RO118524B1 - Metoda pentru tratarea unei tulburari legata de celulele b - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la o metoda pentru tratarea unei tulburari legata de celulele B si consta in aceea ca aceasta cuprinde administrarea parenterala, la un pacient care are nevoie de asemenea tratament, a unei cantitati de dozare eficienta terapeutic a unui prim anticorp himeric anti-CD20, avand o secventa variabila cu catena usoara substantial la fel cu secventa aratata in fig. 4, o secventa variabila cu catena grea substantial la fel cu secventa aratata in fig. 5 si domenii constante IgG1 umane, sau un al doilea anticorp himeric anti CD-20 avand substantial aceeasi activitate de epuizare a celulelor B ca primul anticorp himeric anti-CD20 mentionat, in care o cantitate eficienta terapeutic este in domeniul 0,001...30 mg/kg greutate corporala, administrata pe o perioada de 1...7 zile.

Description

Invenția se referă la o metodă pentru tratarea unei tulburări legată de celulele B.

Este cunoscut că pentru tratamentul limfomului celulei B se folosesc anticorpi himerici și radiomarcați pentru antigenul de suprafață Bp35(“CD 20”) al celulei B.

Sistemul imun al vertebratelor (de exemplu, primate care includ oameni, maimuțe antropoide, alte maimuțe, etc), constă dintr-un număr de organe și tipuri de celule care trebuie să contribuie la recunoașterea specifică și cu precizie a microorganismelor străine (“antigen”) care invadează gazda vertebrată, legarea specifică la asemenea microorganisme străine și eliminarea/distrugerea unor astfel de microrganisme străine.

Printre altele, pentru sistemul imun limfocitele sunt critice. Limfocitele sunt produse în timus, splină și măduva osoasă (la adult) și reprezintă circa 30% din totalul celulelor sanguine albe prezente în sistemul circulator al oamenilor (adulți). Există două sub-populații principale de limfocite: celule T și celule B.

Celulele T sunt responsabile pentru imunitatea mediată celular, în timp ce, celulele B sunt responsabile pentru producerea anticorpului (imunitate umorală).

Cu toate acestea, celulele T și celulele B pot fi considerate ca interdependente întrun răspuns imun tipic. Celulele T sunt activate când receptorul celulei T se leagă la fragmentele unui antigen care a fost legat la glicoproteinele complexului de histocompatibilitate principală (“MHC”) pe suprafața unei celule care prezintă un antigen. Asemenea activare produce eliberarea de mediatori biologici (“interleukine”) care, în esență, stimulează celulele B să se diferențieze și să producă anticorpul (“imunoglobuline”) împotriva antigenului.

Fiecare celulă B din gazdă exprimă pe suprafața sa un anticorp diferit, astfel, o celulă B va exprima anticorpul specific pentru antigen, în timp ce altă celulă B va exprima anticorpul specific pentru un antigen diferit.

Pentru conformitate, celulele B sunt în totalitate deosebite și această diversitate este critică pentru sistemul imunitar.

La oameni, fiecare celulă B poate produce un număr enorm de molecule anticorp (adică, circa 10⁷ până la 10⁸). Asemenea producere de anticorpi, cel mai adesea încetează (sau descrește substanțial) când antigenul străin a fost neutralizat. Ocazional totuși, proliferarea unei anume celule B va continua fără întrerupere; asemenea proliferare poate avea ca rezultat un cancer denumit “limfomul celulei B”.

Ambele celule T și B, cuprind proteine celulare de suprafață care pot fi utilizate ca “markeri” pentru diferențiere și identificare. Un asemenea marker de celulă B umană este antigenul uman Bp35, B limfocitar diferențiat restrictiv, cunoscut ca “CD20.

CD20 este exprimat în timpul dezvoltării timpurii a pre-celulei B și rămâne până când se diferențiază plasma celulară. Molecula CD20 poate regla în mod specific o etapă în procesul de activare, care este necesar pentru inițierea ciclului celular și diferențiere și de obicei, este exprimat la niveluri foarte ridicate pe celule neoplastice (tumori).

Prin definiție, CD20 este prezent pe ambele celule B, a căror proliferare nelimitată poate duce la limfomul celulei B. Astfel, antigenul de suprafață CD20 are potențialul de a servi drept candidat pentru “țintirea” limfoamelor celulei B.

în esență, asemenea țintire se poate generaliza astfel: anticorpii specifici la antigenul de suprafață CD20 al celulelor B sunt de exemplu, injectați într-un pacient. Acești anticorpi anti-CD20 se leagă specific la antigenul celular de suprafață CD20, atât a celulelor B normale, cât și maligne; anticorpul anti-CD20 legat la antigenul de suprafață CD20 poate duce la distrugerea și reducerea celulelor B neoplastice. Suplimentar, se pot conjuga la anticorpul anti-CD20 agenți chimici sau marcaje radioactive care au potențialul de a distruge tumoarea, astfel, încât antigenul este “eliberat” specific spre de exemplu, celulele B neoplazice.

R0118524 Β1

Fără a avea legătură cu o circumstanță anume, un obiectiv inițial este distrugerea tumorii; abordarea specifică se poate determina printr-un anticorp anti-CD20 anume care 50 se utilizează și astfel, abordări accesibile spre țintirea antigenului CD20 pot varia considerabil.

De exemplu, au fost raportate asemenea încercări de țintire a antigenului de suprafață CD20. S-a raportat administrarea prin infuzie intravenoasă continuă la pacienții cu limfom celular B, a anticorpului monoclonal murin (șoarece) 1F5 (un anticorp anti-CD20). 55

S-au raportat niveluri extrem de ridicate (>2 g) de 1F5 necesare pentru reducerea celulelor tumorale din circulație și rezultatele s-au descris ca fiind “pasagere. Press et al., “Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas” Blood 69/2 : 584-591 (1987).

O problemă potențială legată de această abordare este cea a faptului că anticorpii 60 monoclonali non-umani (de exemplu, anticorpi monoclonali murini) de obicei sunt lipsiți de funcționalitate umană efectoare, adică ei sunt incapabili, inter alia, să medieze liza dependentă de complement sau liza celulelor umane țintă, prin toxicitate celulară dependentă de anticorp sau fagocitoza mediată de receptorul Fc.

Mai mult decât atât, anticorpii monoclonali non-umani pot fi recunoscuți de către 65 gazda umană ca o proteină străină; prin urmare, injecții repetate, de asemenea, anticorpi străini pot duce la inducerea de răspunsuri imune, care conduc la hipersensibilizare dăunătoare.

Pentru anticorpii monoclonali pe bază de murină, aceasta este adesea cunoscută ca un răspuns anticorp uman anti-șoarece sau răspuns “HAMA”. în plus, acești anticorpi 70 “străini” pot fi atacați de către sistemul imunitar al gazdei, astfel, încât ei sunt ca urmare neutralizați înainte să atingă locul lor de țintă.

Limfocitele și celulele limfomului sunt inerent, sensibile la radioterapie din câteva motive: emisia locală de radiații ionozante ale anticorpilor radiomarcați, poate omorî celulele cu sau fără antigenul țintă (de exemplu, CD20) în imediata vecinătate la anticorpul legat la 75 antigen. Radiația penetrantă poate preveni problema accesului limitat pentru anticorpi în tumorile bogat sau sărac vascularizate și cantitatea totală de anticorp necesar poate fi redusă.

Radionuclizii emit particule radioactive care pot deteriora ADN-ul celular, la punctul unde mecanismele de reparație celulară sunt incapabile să permită celulei să continue să 80 trăiască; prin urmare, dacă celulele țintă sunt tumori, marcajul radioactiv omoară benefic celulele tumorale.

Anticorpii radiomarcați, prin definiție, includ utilizarea unei substanțe radioactive care poate cere precauții, atât pentru pacient (adică posibilitatea transplantului de măduvă osoasă), cât și pentru cadrul medical care-l îngrijește (adică, este nevoie să se exercite un 85 grad înalt de precauție când se lucrează cu radioactivitate).

De aceea, abordarea îmbunătățirii abilității anticorpilor monoclonali murini de a fi eficienți în tratamentul tulburărilor celulei B a fost conjugarea unui marcaj radioactiv sau toxină la anticorp, astfel, încât marcajul sau toxina să se localizeze la locul tumorii.

De exemplu, anticorpul IF5 la care s-a făcut referire mai sus, a fost “marcat” cu iod- 90 131(“'3i|») șj _s__{a ra}p_Ort_at evaluarea pentru biodistribuția la doi pacienți, conform: J.F. et al., “Imaging and Treatment of B-Cell Lymfoma” J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 (1990).

Vezi, de asemenea, Press, O.W. et al., “Treatment of Refractory Non-Hodgkin’s Limphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody” J. Clin. Onc. 7/8:1027-1038 (1989), (cu indicația că un pacient tratat cu ¹³¹1 marcat IF-5 a atins un “răspuns parțial”); 95

Goldberg, D.M. et al., “Targeting, dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with lodine-131- Labelled LL2 Monoclonal Antibody” J. Clin. Onc. 9/4:548-564 (1991), (trei din opt pacienți primind injecții multiple au fost raportați ca dezvoltând un răspuns HAMA);

RO 118524 Β1

Appelbaum, F.R.,”Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of NonHodgkin’s Lymphoma” Hem/Onc. Clinics of N.A. 5/5:10131025(1991), (articol de revistă);

Press, O.W. et al., “Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphomy with

Autologus Bone Marrow Suport”, New England Journal of Medicine 329/17:1219-1223 (1993), (iodine-131-labeled anti-CD20 antibody IF5 and B1);

Kaminski, M.G. et al.,”Radioimunotherapy of B-Cell Lymphoma with (¹³¹l) anti-B1 (Anti-CD20) Antibody”. NEJM 329/7(1993), (iodine-131 labeled anti-CD20 antibody B1; hereinafter “Kaminski”).

La anticorpi s-au conjugat, de asemenea, toxine (adică, agenți chemoterapeuți, precum doxorubicina sau mitomicina C). Vezi, de exemplu, descrierea PCT publicată WO 92/07466 (publicată în 14 mai 1992).

Anticorpii “himerici”, adică anticorpii care cuprind porțiuni de la două sau mai multe specii diferite (de exemplu, șoarece și om) au fost dezvoltați ca o alternativă pentru anticorpi “conjugați”. De exemplu, Liu, A.Y. et al., “Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent BiologicActivity”, J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987), descrie un anticorp himeric direcționat împotriva antigenului CD20, de asemenea, publicația PCT nr. WO 88/04936.

Totuși, nu este furnizată nici o informație precum abilitatea, eficacitatea sau utilizarea practică de astfel de anticorpi himerici pentru tratamentul tulburărilor celulei B în aceste referințe. Este de notat că în cercetările funcționale in vitro (de exemplu, liză de complement dependentă (“CDC”), citotoxicitate celulară dependentă de anticorpi (“ADCC”), etc., nu se poate prezice capacitatea inerentă in vivo a unui anticorp himeric de a distruge sau reduce celulele țintă care exprimă antigenul specific.

Vezi, de exemplu, Robinson, R.D. et al., “Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities”, Hum. Antibod. Hibridomas 2:84-93 (1991), (anticorp himeric șoarece-uman având activitate ADCC nedetectabilă). Prin urmare, potențialul eficacității terapeutice al anticorpului himeric poate fi cercetat numai prin experimentare in vivo.

De ceea ce este nevoie și ceea ce ar fi un avantaj mare în domeniu, sunt abordările terapeutice țintind antigenul CD20 pentru tratamentul limfoamelor celulei B la primate, inclusiv, dar fără să se limiteze la oameni.

Metoda conform invenției constă în aceea că, cuprinde administrarea parenterală la un pacient care are nevoie de un asemenea tratament, a unei cantități de dozare eficientă terapeutic a unui prim anticorp himeric anti-CD20 având o secvență variabilă cu catenă ușoară, substanțial la fel cu secvența arătată în fig.4, o secvență variabilă cu catenă grea, substanțial la fel cu secvența arătată la fig.5, și domenii constante lgG1 umane, sau un al doilea anticorp himeric anti-CD20 având substanțial aceeași activitate de epuizare a celulelor B ca primul anticorp himeric anti-CD20 menționat, în care o cantitate eficientă terapeutic este în domeniul 0,001...30 mg/kg greutate corporală, administrată pe o perioadă de 1...7 zile.

Invenția prezintă următoarele avantaje pentru tratarea unei tulburări legată de celulele B, în special, a limfoamelor celulei B:

- protocoalele terapeutice se bazează pe administrarea anticorpilor himerici antiCD20 imunologic activi, pentru reducerea celulelor B din sângele periferic, inclusiv celulele B asociate cu limfom;

- se administrează anticorpi anti-CD20 radiomarcați pentru țintirea celulelor B localizate periferic și a celor asociate tumorilor;

- administrarea anticorpilor anti-CD20 himerici și a anticorpilor anti-CD20 radiomarcați se efectuează într-o strategie terapeutică asociată.

RO 118524 Β1 în condițiile prezentei invenții se folosesc termeni care au următoarele semnificații:

Așa cum s-a folosit aici termenul “anticorp anti-CD20” este un anticorp care recu- 150 noaște specific o fosfoproteină celulară de suprafață neglicozilată de 35000 Da, de obicei denumită ca antigenul Bp35, limfocitar B uman diferențiat restrictiv, denumit în mod uzual

CD20.

Termenul “himeric”când s-a folosit cu referire la anticorpul anti-CD20, cuprinde anticorpi care sunt derivați mai ales folosind tehnici acid dezoxiribonucleic recombinant și tehici 155 care cuprind, atât componente umane, cât și non umane (incluzând specii “înrudite” imunologic, de exemplu, cimpanzeu), regiunea variabilă a anticorpului himeric este cel mai adesea derivată de la o sursă non-umană și are antigenitatea și specificitatea dorită față de antigenul celular de suprafață CD20. Sursa non-umană poate fi orice sursă vertebrată care se poate folosi pentru a genera anticorpi față de antigenul celular de suprafață CD20 uman sau 160 un alt material care cuprinde un antigen celular de suprafață CD20 uman. Asemenea surse non-umane includ fără însă a se limita rozătoare, de exemplu: șoarece, șobolan, iepure, etc.), și primate non-umane (Old World Monkey, maimuțe, etc). în special, componenta nonumană (regiunea variabilă) este derivată dintr-o sursă murină.

Așa cum s-a folosit aici denumirea “imunologic activă” când s-a folosit cu referire la 165 anticorpi himerici ani-CD20, înseamnă un anticorp himeric care se leagă la C1q uman, care mediatizează liza dependentă de complement (“CDC”) a liniei celulare umane B limfoide și Uzează celulele țintă umane prin citotoxicitate celulară dependentă de anticorp (“ADCC”).

Expresiile “marcare indirectă” și “abordare de marcare indirectă”, ambele înseamnă că un agent chelator este atașat covalent la un anticorp și că cel puțin un radionuclid este 170 inserat în agentul de chelare. De preferință, agenții de chelare și radionuclizii sunt cei enumerați de Srigavatava, S. C. și Mease, R. C.; “Progress in Research on Ligands, Nuclides and Technique for Labeleing Monoclonal Antibodies”, Nuci. Med. Bio. 18/6:589-603 (1991), (“Srivagtava”) care este încorporat aici pentru referință.

Un agent de chelare preferat în mod deosebit este acidul 1-izotiocicmatobenzil-3- 175 metildiotelen triaminepent acetic (“MX-DTPA”); radionuclizii preferați în mod special pentru marcare indirectă includ indiu (111) și ytriu (90).

Expresiile “marcare directă” și “abordare de marcare directă” înseamnă că un radionuclid este atașat covalent direct la un anticorp (de obicei, pe calea unui rest aminoacid). Radionuclizii preferați sunt prezentați în Srivagtava; un radionuclid preferat în 180 mod deosebit pentru marcare directă este iodul (131) atașat covalent pe calea resturilor tirozinice. în mod special, este preferată abordarea marcării indirecte.

Abordările terapeutice descrise aici se bazează pe capacitatea sistemului imunitar al primatelor de a recupera rapid sau de a reîntineri celulele B din sângele periferic. în plus, datorită răspunsului imun principal al primatelor, ocazionat de celulele T, când sistemul 185 imunitar are o deficiență a celulelor B din sângele periferic, nevoia pentru precauții “extraordinare” (adică, izolarea pacientului, etc) nu este necesară. Ca o consecință a acestora și a altor nuanțe ale sistemului imunitar al primatelor, abordarea terapeutică pentru tulburările celulei B permite înlăturarea celulelor B din sângele periferic folosind anticorpi himerici antiCD20 imunologic activi. 190

Din cauza tulburărilor celulelor B din sângele periferic, prin definiție, se poate indica o necesitate de acces la sânge pentru tratament, ruta administrării anticorpilor himerici antiCD20 imunologic activi și anticorpi anti-CD20 radiomarcați fiind de preferință parenterală.

Așa cum s-a folosit termenul “parenteral”, acesta include: administrarea intravenoasă, intramusculară, subcutanată, rectală, vaginală sau intraperitoneală. Dintre acestea, 195 calea cea mai preferată este cea intravenoasă.

RO 118524 Β1 în condițiile prezentei invenții se folosesc figuri care au următoarele semnificații:

- fig.1, este o reprezentare diagramatică a unui tandem anticorp himeric vector de expresie, util în producerea de anticorpi himerici anti-CD20 imunologic activi (“TCAE”);

- fig.2A până la 2B reprezintă secvența acidului nucleic a vectorului din fig.1;

- fig.3A până la 3F reprezintă secvența acidului nucleic a vectorului din fig.1, cuprinzând în plus regiunile variabile ale catenelor ușoară și grea murine (“anti-CD20 în TCAE 8);

- fig.4, este acidul nucleic și secvențele aminoacide (inclusiv CDR și regiunile în cadru) ale regiunii variabile ale catenei ușoare murine derivată de la anticorpul monoclonal murin anti-CD20 2B8;

- fig.5, este acidul nucleic și secvențele aminoacide (inclusiv CDR și regiunile din cadru) ale regiunii variabile ale catenei grele murine derivate de la anticorpul monoclonal anti-CD20 murin, 2B8;

- fig.6, reprezintă rezultatele ratei citometrice, care evidențiază legarea lui C1q uman marcat prin fluorescență la anticorpul himeric anti-CD20, incluzând controale C1q marcate; C1q marcat și anticorp monoclonal anti-CD20 murin 2B8, C1q marcat și lgG1, k uman;

- fig.7, reprezintă rezultatele lizei legate de complement, prin comparație cu anticorpul himeric anti-CD20 și anticorpul monoclonal anti-CD20 murin 2B8;

- fig.8, reprezintă rezultatele citotoxicității celulare mediată de anticorp cu celule efectoare umane in vivo prin comparație cu anticorpul himeric anti-CD20 și 2B8;

- fig.9A, 9B și 9C, furnizează rezultatele distrugerii limfocitelor B în sângele periferic la primate non-umane, după infuzia a 0,4 mg/kg (A), 1,6 mg/kg (B) și 6,4 mg/kg (C) de anticorp himeric anti-CD20 imunologic activ;

- fig.10, reprezintă rezultatele a, inter alia, distrugerii limfocitului B în sângele periferic la primate non-umane, după infuzia a 0,01 mg/kg anticorp himeric anti-CD-20 imunologic activ;

- fig.11, arată rezultatele impactului tumoricid al lui Y2B8 într-un model șoarece xenografic, utilizând o tumoare limfoblastoidă de celulă B;

- fig.12, prezintă rezultatele impactului tumoricid al lui C2B8 într-un model șoarece xenografic, utilizând o tumoare limfoblastoidă de celule B;

- fig.13, furnizează rezultatele impactului tumoricid a unei combinații Y2B8 și C2B8 într-un model șoarece xenografic, utilizând o tumoare limfoblastoidă de celulă B;

- fig.4A și 14B dau rezultatele de la analiza clinică a fazei l/ll a lui C2B8, evidențiind distrugerea populației de celule B, peste timp, pentru pacienți care evidențiază o emisie parțială a bolii (14A) și o remisie minoră a bolii (14B).

Informații privind depozitul

Anti-CD20 în TCAE 8 (transformat în E. Coli în vederea depozitării) s-a depozitat în colecția americană de de tipuri de culturi (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, în condițiile tratatului de la Budapesta pentru Recunoașterea Internațională a Depozitului Microorganismelor în vederea Procedurii de Brevetare (‘Tratatul de la Budapesta”).

Microrganismul a fost testat de către ATCC pe 9 noiembrie 1992 și s-a determinat ca fiind viabil la aceea dată. ATCC-ul a acordat acestui organism următorul număr de depozit: ATCC 69119 (anti-CD20 în TCAE 8).

Hibridomul 2B8 s-a depozitat la ATCC pe 22 iunie 1993, în condițiile Tratatului de la

Budapesta. Viabilitatea culturii s-a determinat pe 25 iunie 1993 și ATCC a acordat acestui hibridom următorul număr de depozit: HB 1138.

în general, anticorpii sunt compuși din molecule cu două catene ușoare și două catene grele; aceste catene au forma generală a literei Ύ”, cu ambele catene ușoară și grea formând brațele Y - ului și catenele grele formând baza Y - ului. Catenele ușoare și grele

R0118524 Β1 sunt divizate în domenii de homologie structurală și funcțională. Domeniile variabile, atât ale catenei ușoare (“V_L”) și grea (“V_H”) determină recunoașterea și specificitatea. Domeniile regiunii constante ale catenelor ușoară (“C_L”) și grea (“C_H”) conferă proprietăți biologice importante, de exemplu, asocierea catenei anticorpului, secretarea, mobilitatea transplacentară, legarea la complementul receptorului Fc de legare, etc,.

Seriile evenimentelor duc la expresia genei imunoglobinei în celulele care produc anticorp și sunt complexe. Secvențele genetice ale regiunii domeniului variabil sunt localizate în segmente genetice de linie germinală separată, cunoscute ca: “V_H”, “D” și “J_H”, sau “V_L” și “J_L”. Aceste segmente genetice sunt legate prin rearanjamente AND, pentru a forma regiuni V complete, exprimate în catene grele și, respectiv în ușoare. Segmentele (V_L - J_L și V_H - D - J_H), rearanjate legate V, codifică apoi regiunile variabile complete sau domeniile de legare antigenică ale catenelor ușoare, respectiv grele.

Seroterapia limfoamelor celulelor B umane folosind un anticorp monoclonal murin anti-CD20 (1F5) a fost descrisă de către Press et al., (69 Blood 584, 1987, de mai sus); răspunsurile terapeutice raportate din nefericire au fost pasagere. în plus, la 25 % din pacienții testați s-a raportat dezvoltarea prin seroterapie a unui răspuns anticorp uman antișoarece (HAMA). Press et al., sugerează că acești anticorpi conjugați la toxine sau radioizotopi pot permite un beneficiu clinic, în cele din urmă mai mare decât anticorpul neconjugat.

Datorită efectelor de slăbire a limfomului celulei B și a unei necesități foarte reale de a asigura abordarea tratamentului viabil pentru această boală, s-a pornit la drum printr-o abordare diferită, având ca trăsătură comună între cele două abordări un anticorp anume 2B8.0 asemenea abordare exploatează avantajos capacitatea sistemelor de la mamifere de a recunoaște cu ușurință și eficient celule sanguine periferice B. Folosind această abordare s-a căutat în esență, înlăturarea sau reducerea celulelor B din sângele periferic și țesutul limfatic și mijloace de îndepărtare a limfoamelor celulei B. Aceasta s-a realizat prin utilizarea, inter alia, a anticorpilor himerici anti-CD20 imunologic activi.

într-o altă abordare s-a căutat țintirea celulelor tumorale pentru distrugerea cu marcaje radioactive.

Anticorpii himerici anti-CD20 imunologic activi și anticorpii anti-CD20 radiomarcați vor fi de obicei asigurați prin tehnică standard într-un tampon acceptabil farmaceutic, de exemplu, soluție salină sterilă, apă sterilă tamponată, propilenglicol, combinații ale celor dinainte, etc.,

Metode pentru prepararea agenților administrabili parenteral sunt descrise în Pharmaceutical Carries & Formulations, Martin, Remington’s Pharmaceuticals Sciences, 15 th Ed. (Mack Pub. Co., Easton, PA 1975) șl este încorporat aici pentru referință.

Cantitatea eficientă terapeutic, specifică anticorpilor anti-CD20 himerici activi imunologic, este utilă pentru producerea unui efect terapeutic unic la orice pacient, dar poate fi determinată prin tehnici standard binecunoscute pentru cei cu pregătire obișnuită în domeniu.

Dozele eficiente (adică, cantitățile eficiente terapeutic) ale anticorpilor himerici antiCD20 activi imunologic, sunt în domeniul de la circa 0,01 până la circa 30 mg/kg greutate corporală, de preferință, de la circa 0,01 până la circa 25 mg/kg greutate corporală, și cel mai bine, de la circa 0,4 până la circa 20,0 mg/kg greutate corporală.

Sunt viabile și alte dozaje, factorii care influențează dozajul, includ însă nu se limitează la severitatea bolii, tratamentele anteriore, starea globală de sănătate a pacientului, alte boli prezente, etc. Specialistul în domeniu este în stare să analizeze cu ușurință un pacient anume și să determine un dozaj corespunzător, care intră sub incidența domeniilor sau, dacă este necesar, iese în afara domeniilor.

250

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 118524 Β1

Introducerea anticorpilor himerici anti-CD20 activi imunologic în aceste domenii doză, poate fi realizată ca un tratament unic sau ca o serie de tratamente. Având în vedere anticorpii himerici, este de preferat ca o asemenea introducere să fie realizată printr-o serie de tratamente.

Această abordare preferată este previzibilă pe baza metodologiei de tratament asociată cu această boală. Deși nu se dorește asocierea la o teorie anume, datorită activității imunologice, anticorpii himerici anti-CD20 sunt imunologic activi și se leagă la CD20. La introducerea inițială de anticorpi himerici anti-CD20 activi imunologic, va începe la individ reducerea celulelor B din sângele periferic. S-a observat o reducere aproape completă în circa 24 h după tratamentul prin infuzie.

Datorită acesteia, introducerea/introducerile ulterioare a anticorpilor himerici antiCD20 activi imunologic (sau anticorpi anti-CD20 radiomarcați) la pacient se presupune:

a) clarificarea celulelor B rămase în sângele periferic;

b) începerea reducerii celulelor B din nodulii limfatici;

c) începerea reducerii celulelor B din alte surse tisulare, de exemplu, măduvă osoasă, tumoare, etc.

Formulat din nou, prin folosirea introducerilor repetate ale anticorpilor himerici antiCD20 activi imunologic, vor avea loc o serie de evenimente, fiecare eveniment fiind considerat de către noi ca important pentru tratamentul eficient al bolii. Primul “eveniment” poate fi considerat ca orientat în principal pentru reducerea substanțială a celulelor B din sângele periferic al pacientului.

Următoarele “evenimente” pot fi considerate, fie în principal orientate spre îndepărtarea simultană sau serială a celulelor B remanente din sistemul celulelor B din nodulii limfatici, fie ca îndepărtarea celulelor B din alte țesuturi.

Ca urmare, în timp ce un dozaj unic asigură beneficii și poate fi utilizat eficient, pentru tratarea/conducerea bolii, un tratament prefererat de durată poate fi întâlnit în câteva etape; cel mai de dorit se introduce la pacient o dată pe săptămână, pentru circa 4 săptămâni, între circa 0,4 și circa 20 mg/kg greutate corporală de anticorpi himerici anti-CD20 activi imunologic.

Referitor la folosirea anticorpilor anti-CD20 radiomarcați, există o preferință deoarece anticorpul nu este himeric. Această preferință este dictată de timpul de înjumătățire în circulație, semnificativ mai lung al anticorpilor himerici față de anticorpi murini (adică, cu un timp de înjumătățire a vieții în circulație mai lung; radionuclidul este prezent în pacient pentru perioade mai lungi).

Anticorpii himerici radiomarcați pot fi utilizați benefic cu dozajele folosite mai scăzute în mili-Currie (“mCi”) în legătură cu anticorpii himerici relativ la anticorpul murin. Acest scenariu permite o descreștere a toxicității în măduva osoasă până la un nivel acceptabil, menținând în același timp utilitatea terapeutică.

La prezenta invenție sunt aplicabili o multitudine de radionuclizi și specialiștii în domeniu sunt acreditați cu abilitatea de a determina cu ușurință ce radionuclid este cel mai adecvat într-o multitudine de împrejurări. De exemplu, iodul (131) este un radionuclid binecunoscut pentru imunoterapie. Cu toate acestea, utilitatea chimică deplină a iodului (131) poate fi limitată prin câțiva factori incluzând înjumătățirea vieții fizice de 8 zile, dehalogenarea anticorpului iodat, atât în sânge, cât și la locul de situare al tumorilor și emisia caracteristică (de exemplu, componentul gama mare) care poate fi suboptimal pentru depozitul dozei localizate în tumoare.

Cu apariția agenților chelatori superiori, oportunitatea atașării grupărilor chelatoare metalice la proteine a mărit posibilitățile de a utiliza alți radionuclizi ca indiul (131) și ytriul (90).

R0118524 Β1

Ytriul (90) asigură câteva avantaje pentru utilizare în aplicații radioimuno-terapeutice: timpul de înjumătățire a vieții ytriului (90) de 64 h este suficient de lung pentru a permite acumularea anticorpului de către tumoră și spre deosebire de iod (131), ytriu (90) este un emițător beta pur de înaltă energie, fără însoțirea de iradiere gama, în îmbătrânirea sa cu un domeniu în diametrele țesuturilor de 100 până la 1000 celule.

Mai mult decât atât, cantitatea minimă de radiație care penetrează, permite administrarea anticorpilor marcați cu ytriu (90) pacienților, fără să fie în mod necesar spitalizați. Interalierea anticorpului marcat nu este necesară pentru uciderea celulelor, emisia locală de radiație ionizantă va fi letală pentru celulele tumorale învecinate lipsite de antigen țintă.

limitare neterapeutică pentru ytriu (90) se bazează pe absența radiației gama semnificativă care face dificilă vizualizarea acestora. Pentru evitarea acestor probleme se poate utiliza un radionuclid de diagnosticare precum indiu (111) care formează imagini pentru determinarea localizării și mărimii relative a unei tumori înaintea administrării dozei terapeutice de ytriu(90) împreună cu anti-CD20.

Indiu (111) este preferat în mod deosebit ca radionuclid pentru diagnostic, deoarece: între circa 1 până la circa 10 mCi se pot administra în siguranță, fără toxicitate detectabilă; datele sub formă de imagini sunt, în general, previzibile pentru distribuția ulterioară a anticorpului marcat cu ytriu (90). Majoritatea studiilor imaginează utilizarea anticorpului marcat cu 5 mCi indiu (111) deoarece această doză este pe de o parte sigură și are o eficiență de formare a imaginillor crescută, comparativ cu dozele mai mici, cu imaginea optimală formată la 3 până la 6 zile după administrarea anticorpului. Vezi, de exemplu, Murray J.L., 26 J.Nuc.Med. 3328 (1985) și Garraguiilo, J.A. et al., 26 J.Nuc.Med. 67 (1985).

Dozajul tratamentului unic eficient (adică, cantitățile eficiente terapeutic) ale anticorpilor anti-CD20 marcate cu ytriu (90) sunt în domeniul dintre circa 5 și circa 75 mCi, preferabil între circa 10 și circa 40 mCi. Dozajele eficiente de tratament unic ablativ (adică, pot necesita transplantare de măduvă osoasă autologă) de anticorpi anti-C020 marcați cu iod (131) sunt în domeniul dintre circa 30 și circa 600 mCi, de preferință, între circa 50 și mai puțin, decât circa 500 mCi.

în legătură cu un anticorp himeric anti-CD20, datorită vieții de înjumătățire mai lungă în circulație față de anticorpii murini, un dozaj ablativ non-măduvă eficient ca tratament unic cu anticorpi himci anti-CD20 marcați cu iod (131) este în domeniul dintre circa 5 și circa 40 mCi, de preferință mai mic decât circa 30 mCi. Criteriile imaginate pentru, de exemplu, marcaj indiu (111) tipic, sunt mai mici decât circa 5 mCi.

în legătură cu anticorpi anti-CD20 radiomarcați, se poate întâlni, de asemenea, terapia cu aceștia, folosind un tratament terapeutic unic sau folosind tratamente multiple. Datorită componentului radionuclid, este de preferat ca înaintea tratamentului să fie prelevate celule din curentul periferic (PSC) sau măduvă osoasă (BM) de la pacienți, pentru experimentarea toxicității potențiale fetale a măduvei osoase, care ar rezulta de la radiație.

BM și/sau PSC se prelevează folosind tehnici standard și apoi se curăță și se îngheață pentru o posibila reinfuzare. Suplimentar, este de preferat ca anterior tratamentului să se facă un studiu de diagnosticare dozimetric, folosind un anticorp marcat pentru diagnostic (de exemplu, folosind indiu (111) asupra pacientului, în vederea asigurării că anticorpul marcat este terapeutic (de exemplu, folosind ytriu (90)) și nu va deveni în mod nedorit concentrat în orice țesut sau organ normal.

Au fost descriși anticorpi himerici șoarece/om. Vezi, de exemplu, Morrison, S.L. et al., PNAS I 1,6851-6854 (Noiembrie 1984); publicația de brevet european nr. 172494;

Boulianne, G..L. et al., Nature 312;642(decembrie 1984); Neubeiger, M.S. et al., Nature 4x

314 : 268 (martie 1985); publicația brevetului european 125023; Tan et al.,

J.lmmunol.l35;8564 (noiembrie 1985); Sun, L.K. et al, Hyrbridoma 5/1:517 (1986); Sahagan.

345

350

355

360

365

370

375

380

385

390

RO 118524 Β1 et al, J.lmmunol. 137;1066-l074 (1986) . Vezi, în general, Muron, Nature 312;597 (Decembrie 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5/3 (martie 1985); Marx, Science 229;455 (august 1985); și Morrison Science 229;1202-1207 (septembrie 1985). Robinson et al., descriu în publicația PCT nr. WO 88/04936 un anticorp himeric cu regiune constantă umană și regiune variabilă murină, având specificitate față de un epitop al CD20; porțiunea murină a anticorpului himeric din referința Robinson este derivat de la anticorpul monoclonal de șoarece 2H7 (gama 2b, kapa).

Deoarece, referința remarcă faptul ca anticorpul himeric descris este un prim candidat pentru tratamentul tulburarărilor celulei B, această formulare nu poate fi văzută mai mult decât ca o sugestie pentru specialiștii în domeniu, să determine dacă da sau nu această sugestie este exactă pentru acest anticorp anume; în special, datorită lipsei oricăror date de referință în sprijinul unei afirmații asupra eficacității terapeutice, a datelor privind folosirea la mamifere superioare, precum primate sau oameni.

Metodologii pentru generarea de anticorpi himerici sunt accesibile specialiștilor în domeniu. De exemplu, cafenele ușoare și grele se pot exprima separat folosind, de exemplu, catena ușoară a imunoglobulinei și catene grele ale imunoglobulinei în plasmizi separați. Apoi, acestea se pot purifica și asambla in vitro în anticorpi compleți.

Metodologii pentru realizarea unor asemenea asamblări au fost descrise. Vezi, de exemplu, Scharff, M; Harvey Lectures 69:125 (1974). Parametrii reacției in vitro pentru formarea anticorpilor IgG de la catene grele și ușoare izolate reduse au fost, de asemenea, descriși. Vezi, de exemplu, Beychok, S., Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, p.69,1979.

De asemenea, este posibilă, co-expresia catenelor ușoară și grea în aceleași celule, pentru a obține asocierea intracelulară și linkajul catenelor grea și ușoară în anticorpi complecși H₂L>lgG. Asemenea co-expresie se poate realiza folosind, fie același plasmid, fie plasmizi diferiți în aceiași celulă gazdă.

O altă abordare și care pentru noi este cea mai preferată pentru dezvoltarea anticorpului himeric anti-C020 non-uman/uman, se bazează pe utilizarea unui vector de expresie care include ab initio ADN, care codifică regiunile constante din catenele grea și ușoară dintr-o sursă umană.

Un asemenea vector permite insertarea de ADN care codifică regiunea variabilă nonumană, astfel, încât se pot genera diverși anticorpi anti-CD20 non-umani, care se pot cerceta pentru diferite caracteristici (de exemplu, tipul specificității de legare, regiunile epitop de legare, etc.); ulterior, se pot încorpora în vector cADN-uri care codifică regiuni variabile ale catenei ușoară și grea de la un anticorp anti-CD20 preferat sau dorit.

Se face referire la aceste tipuri de vectori, ca vectori Expresie în Tandem Anticorp Himeric (“TCAE). Cel mai preferat vector TCAE care s-a folosit pentru generarea anticorpilor himerici anti-CD20 activi imunolologic pentru tratamentul terapeutic al limfoamelor este TCAE 8. Acesta este un derivat al unui vector propriu al solicitanților acestui brvetet denumit ca TCAE 5.2, diferența fiind aceea că în TCAE 5.2 situl de start al inițierii translației markerului selectabil dominant (neomicin fosfotransferaza, NEO) este o secvență Kozak consens, în timp ce pentru TCAE 8, această regiune este o secvență Kozac consens parțială nepereche.

Detalii referitoare la impactul sitului de stare a inițierii markerului selectabil dominant al vectorilor TCAE (de asemenea, denumiți ca “vector ANEX) față de expresia proteinei, sunt descrise în amănunt în cererea în curs de rezolvare, depusă cu cea de față.

TCAE 8 cuprinde patru (4) casete transcripționale și acestea sunt în ordine tandem, adică, o regiune variabilă absentă a catenei ușoare de la o imunoproteină umană, o regiune variabilă absentă a catenei grele de la o imunoproteină umană, DHFR și NEO.

RO 118524 Β1

Fiecare casetă transcripțională conține propriul său promotor eucariotic și regiunea de poliadenilare (referința este făcută la fig.1, care este o reprezentare diagramatică a vectorului TCAE8). Cu specificarea:

1) Promotorul/intensificatorul CMV în fața catenei grele a imunoglobulinei este o versiune truncată a promotorului /intensifictorului din fața catenei ușoare de la situl Nhe I la-350 până la situl Sst I la -16 (vezi, 41 Cell 521,1985);

2) O regiune constantă a catenei ușoare de imunoglobulină umană s-a derivat pe calea amplificării cADN-ului printr-o reacție PCR în TCAE8, aceasta a fost regiunea constanta kapa, a catenei ușoare de imunoalobulină umană (Kabat numerotare aminoacizii 108-214 alotip Km 3, (vezi, Kabat, E.A. Sequences of Proteins of immunological interest, NIH Publication, Fifth Ed. nr. 91-3242,1991), și regiunea constantă gama 1 a catenei grele de imunogrobulină umană (numerotare Kabat aminoacizii 114-478, alotip Gmla, Gmlz). Catena ușoară s-a izolat din sânge uman normal (IDEC Pharmaceuticals Corporation, La Jolla, CA); ARN-ul de aici s-a folosit pentru sinteza cADN care apoi a fost amplificat folosind tehnici PCR [primeni s-au derivat față de consensul de la Kabat). Catena grea s-a izolat (folosind tehnici PCR) de la cADN preparat de la ARN care, în schimb s-a derivat de la celule transfectate cu un vector lgG1 uman (vezi, 3 Prot. Eng. 531,1990; vectorul ρΝγ, 62). S-au schimbat 2 aminoacizi în lgG1 uman izolat pentru împerecherea secvenței aminoacide consens de la Kabat, la sens: aminoacidul 225 s-a schimbat din valină la alanină, (GTT la GCA), și aminoacidul 287 s-a schimbat de la metionină la lizina (ATG la AAG);

3) Casetele catenei ușoară și grea de imunoglobulină umană conțin secvențe semnal sintetice pentru secretarea catenelor imunogobulinei;

4) Casetele catenei ușoară și grea de imunoglobulină umană conțin situri de restricție ADN specifice care permit insertarea ragiunilor variabile imunoglobulinice ușoară și grea care mențin cadrul de citire tranzițional și nu alterează aminoacizii găsiți în mod normal în catenele imunoglobulinei;

5) Caseta DHFR a conținut propriul sau promotor eucariotic (promotorul principal al b-globinei de șoarece, BETA) și regiunea de poliadenilare (poliadenilarea hormonului bovin de creștere, BGH); și

6) Caseta NEO a conținut propriul sau promotor eucariotic (BETA) și reagiunea de poliadenilare (poliadenilare timpurie SV40, “SV).

Considerând vectorul TCAE 8 și caseta NEO, regiunea Kozac a fost o secvență Kozac consens parțial nepereche (care include un sit Cla I în amonte):

Cla I -3 +1

GGGAGCTTGC ATCGAT ccTct ATG Gtt (în vectorul TCAE 5.2, schimbarea este în regiunile Cla I și ATG, la sens: ccAcc).

Lista completă a secvenței lui TCAE 8 (inclusiv componentele specifice ale celor 4 casete transcripționale) este menționată în fig.2 (Secvența ID nr.1).

Așa cum se va aprecia de specialiști în domeniu, vectorii TCAE permit reducerea substanțială avantajoasă a timpului necesar pentru generarea anticorpilor himerici anti-CD20 activi imunologic. Generarea și izolarea regiunilor variabile ale catenei ușoară și grea nonumane urmată de încorporarea acestora în caseta transcripțională constantă a catenei ușoare și în caseta transcripțională constantă a catenei grele umane permit producerea de anticorpi himerici anti-CD20 imunologic activi.

S-a derivat o regiune variabilă non-umană, cea mai de dorit cu specificitate față de antigenul CD20 folosind o sursa murină și tehnologia hibridomilor. Folosind reacția polimerazică de lanț (“PCR), regiunile variabile murine ușoară și grea s-au donat direct în vectorul TCAE 8 aceasta fiind ruta cea mai preferată pentru încorporarea regiunii variabile non-umane în vectorul TCAE.

445

450

455

460

465

470

475

480

485

490

RO 118524 Β1

Această preferință, este în principal, bazată pe eficiența reacției PCR și corectitudinea inserării. Totuși, pentru realizarea acestei sarcini sunt accesibile și alte proceduri echivalente. De exemplu, folosind TCAE 8 (sau un vector echivalent) se poate obține secvența regiunii variabile a anticorpului anti-CD20 non-uman, urmată de sinteza oligonucleotidelor, porțiunilor secvenței sau dacă corespunde, a întregii secvențe.

Ulterior, porțiunile sau întreaga secvență sintetică se poate insera în localizările corespunzătoare din vector. Specialiști în domeniu au pregătirea necesară pentru realizarea acesteia.

Anticorpii noștri himerici anti-CD20 activi imunologic, cei mai preferați s-au derivat din utilizarea vectorului TCAE 8 care a inclus regiuni variabile murine derivate de la anticorpul monoclonal față de CD20; acest anticorp (va fi discutat în detaliu mai jos), s-a denumit ca “2B8. Secvența completă a regiunilor variabile obținute de la 2B8 în TCAE 8 (antiCD20 în TCAE 8) este menționată în fig.3 (Secvența ID nr. 2).

Linia celulară gazdă utilizată pentru expresia proteinei cel mai adesea este de origine mamiferă; specialiștii în domeniu au pregătirea de a determina preferențial liniile celulare gazdă speciale, care sunt cele mai adecvate pentru produsul genetic dorit să fie exprimat aici. Linii celulare gazdă exemplare includ fără însă să fie limitate, DG44 și DUXB11 (linii ovariene de hamster chinezesc minus DHFR), HELA (carcinom uman cervical), CVI (linie renală de maimuță), COS (un derivat al CVI cu antigen SV 40 T), R1610 (fibroblaste de hamster chinezesc), BALBC/3T3 (fibroblaste de șoarece), HAK (linie renală de hamster), SP2/O (mielom de șoarece), P3x63Ag3.653 (mielom de șoarece), BFA-1c1BPT (celule endoteliale bovine), RAJI (limfocite umane) și 293 (rinichi uman). Linii celulare gazdă sunt accesibile de obicei prin servicii comerciale de la ATCC sau din literatura publicată.

De preferință, linia celulară gazdă este fie DG44 (CHO”) sau SP2/0. Vezi Urlând, G. et al, Effect of gamma rays and the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions Som. Cel & Mol. Gen. 12/6;555-566 (1986); și, respectiv, Shulman, M. et al.,. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies Nature 276;269 (1978). Cea mai preferata este linia celulară gazdă DG44.

Transfecția plasmidului în celula gazdă se poate realiza prin orice tehnică accesibilă specialiștilor în domeniu. Acestea includ, însă nu se limitează la transfecție (inclusiv, electroforeza și electroporarea), fuziunea celulară cu ADN învelit, microinjectarea și infecția cu virus intact. Vezi Ridhway, A.A.G. Mammalian Expression Vectors capitolul 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodrigues and Denhardt Eds (Butterworth, Boston, MA1988). Cel mai de preferat, introducerea plasmidului în gazdă este pe calea electroporării.

Următoarele exemple nu au intenția și ele nici nu vor fi interpretate ca limitând invenția. Exemplele au intenția să evidențieze: formarea unei imagini asupra dozei folosind un anticorp anti-CD20 radiomarcat (I2B8); anticorpul anti-CD20 radiomarcat (Y2B8.); și anticorpul himeric anti-CD20 activ imunologic (C2B8) derivat prin utilizarea unui vector specific (TCAE 8) și regiuni variabile derivate de la un anticorp monoclonal murin antiCD20(2B8). în continuare, se dau câteva exemple de realizare a invenției, de la I la V, după cum urmează:

Exemplul I. Anticorp 2B8 anti-CD20 radiomarcat

A. Producerea anticorpului monoclonal [Murin) anti-CD20(“2B8”)

S-au imunizat repetat șoareci BALB/C cu linia celulară limfoblastoidă umană SB (Vezi, Adams, R.A. et al., Direct implantation and serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in hamsters, SB-2, Can Res 28:1121-1125 (1968); această linie celulară este accesibilă de la colecția americană de culturi de țesuturi, Rockville, MD., sub nr. de acces ATCC, ATCC CCL 120), cu injecții săptămânale timp de 3-4 luni. S-au identificat șoareci care evidențiază titruri serice ridicate de anticorpi anti-CD20 așa cum s-a

RO 118524 Β1 determinat prin inhibiția anticorpilor CD-20 specifici cunoscuți (anticorpii anti-CD20 utilizaji au fost Leu 16, Beckton Dickinson, San Jose, CA nr. catalog 7670; și B1, Coulter Corp.; Hialeah, FL, Nr. catalog 6602201); apoi, s-a îndepărtat splina de la asemenea șoareci. Celulele splenice de șoarece SP2/0 în conformitate cu protocolul descris în EINFELD D.A. et al., (1988) EMBO 7:711 (SP2/0 are numărul de acces la ATCC, ATCC CRL 8006).

Examinările pentru specificitate CD20 s-au realizat prin: radioimunotest. Pe scurt, B1 anti-CD20 purificați s-au radiomarcat cu I¹²⁵ prin metoda descrisă în: Valentine E.A. et al., (1989) J.Biol Chem. 264:1128.2. (lodura de sodiu I¹²⁵, ICN, Irvine, CA, nr.catalog 8665H).

S-au cercetat hibridomii prin co-incubare a 0,05 ml de mediu de la fiecare godeu de fuziune împreună au 0,05 ml de B1 anti-CD20 marcat I¹²⁵ (10 ng) în BSA, PBS 1% (pH=7,4) și 0,5 ml din același tampon care conține 100 000 celule SB. După incubare timp de o oră la temperatura camerei s-au recoltat celulele prin transferare la plăci de titrare de 96 godeuri (V&P Scientific, San Diego, CA) și s-au spălat cu atenție. S-au folosit drept controale pozitive și, respectiv, negative, godeuri duplicat conținând B1 anti-CD20 nemarcat și godeuri lipsite de inhibitori pentru anticorp. S-au dezvoltat și donat godeurile conținând mai mult de 50% inhibiție. Anticorpul care demonstrează cea mai ridicată inhibiție s-a derivat de la linia celulară donată desemnată aici ca 2B8.

B. Prepararea conjugatului 2B8-MX-DTPA

i. MX-DTPA

S-a utilizat ca agent chelator pentru conjugarea radiomarcajului la 2B8 acid 1-izotiocianatobenzil-3-metildietilen-triaminpenta acetic-marcat C¹⁴ (MX-DTPA-marcat C¹⁴). Manipulările lui MX-DTPA-ului s-au făcut pentru menținerea condițiilor fără metal, adică, reactivi lipsiți de metal și, când a fost posibil, s-au utilizat containere din polipropilenă (baloane, cilindri gradați, pahare de laborator, pipete) spălate cu Alconox și clătite cu apă Milli-Q.

S-a obținut MX-DTPA sub formă de solid uscat de la Dr. Otto Gansow [Național Institute of Health, ethesda, MD) și s-a depozitat deshidratat la 48 C (protejat de lumină), soluțiile stoc fiind preparate în apă Milli-Q la o concentrație de 2-5 mM, cu depozitare la -70°C.

MX-DTPA s-a obținut, de asemenea, de la Coulter Immunology (Hialeah, Florida) ca sare de sodiu în apă și s-a depozitat la -70° C· ii. Prepararea lui 2B8

S-a preparat 2B8 purificat pentru conjugare cu MX-DTPA prin transferarea anticorpului în 50 mM bicin-NaOff lipsit de metal, pH=8,6 conținând NaC1150 mM, utilizând în mod repetat tampon de schimb cu filtre spin CENTRICON 30™ (30000 D, MWCO; Amicon). în general, s-au adăugat la unitatea de filtrare 50-200 μΙ de proteină (10 mg/ml) urmat de 2 ml tampon bicin. S-a centrifugat filtrul la 4°C într-o centrifugă Sorval SS - 34 (6000 rpm, 45 min). Volumul reținut a fost de aproximativ 50-100 μΙ; acest procedeu s-a repet de două ori folosind același filtru. S-a transferat ceea ce s-a reținut la o eprubetă din propilenă de 1,5 ml prevăzută cu dispozitiv de rotire la partea superioară, s-a examinat pentru proteină, s-a diluat până la 10,0 mg/ml și s-a depozitat la 4°C până la utilizare; în mod similar, proteina s-a transferat în citrat de sodiu 50 mM, pH=5,5, conținând NaCI 15 mM, pH=5,5, conținând NaC1150 mM și azidă de sodiu 0,05 %, folosind protocolul de mai sus.

iii. Conjugarea lui 2B8 cu MX-DTPA

Conjugarea lui 2B8 cu MX-DTPA s-a realizat în eprube de propilenă la temperatura ambiantă. Soluțiile stoc de MX-DTPA înghețate s-au dezghețat imediat înainte de utilizare.

S-au reacționat 50-200 ml de proteină la 10 mg/ml cu MX-DTPA la un raport molar de MXDTPA-la-2B8 de 4:1.

545

550

555

560

565

570

575

580

585

590

RO 118524 Β1

Reacțiile s-au inițiat prin adaugarea soluției stoc MX-DTPA și agitare blândă; peste noapte lăsat să continue conjugarea [14 până la 20 h) la temperatura ambiantă. S-a îndepărtat MX-DTPA nereacționat din conjugat prin dializă sau ultrafiltrare repetată așa cum s-a descris mai sus în exemplul I.B.ii, în soluție salină normală lipsită de metal (0,9 % g/v) care conține azidă de sodiu 0,05 %. Concentrația proteinei s-a corectat până la 10 mg/ml și s-a depozitat la 4°C într-o eprubetă de polipropilenă până la radiomar-care.

iv. Determinarea încorporării de MX-DTPA încorporarea MX-DTPA s-a determinat prin numărătoare de scintilație și s-a comparat valoarea obținută cu conjugatul purificat pentru activitatea specifică a MX-DTPA marcat C¹⁴. Pentru anumite studii în care s-a utilizat MX-DTPA neradioactiv (Coulter Immunology) încorcoparea MX-DTPA s-a examinat prin incubarea conjugatului cu o soluție în exces purtătoare de ytriu (90) radioactiv de concentrație și activitate specifică cunoscută.

S-a preparat o soluție stoc de clorură de ytriu de concentrație cunoscută în HCI 0,0N fără metal la care s-a adaugat yitriu (90) fără purtător (sare dorică). S-a analizat un alicot al acestei soluții prin numărarea de scintilații în lichid pentru a determina o activitate specifică precisă pentru acest reactiv. într-o eprubetă de propilenă s-a adăugat un volum de reactiv clorură de ytriu egal cu de 3 x numărul de moli de chelat așteptat să se atașeze la anticorp (de obicei, 2 mol/mol anticorp) și s-a corectat pH-ul până la 4,0-4,5 cu acetat de sodiu 2M. Ulterior, s-a adăugat anticorpul conjugat și amestecul s-a incubat 15-30 min, la temperatura ambiantă. Reacția s-a oprit prin adăugare de EDTA 20 mM până la o concentrație finală de mM și pH-ul soluției s-a ajustat până la aproximativ pH=6 cu acetat da sodiu 2M.

După o incubare de 5 min, întregul volum s-a purificat prin cromatografie de înaltă performamță, de excludere după mărime (s-a descris mai jos). Proteina eluată care conține fracțiunile s-a combinat, s-a determinat concentrația proteinei și s-a examinat pentru radioactivitate un alicot. încorporarea chelatului s-a calculat folosind activitatea specifică a preparatului de clorură de ytriu. (90) și concentrația proteinei.

v. Imunoreactivitatea lui 2B8 - MX - DTPA

Imunoreactivitatea conjugatului 2B8 s-a examinat folosind celula integrală ELISA.

S-au recoltat din cultură celule SB în faza Mid-log prin centrifugare și s-au spălat de ori cu 1 X celule HBSS. S-au diluat celulele până la 1-2 x 10⁶ celule/ml în HBSS și s-au împărțit în plăci de microtitrare din polistiren cu 96 godeuri la 50000 -100 000 celule/godeu.

Plăcile s-au uscat la vid timp de 2 h la 40-45°C pentru fixarea celulelor la plastic; până la utilizare plăcile s-au păstrat la loc uscat, la -20°C. Pentru examen s-au încălzit plăcile la temperatura ambiantă imediat înaintea folosirii, apoi s-au blocat cu 1 x PBS , pH=7,2-7,4 care conține BSA 1% (2 h). Probele pentru examinare s-au diluat în 1 x PBS/BSA 1%, s-au aplicat la plăci și s-au diluat serial (1 :2) în același tampon. După incubarea plăcilor timp de o oră la temperatura ambiantă, plăcile s-au spălat de 3 ori cu 1 x PBS. S-a adăugat la godeuri anticorpul secundar (50 μΙ conjugat HRP capră anti-șoarece lgG1-specific) (diluție 1:1 500 în 1 x PBS/BSA 1%) și s-au incubat o oră la temperatura ambiantă.

Plăcile s-au spălat de 4 ori cu 1 x PBS urmat de adăugarea de soluție substrat ABTS [citrat de sodiu 50 mM, pH=4,5 conținâd ATBS 0,01% și H₂O₂ 0,001%). Plăcile s-au citit la 405 nm după incubare 15-30 min. Celulele HSB antigen-negative s-au inclus în examinări pentru urmărirea legării nespecifice.

Imunitatea conjugatului s-a calculat prin marcarea valorilor absorbanței față de factorul de diluție respectiv și comparând acestea la valorile obținute folosind anticorp nativ (care reprezintă 100 % imunoreactivitate) s-au testat pe aceeași placă; s-au comparat câteva valori de pe porțiunea lineară a profilului titrării și s-a determinat o valoare medie (date neprezentate).

R0118524 Β1 vi. Prepararea lui 2B8 - MX - DTPA marcat indiu(111) (Ί2Β8) 640

Conjugatele s-au radiomarcat cu indiu (111) fără purtător. S-a transferat un alicot al izotopului (0,1-2 mCi/mg anticorp) în HCI 0,05 M într-o eprubetă de propilen și s-a adăugat aproximativ 1/10 la volum de HCI 2M fără metal, După incubare timp de 5 min, s-a adăugat acetat de sodiu 2M fără metal pentru a ajusta pH-ul soluției până la 4,0-4,4. S-au adăugat dintr-o soluție stoc DTPA 10,0 ng/ml în soluție salină normală aproximativ 0,5 mg de 2B8- 645

MX-DTPA sau citrat de sodiu 50 mM/NaCI 150 mM conținând azidă de sodiu 0,05 % și soluția s-a amestecat imediat cu grijă. S-a controlat pH-ul soluției cu hârtie de pH măsurând o valoare de 4,0-4,5 și amestecul s-a incubat la temperatura camerei timp de 15-30 min. Ulterior, reacția s-a oprit prin adăugare de EDTA 20 mM până la o concentrație finală de 1 mM și amestecul de reacție s-a adus la pH aproximativ 6,0 folosind acetat de sodiu 2M. 650

După o incubare de 5-10 min radioizotopul necomplexat s-a îndepărtat prin cromatografie de excludere după mărime. Unitatea HPLC a constat dintr-un Waters Model 6000 sau TosoHaas Model TSK- 6110, având sistem de eliberare respectiv, fiind prevăzut cu o valvă de injectare Waters U6K sau Rheodine 700.

Separările cromatografice s-au realizat folosind o coloană cu gel de permeație 655 (BioRad SEC-250; 7,3 x 300 mm sau o coloană comparabilă TosoHaas) și o coloană de gardă SEC-250 (7,5 x 100 mm). Sistemul a fost echipat cu un colector de fracțiune (Pharmacia Frac200) și un monitor UV prevăzut cu un filtru de 280 nm (Pharmacia model UV-1). S-au aplicat probele și s-au eluat izocratic folosind 1 x PBS , pH=7,4, la o rată de curgere de 1,0 ml/min. 660

S-au colectat în eprubete de sticlă 100 ml de fracțiuni și alicoți; din aceștia s-au cuantificat într-un numărător gama. Ferestrele, inferioară și superioară, s-au montat la 100 și respectiv 500 Kev.

S-a calculat radioîncorporarea prin însumarea radioactivității asociate cu maximul proteinei eluate și împărțirea acestui număr prin radioactivitatea totală eluată din coloană; 665 această valoare a fost apoi exprimată ca procent (datele nu s-au prezentat); în câteva cazuri radioîncorporarea s-a determinat folosind cromatografia instantanee în strat subțire (ITLC¹*).

Conjugatul radiomarcat s-a diluat 1:10 sau 1:20 în 1 x PBS sau în 1 x PBS/DTPA 1mM, apoi 1 μΙ s-a colorat la 1,5 cm de la capătul unei fâșii de hârtie ITLC SG de 1 x 5 cm. Hârtia s-a developat prin cromatografie ascendentă folosind acetat de amoniu 10 % în 670 metanol:apă [1:1 v/v).

Fâșia s-a uscat, s-a tăiat în jumătăți transversale și s-a determinat radioactivitatea asociată cu fiecare secțiune prin numărare gama. Radioactivitatea asociată cu jumătatea superioară a fâșiei (radioactivitatea asociată proteinei) s-a exprimat ca un procent al radioactivității totale, determinată prin însumarea valorilor, atât de la bază, cât și de la vârful 675 jumătăților (date neprezentate).

Activitățile specifice s-au determinat prin măsurarea radioactivității unui alicot corespunzător al conjugatului radiomarcat. Această valoare s-a corectat pentru eficiența numărătorii (de obicei 75%) și s-a raportat la concentrația proteinei conjugatului, determinată anterior prin absorbanță la 280 nm și valoarea rezultată s-a exprimat ca mCi / mg proteină. 680

Pentru câteva experimente, 2B8-MX-DTPA s-a radiomarcat cu indiu (111) urmând un protocol similar cu unul dintre cele descrise mai sus, dar fără purificare prin HPLC; acesta a fost denumit protocol mix-and-shoot¹'.

vii. Prepararea de 2B8 - MX - DTPA marcat ytriu (90)(Ύ2Β8)

Pentru prepararea de conjugat 2B8-MX-DTPA marcat ytriu (90)(Ύ2Β8“) s-a urmat 685 același protocol descris pentru prepararea lui I2B8, cu excepția că nu s-a folosit HCL 2 ng; toate preparatele conjugatelor marcate cu ytriu s-au purificat prin cromatografie de excludere după mărime, așa cum s-a descris mai sus.

RO 118524 Β1

C. Studii pe animal non-uman

i. Biodistribuția lui 2B8 - MX - DTPA radiomarcat

S-a evaluat I2B8, pentru.biodistribuție tisulară în șoareci BALB/c de 6 până la 8 săptămâni. Conjugatul radiomarcat s-a preparat folosind 2B8-MX-DTPA grad-clinic, urmând protocolul mix-and-shoot descris mai sus. Activitatea specifică a conjugatului a fost 2,3 mCi/mg și conjugatul s-a formulat în PBS, pH=7,4 care conține HSA.

S-au injectat intravenos șoareci cu 100 μΙ de I2B8 (aproximativ 21 μθΐ) și grupuri de câte 3 șoareci s-au sacrificat prin dislocare cervicală la 0,24, 48 și 72 h. După sacrificare, s-au păstrat: coada, inima, plămânii, ficatul, rinichii, splina, mușchii și femurul care s-au spălat și s-au cântărit. De asemenea, s-a recuperat pentru analiză o probă de sânge.

Radioactivitatea asociată cu fiecare specimen s-a determinat prin numărare gama și ulterior s-a determinat procentul dozei injectate/g de țesut. Nu s-a acordat atenție contribuției scăderii activității reprezentată prin sângele asociat cu organele individuale.

într-un protocol separat, s-au incubat alicoți de 2B8 - MX-DTPA la 4°C și 30°C timp de 10 săptămâni și s-au radiomarcat cu indiu (111) pentru activitate specifică de 2,1 mCi/mg pentru ambele preparate. Aceste conjugate s-au folosit apoi în studiile biodistribuției la șoareci așa cum s-a descris mai sus.

Pentru determinări dozimetrice s-a radiomarcat 2B8-MX-DTPA cu indiu (111) până la o activitate specifică de 2,3 mCi/mg și s-au injectat aproximativ 1,1 pCi în fiecare din cei 20 șoareci BALB/c. în continuare, grupuri de câte 5 șoareci fiecare s-au sacrificat la 1, 24, 48 și 72 h, iar organele s-au oprit și s-au preparat pentru analiză. Suplimentar, s-au recuperat porțiuni de piele, mușchi și os și s-au prelucrat pentru analize; de asemenea, s-au colectat urina și fecalele și s-au analizat, după sacrificările de la 24 și 72 h.

Folosind o abordare similară, 2B8-MX-DTPA s-a radiomarcat de asemenea, cu ytriu (90) și distribuția s-a biologică s-a evaluat în șoareci BALB/c după o periodă de timp de 72 h. După purificare prin HPLC cromatografie de excludere după mărime, 4 grupe de 5 șoareci fiecare s-au injectat intravenos cu aproximativ 1 pCi de conjugat formulat clinic (activitate specifică: 12,2 mCi/mg); grupurile au fost apoi sacrificate la 1,24, 48 și 72 h, iar organele și țesuturile lor s-au analizat așa cum s-a descris mai sus.

Radioactivitatea asociată cu fiecare specimen de țesut s-a determinat prin măsurarea energiei radiației de frânare cu un contoar de scintilație gama. Valorile activității au fost exprimate ulterior ca procent doză injectată per gram țesut sau procent doză injectată per organ. Deoarece, organele și alte țesuturi s-au clătit repetat pentru îndepărtarea sângelui superficial, organele nu au fost perfuzate. Astfel, valorile activităților organului nu s-au scăzut din contribuția de activitate reprezentată de către sângele intern asociat.

ii. Localizarea tumorală a lui I2B8

Localizarea lui 2B8-MX-DTPA radiomarcat s-a determinat în șoareci purtători de tumori ale celulelor B atimice Ramos. șoareci atimici în vârstă de 6 până la 8 săptămâni s-au injectat subcutanat (în partea dorsală stânga) cu 0,1 ml de RPMl -1640, conținând 1,2 x 10⁷ celule tumorale Ramos care au fost anterior adaptate pentru creștere în șoareci atimici. Tumorile au fost provocate în două săptămâni și au fost cuprinse în domeniul de greutate de la 0,07 până la 1,1 g. S șoarecii s-au injectat intravenos cu 100 μΙ de 2B8-MX-DTPA marcat indiu (111) (16,7 pCi) și grupuri de câte 3 șoareci s-au sacrificat prin dizlocare cervicală la 0, 24, 48 și 72 h.

După sacrificare s-au recuperat coada, inima, plămânii, ficatul, rinichii, splina, mușchiul, femurul și tumoarea, s-au spălat și s-au cântărit; de asemenea, s-a prelevat pentru analiză o probă de sânge. S-a determinat radioactivitatea asociată cu fiecare specimen prin numărare gama și s-a determinat procentul doză injectată/g țesut.

RO 118524 Β1 iii. Studii privind biodistribuția și localizarea tumorală cu 2B8-MX-DTPA radiomarcat

După experimentul preliminar asupra biodistribuției descris mai sus (exemplul I.B.viii.) s-a radiomarcat conjugatul 2B8 cu indiu (111) până la o activitate specifică de 2,3 mCi/mg și aproximativ 1,1 pCi.apoi s-au injectat în fiecare din cei 20 de șoareci BALB/c pentru a 740 determina biodistribuția materialului marcat.

în continuare, s-au sacrificat grupuri de câte 5 șoareci fiecare, la 1, 24, 48 și 72 h, prelevându-se organele lor și porțiuni de piele, mușchi și os care s-au prelucrat pentru analize. în plus, s-a colectat urina și fecalele și s-au analizat pentru momentele de timp 24 și 72 h. Nivelul radioactivității în sânge a scăzut de la 40,3 % doză injectată per gram la o 745 oră, până la 18,9 % la 72 h (datele nu au fost prezentate). Valorile pentru inimă, rinichi, mușchi și splină au rămas în domeniul 0,7 - 0,9 % de-a lungul experimentului. Nivelurile de radioactivitate găsite în plămâni au scăzut de la 14,2 % la o oră până la 7,6 % la 72 h; în mod asemănător, respectiv doza injectată per gram în ficat a scăzut de la 10,3 % la 9,9 %.

Aceste date s-au folosit în determinarea dozei de radiații absorbită estimată de I2B8 750 descrisă mai jos.

Biodistribuția conjugatului marcat ytriu [90) având o activitate specifică de 12,2 mCi/mg anticorp s-a evaluat în șoareci BALB/c. S-au obținut radioîncorporări de peste 90 % și anticorpul radiomarcat s-a purificat prin HPLC. Depozitul tisular de radio-activitate s-a evaluat în organele principale și piele, mușchi, os, urină și fecale după 72 h și s-a exprimat 755 ca procent doza injectată/g țesut.

Rezultatele (neprezentate) au evidențiat că în timp ce nivelurile de radioactivitate asociată cu sângele au scăzut de la aproximativ 39,2 % doză injectată/g la o oră, până la aproximativ 15,4 % după 72 h; nivelurile radioactivității asociată cu coada, inima, rinichiul, mușchiul și splina au rămas îndeajuns de constante la 10,2 % sau mai în cursul 760 experimentului.

Important a fost faptul că radioactivitatea asociată cu osul a fost în domeniul de la 4,4 % de doza injectată/g os la o oră, până la 3,2 % la 72 h. Toate acestea, luate împreună, sugerează că puțin ytriu liber s-a asociat cu conjugatul și că puțin radiometal liber s-a eliberat în timpul desfășurării studiului. Aceste date s-au folosit pentru determinarea estimării 765 dozei de radiații absorbită pentru Y2B8 descris mai jos. Pentru studii asupra localizării tumorale s-a preparat 288-MX-DTPA și s-a marcat radioactiv cu indiu (111) până la o activitate specifică de 2,7 mCi/mg. în continuare, s-au injectat 100 μΙ de conjugat marcat (aproximativ 24 pCi) în fiecare din 12 șoareci atimici purtători de tumori Ramos ai celulei B. Tumorile au aparținut în greutate domeniului de la 0,1 până la 1,0 g. 770

La momentele de timp 0, 24, 48 și 72 h după injecție s-au prelevat 50 μΙ de sânge prin puncție retro-orbitală, șoarecii s-au sacrificat prin dizlocare cervicală și s-au reținut coada, inima, plămânii, ficatul, rinichiul, splina, mușchiul, femurul și tumoarea. După prelucrarea și cântărirea țesuturilor s-a determinat radioactivitatea asociată cu fiecare tip de țesut folosind un contoar gama și valorile s-au exprimat ca procent doză injectată/g. 775

Rezultatele (neprezentate) au evidențiat că, concentrațiile tumorale ale 2B8-MXDTPA marcat indiu (111) au crescut constant în cursul experimentului. Din doza injectată 30 % s-a acumulat în tumoră după 72 h. în contrast, nivelurile sanguine au scăzut în timpul experimentului, de la peste 30 % la momentul 0 , până la 13 % la 72 h.

Toate țesuturile cu excepția mușchiului au un conținut între 1,3 și 6,0% doză injec- 780 tată/g țesut la sfârșitul experimentului; țesutul muscular a avut un conținut de aproximativ 13% din doza injectată/g.

RO 118524 Β1

D. Studii umane

i. 2B8 și 2B8-MX-DTPA: Studii imunohistologice cu țesuturi umane

Reactivitatea tisulară a anticorpului monoclonal murin 2B8 s-a evaluat folosind o gamă de 32 țesuturi umane diferite, fixate cu acetonă. Anticorpul 2B8 reacționează cu antigenul anti-CD20 care are o imagine foarte restrictivă a distribuției tisulare fiind observat doar într-un subset de celule în țesuturi limfoide, incluzându-le pe cele de origine hematopoietică.

în nodulii limfoizi s-a observat imunoreactivitate într-o populație de limfocite B corticale mature la fel de bine ca și în celulele proliferative din centrele germinale. De asemenea, s-a observat reactivitate pozitivă în sângele periferic, ariile de celule B ale amigdalelor, pulpa albă a splinei și 40-70% din limfocitele medulare găsite în timus.

De asemenea, s-a observat reactivitate pozitivă în foliculii laminei propria (Peyer's Patches) ale intestinelor mari. Au fost de asemenea, rezultate pozitive cu anticorpul 2B8 la celule grupate sau izolate în stroma a diferite organe incluzând vezica urinară, sân, col uterin, esofag, plămân, parotidă, prostată, intestin subțire și stomac (datele nu s-au prezentat).

Toate celulele simple precum și epiteliul diferitelor organe s-a găsit a fi nereactiv. în mod asemănător, nu s-a observat reactivitate în celulele neuroectodermale, inclusiv cele din creier, coarda spinală și nervii periferici. De asemenea, s-au găsit a fi negative elementele mezenchimale precum și celulele musculare, scheletice și netede, fibroblastele, celulele endoteliale și celulale polimorfonucleare inflamatoare (nu s-au prezentat datele).

Reactivitatea tisulară a conjugatului 2B8-MX-DTPA s-a evaluat folosind o gamă de 16 țesuturi umane care s-au fixat cu acetonă. Așa cum s-a demonstrat anterior cu anticorpul nativ (date neprezentate), conjugatul 2B8-MX-DTPA a recunoscut antigenul CD20 care a prezentat o imagine a distribuției strict restricționată, fiind găsit doar pe un subset de celule de origine limfoidă.

în noduli limfoizi s-a observat imunoreactivitate în populația de celule B. Reactivitate puternică s-a văzut în pulpa alba a splinei și în limfocitele medulare ale timusului.

De asemenea, s-a observat imunoreactivitate în limfocite izolate din vezica urinară, inimă, intestinul gros, ficat, plămâni și uter și s-a atribuit prezenței celulelor inflamatoare aflate în aceste țesuturi. Ca și în cazul anticorpului nativ, nu s-a observat reactivitate în celulele neuroectodermice sau în celulele mezenchimului (datele nu s-au prezentat).

ii. Analiza clinică a I2B8 (formare de imagine) și Y2B8 (terapie)

a) Experiment clinic faza l/ll, studiu terapeutic cu doză unică în mod curent, s-a condus o analiză clinică faza l/ll a I2B8 (formare de imagine) urmată de tratament cu o doză unică de Y2B8. Pentru studiul doză unică s-a folosit următoarea schemă:

1. Recoltare cu eliminare de celule stemice periferice (PSC) sau măduvă osoasă (BM);

2. Formare de imagine I2B8;

3. Terapie Y2B8 (trei niveluri de doză); și

4. Transplantare PSC sau BM autologă (dacă este necesar, pe baza numărării neutrofilelor sub 500/mm³ timp de trei zile consecutive sau plachete sanguine sub 20000/mm³ fără evidențiere de recuperare a măduvei prin examinarea măduvei osoase timp de trei zile consecutive).

Nivelurile dozei Y2B8 au fost următoarele:

Nivelul dozei

1.

2.

3.

Doza (mCi)

RO 118524 Β1

Au fost tratați trei pacienți la fiecare din nivelurile de doză pentru determinarea unei doze maxime tolerate (MTD).

Studiile privind formarea de imagine (dozimetria) s-au condus după cum urmează: fiecare pacient a fost cuprins în două studii in vivo asupra biodistribuției folosind I2B8.

în primul studiu s-a administrat ca infuzie intravenoasă (i.v.) în timp de o oră o cantitate de 2 mg I2B8 (5 mCi); o săptămână mai târziu s-a administrat 2B8 (adică anticorp neconjugat) i.v. la o rată care nu depășește 250 mg/h urmat imediat de 2 mg de I2B8 (5 mCi) administrat i.v. pe parcursul unei ore.

în ambele studii, imediat după infuzia I2B8, fiecare pacient s-a supus formării unei imagini și aceasta s-a repetat la momentul t=14-18 h, t=24 h, t=72 h și t=96 h.

S-au determinat timpii de retenție medii pentru indiu (111) marcat pentru întregul corp; de asemenea, s-au făcut astfel de determinări pentru recunoașterea organelor sau leziunilor tumorale (regiuni de interes). Regiunile de interes s-au comparat la concentrațiile marcajului din întregul corp; pe baza acestei comparații, se poate determina o estimare a localizării și concentrației lui Y2B8 folosind protocoale standard. Dacă doza cumulativă estimată a lui Y2B8 este mai mare decât 8 x doza estimată pentru întregul corp sau dacă doza cumulativă estimată pentru ficat depășește 1500 cGy, nu va avea nici un tratament cu Y2B8.

835

840

845

850

Dacă studiile de formare a imaginii sunt acceptabile, se administrează i.v. 0,0 sau 1,0 mg/kg greutate corporală a pacientului 2B8 la o rată de infuzie care nu depășește 250 mg/h.

Aceasta este urmată de administrare de Y2B8 (10, 20 sau 40 mCi) la o rată de infuzie de 20 mCi/h.

855

b) Experiment clinic faza l/ll: studiu terapeutic cu doză multiplă

S-a condus în mod curent o analiză clinică faza l/ll a lui Y2B8. Pentru studiul dozei multiple s-a folosit următoarea schemă: 1. Prelevare PSG sau MB;

2. Formare de imagine I2B8;

3. Terapie Y2B8 (trei niveluri de doză) pentru patru doze sau o doză cumulativă totală de 80 mCi; și

4. Transplantare PSC sau BM autologă (pe baza deciziei medicului practicant). Nivelurile dozei lui Y2B8 au fost după cum urmează:

860

Nivelul dozei

1.

Doza (mCi)

865

2. 15

3. 20

Au fost tratați trei pacienți la fiecare din nivelurile de doză pentru determinarea unui MTD.

870

Studiile privind formarea de imagine (dozimetrie) au fost conduse după cum urmează: s-a determinat cu primii 2 pacienți o doză preferată asupra formării imaginii pentru anticopul nemarcat (adică, 2B8). Primii 2 pacienți au primit 100 mg de 2B8 nemarcat în 250 cm^{2 3} în soluție salină normală pe parcursul a 4 h, urmat de 0,5 mCi de I2B8; s-a recoltat sânge pentru datele de biodistribuție la momentele t=0, t=120 min, t=24 h și t=48 h. Pacienții au fost scanați cu o cameră pentru imagini gama din regiuni multiple la momentele t=2 h, t=24 h, t=48 h. După scanare, la t=48 h, pacienții au primit 250 mg 2B8, urmat de 4,5 mCi I2B8.

875

Așa cum s-a descris urmează recoltarea de probe de sânge și scanarea. Dacă

100 mg de 2B8 produc imagini superioare, atunci următorii 2 pacienți vor primi 50 mg de

2B8 așa cum s-a descris, urmat de 0,5 mCi de I2B8, urmat 48 h mai târziu de 100 mg 2B8

880

RO 118524 Β1 și apoi cu 4,5 mCi de I2B8. Dacă 250 mg de 2B8 produc imagini superioare, atunci următorii pacienți vor primi 250 mg de 2B8 așa cum s-a descris, urmat de 0,5 mCi de I2B8, urmat h mai târziu de 500 mg 2B8 și apoi de 4,5 mCi de I2B8.

Următorii pacienți vor fi tratați cu cele mai scăzute cantități de 2B8 care furnizează formarea optimă de imagini. Formarea optimă de imagine va fi definită prin: (1) cea mai eficientă formare de imagine cu cea mai lentă dispariție a anticorpului, (2) cea mai bună distribuție care micșorează repartizarea într-un singur organ și (3) cea mai bună rezoluție subiectivă a leziunii (tumoare/evoluția comparativă).

Pentru primii 4 pacienți, prima doză terapeutică de Y2B8 va începe la 14 zile după ultima doză de I2B8; pentru următorii pacienți prima doză terapeutică de Y2B8 va începe între 2 până la 7 zile după I2B8.

înaintea tratamentului cu Y2B8, pentru pacienții alții decât primii 4, 2B8 se va administra așa cum s-a descris urmat de infuzie i.v. de Y2B8 după 5-10 min. Se vor recolta probe de sânge pentru biodistribuție la momentele t=0, t=10 min, t=120 min, t=24 h și t=48 h. Pacienții vor primi doze repetitive de Y2B8 [aceiași doză administrată ca și în cazul primei doze), aproximativ în fiecare 6 până la 8 săptămâni pentru un maxim de 4 doze sau în total doză cumulată de 80 mCi. Cel mai adesea este de preferat ca pacienții să nu primească următoarea doză de Y2B8 până când WBC-ul pacienjilor este mai mare decât/egal la 3 000 și AGC este mai mare decât/egal la 100000.

După completarea studiului nivelului celor trei doze se va defini un MTD. Apoi, în studiu vor fi cuprinși pacienți suplimentari și aceștia vor primi MTD-ul.

Exemplul II. Producerea de anticorp himeric anti-CD20 (C2B8”)

A. Construcția vectorului de expresie ADN a imunoglobulinei himerice anti-CD20 S-a izolat ARN de la celule hibridomice de șoarece 2B8 (așa cum s-a descris în Chomczynki, P. et al., Single step method RNA isolation by acid guanidinium thiocyatephenol-chloroform extraction Anal. Biochem.162;156-159 (1987) și s-a preparat de la acesta cADN.

ADN-ul regiunii variabile a catenei ușoare de imunoglobulină de șoarece s-a izolat de la cADN prin reacție polimerazică de lanț, folosind un set de primeri ai ADN-ului cu homologie la secvențele semnal ale catenei ușoare de șoarece la capătul 5' și regiunea J a catenei ușoare de șoarece la capătul 3'. Secvențele primer au fost după cum urmează:

1. V_L Sens (secvența ID nr. 3)

5'ATC AC AGATCT CTC ACC ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT ATC AGC TTC 3' (Porțiunea subliniată este un sit Bgl II; porțiunea subliniată mai sus este codonul de start).

2. V_L Antisens (Secvența ID nr. 4)

5' TGC AGC ATC CGTACG TTT GAT TTC CAG CTT 3' (Porțiunea subliniată este un sit Bsi Wl)

Vezi fig.1 și 2 pentru siturile corespunzând la Bgl II și Bsi Wl în TCAE 8, și fig.3 pentru siturile corespunzătoare în anti-CD20 în TCAE 8.

Acest fragment ADN rezultat s-a donat direct în vectorul TCAE 8 în fața domeniului constant al catenei ușoare kapa umane și s-a secvențiat. Secvența ADN determinată pentru regiunea variabilă a catenei ușoare murine este menționată în fig.4 (Secvența ID nr.5); de asemenea, vezi fig.3 nucleotidele 978 până la 1362.

Fig.4 asigură suplimentar secvența aminoacidă de la această regiune variabilă murină, CDR-ul și regiunile cadru. Regiunea variabilă a catenei ușoare de șoarece de la 2B8 este din familia kapa VI de șoarece. Vezi Kabat de mai sus.

Regiunea variabilă a catenei grele de șoarece s-a izolat în mod asemănător și s-a donat în fața domeniilor constante IgGI.

RO 118524 Β1

Primerii au fost după cum urmează: 930

1. V_H Sens (Secvența ID nr. 6)

5' GCG GCT CCC ACGCGT GTC CTG TCC CAG 3' (Porțiunea subliniată este un sit Mlu I).

2. V_H Antisens (Secvența ID nr. 7)

5' GG(G/C) TGT TGT GCTAGC TG(A/C) (A/G)GA GAC (G/A)GT GA 3' 935 (Porțiunea subliniată este un sit Nhe i).

Vezi fig.1 și 2 pentru siturile corespunzătoare Mlu I și Nhe I în TCAE 8 și fig.3 pentru siturile corespunzătoare în anti-CD20 în TCAE 8.

Secvența pentru această catenă grea de șoarece este prezentată în fig.5 (Secvența ID nr.8); vezi de asemenea, fig.3 nucleotidele 2401 până la 2820. De asemenea, fig.5 dă 940 secvența aminoacidă de la această regiune variabilă murină, CRD-ul și regiunile cadru. Regiunea variabilă a catenei grele de șoarece de la 2B8 este din familia VH 2B de șoarece. Vezi Kabat de mai sus.

B. Crearea de anti-CD20 himerici care produc transfectomați CHO și SP2/O

S-au crescut celule de DG44 dintr-o linie celulară ovariană de hamster chinezesc 945 (CHO) în mediu SSFM II fără hipoxantină și timidină [Gibco, Grand Island, NY, Forma nr. 91-0456PK; celule mielomice de șoarece SP2/0 s-au crescut pe mediu Dulbecco Modiefied Eagles Medium (“DMEM) (Irvine Scientific, Santa Ana, Ca., Cat. nr,9024), având adăugat 5 % ser fetal bovin și 20 ml/l glutamină. S-au suspus electroporării 4 milioane celule, fie cu 25 pg CHO, fie cu 50 pg SP2/O plasmid ADN care fusese restricționat cu Not I folosind un 950 sistem de electroporare BTX 600 (BTX, San Diego, CA) în cuve de 0,4 ml nerecuperabile.

Condițiile au fost fie 210 V pentru CHO, fie 180 V pentru SP2/O, 400 pF, 13 Ω. Fiecare electroporat s-a depus în 6 plăci cu 96 de godeuri (circa 7000 celule pe godeu). Discurile s-au alimentat cu mediu conținând G418 (GENETICIN, Gibco, nr. catalog 8601811) la 400 pg/ml compus activ pentru CHO (mediul a inclus suplimentar 50 pM 955 hipoxantină și 8 μΜ timidină) sau 800 pg/ml pentru SP2/O, două zile după electroporare și apoi 2 sau 3 zile până când au apărut coloniile. S-au examinat supernatante de la colonii pentru prezență de imunoglobulină himerică pe calea unei ELISA specifică pentru anticorp uman.

Coloniile care produc cea mai ridicată cantitate de imunoglobulină s-au extins și s-au 960 depus în plăci cu 96 godeuri conținând mediu plus metrotexat (25 nM pentru SP2/O și 5 nM pentru CHO) și s-au alimentat la fiecare 2 sau 3 zile. Supernatantele s-au cercetat ca mai sus și s-au examinat coloniile care produc cea mai ridicată cantitate de imunoglobulină. S-a purificat din supernatant anticorpul himeric anti-CD20 folosind proteina A de afinitate cromatografică. 965

S-a analizat himericul anti-CD20 purificat prin electroforeză în geluri poliacrilamidice și s-a estimat a fi mai pur decât circa 95 %. Afinitatea și specificitatea anticorpului himeric s-a determinat pe baza 2B8. Anticorpul himeric anti-CD20 s-a testat în încercări de legare directa și competitivă, când comparându-se la anticorpul monoclonal anti-CD20 murin 2B8, s-a evidențiat afinitatea și specificitatea comparabilă pe un număr de linii celulare B CD20 970 pozitive (datele nu s-au prezentat).

Afinitatea aparentă constantă (“Kap) a anticorpului himeric s-a determinat prin legare directă de anti-CD20 himeric radiomarcat I¹²⁵ și s-a comparat la 2B8 radiomarcat prin plot Scatchard; Kap-ul estimat pentru CHO produs himeric anti-CD20 a fost 5,2 x 10'⁹ M și pentru SP2/0 a fost 7,4 x 10 ⁹ M. Kap-ul estimat pentru 2B8 a fost 3,5 x 10 ⁹M.

975

RO 118524 Β1

S-a utilizat competiția directă prin radioimuotest pentru a confirma, atât specificitatea, cât și retenția de imunoreactivitate a anticorpului himeric prin compararea capacității sale de a concura eficient cu 2B8. Au fost necesare cantități substanțiale echivalente de anticorpi himerici anti-CD20 și 2B8 pentru a produce inhibarea a 50 % a legării la antigeni CD20 pe celule B (date neprezentate), adică, a fost o piedere minimă de activitate de inhibare a anticorpilor anti-CD20 probabil himerizării.

Rezultate de la exemplul II. B. indică, printre altele, că anticorpii himerici anti-CD20 s-au generat de la produsele de transfecție CHO și SP2/O folosind vectori TCAE 8 și că acești anticorpi himerici au avut în principal aceeași specificitate și capacitate de legare ca anticorpul monoclonal anti-C020 murin 2B8.

C. Determinarea activității imunologice a antcorpilor himerici anti-CD20

i. Analiza C1q uman

Anticorpii himerici anti-CD20 produși, atât prin linia celulară CHO, cât și SP2/0, s-au evaluat pentru legare C1q uman într-un test de curent citometric folosind C1q marcat cu fluoresceină (C1q s-a obținut de la Quidel, Mira Mesa, CA, Prod. Nr. A400 și FITC labei de la Sigma, St. Louis MC, Prod. nr. F-7250); FITC. Marcarea lui C1q s-a realizat în concordanță cu protocolul descris în Selected Methods In Cellular Immunology, Michell & Shiigi, Ed.(W.H.Freeman &Co., San Francisco, CA, 1980, p. 292).

Rezultatele analitice s-au derivat folosind un citometru de flux Decton Dickinson FACScan™ (fluoresceină s-a măsurat pe un domeniu de 515-545 nm).

S-au incubat cantități echivalente de anticorp himeric anti-CD20, lgG1 uman, proteină mielomică K (Binding Site, San Diego, CA, Prod. Nr. BP078) și 2B8 cu un număr echivalent de celule SB CD20 pozitive, urmat de o etapă de spălare cu tampon FACS (2% BSA în PBS, pH 7,4, 0,2 % azidă de sodiu) pentru îndepărtarea anticorpului neatașat, urmată de incubare cu C1q marcat FITC. După o incubare de 30-60 min, celulele s-au spălat din nou. Cele trei condiții inclusiv C1q marcat FITC drept control s-au analizat pe FACScan™ urmând instrucțiunile fabricantului. Rezultatele sunt prezentate în fig.6.

Așa cum rezultă din fig.6, s-a observat o creștere semnificativă în fluorescență numai pentru condițiile anticorp himeric anti-CD20; adică, numai celulele SB cu anticorp himeric anti-CD20 aderent au fost C1q pozitive, în timp ce alte condiții au produs aceiași imagine ca și controlul.

ii. Lize celulare dependente de complement

Anticorpii himerici anti-CD20 s-au analizat pentru capacitatea lor de a liza linii celulare de limfom în prezența serului uman (sursă de complement). Celule SB CD20 pozitive s-au marcat ⁵¹Cr prin amestecarea a 100 pCi de ⁵¹Cr cu 1 x 10 ⁶ celule SB timp de o oră la 37°C; celulele SB marcate au fost incubate apoi în prezență de cantități echivalente de complement uman și cantități echiavalente (0-50 pg/ml) de, fie anticorpi himerici anti-C020, fie 2B8 timp de 4 h la 37°C (vezi Brunner, K.T. et al.,Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid celss on ⁵¹Cr-labeled allogeneic target cells in vitro. Immunology 14:181-189 (1968).

Rezultatele sunt prezentate în fig.7.Rezultatele din fig.7 indică printre altele că anticorpii himerici anti-CD20 au produs liză semnificativă (49 %) în aceste condiții.

iii. Examinarea citotoxicității celulare dependentă de anticorpul efector

Pentru acest studiu s-au folosit celule pozitive CD20 (SB) și celule negative CD20 (celule T linie leucemică HSB; vezi, Adams. Richard, Formal Discussion”, Can. Res.

27:2479-2482 (1967); depozit ATCC nr. ATCC CCL 120.1); ambele s-au marcat cu ⁵¹Cr.

Analizele au urmat protocolul descris în Brunner, K.T. et al., Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labeled allogeic target cells in vitro\ inhibition by isoantibody and drugs. Immunology 14:181-189 (1968); s-a observat liza celulară mediată

R0118524 Β1

1025 de anticorpul himeric anti-CD20 a celulelor țintă SB pozitive CD20 (marcate ⁵¹Cr) la sfârșitul incubării 4 h la 37°C și acest efect s-a observat pentru ambii anticorpi produși CHO și SP2/0 (celulele efectoare au fost, limfocite umane; raportul celule efectoarerțintâ a fost 100:1). Liza eficientă a celulelor țintă s-a obținut la 3,9 gg/ml. Spre deosebire, în aceleași condiții, anticorpul monoclonal anti-CD20 murin 2B8 a avut un efect statistic nesemnificativ și celule CD20 negative HSB nu au fost lizate. Rezultatele sunt prezentate în fig.8.

Rezultatele exemplului II, indică, între altele că anticorpii himerici anti-CD20 din exemplul I au fost imunologic activi.

Exemplul III. Reducerea in vivo a celulelor B folosind himeric anti-CD20

A. Studiu la primate non-umane

S-au efectuat 3 studii separate la primate neumane. Pentru conveniență, acestea au fost numite aici ca Himeric anti-CD20; CHO & SP2/O; Himeric anti-CD20:CHO; și Dozaj ridicat himeric anti-C020 Condițiile au fost precum urmează: Anti-CD20 himeric.CHO & SP2/0.

Șase maimuțe cynomolgus cu greutățile cuprinse între 4,5 și 7 kg (White Sands Research Center, Alamogordo, NM) s-au împărțit în 3 grupuri de câte 2 maimuțe fiecare. Ambele animale din fiecare grup au primit aceiași doză de anticorp himeric anti-CD20 imunologic activ. Un animal din fiecare grup a primit anticorp purificat produs prin transfectom CHO; altul a primit anticorp produs prin transfectom SP2 /0. Cele trei grupuri au primit dozaje de anticorp corespunzând la 0,1 mg/kg, 0,4 mg/kg, și 1,6 mg/kg în fiecare zi timp de 4 zile consecutiv.

Anticorpul himeric anti-CD20 imunologic activ, care s-a amestecat cu soluție salină sterilă s-a administrat prin infuzie intravenoasă; au fost luate probe de sânge înainte de fiecare infuzie. S-au luat probe suplimentare de sânge începând la 24 h după ultima injecție (T=0) și apoi în zilele 1, 3, 7,14 și 28; De asemenea, probe de sânge au fost luate după aceea la intervale bisăptămânale până la finalizarea studiului la ziua 90.

S-au centrifugat aproximativ 5 ml din întregul sânge de la fiecare animal la 2000 rpm, timp de 5 min. S-a recuperat plasma pentru examenul nivelurilor de anticorp himeric antiCD20 solubil. Peletul (care conține leucocite din sânge periferic și celule sanguine roșii) s-a resuspendat în ser fetal de vițel pentru analiza anticorpului marcat fluorescent (vezi, Fluorescent Antibody Labeling of Lymphoid Cell Population de mai sus).

Anti-CD20 himeric:CHO

Șase maimuțe cynomolgus cu greutatea cuprinsă între 4-6 kg (White Sands) s-au împărțit în 3 grupuri de câte 2 maimuțe fiecare. Toate amimalele s-au injectat cu anticorpi himerici anti-CD20 imunologic activi produși de transfectomul CHO (în soluție salină sterilă).

S-au separat trei grupuri după cum urmează: subgrupul 1 a primit injecții intravenoase zilnice de 0,01 mg/kg anticorp o perioadă de 4 zile; subgrupul 2 a primit zilnic injecții intravenoase de 0,4 mg/kg anticorp o perioadă de 4 zile; subgrupul 3 a primit o singură injecție intravenoasă de 6,4 mg/kg anticorp.

Pentru toate trei subgrupurile s-a obținut o probă de sânge înaintea inițierii tratamentului; de asemenea, suplimentar, s-au luat probe de sânge la T=0,1,3,7,14 și 28 zile după ultima injectare așa cum s-a descris mai sus și aceste probe s-au prelucrat pentru analiza anticorpului marcat fluorescent (vezi, Fluorecent Antibody, Labeling de mai sus). Pe lângă cuantificarea celulelor B din sângele periferic s-au prelevat biopsii din nodulii limfatitci la zilele 7, 14 și 28 după ultima injecție și s-a colorat un singur preparat de celule pentru cuantificarea populațiilor de limfocite prin citometrie în flux.

Dozaj ridicat de anti-CD20

S-au infuzat două maimuțe cynomolgus (White Sands) cu 16,8 mg/kg anticorpi himerici anti-CD20 imunologic activi de la trasfectomi CHO (în soluție salină sterilă) săptămânal pe o perioada de 4 săptămâni consecutive. La încheierea tratamentului ambele

1030

1035

1040

1045

1050

1055

1060

1065

1070

RO 118524 Β1 animale au fost anesteziate pentru recuperarea măduvei osoase; de asemenea, s-au luat biopsii din noduli limfatici. Ambele seturi de țesuturi s-au colorat pentru prezență de limfocite

B folosind Leu 16 prin citometrie în flux folosind protocolul descris în Ling, N.R., et al., B-cell and plasma cell antigens Leucocyte Typing III White Cell Differentiations Antigens, A. J.

McMichael, Ed. (Oxfora Univetsity Press, Oxford UK, 1987), p.302.

Populația celulară limfoidă de anticorpi marcați fluorescent

După îndepărtarea plasmei, leucocitele s-au spălat de 2 ori cu soluție salină echilibrată Hanks (HBSS) și s-au resuspendat într-un volum de plasmă echivalent de ser fetal bovin (inactivată termic la 56°C, timp de 30 min).

S-a distribuit un volum de 0,1 preparat celular la 6 eprubete conice de centrifugă de 15 ml. S-au adaugat la 3 dintre eprubete, anticorpi monoclonali marcați cu fluoresceină pentru marcherii limfocitari umani de suprafață CD2 (AMAC, Westbrook, ME), CD20 (Becton Dickinson) și IgM uman (Binding Site, San Diego, CA) pentru identificarea populațiilor de limfocite T și B.

Toți reactivii au fost testați anterior ca pozitivitate la antigenii corespunzători limfocitelor de maimuță. Legarea anticorpului himecic anti-CD20 la CD20 de la suprafața celulei B de maimuță s-a măsurat în 4 eprubete folosind anticorp policlonal capră-anti-lgG uman cuplat cu ficoeritrină (AMAC). Acest reactiv s-a preadsorbit pe o coloana de Sepharoză Ig maimuță, pentru a preveni reactivitatea încrucișată la IG maimuță, permițând astfel detectarea specifică și cuantificarea anticorpului himeric anti-CD20 legat la celule.

Α-5-a eprubetă a inclus reactivi anti-lgM și anti-lgG uman pentru colorație dublă a populației de celule B. Α-6-a probă nu a inclus mici un reactiv pentru a se putea determina autofluorescența.

Celulele s-au incubat cu anticorpi fluorescenți timp de 30 min, s-au spălat și s-au fixat cu 0,5 ml tampon de fixare (NaCI 0,15 M paraformaldehidă 1 %, pH=7,4 și s-au analizat pe un instrument Becton Dickinson FACScan™.

Populațiile limfocitare s-au identificat inițial prin sens direct contra unghiului drept al luminii difuze într-o hartă punctiformă cu leucocite nemarcate. Apoi, s-a izolat populația totală de limfocite prin eliminarea tuturor celorlalte evenimente. Măsurătorile ulterioare de fluorescență au reflectat doar evenimentele specifice limfocitelor selectate.

Distrugerea limfocitelor B din sângele periferic

Nu s-a putut stabili nici o diferență observabilă între eficiența anticorpilor produși CHO și SP2/O în distrugerea in vivo a celulelor B, deși o ușoară creștere în recuperarea celulelor B a început după 7 zile, pentru maimuțele injectate cu anticorpi himerici anti-CD20 derivați de la transfectări CHO la nivelurile de dozare 1,6 mg/kg și 6,4 mg/kg, observându-se și pentru maimuța injectată cu anticorp produs SP2/0 la un nivel de dozare de 0,4 mg/kg.

Fig.9A, B și C dau rezultatele derivate de la studiul anti-C020 himeric: CHO & SP2/O, cu fig.9A orientată spre nivelul dozei de 0,4 mg/kg, fig.9B orientată spre nivelul dozei de

1,6 mg/kg, și fig.9C orientată spre nivelul dozei de 6,4 mg/kg.

Așa cum esta evident din fig.9, a existat o descreștere dramatică în nivelul celulelor B periferice (> 95%) după tratamentul terapeutic față de toate domeniile de doză testată, iar aceste nivele s-au mențint până la 7 zile post-infuzie; după această perioadă, celulele au început să se recupereze și în momentul inițierii recuperarea a fost independentă de nivelurile dozei.

în studiul anti-CD20 himeric:CHO s-a utilizat o concentrație de dozare a anticorpului de 10 ori mai scăzută (0,01 mg/kg) o perioadă de timp de 4 injecții zilnice (total 0,04 mg/kg).

Fig.10 dă rezultatele acestui studiu. Acest dozaj a distrus populația de celule sanguine B periferice până la aproximativ 50 % din nivelurile normale estimate, fie cu antigen de suprafață IgM, fie cu anticorp Leu 16.

R0118524 Β1

De asemenea, rezultatele indică saturația antigenului CD20 pe populația limfocitară B, care nu s-a obținut cu anticorpul himeric anti-CD20 imunologic activ la această concentrație a dozei în această perioadă de timp pentru primate non-umane. Limfocite B acoperite cu anticorpi s-au detectat în primele 3 zile ale tratamentului terapeutic. Totuși, de prin ziua a-7-a nu s-au mai detectat celule acoperite.cu anticorp.

Tabelul 1 rezumă rezultatele anticorpului himeric anti-CD20 activ imunologic în doză unică și doze multiple asupra populațiilor sanguine periferice; condiția doză unică a fost 6,4 mg/kg; condiția doză multiplă a fost 0,4 mg/kg timp de 4 zile consecutiv (aceste rezultate au fost derivate de la maimuțele descrise mai sus).

Studiul C2B8 din populația sanguină periferică de la primate

1125

1130

1135

Tabelul 1

Maimuță	Doza	Ziua	CD20	Anti-Hu IgGuman
A	0,4 mg/kg (4 doze)	sânge prelevat anterior	81,5	-
	0	86,5	0,2
	7	85,5	0,0
	21	93,3	-
	28	85,5	-
B	0,4 mg/kg (4 doze)	sânge prelevat anterior	81,7	-
	0	94,6	0,1
	7	92,2	0,1
	21	84,9	-
	28	84,1	-
C	6,4 mg/kg (1 doză)	sânge prelevat anterior	77,7	0,0
	7	85,7	0,1
	21	86,7	-
	28	76,7	-
D	6,4 mg/kg (1 doză)	sânge prelevat anterior	85,7	0,1
		94,7	0,1
		85,2	-
		85,9	-

1140

1145

1150

1155

1160

RO 118524 Β1

Tabelul 1 (continuare)

1165

1170

1175

1180

1185

Maimuță	Anti-Hu IgG-uman Anti-Hu IgM-uman*	Leu-16	Distrugerea celulei B%
A	-	9,4	0
0,3	0,0	97
0,1	1,2	99
-	2,1	78
-	4,1	66
B	-	14,8	0
0,2	0,1	99
0,1	0,1	99
-	6,9	53
-	8,7	41
C	0,2	17,0	0
0,1	0,0	99
-	14,7	15
-	8,1	62
D	0,1	14,4	0
0,2	0,0	99
-	9,2	46
-	6,9	53

* Populație dublu colorată care indică dezvoltarea anti-CD20 himeric celule B învelite.

1190

1195

Datele rezumate în tabelul 1, arată ca distrugerea celulelor B din sângele periferic în condițiile excesului de anticorpi se produc rapid și eficient indiferent de nivelurile de dozare unice sau multiple. Suplimentar, s-a observat distrugere la cel puțin 7 zile după ultima injecție, cu recuperarea parțială de celule B observată prin ziua 21.

Tabelul 2 rezumă efectul anticorpilor himerici anti-CD20 imunologic activi asupra populațiilor celulare ale nodulilor limfatici, folosind regimul de tratament din tabelul 1 (4 doze zilnice de 0,4 mg/kg; o doză de 6,4 mg/kg); de asemenea, se dau valori comparative pentru nodulii limfatici normali (maimuță de control, axilar și ingvinal) și măduvă osoasă normală (2 maimuțe).

1200

1205

R0118524 Β1

Populația celulară a nodulilor limfatici

Tabelul 2

Maimuță	Doză	Ziua	CD2	Anti-Hu IgM
A	0,4 mg/kg (4 doze)	7	66,9	-
14	76,9	19,6
28	84,1	15,7
B	0,4 mg/kg (4 doze)	7	59,4	-
14	83,2	9,9
28	84,1	15,7
C	6,4 mg/kg (1 doză)	7	75,5	-
14	74,1	17,9
28	66,9	23,1
D	6,4 mg/kg (1 doză)	7	83,8	-
14	74,1	17,9
28	84,1	12,8

1210

1215

1220

Maimuță >	Anti-Hu IgG-uman Anti-Hu IgM-uman	Leu-16	Distrugerea limfocitelor B %
A	7,4	40,1	1
0,8	22,6	44
-	26,0	36
B	29,9	52,2	0
0,7	14,5	64
-	14,6	64
C	22,3	35,2	13
1,1	23,9	41
-	21,4	47
D	12,5	19,7	51
0,2	8,7	78
-	12,9	68

1225

1230

1235

1240

RO 118524 Β1

Tabelul 2 (continuare)

	CD2	Anti Hu IgG* Anti Hu IgM	Anti Hu IgM	Leu 16	Distrugere limfocite 30%
Noduli limfatici normali
Control 1
Axilar	55,4	25,0	-	41,4
Inghinal	52,1	31,2	-	39,5
Măduvă osoasă normală
Control 2	65,3	19,0	-	11,4	NA
Control 3	29,8	28,0	-	16,6	NA

Rezultatele din tabelul 2 evidențiază reducerea eficientă a limfocitelor B pentru ambele regimuri de tratament. Tabelul 2 indică suplimentar, că pentru primatele non-umane nu s-a atins saturația completă a celulelor B din țesutul limfatic cu anticorp himeric anti-CD20 imunologic activ; în plus, s-a observat acoperirea celulelor cu anticorp după 7 zile de tratament, urmată de o reducere marcată a celulelor B din nodulii limfatici începând din ziua a 14-a.

Pe baza acestor date, studiul la care s-a făcut referire mai sus ca doză unică ridicată de anti-CD-20 himeric s-a efectuat în principal spre determinarea farmaco-toxicologică. Adică, acest studiu s-a orientat spre evaluarea oricărei toxicități asociată cu administrarea anticorpului himeric, precum și a eficienței distrugerii celulelor B din sângele periferic, noduli limfatici și măduvă osoasă.

Suplimentar, deoarece datele din tabelul 2 arată că pentru acest studiu majoritatea celulelor B din nodulii limfatici au fost distruse între 7 și 14 zile de tratament, un regim de dozare săptămânal poate avea rezultate mai eficiente.

Tabelul 3 prezintă rezultatele studiului dozei ridicate anti-CD20 himeric.

Populația celulară a nodulilor limfatici si a măduvei osoase

Populații limfocitare (%)

Tabelul 3

Maimuță	CD2	CD20a	mlgM+antiC2B8b	C2B8C	Ziuad
Noduli limfatici inghinali
E	90,0	5,3	4,8	6,5	22
F	91,0	6,3	5,6	6,3	22
G	89,9	5,0	3,7	5,8	36
H	85,4	12,3	1,7	1,8	36
Măduvă osoasă
E	46,7	4,3	2,6	2,8	22
F	41,8	3,0	2,1	2,2	22
G	35,3	0,8	1,4	1,4	36
H	25,6	4,4	4,3	4,4	36

^a Indică populația colorată cu Leu 16;

^b Indică populația dublu colorată pozitivă pentru IgM celular de suprafață și anticorpul himeric celule acoperite;

^c Indică totalul populației colorate pentru anticorp himeric inclusiv celulele dublu colorate IgM de suprafață pozitiv și colorația unică (IgM celular de suprafață negativ);

^d Zile după injectarea dozei finale de 16,8 mg/kg.

R0118524 Β1

Ambele animale evaluate la 22 zile după încetarea tratamentului au conținut mai puțin de 5 % celule B comparativ cu 40 % conținute în nodulii limfatici de la control (vezi tabelul 2 de mai sus). în mod asemănător, în măduva osoasă a animalelor tratate cu anticorp himeric anti-CD20, nivelurile celulelor CD20 pozitive au fost mai mici decât 3% comparativ cu 11-15 % în animalele normale (vezi tabelul 2 de mai sus).

în animalele evaluate la 36 zile după încetarea tratamentului unul dintre animale (H) a avut aproximativ 12 % celule B în noduli limfatici și 4,4 % celule B în măduva osoasă în timp ce lotul (G) a avut aproximativ 5 % celule B în nodului limfatic și 0,8 % în măduva osoasă, aceste date indicând o distrugere semnificativă a celulelor B.

Rezultatele de la exemplul 3A. indică priqtre altele ca dozele scăzute de anti-CD20 himeric imunologic activ conduc pe termen lung la distrugerea celulelor B din sângele periferic la primate. De asemenea, datele arată că distrugerea semnificativă a populațiilor de celule B s-a atins în nodulii limfatici periferici și măduva osoasă când s-au administrat doze de anticorp mari și repetate.

Continuarea urmăririi testului pe animale a arătat că, chiar cu o asemenea distrugere severă de limfocite B periferice în timpul primei săptămâni de tratament, nu au apărut alte efecte adverse.

Mai mult decât atât, s-a observat o recuperare a populației de celule B putându-se trage concluzia că celulele stemice pluripotente ale acestor primate nu au fost afectate în mod advers prin tratament.

B. Analiza clinică a C2B8

i. Test clinic faza l/ll a C2B8; Studiul terapiei doză unică

S-au tratat cu C2B8 într-un test clinic faza l/ll 15 pacienți având documentația histologică de recădere în limfom al celulei B.

Fiecare pacient a primit o singură doză de C2B8 într-un studiu de doză crescătoare cu trei pacienți/doză: 10 mg/m²,50 mg/m²,100 mg/m², 250 mg/m².

Tratamentul a fost prin infuzie i. v. printr-un filtru în linie de 0,22 μ cu C2B8 diluat întrun volum final de 250 cm³ sau o concentrație maximă de 1 mg/ml în soluție salină normală. Rata inițială a fost 50 cm³/h, în prima oră; dacă nu s-a observat nici o toxicitate doza ratei s-a crescut până la un maxim de 200 cm³/h.

Toxicitatea (așa cum s-a indicat de către clinician) a fost de la nici una, la “febră”, la moderat (2 pacienți); la severă (1 pacient).

Toți pacienții au primit tratamentul terapeutic complet.

S-au analizat limfocite sanguine periferice pentru a determina, printre altele, impactul C2B8 asupra celulelor T și celulele B. în mod consistent, pentru toți pacienții limfocitele B din sângele periferic au fost distruse după infuzia cu C2B8 și asemenea distrugere s-a menținut în exces timp de 2 săptămâni.

Unul dintre pacienți (primitor a 100 mg/m² de C2B8) a evidențiat un răspuns parțial la tratamentul cu C2B8 (reducere mai mare de 50 % în suma produselor diametrelor perpendiculare a tuturor indicatorilor măsurabili ai leziunilor după mai mult de 4 săptămâni, timp în care nu au mai apărut leziuni noi și nici nu au existat leziuni mai mari).

La cel puțin un alt pacient (care a primit 500 mg/m²) s-a evidențiat un răspuns minor la tratamentul C2B8 (reducere mai mică decât 50 % dar cel puțin 25 % în suma produselor celor două diametre perpendiculare a celor mai lungi ale tuturor indicatorilor măsurabili ai leziunii).

Pentru eficiența sugerată rezultatele PBL-urilor sunt prezentate în fig. 14; datele pentru pacientul care evidențiază un PR sunt prezentate în fig.14A; pentru pacientul care evidențiază un MR, datele sunt prezentate în fig.14B.

1290

1295

1300

1305

1310

1315

1320

1325

1330

RO 118524 Β1 în fig. 14, sunt aplicabile următoarele: = limfocite; = CD3 + celule (Celule T); -Jt = CD20 + celule; = CD19 + celule; θ = kappa; A- = lambda și + = C2B8.

Așa cum s-a evidențiat, markerii celulei B CD20, CD19, kappa și lambda s-au distrus după o perioadă depășind 2 săptămâni; în timp ce a existat o reducere ușoară inițială în numărul celulelor T, acestea au revenit la un nivel aproximativ liniei de bază într-un timpcadru relativ rapid.

ii. Test clinic faza l/ll a C2B8; studiul terapiei doză multiplă

Pacienții având limfom al celulei B confirmat histologic cu boala în progres vizibil, au fost aleși pentru acest studiu care este împărțit în două părți; în faza I, constând dintr-o doză crescătoare pentru caracterizarea toxicităților dozelor limită și determinarea nivelului dozei active tolerată biologic, grupuri de câte 13 pacienți au primit săptămânal infuzii i.v. de C2B8 pentru un total de 4 infuzii separate.

Doza cumulată la fiecare dintre cele 3 niveluri a fost după cum urmează: 500 mg/m² (125 mg/m²/infuzie); 100mg/m² (250mg/m²/infuzie); 1500 mg/m² (375 mg/m²/infuzie).

Se definește o doză activă tolerată biologic și se va determina ca cea mai scăzută doză având, atât toxicitate tolerabilă, cât și activitate adecvată.

în faza II, pacienți suplimentari vor primi doza activă tolerată biologic cu subliniere asupra determinării activității pentru cele 4 doze de C2B8.

Exemplul IV. Terapie combinată : C2B8 și Y2B8

S-a investigat o abordare terapeutică combinată folosind C2B8 și Y2B8 într-un model șoarece xenografic (șoareci nu/nu, femele de aproximativ 10 săptămâni ca vârstă) utilizând o tumoră de celulă B limfoblastoidă (celule tumorale Ramos).

Pentru scopuri comparative, s-au tratat de asemenea, șoareci suplimentar cu C2B8 și Y2B8. Celule tumorale Ramos (ATCC, CRL1596) s-au menținut în cultură folosind PRMI1640 suplimentat cu 10 % ser fetal de vițel și glutamină la 37°C și 5 % CO₂.

S-au inițiat tumori în 9 femele de șoareci lipsiți de păr, în vârstă de aproximativ 7-10 săptămâni, prin injectare subcutanată de 1,7 x 10⁶ celule Ramos într-un volum de 0,10 ml (HBSS) folosind o seringă de 1 cm³, prevăzută cu un ac de 25 g. Toate animalele s-au manipulat într-o hotă cu flux laminar și toate cuștile, așternuturile, alimentele și apa s-au autoclavat.

Celulele tumorale s-au recuperat prin excizarea tumorilor și trecerea acestora printr-o sită de 40 mesh; celulele s-au spălat de 2 ori cu 1 x HBSS (50 ml) prin centrifugare (1300 rpm), s-au resuspendat în 1 x HBSS la 10 x 10⁶ celule / ml și s-au înghețat la -70°C până la folosire.

Pentru condițiile experimentale, s-au dezghețat celule din cîteva loturi înghețate, s-au pelevat prin centrifugare (1300 rpm) și s-au spălat de 2 ori cu 1 x HBSS apoi, celulele s-au resuspendat până la aproximativ 2,0 x 10® celule /ml. S-au injectat aproximativ 9-12 șoareci cu 0,10 ml suspensie celulară (s.c.) folosind o seringă de 1 cm³ prevăzută cu un ac de 25 g; injecțiile s-au făcut pe partea stângă a animalului aproximativ pe porțiunea mediană. Tumorile s-au dezvoltat în aproximativ 2 săptămâni. S-au excizat tumorile și s-au prelucrat cum s-a descris mai sus.

Șoarecii luați în studiu s-au injectat cum s-a descris mai sus cu 1,67 x 10® celule în 0,10 ml HBSS. Pe baza experimentelor preliminare de dozare, s-a determinat că s-ar putea utiliza pentru studiu 200 mg de C2B8 și 100 μθί Y2B8. S-au injectat 90 femele de șoareci nu/nu (în vârstă de aproape 10 săptămâni) cu celule tumorale.

După aproape 10 zile, s-au desemnat 24 de șoareci pentru 4 grupuri de studiu (6 șoareci/grup) urmărind în acest timp menținerea unei distribuții a mărimii tumorilor comparabilă în fiecare grup (mărimea medie a tumorii, exprimată ca produs dintre lumgimea x lățimea tumorii a fost de aproximativ 80 mm²).

RO 118524 Β1

Următoarele grupuri s-au tratat cum s-a indicat pe calea injecțiilor coadă-inutilă, folosind o seringă Hamilton de 100 μΙ prevăzută cu un ac de 25 g.

A. Soluție salină normală

Β. Y2B8 (100 μΟί)

C. C2B8 (200 pg)

D. Y2B8 (100 pCi) + C2B8 (200 pg)

Grupurile testate C2B8 au primit o a doua injecție C2B8 (200 pg/șoarece) la 7 zile după injecția inițială. Măsurătorile tumorii s-au făcut la fiecare 2-3 zile folosind un șubler.

Prepararea materialelor pentru tratament s-au făcut conform cu următoarele protocoale:

A. Prepararea lui Y2B8

S-a transferat clorură de ytriu (90) într-o eprubetă de propilenă și s-a ajustat pH-ul la 4,1 - 4,4 folosind acetat de sodiu 2M lipsit de metal. S-a adăugat 2B8-MX-DTPA (0,3 mg în soluție salină normală; vezi mai sus prepararea lui 2B8-MX-DTPA) și s-a amestecat cu grijă prin turbionare.

După 15 min de incubare, reacția s-a oprit prin adăugarea a 0,05 x 20 mM volum EDTA și 0,05 x 2M volum acetat de sodiu.

Radioactivitatea concentratului s-a determinat prin diluarea a 5,0 pl de amestec de reacție în 2,5 ml 1 x PBS care conține 75 mg/ml HSA și 1 mM DTPA (formulare tampon). Numărătoarea s-a realizat prin adăugarea de 10,0 pl la 20 ml de amestec de scintilare Ecolume™. Amestecul reactiv rămas s-a adăugat la 3,0 ml formulare tampon, s-a filtrat steril și s-a depozitat la 2-8°C până la utilizare.

S-a calculat activitatea specifică (14 mCi/mg la momentul injectării) folosind concentrația de radioactivitate și concentrația proteinei, calculate pe baza cantității anticorpului adăugat amestecului de reacție.

Radioactivitatea asociată proteinei s-a determinat folosind cromatografia instantanee în strat subțire. Radioîncorporarea a fost 95 %. S-a diluat Y2B8 în formularea tampon imediat înaintea folosirii și s-a filtrat steril (concentrația radioactivității finale a fost 1,0 mCi/ml).

B. Prepararea lui C2B8

C2B8 s-a preparat cum s-a descris mai sus. C288 s-a asigurat ca reactiv steril în soluție salină normală la 5,0 mg/ml. înainte de injectare C2B8 s-a diluat în soluție salină normală până la 2,0 mg/ml și s-a filtrat steril.

C. Rezultate

După tratament, mărimea tumorii s-a exprimat ca un produs al lungimii și al lățimii și măsurătorile s-au făcut în zilele indicate în fig.11 (Y2B8 vs. salin); fig. 12 (C2B8 vs.salin); și fig. 13 (Y2B8 + C2B8 salin). De asemenea, s-a determinat eroarea standard.

Așa cum s-a indicat în fig.13, combinația lui Y2B8 și C2B8 prezintă efecte tumoricide comparabile efectelor evidențiate, fie de către Y2B8, fie de către C2B8.

Exemplul V. Strategii de terapie alternativă

Strategiile terapeutice alternative recunoscute din punctul de vedere al exemplelor anterioare sunt evidente.

O asemenea strategie folosește utilizarea unei doze terapeutice de C2B8 urmată în circa 1 săptămână de o combinație de, fie 2B8, fie 2B8 radiomarcat (de exemplu, Y2B8); sau 2B8, C2B8 și de exemplu, Y2B8; sau C2B8 și de exemplu, Y2B8.

O strategie suplimentară este utilizarea de C2B8 radiomarcat. O asemenea strategie permite utilizarea avantajelor porțiunii active imunologic ale lui C2B8 plus acele avantaje asociate cu un radiomarcaj.

Marcajele radioactive preferate includ ytriu-90 care dă o viață de înjumătățire a lui

C2B8 în circulație, mai mare față de anticorpul murin 2B8.

1385

1390

1395

1400

1405

1410

1415

1420

1425

1430

RO 118524 Β1

Datorită capacității lui C2B8 de a distruge celule B, și avantajelor de a fi derivat de la folosirea unui radiomarcaj, o strategie alternativă preferată este de a trata pacientul cu C2B8 (fie cu o doză unică, fie cu doze multiple), astfel, încât majoritatea, dacă nu toate celulele periferice B să fie distruse. Aceasta ar fi apoi urmată de utilizarea lui 2B8 radiomarcat datorită distrugerii celulelor periferice Β; 2B8 radiomarcat menține o șansă crescută de țintire a celulelor tumorale.

Este preferată utilizarea lui 2B8 marcat cu iod (131) dat fiind tipurile rezutatelor raportate în literatură cu acest marcaj (vezi Kaminski).

O preferință alternativă implică utilizarea unui 2B8 radiomarcat (sau C2B8) inițial întrun efort de creștere a permeabilității unei tumori, urmată de tratamente unice sau multiple cu C2B8; intenția acestei strategii este creșterea șanselor lui C2B8 de a ajunge atât în exteriorul, cât și în interiorul masei tumorale. 0 strategie ulterioară implică utilizarea agenților chemoterapeutici în combinație cu C2B8.

Aceste strategii includ așa-numitele tratamente înșelătoare” adică tratament cu agent chemoterapeutic urmat de tratament cu C2B8, urmat de o repetiție a acestui protocol.

Alternativ, este viabil tratamentul inițial cu o doză unică sau doze multiple de C2B8, după care urmează tratamentul chemoterapeutic. Agenți chemoterapeutici preferați, includ, dar nu se limitează la, ciclofosfamidă, doxorubicină, vincristină și prednison, vezi Armitage, J.O. et al., Cancer 60:1695 (1982), încorporat aici ca referință.

LISTA SECVENȚELOR (1) INFORMAȚII GENERALE (i) SOLICITANT: Darrell Anderson, Nabil Hanna, John Leonard, Roland Newman, MitchelL Reff și William Resteter (ii) TITLUL INVENȚIEI: APLICARE TERAPEUTICĂ A ANTICORPILOR HIMERICI Șl RADIOMARCAȚI FAȚĂ DE ANTIGENUL LOMFOCITAR B UMAN DIFERENȚIAT RESTRICTIV PENTRU TRATAMENTUL LIMFOMULUI CELULEI B (iii) NUMĂRUL SECVENȚELOR : 8 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ:

(A) ADRESANT (B) STRADA : IDEC Pharmaceuticals Corporation :11011 Torreyana Road (C) ORAȘ : San Diego (D) STAT : California (E) ȚARA : SUA (F) ZIP :92 121 (v) FORMA CITIBILĂ PE COMPUTER:

(A)TIP SUPORT : 3,5 inch, 1,44Mb (dischetă) (B) COMPUTER : Macintosh (C) SISTEM OE OPERARE: MS.DOS (D) SOFTWARE :Microsoft Word 5.0 (vi) DATE CURENTE ALE CERERII:

(A) NUMĂRUL CERERII:

(B) DATA DEPOZITULUI:

(C) CLASIFICARE:

(viii) INFORMAȚII MANDATAR:

(A) NUME : Burgoon, Richard P.

(B) NUMĂR DE ÎNREGISTRARE: 34,787 (C) REFERINȚA/DOSAR NUMĂRUL

RO 118524 Β1 (ix) INFORMAȚII PENTRU TELECOMUNICAȚII:

(A) TELEFON : (619) 550-8500 1485 (B) TELEFAX : (619) 550-8750 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR: 1:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A)	LUNGIME: 8540 baze
(B)	TIP: acid nucleic	1490
(C)	ÎMPLETIRE: simplă
(D)	TOPOLOGIE: circulară

(ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETICĂ: da (iv) ANTI-SENS: nu 1495 (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: Secvența ID nr. T.

GACGTCGCGG	CCGCTCTAGG	CCTCCAAAAA	AGCCTCCTCA	CTACTTCTGG
AATAGCTCAG	60
AGGCCGAGGC	GGCCTCGGCC	TCTGCATAAA	TAAAAAAAAT	TAGTCAGCCA	1500
TGCATGGGGC	120
GGAGAATGGG	CGGAACTGGG	CGGAGTTAGG	GGCGGGATGG	GCGGAGTTAG
GGGCGGGACT	180
ATGGTTGCTG	ACTAATTGAG	ATGCATGCTT	TGCATACTTG	GCCTGCTGG
GGAGCCTGGG	240				1505
GACTTTCCAC	ACCTGGTTGC	TGACTAATTG	AGATGCATGC	TTTGCATACT
TCTGCCTGCT	300
GGGGAGCCTG	GGGACTTTCC	ACACCCTAAC	TGACACACAT	TCCACAGAAT
TAATTCCCCT	360
AGTTATTAAT	AGTAATCAAT	TACGGGGTCA	TTAGTTCATA	GCCCATATAT	1510
GGAGTTCCGC	420
GTTACATAAC	TTACGGTAAA	TGGCCCGCCT	GGCTGACCGC	CCAACGACCC
CCGCCCATTG	4
ACGTCAATAA	TGACGTATGT	TCCCATAGTA	ACGCCAATAG	GGACTTTCCA
TTGACGTCAA	5				1515
TGGGTGGACT	ATTTACGGTA	AACTGCCCAC	TTGGCAGTAC	ATCAAGTGTA
TCATATGCCA	600
AGTACGCCCC	ATATTGACGT	CAATGACGGT	AAATGGCCCG	CCTGGCATTA
TGCCCAGTAC	660
ATGACCTTAT	GGGACTTTCC	TACTTGGCAG	TACATCTACG	TATTAGTCAT	1520
CGCTATTACC	720	GTACATCAAT	GGGCGTGGAT	AGCGGTTTGA
ATGGTGATGC	GG i I i i uGua
CTCACGGGGB	780
TTTCCAAGTC	TCCACCCCAT	TGACGTCAAT	GGGAGTTTGT	TTTGGCACCA
AAATCAACGG	840				1525
GACTTTCCAA	AATGTCGTAA	CAACTCCGCC	CCATTGACGC	AAATGGGCGG
TADGCGTGTA	900
CGGTGGGAGG	TGTATATAAG	CAGAGCTGGG	TACGTGAACC	GTCAGATCGC
CTGGAGACGC	960
CATCACAGAT	CTCTCACCAT	GAGGGTCCCC	GCTCAGCTCC	TGGGGCTCCT	1530
GCTGCTCTGG	1020

RO 118524 Β1

CTCCCAGGTG CACGATGTGA TGGTACCAAG GTGGAAATCA AACGTACGOT

GGCTGCACCA 1080

TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC

CTCTGTTGTG 1140

TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT

GGATAACGCC1200

CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAG.CAAGGA

CAGCACCTAC1260

AGCCTCAGCA GCACCCTGAG GCTGAGCAAA GGAGAGTACG AGAAACACAA

AGTCTACGCC1320

TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCGTAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA

CAGGGGAGAG 1380

TGTTGAATTC AGATCCGTTA ACGGTTACCA ACTACCTAGA CTGGATTCGT

GACAACATGC1440

GGCCGTGATA TCTACGTATG ATCAGCCTCG AGTGTGCCTT CTAGTTGCCA

GCCATCTGTT1500

GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTG~CC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC

TGTCCTTTCC1560

TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT GTCATTCTAT

TCTGGGGGGT1620

GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT TGGGAAGACA ATAGCAGGCA

TGCTGGGGAT1680

GCGGTGGGCT CTATGGAACC AGCTGGGGCT CGACAGCTAT GCCAAGTACG

CCCCCTATTG1740

ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC

AAATGGGACT1800

TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG

ATGCGGTTTT1860

GGCAGTACAT CAATGGGCGT GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA

AGTCTCCACC1920

CCATTGACGT CAATGGGAGT TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT

CCAAAATGTC1980

GTAACAACTC CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGG-GG

GAGGTCTATA2040

TAAGCAGAGC TGGGTACGTC CTCACATTCA GTGATCAGCA CTGAACACAG

ACCCGTCGAC 2100

ATGGGTTGGA GCCTCATCTT GCTCTTCCTT GTCGCTGTTG CTACGGGTGT

CGCTAGCACC2160

AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCACCC TCCTCCAAGA GCACCTCTGG

GGGCACAGCG2220

GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC

GTGGAACTCA 2280

GGCGCCCTGA CCAGCGGCGT GCACACCTTG CCGGCTGTCC TACAGTCCTC

AGGACTCTAC 2340

TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAGCTTGG GCACCCAGAC

CTACATCTGC 2400

AACGTGBATC ACAAGCCCAG CAABACCAAG GTGGACAAGA AAGCAGAGCC

CAAATCTTGT 2460

RO 118524 Β1

GACAAAACTC	ACACATGCCC	ACCGTGCCCA	GCACCTGAAC	TCCTGGGGGG	1580
ACCGTCAGTC	2520
TTCCTCTTCC	CCCCAAAACC	CAAGGACACC	CTCATGATCT	CCCGGACCCC
TGAGGTCACA	2580
TGCGTGGTGG	TGGACGTGAG	CCACGAAGAC	CCTGAGGTCA	AGTTCAACTG
GTACGTGGAC	2640				1585
GGCGTGGAGG	TGCATAATGC	CAAGACAAAG	CCGCGGGAGG	AGCAGTACAA
CAGCACGTAC	2700
CGTGTGGTCA	GCGTCCTCAC	CGTCCTGCAC	CAGGACTGGG	TGAATGGCAA
GGAGTACAAG	2760
TGCAAGGTCT	CCAACAAAGC	CCTCCCAGCC	CCCATCGAGA	AAACCACCTC	1590
CAAAGCCAAA	2820
GGGCAGCCCC	GAGAACCACA	GGTGTACACC	CTGCCCCCAT	CCCGGGATGA
GCTGACCAAG	2880
AACCAGGTCA	GCCTGACCTG	CCTGGTCAAA	GGCTTCTATC	CCAGCGACAT
CGCCGTGGAG	2940				1595
TGGGAGAGCA	ATGGGCAGCC	GGAGAACAAC	TACAAGACCA	CGCCTCCCGT

GGTGGACTCC 3000

GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTS ACCGTGGACA AGAGCAGGTG

GCAGCAGGGG	3060
ACGTCTTCT i	CATGCTCCGT	GATGGATGAG	GCTCTGCACA	ACCACTACAC	1600
GGAGAAGAGC	3120
CTCTCCCTGT	CTCCGGGTAA	ATGAGGATCC	GTTAACGGTT	ACCAAGTACC
TAGACTGGAT	3180
TCGTGACAAC	ATGCGGCCGT	GATATCTACG	TATGATCAGC	CTCGAGTGTG
CCTTCTAGTT	3240				1605
GCCAGCCATC	TGTTGTTTGC	CCCTCCCCCG	TGCCTTCCTT	GACCCTGGAA
GGTGCCACTC	3300
CCACTGTCCT	TTCCTAATAA	AATGAGGAAA	TTGCATCGCA	TTGTCTGAGT
AGGTGTCATT	3360
CTATTCTGGG	GGGTGGGGTG	GGGCAGGACA	GCAAGGGGGA	GGATTGGGAA	1610
GACAATACCA	3420
GGCATGCTGG	GGATGCGGTG	GGCTCTATGG	AACCAGCTGG	GGCTCGACAG
CGCTGGATCT	3480
CCCGATCCCC	AGC'TTTGCTT	CTCAATTTCT	TATTTGCATA	ATGAGAAAAA
AAGGAAAATT	3540				1615
AATTTTAAGA	CCAATTCAGT	AGTTGATTGA	GCAAATGCGT	TGCCAAAAAG
GATGCTTTAG	3600
AGACAGTGTT	CTCTGCACAG	ATAAGGACAA	ACATTATTCA	GAGGGAGTAC
CCAGAGCTGA	3660
GACTCCTAAG	CCAGTGAGTG	GCACAGCATT	CTAGGGAGAA	ATATGCTTGT	1620
CATCACCGAA	3720
GCCTGATTCC	GTAGAGCCAC	ACCTTGGTAA	GGGCCAATCT	GCTCACACAG
GATAGAGAGG	3780
GCAGGAGCCA	GGGCAGAGCA	TATAAGGTGA	GGTAGGATCA	GTTGCTCCTC
AGATTTGCTT	3840				1625
CTGACATAGT	TGTGTTGGGA	GCTTGGATAG	CTTGGACAGC	TCAGGGCTGC
GATTTCGCGC	3900

RO 118524 Β1

	CAAACTTGAC GGCAATCCTA	GCGTGAAGGC	TGGTAGGATT	TTATCCCCGC
TGCCATCATG	3960
1630	GTTCBACCAT GAAGAACGGA	TGAACTGCAT 4020	CGTCGCCGTG	TCCCAAAATA	TGGGGATTGG
	GACCTACCCT GACCACAACC	GGCCTCCGCT 4080	CAGGAACGAG	TTCAAGTACT	TCCAAAGAAT
1635	TCTTCAGTGG GTTCTCCATT	AAGGTAAACA 4140	GAATCTGGTG	ATTATGGGTA	GGAAAAGCTG
	CCTGAGAAGA AGAACTCAAA	ATCGACCTTT 4200	AAAGGACAGA	ATTAATATAG	TTCTCAGTAG
	GAACCACCAC AAGACTCATT	GAGGAGCTCA 4260	TTTTCTTGCC	AAAAGTTTGG	ATGATGCCTT
1640	GAACAACCGG CAGTTCTGTT	AATT6GCAAG 4320	TAAAGTAGAC	ATGGTTTGGA	TAGTCGCAGG
	TACCAGGAAG GATCATGCAG	CCATGAATCA 4380	ACCAGGCCAC	CTTAGACTCT	TTGTGACAAG
1645	GAATTTGAAA ACTTCTCCCA	GTGACACGTT 4440	TTTCCCAGAA	ATTGATCTGG	GGAAATATAA
	GAATACGCAG TAAGTTTGAA	GCGTCCTCTC 4500	TGAGGTCCAG	GAGGAAAAAG	GCATCAAGTA
	GTCTACGAGA CCTCCTAAAG	AGAAAGACTA 4560	ACAGGAAGAT	G4TTTCAAGT	TGTCTGCTCC
1650	CTATGCATTT CGACTGTGCC	TTATAAGACC 4620	ATGGGACTTT	TGCTGGCTTT	AGATCAGCGT
	TTCTAGTTGC CCCTGGAAGG	CAGCCATCTG 4680	TTGTTTGCCC	CTCCCCCGTG	CCTTCCTTGA
1655	TGCCACTCCC GTCTGAGTAG	ACTGTCCTTT 4740	CCTAATAAAA	TGAGGAAATT	GGATCGCATT
	GTGTCATTCT ATTGGGAAGA	ATTCTGGGGG 4800	GTGGGGTGGG	GCAGGACAGC	AAGGGGGAGG
	CAATAGCAGG CTCGAGCTAC	CATGGTGGGG 4860	ATGCGGTGGG	CTCTATGGAA	CCAGCTGGGG
1660	TAGCTTTGCT TAATTTTAAC	TCTCAATTTC 4920	TTATTTGQBT	AATGAGAAAA	AAAGGAAAAT
	ACAATTCAG GAGACAGTGT	TAGTTGATTG 4980	AGCAAATGCG	TTGCCAAAAA	GGATGCTTTA
1665	TCTCTGCACA AGACTCCTAA	GATAAGGACA 5040	AACATTATTC	AGAGGGAGTA	CCCAGAGCTG
	GCCAGTGAGT AGCCTGATTC	GGCACAGCAT 5100	TCTAGGGAGA	AATATGCTTG	TCATCACCGA
	CGTAGAGCCA GGCAGGAGCC	CACCTTGGTA 5160	AGGGCCAATC	TGCTCACACA	GGATAGAGAG
1670	AGGGCAGAGC TCTGACATAG	ATATAAGGTG 5220	AGGTAGGATC	AGTTGCTCCT	CACATTTGCT
	TTGTGTTGGG ACGCAGGTTC	AGCTTGGATC 5280	GATCCTCTAT	GGTTGAACAA	GATGGATTGC
1675	TCCGGCCGCT CAATCGGCTG	TGGGTGGAGA 5340	GGCTATTCGG	CTATGACTGG	GCACAACAGA

RO 118524 Β1

CTCTGATGCC	GCCGTGTTCC	GGCTGTCAGC	GCAGGGGCGC	CCGGTTCTTT
TTGTCAAGAC	5400
CGACCTGTCC	GGTGCCCTGA	ATGAACTGCA	GGACGAGGCA	GCGCGGCTAT
CGTGGCTGGC	5460
CACGACGGGC	GTTCCTTGCG	CAGCTGTGCT	CGACGTTGTC	ACTGAAGCGG	1680
GAAGGGACTG	5520
GCTGCTATTG	GGCGAAGTGC	CGGGGCAGGA	TCTCCTGTCA	TCTCACCTTG
CTCCTGCCGA	5580
GAAAGTATCC	ATCATGGCTG	ATGCAATGCG	GCGGTCGCAT	ACGCTT6ATC
CGGCTACCTG	5640				1685
CCCATTGGAC	CACCAAGCGA	AACATCGCAT	CGAGCGAGCA	CGTACTSGGA
TGGAAGCCGG	5700
TCTTGTCGAT	CAGGATGATC	G G GACGAAGA	GCATCAGGGG	CTCGCGCCAG
CCGAACTGTT	5760
CGCAAGGCTC	AAGGCGCGCA	TGCCCGACGG	GCAGGARGiC	GTCGTGACCC	1690
ATGGCGATGG	5820
CTGCTTGCCG	AATATCATGG	TGGAAAATGG	CCGCTTTTCT	GGATTCATCG
ACTGTGGCCG	5880
GCTGGGTGTG	GCGGACCGCT	ATCAGGACAT	AGCGTTGGCT	ACCCGIGATA
TTGCTGAAGA	5940				1695
GCTTGGCGGC	GAATGGGCTG	AGCGC7TCCT	CGTGCTTTAC	GGTATCGCCG
CTCCCGATTC	6000
GCAGCGCATC	GCCTTCTATC	GCCTTCTTGA	CGAGTTCTTC	TGAGCGGGAC
TGTGGGGTTC	6060
GAAATGACCG	ACCAAGCGAC	GCCCAACGTG	CCATCACGAG	ATTTCGATTC	1700
CACCGCCGCC	6120
TTCTATGAAA	GGTTGGGCTT	CGGAATCGTT	TTCCGGGACG	CCGGCTGGAT
GATCCTCCAG	6180
CGCGGGGATC	TCATGCTGGA	GTTCTTCGCC	CACCCCAACT	TGTTTATTGC
AGCTTATAAT	6240				1705
GGIIACAAAT	AAAGCAA ΓΑΘ	CATCACAAAT	TTCACAAATA	AAGUAI 1 1 1 1
TTCACTGCAT	6300
TCTAGTTGTG	GTTTGTCCAA	ACTCATCAAT	CTATCTTATC	ATGTCTGGAT
CGCGGCCGCG	6360
ATCCCGTCGA	GAGCTTGGCG	TAATCATGGT	CATAGCTGTT	TCCTGTGTGA	1710
AATTGTTATC	6420
CGCTCACAAT	TCCACACAAC	ATACGAGCCG	GAAGCAIAAA	GTGTAAAGCC
TGGGGTGCCT	6480
AATGAGTGAG	CTAACTCAGA	TTAATTGCGT	TGCGCTCACT	GCCCGCTTTC
CAGTCGGGAA	6540				1715
ACCTGTCGTG	CCAGCTGCAT	TAATGAATCG	GCCAACGCGC	GGGGAGAGGC
GGTTTGCGTA	6600
TTGGGCGCTC	TTCCGCTTCC	TCGCTCACSG	ACTCGCTGCG	CTCGGTCGTT
CGGCTGCGGC	6660
GAGCGGTATC	AGCTCACTCA	AAGGCGGTAA	TACGGTTATG	CACAGAATCA	1720
GGGGATAAGC	6720
CAGGAAAGAA	CATGTGAGCA	AAAGGCCAGC	AAAAGGCCAG	GAACCGTAAA
AAGGCCGCGT	6780

RO 118524 Β1

TGCTGGCGTT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CCACTGGCAG CAGCCACTGG GAGTTCTTGA AGTGGTGGCC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC ACCACCGCTG GTAGCGGTGG GGATCTCAAG AAGATCCTTT TCACGTTAAG GGATTTTGGT AATTAAAAAT GAAGTTTTAA TACCAATGCT TAATCAGTGA GTTGCCTGAC TCCCCGTCGT AGTGCTGCAA TGATACCGCG CBGCCAGCCG GAAGGGCCGA TCTATTAATT GTTGCGGGGA GTTGTTGCCA TTGCTACAGG AGCTCCGGTT CCCAACGATC GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC ATGGTTATGG CAGCACTGCA GTGACTGGTG AGTACTCAAC TCTTGCCCGG CGTCAATACG ATCATTGGAA

TTTCCATAGG 6840	CTCCGCCCCC	CTGAGGAGCA	TCACAAAAAT
GCGAAACCCG	ACAGGACTAT	AAAGATACCA	GGCGTTTCCC
6900 CTCTCCTGTT	CCGACCCTGC	CGCTTACCGG	ATACCTGTCC
6960 CGTGGCGCTT	TCTCAATGCT	CACGCTGTAG	GTATCTCAGT
7020 CAAGCTGGGC	TGTGTGCACG	AACCCCCCGT	TCAGCCCGAC
7080 CTATCGTCTT	GAGTCCAACC	CGGTAAGACA	CGACTTATCG
7140 TAACAGGATT	AGCAGAGCGA	GGTATGTAGG	CGGTGCTACA
7200 TAACTACGGC	TACACTAGAA	GGACAGTATT	TGGTATCTGC
7260 CTTCGGAAAA	AGAGTTGGTA	GGTCTTGATC	CGGCAAACAA
7320 Ί I I I ITTGTT	TGCAAGCAGC	AGATTACGCG	CAGAAAAAAA
7380 GATCTTTTCT	ACGGGGTCTG	ACGCTCAGTG	GAACGAAAAC
7440 CATGAGATTA	TCAAAAAGGA	TCTTCACCTA	GATCCTTTTA
7500 ATCAATCTAA	AGTATATATG	AGTAAACTTG	GTCTGACAGT
7560 GGCACCTATC	TCAGCGATCT	GTCTATTTCG	TTCATCCATA
7620 GTAGATAACT	ACGAT6CGGG	AGGGCTTACG	ATCTGGCCCC
7680 AGACCCAGGC	TCACCGGCTC	CAGATTTATC	AGCAATAAAC
7740 GCGCAGAAGT	GGTCCTGCAA	CTTTATCCGC	CTCCATCCAG
7800 AGCTAGAGTA	AGTAGTTCGC	CAGTTAATAG	TTTGCGCAAC
7860 CATCGTG6TG	TCACGCTCGT	CGTTTGGTAT	GGCTTCATTC
7920 AAGGCGAGTT	ACATGATCCC	CCATGTTGTG	CAAAAAAGCG
7980 GATCGTTGTC	AGAAGTAAGT	TGGCCGGAGT	GTTATCACTC
8040 TAATTCTCTT	ACTGTCATGC	CATCCGTAAG	ATGCTTTTCT
8100 CAAGTCATTC	TGAGAATAGT	GTATGCGGCG	ACCGAGTTGC
8160 GGATAATACC	GCGCCACATA	GCAGAACTTT	AAAAGTGCTC

8220

RO 118524 Β1

AACGTTCTTC	GGGGCGAAAA	CTCTCAAGGA	TCTTACCGCT	GTTGAGATCC
AGTTCGATGT	8280
AACCCACTCG	TGCACCCAAC	TGATCTTCAG	CATCTFTTAC	TTTCACCAGC
GTTTCTGGGT	8340				1775
GAGCAAAAAC	AGGAAGGCAA	AATGCCGCAA	AAAACCCAAT	AAGGGCGACA
CGGAAATGTT	8400
GAATACTCAT	ACTCTTCCTT	TTFCAATATT	ATTGAAGCAT	TTATCAGGGT
TATTGTCTCA	8460
TGAGCGGATA	CATATTTGAA	TGTATTTAGA	AAAATAAACA	AATAGGGGTT	1780
CCGCGCACAT	8520

TTCCCCGAAA AGTGCCACCT 8540 (3) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR: 2

1785 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 9209 baze (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETITURĂ: simplă (D) TOPOLOGIE: circulară 1790 (ii) MOLECULĂ: ADN (genomic) (iii) IPOTETIC: da (iv) ANTI-SENS: nu (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR. 2:

GACGTCGCGG	CCGCTCTAGG	CCTCCAAAAA	AGCCTCCTCA	CTACTTCTGG	1795
AATAGCTCAG	60
AGGCCGAGGA	GGCCTCGGCC	TCTGGATAAA	TAAAAAAAAT	TAGTCAGCCA
TGCATGGGGC	120
GGAGAATGGG	CGGAACTGGG	CGGAGTTAGG	GGCGGGATGG	GCGGAGTTAG
GGGCGGGACT	180				1800
ATGGTTGCTG	ACTAATTGAG	ATGCATGCTT	TGCATACTTC	TGCCTGCTGG
GGAGCCTGGG	240
GACTTTCCAC	ACCTGGTTGC	TGACTAATTG	AGATGCATGC	TTTGCATACT
TCTGCCTGCT	300
GGGGAGCCTG	GGGACTTTCC	ACACCCTAAC	TGACACACAT	TCCACAGAAT	1805
TAATTCCCCT	360
AGTTATTAAT	AGTAATCAAT	TACGGGG-CA	TTAGTTCATA	GCCCATATAT
GGAGTTCCGC	420
GTTACATAAC	TTACGGTAAA	TGGCCCGCCT	GGCTGACCGC	CCAACGACCC
CCGCCCATTG	480				1810
ACGTCAATAA	TGACGTATGT	TCCCATAGTA	ACGCCAATAG	GGACTTTCCA
TTGACGTCAA	540
TGGGTGGACT	ATTTACGGTA	AACTGCCCAC	TTGGCAGTAC	ATCAAGTGTA
TCATATGCCA	600
AGTACGCCCC	CTATTGACGT	CAATGACGGT	AAATGGCCCG	CCTGGCATTA	1815
TGCCCAGTAC	660
ATGACCTTAT	GGGACTTTCC	TACTTGGCAG	TACATCTACG	TATTAGTCAT
CGCTATTACC	720	GTACATCAAT	GGGCGTGGAT	AGCGGTTTGA
ATGGTGATGC	GGTTTTGGCA
CTCACGGGGA	780				1820

RO 118524 Β1

TTTCCAAGTC	TCCACCCCAT	TGACGTCAAT	GGGAGTTTGT	TTTGGCACCA
	AAATGAACGG GACTTTCCAA	840 AATGTCGTAA	CAACTCCGCC	CCATTGACGC	AAATGGGCGG
1825	TAGGCGTGTA CGGTGGGAGG	900 TCTATATAAG	CAGAGCTGGG	TACGTGAACC	GTCAGATCGC
	CTGGAGACGC CATCACAGAT	960 CTCTCACTAT	GGATTTTCAG	GTGCAGATTA	TCAGCTTCCT
	GCTAATCAGT GCTTCAGTCA	1020 TAATGTCCAG	AGGACAAATT	GTTICTCTCCC	AGTCTCCAGC
1830	AATCCTGTCT GCATCTCCAG	1080 GGGAGAAGGT	CACAATGACT	TGCAGGGCCA	GCTCAAGTGT
	AAGTTACATC CACTGGTTCC	1140 AGCAGAAGCC	AGGATCCTCC	CCCAAACCCT	GGATTTATGC
1835	CACATCCAAC CTGGCTTCTG	1200 GAGTCCCTGT	TCGCTTCAGT	GGCAGTGGGT	CTGGGACTTC
	TTACTCTCTC ACAATCAGCA	1260 GAGTGGAGGC	TGAAGATGCT	GGGACTTATT	ACTGCCAGCA
	GTGGACTAGT AACCCACCCA	1320 CGTTCGGAGG	GGGGACCAAG	CTGGAAATCA	AACGTACGGT
1840	GGCTGCACCA TCTGTCTTCA	1380 TCTTCCCGGC	ATCTGATGAG	CAGTTGAAAT	CTGGAACTGC
	CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA	1440 ATAACTTCTA	TCCCAGAGAG	GCCAAAGTAC	AGTGGAAGGT
1845	GGATAACGCC CTCCAAPCGG	1500 GTAACTCCCA	GGAGAGTGTC	ACAGAGCAGG	ACAGCAAGGA
	CAGCACCTAC AGCCTCAGCA	1560 GCACCCTGAC	GCTGAGCAAA	GCAGACTACG	AGAAACACAA
	CGTCTACGCC TGCGAAGTCA	1620 CCCATCAGGG	CCTGAGCTCG	CCCGTCACAA	AGAGCTTCAA
1850	CAGGGGAGAG TGTTGAATTC	1680 AGATCCGTTA	ACGGTTACCA	ACTACCTAGA	CTGGATTCGT
	GACAACATGC GGCCGTGATA	1740 TCTACGTATG	ATCAGCCTCG	ACTGTGCCTT	CTAGTTGCCA
1855	GCGATCTGTT GTTTGCCCCT	1800 CCCCCGTGCC	TTCCTTGACC	CTGGAAGGTG	CCACTCCCAC
	TGTCCTTCC TATAAAATG	1860 AGGAAATTGC	ATCGCATTGT	CTGAGTAGGT	GTCATTCTAT
	TCT6GGGGGT GGGGTGGGGC	1920 AGGACAGCAA	GGGGGAGGAT	TGGGAAGACA	ATAGCAGGCA
1860	TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT	1980 CTATGGAACC	AGCTGGGGCT	CGACAGCTAT	GCCAAGTACG
	CCCCCTATTG ACGTCAATGA	2040 CGGTAATGG	CCCGCCTGGC	ATTATGCCCA	GTACATGACC
1865	TTATGGGACT TTCCTACTTG	2100 GCAGTACATC	TACGTATTAG	TCATCGCTAT	TACCATGGTG
	ATGCGGTTTT GGCAGTACAT	2160 CAATGGGCGT	GGATAGCGGT	TTGACTCACG	GGGATTTCCA
	AGTCTCCACC	2220

R0118524 Β1

CCATTGACGT	CAATGGGAGT	TTTGTTTTGGC	ACCAAAATCA	ACGGGACTTT
CCAAAATGTC	2280				1870
GTAACAACTC	CGCCCCATTG	ACGCAAATGG	GCGGTAGGCG	TGTACGGTGG
GAGGTCTATA	2340
TAAGCAGAGC	TGGGTACGTC	CTCACATTCA	GTGATCAGCA	CTGAACACAG
ACCCGTCGAC	2400
ATGGGTTGGA	GCCTCATCTT	GCTCTTCCTT	GTCGCTGTTG	CTACGCGTGT	1875
CCTGTCCCAG	2460
GTACAACTGC	AGCAGCCTGG	GGCTGAGCTG	GTGAAGCCTG	GGGCCTCAGT
GAAGATGTCC	2520
TGCAAGGCTT	CTGGCTACAC	ATTTACCAGT	TACAATATGC	ACTGGGTAAA
ACAGACACCT	2580				1880
GGTCGGGGCC	TGGAATGGAT	TGGAGCTATT	TATCCCGGAA	ATGGTGATAC
TTCCTACAAT	2640
CAGAAGTTCA	AAGGCAAGGC	CACATTGACT	GCAGACAAAT	CCTCCAGCAC
AGCCTACATG	2700
CAGCTCAGCA	GCCTGACATC	TGAGGACTCT	GCGGTCTATT	ACTGTGCAAG	1885
ATCGACTTAC	2760
TACGGCGGTG	ACTGGTACTT	CAATGTCTGG	GGCGCAGGGA	CCACGGTCAC
CGTCTCTGCA	2820
GCTAGCACCA	AGGGCCCATC	GGTCTTCCCC	CTGGCACCCT	CCTCCAAGAG
CACCTCTGGG	2880				1890
GGCACAGCGG	CCCTGGGCTG	CCTGGTCAAG	GACTACTTCC	CCGAACCGGT
GACGGTGTCG	2940
TGGAACTCAG	GCGCCCTGAC	CAGCGGCGTG	CACACCTTCC	CGGCTGTCCT
ACAGTCCTCA	3000
GGACTCTACT	CCCTCAGCAG	CGTGGTGACC	GTGCCCTCCA	GCAGCTTGGG	1895
CACCCAGACC	3060
TACATCTGCA	ACGTGAATCA	CAAGCCCAGC	AACACCAAGG	TGGACAAGAA
AGCAGAGCCC	3120
AAATCTTGTG	ACAAAACTCA	CACATGCCCA	CCGTGCCCAG	CACCTGAACT
CCTGGGGGGA	3180				1900
CCGTCAGTCT	TCCTCTTCCC	CCCAAAACCC	AAGGACACCG	TCATGATCTC
CCGGACCCCT	3240
GAGGTCACAT	GCGTGGTGGT	GGACGTGAGC	CACGAAGACC	CTGAGGTCAA
GTTCAACTGG	3300
TACGTGGACG	GCGTGGAGGT	GCATAATGCC	AAGACAAAGC	CGCGGGAGGA	1905
GCAGTACAAC	3360
AGCACGTACC	GTGTGGTCAG	CGTCCTCACC	GTCCTGCACC	AGGACTGGCT
GAATGGCAAG	3360
AGCACGTACC	GTGGGTCAG	CGTCCTCACC	GTCCTGCACC	AGGACTGGCT
GAATGGCAAG	3420				1910
GAGTACAAGT	GCAAGGTCTC	CAACAAAGCG	CTCCCAGCCC	CCATCGAGAA
AACCATCTCC	3480
AAAGCCAAAG	GGCAGCCCCG	AGAACCACAG	GTGTACACCC	TGCCCCCATC
CCGGGATGAG	3540
CTGACCAAGA	ACCAGGTCAG	CCTGACCTGC	CTGGTCAAAG	GCTTCTATCC	1915
CAGCGACATC	3600

RO 118524 Β1

GCC6TGGAGT GCCTCCCGTG CTGGACTCCG GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA CCACTACACG CAGAAGAGCC CCAACTACCT AGACTGGATT TGCACTGTGC CTTCTAGTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC TGTCTGAGTA GGTGTCATTC GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCTCGACAGC GCTGGATCTC TGAGAAAAAA AGGAAAATTA GCCAAAAAGG ATGCTTTAGA AGGGAGTACC GAGAGCTGAG TATGCTTGTC ATCACCGAAG CTCACACAGG ATAGAGAGGG TTGCTCCTCA CATTTGCTTC GAGGGCTGCG ATTTCGCGCC TATCCCCGCT GCCATCATGG GGGGATTGGC AAGAACGGAG CCAAAGAATG ACCACAACCT GAAAACCTGG TTCTCCATTC TGTCAGTAGA GAACTCAAAG TGATGCCTTA AGACTTATTG AGTCGGAGGC AGTTCTGTTT

GGGAGAGCAA 3660	TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC
ACGGCTCCTT	CTTCCTCTAC	AGCAAGCTCA	CCGTGGACAA
3720 ACGTCTTCTC	ATGCTCCGTG	ATGCATGAGG	CTCTGCACAA
3780 TCTCCCTGTC	TCCGGGTAAA	TGAGGATCCG	TTAACGGTTA
3840 CGTGACAACA	TGCGGCCGTG	ATATCTACGT	ATGATCAGCC
3900 CCAGCCATCT	GTTGTTTGCC	CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG
3960 CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	ATGAGGAAAT	TGGATCGCAT
4020 TATTCTGGGG	GGTGGGGTGG	GGCAGGACAG	CAAGGGGGAG
4080 GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	GCTCTATGGA	ACCAGCTGGG
4140 CCGATCCCCA	GCTTTGCTTC	TCAATTTCTT	ATTTGCATAA
4200 ATTTTAACAC	CAATTCAGTA	GTTGATTGAG	CAAATGCGTT
4260 GACAGTGTTC	TCTGCACAGA	TAAGGACAAA	CATTATTCAG
4320 ACTCCTAAGC	CAGTGAGTGG	CACAGCATTC	TAGGGAGAAA
4380 CCTGATTCCG	TAGAGCCACA	CCTTGGTAAG	GGCCAATCTG
4440 CAGGAGCCAG	GGCAGAGCAT	ATAAGGTGAG	GTAGGBTCAG
4500 TGACATAGTT	GTGTTGGGAG	CTTGGATAGC	TTGGACAGCT
4560 AAACTTGACG	GCAATCCTAG	CGTGAAGGCT	GGTAGGATTT
4620 TTCGACCATT	GAACTGCATC	GTCGCCGTGT	CCCAAAATAT
4680 ACCTACCCTG	GCCTCCGCTC	AGGAACGAGT	TCAAGTACTT
4740 CTTCAGTGGA	AGGTAAACAG	AATCTGGTGA	TTATGGGTAG
4800 CTGAGAAGAA	TCGACCTTTA	AAGGACAGAA	TTAATATAGT
4860 AACCACCACG	AGGAGCTCAT	TTTCTTGCCA	AAAGTTTGGA
4920 AACAACCGGA	ATTGGCAAGT	AAAGTAGACA	TGGTTTGGAT
4980 ACCAGGAAGC	CATGAATCAA	CCAGGCCACC	TTAGACTCTT

TGTGACAAGG 5040

R0118524 Β1

ATGATGCAGG	AATTTGAAAG	TGACACGTTT	TTCCCAGAAA	TTGATTTGGG	1965
GAAATATAAA	5100
CTTCTCCCAG	AATACCCAGG	CGTCCTCTCT	GAGGTCCAGG	AGGAAAAAGG
CATCAAGTAT	5160
AAGTTTGAAG	TCTACGAGAA	GAAAGACTAA	CAGGAAGATG	CTTTCAAGTT
CTCTGGTCCC	5220	TATAAGACCA		GCTGGCTTTA	1970
uT UOT AAAGC	TATGCAI I I I	îGGGau i i i i
GATCAGCCTC	5280
CAGTGTGCCT	TCTAGTTGCC	AGCCATCTGT	TGTTTGCCCC	TCCCCCGTGC
CTTCCTTGAC	5340
CCTGGAAGGT	GCCACTCCCA	CTGTCCTTTC	CTAATAAAAT	GAGGAAATTG	1975
CATCGCATTG	5400
TCTGAGTAGG	TGTCATTCTA TTCTGGGGGG	TGGGGTGGGG	GAGGACAGCA
AGGGGGAGGA	5460
TTGGGAAGAC	AATAGCAGGC	ATGCTGGGGA	TGCGGTGGGC	TCTATGGAAC
CAGCTGGGGC	5520				1980
TCGAGCTACT	AGCTTTGCTT	CTCAATTTCT	TATTTGCATA	ATGAGAAAAA
AAGGAAAATT	5580
AATTTTAACA	CCAATTCAGT	AGTTGATTGA	GCAAATGCGT	TGCCAAAAAG
GATGCTTTAG	5640
AGACAGTGTT	CTCTGCACAG	ATAAGGACAA	ACATTATTCA	GAGGGAGTAC	1985
CCAGAGCTGA	5700
GACTCCTAAG	CCAGTGAGTG	GCACAGCATT	CTAGGGAGAA	ATATGCTTGT
CATCACCGAA	5760
GCCTGAÎTCC	GTAGAGCCAC	ACCTTGGFAA	GGGCCAATCT	GCTCACACAG
GATAGAGAGG	5820				1990
GAAGGAGCCA	GGGCAGAGCA	TATAAGGTGA	GGTAGGATCA	GTTGCTCCTC
ACATTTGCTT	5880
CTGACATAGT	TGTGTTGGGA	GCTTGGATCG	ATCCTCTATG	GTTGAACAAG
ATGGATTGCA	5940
CGCAGGTTCT	CCGGCCGCTT	GGGTGGAGAG	GCTATTCGGC	TATGACTGGG	1995
CACAACAGAC	6000
AATCGGCTGC	TCTGATGCCG	GGGTGTTCCG	GCTGTCAGCG	CAGGGG6GCC
CGGTTCTTTT	6060
TGTCAAGACC	GACCTGTCCG	GTGCCCTGAA	TGAACTGCAG	GACGAGGCAG
CGCGGCTATC	6120				2000
GTGGCTGGCC	ACGACGGGCG	TTCCTTGCGC	AGCTGTGCTC	GACGTTGTCA
CTGAAGCGGG	6180
AAGGGACTGG	CTGCTATTGG	G.CGAAGTGCC	GGGGCAGGAT	CTCCTGTCAT
CTCACCTTGC	6240
TCCTGCCGAG	AAAGTATCCA	TCATGGCTGA	TGCAATGCGG	CGGCTGCATA	2005
CGCTiGATCC	6300
GGCTACCTGC	CCATTCGACC	ACCAAGCGAA	ACATCGCATC	GAGCGAGCAC
GTACTCGGAT	6360
GGAAGCCGGT	CTTGTCGATC	AGGATGATCT	GGACGAAGAG	CATCAGGGGC
TCGCGCCAGC	6420				2010
CGAACTGTTC	GCCAGGCTCA	AGGCGCGCAT	GCCCGACGGC	GAGGATCTCG
TCGTGACCCA	6480

RO 118524 Β1

TGGCGATGCC GATTCATCGA CTGTGGCCGG CCCGTGATAT TGCTGAAGAG GTATCGCCGC TGCTGAAGAG GAGCGGACT CTGGGGTTCG TTTCGATTCC ACCGCCGCCT CGGCTGGATG ATCCTCCAGC GTTTATTGCA GCTTATAATG AGCATI I I I I TCACTGCATT TGTCTGGATC GCGGCCGCGA CCTGTGTGAA ATTGTTATCC TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA GGGAGAGGCG GTTTGCGFAT TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG ACAGAATCAG GGGATAACGC AACCGTAAAA AGGCCGCGTT CACAAAAATC GACGCTCAAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT GACTTATCGC CACTGGCAGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GGTATCTGCG

TGCTTGCCGA	ATATCATGGT	GGAAAATGGC
6540
CTGGGTGTGG 6600	CGGACCGCTA	TCAGGACATA
CTTGGCGGCG 6660	AATGGGCTGA	CCGCTTCCTC
CAGCGCATCG 6720	CCTTCTATCG	CCTTCTTGAC
AAATGACCGA 6780	CCAAGCGACG	CCCAACCTGC
TCTATGAAAG 6840	GTTGGGCTTC	GGAATCGTTT
GCGGGGATCT 6900	CATGCTGGAG	TTCTTCGCCC
GTTACAAATA 6960	AAGCAATAGC	ATCACAAATT
CTAGTTGFGG 7020	TTTGTCCAAA	CTCATCAATC
TCCCGTCGAG 7080	AGCTTGGCGT	AATCATGGTC
GCTCACAATT 7140	CCACACAACA	TACGAGCCGG
ATGAGTGAGC 7200	TAACTCACAT	TAATTGCGTT
CCTGTCGTGC 7260	CAGCTGCATT	AATCAATCGG
TGGGCGCTCT 7320	TCCGCTTCCT	CGCTGACTGA
AGCGGTATCA 7380	GCTCACTCAA	AGGCGGTAAT
AGGAAAGAAC 7440	ATGTGAGCAA	AAGGCCAGCA
GCTGGCGTTT 7500	TTCCATAGGC	TCCGCCCCCC
TCAGAGGTGG 7560	CGAAACCCGA	CAGGACTATA
CCTCGTGCGG 7620	TCTCCTGTTC	CGACCCTGCC
TTCGGGAAGC 7680	GTGGCGCTTT	CTCAATGCTC
CGTTCGCTCC 7740	AAGCTGGGCT	GTGTGCACGA
ATCCGGTAAC 7800	TATCGTC7TG	AGTCCAACCC
AGCCACTGGT 7860	AACAGGATTA	GCAGAGCGAG
GTGGTGGCCT 7920	AACTACGGCT	ACACTAGAAG

CGCTTTTCTG GCGTTGGCTA GTGCTTTACG GAGTTCTTCT CATCACGAGA TCCGGGACGC

ACCCCAACTT TCACAAATAA TATCTTATGA ATAGCTGTTT AAGCATAAAG GCGCTCACTG CCAACGCGCG CTCGCTGCGC

ACGGITATCC AAAGGCCAGG TGACGAGCAT AAGATACCAG GCTTACCGGA ACGCTGTAGG ACCCCCCGTT GGTAAGACAC GTATGTAGGC GACAGTATTT

RO 118524 Β1

CTCTGGTGAA	GCCAGTTACC	TTCGGAAAAA	GAGTTGGTAG	CTCTTGATCC
GGCAAACAAA	7980		GCAAGCAGCA	GATTACGCGC
CCACCGCTGG	TAGCGG1GG1	I I I1 ITGTTT
AGAAAAAAAG	8040		CGGGGTCTGA	CGCTCAGTGG
GAT CT CAAGA	AGATCCTTTG	ATGTTTTCTA	2065
AACGAAAACT	8100	ATGAGATTAT	CAAAAAGGAT	CTTCACCTAG
UACG1 1AAUU	GATTTTGGTC
ATCCTTTTAA	8160	TGAATCTAAA	GTATATATGA	GTAAACTTGG
ATTAAAAATG	AAGTTTTAAA
TCTGACAGTT	8220				2070
ACCAATGCTT	AATCAGTGAG	GCACCTATCT	CAGCGATCTG	TCTATTTCGT
TCATCCATAG	8280
TTGCCTGACT	CCCCGTCGTG	TAGATAACTA	CGATACGGGA	GGGCTTACCA
TCTGGCCCCA	8340
GTGCTGCAAT	GATACCGCGA	GACCCACGCT	CACCGGCTCC	AGATTTATCA	2075
GCAATAAACC	8400
AGCCAGCCGG	AAGGGCCGAG	CGCAGAAGTG	GTCCTGCAAC	TTTATCCGCC
TCCATCCAGT	8460
CTATTAATTG	TTGCCGGGAA	GC2AGAGTAA	GTAGTTCGCC	AGTTAATAGT
TTGCGCAACG	8520				2080
TTGTTGCCAT	TGCTACAGGC	ATCGTGGTGT	CACGCTCGTC	GTTTGGTATG
GCTTCATTCA	8580
GCTCCGGTTC	CCAACGATCA	AGGCGAGTTA	CATGATCCCC	CATGTTGTGC
AAAAAAGCGG	8640
TTAGCTCCTT	CGGTCCTCCG	ATCGTTGTCA	GAAGTAAGTT	GGCCGCAGTG	2085
TTATCACTCA	8700
TGGTTATGGC	AGCACTGCAT	AATTCTCTTA	CTGTCATGCC	ATCCGTAAGA
TGCTTTTCTG	8760
TGACTGGTGA	GTACTCAACC	AAGTCATTCT	GAGAATAGTG	TATGCGGCGA
CCGAGTTGCT	8820				2090
CTTGCCCGGC	GTCAATACGG	GATAATACCG	CGCCACATAG	CAGAACTTTA
AAAGTGCTCA	8880
TCATTGGAAA	ACGTTCTTCG	GGGCGAAAC	TCTCAAGGAT	CTTACCGCTG
TTGAGATCCA	8940	GCACCCAACT	GATCTTCAGC
GTTCGATGTA	ACCCACTCGT	ATCTTTTACT	2095
TTCACCAGCG	9000
CCCGTGGGTG	AGCAAAAACA	GGAAGGCAAA	ATGCCGCAAA	AAAGGGAATA
AGGGCGACAC	9060
TTTCTGGGTG	AATACTCATA	CTCTTCCTTT	TTCAATATTA	TTGAAGCATT
TATCAGGGTT	9120				2100
ATTGTCTCAT	GAGCGGATAC	ATATTTGAAT	GTATTTAGAA	AAATAAACAA
ATAGGGGTTC	9180

CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCT 9209 (4) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR. 3 2105 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 54 baze (B) TIP:acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară

2110

RO 118524 Β1 (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETIC: da (iv) ANTI-SENS : nu (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR: 3

5' ATC ACA GAT CTC TCA CCA TGG ATT TTC AGG TGC AGA TTA TCA GCT 52 TC 3' 2 (5) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR. 4 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 30 baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE : simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETIC :da (iv) ANTI-SENS (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR. 4:

5* TGC AGC ATC CGT ACG TTT GAT TTC CAG CTT 3' (6) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR. 5 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME: 384 baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUI MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETIC: da (iv) ANTI-SENS : nu (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR. 5:

ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT ATC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCT CTA GTC 51

ATA ATG TCC AGA GGG CAA ATT GTT CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT

102

GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA

153

AGT TAG ATC CAC TGG TTC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG

204

ATT TAT GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC

255

AGT GGG TCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA

306

GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT AAC CCA CCC ACG TTC

357

GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA 384 (7) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR. 6 (i) CARACTERIZAREA SECVENȚEI (A) LUNGIME : 27 baze (B) TIP: acid nucleic

RO 118524 Β1

2160 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE; lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genom) (iii) IPOTETIC: da (iv) ANTI-SENS: nu (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR. 6 :

5’ GCG GCT CCC ACG CGT GTC CTG TCC CAG 3' 27 (8) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR. 7 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME : 29 baze (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETIC: da (iv) ANTI-SENS: da (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI; SECVENȚA ID NR. 7 :

5' GGS TGT TGT GCT AGC TGM RGA GAC RGT GA 3' 29 (9) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR. 8;

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI (A) LUNGIME : 420 baze (C) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETIC: da (iv) ANTI-SENS: nu (ix) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR. 8 :

ATG GGT TGG AGC CTC ATC TTG CTC TTC CTT GTC GCT GTT CGT GCT ACG GTC 51

CTG TCC CAG GTA CAA CTG CAG CAG CCT GGG GCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG 102

GCC TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACA TTT ACC AGT TAC

153

AAT ATG CAC TGG GTA AAA CAG ACA CCT GGT CGG GGC CTG GAA TGG ATT GGA

204

GCT ATT TAT CCC GGA AAT GGT GAT ACT TCC TAC AAT CAG AAG TTC AAA GGC

255

AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTC

306

AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TCG ACT

357

TAC TAC GGC GGT GAC TGG TAC TCC AAC GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC

408

ACC GTC TCT GCA 420

2165

2170

2175

2180

2185

2190

2195

2200

2205

RO 118524 Β1

Claims (9)

1. Revendicări

   1. Metodă pentru tratarea unei tulburări legată de celulele B, caracterizată prin aceea că, cuprinde administrarea parenterală la un pacient care are nevoie de un asemenea tratament, a unei cantități de dozare eficientă terapeutic a unui prim anticorp himeric antiCD20 având o secvență variabilă cu catenă ușoară substanțial la fel cu secvența arătată în fig.4, o secvență variabilă cu catenă grea substanțial la fel cu secvența arătată în fig.5, și domenii constante lgG1 umane, sau a unui al doilea anticorp himeric anti-CD20 având substanțial aceeași activitate de epuizare a celulelor B ca primul anticorp himeric anti-CD20 menționat, în care o cantitate eficientă terapeutic este în domeniul 0,001 ...30 mg/kg greutate corporală, administrată pe o perioadă de 1...7 zile.
2. 2. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, primul anticorp himeric anti-CD20 are secvența variabilă cu catenă ușoară arătată în fig.4 și secvența variabilă cu catenă grea arătată în fig.5.
3. 3. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, primul anticorp himeric anti-CD20 este produs de produsul de transfecție ATTC 69 119.
4. 4. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, acest prim anticorp este produs din transfectoma care cuprinde anti-CD20 în TCAE8 ca parte a depozitului ATTC nr. 69 119, activ imunologic.
5. 5. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, mai cuprinde faza de administrare a unei a doua cantități eficiente terapeutic, a cel puțin unei a doua dozări dintr-un al doilea anticorp himeric anti-CD20 activ imunologic, cu activitate de epuizare a celulelor B.
6. 6. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează o a treia cantitate eficientă terapeutic a numitului anticorp, în decursul a 14 zile de la prima administrare.
7. 7. Metodă, conform revendicării 1 sau 4, caracterizată prin aceea că, un anticorp anti-CD20 marcat radioactiv se administrează într-o a doua perioadă de administrare.
8. 8. Metodă, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că, anticorpul radiomarcat cuprinde un anticorp monoclonal secretat de un hibridom, identificat prin depozitul ATCC nr. HB 11 388.
9. 9. Metodă, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că, anticorpul este radiomarcat cu ytriu (90), indiu (111), iod (131), de preferință ytriu (90).