAvi标签
MYRMQLLSCIALSLALVTNSGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRGGSHHHHHHGGSGLNDIFEAQKIEWHE
M1、M5、M8和M43与人uPAR的DII-DIII结构域结合，而M1也能够结合单独的DIII(图1A、图1B)。发现M1、M5、M8和M43中的每一种都独立于与uPAR结合的uPA(uPAR配体)与uPAR结合。使用抗uPAR抗体ATN-658作为比较物。
为了测试抗体和uPA配体竞争结合，通过SA传感器以3.2μg/ml(200nM)捕获人uPA45秒。将人重组蛋白uPAR-His以100nM加载180秒，随后以200nM的浓度加载M1、M5、M8、M43或ATN 568150秒。
使用Octet平台进行抗体竞争测定。通过将生物素化的人uPAR捕获在SA传感器上进行抗体竞争测定。然后加载M1、M5、M8、M43和ATN-658作为第一配体从而以预定的饱和浓度结合人uPAR。一旦第一配体达到饱和，则加载M1、M5、M8、M43和ATN-568作为第二配体以与M1、M5、M8、M43或ATN-658竞争。第二配体结合溶液含有相同浓度的第一预加载配体以防止其在第二配体结合期间解离。发现M1仅与比较物抗体ATN-658竞争。M5与M43竞争。M1、M8或M43都不相互竞争与人uPAR结合，表明这三种抗体对人uPAR具有独特的表位(即，抗体是非竞争性的)。基质竞争测定数据在下表6中列举。
表6-抗体竞争总结数据。显示竞争的值以粗体显示。
抗体 M1 M5 M8 M43 ATN-368 缓冲液
M1 -0.0441 0.1611 0.3019 0.3122 -0.0144 -0.0137
M5 0.3646 -0.0173 0.3211 0.0175 0.3865 -0.0149
ATN-368 -0.0232 0.1793 0.3104 0.3421 -0.0274 -0.0053
无 0.3049 0.1809 0.2841 0.295 0.3304 -0.0009
接下来测试抗体结合在细胞表面上表达的人和小鼠uPAR的能力。将被工程化为表达人uPAR或小鼠uPAR的人HEK293细胞进行染料标记并与未标记的亲本HEK293细胞混合。将细胞与100nM人和小鼠uPA(uPAR配体)中的每一种一起孵育30分钟，然后用uPAR抗体的滴定液处理30分钟。使用抗小鼠IgG藻红蛋白(PE)标记的第二抗体来检测uPAR抗体结合。测试抗体浓度的中值荧光强度(MFI)值在图2A和图2B中示出。EC50值在下表7中列举。没有uPA配体的细胞结合的EC50值与有uPA配体的实验相似。M1、M5、M8、M43 EC50结合值均优于比较物ATN-658。
表7-细胞结合测定中抗PAR抗体的EC50值
实施例2-亲本抗uPAR抗体的人源化
将上述抗uPAR亲本抗体M1、M8和M43继续用于人源化。首先确定每种抗体的各种参数，包括1)每种小鼠抗体与人抗体序列的天然人源化百分比同一性；2)免疫原性区域(例如，T细胞、B细胞和MHC-II抗原性表位)；3)抗体错误折叠问题(例如，聚集和热稳定性)；以及4)翻译后修饰(PTM)。PTM包括脱酰胺位点(例如，Asn-Gly(NG)，使天冬酰胺变为天冬氨酸/异天冬氨酸)、异构化位点(例如，Asp-Gly(DG)、Asp/Asp(DD)，使天冬氨酸变为异天冬氨酸)、糖基化位点(例如，Asn-X-Ser/Thr(NXS)氨基酸基序，其中“X”是任何氨基酸，诸如NLS)、氧化位点(例如，Met和/或Trp氨基酸，其可以是表面暴露的和/或在抗体的CDR中)、蛋白水解位点(例如，Asp-Ser(DS)和/或Asp-Pro(DP)氨基酸基序)。
然后产生人源化抗体。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)氨基酸序列以及HCDR1-3和LCDR1-3氨基酸序列在下表8中列举。包括抗体的恒定区的全长重链(HC)和轻链(LC)氨基酸序列在下表9中列举。单链可变(scFv)形式抗体氨基酸序列在下表10中列举。
表8-人源化抗体VH/VL和HCDR1-3/LCDR1-3氨基酸序列
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表9-人源化抗体全长氨基酸序列
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表10-ScFv抗体氨基酸序列
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测定人源化抗uPAR抗体M1、M8和M43的结合亲和力。使用如上所述的Octet平台进行结合亲和力分析。简言之，经由抗人Fc(AHC)传感器固定uPAR抗体。以10μg/mL的浓度测试每种uPAR抗体。负载是组氨酸标记的人uPAR，从50nM开始滴定，随后稀释2倍。测试的人源化抗体对人uPAR的结合亲和力在下表11中列举。值得注意的是，与亲本抗体相比，人源化抗体保持与人uPAR相似的结合亲和力。
表11-人源化抗体结合亲和力数据
抗体 KD(M) k on(1/Ms) k dis(1/s)
M1-嵌合 1.11E-09 6.29E+05 7.01E-04
M1–H1/L4 1.48E-09 6.65E+05 9.86E-04
M1–H3/L1 1.64E-09 6.77E+05 1.11E-03
M1–H3/L4 1.30E-09 6.86E+05 8.93E-04
M8-嵌合 1.79E-09 2.73E+05 4.90E-04
M8–H3/L2B2 1.74E-09 2.46E+05 4.27E-04
M8–H3/L2B5 1.65E-09 2.13E+05 3.51E-04
M8–H3/L2B10 2.35E-09 2.03E+05 4.77E-04
M43-嵌合 1.51E-08 4.02E+05 6.06E-03
M43–H1bm5/L4 1.59E-08 4.15E+05 6.58E-03
M43–H4bm5/L4 1.47E-08 4.54E+05 6.66E-03
实施例3-白介素12(IL-12)工程化
IL-12是由p35亚基和p40亚基(它们缔合以形成IL-12p70)构成的异二聚体细胞因子。IL-12由抗原呈递细胞表达并在免疫-肿瘤学生命周期中起多种作用。IL-12是免疫应答的强效刺激物，但毒性问题限制了IL-12在临床中的使用。局部递送可降低毒性，但这妨碍了全身递送。
工程化p35亚基和p40亚基中的一者或两者提供了若干优点。可以在每个亚基中进行一组“锁和钥匙”突变，以调节两个亚基之间的亲和力并增强特异性。例如，引入工程化亚基中的突变可减少对野生型亚基的识别，从而进一步降低毒性。p35与p40之间的界面处的配对电荷残基可被工程化为引入进一步的特异性。
IL12p35/IL12p40半胱氨酸残基工程化
作为初始优化策略的一部分，在p35和p40中鉴定了若干个点突变以提高稳定性和表达。在p35的C74与p40的C177之间形成分子间二硫桥。用p35的C74和p40的C177处的氨基酸取代进行筛选以消除二硫桥，同时保持或提高这两个亚基之间的结合亲和力。对于p35，产生取代C74S、S(SS1)、D、K、R、Q、W和Y。对于p40，产生取代C177S、H、M、F、Y、R、K、E、Q、I、W和N。S(SS1)对应于p35中的C15S、C88S和C74S取代。C15S/C88S对在内部二硫桥中除去。然后针对p40 C177变体中的每一种测试每种p35 C74变体。使用上述Octet平台测量结合亲和力。简言之，传感器负载有5-10μg/mL的p35或p40。以500nM至7.8nM的浓度范围提供捕获化合物。如图3所示，若干种p35/p40变体对表现出高结合亲和力。
选择p35/p40变体对用于进一步结合亲和力表征。具体而言，将p35 C74D、K、W和Y变体与p40 C177S或C177F变体配对。完整的结合亲和力数据在下表12和13中列举。如下所示，每个p35/p40变体对显示出高结合亲和力。
表12–p40 C177S对p35 C74D、K、W和Y的结合亲和力
表13–p40 C177F对p35 C74D、K、W和Y的结合亲和力
除了以上叙述的二硫桥取代外，还在p40(C252)中鉴定了游离硫醇。该位点也被工程化为C252S取代以除去游离硫醇。
IL12p35/IL12p40工程化–稳定性增强
虽然将p35和p40连接到融合配偶体可以提高稳定性和生产产量(见下文)，但是将有利的是工程化亚基以在没有融合配偶体的情况下提高稳定性。p35本身特别不稳定，需要融合配偶体或p40显著辅助才能正确折叠和表达。
在开始时，p35中的S27D和D188N突变是经由定向分子进化方法鉴定的(参见Leong等人,PNAS.100(3):1163-1168.2003)。p35取代可用于提高产量。
在p35上鉴定了若干个表面暴露的疏水区和柔性区。使用计算机建模与仿真方法来鉴定可以提高p35稳定性的潜在氨基酸突变(即，取代、缺失和/或插入)。作为第一遍，通过δ-δG(ddG，即WT和突变体p35的δG之间的差异)、溶解性、位置特异性评分矩阵(pssm)评分和表位预测对85个单点突变进行分级。该过程试图引入极性残基代替暴露于溶剂的疏水性残基以获得更好的溶解性，并在内部引入庞大的疏水性残基以获得更好的芯填充。通过蛋白质印迹测试每个单突变体的表达和稳定性。在蛋白质印迹分析后，纯化蛋白质并通过HPLC测试以确定单体％和聚集％。通过蛋白质印迹测试的点突变在下表14中列举。样品ID号70-90是p35-鼠血清白蛋白(MSA)融合体。粗斜体文本的样品ID号(ID 72、75、76、80、82、83)显示出测试的那些中的最佳表达，尽管所有p35-MSA融合体都表达。
表14–通过蛋白质印迹测试点突变的表达
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蛋白质印迹分析后，通过HPLC测试样品ID号69-90(p35-MSA融合体)以确定单体％和聚集体％。结果在下表15中描绘，其示出了若干种p35点突变体相对于WT p35具有更大的单体含量％。
表15–测试点突变的单体％和聚集体含量％
/>
单点突变体筛选的结果揭示了提高p35表达和稳定性的若干个点突变。特别地，以下单一p35突变体显示出与WT p35-MSA融合体相似或超过该融合体的值的单体值％：
M12S、S27D、F39D、F39H、S44K、M111F、M111W、V114I、M119L、M145L、F150Y、L161D、L161Q。
双重突变体Q35E/N28R也显示出超过WT p35-MSA融合体的值的单体％值。
将测试双重突变以进一步改善这些参数。
IL12p35/IL12p40融合体
IL-12亚基p35和p40存在若干制造挑战，在可以使用IL-12作为可行的治疗剂之前应克服这些挑战。p35显示出几乎没有表达。可以通过将p35连接到融合配偶体(诸如抗体或其片段或者人血清白蛋白(HSA))来提高表达。p35也易于聚集。p40显示出相似的挑战。p40可以在没有融合配偶体的情况下表达，但纯化的组合物通常被p40同二聚体(约15-20％)污染。p40还易于在37℃下随时间二聚化和聚集。
用各种融合配偶体在37℃下测试p35和p40亚基的稳定性。用抗体Fab融合配偶体和全长IgG融合配偶体测试p40，其中两个p40亚基与IgG分子的每个CH3结构域连接。Fab和全长抗体来源于上述抗uPAR抗体。用小鼠血清白蛋白(MSA)融合配偶体和CH1-铰链-CH2-CH3抗体片段融合配偶体测试p35。还测试了单链IL-12(scIL-12)，其中p35和p40亚基通过氨基酸街头连接。示例性IL-12亚基融合蛋白在图4中描绘。通过HPLC分析测试每种融合蛋白以测量37℃下0小时、24小时、48小时、1周和2周的聚集体和二聚体形成。每种融合蛋白的结果在下表16至表21中列举。结果证明，将p35和p40亚基与各种融合配偶体连接可以减少聚集和同二聚体形成。
表16–单独的p40亚基。预测分子量(Da)–37087。粗体值表示单体。其他值代表聚集体和二聚体。预测MW和计算MW的差异部分是由于蛋白质糖基化。
表17–p40-Fab融合体。预测分子量(Da)–62310。粗体值表示单体。其他值代表聚集体和二聚体。预测MW和计算MW的差异部分是由于蛋白质糖基化。
表18–p40-IgG融合体。预测分子量(Da)–215845。粗体值表示单体。其他值代表聚集体和二聚体。预测MW和计算MW的差异部分是由于蛋白质糖基化。
时间点 计算MW(Da) 内插Y值 洗脱时间(Vt) 面积％
0小时 246412 5.392 3.787 100
24小时 803801 5.905 3.162 4
239288 5.379 3.779 96
48小时 912829 5.960 3.128 10
240573 5.381 3.793 90
1周 1114509 6.047 3.061 69
242653 5.385 3.791 31
2周 1179011 6.072 3.054 93
237524 5.376 3.815 7
表19–p35-MSA融合体。预测分子量(Da)–92118。粗体值表示单体。其他值代表聚集体和二聚体。预测MW和计算MW的差异部分是由于蛋白质糖基化。
表20–p35-CH1-铰链-CH2-CH3抗体片段融合体。预测分子量(Da)–124339。粗体值表示单体。其他值代表聚集体和二聚体。预测MW和计算MW的差异部分是由于蛋白质糖基化。
表21–scIL-12。预测分子量(Da)–61001。粗体值表示单体。其他值代表聚集体和二聚体。预测MW和计算MW的差异部分是由于蛋白质糖基化。
接下来测试p35-MSA融合蛋白和p40-fab融合蛋白在37℃下随时间变化的相互结合亲和力。使用上述Octet平台，将生物素化的p35-MSA以50nM至0.78nM的浓度范围固定，其中p40-fab以10-20μg/mL的浓度作为负载。0小时、4小时、24小时和47小时的结合亲和力数据在下表22中报告。结果显示p35/p40亲和力甚至在37℃下47小时后仍然很高。
表22–37℃下的p35-MSA/p40-fab结合亲和力
时间 KD(M) KD误差 k on(1/Ms) k on误差 k dis(1/s) k dis误差 Full R2
0小时 7.82E-09 4.78E-11 5.91E+04 2.15E+02 4.62E-04 2.27E-06 0.999
4hr 7.54E-09 5.34E-11 5.11E+04 1.94E+02 3.85E-04 2.30E-06 0.999
24hr 1.11E-08 6.70E-11 3.81E+04 1.32E+02 4.22E-04 2.10E-06 0.999
47hr 1.05E-08 8.68E-11 3.58E+04 1.60E+02 3.76E-04 2.61E-06 0.999
实施例4-分裂IL-12活性
当p35亚基和p40亚基能够异二聚化以形成IL-12p70时，IL-12的治疗益处至少部分实现。为此，测试了具有不同融合配偶体的每种亚基异二聚化的能力。测试的融合蛋白组合在下表23中列举。
表23–IL-12亚基组合
在基于细胞的体外IL-12活性测定中测试以上叙述的组合。简言之，将冷冻的T细胞(在测定开始之前与rhIL-2+CD3/CD28一起培养9天)解冻，以300,000个细胞/孔接种并在37℃下静置1小时。将IL-12亚基以1:1的比率添加到T细胞中(每种分子的最终起始浓度为250nM)。然后检测磷酸化的Stat4(pStat4)和IFNγ。对于pStat4检测测定，将细胞和IL-12亚基在37℃下孵育45分钟。对于IFNγ检测测定，将细胞和IL-12亚基在37℃下孵育24小时，然后收集上清液。
测试每种组合在CD8+(图6A)和CD4+(图6B)T细胞中诱导Stat4磷酸化的能力。简言之，将来自每个样品的细胞固定并与用荧光团藻红蛋白(PE)标记的抗pStat4抗体一起孵育。然后检测荧光。CD8+T细胞的EC50值和相对于scIL-12的EC50倍数变化在下表24中列举，而CD4+T细胞的这些数据在下表25中列举。
表24–CD8+T细胞中pStat4形成％的EC50值
表25–CD4+T细胞中pStat4形成％的EC50值
还测试了每种组合在细胞中诱导IFNγ产生的能力(图7)。使用MSD T-Plex细胞因子测定系统。MSD测定是一种基于ELISA的测定，其中将MSD板用IFNγ的捕获抗体预包被。在板上孵育样品后，使用也结合IFNγ的标记检测抗体进行化学发光检测。EC50值和相对于scIL-12的EC50倍数变化在下表26中列举。
表26–IFNγ产生的EC50值
实施例5-抗uPAR/IL-12亚基融合体
为了增强IL-12的治疗效力，同时减少毒性问题，将IL-12亚基(p35和p40)与上述亲本抗uPAR抗体连接。uPAR抗体-IL-12亚基融合体可以将亚基递送到表达uPAR的靶组织或细胞(例如，肿瘤组织或细胞)，从而确保仅在靶位点恢复强效IL-12活性。为此，测试了具有不同uPAR抗体融合配偶体的每种亚基异二聚化的能力。测试的融合蛋白组合和p35与p40之间的结合亲和力在下表27中列举。uPAR抗体融合体与uPAR(uPAR-his和uPAR-Fc)之间的结合亲和力也在下面列举。
表27–uPAR抗体-IL-12亚基融合体的结合亲和力
*由于IgG分子的亲和力而未获得亲和力值
接下来用体内小鼠肿瘤模型测试选择的融合蛋白，以显示来自放射性标记的肿瘤靶向IL-12亚基p40(图5A)和p35(图5B)的PET/CT成像的肿瘤和血清药代动力学。测量随时间在小鼠的肿瘤和血液中的肿瘤靶向亚基，并且测定最大暴露的％。肿瘤靶向p40是Fab形式的抗uPAR抗体M37与p40的融合体。肿瘤靶向p35是KiH形式的抗uPAR抗体M37与p35的融合体。简言之，向携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠施用摩尔质量为15.5-16.9nmol/kg(目标：16.4nmol/kg)且放射性剂量为182至192μCi的锆-89(89Zr)标记的融合蛋白(在200μL中，静脉内(尾静脉)注射)。随后在注射后4小时、24小时、48小时、72小时和168小时经由PET/CT对小鼠成像。在每个成像时间点，收集血液用于γ计数。
靶向IL-12亚基的肿瘤清除慢于血清清除，从而促进肿瘤特异性装配。
还用体内小鼠肿瘤模型测试了以上叙述的融合蛋白，以显示肿瘤和肝脏积累。使用三种抗uPAR抗体融合蛋白作为肿瘤靶向化合物，并将它们与非靶向scIL-12或p35-MSA融合蛋白进行比较。三种靶向融合蛋白是Fab-p40、IgG-p40和p35-KiH。对每种化合物进行放射性标记以追踪小鼠中的组织积累。如上用89Zr标记的融合蛋白进行测定。如图8A所示，靶向化合物在肿瘤中积累，然后开始随时间消散。非靶向化合物不能累积。图8B示出了随时间的肝脏累积，证明化合物被逐渐清除。靶向化合物以较慢的速率被清除，表明与非靶向化合物相比保留更好。
然后在人源化小鼠模型中测试融合体，以测试顺序施用的人IL-12亚基的体内活性。通过注射1x107个人PBMC使免疫缺陷NCG小鼠人源化。14天后，用PBS(媒介物)、scIL-12或两个剂量的裂解IL-12分子处理小鼠。对于裂解IL-12分子，p35-MSA与p40-Fab一起施用。scIL-12以0.24mg/kg施用，而裂解IL-12分子以各0.6mg/kg(scIL-12剂量的2.5倍)和各6mg/kg(scIL-12剂量的25倍)施用。注射之间的间隔小于5分钟。然后在不同的时间点对小鼠进行血清取样，以用于血清药代动力学和药效动力学(血清IFNγ浓度)分析。数据显示分裂融合分子在体内起作用。数据还显示单链与裂解分子之间相似的药效动力学反应，使得在以下实验中，人们可以区分这些处理的血清和肿瘤活性(图9)。值得注意的是，scIL-12的2.5倍剂量导致较少的IFNγ产生，表明分裂IL-12融合体的脱靶毒性问题减少。该数据进一步证明了裂解IL-12分子在体内装配的能力。
测试了另外的融合蛋白以及双重靶向的潜力(即，抗体-p35融合体和抗体-p40融合体，其中每种抗体结合相同靶蛋白上的不同表位)。IL-12亚基附接到与人uPAR结合的抗体变体M1和M8。在该测定中，通过将各种组分顺序添加到人uPAR阳性HEK细胞中、然后洗涤来构建IL-12p70复合物。然后将表达uPAR的HEK细胞与CD8+T细胞一起孵育，并测定所述T细胞上的pSTAT4活性。使用M37抗体作为非靶向对照，因为该抗体与小鼠uPAR结合并且不与人uPAR交叉反应。使用scIL-12作为非靶向单一化合物。使用scIL12-M8 Fab融合体作为靶向单一化合物。组合使用M37-p40-Fab和M37-p35-KiH作为非靶向阴性对照。组合使用M8-p40-Fab和M37-p35-KiH作为单一靶向组合(即，只有一个IL-12亚基靶向uPAR)。组合使用M8-p40-Fab和M1-p35-KiH-Fab作为双重靶向组合(即，两个IL-12亚基p35和p40都靶向uPAR)。简言之，用以下方案进行测定：
1)将50,000个表达uPAR的HEK细胞接种在96孔U形底低附接/结合板(CorningProduct#4520)的每个孔中。
2)将板离心，并将细胞用100μL第一分子的滴定液重悬浮。
3)将细胞和第一分子在4℃下孵育30分钟。
4)将细胞离心并洗涤两次。
5)将细胞用100μL第二分子的滴定液重悬浮。
6)将细胞和分子在4℃下孵育30分钟。
7)将细胞离心并洗涤三次。
8)将预先冷冻的人T细胞(在37℃下静置1小时)以每孔100,000个细胞添加到孔中。
9)将板置于培养箱中1小时(37℃)。
10)将板离心、洗涤，并开始下游染色方案。
在T细胞孵育步骤后，测定所述T细胞上的pSTAT4活性。
与靶向亚基相比，非靶向亚基或非靶向scIL-12显示出降低的活性。相对于所有非靶向方法，单一靶向组合显示增强的活性。最后，双重靶向亚基与单独靶向对相比具有提高的活性，并且与靶向scIL-12相比恢复大部分活性，同时具有降低的全身毒性(图10)。
用亲本抗uPAR抗体产生以上叙述的融合蛋白。还产生了具有人源化抗uPAR抗体的类似融合蛋白。M1融合体的氨基酸序列在下表28中列举。M8融合体的氨基酸序列在下表29中列举。M43融合体的氨基酸序列在下表30中列举。
表28–人源化M1抗体-IL-12亚基融合体氨基酸序列
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表29–人源化M8抗体-IL-12亚基融合体氨基酸序列
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表30–人源化M43抗体-IL-12亚基融合体氨基酸序列
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实施例6-另外的uPAR靶向融合蛋白
融合蛋白实施例6的设计
根据实施例6设计和/或合成的融合蛋白构建体见表31。使用表31中发现的这些氨基酸序列中的一些作为以下实验实施例的对照。为了在小鼠模型和小鼠细胞系统中进行测试，包括为了在小鼠实验中进行更好结合而修饰的涉及小鼠蛋白或人蛋白的序列。使用针对小鼠实验修饰的小鼠蛋白或人蛋白的任何构建体可用完全人蛋白取代。
为了在哺乳动物细胞中表达，将N末端前导序列添加到表31中发现的某些融合蛋白构建体中。而且，将6xHis和FLAG标签以及抗生物素蛋白多肽添加到表31中发现的某些融合蛋白构建体中，以便于在重组过程期间进行纯化。
应当理解，可修饰表31中实施例6的融合蛋白的构建体，以例如修饰多肽分子之间的接头分子的氨基酸组成或长度，而不损失期望的生物活性。各种多肽的融合顺序可改变，使得例如uPAR靶向结构域区可位于融合蛋白的细胞因子或免疫检查点调节剂部分的N末端或C末端，或者可经由任选的接头将其他融合蛋白(诸如Fc融合蛋白或人血清白蛋白(HAS)融合蛋白)添加到表31中的构建体中。表31中的缩写包括：单链(sc)；环状排列(cp)加扰序列(ss)。
表31-实施例6中所述的多肽的氨基酸序列
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实施例6的重组程序、蛋白质表达和蛋白质纯化
基因合成和亚克隆到哺乳动物表达载体中
使用标准分子生物学方法进行用于表达设计的构建体的基因的合成和亚克隆。
蛋白质表达
按照制造商的方案，使用EXPI293TM表达系统试剂盒(ThermoFisher Scientific)表达所有蛋白质。
蛋白质纯化
收获表达培养上清液后，根据融合蛋白的性质捕获表达的蛋白质。将含有IgG Fc(小鼠或人)的蛋白质捕获在蛋白A柱上，并用至多5个柱体积的PBS洗涤该柱。通过降低运行缓冲液的pH从柱中洗脱蛋白质，并将其用Tris缓冲液(pH 8)直接中和。然后将纯化的蛋白质针对PBS透析过夜。对于含有六组氨酸(6xHis)融合体的蛋白质，将上清液中的蛋白质捕获在Ni-NTA琼脂糖树脂上，并用增加浓度的咪唑洗脱。然后将纯化的蛋白质针对PBS透析过夜。
基于IL-2和IL-15的融合蛋白与人或小鼠uPAR结合的动力学测量-实施例6
将重组小鼠uPAR-Fc(R&D Systems，目录号531-PA-100)捕获在使用人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare，目录号BR100839)按照制造商的方案修饰的BIACORETMCM5传感器芯片上。使测试分子以30μl/min的流速以浓度范围增加的逐步方式通过芯片2分钟。测量分析物的解离10分钟。通过流过3M MgCl2 30秒使芯片再生。用本机仪器软件(native instrumentsoftware)分析所得传感图以计算构建体的结合亲和力，并且结果在表32中呈现。
将重组人uPAR his(R&D Systems，807-UK-100/CF)生物素化，然后按照制造商的方案捕获在BIACORETM链霉亲和素传感器芯片上。使感兴趣的分子(也称为分析物)以30μl/min的流速以浓度范围增加的逐步方式通过芯片3分钟。测量分析物的解离20分钟。通过流过3M MgCl2 30秒使芯片再生。用本机仪器软件分析所得传感图以计算构建体的结合亲和力，并且结果在表32中呈现。
总体而言，基于人的IL-2或IL-15与uPA-ATF的融合体在0.59-2.2nM的范围内与人uPAR紧密结合(参见表32，SEQ ID NO:98、99和100)。与对照分子SEQ ID NO:20(人uPA-ATF；0.24nM)相比，这些融合分子以稍低的效力结合。IL-2和IL-15与小鼠uPA-ATF的融合体以与SEQ ID NO:104(小鼠uPA-ATF；0.14nM)相似的结合效力(0.14-0.24nM)与小鼠uPAR结合。另外，SEQ ID NO:110(其人cpIL-2:IL-2Rα与具有N22Y、W30R点突变体的人uPA-ATF融合)以0.12nM的KD与小鼠uPAR紧密结合。这些数据表明，基于IL-2和IL-15的序列与uPAR靶向部分(在这种情况下是在N或C末端融合的uPA-ATF)的融合在体外保持与uPAR的强效结合。
表32
被设计成激活人T细胞上的IL-2受体的分子的体外效力-实施例6
为了评估含有IL-2或IL-15的基于人序列的融合体的分子的效力，将HH细胞(CRL-2105TM)与增加浓度的SEQ ID NO:98、99、100、110、94、106和107一起孵育30分钟。孵育后，洗涤并裂解细胞，并使用STAT5α/β(Phospho)[pY694/pY699]多物种InstantOneTMELISA试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号85-86112-11)按照制造商的方案检测STAT5的磷酸化。STAT5的磷酸化是在IL-2/IL-15受体激活时诱导的受体近侧信号传导事件。数据在表33中示出。
非靶向亲本环状排列的cpIL-2:IL2Rα融合蛋白即SEQ ID NO:94在HH pSTAT5测定中表现出1.1nM的EC50。具有C末端uPAR靶向结构域的cpIL-2:IL2 Rα融合蛋白即SEQ ID NO:99、106和110具有相似的效力，EC50分别为1.5nM、1.6nM和2.1nM。SEQ ID NO:98即具有N末端uPAR靶向结构域的cpIL-2:IL2 Rα融合蛋白的效力较低，EC50为7-10nM。非靶向亲本hIL-15Ra(sushi):cpIL-15融合蛋白即SEQ ID NO:95比SEQ ID NO:94更强效，在HH pSTAT5测定中EC50为0.039nM。具有N末端靶向结构域的SEQ ID NO:95的变体也比SEQ ID NO:94更强效，对于SEQ ID NO:100和107，EC50分别为0.18nM和0.099nM。总的来说，具有C末端uPAR靶向结构域的SEQ ID NO:94的靶向变体和具有N末端靶向结构域的SEQ ID NO:95的靶向变体都与它们的非靶向亲本分子等效，表明与uPAR靶向基序融合不会在空间上阻碍/干扰细胞因子结构域与其同源受体结合。
表33
被设计成激活原代小鼠脾细胞上的IL-2受体的分子的体外效力-实施例6
为了探究含有IL-2或IL-15的基于小鼠序列的融合体的分子的效力，从野生型小鼠的脾脏中收获脾细胞，将其与增加浓度的SEQ ID NO:96、小鼠Fc:小鼠IL-15Ra:cpIL-15、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105一起孵育30分钟。然后将细胞固定并用针对表面和细胞内标记的荧光标记的抗体染色，以使用标准流式细胞术技术检测小鼠NK细胞、CD8 T细胞和CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞(Treg)上的STAT5的磷酸化。结果在表34中示出。
重组野生型IL-2(rIL-2)选择性刺激表达高亲和力IL-2受体的细胞，所述受体在正常小鼠和健康人中主要由Treg表达。在高得多的浓度下，rIL-2也可以激活NK细胞和记忆CD8 T细胞亚群，这是由于它们表达中等亲和力的IL-2受体复合物。环状排列的小鼠cpIL-2:IL2Rα融合蛋白即SEQ ID NO:96被工程化为相对于rIL-2对表达中等亲和力受体的细胞更强效。这通过在Treg、NK细胞和记忆CD8 T细胞中等效诱导pSTAT5来证明，其中EC50分别为21.6nM、19.0nM和23.2nM。具有C末端uPAR靶向结构域的小鼠cpIL-2:IL2Rα融合蛋白即SEQID NO:101对Treg、NK细胞和记忆CD8 T细胞的效力相似，其中EC50分别为16.5nM、19.5nM和27.3nM。类似地，具有N末端uPAR靶向结构域的小鼠cpIL-2:IL2 Rα融合蛋白即SEQ ID NO:105对Treg、NK细胞和记忆CD8 T细胞分别表现出21.9nM、34.9nM和38.0nM的EC50。与rIL-2相对，rmIL-15未表现出对Treg的选择性激活，因为它对IL-2/IL-15受体复合物的亲和力不因CD25的存在而增强。这通过小鼠Fc:小鼠IL-15Ra:cpIL-15在Treg、NK细胞和记忆CD8 T细胞中相似诱导pSTAT5来证明，EC50分别为0.60nM、0.047nM和0.15nM。具有N末端uPAR靶向结构域的小鼠IL-15Ra(sushi):cpIL-15融合蛋白即SEQ ID NO:102对Treg、NK细胞和记忆CD8 T细胞表现出相似效力，EC50分别为1.7nM、0.15nM和0.50nM。正如SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95的uPAR靶向变体的情况一样，鼠直向同源物的uPAR靶向变体与其非靶向亲本分子都是等效的，表明与uPAR靶向基序的融合不会在空间上阻碍/干扰细胞因子结构域与其在原代小鼠Treg、NK细胞和记忆CD8 T细胞上表达的同源受体结合。
表34
基于IL-2或IL-15的分子与表达uPAR的小鼠肿瘤细胞系的结合-实施例6
用荧光标记的抗小鼠uPAR(CD87)抗体染色，显示小鼠同基因肿瘤系4T1、CT26、EMT6(以前均得自)和MC38(来自NCI)在细胞表面上表达小鼠uPAR，如通过流式细胞术所检测。用/>溶液(目录号25056CI)剥离贴壁细胞，洗涤，然后与增加浓度的测试分子(参见表35)一起孵育。在4℃下孵育60分钟后，将细胞用荧光标记的抗His抗体染色并使用标准流式细胞术技术进行分析。将平均荧光强度对测试物浓度作图，并使用4参数逻辑曲线拟合计算EC50值。
表35
SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:110在MC38荷瘤小鼠中的药代动力学-实施例6
为了确定在血清中循环的蛋白质相对于肿瘤的比率，在MC38荷瘤雌性C57BL/6小鼠中进行单剂量PK实验。当肿瘤大小在200-400mm3范围内时，向小鼠给药。在时间0处向小鼠皮下给药30μg SEQ ID NO:94或75μg SEQ ID NO:110，然后在给药后0.5、2、4、8和24小时收集每只单独动物的末梢血液并处理成血清。还收获来自相同动物的肿瘤并快速冷冻用于下游浓度分析。通过人IL-2特异性MSD(Meso-Scale Discovery)测定分析血清样品。将肿瘤样品匀化并通过相同的检测测定测量浓度。使用WinNonlin(Phoenix)中的非房室模型测定药代动力学参数。结果在表36中示出。
当比较Cmax和AUC的肿瘤暴露与全身暴露的比率(T/S)时，与非靶向对照分子SEQID NO:94(其相对于血清在肿瘤中显示出相似的暴露比率)相比，SEQ ID NO:110即靶向uPAR的IL-2显示出更大的肿瘤渗透比率。
表36
被设计成激活IL-10受体的分子的体外效力-实施例6
STAT3磷酸化是响应于结合和激活IL-10受体的受体近侧信号传导事件。为了探究含有IL-10的融合体的分子的效力，将人外周血单核细胞与增加浓度的scIL-10:CL:CH1:Fc(scIL10 3aa接头)(＝SEQ ID NO:136，其相当于：scIL-10:CL:CH1:Fc加5AA接头加huPA-ATF)一起孵育1小时。然后将细胞固定并用针对表面和细胞内标记的荧光标记的抗体染色，以使用标准流式细胞术技术检测小鼠B细胞、单核细胞、CD4和CD8 T细胞上的STAT3的磷酸化。数据在表37中示出。
两种分子在各种细胞类型中彼此具有非常相似的效力，支持IL-10分子与uPAR靶向部分(在这种情况下是人uPA-ATF)的融合不影响分子结合和激活在人免疫细胞上表达的IL-10受体的能力。
表37
被设计成激活IL-12受体的uPAR靶向分子的体外效力-实施例6
HEK-BLUETMIL-12细胞(InvivoGen)是专门设计用于通过监测IL-12诱导的NF-κB/AP-1途径的活化来体外检测生物活性IL-12的人胚肾细胞。该细胞系在STAT4诱导型启动子的控制下表达诱导型分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。将HEK-Blue IL-1β细胞以50,000个细胞/孔铺板在含有4.5g/L葡萄糖和2mM L-glu和10％热灭活FBS(Gibco)的DMEM培养基中。将细胞在37℃、5％ CO2下与不同浓度的IL-12(R&D Systems，目录号219-IL-005/CF)或SEQ ID NO:141一起孵育20小时。通过添加QUANTI-BlueTM(InvivoGen)并在37℃、5％ CO2下孵育3小时然后在读板器上在630nm下读数来检测SEAP产生。
与野生型人IL-12(18pM)相比，与SEQ ID NO:141的人uPA-ATF构建体融合的单链人IL-12构建体具有相似的效力(27pM)，表明IL-12与uPA-ATF的融合不影响分子的IL-12部分结合和激活IL-12受体的能力。
被设计成激活人4-1BB受体的uPAR靶向分子的体外效力-实施例6
使用来自Promega的4-1BB生物测定试剂盒来测定含有4-1BB配体的融合蛋白。该测定使用稳定表达4-1BB和应答元件下游的荧光素酶的4-1BB效应细胞。在配体与受体结合时诱导荧光素酶表达。按照制造商的方案进行测定。通过在增加的浓度下孵育测试分子并测量从表达的荧光素酶产生的光来产生剂量响应曲线。数据在表38中示出。
重组人4-1BB配体单体(R&D Systems，目录号2295-4L-025/CF)在测定中未显示出活性，表明未交联的4-1BBL单体不能激活4-1BB，因为4-1BBL通常作为三聚体起作用。与未与人uPA-ATF融合的连接的4-1BBL三聚体分子(SEQ ID NO:129)(其具有0.15nM的EC50)相比，在N或C末端与人uPA-ATF融合的连接的4-1BBL三聚体(SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:131)具有更强效的EC50(和更高的最大信号)。这些结果表明，与人uPAR靶向结构域uPA-ATF融合可使得通过4-1BB进行的信号传导的活性增强2-3倍，这可能是由于与细胞表面上的uPAR强效结合引起的亲合力影响。然而，4-1BBL与uPA-ATF的融合蛋白在功能上能够结合4-1BB并通过4-1BB进行信号传导。
表38
被设计成激活人单核细胞上的GM-CSF受体的分子的体外效力-实施例6
为了评估含有GM-CSF的基于人序列的融合体的分子的效力，将U937细胞(CRL-1593.2TM)与增加浓度的重组人GM-CSF(R&D Systems，目录号215-GM-050/CF)、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:103一起孵育30分钟。孵育后，将细胞固定、透化并用荧光标记的对pSTAT5特异的抗体进行细胞内染色，并且使用标准流式细胞术技术进行分析。数据在表39中示出。
重组人GM-CSF(rhGM-CSF)是STAT5磷酸化的强效诱导剂，如通过在U937 pSTAT5测定中EC50为18.6pM所证明。人uPAR靶向结构域在SEQ ID NO:138中GM-CSF的C末端融合。SEQID NO:138在诱导STAT5磷酸化方面的效力大约高20倍，EC50为1.28pM。将SEQ ID NO:138与增加浓度的单独的人uPAR靶向结构域即SEQ ID NO:103共孵育导致效力降低，与单独的rhGM-CSF相似。这些结果表明，uPAR靶向基序与GM-CSF的融合不会对融合蛋白因与受体结合而诱导STAT5磷酸化的能力产生负面影响，相反，它似乎增强了其活性。
表39
测试分子 竞争物 EC50(pM)
rhGM-CSF 无 18.6
SEQ ID NO:138 无 1.28
SEQ ID NO:138 1nM人uPA-ATF 2.55
SEQ ID NO:138 100nM人uPA-ATF 14.0
示例性融合蛋白的体内药代动力学
在小鼠肿瘤模型中体内分析选择的人抗uPAR-IL-12亚基融合蛋白。具体而言，在施用后的若干个时间点检测小鼠的血清和肿瘤组织中测试的融合蛋白的水平。本节中使用的融合蛋白在下表40中列举。实验细节在下表41中概述。
表40-融合蛋白的氨基酸序列
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表41-测定细节
上述研究中使用的模型是雌性NOD/SCID小鼠中的SC RKO人结直肠癌异种移植模型。为了生成肿瘤模型，用RKO肿瘤细胞皮下接种每只小鼠。当肿瘤大小达到约250mm3时，使用随机化。在最后一个剂量后0.5、1、4、24、48、72小时采集肿瘤和血清样品。根据制造方案，使用Meso Scale Discovery(MSD)测定来检测样品中的p35、p40或p70。
如图11所示，在测试的所有时间点均在肿瘤组织中检测到每组中测试的融合蛋白，水平保持相对稳定。数据显示，融合蛋白在肿瘤组织中大量积累。如图12所示，对于选择的组，血清中融合蛋白的水平随时间稳定下降，证明除了靶肿瘤组织中的融合蛋白外，融合蛋白从系统中快速清除。

Claims (202)

1.一种与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的分离的抗原结合蛋白，其包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含：
i)GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)、GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)、GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)、GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)或GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列；
ii)IDPENGDT(SEQ ID NO:4)、IWSDGGT(SEQ ID NO:12)、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)或IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列；以及
iii)TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)或AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含：
iv)SSVSY(SEQ ID NO:6)、QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)、ENIYSN(SEQ ID NO:22)、SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列；
v)DTS(SEQ ID NO:7)、KVS(SEQ ID NO:15)、AAT(SEQ ID NO:23)或GTS(SEQ ID NO:31)的LCDR2氨基酸序列；以及
vi)QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)、FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)、QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)、QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQ IDNO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)的HCDR1氨基酸序列、IWSDGGT(SEQ IDNO:12)的HCDR2氨基酸序列、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)的LCDR1氨基酸序列、KVS(SEQ IDNO:15)的LCDR2氨基酸序列和FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)的LCDR3氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ ID NO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQ IDNO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ ID NO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
b)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
c)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
d)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
e)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
f)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
g)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
h)所述VH结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或者
i)所述VH结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的抗原结合蛋白，其中所述VH结构域和VL结构域通过氨基酸接头附接。
9.如权利要求8所述的抗原结合蛋白，其中所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。
10.如权利要求8所述的抗原结合蛋白，其中所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:149)、GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)或GGGSGGGGSG(SEQ ID NO:246)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)、dAb片段、单结构域抗体或纳米抗体。
12.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:56-71中任一个的氨基酸序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗原结合蛋白，其还包含SEQ ID NO:72-78中任一个的氨基酸序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:45、46、49、53或54的抗体重链(HC)氨基酸序列和SEQ ID NO:47、48、50、51、52和55的抗体轻链(LC)氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的抗原结合蛋白，其中：
a)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
b)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
c)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
d)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
f)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
g)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
h)所述抗体HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或者
i)所述抗体HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
16.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含SEQID NO:189的氨基酸序列。
17.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含SEQID NO:213的氨基酸序列。
18.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
19.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第二多肽链。
20.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
21.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第二多肽链。
22.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的第一多肽链；
包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链；以及
包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的第三多肽链。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于约5x 10-8M、小于约1x 10-8M、小于约5x 10-9M、小于约1x 10-9M、小于约5x 10-10M或小于约1x10-10M的KD结合人uPAR。
24.如权利要求1-23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合人uPAR。
25.如权利要求1-23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合uPAR配体结合的人uPAR。
26.如权利要求1-23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR，从而产生用与所述抗原结合蛋白结合的荧光标记抗体检测的荧光信号，EC50值为约0.1nM至约3.0nM。
27.如权利要求26所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR。
28.如权利要求1-23中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合人uPAR DII-DIII结构域或人uPAR DIII结构域。
29.一种分离的抗原结合蛋白，其与权利要求1-28中任一项所述的抗原结合蛋白竞争结合。
30.一种分离的抗原结合蛋白，其与权利要求1-28中任一项所述的抗原结合蛋白结合相同表位。
31.一种药物组合物，其包含权利要求1-30中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂。
32.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1-30中任一项所述的抗原结合蛋白的多核苷酸序列。
33.一种表达载体，其包含如权利要求32所述的多核苷酸序列。
34.一种宿主细胞，其包含如权利要求33所述的表达载体。
35.一种产生权利要求1-30中任一项所述的抗原结合蛋白的方法，其包括在表达所述抗原结合蛋白的条件下培养权利要求34所述的宿主细胞。
36.如权利要求35所述的方法，其还包括从所述宿主细胞中分离所述抗原结合蛋白。
37.与uPAR特异性结合的抗原结合蛋白用于治疗或预防与uPAR活性或表达相关的疾病或病症的用途，所述用途包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求31所述的药物组合物。
38.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求31所述的药物组合物。
39.一种融合蛋白，其包含：
(i)权利要求1-30中任一项所述的抗原结合蛋白；以及
(ii)细胞因子或其变体。
40.如权利要求39所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白和所述细胞因子或其变体通过氨基酸接头连接。
41.如权利要求39或40所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或其变体选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10或IL-12。
42.如权利要求39或40所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或其变体包含至少一个白介素-12(IL-12)亚基。
43.如权利要求42所述的融合蛋白，其中所述IL-12亚基包含p35和p40中的一种或两种。
44.如权利要求43所述的融合蛋白，其中所述p35包含在SEQ IDNO:81的位置M12、S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150、L161和D188处的一个或多个氨基酸取代。
45.如权利要求44所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
46.如权利要求44或45所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
47.如权利要求44-46中任一项所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括S27D和D188N。
48.如权利要求44-47中任一项所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括C74K。
49.如权利要求44-48中任一项所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
50.如权利要求44-49中任一项所述的融合蛋白，其中所述p35包含SEQ ID NO:81、SEQID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
51.如权利要求43所述的融合蛋白，其中所述p40包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
52.如权利要求51所述的融合蛋白，其中所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
53.如权利要求51或52所述的融合蛋白，其中所述C252氨基酸取代是C252S。
54.如权利要求51或52所述的融合蛋白，其中所述p40包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
55.如权利要求39或40所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或其变体包含单链IL-12(scIL-12)，所述scIL-12包含通过氨基酸接头附接的p35和p40亚基。
56.如权利要求55所述的融合蛋白，其中所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ IDNO:156)。
57.如权利要求55或56所述的融合蛋白，其中所述scIL-12包含SEQ ID NO:88或SEQ IDNO:89的氨基酸序列。
58.一种药物组合物，其包含权利要求39-57中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂。
59.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求39-57中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列。
60.一种表达载体，其包含权利要求59所述的多核苷酸序列。
61.一种宿主细胞，其包含权利要求60所述的表达载体。
62.一种产生权利要求39-57中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括在表达所述融合蛋白的条件下培养权利要求61所述的宿主细胞。
63.如权利要求62所述的方法，其还包括从所述宿主细胞中分离所述融合蛋白。
64.与uPAR特异性结合的融合蛋白用于治疗或预防与uPAR活性或表达相关的疾病或病症的用途，所述用途包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求58所述的药物组合物或权利要求39-57中任一项所述的融合蛋白。
65.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求52所述的药物组合物或权利要求39-57中任一项所述的融合蛋白。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述药物组合物或融合蛋白与细胞因子或其变体或第二融合蛋白同时施用，其中所述第二融合蛋白包含与所述第一融合蛋白不同的细胞因子或其变体。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述药物组合物或融合蛋白与细胞因子或其变体或第二融合蛋白顺序施用，其中所述第二融合蛋白包含与所述第一融合蛋白不同的细胞因子或其变体。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述细胞因子或其变体包含IL-12p35亚基或IL-12p40亚基。
69.如权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述患者的肿瘤中的所述融合蛋白清除率低于所述患者的血清中的所述融合蛋白清除率。
70.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的融合蛋白和非融合IL-12亚基，其中：
(a)所述融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体，或IL-12p40亚基或其变体；并且
(b)所述非融合IL-12亚基包含IL-12p35亚基或其变体，或IL-12p40亚基或其变体，
其中当所述融合蛋白包含IL-12p35亚基或其变体时，所述非融合IL-12亚基包含IL-12p40亚基或其变体，并且当所述融合蛋白包含IL-12p40亚基或其变体时，所述非融合IL-12亚基包含IL-12p35亚基或其变体。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述融合蛋白和非融合IL-12亚基顺序施用。
72.如权利要求70或71所述的方法，其中所述融合蛋白和非融合IL-12亚基中的一种或两种静脉内施用。
73.如权利要求70-72中任一项所述的方法，其中首先施用所述融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述非融合IL-12亚基。
74.如权利要求70-72中任一项所述的方法，其中首先施用所述融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述非融合IL-12亚基。
75.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中：
(a)所述第一融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)上的第一表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体；并且
(b)所述第二融合蛋白包含：
(i)与uPAR上的第二表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p40亚基或其变体。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述第一表位和第二表位是相同的。
77.如权利要求75所述的方法，其中所述第一表位和第二表位是不同的。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白和第二融合蛋白顺序施用。
79.如权利要求75-78中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种静脉内施用。
80.如权利要求75-79中任一项所述的方法，其中首先施用所述第一融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第一融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述第二融合蛋白。
81.如权利要求75-79中任一项所述的方法，其中首先施用所述第一融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第一融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述第二融合蛋白。
82.如权利要求75-79中任一项所述的方法，其中首先施用所述第二融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第二融合蛋白在所述患者的肿瘤中积累后施用所述第一融合蛋白。
83.如权利要求75-79中任一项所述的方法，其中首先施用所述第二融合蛋白，随后在经过足够长的时间以使所述第二融合蛋白浓度在所述患者的血清中的显著降低后施用所述第一融合蛋白。
84.如权利要求75-83中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种包含抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQ IDNO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
85.如权利要求75-83中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种包含抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ ID NO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
86.如权利要求75-83中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白和第二融合蛋白中的一种或两种包含抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
a)VH结构域，其包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQ IDNO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
b)VL结构域，其包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ ID NO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
87.一种包含第一融合蛋白和第二融合蛋白的组合，其中：
(a)所述第一融合蛋白包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)上的第一表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p35亚基或其变体；并且
(b)所述第二融合蛋白包含：
(i)与uPAR上的第二表位特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)IL-12p40亚基或其变体。
88.如权利要求87所述的组合，其中所述第一表位和第二表位是相同的。
89.如权利要求87所述的组合，其中所述第一表位和第二表位是不同的。
90.一种融合蛋白，其包含：
(i)与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合的抗原结合蛋白；以及
(ii)细胞因子或其变体。
91.如权利要求90所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白和所述细胞因子或其变体通过氨基酸接头连接。
92.如权利要求90或91所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或其变体选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10或IL-12。
93.如权利要求90或91所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或其变体包含至少一个白介素-12(IL-12)亚基。
94.如权利要求93所述的融合蛋白，其中所述IL-12亚基包含p35和p40中的一种或两种。
95.如权利要求94所述的融合蛋白，其中所述p35包含在SEQ ID NO:81的位置M12、S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150、L161和D188处的一个或多个氨基酸取代。
96.如权利要求95所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
97.如权利要求95或96所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
98.如权利要求95-97中任一项所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括S27D和D188N。
99.如权利要求95-98中任一项所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括C74K。
100.如权利要求95-99中任一项所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
101.如权利要求95-100中任一项所述的融合蛋白，其中所述p35包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
102.如权利要求94所述的融合蛋白，其中所述p40包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
103.如权利要求102所述的融合蛋白，其中所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
104.如权利要求102或103所述的融合蛋白，其中所述C252氨基酸取代是C252S。
105.如权利要求102-104中任一项所述的融合蛋白，其中所述p40包含SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
106.如权利要求90-93中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或其变体包含单链IL-12(scIL-12)，所述scIL-12包含通过氨基酸接头附接的p35和p40亚基。
107.如权利要求106所述的融合蛋白，其中所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQID NO:156)。
108.如权利要求106或107所述的融合蛋白，其中所述scIL-12包含SEQ ID NO:88或SEQID NO:89的氨基酸序列。
109.如权利要求90-108中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a)抗体重链可变(VH)结构域，其包含：
i)GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)、GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)、GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)、GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)或GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列；
ii)IDPENGDT(SEQ ID NO:4)、IWSDGGT(SEQ ID NO:12)、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)或IYPRSGNT(SEQ ID NO:28)的HCDR2氨基酸序列；以及
iii)TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)、ARGGRSDLFAY(SEQ IDNO:13)、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)或AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；以及
(b)抗体轻链可变(VL)结构域，其包含：
iv)SSVSY(SEQ ID NO:6)、QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)、ENIYSN(SEQ ID NO:22)、SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列；
v)DTS(SEQ ID NO:7)、KVS(SEQ ID NO:15)、AAT(SEQ ID NO:23)或GTS(SEQ ID NO:31)的LCDR2氨基酸序列；以及
vi)QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)、FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)、QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)、QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
110.如权利要求109所述的融合蛋白，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
111.如权利要求109所述的融合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GFNIKDEY(SEQ ID NO:3)的HCDR1氨基酸序列、IDPENGDT(SEQ IDNO:4)的HCDR2氨基酸序列、TGGNYVGWFPY(SEQ ID NO:5)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSY(SEQ ID NO:6)的LCDR1氨基酸序列、DTS(SEQ ID NO:7)的LCDR2氨基酸序列和QQWSSNPPY(SEQ ID NO:8)的LCDR3氨基酸序列。
112.如权利要求109所述的融合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GFSLTNYG(SEQ ID NO:11)的HCDR1氨基酸序列、IWSDGGT(SEQ IDNO:12)的HCDR2氨基酸序列、ARGGRSDLFAY(SEQ ID NO:13)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO:14)的LCDR1氨基酸序列、KVS(SEQ IDNO:15)的LCDR2氨基酸序列和FQGSHVPYT(SEQ ID NO:16)的LCDR3氨基酸序列。
113.如权利要求109所述的融合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GNTFTDYG(SEQ ID NO:19)或GTTFTDYG(SEQ ID NO:41)的HCDR1氨基酸序列、INTNTGEP(SEQ ID NO:20)的HCDR2氨基酸序列、AHYSFDY(SEQ ID NO:21)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含ENIYSN(SEQ ID NO:22)的LCDR1氨基酸序列、AAT(SEQ ID NO:23)的LCDR2氨基酸序列和QHFWGTPWT(SEQ ID NO:24)的LCDR3氨基酸序列。
114.如权利要求109所述的融合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含GYTFTSYG(SEQ ID NO:27)的HCDR1氨基酸序列、IYPRSGNT(SEQ IDNO:28)的HCDR2氨基酸序列、AGKDYGSTYADY(SEQ ID NO:29)的HCDR3氨基酸序列；并且
b)所述VL结构域包含SSVSSRY(SEQ ID NO:30)的LCDR1氨基酸序列、GTS(SEQ ID NO:31)的LCDR2氨基酸序列和QQYHSDPLT(SEQ ID NO:32)的LCDR3氨基酸序列。
115.如权利要求109-114中任一项所述的融合蛋白，其中：
a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
b)所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
c)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
d)所述VH结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
e)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
f)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
g)所述VH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
h)所述VH结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或者
i)所述VH结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述VL结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
116.如权利要求115所述的融合蛋白，其中所述VH结构域和VL结构域通过氨基酸接头附接。
117.如权利要求116所述的融合蛋白，其中所述氨基酸接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:148)，其中n是介于1与5之间的整数。
118.如权利要求116所述的融合蛋白，其中所述氨基酸接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:149)、GGSGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGSGG(SEQ ID NO:150)、GGGSGGGGSG(SEQ ID NO:246)。
119.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)、dAb片段、单结构域抗体或纳米抗体。
120.权利要求90-119中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含SEQ IDNO:56-71中任一个的氨基酸序列。
121.权利要求90-119中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白还包含SEQ IDNO:72-78中任一个的氨基酸序列。
122.如权利要求90-119中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:45、46、49、53或54的抗体重链(HC)氨基酸序列和SEQ ID NO:47、48、50、51、52和55的抗体轻链(LC)氨基酸序列。
123.如权利要求122所述的融合蛋白，其中：
a)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
b)所述抗体HC包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
c)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
d)所述抗体HC包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
f)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；
g)所述抗体HC包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
h)所述抗体HC包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或者
i)所述抗体HC包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，并且所述抗体LC包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
124.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列。
125.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列。
126.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
127.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第二多肽链。
128.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链。
129.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的第一多肽链；以及
包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第二多肽链。
130.如权利要求90-118中任一项所述的融合蛋白，其包含：
包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的第一多肽链；
包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第二多肽链；以及
包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的第三多肽链。
131.如权利要求90-130中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于约5x10-8M、小于约1x 10-8M、小于约5x 10-9M、小于约1x 10-9M、小于约5x 10-10M或小于约1x 10- 10M的KD结合人uPAR。
132.如权利要求90-130中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合人uPAR。
133.如权利要求90-130中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合uPAR配体结合的人uPAR。
134.如权利要求90-130中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR，从而产生用与所述抗体或其片段结合的荧光标记抗体检测的荧光信号，EC50值为约0.1nM至约3.0nM。
135.如权利要求90-130中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在uPAR配体存在下结合表达人uPAR的细胞上的人uPAR。
136.如权利要求90-130中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合人uPARDII-DIII结构域或人uPAR DIII结构域。
137.一种工程化IL-12p35多肽，其包含在SEQ ID NO:81的位置S27、N28、Q35、F39、S44、C74、M111、V114、M119、M145、F150和L161处的一个或多个氨基酸取代。
138.如权利要求137所述的工程化IL-12p35多肽，其还包含S27和D188氨基酸取代中的一种或两种。
139.如权利要求137或138所述的工程化IL-12p35多肽，其中所述氨基酸取代包括M12S；S27D；N28R；Q35E；F39D或F39H；S44K；C74K、C74D、C74W、C74Y或C74Q；M111F或M111W；V114I；M119L；M145L；F150Y；L161D或L161Q；D188N；或者它们的组合。
140.如权利要求137-139中任一项所述的工程化IL-12p35多肽，其中所述氨基酸取代包括N28R和Q35E。
141.如权利要求137-140中任一项所述的工程化IL-12p35多肽，其中所述氨基酸取代包括C74K。
142.如权利要求137-141中任一项所述的工程化IL-12p35多肽，其中所述氨基酸取代包括S27D、C74K和D188N。
143.如权利要求137-142中任一项所述的工程化IL-12p35多肽，其包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
144.一种融合蛋白，其包含：
(i)权利要求137-143中任一项所述的工程化IL-12p35多肽；以及
(ii)一种或多种融合配偶体。
145.如权利要求144所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含减少所述工程化IL-12p35多肽的聚集的部分。
146.如权利要求144所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p35多肽的表达的部分。
147.如权利要求144所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p35多肽的血清半衰期的部分。
148.如权利要求144-147中任一项所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含靶向部分。
149.如权利要求144-148中任一项所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)或抗原结合蛋白。
150.如权利要求149所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合。
151.一种工程化IL-12p40多肽，其包含在SEQ ID NO:84的位置C177和C252处的一个或多个氨基酸取代。
152.如权利要求151所述的工程化IL-12p40多肽，其中所述C177氨基酸取代选自由以下项组成的组：C177S、C177F、C177M、C177H、C177I或C177Q。
153.如权利要求151或152所述的工程化IL-12p40多肽，其中所述C252氨基酸取代是C252S。
154.如权利要求151-153中任一项所述的工程化IL-12p40多肽，其中所述p40包含SEQID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
155.一种融合蛋白，其包含：
(i)权利要求151-154中任一项所述的工程化IL-12p40多肽；以及
(ii)一种或多种融合配偶体。
156.如权利要求155所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含减少所述工程化IL-12p40多肽的聚集的部分。
157.如权利要求155所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p40多肽的表达的部分。
158.如权利要求155所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含增加所述工程化IL-12p40多肽的血清半衰期的部分。
159.如权利要求155-158中任一项所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含靶向部分。
160.如权利要求155-159中任一项所述的融合蛋白，其中所述一种或多种融合配偶体包含血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)或抗原结合蛋白。
161.如权利要求160所述的融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)特异性结合。
162.一种融合蛋白，其包含：
(i)尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽；以及
(ii)细胞因子或其变体。
163.如权利要求162所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽通过氨基酸接头与所述细胞因子连接。
164.如权利要求162或163所述的融合蛋白，其中所述细胞因子包括其功能片段、其功能变体或其环状排列的变体。
165.如权利要求162-164中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子经由一个或多个任选的氨基酸接头与所述细胞因子对其具有结合特异性的受体的全部或部分连接。
166.如权利要求162-165中任一项所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽包含能够特异性结合uPAR的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)多肽或其变体。
167.如权利要求166所述的融合蛋白，其中所述uPA变体是uPA的氨基酸末端片段(ATF)。
168.如权利要求167所述的融合蛋白，其中所述ATF具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
169.如权利要求167或168所述的融合蛋白，其中uPA的所述ATF包含一个或多个氨基酸取代或缺失。
170.如权利要求166所述的融合蛋白，其中所述uPA具有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
171.如权利要求162-170中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子是环状排列的IL-2，并且所述受体是IL-2Rα。
172.如权利要求162-170中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子是环状排列的IL-15，并且所述受体是IL-15Rα。
173.如权利要求162-170中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子是环状排列的IL-1，并且所述受体是IL-1RI、IL-1RII。
174.如权利要求162-165中任一项所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽是抗uPAR抗原结合蛋白。
175.如权利要求162-165中任一项所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽是抗uPAR抗体的scFv片段。
176.如权利要求162-165中任一项所述的融合蛋白，其选自由以下项组成的组：SEQ IDNO:98、99、100、106、107、111和113。
177.如权利要求162-165中任一项所述的融合蛋白，其选自由以下项组成的组：SEQ IDNO:98、99、111和112。
178.如权利要求162-177中任一项所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合剂、细胞因子和受体是人源的。
179.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求162-178中任一项所述的融合蛋白。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、癌、胚细胞瘤和淋巴瘤。
181.一种治疗有需要的患者的炎性疾病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求162-178中任一项所述的融合蛋白。
182.如权利要求181所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下项组成的组：IBD和RA。
183.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求162-178中任一项所述的融合蛋白和任选的药学上可接受的赋形剂。
184.一种融合蛋白，其包含：
尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)结合多肽，其经由一个或多个任选的氨基酸接头与以下项连接：
(i)细胞因子或其变体；或者
(ii)检查点分子调节剂。
185.如权利要求184所述的融合蛋白，其中所述细胞因子包括其功能片段、其功能变体或其环状排列的变体。
186.如权利要求184或185所述的融合蛋白，其中所述细胞因子经由一个或多个任选的氨基酸接头与所述细胞因子对其具有结合特异性的受体的全部或部分连接。
187.如权利要求184-186中任一项所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽包含能够特异性结合uPAR的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)多肽或其变体。
188.如权利要求187所述的融合蛋白，其中所述uPA变体是uPA的氨基酸末端片段(ATF)。
189.如权利要求187或188所述的融合蛋白，其中所述ATF具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
190.如权利要求188或189所述的融合蛋白，其中uPA的所述ATF包含一个或多个氨基酸取代或缺失。
191.如权利要求184-190中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞因子或检查点分子调节剂选自由以下项组成的组：IL-2、环状排列的IL-2(cpIL-2)、IL-15、环状排列的IL15(cpIL-15)、IL-6、环状排列的IL-6(cpIL-6)、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFNγ、IFNα、4-1BBB(CD131)或其配体、OX40或其配体、PD-1、PD-L1、抗PD-1抗体、CTLA-4、抗CTLA4抗体、GITR或其配体、ICOS或其配体、CD27、CD70、CD40或其配体。
192.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求184-191中任一项所述的融合蛋白。
193.如权利要求192所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤和淋巴瘤。
194.一种治疗有需要的患者的炎性疾病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求184-191中任一项所述的融合蛋白。
195.如权利要求194所述的方法，其中所述炎性疾病选自由由以下项组成的组：IBD和RA。
196.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求184-191中任一项所述的融合蛋白和任选的药学上可接受的赋形剂。
197.一种用于治疗患者的癌症的免疫治疗方法，其包括向有需要的患者施用权利要求162或184所述的融合蛋白。
198.如权利要求197所述的方法，其还包括向所述患者施用靶向癌症疗法。
199.如权利要求198所述的方法，其还包括向所述患者施用选自化学疗法、放射疗法或两者的常规细胞毒性疗法。
200.如权利要求197-199中任一项所述的方法，其还包括施用选自癌症疫苗、检查点抑制剂或单克隆抗体的免疫疗法。
201.如权利要求162或184所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽包含M25或与其同源的在氨基酸水平上具有至少80％同一性的氨基酸序列。
202.如权利要求162或184所述的融合蛋白，其中所述uPAR结合多肽包含P25或与其同源的在氨基酸水平上具有至少80％同一性的氨基酸序列。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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TW200813091A (en) * 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
KR101760242B1 (ko) * 2010-03-31 2017-07-21 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 항-ｃｄ40 항체
US10364286B2 (en) * 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation

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